Stem cells by www.stem-cells.com.ua

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

СТОВБУРОВІ КЛІТИНИ

2 УДК 611–018.1 ББК 28.8я9 Ч–15

Рецензенти: Бутенко Геннадій Михайлович – академік НАМН України, член-кореспондент НАН України, член-кореспондент РАМН, доктор медичних наук, професор, директор Інституту генетичної та регенеративної медицини НАМН Україн. Білько Надія Михайлівна – доктор медичних наук, професор, керівник Центру молекулярних і клітинних досліджень Національного університету «Києво Могилянська академія».

Рекомендовано до друку вченою радою ДВНЗ "Івано-Франківський національний медичний університет". Протокол № 14 від 26.12. 2013 р.

Ч-15 Стовбурові клітини : монографія / Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б. – Івано-Франківськ : Місто НВ, 2014. – 500 с.

ISBN 978-966-428-349-3

Монографію присвячено актуальному розділу сучасної біології та регенеративної медицини – ученню про стовбурові клітини. Наведено загальні відомості про стовбурові клітини, короткі відомості про їхнє відкриття та історію вивчення, класифікацію, маркери, етичні, деонтологічні та нормативно-правові питання використання стовбурових клітин, методи культивування та стандартизації, проблеми токсичності, методи отримання індукованих стовбурових клітин. Детально розглянуто особливості стовбурових клітин тканин і органів у постнатальному онтогенезі. Монографія містить глосарій термінів, які використовуються в науковій літературі щодо стовбурових клітин. УДК 611–018.1 ББК 28.8я9 © Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б., 2014 ISBN 978-966-428-349-3

ЗМІСТ стор.

Передмова . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4 Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини . . . . . . . . . . . .12 1.1. Класифікація стовбурових клітин . . . . . . . . . . . . . . . . . .13 1.2. Етичні і правові питання використання стовбурових клітин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14 1.3. Деонтологічні та нормативно-правові аспекти використання ембріонального матеріалу людини в Україні . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26 1.4. Методи (протоколи) культивування стовбурових клітин . .34 1.5. Тканинна біоінженерія . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52 1.6. Проблема токсичності і стандартизації стовбурових клітин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .62 1.7. Методи отримання індукованих стовбурових клітин . . . . .65 Розділ 2. Стовбурові клітини тканин у постнатальному онтогенезі . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .83 2.1. Маркери стовбурових клітин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .85 2.2. Тканини внутрішнього середовища . . . . . . . . . . . . . . . . .88 2.3. Хрящова тканина . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116 2.4. Кісткова тканина . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126 2.5. М'язова тканина . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136 2.6. Нервова тканина . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148 Розділ 3. Стовбурові клітини органів і систем дорослого організму . 164 3.1. Серцево-судинна система . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164 3.2. Ендокринна система . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193 3.3. Травна система . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212 3.4. Дихальна система . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 283 3.5. Сечова система . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 297 3.6. Чоловіча статева система . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 314 3.7. Жіноча статева система . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 333 3.8. Нервова система . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 350 3.9. Органи чуття . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 386 3.10. Зовнішній покрив організму . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 445 Замість післямови . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 474 Глосарій. Загальні терміни та фрази . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 475 Додатки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 485

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

ПЕРЕДМОВА Короткий нарис історії вивчення та застосування стовбурових клітин Героїня цієї книги – СТОВБУРОВА КЛІТИНА. В ембріогенезі життя нового індивіду починається з однієї стовбурової клітини (СК) – зиготи. Із неї утворюються всі клітини і тканини організму, у тому числі – нові СК, які зберігаються практично в усіх органах і необхідні для їхньої фізіологічної та репаративної регенерації. Як будь-яка клітина, СК є об’єктом вивчення цитології. Цитологія, як наука, почала розвиватися після винайдення світлового мікроскопа, із ХVІІ століття. 1665 року видатний англійський учений Р. Гук, удосконаливши конструкцію мікроскопа, уперше описав у складі рослин комірки, які назвав клітинами (лат. – cellulae, англ. – cells). Спираючись на праці попередників і власні дослідження, видатний німецький учений Т. Шванн 1839 року сформулював основні положення клітинної теорії. Клітини були визнані елементарними блоками життя. Р. Вірхов доповнив клітин ну теорію, довів ши, що кожна клітина походить від клітини – omnis cellula e cellula. А в останній чверті ХІХ ст. було показано, яким чином це відбувається. Е. Страсбургер, П. Перемежко, В. Флемінг, незалежно один від одного, відкрили процес непрямого поділу клітин – мітоз і детально описали його фази. У процесі розвитку цитології формувалося вчення про СК. У другій половині ХІХ ст. цей термін з’явився в працях німецьких біолоЕрнст Генріх Філіп Август Геккель гів, які займалися проблемами емб(Ernst Heinrich Philipp August ковості. Haeckel, 1834-1919) – німецький ріогенезу, еволюції, спад 1868 року Е. Геккель розробив карприрододослідник і філософ.

Передмова

ту генеалогічного дерева, що стосувалася всіх життєвих форм на Землі. На його думку, усі багатоклітинні організми походили від одноклітинного організму, який учений назвав СК – Stammzelle. 1885 року А. Вейсман запропонував тео рію неперервності «зародкової плазми». Він вважав, що "зародкова плазма", яка передається від покоління до покоління, на початку ембріонального розвитку зосереджується в зародкових клітинах. Через сім років Т. Бовері описав потенційні клітининосії "зародкової плазми" в ембріонах аскарид, назвавши їх СК. Того ж року Валентин Геккер, вивчаючи ракоподібних, виокремив клітину, яку також назвав стовбуровою. Вона Схема В.Геккера (1892), на якій виникала в процесі гаструляції і, зазображена стовбурова клітина знавши асиметричного поділу, дава(st) в ембріоні ракоподібного ла початок іншим СК та клітинам родини Cyclops. мезодерми. На межі ХІХ і ХХ ст. термін "стовбурова клітина" почали застосовувати гематологи, які розробляли унітарну теорію кровотворення, згідно якої всі формені елементи крові походять з єдиного джерела. 1896 року А. Папенгейм назвав "лім фомієлобластну мультипотентну стовбурову клітину" родона-

Артур Папенгейм (Artur Pappenheim, 1870-1916) – німецький лікар і гістолог.

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

чальним елементом червоно- та білокрівців. Таких же поглядів притримувалася російська дослідниця В. Данчакова. Видатний російський гістолог О.О. Максимов в 1908 році на з'їзді гематологів у Берліні запропонував термін "стовбурова клітина" саме для визначення родоначальної клітини гематопоезу. Він експериментально довів унітарну теорію кровотворення, показавши, що СК крові може диференціюватися в напрямку еритро-, грануло-, лімфо- і тромбоцитопоезу. Учений вважав, що СК крові має морфологію малого лімфоцита.

Віра Михайлівна Данчакова (Vera Danchakoff, 1879-19??)російський біолог, «мати стовбурових клітин».

Олександр Олександрович Максимов (1874-1928) – російський гістолог та ембріолог, член-кореспондент РАН.

Пізніше уявлення гематологів початку ХХ ст. були підтверджені численними експериментами. 1932 року американська дослідниця Ф. Сабін довела, що хроматин СК, які знаходяться в червоному кістковому мозку, пошкоджується внаслідок радіоактивного опромінення і це призводить до анемії. Особливо важливими були дослідження канадських учених Д. Тіла та Е. Мак Кулоха, опубліковані 1961 року. Вони внутрішньовенно вводили клітини кісткового мозку мишей ізогенним смертельно опроміненим тваринам. У результаті в селезінці реципієнтів виникали колонії проліферуючих клітин. Результати дослідів можна було оцінити кількісно, оскільки було відомо, скільки клітин вводи-

Передмова

лося і скільки колоній виникало. Таким шляхом було доведено, що кожна колонія виникає в результаті проліферації та диференціації однієї гематопоетичної СК. Таким чином, у середині ХХ ст. цими та іншими дослідами було продемонстровано можливос ті практичного застосування кровотворних СК. 1956 року американський медик Е. Томас першим про вів успішну трансплантацію кіст кового мозку. Пізніше цей ме тод почав застосовуватися в клі ніч ній практиці для лікування Флоренс Рена Сабін (Florence Rena Sabin, гострих лейкозів, імунодефіцитів, ане 1871-1953) американська мій, променевої хвороби, а Е. Томас дослідниця. 1990 року отримав Нобелівську премію. Але складність підбо ру сумісного донора кісткового мозку та необхідність тривалої імуносупресивної терапії змусила шу кати альтернативні джерела кровотворних СК. За складом та властивостя ми СК таким джерелом ви явила ся пуповинна кров. Еру її практичного використання від крила 1988 року французька дослідниця Е. Глюкман, яка успішно виконала трансплантацію пуповинної крові дитині з анемією Фанконі. Із цього часу пуповинна кров стала широДжеймс Едгар Тіл (James Edgar Till, ко застосовуватися в клінічній 1931), біофізик, та Ернст Армстронг практиці для лікування як геМак Кулох (Ernest Armstrong матологічних, так і негематолоMcCulloch, 1926-2011), клітинний гічних захворювань. На сьогодбіолог – канадські вчені.

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Едвард Донналл Томас (Edward Donnall (Don) Thomas, 1920-2012) - американський вчений-трансплантолог.

Еліан Глюкман (Eliane Gluckman) – французька дослідниця гематолог, трансплантолог.

нішній день за даними Всесвітньої асоціації донорів кісткового мозку пуповинна кров у світі застосовується в кожному 5-му випадку як джерело кровотворних СК. У 2009 році в США кількість трансплантацій пуповинної крові вперше перевищила кількість трансплантацій кісткового мозку. Пуповинна кров названа "рідким золотом" медицини та найбільшою історією успіху в галузі клітинних технологій. Але кровотворні СК виявилися не єдиними СК в організмі. У 60-х роках радянський учений О.Я. Фріденштейн виділив і вивчив популяцію стромальних клітин кісткового мозку, сформулював поняття про стовбурові стромальні клітини Олександр Якович Фріденштейн кровотворної та лімфоїдної тканин. (1924-1997) - гістолог, гематолог, У даний час ці клітини отримали імунолог, член-кореспондент міжнародну назву "Мультипотентні АМН СРСР і РАМН.

Передмова

мезенхімні стромальні клітини". Вони є одним із перспективних джерел для застосування в регенеративній медицині. Наприкінці минулого століття стало зрозуміло, що СК з’являються в ембріональному періоді, мігрують до різних органів, де зберігаються протягом усього життя. Вважалося, що можливість диференціюватися в клітини різних тканинних ти пів (потентність) поступово обмежується від ембріонального до дорослого періоду. Так, бластомери перших двох-трьох поділів є тотіпотентними. Із них може утворитися новий ембріон із позазародковими органами включно. Клітини внутрішньої клітинної маси бластоцисти є плюрипотентними. Вони можуть дати початок будь-якій тканині організму. СК дорослих можуть бути мультипотентними або уніпотентними. Наприклад кровотворні СК є мультипотентними оскільки з них утворюються всі формені елементи крові. Але сучасна схема кровотворення включає також і ряд уніпотентних клітин-попередниць. Наприклад, ко лонієтворна клітина еритроцитів (КФК-Е), колонієтворна одиниця мегакаріоцитів (КФК-МКЦ) і т.д. 1980 року британський учений М. Еванс виділив лінії ембріо на льних СК мишей і розробив метод отримання трансгенних мишей. А ембріональні СК людини були виділені 1998 року американським ученим Д. Томсоном зі співробітниками. Застосування ембріональних СК піднімає ряд етичних проблем, а також є небезпечним, оскільки в ряді досліджень доведено, що цей тип клітин нерідко трансформується в злоякісні новоутворення. Пізніше були відкриті та запропоновані до застосування плодові СК, які отримують з амніотичСер Мартін Джон ної рідини та Вартонових драглів пупкоЕванс (Martin John Evans, вого канатика. 1941) - англійський учений ембріолог, генетик. На теперішній час СК відкриті прак Лауреат Нобелівської тично в усіх органах і тканинах дорослопремії 2007 року. го організму. Вони знаходять клі ніч не

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

застосування в кардіології, онко ло гії, імунології, ендокринології, офталь моло гії, ортопедії та інших галузях медицини. 1999 року журнал «Science» відзначив, що відкриття СК за значиміс тю є третім поряд із розшифровкою структури ДНК і програмою «Геном людини». Суттєвим досягненням у розробці вчення про СК стало отримання 2006 року японським ученим С. Яманака індукованих СК. Він довів, що активація всього чотирьох генів у клітині сполучної тканини (фібробласті) може переДжеймс Томсон (James A. творити її на плюрипотентну СК. 2012 Thomson, 1958) – року, разом із британським біологом Д. американський вчений, ембріолог, молекулярний Гьордоном, С. Яманака був удостоєний біолог. Нобелівської премії. В останні роки з’являється все бі льше повідомлень про вирощування штучних органів із СК. Так званий деце люляризований матрикс (фактично – строма) органів заселяється СК. Засто сування такого біоінженерного продукту має ряд переваг перед алотрансплантацією від донорів. По-перше, можна використовувати матрикс органів, непридатних для трансплантації, наприклад, сильно пошкоджених. Подруге, для створення штучних органів можна використовувати клітини самого пацієнта. Наприклад, індуковані СК Сінья Яманака (Shinya Yamanaka, 山中伸弥, 1962) - можна трансдиференціювати в визначеному напрямку за допомогою спеяпонський науковець, професор Інституту ціальних факторів росту, отримавши, передових медичних наук таким чином, необмежене джерело пов Кіотському університеті. трібних клітин.

Передмова

Таким чином, за приблизно 100 років розвитку вчення про стовбурові клітини уже сталося багато важливих подій. Прогрес у дослідженнях стовбурових клітин вражає. Вони вже використовуються в лікуванні понад ста нозологій. Можливості вивчення та застосування СК безкінечні і багато в чому непередбачувані. СК усе ширше використовуються в регенеративній медицині. Але історія їхнього вивчення та застосування сьогодні не закінчується. Автори цієї книги впевнені, що наші читачі стануть свідками, а, можливо, і учасниками ще не одного відкриття.

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Розділ 1

ЗАГАЛЬНІ ВІДОМОСТІ ПРО СТОВБУРОВІ КЛІТИНИ Процес ембріонального розвитку починається з однієї клітини - зиготи, яка утворилася в результаті злиття чоловічої та жіночої статевих клітин. Її можна вважати першою СК - джерелом майбутніх численних (1014-1015 клітин дорослого організму людини), серед яких у дорослих багатоклітинних організмах зберігаються недиференційовані (незрілі) СК. СК здатні до самооновлення, утворення нових СК шляхом мітозу і диференціації в спеціалізовані клітини різних органів і тканин. До механізмів самооновлення, які підтримують популяцію СК в організмі належить асиметричний поділ, при якому продукуються дві клітини - одна стовбурова і одна з подальшим диференціюванням на клітини певного типу. Розвиток СК починається з зиготи. Із віком кількість СК у до рослих зменшується. Так, в ембріона на 10000 клітин налічується одна СК, у людини віком 60-80 років - одна на 5-8 млн клітин. СК володіють потентністю. Потентність, або диференціювальний потенціал, являє собою здатність відтворювати визначену кількість різних типів клітин. У залежності від потентності СК створюють такі групи: тотіпотентні (омніопотентні), плюрипотентні, мультипотентні, олігопотентні та уніпотентні. Тотіпотентні СК можуть диференціюватися в клітини ембріональних і позаембріональних тканин та органів у вигляді тривимірних зв’язаних структур (тканин, органів, систем органів в організмі). До них належить запліднена яйцеклітина - зигота і клітини перших її поділів на 5-7-му добу розвитку. Плюрипотентні СК є нащадками тотіпотентних СК і можуть започатковувати практично всі тканини і органи (за винятком позаембріональних). Із плюрипотетних СК розвиваються зародкові листки - екто-, мезо- і ендодерма. Мультипотентні СК дають початок клітинам у межах одного зародкового листка.

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

Олігопотентні можуть диференціюватися лише в деякі, бли зькі за типом клітини (напр. клітини лімфоїдного і мієлоїдного рядів, які беруть участь у процесі кровотворення). Уніпотентні СК (клітини-попередниці, клітини-бласти) - це незрілі клітини, які вже не є стовбуровими, оскільки відтворюють один тип клітин. Вони здатні до самооновлення, що відрізняє їх від нестовбурових клітин. Однак, кількість їхніх поділів обмежена, що відрізняє їх від СК.

1.1. Класифікація стовбурових клітин Ембріональні стовбурові клітини - це клітини, які утворюють внутрішню клітинну масу або ембріобласт на ранній стадії розвитку ембріона. Вони є плюрипотентними. Особливою рисою цих клітин є те, що вони не експресують HLA (human leucocyte antigens), тобто не виробляють антигени тканинної сумісності. Їх можна трансплантувати з незначним ризиком відторгнення, але вони можуть утворювати тератоми, деякі з них можуть стати злоякісними. Слід зауважити, що клінічні випробування з застосуванням похідних ембріональних клітин уже розпочаті. Для отримання ембріональних СК у лабораторних умовах приходиться руйнувати ембріон, що породжує значні етичні проблеми. Клінічні дослідження з використанням ембріональних СК підлягають особливій етичній експертизі. У багатьох країнах дослідження ембріональних СК обмежені законодавством. Одним із головних недоліків ембріональних СК є неможливість використання автологічного, тобто власного матеріалу, при трансплантації, оскільки виділення ембріональних СК несумісне з його подальшим розвитком. Фетальні стовбурові клітини отримують із плодового матеріалу після аборту (на терміні гестації 9-12 тижнів). Безперечно, вивчення та використання такого біоматеріалу також породжує етичні проблеми. Ці клітини вже почали диференціацію і тому кожна з них, по-перше, може пройти лише обмежену кількість поділів, і, по-друге, дати початок не будь-яким, а достатньо визначеним видам спеціалізованих клітин. Так, із клітин фетальної печінки можуть розвинутися спеціалізовані клітини печінки

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

і кровотворні клітини. Із фетальної нервової тканини, відповідно, розвиваються більш спеціалізовані нервові клітини. Постнатальні стовбурові клітини. СК дорослого організму можна поділити на три основних групи: гематопоетичні (кровотворні), мультипотентні мезенхімні (стромальні) і тканиноспецифічні клітини-попередниці. Інколи в окрему групу виділяють клітини пуповинної крові, оскільки вони є найменш диференційованими з усіх клітин зрілого організму, тобто володіють найбільшою потентністю. Пуповинна кров, в основному, містить гематопоетичні СК, а також мультипотентні мезенхімні, але в ній присутні й інші унікальні різновиди СК, які за певних умов здатні диференціюватися в клітини різних органів і тканин. Не дивлячись на те, що СК зрілого організму мають меншу потентність, у порівнянні з ембріональними і фетальними СК, етичний аспект їхніх досліджень і застосування не викликає серйозної полеміки. Крім того, можливість використання автогенного матеріалу забезпечує ефективність і безпеку лікування (електрон ний ресурс http://ru.wikipedia.org/wiki/стволовые клетки). Дослідження стовбурових клітин є відносно новою технологією, яка виявляє примітивні клітини людини і розвиває їх у більшість із будь-яких 220 видів клітин в організмі людини. Деякі вчені і дослідники покладають великі надії на це дослідження і впровадження його результатів для лікування і, можливо, навіть деяких із найстрашніших хвороб, включаючи хвороби серця, діабет і нейродегенеративні захворювання такі, як хвороба Альцгеймера і Паркінсона. Водночас, дослідження стовбурових клітин призводить до етичних проблем - страху людського клонування і серйозної стурбованості з приводу етики проведення наукових досліджень, яка включає в себе знищення людських ембріонів. http://www.wisegeek.com/what-is-stem-cell-research. htm.

1.2. Етичні і правові питання використання стовбурових клітин Процес гуманізації сучасної науки, що відбувається останнім часом, не може здійснюватися без розвитку етичних принципів. Біоетика – це сукупність етичних норм і принципів, що інтегрує в єдине концептуальне ціле аспекти класичної етики та новітні тенденції, що ініційовані бурхливим розвитком науково-техніч-

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

ного прогресу та впливом негативних змін навколишнього се ревища на здоров’я людини. Термін біоетика введений 1927 р. Ф. Ягром, як поняття про моральні засади використання лабораторних тварин і рослин. Сучасне уявлення про біоетику розробив в 1971 р. Ван Рансселер Поттер, як вчення про моральність людської поведінки з позиції біологічно-медичної галузі та інших соціально-орієнтованих наук про життя. Застосування багатьох новітніх біотехнологій, таких як клонування, генна терапія, використання СК, пересадка органів і непередбачуваність їх наслідків вимагають належної уваги з точки зору біоетики. Останнім часом виникло ще немало нових проблем, рішення яких тісно пов’язане з біоетикою. В 1998 р. при Президії НАН України був створений Комітет із питань біоетики. У 2001 р. у Фонді «Відродження» відбулася презентація всеукраїнської громадської організації «Українська асоціація з біоетики» (УАБ) і був проведений Перший Національний конгрес із біоетики. У 2001-2005 рр. при Кабінеті Міністрів України була організована Комісія з питань біоетики. У 2004-2006 рр. Україна брала участь у розробці та впровадженні стандартів на основі доказової медицини. Відбулися ІІ (2004 р.), ІІІ (2007 р.), ІV (2009 р.) і V (2013 р.) Національні конгреси з біоетики, на яких грунтовно були обговорені питання біоетичного характеру, по в’язані зі створенням органів і тканин людини з ембріональних та її власних клітин. На виконання резолюцій конгресів було розроблено «Загальні етичні принципи експериментів на твари нах», «Етичний кодекс лікаря України» та «Етичний кодекс ученого України», введено обов‘язкову біоетичну експертизу при захисті докторських та кандидатських дисертацій з клінічної та експериментальної медицини, біології і ветеринарії тощо. Кожний новий крок у галузі дослідження і використання СК потребує ретельної біоетичної експертизи. У цілому дебати з етики досліджень СК складаються з двох основних етичних проблем: (1) можливість виведення популяції клітин з однієї клітини людини (клонування), і (2) чи етично отримувати СК з ембріонів, зважаючи на проблему - коли починається життя людини. Ідея можливості клонування людини турбує світ. Прихильники наводять багато аргументів на користь клонування людини, у

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

тому числі можливість створення ще одного «Ви» чи частин його тіла або тканин, необхідних для відновлення при захворюваннях. Супротивники, в основному, стверджують, що це не входить у вирішення людиною проблем для виробництва, обробки або знищення людського життя. Питання отримання СК, їх культивування і трансплантації складає самостійне коло складних етичних проблем. У більшості відомих шляхів отримання СК супроводжується деструктивними діями: руйнуванням заплідненої яйцеклітини або ембріона на ранній стадії розвитку, штучним перериванням вагітності тощо. Гострота ситуації пов’язана з тим, що в більшості країн, особливо католицького світу, такі втручання прирівнюються до акту вбивства, до антигуманних дій і тому категорично заперечується їхня допустимість. Ембріони в будь-якій стадії розвитку розглядаються в цих країнах, як, втім, і в країнах з іншою релігійною орієнтацією, як потенційна людська істота. Понад того, такої ж думки дотримуються і міжнародні документи, пов’язані з правами людини: «Загальна декларація прав людини» (1948), «Міжнародна конвенція цивільних і політичних прав» (1966). «Кожна людина має право на повагу до свого життя. Це право має бути захищене законом протягом усього життя від моменту зародження» (п.4 «Американської конвенції з прав людини», 1969). «Європейська конвенція з захисту прав та гідності людини в зв’язку з досягненнями біології та медицини (1997, ст. 8) «забороняє створення ембріонів у дослідницьких цілях». Інші етичні питання, пов’язані з дослідженнями СК, включають у себе дебати, коли починається життя. Правовий статус ембріона залежить від того: чи можуть вважатися ембріони людськими істотами з притаманними їм якостями і правами та з якого моменту вони набувають таких якостей і прав. Так, представники християнства вважають початком життя індивідума момент зачаття, тобто злиття статевих клітин. Представники іудаїзму наполягають на тому, що ембріон набуває людських якостей у постімплантаційний період – через 7 днів. Особи, що сповідують іслам, займають найбільш ліберальну позицію, стверджуючи, що душа вселяється в ембріон на 40-у добу його існування. Деякі вчені стверджують, що ембріони є лише невеликою

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

кількістю недиференційованих тканин, мають великий потенціал для регенерації і повинні бути використані для допомоги іншим людям. Тобто, визначення статусу ембріона – питання не лише релігійне, але й медичне і юридичне, на яке до цього часу немає однозначної відповіді. Можна розглядати три основні позиції відносно нормативного статусу людського ембріона: 1) ембріон із самого початку запліднення є повноцінною людською істотою, яка має право на такий самозахист із боку закону як і доросла людина; 2) ембріон є простою біологічною сукупністю клітин і тому може виступати об’єктом власності; 3) ембріон є своєрідним утворенням, яке заслуговує на певний правовий захист, оскільки є потенційною формою людського життя, однак не є таким життям із моменту запліднення. Аргументами на користь першої точки зору виступає те, що в момент зачаття утворена біологічна істота володіє геномом, відмінним від геному кожного з батьків (донорів), та генетичною інформацією, необхідною для формування окремої людини. На відміну від будь-якої іншої клітини людського орга нізму, зигота має «тотальну потентність», тобто здатність дати початок новому життю. Саме тому право повинно забороня ти будь-які маніпуляції з людським ембріоном, які наносять йому шкоду, наприклад, внесення спадкових генетичних змін, одер жання СК. На думку М.О. Медведевої [1], життя людини – це безперервний процес, який має різні прояви і форми, одна з яких – період внутрішньоутробного розвитку і тому ембріон із моменту запліднення живе повноцінним людським життям і підлягає охороні законом у повному обсязі. Ембріон є людським створінням не тому, що здатний виконувати певні функції, притаманні дорослому організму, а тому, що є єдиною клітинною масою, яка в природних для неї умовах дає початок окремому повноцінному людському організму. Будь-який юридичний факт вимагає конкретності, чіткості та однозначності, але більш конкретної, глобальної, наглядної трансформації живої матерії під час усього процесу відтворення, ніж утворення зиготи, немає, адже в момент зачаття два гаплоїдні геноми започатковують один повноцінний диплоїдний, характерний для соматичної клітини, що може бути чітко і видимо зафіксоване за допомогою мікроскопу.

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Значення проблеми СК надзвичайно складне і життєвоважли ве. Щорічно мільйони людей страждають і вмирають від деге неративних інкурабельних захворювань головного мозку, серця, печінки, нирок, підшлункової залози та інших органів. Із відкриттям генетичного коду створена і розвивається так звана «геномна медицина». Після успіху Я. Вілмута і К. Кемпбелла, які клонували в 1997 р. живу істоту - вівцю Доллі, та робіт Д. Томсона зі співробітниками (1998), які довели можливість отримання СК із бластоцисти з подальшим культивуванням плюрипотентних клітинних ліній, у людства нарешті з’явилася реальна надія на можливість лікування дегенеративних захворювань або, як мінімум, зменшення страждань пацієнтів шляхом трансплантації СК. У даний час відомий ряд джерел отримання СК, серед них велика увага приділяється так званим «зайвим» бластоцистам, або з тих чи інших причин невикористаним бластоцистам, що готували для цілей екстракорпорального запліднення. При використанні таких бластоцист висувається ряд обов’язкових міжнародних етичних правил. Ці правила нескладні і цілком прийнятні. Перш за все, необхідна вільна інформована згода подружжя або тільки матері на використання зайвої бластоцисти. Потрібно також офіційне схвалення і затвердження дослідного протоколу національним або відомчим етичним комітетом або адміністративним органом. Особливо підкреслюється необхідність повністю виключити продаж або купівлю зародка, що насправді дуже важливо, щоб уникнути експлуатації жінки, приниження її гідності, обману шляхом псевдодіагностики і т.п. Потрібно також зберігати анонімність донорів СК. Дані про генетичних батьків СК не повинні знати ні донор, ні реципієнт. Важливим є доступність результатів дослідження, відкрита і повна публікація отриманих даних. Питання етичності клонування людини, її органів чи тканин обговорюється вченими, лікарями й фахівцями з питань біоетики вже протягом кількох років, адже з виникненням наприкінці ХХ століття самої ідеї клонування до жвавих дискусій із цього приводу долучилася чи не вся світова спільнота. Протести з боку церкви, науковців і правників спричинили до прийняття Загальної декларації ЮНЕСКО 1997 року, яка заборонила клонування людини та вимагала суворого контролю над усіма подібними

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

роботами в кожній державі і регулювала наукові дослідження в цій сфері. Крім того, було схвалено Додатковий протокол про заборону клонування людини до Конвенції Ради Європи про права людини та біомедицину 1997 року, який підписали більшість європейських країн, а також прийнято низку національних законів, що заборонили клонування людини, зокрема в Австралії, Бельгії, Великій Британії, Данії, Іспанії, Італії, Нідерландах, Німеччині, Франції, Швеції, Японії. Так, у преамбулі Додаткового протоколу про заборону клонування людини зазначено, що «інструменталізація людських істот шляхом навмисного створення генетично ідентичних людських істот є не сумісною з гідністю людини й, отже, є зловживанням біологією та медициною». Ураховуючи такий підхід, було би справедливим облишити дослідження з ембріонами й спрямувати пошук у площину дорослих організмів. Однак, результати досліджень дорослих СК значно відрізняються, залежно від джерела походження самих клітин. Ефективність ембріональних клітин є набагато вища, ніж соматичних, завдяки тому, що ембріональні СК мають тотипотентність, тимчасом як соматичні клітини є плюрипотентними і мають обмежену можливість диференціації лише в деякі типи клітин і з великими труднощами. Незважаючи на великі досягнення в галузі вивчення СК дорослого організму, складність їхнього застосування викликає сумніви щодо достатньої можливості використання задля вирішення низки терапевтичних проблем, пов’язаних із багатьма захворюваннями. З етичної точки зору різниця між соматичними СК дорослих та ембріональними СК є надзвичайно важливою, оскільки взяття біологічного матеріалу з дорослого організму або з пупкового канатика не становить небезпеки для життя донора і не ставить під загрозу життя особи. У шести країнах прийняті закони, що дозволяють використання «зайвих» ембріонів у дослідницьких цілях. До них належать США (2001), Великобританія (2001), Фінляндія (1993), Греція (2002), Голландія (2002) і Швеція (1991). У 5 країнах повністю заборонено використання бластоцист - в Австрії (1992), Данії (1992), Франції (1994), Ірландії (1983), Іспанії (1988). У більшості інших європейських країн, зокрема в Італії, Португалії, а також

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

у Росії, із цього питання немає законодавств. У Німеччині дозволено ввезення ембріональних СК. Відповідно до міжнародних норм та наказу МОЗ Російської Федерації № 301 від 28.12.1993 р., зайві бластоцисти повинні зберігатися деякий час у замороженому вигляді, але потім неодмінно знищуватися. Тобто, законодавча база, зокрема стосовно використання «зайвих» бластоцист при екстракорпоральному заплідненні, підлягає вдосконаленню. Особливе значення як в науковому, так і в практичному плані відводиться СК, отриманим за класичною методикою Я. Віл мута: перенесення ядра соматичної клітини одного індивідуума в позбавлений ядра ооцит, із подальшим вирощенням зиготи в штучному середовищі до стадії бластоцисти, яка містить плюрипотентні СК. Описана методика практично позбавлена будь-яких серйозних етичних обмежень, крім небезпеки таємного застосування отриманих бластоцист для клонування цілої істоти, що заборонено в усіх країнах світу і віднесено до категорії тяжких злочинів. Вона може розглядатися в якості ідеальної моделі для вивчення механізму репрограмування геному соматичної клітини в цитоплазмі ооцита. У кінцевому рахунку, репрограмовані соматичні клітини виявляться ідеальним рішенням усієї проблеми отримання автологічних поліпотентних клітин і стануть реальним шляхом лікування дегенеративних захворювань безнадійних хворих. Це, безсумнівно, стане найбільшою науковою подією XXI століття - століття генетики. Обговорюючи інші джерела СК та етичні проблеми їх одержання, слід звернути увагу на наступні моменти. При викорис танні плодів, особливо при пізніх абортах, для отримання ембріо нальних стовбурових або клітин-попередниць слід заручитися поінформованою згодою жінки на використання абортивного матеріалу, отримати схвалення комітету з біоетики програми нау кового або клінічного дослідження. Етичними правилами особ ливо підкреслюється необхідність недопущення комерціалізації таких досліджень. Це необхідно, перш за все, для того, щоб уникнути психологічного тиску на матір (за допомогою грошово го підкупу або шляхом помилкової оцінки стану її плоду) при отриманні її згоди на переривання вагітності.

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

Отримання СК із таких джерел, як пуповинна кров, шкіра або кістковий мозок, не потребують будь-яких особливих етичних обмежень. Європейський Союз у 2003 р. визначив 5 етичних принципів, яких слід дотримуватися при випробуванні СК у клініці: 1) принцип поваги гідності людини; 2) принцип індивідуальної автономії (інформована згода, по вага до приватного життя, конфіденційність персональних даних); 3) принцип справедливості і користі (зокрема поліпшення і захист здоров’я); 4) принцип свободи досліджень (у згоді з іншими фундаментальними принципами); 5) принцип пропорційності (маючи на увазі необхідність застосування мінімального набору методів дослідження, потрібних для досягнення мети). Крім того, виділені три чіткі правила, обов’язкове дотримання яких необхідно в клінічних дослідженнях: 1 - вільна інформована згода пацієнта; 2 - об’єктивна оцінка співвідношення ризик/користь; 3- захист здоров’я пацієнта, залученого в клінічні дослідження. Не можна допустити комерціалізації клітинної терапії, яка може штовхнути деяких дослідників на необгрунтовані операції, до створення дорогих клітинних препаратів із грубим порушенням загальноприйнятих етичних норм [2,3]. Матеріали по терапевтичному клонуванню клітин, тканин, органів і репродуктивному - людини в цілому різнобічно представлені на сайтах http://biomedicina.com.ua, www.transplantology. com, www.credo-ua.org, healthy-society.com.ua, catholicnews.org. ua, http://doctor.wpoonline.com та інших. Правові відмінності. Починаючи з 90-х років минулого століття, активізація процесу «криміналізації» клонування людини спричинила прийняття відповідних законів про заборону репродуктивного клонування, а також внесення його до складу злочинів у кримінальних кодексах багатьох країн світу. Репродуктивне клонування - формування і вирощування принципово нових

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

людських істот. Репродуктивне клонування людини передбачає, що індивід, який народився в результаті клонування повинен отримати ім’я, громадянські права, освіту, виховання, тобто все те, що отримують інші повноправні громадяни держави. Терапевтичне клонування - створення ідентичних копій клітин, тканин і органів. Терапевтичне клонування людини передбачає, що розвиток ембріона закінчується через 14 днів, використовується для отримання СК з ембріону [4]. У деяких державах (наприклад, у Німеччині, Великій Британії, Японії) за клонування встановлено кримінальну відповідальність за спеціальними законами. Так, Федеральний закон ФРН про захист ембріонів 1990 року називає злочином створення ембріона, генетично ідентичного іншому ембріонові, незалежно від того, живий останній чи мертвий. У Великій Британії норму про позбавлення волі терміном на 10 років за репродуктивне клонування людини містить Закон про репродуктивне клонування людини (The Human Reproductive Cloning Act of 2001). Цілковиту заборону клонування у США встановлено законом ще 1980 року. Але в 2001 році президент Буш санкціонував видачу коштів із федерального бюджету для дослідження більш ніж 60 існуючих ліній СК. Фінансування цих клітинних ліній було обмежено, оскільки питання про життя і смерть уже були вирішені, тобто лінії СК на той момент були здатні до самостійної і нескінченної регенерації. У 2003 році Палата представників Конгресу ухвалила новий закон (Human Cloning Prohibition Act of 2003), котрим передбачено покарання за клонування, спрямоване як на розмноження, так і на медичні дослідження чи лікування. Скоєння такого злочину тягнуло за собою 10-річне тюремне ув’язнення та штраф у розмірі 1 млн. доларів США. У 2009 році президент Обама скасував обмежувальну політику і дозволив федеральне фінансування, яке буде використовуватися для додаткових ліній СК. У Росії діє Федеральний закон № 54-ФЗ від 20 травня 2002 року «Про тимчасову заборону на клонування людини». Сучасне терапевтичне клонування людини передбачає, що роз виток ембріона зупиняється в межах 14 діб і надалі його клітини використовуються для отримання СК. Прихильники здійснення досліджень клітин клонованих ембріонів із терапевтичною метою

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

мотивують свою позицію бажанням допомогти людству в подоланні низки небезпечних для суспільства хвороб, які майже не піддаються лікуванню або взагалі вважаються невиліковними. Зокрема, терапевтичне лікування клітинами клонованих ембріонів дає змогу ефективніше боротися з цукровим діабетом, хворобами Паркінсона й Альцгеймера, серцево-судинними захворюваннями, травмами спинного мозку, раком крові й багатьма іншими недугами [5]. Сьогодні терапевтичне клонування для отримання ембріональних СК дозволене на законодавчому рівні в деяких країнах, зокрема у Великій Британії та США, де заборону на нього скасовано 2009 року. Однак учені й законодавці багатьох держав висловлюють побоювання (й не безпідставні) із приводу застосування терапевтичного клонування для «дублювання» людини, бо відомі випадки його нелегітимного використання для репродуктивного відтворення окремих особин. Науковці, які розробили техніку клонування, по суті, здатні перетворювати соматичні клітини людини на статеві, «повторюючи» в такий спосіб організми, що вже існують. Пропонується переглянути міжнародні документи, які регламентують питання клонування, заборонивши репродуктивне клонування людини та терапевтичне клонування з використанням ембріонів як донорів біологічного матеріалу й дозволивши застосування лише тих технологій, що передбачають використання пуповинної крові, а також вирощування органів і тканин із дорослих клітин самого хворого чи клітин, узятих із запропонованого вище банку «реставраційного біологічного матеріалу». Незважаючи на те, що в багатьох країнах світу клонування цілковито або частково заборонене, експерименти в цьому напрямі тривають доволі інтенсивно. Тож не випадково протягом кількох останніх років у деяких країнах офіційно дозволено здійснювати наукові дослідження в цій сфері, зокрема й з використанням ембріонів. Так, клонування з науковою метою сьогодні дозволяють проводити Велика Британія, Австралія, Італія, Бельгія та інші країни. Нині здійснюється чимало дослідницьких програм із генетики, терапевтичного клонування та відтворення. Різні країни дозволяють дослідження СК у різному ступені. Такі країни, як Японія, Швеція та Сполучене Королівство

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

зробили це правом, навіть із метою клонування людини. Країни, включаючи Австралію, Канаду та Францію, дозволяють дослідження дорослих і залишків ембріональних клітин, але не клонування людини. Австрія, Ірландія та Польща мають одні з найбільш обмежувальних законів із цього виду досліджень. Україна також підписала та ратифікувала міжнародні акти, що забороняють репродуктивне клонування людини. Окрім того, із 2004 року в нашій державі діє спеціальний Закон «Про забо ро ну репродуктивного клонування людини», який забороняє створення особи, генетично ідентичної іншій живій або померлій людині, шляхом перенесення до жіночої статевої клітини, позбавленої власного ядра, ядра соматичної клітини іншої людини». Цей документ також встановлює заборону на ввезення до України та вивезення з її території клонованих ембріонів лю дини. Із метою лікування патологій (панкреонекрозу, цирозу печінки, гепатитів, опікової хвороби, цукрового діабету II типу, розсіяного склерозу, критичної ішемії нижніх кінцівок тощо) у нашій державі було дозволено здійснення клінічних випробувань із застосуванням СК (наказ МОЗ України № 630 «Про затвердження Порядку проведення клінічних випробувань тканинних і клітинних трансплантатів та експертизи матеріалів клінічних випробувань й унесення змін до Порядку проведення клінічних випробувань лікарських засобів та експертизи матеріалів клінічних випробувань, затвердженого наказом Міністерства охорони здоров’я України від 13.02.2006 р. № 66, зареєстрованого в Міністерстві юстиції України 10.03.2006 р. за № 252/12126» від 10 жовтня 2007 року). Теоретичні і прикладні дослідження, які проводяться в інституті з 80-х років стали основою для створення нового третього покоління препаратів клітинної терапії. Особливе місце посідають у клітинній та тканинній трансплантації гематопоетичні плодові клітини і кровотворні СК пуповинної крові людини, а також клітини і тканини фетоплацентарного комплексу. У зв’язку з цим виникла одна з основних етичних проблем - правоможність роботи з плодовими клітинами і тканинами, отриманими від медичних абортів, хоча їх використання знайшло відображення в Законі України про трансплантацію [6].

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

Нещодавно Україна стала першою з країн СНД, що отримала державну реєстрацію на лікування СК за трьома напрямками: хронічна ішемія кінцівок, панкреонекроз, травми та опіки. Про це йшлося на прес-конференції, присвяченій досягненням у сфері застосування СК у лікуванні важких захворювань протягом останніх 5 років. Уперше, СК застосували для культивування тканин саме з метою лікування складних опікових ран. Із 2003 року більше 500 пацієнтів, із великими опіками тіла (до 98%) було врятовано за допомогою терапії СК. Також успішно проводиться лікування пошкоджених зв’язок і хрящів. Крім того, завдяки терапії з застосуванням препаратів із СК пуповинної крові та клітин, що отримані з жирової клітковини, уже вдалося повернути здатність ходити та врятувати кінцівку від ампутації майже 100 пацієнтам [Опубліковано 28.02.2013. - Режим доступу : http://life.pravda.com.ua]. Література 1. Медведева М.О. Норми етики та права у регулюванні біомедичних досліджень : міжнародно-правовий аспект / М.О. Медведева // «Сучасні проблеми біоетики. - Київ:Академперіодика, 2009. - С. 121-125. 2. Бойко І. Морально-етичний аспект використання стовбурових клітин / І. Бойко // Сучасні проблеми біоетики. - Київ: Академперіодика, 2009. - С. 81-92. 3. Лопухін Ю.М. Стовбурові клітини: етичні проблеми / Ю.М. Лопухін, С.А. Гусєв // Режим доступу до електронного ресурсу: http://pulib.if.ua/referat/view/43504 4. Третьякова В. До питання формування міжнародно-правових біоетичних засад терапевтичного клонування органів і тканин людини / В. Третьякова // Віче. - 2013. - №2 - Режим досту пу до журн.: http://www.viche.info/journal/3481/ 5. Жиганова Л.П. Биомедицина і стовбурові клітин / Л.П. Жиганова // Режим доступу до журналу : http://referaty.net.ua/ referaty/referat_53872.html 6. Грищенко В.И. Этические проблемы клеточной и тканевой терапии / В.И. Грищенко, А.Н. Гольцев, А.М. Компаниец // Сучасні проблеми біоетики. - Київ: Академперіодика, 2009. - С. 185-194.

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

1.3. Деонтологічні та нормативно-правові аспекти використання ембріонального матеріалу людини в Україні Проблема використання ембріонального матеріалу людини в аспекті етично-правових питань виникла в зв’язку зі збільшенням в останні десятиліття «попиту» на медичні ембріологічні об’єкти. З’явився навіть новий напрямок медичної ембріо логії - репродуктологія, яка займається питаннями штучного запліднення. Набирає також обертів трансплантологія в напрямку використання СК, у тому числі, ембріональних для вирощування органів і тканин. Зростає наукова вага клінічної ембріології, яка займається вивченням причин, механізмів та наслідків формування вроджених вад, кількість яких невпинно зростає. Об’єктом використання в усіх зазначених галузях є ембріональний матеріал. У зв’язку з цим, постає необхідність аналізу та систематизації існуючої законодавчо-нормативної бази, яка стосується морально-етичних принципів використання ембріонального матеріалу людини, уніфікації процедур репродуктивних технологій, визначення статусу ембріона, захисту прав батьків та іншого. У світі зазначеного, одним із центральних питань етичності використання ембріонального матеріалу людини є наступне: з якого моменту ембріон людини має статус особистості та підпадає під правові норми? А отже, якими нормативними актами повинні користуватися дослідники та лікарі при вивченні або безпосередньому використанні ембріонального матеріалу людини? (мова йде про «дослідження ембріонального матеріалу», а не про «досліди над ембріональним матеріалом», що заборонено законом). Ще з минулого століття існує низка базових документів, які регламентують положення про права людини та її основні свободи в зв’язку з застосуванням досягнень біології та медицини; один із останніх - це Конвенція про права людини та біомедицину (1997). Підготовка проекту Конвенції велася з 1990 р. спеціально створеним Комітетом, який в 1993 р. був перетворений на Керівний комітет з біоетики. Нині з 42 країн-членів Ради Європи понад 30 приєдналися до Конвенції. Україна не є винят-

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

ком. Наша країна підписала також низку інших міжнародних угод, що стосуються прав людини у сфері біомедицини, на основі яких створений пакет законодавчих норм, що регулюють механізми застосування репродуктивних технологій та інші аспекти використання ембріонального матеріалу людини [1,2]. Існує декілька напрямків використання ембріонального матеріалу людини, які, окрім загальних, підпадають під окремі нормативні акти, тому слід розглянути їх окремо. Напрямок перший – репродуктивна медицина. Значне зростання за останні десятиліття кількості чоловіків та жінок в Україні, які страждають на безпліддя, підштовхнуло практичних лікарів до активного впровадження в життя наукових медичних розробок зі штучного запліднення. Відкриття в Україні клінік, які спеціалізуються на питаннях штучного запліднення, дає надію на покращення гіркої статистики, яка за даними головного спеціаліста відділу акушерсько-гінекологічної допомоги Департаменту материнства, дитинства та санаторного забезпечення Міністерства охорони здоров’я України, свідчить про те, що рівень безпліддя в Україні сягає від 10-12 % до 18-20 %. Згідно нормативів ВООЗ, потреба циклів допоміжних репродуктивних технологій на 1 млн. населення складає близько 800-1000 упродовж року. В Україні існує потреба в проведенні біля 45-47 тис. циклів на рік. Збільшення кількості циклів у 2009-2011 рр. дозволило довести цей показник лише до 250 циклів на 1 мільйон населення, що дуже далеко від середньоєвропейських показників [3]. Під репродуктивними технологіями мають на увазі: штучне запліднення (яке забезпечують двома шляхами: штучною інсемінацією жінки спермою чоловіка або донора та екстракорпоральним заплідненням яйцеклітини in vitro з подальшим перенесенням бластули жінці), забезпечення сурогатного материнства та кріоконсервації донорського матеріалу. За допомогою цих методів, які дозволяють запліднити яйцеклітину штучно в умовах неможливості досягти утворення зиготи природним шляхом, народжені десятки тисяч дітей в усьому світі. Однак серед практичних лікарів, представників різних конфесій і, навіть, науковців не існує єдиної думки щодо використання репродуктивних технологій, оскільки вони пов’язані з додатковими морально-

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

етичними моментами – селекцією ембріонів при багатоплідній вагітності, вибір за бажанням статі майбутньої дитини, психологічними проблемами сурогатної матері та іншими. Суперечки пов’язані, у тому числі, із можливістю виникнення конфліктних ситуацій унаслідок недосконалості нормативної бази, яка охоплює перелічені питання. При формуванні особистої думки з цієї проблеми слід, на наш погляд, ураховувати не тільки етичні аспекти репродуктивних технологій, але і ті можливості, які вони відкривають для фундаментальної медицини, а саме: можливість глибокого вивчення механізму запліднення, наочного спостереження за процесами раннього розвитку ембріона людини (що неможливо дослідити in vivo), можливість діагностики спадкових захворювань у доімплантаційний період розвитку. Дослідним матеріалом при цьому можуть слугувати неімплантовані зародки віком до 14 діб, які дозволено досліджувати. Ембріони, починаючи вже з 15-ї доби розвитку, у багатьох країнах нормативно захищені на рівні зародка, який імплантується [4]. Так, у деяких країнах існує положення закону, згідно з яким дослідження так званих «невикористаних ембріонів» проводиться тільки після дозволу жінки або обох батьків. До недавнього часу правовою підставою для здійснення репродуктивних задач був наказ МОЗ України від 04.02.97 №24 «Про затвердження Умов та порядку застосування штучного запліднення та імплантації ембріона (ембріонів) та методів їх проведення» [5]. Сьогодні базовим документом в Україні, який визначає порядок та умови реалізації репродуктивних технологій, є «Інструкція про порядок застосування допоміжних репродуктивних технологій», затверджена наказом Міністерства охорони здоров’я України від 23 грудня 2008 р. № 771 [6]. У документі йдеться про права пацієнта, регламентований обсяг процедур до, під час та після операції з запліднення, а також означені види процедур, які дозволяється проводити в рамках репродуктивних технологій. Напрямок другий – трансплантологія. Мова йде за використання в якості матеріалу для трансплантації ембріональних СК, які мають здатність диференціюватися в багатьох напрямках та мають безліч переваг перед СК дорослого організму: у них слабо виражені антигенні властивості, що викликають реакції

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

відторгнення чужорідних тканин, а це значно зменшує рівень післятрансплантаційних ускладнень; вони мають потужний проліферативний потенціал; ці клітини здатні синтезувати специфічні ростові фактори, які одночасно стимулюють регенерацію і власних клітин реципієнта. Діапазон захворювань, які здатні відступати при застосуванні методів трансплантації, дуже широкий: це і лікування печінкової недостатності різного ґенезу, і системні вроджені імунодефіцити, і порушення кровотворення, а також дегенеративні захворювання нервової, репродуктивної систем, скелетних тканин, органів чуття та інші патології [7]. Цей напрямок використання ембріонального матеріалу люди ни в рамках морально-етичної дискусії ставить одним із центра льних питання трактування методу трансплантації СК як «ліку вання хворої людини іншим «нереалізованим життям». Але якщо ембріони, які залишаються невикористаними після запліднення in vitro можуть бути корисними для збереження здоров’я і життя людей, чи варто засуджувати застосування їхніх тканин із лікувальною метою? Відповідь на це питання не є однозначною - у деяких країнах (Великобританія, Канада, Швеція, Фінляндія, Іспанія, Австралія) дослідження та пересадка СК дозволені, але підлягають суворому державному контролю. Такі ж держави, як Ірландія, Німеччина, Австрія, Угорщина, Польща, Норвегія, Швейцарія та інші забороняють використання таких технологій [8]. В Україні СК у широкій медичній практиці застосовують, порівняно з світовою практикою, нечасто – переважно при лікуванні лейкозів, деяких захворювань мозку, для нарощування тканин шкіри при опіках та в деяких інших випадках, адже використання подібних технологій обмежено Законом «Про трансплантацію органів та інших анатомічних матеріалів людини» від 16. 07. 1999 № 1007-XIV (із доповненнями № 997-V від 27.04.2007 та № 2608-VI від 19.10.2010) [9]. Зокрема, у статті 18 йдеться про те, що «…укладання угод, які передбачають купівлю-продаж органів або інших анатомічних матеріалів людини, за винятком кісткового мозку, забороняється». У Кримінальному кодексі України та Кодексі України про адміністративні правопорушення від 07.12.1984 р. № 8073-X (у редакції від 16.02.2010 р.) передбачені санкції для медичних працівників,

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

залучених до процедури донорства та трансплантації в разі порушення ними встановленого порядку проведення процедур. Питання застосування СК відображені також і в «Основах законодавства України про охорону здоров’я» (із внесеними змінами, зазначеними в Законі № 3611-VI від 07.07.2011). Зокрема, ст. 29 забороняє «…медичне втручання, яке може викликати розлад генетичного апарату людини». Ст. 47 зазначає, що «…застосування методу пересадки від донора до реципієнта анатомічних матеріалів здійснюється за умови, якщо використання інших засобів і методів для підтримання життя або покращення здоров’я не дає бажаних результатів, а завдана при цьому шкода донору є меншою, ніж та, що загрожувала реципієнту». Неоднозначне положення викладене в ст. 44, яке дозволяє лікарю «…застосувати нові, науково обгрунтовані, але ще не допущені до загального застосування методи діагностики, профілактики, лікування та лікарські засоби (в інтересах вилікування хворого та за його згодою)». На практиці ж реалізація останньої статті є небезпечною для пацієнта, оскільки можливі критичні ятрогенні ускладнення, та з кримінальної точки зору для лікаря, оскільки подібна «ініціатива» може мати непередбачувані (смертельні) наслідки. На жаль, законодавча база з цього питання залишається недосконалою, і це, досить часто, доповнюється низькою юридичною поінформованістю населення. До того ж, нерідко благородні законотворчі і наукові цілі залишаються нереалізованими, оскільки для їхнього здійснення відсутнє відповідне економічне та соціальне підґрунтя. Наприклад, пропозиції зберігання крові з пуповини новонародженої дитини в якості її «посагу». В Україні навіть створено декілька банків кордової (пуповинної) крові, які здійснюють діяльність, пов’язану з її транспортуванням, виділенням СК, кріоконсервацією та збереженням останніх. Ця практика врегульована декількома нормативно-правовими документами: Законом України «Про трансплантацію органів та інших анатомічних матеріалів людині», «Порядком проведення клінічних випробувань тканинних і клітинних трансплантатів та експертизи матеріалів клінічних випробувань» (наказ Міністерства охорони здоров’я України №630 від 10.10.2007), «Порядком проведення клінічних випробувань лікарських засобів та

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

експертизи матеріалів клінічних випробувань» (наказ Міністерства охорони здоров’я України» № 66 від 13.02.2006). Але ж її використання при потребі в нашій непривабливій медичній дійсності є дуже обмеженим, оскільки, по-перше, технології вирощування органів та тканин із СК пуповинної крові з лікувальною метою, які успішно працюють за кордоном, є фінансово нездоланими для пересічного українського громадянина (і навіть того громадянина, який знайшов можливість пуповинну кров своєї дитини законсервувати та зберігати), а по-друге, як вже було зазначено вище, Закон України про основи здоров’я обме жує шляхи використання клітин-трансплантатів. Отже, залишається сподіватися на зростання економічного та наукового потенціалу нашої крани, а також удосконалення правової бази для здійснення наукових розробок із трансплантації СК та втілення їх у життя. Напрямок третій – клінічна ембріологія. У питанні використання ембріонального матеріалу людини з метою вивчення процесів раннього розвитку є два юридичні моменти: перший – правова та нормативна основа досліджень зародків, утворених in vitro, другий – законодавче підґрунтя для можливості вивчення ембріонального матеріалу, отриманого в результаті проведення соціальних або медичних абортів. Існує декілька методичних видань, що узагальнюють основні законодавчі норми, дотримання яких необхідне в обох випадках [10, 11]. Дослідження зародків, утворених in vitro. Ці дії регламентуються «Основами законодавства України про охорону здоров’я». Зокрема, ст. 18, яка стосується досліджень на ембріонах іn vіtrо зазначає, що «…дозволяється проводити дослідження на ембріонах, отриманих іn vіtrо, але воно повинно передбачати і відповідний їхній захист». Ця ж стаття забороняє створення ембріонів людини з дослідницькою метою. Також дослідження цього напрямку повинні проводитися згідно «Інструкції про порядок застосування допоміжних репродуктивних технологій», про що вже йшла мова вище. Дослідження абортивного матеріалу. У «Переліку анатоміч них утворень, тканин, їх компонентів та фрагментів і фетальних матеріалів, дозволених до вилучення у донора-трупа і мертвого

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

плоду людини» зазначаються фетальні матеріали після штучних абортів та пологів, які можуть бути використані для трансплантації. До них відносять: амніотичну оболонку, пуповину, плаценту, фетальні клітини. У питанні, що розглядається, є низка етичних моментів, пов’язаних і з донором, і з самим ембріональним матеріалом. Однією з основних деонтологічних вимог у відношеннях із пацієнткою, яка є відображенням фундаментального принципу поваги до особи, є згода жінки на використання ембріону для дослідницьких цілей. Причому, ні в якому разі факт можливості використання ембріону не повинний впливати на прийняття жінкою рішення про проведення аборту. Йдеться про можливість матеріальної або будь-якої іншої мотивації для проведення аборту чи отримання дозволу на використання ембріону. Тому для виключення можливості мотивації донора неприпустимо пред ставлення жінці-донору інформації про дослідника, який використовує ембріональну тканину, а, відповідно, дослідник не має права знати, хто є донором тканини. Із цих самих міркувань, неприпустима трансплантація донорської тканини родичу донора. Щодо захисту ембріонального матеріалу, то існує заборона на використання живих ембріонів для наукових, діагностичних, терапевтичних, індустріальних або комерційних цілей. Неприпустимим є також штучне підтримання життя ембріону, отриманого внаслідок аборту, із метою отримання ембріональних тканин кращої якості або в більшому об’ємі. Дослідження ембріонального чи фетального матеріалу, отриманого при проведенні аборту, або в результаті передчасних пологів, регламентуються наступними нормативними документами: «Перелік анатомічних утворень, тканин, їх компонентів та фрагментів і фетальних матеріалів, дозволених до вилучення у донора – трупа і мертвого плоду людини»; Закон України «Про трансплантацію органів та інших анатомічних матеріалів людині» №1007-XIV від 16.07.1999 [12]; «Положення про порядок дослідження біопсійного та операційного матеріалів (патогістологічні дослідження); «Інструкція про особливості та порядок розтину трупів дітей раннього віку, новонароджених, мертвонароджених, викиднів та плацент».

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

Наукові розробки, які стосуються застосування СК як інструменту для відновлення тканин та органів, рано чи пізно будуть мати настільки переконливі результати, що стануть одним із традиційних способів лікування невиліковних на сьогодні хвороб, а репродуктивні технології, які все впевнені ше займають свої позиції в рейтингу медикаментозних послуг, через певний час стануть звичними для нашого життя і дозволять покращити демографічну статистику нашої країни та зробити щасливими тисячі подружніх пар. Ураховуючи перспективність означеного, залишається сподіватися, що українські законотворці не знизять темпів у процесі вдосконалення нормативної бази окреслених питань і не залишать Україну осторонь світових науково-медичних досягнень [13]. Література 1. Конвенції про захист прав і гідності людини щодо застосу вання біології та медицини // Збірка договорів Ради Європи. – К., 2000. 2. Гревцова Р. Ю. Біоетичні виклики сучасності і правові рі шення: європейський вимір і український досвід / Р. Ю. Гревцо ва // Матер. IV укр. націон. конгр. з біоетики, м. Київ. – 2010.– С. 61-62. 3. Огірко О. В. Права людського ембріону / О. В.Огірко // Матер. IV укр. націон. конгр. з біоетики, м. Київ. – 2010. – С. 65. 4. Наказ МОЗ України №24 від 04.02.97 «Про затвердження Умов та порядку застосування штучного запліднення та імплантації ембріона (ембріонів) та методів їх проведення». 5. Наказ МОЗ України №771 від 23.12.2008 «Про затвердження «Інструкції про порядок застосування допоміжних репродуктивних технологій». 6. Этика и современное состояние проблемы клеточной и тканевой терапии / В. И. Грищенко, А. Н. Гольцев, А. М. Компаниец // Матер. IV укр. націон. конгр. з біоетики, м. Київ. – 2010. – С. 45-46. 7. Супрун І. С. Правові та біоетичні аспекти отримання і практичного використання стовбурових клітин / І.С. Супрун // Трансплантологія. – 2004. - № 13. – С. 37-40.

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

8. Закон України №1007-XIV від 16. 07. 1999 «Про трансплантацію органів та інших анатомічних матеріалів людині». 9. Дотримання етичних та законодавчих вимог при виконанні наукових морфологічних досліджень (методичні рекомендації) / [В.Л. Кулініченко, В.Д. Мішалов, Ю.Б. Чайковський та ін.] // Київ, 2007. – 29 с. 10. Етичні питання та норми при роботі з ембріональними тканинами людини (методичні рекомендації) / [Смикодуб О. І., Архіпенко І. В., Бушнєва В. О. та ін.] // Київ, 2004. - 20 с. 11. Закон України №1007-XIV від 16. 07. 1999 «Про трансплантацію органів та інших анатомічних матеріалів людині». 12. Закон України №1007-XIV від 16. 07. 1999 «Про трансплантацію органів та інших анатомічних матеріалів людині». 13. Сілкіна Ю. В. Деонтологічні та нормативно-правові аспек ти використання ембріонального матеріалу людини / Ю.В.Сіл кіна, Ю.Б. Чайковський // Здоровье женщины.- 2012.- № 4.С. 21-23.

1.4. Методи (протоколи) культивування стовбурових клітин Одними з перших були виділені і вирощені СК гематопоезу. Вони характеризуються як СК дорослих, і мають величезний те рапевтичний потенціал. Тим не менш, кількість гематопоетичних СК у кістковому мозку є дуже малою, що утруднює роботу з ними. В останній час методи маркування клітинної поверхні і забарвлення СК червоного кісткового мозку доповнені магнітним активованим розділенням і флуоресценцією клітин [1,2]. Гематопоетичні СК і клітини-попередниці можуть бути виділені шляхом збагачення рідкісної популяції клітин за допомогою комбінації моноклональних антитіл. Така ізоляційна схема включає в себе багатоступінчасті процедури з оцінкою щільності фракціонування та попереднього сортування клітин. За останнє десятиліття різні поверхневі і метаболічні маркери клітин були виявлені і використані для виділення гематопоетичних СК і клітин-попередниць у людини. Серед них CD34 став критичним маркером клітинної поверхні при виборі цієї популяції клітин.

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

У CD34+ популяції клітин, диференційна експресія Thy-1, CD38, і AC133 були використані для фракціонування гематопоетичних СК і клітин-попередниць. Для того, щоб виділити субфракціоновані CD34+ клітини з цими маркерами їх додатково очищають із допомогою проточної цитометрії. Гематопоетичні стовбурові CD34+ клітини можуть бути збагачені до Thy-1+, CD38(-Іо) або АС 133+ клітин. Для мобілізації клітин алогенної донорської крові і автологічних лейкоцитів периферійної крові використовуються такі клінічні процедури, як і для гематопоетичних СК і клітин-попередниць у протоколах їхньої трансплантації. Важливо дати якісну і кількісну оцінку ступеня, в якій клітини-попередниці мобілізуються і збагачуються у відповідності з відновленням їхнього довгострокового потенціалу. Тому, описані методи, які визначають кількість мобілізованих клітин-попередниць відповідно до визначених критеріїв, а також їхні функціональні властивості в пробірці і в природних умовах. Ці аналізи можуть бути використані для оцінки мобілізації клітин-попередниць як у людини, так і тварин [3, 4]. Кістковий мозок людини містить також популяцію некровотворних СК, які називають стромальними клітинами, мезенхімними клітинами або мультипотентними мезенхімними стромальними клітинами. Ці клітини мають унікальні властивості СК, включаючи їхню здатність до самооновлення, диференціації в різні типи клітин і модулювання імунної відповіді через паракринні ефекти. Властивості мезенхімних клітин, як біологічних агентів у клінічних випробуваннях лікування захворювань, вив чаються з 1990 року. Мезенхімні клітини були виділені з тканин спеціальними методами і з використанням різних культуральних умов, що в результаті виявило відсутність стандартизації в галузі методів культивування цих клітин. У культивованих у різних лабораторіях клітин визначено неоднакові характеристики. Автори розглядають протоколи для оптимального виділення, підрахунку та вирощування мезенхімних СК кісткового мозку людини в середовищі, яке містить ембріональну телячу сироватку, а також у середовищі, вільному від ксенобіотиків [5]. Мезенхімні стромальні клітини походять від дорослих мезенхімних тканин, мають здатність зазнавати диференціації в

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

кісткові, хрящові, а також жирові клітини, і, отже, становлять великий інтерес для регенеративної медицини як у людини, так і в тварин. Так, багато методів ізоляції та вирощування культури в коней були описані, але результати контролю якості протоколів порівняти між лабораторіями важко. Нещодавно було запропоновано єдиний протокол забезпечення послідовності забору і відтворення СК у цих тварин [6]. Покращені протоколи для ізоляції та характеристики мезен хімних клітин-попередниць із дерми мишей. У скороченому вигля ді процедура вирощення СК може бути представлена, як: ізоляція мезенхімних СК, їхнє виділення, у тому числі проточна цитометрія, аналіз виживаності клітин, утворення колоній, імуноблотинг, імунний аналіз мультипотентної диференціації, приживлення в природних умовах. У більшості випадків протоколи є стандартними, в інших - адаптовані до конкретної мети. Особливий наголос робиться на використанні в пробірці тривимірних культур для мезенхімних клітин-попередниць в епідермальних клітинах [7]. Із кісткового мозку можна отримати обмежену кількість мезенхімних СК, тому їх вирощування ex vivo необхідне для отримання терапевтичних доз клітин. Перехід доклінічних дослідів у клінічні з великомасштабним вирощуванням мезенхімних СК вимагає точного визначення та стандартизації всіх процесуальних параметрів, включаючи щільність посіву клітин на культуральні середовища і культивувальні схеми. Хоча ксеногенні добавки, такі як ембріональна теляча сироватка, усе ще широко використовуються для культивування клітин, її застосування в клінічних умовах пов’язано з багатьма ризиками, такими як пріони, передача вірусів і несприятливі імунологічні реакції проти ксеногенних компонентів. Нещодавно розроблені стандартизовані протоколи і отримані щонайменше 100 мільйонів мезенхімних СК, які, зазвичай, розглядаються як одна клінічна доза з дотриманням вимог GMP [8]. У людини джерелом стромальних СК може бути кісткова спонгіозна тканина хворого, яка забирається через невеликі розрі зи з гребеня крила клубової кістки у вигляді циліндрів діаметром 6–8 мм за допомогою інструментарію для мозаїчної хондропластики, чим забезпечується малоінвазивність втручання. Наводимо

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

протокол отримання і хондрогенного диференціювання стромальних СК за О.О. Коструб, В.І. Грищенко, О.Ю. Петренко та ін. [9]. Клітини кісткового мозку виділяли з кісткової спонгіозної тканини шляхом їх вимивання за допомогою фосфатно-сольового буферу. Суспензію клітин відділяли центрифугуванням при 150 g протягом 10 хв. Ядерні клітини підраховували в камері Горяєва з використанням 3 % оцтової кислоти. Клітини культивували в середовищі α-МЕМ, доповненого 15 % ембріональною сироваткою від великої рогатої худоби, 2 мМ Lглутаміна, 50 од/ мл пеніциліну та 50 мг/мл стрептоміцину. Заміну середовища вперше виконували через 48 год культивування і далі – через кожні 3 доби. При досягненні первинними культурами субконфлуентного моношару клітини знімали з культурального пластику за стандартною методикою, розсіювали з коефіцієнтом 1:3 і культивували стромальні клітини протягом 3 пасажів, після чого клітини знімали з культурального пластику. Отриману суспензію переводили в безсироваткове середовище та індукували хондрогенну диференціацію в альгінатних мікроносіях. Для цього клітини пересаджували та ресуспензували в 2 % розчині альгінату натрію. Потім суспензію покраплинно вносили в 100 мМ розчин CaCl2, інкубували протягом 10 хв для полімеризації альгінату, отримані мікроносії відмивали від надлишку кальцію та додавали до спеціального середовища для індукції хондрогенезу (Cambrex, США) із трансформуючим фактором росту β3 (TGF-β3) та культивували при 37О С та 5 % СО2 у чашках Петрі. Через 3 доби культивування в середовищі та індукції хондрогенезу мікроносії з клітинами переводили в безсироваткове сере довище. Мікроносії, клітинність яких досягала близько 10 млн СК строми кісткового мозку, вводили пацієнту. Залишок клітин культивували в тому ж середовищі ще протягом 25 діб для підтвердження хондрогенної диференціації. Середовище змінювали кожні 3 доби. Маркер хондрогенної диференціації - колаген ІІ типу - визначали за допомогою непрямої імунофлуоресценції з використанням первинних антитіл (Chemicon MAB 6b3) у розведенні 1:200 та вторинних антитіл, кон’югованих із флуоресцентною міткою FITC (Dako, rabbit antimouse FITC-conjugated). Імуно флуоресценцію вивчали в люмінесцентному мікроскопі Carl Zeiss.

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Виконано трансплантацію культури СК строми кісткового мозку трьом хворим із хондромаляцією суглобового хряща ІV стадії. Перед введенням культури СК строми кісткового мозку виконували артроскопічну ревізію, лаваж та дебридмент суглоба. За допомогою шейверної установки видаляли нежиттєздатні фрагменти хряща, ушкоджені частини менісків, здійснювали abrasioартропластику склерозованих ділянок кістки. В оголених ділянках субхондріальної кістки виконували остеоперфорацію з інтервалом 4–6 мм. У післяопераційному періоді іммобілізацію колінного суглоба не застосовували. Хворі з другої доби виконували активні та пасивні рухи в колінному суглобі, також їм призначали електроміостимуляцію чотириголового м’яза стегна та його ізометричні скорочення. Альгінатні носії з розміщеними в них СК вводили під артроскопічним контролем через 21 добу після дебридменту суглоба. Іммобілізацію після введення СК застосовували протягом 3 діб, із наступним поступовим збільшенням обсягу рухів протягом 3 тижнів. Дозоване навантаження на хвору кінцівку розпочинали через 2 міс після введення культури СК, повне – через 3 міс. Суглобовий хрящ є безсудинною тканиною з низьким потенціалом відновлення і тому схильний до розвитку таких захворювань, як остеоартрит. Клітинна терапія могла би відтермінувати настання деградаційних захворювань і зменшити потребу в хірургії суглобів. Джерелом клітин, яке в даний час досліджується для генерації хондрогенних клітини і автологічної імплантації хондроцитів є дорослі мезенхімні СК в якості альтернативного джерела. Клінічне застосування хондрогенних клітин так само, як і протоколи і стратегії тканинної інженерії, вимагають додаткової оптимізації. Ефективність цих типів клітин у регенерації тканини суглобових хрящів, яка здатна витримувати біомеханічні навантаження, буде оцінюватися відповідно з розвитком нормативної бази для визначення найбільш відповідної клітинної терапії [10]. Протоколи виділення і культивування СК/клітин-попередниць хрящової тканини останнім часом доповнені вивченням впливу культурального середовища в якості тригера для вибору диференціації одного типу клітин з усуненням ризику неспри ятливої жирової або кісткової диференціації [11]. Використовуючи протоколи створення хрящової тканини, ліка-

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

рі Каролінської лікарні (Швеція) змоделювали складний за будовою хрящ вушної мушлі і трансплантували пацієнту. Автори розробили каркас із нанокомпозитного матеріалу, який заселили СК цього пацієнта. Це новий крок використання тканинної інженерії, зокрема для реконструкції вроджених і набутих деформацій зовнішнього вуха [12]. Потенційним дуже важливим автологічним джерелом хрящових СК може стати жирова тканина, ураховуючи доступність жирової тканини і її кількість в організмі. Найважливіше значення для розробки стандартних протоколів терапевтичного використання є глибоке розуміння їхнього потенціалу і наявність узгод ження між окремими особами. Така інформація досі відсутня. Для вирішення цих проблем використовували різні методи для створення СК із жирової тканини. У дедифференційованих СК існує можливість селективної індукції в напрямку хряща. У них виявлені маркери, характерні для плюрипотентних клітин, які відповідно легко перепрограмувати в індуковані плюрипотентні СК. Впливаючи хондрогенними, остеогенними, адипогенними чи нейрогенними факторами, можна використати пластичність цих клітин задля подальшої диференціації на визначені тканини, особливо з трансформуючим фактором росту β1 у середовищі до формування хрящів. Тобто ретельна одночасна оцінка диференціації кісткової і хрящової тканини має важливе значення при біоінженерії СК хрящів при клінічному втручанні [13]. Приклад протоколу застосування методів вирощування ме зен хімних СК червоного кісткового мозку в експерименті, які можуть бути в подальшому диференційовані в різних напрямках, наводиться в статті B.S. Monteiro [14]. Донорський кістковий мозок забирали в мишей і вирощували протягом 3 тижнів у середовищі, переносили в середовище DMEM для культивування клітин (DMEM, SIMGA Chemycal Co, Сент-Луїс, Міссурі, США) і витримували в термостаті (інкубаторі) при 37OС при 5 % СО2 і 95 % вологості. На наступному етапі культуральну середу зли вали, посуд промивали 3.0 mL фосфатним буферним фізіологіч ним розчином (PBS 1x, рН 7,2). Клітини, адгезовані до нижньої частини колби трипсинізували розчином трипсину 0,25 % (трип сину-EDTA 1x, SIMGA Chemycal Co, Сент-Луїс, Міссурі, США) і

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

інкубували при 37О С у 5 % СО2 і 95 % вологості протягом 5 хв. Далі клітини ресуспензували в 5,0 мл середовища. Мезенхімні СК переносили в центрифужні пробірки і центрифугували при 22ОC і 1500 rpm протягом 10 хв. Супернатант повністю відкидали і осад ресуспензували в центрифужні пробір- ки з 1,0 мл PBS 1x. 10.0 μL цього нового розчину розбавляли в 10.0 μL трипанового синього барвника, гомогенізували і підраховували клітини в ка мері Neubauer. При мінімальній концентрації осередку було отримано 1,0 х 107 клітин/mL, ще раз центрифугували протягом 10 хвилин, зберігали в термоконтейнерах і транспортували в хірур гічний центр, де безпосередньо пересаджували мишам. Під час імплантації супернатант відкидали, використовували тільки осад. Клітини з четвертого пасажу збирали з трипсином, центрифугували і ресуспензували на рівні 1,0 х 107 клітин/лунку в фосфатно-сольовому буфері. Клітини індивідуально інкубували з первинними антитілами (анти-CD45 клону 69 мишей, антиCD90 клон Ox-7 мишей, анти-CD73 клон 5 F/B9 миші електрон ної анти-CD54 клон 1A29 миша) [BD Bioscience, San Jose, CA, США) протягом 30 хв при 4О C. Після цього клітини промивали в фосфатно-сольовому буфері та інкубували з флуорофором, сполученим із вторинними антитілами (Alexa 488). Зразки були проаналізовані з використанням FACScan цитометрії і CellQuest програмного забезпечення (Becton Dickinson). Відновлення дорослих скелетних м’язів залежить від клітинсателітів - міогенних СК, розташованих між базальною мембраною і плазмолемою м’язових волокон. Стандартизовані протоколи для виділення та культивування міогенних СК є ключовими інструментами для розуміння факторів, які регулюють їхню роботу. Знання, отримані в таких дослідженнях, можуть нести важливу інформацію для розробки стратегій для поліпшення відновлення м’язів після травми і м’язових дистрофій. M.E. Danoviz et al. [15] описують стандартний протокол для ізоляції і культивування міогенних СК від дорослих з імунною характеристикою міосателітів, експресії ними характерних транскрипційних факторів і структурних білків, асоційованих із різними стадіями міогенної проліферації. У цілому, описані протоколи прості і полегшать вивчення різних аспектів СК скелетних м’язів.

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

Кардіоміоцити мають невеликий потенціал для оновлення та розмноження в природних умовах і серцевий м’яз володіє обмеженими можливостями до самооновлення. Існують докази, що ендогенні серцеві клітини-попередниці відіграють ключову роль у регенерації серця, але анатомічне джерело і фенотип цих клітин залишається не визначеним. Результати дослідження J.B. Leinonen [16] показують, що вушко лівого передсердя відіграє роль резервуара кількох типів клітин-попередниць у серці дорослих мишей. Два різних типи епікардіальних і міокардіальних клітин різної локалізації були ізольовані і вивчені. У кардіоміоцити можна диференціювати мезенхімні СК і використати з лікувальною метою для спроби зведення до мінімуму наслідків ішемічно-гіпоксичного ураження і порушення провідної системи серця. Порівнювали три різні протоколи для індукованої диференціації мезенхімних СК, отриманих із жирової тканини молодих трансгенних щурів Льюїса в кардіоміоцити. Результати всіх трьох протоколів виявили експресію саркомерного α-актин білка в екзоскелеті клітин, експресію конексину-43 в ядерній і цитоплазматичній мембрані і формування щілинних контактів, які необхідні для електричного поширення імпульсу в міокарді. Але спонтанних скорочень клітин не спостерігалося ні з одному з тестованих протоколів. Найбільш ефективним був протокол із використанням 5-азацитидину, який забезпечив диференціювання кардіоміоцитів і, таким чином, є методом вибору, як самий простий, швидкий і найдешевший протокол для клітинної диференціації [17]. В останній час виконані спроби створити більш ефективні протоколи для серцевої диференціації індукованих плюрипотентних і ембріональних СК людини за допомогою позаклітинного матриксу в поєднанні з факторами росту. СК культивували у вигляді моношарів на матригелі, із попередньою підготовкою позаклітинної матриці, а згодом накладеної на Matrigel. Матриця «сендвіч» сприяла кращому епітеліо-мезенхімному переходу, як і при гаструляціі з утворенням N-кадгерин-позитивних мезенхімних клітин. Поєднання матриці-сендвіча з послідовним застосуванням факторів росту (Activin, кісткові морфогенетичні білки 4 і основний фактор росту фібробластів), призвели до високого ступе-

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

ня чистоти (до 98 %) і врожайності (до 11 кардіоміоцитів/відносно кількості до початку культивування). У результаті кардіоміоцити поступово дозрівали протягом 30 діб у культурі, клітини якої експресували білки мікрофіламентів. У типових кардіоміоцитах ембріональних вузлових передсердь і шлуночків спостерігалися потенціали дії і моношари були електрично з’єднані. Протокол грунтується на індукованих плюрипотентних СК, отриманих із фібробластів крайньої плоті без інтеграції вектора і трансгенних послідовностей (DF6-9-9Т, DF19-9-7T і DF19-9-11T) і лентивірусів із генерацією плюрипотентних клітинних ліній IMR90 клон 4 (IMR90 C4). Індуковані плюрипотентні СК і емб ріональні СК були збережені на опромінених мишачих ембріональних фібробластах у середовищі з 80% DMEM/F12 основного середовища, 20 % KnockOut замінника сироватки, 0,1 ммоль/л амінокислоти, 1 ммоль/л L-глутаміну (усі з Invitrogen), 0,1 ммоль/л β-меркаптоетанолом (Sigma) із додаванням 100 нг/мл основного фактора росту фібробластів, очищеного від бактерій, для індуко ваних плюрипотентних СК і 4 нг/мл рекомбінантного фактора росту людини (Invitrogen) для ембріональних СК, як описано вище. Клітинні лінії були використані безперервно протягом 2560 пасажів. Протокол Матриця - Сендвіч для серцевої диференціації описаний у роботі Z. Jianhua et al. [18]. Камбіальні епітеліальні клітини ротової порожнини легко доступні і були недавно використані для тканинної інженерії. Ці клітини в даний час широко використовуються в різних наукових дослідженнях, починаючи від вивчення біології ротової порожнини, імунітету слизової оболонки і канцерогенезу. Для успішної ізоляції і культивування епітеліоцитів і фібробластів ротової порожнини людини описані протоколи і методи їхнього використання в 2D i 3D системах культури. Розроблені методи дозволять генерувати відновлення тканин, що нагадують епітеліальні структури in vitro і ключові характеристики яких можна використати в природних умовах [19]. СК пульпи зуба були отримані, в основному, із молочних різців та молярів. Використані протоколи для культивування, виявлення фенотипових властивостей, ультраструктурної харак теристики диференціації і профілів експресії генів цих клітин.

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

СК, ізольовані з пульпи зуба і кісткового мозку, аналізували за допомогою проточної цитометрії, зворотної транскриптази ПЦР, реального часу ПЦР та імуноцитохімії. Обидві клітинні лінії були спрямовані на диференціацію адипогенної, ос теогенної, хондрогенної, міогенної та нейрогенної ліній. Клітини обидвох ліній експресували CD13, CD44, CD90, CD146 і CD166, але не CD3, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD19, CD33, CD34, CD45, CD117 і HLA-DR. Ультраструктурні характеристики СК пульпи показали більшу метаболічну активність клітин. Обидві клі тинні лінії експресували деякі маркери адипогенних (лептин, adipophilin і PPARgamma), міогенних (десмін, міогенін, myosinIIa, і α-SMA), нейрогенних (гамма-енолаза, MAP2a, B, C-FOS, нестин, NF- H, NF-L, GFAP і βIII тубулін), остеогенних (остеонектин, остеокаль цин, остеопонтин, Runx-2 і типу І колагену) і хондрогенних (тип II колагену, Sох9) клітин в умовах без стимуляції диференціації. Ембріональні стовбуровоклітинні маркери Oct4, Rex-1, FoxD-3, Sox2 і Nanog також були визначені [20]. Оцінка середнього рівня життєздатності клітин пульпи зуба показала, що найвища життєздатність СК була досягнута після дев’яти пасажів, припускаючи, що це було би найбільш адекватним для використання в протоколах тканинної інженерії хрящової тканини [21]. R. Karamzadeh et al. [22] використали існуючі прото ко ли для ізоляції СК пульпи людини, тобто ферментативного розпаду тканини пульпи і намагалися сприяти ізоляції за допомогою стоматологічного алмазного диска. Ці клітини характе ри зуються маркерами стромальних клітин (CD73, CD90, CD105 і CD44), кровотворних/ендотеліальних (CD34, CD45 і CD11b), периваскулярних (CD146), а також STRO-1. Результати протоколів порівняли на основі потенціалу диференціації клітин в одонтобласти (полімеразна ланцюгова реакція і забарвлення клітини алізарином). ПЦР була використана для оцінки вираження мінералізації пов’язаних генів (лужної фосфатази, позаклітинного матриксу - фосфоглікопротеїну і сіалопротеїну дентину). Ізоляція епітеліоцитів слизової оболонки ротової порожнини людини та СК/клітин-попередниць кератиноцитів шкіри є клінічно значущим для відновлення епітеліальних тканин для

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

лікування слизової оболонки порожнини рота і дефектів шкіри. Дослідники спробували ізолювати популяції СК/клітин-попередниць кератиноцитів із використанням клітинних маркерів, на основі швидкого приєднання до колагену типу IV та іншими методами, ураховуючи те, що однією зі специфічних характеристик клітин-попередниць кератиноцитів є їхній менший діаметр, ніж диференційованих клітин. Запропоновані два протоколи для сортування кератиноцитів із використанням фізичних критеріїв, розмірів клітин у режимі серійної системи фільтрації. Описані спеціальні протоколи для створення первинних епітеліоцитів слизової оболонки ротової порожнини і шкіри в культурі, позбавленій реактивів тваринного походження. Ці клітини клі нічно апробовані в людини в умовах внутрішньоротового травлення [23]. Покращені протоколи для ізоляції та характеристики мезенхімних клітин-попередниць із дерми мишей. У скороченому вигляді процедура вирощення СК може бути представлена, як: ізоляція мезенхімних СК, їхнє виділення, у тому числі проточна цитометрія, аналіз виживаності клітин, утворення колоній, імуноблотинг, імунний і аналіз мультипотентної диференціації, приживлення в природних умовах. У більшості випадків протоколи є стандартними, в інших - адаптовані до конкретної мети. Особливий наголос робиться на використанні in vitro тривимірних культур для мезенхімних клітин-попередниць в епідермальних клітинах [7]. Oписані протоколи для ефективного виділення нейральних СК дорослого з застосуванням методу подвійного маркування. Клітини виділяли з субепендимальних зон бічних шлуночків дорослих мишей і виявляли в них гліальний фибриллярний кислий білок людини, підсилений зеленим флуоресцентним білком. Протокол триває 7 год і дозволяє оцінити кількісні зміни в клітинах за їхніми молекулярними та функціональними характеристиками [24]. Із моменту відкриття нейральних СК у центральній нервовій системі запропонована велика кількість живильних середовищ, введені протоколи вивчення морфологічного і функціонального стану цих клітин, культивованих in vitro.

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

У протоколі однієї з таких культур, введеному в 1992 році, згадується випробування методу нейросфер. Протокол широко використовується для ізоляції, проліферації, диференціювання і, навіть, кількісного аналізу популяції нервових СК. Через кілька років після цього для кількісного аналізу запропонований новий покроковий аналіз нейронних колонієутворювальних клітин, який дозволяє точно виміряти кількість нейронних СК та їхній проліферативний потенціал. Внесені вдосконалення сприятимуть у перспективі застосуванню нервових СК для терапевтичного використання [25]. При функціональних дослідженнях кори головного мозку людини, його розвитку, моделюваннi захворювань і апробації лікарських препаратів ефективними є нейральні СК і функціональні нейрони з плюрипотентних СК із неокортексу головного мозку людини. Розроблені докладні протоколи для спрямування диференціації ембріональних та індукованих плюрипотентних СК людини в кіркові нейрони всіх видів. Показаний 80-д, три ступеневий процес, який повторює розвиток кори, коли плюрипотентні СК людини спочатку диференціюються в кіркові клітини-попередниці, що потім генерують проекційні нейрони кори з активними потенціалами дії, утворенням синапсів і нейронних ланцюгів у пробірці [26]. Для регенеративної терапії можуть бути використані автологічні нейронні СК дорослої людини, якщо дотриматися етичних вимог. Але експериментальне вирощування СК in vitro потребують подальшого роз’яснення при клінічному застосуванні. Для вирішення цих питань, K.M. Joo et al. [27] отримали біопсії зі скроневої частки від 23 хворих на епілепсію і культивували мультипотентні нейрони дорослої людини. Після 10 пасажів було досягнуто успіху в 9 випадках зі стабільною проліферацією клітин, які експресували маркери нейральних СК (39 %). До 18-го пасажу експресія маркерів нервових СК та диференціація на астроцити і нейрони були збережені. Після 18-го пасажу спостерігали спонтанне старіння, диференціацію і припинення розмноження клітин. Вік пацієнта не впливав на результати культивування. На тваринній моделі інсульту був проаналізований терапевтичний ефект цих клітин. Результати свідчать про те,

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

що відкриваються перспективні експериментальні та клінічні стратегії використання автологічних нервових СК конкретного пацієнта в регенеративній медицині в майбутньому. Важливим питанням є диференціація нервових клітин із точки зору їхньої медіаторної диференціації. Розроблені протоколи для дофамінергічної диференціації плюрипотентних СК [28]. Це п’ятикроковий метод заснований на утворенні розеток (основний протокол 1) і далі протокол для утворення моношару клітин із пригніченням альтернативних шляхів розвитку зі спрямованою диференціацією плюрипотентних клітин (протокол 2). У протоколі культивування нейронів стали використовувати невеликі молекули, якими протягом 3 тижнів впливали на ней рони і спрямовували їхню диференціацію на мотонейрони (50 % випадків). При такій прискореній акселерації моторні нейрони експресували HB9, ISL1 і особливі маркери, які визначаються в природних умовах в ембріональних клітинах спинного мозку людини. Вони також виявляють спонтанну та індуковану активність і прогнозовані аксони до м’язів при їхній трансплантації в курячий спинний мозок. Цікаво, що при дотриманні цього протоколу утворюються, переважно, клітини з маркерами моторних нейронів спинного мозку, які іннервують кінцівки (FOXP1+ / LHX3- [29]. Культивовані нейральні СК можна дослідити за допомогою кількісного автоматизованого аналізу фазоконтрастного покадрового зображення. Цей протокол та супутнє програмне забезпечення відомі під назвою LEVER (lineage editing and validation). Зображення клітин, які проліферують і диференціюються, захоплюються з 5-хвилинними інтервалами протягом 5-15 годин. LEVER автоматично виокремлює, відстежує і генерує лінії СК із послідовним зображенням. LEVER узагальнює кількісні фенотипові риси розташування клітин, їхньої форми, руху і розміру. Якщо необхідно, система може включати біомолекулярні маркери з використанням флуоресценції. Для забезпечення високого пропускного контролю, LEVER включає в себе функції для швидкої ідентифікації помилок і для визначення поправки для автоматичного виявлення і корекції помилок [30]. Величезним потенціалом індукованих плюрипотентних клі тин є те, що з’явилася можливість отримання плюрипотентних

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

СК людини від будь-якого пацієнта. Генерація похідних СК па цієнта служить відмінним джерелом для розробки терапії замі ни клітин, а також для створення клітинних систем людини і моделей конкретних захворювань. Нині описуються надійні і добре відомі протоколи для диференціації плюрипотентних клі тин для клітин-попередниць нейронів, нейронів, гліоцитів і клітин нервового гребеня. Ці встановлені результати можуть бути застосовані до плюрипотентних клітинних ліній, отриманих від пацієнтів із нейродегенеративними розладами для вивчення клітин них механізмів, пов’язаних із нейродегенерацією, а та кож дослідження регенеративного потенціалу отриманих СК па цієнта [31]. Описані процедури підготовки та культивування зорового нерва дорослих щурів і запропоновані протоколи для очищення окремих популяцій гліоцитів, а саме клітин-попередниць олігодендроцитів і астроцитів. Гліальні клітини відіграють ключову роль у функції нервової системи, забезпечуючи доставку нейротрофічних факторів у нейрони, а також беруть участь у двосторонній нейрон-глія сигналізації (наприклад, вивільненні нейромедіаторів) [32]. Очні травми викликають серйозні проблеми, тому особлива увага приділяється лімбальним СК. Лікування полягає в трансплантації життєздатних донорських клітин. Для вирощування лімбальних епітеліальних СК використовуються різні субстрати. Лімбальні епітеліальні СК можуть бути вирощені на різних підкладках, таких як колаген типу IV, прямі пластикові пластини Петрі, неушкоджені і оголені амніотичні мембрани. Максимальний ріст і розмноження спостерігається при культивуванні на інтактній амніотичній мембрані [33]. Для сітківки ока протокол рекомендує спочатку культивувати циліарні епітеліальні клітини у вигляді плаваючих нейро сфер і в подальшому - у моношарі культур [34, 35]. Відкриття методів для отримання плюрипотентних СК із клітин шкіри та інших тканин дорослої людини відкрило нову еру в стовбуровоклітинних дослідженнях. Описані протоколи для диференціації плюрипотентних клітин/клітин-попередниць, які можуть бути придатні для трансплантації, а також обгово-

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

рюється використання людських індукованих плюрипотентних СК, похідних фоторецепторів для моделювання очних хвороб і скринінгу лікарських засобів [36, 37]. Протоколи культивування СК на сьогоднішній день зосереджені в базі Springer Protocols, яка є базою даних наук про життя, опубліковані в Springer Science + Media Business. Протоколи дозволяють вченим відтворити експерименти в своїй лабораторії. База Springer Protocols містить близько 18000 протоколів, більшість з яких є похідними від серії книг про методи молекулярної біології, опублікованій Humanа Press. Ця серія книг, під редакцією Джона М. Уокера із 1984 року, містить понад 400 томів і породила кілька пов’язаних книжкових серій. Springer Protocols замінила BioMed Protocols бази даних Humana Press, у січні 2008 року (http://en.wikipedia.org/wiki/Springer_Protocols). Springer Protocols складається з протоколів із багатьох серій книг Humana Press, у першу чергу методів у молекулярній біології, методів у галузі молекулярної медицини, методів у галузі біотехнології, методів у фармакології і токсикології, нейрометодів. Серед питань, які охоплюються: біохімія, біоінформатика, біотехнології, дослідження раку, клітинна біологія, генетика/ геноміка, радіологія, імунологія, інфекційні захворювання, молекулярна медицина, неврологія, фармакологія, наука про рослини, наука про білки. Веб-сайт розміщений на JournalStore платформі онлайн жур налу MPS технологій. Серед функцій, включених на сайті - пов но текстове індексування, RSS канали, закладки, збереження параметрів пошуку, коментарі для кожного протоколу, а також завантаження протоколу. Сайт також має відео протоколи, спільно з Journal of Visualized Experiments, веб-та відео-журнал біоло гічних досліджень. Відомості про протоколи дослідження СК публікуються в журналах Biomaterials, Biomedical Materials and Engineering, Tissues Eng. Part C: Methods, Nature Protocols, Methods in Molecular Biology, Current Protocols in Stem Cell Biology.

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

Література 1. Tian C. Recent research advances on markers, isolation and purification of mouse hematopoietic stem cells / С.Tian, Y.Z. Zhang // Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. - 2012. - Vol. 20(1). P. 196-199. 2. Reitsma M.J. Method for purification of human hematopoietic stem cells by flow cytometry / M.J. Reitsma, B.R. Lee, N. Uchida // Methods Mol. Med. - 2002. - Vol.63. - P. 59-77. 3. Gur-Cohen S. Quantifying hematopoietic stem and progenitor cell mobilization / S. Gur-Cohen, K. Lapid, T. Lapidot // Methods Mol. Biol. - 2012. - Vol. 904. - P. 15-35. 4. Pesek G. Hematopoietic stem cell mobilization: a clinical protocol / G. Pesek, M. Cottler-Fox // Methods Mol. Biol. - 2012.Vol. 904. - P. 69-77. 5. Wagey R. Isolation, enumeration, and expansion of human mesenchymal stem cells in culture / R. Wagey, B. Short // Methods Mol. Biol. - 2013. - Vol. 946. - P. 315-334. 6. Taylor S.E. Collection and propagation methods for mesenchymal stromal cells / S.E. Taylor, P.D. Clegg // Vet. Clin. North. Am. Equine Pract. - 2011. - Vol. 27(2). - P. 263-274. 7. Kimlin L. Cellular populations isolated from newborn mouse skin including mesenchymal stem cells / L. Kimlin, V. Virador // Methods Mol. Biol. - 2013. - Vol. 989. - P. 217-233. 8. GMP-compliant isolation and large-scale expansion of bone .. marrow-derived MSC / N. Fekete, M.T. Rojewski, D. Furst [et al.] // PLoS One. - 2012. - Vol. 7(8). - P. e43255. 9. Стовбурові клітини строми кісткового мозку: культивування, хондрогенне диференціювання та використання в артрології / О.О. Коструб, В.І. Грищенко, О.Ю. Петренко [та інш.] // Травма. - 2008. - Том 9, №1. - С. 13-18. 10. Oldershaw R.A. Cell sources for the regeneration of articular cartilage: the past, the horizon and the future / R.A. Oldershaw // Int. J. Exp. Pathol. - 2012. - Vol. 93(6). - P. 389-400. 11. Benz K. Maintenance of «stem cell» features of cartilage cell sub-populations during in vitro propagation / K. Benz, C. Stippich, C. Freudigmann // J. Transl. Med. - 2013. - Vol. 11(1). - P. 27.

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

12. Tissue engineering: revolution and challenge in auricular cartilage reconstruction / L. Nayyer, K.H. Patel, A. Esmaeili [et al.] // Plast. Reconstr. Surg. - 2012. - Vol. 129(5). - P. 1123-1137. 13. High plasticity of pediatric adipose tissue-derived stem cells: too much for selective skeletogenic differentiation? / L. Guasti, W. Prasongchean, G. Kleftouris [et al.] // Stem Cells Transl. Med. 2012. - Vol. 1(5). - P. 384-395. 14. Treatment of critical defects produced in calvaria of mice with mesenchymal stem cells / B. S. Monteiro, N.M. Argôlo-Neto, N.B. Nardi [et al.] // An. Acad. Bras. Ci^enc. - 2012. -Vol. 84, №3.Print version ISSN 0001-3765. 15. Danoviz M.E. Skeletal muscle satellite cells: background and methods for isolation and analysis in a primary culture system / M.E. Danoviz, Z. Yablonka-Reuveni // Methods Mol. Biol. - 2012.Vol. 798. - P. 21-52. 16. Left atrial appendages from adult hearts contain a reservoir of diverse cardiac progenitor cells / J.V. Leinonen, A.K. Emanuelov, Y. Platt [et al.] // PLoS One. - 2013. - Vol. 8(3). - P. e59228. 17. Differentiation of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells into cardiomyocytes / P.H. Carvalho, A.P. Daibert, B.S. Monteiro [et al.] // Arq.Bras.Cardiol. - 2013. - Vol. 100(1). - P. 82-89. 18. Extracellular Matrix Promotes Highly Efficient Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. The Matrix Sandwich Method / Z. Jianhua, K. Matthew, F. G. Wilson [et al.] // Circ. Res. - 2012. - Vol. 111. - P. 1125-1136. 19. Leelahavanichkul K. Oral and pharyngeal epithelial keratinocyte culture / K. Leelahavanichkul, J.S. Gutkind // Methods Mol. Biol. - 2013. - Vol. 945. - P. 67-79. 20. Isolation and in vitro characterisation of dental pulp stem cells from natal teeth / E. Karaöz, B.N. Dogan, A. Aksoy [et al.] // Histochem. Cell Biol. - 2010. - Vol. 133(1). - P.95-112. 21. Average cell viability levels of human dental pulp stem cells: an accurate combinatorial index for quality control in tissue engineering / M.A. Martin-Piedra, I. Garzon, A.C. Oliveira [et al.] // Cytotherapy. - 2013. - Vol. 15(4). - P. 507-518. 22. Karamzadeh R. Isolation, characterization and comparative differentiation of human dental pulp stem cells derived from

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

permanent teeth by using two different methods / R. Karamzadeh, M.B. Eslaminejad, R. Aflatoonian // J. Vis. Exp. - 2012. - Vol. 24(69). - P. 4372. 23. Izumi K. Enrichment of oral mucosa and skin keratinocyte progenitor/stem cells // K. Izumi, C.L. Marcelo, S.E. Feinberg // Methods Mol. Biol. - 2013. - Vol. 989. - P. 293-303. 24. Prospective isolation of adult neural stem cells from the mouse subependymal zone / J. Fischer, R. Beckervordersandforth, P. Tripathi [et al.] // Nat Protoc. - 2011. - Vol. 6(12). - P. 1981-1989. 25. Louis S.A. Methods to culture, differentiate, and characterize neural stem cells from the adult and embryonic mouse central nervous system / S.A. Louis, C.K. Mak, B.A. Reynolds // Methods Mol. Biol. - 2013. - Vol. 946. - P. 479-506. 26. Shi Y. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks / Y. Shi, P. Kirwan, F.J. Livesey // Nat. Protoc. - 2012. - Vol. 7(10). - P. 1836-1846. 27. Experimental and clinical factors influencing long-term stable in vitro expansion of multipotent neural cells from human adult temporal lobes / K.M. Joo, B.G. Kang, J.Y. Yeon [et al.] // Exp. Neurol. - 2013. - Vol. 240. - P. 168-177. 28 Dopaminergic differentiation of human pluripotent cells / L.F. Boyer, B. Campbell, S. Larkin [et al.] // Curr. Protoc. Stem Cell Biol. - 2012. - Chapter 1:Unit1H. - P. 6. 29. Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells / M.W. Amoroso, G.F. Croft, D.J. Williams [et al.] // J. Neurosci. - 2013. - Vol. 33(2). - P. 574-586. 30. Vertebrate neural stem cell segmentation, tracking and lineaging with validation and editing / M. Winter, E. Wait, B. Roysam [et al.] // Nat. Protoc. - 2011. - Vol. 6(12). - P. 1942-1952. 31. Denham M. Neural differentiation of induced pluripotent stem cells / M. Denham, M. Dottori // Methods Mol Biol. - 2011. Vol. 793. - P. 99-110. 32. Skaper S.D. Culture of purified glial cell populations from optic nerve / S.D. Skaper // Methods Mol. Biol. - 2012. - Vol. 846.P. 131-145. 33. Comparison of ex vivo cultivated human limbal epithelial stem cell viability and proliferation on different substrates / A.

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Chakraborty, J. Dutta, S. Das [et al.] // Int. Ophthalmol. - 2013. Vol. 33(6). - P. 665-670. 34. Sphere formation of ocular epithelial cells in the ciliary body is a reprogramming system for neural differentiation // R. Kohno, Y. Ikeda, Y. Yonemitsu [et al.] // Brain Res. - 2006. – Vol. 1093(1). – P. 54-70. 35. Isolation and culture of adult ciliary epithelial cells, previously identified as retinal stem cells, and retinal progenitorcells // S. Gualdoni, M. Baron, J. Lakowski [et al.] // Curr. Protoc. Stem Cell Biol. – 2011. – Chapter 1(Unit 1). - P. 4. 36. Boucherie C. Induced pluripotent stem cell technology for generating photoreceptors / C. Boucherie, J.C. Sowden, R.R. Ali // Regen. Med. - 2011. - Vol. 6(4). - P. 469-479. 37. Brief report: self-organizing neuroepithelium from human pluripotent stem cells facilitates derivation of photoreceptors / C. Boucherie, S. Mukherjee, E. Henckaerts [et al.] // Stem Cells. 2013. - Vol. 31(2). - P. 408-414. Уже відомі позитивні результати вирощування органоподібних структур печінки, трахеї, кісток, підшлункової залози, клапанів серця та імплантів судин, рогівки ока. http://www.hemafund.com/News/hemafund_science/ SUChASNI-PIDHODI-DO-BIOINZhENERIYi-ORGANIV-NA-OSNOVISTOVBUROVIH.html

1.5. Тканинна біоінженерія Через тканинну несумісність існують імунологічні проблеми з виживанням і відторгненням трансплантата. Не менш важливою проблемою є нестача органів для трансплантації через етичні і правові питання. Тому активізуються дослідження в галузі тканинної біоінженерії. Загальними принципами тканинної і органної інженерії є отримання СК та їх вирощування на трьохвимірній матриці з метою розвитку тканини і органа. Джерелом СК є різні види стовбурових та клітин-попередниць, які можуть диференціюватися до зрілих клітин. Матрицею в цьому процесі виступають децелюляризовані мембрани, які отримані з тканин тварин чи трупів людей або полімерний матеріал.

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

Останнім часом досягнення в галузі децелюляризації органів дозволили виготовлення каркасу для інженерії нових органів. Ці «будівельні ліси», що складаються з позаклітинного матриксу натурального походження, забезпечують проходження біологічних сигналів і підтримують мікроархітектоніку органа, включаючи інтактність судинної системи, яку можна інтегрувати в кровоносну систему реципієнта. Методи децелюляризації призвели до створення каркасу багатьох органів, зокрема серця, печінки, легенів і нирок. Водночас, як експериментальні дослідження, пов’язані з використанням таких каркасів органів є обнадійливими, до застосування цілого біоінженерно створеного органа в клініці ще далеко. Дослідники наблизилися до високої ефективності розроблених методів децелюляризації цілих органів - серця, легень, печінки і нирки [1 - 3]. Перспектива бачиться в безпечних методах перепрограмування власних клітин пацієнта з безпосередньою диференціацією різних типів клітин, які необхідні для заміни органа. Подальше заселення ними натуральних, синтетичних та/або децелюляризованих каркасів органів стає реальною можливістю [4]. Ідеальним для трансплантації є новий орган, в якому відтворені анатомічна (форма, розміри, частини) і гістологічна будова (клітини і міжклітинна речовина) із виконанням ним його специфічних функцій. Захворювання печінки стали однією з найбільш важливих причин захворюваності та смертності в світі. Проблеми клітинної терапії і трансплантації печінки розробляються і ці два варіанти лікування добре сприймаються лікарями. Тим не менш, брак клітинних джерел у цитотерапії і відсутність печінки донора в трансплантації печінки є основною перешкодою для виконання цих лікувальних методів [5]. Тому найпершим завданням є виявити нові витоки екстра-печінкових клітин. Ряд недавніх досліджень показують, що позапечінкові мезенхімні СК із різних тканин можуть бути диференційовані в гепатоцити. Кілька протоколів печінкової диференціації мезенхімних СК були опубліковані в останні роки, на основі клітинної стимуляції екзогенними цитокінами/факторами росту, спільного культивування плодових або дорослих гепатоцитів, 2-х або 3-хвимірні (2D, 3D) матриці на ко-

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

ристь диференціації. При цьому слід дотримуватися певних мінімальних вимог для забезпечення терапевтичного успіху: умови утворення клітин у культурі з маркерами гепатоцитів, мінімальна або повна відсутність імуногенності в реципієнта. Зроблені спроби вивчити СК із кісткового мозку, пуповини і жирової тканини, які мають печінковий регенеративний потенціал і володіють можливостями диференціації в гепатоцити [6]. Їх можна використати для створення печінки в цілому на децелюляризованому органі. Протоколи децелюляризації повинні відповідати конкретним вимогам щодо того чи іншого органа зі збереженням його тривимірної будови. А.М. Kajbafzadeh et al. [7] порівняли п’ять різних протоколів децелюляризації печінки вівці при отриманні органа, схожого за формою і розмірами до печінки, оцінили збереження судинної мережі, визначили найправільніший метод стерилізації матеріалу, механічні властивості (міцність на розрив і шовного матеріалу) отриманого каркасу. Автори вважають, що визначення найбільш адекватних методів децелюляризації і стерилізації для кожного органу разом з оцінкою механічних властивостей отриманого каркасу є головними кроками для отримання ефективних штучних органів в осяжному майбутньому. H. Yagi et al. [8] описали протокол децелюляризації печінки свині з допомогою методу перфузії при збереженні компонентів позаклітинного матриксу, функціональних властивостей судин, шляхів дренажу жовчі, який може бути клінічно значущим. Крім того, ізольовані гепатоцити помістили в децелюляризовану печінку, використовуючи органну культуру людини. Це дослід ження підкреслює принцип використання тривимірного каркасу, наближеного до розмірів у людини для трансплантації при лікуванні захворювань печінки. Тканинна інженерія відкриває великі перспективи для лі ку вання недостатності органів у межах шлунково-кишкового тракту, таких як термінальна стадія захворювання печінки, недостатності підшлункової залози, кишки і діабету І типу. Викори стання автологічних клітин скоротить потребу в довгостроковій імуносупресії, усуваючи цю перешкоду при трансплантації [9]. Тканинна інженерія судин для їхньої імплантації розвивається з оглядом на їх біологічні та біомеханічні характеристики,

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

наближені до відповідних типів судин. Кінцевою метою дослід ження P. Menu et al. [10], був підбір замінників кровоносних судин, які можуть зберігатися протягом тривалого часу в спеціальних умовах судинного банку. У перших спробах намагалися розробити процедури, що дозволяють покривати поверхні ендотеліальними клітинами, сприяти їхній диференціації та адгезії на судинних замінниках. У 2003 році була проведена оцінка нової модифікації покриття внутрішньої поверхні кровоносних судин, на тлі основи з поліелектролітної плівки з утворенням пошарової структури, що являє собою простий і універсальний спосіб для проектування поверхонь із високими специфічними властивостями. Якщо використати для заселення матриці циркулюючі СК/клітини-попередниці, вони можуть диференціюватися до зрілих судинних клітин, що відкриває нові можливості в судинній техніці. Згідно існуючих протоколів, витрачається не менше одного місяця для розвитку гладких міоцитів і ендотеліальних клітин, які до двох місяців зливаються в моношар клітин. Клітини-попередниці, вирощені на поліелектролітній плівці, показали розвиток зрілих і функціональних судинних клітин тільки в 14-денній культурі. Ці клітини мали морфологічно зовнішній вигляд зрілих і здорових клітин з експресією маркерів, характерних для диференційованих клітин, близьких до зрілих клітин. За останніми даними, розроблено нанофібрилярний колагеновий каркас, який імітує структуру колагенових пучків у кровоносних судинах, а також досліджували вплив цих матеріалів на будову ендотеліоцитів, їхні функції та виживання в природних умовах. Отримали ендотеліоцити з індукованих плюрипотентних клітин людини, культивували їх на каркасі і вони зберігали свої властивості протягом понад 28 діб, за оцінкою біолюмінесценції, при імплантації в ішемізованi тканини [11]. Виготовлення 3D тканин, які зберігають оригінальні функції тканини/органа в пробірці має вирішальне значення для оптимальної тканинної інженерії та регенеративної медицини. Отримання 3D-тканини також сприяє створенню в пробірці тканини/ органу моделей для скринінгу лікарських засобів. У лабораторії Y. Haraguchi et al. [12] розроблений протокол для виготовлення

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

3D тканин клітинної інженерії у вигляді пластинок. Тривимірна серцева тканина, макроскопічно виготовлена шляхом укладання таких пластів серцевих клітин, пульсувала спонтанно і синхронно. Завдяки цьому протоколу, можна виготовити інші тканини, включаючи 3D капіляроподібні преваскулярні мережі з ендотеліальних клітин, затиснутих між шарами клітин. Стовбурові технології укладання пластів обіцяють забезпечити створення в пробірці моделі тканини/органу і сприяти більш ефективній терапії для лікування недостатності тканини чи органу. Для застосування СК у клітинній терапії захворювань органів дихання було встановлено кілька протоколів для диференцію вання СК в альвеолярні епітеліальні клітини, які вимагають високого професіоналізму втручання оператора і водночас мають низький результат утворення зрілих цільових клітин. При цьому було показано, що з використанням кондиціонеру A549 і шляхів інтегрування класичними кроками диференціації ембріональні СК можуть бути спрямовані в епітеліоцити дистальних дихальних шляхів шляхом інкапсуляції в гідрогелі (3D культура) у ротаційному біореакторі. Пневмоцити I і II типу (із виходом 50 % пневмоцитів ІІ типу) і клітини Клара були продемонстровані за допомогою експресії аквапорин5, сурфактантного протеїну С і секреторного білка клітин Клара. Автори визначили клітини-мішені вже в 5-денній культурі, які стабільно підтримувалися диференційованими в пробірці протягом 100 діб. Електронна мікроскопія продемонструвала мікроворсинки і внутрішньоклітинні пластинчасті тільця (у пневмоцитах ІІ типу) і методом флуоресцентного фарбування підтвердився активний процес екзоцитозу цих пластинчастих тілець у диференційованих клітинах ІІ типу. Коли ці клітини культивували в статичних умовах у колбі (2D структура), вони зберігали характерний для пневмоцитів II типу фенотип і морфологію. Дослідники запропонували протокол інтегрованої біотехнологічної, більш короткотривалої диференціації, із більш низькою вартістю, без використання факторів росту, із високим ступенем відтворюваності і високої фенотипової і функціональної стабільності, які піддаються автомати зації і прямують до широкомасштабних технологій для майбутнього клінічного застосування [13].

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

За останні 5 років ми стали свідками нових підходів та початку клінічного застосування тканинних інженерних конструкцій для відновлення структури і функції органів дихання. Велика увага приділяється основам регенераційної медицини трахеї і легень і називаються ключові елементи, необхідні для регенерації тканин, у тому числі СК, біоматеріали і позаклітинний матрикс. Щодо трахеї, то проведені пілотні клінічні дослідження з використанням різних комбінацій клітин і каркасів вимагають оптимізації та стандартизації. Для легень власне тільки стовбуровоклітинні підходи були клінічно апробовані, але стає очевидним, що комбінації клітин і каркасу необхідні для успішного відновлення архітектури і функції легень [14, 15]. Термінальна стадія ниркової недостатності є важкою хворобою, яка вимагає донорської трансплантації органу. У даний час число донорських органів задовільняє менш ніж п’яту частину попиту, тому методи регенеративної медицини були запропоновані в якості потенційних терапевтичних альтернатив. Один із таких підходів біоінженерії для цього великого і складного за структурою органу є поєднання функціональних ниркових клітин із децелюляризованим каркасом нирки свині. Ефективність виділення CК та біосумісність збереженої матриці свині, а також відтворюваність каркасу, мають вирішальне значення для успіху цього підходу. D.C. Sullivan et al. [16] оцінювали ефективність 0,25 % і 0,5 % додецилсульфат натрію і 1 % Тритон Х-100 при децелюляризації нирки дорослої свині. При цьому способі децелюляризації органів мікроархітектоніка зберігається інтактною, включаючи ниркові судини і компоненти позаклітинного матриксу. Оброблений додецилсульфатом натрію децелюляризований каркас був нецитотоксичним до СК нирки людини. Таким чином, розроблено експрес-метод децелюляризації, який може бути використаний для інших великих органів, і це є важливим кроком на шляху розвитку органної трансплантації з використанням методів тканинної інженерії. При пошкодженнях периферійних нервів через травму або хворобу часто виникає необхідність хірургічного втручання. Хоча золотим стандартом для такого «ремонту» до цього часу залишається використання автотрансплантата нерва, розробле-

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

ні і оцінені альтернативні підходи, які не вимагають інвазивних втручань - збір автологічної нервової тканини. Дослідники розробили протокол виготовлення нейронних інженерних трубчастих каркасів при відновленні сідничого нерва в щурів, використовуючи індуковані СК клітини жирової тканини, диференційовані до фібробластів або нейронів і спільно культивовані в тривимірний (3-D) трубчастий каркас нерва. Додавання аскорбінової кислоти-2-фосфату і фактору росту фібробластів2 до середовища сприяло активації 90 % популяції клітин, що було підтверджено експресією колагену І. Диференційовані фібробласти формують моношар, який підлягає деламінації і формуванню 3-D трубчастого каркасу. Нейросфери були сформовані шляхом культивування індукованих клітин у безсироватковому нейробазальному середовищі з додаванням епідермального фактору росту і фактору росту фібробластів. При додаванні по 10 нг останніх нейросфери ставали більшими і численнішими. Після диференціації гліальних клітин, що було підтверджено за допомогою експресії S100, отриманий моношар фібробластів і нейросфери спільно культивували для виготовлення 3-D трубочок нервової тканини. Ці подібні до нерва структури з включенням гліальних клітин, які були зв’язані з регенеруючими аксонами, можуть зробити їх ефективною технологією для ремонту критичних проміжків у периферійному нерві після його пошкодження [17]. K.W. McCracken et al. [18] рекомендують протокол для створення 3D тканин кишки людини (так званих органоїдів) у пробірці з плюрипотентних СК людини. Для генерації кишкових органоїдів плюрипотентні СК спочатку диференціювали в FOXA2+ Sox17+ клітини ендодерми шляхом обробки клітин з активіном А протягом 3 днів. Після індукції ендодерми плюрипотентні СК перетворювали в CDX2+ клітини середньої і задної кишки з використанням FGF4 і WNT3a. У цей етап формування, 3D сфероїдні бруньки середньої або задньої кишки були прикріплені до моношару культури епітелію. 3D сфероїди в подальшому культивували в Матригелі з проінтестинальними факторами росту. Вони розмножувалися протягом 1-3 місяців, розвивалися в кишкову тканину разом із кишковим епітелієм

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

і мезенхімою, включаючи всі основні кишкові типи клітин. На сьогоднішній день це єдиний спосіб ефективного спрямування диференціації плюрипотентних СК у 3D кишкові тканини людини in vitro. Виділення епітеліальних субпопуляцій, у тому числі СК і клітин-попередниць стало стандартною технікою в останні роки, але перевага тих чи інших методів не завжди зрозуміла. Три провідні лабораторії, що працюють із популяцією СК грудної залози, узагальнили свої методи, підкреслили їхні подібності та відмінності, а також обговорили обгрунтування вибраних ними підходів. Ці відомості допоможуть створенню робочих протоколів для виділення і вирощування клітин грудної залози з метою усвідомленого вибору щодо методів, які вони повинні використовувати [19]. Пошкодження пігментного епітелію сітківки тягне за собою багато очних хвороб, у тому числі вікової макулярної дегенерації, і, отже, виділення та культивування цих клітин від недавно померлої дорослої людини- донора є ідеальним джерелом для дослідження хвороб. Пігментні епітеліоцити сітківки дорослих можуть бути використані в якості джерела клітин для лікування трансплантацією дегенеративних захворювань, але ймовірно, вимагають спочатку культивування в пробірці клітин, отриманих від пацієнтів. У попередні роки були розроблені протоколи для виділення пігментних клітин сітківки від дорослих донорів, однак без належної ефективності збільшення кількості клітин та їхньої виживаності. Описується протокол, оптимізований для тканин дорослої людини, що дає можливість культивування клітин пігментного епітелію з морфологічними, фенотиповими і функціональними характеристиками, аналогічними до свіжовиділених пігментоцитів. Ці клітини можна культивувати протягом декількох місяців без старіння, повної загибелі клітин або морфологічних змін. Протокол займає близько місяця, щоб отримати функціональний моношар пігментних клітин сітківки з точними морфологічними характеристиками і нормальною експресією білка, що підтверджено імуногістохімічним аналізом, профілем експресії РНК за допомогою кількісної ПЦР і визначенням трансепітеліального опору [20].

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Є повідомлення про формування перехідного самоорганізованого нейроепітелію з людських ембріональних СК, які культивували разом із позаклітинним матриксом. Це було достатнім, щоб викликати швидке їх перетворення на клітини-попередниці сітківки протягом 5 діб, які мають здатність диференціюватися дуже ефективно в Crx+ фоторецепторні попередники протягом 10 днів, а потім у них з’являється подібність до паличкового фоторецептора протягом 4 тижнів. Спрямована диференціація у фоторецептори, також можлива з індукованих плюрипотентних СК, полегшуючи використання клітинних ліній від конкретного пацієнта [21]. Література 1. Remlinger N.T. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion / N.T. Remlinger, P.D. Wearden, T.W.Gilbert // J. Vis. Exp. - 2012. - Vol. 70. - P. e50059. 2. Decellularization for whole organ bioengineering / J.T. Arenas-Herrera, I.K. Ko, A. Atala [et al.] // Biomed. Mater. 2013.- Vol. 8(1). - P. 014106. 3. He M. Comparison of methods for whole-organ decellularization in tissue engineering of bioartificial organs // M. He, A. Callanan // Tissue Eng. Part B Rev. - 2013. - Vol. 19(3). - P. 194-208. 4. Murphy S.V. Organ engineering-combining stem cells, biomaterials, and bioreactors to produce bioengineered organs for transplantation // S.V. Murphy, A. Atala // Bioessays. - 2013. Vol. 35(3). - P. 163-172. 5. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement / A. Soto-Gutierrez, L. Zhang, C. Medberry [et al.] // Tissue Eng. Part C Methods. - 2011. - Vol. 17(6). - P. 677-686. 6. Research on stem cells as candidates to be differentiated into hepatocytes / L. Zhang, J.S. Ye, V. Decot [et al.] //Biomed. Mater. Eng. - 2012. - Vol. 22(1-3). - P. 105-111. 7. Determining the Optimal Decellularization and Sterilization Protocol for Preparing a Tissue Scaffold of a Human-Size Liver Tissue / А.М. Kajbafzadeh, N. Javan-Farazmand, M. Monajemzadeh [et al.] // Tissue Eng. Part C. Methods. - 2013. - Vol. 19(8). - P. 642-651.

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

8. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach / H. Yagi, K. Fukumitsu, K. Fukuda [et al.] // Cell Transplant. - 2013. - Vol. 22(2). - P. 231-242. 9. Carbone M. How regenerative medicine and tissue engineering may complement the available armamentarium in gastroenterology? / M. Carbone, J. Lerut, J. Neuberger // World J. Gastroenterol. 2012. - Vol. 18(47). - P. 6908-6917. 10. Menu P. Toward completely constructed and cellularized blood vessels / P. Menu, J.F. Stoltz, H. Kerdjoudj // Biomed. Mater. Eng. - 2012. - Vol. 22(1-3). - P.17-20. 11. The modulation of endothelial cell morphology, function, and survival using anisotropic nanofibrillar collagen scaffolds / N.F. Huang, J. Okogbaa, J.C. Lee [et al.] // Biomaterials. - 2013. Vol. 34(16). - P. 4038-4047. 12. Fabrication of functional three-dimensional tissues by stacking cell sheets in vitro / Y. Haraguchi, T. Shimizu, N. Sasagawa [et al.] // Nat. Protoc. - 2012. - Vol. 7(5). - P. 850-858. 13. Development of a novel three dimensional, automatable and integrated bioprocess for the differentiation of embryonic stem cells into pulmonary alveolar cells in a rotating vessel bioreactor system / N. Siti-Ismail, A. Samadikuchaksaraei, A.E. Bishop [et al.] // Tissue Eng. Part C Methods. - 2012. - Vol. 18(4). - P. 263-272. 14. Song J.J. Bioartificial lung engineering / J.J. Song, H.C. Ott // Am. J. Transplant. - 2012. - Vol. 12(2). - P. 283-288. 15. Regenerative medicine for the respiratory system: distant future or tomorrow’s treatment? / K.M. Brouwer, H.R. Hoogenkamp, W.F. Daamen [et al.] // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 2013. Vol. 187(5). - P. 468-475. 16. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system / D.C. Sullivan, S.Y. Mirmalek-Sani, D.B. Deegan [et al.] // Biomaterials. - 2012. Vol. 33(31). - P.7756-7764. 17. Adams A.M. Use of adipose-derived stem cells to fabricate scaffoldless tissue-engineered neural conduits in vitro / A.M. Adams, T.M. Arruda, L.M. Larkin // Neuroscience. - 2012. - Vol. 201. - P. 349-356.

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

18. Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro / K.W. McCracken, J.C. Howell, J.M. Wells [et al.] // Nat. Protoc. - 2011. - Vol. 6(12). - P. 1920-1928. 19. Isolation of mouse mammary epithelial subpopulations: a comparison of leading methods / M.J. Smalley, H. Kendrick, J.M. Sheridan [et al.] // J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. - 2012. Vol. 17(2). - P. 91-97. 20. The culture and maintenance of functional retinal pigment epithelial monolayers from adult human eye // T.A. Blenkinsop, E. Salero, J.H. Stern [et al.] // Methods Mol. Biol. - 2013. - Vol. 945.- P. 45-65. 21. Brief report: self-organizing neuroepithelium from human pluripotent stem cells facilitates derivation of photoreceptors / C. Boucherie, S. Mukherjee, E. Henckaerts [et al.] // Stem Cells. 2013. - Vol. 31(2). - P. 408-414.

1.6. Проблема токсичності і стандартизації стовбурових клітин Слід зауважити, що мобілізовані СК кісткового мозку або їх цитокіни можуть стати серйозною і потенційно небезпечною для життя проблемою з точки зору токсичності. Етіологія токсичності може бути пов’язана з обсягом інфузії, диметилсульфоксидом або бактеріальною чи вірусною інфекцією клітинних продуктів. Токсичними проявами є гіпотонія чи гіпертонія, порушення ритму серця і дихальна недостатність, що вимагає невідкладної уваги кваліфікованого лікаря. Токсичні ефекти можуть бути загальними і включати лихоманку, озноб, нудоту і блювоту. Лихоманка може бути викликана інфекцією або цитокінами, звільненими з лейкоцитів та їхніх продуктів. Інші можливі побічні ефекти можуть бути обумовлені реактивами, які використовані в процесі обробки [1]. При стандартних методах вирощування в пробірці культур клітин використовують реагенти тваринного походження, яких слід уникати в клінічній практиці через їхню небезпечність [2]. Одним із головних побічних дій ксеногенної культури є вплив на пацієнта чужорідних патогенів або антигенів, які викликають за-

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

хворювання або імунну реакцію. Ці небажані продукти можуть надходити від ксеногенної матриці, яка використовується при вирощенні СК, або від компонентів тваринного походження, які застосовуються при цьому. J. Kaur et al. [3] описали стандартизовані протоколи для отримання послідовних та відтворюваних результатів для культивування плюрипотентних СК із допомогою фідерних або систем, вільних від ксенобіотиків. Стандартизація досліджень СК є складним аспектом, хоча намітився прогрес для підвищення надійності та відтворюваності протоколів методів культивування та диференціації клітин. Життєво важливими є питання забезпечення досліджень клітинними лініями. СК ресурсних центрів або «банків» СК можуть відіграти важливу роль у доставці плюрипотентних СК, не забруднених іншими клітинами і мікробами, для потреб дослідників. Ці основні елементи сприятимуть високій якості і порівнювальності наукових публікацій. «Банки» СК можуть також дати пораду щодо вибору ліній плюрипотентних СК, оскільки вони розташовують, зберігають кращі лінії клітин і здійснюють контроль якості стовбурових клітинних ліній [4]. Нові стандартизовані методи в умовах культивування, такі як використання альтернатив для фетальної телячої сироватки, стан дартизована щільність покриття або використання біореакторів буде сприяти подальшій стандартизації виробничого процесу [5]. Розвиток індукованих плюрипотентних СК за допомогою форсованої експресії певних наборів транскрипційних чинників у галузі стовбуровоклітинних досліджень докорінно змінився. Два важливих обмеження для досліджень застосування ембріональ них СК, а саме, етичні та імунологічні питання, можна обійти використанням індукованих плюрипотентних СК. Із часу дослід ження їх перших взірців величезні зусилля були спрямовані на розробку методів для підвищення ефективності процесу і зниження ступеню геномної модифікації, пов’язаної з процедурами перепрограмування. Установлені протоколи клон-видової диференціації, які розроблені для ембріональних СК, застосовуються в процесах індукованих плюрипотентних СК, оскільки вони мають великий потенціал у регенеративній медицині для клітинної терапії хвороб або моделювання для розробки ліків або для

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

фундаментальної науки, і, не в останню чергу, випробування на токсичність. Нині розглядаються зусилля, спрямовані на практичний розвиток диференційованих нервових/серцевих ліній і подальше використання цих індукованих плюрипотентних СК для розробки ліків та випробування на токсичність [6]. Література 1. Kaufman J.L. Toxicities of mobilized stem cell infusion / J.L. Kaufman // Methods Mol. Biol. - 2012. - Vol. 904. - P. 111-115. 2. Development of fully defined xeno-free culture system for the preparation and propagation of cell therapy compliant human adipose stem cells / M. Patrikoski, M. Juntunen , S. Boucher [et al.] // Stem Cell Res. Ther. - 2013. - Vol. 4(2). - P. 27. 3. Methods for culturing human embryonic stem cells in a xenofree system / J. Kaur, M.L. Tilkins, R. Eckert [et al.] // Methods Mol. Biol. - 2013. - Vol. 997. - P. 115-126. 4. Stacey G. Banking stem cells for research and clinical applications / G. Stacey // Prog. Brain Res. - 2012. - Vol. 200. - P. 41-58. 5. Verbeek R. Generation of mesenchymal stem cells as a medicinal product in organ transplantation / Verbeek R. // Curr. Opin. Organ Transplant. - 2013. - Vol. 18(1). - P. 65-70. 6. Deshmukh R.S. Drug discovery models and toxicity testing using embryonic and induced pluripotent stem-cell-derived cardiac and neuronal cells / R.S. Deshmukh, K.A. Kovcs, A. Dinnys // Режим доступу до електронного ресурсу: Stem Cells Int. - 2012. 2012. - 379569.

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

Нобелівську премію в медицині присудили дослідникам стовбурових клітин. Опубліковано 9.10.2012. Вручення Нобелівської премії з медицини відкрило тиждень оголошення лауреатів 2012 року. Нагорода дісталася британцеві Джону Гердону і японцеві Сінье Яманака за дослідження стовбурових клітин. www.kommersant.ru

1.7. Методи отримання індукованих стовбурових клітин Завдяки науковим дослідженням Гердона і Яманака суспільство по-новому подивилося на розвиток клітин і організмів, повідомляється на сайті Нобелівського комітету. Учені довели, що, хоча геном клітин і зазнає змін у процесі розвитку, ці зміни не є незворотними. Так, наприклад, отримавши клітини від пацієнтів із різними захворюваннями, фахівці зможуть вивчити їх і зрозуміти, у чому їх відмінність від здорових. Такі клітини є безцінним інструментом для розуміння механізмів хвороби і надають нові можливості для розвитку медичного лікування. Те, що в 2012 році Нобелівська премія присуджена за дослідження в галузі СК, цілком передбачуване, вважає начальник відділу науки журналу «Російський репортер» Григорій Тарасевич: «Дослідження зі стовбуровими клітинами ведуться по всьому світу дуже успішно і в дуже різних напрямках. Проти них можуть виступати тільки окремі сектантські угруповання, що не мають відношення до науки. Принаймні, багато вчених так вважають це цілком передбачувано. Це велика річ - можливість отримува ти СК, які не визначилися в своєму призначенні, із клітин вже старих, справді, значуща». Можна було очікувати на успіхи в галузі регенеративної медицини, проте виникають проблеми з медичними процедурами за участю ембріональних СК людини. По-перше, це питання біоетики, тому що для створення ембріональних СК використовується запліднена яйцеклітина. Крім того, при застосуванні ембріональних клітин у регенеративній медицині, отримувачі піддаються впливу імунодепресантів для запобігання відторгнення трансплантата. Використання індукованих плюрипотентних СК дозволить вирі-

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

шити вищезазначені проблеми. Плюрипотентні СК перепрограмовують із диференційованих соматичних клітин, повертаючи їх до недиференційованого стану, подібного для ембріональних СК. Ембріональні СК та індуковані плюрипотентні СК визначаються як плюрипотентні і здатні диференціюватися в похідні трьох зародкових листків (ендодерми, мезодерми і ектодерми), а також до самооновлення, що було підтверджено експресією відповідних генів. На сьогодні методи перепрограмування включають: ядерну трансплантацію, злиття клітин, перепрограмування з використанням клітинних екстрактів і пряме перепрограмування. Тим не менше, механізм клітинного перепрограмування залишається незрозумілим. Індукція плюрипотентності в соматичних клітинах включає в себе видалення виниклих епігенетичних змін, що призводять до стану недиференційованості клітин, подібного до ембріонального. Індукція плюрипотентних СК із соматичних клітин (перепрограмування), як очікується, буде застосовуватися в регенеративній медицині, а також для лікування різних захворювань, включаючи рак. Є кілька способів отримання плюрипотентних СК [1] (рис. 1). Ядерна трансфекція. Уперше ядерне перенесення було за пропоновано H. Speman [2] у дослідах на тритонах і виявило ся невдалим. Для ссавців, перші ядерні трансфекції виконані в 1986 році шляхом перенесення ядра бластомерів на стадії 4-8-клітинного ембріона вівці в енуклейовані незапліднені яйця, а в наступному році клонували мишей шляхом перенесення ядер 8-клітинного ембріона миші в енуклейовані 2-клітинні ембріони [3, 4]. B 1997 році клони соматичних клітин були отримані за допомогою клітин молочної залози дорослої вівці [5]. Від 1998 по 2003 роки клонували мишей, кіз, свиней і кролів, велику рогату худобу з допомогою цього методу з великої кількості типів соматичних клітин (лейкоцитів, гепатоцитів, нейронів, міоцитів, лімфоцитів і статевих клітин). Ядерний трансфер перепрограмовує завдяки передачі ядер диференційованих соматичних клітин шляхом їхньої трансплантації в позбавлений ядра ооцит. Для того, щоб створити клонований ембріон без використання сперми після перенесення ядер, яйця були активовані електричним або хімічним подразненням.

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

Ядерна трансфекція Ооцит без ядра Бластоциста Соматична клітина Злиття клітин

Ембріональна стовбурова клітина

Соматична клітина

Перепрограмування з допомогою екстрактів Ек

Плюрипотентна клітина

Соматична клітина

Ембріональна стовбурова клітина Пряме перепрограмування

Соматична клітина

Транскрипційні фактори

Рис. 1. Методи перепрограмування соматичних клітин за S. Miyazaki et al. [1].

Клонований ембріон розвивається з бластоцисти, з якої ембріональні СК видаляються, а соматичні клітини можуть виробляти плюрипотентні СК і диференційовані клітини. Складністю (недоліком) цього методу є те, що для клінічного застосування повинні бути отримані незапліднені яйця та можуть виникнути

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

імунологічні відхилення через генетичні фактори від ядер, виділених із соматичних клітин і яйцеклітини. У 2007 році було повідомлено, що цей метод має низьку ефективність - тільки 2 клітини з загальної кількості (304 яйцеклітини) були успішно індуковані [6]. Злиття клітин. Злиття клітин - це інший метод перепрогра мування. Геном соматичних клітин перепрограмовується в син цитій, де поділ клітин відбувається кілька разів з ядрами ембріо нальних і соматичних клітин змішано [7], тому передбачається, що ембріональні клітини здатні перепрограмувати соматичні клітини, видаляючи їх властивості і перезаписати геном соматичних клітин із властивостями ембріональних клітин [8]. Транскрипційні фактори Oct4 і Nanog, які діють для підтримки недиференційованих властивостей, походять із геному соматичних клітин, які злилися з гібридами ембріональних СК і реактивують себе протягом 48 год [9, 10]. Було повідомлено, що плюрипотентні клітини можуть також бути отримані від мишей [7] і людини [11, 12] шляхом перепрограмування з використанням злиття клітин. У даний час невідомо, чи ядра соматичної клітини можна перепрограмувати шляхом злиття клітин тільки з цитоплазматичних елементів ембріональних СК або необхідні також ядерні елементи. Бажано вибірково видаляти тільки хромосоми ембріональних СК із ядра, але це технічно складно. Замість цього, було запропоновано метод використання ядра ембріональної СК у тимчасовому стані гетерокаріона відразу після злиття клітин, де ядра ембріональних СК і ядра соматичних клітин існують незалежно [13]. Але ще далеко до того часу, коли ця передова технологія буде використана в клінічній практиці. Перепрограмування з використанням клітинних екстрактів. Іншим методом перепрограмування є вставка клітинних екстрактів, отриманих із плюрипотентних СК, таких як ембріональні СК клітини, у соматичні клітини. Як описано в попередньому розділі «Злиття клітин», ембріональні СК мають специфічні характеристики, що дозволяє їм перепрограмувати соматичні клітини. Клітинний екстракт, хімічно виділений з ембріональних СК, складається з перепрограмувальних факторів,

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

які вступають у соматичні клітини і викликають їхню трансдиференціацію. Було повідомлено, що в 2005 році культивування HEK293 і NIH3T3 клітин із факторами, виділеними з людських ембріональних клітин карциноми NCCIT, збільшили рівні експ ресії маркерів недифференційованості, у тому числі Oct4, і про те, що клітини можуть бути стимульовані до диференціації в нейрогенні, адипогенні, остеогенні та ендотеліальні лінії [14]. Але вони не здатні диференціюватися на три зародкові листки ex vivo.Таким чином, цей метод перепрограмування може бути неповним. Прямe перепрограмування. Існують різні методи прямого перетворення, яке останнім часом привертає все більшу увагу в якості потенційної альтернативи спрямованої диференціації плюрипотентних клітин для отримання клітин даної лінії, розробляються протоколи для створення клітинних популяцій [15]. Перепрограмування шляхом додавання транскрипційних факторів. У 2006 році було повідомлено, що чотири транскрипційних фактори (Oct3/4, Sox2, C-Myc і Klf4) були введені в ембріональні фібробласти миші для створення індукованих плюрипотентних клітин [16]. Створені індуковані плюрипотентні клітини показали експресію маркерів генів ембріональних СК, таких як Nanog і Oct3/4. Мікроін’єкції з цих факторів у бластоцисту миші призвели до утворення химер миші, указуючи на те, що це були зародкові фактори, які збереглися в наступному поколінні. Наведені результати говорять про те, що плюрипотентність цих клітин була еквівалентною ембріональним СК [17]. Із того часу пряме перепрограмування широко вивчали шляхом введення цих транскрипційних та інших факторів. Плюрипотентність СК викликали в різних соматичних клітинах, включаючи фібробласти, клітини крові і кератиноцити. Отримані індуковані плюрипотентні СК привертають величезний інтерес у галузі наук про життя для перспективних застосувань у фундаментальній біології, розробці ліків та трансплантації [18]. Реалізація таких пропозицій уже відбувається. Пряме перетворення клітин шкіри в соматичні СК відкриває нові терапевтичні можливості в регенеративній медицині. X. Meng et al. [19] показали, що людські індуковані мезенхімні СК можуть бути ефективно генеровані з пуповинної крові - або з периферій-

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

ної крові дорослих - CD34+ клітин шляхом прямого перепрогра мування з одним фактором Oсt4. У присутності інгібітора GSK3 16 % Oct4-трансдукованих CD34+ клітин перетворюються в індуковані мезенхімні СК протягом 2 тижнів. Ефективність прямого перепрограмування досягалася й епісомальною вектор-опосередкованою експресією Oct4, і лентивірус вектор-опосередкованою Oct4 трансдукцією. Маркери індукованих мезенхімних СК нагадують маркери червоного кісткового мозку і володіють здатністю мультилінійної диференціації в пробірці, але мають більшу здатність до проліферації, у порівнянні з мезенхімними СК. Подібно до мезенхімних СК, імплантовані індуковані мезенхімні СК утворюють кісткову і сполучну тканини і не є онкогенними в мишей. Однак, на відміну від них, індуковані мезенхімні СК можуть утворювати м’язові волокна, що вказує на їхні потенційні функціональні переваги. Крім того виявлено, що високий рівень експресії Oct4 необхідний для початкових етапів перепрограмування і оптимального самооновлення індукованих мезенхімних СК, водночас як зниження експресії Oсt4 набуває значення при множинній диференціації. Метод буде сприяти генерації інду кованих мезенхімних СК конкретного пацієнта, що могло би знайти застосування в регенеративній медицині. Це відкриття буде сприяти розробці стратегій для перетворення клітин крові в інші типи. Нині в перепрограмуванні увага привернута до використання аптамерів (аптамери - невеликі молекули нуклеїнових кислот, які можуть виконувати функції високоспецифічних рецепторів низькомолекулярних органічних сполук) у сигнальних шляхах, зокрема поліпептидних факторів росту, а також можливості застосування аптамерів таргетингу рецептора епідермального фактора росту, обговорюються можливості використання аптамерів в таких складних шляхах, як Wnt/β-Катенін, і родині Factor-β/ Smad сигналізації [20]. Епігенетичне заглушення екзогенних генів має місце при індукційній диференціації нормальних клітин. Для отримання більшого контролю над експресією екзогенних факторів перепрограмування, нині використовують нові доксициклін-індуковані плазмідні вектори, що кодують Oct4, Sox2, с-Myc і Klf4.

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

Для забезпечення ефективного і контрольованого покоління СК за допомогою плазмідної трансфекції використано перепрограмування вектора бактеріофага φC31 attB сайт і експресію φC31 інтегразного вектора інтеграції. Для доксициклін-індукованих плюрипотентних СК характерними є іммуноцитохімічна детекція Oct4, SSEA1 і SSEA4, лужної фосфатази, метилування аналізу ендогенних Oct4 промоутера і RT-PCR аналіз ендогенних генів плюрипотентності в щурів. Були запропоновані протоколи для створення ембріоїдних тілуць і плюрипотентні клітини щурів показали можливість утворення похідних з усіх трьох зародкових листків зародка в пробірці і тератоми в природних умовах. Отримані з допомогою плазмідного вектора плюрипотентні клітини схожі на ембріональні CК щурів. Методи трансфекції ДНК, білків трансдукції і фідерно-вільного моношару культури плюрипотентних клітин можуть бути плановані в майбутньому для подальшого використання в регенеративній медицині [21]. Незрозуміло, як введення цих транскрипційних факторів породжує індукцію плюрипотентних клітин, які характеризуються такими ж рисами, як ембріональні CК. Останні звіти показують, що Oct3/4, Sox2 і Nanog низхідним шляхом можуть регулювати експресію генів, залучених в індукцію диференційованих клітин для підтримки їх недиференційованих властивостей [22, 23] і всі чотири фактори (включаючи C-Myc) викликають епігенетичні зміни, такі як модифікація хроматину та метилювання ДНК, що генерують індуковані плюрипотентні клітини. Промоутер ділянок Nanog, Oct3/4 і Fbx15, як повідомлялося, деметилюється в індукованих плюрипотентних клітинах, а також в ембріональних CK. З іншого боку, миші, вирощені з цих індукованих плюрипотентних СК наражаються на високу швидкість виникнення пухлини, тому що C-Myc, який є одним із факторів перепрограмування, відомий як онкоген. У процесі перепрограмування соматичних клітин в індуковані плюрипотентні СК, гени введені ретровірусно, зазвичай, приглушуються, але С-Myc ген може бути реактивований у генерованій пухлині [24]. Введення трьох факторів транскрипції (окрім C-Myc) також успішно створює індуковані плюрипотентні клітини і в мишей, отриманих із Myc-

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

індукованих плюрипотентних клітин, не розвивалися пухлини протягом періоду дослідження [25]. Тим не менш, ефективність індукції для перепрограмування за допомогою всього трьох факторів транскрипції (мінус C-Myc) була меншою від 1/10, що значно нижче, ніж при введенні всіх чотирьох факторів транскрипції. У 2011 році було повідомлено про перепрограмування шляхом додавання чотирьох факторів транскрипції (Oct3/4, Sox2, Klf4 і Glis1), які мали індукційну ефективність, що була такою ж або вищою, ніж у спостережуваній з іншим набором із чотирьох факторів транскрипції (у тому числі з С-Мус). У цьому випадку проблема формування пухлин, індукованих C-Myc, була відвернена. Перепрограмування шляхом додавання MicroRNAs. Для підтримки самооновлення і плюрипотентності СК виявили кілька генів. Припускають, що мікроРНК є важливими для диференціювання ембріональних СК і відіграють певну роль у самооновленні здатності і підтриманні плюрипотентності. В ембріональних СК кластери mir-302S,-17s,-515s і mir-371-373 збільшуються, особливо рівні їхньої експресії, у той час, як мікроРНК знижується, коли клітини диференціюються [26, 27]. Кластер міr-302s відіграє серйозну роль, коли плюрипотентні СК створюються за допомогою мікроРНК. Деякі дослідники повідомили, що інтеграція і введення міr-302s кластера в геном дозволило сформувати конкретні плюрипотентні клітини, подібні до ембріональних СК із ракових клітин шкіри людини [28]. В останні роки, введення mir-302/367 кластерів дозволило ефективно індукувати плюрипотентні клітини [29]. Таким чином і транскрипційні фактори, і мікроРНК здатні генерувати плюрипотентні СК. Використання методів вірус-векторного перепрограмування. Плюрипотентні СК можуть стати величезним джерелом клітин in vitro для розвитку модельних систем. Технологія індукованих плюрипотентних СК дозволяє клітинним біологам не тільки легко отримати плюрипотентні СК, але й також вивчити процеси перепрограмування самих подій. Описані протоколи для отримання індукованих плюрипотентних СК від соматичних джерел за допомогою звичайних вірусних векторів у трьох видів ссавців: миші, мавпи і людини. У миші легко отримати фібробласти в якості донорів, водночас як мезенхімні СК, як

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

очікується, призводять до більш високої ефективності перепрограмування. Мавпа (Callithrix jacchus), як примат, являє собою альтернативну модель звичайної лабораторної тварини. Нарешті, пацієнт-специфічні індуковані плюрипотентні СК людини дають можливість вивчити патологію і механізмів дизрегульованого імпринтингу генома. Технології створення індукованих СК будуть служити цінним методом вивчення геномного імпринтингу, і, навпаки, висновки з цих досліджень будуть пропонувати цінні критерії для оцінки потенціалу індукованих СК [30]. Кілька досліджень показали, що деякі фактори перепрограмування, такі як Oct3/4, Sox2, C-Myc, Klf4, Glis1, Nanog і Lin28, повинні бути підтримані в стабільному стані як мінімум тривалістю один тиждень для отримання індукованих плюрипотентних клітин. Фактори перепрограмування можуть бути інтегровані в геномну ДНК із використанням вектору ретровірусу або лентівірусів. Після утворення індукованих СК експресія цих інтегрованих екзогенних генів, здається, дизрегулюється і приглушується, однак, туморогенез є основною перешкодою для клінічного застосування. Існує ймовірність того, що експресія онкогенів може бути виражена, а генів-супресорів пухлин - бути інактивована при інтеграції екзогенних генів. Зареєстровані кілька методів для створення індукованих плюрипотетних СК шляхом використання векторів плазміди або аденовірусу без інтеграції екзогенних генів у геном господаря. При цьому досягнута низька ефективність індукції і неможливість повного виключення впливу геному хазяїна. Тому в майбутньому є важливим встановлення способу ефективного отримання індукованих плюрипотетних СК і стабільно без інтеграції в геном ДНК [31]. Методи для отримання індукованих плюрипотетних СК із фібробластів шкіри людини з допомогою вірус-векторного перепро грамування є одними з тривалих і фінансово затратних протоколів. Неправильна оцінка якості колоній на початку процесу в клітинних лініях призводить до ненадійних експериментальних результатів. D.J. Kahler et al. [32] описують удосконалений метод для виведення ліній індукованих плюрипотентних СК за допомогою флуоресцентно активованого сортування клітин (FACS),

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

щоб ізолювати клітини за маркером клітинної поверхні CD13 (NEG) SSEA4(POS)Tra-1-60(POS) на 7-10-у добу після зараження. Цей метод ефективно виділяє повністю перепрограмовані СК, виснажує і батьківські, частково «забруднені» перепрограмовані фібробласти, тим самим істотно скорочуючи час, і реагенти, необхідні для отримання лінії СК без використання певних сумішей дрібних молекул. Індуковані плюрипотентні СК, отримані за допомогою флуоресцентно активованого сортування клітин, експресують загальні маркери плюрипотентності, і володіють спонтанним потенціалом диференціації в пробірці і в природних умовах. Щоб продемонструвати придатність методу FACS для високої ефективності покоління індукованих СК, вищезгадані автори отримали 228 їхніх окремих ліній, використовуючи або інтегрувальні (ретровірусні) або не інтегрувальні (вірус Сендай) фактори. Були отримані лінії індукованих СК від 76 унікальних зразків із різних тканинних джерел, включаючи свіжі чи заморожені фібробласти з біопсійного матеріалу, який забирали в здорових або хворих пацієнтів. Ретровіруси є корисними інструментами для ефективної доставки генів у ссавців, унаслідок їхньої здатності стабільно інтегруватися в геном клітини-хазяїна. Протягом останніх декількох десятиліть, ретровірусні вектори були використані в генній терапії для лікування ряду спадкових захворювань і раку. Найбільш ранні вектори ретровірусів були засновані на простих онкогенних γ-ретровірусах, таких як вірус лейкемії Молоні мишей, які при псевдотипуванні з білками від інших вірусів (вірусом лейкемії мавпи Гібону або вірусом везикулярного G білка стоматиту) можуть ефективно ввести гени в широкому діапазоні клітини-господаря. Тим не менш, γ-ретвовірусні вектори мають той недолік, що вони не в змозі ефективно перетворювати клітини, які повільно діляться. Були розроблені конкретні протоколи для активації клітин за допомогою факторів росту і цитокінів. У разі гематопоетичних СК активацію ретельно контролюють так, щоб зберігалася плюрипотентність. Дизайн векторів ретровірусів і лентівірусів розвивається для вирішення ряду проблем безпеки. До них належать експресія окремих вірусних генів для запобігання рекомбінаційних подій,

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

що призвели до покоління реплікаційних вірусів. Крім того, розвиток інактивуючих себе векторів зменшує потенціал трансактивації сусідніх генів і дозволяє включати регуляторні елементи, які можуть бути спрямовані на фізіологічну експресію генів конкретних типів клітин [33]. Створені протоколи для ефективної диференціації гепатоцитів із людських плюрипотентних ембріональних СК і індукованих плюрипотентних клітин завдяки вектору аденовірус-опосередко ваному переносу генів, що може сприяти регенеративній клітин ній терапії або відкриттю і розробці нових лікарських засобів. Тим не менш, диференціація отриманих ендодермальних клітин у напрямку гепатоцитів, від людських плюрипотентних ембріона льних СК не є ефективною, тому що печінкові клітини диферен ціюються по декількох лініях, у тому числі в ендодермальні клі тини, клітини-попередниці гепатоцитів і зрілі гепатоцити [34]. Перепрограмування без інтеграції генів у геном господаря або з використанням геномної ДНК. У 2009 році повідомлено про перепрограмування зі включенням білків Oct3/4, Sox2, C-Myc і Klf4, які були скопійовані з фібробластів людини або миші, у ци топлазму [35] без використання вірусного вектору і геномної ДНК, але воно вирізнялося складною технікою і дуже низькою ефек тивністю індукції, що призупиняє їхнє клінічне застосування. У 2011 році N. Miyoshi et al. [36] повідомили про метод перепрограмування, який дозволив створювати плюрипотентні СК із використанням не-вірусного вектору і зрілих мікроРНК. Для вибору кандидата мікроРНК для ефективного перепрограмування автори шукали мікроРНК із рівнем експресії, який збільшувався в ембріональних СК і індукованих плюрипотентних клітинах, але знижувався в жирових СК (mASCs) миші. Було використано переважно mASCs, оскільки віни були зареєстровані в 2009 році ефективними щодо індукції плюрипотентних СК при введенні 4 факторів транскрипції в mASCs, у порівнянні з раніше використаними фібробластами. MASCs трансфектували з трьома зрілими мікроРНК (MIR-200c,-302s і 369s-), які були вибрані за рівнем експресії і отриманням плюрипотентних СК. Це дозволило уникнути проблеми виникнення пухлин, які трапляються при інтеграції екзогенних генів безпосередньо в геном господаря.

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Гени-мішені mir-200c,-302s і -369s. При пошуку генів-мішеней mir-200c із використанням бази даних пошукових сайтів, таких як TargetScan і Sanger виявлено понад 700 генів. Жодний із цих генів не контролювався тільки mir-200c, але деякі важливі гени в перепрограмуванні спостерігалися серед них, зокрема, ZEB1/ZEB2- фактори епітеліо-мезенхімного переходу, що є також важливими чинниками в індукції плюрипотентних СК, які регулюються mir-200c, на перших кроках індукції. Крім того, mir-369s регулює і ZEB2-залежний трансформуючий фактор росту-β сигналізації, і епітеліо-мезенхімний перехід. Є повідомлення, що mir-302s відіграє ключову роль у здатності самооновлення плюрипотентних СК і підтриманні плюрипотентності в ембріональних СК і, що специфічні фактори транскрипції посідають промоутерні ділянки мікроРНК, у тому числі mir-302, у плюрипотентних СК, подібно до ембріональних СК. І транскрипційні фактори, і мікроРНК працюють на підтримку функцій цих клітин [37]. Існує близько 100 генів-мішеней для mir-302s і 4 епігенетичні регуляторні фактори [AOF1,AOF2 (KDM1 або LSD1), MECP1-p66 і MECP2], що особливо важливо в перепрограмуванні, і mir-302s активує експресію цих генів шляхом деметилювання промоторних ділянок Nanog, Oct4 і Sox2. Активовані Nanog, Oct4 і Sox2 збільшують не тільки рівень експресії, але і рівень mir-302s, тому що його промоутер реактивується. Передбачається, що цей позитивний зворотний зв’язок існує, і клітини, які були трансфектовані зрілими мікроРНК кілька разів, підтримують підвищену експресію транскрипційних факторів, необхідних для перепрограмування і отримання плюрипотентних СК [38]. Таким чином, метод прямого перепрограмування має великий потенціал у регенеративній медицині і може бути використаний у майбутньому для лікування різних захворювань, включаючи рак, із високою безпекою та ефективністю при клінічному застосуванні. Новаторські відкриття перепрограмування фібробластів до плюрипотентності лише шляхом введення чотирьох транскрип ційних факторів (Oct4, Sox2, KLF4 і c-MYC) за допомогою ретрові русної трансдукції стали перспективним напрямком у в галузі регенеративної медицини. Ці індуковані плюрипотентні СК можуть забезпечити джерело для моделювання захворювань, скри-

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

нінгових платформ наркотиків і стратегій трансплантації для лі кування невиліковних дегенеративних захворювань із метою уникнення етичних проблем та імунних наслідків, пов’язаних із використанням ембріональних СК. Розроблені поточні протоколи перепрограмування, із урахуванням плюсів і мінусів і майбутніх проблем для безпечних, вільних від трансгенів індукованих СК. Клінічне застосування індукованих плюрипотентних CK лю дини вимагає дотримання вимог культивування і трансплантації клітин GMP-класу (Good Manufacturing Practice). Попередні дослідження показали, що індуковані плюрипотентні СК людини можуть бути проведені у відсутності реагентів тваринного по ходження (ксенобіотиків), щоб полегшити перехід до продукції під стандарти GMP. Це вимагає стандартизації протоколів, документації та відтворюваності методів і продукту. Тому розробляються основні набори стандартних операційних процедур для клітин GMP-класу, їх проліферації та диференціації в якості ресурсу для широкого поширення цієї практики [39]. В Україні останнім часом репрограмувальні властивості век торної системи транспозонів Sleeping beauty вивчено та досліджено морфо-функціональні особливості клітинних клонів, отриманих завдяки їхньому застосуванню [40 - 42]. Література 1. Emerging Methods for Preparing iPS Cells / S. Miyazaki, H. Yamamoto, N. Miyoshi [et al.] // Jpn. J. Clin. Oncol. - 2012. - Vol. 42(9). - P. 773-779. 2. Speman H. Embryonic development and induction / H. Speman // Am. J. Med. Sci. - 1938. - Vol. 196. - P. 738. 3. Robl J. Nuclear transplantation in mouse embryos: assessment of recipient cell stage / B. Gilligan, E. Critser, N. First // Biol. Reprod. - 1986. - Vol. 34. - P. 733. 4. Full-term development of mouse blastomere nuclei transplanted into enucleated two-cell embryos / T. Yasui, Y. Shioda, K. Nakamura [et al.] // J. Exp. Zool. - 1987. - Vol. 242. - P. 147-151. 5. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells / A.E. Schnieke, J. McWhir, A.J. Kind [et al.] // Nature. 1997. - Vol. 385. - Р. 810-813.

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

6. Producing primate embryonic stem cells by somatic cell nuclear transfer / J.A. Byrne, D.A. Pedersen, L.L. Clepper [et al.] // Nature. - 2007. - Vol. 450. - P. 497-502. 7. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells / M. Tada, Y. Takahama, K. Abe [et al.] // Curr. Biol. - 2001. - Vol. 11. - P. 1553-1558. 8. Pluripotency of reprogrammed somatic genomes in embryonic stem hybrid cells / M. Tada, A. Morizane, H. Kimura [et al.] // Dev. Dyn. - 2003. - Vol. 227. - P. 504-510. 9. Do J.T. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells / J.T. Do, H.R. Scholer // Stem Cells. - 2004. - Vol. 22. - P. 941-949. 10. Pluripotential competence of cells associated with Nanog activity / J.T. Do, M. Tada, H. Kimura [et al.] // Mech. Dev. 2005. - Vol.122. - P. 67-79. 11. Surani M.A. Nuclear reprogramming by human embryonic stem cells / M.A. Surani // Cell. - 2005. - Vol. 122. - P. 653-654. 12. Human embryonic stem cells reprogram myeloid recursors following cell-cell fusion / J. Yu, M.A. Vodyanik, P. He [et al.] // Stem Cells. - 2006. - Vol. 24. - P. 168-176. 13. A novel method for somatic cell nuclear transfer to mouse embryonic stem cells / D. Pralong, K. Mrozik, F. Occhiodoro [et al.] // Cloning Stem Cells. - 2005. - Vol. 7. - P. 265-271. 14. Induction of dedifferentiation, genomewide transcriptional programming, and epigenetic reprogramming by extracts of carcinoma and embryonic stem cells / C.K. Taranger, A. Noer, A.L. Sorensen [et al.] // Mol. Biol. Cell. - 2005. - Vol. 6. - P. 5719-5735. 15. Sancho-Martinez I. Lineage conversion methodologies meet the reprogramming toolbox / I. Sancho-Martinez, S.H. Baek, J.C. Izpisua Belmonte // Nat. Cell Biol. - 2012. - Vol. 14(9). - P. 892-899. 16. Takahashi K. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors / K. Takahashi, S. Yamanaka // Cell. - 2006. - Vol. 126. - P. 63-76. 17. Okita K. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells / K. Okita, T. Ichisaka, S. Yamanaka // Nature. - 2007. - Vol. 448. - P. 313-317. 18. Ou L. Is iPS cell the panacea? / L. Ou, X. Wang, F.Zou // IUBMB Life. - 2010. - Vol. 62(3). - P. 170-175.

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

19. Rapid and efficient reprogramming of human fetal and adult blood CD34+ cells into mesenchymal stem cells with a single factor / X. Meng, R.J. Su, D.J. Baylink [et al.] // Cell Res. - 2013.Vol. 23(5). - P. 658-672. 20. Conidi A. Aptamers and Their Potential to Selectively Target Aspects of EGF, Wnt/β-Catenin and TGFβ-Smad Family Signaling / A. Conidi, V. van den Berghe, D. Huylebroeck // Int. J. Mol. Sci. - 2013. - Vol. 14(4). - P. 6690-6719. 21. Merkl C. Efficient generation of rat induced pluripotent stem cells using a non-viral inducible vector / С. Merkl, A. Saalfrank, N. Riesen // PLoS One. - 2013. - Vol. 8(1). - P. e55170. 22. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors / J.B. Kim, H. Zaehres, G. Wu [et al.] // Nature. - 2008. - Vol. 454. - P. 646-650. 23. The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells / Y.H. Loh, Q. Wu, J.L. Chew [et al.] // Nat. Genet. - 2006. - Vol. 38. - P. 431-440. 24. Okita K. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells / K. Okita, T. Ichisaka, S. Yamanaka // Nature. - 2007. - Vol. 448. - P. 313-317. 25. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts / M. Nakagawa, M. Koyanagi, K. Tanabe [et al.] // Nat. Biotechnol. - 2008. - Vol. 26. - P. 101- 106. 26. Characterization of microRNAs involved in embryonic stem cell states / B. Stadler, S. Ivanovska, K. Mehta [et al.] // Stem Cells Dev. - 2010. - Vol. 19. - P. 935-950. 27. Comprehensive microRNA profiling reveals a unique human embryonic stem cell signature dominated by a single seed sequence / L.C. Laurent, J. Chen, I. Ulitsky [et al.] // Stem Cells. - 2008. - Vol. 26. - P. 1506-1516. 28. Mir-302 reprograms human skin cancer cells into a pluripotent ES-cell-like state / S.L. Sin, D.C. Chang, S. Chang-Lin [et al.] // RNA. - 2008. - Vol. 14. - P. 2115-2124. 29. Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency / F.Anokye-Danso, C.M. Trivedi, D. Juhr [et al.] // Cell Stem Cell. - 2011. - Vol. 8. - P. 376388.

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

30. Derivation of induced pluripotent stem cells by retroviral gene transduction in mammalian species / M. Imamura, H. Okuno, I. Tomioka [et al.] // Methods Mol. Biol. - 2012. - Vol. 925. - P. 21-48. 31. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration / M. Stadtfeld, M. Nagaya, J. Utikal [et al.] // Science.2008. - Vol. 322. - P.945-949. 32. Improved methods for reprogramming human dermal fibroblasts using fluorescence activated cell sorting / D.J. Kahler, F.S. Ahmad, A. Ritz [et al.] // PLoS One. - 2013. - Vol. 8(3). - P. e59867. 33. Cooray S. Retrovirus and lentivirus vector design and methods of cell conditioning / S. Cooray, S.J. Howe, A.J. Thrasher // Methods Enzymol. - 2012. - Vol. 507. - P. 29-57. 34. Kawabata K. Efficient hepatic differentiation from human iPS cells by gene transfer / K. Kawabata, M. Inamura, H. Mizuguchi // Methods Mol. Biol. - 2012. - Vol. 826. - P. 115-124. 35. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins / H. Zhou, S. Wu, J.Y. Joo [et al.] // Cell Stem Cell. - 2009. - Vol. 4. - P. 381-384. 36. Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs / N. Miyoshi, H. Ishii, H. Nagano [et al.] // Cell Stem Cell. - 2011. - Vol. 8. - P. 633-638. 37. Connecting microRNA genes to the core transcriptional regulatory circuitry of embryonic stem cells / A. Marson, S.S. Levine, M.F. Cole [et al.] // Cell. - 2008. - Vol. 34. - P. 21-33. 38. Current Methods for Inducing Pluripotency in Somatic Cells / G. Tavernier, B. Mlody, J. Demeester [et al.] // Adv. Mater.2013. - Vol. 25(20). - P. 2675-2771. 39. From skin biopsy to neurons through a pluripotent intermediate under Good Manufacturing Practice protocols / S. Karumbayaram, P. Lee, S.F. Azghadi [et al.] // Stem Cells Transl. Med. - 2012. - Vol. 1(1). - P. 36-43. 40. Bilko N.M. Characterization of the interaction between stromal and haematopoietic progenitor cell in expancion cell culture models / N.M. Bilko, I.A. Votijakova, S.V. Vasilovska [et al.] // Cell Biol. Internat. - 2003. - Vol. 29(1). - P. 83-86.

Розділ 1. Загальні відомості про стовбурові клітини

41. Диференційний потенціал отриманих за допомогою транс позонів індукованих плюрипотентних стовбурових клітин миші / С.В. Малишева, Н.М. Билько, Д.І. Білько [та ін.] // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології. - 2012. Т.4., №112. - С. 37-46. 42. Малишева С.В. Диференціювання у кардіоміоцити окремих клонів індукованих плюрипотентних стовбурових клітин миші / С.В. Малишева, Г.В. Будаш, Н.М. Білько [та інші] // Фізіологічний журнал. - 2013. - №3. - С. 10-18. Американські біологи відкрили новий тип клітин, не схожий за своїми властивостями і методом отримання на ембріональні і «перепрограмовані» клітини, які можна буде використовувати для відновлення кінцівок і органів без небезпеки отримати ракову пухлину. Опубліковано 20.11.2012. http://dt.ua/HEALTH/vcheni_vidkrili_noviy_tip_stovburovih_klitin,_ yaki_dopomozhut_vidnovlyuvati_kintsivki.html

«Умовно-перепрограмовані клітини». Біологи виявили клітини не схожі за своїми властивостями і методом отримання на ембріональні і «перепрограмовані» клітини, і назвали їх «умовно-перепрограмовані клітини». «Можливо, ми зможемо використовувати їх для вирощування тканин для пошкоджених органів або лікування діабету. Зокрема, ми можемо вилучити залишки інсулінових острівців з підшлункової залози, кількісно збільшувати їх і пересаджувати назад цій людині. Аналогічна методика може застосовуватися для лікування вроджених хвороб печінки. У таких випадках ми можемо забрати клітини печінки, помістити в них нормальні гени, розмножити і повернути їх законному власникові», - заявив керівник групи Річард Шлегель із Медичного центру при університеті Джорджтауна (США). Шлегель і його колеги проводили експерименти з різними лініями здорових і ракових клітин, вивчаючи їхню реакцію на появу різних гормонів та білків у живильному середовищі. У грудні 2012 року автори статті розробили методику, яка відключає механізми захисту в здорових клітинах і дозволяє їм необмежено ділитися, що дуже схоже на поведінку культур СК. У новій роботі група під керівництвом Р. Шлегеля вивчила

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

властивості клітин у таких культурах і порівняла їх з ембріональними і «перепрограмованими» СК. Для цього вчені зібрали зразки «дорослих» клітин зі стінок шийки матки і помістили їх у живильне середовище. Потім вони додали в неї два ключові компоненти - клітини-«няньки» зі сполучної тканини людини, а також спеціальний фермент, що перешкоджає роботі механізму клітинного самознищення. Біологи дозволили клітинам ділитися протягом кількох поколінь, після чого порівняли вміст їхньої цитоплазми з набором із білків, РНК та інших органічних молекул у СК. Виявилося, що клітини з культур були дуже схожі не на базові СК, здатні перетворитися на будь-який вид тканин та на їхніх нащадків, а на клітини-»заготовки», які становлять основу майбутньої шийки матки в зародку людини. Зі слів вчених, такі клітини безпечні з точки зору розвитку раку – у них відключені гени росту і розвитку, що вважаються основною причиною розвитку пухлин. Клітини Шлегеля і його колег володіють і іншою цікавою властивістю - вони «згадували» свою попередню роль через три доби після того, як вчені переставали додавати в живильне середовище суміш із клітин-»няньок» і ферменту. У результаті цього процесу на стінках чашки Петрі виростала тканина з кількох шарів клітин, аналогічних тим, які спостерігаються в шийці матки. Учені повторили свої досліди на клітинах, забраних зі шкіри рук і тканини легень, і отримали аналогічні результати. З їхніх слів, подібна універсальність методики дозволяє сподіватися на те, що даний тип клітин, яким учені дали ім’я «умовно-перепрограмовані клітини», знайде широке застосування в регенеративній медицині. «Схоже, що це той самий вид клітин, який потрібен для того, щоб перетворити регенеративну медицину з мрії на реальність», - резюмував Шлегель. Новий тип СК, яким учені дали ім’я «умовно-перепрограмовані клітини» мають намір використовувати для вирощування тканин пошкоджених органів або лікування діабету.

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

Розділ 2

СТОВБУРОВІ КЛІТИНИ ТКАНИН У ПОСТНАТАЛЬНОМУ ОНТОГЕНЕЗІ Які ключові питання про дорослі стовбурові клітини ? Багато важливих питань про дорослі стовбурові клітини залишаються без відповіді. Це: • Скільки видів стовбурових клітин дорослого організму існує і в яких тканинах вони знаходяться? • Як дорослі стовбурові клітини розвиваються в процесі диференціювання, і як вони підтримуються в дорослому стані? Чи вони є «залишком» ембріональних стовбурових клітин, чи виникають якимось іншим способом? • Чому стовбурові клітини залишаються в недиферен ційованому стані, коли всі клітини навколо них диференційо вані? Які особливості їхньої «ніші», що керує їхньою поведінкою? • Чи дорослі стовбурові клітини мають здатність трансдиференціюватися, чи можна керувати цим процесом і підвищувати його надійність і ефективність? • Якщо позитивним ефектом дорослих стовбурових клітин є трофічний, які його механізми? • Які фактори контролюють проліферацію і диференціацію дорослих стовбурових клітин? • Які фактори стимулюють пересування стовбурових клітин до місця травм або пошкоджень, і як цей процес може бути підвищений для кращого загоєння? http://www.transplantology.com/ Портал трансплантологів України

Дорослі СК - це недиференційовані клітини, які знаходяться поміж диференційованими клітинами в тканинах або органах і можуть диференціюватися в основні спеціалізовані типи клітин цієї тканини або органа. Основною роллю дорослих СК у живому організмі є підтримання та відновлення тканин, в яких вони знаходяться. Деякі вчені тепер використовують термін «соматичні СК» замість терміну «дорослі СК». На відміну від ембріональних СК, які походять з внутрішньої клітинної маси бластоцисти,

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

походження дорослих СК у зрілих тканинах невідоме. Останні результати досліджень дорослих СК викликають великий інте рес. Науковці знайшли дорослі СК у значно більшій кількості в різних тканинах організму, ніж вважалося раніше. Певні типи дорослих СК, імовірно, спроможні при створених умовах диференціюватися в різні типи клітин. Якщо диференціація дорослих СК може проводитися і контролюватися в лабораторних умовах, то ці клітини можуть стати основою лікування багатьох серйозних захворювань. Це піднімає питання, чи можуть дорослі СК використовуватися для лікувальних технологій, зокрема для трансплантації. На сьогодні дорослі СК виявлено в усіх системах органів нервовій, ендокринній, кровотворній, дихальній, травній, сечостатевій системах, органах чуттів, периферійній крові, кровоносних судинах, скелетних м’язах, шкірі. Важливо розуміти, що в кожній тканині є дуже незначна кількість СК. Вважається, що СК знаходяться в певній зоні кожної тканини і залишаються в „сплячому стані”, не ділячись протягом довгих років, поки не будуть активовані захворюванням чи пошкодженням тканини. Науковці в багатьох лабораторіях стараються знайти спосіб вирощування дорослих СК у культурі клітин та керувати ними, щоб генерувати специфічні типи клітин, які можна було би використовувати для лікування захворювань чи травм. Прикладом потенційного лікування є заміщення допамін-продукуючих клітин в мозку пацієнтів із хворобою Паркінсона, вироблення інсулін-продукуючих клітин при діабеті та відновлення пошкодженого серцевого м’язу після інфаркту міокарда. У червоному кістковому мозку знаходяться принаймні два ти пи СК. Одна група називається гематопоетичні СК, з яких фор муються всі типи клітин крові. Друга група називається стромальні клітини кісткового мозку, які були виявлені дещо пізніше. Стромальні клітини – це змішана популяція клітин, які генерують кісткову, хрящову, жирову та фіброзну тканини. Одна доросла СК генерує лінію генетично ідентичних клітин, які називаються клоном, з яких потім розвиваються відповідні диференційовані клітини. Науковці своїми дослідженнями стараються довести, що СК започатковують ріст клонів у культурі

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

клітин, або що чиста популяція СК може розмножуватися після трансплантації в живу тварину. Зараз немає загально визнаних критеріїв для ідентифікації та перевірки дорослих СК. Часто використовуються один чи декілька з трьох наступних тестів: 1) маркування клітин у живій тканині за допомогою молекулярних маркерів та визначення, які типи клітин вони потім генерують; 2) видалення клітин з живої тварини, маркування їх у культурі тканин та пересадка їх іншій тварині для визначення чи ці клітини розмножаться; 3) видалення клітин, вирощування їх у культурі тканини, та здійснення на них різних впливів, часто додаючи фактори росту, чи вводячи нові гени, для того щоб визначити, в який тип диференційованих клітин вони перетворяться. Нещодавніми дослідженнями, які проводилися на дорослих СК із введеним в них спеціальним вірусом, який дає можливість ідентифікувати кожну окрему клітину, було продемонстровано що клоновані дорослі СК мають можливість розмножуватися і відновлювати пошкоджені тканини в живої тварини.

2.1. Маркери стовбурових клітин Для ідентифікації СК використовують специфічні маркери. До маркерів належать спеціалізовані білки (рецептори) на поверхні клітин, які селективно зв’язуються або приєднуються до інших молекул сигналізації. Кожний тип клітин має визначену сукупність рецепторів на своїй поверхні, що дозволяє відрізнити їх від інших клітин. Назва клітинного маркера збігається з назвою молекули, яка зв’язується з рецептором клітинної поверхні. Наявність чи відсутність маркера позначається (+) чи (-). Дослідники використовують сигнальні молекули, які селек тивно «прилипають» до рецепторів на поверхні клітини, як інструмент, який дозволяє ідентифікувати СК. Була розроблена методика для підключення до сигнальної молекули іншої моле кули (або тега), яка має здатність світитися при активації джерел енергії, таких як ультрафіолетове або лазерне випромінювання (виявлення маркерів клітинної поверхні за допомогою флуоресцентних міток). Нині в розпорядженні дослідників є кілька

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

флуоресцентних міток із випромінюванням світла, які відрізняються за кольором та інтенсивністю. Існують два підходи для поєднання хімічних властивостей флуоресценції та унікальних шаблонів рецепторів на поверхні клітин для визначення конкретних популяцій СК. Один із підходів для визначення маркерів в якості дослідницького інструменту є метод, відомий як флуоресцентне активне сортування клітин (FACS). Його часто використовують як інструмент для ідентифікації рідкісних СК із мільйонів інших клітин. За допомогою цього методу суспензію мічених клітин (тобто клітинна поверхня пов’язується з флуоресцентними мітками) направляють під тиском через дуже вузьку трубку, щоб клітини проходили одна за одною. При виході з трубки, клітини підлягають впливу джерела світла (як правило, лазер), а потім проходять через електричне поле. Флуоресцентні клітини заряджаються негативно, а нефлуоресцентні клітини стають позитивно зарядженими. За відмінностями заряду СК відокремлюються від інших клітин. Цю популяцію клітин продовжують досліджувати за іншими характеристиками і маркерами. Другий метод із використанням маркерів СК та їх флуоресцентних міток дозволяє візуально оцінити клітини, які локалізуються в тканинах із допомогою мікроскопа. У цьому випадку готується тонкий шар тканини, клітини позначаються флуоресцентними мітками, які активуються або спеціальними методами з використанням світлової енергії, або хімічних реакцій. СК випромінюють флуоресцентне світло, що можна побачити під мікроскопом. Останніми досягненнями в ідентифікації СК є застосування методів генетичної інженерії, в якій використовується флуорес ценція, що не залежить від маркерів клітинної поверхні. Важли вість цієї нової методики полягає в тому, що вона дозволяє від стежувати СК у процесі диференціації. У СК вкорінюється «ген-репортер», наприклад зелений флуоресцентний білок. Ген ак тивується тільки тоді, коли вони стають спеціалізованими. Після активації гена СК виробляють білок, який флуоресціює блискучим зеленим кольором. Дослідники поєднують ці методи з FACS і мікроскопічними, описаними раніше для сортуван-

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

ня клітин та ідентифікування їх у тканинах, і простежують, як клітини диференціюються і стають спеціалізованими. Ці методи бурхливо розвиваються і широко використовуються в наукових дослідженнях. Кожна тканина визначається неспецифічними (спільними з усіма СК) і специфічними маркерами. Нижче наводимо основ ні маркери ембріональних плюрипотентних СК (табл. 1) для мож ливості їхнього порівняння з дорослими СК. Маркери СК окремих тканин та органів будуть наведені далі у відповідних розділах. Таблиця 1

Маркери ембріональних плюрипотентних стовбурових клітин Маркер

Значення

Лужна фосфатаза Альфафетопротеїн (AFP) Кістковий морфогенетичний білок-4

Підвищена експресія цього ферменту пов’язана з недиференційованими плюрипотентними СК Білки, експресовані в ході розвитку ентодерми; відображають диференціацію ентодермальних плюрипотентних СК Фактор росту і диференціації в ході раннього утворення і диференціації мезодерми Фактор транскрипції, який відіграє важливу роль у ранній фазі формування мезодерми та її диференціації Поверхневі молекули рецептора знайдені саме на плюрипотентних СК Ген фактора росту, який експресується клітинами ембріональної карциноми, примітивної ектодерми, а також при утворенні кардіоміоцитів Експресія збільшується при утворенні ембріональної карциноми з ентодерми Молекула, яка синтезується недиференційованими поліпотентними СК - антитіла до конкретної позаклітинної матриці Фактор транскрипції, який однозначно експресується клітинами ембріональної карциноми протягом недиференційованого стану поліпотентних СК Фактор транскрипції, який експресується поліпотентними СК

Brachyury Кластер диференціації CD30 Cripto (TDGF-1) GATA-4 ген GCTM-2

Генезис Ядерний фактор зародкових клітин

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

88 Ядерний фактор гепатоцитів - 4 (HNF-4)

Фактор транскрипції, який експресується на початку утворення ендодерми Білок проміжних філаментів у клітинах, характеризує Nestin утворення первинної нейроектодерми Поверхнева молекула клітини, яка сприяє міжклітинМолекули клітинної ним взаємодіям, вказує на утворення первинної ней адгезії нейронів (N-CAM) роектодерми Фактор транскрипції - унікальний для поліпотентних Oct4/POU5F1 СК, необхідний для утворення та росту недиференційованих СК Фактор транскрипції, експресується ембріональними Рах6 СК при їхній диференціації в нейроепітелій Stage specificГлікопротеїн, який специфічно експресується в ранембріональний антиген-3 ньому ембріональному розвитку недиференційовани(SSEA-3) ми ембріональними СК Глікопротеїн, який специфічно експресується в ранStage specific ембріональньому ембріональному розвитку недиференційованиний антиген-4 (SSEA-4) ми ембріональними СК Фактор Мембранний білок, який підсилює проліферацію ембстовбурових клітин ріональних СК, гематопоетичних СК і мезенхімних СК, (SCF або C-Kit ліганд) зв’язується з рецептором c-Kit Фермент, який однозначно пов’язаний із безсмертниТеломераза ми клітинними лініями, корисний для визначення недиференційованих ембріональних СК Антитіла до конкретної молекули позаклітинної мат TRA-1-60 риці, синтезуються недиференційованими поліпотентними СК Антитіла до конкретної молекули позаклітинної маTRA-1-81 триці, синтезуються недиференційованими поліпотентними СК Білок проміжних філаментів у клітинах, характеризує Віментин утворення первинної нейроектодерми

2.2. Тканини внутрішнього середовища Різновиди тканин внутрішнього середовища за зовнішніми ознаками значно відрізняються між собою, але поєднуються в одну тканину, враховуючи спільність походження, будови і функ ції. Усі вони (як і міоцити) розвиваються з мезенхіми (рис. 2). Найкраще вивчені кровотворні СК (СК гематопоезу), оскільки історично саме вони були вперше виявлені в червоному кіст-

враховуючи спільність походження, будови і функції. Усі вони розвиваються Розділ 2. С товбурові 89 з мезенхіми (рис. 2).клітини тканин у постнатальному онтогенезі Мультипотентні мезенхімні стовбурові клітини Проліферація

Хондрогенез

Остеогенез

RUNX-2 SMAD-1/5

Sox 5-6 FOXOA

Хондроцити

Тендогенез

Scleraxis SMAD-8

β-catenin/ FLH2 OSX

Фібробласти Теноцити

Адипогенез

C/EBPα PPARγ

Адипоцити

Міогенез

SRT GATA6 Myocardin MPTFs

Гладкі міоцити

SRF GATA6 Myocardi MRTFs

Остеоцити

Рис. 2. Схема розвитку основних різновидів сполучної тканини Рис. з2.мультипотентних Схема розвитку мезенхімних основних різновидів сполучної стовбурових клітинтканини з мультипотентних мезенхімних стовбурових клітин (транскрипційні (транскрипційні фактори виділені косим шрифтом). фактори виділені косим шрифтом).

ковому мозку, коли російський учений-гістолог О.О. Максимов Найкраще вивчені кровотворні СК (СК гематопоезу), оскільки наісторично початку ХХ ст.були сформулював унітарну теорію кровотворення. саме вони вперше виявлені в червоному кістковому мозку, коли російський учений-гістолог на зіпочатку ХХ ст. Згідно цієї теорії, усі клітини О.О. кровіМаксимов походять СК гематопоезу. теорію кровотворення. Згідно цієї теорії, усі клітини Усформулював ссавців СКунітарну гематопоезу, переважно, локалізуються в червоному крові походять зі СК гематопоезу. У ссавців СК гематопоезу, переважно, кістковому Воникістковому є нащадками які в ембріональлокалізуютьсямозку. в червоному мозку. CK Воникрові, є нащадками CK крові, ному утворюються в жовтковому мішку імішку потімі розселяякі в періоді ембріональному періоді утворюються в жовтковому потім розселяються всій кровотворній системі.УУдорослих дорослих до ються по всійпокровотворній системі. докровотворних кровотворних органів належить червоний кістковий мозок, де утворюються еритроцити, органів належить червоний мозок, делімфоцитів. утворюються тромбоцити, гранулоцити, моноцитикістковий і клітини-попередниці У еритроцити, тромбоцити, моноцити і клітини-поселезінці, лімфатичних вузлахгранулоцити, та тимусі відбувається розмноження і диференціація Т- і В-лімфоцитів. передниці лімфоцитів. У селезінці, лімфатичних вузлах та тимусі відбувається розмноження і диференціація лімфоцитів. Процес утворення еритроцитів, гранулоцитів, моноцитів і тромбоцитів відносять до мієлопоезу, а лімфоцитів і плазмоци тів - до лімфопоезу (рис. 3). Фібробласти (механоцити) належать до клітинних елемен тів сполучної тканини. Вони «будують» сполучну тканину, у

Гладки міоци

Процес утворення еритроцитів, гранулоцитів, моноцитів і тромбоцитів відносять до мієлопоезу, а лімфоцитів і плазмоцитів - до Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б. 90лімфопоезу (рис. 3). Мультипотентні стовбурові клітини гематопоезу

Клітинипопередниці мієлоїдного ряду

Клітинипопередниці лімфоїдного ряду Лімфоцити

Тромбоцити

Моноцити

Еритроцити

Т-лімфоцити В-лімфоцити

Гранулоцити Плазмоцити

Нейтрофіли

Базофіли

Еозинофіли

NK-клітини, натуральні кілери

3. Сучасна спрощена гематоцитопоезу. Рис. Рис. 3. Сучасна спрощена схемасхема гематоцитопоезу.

тому чис лі й опорні структури організму. Фібробласти беруть Фібробласти (механоцити) належать до клітинних елементів участь у ран,«будують» розвитку рубця,тканину, утворенні нав сполучноїзагоєнні тканини. Вони сполучну у томукапсули числі й опорні коло стороннього а також у фібротичних і склеротичних структури організму.тіла, Фібробласти беруть участь у загоєнні ран, розвитку рубця, утворенні капсули навколодиферон стороннього тіла, а також фібротичних і процесах. Фібробластичний включає СК, уклітини-попесклеротичних процесах. Фібробластичний диферон включає СК, клітиниредниці, малоспеціалізовані і зрілі фібробласти - фіброцити. До попередниці, малоспеціалізовані і зрілі фібробласти - фіброцити. До цього ж цього ж ряду належать міофібробласти [1]. ряду належать міофібробласти [1]. Першим,хто хто припустився думкидумки про СК фібробластів, які сприяють Першим, припустився про СК фібробластів, загоєнню ран і загоєнню походять із ран червоного кісткового близькокісткового 130 років які сприяють і походять із мозку червоного тому був Конгейм [2]. Пізніше, Friedenstein et al. [3] визначили мезенхімні СК Т мозку, близько 130 років тому був І.Ф.Конгейм [2]. Пізніше, А.Я. Фриденштейн та ін. [3] визначили мезенхімні СК дорослої людини при спостереженні групи клітин, які розвивалися в фібробласти з колонієтворних клітин (КТК-Ф). Прототипами дорослих СК сполучної тканини є мезенхімні СК. На думку M. Li, S. Ikehara [4], вони здатні до самовідновлен-

В-л

Пл

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

ня і диференціювання в різні тканини не тільки мезодермальної лінії, але й ендо- та ектодермальної ліній - кісткової, жирової, хрящової, нервової тканин, зокрема й ендотеліоцитів, гепатоцитів та інсулоцитів. Вважають, що фібробласти, як і остеоцити, адипоцити, хондроцити та інші клітини мезодермального і немезодермального походження походять із мезенхімних СК. Р. Mafi et al. [5] узагальнили доступну інформацію щодо характеристики поверхневих маркерів мезенхімних СК і визначили, що найчастіше виявляються позитивні: CD105, CD90, CD44, CD73, CD29, CD13, CD34, CD146, CD106, CD54 і CD166 і негативні маркери: CD34, CD14, CD45, CD11b, CD49d, CD106, CD10 і CD31. Рідше повідомляли також про інші маркери - STRO-1, SH2, SH3, SH4, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR, HLA-I, DP, EMA, DQ (MHC Class II), CDIO5, Oct 4, Oct 4A, Nanog, Sox2, TERT, Stat3, fibroblast surface antigen, smooth muscle α-actin, vimentin, integrin subunits α4, α5, β1, integrins αvβ3 and αvβ5 and ICAM-1. Оскільки існує невідповідність про поверхневі маркери мезенхімних СК, автори роблять висновок про необхідність подальшого вивчення маркерів цих клітин та їхніх похідних. Клітини-попередниці фібробластів знаходяться, в основному, у червоному кістковому мозку, але існують інші ділянки їхньої локалізації - строма органів, плацента, пульпа зуба, сухожилки, периферійна і пуповинна кров, амніотична рідина, печінка, скелетні м’язи і серцева м’язова тканина [6, 7]. Серцеві фібробласти. Кардіальні фібробласти відіграють кри тичну роль не тільки в підтриманні нормальної функції серця, але й ремоделюванні серця при інфаркті міокарда і гіпертензії [8 - 10]. Ці клітини виконують численні функції, включаючи синтез і впорядкування екстрацелюлярного матриксу, клітинно-клітинної комунікації з міоцитами, клітинно-клітинних взаємодій з іншими фібробластами і з ендотеліоцитами. Вони підтримують електрофізіологічні властивості кардіоміоцитів, секретують фактори росту і цитокіни і беруть участь в ангіогенезі під час ремоделювання серця [11]. Із віком активація деяких молекулярних шляхів може призвести до фібротичного ремоделювання серця [12]. Активні форми кисню, хемокін-опосередковані мононуклеарні клітини і клітини-попередниці фібробластів, активація тран-

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

формуючого фактора росту (TGF-β), ендотелін-1 та ангіотензин ІІ сигнали сприяють інтерстиційному і периваскулярному фіброзу. Такі фібробласти містяться як в міокарді, так і в епікарді [13 - 14]. Регенерація скелетних м’язів являє собою складний процес, до якого залучаються кілька типів клітин і, зокрема, клітинипопередниці м’язових клітин, макрофаги і клітини-попередниці фібробластів, які підтримують міогенні клітини і реконструюють позаклітинний матрикс [15, 16]. СК фібробластів сполучної тканини скелетних м’язів дорослих у великій кількості експресують Tcf4 (transcription factor 7-like 2, Tcf7l2), котрий під час міогенезу стимулює утворення важких ланцюгів міозину і диференціацію клітин [17]. Це може бути важливим при регенерації м’язової тканини при її дистрофії (Дюшенна) [18]. Водночас велику клінічну проблему складає фіброз скелетних м’язів, включаючи первинний при м’язових дистрофіях і вторинний - посттравматичний чи в результаті пошкоджень мозку [19]. Із сухожилка людини і тварин ізольовані СК. Приблизно 1-2 % цих клітин мають високі мультипотентні клоногенні властивості при низькій щільності посіву [20]. Ці клітини мають поверхневі маркери CD44+, CD90+, CD34– та CD31–, деякі з кот рих спільні з мезенхімними СК. До спеціальних тендогенних автори віднесли α-актин гладких м’язів, тенасцин С і теномодулін, але не колаген типу I. Тендинопатії можуть трапитися в сухожилку з різною локалізацією, тому цікаво чи мають особливості СК у різних ділянках сухожилків м’язів - внутрішньосухожилкових і з перитендинію [21]. Установлено, що, незалежно від ділянки, сухожилкові СК мають мультипотентний потенціал, але більше клітин міститься в перитендинії. Аналіз поверхневих маркерів для СК і клітин-попередниць з обох регіонів вказали, що вони виявляють Sca1+ (маркер СК), CD90+ і CD44+ (маркер фібробластів), CD18– (маркер лейкоцитів), CD34– (маркер клітин кровотворної та судинної систем) і CD133– (периваскулярний маркер). Власне сухожилкові СК експресують підвищені рівні теномодуліну (Tnmd) і scleraxis (Scx). На відміну від них клітини ендотендинію демонструють відносне збільшення васкулярного і перицитного маркерів (CD133). Ці особливості можна

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

враховувати під час лікування сухожилка, залежно від локалізації патологічного процесу. СК фібробластів легень характеризуються маркерами, подіб но до мезенхімних клітин CD34–, CD45–, CD90/Thy-1+, CD73/ SH3, SH4+, CD105/SH2+, CD166/ALCAM+ i Br, ICIG7 і BM212], за винятком STRO-1 антигену [22]. Окремими СК виділені клітини-попередниці з пульпи зуба [23]. У них імуноцитохімічно визначили відомі маркери СК: Cytokeratins (AE1-AE3), α-гладком’язовий актин, Ki-67, CD34, CD44, CD45, CD56, CD133 і типові маркери стромального фенотипу – (CD56, CD44 і CD271). Автори схиляються до думки, що клітини-попередниці фібробластів знаходяться серед стромальних СК пульпи. Клітини-попередниці фібробластів мають визначальне значення в розвитку грануляційної тканини при загоєнні ран [24]. Огляд проблем запалення та участі особливих клітин «фіб роцитів» у процесах фіброзування тканин опубліковані в роботі R. Bucala [25]. За класичними поглядами, загалом терміном «фіброцити» позначаються дефінітивні (кінцеві) форми розвитку фібробластів. Форма їх веретеноподібна, можуть мати крилоподібні відростки, містять невелику кількість органел, синтетичні процеси в них різко знижені. Автор повідомив, що існують не тільки клітини-попередниці фібробластів локально, але й в 1994 році були вперше описані мезенхімні клітини-попередниці фібробластів, як фібробластоподібні клітини, у периферійній крові [26]. Ці клітини експресують колаген (білок позаклітинного матриксу), маркери мієлоїдних (CD45) і гематопоетичних (CD34) клітин-попередниць, беруть участь у загоєнні ран. Через те, що клітина має маркери гематопоетичної клітини, продукує колаген і має веретеноподібну форму, її назвали «фіброцитом». Ці клітини володіють унікальним профілем цитокінів, відмінним від моноцитів, дендритних клітин, клітин Лангерганса шкіри, Т-лімфоцитів, фібробластів, ендотеліоцитів і епітеліоцитів. Їх кількість у периферійній крові складає приблизно 0,5 % від лейкоцитів. Їхніми поверхневими маркерами є рецептори хемокінів CCR2, CCR3, CCR5, і CCR7 CXCR4. Вони експресують α-актин гладких м’язів (α-SMA), що

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

відкриває їхню здатність перетворення на міофібробласти і поповнення популяції останніх у динаміці загоєння ран. Водночас відомості про властивості «фіброцитів» мають значення не тільки для ефективнішого загоєння ран, але й для запобігання патологічного фіброзу в різних органах. Проблемі існування і функціонального значення циркулюючих «фіброцитів» периферійної крові присвячена велика література [27, 28 та інші]. Установлена етіопатогенетична участь «фіброцитів» у форму ванні гіпертрофованих келоїдних рубців, нефрогенної дерматопатії, склеродермії, вітреоретинопатії, атеросклеротичних уражень. Знання молекулярних сигналів, які впливають на міграцію, проліферацію і диференціацію «фіброцитів» відкривають перспективи попередження перерахованих патологічних процесів у шкірі [29, 30]. За останніми експериментальними даними, їх можна застосувати для лікування пошкоджень шкіри при діабеті [31]. Дорослі СК дерми могли би стати привабливим джерелом клі тин у терапевтичних цілях і при вивченні старіння шкіри. Ці мультипотентні СК морфологічно подібні до мезенхімних СК червоного кісткового мозку, але не все з’ясовано щодо їхнього фенотипу. Імуноцитохімічне дослідження показало експресію поверхневих маркерів CD73/CD90/CD105, а також CD271 і SSEA-4 in situ [32]. Клітини в подальшому можуть диференціюва тися в адипо-, остео- та хондрогенні клітини (CD271+) і лише в адипогенні. T.L. Lee, D.W. Shin [33] показали, що in vitro шкірні СК фібробластів мають потужний потенціал проліферації і диференціації, експресують великі кількості Sox2 i S100B, ідентифікуються за високим рівнем експресії нестину, віментину, SNAI2, TWIST1, версикану і CORIN. СК фібробластів шкіри для дослідження отримують у людини з крайньої плоті [34]. Ці клітини можуть розмножуватися і не втрачати своїх властивостей протягом 50 пасажів. Вони мають маркери CD90, CD105, CD166, CD73, SH3 і SH4, які схожі на імунофенотип мезенхімних СК червоного кісткового мозку. Пpи культивуванні в спеціальних середовищах (Ігла, модифікованому Дульбекко) вони утворюють сфери з підвищеним рівнем експресії фібронектину і віментину. Зроблено висновок, що крайня плоть може слугувати джерелом мультипотентних СК із

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

метою перепрограмування до диференційованих остеоцитів, адипоцитів, нейроцитів, гладких міоцитів, шванноцитів, гепатоцитоподібних клітин, клітин крові [34 - 37]. R.P. Hill et al. [38] зауважують, що в культурах СК фібробластів, взятих у новонароджених, клітини-попередниці експресують у більшому ступені маркер α-актин гладких м’язів (αSMA). У периваскулярній сполучній тканині органів дорослих міс тяться адвентиційні клітини, перицити і фібробласти, серед яких локалізуються СК/клітини-попередниці мезенхімного походження [39 - 42]. Ці клітини експресують CD146, NG2 і PDGFRβ і в них відсутні маркери кровотворної, ендотеліальної і міо генної ліній [43, 6]. Вони володіють потужним паракринним потенціалом, що може сприяти підтримці гомеостазу тканини і диференціації мезенхімних клітин локально [44]. Вивчаються процеси їхньої клітинної кінетики: адгезії, міграції, приживлення, самовідновлення і міжклітинних перехресних перешкод при ремонті та регенерації тканин [45]. Одним із маркерів перицитів є α-SMA і, враховуючи їхнє по зитивне чи негативне забарвлення зеленим флуоресцентним білком, перші з них мають здатність до мультилінійної диференціації, а другі - можуть диференціюватися лише в адипогенному напрямку [46]. Тривають дослідження експресії поверхневих маркерів адвентиційних СК і виявлено, що їхніми маркерами є CD34+ CD146– CD271+/–, на 4-у добу культивації вони стали фібробластоподібними і в них активізувалась експресія CD105, CD146, CD271 [47]. Виділені з тканин периваскулярні СК мають переваги над звичайними мезенхімними СК і тому зростає число експериментальних даних, які прокладають шлях до використання автологічних периваскулярних СК у регенерації тканин [48]. До СК мезенхімного ряду відносять також перицити, які локалізуються в стінці мікрогемосудин і в капілярах - у розщепленні їхньої базальної мембрани, і відіграють важливу роль у формуванні, дозріванні і стабільності стінки мікрогемосудин. При культивуванні в людини вони експресують CD34, CD31, CD146. Такі клітини можна отримати від адвентиційних клітин, впливаючи на них факторами росту [49]. За морфо-функціональ-

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

ними і реге нераційними властивостями R. Gutirrez et al. [50] віднесли до «дивних» («peculiar») типів перицитів також зірчасті клітини (клітини Іто) печінки, ретикулоцити червоного кісткового мозку та мезангіальні клітини. В останній час із перицитами пов’язують розвиток діабетичної ангіопатії і фіброзу тканин. Вони є потенційними стромальними мішенями для терапії раку [51, 52]. Із перицитів також можуть розвиватися міофібробласти, які реагують на пошкодження тканин формуванням фіброзної тканини у внутрішніх органах [53, 54]. Активація фібробластів за допомогою різних стимулів може призводити до їх диференціації в напрямку міофібробластного фенотипу і бути важливою для різних фіброзних захворювань. У даний час визнано, що в міо фіб робласти можуть диференціюватися не тільки фібробласти, але й ряд інших клітин, включаючи епітеліальні, ендотеліальні та резиденти і циркулюючі клітини-попередниці (рис. 4). Швидке і різке збільшення експресії α-SMА в клітинах адвентиції, які диференціюються в міофібробласти, спостерігається при гіпоксії, легеневій гіпертензії та при інших васкулопатіях. Міофібробласти виступають як основні учасники ремоделювання у відповідь на зміну в локальному середовищі, у тому числі виробництво колагену та інших білків позаклітинного матриксу (еластину, фібронектину), а також matricellular білків, включаючи тенасцин-C і остеопонтин, різноманітних факторів росту, цитокінів та інших паракринних факторів. У сукупності накопичення міофібробластів можуть безпосередньо впливати на зміни структури стінки судини в патологічних умовах. Диференціація фібробластів у міофібробласти в адвентиції регулюється різноманітними чинниками - зростанням вмісту цитокінів, молекул адгезії, і позаклітинних матричних молекул, у тому числі TGF-β, тромбіну, ендотеліну, ангіотензин-II, IL-6. У нирках виявлені великі популяції нащадків мезенхімних клітин, які при хронічній хворобі нирок, диференціюються в міо фібробласти і сприяють процесам гломерулосклерозу, інтерстиційного фіброзу, атрофії трубчастих структур і запалення [55]. За останній рік були висловлені нові погляди на гомеостаз і функції перицитів і нові молекулярні шляхи, які регулюють їхню

призводити до їх диференціації в напрямку міофібробластного фенотипу і бути важливою для різних фіброзних захворювань. У даний час визнано, що в міофібробласти можуть диференціюватися не тільки фібробласти, але й ряд інших клітин, включаючи епітеліальні, ендотеліальні та резиденти і циркулюючі клітини-попередниці 4). Розділ 2. С товбурові клітини тканин(рис. у постнатальному онтогенезі 97 Локальні мезенхімні клітини Проліферація

Фібробласти

Фібробласти Гладкі міоцити Епітелій Ендотелій Резидентні клітинипопередниці у стінці судин Клітинипопередниці червоного кісткового

Дедиференціація

Диференціація

ЕМТ ЕнМТ

Міофібробласти α-SMA+

Фібробласти

Рис. 4. Типи клітин, які призводять до фенотипу міофібробластів. Позначення: ЕМТ - епітеліо-мезенхімна трансформація, ЕнМТ - ендотеліо-мезенхімна трансформація.

трансдиференціацію в патологічні міофібробласти, у тому числі Рис. 4. Типи клітин,трансформуючий які призводять до фенотипу міофібробластів. Wingless/Int, ефрин, фактор росту β, фактор Позначення: ЕМТ - епітеліо-мезенхімна трансформація, ЕнМТ - ендотеліоросту тромбоцитів і Hedgehog сигнальний шлях. Крім того попемезенхімна трансформація. редні дослідження показали, що мікроРНК, які регулюють посттранскрипційну також можуть грати важливу Швидке і різкеекспресію збільшеннягенів, експресії α-SMА в клітинах адвентиції, якіроль диференціюються в міофібробласти, спостерігається при гіпоксії, в їхній трансдиференціації [56]. легеневій гіпертензії при досліджують інших васкулопатіях. Міофібробласти Останнім часомтаокремо можливості перепрогра виступають як основні учасники ремоделювання у відповідь на зміну в мування фібробластів у плюрипотентні СК із подальшим диференціюванням у нервові лінії [57, 58]. Література 1. Гістологія людини / [підр. для студ вищих мед. навч. закл. ІІІ-ІV рівнів акредитації] / О.Д. Луцик, А.Й. Іванова, К.С. Кабак, Ю.Б. Чайковський. – Київ: Книга плюс, 2010. –584 с.

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

2. Prockop D.J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues / D.J. Prockop // Science. - 1997. - Vol. 276(5309). - P. 71–74. 3. Friedenstein A.J. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells / A.J. Friedenstein, R.K. Chailakhjan, K.S. Lalykina // Cell Tissue Kinet. - 1970. - Vol. 3. - P. 393–403. 4. Li M. Bone-marrow-derived mesenchymal stem cells for organ repair / M. Li, S. Ikehara // Stem Cells Int. - 2013;2013:132642. Режим доступу до журналу :doi: 10.1155/2013/132642. 5. Adult mesenchymal stem cells and cell surface characterization - a systematic review of the literature / P. Mafi, S. Hindocha, R. Mafi [et al.] // Open Orthop. J. - 2011. - Vol. 5 (Suppl 2). - P. 253-260. 6. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs / M. Crisan, S. Yap, L. Casteilla [et al.] // Cell Stem Cell. - 2008. - 3(3). - P. 301–313. 7. Бутенко Г.М. Регенеративная медицина и стволовые клетки - проблемы и решения / Г.М. Бутенко // Журн. НАМН України. - 2011. - Т.17,№1. - С. 62-66. 8. Smad3 signaling critically regulates fibroblast phenotype and function in healing myocardial infarction // M. Dobaczewski, M. Bujak, N. Li [et al.] // Circ. Res. - 2010. - Vol. 107(3). - P. 418-428. 9. Origin of developmental precursors dictates the pathophysiologic role of cardiac fibroblasts / J.R. Crawford, S.B. Haudek, K.A. Cieslik [et al.] // J. Cardiovasc Transl. Res. - 2012. Vol. 5(6). - P. 749-759. 10. Early fibroblast progenitor cell migration to the AngIIexposed myocardium is not CXCL12 or CCL2 dependent as previously thought / A. Falkenham, M. Sopel, N. Rosin [et al.] // Am. J. Pathol. - 2013. - Vol. 183(2). - P. 459-469. 11. Colby A. S. Cardiac Fibroblast: The Renaissance Cell / A.S. Colby, S.L.K. Bowers, T.A. Baundino // Cir. Res. - 2009. - Vol. 105(12). - P. 1164-1176. 12. Biernacka A. Aging and Cardiac Fibrosis / A. Biernacka, N.G. Frangogiannis // Aging Dis. - 2011. - Vol. 2(2). - P. 158-173. 13. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineagespecific EMT of cardiac fibroblast progenitors // A. Acharya, S.T.

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

Baek, G. Huang [et al.] // Development. - 2012. - Vol. 139(12). - P. 2139-2149. 14. Characterization of epicardial-derived cardiac interstitial cells: differentiation and mobilization of hear / A. Ruiz-Villalba, A. Ziogas, M. Ehrbar [et al.] // PLoS One. - 2013. - Vol. 8(1). - P. e53694. 15. Moyer A.L. Regeneration versus fibrosis in skeletal muscle / A.L. Moyer, K.R. Wagner // Curr. Opin. Rheumatol. - 2011. Vol. 23(6). - P. 568-573. 16. Fibroblasts influence muscle progenitor differentiation and alignment in contact independent and dependent manners in organized co-culture devices / N. Rao, S. Evans, D. Stewart [et al.] // Biomed. Microdevices. - 2013. - Vol. 15(1). - P. 161-169. 17. Connective tissue fibroblasts and Tcf4 regulate myogenesis // S.J. Mathew, J.M. Hansen, A.J. Merrell [et al.] // Development.2011. - Vol. 138(2). - P. 371-384. 18. Muscle side population cells from dystrophic or injured muscle adopt a fibro-adipogenic fate / C.M. Penton, J.M. Thomas-Ahner, E.K. Johnson [et al.] // PLoS One. - 2013. - Vol. 8(1). - P. e54553. 19. Lieber R.L. Cellular mechanisms of tissue fibrosis. 4. Structural and functional consequences of skeletal muscle fibrosis / L.R. Lieber, S.R. Ward // Am. J. Physiol. Cell Physiol. - 2013. Vol. 305(3). - P. 241-252. 20. Isolation and characterization of multipotent rat tendonderived stem cells / P.P. Lui,G. Li, S.C. Fu [et al.] // Tissue Eng. Part A. - 2010. - Vol. 16(5). - P.1549-1558. 21. Mienaltowski M.J. Regional differences in stem cell/ progenitor cell populations from the mouse achilles tendon / M.J. Mienaltowski, S.M. Adams, D.E. Birk // Tissue Eng. Part A. 2013. - Vol. 19(1-2). - P.199-210. 22. Human bronchial fibroblasts exhibit a mesenchymal stem cell phenotype and multilineage differentiating potentialities / F. Sabatini, L. Petecchia, M. Tavian [et al.] // Lab. Invest. - 2005. Vol. 85(8). - P. 962-971. 23. Stromal phenotype of dental follicle stem cells / F. Angiero, C. Rossi, A. Ferri [et al.] // Front. Biosci (Elite Ed). - 2012. - Vol. 4. - P. 1009-1014.

100

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

24. Adult stem cells and repair through granulation tissue / L. Jr. Diaz-Flores, R. Gutierrez, J.F. Madrid, H. Varela [et al.] // Front. Biosci (Landmark Ed). - 2009. - Vol. 14. - P. 1433-1470. 25. Bucala R. Review Series – Inflammation & Fibrosis Fibrocytes and fibrosis / R. Bucala // QJM. - 2012. - Vol. 105 (6). - P. 505-508. 26. Circulating fibrocytes define a new leukocyte subpopulation that mediates tissue repair / R. Bucala, L. Spiegel, J. Chesney [et al.] // Mol. Med. - 1994. - Vol. 1. - P. 71-78. 27. Regulated Production of Type I Collagen and Inflammatory Cytokines by Peripheral Blood Fibrocytes / J. Chesney, Ch. Metz, A.B. Stavitsky [et al.] // J. Immunol. - 1998. - Vol. 160 (1). - P. 419-425. 28. Peripheral blood fibrocytes: differentiation pathway and migration to wound sites / R. Abe, S.C. Donnelly, T. Peng [et al.] // J. Immunol. - 2001. - Vol. 166(12). - P. 7556-7562. 29. Circulating fibrocytes: collagen-secreting cells of the peripheral blood / T.E. Quan, S. Cowper, S.P. Wu [et al.] // Int. J. Biochem. Cell Biol. - 2004. - Vol. 36(4). - P. 598-606. 30. Mattoli S. The role of a human hematopoietic mesenchymal progenitor in wound healing and fibrotic diseases and implications for therapy / S. Mattoli, A. Bellini, M. Schmidt // Curr. Stem Cell Res. Ther. - 2009. - Vol. 4(4). - P. 266-280. 31. Peripheral blood fibrocytes: enhancement of wound healing by cell proliferation, re-epithelialization, contraction, and angiogenesis / H.K. Kao, B. Chen, G.F. Murphy [et al.] // Ann. Surg. - 2011. - Vol. 254(6). - P. 1066-1074. 32. Human dermis harbors distinct mesenchymal stromal cell subsets / C. Vaculik, C. Schuster, W. Bauer [et al.] // J. Invest. Dermatol. - 2012. - Vol. 132(3 Pt 1). - P. 563-574. 33. Lee T.R. Enrichment and characterization of human dermal stem/progenitor cells by intracellular granularity / T.R. Lee, D.W. Shin // Stem Cells Dev. - 2013. - Vol. 22(8). - P. 1264-1274. 34. Multilineage differentiation potential of fibroblast-like stromal cells derived from human skin / H.I. Huang, S.K. Chen,Q.D. [et al.] // Tissue Eng. Part A. - 2010. - Vol. 16(5). - P. 1491-1501. 35. Huang H.I. Isolation and differentiation potential of fibroblast-like stromal cells derived from human skin // H.I. Huang, C.Z. Wu // Methods Mol. Biol. - 2012. - Vol. 879. - P. 465-470.

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

101

36. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors / P. Huang, Z. He, S. Ji [et al.] // Nature. - 2011. - Vol. 475(7356). - P. 386-389. 37. Sieweke M.H. Creating a blood line from human skin / M. H. Sieweke // Genome Biol. - 2010. - Vol. 11(12). - P. 143. 38. Generation and characterization of multipotent stem cells from established dermal cultures / R.P. Hill, K. Gledhill, A. Gardner [et al.] // PLoS One. - 2012. - Vol. 7(11). - P. e50742. 39. Lamagna C. The bone marrow constitutes a reservoir of pericyte progenitors / C. Lamagna, G. Bergers // J. Leukoc. Biol. 2006. - Vol. 80(4). - P. 677-681. 40. Perivascular ancestors of adult multipotent stem cells / M. Corselli, C.W. Chen, M. Crisan [et al.] // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2010. - Vol. 30(6). - P. 1104-1109. 41. Hu Y. Adventitial biology: differentiation and function / Y. Hu, Q.Xu // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2011. - Vol. 31(7).P. 1523-1529. 42. Pericyte-like progenitors show high immaturity and engraftment potential as compared with mesenchymal stem cells / A. Bouacida, P. Rosset, V. Trichet [et al.] // PLoS One. - 2012. - Vol. 7(11).- P. e48648. 43. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and geneexpression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts / D.T. Covas, R.A. Panepucci, A.M. Fontes [et al.] // Exp. Hematol.2008. - Vol. 36(5). - P. 642-654. 44. Lin C.S. Defining vascular stem cells / C.S. Lin, T.F. Lue // Stem Cells Dev. - 2013. - Vol. 22(7). - P. 1018-1026. 45. Cellular kinetics of perivascular MSC precursors / W.C. Chen, T.S. Park, I.R. Murray [et al.] // Stem Cells Int. - 2013; 2013:983059. Режим доступу до журналу: doi: 10.1155/ 2013/ 983059. 46. Adipose stem cells originate from perivascular cells / X. Cai, Y.Lin, P.V. Hauschka [et al.] // Biol. Cell. - 2011. - Vol. 103(9).P. 435-447. 47. Concerted regulation of CD34 and CD105 accompanies mesenchymal stromal cell derivation from human adventitial

102

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

stromal cell / J. Braun, A. Kurtz, N. Barutcu [et al.] // Stem Cells Dev. - 2013. - Vol. 22(5). - P. 815-827. 48. Natural history of mesenchymal stem cells, from vessel walls to culture vessels / I.R. Murray, C.C. West, W.R. Hardy [et al.] // Cell Mol. Life Sci. - 2013. - Oct 25. [Epub ahead of print]. 49. The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells // M. Corselli, C.W. Chen, B. Sun [et al.] // Stem Cells Dev. - 2012. - Vol. Vol. 21(8). - P. 1299-1308. 50. Pericytes. Morphofunction, interactions and pathology in a quiescent and activated mesenchymal cell niche / R. Gutirrez, J.F. Madrid, H. Varela [et al.] // Histol. Histopathol. - 2009. - Vol. 24(7). - P. 909-969. 51. Armulik A. Pericytes: Developmental, Physiological, and Pathological Perspectives, Problems, and Promises / A. Armulik, G. Genové, C. Betsholtz // Developmental Cell - 2011. - Vol. 21(2).P. 193-215. 52. Humphreys B.D. Targeting pericyte differentiation as a strategy to modulate kidney fibrosis in diabetic nephropathy / B.D. Humphreys // Semin. Nephrol. - 2012. - Vol. 32(5)P). - Р. 463-470. 53. Schrimpf C. Mechanisms of fibrosis: the role of the pericyte / C. Schrimpf, J.S. Duffield // Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2011. - Vol. 20(3). - P. 297-305. 54. Fligny C. Activation of pericytes: recent insights into kidney fibrosis and microvascular rarefaction / C. Fligny, J.S. Duffield // Curr. Opin. Rheumatol. - 2013. - Vol. 25(1). - P. 78-86. 55. Cellular mechanisms of tissue fibrosis. 3. Novel mechanisms of kidney fibrosis / G. Campanholle, G. Ligresti, S.A. Gharib [et al.] // Am. J. Physiol. Cell Physiol. - 2013. - Vol. 304(7). - P. 591-603. 56. Ren S. Pericytes in kidney fibrosis / S. Ren, J.S. Duffield // Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. - 2013. - Vol. 22(4). - P. 471-480. 57. Lujan E. The many roads to Rome: induction of neural precursor cells from fibroblasts / E. Lujan, M. Wernig // Curr. Opin. Genet. Dev. - 2012. - Vol. 22(5). - P. 517-522. 58. Generation of integration-free and region-specific neural progenitors from primate fibroblasts / J. Lu, H. Liu, C.T. Huang [et al.] // Cell Rep. - 2013. - Vol. 3(5). - P. 1580-1591.

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

103

Разроблено метод отримання клітин печінки з стовбурових клітин жирової тканини. Опубліковано 22.10.13. Вчені Школи медицини Стенфордського університету (Stanford University School of Medicine) розробили швидкий і ефективний метод перепрограмування клітин, витягнутих із ліпосакціонних аспіратів, у клітини печінки. http://untt.com.ua Американці виростили нервові клітини з жирової тканини. Дослідники з США та Великобританії отримали нервові клітини з стовбурових клітин жирової тканини щурів. Medportal.ru. http://doctor.wpoonline.com/article.php?sid=32015 Хрящова тканина з жирових стовбурових клітин пацієнта. Опубліковано 27.04.2012 р. Учені з Duke University Medical Center і Pratt School of Engineering researchers отримали хрящ зі стовбурових клітин, виділених із людської жирової тканини. http://hrenator.ru/viroshhuvannya-xryashhovoi-tkanini-iz-stvolovix

Жирова тканина належить до сполучних тканин зі спеці альними властивостями [1]. В її складі переважають жирові клітини – адипоцити. Адипоцити мають вигляд пухирчастих клітин, заповнених великою краплею жиру. Між групами адипоцитів (жировими часточками) розташовуються вузькі прошарки пухкої сполучної тканини (строма), в якій виявляються фібробласти, мастоцити, лімфоцити, тонкі колагенові волокна, кровоносні і лімфатичні капіляри, нерви. Про білу жирову тканину можна говорити, як про великий метаболічно активний орган, який бере участь у поглинанні з крові, синтезі, зберіганні і мобілізації нейтральних жирів. Жирова тканина слугує депо нейтральних жирів (високоенергетичні поживні речовини), бере участь в обміні води, виконує механічну і амортизаційну функції. Біла жирова тканина гіподерми нині вважається секреторним органом, який продукує адипокіни, що здатні регулювати низку патологічних процесів (ожиріння, діабет і метаболічні захворювання) [2]. До них належать лептин, який стимулює обмін речовин, адипонектин збільшує чутливість до інсуліну, окислює жирні кислоти, зменшує продукцію глюкози в печінці, менше вивчені резистин і ретинозв’язувальний білок [3]. Адипокіни мають вирішальне значення для динаміки контролю енергетичного

104

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

метаболізму і чутливості до інсуліну [4, 5]. У світлі сучасних досліджень тканинної регенерації жирова тканина інтенсивно вивчається, як можливе нове джерело СК [6, 7]. СК жирової тканини отримали з підшкірної жирової клітковини [8]. Доведено, що ці СК мають мультипотентні властивості і є ідеальними для регенеративної медицини [9 - 12]. Жирова тканина розповсюджена в організмі, доступна і зручна для забору, здатна диференціюватися в кількох напрямках і забезпечувати терапевтичний ефект на моделях травм і хвороб за допомогою імуномоделювальних процесів [13]. Фундаментальні дослідження показали, що з жирових СК можна отримати клітини і тканини, які походять не тільки з мезенхіми, але й з екто- та ендодерми [14]. Тобто, жирова тканина є ідеальним донором для трансплантації автологічних СК у людини [15]. Останнім часом темпи відкриття похідних жирових клітин прискорюються як на доклінічному, так і клінічному рівнях. Проведено більше 40 клінічних досліджень із використанням жирових СК у 15 країнах, більшість з яких мають фази І і ІІ клінічної безпеки [16]. CК жирової тканини, переважно, локалізуються в периваскулярних ділянках (додаток 1). Місцево вони диференціюються в гладкі міоцити та ендотеліальні клітини при ангіо- та неоваскулогенезі, а також в адипоцити. Їхніми маркерами є CD34+, CD31+ [17,18]. Із СК, які експресують CD34+, більшість належить до резидентних перицитів [19]. Саме CD34+ i L-NGFR+h ASCs – клітини можна вважати кандидатами для тканинної інженерії та регенеративної медицини [20]. Навколо судини розрізняють два шари клітин: внутрішній, який складається з клітин із CD146+/CD34+ (із перицитогенним), і зовнішній – CD146/ CD34+ SA-ASK (з адипогенним потенціалом) [21]. Найголовніші маркери адипоцитів представлені в табл. 4. У свіжовиділених жирових клітинах M.J. Varma et al. [22] виявили експресію CD34+, CD117+, HLA-DR, CD105+ і незнач ну кількість CD166+. Автори під час операції абдомінопластики в людини отримали жирову тканину i методом проточної цитометрії виокремили з неї 4 популяції клітин: - кандидати на периваскулярні з маркерами (CD146+/CD34+) та ендотеліальні (CD31+/CD34+) клітини; зрілі (CD31+/CD34–) і незрілі (CD31+/

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

105

CD34–) ендотеліальні клітини та преадипоцити (CD31+/CD34–) і (CD90+ без CD146+) [23]. Таблиця 2

Маркери клітин жирової тканини (адипоцити) Маркер

Значення

Адипоцит - ліпід-зв’язуючий білок (ALBP) Транспортер жирних кислот (FAT)

Ліпід-зв’язуючий білок, знаходиться в адипоцитах Транспортна молекула, що знаходиться в адипоцитах

Біологію адипоцитів і механізми, які залучені в процеси проліферації, диференціації, адипокінової секреції та експресії генних білків вивчали іn vitro. Ураховуючи переваги і недоліки адипоцитів, на підставі цих досліджень нещодавно заснована клітинна лінія 3Т3-L1, яка є більш сталою і легшою у використанні, ніж попередні [24]. Численні дослідження щодо можливостей диференціації жирових СК на інші тканини проведені в останні 25 років і отримані нові дані щодо їхнього застосування, у першу чергу, для лікування серцево-судинних захворювань [25 - 27]. Так, N.J. Palpant et al. [28] у жировій тканині навколо судин у мишей виявили стромальні СК, виділили з них адипоцити, культивували in vitro, впливали антитілами, міченими магнітними наночастинками та фармакологічними засобами на Wnt та цитокінові сигнали. Ці стромальні клітини на початку розвитку експресували ізоформи білків серцевих ембріональних і дорослих клітин, у них функціонально спостерігали схильність до скорочення і координовані перехідні сполуки кальцію. Дослідники довели, що диференціація стромальних клітин на кардіоміоцити посилюється неканонічними Wnt агоністами, антагоністами канонічного Wnt і цитокінами. При цьому стромальні клітини можуть диференціюватися в серцеві клітини (маркери відбору – мембранний SCA-1 i c-kit). Тобто, стромальні клітини жирового походження є унікальною популяцією, які виявляють схильність до серцевої диференціації, і можуть бути потенційним джерелом СК для дослідження регенерації серцевого м’яза.

106

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

M. Jumabay et al. [29] в експерименті забирали адипоцити та in vitro довели їхні можливості диференціації на кардіоміоцито-подібні клітини. На мишах в експерименті були визначені маркери вирощених in vitro жирових СК, диференційованих у кардіоміоцито-подібні клітини. Ці клітини пересадили мишам із моделлю інфаркту міокарда, де вони пройшли подальший розвиток, при чому міокард «уникав» ремоделювання і порушень функції [30]. Виходячи з результатів подібних досліджень, R. Madonna, R. De Caterina [31] пропонують жирові клітини, як джерело лікування інфаркту міокарда. G.U. Premaratne et al. [32] висловлюють припущення, що клітинами жирової тканини судинної фракції можна замінити СК червоного кісткового мозку при лікуванні серцевих захворювань. Зауважимо, що за останніми даними [33], жирові СК розмножуються швидше, ніж СК червоного кісткового мозку. Дослідники трансплантували такі клітини в ішемічно пошкоджений міокард і встановили через 4 тижні високу щільність судин, а також CD3+ i CD20+ клітини в ділянці пересадки. Водночас знизилася експресія запальних цитокінів ФНП-α, ІЛ-6, ТІМР-1, що перешкоджає відкладенню колагену. H. Nakagami et al. [34] вважають, що доставка автологічних попередників в ішемічні тканини пацієнтів могла би бути новим терапевтичним варіантом лікування гіпоксичних станів тканин. Автори ізолювали жирові клітини з високою експресією CD44+ i SCA-1+ з пахової ділянки мишей і трансплантували їх в ішемізовану кінцівку, результатом чого було поліпшення кровотоку, підтверджене результатами допплерівського дослідження. Водночас на підставі морфологічного імуногістологічного дослід ження з застосуванням анти-CD31 антитіл показано, що щільність кровоносних капілярів збільшилася. На підставі експериментальних досліджень V. Planat-Benard et al. [35] висловили думку про те, що саме жирові СК є джерелом неоангіогенезу при ішемічніх станах. T. Murohara [36] встановив, що жирові СК виділяють ангіогенні фактори, хемокіни, чим сприяють ангіогенезу. Жирові СК також експрecують FGF-2 (фактор росту фібробластів 2), який зменшує апоптоз і розширює кровоносні судини in vitro. При введенні цих клітин внутрішньом’язово

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

107

в ішемізовані тканини кінцівки вони мають паракринну, ангіогенну дію [37]. Жирові СК людини можна виростити як моношар або сферу. Останні більш ефективні для введення в гіпоксичні тканини. Після внутрішньом’язової трансплантації сфер відбувалася секреція ангіогенного фактора, поліпшення неоваскуляризації і виживання пошкоджених клітин [38]. Цікавими є результати досліджень T. Matsumoto et al. [39], які забирали жирові клітини дорослих від 18 донорів і з допомогою спеціальних методів in vitro отримували дедиференційовані жирові клітини. Проточна цитометрія показала, що популя ція цих клітин досить однорідна, морфологічно вони подібні до фібробластів, мають стійку проліферативну активність, хоча профіль антигенів на їхній поверхні схожий на жирові СК. Дедиференційовані жирові клітини втратили маркери зрілих адипоцитів, але зберегли або набули ознак маркерів генів клітин мезенхімної лінії, таких як активатор проліферації пероксисом – рецептор γ (PPARγ), RUNX2 i Sox9. Установлено, що такі клітини за відповідних умов можуть диференціюватися в адипоцити, хондроцити, остеобласти, тобто вони є типом мультипотентних клітин-попередниць [40]. В експерименті на мишах виявили, що дедиференційовані жирові клітини успішно діляться 22 рази і не втрачають можливостей подальшої диференцації [41]. Цим доведено, що зрілі адипоцити можуть бути легко ізольовані з жирової суспензії і дедиференційовані у вільні від ліпідів фібробластоподібні клітини, які демонструють адипогенний, остеогенний, хондрогенний та міогенний потенціал. В ангіогенних умовах ці клітини можуть проявляти периваскулярні ознаки і викликати утворення нових судин [42, 43]. Ключову роль у цьому, ймовірно, відіграє хемокін SDF-1. Можливості диференціації жирових клітин на хондрогенні й остеогенні відкривають перспективи для лікування пошкоджень суглобових хрящів і патологічно змінених кісток [44 - 48]. Дослідники наголошують на тому, що СК-похідні адипоцитів мають здатність диференціюватися не тільки на хондроцити, міо бласти, остеобласти, а й на клітини-попередниці нейронів [49]. Іn vitro була доведена можливість диференціації адипоцитів на нeйрони в людини [50, 51]. В експерименті за умов пошкодження

108

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

спинного мозку трансплантація алогенних жирових СК сприяла відновленню нервової тканини шляхом прискореної і більш повноцінної неоваскуляризації [52,53]. Пересадка алогенних жирових СК щурам після перерізки сідничого нерва призводила до відновлення структури нерва, що припускає новий потужний терапевтичний підхід при лікуванні пошкоджень периферійних нервів [54]. З’явилися нові дані щодо диференціації СК жирової тканини людини на гепатоцити [55, 56]. T.Ischikawa et al. [57] вважають, що автологічні жирові СК є імуносумісними, вигідні щодо етичних та питань біобезпеки, не відторгаються при їхній трансплантації, не викликають небажаного виникнення тератом. При відновленні гепатоцитів це відбувається завдяки тому, що жирові СК секретують фактори росту (зокрема, фактор росту гепатоцитів і фактор росту ендотеліоцитів) і тим самим стимулюють виживання і проліферацію клітин, мають високий потенціал для відновлення інших тканин [58]. Не менш актуальними і важливими є успішно проведені дослідження по культивуванню in vitro жирових СК в інсулін-продукуючі [59], що окреслює напрям лікування цукрового діабету в майбутньому [60]. Жирові клітини, корисні для клітинної терапії, можна отримати при ліпосакції [61, 62]. S.G. Dubois et al. [63] визначили, що для успішного ізолювання і вирощування жирових СК достатньо 0,5 г біопсійного матеріалу або близько 10,0 мл аспірату ліпосакції. Адипоцити з ліпосакції ізолювали і вирощували протягом 10-12 тижнів, що було достатньо для їх використання з метою «ремонту» суглобового хряща в лікуванні остеоартриту і можливостей їхнього застосування в реконструктивній і пластичній хірургії [64]. На основі експериментів in vitro продемонстровано здатність жирових СК, oтриманих шляхом ліпосакції (у 15 мл ліпоспірату приблизно міститься 1 млн клітин), до остеогенезу і запропоновано їхнє використання в лікуванні такого поширеного патологічного стану кісткової тканини, як остеопороз [65]. Зроблені спроби виростити жирові СК з епітеліальним потенціалом і відновити рогівку ока [66]. Дослідники зазначають, що через 10 років експериментів із вивченням жирових СК нині перейшли до їхнього клінічного випробування в лікуванні цукрового діабету і критичної ішемії кін-

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

109

цівки [67]. Але залишаються маловивченими питання туморогенності цих клітин. Експерименти з трансплантацією жирових СК, проведені на мишах з ослабленим імунітетом, показали, що протягом року в деяких із них виникли доброякісні пухлини [68]. Таким чином, жирові СК доступні, їх легко отримати шляхами спеціального забору (біопсія або метод ліпосакції). Із використанням жирових СК відкриваються великі можливості для тканинної терапії, завдяки їхнім властивостям диференціюватися за певних створених умов на клітини різних органів. • Матеріали опубліковані в статті Дєльцова О.І. Використан ня жирових стовбурових клітин як альтернативного джерела в ре генеративній медицині / О.І. Дєльцова, Ю.Б. Чайковський, С.Б. Геращенко // Галицький лікарський вісник. - 2012. - №3.С. 9-12. Література 1. Гістологія людини / [підруч. для студ. вищих мед. навч. закладів ІІІ-ІV рівнів акредитації] / О.Д. Луцик, А.Й. Іванова, К.С. Кабак, Ю.Б. Чайковський. – Київ : Книга плюс. – 2010. – 584 с. 2. Cellular models for undestanding adipogenesis, adipose dysfunction, and obesity / A. Armani, C. Mammi, V. Mazzola [et al.] // J. Cell Biochem. – 2010. – Vol. 110(3). – P. 564-572. 3. Adiponectin: Regulation of its production and its role in human diseases / A. Shehzad, W. Iqbal, O. Shehzad [et al.] // Hormones (Athens). - 2012. – Vol. 11(1). – P. 8-20. 4. Vazques-Vela M.E. White adipose tissue as endocrine organ and its role in obesity / M.E. Vazques-Vela, N. Torres, A.R. Tovar // Arch. Med. Res. – 2008. – Vol. 39(8). – P. 715-728. 5. Galic S. Adipose tissue as an endocrine organ / S. Galic, J.S. Oakhill, G.R. Steinberg // Mol. Cell Endocrinol. – 2010. – Vol. 316(2). – P. 129-139. 6. Adult stem cells: from new cell sources to changes in methodology / B. Pelacho, M. Mazo, J.J. Gavira [et al.] // J. Cardiovasc. Trasl. Res. – 2011. – Vol. 4(2). – P. 154-160. 7. Stem cells from adipose tissue / M. Witkowska-Zimmy, K. Walenko // Cell Mol. Biol. – 2011. – Vol. 16(2). – P. 236-257.

110

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

8. Nakagami H. Adipose tissue-derived stromal cells as a novel option for regenerative cell therapy / H. Nakagami, R. Morishita, S. Maeda // J. Atheroscler. Tromb. – 2006. – Vol. 13(2). – P. 77-81. 9. Schaffler A. Concise review: adipose tissue-derived stromal cell-basic and clinical implication for novel cell-based therapies / A. Schaffler, C. Bucher // Stem Cells. – 2007. – Vol. 25(4). – P. 818-827. 10. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation / B.A. Bunnell, M. Flaat, C. Gagliardi [et al.] // Methods. – 2008. – Vol. 45(2). – P. 115-120. 11. Mizuno H. Adipose-derived stem and stromal cells for cellbased therapy: current status of preclinical studies and clinical trials / H. Muzino // Curr. Opin. Mol. Ther. – 2010. – Vol. 12(4). – P. 442-449. 12. Rada T. Distinct stem cells subpopulations isolated from human adipose tissue exhibit different chondrogenic and osteogenic differentiation potential / T. Rada, R.L. Reis, M.E. Gomes // Stem Cell Rev. – 2011. – Vol. 7(1). – P. 64-76. 13. Bailey A.M. Characterization of adipose-derived stem cells: an update / A.M. Bailey, S. Kapur, A.J. Katz // Curr. Stem Cell Res. Ther. – 2010. - Vol. 5(2). – P. 95-102. 14. Mizuno H. Concise review: adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine / H. Muzino, M. Tobita, A.C. Uysal // Stem Cells. – 2012. – Vol. 30(5). – P. 804-810. 15. Kim S.C. Adipose Tissue derived stem cells for regeneration and differentiation into insulin-producing cells / S.C. Kim, D.J. Han, J.Y. Lee // Curr. Stem Cell Res. Ther. – 2010. – Vol. 5(2). – P. 190-194. 16. Gimble J.M. Human-adipose-derived cells: an update on the transition to clinical translation / J.M. Gimble, B.A. Bunnell, F. Guilak // Regen. Med. – 2012. – Vol. 7(2). – P. 225-235. 17. Defining stem and progenitor cells within adipose tissue / G. Lin, M. Garcia, H. Hing [et al.] // Stem Cells. – 2008. – Vol. 17(6). – P. 1053-1063. 18. Defining adipose tissue-derived stem cells in tissue and culture / C.S. Lin, Z.C. Xin, C.H. Deng [et al.] // Histol. Histopathol.– 2010. – Vol. 25(6). – P. 807-815. 19. A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface, markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks / D.O.

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

111

Traktuev, S. Merfeld-Clauss, J. Li [et al.] // Circ. Res. – 2008. – Vol. 102(1). – P. 77-85. 20. Anti-L-NGFR and cD34 monoclonal antibodies identify multipotent mesenchymal stem cells in human adipose tissue / N. Quirici, C. Scavullo, L. de Girolamo [et al.] // Stem Cells Dev. – 2010. – Vol. 19(6). – P. 915-925. 21. Stromal vascular progenitors in adult human adipose tissue / L. Zimmerlin, C. Donnenberg, M.E. Pfeifer [et al.] // Cytometry A. – 2010. – Vol. 77(1). – P. 22-30. 22. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells / M.J. Varma, R.G. Brelius, T.E. Schouten [et al.] // Stem Cells Dеv. – 2007. – Vol. 16(1). – P. 91-104. 23. Adipogenic potential of adipose stem cell subpopulations / H. Li, L. Zimmerlin, K.G. Mappa [et al.] // Plast. Reconstr. Surg.– 2011. – Vol. 128(3). – P. 663-672. 24. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes / S.P. Poulos, M.W. Dodson, G.J. Hausman // Exp. Biol. Med. (Maywood). – 2010. – Vol. 235 (10). – P. 1185-1193. 25. Sanz-Ruis R. Adipose tissue-derived stem cells: the friently side of a classic cardiovascular foe / R. Sanz-Ruiz, M.E. Santos, M.D. Munoa // J. Cardiovasc. Transl. Res. – 2008. – Vol. 1(1). – P. 55-63. 26. Cardiac regenerative potential of adipose tissue-derived stem cells / N.N. Hoke, F.N. Salloum, K.E. Loesser-Casey [et al.] // Acta Physiol. Hung. – 2009. – Vol. 96(3). – P. 251-265. 27. Palpant N.I. Aesthetic cardiology: adipose-derived stem cells for myocardial repair / N.J. Palpant, J.M. Metzger // Curr. Stem Cell Res. Ther. – 2010. - Vol. 5(2). – P. 145-152. 28. Non-canonical Wnt signaling enhances differentiation of Sca+/c-kit+ adipose-derived murine stromal vascular cells into spontaneously beating cardiac myocytes / N.J. Palpant, S. Jasuda, O. MacDouglad [et al.] // J. Mol. Cell Cardiol. – 2007. – Vol. 43(3).– P. 362-370. 29. Jumabay M. Spontaneously beating cardiomyocytes derived from white mature adipocytes / M. Jumabay, R. Zhang, Y. Yao [et al.] // Cardiovasc. Res. – 2010. – Vol. 85(1). – P. 17-27.

112

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

30. Adipose-derived cardiomyogenic cells: in vitro expansion and functional improvement in a mouse model of myocardial infarction / B. Leobon, J. Roncally, C. Joffre [et al.] // Cardiovasc. Res. – 2009. – Vol. 83(4). – P. 757-767. 31. Madonna R. Adipose-tissue: a new source for cardiovascular repair / R. Madonna, R. De Caterina // J. Cardiovasc. Med. (Hagerstown). – 2010. – Vol. 11(2). – P. 71-80. 32. Stromal vascular fraction transplantation as a alternative therapy for ischemic heart failure: anti-inflammatory role / G.U. Premaratne, L.P. Ma, M. Fujita [et al.] // J. Cardiothorac. Surg. – 2011. – Vol. 6. – P. 43-48. 33. Webb T.L. In vitro comparison of feline bone marrowderived and adipose tissue-derived mesenchymal stem cells / T.L. Webb, J.M. Quimby, S.W. Dow // J. Feline Med. Surg. – 2012. – Vol. 14(2). – P. 165-168. 34. Novel autologicus cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells / H. Nakagami, K. Maeda, R. Morishita [et al.] // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2005. - Vol. 25(12). - P. 2542-2547. 35. Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives / V. Planat-Benard, J.S. Silvestre, B. Cousin [et al.] // Circulation. – 2004. – Vol. 109(5). – P. 656-663. 36. Murohara T. Autologous adipose tissue as a new source of progenitor cells for thеrapeutic angiogenesis / T. Murohara // J. Cardiol. – 2009. – Vol. 53(2). – P. 155-163. 37. Locally delivered growth factor enhances the angiogenic efficiacy of adipose-derived stromal cells transplanted to ischemic limbs / S.H. Bhang, S.W. Cho, J.M. Lim [et al.] // Stem Cells. – 2009. – Vol. 27(8). – P. 1976-1986. 38. Angiogenesis in ischemic tissue produced by spheroid grafting of human adipose-derived stromal cells / S.H. Bhang, S.W. Cho, W.G. La [et al.] // Biomaterials. – 2011. – Vol. 32(11). – P. 2734-2747. 39. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential // T. Matsumoto, K. Kano, D. Kondo [et al.] // J. Cell Physiol. – 2008. – Vol. 215(1). – P. 210-222.

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

113

40. Yregoire F.M. Adipocyte differentiation: from fibroblasts to endocrine cells / F.M. Gregoire // Exp. Biol. Med. (Maywood). – 2001. – Vol. 226(11). – P. 997-1002. 41. Nobusue H. Establishment of a preadipocyte cell line derived from mature adipocytes of GFP transgenic mice and formation of adipose tissue / H. Nobusue, T. Endo, K. Kano // Cell Tissue Res.– 2008.– Vol. 332(3). – P. 435-446. 30, 42. Implantation of adipose-derived regenerative cells enhances ischemia-induced angiogenesis / K. Kоndo, S. Shintani, R. Shibata [et al.] // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2009. – Vol. 29(1). – P. 61-66. 43. Dedifferentiated fat cells: an alternative source of adult multipotent cells from the adipose tissue / J.F. Shen, A. Sugawara, J. Yamashita [et al.] // Int. J. Oral Sci. – 2010. – Vol. 3(3). – P. 117-124 44. Hepatocyte differentiation of mesenchymal stem cells from humanadipose tissue in vitro promotes hepatic integration in vivo / H. Aurich, M. Sgodda, P. Kaltwasser [et al.] // Gut. – 2009. – Vol. 58(4). – P. 570-581. 45. Ogawa R. Cartilage regeneration using adipose-derived stem cells / R. Ogawa, S. Mizuno // Curr. Stem Cell Res. Ther. – 2010.– Vol. 5(2).– P. 129-132. 46. Ogawa R. Cartilage regeneration using adipose-derived stem cells / R. Ogawa, S. Mizuno // Curr. Stem Cell Res. Ther. – 2010.– Vol. 5(2).– P. 129-132. 47. Application of human adipose-derived stromal cells in bone tissue engineering / Y.S. Zhon, Y.S. Lin, W.S. Ge [et al.] // Beijing Da Xue Xue Bao. – 2012. – Vol. 44(2). – P. 160-162. 48. Characterization of humanadipose-derived stem cells and expression of chondrogenic genes during induction of cartilage differentiation / A.S. Hamid, R.B. Idrus, A.B. Saim [et al.] // Clinics (Sao Paulo). – 2012. – Vol. 67(2). – P. 99-106. 49. Kokai L.E. The potential of adipose-derived adult stem cells as a source of neuronal progenitor cells / L.E. Kokai, J.P. Rubin, K.G. Marra // Plast. Reconstr. Chir. - 2005. - Vol. 16(5). - P.1453-1460. 50. Differentiation of human adipose-derived adult stem cells into neuronal tissue: does it work / A.P. Franco Lambert, A. Fraga

114

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Zandonai, D. Bonatto [et al.] // Differentiation. – 2009. – Vol. 77(3). – P. 221-228. 51. Neural differentiation and therapeutic potential of adipose tissue derived stem cells / P. Erba, G. Terenghi, P.J. Kingham [et al.] // Curr. Stem Cell Res. Ther. – 2010. - Vol. 5(2). – P. 153-160. 52. Functional recovery and neural differentiation after transplantation of allogenic adipose-derived stem cells in a canine model of acute spinal cord injury/ H.H. Ryu, J.H. Lim, Y.E. Byeon [et al.] // J. Vet. Sci. – 2009. – Vol. 10(4). – P. 273-284. 53. Transplantation of an adiposestem cell cluster in a spinal cord injury / J.S. Oh, I.S. Park, K.N. Kim [et al.] // Neuroreport.– 2012. – Vol. 23(5). – P. 277-282. 54. Adipose-derived stem cells promote peripheral nerve repair / G.B. Liu, Y.X. Cheng, Y.K. Feng [et al.] // Arch. Med. Sci. – 2011. – Vol. 7(4). – P. 592-596. 55. Yarak S. Human adipose-derived stem cells: current challenges and critical perspectives / S. Yarak, O.K. Okamoto // Ann. Bras. Dermatol. – 2010. - Vol. 85(5). – P. 647-656. 56. Current status of humanadipose-derived stem cells: differentiation into hepatocyte-like cells / F. Al Battach, J. De Kock, T. Vanhaecke [et al.] // Sci. World. J. – 2011. – Vol. 11. – P. 1568-1581. 57. Stem cells for hepatic regeneration: the role of adipose tissue derived mesenchymal stem cells / T. Ischikawa, A. Banas, K. Hagiwara [et al.] // Curr. Stem Cell Res. Ther. – 2010. - Vol. 5(2).– P. 182-189. 58. Adipose stromal cell-plastic type of cells with high therapeutic potential / D.O. Traktuev // Цитология. – 2006. – Том 48(2). – С. 83-94. 59. Insulin-producing cells from humanadipose tissue-derived mesenchymal stem cells detected by atomic force microscope / Q. Shi, S. Luo, H. Jin [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2012.– Vol. 94(2). – P. 479-486. 60. In vitro Generation of Functional Insulin-producing Cells from Lipoaspirated Human Adipose Tissue-derived Stem Cells / M.L. Mohamad Buang, H.K. Seng, L.H. Chung [et al.] // Arch. Med. Res. – 2012. – Vol. 43(1). – P. 83-88.

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

115

61. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies / P.A. Zuk, M. Zhu, H. Mizuno [et al.] // Tissue Eng. – 2001. – Vol. 7(2). – P. 211-228. 62. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid potentions of liposuction aspirates / K. Yoshimura, T. Shigeura, D. Matsumoto [et al.] // J. Cell Physiol. – 2006. – Vol. 208(1). – P. 64-76. 63. Isolation of human adipose-derived stem cells from biopsies and liposuction specimens / S.G. Dubois, E.Z. Floyd, S. Zvonic [et al.] // Methods Mol. Biol. – 2008. – Vol. 449. – P. 69-79. 64. Isolation of adipose-derived stem cells and their induction to a chondrogenic phenotype / B.T. Estes, B.O. Diekman, J.M. Gimble [et al.] // Nat. Protoc. – 2010. – Vol. 5(7). – P. 1294-1311. 65. Adipose tissue as a stem cell source for musculoskeletal regeneration / J.M. Gimble, W. Grayson, K. Guilak [et al.] // Front. Biosci. (Schol. Ed). – 2011. – Vol. 3. – P. 69-81. 66. Characterization of ocular surface epithelial and progenitor cell markers in humanadipose stromal cells derived from lipoaspirates / E.M. Martinez-Conesa, E. Espel, M. Reina [et al.] // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2012. – Vol. 53(1). – P. 513-520. 67. Поляченко Ю.В. Стан ендотеліоцитів судин у хворих із хронічною ішемією кінцівок після трансплантації мультипотентних стромальних клітин жирової тканини / Ю.В. Поляченко, М.Ф. Дрюк, Д. Б. Домбровський // Укр. мед. альманах. - 2010.Том 13, № 3. - С. 150-154. 68. Long-term in vivo tumorogenic assessment of human culture-expanded adipose stroma/stem cells / Z.M. MacIsaac, H. Shang, H. Agrawal [et al.] // Exp. Cell Res. – 2012. – Vol. 318(4).– P. 416-423.

116

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б. Біоінженери розробляють новий підхід, щоб відновити диски хребта. Опубліковано 21.07.2013 р. Спеціалісти біоінженерії з Університету Дюка винайшли гель, який містить стовбурові клітини і дозволить відновити хрящову тканину після введення в міждисковий простір. http://inmeds.com.ua/content/news/index.php?news=12093

2.3. Хрящова тканина Захворювання опорно-рухового апарату продовжують бу- ти причиною важкої інвалідності в усьому світі. Основним напрямком в їхній терапії, зокрема при запальних захворюваннях, є пригнічення запального процесу і тим самим запобігання руйнуванню суглобів. Хірургічні досягнення включають мінімально інвазивну та комп’ютерно–роботизовану хірургію та вдосконалення методів артроскопічної хірургії. Розробка нових мате ріалів для лікування хронічних деструктивних захворювань, а також травм опорно-рухового апарату – сухожиль, хрящів і кісток із використанням нанотехнологій і CК має потужний потенціал. Нові моделі надання лікувальних послуг повинні бути розроблені, щоб забезпечити відповідну ефективну допомогу [1, 2]. Відомо, що в хрящову тканину здатні диференціюватися мезенхімні СК [3, 4] із глибокого клітинного шару перихондрію (додаток 2). Популяції мультипотентних СК існують у кістковому мозку дорослої людини і становлять значний терапевтичний потенціал для регенеративної медицини [5, 6]. Джерелом СК для регенерації хрящової тканини можуть служити також СК із пульпи зуба [7], СК виділені під час ендопротезування колінного суглоба [8] чи артропластичних операцій на коліні [9], СК синовіальної оболонки суглобів [10 - 13], СК хрящів носових раковин [14], СК охрястя та окістя [15]. Тобто, у регенерації хряща використовуються різні типи клітин. Маркерами клітин хрящової тканини вважаються наступні (табл. 3). Хрящ, пошкоджений унаслідок травми, має обмежені можливості до регенерації. Сучасними методами лікування невеликих дефектів є артроскопічна хірургічна обробка рани та відновне лікування, у тому числі й автологічна імплантація хондроцитів. Великі дефекти вимагають кістково-хрящового алотрансплан-

Розділ 2. С товбурові

117

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

Таблиця 3

Маркери клітин хрящової тканини (хондроцити) Маркер

Значення

Колаген типу II і IV Кератин

Структурні білки, які виробляються хондроцитами Основний білок шкіри; ідентифікує диференційовані кератиноцити Молекули знаходяться в сполучній тканині; синтезовані хондроцитами

Сульфатовані протеоглікани

тата або цілого суглоба. Проте, майбутнє лікування дефектів хрящів полягатиме в забезпеченні біологічного рішення через регенерацію хряща. Лабораторні та клінічні дослідження при великих пошкодженнях вивчають можливості тканинної інженерії хряща. Матеріали в якості каркаса хряща включають білки, вуглеводи, синтетичні матеріали, а також композитні полімери. Використовують каркаси, тканини з нановолокон або побудовані як гідрогелі. Саме нановолокна оптимально відповідають умовам «риштувань» у побудові хрящової тканини [16 - 18]. Хондрогенез може бути пришвидшений при застосуванні хондроіндуктивних факторів росту. До них належать прямі і непрямі механічні та хімічні сигнали, що відіграють важливу роль у регуляції долі СК [19]. Для підвищення доставки поживних речовин і забезпечення механічної стимуляції за тканинної інженерії хрящів, яка характерна для природних умов, розробляються біореактори (пристрої, в яких біологічний чи біохімічний процес може бути відтворений у контрольованих умовах, наприклад, рН, температура, поживних речовин, напруги O2 і видалення продуктів життєдіяльності) [20]. У даний час міждисциплінарні підходи для побудови хрящів спрямовані на вдосконалення підходів регенераційної медицини хряща з метою їхнього використання в клінічній практиці [21, 22]. Хондрогенез як процес, за допомогою якого мезенхімні клітини диференціюються в хондроцити, контролюється комплексом, що включає багато компонентів, у тому числі і внутрішньоклітинні сигнальні шляхи, рецептори плазмолеми та іонні канали (Са2+) [23] (рис. 5).

ови хрящів спрямовані на вдосконалення підходів регенераційної цини хряща з метою їхнього використання в клінічній практиці [21, 22]. Хондрогенез як процес, за допомогою якого мезенхімні клітини ренціюються в хондроцити, контролюється комплексом, що включає о компонентів, у тому числі і внутрішньоклітинні сигнальні шляхи, Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б. тори плазмолеми118 та іонні канали (Са2+) [23] (рис. Чайковський 5).

Ключовим регулятором хонд рогенезу in vivo та in vitro вважаSox9, Wnt-3a, ють Sox9 [24]. У хондрогенезі бере TGF -β3, HoxA, HoxD участь сигнальний шлях Wnt3а, BMPs, FGF Gli3 який сприяє дифе ренціації ме Клітинизенхімних СК через SS-Кате попередниці нін-опосередкований канонічний IGF-1, Wnt шлях та інгібує хондрогенез FGF-/FGFR2, Sox9 через кальцій/кальмодулін-за BMPsF лежну кіназу неканонічного Wnt шляху, що може стати потужним Хондробласти засобом модулювання диференBMPs, Stat1, FGF/FGF-R ціації СК у хондроцити при регеGli3,2 нерації хряща [25, 26]. ТрансPTHrP Runx2 крипцій ний фактор росту індійХондроцити ського їжака (Indian Hedgehog protein) здатний викликати хонРис. 5. Механізми, які діють на Рис. 5. Механізми, які діють на мезенхімні клітини при мезенхімні стовбурові клітинистовбурові при дрогений напрямок диференціаерації хряща (транскрипційні фактори виділені косим шрифтом). регенерації хряща (транскрипційні ції первинної мезенхімної СК у фактори виділені косим шрифтом). [27]. Ключовим регулятором хондрогенезу in vivo та in людини vitro вважають В-лімфоцит [24]. У хондрогенезі бере участьморфогенетичні сигнальний шлях Wnt3а, сприяє Кісткові білкиякий BMP-2 і BMP-7 мають протиренціюванню мезенхімних СК через SS-Катенін–опосередкований лежну дію на результат диференціації клітин-попередниць хонічний Wnt шлях та інгібує хондрогенез через кальцій/кальмодуліндроцитів: дієможе як конкретний ну кіназу неканонічного WntBMP-2 шляху, що стати потужниміндуктор засобом гіпертрофії хондролювання диференціювання у хондроцити при регенерації хрящапідвищує [25, цитів, у СК той час як ВМР–7, ймовірно, або підтримує Транскрипційнийхондрогенний фактор росту індійського (Indian Hedgehog потенціалїжака і запобігає гіпертрофії хондроцитів. Це n) здатний викликати хондрогений напрямок диференціювання прокласти нної мезенхімноїможе СК у людини [27]. шлях до диференційного використання ВМР–2 або BMP–7 29]. На думку Cha et Кісткові морфогенетичні білки[28, BMP-2 і BMP-7 мають B.H. протилежну діюal. [30], спільне вико зультат диференціювання клітин–попередниць хондроцитів: BMP-2до дієпідвищення ефектив ристання ВМР–2 і Sox9 може призвести онкретний індуктор гіпертрофії хондроцитів, у той час як ВМР–7, ності відновлення нормальних хондрогенних властивостей у дерно, підвищує або підтримує хондрогенний потенціал і запобігає диференційованих хондроцитах. У хондрогенезі людини важливу роль відіграють мікроРНК–194, H–89 і мікроРНК–23b [31, 32]. Розроблено протокол спрямованої 3–ступеневої диферен ціації хондроцитів, етапи якого імітують процеси розвитку і специфікації клонів цих клітин під час ембріогенезу. Цей протокол є унікальним і високоефективним для створення повноцінної диференціації хондроцитів і наближеним до їхнього клінічного застосування та в тканинній інженерії хрящів [33]. Мезенхімні стовбурові клітини

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

119

Згідно нових напрямків у регенераційній медицині для відтворення хрящової тканини проведені дослідження індукованих плюрипотентних СК, проте результатів методів індукції ще недостатньо для їхнього клінічного застосування. Була створена флуоресцентна система показників для моніторингу хондрогенної диференціації від індукованих СК для спрощення скринінгу ефективних факторів при використанні ретровірусної трансдукції Oct4, Sox2, Klf4 і с–Мус [34]. Альтернативним варіантом отримання хондроцитів для лікування дефектів хряща в людини стали жирові клітини [35]. Із підшкірної жирової клітковини були отримані СК, їх культивували в хондрогенному середовищі, впливали TGF-β3 і дійшли висновку, що в диференційованих хондроцитах, які розвинулися з жирової тканини, більш виражена експресія генів колагену ІІ типу, агреканів і глікозаміногліканів при меншій експресії колагену І і Х типів, порівняно з клітинами-похідними хрящової тканини, що є позитивним моментом, який наближає їх до природних хондроцитів [36]. Однак учені застерігають від екстраполяції позитивних результатів досліджень тварин на людину, оскільки певні лінії індукованих плюрипотентних СК можуть мати онкогенний потенціал [37]. Останнім часом у клітинній терапії, у тому числі і для вирощування хрящових клітин, із метою забезпечення більшої потужності регенерації з’явилися технології створення тривимірних структур – сфероїдів. Тут враховуються елементи мікросередовища, які відповідають природним умовам. Імплантація таких сфероїдів сприяє повноцінній регенерації хряща, як було показано на хрящових дефектах коліна кроля [38]. На підставі досліджень ембріогенезу встановлено, що в 3D культурі хрящової тканини Wnt3a і фактор росту фібробластів FGF-2 здатні викликати п’ятиразове збільшення числа проліферуючих мезенхімних СК [39]. Хрящова тканина, залежно від її виду та локалізації, має свої певні характеристики. Суглобовий хрящ є гіаліновим хрящем, має особливості в будові компонентів позаклітинного матриксу, профілів експресії генів і механічних властивостей у ділянці переходу хряща в епіфізарну пластинку кістки. До послідовних кроків формування цих хрящів залучаються ключові

120

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

регулятори Wnts, GDF-5, Еrg, і PTHLH. Суглобовий хрящ має обмежені регенеративні властивості, але, ймовірно, володіє і потенційно використовує внутрішні СК – хрящові, із синовіальної оболонки, жирової тканини, кісткового мозку і субхондральної кістки [40]. Для побудови інженерних конструкцій епіфізарних хрящів можна використовувати попередньо кріоконсервовані хрящові СК [41]. Потенційні ніші СК виявлені в міжхребцевих дисках і колінних суглобах ссавців. Важливим моментом є визначення напрямків міграції клітин для регенерації хрящової тканини в дорослих тварин. За допомогою забарвлення 5–бром–2–дезоксиуридином клітини, які проліферують, були виявлені в ділянках волокнистого кільця і драглистого ядра міжхребцевого диска і продемонстрована їхня повільна клітинна проліферація. У наближеній до волокнистого кільця зоні і охрясті виявлені ніші СК із великою кількістю 5–бром–2–дезоксиуридин–позитивних клітин. Тобто міжхребцевий диск являє собою тканину з тривалою повільною клітинною проліферацією як у волокнистому кільці, так і в драглистому ядрі. Ніша СК, виявлена в зоні зв’язки волокнистого кільця і охрясті, відіграє велику роль у морфології і функції міжхребцевого диска. Ці результати можуть мати важливе значення для розробки стратегії біологічного лікування дегенеративних процесів у міжхребцевому диску [42 - 45]. Усе більше і більше уваги приділяється тканинній інженерії менісків. Різні підходи і стратегії для отримання СК, каркасів, біореакторів долучили свій внесок у покоління конструкцій меніска, які здатні до його відновлення при пошкодженні, але переведення успіхів фундаментальної науки до клінічного застосування все ще обмежене [46]. У перспективі США прогнозують до 2030 р. семиразове збільшення використання стовбуровоклітинних технологій у лікуванні остеоартриту, включаючи створення біологічного колінного суглобу та його імплантації [47]. • Матеріали опубліковані в статті Чайковський Ю.Б. Стовбурові клітини хрящової тканини / Ю.Б. Чайковський, С.Б. Геращенко, О.І. Дєльцова // Південноукраїнський медичний науковий журнал. - 2013. - № 5. - С. 136-140.

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

121

Література 1. Choong P. Achievements during the Bone and Joint Decade 2000-2010 / P. Choong, P. Brooks // Best Pract. Res. Clin. Rheumatol. – 2012. – Vol. 26(2). – P. 173–181. 2. New trends for knee cartilage regeneration: from cell-free scaffolds to mesenchymal stem cells / E. Kon, G. Filardo, A. Roffi [et al.] // Curr. Rev. Musculoskelet. Med. – 2012. – Vol. 5(3). – P. 223–243. 3. Enhancing the mesenchymal stem cell therapeutic response: cell localization and support for cartilage repair / S.E. Bulman, V. Barron, C.M. Coleman [et al.] // Tissue Eng. Part B Rev. – 2013. – Vol. 19(1). – P. 58–68. 4. Mesenchymal stem cells / Z. Pojda, E. Machaj, A. Kurzyk [et al.] // Postepy Biochem. – 2013. – Vol. 59(2). – P. 187–197. 5. Human mesenchymal stem cells overexpressing therapeutic genes: from basic science to clinical applications for articular cartilage repair / M. Cucchiarini, J.K. Venkatesan, M. Ekici [et al.] // Biomed. Mater. Eng. – 2012. – Vol. 22(4). – P. 197–208. 6. Cook D. Regulation of mesenchymal stem cell differentiation / D. Cook, P. Genever // Adv. Exp. Med. Biol. – 2013. – Vol. 786.– P. 213–229. 7. Rizk A. Human dental pulp stem cells expressing transforming growth factor β3 transgene for cartilage-like tissue engineering // A. Rizk, A.B. Rabie // Cytotherapy. – 2013. – Vol. 15(6). – P. 712–725. 8. Stem cells derived from osteoarthritic knee mesenchymal tissues: a pilot study / L.S. Labusca, P. Botez, F. Zugun Eloae [et al.] // Eur. J. Orthop. Surg. Traumatol. – 2013. – Vol. 23(2). – P. 169–176. 9. Progenitor cells from cartilage-no osteoarthritis-gradespecific differences in stem cell marker expression / P. Bernstein, I. Sperling, D. Corbeil [et al.] // Biotechnol. Prog. - 2013. – Vol. 29(1). – P. 206–212. 10. Jones B.A. Synovium-derived stem cells: a tissue-specific stem cell for cartilage engineering and regeneration / B.A. Jones, M. Pei // Tissue Eng. Part B Rev. – 2012. – Vol. 18(4). – P. 300– 311.

122

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

11. Synovium-derived mesenchymal stem cells encapsulated in a novel injectable gel can repair osteochondral defects in a rabbit model / J.C. Lee, S.Y. Lee, H.J. Min [et al.] // Tissue Eng. Part A.– 2012. – Vol. 18(19–20). – P. 2173–2186. 12. Properties and usefulness of aggregates of synovial mesenchymal stem cells as a source for cartilageregeneration / S. Suzuki, T. Muneta, K. Tsuji [et al.] // Arthritis Res. Ther. – 2012.– Vol. 14(3). – P. R136. 13. RhoA/Rho kinase signaling regulates transforming growth factor-β1-induced chondrogenesis and actin organization of synovium-derived mesenchymal stem cells through interaction with the Smad pathway / Т. Xu, M. Wu, J.Feng [et al.] // Int. J. Mol. Med. – 2012. – Vol. 30(5). – P. 1119–1125. 14. Human inferior turbinate: an alternative tissue source of multipotent mesenchymal stromal cells / S.H. Hwang, S.Y. Kim, S.H. Park [et al.] // Otolaryngol. Head Neck Surg. – 2012. – Vol. 147(3). – P. 568-574. 15. Cell sources for cartilage repair; contribution of the mesenchymal perivascular niche / L. Jr. Diaz-Flores, R. Gutierrez, J.F. Madrid [et al.] // Front. Biosci. (Schol Ed.). – 2012. – Vol. 4.– P. 1275–1294. 16. Luo W.Q. Proliferation and chondrogenic differentiation of precartilaginous stem cells in self–assembling peptide nanofiber scaffolds / W.Q. Luo, J. Fan, C. Ye // Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. – 2012. – Vol. 26(12). – P. 1505–1511. 17. Fabrication and characterization of multiscale electrospun scaffolds for cartilage regeneration / E.J. Levorson, P. Raman Sreerekha, K.P. Chennazhi [et al.] // Biomed Mater. – 2013. – Vol. 8(1). – P. 014103. 18. In vitro cartilage production using an extracellular matrix– derived scaffold and bone marrow–derived mesenchymal stem cells / Y.H. Zhao, Q. Yang, Q. Xia [et al.] // Chin. Med. J. (Engl.). – 2013. – Vol. 126(16). – P. 3130–3137. 19. Wang Y.K. Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation / Y.K. Wang, C.S. Chen // J. Cell Mol. Med. – 2013. – Vol. 17(7). – P. 823–832.

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

123

20. Mabvuure N. The role of bioreactors in cartilage tissue engineering / N. Mabvuure, S. Hindocha, W.S. Khan // Curr. Stem Cell Res. Ther. – 2012. – Vol. 7(4). – P. 287–292. 21. Tissue engineering and regenerative medicine: past, present, and future / A.J. Salgado, J.M. Oliveira, A. Martins [et al.] // Int. Rev. Neurobiol. – 2013. – Vol. 108. – P. 1–33. 22. Tuan R.S. Cartilage regeneration / R.S. Tuan, A.F. Chen, B.A. Klatt // J. Am. Acad. Orthop. Surg. – 2013. – Vol. 21(5). – P. 303–311. 23. Matta C. Calcium signalling in chondrogenesis: implications for cartilage repair / C. Matta, R. Zakany // Front. Biosci. (Schol Ed). – 2013. – Vol. 5. – P. 305–324. 24. Direct conversion of tenocytes into chondrocytes by Sox9 / A. Takimoto, M. Oro, Y. Hiraki [et al.] // Exp. Cell Res. – 2012. – Vol. 318(13). – P. 149–1507. 25. Huey D.J. Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive / D.J. Huey, J.C. Hu, K.A. Athanasiou // Science. – 2012.– Vol. 338(6109). – P. 917–921. 26. WNT3A modulates chondrogenesis via canonical and non– canonical Wnt pathways in MSCs / F. Qu, J. Wang, N. Xu [et al.] // Front. Biosci. (Landmark Ed.). – 2013. – Vol. 18. – P. 493–503. 27. Indian hedgehog gene transfer is a chondrogenic inducer of human mesenchymal stem cells / A.F. Steinert, M. Weissenberger, M. Kunz [et al.] // Arthritis Res. Ther. – 2012. – Vol. 14(4). – P. R168. 28. Renner J.N. Bone morphogenetic protein–derived peptide promotes chondrogenic differentiation of human mesenchymalstem cells / J.N. Renner, Y. Kim, J.C. Liu // Tissue Eng. Part A. – 2012. – Vol. 18(23–24). – P. 2581–2589. 29. Hypertrophic differentiation during chondrogenic differentiation of progenitor cells is stimulated by BMP–2 but suppressed by BMP–7 / M.M. Caron, P.J. Emans, A. Cremers [et al.] // Osteoarthritis Cartilage. – 2013. – Vol. 21(4). – P. 604–613. 30. Cartilage tissue formation from dedifferentiated chondrocytes by codelivery of BMP–2 and SOX–9 genes encoding bicistronic vector / B.H. Cha, J.H. Kim, S.W. Kang [et al.] // Cell Transplant. – 2013. – Vol. 22(9). – P. 1519–1528.

124

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

31. The role of microRNA–23b in the differentiation of MSC into chondrocyte by targeting protein kinase A signaling / O. Ham, B.W. Song, S.Y. Lee [et al.] // Biomaterials. – 2012. – Vol. 18. – P. 4500–4507. 32. MiR–194 regulates chondrogenic differentiation of human adipose–derived stem cells by targeting Sox5 / J. Xu, Y. Kang, W.M. Liao [et al.] // PLoS One. – 2012. – 7(3). – P. e31861. 33. Chondrocyte protocol / R.A. Oldershaw, M.A. Baxter, E.T. Lowe [et al.]. // Режим доступу до журн. : Stem Book [Internet]. Cambridge (MA): Harvard Stem Cell Institute; 2008 – 2012. – Jun 10. 34. Generation of Col2a1-EGFP iPS Cells for Monitoring Chondrogenic Differentiation / T. Saito, F.Yano, D. Mori [et al.] // PLoS One. – 2013. – Vol. 8(9). – P. e74137. 35. Morphology and mechanics of chondroid cells from human adipose-derived Stem cells detected by atomic force microscopy / S. Luo, Q. Shi, Z. Zha [et al.] // Mol. Cell Biochem. – 2012. – Vol. 365(1–2). – P. 223–231. 36. Comparison between Chondrogenic Markers of Differentiated Chondrocytes from Adipose Derived Stem Cellsand Articular Chondrocytes In Vitro / M. Mardani, B. Hashemibeni, M.M. Ansar [et al.] // Iran J. Basic Med. Sci. – 2013. – Vol. 16(6). – P. 763–773. 37. Cartilage tissue engineering identifies abnormal human induced pluripotent stem cells / A. Yamashita, S. Liu, K. Woltjen [et al.] // Sci. Rep. – 2013. – Vol. 3. – P. 1978. 38. Cartilage self-heating contributes to chondrogenic expression / G.S. Huang, C.S. Tseng, B. Linju Yen [et al.] // Eur. Cell Mater.– 2013. – Vol. 26. – P. 179–194. 39. Priming 3D Cultures of Human Mesenchymal Stromal Cells Toward Cartilage Formation Via Developmental Pathways / M. Centola, B. Tonnarelli, S. Schären [et al.] // Stem Cells Dev. – 2013.– Vol. 22(21). – P. 2849–2858. 40. Toward regeneration of articular cartilage / M. Iwamoto, Y. Ohta, C. Larmour [et al.] // Birth Defects Res. C. Embryo. Today.– 2013. – Vol. 99(3). – P. 192–202. 41. You H. Culturing and cryopreservation of pre–cartilaginous stem cells from neonate rat / H. You, A. Chen, H. Cheng // Zhongguo

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

125

Xiu. Fu. Chong. Jian. Wai. Ke. Za. Zhi. – 2005. – Vol. 19(3). – P. 238-240. 42. Identification of cell proliferation zones, progenitor cells and a potentialstem cell niche in the intervertebral disc region: a study in four species / H. Henriksson, M. Thornemo, C. Karlsson [et al.] // Spine (Phila Pa 1976). – 2009. – Vol. 34(21). – P. 2278– 2287. 43. Chan S.C. Intervertebral disc regeneration or repair with biomaterials and stem cell therapy–feasible or fiction? S.C. Chan, B. Gantenbein-Ritter B. // Swiss Med. Wkly. – 2012. – Vol. 142. – P. w13598. 44. Diversity of intervertebral disc cells: phenotype and function // G. Pattappa, Z. Li, M. Peroglio [et al.] // J. Anat. – 2012. – Vol. 221(6). – P. 480–496. 45. Intervertebral disc–derived stem cells: implications for regenerative medicine and neural repair / W.M. Erwin, D. Islam, E. Eftekarpour [et al.] // Spine (Phila Pa 1976). – 2013. – Vol. 38(3). – P. 211–216. 46. Li S. Research progress in tissue engineered meniscus / S. Li, L. Rong // Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. – 2013. – Vol. 27(1). – P. 95–100. 47. Developments in stem cells: implications for future joint replacements /S.E. Maclaine, L.E. McNamara, A.J. Bennett [et al.] // Proc. Inst. Mech. Eng. H. – 2013. – Vol. 227(3). – P. 275–283.

126

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б. Американські хірурги вперше замінили три чверті черепа пацієнта імплантом, створеним за формою його голови і роздрукованим на 3D-принтері. Опубліковано 19.03.2013. http://www.hemafund.com/uk/news/hemafund_news/75protsentov-cherepa-amerikantsa-zamenili-raspechatannim-na-3D. html. Щелепна кістка, відновлена за допомогою стовбурових клітин, функціонує 3 роки поспіль. Опубліковано 27.03.2013. http://www.hemafund.com/uk/news/hemafund_news/ Chelyustnaya-kost-vosstanovlennaya-pri-pomoshchi-stvolovih-klet. html Новий матеріал і стовбурові клітини допоможуть у боротьбі з остеопорозом. Співробітники університетів Единбурга та Саутгемптона створили новий матеріал, який нагадує соти вулика і дозволяє стовбуровим клітинам затримуватися, прикріплюватися в певному місці і автоматично перетворюватися в клітини кісткової тканини. Джерело: www.meddaily.ru. http://www.hemafund.com/uk/news/hemafund_news/Novijmaterial-i-stvolovie-kletki-pomogut-v-borbe-s-osteoporozom.html

2.4. Кісткова тканина Проблеми, які виникають при пошкодженні кісток (травматичному, остеопорозі, остеопенії, остеоартрозі), мають соціальне значення і тому розуміння механізмів відновлення кісткової тканини дуже важливе і актуальне. Дослідження показують, що в природних умовах відновлювальні процеси в кістках дорослих нагадують нормальний розвиток скелета під час ембріогенезу, що може бути використане в якості моделі регенерації кісткової тканини. Крім того, нещодавні дослідження біології скелетних СК підкреслили кілька важливих молекулярних та клітинних процесів у кістковій тканині. У ці процеси активно включаються остеобласти, остеокласти і мезенхімні СК, транскрипційні фактори Hedgehog, Wnt, паратгормон-споріднений білок, кісткові морфогенетичні білки і мітоген-активована протеїнкіназа. Тим не менше, залишаються питання щодо точних механізмів формування кісток, взаємодії різних молекулярних процесів і реальні можливості регенеративних клітин [1]. Wnt/β-catenin сигнальний шлях має значен-

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

127

ня в ремоделюванні кістки, оскільки завдяки йому регулюється продукція кісткового матриксу [2]. Сформована кісткова тканина постійно розсмоктується і замінюється новою. Остеоцити підлягають апоптозу, oстеокласти активізуються і розсмоктують ділянки виниклих мікроушко джень iз подальшим ремоделюванням кістки [3, 4] а сусідні не-апоптичні остеоцити стають основним джерелом проостео кластогенних сигналів [5 - 6]. Тобто, остеоцити відіграють значну роль у процесах ремоделювання кістки. За недостатності відновлюваних процесів виникає остеопороз, який пов’язаний із порушенням будови трабекулярної і кортикальної мікроархітектури кісткової тканини, ступеня мінералізації позаклітинного матриксу і присутністю певної кількості мікропошкоджень кістки [7]. Підтримка кісткової маси вимагає збереження СК і преостеобластів, їх розмноження і диференціації згідно встановлених етапів. Стан недиференційованих клітин ще недостатньо вивчений. Водночас установлено, що швидкість утворення остеобластів регулюється частково паратгормоном та інсуліно-подібним фак тором росту. Клітини-попередниці виражається при диференціації мезенхімних СК для інших некісткових клітин, включаючи адипоцити. У процесах старіння скелета в балансі між утворенням і резорбцією кістки значну роль відіграє імунна дизрегуляція, яка обмежує утворення кісткової тканини, активує остеокласти. Основним чинником у цьому процесі є фактор некрозу пухлин-α [8]. У червоному кістковому мозку існують ніші для формування СК гематопоезу, до яких причетні остеобласти, ендотеліальні і периваскулярні клітини (рис. 6). Остеобласти є одним із основних, визначальних компонентів ніші гематопоетичних СК червоного кісткового мозку і впливають на розвиток останніх. Кількість трабекулярних остеобластів і гематопоетичних клітин взаємоузгоджені [9]. Термін «Остеобласти» зазвичай використовується для опису ендостального елементу ніші гематопоетичних клітин, але ці клітини є частиною великої родини клітин на різних стадіях диференціація, яка міститься в кістці [10]. Мезенхімні СК ідентифікуються за допомогою нестину, що є важливим компонентом ніші. Нестин+ СК містять коло-

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

128

нієтворні одиниці фібробластів і можуть бути трактовані як «mesenspheres», які можуть самостійно використані в серійних трансплантаціях. Nestin+ мезенхімні СК просторово пов’язані з гематопоетичними СК і адренергічними нервовими волокнами та експресують гени, які здатні ініціювати запуск диференціації остеобластів. При цьому вибірково пригнічується мобілізація гематопоетичних СК або активація β3-адренорецепторів. Водночас втручання паратгормона подвоює кількість нестин+ клітин і сприяє диференціації остеобластів. Osteopontin CS44 Notch Jagged Kitl, Kit sKitl integrins Позаклітинний матрикс HSP

Диференціація

Мобілізація

KП

ДK

СКГ Самооновлення

Синусоїд Ендоост, кістка

Остеобласти Ендостальна ніша

Судинна ніша

Рис. 6. Ніша гематопоетичних клітин у червоному кістковому мозку. Позначення: СКГ гематопоетичних - стовбурова клітина гематопоезу; Рис. 6. Ніша клітин у червоному кістковому мозку. КП - клітина-попередниця; СКГ -(зріла) стовбурова ДК -Позначення: диференційована клітина.клітина гематопоезу; КП - клітинапопередниця; ДК - диференційована (зріла) клітина. Косим шрифтом виділені транскрипційні фактори. Примітку, якщомезенхімних не вписується можна не давати! Примітка: маркери стовбурових клітин гематопоезу CD105, CD73 (SH3/4), CD44, CD90, CD71, Stro-1, CD106, CD166, CD29, CD54.

У природних умовах виснаження нестин+ клітин швидко знижує вміст гематопоетичних клітин у кістковому мозку. Ці дані розкривають безпрецедентне партнерство між двома різ-

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

129

ними типами соматичних СК і вказують на унікальну нішу в кістковому мозку, яка вміщає пари гетеротипових СК [11]. До мінімальних критеріїв мезенхімних СК, які мають остеогенний диференційний потенціал, належить CD73+ [12]. У нішах мезенхімних СК червоного кісткового мозку діє гранулоцитарний колонієстимулювальний фактор (G-CSF), який викликає зміни в морфології та експресії генів остеоцитарної мережі [13]. Остеобласти диференціюються з плюрипотентних мезенхімних СК червоного кісткового мозку [14] і характеризуються визначеними маркерами (табл. 4). Остеобласти синтезують кістковий матрикс для формуванні кісток, відіграють найважливішу роль у мінеральному обміні речовин, кровотворенні і резорбції кісткової тканини. B останнє десятиліття, було продемонстровано вирішальне значення кількох факторів транскрипції в диференціації остеобластів - Hedgehog, Notch, Wnt і кісткових морфогенетичних білків [15 - 18]. Таблиця 4

Маркери остеобластів Маркер

Значення

Кісткової фракції лужної Фермент, виражений в остеобластах; його активність фосфатази (БАТ) вказує на формування кісток Гідроксиапатит

Мінералізований кістковий матрикс, який забезпечує структурну цілісність; маркер формування кістки

Остеокальцин

Мінерал-зв’язуючий білок синтезується остеобластами; маркер формування кістки

Сигнальні шляхи з різними функціями відіграють важливу роль у ВМР-опосередкованому остеогенезі [19, 20]. Кісткові морфогенетичні білки є членами TGF-β суперродини і є найважливішими в розвитку скелета, формуванні кісток і диференціації СК. За останніми даними, TGF-2 (фактор росту фібробластів) стимулює процес диференціації остеобластів в остеоцити [21]. Runx2 експресується клітинами-попередницями при їхньому розвитку в остеобласти. Зміни відбуваються під впливом транскрипційного фактора Osrerix, який активізує гени-мішені в цих клітинах під час диференціації остеобластів [22].

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б. 130 періодами росту, дозрівання і старіння скелета. Функції остеобластів зберігалися навіть лінії у старших осіб. Ці результати показують, що зниження Клітинні остеобластів виникають із мезенхімних СК і є активності формуванні кісток у літніх суб'єктів може бути, зокрема, пов'язано важливою мішенню для розвитку кісткових анатомічних агентів зі зменшенням кількості osteoprogenitor клітин і їхніми можливостями (рис. 7). диференціюватися в остеобласти [23]. Мезенхімні стовбурові клітини Notch

Ids, CTGF, Hey1

Проліферація Клітинипопередниці Wnt

BMP9 Runx2, Osterix

Остеобласти Osteopontin, Osteocalcin

Wnt Диференціація

Остеоцити

Основні події BMP-індукованого остеогенного Рис. Рис. 7. 7. Основні події BMP-індукованого остеогенного диференціювання мезенхімних стовбурових в остеоцити диференціювання мезенхімних стовбурових клітин вклітин остеоцити (фактори (фактори транскрипції виділені косимтранскрипції шрифтом). виділені косим шрифтом). Notch, Notch, Wnt - сигнальні шляхи.шляхи, ВМР - ВМР кісткові морфогенетичні білки.білки Позначення: Wnt - сигнальні - кісткові морфогенетичні Плюрипотентні мезенхімні стромальні клітини мозку, червоноговони кісткового При культивуванні клітин кісткового започатмозку, ізольовані від людських кісток у культурі в присутності інсуліну або із ковувалися від колонієтворних одиниць фібробластів-(КТО-Ф) пролактину, виявляють організацію цитоскелета і AP-1 транскрипційну такими сайту, ознаками остеобластів, як активність лужноїу фосфатази активність що нагадують проліферативні osteochondrocytes, той час і формування кальцикованих вузликів in vivo. як у присутності дексаметазону, пролактину або TGF-β Підтвердженням - остеобласти. Подібні умови відповідають спостереженням під час із цьомуспецифічні є дослідиклітинні з отриманням колонієтворних фібробластів розвитку ендохондральної кістки [24]. клубової кістки осіб віком від 4 до 88 років без метаболічних Остеобласти, що формують клітини кісткової тканини є важливим захворювань кісток,мережі які мали фенотип остеобластів (наявність компонентом стільникової червоного кісткового мозку. Установлено, активності лужної фосфатази, остеокальцину, рецепторів паратщо паратиреоїдний гормон шляхом активації PTH/PTHrP рецепторів (PTH1R) в остеобластах може змінити нішу гематопоетичних СК і значно поліпшити гормону мРНК і формування кальцинованих конкрецій у пробір-

ці). Кількість клітин із найвищою активністю лужної фосфатази було виявлено в наймолодшій групі віком до 10 років, яка різко скоротилася після 10 років із поступовим зниженням із віком,

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

131

що може бути пов’язано з певними періодами росту, дозрівання і старіння скелета. Функції остеобластів зберігалися навіть у старших осіб. Ці результати показують, що зниження активності формуванні кісток у літніх суб’єктів може бути, зокрема, пов’язано зі зменшенням кількості osteoprogenitor клітин і їхніми можливостями диференціюватися в остеобласти [23]. Плюрипотентні мезенхімні стромальні клітини червоного кісткового мозку, ізольовані з кісток людини у культурі в присутності інсуліну або пролактину виявляють організацію цитоскелета і AP-1 транскрипційну активність сайту, що нагадують проліферативні osteochondrocytes, у той час як у присутності дексаметазону, пролактину або TGF-β - остеобласти. Подібні специфічні клітинні умови відповідають спостереженням під час розвитку ендохондральної кістки [24]. Остеобласти, що формують клітини кісткової тканини є важливим компонентом стільникової мережі червоного кістково го мозку. Установлено, що паратиреоїдний гормон шляхом активації PTH/PTHrP рецепторів (PTH1R) в остеобластах може змінити нішу гематопоетичних СК і значно поліпшити виживання мишей, що отримували трансплантації кісткового мозку. Ці висновки мають велике клінічне значення, оскільки вони пока зують, що стратегія, спрямована на зміну підтримувальних клітин у ніші СК, може розширити популяцію гематопоетичних СК. Важливим для взаємодії гематопоетичних клітин і остеобластів є Jagged1/Notch сигнальний шлях, модуляція якого необхідна для контролю мікросередовища СК у ряді органів і систем. Таким чином, слід передбачити додаткові молекулярні мішені для регулювання стану СК та їхньої взаємодії з компонентами мікросередовища в ніші червоного кісткового мозку. Інші клітини кісткової тканини - остеокласти - розвиваються з гематопоетичних клітин лінії моноцитів під контролем остеобластів [25 - 27]. До факторів, які необхідні для остеокластогенезу належать два цитокіни - макрофагальний колонієстимулювальний фактор (M-CSF) і рецептор активатора ядерного чинника Kappa-B ліганд (RANKL). Остеобласти також виробляють остеопротегерин - рецептор, який інгібує взаємодію між RANKL і RANK. Фактори, які стимулюють резорбцію кістки, регулюють експре-

132

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

сію RANKL і остеопротегерина. Ядерний чинник активованих Т-клітин, цитоплазматичний 1 (NFATc1) є фактором транскрипції для диференціювання остеокластів. Wnt білки активують два шляхи: β-catenin-залежний канонічний і β-катенін-незалежний неканонічний шлях. Wnt білки сприяють диференціації остеобластів через канонічний шлях. Канонічний шлях в остеобластах також пригнічує остеокластогенез через регуляцію експресії остеопротегерина і пригнічення експресії RANKL. З іншого боку, активація неканонічного шляху в попередниках остеокластів підвищує RANKL-індуковане диференціювання остеокластів. Таким чином, сигнали Wnt у клітинах-попередницях остеобластів і остеокластів відіграють важливу роль в остеокластогенезі [28]. У кістках і хрящах, як скелетних сполучних тканинах, проліферація та ріст остеокластів збалансовані з термінальною диференціацією. Підтримання цього балансу має важливе значення для моделювання, зростання і підтримання скелета. Відновлення хряща відбувається згідно програм, які регулюються гормонами і цитокінами, в яких ключовими елементами є сигнали Hedgehog і паратиреоїдного гормону [8]. Молекулярні аспекти остеогенезу і хондрогенезу включають також опосередковані сигнальні шляхи кісткових морфогенетичних білків для патерну скелетних елементів і механізмів для індукції хряща і кісткової тканини з мезенхімних попередників клітин [29]. В останні роки показано значний потенціал СК, як джерела недиференційованих попередників клітин для терапевтичного застосування у відновленні тканин або органів. Залишається багато невивчених питань, серед яких генетичні і епігенетичні сигнали, які регулюють долю СК. У даний час визнається, що мікросередовище СК може значно вплинути на їхню диференціацію і фенотипові ознаки. Окрім дії розчинних медіаторів, таких як фактори росту і цитокіни, є істотні прямі і непрямі докази того, що диференціацію СК можуть також регулювати механічні сигнали, які мають можливість впливати на диференціацію клітин, які були класифіковані як клітини-попередниці, прабатьки, або СК. Використання таких механічних сигналів у пробірці в ролі спеціальних «біореакторів» може надати важливі доповнення до стандартних біохімічних сигнальних шляхів для

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

133

поліпшення росту тканин. Подальше розуміння біомеханічних і біохімічних шляхів, що беруть участь у механічній передачі сигналу по СК, сподіваємося, забезпечить нове розуміння для поліпшення регенеративної терапії [30,31], а вивчення основних механізмів, як очікується, сприятиме розвитку нових стратегій для поліпшення відновних процесів у кістковій тканині. • Матеріали опубліковані в статті Геращенко С.Б. Стовбурові клітини кісткової тканини / С.Б. Геращенко, Ю.Б. Чайковський, О.І. Дєльцова // Зб. матеріалів міжнародної наук.-практ. конф. «Медична наука та практика: актуальні питання взаємодії». - Київ, 2013. - С. 9-13. Література 1. Deschaseaux F.Vechanisms of bone repair and regeneration / F. Deschaseaux, L. Sens'eb'e, D.Heymann // Trends Mol. Med. 2009. – Vol. 15(9). – P. 417-429. 2. Rossini M. Involvement of WNT/β-catenin signaling in the treatment of osteoporosis / M. Rossini, D. Gatti, S. Adami // Calcif. Tissue Int. - 2013. - Vol. 93(2). - P. 121-132. 3. Noble B. Microdamage and apoptosis / B. Noble // Eur. J. Morphol. - 2005. - Vol. 42(1-2). - P. 91-98. 4. Osteocyte apoptosis controls activation of intracortical resorption in response to bone fatigue // L. Cardoso, B.C. Herman, O. Verborgt [et al.] // J. Bone Miner. Res. - 2009. - Vol. 24(4). - P. 597-605. 5. Evidence for the role of osteocytes in the initiation of targeted remodeling / T.J. Heino, K. Kurata, H. Higaki [et al.] // Technol. Health Care. - 2009. - Vol. 17(1). - P. 49-56. 6. Activation of resorption in fatigue-loaded bone involves both apoptosis and active pro-osteoclastogenic signaling by distinct osteocyte populations / O.D. Kennedy, B.C. Herman, D.V. Laudier [et al.] // Bone. - 2012. - Vol. 50(5). - P. 1115-1122. 7. Microcracks in cortical bone: how do they affect bone biology? / F.J. O’Brien, O. Brennan, O.D. Kennedy [et al.] // Curr. Osteoporos Rep. - 2005. - Vol. 3(2). - P. - C. 39-45. 8. Blair H.C. Balanced regulation of proliferation, growth, differentiation, and degradation in skeletal cells / H.C. Blair, L.

134

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Sun, R.A. Kohanski // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2007. - Vol. 1116.– P. 165-173. 9. Zhu J. A new bone to pick: osteoblasts and the haematopoietic stem-cellniche // J. Zhu, S.G. Emerson // Bioessays. – 2004. – Vol. 26(6). – P. 595-599. 10. Askmyr M. What is the true nature of the osteoblastic hаematopoietic stem cellniche? / M. Askmyr, N.A. Sims, T.J. Martin [et al.] // Trends Endocrinol. Metab. - 2009. – Vol. 20(6). – P. 303-309. 11. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche / S. Méndez-Ferrer, T.V. Michurina, F. Ferraro [et al.] // Nature. - 2010. - Vol. 466(7308). – P. 829-834. 12. Kim N. Clinical applications of mesenchymal stem cells / N. Kim, S.G. Cho // Korean J. Intern. Med. - 2013. - Vol. 28(4). - P. 387-402. 13. Matrix-embedded osteocytes regulate mobilization of hematopoietic stem/progenitor cells / N. Asada, Y. Katayama, M. Sato [et al.] // Cell Stem Cell. - 2013. - Vol. 12(6). - P. 737-747. 14. Rosenberg N. Osteoblasts in bone physiology-mini review / N. Rosenberg, O. Rosenberg, M. Soudry // Rambam Maimonides Med. J. - 2012. - Vol. 3(2). - P. e0013. 15. Chen D. Bone morphogenetic proteins / D. Chen, M. Zhao, G.R. Mundy // Growth Factors. - 2004. - Vol. 22(4). - P. 233-241. 16. Watanabe K. Ikeda K. Osteoblast differentiation and bone formation / K. Watanabe, K. Ikeda // Nihon Rinsho.- 2009. – Vol. 67(5). – P. 879-886. 17. Tamura Y. Wnt signal and Bone. Parathyroid hormone and Wnt signaling / Y. Tamura, H. Kaji // Clin. Calcium. - 2013. - Vol. 23(6). - P. 847-852. 18. Kobayashi Y. Wnt signal and Bone. Regulation of osteoclast differentiation by Wnt signals / Y. Kobayashi // Clin. Calcium. 2013. - Vol. 23(6). - P. 831-838. 19. BMP9 signaling in stem cell differentiation and osteogenesis / J.D. Lamplot, J. Qin, G. Nan [et al.] // Am. J. Stem Cells. - 2013.Vol. 2(1). - P. 1-21. 20. Liu C. CXCL12/CXCR4 signal axis plays an important role in mediating bone morphogenetic protein 9-induced osteogenic

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

135

differentiation of mesenchymal stem cells / C. Liu, Y. Weng, T. Yuan [et al.] // Int. J. Med. Sci. - 2013. - Vol. 10(9). - P. 1181-1192. 21. Mi Ran Byun. FGF2 stimulates osteogenic differentiation through ERK induced TAZ expression / Mi Ran Byun, A.Rum Kim, Jun-Ha Hwang [et al.] // Bone. - 2013. - Vol. 58. - P. 72-80. 22. Sinha K.M. Osterix and NO66 histone demethylase control the chromatin architecture of Osterix target genes during osteoblast differentiation / K.M. Sinha, H. Yasuda, X. Zhou // J. Bone Miner. Res. - 2013. - Sep 23. Режим доступу до журн. : doi: 10.1002/ jbmr.2103. 23. Number of osteoprogenitor cells in human bone marrow markedly decreases after skeletal maturation // S. Nishida, N. Endo, H. Yamagiwa [et al.] // J. Bone Miner. Metab. – 1999. – Vol. 17(3). – P. 171-177. 24. Functional characterization of human mesenchymal stem cells that maintain osteochondral fates / M. Romero-Prado, C. Bl'azquez, C. Rodr'iguez-Navas [et al.] // J. Cell Biochem. – 2006.– Vol. 98(6). - P. 1457-1470. 25. Wnt5a-Ror2 signaling between osteoblast-lineage cells and osteoclast precursors enhances osteoclastogenesis / K. Maeda, Y. Kobayashi, N. Udagawa [et al.] // Nat Med. - 2012. - Vol. 18(3). - P. 405-412. 26. Maeda K. Roles of Wnt signals in bone resorption during physiological and pathological states / K. Maeda, N. Takahashi, Y. Kobayashi // J. Mol. Med. (Berl). - 2013. - Vol. 91(1). - P. 15-23. 27. Yamashita T. New roles of osteoblasts involved in osteoclast differentiation / T. Yamashita, N. Takahashi, N. Udagawa // World J. Orthop. - 2012. - Vol. 3(11). - P. 175-181. 28. Regulatory mechanism of osteoclastogenesis by RANKL and Wnt signals / N. Takahashi, K. Maeda, A. Ishihara [et al.] // Front Biosci. - 2011. - Vol. 16. - P. 21-30. 29. Hoffmann A. BMP signaling pathways in cartilage and bone formation / A. Hoffmann, G. Gross // Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. – 2001 – Vol. 11(1-3). - P. 23-45. 30. Estes B.T. Mechanical signals as regulators of stem cell fate / B.T. Estes, J.M. Gimble, F. Guilak // Curr. Top. Dev. Biol. – 2004. – Vol. 60. - P. 91-126.

136

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

31. Molecular mechanisms of mesenchymal stem cell differentiation towards osteoblasts / M. Fakhry, E. Hamade, T. Badran [et al.] // World J. Stem Cells. - 2013. - Vol. 5(4). - P. 136. Стовбурові клітини відновлюють м’язи. Опубліковано 12.03.2009. Команда вчених з університету Колорадо визначила тип стовбурових клітин скелетно-м`язової тканини, що сприяють відновленню після травм. Досліди, проведені на мишах, мають величезне значення для терапії враженої, хворої або старіючої тканини м`язів, а також при м`язовій дистрофії. http://health.unian.net/ukr/ detail/195667 Голандські вчені навчилися отримувати м’язи зі стовбурових клітин тварин. Опубліковано 04.12.2013. Задля вирощення м’язової тканини вчені брали міосателітоцити з м’язів ссавців, поміщали в живильні розчини з водорозчинних полімерних каркасів із перспективою вирощування м’яса в пробірці. http://market.avianua.com/?p=2995

2.5. М’язова тканина Відомо, що камбіальними елементами посмугованої несер цевої (скелетні і посмуговані несерцеві нутрощеві м’язи) м’язової тканини є міосателітоцити (додаток 3). Це одноядерні клітини, які локалізуються між базальною мембраною і плазмолемою міосимпласта. Соматичні м’язи відносять до постмітотичних тканин, які оновлюються повільно [1]. Можливості регенерації посмугованої м’язової тканини почали вивчати з ХІХ століття. Зокрема, завідувач кафедри гістології Київського університету святого Володимира Петро Перемежко 1863 року у своїй дисер тації описав «м’язові ядра» і з’ясував їхнє значення в процесах розвитку та відновлення посмугованих м’язових волокон. Фактично ж він відкрив міосателітоцити і лише недостатня роздільна здатність світлового мікроскопа не дозволила вченому зробити правильний висновок. Лише в 1961 р. за допомогою електронного мікроскопа Олександр Мауро ідентифікував міосателітоцити. Він докладно описав їхню ультраструктуру і висловив думку, що вони можуть відновити м’яз. А Бернард Кац пов’язав їх із регенерацією інтрафузальних м’язових волокон [2]. В останні роки переконливо доведено, що міосателіто-

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

137

цити є основним клітинним джерелом регенерації посмугованої м’язової тканини [3, 4]. Клітини–міосателітоцити є самодостатніми в якості джерела регенерації. Сім міосателітоцитів з одного пересадженого м’язового волокна можуть утворити понад 100 м’язових волокон, які містять тисячі нових міоядер. Після експериментальної травми ці клітини швидко розповсюджуються і відновлюють великі компактні кластери м’язових волокон [5]. Але, незважаючи на 50–річне інтенсивне вивчення регенерації м’язів, залишається ще багато невивчених моментів [6]. Найбільш поширені маркери СК м’язової тканини представлені в табл. 5. Таблиця 5

Маркери стовбурових клітин м’язової тканини Маркер

Значення

MyoD

Транскрипційний фактор безпосереднього диференціювання клітин-попередниць у зрілі міоцити. Належить до родини білків, відомих як регуляторні міогенні фактори (MRFs, bHLH - basic helix loop helix). Родина MRF включає MyoD, Myf5, myogenin і MRF4 (Myf6) Транскрипційний фактор, який експресують м’язові стовбурові i активовані клітини-сателіти при регенерації (і ко-експресують MyoD) Ген родини транскрипційних факторів Рах, раніше відомий як sploth,відіграє разом із C-met важливу роль у міогенезі Білок із родини міогенних регуляторних факторів, відіграє ключову роль у регуляції диференціації м’язової тканини або міогенезі. Мембранний рецептор, MET або MNNG HOS, протонкоген, який кодує білок відомий як рецептор фактора росту гепатоцитів (HGFR), в ембріональному розвитку має вирішальне значення для ангіогенезу та процесів міграції в міогенезі Трансмембранні рецептори, які забезпечують міжклітинні або з позаклітинним матриксом контакти, у сигнальній трансдукції передають інформацію про хімічний склад і механічний стан позаклітинного матриксу β1 взаємодіють із багатьма α-ланцюгами Поодинокі трансмембранні домени білків на поверхні клітини, діють як ко-рецептори, особливо для рецепторів, зв’язаних із G-білком

Pax7

Рах3 Myf5 c-met

integrin,α7, β1

Syndecans3,4

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

138 Notch1

Wnt

PW1 CD34 CD45

Myogenin і MR4

Myosin heavy chain Myosin light chain

Міжклітинний сигнальний шлях, трансмембранний рецептор, відіграє роль у процесах розвитку, контролюючи диференціацію клітин. Один із сигнальних шляхів клітини у тварин, що регулює ембріогенез, диференціацію тканин і розвиток ракових пухлин. «Мітотична Wnt сигналізація» сприяє клітинній проліферації Репортер Pw1, ідентифікує СК і клітини-попередниці в скелетних м’язах Глікопротеїн клітинної поверхні, фактор міжклітинної адгезії Член родини протеїн-тирозин-фосфатази (PTP), протеїн-тирозинфосфатази рецептор типу C (PTPRC), фермент, його сигнальні молекули регулюють процеси клітинного росту, диференціації, мітотичний цикл і пухлинну трансформацію Myogenin - транскрипційний фактор, основний-спіраль-петля-спіраль ( bHLH ), що бере участь у координації розвитку скелетного м’яза і регенерації і несерцевих м’язових волокон. Член родини MRF факторів транскрипції, яка також включає MyoD, Myf5 і Mrf4 (див. вище) Структурний і скорочувальний білок кардіоміоцитів Структурний і скорочувальний білок посмугованих несерцевих м’язових волокон

Процес регенерації скелетних м’язів складається з 4 етапів: дегенерації, запальної та імунної реакцій, відновлення та реконструкції, які регулюються численними молекулами, які експресуються м’язовими та імунними, епітеліальними, інтерстиційними та іншими клітинами, що локалізуються поблизу або в м’язовій тканині. До молекулярних механізмів долучаються цитокіни, фактори росту, еритропоетин, ферменти та активні форми кисню та азоту – активуючі чи гальмівні [7]. Одночасно з дегенерацією і запаленням у пошкодженій м’язовій тканині міосателітоцити, що знаходяться у стані спокою, активуються, проліферують, диференціюються і зливаються з утворенням багатоядерних м’язових волокон (рис. 8). На цих етапах морфогенетичного перетворення беруть участь фактор росту гепатоцитів, фактор росту фібробластів, трансформуючий фактор росту β, інсуліноподібний фактор росту, туморнекротизуючий фактор α та інші, функції яких у процесах постнатального міогенезу мало вивчені [8,9].

локалізуються поблизу або в м'язовій тканині. До молекулярних механізмів долучаються цитокіни, фактори росту, еритропоетин, ферменти та активні форми кисню та азоту – активуючі чи гальмівні [7]. Одночасно з дегенерацією і запаленням у пошкодженій м'язовій тканині міосателітоцити, що знаходяться у стані спокою, активуються, проліферують, диференціюються і зливаються багатоядерних Розділ 2. С товбурові клітини тканинз уутворенням постнатальному онтогенезі м'язових волокон 139 (рис. 8).

Міосателітоцити CD3 Міобласти Pax7 Злиття в міотуби Myf5/βMyoD

Утворення міофібрил і міосимпластів Myogenin

MLC3F-

Рис. 8. Схема міогенезу посмугованої м’зової тканини з клітин-сателітів Рис. 8. Схема міогенезу посмугованої м'зової тканини з клітині типові маркери кожної стадії [10]. сателітів і типові маркери кожної стадії [10].

Міосателітоцити, як головне джерело міобластів, у пост На цих етапах морфогенетичного перетворення беруть участь фактор на т альних м’язах розташовуються базальною фактор мембраною росту гепатоцитів, фактор росту фібробластів,під трансформуючий росту м’язового волокна.фактор Зовсімросту, недавно були ідентифіковані β, інсуліноподібний туморнекротизуючий фактор α маркери та інші, функції яких уСК. процесах постнатального міогенезу мало вивчені [8,9]. міогенрезидентних Це чинники транскрипції Рах3 і Рах7, Міосателітоцити, як головне джерело міобластів, у постнатальних ний фактор1 детермінації (MyoD) та міогенін. Більшість міосатем'язах розташовуються під базальною мембраною м'язового волокна. Зовсім літоцитів у дорослих м’язах можуть в міогенез - 12]. недавно були ідентифіковані маркери вступати резидентних СК. Це [10 чинники транскрипції Рах7, міогенний фактор1 детермінації (MyoD) та До цього Рах3 часу ідумки вчених розбігаються щодо визначення м’язових СК – це власне міосателітоцити чи інші окремі клітини. A.C. Sinanan et al. [13] стверджують, що СК м’язових волокон є міосателітоцити. Їхню думку підтримують L.G. Robson et al. [14], які називають міосателітоцити резидентами СК дорослих скелетних м’язів. Водночас інші автори зауважують, що міосателітоцити – це клітини–попередниці, а не СК [15]. S. Kuang et al. [16] на підставі отриманих результатів роблять узагальнений висновок про те, що міосателітоцити є гетерогенною популяцією, яка складається зі СК і комітованих клітин–попередниць. Рах3 і Рах7 виконують чітко окреслені функції в постнатальному міогенезі скелетних м’язів [17]. Рах7 експресується міосателітоцитами і потрібен для підтримання їхньої життєздат-

140

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

ності [18]. Рах7–клітини започатковують міогенні клітини-попередниці, які, у свою чергу, експресують bHLH (helix–loop–helic) транскрипційних факторів Myf5 i MyoD. Комплексний генетичний аналіз показав, що Myf5 i MyoD необхідні для міогенної диференціації, тоді як міогенін і MRT4 відіграють роль у кінцевій диференціації. При асиметричному поділі утворюються справжні СК із маркерами Pax7+/Myf5+ [19]. Рах3 сприяє регенерації Рах7 клітин, але не має антиапоптичних властивостей Рах7. У міогенній програмі Рах3 і Рах7 діють синергічно, що підкреслює їхню важливість у забезпеченні перетворення дизрегульованих СК у пухлинні (ракові) [20,21]. Установлено, що при постійній регенерації посмугованої м’язової тканини оксид азоту підтримує кількість і стан міосателітоцитів за участі Vangl2 i циклічного GMР сигнальних шляхів [22], а Notch шлях регулює долю м’язових стовбурових (Рах7+) клітин [23]. У перелік маркерів міосателітоцитів включили також CD34+ і сфінгомієлін мембранних ліпідів [24], М–кадгерин і молекули клітинної адгезії [25], CD34+ і c–met (фактор мезенхімно–епітеліального переходу) [26]. L.G. Robson et al. [14] у міосателітоцитах визначили маркер Bmit–1 і встановили, що Bmit–1 негативні клітини мають знижену здатність до проліферації, а власне Bmit–1 відіграє важливу роль у підтримці СК у дорослих скелетних м’язах і необхідний для їхньої ефективної регенерації після травм. У пошкоджених скелетних м’язах виявлено новий білок Xin, який сприяє активації м’язових СК [27, 28]. При регенерації міогенні потенційні сателітні клітини, які документують здатність виробляти потомство, зливаються в міо туби (міотрубочки). Важливо знати механізм злиття міобластів у трубочки і далі в м’язові волокна [29]. Проліферація СК, їх наступна диференціація і злиття в міотуби потребує допомоги певних факторів [30]. До них віднесли адгезивні білки, у тому числі й інтегрини [31]. М’язові СК та їх нащадки – клітини–попередниці знаходяться в стовбурових нішах, які локалізуються між базальною мембраною і плазмолемою м’язового волокна [32]. Ніша містить міогенні (СК–резиденти, клітини–попередниці міосателітоцитів)

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

141

і неміогенні (мезангіобласти, перицити, ендотеліоцити, СК кістковомозкового походження) клітини [33]. Останні підтримують міосателітоцити в спокої, доки вони не активовані. Між клітинами ніші існують контакти, які забезпечуються М–кадгерином, інтегринами (α1, α7 і β1) та Syndecans 3 i 4 (із рецепторів тирозин кіназ). Сигнальними шляхами в нішах служать Notch1 (розширює басейн міобластів) i Wnt (сприяє диференціації) [34]. У ніші діяльність СК клітин регулюють IGF–1 (пригнічуючий фактор росту) i TGF–β1 (трансформуючий фактор росту) [35]. Спеціальні дослідження показали, що без ніші м’язові СК не розвиваються, тому існує проблема створення м’язової стовбурової ніші з факторами взаємодії клітин, які забезпечують її матрикс [36, 37]. Знання клітин ніші і факторів, які регулюють асиметричний поділ, мають важливе значення для успішної розробки терапії СК м’язових захворювань [38] (рис. 9). В осіб похилого віку спостерігаються відхилення в системних впливах, збільшення кількості адипоцитів і фібробластів, порушення кровопостачання, що супроводжується зменшенням кількості ендотеліоцитів і мезангіобластів, зростає активність Wnt сигналу, що сприяє фіброгенезу, відбувається ремоделювання нервово–м’язових з’єднань. Базальна мембрана потовщується за рахунок накопичення токсичних побічних продуктів, які утворюються при деградації сполучної тканини. У результаті змінюється метаболізм м’язового скелетного волокна зі зменшенням площі його поперечного перерізу [39]. Iз віком виникає саркопенія – спонтанна втрата скелетної м’язової тканини, що призводить до фізичної слабкості [40]. Для попередження розвитку вікової патології м’язової тканини M. Cerletti et al. [41] пропонують обмеження калорій, яке продовжує термін служби, сприяє нормальному стану м’язових СК у молодих і старших осіб, хоча дослідники не пояснюють механізм цього явища. Cклад м’язової стовбурової ніші та її оточення в молодих і старих осіб відрізняється. У молодих осіб в інтерстиції між м’язовим волокном і прилеглим кровоносним капіляром розташовується пухка сполучна тканина з численними клітинами, які здійснюють позитивну і негативну регуляцію активності м’язових СК за рахунок системних і місцевих впливів і забезпечують сталі гомеостатич-

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

142

ні взаємовідношення цієї ділянки. Тут локалізуються мезангіобласти (і перицити), макрофаги, адипоцити, фібробласти, інтерстиційні клітини, аксони моторних нейронів і моторні бляшки (аксо–м’язові синапси). Базальна мембрана м’язового волокна відокремлює клітини від стовбурової ніші. В останній час привертають увагу дослідження інтерстиційних клітин м’язової тканини. Вони виявляють маркери PW1, але не Рах7 [42]. Окрім цього маркера СК інтерстицію різняться за іншими маркерами – CD34+/45–(SK–34) i CD34–/45– (SK–DN) [43]. Автори висловлюють думку про те, що серед них містяться клітини, які можуть бути новим джерелом міогенних клітин у повідомляли, що в регенерації м'яза після пошкодження відіграють роль не дорослих з утворенням м’язових волокон. Раніше G. Parise et тільки міосателітоцити. al. [44] повідомляли, що в регенерації м’яза після пошкодження відіграють роль не тільки міосателітоцити. Кровоносна судина

Ангіопоетин,Тіе2 Базальна мембрана Протеази (Tfpi2) Сульфатази FGF-рецептор

Інгібітори протеаз (серпін) IGF, Igfbp6 Металопротеїнази

Ламінін Інтегрин

Рах7 M-кадгерини

Міосателіт Notch, Delta

Ядро М'язове волокно

Ядро

Рис. 9. Фактори, які регулюють взаємини у стовбуровій Рис. 9. Фактори, регулюють м’язового взаємини волокна. у стовбуровій ніші ніші які посмугованого посмугованого м'язового волокна.

Не менше значення має міграція міосателітоцитів у забезпеченні швидкої регенерації м'язової тканини. Стало відомо, що рух міосателітоцитів відбувається в дві фази під базальною мембраною: І – повільна і ІІ –

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

143

Не менше значення має міграція міосателітоцитів у забезпеченні швидкої регенерації м’язової тканини. Стало відомо, що рух міосателітоцитів відбувається в дві фази під базальною мембраною: І – повільна і ІІ – пришвидшена. Міосателітоцити використовують при цьому пухирцеподібний (blebbing) чи амебоїдний рух, але без утворення ламелоподій. Для утворення пухирців (бульбашок) та міграції міосателітоцитів потрібен оксид азоту і неканонічний Wnt сигнальний шлях [45]. Із віком швидкість переміщення міосателітоцитів зменшується приблизно в два рази через порушення їхніх амебоїдних рухів і низький рівень експресії інтегринів та фактору росту гепатоцитів [46]. Триває розробка методів отримання та ізоляції м’язових СК у людини, оскільки їх у м’язах невелика кількість [47]. Нещодавно встановлено, що м’язових СК після смерті стає більше і гіпоксія та аноксія сприяє виживанню і збереженню СК [48]. Автори виділили з м’язів людини життєздатні міогенні СК через 17 діб і в миші - через 14 діб після смерті. Методи культивування м’язових клітин у пробірці вивчають ся й для розробки нових технологій промислового вирощення м’я са як продукту харчування. Уже багато зроблено в цьому напрямку, але, на жаль, вирощене «м’ясо» не відповідає вимогам, які ставляться до нього: імітації у всіх його фізичних відчуттях – зовнішній вигляд, запах, текстура і, звичайно, смак [49]. Таким чином, проблема регенерації скелетних м’язів нині інтенсивно вивчається. Це пов’язано з успіхами у визначенні м’язових СК та напрямків розробки можливостей їх використання в лікуванні хвороб різного генезу, при яких пошкоджені скелетні м’язи. З’явилася перспектива лікування м’язових дистрофій міогенними СК [50]. Як вважають M. Meregalli et al. [51], найліпший підхід до лікування м’язових дистрофій – це генна і стовбурова терапія. Водночас указується, що ембріональні СК небезпечнi через їхню туморогенність, а СК дорослих мають обмежені міграційні властивості і погано виживають [52]. СК серцевої і гладкої м’язової тканини описані у розділі «Серцево-судинна система». • Матеріали опубліковані в статті Геращенко С.Б. Стовбу рові клітини посмугованої м’язової тканини / С.Б. Геращенко,

144

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

О.І. Дє льцова, Ю.Б. Чайковський // Науковий вісник Ужго родського університету. Серія Медицина. - 2013. - Вип.1(46). С. 188-191. Література 1. Collins C.A. Satellite cell self–renewal / C.A. Collins // Curr. Opin. Pharmacol. – 2006. – Vol. 6(3). – P. 301–306. 2. Scharner J. Muscle satellite cell at 50: the formative years / J. Scharner, P.S. Zammet // Skelet. Muscle. – 2011. – Vol. 1(1).– P. 28. 3. Charge S.B. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration / S.B. Charge, M.A. Rudnicki // Physiol. Rev. – 2004.– Vol. 84(1). – P. 209–238. 4. Braek A.S. Tissue-specific stem cells: lessons from the skeletal muscle satellite cell / A.S. Braek, T.A. Rando // CellStem Cеll. – 2012. – Vol. 10(5). – P. 504–516. 5. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogenity of cells from the adult muscle satellite cell niche / C.A. Collins, I. Olsen, P.S. Zammit [et al. ] // Cell. – 2005. – Vol. 122(2). – P. 289–301. 6. Gayraud-Morel B. Skeletal muscle as a paradigm for regenerative biology and medicine / B. Gayraud-Morel, F. Chretien, S. Tajbakhsh // Regen. Med. – 2009. – Vol. 4(2). – P. 293–319. 7. Cell and molecular mechanisms of regeneration and reorganization of skeletal muscles / A. Zembron-Lacny, J. Krzywanski, J. Ostapiuk-Karolczuk [et al.] // Ortop. Traumatol. Rehabil. – 2012. – Vol. 14(1). – P. 1–11. 8. Muscle regeneration: cellular and molecular events / M. Karalaki, S. Fili, A. Philippon [et al.] // In Vivo. – 2009. – Vol. 23(5). – P. 779–796. 9. Fan C.M. Making Skeletal Muscle from Progenitor and Stem Cells: Development versus regeneration / C.M. Fan, L. Li, C. Lepper // Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. – 2012. – Vol. 1(3). P. 315–327. 10. Muscle satellite cells adopt divergent fates: a mechanism for self-renewal? / P.S. Zammit, J.P. Golding, Y. Nagata [et al.] // J. Cell Biol. – 2004. – Vol. 166(3). – P. 347–351.

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

145

11. Pax7 and myogenic progression in skeletal muscle satellite cells / P.S. Zammit, F. Relaix, Y. Nagata [et al.] // J. Cell Sci. – 2006. – Vol. 119(Pt 9). – P. 1824–1832. 12. Defining the transcriptional signature of skeletal musclestem cells / Z. Yablonka-Reuveni, K. Day, A. Vine [et al.] // J. Anim. Sci. – 2008. – Vol. 86 (Suppl.). – P. E207–216. 13. Sinanan A.C. Muscling in on stem cells / A.C. Sinanan, P.G. Buxton, M.P. Lewis // Biol. Cell. – 2006. –Vol. 98(4). – P. 203–214. 14. Bmi1 is expressed in postnatal myogenic satellite cells, controls their maintenance and plays an essential role in repeated muscle regeneration / L.G. Robson, V. Foggia, A. Radunovic [et al.] // PLoS One. – 2011. – Vol. 6(11). – P. e.27116. 15. Wernig A. Regeneration capacity of skeletal muscle / A. Wernig // Ther. Umsch. – 2003. – Vol. 60(7). – P. 383–389. 16. Assymetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle / S. Kuang, K. Kuroda, F. Le Grand [et al.] // Cell.– 2007. – Vol. 129(5). – P. 999–1000. 17. Contribution of stem cells to skeletal muscle regeneration / J. Kawiak, E. Brzocka, I. Grabowska [et al. ] // Folia Histochem. Cytobiol. – 2006. – Vol. 44(2). – P. 75–79. 18. Oustanina S. Pax7 directs postnatal renewal and propagation of myogenic satellite cells but not their specification / S. Oustanina, G. House, T. Braum // EMBO. – 2004. – Vol. 23(16). – P. 3430–3439. 19. The molecular regulation of musclestem cell / M.A. Rudnicki, F. Le Grand, I. McKinnell [et al.] // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. – 2008. – Vol. 73. – P. 323–331. 20. Pax3 and Pax7 have distinct and overlapping functions in adult muscle progenitor cells / F. Relaix, D. Montarras, S. Zaffran [et al.] // J. Cell Biol. – 2006. – Vol. 172(1). – P. 91–102. 21. Buckingham M. Skeletal muscle progenitor cells and role of Pax genes / M. Buckingham // C.R.Biol. – 2007. – Vol. 330(6–7).– P. 530–533. 22. Nitric oxide sustains long–term skeletal muscle regeneration by regulating fate of satellite cells via signaling pathways requiring Vangl2 and cyclic GMP / R. Buono, C. Vantaggiato, V. Pisa [et al.] // Stem Cells. – 2012. – Vol. 30(2). – P. 197–209.

146

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

23. Оберемко А. Получение остеопрогениторного трансплан тата in vitro / А. Оберемко, А. Попандопуло, В. Буше // LAP, 2013. - 104 c. 24. Collins C.A. Self-renewal of the adult skeletal muscle satellite cell / C.A. Collins, T.A. Partridge // Cell Cycle – 2005. – Vol. 4(10). – P. 1338–1341. 25. Stem and progenitor cells in skeletal muscle development, maintenance, and therapy / B. Peault, M. Rudnicki, Y. Torrente [et al.] // Mol. Ther. – 2007. – Vol. 15(5). – P. 867–877. 26. Otto A. The origin, molecular regulation and therapeutic potential of myogenic stem cell populations / A. Otto, H. CollinsHooper, K. Рatel // J. Anat. – 2009. – Vol. 215(5). – P. 477–497. 27. Xin, an actin binding protein, is expressed within muscle satellite cells and newly regenerated skeletal muscle fibers / T.J. Hawke, D.J. Alkinson, S.B. Kanatous [et al.] // Am. J. Physiol. Cell. – 2007. – Vol. 293(5). – P. 1636–1644. 28. Skeletal muscle regeneration is delayed by reduction in Xin expression: conseguence of impared satellite cell activation? / A.A. Nissar, B. Zemanek, R. Labata [et al.] // Am. J. Physiol. Cell. – 2012. – Vol. 302(1). – P. 220–227. 29. Pavlath G.K. Spatial and functional restriction of regulatory molecules during mammalian myoblast fusion / G.K. Pavlath // Exp. Cell Res. – 2010. – Vol. 316(18). – P. 3067–3072. 30. Wagers A.J. Cellular and molecular signatures of muscle regeneration: current concepts and controversies in adult myogenesis / A.J. Wagers, M. Conboy // Cell. – 2005. – Vol. 122(5). – P. 659– 667. 31. Jansen K.M. Molecular control of mammalian myoblast fusion / K.M. Janse, G.K. Pavlath // Methods Mol. Biol. – 2008. – Vol. 475. – P. 115–133. 32. Zammit P.S. The skeletal muscle satellite cell: the stem cell that came from the cold / P.S. Zammit, T.A. Partridge, Z. YablonkaReuveni // J. Histochem. Cytochem. – 2006. – Vol. 54(11). – P. 1177–1191. 33. Cossu G. Oriented cell devisions and muscle satellite cell heterogenity / G. Cossu, S. Tajbakhsh // Cell. – 2007. – Vol. 129(5).– P. 859–861.

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

147

34. Tajbakhsh S. Skeletal muscle stem cells in developmental versus regenerative myogenesis / S. Tajbakhsh // J. Inter. Med. – 2009. – Vol. 266(4). – P. 372–389. 35. Ten Broek R.W. Regulatory factors and cell population involved in skeletal muscle regeneration / R.W. Ten Broek, S. Greffe, J.W. Hoff // J. Cell. – 2010. – Vol. 224(1). – P. 7–16. 36. Boonen K.J. The muscle stem cell niche: regulation of satellite cells during regeneration / K.J. Boonen, M.J. Post // Tissue Eng. Part B Rev. – 2008. – Vol. 14(4). – P. 419–431. 37. A home away from home: challenges and opportunities in engineering in vitro muscle satellite cell niches / B.D. Cosgrove, A. Sacco, P.M. Gilbert [et al.] // Differentiation. – 2009. – Vol. 78(2–3). – P. 185–194. 38. Kuang S. Niche regulation of muscle satellite cell selfrenewal and differentiation / S. Kuang, M.A. Gillespie, M.A. Rudnicki // CellStem Cell. – 2008. – Vol. 2(1). – P. 22–31. 39. Gopinath S.D. Stem cell review: aging of the skeletal muscle stem cell niche / S.D. Gopinath, T.A. Rando // Aging Cell. – 2008. – Vol. 7(4). – P. 590–598. 40. Machida S. The roles of satellite and hematopoetic stem cells in impared regeneration of skeletal muscle in old rats / S. Machida, M. Narusawa // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2006. – Vol. 1067. – P. 349–353. 41. Short-term calorie restriction enhances skeletal musclestem cell function / M. Cerletti, Y.C. Jang, L.W. Finley [et al.] // CellStem Cell. – 2012. – Vol. 10(5). – P. 515–519. 42. Identification and characterization of a non-satellite cellmuscle resident progenitor during postnatal development / K.J. Mitchell, A. Pannerec, B. Cadot [et al.] // Nat. Cell Biol. – 2010. – Vol. 12(3). – P. 257–266. 43. Tamaki T. Plasticity and physiological role of stem cells derived from skeletal muscle interstitium: contribution to muscle fiber hyperplasia and therapeutic use / T. Tamaki, Y. Uchiyama, A. Akatsuka // Curr. Parm. Des. – 2010. – Vol. 16(8). – P. 956–967. 44. Parise G. Muscle satellite cell and atypical myogenic progenitor response following exercise / G. Parise, I.W. McKinnell, M.A. Rudnicki // Muscle Nerve. – 2008. – Vol. 37(5). – P. 611-619.

148

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

45. Adult skeletal musclestem cell migration is mediated by a blebbing/ameboid mechanism / A. Otto, H. Collins-Hooper, A. Patel [et al.] // Rejuvenation Res. – 2011. – Vol. 14(3). – P. 249–260. 46. Age–related changes in special and mechanism of adult skeletal musclestem cell migration / H. Collins-Hooper, T.E. Wooley, L. Dyxon [et al.] // Stem Cells. – 2012. – Vol. 30(6). – P. 1182–1195. 47. Boldrin L. Human satellite cells: identification on human muscle fibres / L. Boldrin, J.E. Morgan // PLoS One. – 2012. – Vol. 3. – P. RRN 1294. 48. Skeletal musclestem cells adopt a dormant cell state post mortem and retain regenerative capacity / M. Latil, P. Rocheteau, L. Chatre [et al.] // Nat. Commun. – 2012. – Vol. 3. – P. 903. 49. Post M.J. Cultured meat from stem cells: challenges and prospects / M.J. Post // Meat Sci. – 2012. – Vol. 92(3). – P. 297–301. 50. Aziz A. The origin and fate of muscle satellite cells / A. Aziz, S. Sebastian, F.J. Dilworth // Stem Cell Rev. – 2012. – Vol. 8(2). – P. 609–622. 51. The role of stem cells in muscular dystrophies / M. Meregalli, A. Farini, L. Colleoni [et al.] // Curr. Gene Ther. – 2012. – Vol. 12(3). – P. 192–205. 52. Stem cell therapies to treat muscular dystrophy: progress to date / M. Meregalli, A. Farini, D. Parolini [et al.] // BioDrugs. – 2010. – Vol. 24(4). – P. 237–247. Клітини шкіри мишей вдалося перетворити на нейрони. Вченим з Стенфордського університету вдалося трансформувати клітини шкіри лабораторних мишей у нормально функціонуючі нейрони за допомогою 3 генів. Ученим вдалося обійти крок створення плюрипотентних стовбурових клітин. http://www.anime-tver.ru/nauka/1173

2.6. Нервова тканина Нейрогенез у ссавців, в основному, завершується до перинатального періоду і нові нейрони генеруються безперервно протягом дорослого життя в обмежених ділянках мозку – у зубчастій звивині морського коника та субвентрикулярній зоні бічного

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

149

шлуночка [1 - 6]. Вважається, що нові нейрони в дорослих походять від мультипотентних нервових СК [7]. Запропоновано в цій зоні виділяти три типи СК, більшість з яких становлять мігруючі нейробласти (А тип), що проліферують. Ці клітини формують мережу тангенційно орієнтованих шляхів стінки бічного шлуночка. А–клітини переміщуються на великі відстані через цю мережу з високою швидкістю у складі ростpальних міграційних потоків у нюхову цибулину, де вони диференціюються в інтернейрони [8]. Другий тип клітин – В – належить до повільно мігруючих астроцитів. Найбільш активно проліферуючими є С–клітини, які утворюють кластери серед структур мережі і є вогнищами розмноження безпосередньо біля А-клітин. Нині з’являється все більше доказів того, що нейрогенез у дорослих має важливе значення для підтримання різних функцій мозку, зокрема нюхової і просторової пам’яті. Безперервний нейрогенез досягається за рахунок узгоджених проліферації і диференціації дорослих нейральних СК [9, 10]. Міграція клітин із субвентрикулярної зони бічного шлуночка до нюхової цибулини, досліджена за допомогою забарвлення нейронів методом Нісля, виглядає як доріжка в основі переднього рогу бічного шлуночка, що огинає головку хвостатого ядра і продовжується латерально і вентрально аж до нюхового тракту і цибулини. У складі цієї доріжки виявлені BrdU–імунореактивні клітини з маркерами клітин–попередниць і незрілих нейронів (Ki-67 і doublecortin), але не NeuN – маркером зрілих нейронів [11]. Із цієї доріжки клітини–попередниці можуть розповсюджуватися в різні ділянки головного мозку, відхиляючись від основного рострального міграційного потоку. Це було доведено на підставі результатів виявлення маркерів комітованих нейронів (TuJ1), постмітотичних гранульованих нейробластів (Тuc–4) або зрілих нейронів (MAP–2, NeuN). Практично всі з них експресували антиапоптотичний білок Bcl–2 [12]. У ростральному потоці проліферація і диференціація клітин регулюється кількома внутрішніми і зовнішніми факторами, зокрема регуляторним білком–інгібітором p19 (INK4d) (посередник виходу з клітинного циклу) і сигнальними кістково–морфогенетичними білками (ВМР) [13]. In vitro клітини прозорої

150

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

перегородки і судинного сплетення секретують відштовхуючі фактори, які можуть орієнтувати міграцію клітин–попередниць. Відомі два репеленти для аксонів, що розвиваються з імітацією такого ефекту в ембріогенезі й у дорослих – Slit1 і Slit2. У відсутності Slit1 міграція клітин зростає [14]. Генерація нових нейронів у нюховій цибулині триває в дорослих і є багатоетапним процесом, який включає в себе проліферацію, міграцію, виживання і диференціацію. Нейронні клітини–попередниці виникають у субвентрикулярній зоні і мігрують уздовж ростральних міграційних потоків до нюхової цибулини і перетворюються в інтернейрони різного типу [15], в яких швидко ініціюється ріст дендритів і встановлення дендро–дендритних контактів із мітральними/китичковими клітинами [16]. Задля визначення особливостей нейро– і гліогенезу в ростральному міграційному потоці можна використати імуноцитохімічні методи з застосуванням маркерів–антитіл проти ядер нейронів (NeuN) і гліоцитів (гліальний фібрилярний кислий білок, GFAP) [17]. Клітини–попередниці гліобластів можна розпізнати також за маркером олігодендроцитів Nkx2.2 [18]. У регуляції нейрогенезу (нейропроліферації та диференціації) у різних ділянках головного мозку, зокрема в морському конику і ростральному міграційному потоці, беруть участь домен–вмісні трансмембранні рецептори смерті 4 і 5 (DR4, DR5), які при зв’язуванні з апоптоз–індукуючим лігандом або лігандом Apo2 (членом суперродини цитокінів фактора некрозу пухлин) викликають апоптоз [19]. Міграційні властивості СК і клітин–попередниць та розповсюдження їхніх аксонів in vitro підтримують металопротеїнази MMP-2, MMP-9 і MT1-MMP, що дозволяє по-новому глянути на механізми нейрорегенерації для оптимізації стратегій клітинної терапії [20]. Найбільш поширені маркери стовбурових клітин нервової тканини представлені в табл. 6. В якості маркерів СК/клітин–попередниць субвентрикулярної зони і рострального міграційного потоку використовуються бромдезоксиуридин (BrdU), полісіалові (polysialyted) молекули клітинної адгезії (PSA–NCAM), нейронний ядерний антиген (NeuN) і GFAP [21]. PSA–NCAM бере участь у регуляції мієлінізації нервових волокон ЦНС, їхньої функціональної пластичнос-

Розділ 2. С товбурові

151

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

ті, формуванні синапсів [22]. У дорослих PSA–NCAM–клітини часто експресують нейронну NOS–синтетазу. Найбільше таких клітин міститься в субвентрикулярній зоні і їхня кількість зменшується по мірі наближення до нюхової цибулини [23]. Таблиця 6

Маркери стовбурових клітин нервової тканини Маркер CD133 CCND1

LHX2

Pax6

Sox2

GABA

GAP43

Значення Нервові стовбурові клітини Клітинний поверхневий білок, який ідентифікує стовбурові клітини нервової тканини, які в подальшому утворюють нейрони і гліоцити Білок, у людини кодується CCND1 геном, належить до родини високо консервативних циклінів, члени якої характеризується різкою періодичністю білків клітинного циклу. Цикліни функціонують як регулятори CDKs (циклин-залежної кінази). Діяльність регулюючих субодиниць CDK4 або CDK6 необхідна для G1 / S переходу в клітинному циклі LIM / гомеобоксний білок Lhx2 в людини кодується Lhx2 геном. Цей ген кодує білок, що належить до великої родини білків, члени якого несуть LIM домен, унікальний багатий цистеїном цинкзв’язуючий домен, може функціонувати як регулятор транскрипції Pax6 у людини кодується PAX6 геном, є членом Рах родини, діє як «майстер-контролер» ген для розвитку нервової тканини на молекулярному рівні в сигналізації при формуванні центральної нервової системи SOX2 є чинником транскрипції, членом Sox родини транскрипційних факторів, які відіграють ключову роль на багатьох етапах розвитку ссавців. Клітини, які експресують Sox2, продукують ідентичні до себе і диференційовані типи нервові клітин. Sox2+ нервові стовбурові клітини можуть генерувати нейронні попередники, а також Sox2+ нейронні популяції стовбурових клітин γ-аміномасляна кислота або ГАМК є головним інгібуючим нейротрансмітером у центральній нервовій системі ссавців, відіграє роль у регулюванні нейронної збудливості у всіх відділах нервової системи GAP43 - білок, у людини кодується GAP43 геном. GAP43 був названий білком росту або пластичності, оскільки він має високий рівень експресії в конусах росту нейронів під час розвитку та в ході регенерації, вважається одним із найважливіших компонентів аксона і пресинаптичного полюсу

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

152 Nestin

Vimentin

Microtubuleassosiated protein-2 (MAP-2)

А2В5

Neural tubulin ІІІ GAD65/67

NSE

Noggin Neurofilament (NF) Noggin Tau DARPP32

DCX

Білок проміжних філаментів (IF) VI типу, експресується головним чином нервовими клітинами, причетний до радіального росту аксонів Білок проміжних філаментів (IF) ІІІ типу, експресується в мезенхімних клітинах, разом із мікротрубочками і актиновими мікрофиламентами становить цитоскелет клітини Нейрони Білок, у людини кодується MAP2 геном, кодує білок, який належить родини білків,який бере участь у збірці мікротрубочок, що є важливим кроком у нейрогенезі. MAP2 служить для стабілізації мікротрубочок (МТ) шляхом зшивання MT із проміжних філаментів та інших MT, у щурів і мишей є білком цитоскелету нейронів, специфічним для дендритних розгалужень Антитіло, маркер стовбурових клітин, реагує з поверхневим антигеном на нейронах в сітківці, головному мозку, спинному мозку і гангліях Білок класу III β-тубуліну мікротрубочок, експресується виключно нейронами, є популярним ідентифікатором для диференційованих нейронів у нервовій тканині Глутаматдекарбоксилаза (англ. Glutamate decarboxylase, GAD, GAD65, GAD67) - фермент, що каталізує перетворення глутамату в ГАМК із допомогою декарбоксилювання. У постнатальному періоді виявляється в ділянках активного нейрогенезу, нейроміграціі та інтеграції нових нейронів у субвентрикулярній зоні, ростральному міграційному тракті і в нюховій цибулині Нейрональна енолаза, міститься в різних тканинах організму, включаючи печінку, мозок, нирку, селезінку, жирову тканину. Також відома як енолаза 1 Noggin (білок), сигнальних молекул, що беруть участь в ембріональному розвитку Білок нейрофіламентів, ідентифікує диференційовані нейрони Нейрон-специфічний ген, який експресується під час розвитку ней ронів Допомагає підтримувати структуру аксонів Допамін-цАМФ, білок, регулюючий фосфопротеїни нейронів (DARPP-32), у людини кодується PPP1R1 геном. Порушення в передачі сигналів через дофамінергічні шляхи залучені в кілька основних неврологічних і психічних розладів (зокрема шизофренії) Білок, у людини кодується doublecortin геном, цитоплазматичний, містить два doublecortin домени, які зв’язують мікротрубочки. Кодований білок направляє міграцію нейронів шляхом регулювання організації і стабільності мікротрубочок

Розділ 2. С товбурові PGP9.5

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

153

Білок генного продукту (PGP9.5), нейрон- специфічний, структурно та імунологічно відмінний від нейронної енолази, являє цінність в якості маркера нейронів, що може бути особливо корисним у дослідженні убіквітинованих стовбурових включеннях, характерних для декількох хронічних нейродегенеративних захворювань людини. Виявляє тіла нейронів і аксонів у центральній і периферійній нер вовій системі, нейроендокринні клітини в гіпофізі, щитоподібній та підшлунковій залозах та шлунково-кишкового тракті. TH Білок, що кодується ТН геном, що бере участь у перетворенні тирозину в дофамін, обмежує швидкість у синтезі катехоламінів, відіграє ключову роль у фізіології адренергічних нейронів VGluT Везикулярний транспортер глутамату, VGLUT, знаходиться в мембрані, упаковує транспортери нейромедіатори в синаптичних пухирцях так, що вони можуть бути вивільнені в синаптичну щілину VGAT Транспортер везикулярного ГАМК, локалізується в синаптичних везикулах гліцинергічних і ГАМК-ергічних нейронів Synaptophysin Основний білок синаптичних везикул р38, у людини кодується SYP геном. Ідентифікує синапси Астроцити Glial fibrillary Білок проміжних мікрофіламентів, який кодується GFAP геном в орacidic protein ганізмі людини, ідентифікує астроцити (GFAP) S100 Білок родини білків низької молекулярної маси, присутній у клітинах, що походять із нервового гребеня, бере участь у регуляції фосфорилювання білків, факторів транскрипції, Ca ++ гомеостазу, динаміки складових цитоскелету, активності ферментів, клітинному рості і диференціації HES1 Фактор транскрипції, білок, який кодується Hes1геном, членом родини bHLH, репрессор, який впливає на підтримку нервових стовбурових клітин і клітин-попередниць, може направляти нервові СК по одному з двох шляхів диференціації та підтримувати нервові СК, висловивши Pax6 Notch1 Активовані Notch 1 і Notch 3 сприяють диференціації клітин-попередниць астроглії. Notch 1, активований до народження, викликає диференціацію радіальної глії, а після народження індукує її диференціацію в астроцити J1-31 Antigen Підвищена експресія J1-31 антиген розкриває деякі нові аспекти астроцитів у відповідь на пошкодження, що може бути використано в якості маркера для дослідження реактивності астроцитів BLBP Мозок-ліпід- зв’язуючий білок, експресія якого просторово і тимчасово корелює з нейрональною диференціацією в ЦНС миші, у тому числі в мозочку після народження

154

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Олігодендроцити A2B5 Антитіло, маркер СК, реагує з поверхневим антигеном на нейронах в сітківці, головному мозку, спинному мозку і гангліях O1 Білок клітинної поверхні, ідентифікує зрілі олігодендроцити O4 Білок клітинної поверхні, ідентифікує незрілі олігодендроцити CNPase Мієлін-зв’язаний фермент, який становить 4 % від загального числа білка мієліну, експресується виключно олигодендроцитами в ЦНС, одна з найбільш ранніх подій диференціації олигодендроцитов, відіграє важливу роль у подіях, що призводять до мієлінізації Myelin-basic Білок мієлінової оболонки, характеризує зрілі олігодендроцити, які protein (MВP) продукують мієлін, є основною складовою мієлінової оболонки GALC Галактосілцерамідаза (або galactocerebrosidase) являє собою фермент, який у людини кодується GALC геном, є ферментом, який видаляє галактозу з похідних керамідів (galactocerebrosides) OLIG1 Транскрипційний фактор олігодендроцитів 1, білок, що в людини кодується Olig1 геном OLIG2 Транскрипційний фактор олігодендроцитів 2, білок, що в людини кодується Olig2 геном, для визначення диференціації рухових ней ронів і олігодендроцитів GD3 Антигангліозідні антитіла, пов’язані з гострою аксональною нейропатією NG2 NG2 глія є одним із видів макроглії, знайденої в ЦНС, відрізняється від астроцитів і олігодендроцитів, отримала свою назву від експресії NG2 протеоглікана, її клітини вважаються попередницями олігодендроцитів, присутні в сірій і білій речовині. У білій речовині вони розташовані вздовж аксонів безмієлінових, а також мієлінових аксонів Nkx2.2 Homeobox білка Nkx-2.2, транскрипційний фактор, білок, у людини кодується NKX2-2 геном, може бути залучений до морфогенезу центральної нервової системи OLIG3 Транскрипційний фактор олігодендроцитів 3, білок, у людини кодується Olig3 геном, базова спіраль-петля-спіраль (bHLH) Olig3 ген експресується в клітинах-попередницях, які генерують клас (dI1-di3) нейронів і Olig3, що є важливим чинником у розвитку цих типів клітин SEMA4D Білок із родини семафорина (CD100), у людини кодується SEMA4D геном. Semaphorin 4D (Сема 4D) є молекулою, яка експресується олігодендроцитами, знайдена в аксонах, індукує колапс росту конуса в ЦНС Neurosphere Ідентифікує нейрони і гліоцити на ранніх стадіях розвитку в кластерах нейрокультури

Розділ 2. С товбурові

155

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

Серед клітин зі слабким вираженням PSA–NCAM можна визначити trophinin+ клітини. Останні експресують Ki–67 і нестин. У клітинах рострального потоку в дорослих також виявляється бістин. У залежності від експресії тих чи інших маркерів можна ідентифікувати різні типи клітин А, В, гліоцити. У культурі клітини–попередниці нейронів експресують і трофінін, і бістин [24]. До процесів сигналізації в клітинах–попередницях залучається також білок езрин (Ezrin, cyrovillin, villin–2), який є членом родини цитоплазматичних мембранних білків і відіграє роль у функціях клітинної поверхні – адгезії, міграції і організації. Стовбурова ніша локалізується в субвентрикулярній зоні (рис. 10). Капіляр, ендотеліоцити (Tie2-GFP+) Астроцити (GFP+td/Tomato-) Стовбурові нервові клітини Клітини-попередниці (GFP-/td Tomato+)

Нейро

Нейробласти

Рис. 10. Ніша нервовоїЕпендимоцити стовбурової клітини (YFP+) в субвентрикулярній зоні бічного шлуночка головного мозку. Рис. 10. Ніша нервової стовбурової клітини в субвентрикулярній зоні Позначення: GFP-головного зелений мозку. флуоресцентний білок, td/Tomato - яскраво чербічного шлуночка GFP-білок зелений флуоресцентний білок, td/Tomato клітин, воний Позначення: флуоресцентний для дослідження клонів стовбурових яскраво червоний флуоресцентний білок для дослідження клонів YFP жовтий флуоресцентний білок. стовбурових клітин, YFP - жовтий флуоресцентний білок.

У Удорослих дорослихіз субвентрикулярної із субвентрикулярної зони зони клітини–попередниці клітини–попередниці розповсюджуються на досить великіщоб відстані, щоб досягти розповсюджуються на досить великі відстані, досягти кінцевого пунктукінпризначення – нюхової цибулини. Для цього необхідна висока Для динамічність цевого пункту призначення – нюхової цибулини. цього не-

їхнього цитоскелета з можливістю реагувати на навколишні подразники. Останнім часом конкретне вираження білка езрина було виявлено в ростральному міграційному потоці. Членом родини ERM (Езрин, Radixin, Moesin) є radixin, який зв'язує актин цитоскелета з позаклітинним матриксом через трансмембранні білки. Методами імуногістохімії та конфокальної

156

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

обхідна висока динамічність їхнього цитоскелета з можливістю реагувати на навколишні подразники. Останнім часом конкретне вираження білка езрина було виявлено в ростральному міграційному потоці. Членом родини ERM (Езрин, Radixin, Moesin) є radixin, який зв’язує актин цитоскелета з позаклітинним матриксом через трансмембранні білки. Методами імуногістохімії та конфокальної мікроскопії показано, що radixin сильно виражений у нейробластах цих ділянок у дорослих. Продемонстровано наявність radixin у клітинах кори головного мозку, смугастого тіла, мозочка, таламуса, морського коника, а також гломерулярних і periglomerular шарах нюхової цибулини. Radixin виявлено також у нейросферах культури цих клітин методом Вестернблот. Експресія radixin вказує на його роль у міграції нервових клітин–попередниць і їхньої диференціації в дорослому ростральному міграційному потоці. Розуміння такої регуляції має важливе значення для розробки нових терапевтичних втручань із використанням ендогенних клітин для відновлення нейронів при нейродегенеративних захворюваннях [25]. У мембрані гліальних клітин присутній β–катенін, характерний для клітин–попередниць нейронів, який підтримує їхні проліферативні і міграційні процеси [26]. У мігруючих клітинах у ростральному міграційному потоці й у нюховій цибулині виявлені дребрин–позитивні клітини. Дребрин – це білок, який бере участь у стовбуровоклітинних зв’язках (хімічних та електричних) і клітинній проліферації клітин–попередниць, регулює розвиток дендритів і синаптичну пластичність нейронів. Його присутність у цій ділянці підтверджує міграційну здатність клітин і зникнення експресії дребрину свідчить за припинення їхньої міграції [27]. Відомо, що регуляцію експресії факторів плюрипотентності СК здійснює Sox2. Нині встановлено, що проліферація нервових СК у дорослому нейрогенезі належить осі p21/Sox2/p53, при цьому р21 має негативний вплив на експресію Sox2 у нервових СК [28]. Стосовно нюхових СК, то в постембріональному періо ді Wnt3a сприяє поширенню Sox2+ у культуральних сферах із нюхового епітелію. Wnt-стимульовані клітини зі сфер нюхового епітелію, зберігають свою мультипотентність і можуть диферен

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

157

ціюватися в більшість типів нейронів і не–нейрональних епітеліальних клітин. Крім того, Wnt–активатори збільшують кількість диференційованих нюхових сенсорних нейронів, особливо, після травми. In vivo Wnt модулятори істотно змінюють регенераційний потенціал [29,]. Установлено нову роль Wnt5a в розвитку інтернейронів нюхової цибулини і висловлено припущення, що канонічний і неканонічний шляхи Wnt динамічно протистоять один одному в регуляції дозрівання дендритів [30]. Для диференціації нервових нюхових СК необхідний транскрипційний фактор Р63 (Trp63) – своєрідний молекулярний перемикач, який відповідає за активацію резервних СК при виникаючій необхідності [31]. Не меншого значення в дорослих нервових СК субепендимальної ділянки набуває Notch сигнальний шлях, надмірна експресія якого не тільки зберігає стовбуровоклітинні характеристики, але й може надавати додаткових властивостей «стовбуровості» для клітин-попередниць [32]. Описані відмінності в експресії маркерних білків нервових СК і клітин–попередниць у субвентрикулярній зоні і нюховій цибулині. In vitro характеристики проліферації нейронних попередників зберігаються в обох регіонах, а протеомнi та імуногістохімічнi дані свідчать про те, що попередниці клітин із двох регіонів відрізняються за морфологією і функціональністю, але не здатністю до проліферації [33]. За кількістю виділено дві фракції клітин–попередниць за експресією GFAP – у субвентрикулярній зоні 94 % клітин GFAP+, у нюховій цибулині – поодинокі і за формою більш розгалужені. У профілях експресії генів нервових СК ембріона і дорослої людини спостерігаються великі відмінності. Спільними є гени, які беруть участь у структуруванні обох популяцій (ALDH1A2, Foxa2), клітин-попередниць (LMX1a, ALDH1A1, Sох10), проліферації нервових клітин–попередниць (Wnt1 і Wnt3a), neuroplastin (NPTN), POU3F1 (Oсt6), нейролігін (NLGN4X ), MEIS2, і NPAS1. Експресія генів була зосереджена в трьох сигнальних шляхах – Notch, Wnt, і MTOR, що визначають долю нервової СК. Знайдені і розшифровані гени, які беруть участь в епігенетичних модифікаціях у дорослих – із родини SWI/SNF ДНК хроматину, у тому числі SMARCC1 і SMARCE1 [34].

158

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Нейропептиди також необхідні в ході нюхового нейрогенезу: NPY діє як трофічний фактор для дозрівання і виживання нюхових рецепторних нейронів, тоді як PYY відіграє важливу роль у регуляції їхньої диференціації [35-37]. Для дофамінергічної диференціації клітин–попередниць має значення експресія фактора Id2 [38]. Гіпотетично два гени відповідають за регуляцію в нюхових цибулинах допаміна – receptor Nurr1, але не гомеобокс–вмісні, в яких наявні гени Dlx–1 і 2 [39]. У нейрогенезі в нюховій цибулині дорослих також беруть участь Ngn2, NeuroD і фактор транскрипції Tbr [40]. Водночас ці клітини експресують Neurog1 [41] і якщо не всі, то майже всі безпосередні клітини-попередниці нейронів – NeuroD1 [42]. Iз метою візуалізації міграції клітин–попередниць нейронів у мишей була використана магнітно–резонансна томографія з часточками оксиду заліза мікронних розмірів [43, 44] і встановлено, що цей метод може дати уявлення про аберантні міграції на моделях захворювань і, можливо, у людини. Останнім часом на різних етапах дорослого нейрогенезу в мишей були знайдені деякі фактори, класично відомі з їхнього впливу на серцево–судинну систему. Виявилося, що в дорослих нюхових нервових клітинах провідна роль належить фактору росту ендотелію судин рецептора–1 (VEGFR–1) [45]. Таким чином, нейрогенез клітин нюхової цибулини в дорослих тісно пов’язаний із відновленням нейронів головного мозку. • Матеріал опубліковано в статті Геращенко С. Б. Нюхові нервові стовбурові клітини (нейрогенез у дорослих) / С.Б. Геращенко, О.І. Дєльцова, Ю.Б. Чайковський // Вісник морфології.2013.- №2, Т.19. - С. 456-462. Література 1. Architecture and cell types of the adult subventricular zone: in search of the stem cells / J.M. García-Verdugo, F. Doetsch, H. Wichterle [et al.] // J. Neurobiol. – 1998. – Vol. 36(2). – P. 234– 248. 2. Adult subventricular zone neuronal precursors continue to proliferate and migrate in the absence of the olfactory bulb / B.

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

159

Kirschenbaum, F. Doetsch, C. Lois [et al.] // J. Neurosci. – 1999. – Vol. 19(6). – P. 2171–2180. 3. Neurogenesis in the subventricular zone and rostral migratory stream of the neonatal and adult primate forebrain / V. Pencea, K.D. Bingaman, L.J. Freedman [et al.] // Exp. Neurol. – 2001. – Vol. 172(1). – P. 1–16. 4. Mandairon N. Deprivation of sensory inputs to the olfactory bulb up-regulates cell death and proliferation in the subventricular zone of adult mice / N. Mandairon, F. Jourdan, A. Didier // Neuroscience. – 2003. – Vol. 119(2). – P. 507–516. 5. De Marchis S. Subventricular zone-derived neuronal progenitors migrate into the subcortical forebrain of postnatal mice / S. De Marchis, A. Fasolo, A.C. Puche // J. Comp. Neurol. – 2004.– Vol. 476(3). – P. 290–300. 6. Curtis M.A. The rostral migratory stream and olfactory system: smell, disease and slippery cells // M.A. Curtis, H.J. Monzo, R.L.Faull // Prog. Brain Res. – 2009. – Vol. 175. – P. 33–42. 7. Development of neural stem cell in the adult brain / X.Duan, E. Kang, C.Y. [et al.] // Curr.Opin.Neurobiol. – 2008. – Vol. 18(1).– P. 110–115. 8. Roles of planar cell polarity signaling in maturation of neuronal precursorcells in the postnatal mouse olfactory bulb / Y. Hirota, M. Sawada, Y.S. Kida [et al.] // Stem Cells. – 2012. – Vol. 30(8). – P. 1726–1733. 9. Continuous neurogenesis in the adult brain / I. Imayoshi, M. Sakamoto, T. Ohtsuka [et al.] // Dev. Growth Differ. – 2009. – Vol. 51(3). – P. 379–386. 10. Imayoshi I. Neurogenesis in the postnatal and adult brain / І. Imayoshi // Nihon Shinkei Seishin Yakurigaku Zasshi. – 2012. – Vol. 32(5-6). – P. 293–297. 11. Identification of the rostral migratory stream in the canine and feline brain / S.Z. Malik, M. Lewis, A. Isaacs [et al.] // PLoS One. – 2012. – Vol. 7(5). – P. e36016. 12. The rostral migratory stream in adult squirrel monkeys: contribution of new neurons to the olfactory tubercle and involvement of the antiapoptotic protein Bcl–2 / A. Bédard, M. Lévesque, P.J. Bernier[etal.]//Eur.J.Neurosci.–2002.–Vol.16(10).–P.1917–1924.

160

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

13. Coskun V. Intrinsic and extrinsic regulation of the proliferation and differentiation of cells in the rodent rostral migratory stream // V. Coskun, M.D. Luskin // J. Neurosci. Res. – 2002. – Vol. 69(6). – P. 795–802. 14. Multiple roles for slits in the control of cell migration in the rostral migratory stream / K.T. Nguyen–Ba–Charvet, N. Picard– Riera, M. Tessier–Lavigne [et al.] // J. Neurosci. – 2004. – Vol. 24(6). – P. 1497–1506. 15. Lledo P.M. Origin and function of olfactory bulb interneuron diversity / P.M. Lledo, F.T. Merkle, A. Alvarez-Buylla // Trends Neurosci. – 2008. – Vol. 31(8). – P. 392–400. 16. Belvindrah R. Postnatal neurogenesis: from neuroblast migration to neuronal integration / R. Belvindrah, F. Lazarini, P.M. Lledo // Rev. Neurosci. – 2009. – Vol. 20(5–6). – P. 331–346. 17. Duan Х. Development of neural stem сell in the adult brain / X. Duan, E. Kang // Curr.Opin.Neurobiol. – 2008. – Vol. 18(1).– P. 110–115. 18. Aguirre A. Postnatal neurogenesis and gliogenesis in the olfactory bulb from NG2-expressing progenitors of the subventricular zone / A. Aguirre, V. Gallo // J. Neurosci. – 2004.– Vol. 24(46). – P. 10530–10541. 19. Death receptor 5 and neuroproliferation / Y. Niu, Y. Li, J. Zang [et al.] // Cell Mol. Neurobiol. – 2012. – Vol. 32(2). – P. 255–265. 20. Role of matrix metalloproteinases in migration and neurotrophic properties of nasal olfactory stem and ensheathing cells / A. Ould-Yahoui, O. Sbai, K. Baranger [et al.] // Cell Transplant.– 2013. – Vol. 22(6). – P. 993–1010. 21. Temporal profile of stem cell division, migration, and differentiation from subventricular zone to olfactory bulb after transient forebrain ischemia in gerbils / K. Sato, H. Kamada, N. Omori [et al.] // J. Cereb. Blood Flow Metab. – 2003. – Vol. 23(3).– P. 331–341. 22. Untangling the functional potential of PSA–NCAM– expressing cells in CNS development and brain repair strategies // L. Nguyen, J.M. Rigo, B. Malgrange [et al.] // Curr. Med. Chem.– 2003. – Vol. 10(20). – P. 2185–2196.

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

161

23. Morphological bases for a role of nitric oxide in adult neurogenesis / B. Moreno–López, J.A. Noval, L.G. González–Bonet [et al.] // Brain Res. – 2000. – Vol. 869(1–2). – P. 244–250. 24. Expression of trophinin and bystin identifies distinct cell types in the germinal zones of adult rat brain / L. Ma, M. Yin, X.Wu [et al.] // Eur. J. Neurosci. – 2006. – 23(9). – Р. 2265–2276. 25. Expression of ezrin radixin moesin proteins in the adult subventricular zone and the rostral migratory stream / A. Persson, C. Lindwall, M.A. Curtis [et al.] // Neuroscience. – 2010.– Vol. 167(2). – P. 312–322. 26. Expression of ezrin in glial tubes in the adult subventricular zone and rostral migratory stream / M.A. Cleary, N. Uboha, M.R. Picciotto [et al.] // Neuroscience. – 2006. – Vol. 143(3). – P. 851– 861. 27. Expression of drebrin E in migrating neuroblasts in adult rat brain: coincidence between drebrin E disappearance from cell body and cessation of migration // M. Song, N. Kojima, K. Hanamura [et al.] // Neuroscience. – 2008. – Vol. 152(3). – P. 670–682. 28. Cyclin-dependent kinase inhibitor p21 controls adult neural stem cell expansion by regulating Sox2 gene expression / M.A. Marqués-Torrejón, E. Porlan, A. Banito [et al.] // Cell Stem Cell. – 2013. – Vol. 12(1). – P. 88–100. 29. Canonical Wnt signaling promotes the proliferation and neurogenesis of peripheral olfactory stem cells during postnatal development and adult regeneration / Y.Z. Wang, T. Yamagami, Q. Gan [et al.] // J. Cell Sci. – 2011. – Vol. 124(Pt 9). – P. 1553–1563. 30. Pino D. Wnt5a controls neurite development in olfactory bulb interneurons / D. Pino, Y. Choe, S.J. Pleasure // ASN Neuro.– 2011. – Vol. 3(3). – P. e00059. 31. DeltaNp63 regulates stem cell dynamics in the mammalian olfactoryepithelium / A. Packard, N. Schnittke, R.A. Romano [et al.] // J. Neurosci. – 2011. – Vol. 31(24). – P. 8748–8759. 32. Notch Signaling Imparts and Preserves Neural Stem Characteristics in the Adult Brain / D. Piccin, F. Yu, C.M. Morshead // Stem Cells Dev. – 2013. – Vol. 22(10). – P. 1541–1550. 33. Protein expression differs between neural progenitor cells from the adult rat brain subventricular zone and olfactory bulb /

162

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

.. M.H. Maurer, R.E. Jr. Feldmann, H.F. Burgers [et al.] // BMC Neurosci. – 2008. – Vol.9. – P. 7. 34. Gene expression profile of adult human olfactory bulb and embryonic neural stem cell suggests distinct signaling pathways and epigenetic control / H.E. Marei, A.E. Ahmed, F. Michetti [et al.] // PLoS One. – 2012. – Vol. 7(4). – P. e33542. 35. Neuropeptide Y and peptide YY have distinct roles in adult mouse olfactoryneurogenesis / K.L. Doyle, Y.J. Hort, H. Herzog [et al.] // J. Neurosci. Res. – 2012. – Vol. 90(6). – P. 1126–1135. 36. Jia C. NPY mediates ATP-induced neuroproliferation in adult mouse olfactoryepithelium / C. Jia, C.C. Hegg // Neurobiol. Dis. – 2010. – Vol. 38(3). – P. 405–413. 37. Jia C. Neuropeptide Y and extracellular signal-regulated kinase mediate injury-induced neuroregeneration in mouse olfactory epithelium / C. Jia, C.C. Hegg // Mol. Cell Neurosci. – 2012. – Vol. 49(2). – P. 158–170. 38. Id2 is required for specification of dopaminergic neurons during adultolfactory neurogenesis / M.C. Havrda, D.T. Harris, A. Mantani [et al.] // J. Neurosci. – 2008. – Vol. 28(52). – P. 14074– 14086. 39. Differentiation of the dopaminergic phenotype in the olfactory system of neonatal and adult mice / S. Saino-Saito, H. Sasaki, B.T. Volpe [et al.] // J. Comp. Neurol. – 2004. – Vol. 479(4). – P. 389–398. 40. Involvement of Ngn2, Tbr and NeuroD proteins during postnatal olfactorybulb neurogenesis / L. Roybon, T. Deierborg, P. Brundin [et al.] // Eur. J. Neurosci. – 2009. – Vol. 29(2). – P.232243. 41. Expression of pax6 and sox2 in adult olfactory epithelium / Z. Guo, A. Packard, R.C. Krolewski [et al.] // J. Comp. Neurol. – 2010. – Vol. 518(21). – P. 4395–4418. 42. Progenitor cell capacity of NeuroD1–expressing globose basal cells in the mouse olfactory epithelium / A. Packard, M. Giel–Moloney, A. Leiter [et al.] // J. Comp. Neurol. – 2011. – Vol. 519(17). – P. 3580–3596. 43. Magnetic resonance imaging of the migration of neuronal precursors generated in the adult rodent brain // E.M. Shapiro, O.

Розділ 2. С товбурові

клітини тканин у постнатальному онтогенезі

163

Gonzalez-Perez, J. Manuel Garcia-Verdugo [et al.] // Neuroimage.– 2006. – Vol. 32(3). – P. 1150–1157. 44. MRI visualization of endogenous neural progenitor cell migration along the RMS in the adult mouse brain: validation of various MPIO labeling strategies / R. Vreys, G. Vande Velde, O. Krylychkina [et al.] // Neuroimage. – 2010. – Vol. 49(3). – P. 2094–2103. 45. VEGFR–1 regulates adult olfactory bulb neurogenesis and migration of neural progenitors in the rostral migratory stream .. in vivo / I.M. Wittko, A. Schanzer, A. Kuzmichev [et al.] // J. Neurosci. – 2009. – Vol. 29(27). – P. 8704–8714.

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

164

Розділ 3

СТОВБУРОВІ КЛІТИНИ ОРГАНІВ І СИСТЕМ ДОРОСЛОГО ОРГАНІЗМУ Японські генетики на чолі з російським науковцем К. Агладзе вперше виростили зі стовбурових клітин живе людське серце. Опубліковано 5.03. 2013 р. http://molbuk.ua/world/56254-yaponski-vchenim-vdalosyavirostiti-z-stovburovih-tkanin-serce.html Біологи в США виростили зі стовбурових клітин серце. Опубліковано 14.08.2013. Біологам з університету Піттсбурга вперше вдалося вирости ти штучне серце з перепрограмованих стовбурових клітин людини. http://news.finance.ua/ua/~/1/0/all/2013/08/14/307236

3.1. Серцево-судинна система Серцево-судинні хвороби залишаються однією з найпоширеніших причин захворюваності і смертності в світі. Відповіддю міокарда на ішемічний інсульт є гіпертрофія кардіоміоцитів, яка ініціюється генетичною програмою їх апоптозу, прогресуванням розвитку сполучної тканини на місці загиблих кардіоміоцитів і серцевою недостатністю, що закінчується ремоделюванням серця. Невелика кількість кардіоміоцитів зберігає здатність до проліферації, але було невідомо чи це СК міокарда, чи клітини, які прийшли з червоного кісткового мозку на заміну і регенерацію пошкодженого серцевого м'яза [1]. "Типовий" інфаркт міокарда в людини пов'язаний зi втратою, у середньому, приблизно 1 млрд. кардіоміоцитів [2]. Серце. Відомо, що після народження проліферація кардіо міо цитів припиняється, вони виходять із клітинного циклу і відбувається блок між фазами G0/G1 i G2/M (додаток 4). У результаті цього реакція кардіоміоцитів на стрес обмежується різними формами їх пошкодження. Гостра ішемія призводить

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

165

до пошкодження і смерті кардіоміоцитів і стромальних клітин шляхом онкозу чи апоптозу, а можливо й разом. Тобто водночас існує ймовірність процесів автофагії, апоптозу, онкозу і віднов лення кардіоміоцитів. Наводиться все більше доказів того, що в таких випадках можливе відновлення кардіоміоцитів. Мітотичні фігури презентують дозрівання клітин-попередниць у більшості випадків. Мітоз зрілих кардіоміоцитів, які повер таються в цикл – рідкісна подія. При хронічному стресі переважає гіпер трофія кардіоміоцитів і ремоделювання міокарда, а смерть кардіoміоцитів перевищує їхнє оновлення, що призводить до прогресуючої серцевої недостатності. Тому інтенсивні дослідження зараз спрямовані на можливості клітинної терапії, яка сповіль нює смерть кардіоміоцитів та сприяє відновленню міокарда [3]. Окремо слід зупинитися на ролі автофагії в ремоделювальних процесах у серці. Автофагія є катаболічним процесом, за допомогою якого пошкоджені або старі білки, макромолекули або органели утилізуються шляхом лізосомної деградації. До цього часу остаточно роль автофагії при серцевих захворюваннях, включаючи ішемічну чи дилатаційну кардіоміопатію, серцеву недостатність, гіпертрофію та ішемію/реперфузію, не визначена. Наводяться нові факти, що оксидативний стрес у клітині індукує автофагію, і окислювальні зміни макромолекул і органел можуть бути вибірково видалені шляхом автофагії. М'яка окиснювана стрес-індукована автофагія може стати першою лінією захисту від серйозних пошкоджень, таких як апоптоз і некроз. Втрата специфічного серцевого гену автофагії Atg5, який бере участь в утворенні автофагосом, призводить до гіпертрофії серця, розширення лівого шлуночка і дисфункції його скорочення. Нещодавно стало відомо, що Atg4 – інший ген автофагії, який бере участь в утворенні автофагосом, контролюється редокс-регуляцією в умовах автофагії, індукованої голодом. Звідси випливає, що дослідження ролі автофагії в серцевому м'язі потребує невідкладності [4]. Навіть після успішної реваскуляризації при ішемічній хворобі серця, загибель клітин і втрата кардіоміоцитів триває, що призводить до прогресуючої дилатації лівого шлуночка і дисфункції серця. Можливості регенерації ("ремонту") серця після

166

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

виявлення серцевих СК не тільки в ембріональному, але й в постембріональному періоді життя людини, вселяє оптимізм для розробки і застосування нових технологій лікування цих захворювань [5 - 8]. Клітинна терапія захворювань серця стала інноваційною стратегією в порівнянні з традиційними методами лікування і має великі перспективи [9]. Для цього використовуються по пуляції СК різних ліній (ембріональні і дорослі, мезенхімного та іншого походження). Ембріональні СК мають найпотужніший потенціал диференціації, але зберігаються проблеми імунологічних і тератогенних ефектів. СК дорослих не є туморогенними, але їх кількість незначна [10]. На думку дослідників, серцеві СК для трансплантації є кращими, ніж СК червоного кісткового мозку, але до цього часу вони важко підлягають ідентифікації [11, 12]. Загалом, до сьогодні дискутують питання наявності СК і клітин-попередниць серцевих міоцитів у дорослих [13]. Досить тривалий час вважалося, що в пренатальному та ранньому пост натальному термінах життя людини збільшення маси серця відбувається завдяки збалансованості системи "проліфераціязагибель" у кардіоміоцитарному дифероні; потім цей процес заміщується лише зростанням об'єму кожного міоцита; останні втрачають здатність до поділу. A.B. Carvalho, A.C. de Carvalho [14] розглянули історію цього питання і докази, які привели до гіпотези, що серце не має можливості до регенерації. Із початку ХХ ст. серце вважалося "постмітотичним" органом, а міоцити термінально диференційованими клітинами, тобто такими, які, "з'явившись одного разу на світ", працюють протягом усього життя людини. Іншими словами, вік людини та вік кардіоміоцита співпадають (15 - 19). Кульмінаційним моментом стало повідомлення, що протягом життя людини відновлюються 50 % кардіоміоцитів. З'явилося багато досліджень, в яких доведено, що в серці наявні СК [20 - 29]. Відповідно до нової парадигми, у серці дорослої особи є популяція мультипотентних недиференційованих клітин, які можуть за певних умов розвинутися в кардіоміоцити, ендотеліальні клітини, гладкі міоцити та фібробласти [30, 31]. Тобто, міокард є динамічною системою, в якій нові паренхіматозні клітини

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

167

утворюються для заміни старих чи пошкоджених кардіоміоцитів. Регенераційна здатність серця була спочатку документована класичним морфометричним підходом і зовсім недавно продемонстровано, що в новоутворених серцевих міоцитах у нормі і патології відбувається синтез ДНК, мітоз і цитокінез [32]. Доведено, що тривалість життя кардіоміоцитів, фібробластів і ендотеліальних клітин у серці становить відповідно 4,5; 5 і 8 років. Серце людини володіє значним резервом росту і в ньому міоцити і "неміоцити" замінюються кілька разів протягом життя [33]. Але зі старінням відбувається прогресуюча втрата теломерів ДНК у серцевих СК, новоутворені кардіоміоцити успадковують короткі теломери і швидко наближаються до старіючого фенотипу. Серце жінки оновлюється ліпше – у жінок від 20 до 100 років компартмент кардіоміоцитів замінюється 15 разів, а в чоловіків – 11 разів [34]. D. D-Amario et al. [35] повідомляють, що в серці людини наявні 2 категорії СК – із міогенними і судинними властивостями (за дослідженнями ендоміокардіальних біопсій). Вони активізуються при інфаркті міокарда. Час подвоєння популяції цих клітин у культурі, за їхніми даними, становить 27 годин і вони зберігають свою життєздатність протягом 28 (міогенні) і 41 (судинні) діб. СК серця дорослих є привабливими в розробці нових лікарських технологій, але залишається багато невирішених питань [36, 37]. Велика увага приділяється можливості використання СК червоного кісткового мозку. M.D. Schuster et al. [38] виділили з червоного кісткового мозку ангіобласти (попередники ендотеліальних клітин) і показали, що вони мігрують до зони ішемії міо карда, викликають утворення кровоносних судин і запобігають ремоделюванню міокарда. Це призводить до стійкого поліпшення функцій серця шляхом розгортання механізмів захисту від апоптозу та індукції проліферації/регенерації ендогенних кардіо міоцитів. J.L. Tang [39], J. Tang et al. [40] на підставі експериментів in vitro та in vivo на мишах і щурах зробили висновок, що СК мезенхімного походження можна використати для відновлення міокарда шляхом трансплантації в пошкоджену ділянку міокарда.

168

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

СК червоного кісткового мозку проявили потенціал для регенерації міокарда на тваринних моделях, а також при клінічних випробуваннях. Нефракціонована популяція мононуклеарних клітин червоного кісткового мозку є гетерогенною групою клітин, які містять СК із кількома напрямками диференціації. Kультивування цих клітин у присутності кардіоміоцитів новонароджених мишей і забраних після травми серця, призводить до експресії скорочувального білка, α-актиніна в клітинах культури. Їхня кількість зростає протягом 90 днів. Транскриптомний аналіз цих клітин виявив експресію відповідно до незрілих кардіоміоцитів специфічного серцевого тропоніну І людини, який визначали імуноцитохімічно. Крім того з'ясували, що можливість диференціації підсилюється гранулоцит-колонієстимулювальним фактором після ін'єкції клітин у пошкоджений міокард [41]. При трансплантації автологічних мононуклеарів червоного кісткового мозку розміри інфаркту зменшуються, збільшується фракція викиду лівого шлуночка, аритмії не виникають. Однак при хронічному перебігу серцево-судинних захворювань клітини червоного кісткового мозку приживляються погано [42]. Деякі автори спробували використати скелетні міобласти для обмеження розмірів інфаркту і встановили, що вони виживають у невеликих кількостях і не мають електро-механічних зв'язків, отже через це можливе виникнення аритмій [43]. Є думка, що трансплантація мезенхімних клітин червоного кісткового мозку має паракринну дію на пошкоджений міокард, а власні СК серця треба вивчати для їхнього можливого використання у відновленнi серця [44]. Водночас деякі автори заперечують можливість трансдиференціації мезенхімних клітин червоного кісткового мозку на кардіоміоцити [45]. На фоні досліджень пересадки СК червоного кісткового мозку при серцевих захворюваннях усе більшого значення набуває широкомасштабне вивчення СК серця, тому що трансдиференціа ція мезенхімних СК може призвести до змін у теломер-теломе разній системі і не завжди з них розвиваються кардіоміоцити [46]. Тобто до цього часу науковці знаходяться на роздоріжжі – чи пересаджувати СК червоного кісткового мозку, чи власні серцеві СК [47].

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

169

Одним із перших важливих питань є визначення маркерів серцевих СК. A.P. Beltrani et al. [48] повідомили про існування с-kit+ клітин із властивостями серцевих СК. Пізніше було встановлено, що в людини CD34+ клітини можуть мати значний потенціал для кардіоміогенезу і васкулогенезу з функціональним відновленням серця після інфаркту міокарда [49]. У клітинах-попередницях у серці виявлено маркери SCA-1, Isl-1 i Side Population [50]. A. Leri et al. [51] описали кілька типів серцевих клітин-попередниць, але в якості резидентних клітин із біологічними і функціональними властивостями СК у дорослих вони визнали лише с-kit+ клітини. За останні 5 років проведені широкомасштабні дослідження в напрямку виявлення, культивування і пересадки серцевих СК в експерименті. За допомогою методу черезшкірної ендоміо кардіальної біопсії [52] дослідники отримували клітини, з яких виокремлювали кандидати на СК і вирощували в культурі. У результаті проведених біопсій було виявлено, що кількість СК зростає при гострому і в меншій мірі при хронічному пошкодженні серця [53]. Цікаво, що з біопсій правого передсердя розвивається більше c-kit+ клітин, ніж із лівого та з шлуночків серця [54]. У первинній культурі серцеві СК, отримані зі стінки шлу ночків і передсердь людини і мишей, ростуть у вигляді ба га токлітинних кластерів – кардіосфер [55]. Клітини з кардіосфер є клоногенними, експресують антигени/маркери і ви яв ляють властивості дорослих СК [50]. Вони здатні до довго терміно во го самовідновлення і можуть диференціюватися in vitro після ектопічної (у підшкірну сполучну тканину спини) або ор тото пічної (ділянка інфаркту міокарда) трансплантації. У результаті утворюються спеціалізовані клітини серця: міоцити, які виявляють скоротливі властивості та і/або маркери кардіоміоцитів, і судинні клітини (ендотеліальні клітини і гладкі міоцити при визначенні відповідних маркерів). Як досягнення в цій галузі станом на 2009 р., D.R. Davis et al. [56] повідомляли, що вже в 4 лабораторіях оволоділи методами культивування СК серця у вигляді кардіосфер і їхніх нащадків – клітин-похідних кардіо сфер. При пересадці мишам СК людини з кардіосфер зменшується швидкість апоптозу і збільшується щільність капілярів у

170

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

міокарді [57]. C.A. Carr et al. [58] вводили щурам клітини з кардіосфер під контролем МРТ. Попередньо ідентифікували клітини з маркерами CD90 i CD105, маркерами плюрипотентності - Sox2, Oct3/4 i с-kit4, мітили флуоресцентним білком GFP+ і вводили в зону інфаркту міокарда в щурів. Результатом стало збільшення протягом 16 тижнів щільності капілярів поблизу зони інфаркту. Підтвердженням того, що відбувалася диференціація кардіоміоцитів, свідчила наявність у цих клітинах серцевого тропоніну І, фактора Віллебранда, а утворення міоцитів стінки кровоносних судин – гладком'язового актину. За тиждень вирощування клітин у культурі збирають до 5 "урожаїв". Генетичні дослідження показали, що частина цих клі тин бере початок від міокардіальних СК і містить ембріональний (SSEA-1) і антиген (c-kit, abcg2), характерний для СК дорослих. У цих клітинах in vitro відбувалася ангіогенна/кардіогенна диференціація і секреція цитокінів (IGF-1, VGEF). Тобто, із клітин кар діосфер розвиваються автологічні клітини-попередниці кар діоміоцитів і мезенхімних підтримувальних клітин, що можна використати в подальшому для відновлення тканин міокарда [59]. На біопсійному матеріалі з серця людини C. Bearzi et al. [60] показали наявність с-kit+ клітин iз класичними властивостями серцевих СК – клоногенних і мультипотентних, що було підтвер дже но експериментами на імунодефіцитних мишах і щурах, яким вводили ці клітини в ділянку інфаркту міокарда. СК ге не рували химерне серце, в якому виявили складові міокарда людини – кардіоміоцити, новоутворені артеріоли і капіляри. Автори роблять висновок – оскільки міокард людини структурно і функціонально інтегрований із міокардом гризунів, то отримані результати можуть бути використані в подальших дослідженнях автологічної регенерації пошкодженого міокарда в пацієнтів із серцевою недостатністю ішемічного чи неішемічного походження. Після трансплантації клітин кардіосфер мишам, яким мо делювали інфаркт міокарда, фракція викиду серця поліпшилася і менше проявлялися процеси фібротизації міокарда [61]. Через 3 міс спостереження ремоделювання серця зменшилося по рівняно з тими тваринами, яким не були пересаджені такі клітини. Клітини-попередниці породили нову серцеву тканину,

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

171

яка складалася з кардіоміоцитів і клітин кровоносних судин людини [62]. Як показано в експерименті на свинях, стан міокарда поліпшувався, аритмії і пухлини не виникали [63]. Серцеві клітини-попередниці в стовбурових нішах експре сують Notch1 рецептор і підтримують клітини Jagged1 Notch лігандом [64]. Notch1 діяльність є необхідною для контролю диференціації СК. Wnt/β-catenin cигнал, який сприяє розширенню експансії СК, негативно регулюється Notch1 [65]. Першими показали електронномікроскопічну будову СК із стовбурової ніші перикарда L.M. Popescu et al. [66]. Слід виокремити проблему трансдиференціації різних за фенотипом клітин у кардіоміоцити. Так, серед перших кандидатів на трансдиференціацію клітин у серцеві міоцити були скелетні міобласти. Дані щодо їхнього трансдиференціації на кардіоміоцити є суперечливими. Скелетні міобласти в експерименті при пересадці в міокард поліпшують стан лівого шлуночка, але існує ризик виникнення аритмій. До того ж простежуються їх паракринні взаємодії. На думку P. Menasche [67], міобласти не дають початок новим кардіоміоцитам. In vitro в присутності ретиноєвої кислоти міобласти починають експресувати конексин-43, тривалість їхнього життя становить 5 тижнів і при цьому поліпшуються функції міокарда [68]. Водночас T. Tamaki et al. [69] повідомили про те, що вони отримали зі скелетних м'язів мультипотентні Sk-34 клітини, які можуть диференціюватися в скелетні м'язові волокна і гладкі міоцити, а також кардіоміоцити, що можна в майбутньому використати з метою клітинної кардіопластики. Значну роль у регенерації серцевого м'яза відіграють серцеві фібробласти [70]. Є дані, що вони впливають на міокард завдяки цитокінам, що мало вивчено. Гіпоксія спричинює збільшення продукції тумор-некротичного фактора α, чим посилює пошкодження кардіоміоцитів. Є припущення, що серцеві фібробласти можуть перетворюватися на клітини-попередниці кардіоміоцитів та ендотеліальних клітин in vivo та in vitro [71], хоча об'єктивно наголошується, що існують труднощі в реалізації цієї програми. Стало відомо, що адипоцити сполучної тканини серця людини за певних умов перетворюютьcя на клітини з фенотипом кардіо міоцитів - на 21-у добу культивування після біопсії в них були ви-

172

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

явлені специфічні для серцевої м'язової тканини маркери (конексин-43, саркомерний α-актин, серцевий тропонін І і Т і десмін [72]. Окремо наголошують на тому, що потенційним розв'язанням проблеми втрати кардіоміоцитів та їх відновлення може стати не тільки відтворення нових клітин, але й активізація СК/клітин-попередниць із подальшою їхньою диференціацією в кардіоміоцити. Індукція проліферації кардіоміоцитів ссавців може стати одним із напрямків терапевтичної стратегії відновлення міокарда. Ураховуючи, що при захворюваннях серця смерть кардіоміоцитів настає шляхом некрозу, апоптозу та/або онкозу, слід протидіяти цим процесам і передбачити модуляцію активності кардіоміоцитів у клітинному циклі [73]. Новим підходом є також стимуляція ендогенної регенерації, а не тільки трансплантація СК [74, 75]. Визначено, що ключовим негативним регулятором проліферації кардіоміоцитів є p38 MAP-kinase [76]. Установлено, що циклін А2 у трансгенних серцевих клітинах збільшує проліферативну активність [77, 78], а циклін D2 активує клітинний цикл кардіоміоцитів після інфаркту міокарда в мишей [79]. Циклін D2 в трансгенних мишей індукує клітинний цикл у кардіоміоцитах у 500 разів більше, ніж у нетрансгенних [80]. Зроблені спроби використати рекомбінантні аденовіруси, як регулятори клітинного циклу in vivo та in vitro [81]. Нещодавно з'явилися дані про те, що ephrin A1-EphA2 сприяє рухливості Ерh2+ СК, пришвидшує їх міграцію в ділянки пошкодження і покращує серцеву регенерацію [82]. Можна стимулювати серцеві СК мікро РНК-499, який підвищує кардіоміогенез in vitro і після інфаркту в природних умовах, що призводить до поліпшення функції шлуночків [83]. Підсумовуючи викладене вище, слід сказати, що прогресивні науковці не помилялися, коли ініціювали багатовекторні дослідження в напрямку пошуків субстрату для відновлення серцевого м'яза. Філософія життя підказує, що не могла природа залишити один із найважливіших органів людини без потенціалу для самовідновлення та без джерела для репарації в разі крайньої потреби І внаслідок ретельних пошуків вчені не тільки знайшли клітини, що здатні формувати кардіоміоцитарний пул за певних умов, а й переконалися в тому, що самі кардіоміоцити можуть виходити з нульової точки клітинного циклу і реалізувати мітотичні проце-

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

173

си. Відкриттям було також і те, що навіть мікрооточення кардіоміоцитів "не пасе задніх": клітини сполучнотканинного диферону в разі потреби активно включаються в репаративні механізми, причому найнепередбачуванішим способом - експресією протеїнових детермінант, характерних для серцевих міоцитів. Таким чином, сподівання на створення універсального клітинного лікувального інструменту для відновлення структури та функції життєзабезпечувального органу в разі пошкодження набуває все більш оптимістичних обрисів і відкриває завісу того безмежного і потужного потенціалу, який закладений у нашому організмі. • Матеріали опубліковані в статті - Шляхи регенерації міо карда / О.І. Дєльцова, С.Б. Геращенко, Ю.Б. Чайковський [та інші] // Серце і судини. - 2012. - №2(38). - С. 96-101. Література 1. Itescu S. New directions in strategies using cell therapy for heart disease / S. Itescu, M.D. Schuster, A.A. Kocher // J. Mol. Med. (Berl.). – 2003. – Vol. 81(5). – P. 288-296. 2. Cardiogenic differentiation and transdifferentiation of progenitor cells / H. Reinecke, E. Minami, W.Z. Zhu [et al.] // Circ. Res. – 2008. – Vol. 103(1). – P. 1058-1071. 3. Buja L.M. Cardiomyocyte death and renewal in the normal and diseased heart / L.M. Buja, D. Vela // Cardiovasc. Pathol. – 2008. – Vol. 17(6). – P. 349-374. 4. Gurusamy N. Autophagy, redox signaling, and ventricular remodelling / N. Gurusamy, D.K. Das // Antioxid. Redox Signal. – 2009. – Vol. 11(8). – P. 1975-1988. 5. Dinsmore J.H. Stem cells and cardiovascular repair: a crytical analysis / J.H. Dinsmore, N. Dib // J. Cardiovasc. Trancl. Res. – 2008. – Vol. 1(1). – P. 41-54. 6. Segers V.F. Stem-cell therapy for cardiac disease / V.F. Segers, R.T. Lee // Nature. – 2008. – Vol. 451(7181). – P. 937- 942. 7. Cell therapy for myocardial regeneration / J. Liu, J.P. Sluijter, M.J. Goumans [et al.] // Curr. Mol. Med. - 2009. - Vol. 9(3). - P. 287-298. 8. Гринь В.К. Применение аутологичных мезенхимальных стволовых клеток в кардиологии и травматологии / В.К. Гринь,

174

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

А.А. Штутин, В.Ю. Михайличенко // Журн. НАМН України. 2011. - Т.17,№1. - С. 67-75. 9. Стовбурові клітини в кардіології / К.М. Амосова, І.В. Прудкий, І.Ю. Кацитадзе [та інші] // Серце і судини. - 2010. №3. - С. 109-114. 10. Bollini S. Resident cardiac progenitor cells: at the heart of regeneration / S. Bollini, N. Smart, P.R. Riley // J. Mol. Cell Cardiol. – 2011. – Vol. 50(2). – P. 296-303. 11. Stem cells sources for cardiac regeneration / M. Roccio, M.J. Gourmans, J.P. Sluijter [et al.] // Panminerva Med. – 2008. – Vol. 50(1). – P. 19-30. 12. Gonsales C. Progenitor cell therapy for heart disease / C. Gonsales, T. Pedrazzini // Exp. Cell Res. – 2009. – Vol. 315(18). – P. 3077-3085. 13. Neri T. Cardiac regeneration: still a 21st century challenge in search for cardiac progenitors from stem cells and embryos / T. Neri, S. Stefanovich, M. Puceat // J. Cardiovasc. Pharmacol. – 2010. – Vol. 56(1). – P. 16-21. 14. Carvalho A.B. Heart regeneration: Past, present and future / A.B. Carvalho. A.C. de Carvalho // World J. Cardiol. – 2010. – Vol. 2(5). – P. 107-111. 15. Adenoviral delivery of E2F-1 directs cell cycle reentry and p53-independent apoptosis in postmitotic adult myocardium in vivo / R. Agah, L.A. Kirshenbaum, M. Abdellatif [et al.] // J. Clin. Invest. – 1997. – Vol.100. – P. 2722–2728. 16. Chien K.R. Converging pathways and principles in heart development and disease // K.R. Chien, E.N. Olson // Cell. – 2002.– Vol. 110. – P. 153–162. 17. MacLellan W.R. Genetic dissection of cardiac growth control pathways // W.R. MacLellan, M.D. Schneider // Annu. Rev. Physiol. – 2000. – Vol. 62. – P. 289–319. 18. Oh H. The emerging role of telomerase in cardiac muscle cell growth and survival / H. Oh, M.D. Schneider // J. Mol. Cell Cardiol. – 2002. – Vol. 34. – P. 717–724. 19. Olson E.N. Sizing up the heart: development redux in disease / E.N. Olson, M.D. Schneider // Genes Dev. – 2003. – Vol. 17. – P. 1937–1956.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

175

20. Leinward L.A. Hope for a broken heart? / L.A. Leonward // Cell. – 2003. - Vol. 114(6). – P. 658-659. 21. Cardiac stem cells and myocardial regeneration / B. NadalGinard, P. Anversa, J. Kajstura [et al.] // Novartis Found Symp.– 2005. – Vol. 265. – P. 142-154. 22. Oh H. New era of cardiac stem cell therapy in heart failure / H. Oh // Rinsho Byori. – 2005. – Vol. 53(1). – P. 61-69. 23. Anversa P. Cardiac regeneration / P. Anversa, A. Leri, J. Kajstura // J. Am. Coll. Cardiol. – 2006. – Vol. 47(9). – P. 17691776. 24. Pallante B.A. Cell sources for cardiac regeneration – which cells and why / B.A. Pallante, J.M. Edelberg // Am. Heart Hosp. J. – 2006. – Vol. 4(2). – P. 95-97. 25. Rubbart M. Cardiac regeneration: repopulating the heart /M. Rubbart, L.J. Field // Annu. Rev. Physiol. – 2006. – Vol. 68.– P. 29-49. 26. Ahuja P. Cardiac myocyte cell cycle control in development, disease, and regeneration / P. Ahuja, P. Sdek, W.R. MacLellan // Physiol. Rev. – 2007. – Vol. 87(2). – P. 541-544. 27. Lyngbaek S. Cardiac regeneration by resident stem cell and progenitor cell in the adult heart / S. Lybgbaek, M. Schneider, J.L. Hansen // Basic Res. Cardiol. – 2007. – Vol. 102(2). – P. 101114. 28. Isolation and expansion of resident cardiac progenitor cells / P. van Vilet, J.P. Sluijter, P.A. Doevendans [et al.] // Expert. Rev. Cardiovasc. Ther. – 2007. – Vol. 5(1). – P. 33-43. 29. Stem cell therapy for myocardial regeneration mechanisms and current clinical applications / M. Centola, K.H. Schuleri, A.C. Lardo [et al.] // G. Ital. Cardiol. (Rome). – 2008. – Vol. 9(4).– P. 234-250. 30. Resident human cardiac stem cells : role in cardiac cellular homeostasis and potential for myocardial regeneration / D. Torella, G.M. Ellison, S. Mendez-Ferres [et al.] // Nat. Clin. Pract. Cardiovasc. Med. – 2006. – Vol. 3, Suppl. 1. – P. 8-13. 31. Cardiac stem cells and myocardial disease / J. Kajstura, K. Urbanek, M. Rota [et al.] // J. Mol. Cell Cardiol. – 2008. – Vol. 45(4). – P.505-513.

176

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

32. The human hearst: a self-renewing organ / J. Kajstura, T. Hocoda, C. Bearzi [et al.] // Clin. Transl. Sci. – 2008. – Vol. 1(1).– P. 80-86. 33. Cardiomyogenesis in the adult human heart / J. Kajstura, K. Urbanek, S. Perl [et al.] // Cir. Res. – 2010. – Vol. 107 (2). – P. 305-315. 34. Myocyte turnover in the aging human heart / J. Kajstura, N. Gurusamy, B. Ogorek [et al.] // Circ. Res. – 2010. – Vol. 107(11).– P. 1374-1386. 35. Functionally competent cardiac stem cells can be isolated from endomyocardial biopsies of patients with advanced cardiomyopathies / D. D-Amario, C. Fiorini, P.M. Campell [et al.] // Circ. Res. – 2011. – Vol. 108(7). – P.857-861. 36. Martinez E.C. Adult stem cells for cardiac tissue ingineering / E.C. Martinez, T. Kofidis // J. Mol. Сell Cardiol. – 2011. – Vol. 50(2). – P. 312-319. 37. Yoshida Y. iPS cells: a source of cardiac regeneration / Y. Yoshida, S. Yamanaka // J. Mol. Cell Cardiol. – 2011. – Vol. 50(2).– P. 327-332. 38. Myocardial neovascularization by bone marrow angioblasts results in cardiomyocyte regeneration / M.D. Schuster, A.A. Kocher, T. Seki [et al.] // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. – 2004. – Vol. 287(2). – P. 525-532. 39. Tang J.L. Autologous mesenchymal stem cells for postischemic myocardial repair / J.L. Tang // Methods Mol. Med. – 2005. – Vol. 112. – P. 183-192. 40. Mesenchymal stem cells participate in angiogenesis and improve heart function in rat model of myocardial ischemia with reperfusion / J. Tang, Q. Xie, G. Pan [et al.] // Eur. J. Cardiovasc. Surg. – 2006. – Vol. 30(2). – P. 353-361. 41. Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration / H.A. Sadek, C.M. Martin, S.S. Latif [et al.] // J. Cardiolvasc. Transl. Res. – 2009. – Vol. 2(2). – P. 173-181. 42. Henning R.J. Stem cells in cardiac repair / R.J. Henning // Future Cardiol. – 2011. – Vol. 7(1). – P. 99-117. 43. Therapeutical potential of stem/progenitor cells in human skeletal muscle for cardiovascular regeneration / T. Nomura, E.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

177

Ashihara, K. Tateishi [et al.] // Curr. Stem Cell Res. Ther. – 2007.– Vol. 2(4). – P. 293-300. 44. Hosoda T. Mechanisms of myocardial regeneration / T. Hosoda, J. Kajstura, A. Leri // Circ. J. – 2010. – Vol. 74(1). – P. 13-17. 45. Nadal-Ginard B. Cardiovascular regenerative medicine at the crossroads. Clinical trials of cellular therapy must now be based on reliable experimental data from animals with characteristics similar to human's / B. Nadal-Ginard, D. Torella, G. Ellison // Rev. Esp. Cardiol. – 2006. – Vol. 59(11). – P. 1175-1189. 46. Joggerst S.J. Stem cell therapy for cardiac repair: benefits and Barriers / S.J. Joggerts, A.K. Hatzopoulos // Expert Rev. Mol. Med. – 2009. – Vol. 11. – P. e20. 47. Shah V.K. Stem Cell Therapy in Acute Myocardial Infarction: A Pot of Gold or Pandora's Box / V.K. Shah, K.K. Shalia // Stem Cells Int. – 2011; 2011 :536758. 48. Beltrani A.P. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration / A.P. Beltrani, L. Barlucci, D. Torella // Cell. – 2003. – Vol. 114(6). – P. 763-776. 49. Dose-dependent contribution of CD34-positive vasculogenesis and cardiomyogenesis for functional regenerative recovery after myocardial infarction / H. Iwasaki, A. Kawamoto, M. Ishikawa [et al.] // Circulation. – 2006. – Vol. 113(10). – P. 1311-1325. 50. Endogenous cardiac stem cells / L. Barile, E. Messina, A. Giacomello [et al.] // Prog. Cardiovasc. Dis. – 2007. – Vol. 50(1). – P. 31-48. 51. Leri A. Role of cardiac stem cells in cardiac pathophysiology: a paradigm shift in human myocardial biology / A. Leri, J. Kajstura, P. Anversa // Circ. Res. – 2011. – Vol. 109(8).– P. 941-961. 52. Laser J.A. Endomyocardial biopsy / J.A. Laser, R.E. Fowles, J.W. Mason // Cardiovasc. Clin. – 1985. – Vol. 15(1). – P. 141163. 53. Myocardial regeneration by activation of multipotent cardiac stem cells in ischemic heart failure / K. Urbanek, D. Torella, F. Sheiku [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2005. – Vol. 102(24). – P. 8692-8697.

178

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

54. Itzhaki-Alfia A. Patient characteristics and cell source determine the number of isolated human progenitor cells / А. Itzhaki-Alfia // Circulation. – 2009. – Vol. 120(25). – P. 25592566. 55. Isolation and expasion of adult cardiac stem cells from human and murine heart / E. Messina, L. De Angelis, G. Frati [et al.] // Circ. Res. – 2004. – Vol. 95(9). – P. 911-921. 56. Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue / D.R. Davis, Y. Chang, R.R. Smith [et al.] // PLoS One. – 2009. – Vol. 4(9). – P. e7195. 57. Relative roles of direct regeneration versus paracrine effects of human cardiosphere-derived cells transplanted into infarcted mice / I. Chimenti, R.R. Smith, T.S. Li [et al.] // Circ. Res. – 2010.– Vol. 106(5). – P. 971-980. 58. Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at last 16 weeks – an MRT study / C.A. Carr, D.J. Stucey, J.J. Tan [et al.] // PLoS One. – 2011. – Vol. 6(10). – P. 256269. 59. Isolation and expansion of functionally-competent cardiac progenitor cells directly from heart biopsies / D.R. Davis, E. Kizana, J. Terrovitis [et al.] // J. Mol. Cell Cardiol. – 2010. – Vol. 49(2). – P. 312-321. 60. Human cardiac stem cells / С. Bearzi, M. Rota, T. Hosoda [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2007. – Vol. 104(35). – P. 14068-14075. 61. Regenerative potential of cardiosphere-derived cells expanded from percutaneous endomyocardial biopsy specimens / R.R. Smith, L. Barile, H.C. Cho [et al.] // Circulation. – 2007. – Vol. 115(7). – P. 896-908. 62. Human cardiomyocyte progenitor cell transplantation preserves long-term function of the infarcted mouse myocardium / A.M. Smits, L.W. van Laake, K. den Ouden [et al.] // Cardiovasc. Res. – 2009. – Vol. 83(3). – P. 527-535. 63. Engraftment, differentiation, and functional benefits of autologous cardiosphere-derived cells in porcine ischemic cardiomyopathy / P.V. Jonston, T. Sasano, K. Mills [et al.] // Circulation. - 2009. – Vol. 120(12). – P. 1075-1083.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

179

64. Notch1 regulates the fate of cardiac progenitor cells / A. Boni, K. Urbanek, A. Nascimbene [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2008. – Vol. 109(40). – P. 15529-15534. 65. A regulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/esl1 determines cardiac progenitor cell fate / C. Kwon, L. Qian, P. Cheng [et al.] // Nat. Cell Biol. – 2009. – Vol. 11(8). – P. 951-957. 66. Cardiac renewing intestinal Cajal-like nurse cardiomyocyte progenitors in epicardial stem cell niches / L.M. Popescu, M. Gherhiceanu, C.G. Mande [et al.] // J. Cell Mol. Med. – 2009. – Vol. 13(5). – P. 866-886. 67. Menasche P. Skeletal myoblasts as a therapeutic agent / P. Menasche // Prog. Cardiovasc. Dis. – 2007. – Vol. 50(1). – P. 7-17. 68. Human adult skeletal muscle stem cells differentiate into cardiomyocyte phenotype / G. Invernici, S. Cristini, P. Madeddu [et al.] // Exp. Cell Res. – 2008. – Vol. 314(2). – P. 366-376. 69. Cardiomyocyte formation by skeletal muscle-derived multimyogenic stem cells after transplantation into infarcted myocardium / T. Tamaki, A, Akatsuka, Y. Okada [et al.] // PloS One. – 2008.– Vol. 3(3). – P. e1789. 70. Paracrine effects of hypoxic fibroblast-derived factors on the MPT-ROS threshold and viability of adult rat cardiac myocytes / K. Shivakumar, S.J. Solotti, M. Sangeetha [et al.] // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. – 2008. – Vol. 294(6). – P. 26532658. 71. Another possible cell resources for cardiac regenerative medicine: reprogramming adult fibroblasts to cardyomyocytes and endothelial progenitor cells / X. Xie, A. Sun, Z. Huang [et al.] // Med. Hypotheses. – 2011. – Vol. 76(3). – P. 365-367. 72. Human cardiac tissue induces transdifferentiation of adult stem cells towards cardiomyocytes / M. Peran, J.A. Marchal, E. Lopez [et al.] // Cytotherapy. – 2010. – Vol. 12(3). – P. 332-337. 73. Lafontant P.J. The cardiomyocyte сell cycle / P.J. Lafontant, L.J. Field // Novartis Found Symp. – 2006. – Vol. 274. – P. 196207. 74. Bolli P. Molecular physiology of cardiac regeneration / P. Bolli, H.W. Chaudhry // Ann. NY Acad. Sci. – 2010. – Vol. 1211.– P. 113-126.

180

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

75. Guyette J.P. Strategies for regeneration of heart muscle / J.P. Guyette, I.S. Cohen, G.R. Gaudette // Crit. Rev. Eukaryot. Gene Exp. – 2010. – Vol. 20(1). – P. 35-50. 76. Engel F.B. Cardiomyocyte proliferation: a platform for mammalian cardiac repair / F.B. Engel // Cell Cycle. – 2005. – Vol. 4(10). – P. 1360-1363. 77. Cyclin A2 mediates cardiomyocyte mitosis in the postmitotic myocardium / H.W. Chaudhry, N.H. Dastoush, H. Tang [et al.] // J. Biol. Chem. – 2004. – Vol. 279(34). – P. 35858-35866. 78. Cyclin A2 induces cardiac regeneration after myocardial infarction and prevents heart failure / P.K. Cheng, T. Assai, H. Tang [et al.] // Circ. Res. – 2007. – Vol. 100(12). – P. 17411748. 79. Hassink R.J. Cardiomyocyte cell cycle activation improves cardiac function after myocardial infarction / R.J. Hassink, K.B. Pasumarthi, H. Nakajima // Cardiovasc. Res. – 2008. – Vol. 78(1). – P. 18-25. 80. Cell-cycle-based strategies to drive myocardial repair / W. Zhu, R.J. Hassink, M. Rubart [et al.] // Pediatr. Cardiol. – 2009. – Vol. 30(5). – P.710-715. 81. Bicknell K.A. Can cardiomyocyte cell cycle be reprogrammed? / K.A. Bicknell, C.H. Coxon, G. Brooks // J. Mol. Cell Cardiol. – 2007. – Vol. 42(4). – P. 706-721. 82. The ephrin A1-EphA2 system promotes cardiac stem cell migration after infarction / P. Goisberg, Y. Bai, A. D.Amario [et al.] // Circ. Res. – 2011. – Vol. 108(9). – P. 1071-1083. 83. Human cardiac stem cell differentiation is regulated by a mircrine mеchanism / T. Hosoda, H. Zeng, M. Cabral-da-Silva [et al.] // Circulation. – 2011. – Vol. 123(12). – P. 1287-1296.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

181

Дитині успішно пересаджено вену, штучно вирощену з її власних стовбурових клітин. Опубліковано 25.06.2012. Шведські лікарі зі Сахлгренського універсіту в Гетеборзі вперше в світі виростили вену зі стовбурових клітин та пересадили її 10-річній дівчинці. Рік потому після першої операції шведські вчені подовжили дівчинці вену, яка стала короткою, виростивши ще один сегмент судини таким чином. Джерело: www.umj.com.ua. http:// www.hemafund.com/uk/news/hemafund_news/Vrachi-uspeshnoperesadili-rebenku-venu-iskusstvenno-virashchen.htm

Відомо, що у фізіологічній чи репаративній регенерації кожної тканини і органа в дорослих беруть участь СК. Великий обсяг досліджень стосується СК гладких міоцитів стінки кровоносних судин. Згідно канонічної точки зору СК гладкої м'язової тканини стінки кровоносних судини розташовуються в їхній адвентиційній оболонці [1 - 5]. Водночас у численних працях наголо шується на тому, що клітини–попередниці з адвентиційної оболонки можуть мігрувати у внутрішню оболонку і долyчатися до розвитку атеросклеротичних пошкоджень інтими [6]. Останні дані щодо СК гладких міоцитів у стінці кровоносних судин наводяться в роботі Z. Tang et al. [7]. Автори пpезентують новий тип мультипотентних СК із маркерами Sox17, Sox10 i S100, які можуть проліферувати і диференціюватися в гладкі міоцити і тим самим сприяти ремоделюванню стінки судини. У дорослих їхню диференціацію можна спрямувати саме в такому напрямку з допомогою тромбоцитарного фактору росту–ВВ (PDGF–BB) і трансформуючого фактору росту β1 [8]. Регуляцію диференціації СК стінки судини здійснює Notch сигнал за посередництвом TGF-β, які узгоджено стимулюють молекулярний і скоротливий фенотип [9 - 12]. Водночас зрілі гладкі міоцити можна активізувати для перетворення на проліферативний фенотип у культурі шляхом змін внутрішньоклітинного Ca (2+) та його рецепторів [13]. У клініці вивчали Notch сигналізацію в аневризмі грудної частини аорти та за її розшарування. Notch сигналізація є надзвичайно важливою в збереженні і регуляції долі клітин у багатоклітинних організмах [14]. Недавні дослідження показали, що Notch шлях бере участь у проліферації, міграції, диференціації

182

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

гладких міоцитів стінки кровоносних судин і виконує важливу роль у захворюваннях серцево–судинної системи. Виявили, що відбувається прогресуюча дегенерація середньої оболонки судини через руйнування тканин і недостатнього їх відновлення. В обох випадках у медії виявлені СК iз маркерами CD34+ i STRO–1+. У фібробластах і макрофагах, які накопичуються в стінці аорти таких пацієнтів, виявлені маркери NICD i Hes1. Ці клітини знаходяться під впливом складних неоднозначних відхилень Notch сигналізації – пригнічення в гладких міоцитах середньої оболонки і активації в фібробластах і макрофагах [15]. Аневризми черевної аорти є зростаючою проблемою в усьому світі. Патогенез включає в себе посилення деградації еластину і зменшення його утворення, у результаті прогресує апоптоз гладких м'язів стінки судини. Дослідники зосередили свою увагу на потенційній ролі СК в ослабленні прогресування аневризми аорти шляхом інгібування цих патогенетичних механізмів. В експерименті виділили СК зі скелетних м'язів у мишей і їх стимулювали PDGF-BB у пробірці для утворення клітин–попередниць гладких міоцитів, які були імплантовані в еластаз-індуковану аневризму аорти щурам. У результаті такої маніпуляції знизилася швидкість прогрeсування аневризми, у порівнянні з контролем. Ці результати показують перспективну роль терапії СК для лікування аневризми аорти [16]. У "васкулогенних зонах" (стовбурових нішах), які розташо вані між середньою і адвентиційною оболонками судини [17, 18] (додаток 5), ідентифікуються не тільки СК–резиденти і клітини–попередниці гладких міоцитів, але й ендотеліоцитів [19 - 21]. Їх можна визначити також у субендотеліальному просторі [22]. На думку E. Torsney, O. Xu [23], усі оболонки кровоносної судини містять СК, у тому числі і клітини–попередниці мезен хімно-стромальних ліній – SCA–1+ i CD34+[24]. В адвентиції судин виявили CD44+, CD90+, CD73+, CD34–, CD45– клітини з властивостями мультипотентних клітин [25]. М'язові СК з адвентиції мишей характеризуються маркером ССС–1+ [26] (табл. 7). Клітини–попередниці, які локалізуються в судинній стінці, відіграють ключову роль у судинному гомеостазі та реге нерації [27].

Розділ 3. С товбурові

183

клітини органів і систем дорослого організму

H. Chao, K.K. Hirschi [28] вважають, що попередниці ендотеліоцитів походять із кровотворної і судинної систем і циркулюючі в крові не–резиденти дають початок ендотеліоцитам і гладким міоцитам [29], a кістковомозкові СК беруть участь в утворенні нової капілярної сітки після ішемії (неоваскуляризація) [30, 31], що може бути використано для автологічної терапії постраждалих кровоносних судин і протезів та лікування ішемічних розладів [32 - 34]. Таблиця 7

Найбільш поширені маркери стовбурових клітин стінки кровоносних судин Маркер

Значення

Рецептор поверхні ендотеліальної клітини-попередниці FLK1 (VEGFR-2), маркер міжклітинних контактів, фактор проникності (Fetal liver kinase-1) судин, індукує проліферацію ендотеліоцитів у пробірці і проникність судин у живому організмі SM-CSM Ідентифікує гладкі міоцити в стінці кровоносних судин, вико(Smooth muscle ристовується для вивчення процесів диференціації гладких cell-specific myosin міоцитів на рівні транскрипції heavy chain) VE- кадгеVE-кадгерін (судинний ендотеліальний), також відомий як рин (Vascular CD144, ідентифікує гладкі міоцити в стінці кровоносних судин, endothelial cell необхідний для правильного розвитку судин та підтримки ноcadherin) воутворених судин Глікопротеїн, відомий як Prominin1, експресується ендотеліальCD133 ними клітинами-попередницями CD34 Глікопротеїн клітинної поверхні, фактор міжклітинної адгезії Iнтегральний мембранний глікопротеїн, відомий як (РЕCD31 САМ-1), експресується ранніми і зрілими ендотеліальними клітинами, маркер міжклітинних контактів Глікопротеїн, присутній у плазмі крові, синтезується ендотеліоцитами і накопичується в тільцях Weibel-Palade, поява яких в vWF (фактор фон експерименті була пов'язана зі зміною функціональної активВіллебранда) ності ендотеліоцитів і можливо, вказувала по ряду непрямих ознак, на зміну ступеня їх зрілості при вторинному ангіогенезі

B.R. Everaert et al. [35] показали, що ендотеліальні клітини–попередниці перебувають у червоному кістковому мозку в тісному контакті зі стромальними клітинами, а при стимуляції

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

184

запальними цитокінами мобілізуються з червоного кісткового мозку в кров, осідають у периферійних тканинах і підлягають подальшій проліферації та диференціації (рис. 11). Стромальні клітини червоного кісткового мозку

mKitL Клітини-попередниці ендотеліоцитів

sKitL

ММР-9 Гематопоетичні клітини-попередниці

CD133+ CD34+ VEGFR-2+ Ендотеліоцити стінки судини CD133+/CD34+ VEGFR-2+ CD31+ VE-cadherin vWF+

CD34+ VEGFR-2+ CD31+ VE-cadherin vWF+

Циркулюючі клітинипопередниці ендотеліоцитів

Ендотеліоцити стінки судини

Рис. 11. Самооновлення і диференціація ендотеліальних стовбурових клітин із червоного кісткового мозку за M. Hristov et al. [36]. Позначення: vWF+ - фактор Віллебранда, VEGFR-2+ - васкулоендотеліальний фактор росту.

Рис. 11. Самооновлення і диференціація ендотеліальних стовбурових При захворюваннях ці процеси порушуються. За умов норми клітин із червоного кісткового мозку. при мобілізації, самонаведенні та при регенерації Позначення: vWF+диференціації, - фактор Віллебранда, VEGFR-2+ ключову роль фактор ангіогенних васкулоендотеліальний росту. властивостей контролює PIZK/AKT/ Ендотеліальні попередниці клітин циркулюють у периферійній крові дорослої людини і, вважають, що вони беруть участь у постнатальному рості

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

185

eNOS сигнальний шлях. J.D. Pearson [37] висловлює думку про те, що більшість ендотеліальних попередниць не є по суті власне такими і тому, можливо, їх краще описувати як "ангіогенні моноцити". J.M. Daniel, D.G. Sedding [38] також стверджують, що з циркулюючих у крові моноцитів можуть утворитися ендотеліоцити, але потенціал їхньої "трансдиференціації" залишається спірним питанням. У крові людини в нормі можна виявити ендотеліоцити різних ступенів зрілостi і морфо–функціонального стану – від клітин–попередниць до клітин у стані апоптозу. Понад 10 років тому з'явився термін "циркулюючі ендотеліальні клітини–попередниці". Ці клітини є членами гематопоетичної родини [39], виявляють властивості клітин–попередниць ендотеліоцитів [40] і можуть бути використані в регенеративній медицині [41]. До них проявляється великий інтерес, але немає "золотого стандарту" для ізоляції цих клітин, що стримує їхнє застосування з лікувальною метою. Такі клітини були визначені в крові за поверхневими антигенними маркерами CD34+, AC133+, Flk–1+ та іншими, спільними з гематопоетичними СК [42]. Ендотеліальні попередниці клітин циркулюють у периферійній крові дорослої людини і, вважають, що вони беруть участь у постнатальному рості нових кровоносних судин. Накопичені експериментальні дані щодо потенційних можливостей цих клітин у терапевтичному лікуванні серцево–судинних захворювань [43]. Їх застосували для лікування гіпоксичних станів і неоваскуляризації ішемічно пошкоджених органів, прискорення ендотелізаціі в ділянці пошкодження судин [44 - 46, 34]. У крові також виявлені "циркулюючі" гладком'язові клітини–попередниці" [37], які характеризуються маркером CD14+ i при їхньому культивуванні в культурі набувають веретеноподібної форми та виявляють конкретні маркери СК під впливом тромбоцитарного фактору росту–ВВ (PDGF–BB). O. Van Oostrom et al. [46] вважають, що такі клітини беруть участь у патогенезі судинних захворювань. Під впливом факторів судинного ризику вони мобілізуються з червоного кісткового мозку, стають циркулюючими клітинами–попередницями під впливом тромбоцитарного фактору росту–ВВ, експресують CD34+, CD14+, CD105+,

186

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

SM22+, SM MHC+, Calponin+, вступають у судинну стінку і можуть формувати ділянки неоваскуляризації чи атеросклeротичну бляшку. Тому автори ставлять питання: у данному випадку новоутворені гладкі міоцити – друзі чи вороги? Ендотеліальні клітини–попередниці (CD34+) можуть дифе ренціюватися в ендотеліоцити і гладкі міоцити під впливом фактору росту фібробластів (bFGF) або тромбоцитарного фактору росту–ВВ (PDGF–BB) [48]. Новоутворені гладкі міоцити експресують α-актин і кальпонін, а ендотеліоцити CD31+ і фактор Віллебранда. Під впливом PDGF–BB 83,76% клітин стали глaдкими міоцитами, а під впливом bFGF 89,27 % – ендотеліоцитами [49]. Новим ангіогенним білком, який позитивно впливає на ендотеліальні клітини–попередниці і поліпшує кровоток у постнатальному онтогенезі, є Wnt [50]. Окремо слід розглянути долю адвентиційних клітин капілярів – перицитів (клітин Маршана), які вважаються малодиференційованими клітинами, що беруть участь у відновленні стінки капіляра. Вивчені перицити капілярів різних органів (скелетні м'язи, підшлункова залоза, жирова тканина, плацента) і встановлено, що перицити мають міогенні властивості [51 - 53]. Недавні експерименти показали терапевтичний потенціал перицитів людини до регенерації скелетних м'язів і сприяли функціональному відновленню хворого серця і нирок [54]. Захоплюючі відкриття в тканинах дорослих СК/клітин- попередниць в останні роки призвели до вибуху інтересу до розробки нових технологій вирощування і застосування СК у терапії для підвищення регенеративної здатності цих ендогенних незрілих клітин або пересаджених клітин для відновлення пошкоджених і уражених тканин. На противагу, усе більше доказів наводиться на користь того, що зміни фенотипових і функціональних властивостей СК/клітин–попередниць дорослої людини виникають під час хронологічного старіння і мають серйозні патологічні наслідки. Інтенсивний окислювальний і метаболічний стрес і хронічне запалення, посилене виснаження теломерів і дефектів у механізмах репарації ДНК ініціює серйозні пошкодження ДНК і геномну нестабільність дорослих СК/клітин-попередниць із віком, що, у свою чергу, викликає старіння чи їхню репліка-

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

187

тивну та/або запрограмовану клітинну смерть. Крім того, зміни у внутрішніх і зовнішніх факторах, що беруть участь у строгому контролі самооновлення і множинної диференціації можливостей цих регенеративних клітин, виникнення нерегульованих сигналів у стовбурових нішах залежно від віку, призводить до їхньої дисфункції або втрати під час хронологічного старіння. Пов'язане з віком зниження регенеративного і функціонального потенціалу дорослих СК/клітин-попередниць може збільшити ризик розвитку деяких захворювань [55]. Описано фенотип старіючих ендотеліоцитів і обговорюються патофізіологічні наслідки цих процесів [56]. Існують докази того, що старіння ендотеліальних клітини має відношення до судинних захворювань [57]. Ендотеліальні клітини–попередниці підлягають віковим змінам, які зменшують їх кількість в обігу і обмеження функції, тим самим підвищують ризик судинних захворювань [58, 59]. Зменшення кількості циркулюючих ендотеліальних клітин–попередниць у літніх людей пояснюють зниженням експресії ними протиапоптичних білків, через що втрачається опір апоптичним змінам у клітинах [60, 61]. Література 1. Roberts N. Progenitor cells in vascular disease / N. Roberts, M. Jahangiri, O.Xu // J. Cell Mol. Med. – 2005. – Vol. 9(3). – P. 583–591. 2. Xu O. The role of stem cells in atherosclerosis / O. Xu // Arch. mal. Couer. Vaiss. – 2005. – Vol. 98(6). – P. 672–676. 3. Margariti A. Stem cells vascular smooth muscle cells and atherosclerosis / A. Margariti, L. Zeng, O. Xu // Histol. Histopathol.– 2006. – Vol. 21(9). – P. 979–985. 4. Albiero M. Curculating smooth muscle progenitors and atherosclerosis / M. Albiero, L. Menegazzo, G.P. Fadini // Trend. Cardiovasc. Med. – 2010. – Vol. 20(4). – P. 133–140. 5. Resident vascular progenitor cells-diverse origins, phenotype and function / P.J. Psaltis, A. Harbuzarin, S. Delacroix [et al.] // J. Cardiovasc. Transl. Res. – 2011. – Vol. 4(2). – P. 161–176. 6. Torsney E. Adventitial progenitor cells contribute to atherosclerosis / E. Torsney, Y. Hu, Q. Xu // Trends Cardiovasc. Med. – 2005. – Vol. 15(2). – P. 64–68.

188

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

7. Differentiation of multipotent vascular stem cells contributes to vascular diseases / Z. Tang, A. Wang, F. Guan [et al.] // Nat. Commun. – 2012. – Vol. 3. – P. 875. 8. Wanjare M. Derivation and maturation of synthetic and contractile vascular smooth muscle cells from human pluripotent stem cells / M. Wanjare, F. Kuo, S. Gerecht // Cardiovasc Res. – 2013. – Vol. 97(2). – P. 321–330. 9. Kurpinski К. Transforming growth factor–beta and Notch signaling mediate stem cell differentiation into smooth muscle / K. Kurpinski // Stem Cells. – 2010. – Vol. 28(4). – P. 734–742. 10. Notch and transforming growth factor–beta (TGF– beta) signaling pathways cooperatively regulate vascular smooth musclecell differentiation / Y. Tang, S. Urs, J. Boucher [et al.] // J. Biol. Chem. – 2010. – Vol. 285(23). – P. 17556–17563. 11. Yang K. Vascular smooth muscle Notch signals regulate endothelial cell sensivity to angiogenic stimulation / K. Yang, A. Proweller // J. Biol. Chem. – 2011. – Vol. 286(15). – P. 13741–13753. 12. Yong Z. Use of human mesenchymal stem cells as alternative source of smooth musclеcells in vessel engineering / Z. Yong, L.E. Niklason / Methods Mol. Biol. – 2011. – Vol. 698. – P. 279–294. 13. Matchkov V.V. Intracellular Ca2+ signalling and phenotype of vascular smooth muscle cells // V.V. Matchkov, О. Kudryavtseva, С. Aalkjaer // Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. – 2012. – Vol. 110(1).– P. 42–48. 14. Iso T. Notch signaling in vessels development / T. Iso , Y Hamamori , L. Kedes // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2003.– Vol. 23 (4). – P.543–553. 15. Notch signaling in descending thoracic aortic aneurysm and dissection // S. Zou, P. Ren, M.Nguyen [et al.] PLoS One. – 2012.– Vol. 7(12). – P. e52833. 16. Potential role of vascular smooth muscle cell–like rogenitor cell therapy in the suppression of experimental abdominal aortic aneurysms // H.S. Park, G.H. Choi, S. Hahn [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2013. – Vol. 431(2). – P. 326–331. 17. Vascular wall resident progenitor cells: a source for postnatal vasculogenesis / E. Zengin, F. Chalajour, U.M. Gehling [et al.] // Development. – 2006. – Vol. 133(8). – P. 1543–1551.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

189

18. The adventitia: a progenitor cell niche for the vessel wall / M.W. Majesky, X.R. Dong, V. Hoglund [et al.] // Cells Tissues Organs. – 2012. – Vol. 195(1-2). – P. 73–81. 19. Ergun S. Vascular wall as a reservoir for different types of stem and progenitor cells / S. Ergun, D. Tilki, D. Klein // Antioxid. Redox Signal. – 2011. – Vol. 15(4). – P. 981–985. 20. Hu Y. Adventitial biology: differentiation and function / Y. Hu, O. Xu // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2011. – Vol. 31(7). – P. 1523–1529. 21. Majesky M.W. The adventitia: a namic interface containing resident progenitors cells / M.W. Majeski // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2011. – Vol. 31(7). – P. 1530–1539. 22. Emerging biology of vascular wall progenitor cells in health and disease / D. Tilki, H.P. Hohn, S.Ergun [et al.] // Trends Mol. Med. – 2009. – Vol. 15(11). – P. 501–509. 23. Torsney E. Resident vascular progenitor cells / E. Torsney, O. Xu // J. Mol. Cell Cardiol. – 2011. – Vol. 50(2). – P. 304–311. 24. Vascular wall–resident stem cells / D. Klein, H.P. Hohn, V. Kleff [et al.] // Histol. Histopathol. – 2010. – Vol. 25(5). – P. 681689. 25. Vascular wall–resident CD44+ multipotent stem cells give rise to pericytes and smooth musclecells and contribute to new vessel maturation / D. Klein, P. Weisshardt, V. Kleff [et al.] // PLoS One. – 2011. – Vol. 6(5). – P. 20540. 26. Proteomic and metabolic analysis of smooth muscle cells derived from the arterial media and adventitial progenitors of apolipoprotein E-deficient mice / M. Mayr, A. Zampetaki, A. Sidide [et al.] // Cir. Res. – 2008. – Vol. 102(9). – P. 1046–1056. 27. Hofmann N.A. Endothelial colony-forming progenitor cell isolation and expansion / N.A. Hofmann, A. Reinich, D. Strunk // Methods Mol. Biol. – 2012. – Vol. 879. – P. 381–387. 28. Chao H. Hemato–vascular origins of endothelial progenitor cells? / H. Chao, K.K. Hirschi // Microvasc. Res. – 2010. – Vol. 78(3). – P. 169–173. 29. Campagnolo P. Progenitor cells in arteriosclerosis: good or bay guys? / P. Campagnolo, M.M. Wong, O. Xu // Antioxid. Redox Signal. – 2011. – Vol. 15(4). – P. 1013–1027.

190

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

30. Hirschi K.K. Smooth muscle stem cells / K.K. Hirschi, M.W. Majesky // Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. – 2004. – Vol. 276(1). – P. 22–33. 31. Urbich C. Endothelial progenitor cells functional characterization / C. Urbich, S. Dimmeter // Trends Cardiovasc. Med. – 2004. – Vol. 14(8). – P. 318–322. 32. Isolation and transplantation of autologous circulating endothelial cells into denuded vessels and prosthetic grafts: implications for cell–based vascular therapy // D.P. Griese, A. Ehsan, L.G. Melo [et al.] // Circulation. – 2003. – Vol. 108(21). – P. 2710–2715. 33. Marsboom G. Endothelial progenitor cells: new perspectives and applications in cardiovascular therapies // G. Marsboom, S. Janssens // Expert. Rev. Cardiovasc. Ther. – 2008. – Vol. 6(5). – P. 687–701. 34. Yamahara K. Potential use of endothelial progenitor cells for regeneration of the vasculature // К. Yamahara, Н. Itoh // Ther. Adv. Cardiovasc. Dis. – 2009. – Vol. 3(1). – P. 17–27. 35. Current perspective of pathophysiological and interventional effects on endothelialprogenitor cell biology: focus on PIZK/AKT/ eNOS pathway / B.R. Everaert, E.M. Van Craenebroeck, V.Y. Hoymans [et al.] // Int. J. Cardiol. – 2010. – Vol. 144(3). – P. 350–366. 36. Hristov M. Endothelial progenitor cells: mobilization, differentiation, and homing / M. Hristov, W. Erl, P.C. Weber // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2003. - Vol. 23(7). - P.1185-1189. 37. Pearson J.D. Endothelialprogenitor cells – an evolving story / J.D. Pearson / Microvasc. Res. – 2010. – Vol. 79(3). – P. 162–168. 38. Daniel M. Circulating smooth muscle progenitor cells in arterial remodelling / M. Daniel, D.G. Sedding // J. Mol. Cell Cardiol. – 2011. – Vol. 50(2). – P. 273–279. 39. Richardson M.R. Endotelialprogenitor cells: quo vadis? / M.R. Richardson, M.C. Yoder // J. Moll. Cell Cardiol. – 2011. – Vol. 50(2). – P. 266–272. 40. Yoder M.C. Is endothelium the origin of endothelialprogenitor cells? / M.C. Yoder // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2010. – Vol. 30(6). – P. 1094–1103.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

191

41. A novel method for the extraction and culture of progenitor stem cells from human peripheral blood for use in regenerative medicine / G. Punshon, D.S. Vara, K.M. Sales [et al.] // Biotechnol. Appl. Biochem. – 2011. – Vol. 55(8). – P. 328–334. 42. Kawamoto A. Role of progenitorendothelial cells in cardiovascular disease and upcoming–therapies / A. Kawamoto, T. Asahara // Catheter Cardiovasc. Interv. – 2007. – Vol. 70(4). – P. 477–484. 43. Ben-Shoshan J. Endothelial progenitor cells as therapeutic vectors in cardiovascular disorders: from experimental models to human trials // J. Ben-Shoshan, J. George // Pharmacol. Ther. – 2007. – Vol. 115(1). – P. 25–36. 44. Circulating endothelial progenitor cells characterization, function and relationship with cardiovascular risk factors // А. Balbarini,M.C. Barsotti, R. Di Stefano [et al.] // Curr. Pharm. Des. – 2007. – Vol. 13(16). – P. 1699–1713. 45. Geft D. Circulating endothelial progenitor cells in cardiovascular disorders / D. Geft, S. Schwartzenberg, J.George // Expert. Rev. Cardiovasc. Ther. – 2008. – Vol. 6(8). – P. 1115–1121. 46. Povsic T.J. Endothelial progenitor cells: markers of vascular reparative capacity // T.J. Povsic, P.J. Goldschmidt-Clermont // Ther. Adv. Cardiovasc. Dis. – 2008. – Vol. 2(3). – P. 199-213. 47. Smooth muscle progenitor cells: friend or foe in vascular disease? / O. van Oostrom, J.O. Fledderus, D. de Kleijn [et al.] // Curr. Stem Cell Res. Ther. – 2009. – Vol. 4(2). – P. 131–140. 48. Platelet–derived growth factor–BB (PDGF–BB) induces differentiation of bone marrow endothelial progenitor cell–derived cell line TR-BMF2 into mural cells, and changes the phenotype / T. Miyata, H. Lizasa, Y. Sai [et al.] // J. Cell Physiol. – 2005. – Vol. 204(3). – P. 948-955. 49. Endothelial progenitor cells derived from CD34+ cells form cooperative vascular networks / S. Guo, Y. Cheng, Y. Ma [et al.] // Cell Physiol. Biochem. – 2010. – Vol. 24(4-5). – P. 679–688. 50. Wnt1 is a proangiogenic molecule, enhances human endothelial progenitor function, and increases blood flow to ischemic limbs in a HGF–dependent manner / C.M. Gherge, J. Duan, J. Gong [et al.] // FASEB. – 2011. – Vol. 25(6). – P. 1836–1843.

192

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

51. Рerivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs / M. Crisam, S. Yap, L. Castella [et al.] // Cell Stem Cell. – 2008. – Vol. 3(3). – P. 301–303. 52. Perivascular multipotent progenitorcells in human organs / M. Crisan, C.W. Chen, M. Corselli [et al.] // Ann. NY Acad. Sci. – 2009. – Vol. 1176. – P. 118–123. 53. Perivascular multi–lineage progenitorcells in human organs: regenerative units, cytokine sources or both? / C.W. Chen, E. Montelatici, M. Crisan [et al.] // Cytokine Growth Factor Rev. – 2009. – Vol. 20(5-6). – P. 429–434. 54. Perivascular ancestors of adult multipotent stem cells / M. Corselli, C.W. Chen, M. Crisam [et al.] // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2010. – Vol. 30(6). – P. 1104–1109. 55. Mimeault M. Aging of tissue–resident adult stem/progenitor cells and their pathological consequences / M. Mimeault., S.K. Batra // Panminerva Med. – 2009. – Vol. 51(2). – P. 57–79. 56. Erusalimsky J.D. Endothelial cell senescence // J.D. Erusalimsky, D.J. Kurz // Handb. Exp. Pharmacol. – 2006. – Vol. 176(Pt 2). – P. 213–248. 57. Stimulation of endothelial progenitor cells: a new putative effect of several cardiovascular drugs / M.F. Jime'nez–Navarro, N. António, R. Fernandes [et al.] // Eur. J. Clin. Pharmacol. – 2010. – Vol. 66(3). – P. 219–230. 58. Ballard V.L Stem cells and the regeneration of the aging cardiovascular system // V.L. Ballard, J.M. Edelberg // Circ. Res. – 2007. – Vol. 100(8). – P. 1116–1127. 59. Williamson K. Endothelial progenitor cells enter the aging arena // K. Williamson, S.E. Stringer, M.Y. Alexander // Front. Physiol. – 2012. – Vol. 3. – P. 30. 60. Hematopoietic stem cells and endothelialprogenitor cells in healthy men: effect of aging and training // D.H. Thijssen, J.B. Voc, C. Verseyden [et al.] // Aging Cell. – 2006. – Vol. 5(6). – P. 495–503. 61. Aging is associated with a proapoptic endothelialprogenitor cell phenotype / E.J. Kuschner, O.J. MacEneaney, B.R. Weil [et al.] // J. Vasc. Res. – 2011. – Vol. 48(5). – P. 408–414.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

193

Методика вирощування гіпофіза зі стовбурових клітин розроблена дослідниками Центру біології розвитку RIKEN в Кобе (Японія). Опубліковано 14.11.2011. http://gazeta.ua/articles/life/_ yaponcyam-vpershe-vdalosya-virostiti-gipofiz/409645

3.2. Ендокринна система Гіпофіз. Протягом багатьох десятиліть були використані різні підходи для дослідження СК гіпофіза. Узяті разом аргументи в ході давнього вивчення гіпофіза підтвердили існування СК, а також їх можливих кандидатів. Тим не менш, жодна з цих клітин не має до цього часу однозначного доказу, щоб задовольнити всі характеристики СК [1]. Нещодавно п'ять лабораторій повідомили про присутність дорослих клітин-попередниць у гіпофізі і показали потенціал ендокринної диференціації, використовуючи різні методи і тести in vitro, маркери для їхньої очистки і характеристики. Завдяки цим дослідженням, відомості про СК і клітини–попередниці гіпофіза можна інтерпретувати у фізіології залоз, розкрити їх участь у нормальних і патологічних ситуаціях [2]. За допомогою флуоресцентно активованого сортування в передній частці гіпофіза собаки були візуалізовані та ідентифіковані СК/клітини–попередниці (1,3 %), які мали маркери CD34+ і Thy1+ [3]. Нині вважають, що СК/клітинами–попередницями гіпофіза є фолікулярно–зірчасті клітини, з яких після пошкодження можуть диференціюватися ендокриноцити [4]. Історично склалося, що вивчення фолікулярно–зірчастих клітин із передньої частки гіпофіза почалося з вивчення їхніх морфологічних та електрофізіологічних характеристик, топографії, міжклітинних з'єднань цих клітин, що відіграють важливу роль у розумінні їх передбачуваних функцій [5]. Фолікулярно–зірчасті клітини в електронномікроскопічному дослідженні виглядають як ендокринні клітини без гранул. Світлова мікроскопія показала, що маркером для них є S100 білки. Цитологічні багатогранні особливості фолікулярно–зірчастих клітин підтверджують їхню можливість стати органоспецифічними СК [6 - 8]. Установлено, що ключову роль у розвитку і регенерації гіпофіза відіграє транскрипційний фактор Rах, який є маркером ембріональних СК та клітин–по-

194

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

передниць у дорослих [9]. Цікаво, що СК/клітини–попередниці гіпофіза дорослих експресують такі самі транскрипційні фактори, які мають значення в ембріогенезі [10]. G.L. Kim et al. [11] виявили в мультипотентних СК гіпофіза людини експресію нестина, S100, Sох9 і Sox2, що підтримує гіпотезу про здатність S100+ клітин диференціюватися в гормон– продукуючі клітини, як і в гіпофізі дорослих щурів [12, 13]. Нестин–імунореактивні клітини зі спільним вираженням гладкого актина (α-SMA) із периваскулярного простору передньої частки гіпофіза в умовах клонування генерують первинні та вторинні скупчення у вигляді сфер. У культурі підтримується стабільна тривалість клітинного циклу з подвоєнням клітин у 10 діб протягом восьми місяців [14]. Ідентифікація ніші СК гіпофіза є важливим кроком у розумінні розвитку цього органа. Cтовбурові ніші локалізуються в зоні між передньою і проміжною частками гіпофіза [15]. Клітини зі стовбурових ніш гіпофіза в гризунів і людини характеризуються експресією GFRa2, Ret ко-рецептора для Neurturin. Ці клітини також експресують β–катенін і E–кадгерин, зумовлюючи полярність плоских клітин ніші. В інших клітинах ніші однозначно визначається фактор транскрипції Prop1, специфічний для гіпофіза, а також фактори для клітин–попередниць/СК, такі як Sox2, Sox9 і Oct4. GFRa2+ клітини у культурі утворюють ендокринні сфероїди, які можуть бути диференційовані на гормон-продукуючі клітини або нейрони з нейроектодермальним потенціалом цих попередників [16] (рис. 12). Клітини, що експресують Sох2 (маркер кількох ранніх ембріональних попередників, СК і "pituispheres" у культурі, яка може рости), утворюють вторинні сфери, і диференціюються на всі типи ендокринних клітин гіпофіза, а також фолікулярно-зір часті клітини. Диференціація клітин у pituispheres пов'язана з експресією нестина, Sох9 і S100. Клітини з експресією Sох2 і E-кадгерина, які виявляються в кишені Ратке в ембріонах, лока лізуються в дорослій залозі, в основному, у вузькій зоні, що вистилає лійку гіпофіза, і розкидані по всьому гіпофізу. Однак, на відміну від ембріональних клітин кишені Ратке, більшість із цих Sох2+ клітин у дорослій залозі також експресують Sох9 і

у pituispheres пов'язана з експресією нестина, Sох9 і S100. Клітини з експресією Sох2 і E-кадгерина, які виявляються в кишені Ратке в ембріонах, локалізуються в дорослій залозі, в основному, у вузькій зоні, що вистилає лійку гіпофіза, і розкидані по всьому гіпофізу. Однак, на відміну від Розділ 3. С товбурові клітини органів і систем дорослого організму 195 ембріональних клітин кишені Ратке, більшість із цих Sох2+ клітин у дорослій залозі також експресують Sох9 і S100. Автори вважають, щоявляють Sох2+/Sох9+ S100. Автори вважають, що Sох2+/Sох9+ клітини пеклітини являють тип клітин, як водночас як Sох2+/Sох9– клітини рехіднийперехідний тип клітин, водночас Sох2+/Sох9– клітини ототожототожнюються знаходяться вв дорослому дорослому нюютьсяз змультипотентними мультипотентнимиСК, СК, які які знаходяться гіпофізі [17]. гіпофізі [17].

Стовбурові клітини

Sох2 Sох9 NonSca1 GFRa2 AMCA/ACE

Диференційовані клітини

Рис. 12. Самооновлення і розвиток стовбурових клітин аденогіпофіза.

Рис. 12. Самооновлення і розвиток стовбурових клітин аденогіпофіза.У гризунів (миші) протягом першого тижня життя відбувається дозрівання гормон–продукуючих клітин. Неонатальні СК/ більш активні плані життя проліферації, ексУклітини–попередниці гризунів (миші) протягом першого втижня відбувається стовбурових генів і функціональної діяльностіСК/клітини– СК, вклюдозріванняпресії гормон–продукуючих клітин. Неонатальні чаючи формування сфер, мультипотентних потужностей попередниці більш активні в плані проліферації, експресії стовбуровихдифегенів і функціональної формування ренціації діяльності та механізмівСК, Sox2+.включаючи Ці клітини особливо помітнісфер, на мультипотентних потужностей диференціації та механізмів Sox2+. Ці межі передньої і проміжної часток гіпофіза. Ко-локалізація Sox2 клітини особливо помітні на межі передньої і проміжної часток гіпофіза. Коі гормонів, як правило, не спостерігається [18]. локалізація Sox2 і гормонів, як правило, спостерігається [18]. У щурів кількісний аналізнеімунореактивних клітин показав, Ущо щурів кількісний аналіз імунореактивних клітин що Sох2+ Sох2+ СК/клітини-попередниці гіпофіза не показав, тільки переважСК/клітини-попередниці гіпофіза не тільки переважно локалізовані но локалізовані в крайовому шарі, але й розкидані в паренхімів крайовомупередньої шарі, алечастки. й розкидані в паренхімі передньої частки. У граничних У граничних ділянках шару, кількість Prop1/ ділянках Sох2+ шару, кількість Prop1/Sох2+ клітин значно зменшується до 15–го клітин значно зменшується до 15–го дня після народжендня післяня, народження, накількісний значний кількісний перехід протягом що вказуєщо на вказує значний перехід протягом першої першої післяпологової хвилі зростання передньої частки гіпофіза [19]. Члени післяпологової хвилі зростання передньої частки гіпофіза [19]. Члени Sox сімейства транскрипційних факторів, імовірно, беруть участь у самих ранніх етапах розвитку СК гіпофіза, їхній проліферації і ранньому переході до диференціації. Prop1–транскрипційний фактор і сигнальний шлях Notch можуть регулювати перехід до диференціації [20, 21]. У СК/клітинах–попередницях гіпофіза був визначений антиген–1, пов'язаний із факторами і компонентами Notch, Wnt

196

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

і Sonic Hedgehog (Shh) сигнальних шляхів [22]. При дослідженні антигену–1 у СК несподівано виявилося, що, не підмножина клітин із високим рівнем антигена–1, а, навпаки, із низьким рівнем, складає основну частину кластерів клітин–попередниць гіпофіза [23]. Описані механізми виходу з циклу клітин–попередниць на його початку, які критично залежать від клітинного інгібітору циклу p57Kip2. Це запобігає повторному входу в цикл диференційованих клітин, що викликає нові питання в розумінні окремих сигналів, які можуть управляти процесом диференціації і клітинного циклу [24, 25]. Недавні дослідження показали, що недиференційовані СК мають імуномодуляторні властивості. Імунногістохімічними методами виявлено, що в клітинах навколо кишені Ратке локалізується інтерлейкін IL–18. Із передньої частки гіпофіза бика отримані клоновані клітини, які експресували транскрипційні фактори СК/клітин-попередниць – Nanog, Oct4, Ptch1, нестин, Notch1, Hes1, Lrp і Fzd4. Ці клітини швидко ростуть у культурі під впливом епідермального фактора росту і фактора росту фібро бластів [26]. Крім того, ці ж клітини виявляють цитокіни, такі як IL–1α, IL–6, IL–7, IL–12 і IL–15. На 6–у добу в культурі клітин визначили мРНК гормона росту. Ці результати переконливо показують, що СК/клітини-попередниці модулюють імунно–ендокринні функції клітин передньої частки гіпофіза через продукцію цитокінів [27]. Однак, тільки в останні роки виявлені фенотипові особливості СК у гіпофізі дорослих і визначені множинні кандидати СК/клітин–попередниць [28, 29]. СК проліферують після народ ження і починають диференціюватися з утворенням клітин, які заселяють орган, замість тих диференційованих клітин, які розвинулися з ембріональних попередників. Цим створюється мо заїка органа з двох фенотиповоподібних підмножин ендокринних клітин, які мають різне походження і різні історії життя. Ці паралельні, але окремі лінії диференційованих клітин у залозі, можуть допомогти дозріванню організму і його адаптації. СК відіграють важливу роль у виникненні злоякісних новоутворень у деяких тканинах, а їхня роль у гіперплазії гіпофіза,

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

197

гіпофізаденоми, пухлин є важливою проблемою для майбутніх досліджень. Із терапевтичної точки зору, можливість культивувати і вирощувати СК гіпофіза в стані предиференціації також може бути корисним для довгострокового лікування недостатності гіпофіза. Уточнення властивостей і регуляції диференціації СК гіпофіза дозволить провести подальшу розробку технологій їхнього культивування з метою імплантації [30]. Останнім часом виявлено, що соматотропнi і пролактиновi ендокриноцити також мають регенеративну здатність. Відновлення пролактинових ендокриноцитів обумовлено комбінацією механізмів, включаючи набір зі СК, їх розмноження і трансдиференцації з соматотропних ендокриноцитів [31]. Cоматотропні ендокриноцити зберігають свої клітини–попередниці завдяки інсуліноподібному фактору росту–І безпосередньо і через його сигнальні шляхи, які можуть бути залучені в підтримання прабатьків [32]. У нейрогіпофізі клітини мають специфічну будову, належать до гліоцитів і отримали назву пітуїцити. У щурів клітини-попередниці пітуїцитів за маркерами ототожнюються з клітинами–попередницями олігодендроцитов. У культурі неонатальних клітин–попередниць нейрогіпофіза також виділяють основні функціональні характеристики з олігодендритичними клітинами–попередницями, які одночасно мають міграційні та біпотенційні властивості і можуть диференціюватися в пітуїцити [33]. Висловлено припущення, що дорослий нейрогіпофіз може містити незрілі клітини. Для їхнього вивчення використовували аналіз формування нейросфер, щоб перевірити наявність чи відсутність CK або клітин-попередниць. Дорослі клітини нейрогіпофіза можуть генерувати біпотентні первинні нейросфери, припускаючи, що структура містить гліальні попередниці, але, імовірно, не СК [34]. Cеред останніх досягнень є змодельовані в лабораторних умовах тривимірні структури зі СК – очний келих і гіпофіз, завдяки виявленню внутрішніх програм, які керують у локально автономних режимах процесами органогенезу і гомеостазу [35].

198

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б. Вирощена генерація фолікулярних клітин щитовидної залози зі стовбурових клітин групою дослідників з Вільного університету Брюсселя. Стовбурові клітини були модифіковані в результаті генно-інженерних маніпуляцій зі внесенням до них генів, що кодують два білки, NKX2-1 і PAX-8. www.medportal.ruhttp://www. hemafund.com/uk/News/hemafund_news/Follikuli-shchitovidnojzhelezi-virastili-iz-stvolovih-kletok.html

Щитоподібна залоза. У щитоподібній залозі дорослої людини виявлені СК і клітини–попередниці ендодермального походження [36, 37] (додаток 6). Лише недавно стали відомими сигнали, які призводять до біохімічних та морфогенетичних подій при відновленні структур щитоподібної залози в дорослих [38]. У щитоподібній залозі мишей СК для тироцитів Т (фолікулярні клітини – продуценти три– і тетрайодтироніну) представлені двома популяціями клітин: CD45–/C–комплект–/SCA1+ і CD45–/C–комплект–/SCA1– клітин. Ці клітини експресують ABCG2 і маркери генів СК, що кодують nucleostemin і Oct4, у той час як клітин з експресією генів, що кодують маркери диференціації щитоподібної залози, мало [39, 40]. Для ідентифікації СК щитоподібної залози A. Fierabracci et al. [41] розробили метод на основі ферментативного розщеплення свіжої тканини щитоподібної залози, отриманої після хірургічного втручання. Клітини культивували в присутності епідермального фактора росту і фактора росту фібробластів. Були отримані сфероїди з усіх зразків щитоподібної залози. З ізольованої популяції клітин, що містили підмножини клітин CD34+ і CD45–, створили умови для формування фолікулів щитоподібної залози з гормональними властивостями. У клітинах тироїдних сфер від нормальної, але не від ракової тканини, можна індукувати їхню подальшу диференціацію [42]. Крім того, було виявлено, що in vitro стимулювати генерацію клітин щитоподібної залози здатні активін, інсулін та інсуліноподібний фактор росту. СК тироцитів Т щитоподібної залози людини мають типову морфологію і характеризуються можливістю самооновлення і диференціації. У клонованих у культурі сферах клітин щитоподібної залози, спектр експресії нагадує СК. У відповідь на тиротропний гормон (ТТГ) у сироватці ці клітини сфер диференціювалися в тироцити

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

199

Т з експресією транскрипційного фактору Pах8, тироглобуліну, symporter йодиду натрію, тироїд–стимулювального рецептору гормону і тиропероксидази мРНК. Спостерігали ТТГ–залежне 125 йодиду поглинання [43]. Дослідження нормальних і ракових СК щитоподібної залози матиме важливе значення для майбутньої цільової терапії цього органа [44, 45]. Нині широко обговорюється стовбурове походження раку щитоподібної залози, вивчення клінічних проя вів раку СК у щитоподібній залозі (найбільш поширеного раку з ендокринних залоз), досліджуються молекулярні і клітинні аспекти біології СК щитоподібної залози, що в кінцевому рахунку призведе до розуміння механізмів, що лежать в основі захворювання цього органа людини [46, 47, 48]. Біоінженерія м'яких тканин і органів, зокрема ендокринних залоз залишається істотною проблемою регенеративної медицини. Низка порожнистих внутрішніх органів серцево–судинної, дихальної, сечостатевої та травної систем були успішно створені біоінженерно ex situ, із використанням біосумісної сітки (каркас) із 3D морфологією, що повторює будову рідного органу (oрганоморфічна сітка). Для побудови внутрішніх органів ендокринної системи необхідне створення органоморфічної сітки, але відсутні матеріали, які здатні підтримувати зростання в діапазоні товщини регенеруючої маси клітин, і факторів для забезпечення формування повноцінної макроскопічної будови залози ex situ. Існуючі технічні варіанти для реконструкції органів ендокринної системи включають або біосумісний 3D ретикулярний каркас із відсутністю будь–якої органоморфічної геометрії, або алогенну/ксеногенну безклітинну 3D матрицю, отриману з заліза так само, як і для біоінженерії. У 2007 році R. Toni et al. [49], використавши біосумісні матеріали, створили органоморфічний каркас із допомогою біореактора (пристрій для біоінженерії ex situ) для щитоподібної залози людини, обраної в якості моделі через відносно просту анатомічну організацію (повторювані порожнини фолікулів). Цей пристрій відтворює 3D рідну (нативну) геометрію стромального/судинного компоненту і природний тироцити/судинний інтерфейс щитоподібної залози людини. Модель зараз інтенсивно досліджується в якості експерименталь-

200

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

ного інструменту для тестування стільникового 3D автoзбирання тканини щитоподібної залози і пов'язаних із її судинною системою ділянках 3D макроскопічних структур. Автори вважають, що ці дослідження стануть основою для нової концепції в регенеративній медицині м'яких тканин і ендокринних органів, що в кінцевому підсумку призведе до фізіологічно компетентної та імунотолерантної біоконструкції, макроскопічно придатної для трансплантації та клінічного застосування. Щодо тироцитів С (С–клітин, прифолікулярних клітин) відомо, що ці клітини походять із нервового гребеня [50]. Щоб перевірити цю ідею, Y. Kameda et al. [51] у трансгенних мишей використали маркери Connexin43–LacZ і Wnt1–Cre/R26R, як маркери клітин нервового гребеня. Були розглянуті також імуногістохімічні маркери, які визначають міграційні або пост міграційні клітини нервового гребеня, а саме, TuJ1, нейрофіламент160, нестин, P75NTR, і Sox10. Крім того, досліджена експресія Е–кадгерина (маркера епітеліальних клітин). На підставі отриманих результатів, автори зробили суперечливий висновок, що тироцити C щитоподібної залози в мишей походять з ендодермальних епітеліальних клітин четвертої глоткової кишені і не походять із нервового гребеня. Для вивчення регенераційних можливостей щитоподібної залози Т. Ozaki et al. [52] виконали часткову тироїдектомію залози і вивчали непошкоджені ділянки та їхні проліферативні центри, де були локалізовані бромдезоксиуридин+ та/або C клітини в мікрофолікулах. Через два тижні після операції, кількість бромдезоксиуридин+ клітин і клітин із прозорою або слабоеозинофільною цитоплазмою помітно збільшилося в центральній ділянці. Електронномікроскопічно деякі з клітин зберегли характеристики клітин – виробників кальцитоніну (клітин С), маючи нейроендокринні гранули, тоді як інші – ознаки тироцитів Т фолікулів із мікроворсинками на апікальному полюсі. Деякі клітини були бромдезоксиуридин+ і експресували Foxa2 (остаточний маркер клітин ендодермального походження). Сироваткові рівні тиротропного гормону різко змінилися в зв'язку з тироїдектомією з гострим зменшенням генерації клітин T4. Отримані результати свідчать, що і клітини С, і Т (фолікулярні клітини) можуть

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

201

трансдиференціюватися і стати незрілими клітинами на шляху до диференціації в клітини Т чи С і брати участь у відновленні та/або регенерації щитоподібної залози. Прищитоподібна залоза. Клітини нормальних прищитопо дібних залоз, використали для визначення їхнього фенотипу. Після ферментативного розщеплення та вирощення первинної культури в ній з'явилися фібробластоподібні клітини, які були морфологічно однорідними. Їх вивчали в наступних серійних розведеннях та при клональній експансії. Каріотипування було нормальним, час подвоєння клонових клітин оцінювався в 70,7 ± 14,5 год. Поверхня клітин була позитивною для CD73, CD166, CD29, CD49a, CD49b, CD49d, CD44, CD105 і MHC класу I, і негативною для CD34, CD133, CD117, Cd114, CD31, CD62P, EGF-R, ICAM–3, CD26, CXCR4, CD106, CD90 та МНС класу II. Вони були схожі на мезенхімні СК. В ізольованих клітинах визначалася активність теломерази разом з експресією генів плюрипотентності Sall4. Також спостерігалася експресія кальцій–чутливих рецепторів гена поряд з α–актином гладких м'язів і поглинання позаклітинних іонів кальцію. Крім того, прищитоподібні СК володіють остеогенним, хондрогенним і адипогенним потенціалом диференціації [53]. Для відновлення функції ендокринних паратироцитів у перспективі можуть бути використані клітини–попередниці людини, вирощені в культурі, з їхньою подальшою диференціацією у функціонуючі паратироцити. Це край важливо при гіпопаратироїдизмі, який є найбільш частим ускладненням хірургії щитоподібної залози. На сьогодні стабільною моделлю для вивчення диференціації в тип паращитоподібних клітин є ембріональні СК людини. Раніше повідомлялося, що BG01 лінії СК стимулювали для формування ендокринних паратироцитів. Нині ця клітинна лінія більше не доступна і необхідні додаткові дослідження, щоб підтвердити і продовжити такі спостереження [54]. Автори підвищили концентрацію ембріональної телячої сироватки та своєчасного впливу активіну для виокремлення клітин лінії H1 прищитоподібного типу. Була оцінена потенційна вигода від впливу транскрипційного фактору Shh на розвиток ендокринних паратироцитів при змінах умов культивування. В якості маркерів диференційованих клітин були використані кальцій–чутливі рецепто-

202

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

ри та секреція паратироїдного гормону. У результаті проведеного дослідження отримані обнадійливі результати щодо реплікації прищитоподібних клітин і їхньої диференціації з ембріональних СК H1-лінії в пробірці для автотрансплантації в окремих пацієнтів. Альтернативою вітаміну D3 і кальцію в лікуванні гіпопаратиреозу можна розглядати також алотрансплантацію культури клітин прищитоподібних залоз. Є відомості про те, що у 85 пацієнтів, які перенесли алотрансплантацію культури прищитоподібних СК із приводу хірургічного гіпопаратиреозу, алотрансплантат діяв довгостроково. Для всіх пацієнтів тривалість виживання СК трансплантата була від 6,35 до 13,08 місяців. У 64 пацієнтів (55,1%) алотрансплантати зберегли свою ендокринну функцію більш ніж 2 місяці [55]. Для клітин–попередниць прищитоподібних залоз досліджували тимус в якості джерела автологічних клітин ендодерми. Клітини тимусу людини, згідно розробленого і вдосконаленого протоколу (Bingham Protocol) із використанням активіну і розчинних Shh, протягом більше 13 тижнів диференціювали і виростили клітини, які секретували паратироїдний гормон. Ці хімічно диференційовані клітини не утворювали пухлин із порушенням імунної системи в мишей. Такий підхід є ще одним кроком на шляху до стратегії відновлення функції прищитоподібних залоз за рахунок використанням автологічних клітин зі спрямуванням їхньої обробки негенетичними способами впливу [56]. Цікаво, що при гіперпаратироїдизмі через доброякісні чи злоякісні пухлини в тканині прищитоподібних залоз виявляються СК, які беруть участь у патогенезі клональної експансії клітин цієї залози [57]. Надниркова залоза. Раніше вважали, що регенерація клітин кори надниркових залоз відбувається з малодиференційованих клітин, що локалізуються між клубочковою і пучковою та клубочковою і сітчастою зонами [58]. Водночас при вивченні проліферативної активності кори наднирників у щурів із використанням імуногістохімічного методу для виявлення присутності ядерного антигену проліферуючих клітин внутрішньоядерного ферменту PCNA, синтез якого досягає максимальної інтенсивності в S–фазі клітинного циклу, встановили, що PCNA+ кліти-

Розділ 3. С товбурові

203

клітини органів і систем дорослого організму

ни були ідентифіковані в клубочковій і проміжній зоні (між клубочковою і капсулою) і в капсулі. Не виключено, що ці клітини можуть бути СК, які диференціюються в кортикостероцити [59]. Нині все більше вчених схиляються до думки, що СК надниркової залози локалізуються на периферії кори протягом усього життя і складають 0,01-0,64 % від усіх клітин субкапсулярної зони і активуються під впливом екзо– чи ендогенних факторів [60, 61]. Ці клітини розмножуються і деякі з них мігрують уздовж кровоносних капілярів до глибокої частини пучкової і сітчастої зон [62]. A.C. Kim, G.D. Hammer [63] визначили недиференційовані клітини кори надниркових залоз, як клітини, позбавлені експресії стероїдогенних генів, і диференційовані клітини, як клітини зi стероїдогенними потужностями. У стовбурових нішах клітини капсули надниркової залоі субкапсулярної зони докази є найважливішими її компонентами останнійзичас представлені численні потенційного внеску СК/клітин– попередниць кори7, наднирників карциноми цієї залози [69]. (додаток рис. 13). уУпатогенез СК генетичний аналіз виявив різні сиг-

Капсула

Gli1+

Pod1+

Sf1+ Cyp11β2 Кора наднирника

Cyp11β1

Sf1-

Shh+

Cyp11β2

Wnt+ β-катенін Cyp11β1

Рис. 13. Гіпотетичні уявлення про стовбурову нішу в капсулі і субкапсулярній

Рис. 13. Гіпотетичні уявлення про стовбурову нішу в капсулі і зоні наднирника. субкапсулярній зоні наднирника. Позначення: Gli1 - транскрипційний фактор - активує Shh шлях, Sf1 - молекуПозначення: Gli1 росту - транскрипційний фактор - активує Shh Sf1 лярна детермінанта кори наднирника і стероїдогенезу, Pod1шлях, - транскрипмолекулярна наднирника і стероїдогенезу, Pod1 ційний детермінанта фактор, Cyp11βросту 2 - ген,кори що кодує альдостеронсинтетазу, Cyp11 β1 - ген, транскрипційний Cyp11β2 - ген, що кодує альдостеронсинтетазу, що кодує 11βфактор, гідрогеназу, Cyp11β1 - ген, що кодує 11β гідрогеназу, Для ідентифікації СК/клітин–попередниць кортикостероцити спробували розділити за допомогою Нільського червоного на червонояскраві

204

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

нальні шляхи, у тому числі Shh і Wnt в якості найважливіших медіаторів кори надниркових ліній і органного гомеостазу [64]. Експресія Shh фактора обмежена периферійними кірковими клітинами, які виражають недостатність генів стероїдогенезу, але призводять до базових диференційованих клітин кори надниркової залози [65]. Wnt/β–катенін сигналізація підтримує недиференційований стан і долю СК/клітин–попередниць кори надниркових залоз, зокрема, шляхом індукції його генів–мішеней Dax1 і інгібiну–α, відповідно [66, 67]. Недавні дослідження показали, що експресія декількох компонентів Wnt/β–катенін сигналізації в корі надниркових залоз визначають ключову роль цього шляху в регуляції проліферації/диференціації клітин-попередниць і пухлин залози [68]. В останній час представлені численні докази потенційного внеску СК/клітин–попередниць кори наднирників у патогенез карциноми цієї залози [69]. Для ідентифікації СК/клітин–попередниць кортикостероцити спробували розділити за допомогою Нільського червоного на червонояскраві і червонотьмяні, пересадити їх під капсулу і прослідкувати їх здатність до регенерації [70]. Установлено, що серед червонотьмяних клітин містяться клітини–попередниці кортикостероцитів, які здатні розмножуватися, утворювати диференційовані дочірні клітини і можуть бути корисні для відновлення кори надниркової залози. Для виокремлення клітин–попередниць із кори надниркової залози були застосовані біофізичні методи з використанням гідродинамічних сил інерції, що, на думку авторів, дозволить заощадити кошти на молекулярні біомаркери. Флуоресцентне фарбування, поряд із вимірами експресії генів, підтвердили, що отримані й оброблені таким чином клітини залишаються життєздатними і можуть бути культивовані протягом 10 діб in vitro. Пропонована техніка ізоляції клітин– мішеней може забезпечити практичні засоби для збору значної кількості життєздатних клітин не тільки клітин надниркової залози, але й СК інших органів і тканин для задовільнення потреб клітинної біології в регенеративній медицині [71]. Клітини мозкової речовини надниркової залози походять із нервового гребеня і є клітинами симпатоадреналової лінії. Наведені докази існування субпопуляції компетентних клітин–попе-

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

205

редниць у дорослому організмі. Ідентифікація симпатоадреналових клітин–попередниць у наднирковій залозі значно поглибила би розуміння їхньої фізіології та потенційної ролі в патогенезі хвороб наднирника. Виділення і диференціація клітин–поперед ниць у культурі буде служити інструментом розуміння їхнього розвитку. Крім того, завдяки тісному зв'язку з симпатичними нейронами, ці клітини можуть розширити джерело клітин для клітинної терапії нейродегенеративних захворювань. Тому дослідники прагнуть до створення протоколів для ефективної ізоляції, збагачення і диференціації хромафінних клітин–поперед ниць у дофамінергічні нейрони в культурі [72, 73]. • Матеріали опубліковані в статті Чайковський Ю.Б. Стовбу рові клітини ендокринних залоз / Ю.Б. Чайковський, О.І. Дєльцова, С.Б. Геращенко // Світ медицини та біології. - 2013. - №3.С. 144-150. Література 1. Vankelecom H. Stem cells in the postnatal pituitary? / H. Vankelecom // Neuroendocrinology. – 2007. – Vol. 85(2). – P. 110– 130. 2. Rizzoti K. Adult pituitary progenitors/stem cells: from in vitro characterization to in vivo function / K. Rizzoti // Eur. J. Neurosci. – 2010. – Vol. 32(12). – P. 2053–2062. 3. Identification and characterisation of side population cells in the canine pituitary gland / S.J. van Rijn, L. Gremeaux, F.M. Riemers [et al.] // Vet. J. – 2012. – Vol. 192(3). – P. 476–482. 4. Folliculo–stellate cells of the human pituitary as adult stem cells: examples of their neoplastic potential / E. Horvath, C.I. Coire, K. Kovacs [et al.] // Ultrastruct. Pathol. – 2010. – Vol. 34(3). – P. 133–139. 5. Allaerts W. History and perspectives of pituitary folliculo– stellate cell research / W. Allaerts, H. Vankelecom // Eur. J. Endocrinol. – 2005. – Vol. 153(1). – P. 1–12. 6. Horvath E. Folliculo–stellate cells of the human pituitary: a type of adult stem cell? / E. Horvath, K.Kovacs // Ultrastruct. Pathol. – 2002. – Vol. 26(4). – P. 219–228.

206

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

7. Are folliculo–stellate cells in the anterior pituitary gland supportive cellsor organ–specific stem cells? / K. Inoue, C.Mogi, S. Ogawa [et al.] // Arch. Physiol. Biochem. – 2002. – Vol. 110(1–2).– P. 50–53. 8. Devnath S. An insight to pituitary folliculo–stellate cells / S. Devnath, K. Inoue // J. Neuroendocrinol. – 2008. – Vol. 20(6).– P. 687–691. 9. Muranishi Y. An essential role for Rax in retina and neuroendocrine system development / Y. Muranishi, K. Terada, T. Furukawa // Dev. Growth Differ. – 2012. – Vol. 54(3). – P. 341– 348. 10. Vankelecom H. Pituitary stem/progenitor cells: embryonic players in the adult gland? / H. Vankelecom // Eur. J. Neurosci. – 2010. – Vol. 32(12). - P. 2063–2081. 11. Generation of immortal cell lines from the adult pituitary: role of cAMP on differentiation of SOX2–expressing progenitor cells to mature gonadotropes / G.L. Kim, X. Wang, J.A. Chalmers [et al.] // PLoS One. – 2011. – Vol. 6(11). – P. e27799. 12. Immunohistochemical localization of anterior pituitary hormones in S–100 protein-positive cells in the rat pituitary gland / M. Kikuchi, M. Yatabe, Y. Tando [et al.] // Cell Tissue Res. – 2011. – Vol. 345(3). – P. 425–429. 13. Fu Q. Regenerative Capacity of the Adult Pituitary: Multiple Mechanisms of Lactotrope Restoration After Transgenic Ablation / Q.Fu, H.Vankelecom H. // Stem Cells Dev. – 2012. – Vol. 21(18). – P. 3245–3257. 14. Evidence for a progenitor cell population in the human .. pituitary / S. Weiss, F.A. Siebzehnrubl, J. Kreutzer [et al.] // Clin. Neuropathol. – 2009. – Vol. 28(4). – P. 309–318. 15. Pituitary stem cell update and potential implications for treating hypopituitarism / F. Castinetti, S.W. Davis, T. Brue [et al.] // Endocr. Rev. – 2011. – Vol. 32(4). – P. 453–471. 16. A GRFa2/Prop1/stem (GPS) cell niche in the pituitary / M. Garcia–Lavandeira, V. Quereda, I. Flores [et al.] // PLoS One. – 2009. – Vol. 4(3). – P. e4815. 17. SOX2–expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland / K. Rizzoti, M.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

207

Dattani, R. Lovell–Badge [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. – 2008. – Vol. 105(8). – P. 2907–2912. 18. Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early–postnatal maturation phase of the gland / L. Gremeaux, Q. Fu, J. Chen [et al.] // Stem Cells Dev. – 2012. – Vol. 21(5). – P. 801–813. 19. Significant quantitative and qualitative transition in pituitary stem progenitor cells occurs during the postnatal development of the rat anterior pituitary / S. Yoshida, T. Kato, H. Yako [et al.] // J. Neuroendocrinol. – 2011. – Vol. 23(10). – P. 933–943. 20. The notch signaling system is present in the postnatal pituitary: marked expression and regulatory activity in the newly discovered side population / J. Chen, A. Crabbe, V. Van Duppen [et al.] // Mol. Endocrinol. – 2006. – Vol. 20(12). – P. 3293–3307. 21. Sustained Notch signaling in progenitors is required for sequential emergence of distinct cell lineages during organogenesis // X. Zhu, J. Zhang, J. Tollkuhn [et al.] // Genes Dev. – 2006. – Vol. 20(19). – P. 2739–2753. 22. The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early embryonic characteristics / J. Chen, N. Hersmus, V. Van Duppen [et al.] // Endocrinology. – 2005. – Vol. 146(9). – P. 3985–3998. 23. Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection / J. Chen, L. Gremeaux, Q. Fu [et al.] // Stem Cells. – 2009. – Vol. 27(5). – P. 1182–1195. 24. Bilodeau S. Distinct developmental roles of cell cycle inhibitors p57Kip2 and p27Kip1 distinguish pituitary progenitor cell cycle exit from cell cycle reentry of differentiated cells / S. Bilodeau, A. Roussel-Gervais, J. Drouin // Mol. Cell Biol. – 2009.– Vol. 29(7). – P. 1895–1908. 25. Drouin J. Stem cells, differentiation and cell cycle control in pituitary / J. Drouin, S. Bilodeau, A. Roussel–Gervais // Front. Horm. Res. – 2010. – Vol. 38. – P. 15–24. 26. Norlin S. Fibroblast growth factor signaling is required for the proliferation and patterning of progenitor cells in the developing .. anterior pituitary / S. Norlin, U. Nordstrom, T. Edlund // Mech. Dev. – 2000. – Vol. 96(2). – P. 175–182.

208

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

27. Bovine anterior pituitary progenitor cell line expresses interleukin (IL) –18 and IL–18 receptor / Y. Nagai, H. Ogasawara, Y. Taketa [et al.] // J. Neuroendocrinol. – 2008. – Vol. 20(11). – P. 1233–1241. 28. Genetic approaches identify adult pituitary stem cells / A.S. Gleiberman, T.Michurina, J.M. Encinas [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2008. – Vol. 105(17). – P. 6332–6337. 29. Florio T. Adult pituitary stem cells: from pituitary plasticity to adenoma development / T. Florio // Neuroendocrinology. – 2011. – Vol. 94(4). – P. 265–277. 30. Pituitary stem cells: review of the literature and current understanding // J.P. de Almeida, J.H. Sherman, R. Salvatori [et al.] // Neurosurgery. – 2010. – Vol. 67(3). – P. 770–780. 31. The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration // Q.Fu, L. Gremeaux, R.M. Luque [et al.] // Endocrinology. – 2012. – Vol. 153(7). – P. 3224–3235. 32. Somatotropes maintain their immature cells through Insulin–like growth factor I (IGF-I) / K. Yokoyama, C. Mogi, K. Miura [et al.] // Endocr. Pathol. – 2007. – Vol. 18(3). – P. 174–181. 33. Oligodendrocyte precursor cells generate pituicytes in vivo during neurohypophysis development / I. Virard, D. Coquillat, M. Bancila [et al.] // Glia. – 2006. – Vol. 53(3). – P. 294–303. 34. Characterization of heterogeneous glial cell populations involved in dehydration–induced proliferation in the adult rat neurohypophysis / I. Virard, O. Gubkina, F. Alfonsi [et al.] // Neuroscience. – 2008. – Vol. 151(1). – P. 82–91. 35. Sasai Y. In vitro organogenesis in three dimensions: self-organising stem cells / Y. Sasai, M. Eiraku, H. Suga // Development.– 2012. – Vol. 139(22). – P. 4111–4121. 36. Expression of endoderm stem cell markers: evidence for the presence of adult stem cells in human thyroid glands / T. Thomas, K. Nowka, L. Lan [et al.] // Thyroid. – 2006. – Vol. 16(6). – P. 537–544. 37. Gholamrezanezhad A. Is there any benefit in generating thyrocytes from stem cells? / A. Gholamrezanezhad, S. Mirpour, S. Kolahdoozan // Polish J. Endocrinol. – 2009. – Vol. 60 (5). – P. 422–423.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

209

38. De Felice M. Minireview: Intrinsic and extrinsic factors in thyroid gland development: an update / M. De Felice, R. Di Lauro // Endocrinology. – 2011. – Vol. 152(8). – P. 2948–2956. 39. Side population cells in the mouse thyroid exhibit stem/ progenitor cell–like characteristics / N. Hoshi, T. Kusakabe, B.J. Taylor [et al.] // Endocrinology. – 2007. – Vol. 148(9). – P. 4251–4258. 40. Regenerative potentials of the murine thyroid in experimental autoimmune thyroiditis: role of CD24 / C.Y. Chen, H. Kimura, M.A. Landek-Salgado [et al.] // Endocrinology. – 2009. – Vol. 150(1). – P. 492–499. 41. Identification of an adult stem/progenitor cell–like population in the human thyroid / А. Fierabracci, М.А. Puglisi, L. Giuliani [et al.] // J. Endocrinol. – 2008. – Vol. 198(3). – P. 471–487. 42. Insulin receptor isoforms and insulin–like growth factor receptor in human follicular cell precursors from papillary thyroid cancer and normal thyroid / R. Malaguarnera, F. Frasca, A. Garozzo [et al. ] // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2011. – Vol. 96(3). – P. 766–774. 43. Isolation, proliferation and differentiation of thyroid stem cell from human thyroid nodule tissue / L. Lan, D. Cui, B.Y. Shi [et al.] // Zhonghua Yi. Xue. Za. Zhi. – 2012. – Vol. 92(12). – P. 806–810. 44. Lin R.Y. New insights into thyroid stem cells / R.Y. Lin // Thyroid. – 2007. – Vol. 17(10). – P. 1019–1023. 45. Klonisch T. Thyroid stem cells and cancer / T. Klonisch, C. Hoang–Vu, S. Hombach–Klonisch // Thyroid. – 2009. – Vol. 19(12). – P. 1303–1315. 46. Thomas D. Thyroid stem cells: lessons from normal development and thyroid cancer / D. Thomas, S. Friedman, R.Y. Lin // Endocr. Relat. Cancer. – 2008. – Vol. 15(1). – P. 51–58. 47. Thyroid stem cells–danger or resource? / B. Gibelli, A. El–Fattah, G. Giugliano [et al.] // Acta Otorhinolaryngol. Ital. – 2009.– Vol. 29(6). – P. 290–295. 48. Fierabracci A. Identifying thyroid stem/progenitor cells: advances and limitations / А. Fierabracci // J. Endocrinol. – 2012.– Vol. 213(1). – P. 1–13. 49. Ex situ bioengineering of bioartificial endocrine glands: a new frontier in regenerative medicine of soft tissue organs / R.

210

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Toni,A. Tampieri, N. Zini [et al.] // Ann. Anat. – 2011. – Vol. 193(5). – P. 381–394. 50. Neural crest progenitors and stem cells // E. Dupin, G. Calloni, C. Real [et al.] // C. R. Biol. – 2007. – Vol. 330(6–7). – P. 521–529. 51. Expression of the epithelial marker E–cadherin by thyroid C cells and their precursors during murine development // Y. Kameda, T. Nishimaki, O. Chisaka [et al.] // J. Histochem. Cytochem. 2007.– Vol. 55(10). – P. 1075–1088. 52. Thyroid regeneration: characterization of clear cells after partial thyroidectomy / T. Ozaki, T. Matsubara, D. Seo [et al.] // Endocrinology. – 2012. – Vol. 153(5). – P. 2514–2525. 53. Isolation and characterization of stem cells from the human parathyroid gland // Y.R. Shih, T.K. Kuo, A.H. Yang [et al.] // Cell Prolif. – 2009. – Vol. 42(4). – P. 461–470. 54. Differentiation of precursors into parathyroid–like cells for treatment of hypoparathyroidism / K.M. Woods Ignatoski, E.L. Bingham, L.K. Frome [et al.] // Surgery. – 2010. – Vol. 148(6). – P. 1186–1190. 55. Allotransplantation of cultured parathyroid progenitor cells without immunosuppression: clinical results / I. Nawrot, B. Wozniewicz, T. Tolloczko [et al.] // Transplantation. – 2007. – Vol. 83(6). – P. 734–740. 56. Directed trans–differentiation of thymus cells into parathyroid–like cells without genetic manipulation // K.M. Woods Ignatoski, E.L. Bingham, L.K. Frome [et al.] // Tissue Eng. Part C Methods. – 2011. – Vol. 17(11). – P. 1051–1059. 57. Expansion of a cell population expressing stem cell markers in parathyroid glands from patients with hyperparathyroidism / S.H. Fang, J.A. Guidroz, Y. O'Malley [et al.] // Ann. Surg. - 2010.– Vol. 251(1). – P. 107–113. 58. The undifferentiated cell zone is a stem cell zone in adult rat adrenalcortex / F. Mitani, K. Mukai, H. Miyamoto [et al.] // Biochim. Biophys. Acta. – 2003. – Vol. 1619(3). – P. 317–324. 59. Proliferation of capsular stem cells induced by ACTH in the rat adrenalcortex / D. Pignatelli, J. Ferreira, P. Vendeira [et al.] // Endocr. Res. – 2002. – Vol. 28(4). – P. 683–691.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

211

60. Aiba M. Alteration of subcapsular adrenocortical zonation in humans with aging: the progenitor zone predominates over the previously well–developed zona glomerulosa after 40 years of age / M. Aiba, M. Fujibayashi // J. Histochem. Cytochem. – 2011. – Vol. 59(5). – P. 557–564. 61. The side population phenomenon enriches for designated adrenocortical progenitor cells in mice / U.D. Lichtenauer, I. Shapiro, S. Sackmann [et al.] // J. Endocrinol. – 2012. – Vol. 215(3). – P. 383–391. 62. Kashirina N.K. The morphological and functional basis of the new conception about the suprarenal cortex regeneration / N.K. Kashirina // Medicina (Kaunas). – 2003. – Vol. 39(10). – P. 951–954. 63. Kim A.C. Adrenocortical cells with stem/progenitor cell properties: recent advances / A.C. Kim, G.D. Hammer // Mol. Cell Endocrinol. – 2007. – Vol. 265–266. – P.10–16. 64. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog / C.C. Huang, S. Miyagawa, D. Matsumaru [et al.] // Endocrinology. – 2010. – Vol. 151(3). – P. 1119–1128. 65. King P. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages / P. King, A. Paul, E. Laufer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2009. – Vol. 106(50). – P. 21185–21190. 66. Simon D.P. Adrenocortical stem and progenitor cells: implications for adrenocortical carcinoma / D.P. Simon, G.D. Hammer / Mol. Cell Endocrinol. – 2012. – Vol. 351(1). – P. 2–11. 67. Wood M.A. Adrenocortical stem and progenitor cells: unifying model of two proposed origins / M.A. Wood, G.D. Hammer // Mol. Cell Endocrinol. – 2011. – Vol. 336(1–2). – P. 206–212. 68. El Wakil A. The Wnt/beta–catenin pathway in adrenocortical development and cancer / A. El Wakil, T. Lalli // Mol. Cell Endocrinol. – 2011. – Vol. 332(1–2). – P. 32–37. 69. In search of adrenocortical stem and progenitor cells / A.C.Kim, F.M. Barlaskar, J.H. Heaton [et al.] // Endocr. Rev. – 2009. – Vol. 30(3). – P. 241–263. 70. Transplantation of adrenal cortical progenitor cells enriched by Nile red / J.C. Dunn, Y. Chu, H.H. Qin [et al.] // J. Surg. Res.– 2009. – Vol. 156(2). – P. 317–324.

212

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

71. Label–free enrichment of adrenal cortical progenitor cells using inertial microfluidics / S.C. Hur, T.Z. Brinckerhoff, C.M. Walthers [et al.] // PLoS One. – 2012. – Vol. 7(10). – P. e46550. 72. Adams M.S. Review: the role of neural crest cells in the endocrine system / M.S. Adams, M. Bronner–Fraser // Endocr. Pathol. – 2009. – Vol. 20(2). – P. 92–100. 73. Chromaffin progenitor cells from the adrenal medulla / M. Ehrhart–Bornstein, V. Vukicevic, K.F. Chung [et al.] // Cell Mol. Neurobiol. – 2010. – Vol. 30(8). – P. 1417–1423. Японські фахівці здивували своїм новим «винаходом». Їм вдалося виростити зуб зі стовбурових клітин. Опубліковано 31.07.2011. Саме незвичайне, що якщо імплантувати такий зуб у рот людині, він почне рости. Зростає чудо-зуб тридцять днів. http://ua.ma-rss. ru/?p=149 Можна самостійно вирощувати відсутні зуби прямо у себе в роті. Опубліковано 11.03.2013 р. Співробітники Стоматологічного інституту при Королівському коледжі Лондона розробили технологію, за допомогою якої пацієнти зможуть самостійно вирощувати відсутні зуби прямо в себе в роті. http://amn.net.ua/ukr/news/za_kordonom/17812

Розділ 3.3. Травна система Зуби. Відомо, що зуби мають обмежені можливості відновлення у відповідь на пошкодження. На початку ХХІ століття S. Gronthos et al. [1] виділили з пульпи зуба дорослої людини клоногенну, швидко проліферуючу популяцію клітин і порівняли їх зі стромальними клітинами червоного кісткового мозку, відомими як попередники остеобластів. Дослідники трансплантували ці клітини мишам із пригніченим імунітетом і впевнилися в тому, що вони диференціювалися в одонтобластоподібні клітини, що були оточені пульпоподібною тканиною. Автори назвали їх СК пульпи зуба. Через 6 тижнів клітини утворювали дентиноподібну структуру, оточену матриксом із колагеновими волокнами (колаген І типу) і кровоносними судинами. Одонтобластичні клітини посилали цитоплазматичні відростки в матрикс дентину. Тут же виявили остеобласти. Автори зробили висновок, що дентинні СК

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

213

мають більшу швидкість проліферації, ніж СК червоного кісткового мозку, але шляхи їхнього диференціювання схожі. Цікавою є думка дослідників про те, що хоча м’язова, нервова тканини і дентин не реконструюються впродовж життя людини, але вони містять СК, які здатні диференціюватися в певному напрямку при травмах. Зокрема, кількість дентину і пульпи, що утворилися при пересадках цих клітин на мишах, набагато разом переви щують ті, які формуються на місці протягом цілого життя. Отже один зуб володіє потенціалом, який можна використати для “ре монту” багатьох зубів. Водночас було повідомлено, що при культивуванні клітин пульпи in vitro спостерігали утворення шару клітин, подібних до одонтобластів, але новоутворена тканина більше нагадувала кісткову з формуванням кульок мінералізації [2]. СК зуба, як і в інших органах і тканинах тіла людини, розташовуються в стовбурових нішах - спеціальних ділянках в органі чи тканині, де містяться СК з їхнім мікрооточенням. У зубі виявили кілька ніш із клітинами-попередницями. У нішах розташовуються СК - мультипотентні клітини мезенхімного походження. Пульпа вважається багатим джерелом мезенхімних СК, які відповідають вимогам тканинної інженерії цієї ділянки [3, 4]. Вивчення цих клітин формує основу для розвитку нових клінічних методів лікування стоматологічних захворювань. Ці СК високопроліферативні і можуть диференціюватися в одонтобласти, попередники нейронів, остеобласти, хондроцити та адипоцити, ендотеліальні клітини судин [5 - 8]. G.T.Huang et al. [9] додали до цього переліку їх можливість диференціації в м’язову тканину. CК зубо-щелепної ділянки за напрямками диферен ціації типів клітин схожі з мезенхімними клітинами червоного кісткового мозку і мають багато спільних рис [10 - 12]. На сьогодні в зубній ділянці підтверджено 5 ніш СК і клітинпопередниць: 1. У пульпі постійних зубів, 2. У пульпі молочних зубів, 3. У періодонтальній зв’язці, 4. В апікальному сосочку, 5. У тканині, яка залишилася від зубного мішечка [13, 14]. Наявність цих клітин випливає з того, що зуби ссавців розвиваються зі стомодіальної ектодерми, яка формує амелобласти, і краніальної частини нервового гребеня – похідним ектомезенхіми, які утворюють одонтобласти і цементобласти [15, 16].

214

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

У природних умовах в живому організмі в пульпі зуба виявили СК і клітини-попередниці, які можуть дифереренціюватися в одонтобласти під впливом кісткових морфогенетичних білків [17]. Пульпа зуба являє собою ідеальний матеріал для реконструкції тканин, оскільки її мультипотентні СК безпечно консервуються, інтенсивно проліферують, мають довгий термін служби і можуть побудувати in vivo зрілу кісткову тканину з каналами Гаверса і відповідним кровопостачанням [18]. Установлено, що СК пульпи зберігають свої остеогенні властивості протягом 2 років кріоконсервації, їхня ультраструктура відповідає остеобластам і після трансплантації вони утворюють трьохвимірну пластинчасту кістку [19]. Для дослідження СК пульпи постійного зуба слугує, переважно, пульпа, забрана з третього моляра під час його видалення [20]. Отримані з неї клітини поміщають у спеціальні живільні середовища і вивчають результати процесів їхньої диференціації. Фенотип клітин, які ми відносимо до СК пульпи зуба, має багато гістофізіологічних і морфологічних особливостей, серед яких: модифікований клітинний цикл, великий вміст лужної фосфатази, потужний синтез сіалопротеїну дентину, колагену І типу та інших неколагенових білків, експресії гену сіалопротеїну дентину і білка матриксу дентину й утворення мінералізованих глобул in vitro. У природних умовах (in vivo) утворюється тканина, подібна до кістки [21]. Одними з перших автори показали, що для утворення регулярної форми дентино-пульпарного комплексу, що містить дентинні трубочки і предентин, потрібна імітація дентиногенного мікрооточення з зубних зародкових клітин, яке має істотне значення і без якого не відбувається формування дентину. Тобто при створенні належних умов одонтобласти можуть утворювати / відновлювати матрикс дентину, який нагадує трубчастий характер первинного дентину [22]. Сіалопротеїн дентину – це позаклітинний білок матриці дентину, унікальний маркер дентиногенезу, який відіграє визначну роль у диференціації одонтобластів і мінералізації дентину. Була висловлена гіпотеза, що дентинний сіалопротеїн, як натуральний терапевтичний агент, може сти-

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

215

мулювати відновлення тканин зуба шляхом ендогенної індукції клітин пульпи від мезенхімних СК/попередниць одонтобластів до синтезу позаклітинного матриксу дентину, формування третинного дентину і функціонального відновлення дентино-пульпарного комплексу [23, 24]. При цьому, мезенхімні одонтогенні СК потребують своїх спеціальних сигнальних шляхів [25]. В експерименті на мишах отримано перші результати трансплантації пульпи зуба [26]. СК пульпи людини ізолювали, поміщали на спеціальну сітку і вставляли в канал зуба миші. Автори показали, що канал заповнювався пульпоподібною тканиною з добре розвиненими кровоносними судинами. Суцільний шар дентиноподібної тканини відкладався на внутрішній стінці каналу кореня. Ця дентиноподібна структура з’явилася завдяки продукції шару одонтобластичних клітин, які експресували дентинний сіалофосфопротеїн, кістковий сіалопротеїн, лужну фосфатазу і CD105. Клітини регенерованої пульпи позитивно реагували на мітохондріальні антитіла людини, вказуючи на їх походження. Це дослідження вперше довело, що пульпоподібна тканина може бути регенерована de novo в порожньому кореневому каналі зі СК пульпи і дентинні СК можуть дати початок клітинам, подіб ним до одонтобластів із продукцією дентину на стінці кореневого каналу. У процесі пасерування культури від І до ІХ посівів клітинні характеристики СК пульпи змінюються в кілька разів [27]. При подальшому розвитку клітин на І етапі з них можуть диференціюватися одонтобласти, остеобласти і хондробласти, тоді як після ІХ посіву – тільки остеобласти. Дослідників зацікавило питання чи порушується потенціал СК пульпи при її запальних процесах [28]. Імуноцитохімічний аналіз показав, що в СК пульпи при запаленні підвищується вміст STRO-1, CD90, CD105 i CD 146, порівняно з нормальною пульпою. У цих клітинах виявляється багато ембріонального антигену-4, СВ76 і СВ166. У цілому остео-дентиногенний потенціал при запаленні зменшується, тим не менш, при запаленні утворюються дентино-пульпарні комплекси, подібні до нормальної пульпи і СК зберігають регенеративні можливості in vivo. При пульпіті виникає гіпоксія пульпи, яка посилює утворення коло-

216

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

ній і проліферацію клітин пульпи, пригнічує їхню диференціа цію [29]. Збереженість СК у пульпі при хронічному пульпіті підтвердили Z.Wang et al. [30], водночас наголосивши, що їхня можливість утворювати колонії зменшилася. Після проведеного лікування СК у пульпі зберігають свої мультипотентні властивості. Якщо з пульпи пролікованого зуба виділити фібробласти і вплинути на них фактором росту фібробластів, то останні збільшують свою проліферативну активність і здатні in vitro диференціюватися в остеобласти, хондроцити і адипоцити [31]. Клітини пульпи в дітей можна ізолювати з молочних різців і молярів. Було проведено дослідження СК пульпи молочних зубів, порівняння їх із мезенхімними клітинами червоного кісткового мозку і встановлено, що вищезгадані клітини в однаковій мірі могли диференціюватися в адипо-, остео-, хондро-, міо- та нейрогенні лінії [32]. Водночас, на відміну від кістковомозкових, ультраструктурно СК пульпи є більш розвиненими і метаболічно активними [33] і негативними за CD45 [34]. СК пульпи молочних зубів є високопроліферативними, клоногенними і мультипотентними мезенхімними клітинами [35]. В отриманих від 6- і 9-річних дітей взірцях пульпи виявили типові фібробласти, які експpеcували антигени MSC, STRO-1, CD 146, CD45, CD106 I CD166, але не маркери гематопоетичних та ендотеліальних клітин (CD34 і CD31). Порівняльне дослідження виявило сильний остео – та адипогенний потенціал цих клітин. При подальшому вивченні in vitro на них подіяли фактором росту нер вів і імунофлуоресцентне забарвлення показало, що ці клітини експресують nestin і b-III tubulin, а пізніше маркери проміжних за розвитком нейронів (PSA-NCAM, Neun, Tay, TH, GFAP), вміст яких збільшився після впливу фактору росту. Це свідчить за те, що клітини, які виділені з зубів після їхньої екстракції, можуть диференціюватися в нейрони з визначеним набором генів і білків, які характерні для дефінітивних нейроноподібних клітин in vitro. Тобто СК пульпи зуба як у дітей, так і в дорослих, можуть розглядатися як нові кандидати для автологічної трансплантації при широкому спектрі не тільки стоматологічних, але й неврологічних захворювань і нейротравм.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

217

Кожна дитина з видаленням молочного зуба втрачає можливість для відновлення та збереження тканин, оскільки пульпа молочного зуба є доступним джерелом СК [36, 37]. Тому стоматологи можуть стати одними з ключових постачальників СК. У цьому напрямку ведуться інтенсивні дослідження, проробляються питання створення банків СК як із точки зору відновлення зубів, так і здоров’я загалом. Прогностично ці пошуки будуть метою досліджень наступного десятиліття [38, 39]. A.H. Huang et al. [40] раніше встановили ідентичність будови СК дорослих (пульпа зуба жінки віком 41 рік, забрана після перелому зуба) і дітей (пульпа молочного зуба хлопчика віком 10 років). У відповідь на пошкодження пульпа зуба слугує джерелом постійної фізіологічної регенерації одонтобластів і відновлення дентину, яке відбувається повільно і частково, тоді як СК періодонтальної зв’язки являють собою більш динамічну систему для регенерації періодонтa при його захворюваннях [37]. Серед СК періодонтальної зв’язки виявили CD90, CD29, CD44, CD166, CD105, CD13-позитивні клітини [41], які характерні для стромальних попередників червоного кісткового мозку, водночас у них спостерігаються морфологічні фенотипові риси кісткових тканин [42]. Показано також, що СК мезенхімного походження мають можливості не тільки для відновлення пов’язаних iз коренем зуба тканин, але й самого кореня зуба, тобто існують можливості розвитку цементу/періодонтa [43]. Ці процеси відбуваються завдяки проліферації і диференціації не тільки СК періодонтальної ніші, але і апікальної ніші кореня зуба і ніші зубного мішечка. В останній зосереджені СК пухкої волокнистої сполучної тканини, які постійно присутні навколо зуба, який видалено [44]. У 2006 р. W. Sonoyama et al. [45] після повідомлення про нову популяцію СК – з апікального сосочка коренів зуба людини, на міні-свинях виконали трансплантацію СК, отриманих із цієї ділянки, для відновлення структури періодонтальної зв’язки і тканин зуба. K.Kadar et al. [46] ізолювали клітини з дентино-періодонтальної зв’язки після екстракції третіх молярів у людини, виявили їхню високу здатність до проліферації та ідентифікували в

218

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

них маркер мезенхімних СК - STRO-1. При подальшому культи вуванні цих клітин вони диференціювалися на остеогенну і нейро генну клітинні лінії, тобто клітини періодонтальної зв’язки мають не тільки стоматологічний, але й кістковий і нервовий потенціал. Таким чином, наукове співтовариство розуміє необхідність грунтовних фундаментальних досліджень СК [47]. Останнім часом усе більше зростає інтерес до застосування засад тканинної інженерії в ендодонтії [48], при лікуванні захворювань пародонта та відновної хірургії зубо-щелепної ділянки [49 - 51], які в перспективі можуть стати альтернативою традиційним підходам і використовуватися для спрямованого розвитку тканин зуба, реконструкції його частин і заміни втраченої і пошкодженої кісткової тканини навколо зуба. • Матеріали опубліковані в статті Геращенко С.Б. Стовбуро ві клітини тканин зуба / С.Б. Геращенко, Ю.Б. Чайковський, О.І. Дєльцова // Галицький лікарський вісник. - 2011. - Том 18, число 4. - С. 5-8. Література 1. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo / S. Gronthos, M. Mankani, J. Brahim [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2000. – Vol. 97(25). – P. 13625–13630. 2. Odontoblast differеntiation of human dental pulp cells in explant cultures / M.L. Couble, J.C. Farges, G. Bleicher [et al]. // Calcif. Tissue Int. – 2000. – Vol. 66(2). – P. 129–138. 3. Sloan A.J. Stem cells and the dental pulp: potential roles in dentine regeneration and repair / A.J. Sloan, A.J. Smith // Oral Dis. – 2007. – Vol. 13(2). – P. 151–157. 4. Sloan A.J. Dental pulp stem cells: what, where, how? / A.J. Sloan, R.J. Waddington // Int. J. Paediatr. Dent. – 2009. – Vol. 19(1). – P. 61–70. 5. Stem cell properties of human dental pulp stem cells / S. Gronthos, J. Brahim, W. Li [et al.] // J. Dent. Res. – 2002. – Vol. 81(8). – P. 531–535. 6. Human postnatal dental pulp cells co-differentiate into osteoblasts and endotheliocytes: a pivotal synergy leading to adult

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

219

bone tissue formation / R. d’Aquino, A. Graziano, M. Sampaolesi [et al.] // Cell Death Differ. – 2007. – Vol. 14(6). – P. 1162 – 1171. 7. Dental pulp stemcells in regenerative dentistry / L. Casagrande, M.M. Cordeiro, S.A. Nor [et al.] // Odontology. – 2011. – Vol. 99(1). – P. 1–7. 8. Tooth slice/scaffold model of dental pulp tissue engineering / V.T.Sakai, M.M. Cordeiro, Z. Dong [et al.] // Adv. Dent. Res. – 2011. – Vol. 23(3). – P. 325–332. 9. Huang G.T. Mesenchymal stemcells derived from dental tissue vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine / G.T.Huang, S. Gronthos, S. Shi // J. Dent. Res. – 2009. – Vol. 88(9). – P. 792–806. 10. Differentiation potential of stemcells from human dental origin-promise for tissue engineering / K. Kadar, M. Kiraly, B. Porcsalmy [et al.] // J. Physiol. Phamacol. – 2009. – Vol. 60 Suppl.7. – P. 167–175. 11. Pontikoglou C. Human bone marrow native mesenchymal stemcells / C. Pontikoglou, B. Delorme, P. Charbord // Regen. Med. – 2008. – Vol. 3(5). – P. 731–741. 12. Mesenchymal Stem or Stromal Cells: Towards a Better Understanding of Their Biology? / U. Lindner, J. Kramer, J. Rohwedel [et al.] // Transfus. Med. Hemother. – 2010. – Vol. 37(2). – P. 75–83. 13. Hypoxia enhances colony formation and proliferation of human dental pulp cells / K. Iida, T. Takeda-Kawaguchi, Y.Tezuka [et al.] // Arch. Oral Biol. – 2010. – Vol. 55(9). – P. 648–654. 14. Mesenchymal stemcells in the dental tissues: perspectives for tissue regeneration / C. Estrala, A.H. Alencar, G.T. Kitten [et al.] // Braz. Dent. J. – 2011. – Vol. 22(2). – P. 91–98. 15. Sharpe P.T. Neural crest and tooth morphogenesis / P.T. Sharpe // Adv. Dent. Res. – 2001. – Vol. 15. – P. 4–7. 16. Li P. Mesenchymal Stem Cells and Tooth Engineering / P. Li, Y. Ling, Z. Xue-dong // Intern. J. Oral Sci. - 2009. - Vol. 1(6). - P. 6-12. 17. Nakashima M. The application of tissue engineering to regeneration of pulp and dentin in endodontics / M. Nakashima, Akamine // J. Endodont. – 2005. – Vol. 31(10). – P. 711–718.

220

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

18. Dental pulp stem cells: a promising tool for bone regeneration / A. Graziano, R. d’Aquino, G. Laino [et al.] // Stem Cell Rev. – 2008. – Vol. 4(1). – P. 21–26. 19. Long-term cryopresentation of dental pulp stem cells (SBPDPSCs) and their differentiationed osteoblasts: a cell source for tissue repair / G. Pappacio, A. Graziano, R. a’Aquino [et al.] // J. Cell. Physiol. – 2006. – Vol. 208(2). – P. 319–325. 20. The efficacy of mesenchymal stem cells to regenerative and repair dental structures / S. Shi, P.M. Bartold, M. Miura [et al.] / Orthod. Craniofac. Res. – 2005. – Vol. 8(3). – P. 191–199. 21. Differentiation of dental pulp stemcells into regular-shaped dentin-pulp complex induced by tooth germ sell conditioned medium / J. Ju, Z. Deng, J. Shi [et al.] // Tissue Eng. – 2006. – Vol. 12(11).– P. 3097–3105. 22. TWIST 1 Promotes the Odontoblast-like Differentiation of Dental StemCells / Y. Li, Y. Lu, I. Maciewska [et al.] // Adv. Dent. Res. – 2011. – Vol. 23(3). – P. 280–284. 23. Differential regulation of dentin sialophosphoprotein expression by Runx2 during cytodifferentiation // S. Chen, S. Rani, Y. Wu [et al.] // J. Biol. Chem. – 2005. – Vol. 280(33). – P. 29717–29727. 24. Potential Role of Dentin Sialoprotein by Inducing Mineralization for Dental Tissue Repair / G.H. Yuan, G.B. Yang, L.A. Wu [et al.] // Dent. Hypotheses. – 2010. – Vol. 1(2). – P. 69–75. 25. Tsiafas D. Differentiation potential of dental papilla, dental pulp, and apical papilla progenitor cells / D. Tsiafs, K. Kodonas // J. Еndod. – 2010. – Vol. 36(5). – P. 781–789. 26. Stem/progenitor cell-mediated de novo regeneration of dental pulp with newly deposited continuous layer of dentin in an in vivo model / G.T. Huang, T. Yamaza, L.D. Shea [et al.] // Tissue Eng. Hart A. – 2010. – Vol. 16(2). – P. 605–615. 27. Differentiation potential of STRO-1 + dental pulp stemcells changes during cell passaging / J. Yu, H. He, C. Tang [et al.] // BMC Cell Biol. – 2010. – Vol. 8. – P. 11–32. 28. Alongi D.J. Stem / progenitor cells from inflamed human dental pulp retain tissue regeneration potential / D.J. Alongi, T. Yamaza, Y. Song // Regen. Med. – 2010. – Vol. 5(4). – P. 617–631.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

221

29. Hypoxia enhances colony formation and proliferation of human dental pulp cells / K. Iida, T. Takeda-Kawaguchi, Y.Tezuka [et al.] // Arch. Oral Biol. – 2010. – Vol. 55(9). – P. 648–654. 30. Putative stemcells in human dental pulp with irreversible pulpitis: an explorary study / Z. Wang, J. Pan, J.T. Wright [et al.] // J. Endod. – 2010. – Vol. 36(5). – Р. 820–825. 31. Effects of basic fibroblast growth factor on the development of the stemcell properties of human dental pulp cells / A. Morito, Y. Kida, K. Suzuki [et al.] // Arch. Histol. Cytol. – 2009. – Vol. 72(1). – P. 51–64. 32. Stemcell proliferation pathways comparison between human exfoliated decidouous teeth and dental pulp stemcells by gene expression profile from promising dental pulp / S. Nakamura, Y. Yamada, W. Katagiri [et al.] // J. Endod. – 2009. – Vol. 35(11). – P. 1536–1542. 33. Isolation and in vitro characterization of dental pulp stemcells from natal teeth / Z. Karaoz, B.N. Dogan, A. Aksoy [et al.] // Histochem. Cell Biol. – 2010. – Vol. 133(1). – P. 95–112. 34. Saber S.E. Tissue engineering in endodontitis / S.E. Saber // J. Oral Sci. – 2009. – Vol. 51(4). – P. 495–507. 35. Induced in vitro differentiation of neural-like cells from human exfoliated deciduous teeth-derived stemcells / N. Nourbakhsh, M. Solumani, Z. Tagnipour [et al.] // Int. J. Biol. – 2011. – Vol. 55(2). – P. 189–195. 36. Arora V. Banking stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED): saving for the future / V. Arora, P. Arora, A.K. Munshi // J. Clin. Pediatr. Dent. – 2009. – Vol. 33(4). – P. 289–294. 37. Volponi A.A. Stemcell-based biological tooth repair and regeneration / A.A.Volponi, Y. Pang, P.T. Sharpe // Trends Cell Biol. – 2010. – Vol. 20(10). – P. 715–722. 38. Dadu S.S. Tooth regeneration: current status / S.S. Dadu // Indian J. Dent. Res. – 2009. – Vol. 20(4). – P. 506–507. 39. Krasner P. Stem cells in dentistry and medicine: the dentist’s role // P. Krasner, D. Le Anh // Dent. Today. – 2011. – Vol. 30(1).– P. 130–134. 40. Isolation and characterization of human dental pulp stem / stromal cells from nonextracted crown-fractured teeth requiring

222

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

root canal therapy / A.H. Huang, Y.K. Chen, A.W. Chan [et al.] // J. Endod. – 2009. – Vol. 35(5). – P. 683–681. 41. Morphological and cytofluometric analysis of adult mesenchymal stem cells expanded ex vivo from periodontal ligament / O. Trubiani, R. Di Primio, T. Traini [et al.] // Int. J. Immunopathol. Pharmacol. – 2005. – Vol. 18(2). – P. 213–231. 42. Adult mesenchymal stem cells in dental research: a new approach for tissue engineering / O.Trubiani, G. Orsini, S. Caputi [et al.] // Int. J. Immunopathol. Pharmacol. – 2006. – Vol. 19(3). – P. 451–460. 43. Periapical follicle stemcell: a promising candidate for cementum/periodontal ligament regeneration and bio-root engineering / C. Han, Z. Yang, W. Zhou [et al.] // StemCells. – 2010. – Vol. 19(9). – P. 1405–1415. 44. Dental follicle stemcells and tissue engineering / M.J. Honda, M. Imaizumi, S. Tsuchiya [et al.] // J. Oral Sci. – 2010. – Vol. 52(4). – P. 541–552. 45. Mesenchymal stem-cell-mediated functional tooth regeneration in swine / W. Sonoyama, Y.Liu, D.Fang [et al.] // PloS Оne. – 2006. – Vol. 1. – P. E79. 46. Differentiation potential of stemcells from human dental origin-promise for tissue engineering / K. Kadar, M. Kiraly, B. Porcsalmy [et al.] // J. Physiol. Phamacol. – 2009. – Vol.60, Suppl.7. – P. 167–175. 47. Stem cells: therapeutic potential in dentistry / F. Nedel, A. Andre Dde, I.O. de Oliveira [et al.] // J. Contemp. Dent. Tract. – 2009. – Vol. 10(4). – P. 90–96. 48. Saber S.E. Tissue engineering in endodontitis / S.E. Saber // J. Oral Sci. – 2009. – Vol. 51(4). – P. 495–507. 49. Stem cells of dental pulp // E. Renard, S. Lopez-Caraux, J. Guicheux [et al.] // CR Biol. – 2007. – Vol. 330(9). – P. 635-643. 50. Lin N.H. Stem cells and periodontal regeneration / N.H. Lin, S. Gronthos, P.M. Bartold // Aust. Dent. J. – 2008. – Vol. 53(2). – P. 108–121. 51. Hughes F.J. Periodontal regeneration: a challenge for the tissue engineering ? / F.J. Hughes, M. Ghuman, A. Talal // Proc. Inst. Mech. Eng. H. – 2010. – Vol. 224(12). – P. 1345–1358.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

223

Японські біологи вперше виростили слинні і слізні залози з особливих культур - "заготовок" і успішно пересадили їх живим мишам. Опубліковано 03.10.2013. http://www.ukrinform.ua/ukr/news/biologi_virostili_slinni_i_ slizni_zalozi_v_probirtsi_1869179

Слинні залози. Слинні залози часто є органами-мішенями для радіаційного, запального чи токсичного пошкодження з наступним виникненням гіпосалівації і ксеростомії, що призводить до значного погіршення якості життя хворих. Гіпосалівація і сухість у роті є головною проблемою в лікуванні хворих на злоякісні пухлини голови і шиї. Сучасна медицина все більше пов’язує лікування недостатності слинних залоз зі СК і/чи тканинною інженерією [1, 2]. Сьогодні безперечною є думка про те, що в слинних залозах містяться СК, які можна використати для лікування ксеростомії [3, 4]. Трансплантація СК може ослабити процеси гіпофункції і поліпшити якість життя пацієнтів, тому знання про ембріональний розвиток, гомеостаз та регенерацію слинних залоз після розвитку їх атрофії є важливими. Для цього треба точно встановити осередок СК у слинних залозах, розробити методи отримання і культивування цих клітин із наступною їхньою трансплантацією з метою відновлення структури і функціональної здатності слинних залоз [5]. Розуміння регенерації слинних залоз обмежене труднощами виявлення СК і клітин-попередниць, які мають мультипотентні властивості проліферуючих клітин, оскільки вважається, що регенерація – це тонко налаштований баланс клітинної проліферації, диференціації та апоптозу [6, 7]. Вивчення СК великих слинних залоз має свою історію. Одним із перших регенерацію піднижньощелепної слинної залози вивчав M.Minarbe [8]. Дослідник тимчасово порушував відток слини по загальній вивідній протоці шляхом накладення лігатури, послідовно вивчав можливості відновлення паренхіми залози на 7–28-у доби і встановив, що протягом 28 діб відбувається регенерація секреторних клітин залози. Авторадіографічні дослідження показали за таких умов як гіперплазію ацинарних клітин, так і проліферацію епітеліоцитів вставних проток [9].

224

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Численні експерименти на тваринах із перев’язкою загальної вивідної протоки виявили, що регенерація сероцитів у привушній залозі починається через один день після звільнення протоки від лігатури. На фоні виниклих атрофічних процесів показники ацинусів, вставних, посмугованих проток відновлювалися на 14-у добу [10]. Клітини вставних проток проліферують, утворюють стовбурову нішу і забезпечують регенерацію секреторних клітин. При використанні нових точних методів дослідження регенеруючих клітин встановлено, що морфологічні маркери регенерації з’являються через 3 дні після перев’язки загальної протоки піднижньощелепної слинної залози [11]. У клітинах вставних проток, які локалізуються поблизу ацинусів, з’являється амілазна активність [12]. Тобто, клітини вставних вивідних проток можуть редиференціюватися і поповнювати пул зруйнованих ацинарних клітин [13]. R. He et al. [14] виявили у вставних протоках СК, а P.C.Denny et al. [15] підтвердили їхню думку про те, що джерелом регенерації гландулоцитів піднижньощелепної слинної залози є клітини вставних проток. Тобто, самооновлення піднижньощелепної залози відбувається від клітин вставних проток, які є фенотипово різноманітні [16, 17]. До того ж висловлюється гіпотеза, що процес диференціації ацинарних клітин відбувається так, як і в ембріональному розвитку [18, 19]. Таким чином, першочерговими завданнями відновної медицини великих слинних залоз є встановлення точної локалізації СК у них, розробка способів їх виокремлення з цих ділянок, умови культивування і способів подальшої трансплантації. Багато досліджень проведено з метою встановлення місця розташування СК і науковці схиляються до думки, що СК у слинних залозах, які забезпечують відновлення (регенерацію) як у фізіологічних умовах, так і при патології, розташовуються у стінці вставних проток на межі з ацинусами (шийка вставної протоки, додаток 8) [20]. Установлено, що клітини-попередниці піднижньощелепної залози, ізольовані від щурів, мишей і свиней мають схожі характеристики, у тому числі внутрішньоклітинні маркери ламініну і α6β1 інтегринів [21].

Розділ 3. С товбурові

225

клітини органів і систем дорослого організму

СК можна отримати шляхом біопсії слинної залози. Із усіх клітин у мишей виокремлювали ті, які експресують Ascl3, відомий як Sgn1– представник родини генів транскрипційних факторів, які залучені в процеси спеціалізації і диференціації клітини, і можна вважали їх СК [22], враховуючи, що Sgn1 є регулятором транскрипції саме клітин проток [23]. У піднижньощелепній слинній залозі новонароджених щурів T. Kishi et al. [24] виявили високопроліферативні СК/попередниці, що належать до мультипотентних, і з яких можуть диференціюватися секреторні клітини, епітеліоцити проток і міоепітеліальні клітини. Y. Tatsuishi et al. [25] забирали клітини піднижньощелепної залози в людини різного віку і отримали клітини з високими мультипотентними властивостями. У клітинах-попередницях слинних залоз визначаються маркери, які характерні, в основному, для епітеліальних клітин (табл. 8). До них належать білки і гени цитоплазми, плазмолеми і ядра. Для клітин слинних залоз остаточно не виявлено специфічних маркерів для ідентифікації їхніх екзо- та ендокриноцитів [26]. Таблиця 8

Білки і гени клітин-попередниць слинних залоз, їхня локалізація і функція (За I.M. Lombaert [2]) Білок

Ген

Keratin 5α (K5) Keratin 14 (K14) Keratin 19 (19)

Krt14

c-Kit

Kit

Krt5

Krt19

Локалізація

Функція

Білок проміжних мікрофіламентів, зальних клітин-попередниць Білок проміжних мікрофіламентів, цитоплазма зальних клітин-попередниць Білок проміжних мікрофіламентів, цитоплазма тин-попередниць проток Білок проміжних мікрофіламентів, плазмолема тин-попередниць проток цитоплазма

маркер бамаркер бамаркер клімаркер клі-

CD133, Prom1 плазмолема Маркер клітин-попередниць в органах prominin CD24 CD24 плазмолема Маркер клітин-попередниць в органах CD49f, Itg α, β плазмолема Позаклітинний ламінін, у напівдесмосомах α, β-integrin

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

226 Sca1 p63 Oct3/4 Nanog Sox2 Sox9 Sox10 Klf4 CMYC Etv4, Pea3 Etv5, Erm Asl3 Aquaporin

Антиген лімфоцитів, маркер клітин-попередниць Trp63 ядро Транскрипційний фактор клітин-попередниць Pou5f1 ядро Транскрипційний фактор ембріональних СК Nanog ядро Транскрипційний фактор ембріональних СК Sox2 ядро Транскрипційний фактор ембріональних СК Sox9 ядро Транскрипційний фактор ембріональних СК Sox10 ядро Транскрипційний фактор СК в органах Klf4 ядро Транскрипційний фактор СК в органах Myc ядро Транскрипційний фактор ембріональних СК Etv4 ядро Транскрипційний фактор СК в органах Транскрипційний фактор клітин-попередниць Etv5 ядро в органах Транскрипційний фактор клітин-попередниць Asl3 ядро у протоках AQP3 плазмолема Транскрипційний фактор клітин-попередниць Ly6α

плазмолема

Після виділення клітин-претендентів на СК їх культивують in vitro. За певних умов СК/клітини попередниці діляться, утворюють колонії. Середній час подвоєння кількості колонієутворювальних клітин у щурів становить 24,7 години, а при додаванні факторів росту – 13,2 години, що вказує на їх високу проліферативну активність [24]. У мишей у результаті вирощування в 3-денній культурі найновішими сучасними маркерами з допомогою методів імуноцитохімії і проточної цитометрії (CD133+, CD49f+ і CD24+) ідентифікували СК, пересаджували їх радіаційно ураженим мишам і отримали відновлення функції слинних залоз [27, 28]. Згідно сучасних технологій, культивування СК відбувається з утворенням слинних клітинних сфер (salispheres). У первинних сферах може послідовно відбутися 7 поділів і отримано приблизно 3000 с-kit+ клітин. J. Feng et al. [29] виділяли зі сфер 100-300 с-kit+ клітин, трансплантували їх y слинні залози мишей і спостерігали покращення функціонального стану залоз після радіаційного пошкодження. L.S. Nanduri et al. [30] в експерименті культивували отримані C-Kit (+) клітини слинних залоз, які ко-експресували CD24 і/або CD49f маркери, отримали salispheres і трансплантували їх внутрішньогландулярно мишам із порушеним слиновиділенням після опромінення. Автори встановили, що ця процедура

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

227

призвела до нормалізації васкуляризації, зменшенню фіброзу в слинній залозі. Особливий інтерес являють собою питання трансплантації СК. T. Sugito et al. [31], I.M. Lombaert et al. [32, 2] при експериментальній атрофії пересаджували їх внутрішньозалозисто і отримали довгострокове відновлення функції залоз. Через 2 тижні мічені в культурі флуоресцентним барвником РКН26 клітини виявлялися в сполучній тканині, через 4 тижні – широко розповсюджувалися по залозі з переважною локалізацією в ділянці пошкоджених ацинусів і проток, не залучаючи в регенерацію ділянки здорової тканини. Є відомості про введення СК субкапсулярно з регенерацією в межах однієї часточки. R.S. Redman et al. [33] запронували вводити СК через загальну вивідну протоку. Вищенаведені дані стосуються відновлення залозистої части ни, тоді як питання регенерації стромального компоненту залишаються мало вивченими. Наводяться дані про те, що з мезенхімних клітин привушної залози людини, які можна вважати СК, при подальшому культивуванні відбувається їхня диференціація в адипо-, хондро- та остеогенні [34]. Крім того, клітини-попередниці, виділені зі сполучної тканини слинних залоз, транс диференціюються в клітини з фенотипом ендокринної функції підшлункової залози [35]. Не менш цікавими є дані про те, що при трансплантації клітин-попередниць піднижньощелепної слинної залози шляхом введення їх у ворітну вену, отримали клітини, подібні за імуноцитохімічними властивостями до гепатоцитів [36]. Автори зробили висновок про можливість клітин слинних залоз диференціюватися в клітини ендодермального походження. Виявлено, що культивовані епітеліоцити вивідних проток піднижньощелепної слинної залози у свиней, експресують інсулін і альбумін, що характеризує їхню можливість диференціації у β-клітини і гепатоцити [37]. Важливим є дослідження A. Maass et al. [38], які в експерименті культивували in vitro залозисті клітини слинних залоз у присутності матеріалу біопсії міокарда. Залозисті клітини при цьому перетворювалися на кардіоміоцитоподібні. Автори імплантували такі клітини в ділянку міокарда з інфарктом і встано-

228

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

вили, що в них збільшується експресія специфічних кардіологічних маркерів-протеїнів: тропоніну І, тропоніну Т, саркомерного міозину, а також відбувається їхня більш активна проліферація. Щоб досягти ефекту in vivo, на думку дослідників, активовані СК слід доставляти в ділянку інфаркту протягом тривалого часу. Оскільки клітинна терапія привертає все більшу увагу в регенерації слинних залоз, то виникає питання чи можна вико рис тати з цією метою інші за походженням СК окрім власне слинних залоз. Останнім часом було показано, що СК червоного кісткового мозку можуть диференціюватися в епітеліоцити слинних залоз in vitro [39]. Автори мітили СК червоного кісткового мозку наночастинками і культивували в присутності ацинарних клітин, отримували мічені ацинарноподібні клітини і висло вили думку, що такі клітини можна трансплантувати in vivo. Y. Sumita et al. [40] виявили, що після пересадки СК червоного кісткового мозку опроміненим мишам у них збільшується кількість слини. Гістологічно зростає рівень проліферативних процесів у слинних залозах, активно утворюються кровоносні судини. У мишей, яким не трансплантували такі клітини, у залозах підвищується рівень апоптозу. Науково розробляються клітинні моделі слинних залоз, що можуть бути використані для відновного лікування та поліпшення якості життя багатьох пацієнтів, які страждають від сек реторної дисфункції, через створення штучної слинної залози. Ці моделі являють собою перші кроки з клінічних та трансплантаційних досліджень із метою сприяння створенню клінічно безпечних слинних залоз. Необхідні подальші дослідження попередників і маркерів СК, клітинних ліній і первинних клітин для підвищення виживаності, клітинної диференціації і секреторної функції слинних залоз. Тобто вчені наближаються до створення штучної слинної залози [41]. • Матеріали опубліковані в статті Чайковський Ю.Б. / Ю.Б. Чайковський, С.Б. Геращенко, О.І. Дєльцова // Стовбурові клітини великих слинних залоз / Світ медицини та біології. – 2012. - №2. – С. 200-203.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

229

Література 1. Salivary glandstem cells: Can they restore radiation–induced salivary gland dysfunction? / N. Rotter, S. Schwarz, M. Jacob [et al.] // HNO. – 2010. – Vol. 58(6). – P. 556–563. 2. Lombaert I.M. Salivary gland progenitor cell biology provides a rationale for therapeutic salivary gland regeneration / I.M. Lombaert, S.M. Knox, M.P. Hoffman // Oral Dis. – 2011. – Vol. 17(5). – P. 445–449. 3. Isolation of mouse salivary glandstem cells / S. Pringle, L.S. Nanduri, M. van der Zwaag [et al.] // J. Vis. Exp. – 2011. – 8 February. – Режим доступу до журналу : Pll: 2484. DOI: 10.3791/2484. 4. Pringle S. Concise review: Adult salivary gland stem cells and a potential therapy for xerostomia / S. Pringle, R. Van Os, R.P. Coppes // Stem Cells. - 2013. - Vol. 31(4). - P. 613-619. 5. Coopers R.P. Stem cells and the repair of radiation-induced salivary gland damage / R.P. Cooper, M.A. Stokman // Oral Dis. – 2011. – Vol. 17(2). – P. 143–153. 6. Regeneration in chronic sialadenitis: an analysis of proliferation and apoptosis based on double immunohistochemical labelling / S. Ihrler, S. Biasenbren-Vogt, A. Sendelhofert [et al.] // Virchow’s Archiv. – 2004. – Vol. 444(4). – P. 356–361. 7. Jeong J. Human salivary gland stem cells ameliorate hyposalivation of radiation-damaged rat salivary glands / J. Jeong, H. Baek, Y.J. Kim [et al.] // Exp. Mol. Med. - 2013. - Vol. 45. P.e58. 8. Minarbe M. Regeneration of the rat submandibular glands after duct ligation / Kanagawa Shigaku. – 1989. – Vol. 24(3). – P. 484–500. 9. Dardick I. A review of the proliferative capacity of major salivary glands and the relationship to current concepts of neoplasia in salivary glands / I. Dardick, R.W. Byard, J.A. Carnegia // Oral Surg., Oral Med., Oral. Pathol. – 1990. – Vol. 69(1). – P. 53–67. 10. Burgess K.L. Cell population changes during atrophy and regeneration of rat parotid gland / K.L. Burgess, I. Dardick // Oral Surg., Oral. Med., Oral Pathol., Oral Radiol.Endod. – 1998. – Vol. 85(6). – P. 699–706.

230

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

11. Early markers of regeneration following ductal ligation in rat submandibular gland / E. Cotroneo, G.B. Proctor, K.L. Paterson [et al.] // Cell Tissue Res. – 2008. – Vol. 332(2). – P. 227–235. 12. Intercalated duct cells in the rat parotid gland may behave as tissue stem cells / O. Katsumata, Y. Sato, Y. Sakai [et al.] // Anat. Sci. Int. – 2009. – Vol. 84(3). – P. 148–154. 13. Dispersed donor salivary glandcells are widely distributed in the recipient gland when infused up the ductal tree / R.S. Redman, W.D. Ball, E. Mezey [et al.] // Biotech. Histochem. – 2009. – Vol. 84(6). – P. 253–260. 14. He R. Observation of proliferative capacity of rat salivary glandcells / R. He, H. Xu, T. Akio // Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. – 1996. – Vol. 31(2). – P. 67–70. 15. Denny P.C. Dynamics of parenchymal cell division, differentiation, and apoptosis in the young adult female mouse submandibular gland / P.C. Denny, P.A. Denny // Anat. Rec. – 1999. – Vol. 254(3). – P. 408–417. 16. Contributions of intercalated duct to the normal parenchyma of submandibular glands of adult rats / Y.Y. Man, W.D. Ball, L. Marchetti [et al.] // Anat. Rec. – 2001. – Vol. 263(2). – P. 202–214. 17. A morphogenetic concept of salivary duct regeneration and metaplasia / S. Ihrler, C. Zietz, A. Sendelhofert [et al.] // Virchows Arch. – 2002. – Vol. 440(5). – P. 519–526. 18. Carpenter G.H. Salivary gland regeneration / G.H. Carpenter, E. Cotroneo // Front. Oral Biol. – 2010. – Vol. 14. – P. 107–128. 19. Cotroneo E. Regeneration of acinar cells following ligation of rat submandibular gland retraces the embryonic-perinatal pathway of cytodifferentiation / E. Cotroneo, G.B. Proctor, G.H. Carpenter // Differentiation. – 2010. – Vol. 79(2). – P. 120–130. 20. Kimoto M. Label-retaining cells in the rat / M. Kimoto, Y. Yura, M. Kishino [et al.] // J. Histochem. Cytochem. – 2008. – Vol. 56(1). – P. 15–24 21. Okumura K. Capability of tissue stem cells to organize into salivary rudiments/ K. Okumura, M. Shinohara, F. Endo // Stem Cells Int. - 2012. - Vol. 2012. - P. 502136. 22. Asl3 expression marks a progenitor population of both acinar and ductal cells in mouse salivary glands / N. Bullard, L.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

231

Koek, E. Roztocil [et al.] // Dev. Biol. – 2008. – Vol. 320(1). – P. 72–78. 23. Sgn1, a basic helix–-loop-helix transcription factor delineates the salivary gland duct cell lineage in mice / S. Yoshida, K. Ohbo, A. Takamura [et al.] // Dev. Biol. – 2001. – Vol. 240(2). – P. 517–530. 24. Redman R.S. On approaches to the functional restoration of salivary glands damaged by radiation therapy for head and neck cancer, with a review of related aspects of salivary gland morphology and development / R.S. Redman // Biotech. Histochem. – 2008. – Vol. 83(3). – P. 103–130. 25. Regeneration in chronic sialadenitis: an analysis of proliferation and apoptosis based on double immunohistochemical labelling / S. Ihrler, S. Biasenbren-Vogt, A. Sendelhofert [et al.] // Virchow’s Archiv. – 2004. – Vol. 444(4). – P. 356–361. 26. Schwarz S. Human salivary gland stem cells: isolation, propagation, and characterization / S. Schwarz, N. Rotter // Methods Mol. Biol. - 2012. - Vol. 879. - P. 403-442. 27. Redman R.S. On approaches to the functional restoration of salivary glands damaged by radiation therapy for head and neck cancer, with a review of related aspects of salivary gland morphology and development / R.S. Redman // Biotech. Histochem. – 2008. – Vol. 83(3). – P. 103–130. 28. Regeneration of irradiated salivary glands with stem cell marker expressing cells / L.S. Nandry, M. Maimets, S.A. Pringle [еt al.] // Radiother. Oncol. – 2011. – Vol. 99(3). – P. 367–372. 29. Isolation and characterization of human salivary glandcells for stem cell transplantation to reduce radiation-induced hyposalivation / J. Feng, M. van der Zwaag, M.A. Stokman [et al.] // Radiother. Oncol. – 2009. – Vol. 92(3). – P. 466–471. 30. Salisphere derived c-Kit(+) cell transplantation restores tissue homeostasis in irradiated salivary gland / L.S. Nanduri,I.M. Lombaert, M. van der Zwaag [et al.] // Radiother. Oncol. - 2013. Vol. 108(3). - P. 458-463. 31. Transplantation of cultured salivary glandcells into an atrophic salivary gland / T. Sugito, T. Kagami, K. Hata [et al.] // Cell Transplant. – 2004. – Vol. 13(6). – P. 891–699.

232

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

32. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands / I.M. Lombaert, J.F. Brunsting, P.K. Wierenge [et al.] // PLoS One. – 2008. – Vol. 3(4). – P. e2063. 33. Dispersed donor salivary glandcells are widely distributed in the recipient gland when infused up the ductal tree / R.S. Redman, W.D. Ball, E. Mezey [et al.] // Biotech. Histochem. – 2009. – Vol. 84(6). – P. 253–260. 34. Isolation and characterization of adult stem cells from human salivary glands / N. Rotter, J. Oder, P. Schlenke [et al.] // Stem Cells Dev. – 2008. – Vol. 17(3). – P. 509–518. 35. Sato A. Isolation, tissue localization, and cellular characterization of progenitors derived from adult human salivary glands / А. Sato // Cloning Stem Cells. – 2007. – Vol. 9(2). – P. 191–205. 36. Salivary gland progenitor cells induced by duct ligation differentiated into hepatic and pancreatic lineages / K. Okumura, K. Nakamura, Y. Hisatori [et al.] // Hepatology. – 2003. – Vol. 38(1). – P. 104–113. 37. Isolation of tissue progenitor cells from duct-ligated salivary glands of swine / S. Matsumoto, K. Okumura, A. Ogata [et al.] // Cloning Stem Cells. – 2007. – Vol. 9(2). – P. 176–190. 38. Towards a pragmatic strategy for regenerating infracted myocardium with glandular stem cells / A. Maass, J. Kajahn, E. Guerlejik [et al.] // Ann. Anat. – 2009. – Vol. 191(1). – P. 51–61. 39. Cell therapy for salivary gland regeneration / C.Y. Lin, F.H. Chang, C.Y. Chen [et al.] // J. Dent. Res. – 2011. – Vol. 90(3). – P. 341–346. 40. Bone marrow-derived cells rescue salivary gland function in mice with head and neck irradiation / Y. Sumita, Y. Liu, S. Khalili [et al.] // Int. J. Biochem. Cell Biol. – 2011. – Vol. 43(1). – P. 80–87. 41. Nelson J. Current cell models for bioengineering a salivary gland: a mini-review of emerging technologies / J. Nelson, K. Manzella, O.J. Baker // Oral Dis. - 2013. - Vol. 19(3). - P. 236244.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

233

Стравохід. Відновлення епітелію слизової оболонки стравоходу в людини триває приблизно 11 діб [1]. Вважають, що СК епітелію стравоходу локалізуються в його базальному шарі (додаток 9) і в подальшому диференціюються до епітеліоцитів поверхневого шару [2 - 6]. Було встановлено, що в людини і миші відновлення епітелію стравоходу починається на 3-ю добу постнатального розвитку. Імуногістохімічні дослідження показали, що цей термін узгоджується з локалізацією NGFR (нервові рецептори фактора росту) у базальних клітинах [7]. Визначені транскрипційні фактори СК епітелію стравоходу, які можуть мати значення в діагностиці стравоходу Баррета і його диспластичного прогресування [8]. Оскільки ряд вроджених і набутих порушень стравоходу вимагає заміни тканин, то останнім часом розробляються методи тканинної інженерії стравоходу на основі використання децелюляризованих матриць із м'язовими та епітеліальними клітинами з метою підготовки до повної заміни стравоходу, але вони вимагають вирішення численних питань [9 ]. СК червоного кісткового мозку при їхній трансплантації в слизову оболонку позитивно впливають на відновлення стінки стравоходу, зокрема його епітеліального шару [10]. Був використаний безклітинний каркас підслизової основи тонкої кишки свині з трансплантацією в нього мезенхімних СК червоного кісткового мозку і переміщенням його на місце резекованого (5 см) стравоходу в собаки [11]. Для анатомічної заміни стравоходу розглядаються можливості використання різноманітних матеріалів для створення алотрансплантатів, які не розсмоктуються і які розсмоктуються [12]. Досліджені властивості каркасу стравоходу з нановолокон і зроблено висновок, що вони володіють якостями потенційних кандидатів на функціональне відновлення стравоходу [13]. Т. Ohki et al. [14] після проведеної ендоскопічної диссекції підслизової основи стравоходу при поверхневих злоякісних новоутвореннях трасплантували ендоскопічно попередньо культивовані клітини слизової оболонки ротової порожнини. Повну реепітелізацію спостерігали протягом 3,5 тижня. Ця процедура може бути використана для запобігання стриктури і поліпшення жит-

234

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

тя пацієнтів. До новітніх методів регенераційної медицини стравоходу належить ендоскопічна трансплантація автологічних клітин у ділянку стриктури органа [15]. Література 1. Identification of lineage-uncommitted, long-lived, labelretaining cells in healthy human esophagus and stomach, and in metaplastic esophagus / Q. Pan, A.M. Nicholson, H. Barr [et al.] // Gastroenterology. - 2013. - Vol. 144(4). - P. 761-770. 2. Seery J.P. Stem cells of the oesophageal epithelium / J.P. Seery // J. Cell Sci. - 2002. - Vol. 115(Pt 9). - P. 1783-1789. 3. Esophageal stem cells - a review of their identification and characterization / D. Croagh, R.J. Thomas, W.A. Phillips [et al.] // Stem Cell Rev. - 2008. - Vol. 4(4). - P.261-268. 4. Developing a quantitative in vivo tissue reconstitution assay to assess the relative potency of candidate populations of mouse oesophagealepithelial cells / D. Croagh,R. Redvers,W.A. Phillips [et al.] // Methods Mol. Biol. - 2012 - Vol. 879. - P. 73-88. 5. Barker N. Epithelial stem cells in the esophagus: who needs them? / N. Barker // Cell Stem Cell. - 2012. - Vol. 11(3). - P. 284-286. 6. A single progenitor population switches behavior to maintain and repair esophageal epithelium / D.P. Doup'e, M.P. Alcolea, A. Roshan [et al.] // Science. - 2012. - Vol. 337(6098). - P. 1091-1093. 7. Molecular profiles of the mouse postnatal development of the esophageal epithelium showing delayed growth start / H. Daiko, N. Isohata, M. Sano [et al.] // Int. J. Mol. Med. - 2006. - Vol. 18(6). P. 1057-1066. 8. Souza R.F. Esophageal stem cells and 3D-cell culture models / R.F. Souza, R.E. Schwartz, H. Mashimo // Ann. N. Y. Acad. Sci.2011. - Vol. 1232. - P. 316-322. 9. Esophageal tissue engineering: a new approach for esophageal replacement / G. Totonelli, P. Maghsoudlou, J.M. Fishman [et al.] // World J. Gastroenterol. - 2012. - Vol. 18(47). - P. 6900-6907. 10. Bone marrow-derived cells participate in the long-term remodeling in a mouse model of esophageal reconstruction/ T.W. Gilbert, S.A. Johnson, N.J. Turner [et al.] // J. Surg. Res. - 2013. - Vol. 182(1). - P. e1-7.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

235

11. Tissue engineered esophagus by mesenchymal stem cell seeding for esophageal repair in a canine model / B. Tan, R.Q. Wei, M.Y. Tan [et al.] // J. Surg. Res. - 2013. - Vol. 182(1). - P. 40-48. 12.Tissue engineering: an option for esophageal replacement? / A. Zani, A. Pierro, N. Elvassore [et al.] // Semin. Pediatr. Surg. 2009. - Vol. 18(1). - P. 57-62. 13. Kuppan P. PCL and PCL-gelatin nanofibers as esophageal tissue scaffolds: optimization, characterization and cell-matrix interactions / P. Kuppan, S. Sethuraman, U.M. Krishnan // J. Biomed. Nanotechnol. - 2013. - Vol. 9(9). - P. 1540-1555. 14. Prevention of esophageal stricture after endoscopic submucosal dissection using tissue-engineered cell sheets / T. Ohki, M. Yamato, M. Ota [et al.] // Gastroenterology. - 2012. - Vol. 143(3). - P. 582-528.e1-2. 15. A new era: endoscopic tissue transplantation / C.L. Leggett, E.C. Gorospe, L. Lutzke [et al.] // Curr. Opin. Gastroenterol. 2013.- Vol. 29(5). - P. 495-500. Шлунок. Регенерація епітелію шлунка в дорослих триває від декількох днів до декількох місяців. В одному з перших дос ліджень регенерації слизової оболонки шлунка вказувалося, що проліферуючі мультипотентні стовбурові клітини (СК) функціонально закріплені в перешийку (додаток 10) залоз і започатковують 3 лінії клітин: 1) які рухаються до поверхні слизової оболонки і диференціюються в слиз–продукуючі клітини; 2) які мігрують у протилежному напрямку і диференціюються в шийкові мукоцити; 3) препарієтальні клітини, які диференціюються в парієтальні (пристінкові екзокриноцити) і мігрують до дна залоз уздовж їхньої стінки [1, 2]. На думку цього автора, пристінкові екзокриноцити виробляють регуляторні сигнали, які контро люють клітинні програми диференціації клітин–попередниць зимогенних ліній, що може мати значення в злоякісній трансформації. Ключову роль у підтримці СК, збереження кількості і регуляції їхньої діяльності відіграє фактор Sonic hedgehog (Shh) і білки Cdx2 [3] (рис. 14). Shh експресується пристінковими екзокриноцитами, підтримує гомеостаз і процеси нормальної диференціації епітелію

ɪɟɝɭɥɹɬɨɪɧɿ ɫɢɝɧɚɥɢ, ɹɤɿ ɤɨɧɬɪɨɥɸɸɬɶ ɤɥɿɬɢɧɧɿ ɩɪɨɝɪɚɦɢ ɞɢɮɟɪɟɧɰɿɚɰɿʀ ɤɥɿɬɢɧ–ɩɨɩɟɪɟɞɧɢɰɶ ɡɢɦɨɝɟɧɧɢɯ ɥɿɧɿɣ, ɳɨ ɦɨɠɟ ɦɚɬɢ ɡɧɚɱɟɧɧɹ ɜ ɡɥɨɹɤɿɫɧɿɣ ɬɪɚɧɫɮɨɪɦɚɰɿʀ. Ʉɥɸɱɨɜɭ ɪɨɥɶ ɭ ɩɿɞɬɪɢɦɰɿ ɋɄ, ɡɛɟɪɟɠɟɧɧɹ ɤɿɥɶɤɨɫɬɿ ɿ ɪɟɝɭɥɹɰɿʀ ʀɯɧɶɨʀ ɞɿɹɥɶɧɨɫɬɿ ɜɿɞɿɝɪɚɽ ɮɚɤɬɨɪ Sonic hedgehog (Shh) ɿ ɛɿɥɤɢ Cdx2 [3] (ɪɢɫ. Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б. 236 ɋɬɨɜɛɭɪɨɜɿ ɤɥɿɬɢɧɢ ɲɥɭɧɤɚ EGF

Notch, Wnt

Ihh

Shh, Gastrin, BMP

Ʉɥɿɬɢɧɢɩɨɩɟɪɟɞɧɢɰɿ ɩɪɢɫɬɿɧɤɨɜɢɯ ɟɤɡɨɤɪɢɧɨɰɢɬɿɜ

Ʉɥɿɬɢɧɢɩɨɩɟɪɟɞɧɢɰɿ ɩɨɜɟɪɯɧɟɜɢɯ ɦɭɤɨɰɢɬɿɜ

Ʉɥɿɬɢɧɢɩɨɩɟɪɟɞɧɢɰɿ ɲɢɣɤɨɜɢɯ ɦɭɤɨɰɢɬɿɜ

ɉɪɢɫɬɿɧɤɨɜɿ ɟɤɡɨɤɪɢɧɨɰɢɬɢ

ɉɨɜɟɪɯɧɟɜɿ ɦɭɤɨɰɢɬɢ

ɒɢɣɤɨɜɿ ɦɭɤɨɰɢɬɢ

Arf1, Sod2, Pthlh ɋdhr5, Fads1 Calm2, Igfbp2

Muc5Ac, Gkn1 Tff1, FoxQ1

Tff2 Muc6

Ɍɪɚɧɫɞɢɮɟɪɟɧɰɿɚɰɿɹ RA, Mist1 Ƚɨɥɨɜɧɿ ɟɤɡɨɤɪɢɧɨɰɢɬɢ

Pgc, Gif Ɋɢɫ. 14. ɋɚɦɨɨɧɨɜɥɟɧɧɹ ɿ ɞɢɮɟɪɟɧɰɿɚɰɿɹ ɫɬɨɜɛɭɪɨɜɢɯ ɤɥɿɬɢɧ ɲɥɭɧɤɚ. Рис. 14. Самооновлення і диференціація стовбурових клітин шлунка. ɉɨɡɧɚɱɟɧɧɹ: Notch, Wnt, EGF, Ihh, Shh, Gastrin, BMP, RA, Mist1 -ɫɢɝɧɚɥɶɧɿ Позначення: Notch, Wnt, EGF, Ihh, Shh,ɞɥɹ Gastrin, BMP, RA, Mist1 -сигнальні шляхи. ɲɥɹɯɢ. Ʉɨɫɢɦ ɲɪɢɮɬɨɦ ɜɢɞɿɥɟɧɿ ɝɟɧɢ ɤɨɠɧɨʀ ɡ ɞɢɮɟɪɟɧɰɿɣɨɜɚɧɢɯ ɤɥɿɬɢɧ Косим шрифтом виділені гени для кожної з диференційованих клітин

шлунка [4], бере участь у канцерогенезі і регулює вміст СК і ракових СК. Не менше значення відіграє фактор транскрипції Sox2, який експресується епітеліоцитами шлунка, підтримує плюрипотентність ембріональних клітин і регулює утворення декількох видів епітеліоцитів у період внутрішньоутробного розвитку [5]. Sox 2+ або Oct 3/4 експресія в дорослих можуть бути

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

237

пов'язані з пухлинними процесами в шлунку і стати незалежними прогностичними факторами для пацієнтів із раком шлунка [6]. Експресія Sox9 за умов норми, переважно, обмежується клітинами шийки/перешийка пілоричних залоз, але водночас Sох9 є вираженим при кишковій метаплазії і раку шлунка в людини [7]. Для підтримки популяції СК шлунка потрібний Notch сигнальний фактор, який викликає диференціювання СК та/або мультипотентних клітин-попередниць слизової оболонки. Тривала активізація Notch призводить до проліферації й утворення аденом за локальної участі Wnt сигналів [8]. Сигнальний шлях кістково–морфогенетичних білків (ВМР) негативно регулює проліферацію і комітування нейроендокринних клітин, але втрата ВМР сигналізації не є суттєвою для індукції неопластичних процесів в епітеліоцитах шлунка [9]. Маркером усіх ліній шлункових СК та їхніх попередниць є Lgr5 (+ve) і villin–трансген [10]. In vitro Lgr5 (+ve)–клітини нагадують зрілі клітини пілоричного відділу [11]. Питання диференціації головних екзокриноцитів до цього часу вивчене недостатньо. Зауважено, що при диференціації головних екзокриноцитів велике значення має Mist1 [12], а їхній клітинний цикл триває біля 54 діб. У людини в антральному і фундальному відділах шлунка СК визначали за 15 маркерами [13]. Gre–рекомбіназа характерна для СК антрального і пілоричного відділів шлунка [14]. Локалізація CD133+ (prominin) відповідала розташуванню клітин, в яких відбулася пухлинна трансформація [15]. Клон KMU–Gl2-клітин являє популяцію СК, що експресують антиген епітеліальних мембран (ЕMА), муцину (5АС), гліального фібрилярного кислого білка (GFAP), цитокератину–1 (СК18), TFF1 i Oct4-фактори [16]. Імуноцитохімічно в клітинах дна залоз і перешийка ідентифікували Eph–B1 і VSIG1 (молекули клітинної адгезії). У шийкових мукоцитах, головних і пристінкових екзокриноцитах виявили Eph–B1, Eph–B2, Eph–B3 [17]. Клітини слизової оболонки шлунка можна виростити в культурі у вигляді сфер [18]. Дослідники помістили біоптати шлунка мишей на сітку і клітини диференціювалися у вигляді сфер із простим стовпчастим епітелієм, організованим у шлункові зало-

238

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

зи з прилеглими до них м'язами. Серед епітеліальних клітин визначили 4 види клітин – слизові, поодинокі ендокриноцити, головні і пристінкові екзокриноцити. Ці клітини проліферували в терміни, наближені до in vivo і експресували два передбачуваних маркери стовбурових клітин: DCAMK1 i Lgr5. Вивчення цих маркерів, в основному, обмежується мишачою моделлю, але є надія, що швидкі темпи останніх досягнень біології СК від цієї тваринної моделі незабаром приведе до більш глибокого розуміння CK шлунка людини і виявить новий погляд на рак шлунка. На сьогодні створена довгострокова тривимірна (3D) система первинної культури шлунка в стовбуровій ніші [19]. Нині переглядаються та оновлюються сучасні уявлення про клітинні і молекулярні механізми загоєння виразки шлунка. При цьому використовуються Rho/Rac/актину, Ras, МАРК, PI– 3K/AKT, PLC–γ сигнальні шляхи Фактори EGF, HGF, IGF–1, їх рецепторів і Sох2 важливі для проліферації епітеліоцитів, їх міграції, реепітелізації та регенерації шлункових залоз; для ангіо генезу, ремоделювання судин і регенерації слизової оболонки EGF, angiopoietins, оксид азоту, ендотелін, простагландини та металопротеїнази [20]. • Матеріали опубліковані в статті Дєльцова О.І. Стовбурові клітини слизової оболонки шлунка / О.І. Дєльцова, Ю.Б. Чайковський, С.Б. Геращенко // У зб. матеріалів міжнародної наук. - практ. конференції "Охорона та захист здоров'я людини в умовах сьогодення" // Київ:Київський медичний науковий центр, 2013. - С.5-9. Література 1. Karam S.M. Cell lineage relationship in the stomach of normal and genetically manipulated mice / S.M. Karam // Braz. J. Med. Biol. Res. – 1998. – Vol. 31(2). – P. 271–279. 2. Karam S.M. A focus on parietal cells as a renewing cell population / S.M. Karam // World J. Gastroenterol. – 2010. – Vol. 16(5). – P. 538–546. 3. Feng R. The role of Sonic Hedgehog as a regulator of gastric function and differentiation / R. Feng, C. Xiao, Y. Zavros // Vitam. Horm. – 2012. – Vol. 88. – P. 473–489.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

239

4. Zavros Y. The adventures of sonic hedgehog in development and repair. IV. Sonic hedgehog processing, secretion, and function in the stomach / Y. Zavros // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. – 2008. – Vol. 294(5). – P. 1105–1108. 5. Sox2(+) adult stem and progenitor cells are important for tissue regeneration and survival of mice / K. Arnold, A. Sarkar, M.A. Yram [et al.] // Cell Stem Cell. – 2011. – Vol. 9(4). – P. 317–329. 6. Role of the stemness factors sox2, oct3/4, and nanog in gastric carcinoma / J. Matsuoka, M. Yashiro, K. Sakurai [et al.] // J. Surg. Res. – 2012. – Vol. 174(1). – P. 130–135. 7. Sashikawa Kimura M. SOX9 is expressed in normal stomach, intestinal metaplasia, and gastric carcinoma in humans / М. Sashikawa Kimura, Н. Mutoh, К. Sugano // J. Gastroenterol. – 2011. – Vol. 46(11). – P. 1292–1299. 8. Kim T.H. Notch signaling in stomach epithelial stem cell homeostasis / Tae-Hee Kim, R.A. Shivdasani // JEM. – 2011. – Vol. 208(4). – P. 677–682. 9. Epithelial BMP signaling is required for proper specification of epithelial cell lineages and gastric endocrine cells / F. Maloum, J.M. Allaire, J. Gagnе-Sansfaçon [et al.] // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. – 2011. – Vol. 300(6). – P. 1065–1079. 10. Takaishi S. Current molecular markers for gastric progenitor cells and gastric cancer stem cells / S. Takaishi, T. Okumura, C.T. Wang // J. Clin. Oncol. – 2011. – Vol. 46(7). – P. 2876–2882. 11. Barker N. Tissue-resident adult stem cell populations of rapidly self-renewing organs / N. Barker, S. Bartfeld, H. Clevers // CellStem cells. – 2010. – Vol. 7(6). – P. 656–670. 12. Тhe maturation of mucus-secreting gastric epithelial progenitors into digestive–enzyme secreting zymogenic cells requires Mist1 / V.G. Ramsey, J.M. Doherty, C.C. Chen [et al.] // Development. – 2007. – Vol. 134(1). – P. 211–222. 13. Self–renewal of the human gastric epithelium: new insights from expression prolifiling using laser microdissection / I. Kouznetsova, T. Kalinski, F. Meyer [et al.] // Mol. Biosyst. – 2011.– Vol. 7(4). – P. 1105–1112. 14. Mills C. Gastric Epithelial Stem Cells / J.C. Mills, P.A. Shivdasani // Gastroenterology. - 2011. – Vol. 140(2). – P. 412-424.

240

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

15. CD133 is a marker of gland–forming cells in gastric tumors and Sox17 is involved in its regulation / H. Fukamachi, S. Shimada, K. Ito [et al.] // Cancer Sci. – 2011. – Vol. 102(7). – P. 1313–1321. 16. Isolation and characterization of human gastric cell lines with stem cell phenotypes / Y.C. Yang, S.W. Wang, H.Y. Hung [et al.] // J. Gastroenterol. Hepatol. – 2007. – Vol. 22(9). – P.1460–1468. 17. Complementary expression and repulsive signaling suggest that EphB receptors and ephrin–B ligands control cell positioning in the gastric epithelium / K. Ogawa, N. Takemoto, M. Ishii [et al.] // Histochem. Cell Biol. – 2011. – Vol. 136(6). – P. 412–424. 18. Murine tissue-engineering stomach demonstrates epithelial differentiation / A.L. Speer, F.G. Sala, J.A. Matthews [et al.] // J. Surg. Res. – 2011. – Vol. 171(1). – P. 6-14. 19. Katano T. Establishment of a long–term three-dimensional primary culture of mouse glandular stomach epithelial cells within the stem cell niche / T. Katano, A. Ootani, T. Mizoshita // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2013. – Vol. 432(4). – P. 558–563. 20. Tarnawski AS. Molecular mechanisms of epithelial regeneration and neovascularization during healing of gastric and esophageal ulcers // A.S. Tarnawski, A. Ahluwalia // Curr. Med. Chem. – 2012. – Vol. 19(1). – P. 16–27. У 2011 році вчені Корнельського університету і Пітсбургу створили кишку з використанням колагену і стовбурових клітин. У 2012 році професор з Лозанни Мартін Гийс очолив проект по створенню мініатюрної стінки кишки з вирощених епітеліоцитів і електроніки з включенням NutriChip. Учені Институту Уїсса при Гарвардскому университеті також створили з використанням кишкових клітин, заточених у прилад з тонкого силіконового полімеру, «чиповану кишку», яка імітувала справжню кишку. http://telegrafist.org/2013/07/25/74529

Тонка і товста кишка. Тонка кишка належить до інтенсив но регенеруючих органів у ссавців. Її епітелій відновлюється кожні 2–3 доби, а до його складу входять: ентероцити, келихопо дібні клітини, екзокриноцити з ацидофільною зернистістю (клітини Панета) і шлунково–кишково–підшлункові ендокриноцити (GEP–ендокриноцити) [1]. Проліферація, диференціація та апоп-

Розділ 3. С товбурові

241

клітини органів і систем дорослого організму

тоз епітелію відбувається по осі крипта-ворсинка. Крипта складокази дає того, що серед СК компартмент визначаються 2і містить популяції – довготривало проліферативний стовбурові клітини "спокійні" (зарезервовані, резервні) і активно вступаючі в цикл. Ці клітини (додаток 11). Ворсинки репрезентують компартмент диференцілокалізуються стовбурових нішах з епітеліоцити унікальним мікрооточенням. ації і в вньому представлені не з одної, а зЗв'язок різних між цими СК недостатньо вивчений, особливо епітеліально-мезенхімні крипт [2] (рис. 15). взаємодії [6].

Стовбурові клітини кишки Wnt/β-catenin Tcf4 Клітинипопередниці абсорбтивних клітин NICD1 RBP-J →Hes1 Match1

Lgr5+

Клітинипопередниці секреторних клітин RBP-J → Hes1 → Match1

Гени секреторних клітин

Ентероцити

? Келихоподібні клітини

Notch

Ngn3 Pax4 Pax6

GEPендокриноцити

Wnt/βcatenin Tcf4

Клітини Панета

15. Самооновлення і диференціаціястовбурових стовбурових клітин клітин кишки. Рис.Рис. 15. Самооновлення і диференціація кишки.

У мишей поглядами, відновлюється приблизно 200 млн одна крипта в дорослих осібепітеліоцитів містить 4-6 За сучасними щодня. РегенераціяСКпочинається з мітотичного поділунаСК, які справжніх (функціонуючих) (рис. 16). Ці клітини локалізуються висоті діаметрів 4 клітин вищев основи крипти, просторово середкрипта своїх локалізуються криптах тонкої і товстої розподілені кишки. Кожна дочірніх, утворюючи кільце 250 приблизно клітин. Вони лежать основи містить орієнтовно клітинз у16залежності від виду вище і анатомічноклітин Панета і розташовуються не завжди в одній площині. Їхні дочірні клітини в нормі проходять обмежену кількість поділів, хоча їх ліміт залишається невизначеним [7, 8].

242

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

го розташування. Розмір крипт приблизно однаковий у всіх відділах кишкового тракту. Дочірні клітини по мірі дозрівання від СК мігрують по осі крипта-ворсинка в напрямку просвіту кишки [3]. На верхівці ворсинки ентероцити знаходяться в стані апоптозу, їхні міжклітинні контакти слабшають і клітини відходять у просвіт кишки. Таким чином диференційовані функціональні клітини знаходяться на ворсинках у тонкій кишці або на вершинах крипт – у товстій. У межах фізіологічної регенерації вони мусять бути замінені новими, які починають свій розвиток у криптах. У динамічній моделі організації крипт враховані експериментальні дослідження клітинної проліферації, напрямку міграції, утворення кількох клітинних ліній і клональної компетенції, завдяки чому можна прогнозувати повне відновлення клітинних популяцій, включаючи функціональні стовбурові клітини [4, 5]. Крипта є найбільшим проліферуючим компартментом (СК і уніпотентні попередники). Ворсинка презентує компартмент диференціації (мультипотентні клітини, які сюди переміщаються з кількох крипт). У кожній крипті є щонайменше одна СК. СК крипт характеризуються властивостями "стовбуровості" і недиференційованоcті (по відношенню до інших типів епітеліальних клітин, але не обов'язково – до ембріональних клітин). Кількість СК у крипті може бути різною в залежності від обставин. Існують докази того, що серед СК визначаються 2 популяції – довготривало "спокійні" (зарезервовані, резервні) і активно вступаючі в цикл. Ці клітини локалізуються в стовбурових нішах з унікальним мікрооточенням. Зв'язок між цими СК недостатньо вивчений, особливо епітеліо-мезенхімні взаємодії [6]. За сучасними поглядами, одна крипта в дорослих осіб містить 4-6 справжніх (функціонуючих) СК (рис. 16). Ці клітини локалізуються на висоті діаметрів 4 клітин вище основи крипти, просторово розподілені серед своїх дочірніх, утворюючи кільце приблизно з 16 клітин. Вони лежать вище основи клітин Панета і розташовуються не завжди в одній площині. Їхні дочірні клітини в нормі проходять обмежену кількість поділів, хоча їх ліміт залишається невизначеним [7, 8]. Наступний ряд клітин знаходиться в ділянці середини крипт і з них можуть дозріти один із чотирьох типів клітин. Із до-

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

243

зріванням клітини втрачають свою "стовбуровість" і у верхній ділянці крипт вони вже не мають можливості регенерації крипти (тобто не є клоногенними). Рівні розташування клітин позначають від І+ до 6+. У крипті міститься до 30-40 клоногенних клітин Незрілі дочірні клітини І-ІІІ покоління від справжніх СК можуть повернути свою стовбуровість у разі необхідності (напр., після пошкодження). Позиція клітин у крипті

Shh

10 9 8

Проліферація 0%

7 6

Диференціація клітин

5 4 Wnt

3 21 1

Проліферація 60%

Дно крипти

Рис. 16. Позиція клітин у крипті кишки, їхня проліферація та диференціація.

Рис. 16. Позиція клітин у крипті кишки, їхня проліферація та диференціація. Примітка: - транскрипційні Цікаво,Shh, щоWnt існує можливість фактори. частково диференційованих Примітка: Shh, Wnt - транскрипційні фактори.

клітин дедиференціюватися і поповнювати запас справжніх СК. Наступний ряд клітин знаходиться в ділянці середини крипт і з них Цей аспект є дещо несподіваним стосовно традиційного розумінможуть дозріти один із чотирьох типів клітин. Із дозріванням клітини ня функцій СК [8]. втрачають свою "стовбуровість" і у верхній ділянці крипт вони вже не мають ділятьсякрипти мітозом, щоб задовільнити самопідтримку і сарегенерації після радіаційного пошкодження (тобто не є можливостіСК мовідтворення цих клітин. клітин Для цього СК мають асимеклоногенними). Рівні розташування позначають від І+ділитися до 6+. У крипті міститься до і30-40 клітин СК, Незрілі дочірні клітини І-ІІІ трично одна зклоногенних них залишається а друга диференціюється покоління від справжніх СКМатематичне можуть повернути свою стовбуровість у разі до зрілої (дорослої). моделювання однак показало, необхідності (напр., після пошкодження). що приблизно 5 % СК крипт діляться симетрично і тоді СК у Цікаво,стає щоменше існує вможливість диференційованих клітин крипті результатічастково їхньої диференціації, переміщендедиференціюватися і поповнювати запас справжніх СК. Цей аспект є дещо ня і апоптозу. При змінах в оточенні може переважати один із несподіваним стосовно традиційного розуміння функцій СК [8]. СК діляться мітозом, щоб задовільнити самопідтримку і самовідтворення цих клітин. Для цього СК мають ділитися асиметрично і одна з них залишається СК, а друга диференціюється до зрілої (дорослої). Математичне моделювання однак показало, що приблизно 5 % СК крипт

244

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

типів поділу СК. Надлишок СК може бути врегульований шляхом спонтанного апоптозу, можливо, iз видаленням клітин, які мають пошкодження ДНК (до 5-10 %). Такий суворий контроль є життєво важливим, оскільки одна додаткова СК може призвести до надлишку 6-120 клітин у крипті. Апоптоз у товстій кишці, за даними K. Booth, C.S. Potten [9], пригнічується bcl–2. Це процес, який може еволюціонувати, щоб захистити крипту від постійної необхідності симетричних поділів клітин у ферментному цитотоксичному середовищі товстої кишки. Однак, у результаті bcl–2–індукованої супресії спонтанного апоптозу пришвидшується переміщення клітин із крипт до поверхні, що може призвести до гіперплазії. Таке співвідношення ризику і користі апоптозу випливає, без сумніву, із процесу еволюції, але при сучасних медичних досягненнях збільшення тривалості життя, захисний ефект придушення апоптозу має більший ризик для розвитку раку, ніж для саморегуляції вмісту крипт товстої кишки. Доведено, що кількість СК у крипті жорстко регулюється і це впливає на структурну організацію крипт. Зміни в ділянці СК можуть стосуватися їх кількості, часової тривалості циклу, кількості поділів до етапу диференціації і числа ліній від кожної стовбурової клітини. Оскільки ці клітини зберігаються протягом життя, то кількість СК може відповідати числу клітин, які здатні генерувати карциноми. СК кишки розташовуються в стовбурових нішах і мають визначене мікрооточення (додаток 12). Стовбурова ніша включає клітинні і неклітинні компоненти, що взаємодіють із метою контролю СК у дорослих і ці взаємодії складаються з механічних і дифундуючих факторів [10]. Основою регуляції кишкових СК є постійні перехресні взаємини між епітеліальними і мезенхімними клітинами в стовбуровій ніші, які опосередковуються Wnt, Sonic hedgebog, Notch, Pt3K i PMP шляхами [11]. Порушення цих тонких взаємодій можуть ініціювати кишкові пухлини з додатковими генетичними пошкодженнями або екологічною активацією ембріональних процесів, таких як епітеліо–мезенхімні. Кишкова проліферативна ніша складається з епітеліальних клітин, які розмножуються і диференціюються, і оточені кліти

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

245

нами мезенхімного походження, що забезпечують епітеліо–мезенхімні зв'язки [2]. Розрізняють 2 типи СК крипт кишки – активні, що вступають у поділ (первинні) і довгоживучі спокою (резервні) [12, 6]. Клітини, що виникли в результаті асиметричного чи симетричного поділу, розрізнити важко, але відомо, що їх діяльність регулюється факторами росту і цитокінами, завдяки паракринній регуляції [13]. За спостереженнями R.C. Mifflin et al. [14], до клітин мікрооточення належать також фібробласти і міофібробласти – клітини мезенхімного походження з власної пластинки слизової оболонки кишки, які містять α–актин (αSMA+). Такі субепітеліальні міофібробласти необхідні для розвитку СК і дочірніх клітин, особливо GEP–ендокриноцитів [15]. Це підтверджено дослідами P. Simon–Assmann et al. [16], які відтворювали в культурі клітин крипт комплекс мікрооточення стовбурової ніші з обов'язковою присутністю фібробластів. Незважаючи на численні наукові розробки в галузі СК кишки, до цього часу залишаються невирішеними багато питань. У крипті з кількома СК, центральним питанням постає чи кожна СК у звичайних умовах генерує тільки один тип клітин із різних диференційованих фенотипів, чи кожна СК повністю плюрипотентна і здатна дати початок усім типам кишкових клітин. Попередньо встановлено, що одна СК, безумовно, здатна виробляти кілька типів і, малоймовірно, що СК крипт є уніпотентними [9]. Але останнім часом з'явилися повідомлення, що в криптах існують різні види СК, які проліферують і диференціюються в різні клітинні лінії епітелію тонкої кишки [7, 17]. До цього часу остаточно не розкритий механізм, за яким клітина здійснює і приступає до реалізації програми диференціації [18]. Епітеліальний покрив кишки швидко оновлюється у всіх хребетних за допомогою спеціальних сигналів [19, 20, 21]. Одними з перших факторів були вивчені деякі фактори гомеобокс транскрипції. Гомеобокс гени визначають долю клітини і загальне структуроутворення в багатьох тканинах. Гомеобокс-вмісним білкам cdх–1 i cdx–2 надають регуляторну роль в епітеліальній диференціації. Питання механізмів регуляції проліферації і диференціації клітин крипт постійно поповнюється новими фактами. M.

246

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Brittan, N.A. Wright [22] сигнальними шляхами для СК крипт визначили Notch/Delta i Wnt, F. Radtke, H. Clevers [23] – Wnt, Notch/Delta і кістково–морфогенетичні білки, S.J. Leedham et al. [13] - Notch/Delta та кістково–морфогенетичні білки. D. Pinto, H. Clevers [24, 25] повідоміли, що ключова роль у контролі стану СК і диференціації кишкового епітелію належить сигнальному шляху Wnt/β–катеніну і їхні зміни можуть привести до канцерогенезу в людини і миші. Кишкові крипти являють собою нішу, в якій епітеліоцити прабатьків реагують на сигнали Wnt для реплікації і підготовки клітин до диференціації, а мутації в генах Wnt шляху призводять до раку [26]. T. Fevr et al. [27] підтвердили, що в 90 % випадків колоректального раку в людини виявили порушення Wnt сигнального шляху. У пухлинах людини часто активується сигнал фактора–перетворювача транскрипції і активатора транскрипції (STAT3). STAT3 також підтримує плюрипотентність і самооновлення ембріональних СК мишей і абсолютно необхідна для контролю клітин на 4+ і 6+ рівні кишкових крипт [28]. Позитивно впливає на регенерацію кишкового епітелію глюкагон–подібний пептид-2, але водночас він може сприяти канцерогенезу товстої кишки [29]. Тобто, через високу безпрецедентну швидкість оновлення епітелію кишки, цей орган водночас має високу сприйнятливість до канцерогенезу. Довести присутність у крипті різних типів клітин можна лише з допомогою маркерів [30]. Асиметричний поділ показує, що існує переважне спадкування тих чи інших дочірніх клітин: кожна клітина отримує цитоплазматичну і ядерну інформацію (чи обидві), яка визначає чи стане дочірня клітина комітувальною транзитною, чи залишиться СК. Одним із перших маркерів, який ідентифікували в справжніх кишкових СК, був маркер Musashi–1, який раніше був презентований у нейроендокринних СК [31 - 34]. Пізніше в ролі маркерів запропонували CD45+ [35], BMPR1α, phosphoPTEN, DCAMKL1, Eph рецептори та інтегрини [36]. Із панелі кишкових Wnt–генів виокремили Lgr–5 (leucine– rich–repeat–containing G–protein–зв'язаний рецептор 5, також відомий як Gpr49) [37]. Використавши 2 точки в алелях, N. Barker et al. [38- 40], A. Haegebath, H. Clevers [41], A.P. Garrison et al. [30] розкрили винятково високу експресію Lgr5 у клітинах,

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

247

що розташовані в ділянці дна крипт. В експерименті автори показали, що Lgr5+ клітини крипт генерують усі епітеліальні лінії протягом 60 діб, що наводить на думку, що вони представляють СК тонкої і товстої кишки. До того ж експресія Lgr5 виявлена в інших дорослих тканинах і тканинах пухлин. Імуногістохімічно Lgr5 спостерігали в тонкій і товстій кишці людини в нормі та при передракових станах – їх кількість збільшується, особливо на поверхні кишки, а не в криптах [42]. N.Y. Hou et al. [43] стверджують, що ті клітини, в яких імуногістохімічно визначили Lgr5, можуть бути СК лише тоді, коли вони експресують СD133+ і СD44+ і Lgr5 одночасно, що потребує подальшого вивчення. CD133+ (prominin–1) був одним із перших у класі білків мембран, які визначили в СК гематопоетичної і нервової системи в людини, що може бути використано в алогенній трансплантації [44]. Приблизно в 7 % ракових клітин у мишей виявлено CD133+, як додатковий маркер для визначення клітин пухлин [45]. Водночас, E. Sangiorgi [46], H. Tian et al. [47] спостерігали в криптах два пули СК: перші, які експресують Lgr5, швидко діляться, другі – Вmi1, які локалізуються над основою крипт. Автори стверджують, що клітини з Lgr5 не є обов'язковими для нормального кишкового гомеостазу і за їхньої відсутності клітини, що експресують Вmi1, можуть служити альтернативою цим клітинам. Тобто, СК із Вmi1 у людини є резервом у разі пошкодження епітелію тонкої кишки, а клітини, які не пов'язані з патологічними станами експресують Lgr5 [48]. Водночас у мишей СК експресують Lgr5, Bmi+1 і WIP–1 [32]. В останніх дослідженнях із використанням генних мікрочіпів було проаналізовано 85 генів, експресія яких пов'язана з асиметричним поділом при самооновленні. Із них два білки, окрім Lgr5 i H2AZ, найбільшe відповідають клітинам із таким типом поділу – CXCR6 i BTG2 [49]. Нині в мишей розрізняють дві клітинні лінії (Lgr5 i Asc12+): із високою швидкістю поділу і mTERT – із повільною швидкістю поділу [50, 35]. Тоді як високопроліферативні Lgr5+ клітини, пе реважно, відіграють роль у тканинному гомеостазі, mTERT клітини більш резистентні до пошкодження і беруть участь у

248

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

відновленні після пошкодження. На думку авторів, ці знання допомагають нашому розумінню відновлення епітелію тонкої кишки і можуть бути використані в поліпшенні стану кишки при її захворюваннях і у хворих зі злоякісними пухлинами. Виявили, що в двох нижніх третинах крипт маркером СК спокою є doublecortin i Cam kinase–like–1 (DCAMKL-1) [51]. Цей маркер може бути використаний при виділенні нормальних СК кишки і являє собою інструмент дослідження у відновній медицині і терапії раку. Кишковий епітелій є найбільш швидким у самооновленні тканин. Показано близько 6 циклів СК у кишковій крипті. Lgr5+ СК у крипті перемежовуються з клітинами Панета і діляться кожного дня. Як популяція, Lgr5+ СК зберігаються довічно і в криптах оновлюються протягом 1-6 місяців. Більшість Lgr5+ СК діляться симетрично і не підтримують модель, в якій дві дочірні клітини мають різну долю. Клітинна динаміка узгоджується з моделлю, в якій резидентні СК подвоюються щодня [30]. Поодинокі Lgr5+ також можуть розташовуватися за межа ми крипт і давати початок епітеліальним клітинам [52]. Культивування Lgr5+ клітин можна використати для довготривалого самоорганізуючого розвитку епітеліоцитів крипт і ворсинок при відсутності неепітеліальних клітин ніші. Lgr5+ визначили в СК Панета в людини і мишей in vivo та in vitro. Окрім того клітини Панета з маркером CD24+ експресують EGF, TGF-α, WNT3, Notch ligand Dll4, які потрібні для розвитку СК у культурі. Культивування СК із клітин Панета значно полегшує утворення нових клітин. Ці впливи, які виходять із клітин Панета, можуть замінити екзогенний Wnt [53]. Якщо шляхам розвитку ентероцитів з облямівкою присвячено багато наукових праць, то стосовно інших клітин – GEP–ендокриноцитів, келихоподібних та Панета - досліджень проведено небагато. Так, відомо, що абсорбтивні ентероцити, келихоподібні, Панета та GEP–ендокриноцити розвиваються зi спільної для усіх клітин СК [54]. Найбільш ранні стадії розвитку GEP–ендокриноцитів регулюються Notch сигнальним шляхом. Notch є неактивним у попередників GEP–ендокриноцитів. Клітини, які диференціюються, активують Notch у сусідніх клітинах для вимкнення проендо-

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

249

кринних факторів і пригнічення ендокринної диференціації. В ендокринній специфікації бере участь фактор Match–1, щоб далі клітина могла диференціюватися в одну з трьох клітин – келихоподібну, Панета чи ендокриноцит. На наступному етапі ендокринної диференціації потрібен Neurogenin 3, а також транскрипційні фактори Pax4, Pax6, BETA2/neuroD homedox 1 [55]. Neurogenin 3 має важливе значення для розвитку GEP–ендокриноцитів тому, що він зменшує число келихоподібних клітин, що розвиваються, і водночас збільшує кількість GEP–ендокриноцитів шляхом спрямування диференціації біпотенційних попередників у бік переважного розвитку GEP–ендокриноцитів, а не келихоподібних клітин [56]. Стовбурові і дочірні клітини для GEP–ендокриноцитів локалізуються в криптах на позиції 4+, але мігрують вниз до дна крипт і маркерами для них є маркери ендокринної системи [57]. Винятково мало робіт присвячено розвитку келихоподібних клітин слизової оболонки кишки [58]. До цього часу невідомі фактори програмування секреторних клітин кишки. Перетворення на секреторну клітину передбачає перепрограмування біпотентних клітин–попередниць [59]. Клітини Панета розвиваються як одна з ліній СК [60]. Стало відомо, що для диференціації клітин Панета потрібен Sох9 [61], а для них і келихоподібних клітин Е–кадгерин [62]. Маркером постмітотичних GEP–ендокриноцитів і клітин Панета вважають Sох9 [61, 63]. У 30 % СК крипт, з яких розвиваються клітини Панета, виявлено CD24+ [64, 65]. R.C. Mustafa et al. [66] ідентифікували Lgr4 у клітинах Панета, як дозвільний фактор Wnt шляху в кишці при визначeнні потенціальної мішені для терапії раку кишки. Таке ж значення приписують і CD166+ активатору молекул клітинної адгезії лейкоцитів на поверхні епітеліальних клітин [67]. CD166+ виявляється в СК крипт і клітинах Панета в людини і мишей у нормі і при пухлинах і має терапевтичний потенціал лікувальної мішені за колоректaльного раку. Нині існує гостра необхідність технологій вирощування клітин кишки in vitro [68]. Хоча кишкові СК вивчаються понад 30 років, але способи їхньої ізоляції залишаються невирішеною проблемою [69]. Були зроблені спроби виростити в культурі кишкові

250

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

клітини зі СК і доведено, що спочатку утворюються агрегати, а з них формується «химерна» слизова оболонка [70]. Нині дослідження спрямовані на ізоляцію і характеристику СК епітелію кишки, що передбачає використання результатів цих досліджень у новітніх лікувальних технологіях хвороб шлунково-кишкового тракту [71]. Можливо, буде використана терапія СК при різних хворобах – від відновлення пошкодженої слизової оболонки до тканинної інженерії штучних конструкцій тонкої кишки у хворих із синдромом короткої кишки [72], травм і запалення кишки, некротичних ентероколітів [73]. У подальшому лікування СК може мати застосування за радіаційних пошкоджень тонкої кишки та інших патологічних станів, які супроводжуються атрофією її слизової оболонки та у хворих на злоякісні пухлини [74]. Першою демонстрацією можливостей використання тканинної інженерії були експерименти з трансплантацією сегменту тонкої кишки чи шлунка [75]. Із цією метою забирали короткий сегмент кишки або шлунка в свиней йоркширської породи віком 6 місяців, поміщали в спеціальні контейнери, які імплантували внутрішньоочеревинно. Через 7 тижнів проводили гістологічні та імунологічні дослідження. Утворені структури були подібні до нативної кишки. Гістологічно показано, що слизова оболонка складалася з циліндричного епітелію з усіма клітинними типами і прилеглою сполучною та м'язовою тканиною і була іннервована. У стовбурових нішах виявили міофібробласти. • Матеріали опубліковані в статті Дєльцова О.І. Стовбурові клітини кишки / О.І.Дєльцова, С.Б. Геращенко, Ю.Б. Чайковський // Клінічна анатомія та оперативна хірургія. - 2013. - Том 12, №2(44). - С. 76-82. Література 1. Chia L.A. Intestinal stem cell / L.A. Chia, C.J. Kuo // Prog. Mol. Biol. Trans. Sci. – 2010. – Vol. 96. – P. 157–173. 2. Yen T.H. The gastrointestinal tract stem cell niche / T.H. Yen, N.A. Wright // Stem Cell Rev. – 2006. – Vol. 2(3). – P. 203–212. 3. Хэм А. Гистология в 5 томах, пер. с англ. / А. Хэм, Д. Кормак. – М. : Мир, 1983. – Т. 4. – 245 с.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

251

4. A comprenhensive model of spatio-temporal stem cell and tissue organisation in the intestinal crypt / P. Buske, J. Galle, N. Barker [et al.] // PloS Comput. Biol. – 2011. – Vol. 7(1). – Р. 1001–1045. 5. Simons B.D. Stem cells self-renewal in intestinal crypt / B.D. Simons, H. Clevers // Exp. Cell Res. – 2011. – Vol. 317(19). – P. 2719–2724. 6. Shaker A. Intestinalstem cells and epithelial-mesenchymal interactions in the crypt and stem cell niche / A. Shaker, D.S. Rubin // Transl. Res. – 2010. – Vol. 156(3). – P. 180–187. 7. Freeman H.J. Crypt region localization of intestinalstem cells in adult / H.J. Freeman // World J. Gastroenterol. – 2008. – Vol. 14(47). – P. 7160–7162. 8. Current review: intestinalstem cells and signaling / D.H. Scoville, T. Sato, X.C. He [et al.] // Gastroenterology. – 2008. – Vol. 134(3). – P. 849–864. 9. Booth K. Gut instincts: thoughts on intestinal epithelial stem cells / K. Booth, S.C. Potten // J. Clin. Invest. – 2000. – Vol. 105(11). – P. 1493–1499. 10. Walker M.R. Stem cell niche / M.R. Walker, K.K. Patel, T.S. Stappendeck // J. Pathol. – 2009. – Vol. 217(2). – P. 169–180. 11. Brablets S. Gastrointestinal stem cells in development and cancer / S. Brablets, O. Shumalhofer, T. Brabletz // J. Pathol. – 2009. – Vol. 217(2). – P. 307–317. 12. Potten C. Adult Small Intestinal Stem Cells: Identification, Location, Characteristics, and Clinical Applications / C. Potten, J. Ellis // Springer Series on Biofilms. – 2006. – Vol. 60. – P. 81–98. 13. Intestinalstem cells / S.J. Leedham, M. Brittan, S.A. McDonald [et al.] // J. Cell Mol. Med. – 2005. – Vol. 9(1). – P. 11–24. 14. Intestinal myofibroblasts: target for stem cell therapy / R.C. Mifflin, I.V. Pinchuk, J.I. Saada [et al.] // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. – 2011. – Vol. 300(5). – P. 684–696. 15. Intestinal type fibroblasts selectively influence proliferation rate and peptide synthesis in the murine entero–endocrine cell line STC-1 / C. Ratineau, M. Plateroti, J. Dumortier [et al.] // Differentiation. – 1997. – Vol. 62(3). – P. 139-147.

252

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

16. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation / P. Simon–Assmann, N. Turck, M. Sidhoum–Jenny [et al.] // Cell Biol. Toxicol. – 2007. – Vol. 23(4). – P. 241–256. 17. Freeman H.J. Crypt region localization of intestinalstem cells in adult / H.J. Freeman // World J. Gastroenterol. – 2008. – Vol. 14(47). – P. 7160–7162. 18. Umar S. Intestinalstem cells / S. Umar // Curr. Gastroenterol. Rep. – 2010. – Vol. 12(5). – P. 340–348. 19. Karpowicz P. All for one, and one for all : the clonality of the intestinalstem cell niche / P. Karpowicz, N. Perrimon // F 1000 Biol. Rep. – 2010. – Vol. 2. – P. 73. 20. Crosnier C. Organizing cell renewal in the intestine: stem cells, signals and combinatorial control / C. Crosnier, D. Stamataki, J. Lewis // Nat. Rev. Genet. – 2006. – Vol. 7(5). – P. 349–359. 21. van der Flier L.G. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium / L.G. van der Flier, H. Clevers // Annu. Rev. Physiol. – 2009. – Vol. 71. – P. 241–260. 22. Brittan M. Gastrointestinal stem cells / M. Brittan, N.A. Wright // J. Pathol. – 2002. – Vol. 197(4). – P. 492–509. 23. Radtke F. Self-renewal and cancer of the gut: two sides of a coin / F. Radtke, H. Clevers // Science. – 2005. – Vol. 307(5717).– P. 1904–1909. 24. Pinto D. Wnt control of stem cells and differentiation in the intestinal epithelium / D. Pinto, H. Clevers // Exp. Cell Res. – 2005. – Vol. 306(2). – P. 357–363. 25. Pinto D. Wnt, stem cells and cancer in the intestine / D. Pinto, H. Clevers // Biol. Cell. – 2005. – Vol. 97(3). – P. 185–196. 26. Phases of canonical Wnt signaling during the development of mouse intestinal epithelium / B.M. Kim, J. Mao, M.M. Taketo [et al.] // Gastroenterology. – 2007. – Vol. 133(2). – P. 529–538. 27. Wnt/beta-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinalstem cells / T. Fevr, S. Robine, D. Louwaed [et al.] // Mol. Cell Biol. – 2007. – Vol. 27(21). – P. 7551–7559. 28. Matthews J.R. Absolute requirement for STAT3 function in small-intestine crypt stem cell survival / J.R. Matthews, O.J. Sansom, A.R. Clarke // Cell Death Differ. – 2011. – Vol. 18(12). – P. 1934-1943.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

253

29. Rowland K.J. The "cryptic" mechanism of action of glucagon-like peptide-2 / K.J. Rowland, P.L. Brubaker // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. – 2011. – Vol. 301(1). – P. 1–8. 30. Garrison A.P. Intestinalstem cells / A.P. Garrison, M.A. Helmrath, C.M. Dekaney // J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. – 2009. – Vol. 49(1). – P. 3–7. 31. Sakakibara S. Expression of neural RNA–binding proteins in the postnatal CNS: implications of their roles in neuronal and glial cell development / S. Sakakibara, H. Okano // J. Neurosci. – 1997. – Vol. 17. – P. 8300–8312. 32. Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker Musashi–1 / C.S. Potten, C. Booth, G.L. Tudur [et al.] // Differentiation. – 2003. – Vol. 71. – P. 28–33. 33. Stem cells of small intestinal crypt : where are they? / C.S. Potten, R. Gandara, Y.R. Manida [et al.] // Cell Prolif. – 2009. – Vol. 42(6). – P. 731–750. 34. Higher expression patterns of the intestinalstem cell markers Musashi-1 and hairy and enhancer of split1 and their correspondence with proliferation patterns in the mouse jejunum / T. Yu, Q.K. Chen, Y. Gong [et al.] // Med. Sci. Monit. – 2010. – Vol. 16(2). – P. BR68–74. 35. Isolation and characterization of a putative intestinalstem cell fraction from mouse jejunum / C.M. Dekaney, J.M. Rodriguez, M.C. Graul [et al.] // Gastroenterology. – 2005. – Vol. 129(5). – P. 1567–1580. 36. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells / R. Montgomery, D. Carlone, C. Richmond [et al.] // Proc. Nat. Acad. Sci. – 2011. – Vol. 108. – P. 179–184. 37. Intestinal crypt homeostasis results from neutral completition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells / H.J. Snippert, L.G. van der Flier, T. Sato [et al.] // Cell. – 2010. – Vol. 143(1). – P. 133–144. 38. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5 / N. Barker, J.H. van Es, J. Kuipers [et al.] // Nature. – 2007. – Vol. 449. – P. 1003–1007.

254

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

39. Becker L. Immunostaining of Lgr5, an intestinalstem cell marker, in normal and premalignant human gastrointestinal tissue / L. Becker, Q. Huang, H. Mashimo // Sci. World J. – 2008.– Vol. 8. – P. 1168–1176. 40. Very Long–term Self-renewal of Small Intestine, Colon and Hair Follicles from Cycling Lgr5+ve Stem Cells / N. Barker, J.H. van Es, V. Jaks [et al.] // Cold Spring Harb. Symp. Quant Biol. – 2008. – Vol.73. – P. 351–356. 41. Haegebath A. Wnt signaling, lgr5, and stem cells in the intestine and skin / A. Haegebath, H. Clevers // Am. J. Pathol. – 2009. – Vol. 174(3). – P. 715–721. 42. Recker L. Immunostaining of Lgr5, an intestinal stem cell marker, in normal and premalignant human gastrointestinal tissue / L. Recker, Q. Huang, H. Mashimo // Sci. World J. – 2008. – Vol. 23(8). – P. 1168–1176. 43. CD133+ CD44+ subgroups may be human small intestinalstem cells / N.Y. Hou, K. Yang, T. Chem [et al.] // Mol. Biol. Rep. – 2011. – Vol. 38(2). – P. 997–1004. 44. Mizrak D. CD133: molecula of the moment / D. Mizrak, M. Brittan, M.R. Alison // J. Pathol. – 2008. – Vol. 214(1). – P. 3–9. 45. Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation / L. Zhu, P. Gibson, D.S. Currle [et al.] // Nature. – 2009. – Vol. 457(7229). – P. 603–607. 46. Sangiorgi E. Bmi1 is expressed in vivo in intestinalstem cells / E. Sangiorgi, M.R. Capecchi // Nat. Genet. – 2008. – Vol. 40(7). – P. 915–920. 47. Tian H.A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr–5 positive cell dispensable / H. Tian, B. Biens, S. Warming // Nature. – 2011. – Vol. 478(7368). – P. 215–259. 48. Stem cells of small intestinal crypt : where are they? / C.S. Potten, R. Gandara, Y.R. Manida [et al.] // Cell Prolif. – 2009. – Vol. 42(6). – P. 731–750. 49. A resource for discovering specific and universal biomarkers for distributed stem cells // M. Noh, J.L. Smith, J.H. Huh [et al.] // PLoS One. – 2011. – Vol. 6(7). – P. 220–277. 50. Montgomery R.K. Small intestinal stem cell markers / R.K. Montgomery, D.T. Breault // J. Anat. – 2008. – Vol. 213(1). – P. 52–58.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

255

51. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells / R. Montgomery, D. Carlone, C. Richmond [et al.] // Proc. Nat. Acad. Sci. – 2011. – Vol. 108. – P. 179–184. 52. Doublecortin and CaM kinase–like–1 and leucine-rich– repeat-cоuntaining G-protein–coupled receptor mark quiescent and cycling intestinalstem cells, respectively / R. May, S.M. Sureban, N. Hoang // Stem Cells. – 2010. – Vol. 27(10). – P. 2571–2579. 53. Intestinal crypt homeostasis results from neutral completition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells / H.J. Snippert, L.G. van der Flier, T. Sato [et al.] // Cell. – 2010. – Vol. 143(1). – P. 133–144. 54. Single Lgr5 stem cells build crypt–villus structures in vitro without a mesenchymal niche / T. Sato, Vries R.G., H.J. Snippert [et al.] // Nature. – 2009. – Vol. 459 (7244). – P. 262–265. 55. Paneth cells constitute the niche for lgr5 stem cells in intestinal crypts / T. Sato, J.H. van Es, H.J. Snipper [et al.] // Nature. – 2011. – Vol. 469 (7330). – P. 415–418. 56. Sabot T. Identification and classification of lysozyme– expressing cells in the mouse small intestinal crypt and their correlation with the morphology of secretory granules and labeling density of immunology / T. Sabot, E. Kawamoto, J. Yamata // Kaibogaku Zasshi. – 2009. – Vol. 84(3). – P. 83–91. 57. Schonholf S.E. Minireview: Development and differentiation of gut endocrine cells / S.E. Schonholf, M. Giel-Moloney, A.B. Leiter // Endocrinology. – 2004. – Vol. 145(6). – P. 2639–2644. 58. Intestinal Neurogenin 3 directs differentiation of a bipontential secretory progenitor to endocrine cell rather than goblet cell fate / L. Lopez-Diaz, R.N. Jain, T.M. Keeley [et al.] // Dev. Biol. – 2007. – Vol. 309(2). – P. 298–305. 59. Stem cell marker-expressing subset of enteroendocrine cells resides at the crypt base in the small intestine / Y. Sei, X. Lu, A. Liou [et al.] // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. – 2011.– Vol. 300(2). – P. 345–356. 60. Yeung T.M. Regulation of cell-renewal and differentiation by the intestinal stem cell niche / T.M. Yeung, L.A. Chia, C.M. Kosinski // Cell Mol. Life Sci. – 2011. – Vol. 68(15). – P. 2513–2523.

256

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

61. VanDussen K.L. Mouse atonal homolog 1 directs intestinal progenitors to secretory cell rather than absorptive cell fate / K.L. VanDussen, L.C. Samuelson // Dev. Biol. – 2010. – Vol. 346(2). – P. 215–223. 62. Paneth cell differentiation in the developing intestine of normal and transgenic mice / L. Bry, P. Falk, K. Huttner [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1994. – Vol. 91(22). – P. 10335–10339. 63. SOX9 is required for the differentiation of paneth cells in the intestinal epithelium / Y. Mori-Akiyama, M. van den Born, J.H. van Es [et al.] // Gastroenterology. – 2007. – Vol. 133(2). – Р. 539–546. 64. A key role for E-cadherin in intestinal homeostasis and Paneth cell maturation / M.R. Schneider, M. Dahlhoff, D. Horst [et al.] // PLoS One. – 2010. – Vol. 5(12). – P. 1432–1435. 65. Distinct SOX9 levels differentially mark stem/progenitor populations and enteroendocrine cells of the small intestine epithelium / E.J. Formeister, A.L. Sionas, D.K. Lorance [et al.] // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. – 2009. – Vol. 296(5).– P. 1108–1118. 66. Sorting mouse jejunal cells with CD24 yields a population with characteristics of intestinal stem cells / R.J. von Furstenberg, A.S. Gulati, A. Baxi [et al.] // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. – 2011. – Vol. 300(3). – P. 409–417. 67. Sato T. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts / T. Sato, J.H. Es, H.J. van Snippert [et al.] // Nature. – 2011. – Vol. 469(7330). – P. 415–418. 68. Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo / R.C. Mustafa, T. Van Loy, A. Lefort [et al.] // EMBO. – 2011. – Vol. 12(6). – P. 558–564. 69. Characterization of the intestinal cancer stem cells marker CD166 in the human and mouse gastrointestinal tract / T.G. Levin, A.E. Powell, P.S. Davies [et al.] // Gastroenterology. – 2010. – Vol. 139(6). – P. 2072–2082. 70. Intestinal epithelial cells in vitro / D.P. Copra, A.A. Dombrkowski, P.M. Stemmer [et al.] // Stem Cells Dev. – 2010. – Vol. 19(1). – P. 131–142. 71. Slorach E.M. A mouse model of intestinal stem cell function and regeneration / E.M. Slorach, F.C. Champbell, J.R. Dorin // J. Cell Sci. – 1999. – Vol. 112. – P. 3029–3038.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

257

72. Quante M. Stem cells in gastroenterology and hepatology / M. Quante, T.C. Wang // Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. – 2009. – Vol. 6(12). – P. 724–737. 73. Day R.M. Epithelial Stem Cells and Tissue Engineering Intestine / R.M. Day // Curr. Stem. Res. Ther. – 2006. – Vol.1. – P. 113–120 74. Intestinalstem cells and their roles during mucosal injury and repair / M.D. Neal, W.N. Richardson, C.P. Sodni [et al.] / J. Surg. Res. – 2011. – Vol. 167(1). – P. 1–8 75. Tissue-engineering small intestine and stomach form from autologous tissue in a preclinical large animal model / F.G. Sala, S.M. Kunisaki, E.R. Ochoa [et al.] // J. Surg. Res. – 2009. – Vol. 156(2). – P. 205–212. Японські вчені з університету міста Йокогама нещодавно заявили, що вони здатні виростити людську печінку зі стовбурових клітин. Опубліковано 22.11. 2013. http://ua.euronews.com/2013/07/10/japanese-stem-cell-expertsmake-liver-growth-breakthrough Амеріканські вчені успішно пересадили щурам печінку, вирощену в лабораторії. http://medic-ua.com/1481

Печінка. Печінка є найбільшою залозою, яка виконує метаболічні, екзо- та ендокринні функції, серед яких найбільш важливими є вироблення жовчі, метаболізм складових живлення організму, детоксикація, регуляція рівня глюкози завдяки накопиченню глікогену і контроль гомеостазу організму через секрецію факторів згортання і білків крові. Відомо, що гепатоцити, які забезпечують ці функції, складають понад 70 % маси печінки. Гепатоцити разом з епітеліоцитами жовчних проток (холангіоцитами) походять з ембріональної ендодерми, тоді як клітини строми, навколосинусоїдні жиронакопичувальні клітини (зірчасті клітини, клітини Іто), зірчасті макрофагоцити (клітини Купфера) і ендотеліоцити синусоїдів печінки мають мезодермальне походження. H.Liu et al. [1] вважають, що первинні гепатоцити є похідними ендодерми, плюрипотентними і не відрізняються від ембріональних СК із точки зору морфології колоній, можли

258

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

востей росту, експресії транскрипційних плюрипотенційно-по в’язаних факторів і поверхневих маркерів та потенціалу диференціації в тілі ембріона. В ембріональному розвитку печінки прослідковуються процеси прямої диференціації печінкових ембріональних СК та індукції плюрипотентних клітин у гепатоцитоподібні клітини [2]. У зв’язку з потребою клітинної терапії в останній час швидкими темпами розвиваються і вдосконалюються технології для індукції в плюрипотентних чи ембріональних СК їхньої диференціації в гепатоцити. У майбутньому плюрипотентна пластичність СК відкриє широкі клінічні перспективи в лікуванні пошкоджених і дегенеруючих тканин. У гепатології надії покладають на печінкові СК, які можуть бути використані для генної терапії, клітинної трансплантації, біологічної “штучної” печінки (системи для заміщення функцій ураженої печінки з використанням ізольованих гепатоцитів), шляхів тестування в токсикологічних дослідженнях [3]. Останнім часом усе частіше повідомляється про позитивні результати клітинної терапії в тварин на моделях захворювань печінки і прогнозується їхнє застосування в людини [4 - 8]. Печінка дорослих тварин і людини має чудові регенераторні можливості і відновлюється, навіть, після видалення 70 % її маси [9, 10]. Повне відновлення втрати тканин печінки відбувається протягом одного року і супроводжується проліферацією зрілих гепатоцитів, диференціацією овальних (клітин-попередниць із можливостями диференціації в гепатоцити та епітеліоцити жовчних проток) і синусоїдних клітин (додаток 13). Після часткової гепатектомії в експерименті і в людини печінка швидко регенерує. У першу чергу, має місце компенсаторна гіперплазія гепатоцитів. Відомо, що гепатоцити, які знаходяться в G0 періоді клітинного циклу і функціонують до смерті, можуть повернутися в клітинний цикл [11] і вступати в мітоз. Регенерація печінки має визначені фази: 1) ініціації, яка регулюється цитокінами (IL–6, TNF–a), 2) експансії – збільшення популяції гепатоцитів (під впливом фактору росту гепатоцитів і трансфор муючого фактору росту альфа); 3) кінцева (термінальна) – збільшення клітинної маси, проліферація клітин (регулюється трансформуючим фактором росту бета і активінами). Вищезгадані

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

259

процеси морфогенезу спрямовані на виконання ремоделюючого відгуку, результатом якого є реконструкція васкуляризованої печінкової часточки [12]. Головні непаренхіматозні клітини печінки (зірчасті макрофагоцити, ендотеліоцити синусоїдів, клітини Іто) беруть участь у проліферації гепатоцитів після гепатектомії. Вони мають як позитивний, так і негативний вплив на проліферацію гепатоцитів, завдяки їх забезпеченню резервним екстрацелюлярним фактором росту гепатоцитів, який активується після пошкодження. Це відбувається на ранніх стадіях через швидкий синтез ДНК у гепатоцитах, синтез TNF–a і IL–6, а пізніше - утворення факторів, які стримують синтез ДНК у гепатоцитах (IL–1, TGF–b) та ініціюють реконструкцію і реформацію білків матриксу [13, 14]. Роль клітин Купфера в регенерації печінки довели C.Meijer et al. [15], які спостерігали в експерименті на щурах із пошкодженими клітинами Купфера розбалансованість експресії цитокінів, що привела до затримки регенерації печінки після часткової гепатектомії. Клітини Купфера стимулюють регенерацію печінки шляхом розширення експресії фактора росту гепатоцитів завдяки посередництву TNF–a незалежного механізму [16]. За хронічних захворювань печінки cпостерігається активація зірчастих клітин (клітин Іто), яка корелює з проліферацією клітин-попередниць гепатоцитів у процесі їх регенерації [17, 18]. Важливим питанням є вивчення факторів, що регулюють регенерацію печінки. У першу чергу, це фактор росту гепатоцитів, який є потенційним мітогеном для різних клітин. Він впливає на овальні клітини in vitro через активацію PIЗK/AKT сигнального шляху [15]. Важливу роль у регенерації печінки відіграють також епідермальний фактор росту, трансформуючий фактор росту альфа, IL–6, TNF–a, iнсулiн, норепінефрин та інші [19, 20]. Водночас, дексаметазон пригнічує індукцію і експансію овальних клітин, але не впливає на проліферацію клітин жовчних проток [21]. Нейропептиди бомбезин і нейротензин справляють дію на овальні клітини, гепатоцити і холангіоцити таким чином: а) проліферація овальних клітин зменшується; б) проліферація гепатоцитів збільшується зі зменшенням апоптозу і в) проліферація холангіоцитів зменшується, а їх апоптоз збільшується [22].

260

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Однак можливості відновлення печінки при її численних хворобах обмежені втратою життєздатності гепатоцитів і виникненням печінкової недостатності. Клітини-попередниці гепатоцитів присутні в здоровій печінці і активуються при її захворюваннях, коли регенераційні властивості зрілих гепатоцитів і/чи холангіоцитів погіршуються [23]. Найкращим методом лікування на сьогоднішній день є трансплантація печінки, імплантація ізольованих гепатоцитів або використання біологічної “штучної” печінки, які призводять до відновлення функцій органа. Але існують проблеми донорства і труднощі в культивації зрілих гепатоцитів, що серйозно обмежує застосування цих способів лікування. Тканина печінки, яка розвивається зі СК, має можливості необмеженого джерела матеріалу для трансплантації. Дослідники працюють над питаннями регенерації гепатоцитів від СК дорослих осіб, плодів і ембріонів [24]. Раніше S.S.Thorgeirsson [25], узагальнюючи дані щодо присутності в печінці, як в інших тканинах і органах, клітин із властивостями СК, представив докази того, що вони відрізня ються від класичних систем СК і їхня активація зростає після втрати маси печінки. Загалом СК печінки діляться на основі їх походження і функціональних властивостей на 2 види: перший –це ембріональні СК, які походять із внутрішньої клітинної маси бластоцисти, тоді як другі – є СК у дорослих [26]. Водночас морфологічно клітини-попередниці печінки схожі і не відрізняються в різних видів тварин і людини – у собак, котів, мишей, щурів [27]. Якщо використати модель пошкодження печінки і одночасного блокування проліферації гепатоцитів, то спостерігається мобілізація печінкових клітин-попередниць, до яких відносять і овальні клітини [28]. Овальні клітини є незрілими епітеліоцитами, які розташовуються в найменших розгалуженнях біліарного дерева в печінці людини. Вони наявні в печінці при її захворюваннях. Овальні клітини здатні до активації і напрямок їх подальшої диференціації корелює з важкістю пошкодження і типом ураженої зрілої клітини (гепатоцит чи епітеліоцит жовч ної протоки). Вони здатні диференціюватися в гепатоцити і епітеліоцити вивідних проток, тобто є біпотенційними. Ці клітини

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

261

з двома напрямками подальшого розвитку беруть початок від гепатобластів, залишаються недиференційованиз’являлисьфетальних окремі великі клітини, які які експресували цитокератин-19 (маркер мижовчних в ніші СК усередині проток [29]. епітеліоцитів проток). Із метою вивчення потенціалу проліферації та диференціації L.Song et al. [30] виділили СК і клітини-попередниці з печінки дорослих мишей і культивували їх in vitro (рис. 17).

Стовбурові клітини печінки C/EBPβ HGF Ламінін Колаген IV Колаген І

AFP+, ALB-,CK19-

Клітини-попередниці (овальні) AFP+,ALB+, CK19-

HGF OSM Клітини-попередниці гепатоцитів OSM

ALB+, CK19Гепатоцити ALB+, αAT+ G6P+, TO+ ТАТ+

? Клітини-попередниці епітеліоцитів проток ALB-, CK19+ Епітеліоцити проток CK19+, GGT19+

Рис. 17. Фактори, які сприяють самооновленню і диференціації стовбурових клітин печінки. Позначення: C/EBPβ - печінковий транскрипційний фактор, HGF - фактор росту гепатоцитів, OSM - олігопептид з активністю трансформуючого фактору росту Рис. 17. Фактори, які сприяють самооновленню і диференціації і онкос татину m, AFP - альфафетопротеїн, ALB - альбумін, CK19 - цитокерастовбурових клітин печінки. тин19, αAT -C/EBPβ α-1- антитрипсин, G6P -транскрипційний глюкозо-6-фосфат,фактор, TO - триптофан-2,3Позначення: - печінковий HGF диоксигеназа, ТАТ трансактиватор транскрипції, GGT19 гаммаглутамілтрансфактор росту гепатоцитів, OSM - олігопептид з активністю трансформуючого фераза 19.

фактору росту і онкостатину m, AFP - альфафетопротеїн, ALB - альбумін, CK19 цитокератин19, αAT - α-1- антитрипсин, G6P - глюкозо-6-фосфат, TO триптофан-2,3-диоксигеназа, ТАТ - трансактиватор транскрипції, GGT19 гаммаглутамілтрансфераза 19.

262

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Було встановлено, що через одну добу в гепатоцитах виявлена позитивна реакція специфічних маркерів альбуміну гепатоцитів, яка активувалася на 2–3–ю доби і ці клітини зберігали життєздатність протягом 60 діб. Із 5–ї доби всі клітини колонії експресували маркер печінкових СК (альфа-протеїн). До 13–15–ї діб окремі клітини втратили можливість поділу і диференціювалися в клітини з великою за об’ємом цитоплазмою, двома ядрами і морфологічно були подібні до зрілих гепатоцитів. На 30–у добу в колоніях з’являлись окремі великі клітини, які експресували цитокератин-19 (маркер епітеліоцитів жовчних проток). Таким чином, підтверджено, що ізольовані з печінки мишей клітини, які мають назву клітин-попередниць зрілої печінки дорослих, є клітинами з високим рівнем проліферативної активності і біпотенціальні щодо шляхів диференціації. При визначенні фенотипової приналежності клітин-поперед ниць під час їхнього розвитку розрізняють низку маркерів для гепатоцитів і холангіоцитів. Так, у популяції овальних клітин печінки після часткової гепатектомії в цитоплазмі виявили активатори плазміногену і плазміну [31], в епітеліоцитах біліарного типу ідентифікували аквапорин–1 та β4–інтегрин, який характерний для зрілих епітеліальних клітин жовчевивідних проток [32]. Найновіші дані стосуються виявлення в гепатоцитах, що диференціююються, Musachi1 RNA–зшивного білка, тоді як у зрілих гепатоцитах він відсутній [33]. Навколо фетальних гепатоцитів, які вирощувались у культурі, імунохімічним методом виявлено високі рівні альбуміну і цитокератину 18 – фенотипових маркерів гепатоцитів та фібронектину, особливо при утворенні печінкових пластинок [34]. Сигнали, що поступають до СК печінки від білків екстрацелюлярного матриксу (ламінін, фібронектин), беруть участь у диференціації клітин і кооперують із сигналами від факторів росту [35]. Лікування СК має за мету усунути пошкоджені печінкові клітини і скоригувати розбалансованість регенерації/деградації екстрацелюлярного матриксу [36]. Для СК важливе значення має мікрооточення, так звана стовбурова ніша [37], яка відіграє визначальну роль у підтриманні і відновленні гомеостазу печінки [38]. У печінці ця ніша являє собою фізіологічну/анато

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

263

мічну нішу, яка вміщає справжні СК/клітини-попередниці (або обидві) [39]. У мікрооточенні гепатоцитів спостерігаються різноманітні білки і активні речовини, які регулюють життєдіяльність печінки та її регенерацію, модулюють збереження архітектоніки печінки на стадії диференціації. Навколо гепатоцитів після часткової гепатектомії ламініну визначається мало, тоді як у синусоїдах регенеруючої печінки він виявляється через 6 год, досягає максимуму через 24 год і зменшується до 6–ї доби. Зміни вмісту інших білків екстрацелюлярного матриксу (колаген І, ІІІ, ІV і V типу) виявляються не раніше 24 год [40]. Якщо відтворити події після гепатектомії, то слід зауважити, що завдяки проліферації гепатоцитів утворюються клітинні кластери, які містять 10–14 гепатоцитів. У них не виявляються синусоїди і структури екстрацелюлярного матриксу. Через 4 доби клітини Іто посилають тонкі відростки між гепатоцитами в кластері. «Інвазія» співпадає з активацією генів у клітинах Іто, що кодують ланцюги ламініну. Пенетрація клітин Іто в кластери відбувається після фенестрації ендотеліоцитів і в такий спосіб відновлюються нормальні взаємини гепатоцитів із судинами. Як тільки встановлюється нормальний судинний малюнок, дія генів ламініну виключається. Звідси висновок про те, що секретовані ланцюги ламініну можуть служити сигналом для васкуляризації кластерів фенестрованими синусоїдами [41]. Нині відомо, що існують дві популяції печінкових клітин-попередниць – внутрішньопечінкові (походять із біліарного дерева) і позапечінкові (СК червоного кісткового мозку), які підтримують постійність популяції клітин печінки [42]. Привертають увагу дослідження способів перетворення соматичних клітин на гепатоцити. Можливість утворення плюрипотентних СК із соматичних клітин складає основу для регенерації органів без використання імуносупресорів. Однак, до цього часу не доведено, чи диференційовані з плюрипотентних клітини можуть ефективно усувати функціональну недостатність живого органа. Результати досліджень S.Espejel et al. [43] показали, що плюрипотентні СК забезпечують повноцінне швидке і стабільне клінічне відновлення печінки. Пересадка активованих плюрипотентних клітин є альтернативою

264

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

трансплантації печінки і має перспективи автологічної терапії з виключенням імунної реакції і корекції генних дефектів [44]. Для цієї мети пропонують СК червоного кісткового мозку та мезенхімні клітини з жирової тканини [45, 46]. Гемaтопоетичні СК, які ізолюють із червоного кісткового мозку, можуть диференціюватися в клітини різних тканинних ліній і мають великий потенціал для клітинної терапії в регенеративній медицині. Z.C.Liu, T.M.Chang [47] створили мікрокапсули зі СК червоного кісткового мозку, вводили їх внутрішньоочеревинно при печінковій недостатності в щурів і спостерігали трансдиференціацію цих СК у гепатоцити. У дослідах in vitro автори виявили подовження тривалості життя і функціонування гепатоцитів. Виходячи з результатів експериментальних досліджень, зроблено новий крок і запропоновано хворим на цироз печінки трансплантацію клітин, які відновлюють популяцію пошкоджених гепатоцитів [48]. На думку A.W.Duncan et al. [49], дефініціями клітин, що забезпечують регенерацію печінки є: 1.клітини, відповідальні за нормальне відновлення тканини; 2.клітини, які індукують від нов лення після часткової гепатектомії; 3.клітини-попередниці гепатоцитів; 4.клітини, які утворюють гепатоцитні і епітеліальні фенотипи in vitro; 5.клітини печінки, які можна трансплантувати. На кінець слід зазначити, що процеси проліферації і диференціації СК контролювати важко і тому виникає ризик їх злоякісної трансформації і розвитку гепатоцелюлярної карциноми [50], що може обмежити їх клінічне застосування. • Матеріали розділу опубліковані в статті Дєльцова О.І. Стов бурові клітини і регенерація печінки / О.І. Дєльцова, С.Б. Гера щенко, Г.Б. Кулинич // Науковий вісник Ужгородського університету. Серія Медицина. - 2012. - Вип. 1(43). - С. 175-179. Література 1. Generation of endoderm-derived human induced pluripotent stem cells from primary hepatocytes / H. Liu , Z. Ye, Y. Kim [et al.] // Hepatology. – 2010. – Vol. 51 (5). – P.1810–1819. 2. Liver development, regeneration, and carcinоgenesis / J.W.Kung, I.S. Currie, S.J. Forbes [et al.] // J. Biomed. Biotechnol.– 2010. – Vol. 98. – P. 42–48.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

265

3. Karp S.J. Clinical implications of advances in basic science of liver repair and regeneration / S.J. Karp // Am. J. Transplant.– 2009. – Vol. 9 (9). – P. 1973–1980. 4. Human liver stem cells originate from the canals of Hering / N. De Alwis, G. Hudson, A.D. Burt [et al.] // Hepatology. – 2009.– Vol. 50 (3). – P. 992–993. 5. Ogawa S. Potentials of regenerative medicine for liver disease // S. Ogawa, S. Miyagawa // Surg. Today. – 2009. – Vol. 39 (12). – P. 1019–1025. 6. Stem cells and hepatic cirrhosis / Z. Cheng, L.Z. Qi, R. Zeng [et al.] // Panminerva Med. – 2010. – Vol. 52 (2). – P. 149–165. 7. Quante M. Stem cells in gastroenterology and hepatology / M. Quante, T.C. Wang // Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. – 2009.– Vol. 6 (12). – P. 724–737. 8. Pluripotent plasticity of stem cells and liver repopulation / L. Gennero, M.A. Ross, K. Sperber // Cell Biochem. Funct. – 2010.– Vol. 28 (3). – P. 178–189. 9. Fausto N. The role of hepatocytes and oval cells in liver regeneration and repopulation / N. Fausto, J.S. Campbell // Mech. Dev. – 2003. – Vol. 120 (1). – P. 117-130. 10. Michalopoulos G.K. Liver regeneration: Alternative epithelial pathways // Int. J. Biochem. Cell Biol. – 2011. – Vol. 43 (2). – P. 173–179. 11. Gilgenkrantz H. Rodent models of liver repopulation / H. Gilgenkrantz // Methods Mol. Biol. – 2010. – Vol. 640. – P. 475– 490. 12. Zimmermann A. Regulation of liver regeneration / A. Zimmermann // Nephrol. Dial Transplat. – 2004. – Vol. 19, Suppl.4. – P. iv 6–10. 13. Malik R. The role of non-parenchymal cells in liver growth / R. Malik, C. Selden, H. Hodgson // Semin. Cell Dev. Biol. – 2002.– Vol. 13 (6). – P. 425–431. 14. Liu Q. Role of cytokines in the pathophysiology of acuteon-chronic liver failure / Q. Liu // Blood Purif. – 2009. – Vol. 28 (4).– P. 331–341. 15. Kupffer cell depletion by CI2MDP-liposomes alters hepatic cytokine expression and delays liver regeneration after partial

266

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

hepatectomy / C. Meijer, M.J. Wiezer, A.M. Diehl [et al] // Liver.– 2000. – Vol. 20 (1). – P. 66–77. 16. The role of Kupffer cells in liver regeneration / T. Takeishi, K. Hirano, T. Kobayashi [et al.] // Arch. Histol. Cytol. – 1999. – Vol. 62 (5). – P.413–422. 17. Hepatic stellate cells’ involment in progenitor-mediated liver regeneration / D.G. Pintilie, T.D. Shupe, S.H. Oh [et al.] // Lab. Invest. – 2010. – Vol. 90 (8). – P. 1199–1208. 18. Tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis is a mitogen for liver progenitor cells / J.E. Tirnitz-Parker, C.S. Viebahn, A. Jakubowski [et al.] // Hepatology. – 2010. – Vol. 52 (1). – P. 291–302. 19. Hepatocyte growth factor exerts a proliferative effect on oval cells through the PI3K/AKT signaling pathway / J. Okano, G. Shiota, K. Matsumoto [et al.] // Exp. Mol. Pathol. – 2010. – Vol. 88 (1). – P. 7–14. 20. Cytokine-dependent activation of small hepatocyte-like progenitor cells in retrorsine-induced rat liver injury / D.H. Best, G.M. Butz, W.B. Coleman // Exp. Mol. Pathol. – 2010. – Vol. 88 (1). – P. 7–14. 21. Dexamethasone inhibits the proliferation of hepatocytes and oval cells but not bile duct cells in rat liver / P. Nagy, A. Kiss, J. Schnur [et al.] // Hepatology. – 1998. – Vol. 28 (2). – P. 423–429. 22. Bombesin and neurotensin exert antiproliferative effects on ovall cells and augment the regenerative response of the cholestatic rat liver / S.F. Assimakopoulos, A.C. Tsamandas, C.D. Georgiou [et al.] // Peptides. – 2010. – Vol. 31 (12). – Р. 2294–2303. 23. The quest for liver progenitor cells: a practical point of view / L. Dolle, J. Best, J. Mei [et al.] // J. Hepatol. – 2010. – Vol. 52 (1). – P. 117–129. 24. Lemaigre F.P. Mechanisms of liver development: concepts for understanding liver disorders and design of novel therapies / F.P. Lemaigre // Gastroenterology. – 2009. – Vol. 137 (1). – P. 62–79. 25. Thorgeirsson S.S. Hepatic stem cells in liver regeneration / S.S. Thorgeirsson // FASEB J. – 1996. – Vol. 10. – P. 1249–1256. 26. Saxena A.K. Role of stem cell research in therapeutic purpose – a hope for new horizont in medical biotechnology // A.K.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

267

Saxena, D. Singh, J. Cupta // J. Exp. Ther. Oncol. – 2010. – Vol. 8 (3). – P. 223–233. 27. The progenitor cell compartment in the feline liver: an (immuno)histochemical investigation / J. Ijzer, J.R. Kisjes, L.C. Penning [et al.] // Vet. Pathol. – 2009. – Vol. 46 (4). – P. 614–621. 28. Oval cell-mediated liver regeneration: Role of cytokines and growth factors / K.N.Lowes, E.J. Croager, J.K. Olinyk [et al.] // J. Gastroenterol. Hepatol. – 2003. – Vol. 18 (1). – P. 4–12. 29. Roskams T.A. Progenitor cells in diseased human liver / T.A. Roskams, L. Libbrecht, V.J. Desmet // Semin. Liver Dis. – 2003. – Vol. 23 (4). – P. 385–396. 30. Proliferation and differentiation potential of mouse adult hepatic progenitor cells cultured in vitro / L. Song, H. Wang, X. Gao [et al.] // Acta Biochem. Biophys. Sin (Shanghai). – 2010. – Vol. 42 (2). – P. 122–128. 31. Modulation of the plasminogen activator/plasmin system in rat liver regenerating by recruitment of oval cells / H.C. Bisgaard, E. Santoni-Rugiu, P. Nagy [et al.] // Lab. Invest. – 1998. – Vol. 78 (3). – P. 237–246. 32. In vitro differentiation of WB-F344 rat liver epithelial cells into the biliary lineage / D. Couchie, N. Holic, M.N. Chobert [et al.] // Differentiation. – 2002. – Vol. 69 (4-5). – P. 209–215. 33. Expression of the RNA-binding protein Musashi1 in adult liver stem-like cells / E. Hattori, H.J. Shu, T. Saito [et al.] // Hepatol. Res. – 2010. – Vol. 40 (4). – P. 432–437. 34. Fibronectin regulates morphology, cell organization and gene expression of rat fetal hepatocytes in primary culture / A. Sanchez, A.M. Alvarez, R. Pagan [et al.] // J. Hepatol. – 2000. – Vol. 32 (2). – P. 242–250. 35. Fibronectin and laminin induce expression of islet cell markers in hepatic oval cells in culture / A.R. Leite, M.L. CorreaGiannella, M.L. Dagli [et al.] // Cell Tissue Res. – 2007. – Vol. 327 (3). – P. 529–537. 36. Stem cells for liver repopulation / A. Soto-Gutierrez, N. Navaro-Alvarez, H. Yagi [et al.] // Curr. Opin. Organ Transplant.– 2009. – Vol. 14(6). – P. 667–673.

268

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

37. Fuchs E. Socializing with the neighbors: stem cells and their niche / E. Fuchs, T. Tumbar, G. Guasch // Cell. – 2004. – Vol. 116 (6). – P. 769–778. 38. Greenbaum L.E. The role of stem cells in liver repair and fibrosis / L.E. Greenbaum, R.G. Wells // Int. J. Biochem. Cell Biol.– 2011. – Vol.43 (2). – P. 222–229. 39. Theise N.D. Liver stem cells / N.D. Theise // Cytotechnology.– 2003. – Vol. 41 (2-3). – P. 139–144. 40. Concurrent changes in sinusoidal expression of laminin and affinity of hepatocytes to laminin during rat liver regeneration / S. Kato, K. Otsu, K. Ohtake [et al.] // Exp. Cell Res. – 1992. – Vol. 198 (1). – P. 59–68. 41. Martinez-Hernandez A. The extracellular matrix in hepatic regeneration / A. Martinez-Hernandez, P.S. Amenta // FASEB. – 1995. – Vol. 9 (14). – P.1401–1410. 42. Theise N.D. Gastrointestinal stem cells. III. Emergent themes of liver stem cell biology niche, quiescence, self-renewal, and plasticity / N.D. Theise // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. – 2006. – Vol. 290 (2). – P. G189–193. 43. Induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes have the functional and proliferative capabilities needed for liver regeneration in mice / S. Espejel, G.R. Roll, K.J. McLaughlin [et al.] // J. Clin. Invest. – 2010. – Vol. 120 (9). – P. 3120–3129. 44. Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology / S. Asgari, B. Pournasr, G.H. Salekdeh [et al.] // J. Hepatol. – 2010. – Vol. 53 (4). – P. 738–751. 45. Ochiya T. Commitment of stem cells into functional hepatocytes / T. Ochiya, Y. Yamamoto, A. Banas // Differentiation.– 2010. – Vol. 79 (2). – P. 65–73. 46. Schwartz R.E. Hepatic stem cells / R.E. Schwartz, C. Verfaillie // Methods Mol. Biol. – 2010. – Vol. 640. – P. 167–179. 47. Liu Z.C. Artificial cell microencapsulated stem cells in regenerative medicine, tissue engineering and cell therapy / Z.C. Liu, T.M. Chang // Adv. Exp. Med. Biol. – 2010. – Vol. 670. – P. 68–79. 48. Kisseleva T. Recent advances in liver stem cell therapy / T. Kisseleva, E. Gigante, D.A. Brenner // Curr. Opin. Gastroenterol. – 2010. – Vol. 26 (4). – P. 395–402.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

269

49. Duncan A.W. Stem cells and liver regeneration / A.W. Dunkan, C. Dorrell, M. Grompe // Gastroenterology. – 2009. – Vol. 137 (2). – P. 466–481. 50. Lotowska J.M. Electron microscopic alterations in intermediate hepatocyte-like cells in children with chronic hepatities B: the first report in pediatric patients / J.M. Lotowska, M.E. Sobaniec-Lotowska, D.M. Lebensztejn // Eur. J. Gastroenterol. – 2010. – Vol. 22 (6). – P. 741–747. Датські вчені заявили про винайдення методу успішного вирощування клітин підшлункової залози на основі стовбурових клітин людини. Опубліковано 17.10.2013 р. Учені виростили з чотирьох стовбурових клітин 40 тисяч клітин підшлункової залози протягом одного тижня в тривимірному гелевому середовищі, досягли утворення сітки тканин, які формували міні-залози, спроможні виробляти гормони (інсулін) і ферменти. http://leocity.info/danski-vcheni-stvoryly-minipidshlunkovu-zalozu-yaka-syntezuje-insulin

Підшлункова залоза. Підшлункова залоза складається з екзо- та ендокринної частини. Її пошкодження викликає важкі захворювання, зокрема запальні, пухлинні і цукровий діабет. Вивчення можливостей регенерації підшлункової залози має велике значення як для хірургії, так і для ендокринології. Питання наявності СК у цьому органі в дорослих хвилює клініцистів, проводяться численні дослідження диференціації клітин-попе редниць як для клітин ендокринної частини залози, так і для її ацинарного та протокового компартментів [1, 2 та інші]. Ендокриноцити острівців Лангерганса, екзокриноцити ацинусів та епітеліоцити проток підшлункової залози виникають із спільних попередників в ембріогенезі і в дорослих [3]. Нині накопичилися відомості про те, що СК підшлункової залози в дорослих розташовуються серед епітеліоцитів її вивідних проток і здатні відтворювати як екзокриноцити ацинусів, так і ендокриноцити острівців [4] (додаток 14). Після перев'язки протоки або пошкодження залози відбувається індукція β-клітинної регенерації з клітин-попередниць із маркером Neurogenin3+ (Ngn3+) – члена сім'ї транскрипційних факторів, маркера клітин-попередниць ендокриноцитів

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

270

підшлункової залози [5]. Відомо, що Ngn 3+ i NeuroD1 під час ембріонального розвитку підшлункової залози сприяють диференціації 4 типів ендокриноцитів острівців [6]. G.Gradwohl et al. [7] показали, що миші, у клітинах яких відсутній Ngn 3+, не в змозі генерувати ендокриноцити і вмирають відразу після народження від діабету. Тобто ключовим регулятором трансдиференціації екзокриноцитів ацинусів у β-клітини в ембріогенезі є Ngn 3+ [8, 9]. Новоутворені β-клітини після пересадки здатні відновити рівень глюкози в крові, що може бути застосовано в лікуванні діабету в людей, якщо модель із гризунів екстраполювати на людину. Найбільш поширеними маркерами клітин підшлункової залози є (табл. 9). Таблиця 9

Найбільш поширені маркери клітин підшлункової залози Маркер Notch

Foxa1

Foxa2 Hnf3a, Hnf3b (ГНФ) Pdx1

Hlxb9 Nkx2.2 Hnf6

Значення Сигнальний шлях, короткий, універсальний, проведення сигналу з поверхні клітини в ядро, експресується під час ембріогенезу і в популяціях клітин, які діляться Білок, ядерний фактор 3-альфа(HNF-3А) гепатоцитів, у людини кодується FOXA1 геном, регулює процес диференціації клітин підшлункової залози Білок, ядерний фактор 3-бета (HNF-3В) гепатоцитів, відомий як фактор транскрипції 3B (TCF-3B), у людини кодується FOXA2 геном, регулює процес диференціації клітин підшлункової залози Ядерні фактори (ГНФ) гепатоцитів, впливають експресію гена інсуліну, а також на гени, що беруть участь у транспорті і метаболізмі глюкози Фактор транскрипції підшлункової залози та дванадцятипалої кишки гомеобокс 1 (Рdx1), відомий у людини як інсуліновий промоутер фактор 1 (Ipf1), необхідний для розвитку підшлункової залози та дозрівання β-клітин Ген у людини рухового нейрона і підшлункової залози гомеобокс 1 (MNX1) Білок, у людини кодується NKX2-2 геном, може бути залучений до морфогенезу ЦНС Транскрипційний фактор, гепатоцитоядерний, регулює транскрипцію у різних групах генів у білках-ферментах і транспортерах, пов'язаних із метаболізмом глюкози

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

271

Білок, у людини кодується NKX6-1 геном, потужний біфункціональний регулятор транскрипції в підшлунковій залозі, потрібний для розвитку бета-клітин Фактор транскрипції, білок, у людини кодується ISL1 геном, містить два Isl1 N-кінцевих домени LIM і один С-кінцевий гомеодоменовий, відіграє важливу роль в ембріогенезі панкреатичних острівців Білок, у людини кодується РAX4 геном, бере участь у розвитку і дифеPax4 ренціації інсуліноцитів миші Білок, у людини кодується PAX6 геном, діє як "майстер-контролер" ген Pax6 для розвитку гомологічних тканин з ектодерми Фактор транскрипції, відомий як Бета2, виражений в інсуліноцитах підNeuroD шлункової залози і ентероендокринних клітинах, бере участь у розвитку підшлункової залози Неструктурний білок, відображає везикулярну модель локалізації в трансP48 фекції клітин при злитті з жовтим флуоресцентним білком репортера Транскрипційний фактор, є основним спіраль-петля-спіраль (bHLH) факMist1 тором, має важливе значення для правильного розвитку екзокринної частини підшлункової залози Фактор транскрипції, ядерний фактор гепатоцитів, людський ген, ексHNF1A пресується на високому рівні в печінці і бере участь у регуляції експресії декількох специфічних печінкових генів Білок, у людини кодується NEUROG3 геном, належить до родини транскрипційних факторів, основний спіраль-петля-спіраль (bHLH), експресуNgn3 ється в ендокринних клітинах-попередницях, необхідний для розвитку ендокринних клітин підшлункової залози і кишки Транспортер глюкози 2, відомий (SLC2A2), у людини кодується SLC2A2 GLUT2 геном, трансмембранний носій білка для пасивного переміщення глюкози через клітинні мембрани Білок, кодується Hes1 геном, член Hes родини генів (HES1-7), кодує ядерні білки, які пригнічують транскрипцію. У клітинах панкреатичних попереHes1 дників, HES1 інгібує експресію Ptf1a, що контролює диференціацію екзокриноцитів, водночас Ngn3 призводить до диференціювання ендокриноцитів острівців Лангерганса Транскрипційній фактор 1-субодиниці альфа підшлункової залози, білок, у людини кодується Ptf1a геном, відіграє роль у ссавців у розвитку підPTF1а шлункової залози, бере участь у підтримці екзокриноцитів підшлункової залози, експресії їхніх конкретних генів, у тому числі для еластази-1 і амілази Nkx6.1

На думку J. Magenheim [10], недостатність експресії Ngn3+ викликає зменшення розгалуження проток залози водночас з активністю епітелію проток і пригніченням Notch сигнального шляху, який сприяє розвитку структур підшлункової залози. І, навпаки,

272

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

змушене збільшення ендокринних клітин-попередниць стає причиною редукції калібру проток і надмірної кількості екзокриноцитів ацинусів. Ці взаємини потребують вивчення, що може відкрити нові підходи до регуляції (координації) морфогенезу і ендо/екзокринної диференціації для збільшення виходу інсуліноцитів зі СК. Особливо важливим є встановлення можливості регенерації ендокринних клітин острівців Лангерганса, зокрема ендокриноцитів В (інсуліноцити, β-клітини), які виробляють інсулін. Механізми регенерації інсуліноцитів вивчені недостатньо, а питання наявності СК для ендокриноцитів острівців залишаються невирішеними [11]. У принципі регенерація інсуліноцитів могла би відбутися за рахунок уже існуючих, але при цукровому діабеті вони відсутні, а інформація щодо СК для ендокриноцитів В суперечлива. Нещодавно відкрили, що ендокриноцити А (глюкагоноцити, α-клітини) можуть претендувати на звання клітин, які за певних умов здатні трансдиференціюватися на β-клітини [12, 13]. Були зроблені спроби трансдиференціювати ендокриноцити А на ендокриноцити В острівців у тварин і в людини [14 - 16]. Існує також думка про те, що в острівцях Лангерганса містяться клітини-попередниці ендокриноцитів [17 - 19]. Із них можна виростити кластери острівцевих клітин [20 - 22]. Серед цих клітин Y. Choi et al. [23] виявили кілька типів клітин із фенотиповими ознаками β-клітин. Кандидатами на СК острівців є екзокриноцити ацинусів та центроацинарні клітини (рис. 18), які могли би трансдиференціюватися на клітини-попередниці чи СК інсуліноцитів, але єдиної думки в цьому питанні немає [24]. До джерел відновлення популяції інсуліноцитів можна віднести і клітини-попередниці епітеліоцитів проток залози [25, 26], тому що за певних умов їх можна перетворити на острівцеві клітини, як і продукують інсулін [27]. У людини виділили і очистили клітини з проток підшлункової залози і серед них виявили клітини-попередниці як для острівців, так і для ацинусів [28]. R. Kikugawa et al. [29] в експерименті в лабораторних умовах in vitro виростили GFP-позитивні клітини (GFP – зелений флуоресцентний білок, який експресується клітиною і дає можливість ідентифікувати клітину, що знаходиться в процесі регенерації) з ацинусів і проток підшлункової залози мишей.

Розділ 3. С товбурові

273

клітини органів і систем дорослого організму

Стовбурові клітини підшлункової залози (епітелій проток і ацинусів) Pdx1 Notch Екзокринна частина Hes1

Ендокринна частина (острівці) Ngn3

Клітинипопередниці Ptf1a, p48

Клітинипопередниці NeuroD Brn4 ISL1 Pax6

Епітеліоцити проток і ацинусів

Глюкагоноцити

? Ендокриноцити РР

ISL1 Pax4

Соматостатиноцити Pdx1 GLUT2 Інсуліноцити

Рис. 18. Самооновлення і диференціація клітин підшлункової залози. Позначення: див. табл. 9.

Через один тиждень у культурі отримали кластери або окремі клітини, в якихі диференціація виявляли інсулін-1 (частіше інсулін-2), Рис. 18. Самооновлення клітин підшлункової залози. панкреатично-дуоденальний homeоbox-1 (PDX-1, чинник регуляції Позначення: див. табл. 9. розвитку ендокриноцитів острівців, регулятор експресії ключоЧерез у культурі отримали кластери абоепітеліальних окремі виходин генівтиждень інсуліноцитів) і цитокератин 19 (маркер клітини, в клітин, яких виявляли інсулін-1 (частіше інсулін-2), панкреатичнопроміжний білок їхнього цитоскелету). дуоденальний homeоbox-1 (PDX-1, чинник регуляції розвитку Маркерами для ендо- та екзокринних СК підшлункової заендокриноцитів острівців, регулятор експресії ключових генів інсуліноцитів) лози19M. Zhao et al. [30] вважали Sox2, білок CD34їхнього mРНК, при проміжний цитокератин (маркер епітеліальних клітин, Oct4, чому Sox2 (+VE), Oct4, переважно, для епітеліоцитів стінки цитоскелету).

274

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

дрібних проток. Пізніше до цього переліку додалися передбачувані маркери CD133, нестин, Notch1-4, Jagged 1 i 2, ABCG2 i альдегіддегідрогеназa (ALDH1) [31 -33]. H. Zulewski [34] вивчав ендокриноцити острівців щурів (у тому числі й інсуліноцити) і встановив, що в нормі вони живуть 40-50 днів, підлягають апоптозу і нові клітини острівців дифе ренціюються від клітин-попередниць, які розташовуються в протоках залози. Автори показали, що в острівцях містяться клітини, подібні до нервових СК із маркером – нестин. Ці клітини не експресують ні гормони, ні маркери ендотеліальних клітин. У протоках залози виявили клітини з маркерами колагену ІV, галаніну і нестину, водночас ці клітини не експресують цитокератин-19, характерний для епітеліоцитів. Після ізоляції такі клітини in vitro протягом 8 місяців здатні до проліферації, можуть бути неодноразово клоновані і брати участь у регенерації інсуліноцитів. Зауважимо, що оскільки інсуліноцити можуть утворюватися з епітеліоцитів панкреатичних проток, то в разі необхідності їх можна отримати при хірургічних операціях на підшлунковій залозі [35]. Сьогодні окреслюються 3 стратегії (шляхи) вирішення замінної терапії β-клітин при цукровому діабеті: 1. Отримання донорських СК та їхня трансплантація. 2. Стимулювання ендогенної регенерації. 3. Перепрограмування не β-клітин (соматичних СК різних органів) на β-клітини [36]. У кожному з цих шляхів є позитивні і негативні сторони. Отримання донорських стовбурових β-клітин і їхня пересадка є привабливим підходом до лікування діабету [37, 38]. Але існує проблема забору донорських органів для клітин острівців, питання профілактики смерті інсуліноцитів і підтримки довгострокової ендокринної функції після їхньої пересадки [39]. A. Santana et al. [40] отримали такі клітини від ембріонів і дорослих. Перші забори клітин були виконані від трупних донорів і згідно встановлених протоколів пересаджені реципієнтам, але виникала проблема отримання чистої популяції функціонуючих інсуліноцитів і попередження їхнього імунного відторгнення, утворення пухлин і біобезпеки механізмів пересадки [41]. За таких самих умов забору спробували виростити клітини в культурі і 8 % із них мали фенотип інсуліноцитів із ядерним маркером

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

275

Oct4/Sox2/Nanog [42]. Культивовані клітини острівців людини утворювали протоко-подібні структури, які складалися, голов ним чином, із цитокератин- (епітеліоцити) і нестин-позитивних (інсуліноподібні) клітин [43]. Ці результати підтверджують концепцію морфогенетичної пластичності острівців у дорослих. Питання пересадки острівцевих клітин дорослих нині серйозно розробляються та обговорюються. S. Matsumoto [44] впевнений у тому, що можна пересаджувати як алогенний, так і автологічний острівець. Трансплантація алогенного острівця має свої недоліки: важкі методи і недостатня ефективність ізоляції острівців, необхідність кількох донорів підшлункової залози і небажані ефекти імунодепресантів. До того ж існує проблема забезпечення донорським матеріалом. У зв'язку з цим передбачається, що наступним кроком буде отримання β-острівців зі СК людини, за допомогою методів генної індукції. Автологічні острівці мають певні переваги. Їх можна пересадити після тотальної панкреатектомії для лікування хронічних панкреатитів, доброякісних пухлин і при травмах підшлункової залози, але ці операції можна виконати за наявності спеціального обладнання. Автор називає умови ефективної автологічної пересадки: відсутність автоімунних захворювань у пацієнтів і реакції відторгнення; не вимагається введення гіпоглікемічних препаратів; залоза менше зазнає стресу через вплив цитокінів; період холодової підготовки короткий; острівці можна ізолювати безпосередньо і трансплантувати, уникаючи культивування; залоза у хворих із панкреатитом може містити більше клітинпопередниць. Найбільшими при цьому залишаються труднощі ізоляції острівців [45]. Передбачається використання для трансплантації при цукро вому діабеті клітин червоного кісткового мозку, ембріональних, гепатоцитів, панкреатичних та індукованих плюрипотентних СК [46, 47]. Не менш привабливими є пропозиції щодо збільшення маси β-клітин шляхом стимуляції їхньої проліферації і диференціювання чи інгібування загибелі цих клітин. Із цією метою очищені зірчасті клітини підшлункової залози щурів in vitro піддавали впливу інсуліну, трансферину, селену – GPL-1 (глюкагон-подіб

276

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

ний пептид-1) і виростили клітини, які мали багато фенотипових маркерів інсуліноцитів, а також незначну інсуліно-секреторну реакцію [17]. Зроблено спробу використати фактори росту GLP-1, BTC, HGF i EGF i форсувати експресію ендокриноцитів В транскрипційними факторами, такими як Pdx-1, NeuroD i MafA, що призвело до регенерації β-клітин in vivo [48]. Тобто ставиться задача реплікації та регенерації β-клітин, що можна досягти шляхом їхньої активації [49 - 51]. Особливо цікавими є пошуки методів отримання СК чи попередників ендокриноцитів В методами перепрограмування з соматичних клітин [52]. У недавніх експериментальних дослідженнях було продемонстровано, що при повному руйнуванні β-клітин у мишей зберігається внутрішній потенціал диференціювання панкреатичних епітеліоцитів шляхом перепрограмування на клітини, які виробляють інсулін [53]. Незважаючи на відомості про те, що дорослі СК ендокриноцитів В існують у підшлунковій залозі і можуть виробляти інсулін in vitro, дослідники пропонують використати СК інших органів (гепатоцити печінки, червоного кісткового мозку, кишки) і трансдиференціювати їх на інсулінпродукуючі [54 - 57]. З'явилися повідомлення про те, що інсуліноцити можна трансдиференціювати зі СК жовчних проток і жовчного міхура [58, 59]. В експерименті трансдиференціювали клітини селезінки в екзокриноцити і ендокриноцити В підшлункової залози, піддаючи їх впливу транскрипційних факторів PВ1, PDX-1, Пакс-4, СПП-3 із пуповинної крові, які важливі для їхньої диференціації. Новоутворені клітини стали експресувати нестин (інсуліноподібні) і цитокератин 8 і 18 (епітеліоцити) [60]. In vitro W. Goo et al. [61] перетворили СК шкіри на інсулін-продукуючі. Розробляються нові методи перепрограмування клітин на інсуліноцити В шляхом вірусних і невірусних впливів на генному рівні [62]. Таким чином, дослідження СК підшлункової залози дорослих стають першорядною проблемою вивчення їх ролі в лікуванні цукрового діабету, пухлин, запальних процесів та захворювань травматичного походження цього органа і надають оптимізму щодо якості і прогнозу життя хворих із такими захворюваннями.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

277

• Матеріали розділу опубліковані в статті Чайковський Ю.Б. Стовбурові клітини підшлункової залози дорослих та їх роль у лікуванні цукрового діабету / Ю.Б. Чайковський, С.Б. Геращенко, О.І. Дєльцова // Галицький лікарський вісник. - 2012. - Том 19, №1. - С. 5-8. Література 1. Peshavaria M. Manipulation of pancreatic stem cells for cell replacement therapy / M. Peshavaria, K. Pang // Diabetes Technol. Ther. – 2000. – Vol. 2(3). – P. 453-460. 2. Zhang Y.Q. Identification and expansion of pancreatic stem progenitor cells / Y.Q. Zhang, M. Kritzik, N. Sarvetnick // J. Cell Mol. Med. – 2005. – Vol. 9(2). – P. 331-344. 3. Grapin-Botton A. Ductal cells of the pancreas / A. GrapinBotton // Int. J. Biochem. Cell Biol. – 2005. – Vol. 37(3). – P. 504-510. 4. Duct cells contribute to regeneration of endocrine and acinar cells following pancreatic damage in adult mice / A. Criscimanna, J.A. Speicher, G. Hoyshmand [et al.] // Gastroenterology. – 2011.– Vol. 141(4). – P. 1451-1462. 5. Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throught development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas / J.L. Kopp, C.L. Dubois, A.E. Schaffer [et al.] // Development. – 2011. – Vol. 138(4). – P. 653-665. 6. Liew C.G. Generation of insulin-producing cells from pluripotent stem cells: from the selection of cell sources to the optimization of protocols / C.G. Liew // Rev. Diabet. Stud. – 2010.– Vol. 7(2). – P. 82-92. 7. Neurogenin3 is requed for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas / G. Gradwohl, A. Dierich, M. LeMeur [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2000. – Vol. 97(4). – P. 1607-1611. 8. Baeyens L. Can beta-cells be derived from exocrine pancreas? / L. Baeyens, L. Bouwens // Diabetes Obes. Metab. – 2008. – Vol. 10 Suppl. 4. – P. 170-178. 9. Baeyens L. Notch signaling as gatekeeper of rat acinar-tobeta-cell conversion in vitro / L. Bayens, S. Bonne, T. Toe [et al.] // Gastroenterology. – 2009. – Vol. 136(5). – P. 1750-1760.

278

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

10. Magenheim J. Ngn 3(+) endocrine progenitor cells control the fate and morphogenesis of pancreatic ductal epithelium / J. Magenheim // Dev. Biol. – 2011. – Vol. 359(1). – P. 26-36. 11. Hori Y. Insulin-producting cells derived from stem/ progenitor cells: therapeutic implications for diabetes mellitus / Y. Hori // Med. Mol. Morphol. – 2009. – Vol. 42(4). – P. 195-200. 12. Chung C.H. Adult pancreatic alpha-cells : a new source of cells for beta-cell regeneration / C.H. Chung, F. Levine // Rev. Diabet Stud. – 2010. – Vol. 7(2). – P. 124-131. 13. In vivo conversion of adult α-cells into β-like cells : a new research avenue in the context of type 1 diabetes / M. Courtney, A. Pfeifer, K. Al-Hasani [et al.] // Diabetes Obes. Metab. – 2011. – Vol. 13 Suppl. 1. – P. 47-52. 14. Sangan C.B. A new paradigm in cell therapy for diabetes: turning pancreatic α-cells into β-cells / C.B. Sangan, D. Tosh // Bioassays. – 2010. – Vol. 32(10). – P. 881-884. 15. Conversion of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss / F. Torel, V. Nepote, I. Avril [et al.] // Nature. – 2010. – Vol. 464(7292). – P. 1149-1154. 16. Gianani R. Beta cell regeneration in human pancreas / R. Gianani // Semin. Immunopathol. – 2011. – Vol. 33(1). – P. 23-27. 17. Doherty K. Growth and development of the islets of Langerhans : implications for the treatment of diabetes mellitus / K. Doherty // Curr. Opin. Pharmacol. – 2001. – Vol. 1(6). – P. 641650. 18. Bonner-Weir S. Pancreatic stem cells / S. Bonner-Weir, A. Sharma // J. Pathol. – 2002. – Vol. 197(4). – P.519-526. 19. Hanley S. Islet-derived progenitors as a source of in vitro islet regeneration / S. Hanley, L. Rosenberg // Methods Mol. Biol.– 2009. – Vol. 482. – P. 371-385. 20. Wang R. Phenotypic analysis of c-kit expression in epithelial monolayers derived from postnatal rat pancreatic islets / R. Wang, J. Li, N. Yashpal // J. Endocrinol. – 2004. – Vol. 182(1). – P. 113122. 21. Peck A.B. In vitro-generation of surrogate islets from adult stem cells / A.B. Peck, V. Ramiya // Transp. Immunol. – 2004. – Vol. 12(3-4). – P. 259-272.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

279

22. Peck A.B. Animal models to study adult stem cell-derived, in vitro-generated islet implantation / A.B. Peck, L. Yin, V. Ramiya // ILAR. – 2004. – Vol. 45(3). – P. 259-267. 23. Adult pancreas generates multipotent stem cells and pancreatic and nonpancreatic progeny / Y. Choi, M. Ta, F. Atouf [et al.] // Stem Cells. – 2004. – Vol. 22(6). – P. 1070-1084. 24. Houbracken I. The quest for tissue stem cells in pancreas and other organs, and their application in beta-cell replacement / I. Houbracken, L. Bouwens // Rev. Diabet Stud. - 2010. – Vol. 7(2).– P. 112-123. 25. Minami K. Pancreatic acinar-to-beta cell differentiation / K. Minami, S. Seino // Front. Biosci. – 2008. – Vol. 13. – P. 5824-5837. 26. Can pancreatic duct-derived progenitors be a source of islet regeneration ? / B. Xia, X.R. Zhan, R. Yi [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2009. – Vol. 383(4). – P. 383-385. 27. Pancreatic progenitors: The shortest route to restore islet cell mass / V. Venkatesan, R. Gopurappidly, S.K. Goteti [et al.] // Islets. – 2011. – Vol. 3(6). – P. 295-301. 28. In vivo conversion of adult α-cells into β-like cells : a new research avenue in the context of type 1 diabetes / M. Courtney, A. Pfeifer, K. Al-Hasani [et al.] // Diabetes Obes. Metab. – 2011. – Vol. 13 Suppl. 1. – P. 47-52. 29. Differentiation of COPAS-sorted non-endocrine pancreatic cells into insulin-positive cells in the mouse / R. Kikugawa, H. Katsuta, T. Akashi [et al.] // Diabetologia. – 2009. – Vol. 52(4). – P. 645-652. 30. Evidence for the presence of stem-like progenitor cells in human adult pancreas / M. Zhao, S.A. Amiel, M.R. Christie [et al.] // J. Endocrinol. – 2007. – Vol. 195(3). – P. 407-414. 31. Expression of the "Stem cell marker" CD 133 in pancreas and pancreatic ductal adenocarcinomas / H. Immervoll, D. Hoem, P.O. Sakariassen [et al.] // BMC Cancer. – 2008. – Vol. 8. – P. 48. 32. Corbeil D. The intriguing links between prominin-1 (CD133), cholesterol-based membrane microdomains, remodelling if apical plasma membrane protrusions, extracellular membrane particles, and (neuro)epithelial cell differentiation / D. Corbeil, A.M. Marzesco // FEBS Lett. – 2010. – Vol. 384(9). – P. 1659-1664.

280

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

33. Comparative evaluation of cancer stem cell markers in normal pancreas and pancreatic ductal adenocarcinoma / B. Vizio, F.A. Mauri, A. Prati [et al.] // Oncol. Rep. – 2012. – Vol. 27(1). – P. 69-76. 34. Zulewski H. Pancreatic stem cells – a new therapeutic option for the treatment of type 1 diabetes mellitus? / H. Zulewski // Ther. Umsch. – 2002. – Vol. 59(11). – P. 599-602. 35. Noguchi H. Pancreatic stem/progenitor cells for the treatment of diabetes / H. Noguchi // Rev. Diabet Stud. – 2010. – Vol. 7(2). – P. 105-111. 36. Bain D. Potential pathways to restore β-cell mass: pluripotent stem cells, reprogramming and endogenous regeneration / D. Bain, F. Merriam, J. Odorico // Curr. Diab. Rep. – 2011. – Vol. 11(5). – P. 392-401. 37. Roche E. Generation of new islets from stem cells / E. Roche, B. Soria // Cell Biochem. Biophys. – 2004. – Vol. 40 Suppl. 3. – P. 113-124. 38. Holland A.M. Progenitor cells in the adult pancreas / A.M. Holland, L.J. Gonez, L.C. Harrison // Diabetes Metab. Res. Rev. – 2004. – Vol. 20(1). – P. 13-27. 39. Neurogenin3 is requed for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas / G. Gradwohl, A. Dierich, M. LeMeur [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2000. – Vol. 97(4). – P. 1607-1611. 40. Insulin-producing cells derived from stem cells: recent progress and future directions / A. Santana, R. Ensend-Waser, M. Arribas [et al.] // J. Cell Mol. Med. – 2006. – Vol. 10(4). – P. 866-883. 41. Insulin-secreting cells derived from stem cells: clinical perspectives, hypes and hopes / E. Roche, A.T. Reig, A. Campos [et al.] // Transp. Immunol. – 2005. – Vol. 15(2). – P. 113-129. 42. Pluripotency-associated stem cell marker expression in proliferative cell cultures derived from adult human pancreas / M.G. White, H.R. Al-Turaifi, G.H. Holliman [et al.] // J. Endocrinol. – 2011. – Vol. 211(2). – P. 169-176. 43. Hanley S. Cellular origins of adult human islet in vitro dedifferentiation / S. Hanley, A. Pilotte, B. Massie // Lab. Invest.– 2008. – Vol. 88(7). – P. 761-772.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

281

44. Matsumoto S. Clinical allogeneic and autologous islet cell transplantation: update / S. Matsumoto // Diabet. Metab. J. – 2011. – Vol. 35(3). – P. 199-206. 45. Matsumoto S. Autologous islet cell transplantation to prevent surgical diabetes / S. Matsumoto // J. Diabet. – 2011. – Vol. 3(4). – P. 328-336. 46. Cell therapy for diabetes mellitus : an opportunity for stem cells ? / B. Soria, F.J. Bedoya, J.R. Tejedo [et al.] // Cells Tissue Organs. – 2008. – Vol. 188(1-2). – P. 70-77. 47. Stem cell-based treatments for Type-1 diabetes mellitus : bone marrow, embryonic, hepatic, pancreatic and induced pluripotent stem cells / K.J. Godfrey, B. Mathew, J.C. Bulman [et al.] // Diabet Med. – 2011. – Режим доступу до журналу : DOI:10.1111/j. 14645491. 2011. 034.33 x. 48. Jun H.S. In vivo regeneration of insulin-producing betacells / H.S. Jun // Adv. Exp. Med. Biol. – 2010. – Vol. 654. – P. 627-640. 49. Adult human beta-cell neogenesis ?/ C. Demeterco, E. Hao, S.H. Lee [et al.] // Diabetes Obes. Metab. – 2009. – Vol. 11 Suppl. 4. – P. 46-53. 50. Pancreatic beta-cells: from generation to regeneration / P. Collombat, X. Xu, H. Heimberg [et al.] // Semin. Cell Dev. Biol. – 2010. – Vol. 21(8). – P. 838-844. 51. Levetan C. Distinctions between islet neogenesis and β-cell replication: implications for reversal of Type 1 and 2 diabetes / C. Levetan // J. Diabetes. – 2010. – Vol. 2(2). – P. 76-84. 52. Generation of pancreatic islet cells from human embryonic stem cells / D. Zhang, W. Yiang, Y. Shi [et al.] // Sci. China C. Life Sci. – 2009. – Vol. 52(7). – P. 615-621. 53. Desgraz R. β-cells regeneration : the pancreatic intrinsic faculty / R. Desgraz, C. Bonal, P.L. Herrera // Trends Endocrinol. Metabol. – 2011. – Vol. 22(1). – P. 34-43. 54. Porat S. New sources of pancreatic beta cells / S. Porat, Y. Dor // Curr. Diab. Rep. – 2007. – Vol. 7(4). – P. 304-308. 55. Zhang L. Progress in treating diabetes mellitus with adult stem cells / L. Zhang, C. Teng, T. An // Sheng. Wu. Yong. Cheng. Xue. Bao. – 2008. – Vol. 24(2). – P. 177-182.

282

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

56. Sordi V. Diabetes mellitus: an opportunity for therapy with stem cells? / V. Sordi, F. Bertuzzi, L. Piemonti // Regen. Med. – 2008. – Vol. 3(3). – P. 377-397. 57. Zulewski H. Differentiation of embryonic and adult stem cells into insulin producing cells / H. Zulewski // Panminerva Med.– 2008. – Vol. 50(1). – P. 73-79. 58. Yang L. In vitro trans-differentiation of adult hepatic stem cells into pancreatic endocrine hormone-producing cells / L. Yang // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2002. – Vol. 99(12). – P. 80788083. 59. Sahu S. New sources of beta-cells for treating diabetes / S. Sahu, D. Tosh, A.A. Hardikar // J. Endocrinol. – 2009. – Vol. 202(1). – P. 13-16. 60. Transdifferentiation of stem cells in pancreatic cells: state of the art / G. Di Giacchino, C. Di Campi, M.A. Zocco [et al.] // Transplant. Proc. – 2005. – Vol. 37(6). – P. 2662-2663. 61. Efficient differentiation of insulin-producing cells from skin-derived stem cells / W. Goo, C. Miao, S. Liu [et al.] // Cell Prolif. – 2009. – Vol. 42(1). – P. 49-62. 62. Tuduri E. Reprogramming gut and pancreas endocrine cells to treat diabetes / E. Tuduri, T.J. Kieffer // Diabetes Obes. Metab.– 2011. – Vol. 13 Suppl. 1. – P. 53-59. Зі стовбурових клітин людини вперше виростили тканину легень. Опубліковано 04.12.2013. Ученим із Медичного центру Колумбійського університету вперше вдалося отримати функціонуючі клітини легенів і дихальних шляхів зі стовбурових клітин людини. http://health.unian.net/ukr/detail/255287 9 червня у Швеції відбулась унікальна операція по трансплантації трахеї, що була штучно вирощена з власних стовбурових клітин пацієнта. Через майже місяць після пересадки 36-річний пацієнт почував себе чудово. Опубліковано 09.07.2011. http://www.epochtimes.com.ua/science/technology-anddiscoveries/ljudyni-vpershe-peresadyly-shtuchno-vyroshhenutraheju-97227.html Десятилітній британець виростить нову трахею в себе в грудях. Під час підготовки до трансплантації взяли трахею від донора і очистили його від клітин, залишивши тільки сполучнотканинний

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

283

каркас з колагену. Потім цей каркас був оброблений стовбуровими клітинами, узятими з кісткового мозку хлопчика. Лікарі сподіваються, що через місяць після трансплантації стовбурові клітини сформують зовнішню і внутрішню оболонки органу. http://medic-ua.com/964

3.4. Органи дихальної системи Оцінка стану відновлення стінки дихальних шляхів має основоположне значення для розуміння ремоделювання тканин при хронічних захворюваннях легень: хронічному бронхіті, муковісцидозі, емфіземі, хронічному обструктивному захворюванні легень [1, 2], тому в дослідженні СК легень намітився швидкий прогрес [3]. Лікування СК легень є перспективним, але, на жаль, маловивченим [4, 5]. У здорових людей дихальний епітелій відіграє роль бар'єру від зовнішніх шкідливих факторів. При захворюваннях епітелій перебудовується, його захисні реакції порушуються і тому швидкість відновлення епітелію набуває надзвичайно великого значення для пацієнтів із захворюваннями органів дихання. Повна регенерація епітелію являє собою складний процес, який передбачає двох партнерів – епітеліальні СК / клітини-попередниці і фактори, що здатні регулювати цей процес. Серед останніх знач ну роль відіграє позаклітинний матрикс із матричними металопротеїназами [6]. При розгляді відновлення дихальних шляхів і легень виникають певні труднощі. До них належить, перш за все, велика площа до оновлення. Легені є найскладнішим органом тканинної інженерії через їхню складну тривимірну структуру і наявність понад 40 видів клітин [7 - 9]. У дихальній системі повітроносні шляхи вистелені псевдобагатошаровим війчастим епітелієм (респіраторним), який у людини містить 7 типів клітин – війчасті, келихоподібні, вставні (низькі – базальні і високі – проміжні), щіточкові, бронхіолярні екзокриноцити (клітини Клара), ендокринні і дендритні (клітини Лангерганса) [10]. Саме базальні (низькі вставні) є камбіальними клітинами. Залози дихальної системи відкриваються на поверхні епітелію і представлені слизовими і змішаними клітинами (гландулоцити: мукоцити, серомукоцити; міоепітеліоцити) та вивідни-

284

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

ми протоками, вистеленими епітеліоцитами. Власна пластинка епітеліального вистелення і підслизова основа складаються з пухкої сполучної тканини з характерними для неї клітинами: фібробластами, макрофагами, лаброцитами, лімфоцитами, плазмоцитами та іншими. Крім цих клітин у кожному відділі дихальної системи містяться специфічні клітини: у нюховій ділянці носової порожнини – нюхові рецепторні, підтримувальні, базальні; у надгортаннику – клітини багатошарового плоского незроговілого епітелію, у гортані – клітини хрящової (хондроцити і хондроблас ти), гладкої (гладкі міоцити) і посмугованої м'язової тканини (м'язові волокна); у трахеї і бронхах – клітини хрящової і гладкої м'язової тканини, лімфоїдних вузликів (В- і Т-лімфоцити – лімфоїдна тканина, асоційована з бронхами, BALT- система); у легенях – в альвеолах (комірках) пневмоцити (альвеолоцити) І та ІІ типу, коміркові макрофаги, перегородкові клітини, у складі мікрогемосудин – ендотеліоцити. У легенях відновлення відбувається повільно і за умов норми триває біля 13 діб [11, 12, 13, 14]. Регенераційна терапія легень нині спрямована на досягнення 3 цілей: 1.Виявлення та стимуляцію місцевих (ендогенних) СК. 2.Пересадку екзогенних клітин, які могли би поліпшити стан хворого. 3.Імплантацію створених на матриці новоутворених органів (бронхи і трахея). Відсутність консенсусу щодо конкретних маркерів СК і клітин-попередниць обмежує можливість передачі досвіду досліджень між лабораторіями. Крім того, не доведено ефективність окремих методів клітинної терапії для корекції газообміну. Нарешті, не підтверджено можливість заміни цілого автологічного органу в якості довготривалого лікування. Ключовим питанням залишається зниження необхідності заміни легень із допомогою ендогенного клітинного "ремонту" [15]. Багато дослідників схиляються до думки щодо використання ендогенних СК дорослих у лікуванні захворювань легень [16, 5, 17] шляхом їхньої пересадки або стимуляції [18, 19]. Недавній прогрес у дослідженні стовбурових клітин у легенях включає в себе опис легеневих СК/клітин-попередниць, що беруть участь у гомеостазі тa регенерації дихальної системи, але їхні фенотипові ознаки до цього часу не визначені [20]. Легені людини містять недиференційовані СК, які локалізуються в нішах прокси-

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

285

мальних (трахея, бронхи; додаток 15,16) і дистальних (бронхіоли, альвеоли) відділів дихальних шляхів [21, 14, 22 - 24] (рис. 19). Епітеліоцити дихального епітелію

Трахея 1.

Trp63+, Krt5+/Krt14+ NGFR+, Pdpn+, K14+, K18+

Notch1 Трахея бронхи 2.

Епітеліоцити дихального епітелію і нейроендокриноцити

Trp63+, Krt5+/Krt14+ NGFR+, Pdpn+, Scgblal1+

Бронхіола 3.

Клітини Клара і нейроендокриноцити

Scgblal1+, Upka3/Scgb3a2, Ascl1, Gfi1 NeuroD1

Клітини Клара

Itga6b4+, Sftpc‐, Scgblal1+/‐, Krt5‐

Альвеолоцити

Krt5+,Trp63+, Scgblal1+, Sftpc+

Бронхіолоальвеолярна ділянка 4. Альвеола 5.

Sox2

Рис. 19. Локалізація ніш стовбурових клітин та їхні маркери в 5 важливих трофічних ділянках у дихальній системі мишей: 1. Епітелій слизової оболонки вивідних проток залоз трахеї. 2. Епітелій слизової оболонки міжхрящових ділянок. Рис. 19. Локалізація ніш стовбурових клітин та їхні маркери в 5 3. Епітелій бронхіол. важливих трофічних ділянках у дихальній системі мишей: 1. Епітелій Епітелій бронхіоло-альвеолярного з'єднання. слизової4. оболонки вивідних проток залоз трахеї. 2. Епітелій слизової Альвеоли, пневмоцити типу. бронхіол. 4.Епітелій бронхіолооболонки5. міжхрящових ділянок. 2-го 3. Епітелій

альвеолярного з'єднання. 5.Альвеоли, пневмоцити 2-го типу. Ніші в бронхоальвеолярних переходах у людини і миші вмі-

щуть у собі СК/клітини-попередниці і стромальні інтерстиційні

Наведені переконливі докази, що стовбуровими нішами для нових клітини – нещодавно телоцитами. Останні мають СК/клітин-попередниць у дорослихназвані є популяції клітин у підслизових залозах довгі які складаються з подомерів 200 нм, хрящовоївідростки, частини дихальних шляхів (трахея і бронхи)довжиною [27, 28]. Цібіля клітини здатні дощо диференціації в різних кінці напрямках – на ендота мезодермальні за конмають розширені – подоми (podoms), в яких при походженням [29]. У бронхах джерелом відновлення епітеліоцитів є базальні клітини, для яких характерною є експресія цитокератину 5/14 і BCRP-1p63). У розгалуженнях дрібних бронхів на бронхіоли роль СК відіграють клітини-

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

286

фокальній мікроскопії виявлено с-комплект і CD34+. Вважають, що телоцити передають сигнали на сусідні клітини, змінюють їхню транскрипційну активність [25, 26] і можуть мати значення в патогенезі легеневих захворювань [17]. Наведені переконливі докази, що стовбуровими нішами для нових СК/клітин-попередниць у дорослих є популяції клітин у підслизових залозах хрящової частини дихальних шляхів (трахея і бронхи) [27, 28]. Ці клітини здатні до диференціації в різних напрямках – на ендо- та мезодермальні за походженням [29]. У бронхах джерелом відновлення епітеліоцитів є базальні клітини, для яких характерною є експресія цитокератину 5/14 і BCRP-1p63). У розгалуженнях дрібних бронхів на бронхіоли роль СК відіграють клітини-попередниці Клара з маркером Scgb1a1, а в кінцевих бронхіолах - клітини Клара з маркерами SttpC/Scgb1a1 [30, 31]. попередниці Клара з маркером Scgb1a1, а в кінцевих бронхіолах - клітини Сигнальні шляхи мають вкрай важливе значення для процеКлара з маркерами SttpC/Scgb1a1 [30, 31]. сів регенерації клітин легень різних епітеліальних лінійпроцесів в їхній Сигнальні шляхи мають вкрай важливе значення для подальшій Але механізми на регенерації клітиндиференціації легень різних[32]. епітеліальних ліній їх в диференціації їхній подальшій війчасті, келихоподібні власне клітинина Клара до цього часу недиференціації [32]. Але механізмиі їх диференціації війчасті, келихоподібні і власне клітини допоодинокі цього часу роботи, невідомів[33, 34].вказується, Є поодинокіщо роботи, в відомі [33,Клара 34]. Є яких при реяких вказується, що при регенерації клітин Клара важливу роль відіграє генерації клітин Клара важливу роль відіграє Notch сигнальний Notch-сигнальний через стимулювання Hes5 i Pax6 експресії шлях черезшлях стимулювання Hes5 i Pax6 експресії генів [35]генів (рис.[35] 20), (рис. 20), а для їхньої проліферації та диференціації необхідний Sox2 [36]. а для їхньої проліферації та диференціації необхідний Sox2 [36]. Notch1

Hes5, Pax6

Клітинипопередниці

Клітини Клара

PGP9.5

CC10

Рис. 20. Роль Notch1 у регенерації клітин Клара епітелію бронхів. Позначення: Notch1 - сигнальний шлях, Hes5Клара - (hairy/enhancer of split-5), Рис. 20. Роль Notch1 у регенерації клітин епітелію бронхів. PGP9.5 - protein Notch1 gene product (ubiquitin шлях, carboxy-terminal hydrolase 1). of splitПозначення: - сигнальний Hes5 - (hairy/enhancer

5), PGP9.5 - protein gene product (ubiquitin carboxy-terminal hydrolase 1).

При кокультивації СК епітелію дихальної системи з мезенхімними клітинами легень [EpCAM (negative), Sca-1 (positive)] описані колонії

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

287

При ко-культивації СК епітелію дихальної системи з мезенхімними клітинами легень [EpCAM (negative), Sca-1 (positive)] описані колонії епітеліальної, альвеолярної чи змішаної епітеліальних ліній і визначена експресія ними EpCAM (high), CD49f (positive), CD104 (positive), CD24 (low) [37]. Окремо слід наголосити на тому, що під час регенерації клітини мігрують від стовбурової ніші до місця їхньої постійної локалізації. Установлено, що експресія STAT3 гальмує міграцію клітин, а комплекс STAT3 - глікопротеїн-30 виконує в клітині сигнальні функції, які необхідні для відновлення форми і кількості клітин бронхіального епітелію в автономному режимі після пошкодження [12]. E.L. Rawlins et al. [33] підкреслюють, що для трахеї, бронхіол і альвеол існують різні типи СК. Спірною є думка про те, що джерелом відновлення пневмоцитів в альвеолах слугують клітини-попередниці ІІ типу альвеолоцитів [28, 38], хоча в експерименті зроблена вдала спроба трансплантувати альвеолоцити ІІ типу щурам на моделі блеоміцинового фіброзу. Тобто, визначення способів активації ендогенних СК стоїть під першим номером сучасної регенераційної медицини тканин дихальних шляхів. Особливої уваги заслуговують шляхи розвитку нейроендокриноцитів слизової оболонки дихальних шляхів (рис. 21). Другим напрямком відновної медицини, зокрема органів дихання, є пересадка екзогенних клітин ембріональних і дорослих СК. Ембріональні СК визнані "золотим стандартом" для дослідження плюрипотентності, диференціації та можливостей трансплантації. Однак традиційні методи для отримання ембріональних СК залежать від надлишків процедури екстракорпорального запліднення і не сумісні з поколінням генетично різноманітних пацієнтів або конкретних чи специфічних для хвороби СК. Щодо дорослих СК, то існує проблема їхньої кількості при отриманні потрібного матеріалу [39]. Проривом у біології СК є перетворення соматичних клітин людини на плюрипотентні клітини з використанням факторів їхнього "перепрограмування" (перші дослідження з 2006 року). Ці перепрограмовані клітини схожі на ембріональні СК, але вони не отримані з ембріонів і тому називаються індуковані плюрипотентні СК. Великою перспективною для таких клітин є усунен-

першим номером сучасної регенераційної медицини тканин дихальних шляхів. Особливої уваги заслуговують шляхи розвитку нейроендокриноцитів слизової оболонки дихальних шляхів (рис. 21). Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б. 288 Ascl1

Notch

Клітини/ попередниці Клара Sox2

Клітини Клара

Ascl1 Notch

Клітини/ попередниці дихальних нейроендокриноцитів Ascl1, Gfi1 NeuroD1 Дихальні нейроендокриноцити

Ascl1

Клітини/ попередниці Клара

Sox2

Клітини Клара

CGRP, PGP9.5 Рис. 21. Шляхи специфікації (А), комітування (Б) і диференціації (В) дихальних (А), нейроендокриноцитів. Рис. 20. Шляхи специфікації комітування (Б) і диференціації (В)

Позначення: CGRP - calcitonin gene-related peptide, PGP9.5 - proteingene-related gene product, дихальних нейроендокриноцитів. Позначення: CGRP - calcitonin Ascl1 білок, що в людини кодується ASCL1 геном, відіграє важливу роль у дифеpeptide, PGP9.5 - protein gene product, Ascl1 - білок, що в людини кодується ренціації нейронів. ASCL1 геном, відіграє важливу роль у диференціації нейронів.

ня негативних імунологічних впливів, оскільки вони отримані Другим напрямком відновної медицини, зокрема органів автологічно. На даний момент ідеї, технології, логіка,дихання, безпека єі пересадка екзогенних клітин ембріональних і дорослих СК. Ембріональні СК корисність покоління цих СК призвели до їхнього використання визнані "золотим стандартом" для дослідження плюрипотентності, при створенні моделей трансплантації. захворювань і Однак випробуванні нових лікардиференціації та можливостей традиційні методи для ських засобів, але в регенеративній медицині лише прокладаютьотримання ембріональних СК залежать від надлишків процедури ся шляхи до нових методіві лікування екстракорпорального запліднення не сумісні індукованими з поколінням плюрипогенетично різноманітних або [40]. конкретних чи специфічних для хвороби СК. тентнимипацієнтів клітинами Використання таких клітин дозволить Щодоуникнути дорослих багатьох СК, то існує проблема їхньої кількості при отриманні етичних проблем, пов'язаниx з отриманням потрібного матеріалу матеріалу від [39]. ембріонів, але виникають інші перешкоди в заПроривом у біології СК є перетворення соматичних клітин людини лежності від способів перепрoграмування, наприклад при викона плюрипотентні клітини з використанням факторів їхнього ристанні вірусних векторів, клітини можуть стати онкогенами, існують труднощі в отриманні "чистих" популяцій індукованих плюрипотентних СК [41]. Використання сучасних методів вірусної трансдукції 4 транскрипційних факторів у перепрограмуван-

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

289

ні робить ці клітини непридатними для терапевтичних цілей, тому що не задовільняє вимогам безпечності [42]. Плюрипотентні СК можуть давати початок усім клітинним типам організму [43, 44]. Але наслідки перепрограмування на клітинному та генетичному рівні залишаються, в основному, невідомими [45]. Нині широко обговорюються питання дослідження перепрограмованих клітин і висловлюються різні за напрямком думки – від їхнього використання в якості потужного засобу терапії різних хвороб до їхньої непридатності для регенеративної медицини [46 - 48]. Позитивним є те, що перепрограмовані клітини можуть бути персоналізовані для терапії кожного окремого пацієнта. Перeд ученими стоїть важлива задача – визначення модуляторів перепрограмування [49]. Це можуть бути хімічні речовини з рекомбінантних білків або невеликі за розмірами синтетичні молекули, які спрямовані на конкретні сигнальні шляхи та механізми [39, 50 - 52]. І хоча у вченні про СК настала "ера індукованої плюрипотентності", зараз якраз виникла пауза для осмислення чи індуковані плюрипотентні клітини є істинним еквівалентом ембріональних СК [53]. У зв'язку з широким застосуванням у лікуванні хвороб різних органів і систем СК червоного кісткового мозку, як екзогенних клітин, подібні спроби були виконані щодо захворювань органів дихальної системи. Слід зауважити, що клітинна терапія є альтернативою трансплантації органів, а використання гематопоетичних СК визнане стандартом лікування лише злоякісних і генетичних порушень червоного кісткового мозку. Застосування всіх інших СК із лікувальною метою вивчається в експериментах і не належить до стандартів лікування СК [54]. Тому пошук і рекомендації для застосування СК у лікуванні захворювань органів дихальної системи, зокрема легень, знаходяться в стадії вивчення [55, 56]. Недавні дослідження показали, що СК червоного кісткового мозку сприяють регенерації легень, що може бути потужним засобом для лікування нового покоління пацієнтів із хронічним обструктивним захворюванням легень [57]. При муковісцидозі приживлення таких СК було рідкісним [58]. V. Sublinvong, D.J. Weiss [59] зробили спроби експериментального (на мишах) обгрунтування лікування СК кістковомоз-

290

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

кового походження емфіземи легень, легеневого фіброзу, легеневої гіпертензії і гострого респіраторного дистрес-синдрому і встановили, що ці клітини проявляли паракринні ефекти, які стимулювали ангіогенез, модулювали місцеві запальні та імунні реакції. Водночас M.R. Loebinger, S.M. Janes [60] критично ставляться до використання дорослих СК червоного кісткового мозку в лікуванні захворювань легень. M. Gharaee-Kermani et al. [61] припускаються думки, що пересадка СК червоного кісткового мозку небезпечна, тому що ці клітини можуть стимулювати надлишковий розвиток фібробластів із подальшим прогресуванням фібротичних процесів у легенях. Окремо слід зупинитися на проблемі лікування хронічного обструктивного захворювання легень, яке нині є всесвітньою епідемією з 3 млн смертей щорічно. Згідно даних літератури, протягом наступних 20 років смеpтність може збільшитися вдвічі [62]. До нових стратегій лікування хронічного обструктивного захворювання легень належить вивчення ролі і використання тканиноспецифічних СК і СК кістковомозкового походження; позаклітинного матриксу і факторів росту [62, 63], оскільки лікування сучасними фармакологічними засобами цієї недуги не завжди високоефективне [64, 65]. В експериментах отримані певні позитивні результати, але існує небезпека виникнення пухлин [66]. Останньою надією лікування ХОЗЛ є трансплантація легень, але це супроводжується великими труднощами. Третій напрям регенеративної медицини - імплантація створених на матриці новоутворених органів - активно розвивається. В якості основи при вирощуванні тканин і клітин нині використовуються різні види синтетичних і природних біополімерів (альгінат, колаген), безклітинна підслизова основа тонкої кишки і сечового міхура. Останнім часом використана безклітинна трахея мертвого донора для підтримки культури хрящової тканини. Р. Macchiarini в 2008 р. виконав першу трансплантацію трахеї, вирощеної з власних СК пацієнта на безклітинній трахеї померлого донора [67]. У 2011 році його міжнародна команда вперше успішно імплантувала штучну трахею з автологічних клітин 36-річного хворого з пізньою стадією раку. Досягнуті успіхи в підготовці до пересадки ферментативно отриманої безклітинної

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

291

матриці трахеї зі збереженими біомеханічними властивостями [68, 69]. Водночас, існує багато труднощів при заборі матеріалу, створення для вирощування умов, які імітують природне середо вище [70]. • Матеріали опубліковані в статті Геращенко С.Б. Сучасний погляд на стовбурові клітини органів дихальної системи дорослих і можливість їх участі в регенераційній терапії / С.Б. Геращенко, Ю.Б. Чайковський, О.І. Дєльцова // Галицький лікарський вісник. - 2013. - Том 20, №2. - С. 6-9. Література 1. Regeneration of injured airway epithelium / E. Puchelle, P. de Simple, R. Haig [et al.] // Ann. Pharm. Fr. – 2006. – Vol. 64(2).– P. 107–113. 2. Chen H. Bronchiolar progenitor cells / H. Chen, K. Matsumoto, B.R. Stripp // Proc. Am. Thorac. Soc. – 2009. – Vol. 6(7). – P. 602–606. 3. Rawlins E.L. Lung epithelial progenitor cells: lessions from development / E.L. Rawlins // Proc. Am. Thorac Soc. – 2008. – Vol. 5(6). – P. 675–681. 4. Deriving respiratory cell types from stem cells / F. Olsson, M. Denham, T.J. Cole [et al.] // Curr. Stem Cell Res. Ther. – 2007. – Vol. 2(3). – P. 197–208. 5. Bertoncello I. Endogenous lung stem cells: what is their potential for use in regenerative medicine? I. Bertoncello, J.L. McQualter // Expert. Rev. Respir. Med. – 2010. – Vol. 4(3). – P. 349–362. 6. Epithelial cell-extracellular matrix interactions and stem cells in airway epithelial regeneration / C. Coraux, J. Roux, T. Jolly [et al.] // Proc. Am. Thorac. Soc. – 2008. – Vol. 5(6). – P. 689–694. 7. Kannan S. Respiratorsystem cells and progenitors: overview, derivation, differentiation, carcinogenesis, regeneration and therapeutic application / S. Kannan, M. By // Curr. Stem Cell Res. Ther. – 2006. – Vol. 1(1). – P. 37–46. 8. Kubo H. Molecular basis of lung tissue regeneration / H. Kubo // Gen. Thorac. Cardiovasc. Surg. – 2011. – Vol. 59(4). – P. 231–244.

292

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

9. Kubo H. Regenerative approach for COPD / H. Kubo // Nihon Rinsho. – 2011. – Vol. 69(10). – P. 1869–1872. 10. Гістологія людини / [підруч. для студентів вищих медичних навчальних закл. ІІІ ІV рівнів акредитації] / О.Д. Луцик, А.Й. Іванова, К.С. Кабак, Ю.Б. Чайковський. – Київ : Книга плюс. – 584 с. 11. Kotton D.N. Lungstem cells: new paradigms // D.N. Kotton, R. Summer, A. Fine // Exp. Hematol. – 2004. – Vol. 32(4). – P. 340–343. 12. GP-130-STAT3 regulates epithelial cell migration and its required for repair of the bronchiolar epithelium / H. Kida, M.L. Mucenski, A.R. Thitoff [et al.] // Am. J. Pathol. – 2008. – Vol. 172(6). – P. 1542–1554. 13. Stripp B.R. Maintenance and repair of the bronchiolar epithelium / B.R. Stripp, S.D. Reynolds // Proc. Am. Thorac. Soc.– 2008. – Vol. 5(3). – P. 328–333. 14. Stripp B.R. Hierarchical organization of lung progenitor cells: is there an adult lung tissue stem cell ? / B.R. Stripp // Proc. Am. Thorac. Soc. – 2008. – Vol. 5(6). – P. 695–698. 15. Cell-based therapies for lung disease / O. Garcia, G. Carraro, S. Navarro [et al.] // Br. Med. Bull. – 2012. – Vol. 101. – P. 147–161. 16. Kadzik R.S. Directing lung endoderm differentiation in pluripotent stem cells / R.S. Kadzik, E.E. Morrisey // CellStem Cell. – 2012. – Vol. 10(4). – P. 355–361. 17. Zheng Y. Telocyte morphologies and potential roles in diseases / Y. Zeng, C. Bai, X. Wang // J. Cell Physiol. – 2012. – Vol. 227(6). – P. 2311–2317. 18. Rawlins E.L. Lung epithelial progenitor cells: lessions from development / E.L. Rawlins // Proc. Am. Thorac Soc. – 2008. – Vol. 5(6). – P. 675–681. 19. Stem/progenitor cells in lung development, injury, repair, and regeneration / D. Warburton, L. Perin, R. Defilippo [et al.] // Proc. Am. Thorac. Soc. – 2008. – Vol. 5(6). – P. 703–706. 20. Mesenchymal stem cell therapy for the treatment of chronic obstructive pulmonary disease / B. D'Agostino, N. Sullo, D. Sinicalco [et al.] // Expert. Opin. Biol. Ther. – 2010. – Vol. 10(5).– P. 681–687.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

293

21. Lensson J. Pulmonary stem cells and the inductor of tissue regeneration in the treatment of emphysema / J. Lesson, J. Stock // Int. J. Odstruct. Pulmon. Dis. – 2007. – Vol. 2(2). – P. 131–139. 22. Jiang J.X. Potential therapeutic application of adult stem cells in acute respiratory distress syndrome / J.X. Jiang, L. Li // Clin J. Traumatol. – 2009. – Vol. 12(4). – P. 228–233. 23. Chistiakov D.A. Endogenous and exogenous stem cells: a role in lung repair and use in airway tissue engineering and transplantation / D.A. Chistiakov // J. Biomed. Sci. – 2010. – Vol. 17. – P. 92. 24. Evidence for human lungstem cells / J. Kajstura, M. Rota, S.R. Hail [et al.] // N. Eng. J. Med. – 2011. – Vol. 364(19). – P. 1795–1806. 25. Telocytes and putative stem cells in the lungs: electron microscopy, electron tomography and laser scanning microscopy / L.M. Popescu, M. Gherghiceanu, L.C. Susin [et al.] // Cell Tissue Rec. – 2011. – Vol. 345(3). – P. 391–403. 26. Telocytes in trachea and lungs / Y. Zheng, H. Li, C.G. Manole [et al.] // J. Cell Mol. Med. – 2011. – Vol. 15(10). – P. 2262–2268. 27. Liu X. Airway glandular development and stem cells / X. Liu, R.R. Drikel, J.F. Engelhardt // Curr. Top. Dev. Biol. – 2004.– Vol. 64. – P. 33–56. 28. Liu X. The glandular stem/progenitor cell niche in airway development and repair / X. Liu, J.F. Engelhardt // Proc. Am. Thorac. Soc. –2008. - Vol. 5(6). – P. 682–688. 29. Hayes M. Lungstem cells – from an evolving understanding to a paradigm shift? /M. Hayes, G.F. Curleg, J.G. Laffey // Stem Cell Res. Ther. – 2011. – Vol. 2(5). – P. 41. 30. Hackett T.L. Potential role of stem cells in management of COPD / T.L. Hackett, D.A. Knight, D.D. Sin // Int. J. Chron. Obstruct. Pulmon. Dia. – 2010. – Vol. 5. – P. 81–88. 31. Reynolds S.D. Clara cell: progenitor for the bronchiolar epithelium / S.D. Reynolds, A.M. Malkinson // Int. J. Biochem. Cell Biol. – 2010. – Vol. 42(1). – P. 1–4. 32. Kadzik R.S. Directing lung endoderm differentiation in pluripotent stem cells / R.S. Kadzik, E.E. Morrisey // CellStem Cell. – 2012. – Vol. 10(4). – P. 355–361.

294

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

33. Rawlins E.L. The role of Scgb1a+ Clara cells in the long-term maintenance and repair of lung airway, but not alveolar epithelium / E.L. Rawlins // Cell Stem Cell. – 2009. – Vol. 4(6). – P. 525–534. 34. Signaling via Alk5 controls the ontogeny of lung Clara cells / Y. Xing, C. Li, A. Li [et al.] // Development. – 2010. – Vol. 137 (5). – P. 825–833. 35. NOTCH1 is Required for Regeneration of Clara cells During Repair of Airway Injury / Y. Xing, A. Li, Z. Borok [et al.] // Stem Cells. – 2012. – Vol. 30(5). – P. 946–955. 36. Sox2 is requered for maintenance and differentiation of bronchiolar Clara, ciliated, and goblet cells / D.H. Tompkins, V. Besnard, A.W. Lange [et al.] // PLoS One. – 2009. – Vol.12. – P. e8248. 37. Evidence of an epithelial stem/progenitor cell hierarchy in the adult mouse lung / J.L. McQualter, K. Yuen, B. Williams [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA – 2010. – Vol. 107(4). – P. 1414–1419. 38. Roomans G.M. Tissue engineering and the use of stem/ progenitor cells for airway epithelium repair / G.M. Roomans // Eur. Cell Mater. – 2010. – Vol. 19. – P. 284–299. 39. Cell reprogramming expertations and challenges for chemistry in stem cell biology and regenerative medicine / L. Anastasia, G. Pelissero, B. Venerando [et al.] // Cell Death Differ. – 2010. – Vol. 17(8). – P. 1230–1237. 40. Deng W. Exploiting pluripotency for therapeutic gain / W. Deng // Panminerva Med. – 2010. – Vol. 52(2). – P. 167–173. 41. How far are induced pluripotent stem cells from the clinic? / M. Li, M. Chen, W. Han [et al.] // Ageing Res. Rev. – 2010. – Vol. 9(3). – P. 257–264. 42. Sidhu K.S. New approaches for the generation of induced pluripotent stem cells / K.S. Sidhu // Expert. Opin. Biol. Ther. – 2011. – Vol. 11(5). – P. 569–579. 43. Current progress and potential practical application for human pluripotent stem cells / E.S. Philonenko, M.V. Shutova, I.V. Chestkov [et al.] // Int. Rev. Cell Mol. Biol. – 2011. – Vol. 292. – P. 153–196. 44. Wang P. Mechanism and methods to induce pluripotency / P. Wang, J. Na // Protein Cell. – 2011. – Vol. 2(10). – P. 792–799.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

295

45. Analysis of human and mouse reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells / S. Bone, I. Paramonov, M.J. Barrero [et al.] // PLoS One. – 2010. – Vol. 5(9). – P. e12664. 46. Lowry W.E. Roadblocks an route to the clinical application of induced pluripotent stem cells / W.E. Lowry, W.L. Quan // J. Cell Sci. – 2010. – Vol. 123 (pt5). – P. 643–651. 47. Cohen D.E. Turning straw into gold : directing cell fate for regenerative medicine / D.E. Cohen, D. Melton // Nat. Rev. Genet. – 2011. – Vol. 12(4). – P. 243–252. 48. Human stem cell research and regenerative medicine – present and future / V. Volarevie, B. Ljujic, P. Stojkovich [et al.] // Br. Med. Bull. – 2011. – Vol. 99. – P. 155–168. 49. Zhou H. Evolution of induced pluripotent stem cell technology / H. Zhou, S. Ding // Curr. Opin. Hematol. – 2010. – Vol. 17(4). – P. 276–280. 50. Andrews P.D. Discovering small molecules to control stem cell fate / P.D. Andrews // Future Med. Chem. – 2011. – Vol. 3(12).– P. 1539–1549. 51. Zhu S. Chemical strategies for stem cell biology and regenerative medicine / S. Zhu, W. Wei, S. Ding // Annu. Rev. Biomed. Eng. – 2011. – Vol. 13. – P. 73–90. 52. Li W. Consice review. A chemical approach to control cell fate and function / W. Li, K. Jiang, S. Ding // Stem Cells. – 2012.– Vol. 30(1). – P. 61–68. 53. Robinton D.A. The promice of induced pluripotent stem cells in research and therapy / D.A. Robinton, G.Q. Daley // Nature. – 2012. – Vol. 481 (7381). – P. 295–305. 54. Perez Lopez S. Advances in stem cell therapy / S. Perez Lopez, J. Otero Hernandez // Adv. Exp. med. Biol. – 2012. – Vol. 741. – P. 290–313. 55. Bishop A.E. Pulmonary epithelium / A.E. Bishop, J.M. Polak // Methods Enzymol. – 2006. – Vol. 418. – P. 333–349. 56. Loebinger M.R. Therapeutic potential of stem cells in lung diseases: progress and pitfalls / M.R. Loebinger, S. Aginap, S.M. Janes // Clin. Sci. (Lond.). – 2008. – Vol. 114(2). – P. 99–108. 57. Martin U. Methods for studying stem cells: adult stem cells for lung repair / U. Martin // Methods. – 2008. – Vol. 45(2). – P. 121–132.

296

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

58. Sueblinvong V. Cell therapy approaches for lung diseases: current status / V. Sublinvong, D.J. Weiss // Curr. Opin. Pharmacol. – 2009. – Vol. 9(3). – P. 268–273. 59. Sueblinvong V. Stem cells and cell therapy approaches in lung biology and diseases / V. Sublinvong, D.J. Weiss // Transl. Res. – 2010. – Vol. 156(3). – P. 188–205. 60. Loebinger M.R. Stem cells for lung disease / M.R. Loebinger, S.M. Janes // Chest. – 2007. – Vol. 132(1). – P. 279–285. 61. New insights into the pathogenesis and treatment of idiopathic pulmonary fibrosis: a potential role for stem cells in the lung parenchyma and implications for therapy / M. GharaeeKermani, M.R. Gyetko, B. Hu [et al.] // Pharm. Res. – 2007. – Vol. 24(5). – P. 819–841. 62. Kubo H. Cell based therapy for COPD / H. Kubo // Nihon Rinsho. - 2007. – Vol. 65(4). – P. 740–747. 63. Ohnishi S. Tissue regeneration as next-generation therapy for COPD-potential applications / S. Ohnishi, N. Nagaya // Int. J. Chron. Obstruct. Pulmon. Dis. – 2008. – Vol. 3(4). – P. 509–514. 64. Kubo H. Tissue engineering for pulmonary diseases: insights from laboratory / H. Kubo // Respirology. – 2012. – Vol. 17(3). – P. 445–454. 65. Rennard Sl. Rationale and emerging approaches for targeting lung repair and regeneration in the treatment of chronic obstructive pulmonary disease / Sl. Rennard, K. Wachenfeldt // Proc. Am. Thorac. Soc. – 2011. – Vol. 8(4). – P. 368–375. 66. Hind M. Is a regenerative approach viable for the treatment of COPD? / M. Hind, M. Maden // Br. J. Pharmacol. – 2011. – Vol. 163(1). – P. 106–115. 67. Macchiarini P. Bioartificial tracheobronchial transplantation / P. Macchiarini // Regen. Med. – 2011. – Vol. 6 (6 Suppl.) – P. 14–15. 68. Development of bioengineering human larynx / S. Baiguera, A. Gonfiotti, M. Jaus [et al.] // Biomaterials. – 2011. – Vol. 32 (19). – P. 4433–4442. 69. Tracheobronchial transplantation with a stem-cellseeded bioartifitial nanocomposite : a proof-of-concept study / P. Jungebluth, E. Alici, S. Bagiguera [et al.] // Lancet. – 2011. – Vol. 378 (9808). – P. 1997–2004.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

297

70. Alberti C. Tissue engineering technologies: just a quick note about transplantation of bioengineering donor trachea and augmentation cystoplasty by de novo engineering bladder tissue / C. Alberti // J. Chir. – 2009. – Vol. 30(11–12). – P. 514–519. Нирку зі стовбурових клітин виростили американці. Опубліковано 16.04.2013. Експерименти проводилися над щурами в знаменитому науковому центрі США – Загальному госпіталі штату Массачусетс (Гарвардська медична школа). Нирка створена на основі технології, яку раніше застосували для вирощування серця. Вона передбачає наявність донорського органу, який повністю звільняють від клітин, за винятком тих, які утворюють її форму. На думку вчених, років через п’ять, до 2018 року, відбудуться перші пересадки таких нирок людям. За матеріалами newsradio.com.ua

3.5. Сечова система Інтерес до регенеративних можливостей нирки пов'язаний, у першу чергу, із широким розповсюдженням у світі хронічних захворювань нирок, від яких потерпає до 11 % дорослого населення і є провідною причиною захворюваності і смертності. Дорослі ниркові СК можуть відкрити нові можливості для автотрансплантації і регенерації пошкодженої нирки. Концепція СК нирки швидко доповнюється новими фактами і вдосконалюється разом iз розширенням методів дослідження і думок щодо практичного застосування отриманих результатів [1]. Історія можливостей регенерації нирок давня. Ще в 1887 р. W. Podwyssozki Jr. [2] визначив, що клітинна регенерація має місце в ниркових канальцях після пошкодження. Пізніше W.C. Hunter [3] встановив, що після травми в нирці дорослої людини "трубочки нефрона майже всі дубльовані на нові та атипові клітини, які відрізняються від первинного епітелію. Регенеровані клітини за забарвленням подібні до ембріонального епітелію". Протягом останнього десятиліття саме ці клітини, які здатні до регенерації епітелію трубочок, вивчаються та обговорюються їхні потенційні властивості. Тобто, якщо нирки розглядалися довший час, як орган із малою регенераторною здатністю, то в останні роки ця догма поставлена під сумнів.

298

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

D. Lindgren et al. [4] запропонував альтернативну гіпотезу походження подібних клітин в епітелії канальців – це ембріональні попередниці, які в людини розкидані в найбільш диференційованих ділянках нефрона: проксимальних канальцях із маркерами CD133+, CD24+; у сечовому і CD 133+, CD24+ i PDX+ у судинному його полюсах, що може свідчити про біпотентність клітин-попередниць [5]. Нині є впевненість, що нирки здатні до регенерації, але точаться численні суперечки навколо потенції, поведінки, походження типів клітин [6]. Нирки – складний орган, який вимагає точної структурної організації декількох типів клітин для ефективного функціонування [7]. У нирці і сечоводі утворюється більше ніж 26 різних типів клітин. Загалом, у нирці підлягають відновленню три компартменти – епітеліальний, судинний і стромальний, тому вважають, що існує кілька типів СК у своїх окреслених нішах [8] (рис. 22). Програми регенерації нирок за допомогою СК вбачають, що збережені після пошкодження ниркові клітини дедиференціюються, набувають мезенхімних характеристик, відновлюють базальні мембрани і редиференціюються в епітеліоцити ниркових трубочок. Дедиференціація є важливим кроком для відновлення трубчастих структур на тлі реактивації мезенхімних клітин. Клітини клубочків і трубочок можуть дедиференціюватися до більш ембріональних/фенотипових мезенхімних за своїми властивос тями [9]. У стінці трубочок містяться інтратубулярні СК (додаток 17). Екстратубулярні клітини сприяють ремонту пошкодженої строми і в них присутні ніші з інтерстиційними клітинами [10, 11]. До цього списку додають циркулюючі СК [12, 13]. Клітини метанефротичної мезенхіми можуть генерувати всі епітеліальні клітини нефрона зі СК, за винятком епітеліоцитів збірних канальців [14, 15]. Останнім часом стали писати про "ренопоетичну систему", яка забезпечує регенерацію структур нирки [16, 17]. Більшість дослідників сходиться в думці, що клітини–попередниці епітеліальних структур локалізуються в капсулі Шумлянського-Боумена (ніша СК і клітин–попередниць для відновлення епітеліального компоненту нефрона) і звідси розповсюджуються в бік його

стромальний, тому вважають, що існує кілька типів СК у своїх окреслених Розділ 3. С товбурові клітини органів і систем дорослого організму нішах [8] (рис.21).

299

Проксимальна трубочка Ниркові стовбурові клітини CD133+ CD24+

Сечовий полюс

Клубочкова капсула

Простір капсули

Подоцити

Ендотеліоцити Судинний полюс

Капіляри Мезангіоцити Гематопоетичні стовбурові клітини

Рис.21. 22. Гіпотетичні Гіпотетичні напрями (…►() диференціації нирковихниркових і гематопоетичних Рис. напрями ) диференціації і клітин у нирковому тільці. гематопоетичних стовбуровихстовбурових клітин у нирковому тільці.

судинного – з утворенням подоцитів і сечового полюса,що а також Програми регенерації нирок за допомогою СК вбачають, трубочок з їхнім епітелієм. збережені після пошкодження ниркові клітини дедиференціюються, Із маркером CD133+ (prominin1) клітини ів клубазальні мембрани набувають мезенхімних характеристик, відновлюють виявлені редиференціюються в епітеліоцити ниркових трубочок. Дедиференціація є бочках, трубочках та інтерстиції кіркової та мозкової речовиважливим ни кроком для відновлення трубчастих структур на тлі реактивації [18, 19, 20]. Оскільки експресія маркера CD133+ характерна для гематопоетичних, нервових, ендотеліальних та інших СК, то

300

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

необхідні додаткові маркери для визначення власне СК нирки. У нормі in situ нестин+ і CD133/1+ клітини ідентифікуються між епітеліоцитами канальців нефрона, що розташовані в мозковій речовині. H.H. Ward et al. [21] забирали і культивували ці клітини в людини і показали їхні можливості щодо утворення канальців нефрона. F. Ronconi et al. [22], за даними літератури, представили таб лицю з маркерами клітин ниркового тільця. Так, усі ниркові клітини–попередниці епітелію та інтерстиційних клітин експресують CD133+; - подоцитів – Podocyte–specific PTPase (GLEPB–1), нестин, Complement receptor–1 (CR1), Wilms tumor antigen (WT1), Synaptopodin, nephrin, Podocin; - проксимальних трубочок – Lotus tetragonolobus (LTA, лектин лотоса), aminopeptidase A (APA), Bmi1, Na/Gluc1 cotransporter (Na Gluc1 – gamma-glutamiltransferasa), aquaporin1; - низхідної петлі Генле – aquaporin1; - дистальної трубочки - CD 36+, Bmi1, Thiazide-sensitive Na/Cl; - збірної трубочки – aquaporin3; - ендотеліальних клітин клубочка – PDX (podocalyxin), CD31; - лейкоцитів – Complement receptor–1 (CR1),CD45; - усі клітини нирки людини – HLA-1 [23, 24]. Автори доповнили таблицю власними даними щодо маркерів мультипотентних і диференційованих клітин нефрона. Вони встановили, що в мультипотентних клітинах виявляються CD133+, CD24+, PDX–, у клітинах на стадії переходу від мультипотентних до подоцитів – CD133+, CD24+, PDX+, у диференційованих подоцитах – CD133–, CD24+, PDX+. Зрілі подоцити є постмітотичними і не діляться через те, що зупиняють свою діяльність у G2/M фазі клітинного циклу. Додаткову інформацію про клітини, які регенерують, можна отримати за допомогою маркера CD106+. На сечовому полюсі ниркового тільця реакція на CD106 позитивна, а в проксимальній і дистальній трубочках негативна. Клітини з CD106+ показують високу швидкість проліферації і можуть у подальшому диференціюватися і в подоцити, і в клітини трубочок, тоді як CD106(–) – низьку швидкість проліферації і схильність до утво-

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

301

рення тільки клітин трубочок [25]. Саме клітини, що експресують CD133+, CD24+ і CD106(–), є клітинами-попередницями для епітеліоцитів трубочок, стійкими до апоптозу, і надають регенераційний потенціал трубочкам нефрона. За останніми повідомленнями в СК ниркового сосочку миші містяться Pax2+ клітини. Деякі з них є попередницями в органогенезі нефронів, володіють мультипотентними властивостями, здатні до оновлення і можуть бути клоновані. При створенні певних умов ці клітини диференціюються в епітеліоцити нефронів (подоцити) і їх прокcимальних канальців, а також утворюють не ниркові типи клітин – адипоцити та остеоцити [26]. Процес переходу від клітин мезенхімного до епітеліального типу вимагає послідовних Wnt сигналів. Wnt9b спрямовує пе реміщення СК у ніші, а Wnt4 достатній для формування епітелію. Без цих факторів нефрони не утворюються. Доведено, що активація Notch сигнального шляху може індукувати утворення нефронів за відсутності Wnt, при цьому Notch у подальшому регулює утворення епітелію в проксимальних канальцях. Але Notch і Wnt не можуть регулювати активацію стромальних клітин [27]. До того ж Notch сигнали практично відсутні в здорової дорослої людини і посилюються при захворюваннях нирок. Це робить важливим регулювання Notch сигналу і створення динамічної рівноваги між смертю епітеліоцитів та їхнім відновленням [28]. Механізм дії СК червоного кісткового мозку при пересадці в нирку до цього часу не з'ясовано. Автори по-різному пояснюють їхній позитивний вплив. Так, B. Bussolati et al. [29] не впевнені чи вони діють паракринно, чи ендокринно. M. Flaquer et al. [30] вбачають їхню паракринну дію через фактори росту, які вони експресують. Слід зауважити, що нирки мають власні мезенхімні СК, які сприяють відновленню через паракринну та/або ендокринну дію, виробляють ряд протизапальних цитокінів і хемокінів, які модулюють імунну відповідь [31]. Окремі автори висловлюють думку про те, що епітеліоцити ниркових трубочок можуть утворюватися з клітин червоного кісткового мозку [32] за їхньої трансплантації, тоді як інші категорично заперечують такі можливості [33]. Водночас вказується на допоміжну роль СК червоного кісткового мозку, які сприяють «ремонту» перитубулярних капілярів [34].

302

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

При введенні ембріональних СК мезенхімного походження встановили, що вони мали тривалу терапевтичну функцію зі зникненням проявів хронічної ниркової недостатності [35, 36]. На думку P. Chabra, K.L. Brayman [34], ліпшого ефекту можна досягти при пересадці СК червоного кісткового мозку і власних дорослих ниркових СК/клітин-попередниць. Це до того ж ліквідує проблеми обмеженості доступності донора і хронічної імуносупресивної терапії. Епітелій ниркових трубочок схильний до травм із цілого ряду причин – запальні та імунні процеси, окиснювальний стрес, вплив нефротоксинів та інших факторів. При гострому пошкод женні нирки (травма, ішемія) кількість клітин із маркерами проліферації збільшується [37, 38]. При ішемії в ниркових сосоч ках зростає експресія нестину, який є маркером мультипотентної лінії СК і клітин–попередниць для багатьох типів клітин, у тому числі й клітин мезонефральної мезенхіми й ендотеліальних клітин [39]. Це відбувається завдяки їхній мобілізації зі стовбурових ніш, що можна використати для забору клітин, їх культивації і пересадки в потрібне місце [40]. Не менш важливим при регенерації ниркового тільця є відновлення судинного (гломерулярного) компоненту [41]. Зона зі СК і клітинами–попередницями - CD34+ i CD31– локалізується між м'язовою і адвентиційною оболонками судин [42, 43]. Автори вважають, що для відгалужень дрібніших судин у капіляри характерні клітини–попередниці з маркерами VEGFR2, TIE2, CD45+ i CD34+. В адвентиції судин D. Klein et al. [44, 45] також визначили резиденти мультипотентних СК із маркерами CD44+, CD90+, CD73+, CD34–, CD45–. У здорової людини провідна роль в ангіогенезі, судинній стабільності і цілісності судин належить перицитам судин нирок, які експресують колаген α1. При пошкодженні нирки перицити швидко мігрують від стінки судини в інтерстиційний простір, активуються і диференціюються в рубець–утворювальні міофіб робласти. У разі відсутності перицитів перитубулярні капіляри дестабілізовані, що призводить до регресії судин. У пацієнтів із фібротизуючими захворюваннями перицити є основним джерелом міофібробластів [46, 47, 48]. У відповідь на травму пери-

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

303

цити швидко активують експресію desintegrin і металопротеїназ із мотивами тромбоспондина 1 (ADAMTS1) і пригнічують його інгібітор - металопротеїназу 3 (TIMP3) [49]. Кровоносні судини нирки зсередини вистелені ендотеліоцитами. На думку N.A. Hofmann et al. [50], клітини–попередниці ендотеліоцитів походять із судинної стінки і є основою судинного гомеостазу і регенерації. Будова цих клітин і їхня стовбурова ніша мало вивчені. До сьогодні існує невирішене питання приналежності СК і клітин–попередниць ендотеліоцитів до власне судинного ендотелію кровоносних судин нирки чи до клітин– попередниць ендотеліоцитів-колонієутворювальних із червоного кісткового мозку. Підставою для такої думки є виявлення в крові ендотеліоцитів пошкоджених, старіючих, апоптичних та в стадії некрозу [51]. Про клітини–попередниці ендотеліоцитів кістковомозкового походження, які захищають і беруть участь у регенерації негематопоетичних тканин, відомо, що вони мають потужну проангіогенну дію [52]. При введенні мічених клітин– попередниць ендотеліоцитів у ниркову артерію щурів відбувалося зменшення ознак пошкодження судинного ендотелію [53]. За останніми даними, у нирковому клубочку людини, поз бавленому капсули Шумлянського-Боумена, містяться клітини з маркерами CD133– i CD146+, що коекспресують типові маркери мезенхімних СК такі, як CD29+, CD105+ i CD73+ i ниркових епітеліоцитів – CD24+, CD146+. Ці клітини в культурі виявили можливості самооновлення, клоногенність і мультипотентність. При культивуванні за певних умов із них утворювалися остео-, адипо-, хондрогенні, а також ендотеліальні, подоцити і мезангіальні клітини, що підтвердилося відповідними маркерами [54]. Епітеліальні, ендотеліальні та мезангіальні клітини беруть участь у більшості патологічних процесів, які розвиваються в нирках. Із них мезангіоцити є головними в ініціації і прогресуванні їхніх захворювань [55, 56]. Мезангіальний гомеостаз є невід'ємною частиною нормального функціонування клубочків. Мезангіоцити першими реагують на шкідливі впливи і часто останніми повертаються до норми при їх лікуванні [57]. В останні роки показано, що в червоному кістковому мозку є СК, які можуть відновлювати мезангіоцити. У нирках людини мезангіо-

304

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

цити мають маркер CD105+ і їх можна використати in vivo для відновлення після гломерулярного пошкодження [58, 59]. При хронічній нирковій недостатності дослідники пропонують дві стратегії для відновлення нирки [60]. Перша полягає у використанні нефрогенного потенціалу нирки, тобто ниркових СК у процесі неонефрогенезу, друга – за рахунок екстраренальних СК, які здійснюють паракринні ефекти. До них відносять гематопоетичні СК червоного кісткового мозку, мезенхімні СК (протизапальний і антиапоптичний ефект) та клітини–попередниці ендотеліальних клітин (проангіогенний і промітотичний ефект). Автори наголошують на тому, що СК є ідеальними для генної терапії, клітинної трансплантації і тканинної інженерії. На ранніх стадіях хвороби, коли ще структури нирки збережені, можна досягти позитивного ефекту при пересадці СК червоного кісткового мозку. Пізніше, при поглибленні пошкоджень нирки вирішального значення набувають нефрогенні СК та індуковані плюрипотентні СК. Нині велика увага приділяється дослідженню індукованих СК, які отримані нещодавно [61]. Вони можуть походити з різних соматичних клітин і мають багато спільних рис з ембріональними СК [62]. Використання індукованих плюрипотетних CК характеризується простотою отримання донорського матеріалу, зменшує етичні проблеми, але існують кілька перешкод, які треба подолати [63]. Дослідники, у першу чергу, наголошують на безпечності лікування за допомогою індукованих СК, але нагадують за те, що вони мають туморогенний потенціал [64]. Пряме перепрограмування соматичних клітин в індуковані плюрипотентні СК підняло фундаментальне питання епігенетичної стабільності їх стану [65], тобто чи є в них відхилення через "епігенетичну пам'ять". Транскрибовані гени, епігенетичний ландшафт, потенціал диференціації і мутаційні навантаження виявляють невеликі, але характерні відмінності між індукованими та ембріональними СК, які використовуються як "золотий стандарт" для плюрипотентності in vitro [66]. Огляд літератури показує, що оскільки між різними популяціями плюрипотентних СК існують відмінності в епігенетичному і транскрипційному рівні, то виникає питання їх використання – для експери-

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

305

ментальних, діагностичних чи терапевтичних цілей [67]. Разом із тим, важливо чи такі "епігенетичні відхилення" можна усунути шляхом диференціації і послідовного перепрограмування або їхнього лікування хроматин-модифікувальними засобами, щоб вони наблизилися в більшій мірі до ембріональних СК [68]. Цікавим є питання "старіння" СК, які піддалися перепрограмуванню. Індуковані плюрипотентні СК при поділі старіють через модуляцію теломерази р53 і мітохондріє/окиснювального стресу. При перепрограмуванні мітохондрії в них перебудовуються до стану незрілих, як в ембріональних СК. Це стосується морфології і розподілу, експресії ядерних факторів, залучених у біогенез мітохондрій, рівня внутрішньоклітинного АТФ, окисного пошкодження і утворення лактату. При диференціації в індуковані та ембріональні СК мітохондрії проявляють аналогічні стадії дозрівання і анаеробно–до–аеробної метаболічної модифікації [69]. На підставі результатів цього дослідження автори роблять висновок про антиоксидантну корекцію процесів перепрограмування СК. Можна вважати, що це перші спроби оцінити метаболомічний (metabolomic) стан клітини при її переході від соматичної до індукованих плюрипотентних СК, що корелює з ефективністю перепрограмування клітин [70]. У контексті вищевикладеного є відомості про те, що виконане перепрограму вання клітин шкіри людини на ниркові з допомогою векторів лентивірусів може забезпечити легку, доступну трансплантацію таких індукованих СК пацієнтам із нирковими захворюван нями [71]. Підходи до лікування автологічними СК вимагають їхньої ізоляції, культивування в культурі, реінтродукції назад у нирку. Тим не менш, людські епітеліоцити через кілька пасажів у культурі втрачають свій фенотип, дедиференціюються і серед них з'являються фібробласти, які можуть синтезувати колаген у надлишковій кількості і тим самим ускладнювати перебіг захворювання через фіброз [72]. Дослідження СК і можливостей їхнього застосування розвивається швидкими темпами. Для майбутнього обнадійливим методом лікування органів із великим об'ємом і кількістю типів клітин (нирка, серце, печінка, легені) є створення штучних ор-

306

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

ганів, в яких основними функціональними елементами будуть персоналізовані клітини пацієнта. У цьому напрямку окреслилися певні перспективи – створення органічного чи синтетичного каркасу органа, заселення його клітинами і вирощування цілого органа з майбутньою трансплантацією хворому [73, 74]. Для матриці або каркасу органа можна використати орган (наприклад, нирку), який позбавлений клітин [75 - 77]. K.H. Nakayama et al. [78, 79] створили безклітинні каркаси нирок плодів неповнолітніх і дорослих мавп і заселили їх СК, забраними в тварин різних вікових груп. У перекладках органічної сітки ступінь клітинного заселення був найбільшим у молодих приматів. Біоматеріали для матриць (каркасів) органів при відновленні в майбутньому мають бути мінімізованими щодо імунної відповіді, перешкоджати інфекції і сприяти регенерації. Для моделювання каркасу можна використовувати синтетичні матеріали (волокнистий поліуретан) [80]. У зв'язку з прогресом у галузі нанотехнологій розробляються наноструктуровані полімери і метали. Нанотехнології пропонують багатообіцяючі перспективи для біомедичних досліджень – вивчаються можливості створення каркасу (матриці) шкіри, кісток, судин, серця, рогівки, органів нервової системи [81 - 83]. Таким чином, перспективи лікування хвороб нирок у майбутньому будуть спрямовані на використання трансплантаційних технологій СК з урахуванням їх безпечності – автологічних ендогенних та екзогенних дорослих; ембріональних ксеноклітин, індукованих СК і штучно створеного органа на органічній безклітинній чи полімерній матриці з заселеними СК для автологічних епітеліальних, судинних (ендотеліоцити і мезангіоцити) та інтерстиційних (сполучнотканинних) диферонів. Це стане можливим при глибокому знанні механізмів відтворення ниркових структур із морфологічними і функціональними властивостями і патогенетично обгрунтує цільову терапію при гострих і хронічних захворюваннях нирок. • Матеріали опубліковані в статті Геращенко С.Б. Регенераційні можливості стовбурових клітин нирки / С.Б. Геращенко, Ю.Б. Чайковський, О.І. Дєльцова // Український журнал нефрології та діалізу. – 2013. – №4. – С. 39-44.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

307

Література 1. Abbattista M.R. Stem cells and kidney disease / M.R. Abbattista, F.P. Schena // Minerva med. – 2004. – Vol. 95(5). – P. 411–418. 2. Podwyssozki W. Jr. Ueber die regeneration der Epithelien der Leber, der Niere, der Speichel – und Meibom'schen Drfizen unter pathologischen Bedingung, Fortschr.d. med., 1885. – iii, 630 p. 3. Hunter W.C. Regeneration of tubular epithelium in human kidney following injuri by mercuric chloride / W.C. Hunter // Annu. Inter. Med. – 1928. – Vol. 1. – P. 463–469. 4. Isolation and characterisation of progenitor–like cells from human renal prоximal tubules / D. Lindgren, A.K. Bostrom, K. Nilsson [et al.] // Am. J. Pathol. – 2011. – Vol. 178. – P. 828–837. 5. Lazzeri E. Regeneration and the kidney / E. Lazzeri, B. Mazzinghi, P. Romagnani // Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. – 2010. – Vol. 19(3). – P. 248–253. 6. McCampbell K.K. Renal stem cells: fact or science fiction? / K.K. McCampbell, R.A. Wingert // Biochem. J. – 2012. – Vol. 444(2). – P. 153–168. 7. Guo J.K. Cellular maintenance and repair of the kidney / J.K. Guo, L.G. Cantley // Annu. Rev. Physiol. – 2010. – Vol. 72. – P. 357–376. 8. Harari–Steinberg O. Selecting the optimal cell for kidney regeneration: fetal, adult or reprogrammed stem cells / O. Harari– Steinberg, O. Pleneceanu, B. Dekel // Organogenesis. – 2011. – Vol. 7(2). – P. 123–134. 9. Ricardo S.D. Adult stem cells in renal injury and repair / S.D. Ricardo, J.A. Deane // Nephrology. – 2005. – Vol. 10(3). – P. 276–282. 10. Bonventre J.V. Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure / J.V. Bonventre // J. Am. Soc. Nephrol. – 2003. – Vol.1 (Suppl.) – P. 5–61. 11. Humphrey B.D. Renal stem cells in recovery from acute kidney injury / B.D. Humphrey, J.S. Duffied, J.V. Bonventre // Minerva Urol. Nefrol. – 2006. – Vol. 58(4). – P. 329–337. 12. In search of adult stem cells / F. Anglani, M. Forino, D. Del Prete [et al.] // J. Cell Mol. Med. – 2004. – Vol. 8(4). – P. 474–487.

308

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

13. The renal stem cell system in kidney repair and regeneration / F. Anglani, M. Ceol, F. Mezzabotta [et al.] // Front Biosci. – 2008.– Vol. 13. – P. 6395–6405. 14. Al-Awquati Q. Stem cells in the kidney / Q. Al–Awquati, J.A. Oliver // Kidney. – 2002. – Vol. 61(2). – P. 387–395. 15. Oliver J.A. Adult renal stem cells and renal repair / J.A. Oliver // Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. – 2004. – Vol. 13(1). – P. 17–22. 16. Romagnani P. Toward the identification of a "renopoietic system"? / P. Romagnani // Stem Cells. – 2009. – Vol. 27(9). – P. 2247–2253. 17. Romagnani P. Kidney regeneration: any prospects? / P. Romagnani // Contrib. Nephrol. – 2011. – Vol. 170. – P. 228–236. 18. Reule S. Kidney regeneration and resident stem cells / S. Reule, S. Gupta // Organogenesis. – 2011. – Vol. 7(2). – P. 135–139. 19. Romagnani P. Family portrait : renal progenitor of Bowman's capsule and its tubular brothers / P. Romagnani // Amer. J. Pathol. – 2011. – Vol. 178(2). – P. 490–493. 20. Bussolati B. CD133+ cells as therapeutic target for kidney disease / B. Bussolati F. Collino, G. Camussi // Expert. Opin. Ther. Targets. – 2012. – Vol. 16(2). – P.157–165. 21. Adult human CD133/1(+) kidney cells isolated from papilla integrate into developing kidney tubules / H.H. Ward, E. Romero, A. Welford [et al.] // Biochem. Biophys. Acta. – 2011. – Vol. 1812(10). – P. 1344–1357. 22. Regeneration of glomerular podocytes by human renal progenitors / E. Ronconi, C. Sagrinati, M.L. Angelotti [et al.] // J. Am. Soc. Nephrol. – 2009. – Vol. 20(2). – P. 322–332. 23. Isolation and characterization of multipotent progenitor cells from the Bowman's capsule of adult human kidney / C. Sagrinati, G.S. Netti, B. Mazzinghi [et al.] // J. Am. Soc. Nephrol. – 2006. – Vol. 17. – P. 2443–2456. 24. Regenerative potential of embryonic renal multipotent progenitors in acute renal failure / E. Lazzeri, C. Creoscioli, E. Ronconi [et al.] // J. Am. Soc. Nephrol. – 2007. – Vol. 18(12). – P.3128–3138. 25. The renal papilla is a nishe for adult kidney stem cells / J.A. Oliver, O. Maaroef, F.H. Cheema [et al.] // J. Clin. Invest. – 2004.– Vol. 114. – P. 795–804.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

309

26. Characterization of Renal Progenitors Commited Toward Tubular Lineage and Their regenerative Potential in Renal Tubular Injuri / M.L. Angelotti, E. Ronconi, L. Ballerini [et al.] // Stem Cells.– 2012. – May, 24. Доступ до елeктронного ресурсу DOI:10.1002 / stem cells 0.1130. 27. Differentiation of podocyte and proximal tubulu–like cells from a mouse kidney–derived stem cell line / C. Fuente Mora, E. Rangini, S. Bruno [et al.] // Stem Cells Dev. – 2012. – Vol. 21(2).– P. 296–307. 28. Notch pathway activation can replace the requirement for Wnt4 and Wnt9b in mesenchymal–to–epithelial transition of nephron / S.C. Boyle, M. Kim, M.T. Valerius [et al.] // Development. – 2011. – Vol. 138(19). – P. 4245–5254. 29. Notch activation differentially regulates renal progenitors proliferation and differentiation toward the podocyte lineage in glomerular disordes / L. Lasagni, L. Ballerini, M.L. Angelotti [et al.] // Stem Cells. – 2010. – Vol. 28(9). – P. 1674–1685. 30. Contribution of stem cells to kidney repair / B. Bussolatі, P.V. Hauser, R. Carvalhosa [et al.] // Curr. Stem Cell Res. Ther. – 2009. – Vol. 4(1). – P. 2–8. 31. Growth factors and renal regeneration / M. Flaquer, P. Romagnani, J.M. Cruzado [et al.] // Nefrologia. – 2010. – Vol. 30(4). – P. 385–393. 32. Wise A.F. Mesenchymal stem cells in kidney inflammation and repair / A.F. Wise, S.D. Ricardo // Nephrology (Carlton). – 2012. – Vol. 17(1). – P. 1–10. 33. The regenerative potential of stem cells in acute renal failure / M. Morigi, A. Benigni, G. Remuzzi [et al.] // Cell Transplant. – 2006. – Vol. 15 Suppl. 1. – P. 111–117. 34. Romagnani P. Possible mechanisms of kidney repair / P. Romagnani, R. Kalluri // Fibrogenesis Tissue Repair. – 2009. - Vol. 2(1). – P. 3. 35. Chhabra P. The use of stem cells in kidney disease / P. Chhabra, K.L. Brayman // Curr. Opin. Organ Translant. – 2009. – Vol. 14(1). – P. 72–78. 36. Yeagy B.A. Kidney repair and stem cells: a complex and controversial process / B.A. Yeagy, S. Cherqui // Pediatr. Nephrol.– 2011. – Vol. 26(9). – P. 1427–1434.

310

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

37. Human embryonic mesenchymal stem cell-derived conditioned medium rescus kidney function in rats with established chronic kidney disease // A. Van Koppen, J.A. Joles, van Balkom [et al.] // PLoS One. – 2012. – Vol. 7(6). – P. e38746. 38. The renal papilla is a nishe for adult kidney stem cells / J.A. Oliver, O. Maaroef, F.H. Cheema [et al.] // J. Clin. Invest. – 2004.– Vol. 114. – P. 795–804. 39. Proliferation and Migration of Label-Retaining Cells of the Kidney Papilla / J.A. Oliver, A. Kinakis, H. Faisal [et al.] // J. Аm. Soc. Nephrol. – 2009. – Vol. 20(11). – P. 2315–2327. 40. Normal distribution and medullary-to-cortical shifts of Nestin-expressing cells in acute renal ischemia / D. Patshan, T. Michurina, H.K. Shi [et al.] // Kidney. – 2007. – Vol. 71(8). – P. 744–754. 41. Review article : Endothelial progenitor cells in renal disease / M.S. Goligorsky, M.C. Kuo, D. Patshan [et al.] // Nephrology (Carlton). – 2009. – Vol. 14(3). – P. 291–297. 42. Herrera G.A. Mesangial homeostasis and pathology: their role in health and disease / G.A. Herrera, E.A. Turbat–Herrera, J. Teng // Contribut. Nephrol. – 2011. – Vol. 169. – P. 6–22. 43. Vascular wall resident progenitor cells: a source for postnatal vasculogenesis / E. Zengin, F. Chalajour, U.M. Gehling [et al.] // Development. – 2006. – Vol. 133(8). – P. 1543–1551. 44. Resident vascular progenitor cells – diverse origins, phenotype, and function / P.J. Psaltis, A. Harbuzaniu, S. Delacroix [et al.] // J. Cardiovasc. Transl. Res. – 2011. – Vol. 4(2). – P. 161–176. 45. Klein D. Vascular wall–resident stem cells / D. Klein, H.P. Hohn, V. Kleft [et al.] // Histol. Histopathol. – 2010. – Vol. 25(5).– P. 681–689. 46. Vascular wall–resident CD44+ multipotent stem cells give rise to pericytes and smooth muscle cells and contribute to new vessel maturation / D. Klein, P. Weisshardt, V. Kleft [et al.] // PLoS One. – 2011. – Vol. 6(5). – P. e20. 47. Grgic I. The origin of interstitial myofibroblasts in chronic kidney disease / I. Grgic, J.S. Duffield, B.D. Humphreys // Pediatr. Nephrol. – 2012. – Vol. 27(2). – P. 183–193.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

311

48. The role of perivascular cells in kidney interstitial injury / A. Rojas, F.C. Chang, S.L. Lin [et al.] // Clin. Nephrol. – 2012. – Vol. 75(5). – P. 400–408. 49. Pericyte TIMP3 and ADAMTS1 modulate vascular stability after kidney injury / C. Schrimpf, C. Xin, G. Campanholle [et al.] // J. Am. Soc. Nephrol. – 2012. – Vol. 25(3). – P. 868–883. 50. Hofmann N.A. Endothelial colony-forming progenitor cell isolation and expansion / N.A. Hofmann, A. Reinisch, D. Strunk // Methods Mol. Biol. – 2012. – Vol. 879. – P. 381–387. 51. Yoder M.S. Is endothelium the origin of endothelial progenitor cells? / M.S. Yoder // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.– 2010. – Vol. 30(6). – P. 1094–1103. 52. Yuen D.A. Bone marrow cell therapies for endothelial repair and their revelance to kidney disease / D.A. Yuen, R.E. Gilbert, P.A. Marshen // Semin. Nephrol. – 2012. – Vol. 32(2). – P. 215– 223. 53. Intrarenal injection of bone marrow–derived angiogenic cells reduces endothelial injury and mesangial cell activation in experimental glomerulonephritis / H. Uchimura, T. Marumo, O. Takase [et al.] // J. Am. Soc. Nephrol. – 2005. – Vol. 16(4). – P. 997–1104. 54. Bruno S. Isolation and characterization of resistent mesenchymal stem cells in human glomeruli / S. Bruno, G. Camussi // Methods Mol. Biol. – 2012. – Vol. 879. – P. 367–380. 55. Inoue C.N. LPA as a determinant of mesangial growth and apoptosis / C.N. Inoue // Semin. Nephrol. – 2002. – Vol. 22(5). – P. 415–422. 56. Scindia Y.M. Mesangial pathology in glomerular disease: targets for therapeutic intervention / Y.M. Scindia, U.S. Deshmukh, H. Bagavant // Adv. Drug Deliv. Rev. – 2010. – Vol. 62(14). – P. 1337–1343. 57. Herrera G.A. Glomerular repair: present status and future expactations / G.A. Herrera, E.A. Turlat– Herrera, J. Teng // Contrib. Nephrol. – 2011. – Vol. 169. – P. 351–362. 58. Herrera G.A. Plasticity of mesangial cells: a basis for understanding pathological alterations / G.A. Herrera // Ultrastruct. Pathol. – 2006. – Vol. 30(6). – P. 477–479.

312

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

59. Differentiation of human mesenchymal stem cells into mesangial cells in post-glomerular injury murine model / C.Y. Wong, S.K. Cheong, P.L. Mok [et al.] // Pathology. – 2008. – Vol. 40(1). – P. 52–57. 60. Pleniceanu O. Concise review: Kidneystem / progenitor cells: differentiate, sort out, or reprogram? / O. Pleniceanu, O. HarariSteinberg, B. Dekel // Stem Сells. – 2010. – Vol. 29(8). – P. 1649–1660. 61. Current progress and potential practical application for human pluripotent stem cells / E.C. Philonenko, M.V. Shutova, I.V. Chestkov [et al.] // Int. Rev. Cell Biol. – 2011. – Vol. 292. – P. 153–196. 62. How far are induced pluripotent stem cells from the clinic? M. Li, M. Chen, W. Han [et al.] // Ageing Res. Rev. – 2010. – Vol. 9(3). – P. 257–264. 63. Zhon H. Evolution of induced pluripotent stem cell technology / H. Zhon, S. Dings // Curr. Opin. Hematol. – 2010. – Vol. 17(4). – P. 276–280. 64. Lin Sl. Concise review: Deciphering the mechanism behind induced pluripotent stem cell generation / Sl. Lim // Stem Cells. – 2011. – Vol. 29(11). – P. 1645–1649. 65. Hanna J.H. Pluripotency and cellular reprogramming facts, hypothesis, unresolved issues / J.H. Hanna, K. Saha, R. Jaenisch // Cell. – 2010. – Vol. 143(4). – P. 508–525. 66. Bilic J. Concise review: Induced pluripotent stem cells versus embryonic stem cells: close enough or yet too far apart? / J. Bilic, J.C. Izpisua Belmonte // Stem Cells. – 2012. – Vol. 30(1). – P. 33–41. 67. Induced pluripotent stem cells: epigenetic memories and practical implications / G.J. Sallivan, Y. Bai, J. Fletcher [et al.] // Mol. Hum. Reprod. – 2010. – Vol. 16(12). – P. 880–885. 68. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells / K. Kim, A. Doi, B. Wen [et al.] // Nature. – 2010. – Vol. 467(7313).– P. 285–290. 69. The senescence–related mitochondrial / oxidative stress pathway is repressed in human induced pluripotent stem cells / A. Prigone, B. Fauler, R. Lurz [et al.] // Stem Cells. – 2010. – Vol. 28(4). – P. 721–733. 70. The metabolome of induced pluripotent stem cells reveals metabolic changes occuring in somatic cell reprogramming / A.D.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

313

Panopoulos, O. Janes, S. Ruiz [et al.] // Cell Res. – 2012. – Vol. 22(1). – P. 168–177. 71. Successful disease–specific induced pluripotent stem cell generation from patients with kidney transplantation / T. Thatava, A.S. Armstrong, J.G. De Lamo [et al.] // Stem Cell Res. Ther. – 2011. – Vol. 2(6). – P. 48. 72. Buzhor E. Kidney spheroids recapitulate tubular organoids leading to enchanged tubulogenic potency of human kidney-derived cells / E. Buzhor, O. Harari-Steinberg, D. Omer // Tissue eng. Part A. – 2011. – Vol. 17(17–18). – P. 2305–2319. 73. Nerem R.M. Cell-based therapies: from basic biology to replacement, repair, and regeneration / R.M. Nerem // Biomaterials.– 2009. – Vol. 61(12). – P. 1084–1096. 74. Tabata Y. Important contribution and necessity of stem cells scanffolds for regenerative medicine and therapeutic applications / Nihon Rinsho. – 2008. – Vol. 66(5). – P. 881-886. 75. Decellularized matrices for tissue engineering / T. Hoshiba, H. Lu, N. Kawazoe [et al.] // Expert Opin. Biol. Ther. – 2010. – Vol. 10(12). – P. 1717–1728. 76. Badylak S.F. Whole–organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three–dimentional matrix scaffords / S.F. Badylak, D. Taylor, K. Uygun // Annu Rev. Biomed. Eng. – 2011. – Vol. 13. – P. 27–53. 77. Song J.J. Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds / J.J. Song, H.C. Ott // Trends Mol. Med. – 2011. – Vol. 17(8). - P. 424–432. 78. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering / K.H. Nakayama, C.A. Batchelder, Cl. Lee [et al.] // Tissue Eng. Part A. – 2010. – Vol. 16(7). – P. 2207–2216. 79. Nakayama K.H. Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences / K.H. Nakayama, C.A. Batchelder, Cl. Lee [et al.] // Tissue Eng. Part A. – 2011. – Vol. 17(23-24). – P. 2891–2901. 80. Lim S.H. Electrospun scaffolds for stem cell engineering / S.H. Lim, H.Q. Mao // Adv. Drug Deliv. Rev. – 2009. – Vol. 61(12). – P. 1084–1096.

314

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

81. Nanotechnology for regenerative medicine / D. Khang, J. Carpenter, Y.W. Chung [et al.] // Biomed. Microdevices. – 2010. – Vol. 12(4). – P. 575–587. 82. Kubinova S. Nanotechnologies in regenerative medicine / S. Kubinova, E. Sykova // Minim. Invasive Ther. Allied Technol. – 2010. – Vol. 19(3). – P. 144–156. 83. Verma S. Nanomaterials for regenerative medicine / S. Verma, A.J. Domb, N. Kumar // Nanomedicine. – 2010. – Vol. 6(1). – P. 157–181. Американські вчені виростили з клітин шкіри справжні клітинипопередники сперматозоїдів. Використані клітини шкіри чоловіків, в яких викликали посилену експресію певних генів. http://glob-news.ru/zdorovie/1081-z-klitin-shkiri-virostili-klitinipoperedniki-spermatozoidiv.html

3.6. Чоловіча статева система Сперматогенез у ссавців є класичним процесом, пов'язаним із дорослими СК для підтримання самооновлення і диференціювання стовбурових клітин сперматогоній, вивчення яких забезпе чує краще розуміння їхньої клітинної біології з метою лікування чоловічого безпліддя і пухлинних захворювань яєчка. Чоловічі гермінативні СК - СК сперматогоній (сперматогоніальні) - становлять єдину лінію зародкових клітин у дорослих, які потрібні для безперервної підтримки сперматогенезу. Вважається, що чоловічі статеві клітини розмножуються і диференціюються від періоду статевого дозрівання протягом усього життя [1]. Метою очищення, культивування, кріоконсервації СК сперматогоній є вивчення можливості їхньої трансплантації чоловікам при безплідді, що вперше було виконано в 1994 р. Ці клітини в людини і тварин отримують з основного компартменту звивистих сім'яних трубочок і вирощують у культурі. Тому до відомої допоміжної репродуктивної технології запліднення ооцитів можна віднести також клінічне використання культивованих людських СК сперматогоній [2]. Збереження та самооновлення в стовбуровоклітинній ніші сперматогоній жорстко регулюється зовнішніми сигналами з нав

фібробластів-2 (FGF2) і диференціації - активін, кістковий морфогенeтичний білок-4 (BMP4) i фактор росту СК (SCF). Через клітини Сертолі (непрямо) діють SCF1, який продукується інтерстиційними ендокриноцитами (клітинами Лейдіга), і фолікул-стимулюючий гормон [4 - 6]. Водночас молекули адгезії приєднують СК сперматогоній Розділ 3. С товбурові клітини клітинної органів і систем дорослого організму 315 до базальної мембрани і клітини інтерстицію і є важливими регуляторами колишнього і забезпечуєв нормальний функції ніші [7]. мікрооточення Ці фактори експресуються неоднакових сперматогекількостях у нез [3] (рис. 23). перинатальному і пубертатному періодах онтогенезу [8]. GDNF FSH GFRα-1/Ret Fgf2 TNFα IL-1β Клітини СКС Сертолі Клітини - міоїдні, інтерстиційні, адвентиційні

Базальна мембрана

Рис. 23. Управління самовідновленням стовбурових клітин сперматогоній (СКС) Рис. 22. Управління самовідновленням стовбурових клітин фактором гліального походження (GDNF), який експресується клітинами сперматогоній (СКС) нейтрофічним фактором гліального походження Сертолі під контролем фолікул-стимулюючого гормону (FSH), фактора росту (GDNF), який експресується клітинами Сертолі (TNF-α) під контролем фолікулфібробластів (FGF-2), фактора некрозу пухлин-α та інтерлейкінa1β стимулюючого гормону (FSH), αфактора фібробластів (FGF-2),фактора фактора (IL-1β) за участі рецептора родини росту гліального нейротрофічного та протоонкогена - Ret.за участі рецептора α некрозу пухлин-α (TNF-α)(GFRα-1) та інтерлейкінa1β (IL-1β)

родини гліального нейротрофічного фактора (GFRα-1) та протоонкогена Одним із основних компонентів ніші є сустентоцити (клітиRet.

ни Сертолі). Сустентоцити здатні виробляти фактори росту, які стимулюють самовідновлення - нейротрофічний гліальний факНа самооновлення статевих клітин у гризунів великий вплив чинить тор (GDNF), фібробластів фактору 2 (FGF-2)росту і диференціації (GDNF) - член фактор родини росту трансформуючого - β, який продукується і відіграє важливу роль у проліферації та - активін,сустентоцитами кістковий морфогенeтичний білок 4 (BMP-4) i фактор диференціації СК сперматогоній [9] (рис. 23 ). росту СК (SCF). Через клітини Сертолі (непрямо) діють SCF1, У СК миші GDNF інтерстиційними активує експресію фактора транскрипції(клітинагенів, що який продукується ендокриноцитами кодують bcl6b, etv5 і Lhx1, які впливають на їхнє самооновлення. Крім них ми Лейдіга), і фолікул-стимулюючий гормон [4 - 6]. (GDNF) беруть участь не-GDNF стимульовані фактори транскрипції PLZF і Водночас молекули клітинної адгезії приєднують СК спермаTaf4b. Разом, ці молекули є частиною потужної мережі генів, що контролює тогоній до базальноїякі мембрани і клітини інтерстицію і є важлидолю СК сперматогоній, мають місце в регуляторних мережах інших вимистовбурових регуляторами функції ніші [7].[10]. Ці Навпаки, факториіснують експресуються дорослих клітинних популяціях фактори, в неоднакових кількостях у перинатальному пубертатному пеякі пригнічують проліферацію, викликаючи апоптоз - цеізменшення експресії гена ріодах Pou3f1 короткими РНК (міРНК) у культурі [11]. онтогенезуінтерферуючими [8]. СК можна сортувати за допомогою до GDNFНасперматогоній самооновлення статевих клітин у гризунівантитіл великий вплив receptor-alpha-1 (GFRA1). Таким методом імуноцитохімічно виявляють від 95 чинить GDNF - член родини трансформуючого фактору росту β, до 99 % СК [12]. У людини підтверджена присутність (GFRA1)-клітин і 5% який продукується сустентоцитами і відіграє важливу роль у від них можуть генеруватися асиметричним поділом [13, 14]. проліферації та диференціації СК сперматогоній [9] (рис. 24). У СК миші GDNF активує експресію фактора транскрипції генів, що кодують bcl6b, etv5 і Lhx1, які впливають на їхнє самооновлення. Крім них (GDNF) беруть участь не-GDNF стимульовані фактори транскрипції PLZF і Taf4b. Разом, ці молекули є

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

316

GDNF GFRα1 Плазмолема

Ret Фосфорилювання Shc Фосфорилювання Grb2

Цитоплазма Ras

Активація

ERK1/2

Ядро

CREB-1 ATF-1 CREM-1

Фосфорилювання c-fos

cyclin A

S фаза

CDK2

Рис. 24. механізмів, які активуються під впливом гліального Рис.Каскад 23. Каскад механізмів, які активуються під впливомнейтрофічгліального ного фактора (GDNF),(GDNF), у розвитку стовбурових сперматогоній.клітин нейтрофічного фактора у розвиткуклітин стовбурових сперматогоній. частиною потужної мережі генів, що контролює долю СК спер-

матогоній, які мають місце в регуляторних мережах інших доПри дослідженні матеріалу (яєчко) від 6 дорослих чоловіків, які рослих стовбуровоклітинних популяціях перенесли орхідектомію, як частину лікування[10]. ракуНавпаки, простати, існують виділяли фактори, які пригнічують проліферацію, викликаючи клітини яєчка, культивували в збагаченому середовищі StemPro апоптоз і отримали це зменшення експресії генаНаявність Pou3f1 короткими інтерферуючими кластери зародкових СК [15]. сперматогоній визначали за допомогою полімеразної реакції РНК (міРНК) у культурі [11].транскриптази та імунофлюоресценції сперматогоніальних маркерів. Для перевірки функціональних СК сперматогоній можна сортуватиназанаявність допомогою антитіл до СК GDNF-receptor-alpha-1 сперматогоній у культурі (GFRA1). була виконана ксенотрансплантація в сім'яники Таким методом імуноцитохімічімунодефіцитних мишей. Мігруючі СК сперматогоній людини після но виявляють від 95 до 99 % СК [12]. У людини підтверджена трансплантації були визначені шляхом СОТ-1 флуоресценції гібридизації in (GFRA1)-клітин і 5% від них вивчали можуть вгенеруватися situ.присутність Кількість колонізованих СК сперматогоній різні терміни асиметричним поділом [13, 14]. культивування. Установили, що клітини яєчка зберігаються і розмножуються

до 15 тижнів. Кластери статевих СК виникли в культурах клітин яєчок усіх 6

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

317

При дослідженні матеріалу (яєчко) від 6 дорослих чоловіків, які перенесли орхідектомію, як частину лікування раку простати, виділяли клітини яєчка, культивували в збагаченому середовищі StemPro і отримали кластери зародкових СК [15]. Наявність сперматогоній визначали за допомогою полімеразної реакції транскриптази та імунофлуоресценції сперматогоніальних маркерів. Для перевірки на наявність функціональних СК сперматогоній у культурі була виконана ксенотрансплантація в сім'яники імунодефіцитних мишей. Мігруючі СК сперматогоній людини після трансплантації були визначені шляхом СОТ-1 флуоресценції гібридизації in situ. Кількість колонізованих СК сперматогоній вивчали в різні терміни культивування. Установили, що клітини яєчка зберігаються і розмножуються до 15 тижнів. Кластери статевих СК виникли в культурах клітин яєчок усіх 6 чоловіків, при субкультивації розмножувалися до 28 тижнів. Експресія сперматогоніальних маркерів на РНК і рівень білка підтримувалася протягом усього періоду культивування. Ксенотрансплантація клітин від 4 із 6 чоловіків мишам продемонструвала наявність функціональних СК сперматогоній, навіть після тривалого їх перебування в культурі в пробірці. Протягом 19 днів кількість СК сперматогоній у культурі збільшилася в 53 рази і протягом 64 днів - у 18450 разів. Тобто, довготривала культура з розмноженням СК сперматогоній можлива. Автори наводять один із випадків застосування цих відомостей - виконання прогнозованого забору матеріалу яєчок від молодих осіб до застосування високих доз хіміотерапії при лікуванні злоякісних пухлин, які призводять до бізпліддя в зрілому віці, його кріоконсервацію з подальшою автотрансплантацією для відновлення фертильності. Установлено, що додавання до культури СК сперматогоній людини нейротрофічного фактору гліоцитів (GDNF), основного фактору росту фібробластів (BFGF), епідермального фактору росту (EGF) і фактору-інгібітора лейкемії мишей (LIF) значно збільшувало кількість кластерів СК сперматогоній, які експресували сперматогоніальні маркери протягом усього часу культивування. Ультрамікроскопічне дослідження культивованих клітин виявили типову морфологію, характерну для СК сперматогоній [16].

318

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Першими були вивчені СК сперматогоній у гризунів - миші і щура. Останнім часом велика увага приділяється цим клітинам у приматів. Визначено, що вони володіють деякими маркерними відмінностями, порівняно з гризунами, що має певне значення для вивчення кінетики сперматогоніального оновлення, проліферації та клональної диференціації в сперматогенезі приматів [17, 18]. В яєчку дорослих приматів, є різні популяції CD90 + CD49f + CD117- (потрійно забарвлені) клітини і невелика популя ція клітин із маркером специфічного ембріонального антигену-4 SSEA-4+, обидва види клітин локалізовані на базальній мембрані звивистих сім'яних трубочок, демонструють високу активність теломерази, однак тільки в дорослих мавп SSEA-4+ клітини яєчка функціонально активні і проліферують, як це спостерігали при їхній подальшій трансплантації в яєчко миші. Аналіз ДНК із цих груп показав, що SSEA-4+ клітини містять профіль ДНК, подібний до клітин, які активно діляться, тоді як потрійно забарвлені клітини мають затримку в S-фазі клітинного циклу [19]. Цікавими є результати дослідження СК сперматогоній у мишей, проведені F. Izadyar et al. [20]. Автори виявили дві стовбуровоклітинні лінії серед зародкових клітин яєчка відносно експресії транскрипційного фактора Pou5f1 і с-Kit рецептора. Тільки POU5F1+/с-Kit+ підмножина зародкової лінії СК, при виділенні від новонароджених або дорослих сім'яників і культивуванні в складній суміші факторів росту, формує клітинні лінії, які експресують маркери плюрипотентних ембріональних СК, тобто Pou5f1, Nanog, Sox2, Rex1, Dppa5, SSEA-1 і лужної фосфатази, проявляють високу активність теломерази і диференціюються в кілька ліній, у тому числі кардіоміоцитів, нервових клітин і хондроцитів. Ці дані показують існування двох різних популяцій у зародковій лінії СК: одним судилося стати СК сперматогоній, а іншим - із можливістю генерувати клітинні лінії з деякими плюрипотентними характеристиками. Висловлено припущення про індукцію диференціації СК сперматогоній яєчка на різні тканини, що може забезпечити простий доступ до СК без етичних та імунологічних проблем, які пов'язані з використанням ембріональних СК людини, і є привабливою альтернативою для майбутньої клітинної терапії в людини [21 - 25]. Ці дані були

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

319

підтверджені N. Kossack [26] на біопсійному матеріалі від яєчка людини. Автори отримали гермінативні СК, які експресували маркери плюрипотетності, формували ембріоїдні тільця, що містили похідні всіх трьох зародкових листків і нормальний XY каріотип, були гіперметильовані на Н19 локусі і експресували високі рівні теломерази. Водночас, окремі дослідники висловлюють критичні погляди на можливість вирощування плюрипотентних клітин з яєчка людини [27]. До того ж вони застерігають від індукції ретровіру сами, гени яких можуть призводити до розвитку злоякісних пухлин [28, 29]. У літературі, яка присвячена гаметогенезу, велика увага останнім часом приділяється дуже маленьким ембріональним стовбуровим клітинам (VSEL) [30]. Автори стверджують, що VSEL є первинними зародковими клітинами, які мігрують у ділянку майбутніх статевих залоз під час раннього ембріонального розвитку і зберігаються в зрілому віці. Точиться дискусія, чи в сперматогенезі VSEL клітини (діаметр 1-3 мкм) аналогічні до примордіальних гермінативних клітин (діаметр 15-20 мкм), чи це інші клітини. Тобто, необхідні подальші дослідження, щоб краще зрозуміти, чи є VSEL клітини аналогічними або є більше примітивними відносно примордіальних гермінативних клітин. Згідно такої точки зору, останні можуть стати джерелом плюрипотентних СК in vitro, але вони не поводять себе як СК in vivo. Пізніше в період внутрішньоутробного розвитку істинної популяції СК сперматогоніальні СК з'являються в яєчках і протягом усього життя діляться, породжуючи хвилі сперматогенезу. VSEL клітини є нащадками епібласта і плюрипотентними СК. Вони осідають у різних органах тіла, включаючи статеві залози на ранніх стадіях розвитку, і можливо, служать в якості резерву тканинних СК. Ці дві популяції стовбурових клітин (VSEL і тканинні СК) разом несуть відповідальність за відновлення тканин, гомеостаз, і регенерацію після травми протягом усього життя, їхня кількість зменшується з віком. Гіпотеза про співіснування двох популяцій СК (більш примітивних у стані спокою і клітин-попередниць, які більш швидко діляться), була нещодавно запропонована N. Li, H. Clevers [31]. У різних моде-

320

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

лях хвороби, як інфаркт міокарда, інсульт, травми, опіку шкіри, для нейронної регенерації та інших ці клітини мобілізуються в обіг протягом 24 годин. Оскільки вони стають дефіцитними з віком, регенерація може стати неефективною саме через недостатність їхньої кількості з віком. Вікове зменшення кількості і якості сперматозоїдів у мишей і людей, імовірно, залежить від вікових змін клітин стовбурової ніші. Найбільша кількість плюрипотентних VSEL клітин із маркерами Oct4+, SSEA1+, Sca1+, Lin–, CD45–, знаходиться в головному мозку, нирках, м'язах, підшлунковій залозі та червоному кістковому мозку. Це диплоїдні клітини з високою активністю теломерази, експресують інші маркери плюрипотентних (Rex-1, Nanog, SSEA і KLF-4) і статевих клітин (Mvh, SSEA, Fragilis, Nobox і HDAC-6). Як ембріональні СК, вони не експресують MHC класу I і HLA-DR антигени і також негативні по відношенню до мезенхімних СК маркерів CD90, CD105 і CD29. Їхній ядерно-цитоплазматичний коефіцієнт високий, ядра великі з вираженим еухроматином і відкритою структурою хроматину для Oct4 і Nanog промоутерів. У природних нішах в яєчку VSEL були локалізовані в базальному шарі клітин, прилеглих до базальної мембрані в звивистих сім'яних канальцях. VSEL клітини можуть стати клітинами-попередницями ракових клітин. Дослідники вважають, що при цьому клітини з асиметричним типом поділу клітин за нормальних умов, переходять до симетричного. Водночас висловлюються великі сподівання на те, що VSEL клітини стануть для регенеративної медицини джерелом плюрипотентних СК. Щодо СК інтерстиційних ендокриноцитів (клітин Лейдіга) є лише поодинокі повідомлення. Ці клітини розвиваються під час закладки інтерстиційної тканини яєчка [32]. Автори охарактеризували нові маркери в гонадах - MAFB, C-MAF, VCAM1 і пов'язують їх із клітинами-попередницями інтерстиційних ендокриноцитів. Водночас, не виключається можливість походження ендокриноцитів із мезенхімних клітин, які локалізуються навколо кровоносних судин. У постнатальному періоді проліферація і диференціація інтерстиційних ендокриноцитів знаходяться під впливом тестостерону і естрогенів, які регулюють кількість зрілих інтерстиційних клітин [33]. Інсулін-подібний фактор росту 1

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

321

індукує проліферацію клітин-попередниць. Трансформуючий фактор росту α є мітогеном для мезенхімних попередників клітин. Тромбоцитарний фактор росту є важливим фактором для диференціації незрілих інтерстиційних клітин. Гормон щитоподібної залози є критичним для проліферації мезенхімних попередників, прискорення диференціації мезенхімних клітин у клітини-попередниці, посилює проліферацію новоутворених клітин Лейдіга не тільки в пренатальному періоді, але й в яєчках дорослих щурів. Таким чином, більш глибоке розуміння процесу самооновлення СК сперматогоній дозволить використовувати ці клітини для трансгенезу тварин і в лікуванні захворювань людини [34]. • Матеріали опубліковані в статті Дєльцова О.І. Стовбурові клітини яєчка / О.І. Дєльцова, Ю.Б. Чайковський, С.Б. Геращен ко // Морфологічні основи наукових досліджень у медицині. Науково-практична конференція, присвячена 110-річчю з дня народження М.І.Зазибіна. – Київ, 2013. – С. 16-22. Література 1. Ogawa T. Spermatogonial transplantation: the principle and possible applications / T. Ogawa // J. Mol. Med. (Berl). - 2001. Vol. 79(7). - P. 368-374. 2. Kubota H. Technology insight: In vitro culture of spermatogonial stem cells and their potential therapeutic uses / H. Kubota, R.L. Brinster // Nat. Clin. Pract. Endocrinol. Metab. 2006. - Vol. 2(2). - P. 99-108. 3. Ogawa T. The niche for spermatogonial stem cells in the mammalian testis / T. Ogawa, M. Ohmura, K. Ohbo // Int. J. Hematol. - 2005. - Vol. 82(5). - P. 381-388. 4. de Rooij D.G. The spermatogonial stem cell niche / D.G. de Rooij // Microsc. Res. Tech. - 2009. - Vol. 72(8). - P. 580-585. 5. Identification of glial cell line-derived neurotrophic factorregulated genes important for spermatogonial stem cell self-renewal in the rat / J.A. Schmidt, M.R. Avarbock, J.W. Tobias [et al.] // Biol. Reprod. - 2009. - Vol. 81(1). - P. 56-66. 6. The spermatogonial stem cell niche in the collared peccary (Tayassu tajacu) / P.H. Campos-Junior, G.M. Costa, S.M. Lacerda [et al.] // Biol. Reprod. - 2012. - Vol. 86(5). - P. 1-10.

322

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

7. Hofmann M.C. Gdnf signaling pathways within the mammalian spermatogonial stem cell niche / M.C. Hofmann // Mol. Cell Endocrinol. - 2008. - Vol. 288(1-2). - P.95-103. 8. Dadoune J.P. New insights into male gametogenesis: what about the spermatogonial stem cell niche? / J.P. Dadoune // Folia Histochem. Cytobiol. - 2007. - Vol. 45(3). - P. 141-147. 9. Regulatory effect of GDNF on the proliferation and differentiation of mammalian spermatogonial stem cells / X.Y. Li, Y.J. Liu, L.L. Hou [et al.] // Zhonghua Nan Ke Xue. - 2011. - Vol. 17(7). - P. 628-633. 10. Oatley J.M. Regulation of spermatogonial stem cell selfrenewal in mammals / J.M. Oatley, R.L. Brinster // Annu Rev. Cell Dev. Biol. - 2008. - Vol. 24. - P. 263-286. 11. The POU domain transcription factor POU3F1 is an important intrinsic regulator of GDNF-induced survival and selfrenewal of mouse spermatogonial stem cells /X. Wu, J.M. Oatley, M.J. Oatley [et al.] // Biol. Reprod. - 2010. - Vol. 82(6). - P. 1103-1111. 12. The molecular signature of spermatogonial stem/progenitor cells in the 6-day-old mouse testis / M. Kokkinaki, T.L. Lee, Z. He [et al.] // Biol. Reprod. - 2009. - Vol. 80(4). - P. 707-717. 13. Identification of spermatogonial stem cell subsets by morphological analysis and prospective isolation / L. Grisanti, I. Falciatori, M. Grasso [et al.] // Stem Cells. - 2009. - Vol. 27(12). - P. 3043-3052. 14. Isolation of human male germ-line stem cells using enzymatic digestion and magnetic-activated cell sorting / Z. He, M. Kokkinaki, J. Jiang [et al.] // Methods Mol. Biol. - 2012. - Vol. 825. - P. 45-57. 15. Propagation of human spermatogonial stem cells in vitro / H. Sadri-Ardekani, S.C. Mizrak, S.K. van Daalen [et al.] // JAMA. - 2009. - Vol. 302(19). - P. 2127-2134. 16. Proliferation of small number of human spermatogonial stem cells obtained from azoospermic patients / M. Koruji, A. Shahverdi, A. Janan [et al.] // J. Assist. Reprod. Genet. - 2012. Vol. 29(9). - P. 957-967. 17. Molecular dissection of the male germ cell lineage identifies putative spermatogonial stem cells in rhesus macaques / B.P.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

323

Hermann, M. Sukhwani, D.R. [et al.] // Hum. Reprod. - 2009. Vol. 24(7). - P. 1704-1716. 18. Spermatogonial stem cells in higher primates: are there differences from those in rodents? / B.P. Hermann, M. Sukhwani, M.C. Hansel [et al.] // Reproduction. - 2010. - Vol. 139(3). - P. 479-493. 19. Phenotypic and molecular characterization of spermatogonial stem cells in adult primate testes / C.B. Maki, J. Pacchiarotti, T. Ramos [et al.] // Hum. Reprod. - 2009. - Vol. 24(6). - P. 1480-1491. 20. Generation of multipotent cell lines from a distinct population of male germ line stem cells / F. Izadyar, F. Pau, J. Marh [et al.] // Reproduction. - 2008. - Vol. 135(6). - P. 771-784. 21. Generation of pluripotent stem cells from adult human testis / S. Conrad, M. Renninger, J. Hennenlotter [et al.] // Nature. - 2008. - Vol. 456(7220). - P. 344-349. 22. Potency of germ cells and its relevance for regenerative medicine / P. Mardanpour, K. Guan, J. Nolte [et al.] // J. Anat. 2008. - Vol. 213(1). - P. 26-29. 23. Feng L.X. Updated dedifferentiation and pluripotency of spermatogonial stem cells / L.X. Feng, X.F. Chen // Zhonghua Nan Ke Xue. - 2009. - Vol. 15(5). - P. 387-389. Kee K. Testicular germline stem cells / K. Kee, R.A. Pera, P.J. Turek // Nat. Rev. Urol. - 2010. - Vol. 7(2). - P. 94-100. 24. Embryonic stem cell-like cells derived from adult human testis / S.C. Mizrak, J.V. Chikhovskaya, H. Sadri-Ardekani [et al.] // Hum. Reprod. - 2010. - Vol. 25(1). - P. 158-167. 25. Simon L. Spermatogonial stem cells, in vivo transdifferentiation and human regenerative medicine / L. Simon, R.A. Hess, P.S. Cooke // Expert. Opin. Biol. Ther. - 2010. - Vol. 10(4). - P. 519-530. 26. Isolation and characterization of pluripotent human spermatogonial stem cell-derived cells / N. Kossack, J. Meneses, S. Shefi [et al.] // Stem Cells. - 2009. - Vol. 27(1). - P.138-149. 27. Concise review: challenging the pluripotency of human testis-derived ESC-like cells / N. Tapia, M.J. Ara'uzo-Bravo, K. Ko [et al.] // Stem Cells. - 2011. - Vol. 29(8). - P. 1165-1169. 28. Spermatogonial stem cells: unlimited potential / M. Dym, Z. He, J. Jiang [et al.] // Reprod. Fertil. Dev. - 2009. - Vol. 21(1). - P. 15-21.

324

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

29. Zhang Y. Generation and application of pluripotent stem cells from spermatogonial stem cells / Y. Zhang, Y. Wu // Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi. - 2011. - Vol. 28(1). - P. 208-212. 30. Very small embryonic-like stem cells: implications in reproductive biology / D. Bhartiya, S. Unni, S. Parte [et al.] // Biomed. Res. Int. - 2013;2013:682326. 31. Li N. Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals / N. Li, H. Clevers // Science. - 2010. - Vol. 327(5965). P. 542–545. 32. DeFalco T. Two distinct origins for Leydig cell progenitors in the fetal testis / T. DeFalco, S. Takahashi, B. Capel // Dev. Biol. - 2011. - Vol. 352(1). - P. 14-26. 33. Mendis-Handagama S.M. Differentiation of the adult Leydig cell population in the postnatal testis / S.M. Mendis-Handagama, H.D. Ariyaratne // Biol. Reprod. - 2001. - Vol. 65(3). - P. 660-671. 34. Kanatsu-Shinohara M. Spermatogonial stem cell selfrenewal and development / M. Kanatsu-Shinohara, T. Shinohara // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. - 2013. - Vol. 29. - P. 163-187. Простата. Брак донорів для трансплантації органів стимулював дослідження СК в якості потенційного ресурсу для клітинної терапії всіх тканин людини. В урології лікарі мають бути оптимістами щодо регенераційної медицини і тканинної інженерії, що можуть забезпечити основні методи лікування захворювань сечостатевої системи [1 - 4]. У зв'язку з цим, в останні роки був досягнутий швидкий прогрес в розумінні природи і ролі кандидата у СК у простаті дорослих [5], оскільки наші знання про самооновлення і диференціацію були обмежені і недосконалі. Водночас, мало повідомлень присвячено клінічному застосуванню знань щодо будови СК простати і можливостей лікування ними захворювань цього органа [6, 7]. Існування СК простати мають прямі і непрями докази. Так, зменшення вмісту андрогенів призводить до інволюції простати, а їхнє відновлення до регенерації залози. Непрямі докази наводяться на користь їхньої локалізації в базальному шарі епітеліальних структур [8]. Автори шляхом дисоціації виокремлювали СК простати дорослих мишей і трансплантували їх під капсулу

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

325

нирки. Ефективну проліферацію клітин спостерігали протягом 6-8 тижнів із відповідними маркерами і утворенням розгалужених трубчастих структур. Повідомляється, що разом із маркерами СК/клітин-попередниць простати - CD133, рецептора клітинної поверхні тирозин кінази КІТ і його ліганд-стовбуровоклітинним фактором (SCF) у біопсійному матеріалі дорослих виявляються нечисленні епітеліальні клітини з CD133+/CD133 (низький) / Bcl-2 (високий)/ цитокератини+/віментин–/КІЕ (низький)/SCF (низький) [9]. У стромальних клітинах виявлені мезенхімні маркери - CD133– / CD133 (високий) / Bcl-2 – / цитокератини–/KIT (високий)/SCF (високий). Невелика кількість базальних клітин (близько 1 %) простати людини експресує маркер клітинної поверхні CD133 і лише обмежені клітини – α(2)β (1)(hi). У мишей таких клітин набагато більше [10]. Фактор α(2)β(1)(hi)/CD133+ клітин демонст рує два важливих атрибути епітеліальних СК: вони володіють у пробірці високим проліферативним потенціалом і можуть відновлювати ацинуси передміхурової залози при їхній трансплантації самцям мишей з ослабленим імунітетом [11]. Такі клітини W.W. Barclay et al. [12], K.G. Leong [13], М. Ousset et al. [14] віднесли до мультипотентних СК, які диференціюються на базальні, секреторні та ендокриноцити, доповнивши маркерами: Lin–, Sca-1+, CD133+, CD44+, CD117+. Стовбурова ніша локалізується в базальному клітинному компартменті в тісному контакті з базальною мембраною і стромаль ноклітинним компартментом. Клітини ніші характеризуються екс пресією базальних цитокератинів 5 і 14, високим рівнем інтегринів, CD44, стовбуровоклітинними маркерами CD133 і ABCG2, і AR–. Вони започатковують лінії секреторних клітин, прилеглих до просвіту (цитокератини 8/18, CD57, AR, p27, PSA, PAP), і нейроендокринних клітин (цитокератини 8/18, CD57, CGA, NSE, ПВІ) – двох основних типів клітин залозистого епітелію. Зростаючий обсяг експериментальних досліджень виявив можливість участі CD44+, α(2)β(1)(hi), CD133+ клітин у розвитку раку простати [15]. Створення і характеристика клонів епітеліальної тканини простати людини можуть служити для розробки нових стратегій для профілактики і лікування раку простати [16, 17]. У межах

326

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

стовбурової ніші простати проявляються сигнальні шляхи епітеліо-мезенхімних взаємодій, оскільки тут локалізуються СК/клітини-попередниці епітеліального і мезенхімного походження [18]. Спеціально досліджували фенотип клітин простати в нормі і при пухлинному процесі. У СК дорослих був визначений фенотип клітин із маркерами CD44+/α(2)β(1) (високий)/CD133+. Клітини базального фенотипу також експресують (CD44+) CD49f+, CK5+, P63+, CK8-AR-PSA– [19, 20]. Стромальні клітини експресували фактор-1 (SDF-1) і його рецептор, CXCR4, які мають кілька важливих функцій, у тому числі хоумінг СК і метастазування ракових клітин. Ці клітини можна культивувати з утворенням "простасфер" і вони зберігають високий рівень експресії CD133 і АР [21, 22]. Особливістю культивування клітин простати є те, що сфери можна отримати з однієї клітини, а виростити СК на моношарі можна лише з групи клітин [23]. Описані методи отримання первинних культур клітин простати є досить складним при виконанні процесом [24, 25]. Вони потребують ферментативного розщеплення, фракціонування епітелію і строми і вирощування епітеліальних і стромальних клонів відповідно. В епітеліальній культурі містяться, переважно, базальні клітини, меншою популяцією серед них виявилися CD133+ клітини. При спільному культивуванні двох ліній епітеліальні клітини були здатні утворювати ацинусоподібні структури, які містити клітини кількох ліній [26]. У сигнальних шляхах СК простати також немає чіткої визначеності. Так, існують суперечливі дані щодо участі Wnt i Notch шляхів. Notch ліганди, в основному, експресуються в базальних клітинах епітеліальної лінії простати, тоді як активні сигнали Notch визначаються і в епітеліальних, і в секреторних клітинах [27]. TGF-β домінує над Notch сигналізацією і таким чином забезпечує реципрокну регуляторну петлю, яка пригнічує активність базальних клітин-попередниць у простаті миші [28]. Wnt раніше був визначений як ключовий посередник для підтримки СК тканин, але можливим є варіант перехресного регулювання з іншими шляхами (Notch), що беруть участь у гомеостазі дорослих тканин [29 - 31]. Підкреслюється важливість Wnt/Notch перехресної регуляції в стовбуровоклітинній біології

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

327

дорослих клітин і стверджується, що Wnt сигнали контролюють проліферацію та/або підтримання епітеліальних попередників за допомогою модуляції сигналів Notch [32, 33]. Проліферація базальних клітин, виділених із проксимальної ділянки протоки простати та клітини її стовбурової ніші регулюються частково протилежними ефектами SCF і ендогенного TFF-β [34]. Ідентифікація СК/клітин-попередниць являє собою найваж ли віший крок для передбачення можливої лінії епітеліальної злоякісної пухлини простати. Недавні дослідження сприяли значному прогресу у визначенні кандидата такої стовбуровоклітинної популяції, але залишили невирішеними ключові питання її локалізації і функціональних властивостей. M.M. Shen et al. [35] на підставі вивчення генетичного маркування in vivo повідомляють, що на їхню думку, у простаті локалізуються рідкісні клітини, які експресують Nkx3.1 homeobox gene і можуть бути джерелом пухлинних клітин простати. D.J. Vander Griend et al. [36] у культурі тканини простати при злоякісній пухлині виявили клітини, що ініціюють рак. Серед них присутні андроген-рецептор AR+ і CD133– клітини і AR сигнальні шляхи є терапевтичною мішенню для клітин, що ініціюють рак простати. C.J. Shepherd et al. [37] виявили в злоякісних пухлинних клітинах простати експресію транскрипційного фактора Olig1. Обговорюється питання ролі р63 в розвитку раку простати [38]. Був також запропонований маркер, який пов'язаний із передраковими станами простати, простато-специфічний антиген (PSA) [39]. Серед пухлинних клітин простати виявляються клітини, які експресують Oct4A/Chromogranin. Вважають, що вони беруть участь у диференціації ендокриноцитів [40]. Не меншу роль у канцерогенезі простати відіграють строма льні осередки ніші СК простати [41]. Hedgehog сигнальний шлях має важливу роль не тільки в розвитку простати, але й є характерною рисою пухлини простати, стимулює ріст пухлини і тому інгібітори цього шляху могли би стати перспективними для нових методів лікування задля уповільнення або розвитку регресії пухлини [42, 43]. Індуковані СК є цінним ресурсом для вивчення епігенетичних змін, критичних для специфічної диференціації простати.

328

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Повідомлення про перепрограмування нормальних епітеліальних клітин простати в плюрипотентні клітини поодинокі. Піонерами в цьому напрямку стали М. Moad et al. [44], H. Zhao et al. [45]. Автори спробували перепрограмувати базальні епітеліальні клітини простати за допомогою лентивірусного вектора і отримали ембріонально-подібні СК у вигляді колоній. Ці клітини з нормальним каріотипом експресували типові для поліпотентних СК маркери (Tra-1-81, SSEA-3, Nanog, Sox2, and Oct4), втратили можливість експресії маркерів, характерних для епітеліальних клітин (CK5, CK14, і p63), і продемонстрували плюрипотентні можливості диференціації в екто-, мезо- і ендодермальні клітини in vitro. Важливо відмітити, що індуковані клітини повторно експре сували маркери базальних епітеліальних клітин (CD44, p63, MAO-A) у відповідь на специфічне середовище сфероїдної культури. Андро ген-індукована експресія андрогенових рецепторів та спільне культивування з мезенхімою урогенітального синусу в щурів призвело до подальшої індукції експресії простато-специфічного антигену (РSА), який є відмінною рисою секреторних клітин. Література 1. Becker C. Stem cells for regeneration of urological structures / C. Becker, G. Jakse // Eur. Urol. - 2007. - Vol. 51(5). - P. 12171228. 2. Regenerative medicine: applications and development in urology / F. Pinto, A. Calarco, A. Brescia [et al.] // Urologia. 2007. - Vol. 74(4). - P. 197-205. 3. Aboushwareb T. Stem cells in urology / T. Aboushwareb, A. Atala // Nat. Clin. Pract. Urol. - 2008. - Vol. 5(11). - P. 621-631. 4. Yu R.N. Stem cells: a review and implications for urology / R.N. Yu, C.R. Estrada // Urology. - 2010. - Vol. 75(3). - P. 664-670. 5. Powers G.L. Recent advances in prostate development and links to prostatic diseases / G.L. Powers, P.C. Marker // Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. - 2013. - Vol. 5(2). - P. 243-256. 6. Pastor-Navarro T. Stem cells and regenerative medicine in urology, part 2: urothelium, urinary bladder, urethra and prostate / T. Pastor-Navarro, M. Beamud-Cortés // Actas Urol. Esp. - 2010.Vol. 34(7). - P. 592-597.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

329

7. Shokeir A.A. Tissue engineering and stem cells: basic principles and applications in urology / A.A. Shokeir, A.M. Harraz, A.B. El-Din // Int. J. Urol. - 2010. - Vol. 17(12). - P. 964-973. 8. In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme / L. Xin, H. Ide, Y. Kim [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - Vol. 100, Suppl. 1. - P. 11896-11903. 9. The characterization of epithelial and stromal subsets of candidate stem/progenitor cells in the human adult prostate / J.A. Ceder, L. Jansson, R.A. Ehrnstrоm [et al.] // Eur. Urol. - 2008. Vol. 53(3). - P. 524-531. 10. CD133, a novel marker for human prostatic epithelial stem cells / G.D. Richardson, C.N. Robson, S.H. Lang [et al.] // J. Cell Sci. - 2004. - Vol. 117(Pt 16). - P. 3539-3545. 11. Prominin-1 (CD133) is not restricted to stem cells located in the basal compartment of murine and human prostate / E. MissolKolka, J. Karbanov, P. Janich [et al.] // Prostate. - 2011. - Vol. 71(3). - P. 254-267. 12. Characterization of adult prostatic progenitor/stem cells exhibiting self-renewal and multilineage differentiation / W.W. Barclay, L.S. Axanova, W. Chen [et al.] // Stem Cells. - 2008. - Vol. 26(3). - P. 600-610. 13. Generation of a prostate from a single adult stem cell / K.G. Leong, B.E. Wang, L. Johnson [et al.] // Nature. - 2008. - Vol. 456(7223). - P. 804-808. 14. Ousset M. Multipotent and unipotent progenitors contribute to prostate postnatal development / M. Ousset, A. Van Keymeulen // Nat. Cell Biol. - 2012. - Vol. 14(11). - 1131-1138. 15. Zenzmaier C. Aging of the prostate epithelial stem/ progenitor cell / C. Zenzmaier, G. Untergasser, P. Berger // Exp. Gerontol. - 2008. - Vol. 43(11). - P. 981-985. 16. Tokar E.J. Stem/progenitor and intermediate cell types and the origin of human prostate cancer / E.J. Tokar, B.B. Ancrile // Differentiation. - 2005. - Vol. 73(9-10). - P. 463-473. 17. Taylor R.A. The path toward identifying prostatic stem cells / R.A. Taylor, G.P. Risbridger // Differentiation. - 2008. Vol. 76(6). - P. 671-681.

330

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

18. Molecular signatures of the primitive prostate stem cell niche reveal novel mesenchymal-epithelial signaling pathways / R. Blum, R. Gupta, P.E. Burger [et al.] // PLoS One. - 2010. - Vol. 5(9). - P. e13024. 19. Human prostate sphere-forming cells represent a subset of basal epithelial cells capable of glandular regeneration in vivo / I.P. Garraway, W. Sun, C.P. Tran [et al.] // Prostate. - 2010. - Vol. 70(5). - P. 491-501. 20. Epcam, CD44, and CD49f distinguish sphere-forming human prostate basal cells from a subpopulation with predominant tubule initiation capability / C. Guo, H. Liu, B.H. Zhang [et al.] // PLoS One. - 2012. - Vol. (4). - P. e34219. 21. Drewa T. Progenitor cells are responsible for formation primary epithelial cultures in the prostate epithelial model / T. Drewa, J. Styczynski // Int. Urol. Nephrol. - 2007. - Vol. 39(3). - P. 851-857. 22. Identification of putative stem cell markers, CD133 and CXCR4, in hTERT-immortalized primary nonmalignant and malignant tumor-derived human prostate epithelial cell lines and in prostate cancer specimens / J. Miki, B. Furusato, H. Li [et al.] // Cancer Res. - 2007. - Vol. 67(7)/ P. 3153-3161. 23. Modeling the prostate stem cell niche: an evaluation of stem cell survival and expansion in vitro / S.H. Lang, E. Anderson, R. Fordham [et al.] // Stem Cells Dev. - 2010. - Vol. 19(4). - P. 537-546. 24. Shi X. Anchorage-independent culture maintains prostate stem cells / X. Shi, J. Gipp, W. Bushman // Dev. Biol. - 2007. - Vol. 312(1). - P. 396-406. 25. Nirajan B. Primary culture and propagation of human prostate epithelial cells / B. Niranjan, M.G. Lawrence // Methods Mol. Biol. - 2013. - Vol. 945. - P.365-382. 26. Prostate-regenerating capacity of cultured human adult prostate epithelial cells / M. Yao, R.A. Taylor, M.G. Richards [et al.] // Cells Tissues Organs. - 2010. - Vol. 191(3). - P. 203-212. 27. Leong K.G. The Notch pathway in prostate development and cancer / K.G. Leong, W.Q. Gao // Differentiation. - 2008. Vol. 76(6). - P. 699-716. 28. Notch and TGFβ form a reciprocal positive regulatory loop that suppresses murine prostate basal stem/progenitor cell activity

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

331

/ J.M. Valdez, L. Zhang, Q. Su [et al.] // Cell Stem Cell. - 2012. Vol. 11(5). - P. 676-688. 29. Notch signaling is required for normal prostatic epithelial cell proliferation and differentiation / X.D. Wang, C.C. Leow, J. Zha [et al.] // Dev. Biol. - 2006. - Vol. 290(1). - P. 66-80. 30. Katoch M. Network of WNT and other regulatory signaling cascades in pluripotent stem cells and cancer stem cells / M. Katoh // Curr. Pharm. Biotechnol. - 2011. - Vol. 12(2). - P. 160-170. 31. Wnt signaling in prostate development and carcinogenesis / G. Kharaishvili, D. Simkova, E. Makharoblidze [et al.] // Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc. Czech Repub. - 2011. - Vol. 155(1). - P. 11-18. 32. Notch and wingless signaling cooperate in regulation of dendritic cell differentiation / J. Zhou, P. Cheng, J.I. Youn [et al.] // Immunity. - 2009. - Vol. 30(6). - P. 845-859. 33. Wnt and Notch pathways have interrelated opposing roles on prostate progenitor cell proliferation and differentiation / P. Shahi, M.R. Seethammagari, J.M. Valdez [et al.] // Stem Cells. 2011. - Vol. 29(4). - P. 678-688. 34. Salm S. TGF-β and stem cell factor regulate cell proliferation in the proximal stem cell niche / S. Salm, P.E. Burger, E.L. Wilson // Prostate. - 2012. - Vol. 72(9). - P. 998-1005. 35. Progenitor cells for the prostate epithelium: roles in development, regeneration, and cancer / M.M. Shen, X. Wang, K.D. Economides [et al.] // Cold. Spring Harb. Symp. Quant. Biol.2008. - Vol. 73. - P. 529-538. 36. The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells / D.J. Vander Griend, W.L. Karthaus, S. Dalrymple [et al.] // Cancer Res. - 2008. - Vol. 68(23).P. 9703-9711. 37. Expression profiling of CD133+ and CD133- epithelial cells from human prostate / C.J. Shepherd, S. Rizzo, I. Ledaki [et al.] // Prostate. - 2008. - Vol. 68(9). - P. 1007-1024. 38. Risbridger G.P. Minireview: regulation of prostatic stem cells by stromal niche in health and disease / G.P. Risbridger, R.A. Taylor // Endocrinology. - 2008. - Vol. 149(9). - P. 43034306.

332

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

39. Grisanzio C. p63 in prostate biology and pathology / C. Grisanzio, S. Signoretti // J. Cell Biochem. - 2008. - Vol. 103(5). P. 1354-1368. 40. Prostate stem cell antigen: a Jekyll and Hyde molecule? / N. Saeki, J. Gu, T. Yochida [et al.] // Clin. Cancer Res. - 2010. - Vol. 16(14). - P. 3533-3538. 41. Oct4A is expressed by a subpopulation of prostate neuroendocrine cells / P. Sotomayor, A. Godoy, G.J. Smith [et al.] // Prostate. - 2009. - Vol. 69(4). - P. 401-410. 42. Shaw A. Hedgehog signaling in the prostate / A. Shaw, W. Bushman // J. Urol. - 2007. - Vol. 177(3). - P. 832-838. 43. Heretsch P. Modulators of the hedgehog signaling pathway / P. Heretsch, L. Tzagkaroulaki, A. Giannis // Bioorg. Med. Chem. - 2010. - Vol. 18(18). - P. 6613-6624. 44. Induced pluripotency of human prostatic epithelial cells / H. Zhao, N. Sun, S.R. Young [et al.] // PLoS One. - 2013. - Vol. 8(5). - P. e64503. 45. A Novel Model of Urinary Tract Differentiation, Tissue Regeneration, and Disease: Reprogramming Human Prostate and Bladder Cells into Induced Pluripotent Stem Cells / M. Moad, D. Pal, A.C. Hepburn [et al.] // Eur. Urol. - 2013. - pii: S03022838(13)00341-2. Стовбурові клітини яєчників таки існують? Опубліковано Science. 03.03.2012 В яєчниках дорослої людини були знайдені стовбурові клітини, що виробляють яйцеклітини... http://www.nature.com/ news/egg-making-stem-cells-found-in-adult-ovaries-1.10121

3.7. Жіноча статева система Яєчник. Згідно класичних уявлень репродуктивної біології, в яєчнику після народження існує певна кількість ооцитів, яка з роками зменшується по мірі дозрівання фолікулів. Із 2004 року ця догма переглядається і висловлена думка про наявність в яєчнику дорослих (оогоніальних) СК, які мають здатність до утворення нових ооцитів (додаток 18). Це питання активно дискутується і проводяться численні дослідження щодо цього питання з наведенням як позитивних, так і негативних результатів [1 - 7].

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

333

Усе більша кількість дослідників схиляється до думки про існування оогоніальних СК у дорослих. З'явилися повідомлення про те, що з яєчника мишей успішно ізолювали оогоніальні СК і трансплантували їх в яєчник тієї самої миші. Ці клітини є мітотично активними клітинами-попередницями ооцитів і належать до зародкової лінії СК. У миші вони диференціювалися в зрілі ооцити, відбулася овуляція і після запліднення розвинулися здорові ембріони [8]. Паралельні дослідження в людини показали, що в яєчнику жінок репродуктивного віку також існують оогоніальні СК, схожі за своїми характеристиками на мишачі, але з віком оогенез згасає [9, 10]. Першими про оогоніальні СК у мишей повідомили J. Johnson et al. [11]. A. Bukovsky et al. [12] докладно описують джерело походження оогоніальних СК. Вони вважають, що в людини мезенхімні клітини з білкової оболонки яєчника переходять завдяки мезенхімно-епітеліальним взаємодіям у поверхневі епітеліальні клітини яєчника (VSEL-клітини - дуже маленькі ембріональноподібні клітини), послідовно диференціюються в примітивні клітини гранульози і статеві клітини. Поверхневі клітини в яєчниках дорослих являють собою зародкову лінію компетентних СК, новий тип тотипотентних попередників для різних типів клітин, у тому числі жіночих зародкових/статевих клітин із потенціалом їхнього використання для автологічного лікування безпліддя яєчників. Оскільки при стовбуровоклітинній терапії виникають наукові, лікувальні, соціально-економічні та правові обмеження в багатьох розвинених країнах, то використання таких клітин дозволить проводити процедуру автологічної трансплантації, не торкаючись вищезгаданих обмежень [13]. Ці клітини зосереджуються в глибоких ділянках кіркової речовини яєчника і утворюють нові фолікули для заміни атрезованих первинних фолікулів (фолікулярне оновлення, нео-оогенез). Стовбуровоклітинні ніші в яєчнику складаються з периваскулярного компартменту, який об'єднує СК з імунною і судинною системами, а згодом при розвитку оогоніальних СК епітеліального походження ніша об'єднує їх з гормональним сигналюванням [14]. СК у ніші закріплені за допомогою молекул адгезії, які мають вирішальне значення для регуляції їхнього самооновлення [15].

334

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

У процесах розвитку, включаючи проліферацію, бере участь родина Wnt сигналізації. Wnt сигналізація долучається до диференціації дорослих СК яєчника. Wnt перетворюють їх сигнал через один із трьох сигнальних шляхів. Найбільш вивченим є Wnt/β-катенін шлях, який призводить до збільшення внутрішньоклітинного β-катеніну, що діє в якості ко-фактора транскрипції з членами TCF/Lef родини. Wnt сигнали виражені, особливо, у гранульозі яєчників і поверхневому епітелії [16]. У людини ооцити можна відрізнити від похідних поверхневого епітелію in vitro. Тобто, пул фолікулів в яєчниках дорослої людини не є статичним, а являє собою динамічну популяцію структур, які диференціюються і регресують. Однак, фолікулярне оновлення може припинитися в певному віці і зумовити настання природної менопаузи або передчасне згасання функцій яєчника. Відсутність оновлення в старіючих яєчниках може стати причиною акумуляції спонтанно виниклих під впливом екологічних чинників генетичних відхилень в ооцитах і, можливо тому, старіючі жінки мають вищі шанси мутацій в ооцитах із первинних фолікулів. М. De Felici [17] підтримала цю гіпотезу і висунула іншу - на VSEL клітини перетворюються примордіальні гермінативні клі тини/оогонії і з них розвиваються ооцити. VSEL- клітини - це дуже маленькі ембріонально-подібні клітини покривного епітелію яєчника, є сkit+ i SSEA+. Вони експресують мРНК для білків, типових для епітеліальних і примордіальних СК: Oct4, Nanog, Sox2. Через 20 днів культивування ці клітини розвиваються в напрямку ооцита і починають експресувати гени, характерні для зародкових клітин – Mvh (Vasa) i блискучої оболонки (Zp2). У тій же культурі інші клітини виявили здатність диференціюватися в клітини гранульози [18]. Клітини гранульози локалізуються в нішах разом із гермінативними клітинами і існує можливість, за даними К. Kossowska-Tomaszczuk [19], їхньої диференціації на ооцити. VSEL клітинам присвячена значна кількість досліджень. Наголошується на тому, що ці клітини походять від червоного кісткового мозку, є мезенхімними, локалізуються в різних орга нах і, можливо, через свій малий розмір (3-5 мм) не завжди по трапляють у поле зору дослідників і втрачаються при підготов

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

335

ці мезенхімних СК для трансплантації. Це плюрипотентні СК із максимальним регенеративним потенціалом, експресують марке ри: Oct4, білок клітинної поверхні SSEA-4 і інші маркери плюри потентних клітини, такі як Nanog, Sох2, Rex1 [20]. Корисним маркером цих клітин є CD133 (промінін) i CD 45 [21, 22]. Їх ве лика кількість міститься в пуповинній крові і, на думку M.Z. Ratajczak et al. [23, 24], вони вивільняються в периферійну кров новонароджених, мігрують і беруть участь у регенерації тканин. Автори наводять дані, що VSEL клітини володіють деякими ха рактеристиками довготривало рециркулюючих гематопоетичних СК. У тканинах організму VSEL клітини захищені авто- і парак ринно від інсулін-подібного фактору сигналізації для запобігання їхнього передчасного виснаження і неконтрольованого утворення тератоми. Водночас, з'явилися публікації щодо використання VSEL клітин у регенеративній медицині серцевих захворювань (інфаркт міокарда та хірургічні втручання на серці), хвороби Крона, інсульту, хвороб шкіри [25 - 30]. Була висловлена впевненість у тому, що клінічні прояви формування яйцеклітини de novo буде мати великі майбутні важливі наслідки при їхньому підтвердженні [31]. Процеси нео-оогенезу не підтримуються всіма дослідниками беззаперечно. Зокрема, А. Gougeon [32] стверджує, що атрезія фолікулів у мишей не має широкого розповсюдження в яєчнику і тому в дорослих самок-мишей немає необхідності нео-оогенезу для підтримки нормальної репродуктивної функції. Важливим є доведення можливості дозрівання, запліднення і розвитку зародків від таких ооцитів. У цьому питанні залишається немало невирішених задач. K. Zou et al. [33] створили післяпологову лінію оогоніальних СК із нормальним каріотипом і високою активністю теломерази і культивували їх протягом понад 15 місяців. Водночас виділили такі самі клітини від дорослих і культивували понад 6 місяців. Ці клітини проліферували і підтримували експресію трансгенного маркера - зеленого флуоресцентного білка. На наступному етапі виконали пересадку безплідним мишам. Трансплантовані клітини зазнали оогенезу, що відкриває нові можливості їхнього використання в біотехнології

336

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

та медицині. Їхні дані були підтверджені G. Abban, J. Johnson [34]. J. Pacchiarotti et al. [35] культивували такі клітини протягом одного року і встановили, що вони зберегли свої стовбурові характеристики, у присутності факторів росту проявляли здатність утворювати ембріональні тільця, клітини яких експресували маркери трьох зародкових листків. Без впливу факторів росту клітини характеризувалися мультипотентними властивостями. • Матеріали опубліковані в статті Дєльцова О.І. Стовбурові клітини яєчника / О.І. Дєльцова, Ю.Б. Чайковський, С.Б. Гера щенко // Південноукраїнський медичний науковий журнал. 2013. - №4. - С.24- 27. Література 1. Oktem O. Stem cells: a perspective on oocytes / O. Oktem, K. Oktay // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2008. - Vol. 1127. - P. 20-26. 2. Oktem O. Stem cells and reproductive medicine / O. Oktem, K. Oktay // Minerva Ginecol. - 2009. - Vol. 61(4). - P. 247-252. 3. Oktem O. Current knowledge in the renewal capability of germ cells in the adult ovary / O. Oktem, K. Oktay // Birth Defects Res. C Embryo. Today. - 2009. - Vol. 87(1). - P. 90-95. 4. Virant-Klun I. Ovarian pluripotent/multipotent stem cells and in vitro oogenesis in mammals / I. Virant-Klun, M. Stimpfel, T. Skutella // Histol. Histopathol. - 2011. - Vol. 26(8). - P. 1071-1082. 5. Virant-Klun I. Stem cells in adult human ovaries: from female fertility to ovarian cancer / I. Virant-Klun, M. Stimpfel, T. Skutella // Curr. Pharm. Des. - 2012. - Vol. 18(3). - P. 283-292. 6. Dunlop C.E. Ovarian stem cells-Potential roles in infertility treatment and fertility preservation / C.E. Dunlop, E.E. Telfer, R.A. Anderson // Maturitas. - 2013. - May 18. - Доступ до електронного ресурсу : pii: S0378-5122(13)00128-X. 7. Ghazal S. Oogonial stem cells: do they exist and may they have an impact on future fertility treatment? / S. Ghazal // Curr. Opin. Obstet. Gynecol. - 2013. - Vol. 25(3). - P. 223-228. 8. Woods D.C. Purification of oogonial stem cells from adult mouse and human ovaries: an assessment of the literature and a view toward the future / D.C. Woods, Y.A. White, J.L. Tilly // Reprod Sci. - 2013. - Vol. 20(1). - P. 7-15.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

337

9. Woods D.C. An evolutionary perspective on adult female germline stem cell function from flies to humans / D.C. Woods, J.L.Tilly // Semin. Reprod. Med. - 2013. - Vol. 31(1). - P. 24-32. 10. Woods D.C. Isolation, characterization and propagation of mitotically active germ cells from adult mouse and human ovaries // D.C. Woods, J.L. Tilly // Nat. Protoc. - 2013. - Vol. 8(5). - P. 966-988. 11. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary / J. Johnson, J. Canning, T. Kaneko [et al.] // Nature. - 2004. - Vol. 428. - P. 145-150. 12. Oogenesis in adult mammals, including humans: a review / A. Bukovsky, M.R. Caudle, M. Svetlikova [et al.] // Endocrine. 2005. - Vol. 26(3). - P. 301-316. 13. Ovarian germ cells / A. Bukovsky, I. Virant-Klun, M. Svetlikova [et al.] // Methods Enzymol. - 2006. - Vol. 419. - P. 208-258. 14. Bukovsky A. Ovarian stem cell niche and follicular renewal in mammals / A. Bukovsky // Anat. Rec. (Hoboken). - 2011. - Vol. 294(8). - P. 1284-1306. 15. Chen S. Adhesion in the stem cell niche: biological roles and regulation / S. Chen, M. Lewallen, T. Xie // Development. - 2013.Vol. 140(2). - P. 255-265. 16. Usongo M. β-catenin/Tcf-signaling appears to establish the murine ovarian surface epithelium (OSE) and remains active in selected postnatal OSE cells / M. Usongo, R. Farookhi // BMC Dev. Biol. - 2012. - Vol. 12. - P. 17. 17. De Felici M. Germ stem cells in the mammalian adult ovary: considerations by a fan of the primordial germ cells / M. De Felici // Mol. Hum. Reprod. - 2010. - Vol. 16(9). - P. 632-636. 18. Putative stem cells with an embryonic character isolated from the ovarian surface epithelium of women with no naturally present follicles and oocytes / I. Virant-Klun, N. Zech, H. Rozman [et al.] // Differentiation. - 2008. - Vol. 76(8). - P. 843-856. 19. Kossowska-Tomaszczuk K. Cells with stem cell characteristics in somatic compartments of the ovary / K. Kossowska-Tomaszczuk, C. De Geyter // Biomed. Res. Int. - 2013.- 2013:310859. 20. Very small embryonic-like stem cells with maximum regenerative potential get discarded during cord blood banking and bone marrow processing for autologous stem cell therapy / D.

338

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Bhartiya, A. Shaikh, P. Nagvenkar [et al.] // Stem Cells Dev. 2012. - Vol. 21(1). - P. 1-6. 21. Hematopoietic differentiation of umbilical cord bloodderived very small embryonic/epiblast-like stem cells / J. Ratajczak, E. Zuba-Surma, I. Klich [et al.] // Leukemia. - 2011. - Vol. 25(8).Р. 1278-1285. 22. CD133 Expression Strongly Correlates with the Phenotype of Very Small Embryonic-/Epiblast-Like Stem Cells / M.Z. Ratajczak, K. Mierzejewska, J. Ratajczak [et al.] // Adv. Exp. Med. Biol. 2013. - Vol. 777. - P. 125-141. 23. Very small embryonic/epiblast-like stem cells (VSELs) and their potential role in aging and organ rejuvenation--an update and comparison to other primitive small stem cells isolated from adult tissues / M.Z. Ratajczak, D.M. Shin, R. Liu [et al.] // Aging (Albany N.Y.). - 2012. - Vol. 4(4). - P. 235-246. 24. Umbilical cord blood-derived very small embryonic like stem cells (VSELs) as a source of pluripotent stem cells for regenerative medicine / M.Z. Ratajczak, M. Suszynska, D. Pedziwiatr [et al.] // Pediatr. Endocrinol. Rev. - 2012. - Vol. 9(3).- P. 639-643. 25. Bone marrow-derived pluripotent very small embryonic-like stem cells (VSELs) are mobilized after acute myocardial infarction / E.K. Zuba-Surma, M. Kucia, B. Dawn [et al.] // J. Mol. Cell Cardiol. - 2008. - Vol. 44(5). - P. 865-873. 26. Clinical evidence that very small embryonic-like stem cells are mobilized into peripheral blood in patients after stroke / E. Paczkowska, M. Kucia, D. Koziarska [et. al.] // Stroke. - 2009. Vol. 40(4). - P. 1237-1244. 27. Wojakowski W. Mobilization of very small embryonic-like stem cells in acute coronary syndromes and stroke / W. Wojakowski, M.Z. Ratajczak, M. Tendera // Herz. - 2010. - Vol. 35(7). - P. 467-472. 28. Very small embryonic-like stem cells in cardiovascular repair // W. Wojakowski, M. Kucia, E. Zuba-Surma [et al.] // Pharmacol. Ther. - 2011. - Vol. 129(1). - P. 21-28. 29. Stem cells, including a population of very small embryoniclike stem cells, are mobilized into peripheral blood in patients after skin burn injury / J. Drukala, E. Paczkowska, M. Kucia [et al.] // Stem Cell Rev. - 2012. - Vol. 8(1). - P. 184-194.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

339

30. Various types of stem cells, including a population of very small embryonic-like stem cells, are mobilized into peripheral blood in patients with Crohn's disease / W. Marlicz, E. Zuba-Surma, M. Kucia [et al.] // Inflamm. Bowel Dis. - 2012. - Vol. 18(9). - P. 17111722. 31. Kayisli U.A. Stem cells and fertility: what does the future hold? / U.A. Kayisli, E.Seli / Curr. Opin. Obstet. Gynecol. - 2006.Vol. 18(3). - P. 338-343. 32. Gougeon A. Is neo-oogenesis in the adult ovary, a realistic paradigm? / A. Gougeon // Gynecol. Obstet. Fertil. - 2010. - Vol. 38(6). - P. 398-401. 33. Production of offspring from a germline stem cell line derived from neonatal ovaries / K. Zou, Z. Yuan, Z. Yang [et al.] // Nat. Cell Biol. - 2009. - Vol. 11(5). - P. 631-636. 34. Abban G. Stem cell support of oogenesis in the human / G. Abban, J. Johnson // Hum. Reprod. - 2009. - Vol. 24(12). - P. 29742978. 35. Differentiation potential of germ line stem cells derived from the postnatal mouse ovary / J. Pacchiarotti, C. Maki, T. Ramos [et al.] // Differentiation. - 2010. - Vol. 79(3). - P. 159-170. Маткові труби відіграють у репродуктивній функції організму важливу роль завдяки транспортуванню сперми і яйцеклітин. Труба позиціонується як міст між яєчником, звідки виходять яйцеклітини, і маткою, де відбувається імплантація. Протягом репродуктивного віку епітелій маточних труб піддається повторним пошкодженням і регенерації. До цього часу СК маткових труб залишаються мало вивченими. D.Y. Paik et al. [1] повідомляють, що з епітеліоцитів маткових труб були виділені клітини, які не мали маркерів диференційованих миготливих (β-тубулін, TUBB4) або секреторних (Pах8) епітеліоцитів. У цих недиференційованих клітинах виявили серед поверхневих антигенів молекули клітинної адгезії (EpCAM), CD44 і інтегрини α6 (ITGA5). На наступному етапі визначили можливості їхнього клонування і самооновлення, припускаючи, що власне вони містять СК епітелію маткових труб. Їхня кількість була більшою в два рази в дистальних відділах труби, у

340

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

порівнянні з проксимальними. Автори пов'язують виникнення серозних пухлин з такою локалізацією СК і їхніми можливостями ініціювати пухлини цієї ділянки. CК маткових труб людини мають біомаркери CD34, CD133, CD117, CD90, CD105, CD73, нестин, CD29, CD44, CD31, CD54, CD166, CD106, CD49d, CD45, ABCG2, SSEA4, OCT4, SOX2, CD140b і CD146 [2]. Можливість використання СК для регенеративної медицини відкриває все нові напрями досліджень. Пошук джерел для отримання мультипотентних СК із видалених неінвазивно з організму тканин становить великий інтерес. Як було сказано в попередніх підрозділах, мезенхімні СК, отримані з пуповини, пульпи зуба і жирової тканини, як усі біологічні "викиди" здатні диференціюватися в м'язову, жирову, кісткову і хрящову тканини. Останнім часом було показано, що мезенхімні СК клітини маткових труб, які були отримані в результаті деяких гінекологічних процедур, є багатим джерелом цих клітин і in vitro диференціюються в адипогенні, хондрогенні, остеогенні і міогенні лінії [3]. Література 1. Paik D.Y. Stem-Like Epithelial Cells are Concentrated in the Distal End of the Fallopian Tube: A Site for Injury and Serous Cancer Initiation / D.Y. Paik, D.M. Janzen, A.M. Schafenacker [et al.] // Stem Cells. – 2012. - Vol. 30(11). - P. 2487-2497. 2. Prospective biomarkers of stem cells of human endometrium and fallopian tube compared with bone marrow / S. Indumathi, R. Harikrishnan, J.S. Rajkumar [et al.] // Cell Tissue Res. - 2013. Vol. 352(3). - P. 537-549. 3. Human fallopian tube: a new source of multipotent adult mesenchymalstem cells discarded in surgical procedures / T. Jazedie, P.M. Perin, C.E. Czeresnia [et al.] // J. Transl. Med. – 2009. – Vol. 7. – P.46. Матка (ендометрій). Диференціація дорослих СК допускає, що різні лінії клітин можуть бути отримані від однієї початкової клітини in vitro й у природних умовах. Показано, що їхнє приживлення є достатньо надійним і стійким як у фізіологічних умовах, так і в патологічних ситуаціях [1]. Брак донорських ор-

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

341

ганів для регенеративної медицини стимулює дослідження СК різних органів в якості ресурсу для клітинної терапії [2]. У дорослих є СК, які здатні перепрограмуватися в інші види і серед них ті, які виділені з менструальної крові [3 - 6]. Уперше СК із менструальної крові описані C.E. Gargett у 2004 році [7]. Це клітини ендометрію, які виявили в менструальній крові і тому назвали менструальними СК. Eндометрій є унікальною тканиною, яка циклічно регенерує під впливом жіночих статевих гормонів, для відновлення маткових залоз існують СК і за життя жінки ендометрій відновлюється приблизно 480 разів [8 - 11]. Ендометрій людини піддається щомісяця обширній регенерації у відповідь на коливання рівня естрогену і прогестерону в пременопаузі жінок. На противагу цьому, у постменопаузі ендометрій тонкий із низькою мітотичною активністю [12]. Одним із перших концепцію СК ендометрію висловив В.А. Прянишников [13], вивчаючи модель функціонально-морфологічної структури ендометрію. Про присутність СК в ендометрії повідомляло багато вчених, але спроби отримання та ізолювання цих клітин із біопсійного матеріалу ендометрію здійснені нещодaвно [14]. Висловлена і підтверджена думка про те, що у високопроліферативній тканині ендометрію в дорослих є епітеліальні і стромальні клоногенні СК [15]. Їх було виділено і виявили, що 0,22 % епітеліальних клітин ендометрію і 1,25 % стромальних визначаються поведінкою СК/клітин-попередниць і є клоногенними, які in vitro підтримуються факторами росту. Основними тpанскрипційними факторами, які відповідають за розвиток і регулювання СК ендометрію, є 22 гени, асоційовані з Wnt шляхом [12]. Cтромальні клітини ендометрію клонували in vitro (понад 15 поділів) і в них не визначили маркерів кровотворних клітин, водночас виявили маркери, позитивні для клітин мезенхімного походження – CD19, CD16/56 i HLA-DR [16]. Ці плюрипотентні клітини мають потенціал до розвитку будь-якої клітинної лінії, яка виникає з трьох зародкових листків. Дорослі плюрипотентні клітини в менструальній крові рідкісні і нечисленні, але їх можна виділити [17]. Їхня пластичність забезпечує стовбуровоклітинні механізми: трансдиференціацію, дедиференціацію, однорідність

342

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

і клітинний поділ за допомогою характерного для них мікрооточення - стовбурової ніші, яка локалізується в базальному шарі ендометрію [18, 19]. Дорослі СК, які виявлені в ендометрії людини, можуть відновлювати тканини ендометрію в природних умовах та можна передбачити їхнє використання в лікуванні розладів, пов'язаних із недостатністю ендометрію [20, 21]. Знання особливостей експресії генів є важливим у диференційній діагностиці клітин ендометрію в нормі і при ендометріозі. Гени UTF1, TCL1 i ZEO42 були більш виразними при ендомет ріозі, тоді як GDF3 показали більш високу частоту експресії в нормальному ендометрії [22]. Відомості про те, що ізольовані CD133+ клітини з ендометрію здатні ініціювати утворення пухлин, у перспективі допоможуть нам зрозуміти механізми регенерації і канцерогенезу ендометрію і окреслити створення нових молекулярних підходів до лікування пухлин [23, 24]. Менструальна кров окрім епітеліальних клітин-попередниць містить стромальні СК мезенхімного походження [25, 26, 27, 28]. Менструальні СК мають деякі спільні риси з мезенхімними СК червоного кісткового мозку, але водночас від останніх вони відрізняються відсутністю STRO-1 і виразністю Oct4. При вирощуванні їх на нановолокнистій сітці новоутворені клітини мали ознаки хрящових, що може бути використано для тканинної інженерії хряща [29]. Тобто ендометрій є потенційним джерелом мультипотентних СК [30]. C.E.Gargett et al. [31] виділили з менструальної крові 15 жінок із нормальним менструальним циклом клоногенні епітеліальні і мезенхімні СК. При вирощуванні їх у культурі протягом 4 міс стромальні клітини витримали 30 подвоєнь. Епітеліальні СК диференціювалися в цитокератин+ залозисто-подібні в трьохвимірній культурі. Стромальні визначалися мультипотентністю і далі диференціювалися в гладкі міоцити, адипоцити, хондроцити і остеобласти. Їхніми маркерами слугували ITGB1 (CD29), CD44, NT5E (CD73), THY1 (CD90), ENG (CD105), PDGFRB (CD140B), MCAM (CD146) [32]. Водночас у них не проявлялася експресія ендотеліальних і гематопоетичних маркерів – PECAM1 (CD31), CD34, PTPRC (CD45). Автори наголошують на тому, що епітеліальні клітини-попередниці траплялися рідко.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

343

Cпеціальними дослідженнями доведено, що саме менструаль ні СК, а не СК, які потрапили сюди з червоного кісткового мозку, здатні диференціюватися в 9 клітинних ліній – кардіоміоцити, клітини респіраторного епітелію, нейрони, міоцити, ендотеліоцити, панкреатоцити, гепатоцити, адипоцити і остеогенні клітини [33]. У менструальних СК визначені маркери Oct4, SSEA-4, Nanog i c-kit (CD117) [34, 35, 17]. Після їхньої трансплантації не виявлено побічних ефектів, терапевтичної та імунної відповіді в тваринних моделях. N. Hida et al. [36] встановили in vitro, що менструальні СК можуть поділитися 28 разів і перетворитися на кардіогенні тропонін-1+ клітини. Автори вважають, що такі процеси відбуваються в СК мезенхімного походження. X.Y. Yang et al. [37] підтвердили, що зібрані з менструальної крові стромальні СК можуть диференціюватися на остео- і хондробласти. Важливо, що менструальні СК відповідають вимогам Міжнародного товариства клітинної терапії для визначення мультипотентних СК будь-якого походження [38]. Дослідниками підтверджено встановлені раніше характеристики, що ці клітини експресують CD73+, CD90+, CD105+, CD13+, CD29+, CD44+ і в них відсутні маркери гематопоетичних клітин – CD19, CD34, CD45, CD117, CD130 i HLA-DR (клас ІІ). Доведена їхня здатність диференціюватися в клітини мезодермального походження – остеоцити і адипоцити. Імуноферментний аналіз показав експресію маркерів попередників нейронів – нестину і βІІІ-тубуліну. Ці клітини мають високу швидкість проліферації (час подвоєння 22-23 години) і високу ефективність клонування (приблизно 60 %). У пробірці в них може відбутися понад 45 поділів без виникнення порушень каріотипу. Ці клітини подібні до лінії ембріональних СК людини С612 і С910. Автори висловлюють надію, що отримання СК із менструальної крові є простим неінвазивним шляхом із великим майбутнім. На підставі отриманих результатів цитологічних дослід жень менструальних СК стосовно їхніх міогенних властивостей були висловлені думки щодо лікування ними критичної ішемії кінцівoк [39]. В експерименті показано, що пересадка менструальних СК мишам на моделі м'язової дистрофії Дюшенна

344

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

(Х-зчеплене рецесивне генетичне захворювання в дітей, яке характеризується відсутністю дистрофіна в сарколемі м'язових волокон) призводить до відновлення сарколеми м'язових волокон [40, 41]. За можливості диференціації менструальних СК у нейрогенну лінію на мишачій моделі хвороби Паркінсона P.G. Figueira et al. [42], E.E. Wolff et al. [43] успішно спробували замінити ними дофамінергічні нейрони. P.R. Sanberg et al. [44] трансплантували менструальні СК тваринам із моделями нейродегенеративних захворювань і отримали обнадійливі результати. Автори пояснили це протизапальними ефектами, секрецією специфічних цитокінів і факторів росту, які сприяють виживанню клітин за цих умов. E. Zhong et al. [45] клінічно застосували алогенні менструальні СК у 4 пацієнток із розсіяним склерозом. M.C. Rodrigues et al. [46, 47] пропонують використання автологічних СК менструальної крові у відновлювальному лікуванні мозкового інсульту, хвороб Паркінсона і Хантінгтона, які пов'язані з розладами в базальних ядрах кінцевого мозку. У лікуванні злоякісних пухлин останнім часом викристалізовується новий напрямок – імунна терапія дендритними клітинами, отриманими з менструальної крові [48]. Постійно ведуться пошуки альтернативних джерел для лікування цукрового діабету, у тому числі й із використанням СК ендометрію. Від 6 донорів були виділені стромальні клітини з ендометрію з високим ступенем генів СК (Nanog, Oct4, нестин). Із них протягом 2 тижнів формувалися сфероїди, клітини яких диференціюються на інсулін-позитивні, що підтверджено імуноферментним аналізом [49, 50]. Можна сподіватися на те, що наступним кроком у лікуванні цукрового діабету буде застосування клітин, виділених із менструальної крові. Спеціальні дослідження СК ендометрію людини щодо можливостей їхнього перепрограмування на плюрипотентні показали, що вони більш пластичні, ніж фібробласти шкіри новонарод жених, мають прискорену експресію ендогенних Nanog i Oct-4 і в результаті клітини вирощених колоній можна субкультивувати через 12 днів трансдукції, тоді як для інших типів соматичних клітин цей термін визначається 3-4 тижнями [51].

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

345

Таким чином, результати широкомасштабних досліджень менструальної крові в контексті знаходження в них CК доводять їхню доступність для забору і використання. Менструальні СК є альтернативним джерелом для вирощування епітеліальної, сполучної, м'язової та нервової тканин і при подальшому вивченні їх особливостей трансдиференціації можуть стати потужним банком найбільш придатних до трансплантації автологічних СК. • Матеріали опубліковані в статті Чайковский Ю.Б. Значе ние менструальных стволовых клеток для регенерационной медицины / Ю.Б. Чайковский, С.Б. Геращенко, Е.И. Дельцова // Здоровье женщины. - 2012. -№ 10. - С. 29-31. Література 1. Zhou Z.Y. Adult stem cells and mechanisms of its differentiation - editorial / Z.Y. Zhou, M. Yang, Y.H. Jiang // Zhongguo. Shi. Yan. Xue. Ye. Xue. Za. Zhi. – 2005. – Vol. 13(3).– P. 353-357. 2. Hipp J. Sources of stem cells for regenerative medicine / J. Hipp, A. Atala // Stem Cell Rev. – 2008. – Vol. 4(1). – P. 3-11. 3. Patel A.N. Menstrual blood stromal cells: the potential for regenerative medicine / A.N. Patel, F. Silva // Regen. Med. – 2008.– Vol. 3(4). – P. 443-444. 4. Umezawa A. Cell source for regenerative medicine / A. Umezawa, H. Makino / Nihon Rinsho. – 2008. – Vol. 66(5). – P. 865-872. 5. Adult stem cells as an alternative source of multipotential (pluripotential) cells in regenerative medicine / S. Kuci, Z. Kuci, H. Аtifi-Pupovci [et al.] // Curr. Stem Cell Res. Ther. – 2009. – Vol. 4(2). – P. 107-117. 6. Perivascular human endometrial mesenchymal stem cells express pathways relevant to self-renewal, lineage specification, and functional phenotype / T.L. Spitzer, A. Rojas, Z. Zelenko [et al.] // Biol. Reprod. – 2012. – Vol. 86(2). – P. 58. 7. Gargett C.E. Stem cells in gynaecology / C.E. Gargett // Aust. NZJ. Obstet. Gynaecol. – 2004. – Vol. 44(5). – P. 380-386. 8. Human endometrial side population cells exhibit genotypic, phenotypic and functional features of somatic stem cells / I.

346

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Cervello, C. Gil-Sanchis, A. Mas [et al.] // PLoS One. – 2010. – Vol. 5(6). – P. e10964. 9. Human uterine stem/progenitor cells: their possible role in uterine physiology and pathology / T. Maruyama, H. Masuda, M. Ono [et al.] // Reproduction. – 2010. – Vol. 140(1). – P. 11-22. 10. Kato K. Stem cells in human endometrium and endometrial cancer cells: characterization of side population cells / K. Kato // Kaohsiung. J. Med. Sci. – 2012. – Vol. 28(2). – P. 63-71. 11. Identification of quiescent, stem-like cells in the distal female reproductive tract / Y. Wang, A. Sacchetti, M.R. van Dijk [et al.] // PLoS One. – 2012. – Vol. 7(7). – P. e40691. 12. Nguyen H.P. Differential expression of Wnt signaling molecules between pre- and postmenopausal endometrial epithelial cells suggests a population of putative epithelial stem/progenitor cells reside in the basalis layer / H.P. Nguyen, C.N. Sprung, C.E. Gargett // Endocrinology. – 2012. – Vol. 153(6). – P. 2870-2883. 13. Прянишников В.А. О концепции стволовых клеток и модели функционально-морфологической структуры эндометрия / В.А. Прянишников // Контрацепция. – 1978. – Том 18(3). – С. 213-223. 14. Gargett C.E. Uterine stem cells: what is the evidence? / C.E. Gargett // Hum. Reprod. Update. – 2007. – Vol. 13(1). – P. 87-101. 15. Schwab K.E. Putative stem cell activity of human endometrial epithelial and stromal cells during the menstrual cycle / K.E. Schwab, R.W. Chan, C.E. Gargett // Fertil. Steril. – 2005.– Vol. 84 Suppl. 2. – P. 1124-1130. 16. Characterization of clonogenic stromal cells isolated from human endometrium // R/ Dimitrov, T. Timeva, D. Kyurkchiev [et al.] // Reproduction. – 2008. – Vol. 135(4). – P. 551-558. 17. Plasticity of human menstrual blood stem cells derived from the endometrium // J. Lin, Xiang D., Zhang J.-long [et al.] // J. Zhejiang Univ. Sci B. – 2011. – Vol. 12(5). – P. 272-380. 18. Cervello I. Somatic stem cells in the endometrium / I. Cervello, C. Simon // Reprod. Sci. – 2009. – Vol. 16(2). – P. 200205. 19. Walker M.R. Stem cell niche / M.R. Walker, K.K. Patel, T.S. Stappenbeck // J. Pathol. – 2009. – Vol. 217(2). – P. 169-180.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

347

20. Du H. Stem cells and female reproduction / H. Du, H.S. Taylor // Reprod. Sci. – 2009. – Vol. 16(2). – P. 126-139. 21. Gargett C.E. Endometrial reconstruction from stem cells / C.E. Gargett, L. Ye // Fertil. Steril. – 2012. – Vol. 98(1). – P.11-20. 22. Expression pattern of stemness-related genes in human endometrial and endometrioc tissues / F. Forte, M.T. Schettino, M. Finicelli [et al.] // Mol. Med. – 2009. – Vol. 15(11-12). – P. 392401. 23. Stem cells in human endometrium and endometrial carcinoma / I. Cervello, C. Mirantes, X. Santamaria [et al.] // Int. J. Gynecol. Pathol. – 2011. – Vol. 30(4). – P. 317-327. 24. Kyo S. Stem cells in endometrium and endometrial cancer: accumulating evidence and unresolved questions / S. Kyo, Y. Maida, M. Inoue // Cancer Lett. – 2011. – Vol. 308(2). – P. 123-133. 25. Endometrial mesenchymal stem cells isolated from the menstrual blood / R.A. Musina, A.V. Belyavski, O.V. Taruson [et al.] // Exp. Biol. Bull. Med. – 2008. – Vol. 145(4). – P. 539-543. 26. Ding D.S. Mesenchymal stem cells / D.S. Ding, W.C. Shyu, S.Z. Lin // Cell Transplant. – 2011. – Vol. 20(1). – P. 5-14. 27. Characterization of endometrial mesenchymal stem-like cells obtained by endometrial biopsy during routine diagnostics / A.N. Schuring, N. Schulte, R. Kelsch [et al.] // Fertil. Steril. – 2011. – Vol. 95(1). – P. 423-426. 28. Porcine uterus contains a population of mesenchymal stem cells / K. Miernik, J. Karasinski // Reproduction. – 2012. – Vol. 143(2). – P. 203-209. 29. Characterization and chondrogenic differentiation of menstrual blood-derived stem cells on a nanofibrous scafford / S. Kazemnejad, M.M. Akhondi, M. Soleimani [et al.] // Int. J. Artif. Organs. – 2012. – Vol. 35(1). – P. 55-66. 30. Demonstration of multipotent stem cells in the adult human endometrium by in vitro chondrogenesis / E.F. Wolff, A.B. Wolff, Du. Hongling [et al.] // Reprod. Sci. – 2007. – Vol. 14(6). – P. 524-533. 31. Isolation and culture of epithelial progenitors and mesenchymal stem cells from human endometrium / C.E. Gargett, K.E. Schwab, R.M. Zillwood [et al.] // Biol. Reprod. – 2009. – Vol. 80(6). – P. 1136-1145.

348

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

32. Kyurkchiev S. Assessment of presence and characteristics of multipotent stromacells in human endometrium and decidua / S. Kyurlchiev, A. Shterev, R. Dimitrov // Reprod. Biomed. Online. – 2010. – Vol. 20(3). – P. 305-313. 33. Endometrial regenerative cells: A novel stem cell population / X. Meng, T.E. Ichim, J. Zhong [et al.] // J. Transl. Med. – 2007. – Vol. 5. – P. 57. 34. Multipotent menstrual blood stromal cells: isolation, characterization, and differentiation // A.N. Patel, E. Park, M. Kuzman [et al.] // Cell Transplant. – 2008. – Vol. 17(3). – P. 303311. 35. Menstrual blood cells display stem-like phenotypic markers and exert neuroprotection following transplantation in experimental stroke / C.V. Borlongan, J. Kaneko, M. Maki [et al.] // Stem Cells Dev. – 2010. – Vol. 19(4). – P. 439-452. 36. Novel cardiac precursot-like cells from human menstrual blood-derived mesenchymal cells / N. Hida, N. Nishiyama, S. Miyoshi [et al.] // Stem Cells. – 2008. – Vol. 26(1). – P. 1695-1704. 37. Induced differentiation of endometrial stromal stem cell into osteo- and chondroblasts / X.Y. Yang, W. Wang, W. Chen [et al.] // Nan. Fang. Yi. Ke. Da. Xue. Bao. – 2011. – Vol. 31(9). – P. 1488-1492. 38. Zemelk'o V.I. Multipotent mesenchymal stem of desquamated endometrium: isolation and use as feeder layer for maintenance of human embryonic stem cells lines / V.I. Zemelk'o, T.M. Grinchuk, A.P. Domnina [et al.] // Tsitologia. – 2011. – Vol. 53(12). – P. 919929. 39. Allogenic endometrial regenerative cells: an "of the shelf solution" for critical limb ischemia? / M.P. Murphy, H. Wang, A.N. Patel [et al.] // J. Transl. Med. – 2008. – Vol. 19(6). – P. 45. 40. Menstrual blood-derived cells confer dystrophin expression in the murine model of Duchenne muscular dystrophy via cell fusion and myogenic transdifferentiation / C.H. Cui, T. Uyama, K. Miyado [et al.] // Mol. Biol. Cell. – 2007. – Vol. 18(5). – P. 1586-1594. 41. Myogenic transdifferentiation of menstrual blood-derived cells / M. Toyoda, C.H. Cui, A. Umezawa [et al.] // Acta Myol. – 2007. – Vol. 26(3). – P. 176-178.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

349

42. Stem cells in endometrium and their role in the pathogenesis of endometriosis / P.G. Figueira, M.S. Abrao, G. Krikun [et al.] // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 2011. – Vol. 1221. – P. 10-17. 43. Endometrialstem cell transplantation restores dopamine production in a Parkinson's disease model // E.E. Wolff, X.B. Gao, K.V. Yao [et al.] // J. Cell Mol. Med. – 2011. – Vol. 15(4). – P. 747-755. 44. The treatment of neurodegenerative disorders using umbilical cord blood and menstrual blood-derived stem cells / P.R. Sanberg, D.J. Eve, A.E. Willing [et al.] // Cell Transplant. – 2011.– Vol. 20(1). – P. 85-94. 45. Feasibility investigation of allogenic endometrial regenerative cells / Z. Zhong, A.N. Patel, T.E. Ichim [et al.] // J. Transl. Med. – 2009. – Vol. 20. – P. 7-15. 46. Recent progress in cell for basal ganglia disorders with emphasis on menstrual blood in stroke / M.C. Rodrigues, J. Voltarelli, P.R. Sanberg [et al.] // Neurosci. Biobehav. Rev. – 2012.– Vol. 36(1). – P. 177-190. 47. Toward personalized cell therapies: autologous menstrual blood cells for stroke / M.C. Rodrigues, L.E. Glover, N. Weinbren [et al.] // J. Biomed. Biotechnol. – 2011. – 2011:194720. Доступ до електронного ресурсу www. ncbi. nim. nih. gov/pubmed/22162629. 48. Production of functional dendrite cells from menstrual blood – a new dendrite cell source immune therapy / P.V. Phuc, D.H. Lam, V.B. Nga [et al.] // In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. – 2011. – Vol. 47(5-6). – P. 368-375. 49. Induction of insulin-producting cells derived from endometrial mesenchymal stem-like cells / H.Y. Li, Y.J. Chen, C.L. Kao [et al.] // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 2010. – Vol. 335(3). – P. 817-829. 50. Derivation of insulin producing cells from human endometrial stromal stem cells and use in the treatment of murine diabetes / X. Santamaria, E.E. Massasa, Y. Feng [et al.] // Mol. Ther. – 2011. – Vol. 19(11). – P. 2065-2071. 51. Human endometrial cells express elevated levels of pluripotent factors and are more amenable to reprogramming into induced pluripotentstem cells / J.H. Park, L. Daheron, S. Kantarci [et al.] // Endocrinology. – 2011. – Vol. 152(3). – P. 1080-1089.

350

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б. В Австрії вчені виростили з клітин шкіри «головний мозок у пробірці». Опубліковано 29.08.2013. Уперше зі стовбурових клітин вдалося отримати орган, схожий на мозок: у розітнутих зразках можна спостерігати обриси кори великих півкуль, судинне сплетення і навіть зачатки очей. Учені назвали отримані зразки «органоїдами». За їхніми словами, «органоїди» нагадують нервову систему людини на ранньому етапі розвитку зародка. Відзначається, що вчені змогли виростити у пробірці за 15-20 днів «органоїди» розміром в 2-3 міліметра і зберігати їх живими протягом 10 місяців. http:// newsradio.com.ua/2013_08_29 Китайським біологам вдалося отримати стовбурові клітини мозку з сечі. Опубліковано 10.12.2012. Учені з Китаю розробили метод, за допомогою якого можна отримати індуковані стовбурові клітини мозку із клітин ниркового епітелію, які містяться в сечі. У ході досліджень біологи використовували метод перепрограмування ниркового епітелію за допомогою введення кількох генів, робота яких визначає долю клітин. http://ua.korrespondent.net/tech/science/1435719-kitajskimbiologam-vdalosya-otrimati-stovburovi-klitini-mozku-iz-sechi

3.8. Нервова система Відновлення тканин і клітин (регенерація) – це стратегія для підтримки форми і функції протягом життя. На тваринних моделях протягом останнього десятиріччя простежені її філогенетичні корені і це пов’язано з дослідженням СК, що має значення для регенераційної медицини. Деякі органи ссавців майже втратили свої регенераторні можливості і серед них головний і спинний мозок [1]. Загальноприйнято вважати, що нейрогенез у ЦНС припиня ється до або незабаром після народження особини. Протягом ос танніх десятиріч виявлено, що нові нейрони продовжують утво рюватися і в дорослому мозку риб, жаб, рептилій, птахів і ссавців. Більшість дослідників стверджують, що СК і клітини-попередниці в невеликих кількостях розташовані в стінках бічних шлуночків мозку (див. розділ 2.4). Питання нейрогенезу в центральній і периферійній нервовій системі стали предметом уваги науковців. Із цього часу заговорили про важливість досліджень нейрогенезу з СК, їхньої участі у виникненні патологічних станів і можливості лікування неврологічних захворювань новими технологіями на

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

351

основі використання нервових СК [2]. Про роль нейрональних стовбурових прогеніторів у процесах виникнення і прогресування деяких пухлин головного мозку, а також епілептогенезу повідомляли В.І. Цимбалюк, В.В. Медведєв [3,4]. Ці автори присвятили ґрунтовну монографію нейрогенним СК і окреслили теоретичні та клінічні перспективи їх застосування [5]. У 2003 році T. Ostenfeld, C.N. Svensen [6] визначили основні властивості нервових СК на той період: 1. Нервові СК можна вирощувати з ЦНС різних видів ссавців на багатьох етапах розвитку. Вони мають великий потенціал для самовідновлення. Нервові СК є мультипотентними і з них розвиваються нащадки всіх фенотипів нервової тканини – нейрони та нейроглія. 2. Нервові СК можна отримати з більш примітивних ембріональних СК, які культивуються з бластоцисти. 3. Існує думка, що в приматів і людини є такі клітини, які володіють ендогенною пластичністю для перебудови. 4. Такі клітини мігрують, відповідають на цитокіни, можуть бути вирощеними в культурі і тим самим ліквідуються етичні питання забору ембріональних клітин. 5. Але висновок був невтішним: терапія СК, імовірно, ще довго залишиться експериментом. Вимогами до нервових СК є наявність у них таких функціональних властивостей, як «мультипотентність» - тобто здатність клітин до наступної диференціації на три типи клітин нервової тканини – на нейроцити, астроцити і олігодендроцити в контексті регіональних особливостей; можливість заселення регіону віддаленої чи близької від утворення ділянки; їх можна серійно трансплантувати; їхньою характерною властивістю є «самовідновлення» – тобто можливість утворювати дочірні клітини (включаючи нові СК) з однаковими властивостями і потенціалом [7]. Нейрогенез у дорослих являє собою яскравий приклад структурної пластичності в зрілій тканині ЦНС і відбувається тільки в дискретних ділянках нервової системи: субвентрикулярній і субгранулярній зоні бічних шлуночків головного мозку. У цих ділянках містяться нервові стовбурові клітини. Уперше вони були описані J. Altman в 1970 р. [8]. До того часу вважали, що проліферація клітин у головному мозку обмежена гліоцитами. Пізніше утворення нейронів було продемонстровано в кінцевому мозку дорослих рептилій, птахів і ссавців (у мишей, щурів,

352

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

кролів, корів, приматів і людини) і сьогодні вважають, що СК можуть диференціюватися в усі типи клітин нервової тканини – нейрони і гліоцити (астроцити і олігодендроцити) [9 - 12]. Для диференціації СК у субвентрикулярній зоні мишей важливим є онкостатин М, який здійснює ендогенний сигналінг в межах гіпокампа і нюхової цибулини [6]. Викликають цікавість повідомлення, що нейрогенез відбувається не тільки в субвентрикулярній зоні, але й у меншій мірі в інших відділах головного мозку – мозочку [13, 14], мигдалеподібному тілі [15], корі головного мозку [16, 17], чорній речовині [18, 19] і смугастому тілі [20, 21]. Мозковими нішами СК у гіпокампі є субвентрикулярна і субгранулярна зони [22, 23]. У першій розрізняють СК трьох типів – А, В і С. Найбільшою популяцією є клітини типу В, серед яких визначають В1 (мають контакт із порожниною шлуночка) і В2 (не мають такого контакту). У клітинах В1 виявляється одна коротка первинна війка в напрямку порожнини шлуночка, що край важливо для контролю клітинної проліферації і впливу на кровоносні судини. Ці клітини дають початок проміжним попередникам нейронів, активно проліферують і стають клітинами типу С. Останні діляться симетрично і продукують мігруючі нейробласти (тип А), які переміщуються вентрально в нюхові цибулини, щоб стати інтернейронами. За останніми даними, клітини типу В можуть давати початок олігодендроцитам, які мігрують у мозолисте тіло й у стрічку склепіння. Кровоносні судини регулюють активацію проліферації СК у нішах. Субгранулярна зона є проліферативною ділянкою, яка розташована в зубчастій звивині гіпокампа, містить попередники нейронів, що дають початок зернистим нейронам. Ці клітини належать до типу В, мають мультипотентні властивості, діляться асиметрично і результатом цього є утворення клітин типу D, які диференціюються локально в зрілі гранулярні нейрони. До функції цих нейронів, імовірно, належить регуляція процесів пам’яті, навчання і депресії. У цих мозкових нішах спостерігаються численні мікрогліоци ти, які знаходяться в тісному контакті з нейральними СК. Вони мають гематопоетичне походження, постійно очищують ЦНС від

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

353

пошкоджених нейронів, бляшок, інфекційних агентів. Мікроглія є «першою лінією захисту» ЦНС. Установлено, що мікроглія впливає на СК завдяки секреторним чинникам, які вона виробляє і які необхідні для нейрогенезу. Однак, мікроглія не бере участі в самовідновленні і поширенні нейробластів. Ці ефекти опосередковуються низкою факторів, таких як IL-1, TNF-α (автокринні активатори), γ-інтерферон (викликає і поглиблює імунну відповідь), інсулін-подібний фактор росту-1 (сприяє проліферації клітин), IL-4 (збільшує фагоцитарні властивості мікроглії), гальмівний фактор лейкемії, LIF (пов’язаний із пересуванням і диференціацією клітин) [24]. У «нюхових ділянках» мозку дорослих M. Schmidt, C.D. Derby [25] спостерігали в нішах формування кластерів або «ней рогенних комплексів», в яких відбувається асиметричний поділ нейробластів, що поповнюють пул попередників нейронів у відповідній зоні. Стовбурові ніші в дорослих схожі на зародкові і містять елементи ембріонального мікрооточення – гліоцити і судини [26]. Один із можливих механізмів, які регулюють ангіогенез у стовбурових нішах, є GABA сигнальний шлях [27]. У нішах відбувається проліферація дорослих СК, яка харак теризується динамічністю і потенціалом для масивного само оновлення. Самооновлення нейронів ЦНС і розміри ніші можуть бути змодельовані фармакологічно чи генетично при активації гістонів Н2АХ. Важливим моментом є наявність механізмів, які постійно обмежують проліферацію і тим самим демонструють вплив на нейрогенез у дорослих [28]. Це є позитивним щодо некерованої проліферації і можливості утворення пухлин і негативним для відновлення мозку при хворобах. Водночас, слід зауважити, що нейрогенез у дорослих динамічно регулюється протягом усього життя і залежить від віку, екологічних і стресових впливів, фізичної активності і розвитку невропатологічних станів [29, 30]. Накопичується все більше доказів про те, що для життєдіяльності нейральних СК необхідні елементи позаклітинного мат риксу мозкових стовбурових ніш [31]. Молоді нейрони, які утворилися в субвентрикулярній зоні за нормальних умов мігрують згідно ростральних міграційних

354

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

потоків у нюхові цибулини, а потім шляхом радіальної міграції досягають різних нейронних шарів головного мозку [32 - 34]. У мавп значна кількість клітин відхиляється від рострального потоку і прямує не до нюхової цибулини, а вентрально до нюхового горбка, де в них виявляють зрілий фенотип (MAP-2) [35]. Поляризовані клітини епітелію шлуночків надають векторну інформацію для напрямку поширення молодих мігруючих клітин [36]. В експерименті показано, що в разі пошкодження певної ділянки мозку ці клітини мігрують до місця пошкодження, диференціюються в нейрони і функціонально інтегруються в мозкову паренхіму [37 - 39]. Таким чином, процеси міграції мають вирішальне значення для переміщення новоутворених нейронів у місця пошкодження головного мозку. Міграція супроводжується ростом аксонів і встановленням синаптичних контактів і залежить, певною мірою, від впливу загальних молекул переміщення, стану поверхневих рецепторів і шляхів сигнальної трансдукції, що відбувається завдяки активації рецепторів для реорганізації цитоскелету нейронів [40]. В експерименті моделювали різні патологічні стани (ішемію, епілепсію) і встановили, що при цьому збільшується рівень проліферації клітин у субвентрикулярній зоні [41 - 44]. При інсульті тут генеруються нові нейрони і нейробласти, які мігрують у смугасте тіло, де вони експресують маркери зрілих нейронів, тобто інсульт викликає фенотипову диференціацію нейронів. У хворих із хворобою Гантінгтона спостерігається збільшення проліферації в субепендимальному шарі ділянок, прилеглих до хвостатого ядра, ступінь якої зростає з важкістю захворювання [45]. Підвищений нейрогенез за патологічних станів пов’язують з активізацією самооновлення СК і клітин-попередниць. Виснаження популяції попередників і нейробластів у субвентрикулярній зоні призводить до посилення проліферації СК, виходячи з позицій гомеостазу – чим менше СК і попередників залишається в ніші, тим вони швидше розмножуються. Для трансплантації СК треба виділити і культивувати in vitro. W.L. Brain et al. [46] отримали нейральні СК із субвентрикулярної зони людей після швидкої автопсії, культивували, виростили нейросфери, які містили в центрі клітини з позитивними

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

355

маркерами на Musashi-1, nestin та nucleostemin, а більш до периферії – диференційовані GRAP+ нейрони і galactocerebroside+ олігодендроцити. У нейросфері процеси утворення попередників нервових клітин підтримувалися протягом кількох місяців після первинного культивування, а в деяких випадках – 2 роки, aле ці клітини залишалися незрілими. Дослідники висловили припущення, що клітини-попередниці в людини можуть залишатися життєздатними протягом більшої частини життя людини, і зберігати свою активність, навіть, в умовах важких нейродегенеративних захворювань. Раніше J. Macos et al. [47] забирали ділянки гіпокампа на автопсії людей з інсультом і виростили в культурі нейрони, астроцити і олігодендроцити. Великого значення в проліферації нейральних СК та їхньої диференціації відіграють фактори росту і нейротрофіни. У нейро сферах культури взаємодія FGF-4 з його рецептором FGFR-1/2 індукує нейральні СК до самооновлення. Нейротрофіни сприяють виживанню і диференціації нейронів (Рис. 25). Нейральні СК здатні утворювати колонії, які містять нейрони і гліоцити, або можна вирощувати тривимірні культури тканини, які містять нейрони і нейроглію, так звані нейросфери [48]. Клітини нейросфер неоднорідні морфологічно і функціонально. Конфокальна мікроскопія виявила різницю в розмірах, життєздатності, вмісту цитоплазми і в розподілі активних мітохондрій. Електронномікроскопічно нейросфера виглядає як складна структура з клітинами у фазі мітозу, апоптозу і, навіть, фагоцитозу. До того ж нейральні СК у нейросфері не синхронізовані і представлені у всіх фазах клітинного циклу [49]. N. Horie et al. [50] уперше показали, що пересаджені в мозок людини при підгострому ішемічному пошкодженні клітини нейросфер (hCNS-SChs) виділяють фактор росту ендотелію судин (hVEGF), який пригнічує запальні процеси і активізує клітини до відновлення на фоні неоваскуляризації. Триває пошук i вивчення джерел для трансплантації СК при нейродегенеративних захворюваннях ЦНС, у тому числі ембріональних і дорослих соматичних СК [51 - 53]. У першу чергу, увагу привертають мезенхімні СК червоного кісткового мозку, які є привабливими кандидатами для використання в регенераційній

диференціації відіграють фактори росту і нейротрофіни. У нейросферах культури взаємодія FGF-4 з його рецептором FGFR-1/2 індукує нервові СК до самооновлення. Нейротрофіни сприяють виживанню і диференціації нейронів (Рис. 24).

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

356

Нервові стовбурові клітини bFGF, EGF FGF-4

Нейросфери

BDNF, NT-3, NGF, FGF-4

Астроцити Нейрони

Олігодендроцити

Рис. 24. Уявлення проFGF-4 рольдляFGF-4 для проліферації нервових Рис. 25. Уявлення про роль проліферації нервових стовбурових стовбурових клітин та їхнього клітин диференціювання. та їхнього диференціювання. Позначення: - основний фактор росту фібробластів, EGF Позначення: bFGF -bFGF основний фактор росту фібробластів, EGF - епідермальний епідермальний фактор FGF-4 фактор росту фібробластів 4, -BDNF, фактор росту, FGF-4 росту, - фактор росту-фібробластів 4, BDNF, NT-3, NGF нейроNT-3,трофіни. NGF - нейротрофіни.

медицині, легко доступні умовах іі Нервові оскільки СК здатнівони утворювати колонії, вякіприродних містять нейрони мають унікальні імунологічні властивості. Більш того, ці гліоцити, або можна вирощувати тривимірні культури тканини, які мультимістять потентні клітини єтак важливими в екологічній та секренейрони і нейроглію, звані нейросфери [48]. адаптації Клітини нейросфер неоднорідні морфологічно і функціонально. Конфокальна мікроскопія торній здатності, можуть мігрувати і тому розглядається питання виявила різницю в розмірах, життєздатності, вмісту цитоплазми і в розподілі їх трансплантації і трансдиференціації при неврологічних пошкоактивних мітохондрій. Електронномікроскопічно нейросферапри виглядає як дженнях [54]. Mезенхімні СК можна використати захворюваннях головного мозку і травмах спинного мозку як моделі доставки терапевтичних молекул. Ці клітини модулюють імунну відповідь за рахунок зменшення прозапальних функцій клітин і заохочення проліферації Т лімфоцитів і секреції IL-4 та IL-10 [55]. В експерименті показано, що використання мезенхімних СК для лікування неврологічних захворювань покращує клінічний перебіг, зменшує демієлінізацію, імунні інфільтрати і аксонні втрати [56].

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

357

• Матеріали опубліковані в статті Чайковський Ю.Б. Стовбурові клітини головного мозку в постнатальному періоді / Ю.Б. Чайковський, О.І. Дєльцова, С.Б. Геращенко // Світ медицини та біології. – 2011. - №4. – С. 148-153. Література 1. Bonfanti L. From Hydra Regeneration to Human Brain Structural Plasticity: A long Trip through Narrowing Roads / L. Bonfanti // Scientific World J. – 2011. – Vol. 9 (11). – P. 12701299. 2. Аlvarez-Buylla A. Neuronal stem cells in the brain of adult vertebrates / А.Alvarez-Buylla, C. Lois // Stem Cells. – 1995. – Vol. 13 (3). – P. 263-272. 3. Цимбалюк В.І. Роль нейрональних стовбурових прогеніторів в процесах виникнення і прогресування деяких пухлин головного мозку, а також епілептогенезу (огляд літератури) / В.І. Цимбалюк, В.В. Медведєв // Український нейрохірургічний журнал. – 2004. - №1. – С. 9-13. 4. Цымбалюк В.И. Нейрогенные стволовые клетки / В.И. Цымбалюк, В.В. Медведев. – К.: Коваль, 2005. – 596 с. 5. Цимбалюк В.І. Перспективи застосування нейрогенних стовбурових клітин: теоретичні та клінічні аспекти / В.І. Цимбалюк, О.І. Троян, Є.С. Ярмолюк // Науковий вісник Національного медичного університету імені О.О. Богомольця. – 2009. №1.– С. 120-127. 6. Oncostatin M regulates neural precursor activity in the adult brain / P. Beatus, D.J. Jhaveri, T.L. Walker [et al.] // Dev. Neurobiol. – 2011. – Vol. 71(7). – P. 619-633. 7. Expression profile of an operationally-defined neural stem cell clone / M.A. Parker, J.K. Anderson, D.A. Corliss [et al.] // Exp. Neurol. – 2005. – Vol. 194(2). – P. 320-352. 8. Altman J. Postnatal neurogenesis and the problem of neural plasticity / J. Altman // In.: Himwich W.A. ed. Development neurology. – C.C.Thomas, Springfield, 1970. – P. 197-237. 9. Alvarez-Buylla A. A unified hypothesis on the lineage of neural stem cells / A. Alvarez-Buylla, J.M. Garcia-Verdugo, A.D. Tramontin / Nat. Rev. Neurosci. – 2001. – Vol. 2 (4). – P. 287-293.

358

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

10. Temple S. The development of neural stem cells / S. Temple // Nature. – 2001. – Vol. 414 (6859). – P. 112-117. 11. Cage F.H. Neurogenesis in the adult brain / F.H. Cage // J. Neurosci. – 2002. – Vol. 22(3). – P. 612-613. 12. The proliferative ventricular zone in adult vertebrates: a comparative study using reptiles, birds, and mammals / J.M. Garcia-Verdugo, S. Ferron, N. Flames [et al.] // Brain Res. Bull. – 2002. – Vol. 57(2). – P. 765-775. 13. Hatlen M.E. Central nervous system neuronal migration / M.E. Hatlen // Annu Rev. Neurosci. – 1999. – Vol. 22. – P.511-539. 14. Immortalized neural stem cells differ from nonimmortalized cortical neurospheres and cerebellar granular cell progenitors / R. Mi, J. Luo, J. Cai [et al.] // Exp. Neurol. – 2005. – Vol. 194(2). – P. 301-319. 15. Newly generated neurons in the amygdale and anjoining cortex of adult primates / P.J. Bernier, A. Bedard, J. Vinet [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci USA. – 2002. – Vol. 99 (17). – P. 1146411669. 16. Neurogenesis in the neocortex of adult primates / E. Gould, A.J. Reeves, M.S. Graziano [et al.] // Science. – 1999. – Vol. 286 (5439). – P. 548-552. 17. Takemura N.U. Evidence of neurogenesis within the white matter beneath the temporal neocortex of the adult rat brain / N.U. Takemura // Neuriscience. – 2005. – Vol. 134 (1). – P. 121-132. 18. Zhao C. Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis / C. Zhao, W. Deng, F.H. Gage // Cell. – 2008. – Vol. 132 (4). – P. 645-660. 19. Possibility for neurogenesis in substantia nigra of parkinsonian brain / K. Yoshimi, Y.R. Len, T. Seki [et al.] // Ann. Neurol. – 2005. – Vol. 58(1). – P. 31-40. 20. Van Kampen J.M. A possible role for dopamine D3 receptor stimulation in the induction of neurogenesis in the adult rat substantia nigra / J.M. Van Kampen, H.A. Robertson // Neurosci.– 2005. – Vol. 136 (2). – P. 381-386. 21. Bedard A. Chemical characterization of newly generated neurons in the striatum of adult primates / A. Bedard, C. Gravel, A. Parent // Exp. Brain Res. – 2006. – Vol.170 (4). – P. 501-512.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

359

22. Goldman S.A. Neural progenitor cells in adult brain / S.A. Goldman, F. Sim // Novartis Foynd. Symp. – 2005. – Vol. 265. – P. 66-80. 23. Gonsalez-Perez O. Immunological control of adult neural stem cells / O. Gonsalez-Perez, A. Quinones-Hinojosa, J.M. GarciaVerdugo // J. Stem Cells. – 2010. – Vol. 5 (1). – P. 23-31. 24. Pivneva T.A. Microglia in normal condition and pathology / T.A. Pivneva // Fiziol. Zn. – 2008. – Vol. 54(5). – P. 81-89. 25. Schmidt M. Cytoarchitecture and ultrastructure of neural stem cell niches and neurogenic complexes maintaining adult neurogenesis in the olfactory midbrain of spiry lobsters, Panulirus argus / M. Schmidt, C.D. Derby // J. Comp. Neurol. – 2011. – Vol. 519 (12). – Spc.1. 26. Xin Duan. Development of neural stem cell in the adult brain / Xin Duan, E. Kang, Y. Cindy // Curr. Opin. Neurobiol. – 2008. – Vol. 18 (1). – P. 108-115. 27. Ahn S. In vivo analysis of quiescent adult neural stem cells responding to Sonic hedgehog / S. Ahn, A.L. Joyner // Nature. – 2005. – Vol. 437 (7060). – P. 894-897. 28. Ruani N.F. Cell cycle restriction by histone H2AX limits proliferation of adult neural stem cells / N.F. Ruani, E. Boris, A. Shaimoa // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2011. – Vol. 108 (14). – P. 5837-5842. 29. Stem cells: establisched facts, open issues, and future directions / G. Kuhn, O. Brustle, U. Martens [et al.] // Cell Tissue Res. – 2008. – Vol. 331 (1). – P. 1-3. 30. Evidence for neurogenesis in the adult mammalian substantia nigra / M. Zhao, S. Momma, K. Delfani [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2003. – Vol. 100(13). – P. 79257930. 31. Preston M. Neural stem cells niches: Roles for the hyaluronan-based extracellular matrix // M. Preston // Front Biosci. (School Ed.). – 2011. – Vol. 3. – P. 1165-1179. 32. Differential neurogenesis and gliogenesis by local and migrating neural stem cells in the olfactory bulb / N. Fukushima, K. Yokouchi, K. Kawagishi [et al]. // Neurosci. Res. – 2002. – Vol. 44 (4). – P. 467-473.

360

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

33. Liu J.H. Development and evolution of the human neocortex / J.H. Liu, D.V. Hansen, A.R. Knegstein // Cell. – 2011. – Vol. 46 (1). – P. 18-36. 34. The rho kinase pathway regulates mouse adult neural precursor cell migration / S.Y. Leong, C.H. Faux, A. Turbic [et al.] // Stem Cells. – 2011. – Vol. 9 (2). – P. 332-343. 35. The rostral migratory stream in adult squirrel monkeys: contribution of new neurons to the olphactory tubercle and involment of the antiapoptic protein Bcl-2 / A. Bedard, M. Levesque, P.J. Bernier [et al.] // Eur. J. Neurosci. – 2002. – Vol. 16 (10). – P. 1917-1924. 36. New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain / K. Sawamoto, H. Wichterle, O. Gonzalez-Perez [et al.] // Science. – 2006. – Vol. 311(5761). – P. 629-632. 37. Kokaia Z. Neurogenesis after ischemic brain insults / Z. Kokaia, O. Linwall // Curr. Opin. Neurobiol. – 2003. – Vol. 13 (1).– P. 127-132. 38. Persistent production of neurons from adult brain stem cells during recovery after stroke // P. Thored, A. Arvidson, E. Cacci [et al.] // Stem Cells. – 2006. – Vol. 24 (3). – P. 739-747. 39. Kaneko N. Adult neurogenesis and its alteration under pathological conditions / N. Kaneko, K. Sawamoto // Neurosci. Res. – 2009. – Vol. 63 (3). – P. 155-164. 40. Song H. The cell biology of neuronal navigation. / H. Song, M. Poo // Nat. Cell Biol. – 2001. – Vol. 3 (3). – P. E81-88. 41. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke // A. Arvidson, T. Collin, D. Kirik [et al.] // Nat. Med. – 2002. – Vol. 8 (9). – P. 963-970. 42. Regeneration of hippocampal pyramidal neurons after ischemic brain injury by recruitment of endogenous neural progenitor / H. Nakatoni, T. Kuriu, S. Okabe [et al.] // Cell. – 2002. – Vol. 110 (4). – P. 429-441. 43. Parent J.M. Prolonged seizures increase proliferating neuroblasts in the adult rat subventicular zone – olfactory bulb pathway / J.M. Parent, V.V. Valentin, D.H. Lowenstein // J. Neurosci. – 2002. – Vol. 22 (8). – P. 3174-3188. 44. Temporal profile of stem cell division, migration, and differentiation from subventricular zone to olfactory bulb after

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

361

transient forebrain ischemia in girbils / M. Iwai, K. Sato, H. Kamada [et al.] // J. Cereb. Blood Flow Metab. – 2003. – Vol. 23 (3). – P. 331-341. 45. Increased cell proliferation and neurogenesis in the adult human Huntington’s disease brain // M.A. Curtis, E.B. Penny, A.G. Pearson [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2003. – Vol. 100(15). – P. 9023-9027. 46. Subventricular Zone Neural Progenitors from Rapid Brain Autopsies of Elderly Subjects with an without Neurodegenerative Disease / W.L. Brain, Diego Mastroeni, A. Grover [et al.] // J. Comp. Neurol. – 2009. – Vol. 515 (3). – P.269-294. 47. Increased generation of neuronal progenitors after ischemic injury in the adult human forebrain / J. Macos, C. Nern, K.H. Plate [et al.] // J. Neurosci. – 2006. – Vol. 26(50). – P.13114-13119. 48. Recent Advancements in Stem Cell, and Gene Therapies For Neurological Disorders and Intractable Epilipsy / R.N. Janice,Xu maisano, Jia Yang [et al.] // Neuropharmacology. – 2010. – Vol. 58 (6). – P. 855-864. 49. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization / A. Bez, E. Casini, D. Curti [et al.] // Brain Res. – 2003. – Vol. 993 (1-2). – P. 18-29. 50. Transplated stemcell-secreted vascular endothelial growth factor effects poststude recovery, inflammation, and vascular repair / N. Horie, M.P. Pereira, K. Nizuma [et al.] // Stem Cells. – 2011.– Vol. 29 (2). – P. 274-285. 51. Webler D.J. Therapeutic potential of stemcells in central nervous system regeneration / D.J. Webler, S.L. Mibger // Curr. Opin. Invest. Drugs. – 2004. – Vol. 5 (7). – P. 714-719. 52. Yu D. Stemcell sources and therapeutic approaches for central nervous system and neural retinal disordes // D. Yu, G.A. Silva // Neurosurg. Focus. – 2008. – Vol. 24 (34). – P. E11. 53. Ruffield G.J. Stem cells for central nervous system repair and rehabilitation / G.J. Ruffield, P.A. Pooc, M. Oudega // PMR.– 2011. – Vol. 3 (6 Suppl.). – P. 117-122. 54. Maltman D.J. Role of mesenchymal stem cells in neurogenesis and nervous system repair / D.J. Maltman, S.A. Hardy, S.A. Przyborshi // Neurochem. Int. – 2011. – Vol. 59 (3). – P. 347-356.

362

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

55. Azari M.F. Mesenchymal stem cells for treatment of cNS injury / M.F. Azari, L. Mathias, E. Ozturk // Curr. Neuropharmacol.– 2010. – Vol. 8 (4). – P. 316-323. 56. Ucelli A. Mesenchymal stemcells for the treatment of multiple sclerosis and other neurological diseases / A. Ucelli, A. Laroni, M.S. Freedman // Lancet Neurol. – 2011. – Vol. 10 (7). – P. 649-656. СК і ремієлінізація в центральній нервовій системі. Хворо би головного і спинного мозку є серйозними проблемами в неврології. Мієлінізація має вирішальне значення для нормального функціонування нервової системи в хребетних. У ЦНС мієлін продукується олігодендроцитами і втрата мієліну призводить до важких наслідків. При розсіяному склерозі відбувається демієлінізація, яка тісно пов'язана з пошкодженням імунної системи. Стан олігодендроцитів і можливості ними мієлінізації аксонів можуть вказати на те, чому демієлінізовані аксони дегенерують швидше, особливо при розсіяному склерозі. В експерименті показано, що ремієлінізація опосередковується попередниками олігодендроцитів, які мігрують у місце пошкодження завдяки хемотаксису, проліферують і диференціюються в зрілі олігодендроцити і виконують ремієлінізацію аксонів. При хронічних процесах це відбувається повільно, що, імовірно, пов'язано зі станом нервових клітин. Терапевтичні стратегії включають трансплантацію клітин-попередників екзогенних і активацію мієлінізації ендогенними клітинами-попередницями. Це не впливає на перебіг нервових процесів [1]. Мезенхімнi СК можуть сприяти ендогенному ремонту мієліну і модуляції імунної відповіді. Стратегічно важливо – заміна пошкоджених клітин або доставка до них факторів росту, імуномодуляторів або метаболічних ферментів [2]. R.J. Franklin, W.F. Blakemore [3] одними з перших показали, що шванноцити здатні мігрувати в ЦНС і мієлінізувати аксони при патологічних станах. Існують тонкощі взаємодії шванноцитів і астроцитів, що потребує їхніх подальших досліджень. Автори в експерименті in vitro представили дані про те, що для міграції шванноцитів і утворення мієліну значення має позаклітинний матрикс. Несумісність шванноцитів і астроцитів є важ-

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

363

ливим аспектом біології гліальних клітин, які будуть мати вирішальне значення при ремієлінізації демієлінізованих аксонів при трансплантації шванноцитів у ЦНС. Вказуючи на можливість відновлення мієліну при ураженнях ЦНС олігодендроцитами і шванноцитами, але за відсутності маркерів цих клітин, висновки є передчасними для їхньої транс плантації в демієлінізовані ділянки спинного мозку дорослих мишей і щурів [4]. В експерименті на гризунах показано, що шванноцити, включаючи клітини диферону шванноцитів, які були пересад жені в спинний мозок, можуть конкурувати з місцевими олігодендроцитами в ремієлінізації денудованих центральних аксонів нейронів спинного мозку. Мієлін, який вони утворюють, структурно нормальний і безпечний для нервової провідності. За сприятливих умов шванноцити мігрують на значну відстань (кілька мм) і частково відновлюють пошкодження. Таким чином, шванноцити можуть підтримувати ріст аксона і відіграють важливу роль у відновленні нервової системи. Можливість отримання великої кількості таких клітин дозволяє розглянути автологічні шванноцити, як джерела трансплантації і лікування наслідків демієлінізуючих і травматичних хвороб [5]. Процеси ремієлінізації і регенерації аксонів, переважно, вив чаються на тваринах. Ці процеси забезпечуються периферійними мієліноутворювальними клітинами, такими як шванноцити. Водночас зроблені спроби трансплантації гризунам СК червоного кісткового мозку, що буде мати значення для майбутніх клінічних досліджень [6]. У дослідах із перерізкою спинного мозку було показано, що шванноцити сприяли аксональній регенерації та відновленню провідності. Автори обговорюють питання підготовки потенцій них СК для клінічної терапії демієлінізуючих хвороб людини [7]. Раніше H.S. Keirsted, W.F. Blakemore [8] показали, що ре мієлінізація дозволяє відновлювати сальтаторну провідність і повернення нормальної функції нерва. Недостатність або пору шення ремієлінізації є основою демієлінізувальних захворювань нер во вої системи. Із літератури відомо, що при ремієлінізації олігодендроцити виникають у результаті дедиференціації та/або

364

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

проліферації зрілих олігодендроцтів, або створюються виключно при проліферації і диференціації попередників гліальних клітин. Експерименти з перерізкою спинного мозку в щурів показали, що: 1) олігодендроцити, які виживають у ділянці демієлінізації, не сприяють ремієлінізації, 2) ремієлінізація здійснюється з поперед ників гліоцитів, 3) збільшення кількості попередників гліоцитів є місцевою реакцією, 4) поділ попередників олігодендроцитів – симетричний, що викликає виснаження їхнього пула в білій речовині. Часто це проявляється порушенням утворення мієліну, що є наслідком того, що олігодендроцити стають конкретними і єдиними жертвами хвороб (судинні захворювання, травми, запальна демієлінізація) і вроджені дитячі (лейкодистрофії). Саме ці хвороби стають привабливими для клітинної терапії [9]. Мультипотентні нервові СК здатні породжувати як нейрони, так і гліоцити як у тварин, так і в людини. Тому в лікувальній стратегії їх можна використати для лікування втрати нейронів при хворобі Паркінсона, при розладах в утворенні мієліну, при травмах спинного мозку, для відновлення нейронів при нейродегенеративних захворюваннях [10]. Розсіяний склероз – це запальні демієлінізувальні розлади в ЦНС. В останні десятиліття дослідники вказують на те, що при цій хворобі під впливом стресових факторів пошкоджуються клітини, які генерують і підтримують стан мієліну в ЦНС, а реaкція ендоплазматичної сітки дозволяє клітині оговтатися і вижити після цих стресових подій [11]. Ремієлінізація – це формування нових мієлінових оболонок навколо аксонів ЦНС дорослих. Ремієлінізація може відновити властивості провідності аксонів (тим самим відновити неврологічні функції) і все частіше говорять про її нейропротекторне значення для аксонів. Особливо ці питання стосуються ремієлінізувальних процесів при розсіяному склерозі. Експериментальне вивчення ремієлінізації показало, що вона відбувається в 2 фази. Перша складається з колонізації пошкоджень попередниками олігодендроцитів, друга – з їхньої диференціації в мієліноутворювальні олігодендроцити, що контактують із демієлінізованими аксонами для створення функціонально активних мієлінових оболонок. При цьому можна

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

365

ідентифікувати кілька інтра- та екстрацелюлярних молекул, які є маркерами цих етапів відновлення. Теоретично "ремонт" демієлінізувальних пошкоджень може відбутися при підвищенні внутрішніх відновних процесів, за допомогою введення факторів ремієлінізації або за допомогою терапії з імуноглобуліном. Альтернативно, ендогенне відновлення можна викликати введенням мієліногенетичних клітин, які визначені кандидатами для відновлення, у ділянки демієлінізації [12]. M. Stangel [13] запропонував пересадку олігодендроцитів при розсіяному склерозі. Це було доведено ним в експериментах і почалися клінічні випробування. Найбільш перспективними для цієї мети автор вважає шванноцити з литкових нервів пацієнта, отриманих у результаті біопсії. Але сам автор висловлює сумнів, що трансплантація клітин стане клінічною практикою в найближ чому майбутньому. При лікуванні демієлінізувальних хвороб виникають труднощі трансплантації і існують етичні проблеми [14]. Завжди вважалося, що шванноцити є прерогативою периферійної нервової системи. Але є дані, що існують їх попередники в ЦНС, які дають початок шванноцитам, їх отримали і помістили in vitro з наступною трансплантацією у вільні від астроцитів ділянки демієлінізації in vivo. Отримано дані, що ці шванноцити можуть ремієлінізувати аксони в ЦНС [15]. Водночас A. Woodhoo et al. [16] вказують на те, що гліальні клітини ЦНС і шванноцити несумісні. Тобто шванноцити не можуть мієлінізувати аксони в ЦНС. Цього можна уникнути, якщо отримати ці клітини від новонароджених або ембріонів щурів в експерименті. Через 1-2 міс такі шванноцити, пересад жені в ЦНС, стали ультраструктурно подібні до шванноцитів периферійних нервів і добре мігрують у тканинах ЦНС. Висновок: шванноцити є ідеальними кандидатами для трансплантації при розсіяному склерозі. Таким чином, терапія СК є перспективним підходом до стра тегії ремієлінізації при демієлінізувальних і травматичних пошкодженнях спинного мозку. У дорослих ссавців у головному і спинному мозку існують самовідновлюючі нейральні СК/ клітини-попередниці. Автори трансплантували ці клітини трансгенним мишам у 2 ділянки фокальної демієлінізації і вродже-

366

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

ної демієлінізації. При наступному рентгенівському опроміненні трансплантовані клітини диференціювалися в межах олігодендро цитів і тільки поодинокі брали участь у ремієлінізації аксонів. Без рентгенівського пошкодження ці клітини диференціювалися в клітини, подібні до шванноцитів (за ультраструктурою, експресією маркерів шванноцитів, утворенням периферійного мієліну). Після пересадки в спинний мозок, навпаки, фенотипово олігоденд ритні клітини формують компактний мієлін, а шванноцито-по дібні – ні. Це демонструє високу пластичність даних клітин [17]. • Матеріали опубліковані в статті Геращенко С.Б. Сучасний погляд на роль шванноцитів у відновленні мієлінової оболонки / С.Б.Геращенко, О.І.Дєльцова, Ю.Б.Чайковський // Морфологічні основи наукових досліджень у медицині. Науково-практична конференція, присвячена 110-річчю з дня народження М.І. Зази біна. – Київ, 2013. – С. 11–15. Література 1. Miron V.E. Cells of the oligodendroglial lineage, myelination, and remyelination / V.E. Miron, T. Kuhlmann, J.P. Antel // Biochim. Biophys. Acta. – 2011. – Vol. 1812(2). – P. 184–193. 2. Miller R.H. Cellular approaches for stimulating CNS remyelination / R.H. Miller, L. Bai // Regen. Med. – 2007. – Vol. 2(5). – P. 817–829. 3. Franklin R.J. Requirements for Scwann cell migration within CNS environments: a viewpoint // R.J. Franklin, W.F. Blakemore // Int. J. Dev. Neurosci. – 1993. – Vol. 11(5). – P. 641–649. 4. Baron-Van Evercooren A. Future prospects in transplantation / A. Baron-Van Evercooren // Ann. Neurol. – 1994. – Vol. 36(Suppl.). – P. 151–156. 5. Baron-Van Evercooren A. Scwann cell transplantation and myelin repair of the CNS / A. Baron-Van Evercooren, V. AvellanaAdalid, F. Lachapelle [et al.] // Mult. Scler. – 1997. – Vol. 3(2). – P. 157–161. 6. Koscis J.D. Cell transplantation of peripheral-myelinforming cells to repair the injured spinal cord / J.D. Koscis, Y. Akiyama, K.L. Landlford [et al.] // J. Rehabil. Res. Dev. – 2002.– Vol. 39(2). – P. 287–298.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

367

7. Koscis J.D. Neuroprecursors as a cell to repair the demyelinated spinal cord / J.D. Koscis, Y. Akiyama, C. Radtke // J. Neurotrauma. – 2004. – Vol. 21(4). – P. 441–449. 8. Keirsted H.S. The role of oligodendrocytes and oligodendrocyte progenitors in CNS remyelination / H.S. Keirsted, W.F. Blakemore // Adv. Exp. Med. Biol. – 1999. – Vol. 468. – P. 183–197. 9. Goldman S.A. Cell replacement therapy in neurological disease / S.A. Goldman, M.S. Windrem // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. – 2006. – Vol. 361. – P. 1463– 1475. 10. Goldman S. Stem and progenitor cell-based of the human central nervous system / S. Goldman // Nat. Biotechnol. – 2005. – Vol. 23(7). – P. 862–871. 11. Endoplasmic reticulum stress response as a potential therapeutic target in multiple sclerosis / M.T. Getts, R.R. Getts, A.P.Kohm [et al.] // Therapy. – 2008. – Vol. 5(5). – P. 631– 634. 12. Chari D.M. Remyelination in multiple sclerosis / D.M. Chari // Int. Rev. Neurobiol. – 2007. – Vol. 79. – P. 589–620. 13. Stangel M. Transplantation of myelinating cells as regenerative therapy for multiple sclerosis-clinical studies / M. Srangel // Nervenazzt. – 2002. Vol. 73(10). – P. 937–945. 14. Stangel M. Remyelinating strategies for the treatment of multiple sclerosis / M. Srangel, H.P. Hartung // Prog. Neurobiol.2002. – Vol. 68(5). – P. 361–376. 15. Blakemore W.F. The case for a central nervous system (CNS) origin for the Schwann cells that remyelinate CNS axons following concurent loss of oligodendrocytes and astrocytes / W.F. Blakemore // Neuropathol. Appl. Neurobiol. – 2005. – Vol. 31(1). – P.1–10. 16. Woodhoo A. Schwann cell precursors : a favourable cell for myelin repair in the Central Nervous System / A. Woodhoo, V. Sahni, J. Glison [et al.] // Brain. – 2007. – Vol. 130(Pt8). – P. 2175–2184. 17. Mothe A.J. Transplanted neural stem/progenitor cells generate myelinating oligodendrocytes and Scwann cells in spinal cord demyelination and dysmielination / A.J. Mothe // Exp. Neurol. – 2008. – Vol. 213(1). – P. 176–190.

368

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Стовбурові клітини і проблема регенерації периферійних нервів. Пошкодження периферійних нервів є однією з актуальних проблем неврології та нейрохірургії. Мікрохірургічні операції дозволили поліпшити результати лікування травм нервових стовбурів, однак повне одужання хворих настає рідко. Тому багато досліджень останніх років було спрямовано на розробку нових методів фармакотерапії [1] та клітинних технологій [2 - 4]. Історія застосування клітинних технологій для вирішення проблеми регенерації нервових стовбурів починається з пересадки в інтактні нерви ембріональної нервової тканини. Перші спроби такого роду були зроблені в 80-ті роки минулого сторіччя. Була показана принципова можливість трансплантації в нерв дорослих щурів фрагментів ембріонального неокортексу і спинного мозку [5, 6], вивчені особливості диференціації їхніх нейронів, взаємодії з клітинами нейроглії [7, 8], розмноження і загибелі нервових клітин, впливу на їх диференціацію медіаторів і трофічних факторів [9]. У подальшому було встановлено, що нейрони алотрансплантатів ембріонального спинного мозку щурів, пересаджені в перерізаний нерв, здатні виконувати роль релейних трофічних центрів і реіннервувати відповідний м'яз [10 - 12]. За допомогою електроміографії і морфометрії показано, що трансплантація фрагментів ембріонального спинного мозку в ушкоджений нерв значно прискорює ріст нервових волокон, їхню мієлінізацію, підвищує проліферативну активність шванноцитів [13. 14]. Однак трансплантація ембріональної нервової тканини для стимуляції регенерації периферійних нервів у даний час у клініці застосовується дуже рідко. Це пов'язано з двома чинниками. По-перше, у довгоживучих трансплантатах ембріонального мозку спостерігаються дистрофічні зміни і загибель пересад жених нейронів, а також реактивний гліоз [15 - 17]. По-друге, даний метод поступився місцем розробленій пізніше пересадці нейральних СК у пошкоджений нерв, про що буде сказано нижче. Шванноцити (нейролеммоцити) є клітинами, які після трав ми нерва дедиференціюються, фактично перетворюючись на уні потентні СК. Тому наступним кроком у розробці клітинних технологій стало застосування трансплантації шванноцитів у нерв або в кондуїт, що з'єднує кінці перерізаного нерва. Особливо час-

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

369

то дана методика застосовувалася при виникненні дефекту і неможливості безпосереднього з'єднання проксимального і дистального відрізків [18 - 22]. Автологічні шванноцити культивували in vitro, і їхня пересадка в кондуїт покращувала як морфологічні, так і електрофізіологічні показники відновного процесу [23, 24]. В останні роки продемонстрована можливість більш ефективного використання трансплантації шванноцитів за рахунок застосування генетично модифікованих клітин [25] із гіперекс пресією нейротрофіну-3 [26], FGF-2 [27, 28], GDNF [29]. Тим не менше, застосування автологічних нейролемоцитів для лікування гострих ушкоджень нервів може бути ускладнене в зв'язку з тим, що для отримання достатнього обсягу клітин може знадобитися кілька тижнів культивування [30]. Із цієї точки зору привабливою є ідея трансплантації алогенних шванноцитів. Вони можуть бути заготовлені в достатній кількості, зберігатися в банках тканин і піддаватися імунологічному скринінгу на сумісність із реципієнтом, як це відбувається при трансплантації органів. Така спроба була зроблена в експерименті, однак процес відторгнення клітин «був занадто швидким» і регенерація нер вових волокон істотно не змінювалася в порівнянні з контролем [31]. Таким чином, пересадка ембріональної нервової тканини або шванноцитів, хоча і була розроблена в експерименті, проте не знайшла значного клінічного застосування. Наступним кроком став пошук СК із різних джерел для застосування в якості трансплантатів пошкоджених периферійних нервів. Застосування СК. Ембріональні СК виділяють із зародків експериментальних тварин [32 - 34] і людини [35] на стадії бластоцисти. Ембріональні СК мають здатність диференціюватися в умовах in vitro та in vivo в клітини різних типів [36]. Проведена спрямована диференціація ембріональних СК людини в шванноцити [37]. Ембріональні СК були трансплантовані в ушкоджений сідничий нерв щурів [38] і через 3 місяці частина пересаджених клітин диференціювалася в шванноцити, що було підтверджено експресією в них білка S100. Електрофізіологічно встановлено, що відновлення нерва відбувалося швидше, ніж у контролі. Автори вважають, що поліпшення регенерації нервових волокон за допомогою ембріональних СК пов'язане з їхньою здатністю

370

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

секретувати нейротрофічні фактори. Однак застосування ембріо нальних СК у клітинній терапії має бути обмеженим. Це обумов лено етичними проблемами, що виникають при використанні клітин ембріона людини, і з ризиком розвитку в організмі реципієнта злоякісних новоутворень [39, 40]. В останні роки увагу дослідників привертають плодові СК, тому що за пластичністю займають проміжне положення між ембріональними та дорослими СК. Плодові СК не виявляють туморогенності і легко можуть бути заготовлені з абортного матеріа лу. Їх можна отримувати з крові, печінки, кісткового мозку, підшлункової залози, селезінки та нирки плодів, а також екстраплодових джерел - кордової крові, амніона, амніотичної рідини, плаценти [41]. Нам вдалося виявити в доступній літературі декілька робіт, присвячених використанню плодових СК для лікування травми нерва. Плодові СК, отримані з Вартонових драглів пупкового канатика, in vitro диференціювалися в шванноцити, експресували відповідні маркери (р75 та S100), секретували BDNF, NGF та NT-3, мієлінізували нейрити клітин лінії РС12 [42]. Автори зробили висновок про можливість застосування плодових СК у клініці для лікування травм нервів. В експерименті на щурах показано, що пересадка плодових СК, отриманих з амніотичної рідини людини, покращувала результати регенерації сідничого нерва [43]. Таким чином, незважаючи на те, що плодові СК уже широко застосовуються в регенеративній медицині, їх використання в лікуванні травм нервів, мабуть, ще попереду. Нині відомо, що в дорослих нейральні СК локалізуються в субвентрикулярній зоні неокортексу і зубчастій звивині гіпокампу мозку дорослих ссавців [44, 45]. Вони є попередниками як гліальних, так і нервових клітин. Введені у хвостову вену мишейреципієнтів попередньо мічені карбоцианіновими барвника ми нейральні СК були виявлені в місці пошкодження нерва. Вони диференціювалися в шванноцити, ендотеліоцити і гладкі міоци ти [46]. При трансплантації в сідничий нерв нейральних СК щурів було показано, що вони диференціюються в клітини, подібні до шванноцитів, тому що експресують маркери S100 і Р75 [47]. Аналогічні результати отримали інші автори [48 - 50]. В їхніх

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

371

дослідах морфометрично і за допомогою МРТ було продемонстровано поліпшення регенерації нерва. Трансплантація генетично модифікованих нейральних СК із гіперекспресією трофічних факторів (BGNF, GDNF) більш ефективна в плані стимулювання регенерації нерва, ніж пересадка звичайних клітин [51]. Клітини нюхового епітелію можуть розглядатися як перспективне джерело для пересадки в пошкоджені структури цент ральної і периферійної нервової системи [52]. При трансплантації нюхових СК в ушкоджений периферійний нерв спостерігали поліпшення регенерації [53], що було підтверджено як морфометрично [54 - 56], так і електрофізіологічно [57, 52]. Причому імуногістохімічно було доведено, що ці клітини проявляють властивості шванноцитів і мієлінізують регенеруючі аксони [55]. При пересадці нюхових СК, шванноцитів та їхньої суміші було встановлено, що в останньому випадку регенерація аксонів є найбільш ефективною [58]. Автори вважають, що це пов'язано зі стимулюючим впливом нюхових СК на шванноцити. При вив ченні реакції нейронів спинного мозку на перерізку нерва, показано, що застосування нюхових СК і, навіть, фрагментів нюхового епітелію в значній мірі запобігає загибелі нейронів [59, 60]. Доведена in vitro можливість диференціації епідермальних СК, які в ембріогенезі утворюються з нервового гребеня і представлені клітинами волосяних фолікулів і базального шару епідермісу, у клітини, подібні до шванноцитів [61]. В умовах трансплантації епідермальних СК із волосяних фолікулів в ушкоджений нерв вони перетворювалися на шванноцити і покращували результати регенерації нервового стовбура [62 - 65]. Причому поліпшення відновлення нерва спостерігалося, навіть, при пересадці цілих фрагментів волосяних фолікулів [66]. Стромальні клітини кісткового мозку в якості СК були описані О.Я. Фріденштейном із співробітниками в ніжній стромі кісткового мозку [67, 68]. Була продемонстрована їхня диферен ціація в шванноцити in vitro, що було досягнуто шляхом їхнього спільного культивування з нейронами спинномозкових вузлів [69] або при додаванні в культуральне середовище фактора росту глії [70]. Клітини набували веретеноподібної форми і експресували маркери шванноцитів [p75, S100], секретувати BDNF і NGF

372

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

[71-75], стимулювали ріст і мієлінізацію відростків нейронів спинномозкових вузлів [76]. Ряд авторів спостерігав диференціацію стромальних клітин кісткового мозку в нейролемоцити in vivo при трансплантації в ділянку травми нерва [77-83]. При цьому було показано їхній сприятливий вплив на відновлення периферійних нервів [84 93]. У дослідах на мавпах було продемонстровано повноцінну регенерацію нервових стовбурів при заміщенні їхніх травматичних дефектів алогенними трансплантатами, заповненими автологічними стромальними клітинами кісткового мозку [94, 95] і встановлено, що вони запобігають загибелі нейронів спинномозкових вузлів [96]. Показано, що стромальні клітини кісткового мозку покращують регенерацію нервових волокон завдяки виділенню BDNF [97]. Стромальні клітини кісткового мозку в експерименті стали використовуватися в якості наповнювачів при біоінженер ному конструюванні «штучних» нервів [98-101]. При цьому відновлення пошкоджених нервів було дещо нижче [102] або, навіть, вище [103], ніж при використанні автотрансплантатів нервів. За фенотиповими ознаками, експресією генів та пластичності до стромальних клітин кісткового мозку аналогічні СК жирової тканини [104]. СК жирової тканини виділяють після ліпосакції або хірургічного видалення жирових відкладень. Однак кількість СК у жировій тканині на 2-3 порядки вище, ніж кількість стромальних СК у кістковому мозку [105]. Цей факт робить їх привабливими для використання в клітинних технологіях, зокрема, для пересадки в ділянку травми нерва. Використовуючи суміш трофічних факторів, можна забезпечити спрямовану диференціацію СК жирової тканини щурів у шванноцити [106-109]. У культурі СК жирової тканини мієлінізували нейрити клітин лінії РС12 [110]. Було встановлено, що кращі результати відновлення нерва досягаються шляхом застосування СК жирової тканини з гіподерми або жирової капсули нирки, ніж за трансплантації СК з епідидімальної жирової тканини [111]. Автори пояснюють це різницею в секреції нейротрофних факторів. Було показано, що СК жирової тканини при пересадці в ушкоджений нерв щурів диференціюються в шванноцити і забезпечують мієлінізацію новоутворених нервових волокон [112-115]. Установлено, що СК

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

373

жирової тканини стимулюють регенерацію нервових волокон завдяки виділенню BDNF та експресії ламініну [116, 117]. При пересадці в ушкоджений лицевий нерв щурів СК пульпи зуба, які мають мезенхімне походження, його регенерація покращувалася [118]. Введення CD133+ мононуклеарів периферійної крові в силіконовий кондуїт, поміщений між центральним і периферійним відрізками сідничого нерва щура, значно поліпшило результати його регенерації, що було підтверджено електрофізіологічно і морфометрично. Установлено, що пересаджені клітини диференціювалися в шванноцити та експресували білок S100 [119]. Відносно недавно відкриті індуковані СК є перспективним джерелом використання в регенеративній медицині. На сьогоднішній день у літературі міститься небагато повідомлень про використання цих СК із метою стимуляції регенерації периферійних нервів. Дві групи дослідників використовували індуковані СК, які поміщали в кондуїти, що з’єднували центральний і периферійний відрізки пошкодженого сідничого нерва щурів [120,121]. Спостерігали пришвидшення росту аксонів і їхню більш швидку мієлінізацію. Очевидно, вивчення особливостей поведінки індукованих СК за умов трансплантації в нервові стовбури тільки починається. Таким чином, аналіз експериментальних робіт із розробки ефективних методів відновлення нервових стовбурів показує, що клітинні технології є перспективними і можуть забезпечити поліпшення результатів лікування травм нервів. Однак кількість робіт із застосуванням клітинних технологій стосовно периферійного нерва поки відносно невелика. Практично не використовуються трансплантації СК у пошкоджені периферійні нерви в клініці. Мабуть, це пов'язано з відсутністю віддалених результатів пересадки СК і настороженістю щодо можливої їхньої онкотрансформації або розгортання автоімунного процесу. • Матеріал опубліковано в статті Дєльцова О.І. Стовбурові клітини і регенерація периферійних нервів / О.І. Дєльцова, С.Б. Геращенко, Ю.Б. Чайковський // Клінічна хірургія. - 2013.№ 7.- С. 65-68.

374

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Література 1. Magnaghi V. Novel pharmacological approaches to Schwann cells as neuroprotective agents for peripheral nerve regeneration / V. Magnaghi, P. Procacci, A.M. Tata // Int. Rev. Nuerobiol. - 2009.Vol. 87. - P. 295-315. 2. Петрова Е.С. Применение стволовых клеток для стимуляции регенерации поврежденного нерва / Е.С. Петрова // Цитология. - 2012. - №7. - С. 525-540. 3. Terenghi G. Use of stem cells for improving nerve regeneration / G. Terenghi, M. Wiberg, P.J. Kingham // Int. Rev. Nuerobiol. 2009. - Vol. 87. - P. 393-403. 4. Walsh S. Practical considerations concerning the use of stem cells for peripheral nerve repair / S. Walsh, R. Midha // Neurosurg. Focus. - 2009. - Vol. 26. - P. 2-6. 5. Bernstein J.J. Viability, growth and maturation of fetal brain and spinal cord in the sciatic nerve of adult rat / J.J. Bernstein // J. Neurosci. Res. - 1983. - Vol. 10. - P. 343-350. 6. Richardson P.M. Transplantation of embryonic spinal and cerebral tissue to sciatic nerves adult rats / P.M .Richardson, V.W. K.Issa // Brain Res. - 1984. - Vol. 298. - P. 146-148. 7. Чумасов Е.И. Имплантация эмбриональных закладок нео кортекса и спинного мозга в поврежденный периферический нерв взрослой крысы / Е.И. Чумасов, Е.С. Петрова // Бюллетень экспери ментальной биологии и медицины. - 1990. - т.108, №8. - С. 198-201. 8. Чумасов Е.И. Цитодифференцировка нейральных элемен тов спинного мозга и неокортекса крыс в условиях имплантации в периферический нерв / Е.И. Чумасов, Е.С. Петрова // Цитология. - 1993. - T. 35, №1. - С. 59-64. 9. Петрова Е.С. Изучение влияния серотонина на гистогенез эмбрионального неокортекса крыс на модели эктопической ней ротрансплантации / Е.С. Петрова, В.А. Отеллин // Журн. эво люц. биохим. - 2007. - T. 43, № 6. - С. 494-498. 10. Петрова Е.С. Имплантация эмбриональной ткани мозга в регенерирующий нерв / Е.С. Петрова, Е.И. Чумасов, В.А. Отеллин // Арх. анат. - 1987. - T. 93, № 10. - С. 43-49. 11. Erb D.E. Reinnervation of adult rat gastrocnemius muscle by embryonic motoneurons transplanted into the axotomized tibial

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

375

nerve / D.E. Erb, R.J. Mora, R.P. Bunge // Exp. Neurol. -1993. Vol. 124. - P. 372-376. 12. Katsuki M. Reinnervation of denervated muscle by transplantation of fetal spinal cord to transected sciatic nerve in the rat / M. Katsuki, Y. Atsuta, T. Hirayama // Brain Res. - 1997.Vol. 771. - P. 31-36. 13. Цимбалюк В.І. Вивчення впливу трансплантації ембріональної нервової тканини на регенерацію ушкоджених периферичних нервів / В.І. Цимбалюк, М.М. Сулій, Б.М. Лузан // Трансплантологія. - 2000. - № 1. - С. 268-269. 14. Xiong G. Transplanted embryonic spinal tissue promotes severed sciatic nerve regeneration in rats / G. Xiong, N. Ozaki, Y. Sugiura // Arch. Histol. Cytol. - 2009. - Vol. 72. - P. 127-138. 15. Отеллин В.А. Строение длительно живущих трансплантатов эмбриональных закладок ЦНС крыс / В.А. Отеллин, Е.С. Петрова // Морфология. -1998. - T. 113, № 2. - С. 39-44. 16. Doering L.C. Hirano bodies and other cytoskeletal abnormalities develop in fetal rat CNS grafts isolated for long periods in peripheral nerve / L.C. Doering, A.J. Aguayo // Brain Res. - 1987. - Vol. 401. - P. 178-184. 17. Doering L.C. Transplantation of fetal CNS tissue into the peripheral nervous system: a model to study aberrant changes in the neuronal cytoskeleton / L.C. Doering // J. Neural. Transplant. Plast. - 1991. - Vol. 2. - P. 193-205. 18. Hadlock T. A polymer foam conduit seeded with Schwann cells promotes guided peripheral nerve regeneration / T. Hadlock, C. Sundback, D. Hunter // Tissue Eng. - 2000. - Vol. 6. - P. 119127. 19. Hood B. Transplantation of autologois Schwann cells for the repair of segmental peripheral nerve defects / B. Hood, H.B. Levene, A.D. Levi // Neurosurg. Focus. - 2009. - Vol. 26. - P. 1-5. 20. Kim D.H. Labeled Schwann cell transplants versus sural nerve grafts in nerve repair / D.H. Kim, S.E. Connolly, D.S. Kline // J. Neurosurg. - 1994. - Vol. 80. - P. 254-260. 21. Levi A.D. The functional characteristics of Schwann cells cultured from human peripheral nerve after transplantation into

376

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

a gap within the rat sciatic nerve / A.D. Levi, V. Guenard, P. J. Aebischer // Neurosci. - 1994. - Vol. 14. - P. 1309-1319. 22. Radtke C. Integration of engrafted Schwann cells into injured peripheral nerve: axonal association and nodal formation on regenerated axons / C. Radtke, Y. Akiyama, K.L. Lankford // Neurosci. Lett. - 2005. - Vol. 387. - P. 85-89. 23. Mosahebi A. Retroviral labeling of Schwann cells: In vitro characterisation and in vivo transplantation to improve peripheral nerve regeneration / A. Mosahebi, B. Woodward, M. Wiberg // Glia. -2001. - Vol. 34. - P. 8–17. 24. Tohill M. Green fluorescent protein is a stable morphological marker for Schwann cell transplants in bioengineered nerve conduits / M. Tohill, D.J .Mann, C. Mantovani // Tissue Eng. -2004. - Vol. 10. - P. 1359–1367. 25. Haastert K. Gene therapy in peripheral nerve reconstruction approaches / K. Haastert, C. Grothe // Curr. Gene. Ther. - 2007. Vol. 7. - P. 221-228. 26. Pattingill L.N. Schwann cells genetically modified to express neurotrophins promote spiral ganglion neuron survival in vitro / L.N. Pattingill, R.L. Minter, R.K. Shepherd // Neuroscience. 2008. - Vol. 152. - P. 821-828. 27. Haastert K. Differentially promoted peripheral nerve regeneration by grafted Schwann cells over-expressing different FGF-2 isoforms / K. Haastert, E. Lipokatic, M. Fischer / Neurobiol. Dis. - 2006. - Vol. 21. - P. 138-153. 28. Timmer M. Axonal regeneration across long gaps in silicone chambers filled with Schwann cells overexpressing high molecular weight FGF-2 / M. Timmer, S. Robben, F. Muller-Ostermeyer // Cell. Transplant. - 2003. - Vol. 12. - P. 265-277. 29. Li Q. Nerve conduit filled with GDNF gene-modified Schwann cells enhances regeneration of the peripheral nerve / Q. Li, P. Ping, H. Jiang // Microsurgery. - 2006. - Vol. 26. - P. 116121. 30. Mosahebi A. Retroviral labeling of Schwann cells: In vitro characterisation and in vivo transplantation to improve peripheral nerve regeneration / A. Mosahebi, B. Woodward, M. Wiberg // Glia. - 2001. - Vol. 34. - P. 8–17.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

377

31. Mosahebi A. Effect of allogeneic Schwann cell transplantation on peripheral nerve regeneration / A. Mosahebi, P. Fuller, M. Wiberg // Exp. Neurol. - 2002. - Vol. 173. - P. 213–223. 32. Evans M.J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos / M.J. Evans, M.H. Kaufman // Nature.1981.- V. 292.- P. 154-156. 33. Martin G.R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells / G.R. Martin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1981. Vol. 78. - P. 7634-7638. 34. Thomson J.A. Isolation of a primate embryonic stem cell line / J.A. Thomson, J. Kalishman, T.G. Golos // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1995. - Vol. 92. - P. 7844-7848. 35. Thomson J.A. Primate embryonic stem cells / J.A. Thomson, V.S. Marshall // Curr. Top. Dev. Biol. - 1998. - Vol. 38. - P. 133-165. 36. Pera M.F. Isolation and characterization of human ES cells / M.F. Pera, A. Laslett, S.M. Hawes // Embryonic stem cells. 2006: Oxford University Press, Oxford. - P. 238-260. 37. Ziegler L. Efficient generation of Schwann cells from human embryonic stem cell-derived neurospheres / L. Ziegler, S. Grigoryan, I.H. Yang. // Stem Сell Rev. Rep. - 2011. - Vol. 7. - P. 394-403. 38. Cui L. Transplantation of embryonic stem cells improves nerve repair and functional recovery after severe sciatic nerve axotomy in rats / L. Cui, J. Jiang, L. Wei // Stem cells. - 2009. Vol. 26. - P. 1356-1365. 39. Петренко А.Ю. Стволовые клетки. Свойства и перспективы клинического применения / А.Ю. Петренко, Ю.А. Хунов, Э.Н. Иванов // Луганск: Пресс-экспресс, 2011. - 368 с. 40. Cao F. Noninvasive de novo imaging of human embryonic stem cell-derived teratoma formation / F. Cao, Z. Li, A. Lee // Cancer Res. - 2009. - Vol. 69. - P. 2709-2713. 41. Abdulrazzak H. Biological characteristics of stem cells from foetal, cord blood and extraembryonic tissues / H. Abdulrazzak, D. Moschidou, G. Jones // J.R.Soc. Interface. - 2010. - Vol. 7. - P. 689-706. 42. Peng J. Human umbilican cord Wharton is jelly-derived mesenchymal stem cells differentiate into a Schwann cells phenotype

378

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

and promote neurite outgrowth in vitro / J. Peng, Y. Wang, L. Zhang // Brain Res. Bull. - 2011. - Vol. 84. - P. 235-243. 43. Pan H.-C. Enhanced regeneration in injured sciatic nerve by human amniotic mesenchymal stem cells / H.-C. Pan, D.-Y. Yang, Y.-T. Chiu // J. Clin. Neurosci. - 2006. - Vol. 13. - P. 570-575. 44. Altman J. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats / J. Altman, G.D. Das // J. Comp. Neurol. - 1965. - Vol. 124. - P. 319-335. 45. Altman J. Autoradiographic and histological studies of postnatal neurogenesis. I.A longitudinal investigation of the kinetics, migration and transformation of cells incorporating tritiated thymidine in neonate rats, with special reference to postnstsl neurogenesis in some brain region / J. Altman, G.D. Das // J. Comp. Neurol. - 1966. - Vol. 126. - P. 337-389. 46. Concurrent vasculogenesis and neurogenesis from adult neural stem cells / M. Li, H. Nishimura, H. Sekiguchi [et al.] // Circ. Res. - 2009. - Vol. 105. - P. 860-868. 47. Murakami T. Transplanted neuronal progenitor cells in a peripheral nerve gap promote nerve repair / T. Murakami, Y Fujimoto, Y. Yasunaga // Brain Res .- 2003. - Vol. 973 .- P. 1724. 48. Cheng L.N. Transplanted neural stem cells promote nerve regeneration in acute peripheral nerve traction injury: assessment using MRI / L.N. Cheng, X.H. Duan, X.M. Zhong // Am. J. Roentgenol. - 2011. - Vol. 196. - P. 1381-1387. 49. Shi W. The delayed repair of sciatic nerve defects with tissue-engineered nerve grafts in rats / W. Shi, J. Yao, X. Chen // Art. Cells Blood Substit. Biotech. - 2011. - Vol. 38. - P. 29-37. 50. Zhang H. Implantation of neural stem cells embedded in hyaluronic acid and collagen composite conduit promotes regeneration in a rabbit facial nerve injury model / H. Zhang, W.Y. Tei, K.S. Tsang // J. Translat. Med. - 2008. - Vol. 6. - P. 67-69. 51. Fu C.Y. Sciatic nerve regeneration by microporous nerve conduits seeded with glial cell line-derived neurotrophic factor or brainderived neurotrophic factor gene transfected neural stem cells / C.Y. Fu, L.G. Dai, I.M. Chiu // Artif. Organs. - 2011. - Vol. 35. P. 363-372.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

379

52. Radtke C. Transplantation of olfactory ensheathing cells enhances peripheral nerve regeneration after microsurgical nerve repair / C. Radtke, A.A. Aizer, S.K. Agulian // Brain Res. - 2009. - Vol. 1254. - P. 10-17. 53. Delaviz H. Transplantation of olfactory mucosa improve functional recovery and axonal regeneration following sciatic nerve repair in rats / H. Delaviz, M.T. Joghataie, M. Mehdizadeh // Iran Biomed. J. - 2008. - Vol. 12. - P. 197-202. 54. Cheng S.Y. Olfactory ensheathing cells enhance functional recovery of injured sciatic nerve / S.Y. Cheng, H.Z. Ruan, X.G. Wu // Exp. Neurol .- 2003. - Vol. 17. - P. 18-23. 55. Dombrowski M.A. Myelination and nodal formation of regenerated peripheral nerve fibers following transplantation of acutely prepared olfactory ensheathing cells / M.A. Dombrowski, M. Sassaki, K.L. Lankford // Brain Res. - 2006. - Vol. 1125. - P. 1-8. 56. Guerout N. Transplantation of olfactory ensheathing cells promotes axonal regeneration and functional racovery of peripheral nerve lesion in rats / N. Guerout, C. Duclos, L. Drouot // Muscle Nerve. - 2011. - Vol. 43. - P. 543-551. 57. Li B.S. PLGA conduit seeded with olfactory ensheathing cells for bridging sciatic nerve defect of rats / B.S. Li, S.S. Jiao, C. Xu // J. Biomed. Mater Res. - 2010. - Vol. 94. - P. 769-780. 58. You H. Olfactory ensheathing cells enhance Schwann cellmediated anatomical and functional repair after sciatic nerve injury in adult rats / H. You, L. Wei, Y. Liu // Exp. Neurol. - 2011.- Vol. 229. - P. 158-167. 59. Cheng S.Y. Olfactory ensheathing cells enhance functional recovery of injured sciatic nerve / S.Y. Cheng, H.Z. Ruan, X.G. Wu // Exp. Neurol. - 2003. - Vol. 17. - P. 18-21 60. Murrell W. Multipotent stem cells from adult olfactory mucosa / W. Murrell, F. Feron, A. Wetzing // Dev. Dynamics. 2005. - Vol. 233. - P. 496-515. 61. Sieber-Blum M. Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle / M. Sieber-Blum, M. Grim, Y.F. Hu // Dev. Dynamics. - 2004. - Vol. 231. - P. 258-269. 62. Amoh Y. Implanted hair follicle stem cells form Schwann cell that support repair of severed peripheral nerves / Y. Amoh, L.

380

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Li, R. Campillo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. - Vol. 102. P. 17734-17738. 63. Amoh Y. Multipatene nestin-expressing hair follicle stem cells / Y. Amoh, L. Li, K. Kalsuoka // J. Dermatology. - 2009. Vol. 36. - P. 1-9. 64. Walsh S. Supplementation of acellular nerve grafts with skin derived precursor cells promotes peripheral nerve regeneration / S. Walsh, J. Biernaskie, S.W. Kemp // Neuroscience. - 2009. Vol. 164. - P. 1097-1107. 65. Walsh S. Skin-derived precursor cells enhance peripheral nerve regeneration following chronic denervation / S. Walsh, T. Gordon, B.M. Addas // Exp. Neurology. - 2010. - Vol. 223. - P. 221-228. 66. Amoh Y. Direct transplantation of uncultured hair-follicle pluripotent stem (hfPS) cells promotes the recovery of peripheral nerve injury / Y. Amoh, Y. Hamada, R. Aki // J. Cell Biochem. 2010. - Vol. 110. - P. 272-277. 67. Friedenstein A.J. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells / A.J. Friedenstein, I.I. Piatetzky-Shapiro, K.V .Petrakova // J. Embryol. Exp. Morph. - 1966. - Vol. 16. - P. 581-390. 68. Friedenstein A.J. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers / A.J. Friedenstein, R.K. Chailakhyan, U.V. Gerasimov // Cell. Tissue. Kinet. - 1987. - Vol. 20. - P. 263-272. 69. Yang J. Dorsal root ganglion neurons induce transdifferentiation of mesenchymal stem cells along a Schwann cell lineage / J. Yang, Q. Lou, R. Huang // Neurosci. Lett. - 2008.- Vol. 445. - P. 246-251. 70. Brohlin M. Characterisation of human mesenchymal stem cells following differentiation into Schwann cell-like cells / M. Brohlin, D. Mahay, L.N. Novikov // Neurosci. Res. - 2009. - Vol. 64. - P. 41-49. 71. Caddick J. Phenotypic and functional characteristics of mesenchymal stem cells differentiated along a Schwann cell lineage / J. Caddick, P.J. Kingham, N.J. Gardiner // Glia. - 2006. - Vol. 54. - P. 840–849. 72. Crigler L. Human mesenchymal stem cell subpopulations express a variety of neuro-regulatory molecules and promote

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

381

neuronal cell survival and neuritogenesis / L. Crigler, R.C. Robey, A. Asawachaicharn // Exp. Neurol. - 2006. - Vol. 198. - P. 54–64. 73. Kashani I.R. Schwann-like cell differentiation from rat bone marrow stem cells / I.R. Kashani, Z. Golipoor, M. Akbari // Arch. Med. Sci. - 2011. - Vol. 7. - P. 45–52. 74. Mahay D. Growth factors in mesenchymal stem cells following glial cell differentiation / D. Mahay, G. Terenghi, S. Shawcross // Biotechnol. Appl. Biochem. - 2008. - Vol. 51. - P. 167–176. 75. Rat bone marrow stromal cells could be induced into Schwann cell precursor-like cells in vitro / Y. Xu, F. Xiong, L. Liu [et al.] // Neurosci. Lett. - 2011. - Vol. 25. - P. 229-233. 76. Mantovani C. Development of an in vitro co-culture model to investigate peripheral myelin formation / C. Mantovani, D. Mahay, S. Shawcross // Neurosci. Res. – 2009. - Vol. 70. - P. 309328. 77. Chen C.J. Transplantation of bone marrow stromal cells for peripheral nerve repair / C.J. Chen, Y.C. Ou, S.L. Liao // Exp. Neurol. - 2007. - Vol. 204. - P. 443-453. 78. Cuevas P. Peripheral nerve regeneration by bone marrow stromal cells / P. Cuevas, F. Carceller, M. Dujovny // Neurol. Res. 2002. - Vol. 24. - P. 634–638. 79. Dadon-Nachum M. Differentiated mesenchymal stem cells for sciatic nerve injury / M. Dadon-Nachum, O. Sadan, I. Srugo // Stem Cell Rev. Rep. - 2011. - Vol. 7. - P. 664-671. 80. Dezawa M. Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells / M. Dezawa, I. Takahashi, M. Esaki // Eur. J. Neurosci. - 2001. Vol. 14. - P. 1771-1776. 81. Jiang L. Differentiation of rat adipose tissue-derived stem cells into Schwann-like cells in vitro / L. Jiang, J.K. Zhu, X.L. Liu // Neuroreport. - 2008. - Vol. 19. - P. 1015-1019. 82. Keilhoff G. Transdifferentiation of mesenchymal stem cells into Schwann cell-like myelinating cells / G. Keilhoff, A. Goihl, K. Langnase // Eur. J. Cell Biology. - 2006. - Vol. 85. - P. 11-24. 83. Lin W. Adult rat bone marrow stromal cells differentiate into Schwann cell-like cells in vitro / W. Lin, X. Chen, X. Wang // In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. - 2008. - Vol. 44. - P. 31-40.

382

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

84. Choi B.-H. Transplantation of cultured bone marrow stromal cells to improve peripheral nerve regeneration / B.-H. Choi, S.-J. Zhu, B.-Y. Kim // Int. J. Oral. Maxillofac. Surg. - 2005. - Vol. 34.P. 537-542. 85. Ding F. Use of tissue engineered nerve grafts consisting of a chitosan/poly(lactic-co-glycolic acid)-based scaffold included with bone marrow mesenchymal cells for bridging 50-mm dog sciatic nerve gaps / F. Ding, J. Wu, Y. Yang // Tissue. Eng. - 2010. - Vol. 16. - P. 3779-3790. 86. Keilhoff G. Transdifferentiation of mesenchymal stem cells as alternative therapy in supporting nerve regeneration and myelination / G. Keilhoff, F. Stang, A. Goihl // Cell. Mol. Neurobiol. - 2006. - Vol. 26. - P. 1235-1252. 87. Lopes F.R.P. Bone marrow stromal cells and resorbable collagen guidance tubes enhance sciatic nerve regeneration in mice / F.R.P. Lopes, L.C. de Moura Campos, J.D. Correa // Exp. Neurol. - 2006. - Vol. 198. - P. 457-468. 88. Lopes F.R.P. Transplantation of bone-marrow derived cells into a nerve guide resulted in transdifferentiation into Schwann cells and effective regeneration of transected mouse sciatic nerve / F.R.P. Lopes, F. Frattini, S.A. Marques // Micron. - 2010. - Vol. 41. - P. 783-790. 89. Pereira Lopes F.R. Bone marrow stromal cells and resorbable collagen guidance tubes enhance sciatic nerve regeneration in mice / F.R. Pereira Lopes, L.C. de Moura Campos, J. D.Correa // Exp. Neurol. - 2006. - Vol. 198.-P. 457–468. 90. Shen J. In vivo MR imaging tracking of transplanted mesenchymal stem cells in a rabbit model of acute peripheral nerve traction injury / J. Shen, X.H. Duan, L.N. Cheng // J. Magn. Reson. Imaging. - 2010. - Vol. 32. - P. 1076-1085. 91. Shimizu S. Peripheral nerve regeneration by the in vitro differentiated-human bone marrow stromal cells with Schwann cell property / S. Shimizu, M. Kitada, H. Ishikawa // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2007. - Vol. 359. - P. 915-920. 92. Tohill M. Green fluorescent protein is a stable morphological marker for Schwann cell transplants in bioengineered nerve conduits / M. Tohill, D.J. Mann, C. Mantovani // Tissue Eng. - 2004. - Vol. 10. - P. 1359–1367.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

383

93. Wang X. Schwann-like mesenchymal stem cells within vein graft facilitate facial nerve regeneration and remyelination / X. Wang, E. Luo, Y. Li // Brain Res. - 2011. - Vol. 1383. - P. 7180. 94. Hu J. Repair of extended peripheral nerve lesions in rhesus monkeys using acellular allogenic nerve grafts implanted with autologous mesenchymal stem cells / J. Hu, Q.T. Zhu, X.L. Liu // Exp. Neurol. - 2007. - Vol. 204. - P. 658-666. 95. Wang D. Brindging small-gap peripheral nerve defects using acellular nerve allograft implanted with autologous bone marrow stromal cells in primates / D. Wang, X.-L. Liu, J.-K. Zhu // Brain Res. - 2008. - Vol. 1188. - P. 44-53. 96. Ribeiro-Resende V.T. Trophic activity derived from bone marrow mononuclear cells increases peripheral nerve regeneration by acting on birth neuronal and glial cell populations / V.T. RibeiroResende, P.M. Pimentel-Coelho, L.A. Mesentier-Louro // Neurosci. - 2009. - Vol. 159. - P. 540-549. 97. Takemura Y. Brain-derived neurotrophic factor from bone marrow-derived cells promotes post-injury repair of peripheral nerve / Y. Takemura, S. Imai, H. Kojima // PLоS One. - 2012. Vol. 7. - P. 11-18. 98. Ao Q. The regeneration of transected sciatic nerves of adult rats using chitosan nerve conduits seeded with bone marrow stromal cell-derived Schwann cells / Q. Ao, C.K. Fung, A.Y. Tsui // Biomaterials. -2011. - Vol. 32. - P. 787-796. 99. Kalbermatten D.F. Fibrin matrix for suspension of regenerative cells in an artificial nerve conduit / D.F. Kalbermatten, P.J. Kingham, D.J. Mahay // Plast. Reconstr. Aesthet. Surg. 2009. - Vol. 61. - P. 669–675. 100. Ladak A. Differentiation of mesenchymal stem cells to support peripheral nerve regeneration in a rat model / A. Ladak, J. Olson, E.E. Tredget // Exp. Neurology. - 2011. - Vol. 228. - P. 242- 252. 101. Yamakawa T. Nerve regeneration promoted in a tube with vascularity containing bone marrow-derived cells / T. Yamakawa, R. Kakinoki, R. Ikeguchi // Cell Transplant. - 2007. - Vol. 16. - P. 811–822.

384

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

102. Hou S.-Y. Tissue-engineered peripheral nerve grafting by differentiated bone marrow stromal cells / S.-Y. Hou, H.-Y. Zhang, D.-P. Quan // Neurosci. - 2006. - Vol. 140. - P. 101-110. 103. Yang Y. Repair of rat sciatic nerve gap by a silk fibroinbased scaffold added with bone marrow mesenchymal stem cells / Y. Yang, X. Yuan, F. Ding // Tissue Eng. - 2011. - Vol. 17-18. - P. 2231-2244. 104. Tholpady S.S. Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibit multipotential differentiation in vitro / S.S. Tholpady, A.J. Katz, R.C. Ogle // Anat. Rec. Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. 2003. - Vol. 272. - P. 398–402. 105. Banfi A. Bone marrow stromal damage after chemo/ radiotherapy: Occurrence, consequences and possibilities of treatment / A. Banfi, G. Bianchi, M. Galotto // Leuk. Lymphoma.2001. - Vol. 42. -P. 863–870. 106. Jiang L. Differentiation of rat adipose tissue-derived stem cells into Schwann-like cells in vitro / L. Jiang, J.K. Zhu, X.L. Liu // Neuroreport. - 2008. - Vol. 19. - P. 1015-1019. 107. Kingham P.J. Adipose-derived stem cells differentiate into a Schwann cell phenotype and promote neurite outgrowth in vitro / P.J. Kingham, D.F. Kalbermatten, D. Mahay // Exp. Neurology. 2007. - Vol. 207. - P. 267-274. 108. Mantovani C. Development of an in vitro co-culture model to investigate peripheral myelin formation / C. Mantovani, D. Mahay, S. Shawcross // Neurosci. Res. – 2009. - Vol. 70. - P. 309328. 109. Tse K.H. In vitro evaluation of polyester-based scaffolds seeded with adipose derived stem cells for peripheral nerve regeneration / K.H. Tse, M. Sun, C. Mantovani // J. Biomed. Mater. Res. - 2010. - Vol. 95. - P. 701-708. 110. Xu Y. Myelin-forming ability of Schwann cell-like cells induced from rat adipose-derived stem cells in vitro / Y. Xu, L. Liu, Y. Li // Brain Res. - 2008. - Vol. 6. - P. 1239-1255. 111. Kaewkhaw R. Anatomical site influences the differentiation of adipose-derived stem cells for Schwann-cell phenotype and function / R. Kaewkhaw, A.M. Scutt, J.W. Haycock // Glia. 2011. - Vol. 59. - P. 734-749.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

385

112. Di Summa P.G. Adipose-derived stem cells enhance peripheral nerve regeneration / P.G. Di Summa, P.J. Kingham, W.J. Raffoul // Plast. Reconstr. Aesthet. Surg. - 2010. - Vol. 63. P. 1544-1552. 113. Erba P. Regeneration potential and survival of transplanted undifferentiated adipose tissuederived stem cells in peripheral nerve conduits / P. Erba, C. Mantovani, D.F. Kalbermatten // J. Plast. Reconstr. Aesthet. Surg. - 2010. - Vol. 63. - P. 811-817. 114. Lin G. Cavernous nerve repair with allogenic adipose matrix and autologous adipose-derived stem cells / G. Lin, M. Albersen, A.M. Harraz // Urology. - 2011. - Vol. 77. - P. 1501-1509. 115. Sun F. Combined use of decellularized allogeneic artery conduits with autologous transdifferentiated adipose-derived stem cells for facial nerve regeneration in rats / F. Sun, K. Zhou, W.J. Mi // Biomaterials. - 2011. - Vol. 32. - P. 8118-8128. 116. Karlsson L. Roles for BDNF and laminin in peripheral nerve regeneration / L. Karlsson, C. Bondjers, C. Betsholtz // Development. Res. - 2009. - Vol. 12. - P. 2611–2621. 117. Lopatina T. Adipose-derived stem cells stimulate regeneration of peripheral nerves: BDNF secreted by these cells promotes nerve healing and axon growth de novo / T. Lopatina, N. Kalinina, M. Karagyaur // PLoS One. - 2011. - Vol. 6. - P. 178-199. 118. Sasaki R. Tubulation with dental pulp cells promotes facial nerve regeneration in rats / R. Sasaki, S. Aoki, M. Yamato // Tissue Eng. - 2008. - Vol. 14. - P. 1141-1147. 119. Kijima Y. Regeneration of peripheral nerve after transplantation of CD133+ cells derived from human peripheral blood / Y. Kijima, M. Ishikawa, T. Sunagawa // J. Neurosurg. 2009. - Vol. 110. - P. 758-767. 120. Uemura T. Transplantation of induced pluripotent stem cell-derived neurospheres for peripheral nerve repair / T. Uemura, K. Takamatsu, M. Ikeda // Biochem. Biophys. Res. - 2012. - Vol. 419. - P. 130-135. 121. Wang A. Induced pluripotent stem cells for neural tissue engineering / A. Wang, Z. Tang, I.-H. Park // Biomaterials. - 2011.Vol. 32. - P. 5023-5032.

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

386

Уперше в історії медицини двом повністю сліпим пацієнтам були успішно імплантовані стовбурові клітини сітківки ока, що дозволили повернути їм зір. Опубліковано 26.01.2012. http://www.hemafund.com/uk/News/hemafund_news.htm?_ offset%5B0%5D=40&type=hemafund_news Зі стовбурових клітин вирощують рогівку ока. Опубліковано 20.03.2012. Ученим з Салгренской Академії в Швеції (The Sahlgrenska Academy) вперше з успіхом вдалося культивувати зі стовбурових клітин людську рогівку. www.megapressa.ru, www.globalscience.ru Японці виростили штучне око зі стовбурових клітин. Опубліковано 03.06.2012. http://www.openlife.lviv.ua Учені створили лінзи зі стовбуровими клітинами, які повертають зір. Опубліковано 07.12.2012. http://novyny.ostriv.in.ua/publication/ code-5110AEF7F1515/list-936EFE032.

3.9. Органи чуття Орган зору має складну будову. Він включає очне яблуко та допоміжні частини (повіки, м'язи очного яблука і слізний апарат). В очному яблуці розрізняють зовнішню (білкову), середню (судинну) та внутрішню (нервову, сітківку) оболонки. Джерелом клітинних структур сітківки і зорового нерва є нервова трубка, рогівки і кришталика – ектодерма, власної речовини рогівки, склери, судинної оболонки і склистого тіла – мезенхіма. У дорослої людини в різних частинах ока виявлені кілька ніш СК, зокрема у рогівці, кон'юнктиві і сітківці [1]. Рогівка. Рогівка має 5 шарів: зовнішній (багатошаровий плоский незроговілий епітелій), передню пограничну пластинку (мембрану Боумена), власну речовину, задню пограничну пластинку (мембрану Десцемета) і задній епітелій (ендотелій) рогівки (додаток 19). У дорослому організмі відбувається постійне оновлення всіх його структур [2]. Епітелій рогівки у ссавців повністю оновлюється за 7-14 діб [3]. До цього часу вважали, що зовнішній (передній) епітелій рогівки є самодостатнім для самооновлення, маючи на увазі, що його СК знаходяться в базальному шарі. Останні дослідження показали, що СК, за рахунок яких відновлюється передній

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

387

епітелій рогівки, розташовуються в лімбальній зоні. Ця гіпотеза грунтується на тому, що клітини з цієї ділянки з маркером К3+(кератин) мають більшу здатність до проліферації, ніж у центральній частині рогівки [4-6]. Іншими поглядами на джерело СК для рогівки є твердження, що для відновлення епітелію рогівки СК мігрують з кон'юнктиви. Серед них ідентифікуються клітини на різних стадіях диференціації: корнеальні клітини-попередниці, проліферуючі, непроліферуючі та постмітотичні диференційовані клітини з маркерами К12+ і Muc5ac+ [7]. Але епітелій рогівки і кон'юнктиви мають різні клітинні лінії і різні стовбурові ніші [8]. Але більшість дослідників схиляється до думки, що нішею СК для переднього епітелію, які забезпечують постійну регенерацію рогівки, є рогівково-склеральне сполучення (кант рогівки, лімб) [9, 10]. Експерименти на мишах показали ключову роль ендогенних сигналів Нedgehog при тісній взаємодії з Рах6 у нормі і при регенерації епітелію рогівки [11]. Недостатність Нedgehog сигналізації є знакою хвороб рогівки, які не можуть бути усунені фармакологічним шляхом додавання лігандів. Самооновлення в рогівці контролює NGF (фактор росту нер вів – член родини нейротрофінів, найважливіший автокринний чи паракринний фактор підтримки СК у лімбальній ніші). Його рецептор TrkA є потенційним маркером клітин-попередниць у рогівці людини. До маркерів лімбальних СК також відносять p63, ABCG2, інтегрини [12 - 16]. Лімбально-стромальні взаємодії регулюються інтерлейкіном-6 [17]. На сьогодні відомо, що в ділянці лімба існують три стовбурові ніші, які посідають чітко визначену просторову локалізацію різних СК у лімбічній ділянці [18]. Автори зробили 2200 пошарових зрізів рогівково-лімбічної ділянки ока людини. Зрізи забарвили гематоксилін-еозином. Мікроскопічні зображення, сфотографовані при малому і великому збільшеннях, були оцифровані і виконана реконструкція з використанням інтерактивного 3D програмного забезпечення. Було визначено ніші в лімбальних епітеліальних криптах (із них 7 у верхній ділянці), 25 ніш – у лімбальних криптах (19 - у верхній ділянці) і 105 ніш у фокальних стромальних проекціях (12 – у верхній ділянці) і

388

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

поодинокі ніші – у носовій і скроневій ділянках лімба. Лімбальними криптами були названі "палісадні" структури, які складалися зі щільно упакованих шнурів клітин із кінцевими розширеннями, зануреними в строму лімба з орієнтацією паралельно чи перпендикулярно до палісаду, їхні маркери CK14+ i ABCG2+ [19, 20]. При порівнянні гістології, профілю експресії генів і фенотипу лімбальних епітеліальних клітин із різних ділянок лімба виявлено, що клітини не відрізняються за маркерами і в них ідентифікуються p63+, DeltaNp63+, ABCG2+, K19+, vimentin+, integrinβ1+, nestin–, K3–, E-кадгерин+ [21]. Цікавими є результати досліджень із кріоконсервації лімба льних СК. Виявлено, що трансплантація кріоконсервованих клітин була успішною і мала позитивні наслідки, що окреслює нові клінічні підходи до відновлення епітелію рогівки [22, 23]. Негативні впливи від навколишнього середовища, хімічне і термічне пошкодження та інші види дії на рогівку призводять до її помутніння, що потребує певних лікувальних заходів. Установлено, що в патогенезі уражень рогівки велику роль надають недостатності лімбальних СК. Дефіцит СК призводить до утворення стійких епітеліальних дефектів і проявів неоваскуляризації [24]. Це спонукало вчених до дослідження можливості трансплантації СК, як лікувальної стратегії за таких умов [25 - 28]. P. Rama et al. [29] вивчили лімбальні СК людини в культурі і встановили, що вони можуть бути джерелом клітин для трансплантації при лікуванні опіків рогівки або її пошкодженні через лікарські препарати і застосували їх на 112 пацієнтах. M. Notara et al. [30] показали, що лімбальні клітини з ділянки крипт у людини і свині мають потужніші колонієутворювальні властивості, ніж із центральної ділянки рогівки, і експресують маркери p63α i integrin 1β. Автори апробували свій метод вирощування СК у культурі і трансплантації на пошкоджену рогівку свині з позитивним результатом. G. Marchini et al. [31] пересадили 16 пацієнтам із хімічними опіками і помутнінням рогівки автологічні лімбальні СК, вирощені на фібринових дисках, із винятково позитивним результатом – відновленням зору. Задній епітелій рогівки (ендотелій передньої камери ока) також має здатність до самовідновлення. У райдужно-рогівковому

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

389

куті розташовується гребеняста зв'язка, яка складається зі сполучнотканинних трабекул, вкритих ендотелієм (трабекулярна, перекладкова сітка). Ця ділянка разом із стінкою венозної пазухи білкової оболонки забезпечує відплив рідини з передньої камери ока. Ендотелій рогівки має здатність до проліферації, але його клітини, переважно, знаходяться в G1-періоді клітинного циклу [32]. Ніша для ендотеліальних СК міститься саме в куті ока там, де не відбувається фільтрації водянистої вологи, звідси вони мігрують на задню поверхню рогівки і на трабекулярну сітку [33 - 35]. Водночас клітини з задньої поверхні центральної частини рогівки мають менший проліферативний потенціал, ніж із периферійної [36, 37]. У нормі ендотеліальні СК рогівки експресують нестин, лужну фосфатазу і теломеразу. Водночас при пошкодженні рогівки в клітинах перекладкової сітки відбувається їхня активація і визна чаються додаткові маркери – Осt3/4 i Wnt1 (СК) і Pax6 i Sox2 (диференціації) [38]. У перекладковій сітці виявлені й маркери мезенхімних СК: CD73, CD90 i CD105, геномні характеристики яких свідчать, що вони найближчі до мезенхімних СК інших органів [39]. Останнім часом широко вивчаються культуральні ознаки ендотелію рогівки, пересадка якого може бути альтернативним варіантом лікування захворювань ока [40, 41]. При культивуванні клітин, взятих у молодих осіб, виявлялися більш потужні можливості проліферації [42]. J. Du et al. [43] виділили з перекладкової сітки СК, ізолювали їх у клональних культурах і встановили, що ці клітини експресують ABCDG2, Noth1, MGP, CHO3L1 i TIMP3. Пpи пасеруванні 95 % клітин позитивні до CD73, CD90, CD166 i Bmi1. Ці клітини виявляють мультипотентні можливості до диференціації на різні типи з експресією нейронних (нейрофіламенти, βІІІ-тубулін, гліальний фібрилярний білок), керато-специфічних (кератан-сульфат, кератосан) і адипоцитарних (ар2 і лептин) маркерів. СК із перекладкової сітки легко диференціюються в перекладкові клітини з фагоцитарною функцією і експресією специфічних для них маркерів AQP1, CHI3L1 i TIMP3. Клітини, які отримали з перекладкової сітки і помістити в культуральне середовище з сироваткою крові, утворювали пер-

390

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

винні "вільно плаваючі" сфери. Ці сфери далі розвиваються у вторинні і містять клітини-попередниці, схильні до диференціації в ендотеліальні (маркери – MGF i CHI3L1, характерні для фенотипу перекладкових клітин рогівки), нервові (нестин, β-ІІІтубулін, гліальний кислий фібрилярний білок) і гладком'язові клітини (α-актин) [44 - 46]. Вирощені клітини плоскі і мають шестикутну форму. На думку S. Yamagami et al. [47], ін'єкція таких клітин у рогівку може стати потужним інструментом для відновлення ендотелію рогівки. Власна речовина (строма) рогівки містить кератоцити, відомі як фібробласти мезенхімного походження і характеризуються складним фенотипом. Учені вважали, що стромальні СК рогівки за експресією маркерів наближаються до кістковомозкових [48, 49]. Але в дослідженні N. Pinnamameti, J.L. Funderburh [50] акцентується увага на доказах їхньої будови як мезенхімних клітин нейронального походження. Автори вважають, що такими доказами є локалізація стромальних СК поблизу епітеліальних СК у передній частині лімбічної ділянки і їх знахідки в епіте ліальних лімбальних нішах, де вони функціонують для підтримки епітеліальних клітин-попередниць. Кератоцити секретують спеціалізований позаклітинний матрикс, необхідний для прозорості рогівки. У спокої ці клітини мають обмежену здатність до самовідновлення. Близько лімба виявлені стромальні клітини з маркером ABCG2, який присутній у багатьох СК. Автори сортували цю клітинну популяцію по забарвленню Hoechst 33342 і клонували, після чого визначили в клітинах Pax6 (продукт гену homeobox), який не експресується дорослими кератоцитами. Клоновані кератоцити культивували в середовищі з фактором росту фібробластів 2 і встановили, що вони втратили ABCG2, Pax6 і молекулярні маркери кератоцитів, серед яких кератосан, альдегід-дегідрогеназу 3АР і кератан сульфат [51]. При створенні відповідних умов клітини виявляють хондрогенні і нейрогенні потенції, тобто вони є мультипотентними. Незважаючи на проліферативні можливості, СК, переважно, стають фібробластами і втрачають здатність біосинтезу прозорого матриксу. Лише клітини з маркером Рах6 є потенційними для збереження популяції кератоцитів рогівки [52].

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

391

У рогівці людини виявлено 5,3 % СК із маркером CD133+ і 3,6 % - із маркером CD34+, якi характернi для соматичних СК різних тканин. CD34+ клітини є кістковомозкового походження і експресують маркери гематопоетичних СК [53]. Клітини CD133+ водночас експресують CD45 і CD14. До того ж у подальшому з використанням стандартного аналізу будови нормальної строми встановлено, що вони мали властивість утворювати колонії клітин моноцитарного ряду і, ймовірно, за даними N. Till et al. [54], їх можна диференціювати в вератоцити, які секретують люмікан. Люмікан і кератосан відіграють важливу роль у підтримці прозорості рогівки. Люмікан – білок, який кодується геном LUM, член родини малих, багатих на лейцин, білків (SRLP), до яких також належать декорин, біглікан, фібромодулін, кератокан, епіфікан, остеогліцин. В інших органах ламікан потрібен для фор мування сполучної тканини, оскільки укріплює колагенову сітку, скріплює колагенові волокна в пучки і підвищує їхню щільність [55]. При відновленні рогівки після пошкодження важливим моментом є ступінь ураження базальної мембрани. Порушення цілості базальної мембрани призводить до смерті клітин строми, змінам у системі металопротеїназ з активацією проліферації кератоцитів, що зумовлено сильновираженими епітеліо-стромальними взаємодіями. При цьому трансформуючий фактор росту β викликає перетворення кератоцитів у міофібробласти, які беруть участь у формуванні екстрацелюлярного матриксу. При відновленні базальної мембрани відбувається пригнічення дії трансформуючого фактору росту β, міофібробласти не утворюються, строма відновлюється [56]. Базальна мембрана відіграє роль у створенні унікального мікрооточення для СК/клітин-попередниць і вирізняється найбільшою гетерогенністю в лімбальній ділянці [57]. Склера. Із склери виділені мультипотентні СК із позитивни ми мезенхімними маркерами (Sca-1, CD90.2, CD44, CD105, CD73) і негативними для гематопоетичних клітин (CD45, CD11b, Fik1, CD34 i CD117) [58]. Були вивчені культури фібробластів із рогівки, лімба і склери і встановлено, що темпи росту клітин однакові. В усіх 3 культурах клітини експресують CD90+ і віментин+, тоді як CD34, CD45, CD141 і CD271 – ні. У склеральних клітинах

392

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

забарвлення на α-SMA позитивне, а в рогівці – негативне. Склеральні фібробласти характеризуються більш неправильною формою і проявляють високу здатність до утворення міофібробластів [59]. Ці дані можуть бути корисними для пояснення клітинних механізмів захворювань склери (склерит) і короткозорості. Кон'юнктива. Оскільки передній епітелій рогівки топографічно пов'язаний із кон'юнктивою, то виникає питання регенерації кон'юнктиви. Поширена думка про те, що стовбуровою нішею для епітелію кон'юнктиви є склепіння сполучної оболонки (fornix conjunctivae). Клітини склепіння експресують Sox2, Oct4, Nanog, Rex1, NES, ABCG2 [60], хоча в кроля, як зауважують L. Su et al. [61], СК можуть займати позицію між шкірною і слизовою частинами повіки і слугувати джерелом клітин, які мігрують у склепіння. Водночас, окрім СК у склепінні виявлені їхні кластери (К12+) [62] або поодинокі, СК розкидані в епітелії [63]. CК бульбарної кон'юнктиви експресують CK4+, CKf+, CK14+, CK15+,CK19+, але СК3–, а в епітелії рогівки СК3+. Молекулярні маркери клітин схожі з маркерами рогівки, у тому числі ABCG2, p63, NGF із рецепторами тирозинкінази (TrkA). СК бульбарної кон'юнктиви мають більше цитокератинове вираження і не експресують нестин, Е-кадгерин, інволукрин. У СК кон'юнктиви визначені також гени PLA(2)-IIA, lipocalin2, IGFBP3 [64]. Із біпотентних СК кон'юнктиви диференціюються епітеліоцити і мукоцити (келихоподібні eкзокриноцити) [65]. Мукоцити можуть також диференціюватися з лімбальних СК під впливом фактору росту нервів у культурі, при цьому кількiсть клітин із MUC-5AC+ збільшується [66]. Кон'юнктивальні епітеліальні клітини-попередниці при кріоконсервації протягом від 14 до 202 діб проходять до старіння понад 20 подвоєнь, зберігають свої властивості і при необхідності їх можна використати для трансплантації [67]. Строма кон'юнктиви ока людини (біопсія і вирощування в культурі) містить фібробластоподібні клітини з маркерами SH2+, SH3+, CD29+, CD44+, CD166+, CD13+, які можуть диференцію ватися в остео-, хондро-, адипо- і нейрогенні лінії. Ці клітини експресують Oct4, Nanog, Rex1 гени і деякі специфічні маркери (серцевий актин і кератин) [68].

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

393

Мейбомієві залози. Кон'юнктива вкриває склеру і вистеляє повіки, які ззовні мають шкірну поверхню. По краю повіки розрізняють перехідну зону між слизовою оболонкою кон'юнктиви і шкірною поверхнею повіки. Епітелій краю повіки утворюється з 2 різних популяцій епітеліоцитів зі специфічним, але перекриваючим розподілом клітин. Тут розташовуються отвори вивідних проток Мейбомієвих залоз і клітини-попередниці [69]. У цих перехідних зонах у мишей з боку слизової оболонки відсутні СК1, СК10 і філагрин, а з боку шкіри – СК4, СК6, СК13, і позитивні СК5+, інволукрин і коннексин 43 [70]. Мейбомієві залози (сальні залози хряща повіки) є альвеолярними розгалуженими сальними залозами [71]. Секреторні епітеліоцити мігрують від базальної мембрани до центра ацинуса зі швидкістю (0,62±0,11) мкм/добу. Час регенерації клітин у серед ньому складає 4,1 доби [72]. Ці клітини утворюються зі СК/клітин-попередниць, які локалізуються в краї повіки. В ацинусах старих осіб Кі67-ядер ідентифікується менше, ніж у молодих [73]. Cльозові залози. Cльозова залоза виділяє серозний секрет, який зволожує рогівку і кон'юнктиву очного яблука і попереджує їхню сухість, що може ускладнити перебіг багатьох захворювань цієї ділянки ока [74]. Із сльозових ацинусів дорослих щурів у нормі виділили незрілі маленькі клітини з маркерами СК – нестин, Mycaci1 ABC2, Pax6, CHX10, An p63 i Cokc2 у сполученні з SMA (α-актин гладких міоцитів), які можуть бути диференційовані на кілька ліній [75]. Після травми кількість нестин+ клітин збільшувалася від 2-ї до 3-ї доби після пошкодження і деякі з цих клітин експресували Кі67+ (маркер клітинної проліферації) та α-актин (маркер міоепітеліальних клітин). Зростав вміст ВМР7, який може ідентифікуватися в нестин+ клітинах [76]. Автори роблять висновок, що в сльозовій залозі є СК/клітини-попередниці, здатні відновлювати її тканини після травми, імовірно, за посередництва ВМР-7 шляху. S. You et al. [77] виявили в слізних залозах мишей мезенхімні СК, які відіграють визначену роль у відновленні їхніх тканин. Вважають, що під час регенерації мезенхімні СК активуються і регулюють епітеліо-мезенхімні взаємодії для процесів формування епітелію ацинарних проток і утворення ацинусів [78].

394

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Судинна оболонка очного яблука складається з трьох частин: власне судинної оболонки, війкового тіла і райдужки. У формуванні судинної оболонки в ембріогенезі і відновленні в дорослих беруть участь CD44+ СК [79]. Автори вважають, що ці клітини можна диференціювати на CD44+/CD39+ клітини (ендотеліоцити) та CD44+, які експресують αSMA (гладкі міоцити, перицити), які презентують різні клітини судинної стінки. У стінці судин між гладкими міоцитами і перицитами та ендотеліоцитами існують тісні взаємини, що підтримують судинний гомеостаз. Проліферацію і міграцію гладких міоцитів регулюють TSP1 (тромбоспондин1) і PDGF-BB [80]. Із строми райдужки дорослих мишей були виділені мультипотентні СК із нейральними маркерами Sox 10 i p75NTR (рецептори нейротрофіну), які в пробірці утворювали сфери. Ці клітини здатні диференціюватися в різні клони клітин, включаючи нейрони, гладкі міоцити і хрящі [81, 82]. Останнім часом до органів, в яких містяться СК, додалося і війкове тіло [83]. В умовах клоногенної культури виявили, що клітини нейросфер – похідних циліарного епітелію містили більш диференційовані клітини, у порівнянні з клітинами ней росфер – похідними переднього мозку, і вони спочатку експресували набір молекул генів Notch шляху, включаючи Notch 1 та Delta 1, HЕS-1 і HЕS-5, і частково втрачали свої властивості після пасажів культури [84]. Серед СК були виділені нейральні клітини-попередниці і клітини-попередниці з маркерами епітеліальних клітин і вислов лена думка щодо перепрограмування епітеліоподібних клітин на нейрони сітківки [85, 86]. У райдужці і циліарному тілі щурів містяться СК, які експресують Crx і Otx2 – гомеобоксні гени, пов'язані з розвитком фоторецепторів [87, 88]. Aктивація кано ніч ної Wnt сигналізації є достатньою для сприяння розвитку нейронів [89]. CК із війкового тіла мишей, щурів і людини в нейросферах мають приблизно однаковий діаметр. Кількість клітин у вирощеній нейросфері становить 1183 – у мишей, 5360 – у щурів і 685 – у людини. Ці клітини експресують нестин, Chx10, віментин, кислий гліальний фібрилярний білок і Pax6 [90].

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

395

Розроблені протоколи для культивування клітин циліарного епітелію мишей - спочатку в нейросферах, а пізніше в моношаровій культурі задля отримання нейронів для відновлення сітківки [91, 92]. Загалом, F.D Rodriguez, E.Vecino [93] вважають, що в очному яблуці людини існують лише дві стовбурові ніші – у лімбі і в циліарному тілі. С. Abburi, А. Anand [94] наводять дані доклінічних досліджень про те, що з циліарного епітелію можна отримати СК для використання в терапевтичній регенерації. CК райдужки, отримані з очей трупів, можуть за спеціальних умов створювати нейросфери і експресувати гени СК/клітин-попередниць, що в подальшому може стати практичним джерелом донорських клітин для лікування дегенеративних захворювань сітківки [95]. Сітківка (додаток 20). Значний прогрес у регенеративній медицині в останні роки досягнутий у вивченні можливості вико ристання СК в офтальмології, а саме в лікуванні захворювань сітківки [96, 97]. Історія виявлення і дослідження дорослих СК у сітківці почалася з 2000 року. Перші результати отримані з морфології СК сітківки нижчих тварин і узагальнені в праці M. Loker et al. [98]. Про регенерацію сітківки інформація менша, ніж рогівки, і являє серйозну проблему [99]. Популяції СК сітківки включають ембріональні і дорослі нейральні і кістковомозкові клітини, до вирішення ролі яких виникає багато наукових і етичних питань [100]. На сьогодні розглядаються два кандидати на СК сітківки – клітини пігментного епітелію і променеві (радіальні) гліоцити (клітини Мюллера), яким присвячені численні дослідження [101]. У дорослої миші СК сітківки в незначній кількості локалізуються у війковій частині сітківки [102 - 104]. Раніше повідомлялося, що епітелій війчастого тіла містить невелику популяцію клітин, які утворюють клоногенні пігментовані сфери в культурі з маркерами нестин і β-ІІІ-тубулін [105]. У свині, в якої існує велика схожість з оком людини, із сітківки були виділені і вирощені первинні і вторинні нейросфери, клітини яких експресують маркери нейронів і глії [106]. У курей ген-спрямоване перепрограмування пігментних клітин призводить до ефективної регенерації клітин з ознаками нейронів [107]. У людини, мишей

396

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

і щурів серед клітин війкової частини сітківки виявили клітинипопередниці, які можуть утворювати нейросфери в культурі і на кінець першого тижня експресують нестин, СНХ-10, віментин, кислий фібриллярний білок і Рах6 [108 - 109]. Ці клітини також експресували маркери СК, такi як Осt4(POU5F1), Nanog, Prox1, Mycaci1 i Pax6, що свідчить про можливість трансдиференціації пігментоцитів на нейронні лінії сітківки [110 - 112]. Перепрограмування пігментоцитів у нейрони в природних умовах та in vitro може ініціювати Sox2 [113]. Детально поводження пігментоцитів сітківки в культурі вив чали С. Aruta et al. [114]. Автори показали, що в культурі пігментоцити сітківки не виявляють характеристик, типових для функціонуючого пігментного епітелію – наявність пігментних гранул і експресії специфічних маркерів. Тому були створені умови для вирощування і диференціації СК у пігментоцити в нейросферах. СК сітківки мишей були очищені і вирощені як пігментні нейросфери. Їх помістили на матрикс, створили спе ціальні умови культивування і через 7-15 діб клітини виявили здатність до фагоцитозу. До 7-ї доби в клітинах спостерігали різні стадії меланогенезу, а на 15-у добу пігментоцити містили зрілі меланосоми. Пошкодження пігментного епітелію сітківки викликає дегенерацію фоторецепторів і втрату зору. Водночас у відповідь на пошкодження у війковій частині сітківки в мишей збільшується кількість незрілих нейронів сітківки/клітин-попередниць [115]. Із лікувальною метою R.C. Sequeira [116] виконав трансплантацію автологічних клітин пігментного епітелію при віковій макулярній дегенерації сітківки і отримав позитивний ефект. Але незважаючи на можливості цієї техніки, триває пошук клітин для лікування сітківки. R.C. Froen et al. [117] ізолювали пігментоцити при іридектомії і виростили з них сфери. У клітинах сфер зберігаються фенотипoві ознаки пігментоцитів дорослої людини. Після індукованої диференціації похідні цих клітин показали часткові ознаки нейронів і незрілих гліоцитів із маркерами βІІІ-тубулін, Мар-2 і Rodopsin. Для стимуляції перетворення пігментоцитів сітківки в нейрони S. Khera et al. [118] використали ретиноєву кислоту, епідермальний фактор росту,

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

397

основний фактор росту фібробластів і фактор склистого тіла від померлої людини і встановили, що вони не поступаються своїми властивостями індукторів трансдиференціації. За результатами останніх досліджень I. Decimo et al. [119], показано, що при створенні відповідних умов можна виростити первинні сфери з пігментних клітин людини і вторинні – мультипотентні зі схильністю до самовідновлення, які здатні перетворитися на палички, біполярні нейрони і променеві гліоцити. Як джерело СК для розвитку нейронів сітківки, можна використати також пігментоцити заднього епітелію райдужки [120]. У мишей виокремили клітини з рецепторами нестин/низької спорідненості нейротрофінів р75(р75(NTR). У культурі ці клітини виявили незначну кількість або відсутність меланіну, але були нестин+, які здатні диференціюватися в нейрони сітківки. Відомо, що нестин виявляється тільки в ділянках регенерації в клітинах-попередницях і є маркером мультипотентних клітин [121]. Не менш переконливими є докази потенційних можливостей променевих гліоцитів (клітин Мюллера) до диференціації на нейрони сітківки (рис. 26). Багато авторів вважають, що променеві гліоцити виконують функції мультипотентних СК сітківки [122 - 128]. Променеві гліо цити, які мають регенераційний потенціал і експресують маркери СК, локалізуються в епітелії крайової зони війчастого тіла [129, 130]. Після пошкодження променеві гліоцити активу ють ся і переміщуються від гангліонарного до внутрішнього і зовнішнього ядерного шарів. Гліоцити набувають ознак клітинпопередниць нейронів – вони втрачають кислий фібриллярний білок і експресують Рах6 і olig2 [131]. Стовбуровий потенціал сітківки, імовірно, також регулює сигнальний шлях Sonic hedgehog, забезпeчує процес поширення клітин-попередниць і сприяє регенеpації сітківки [132, 133]. S.G. Gianelli et al. [134] виростили палички з променевих гліоцитів людини і мишей, трансплантували мишам з імунодефіцитом і палички вижили. Eкспериментально виконані спроби трансплантації клітин сітківки позитивні, але застосування пересадки клітин-попередниць сітківки ще остаточно не розроблене в зв'язку зі складністю компонентів багатошарової архітектури сітківки [135, 136].

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

398

Фоторецептори Зовнішній ядерний шар

↓REST (?) ↑MASH1 ↑Lin28 ↓Let7

Зовнішній сітчастий шар

Chx10+ Rx+ Pax6+ ABCG2+ ↑Hes1 ↑Lef1 ↓p27KIP1

Внутрішній ядерний шар

Notch/Wnt/ FGF Клітини Мюллера (СК)

Клітинипопередниці

Рис. 26. Потенційні можливості диференціації променевих гліоцитів

Рис. 25. Потенційні можливості диференціації променевих гліоцитів (клітин Мюллера) на фоторецептори сітківки. (клітин Мюллера) на фоторецептори сітківки.

Таким чином, як у нижчих, так і у вищих тварин, для регенерації сітківки існує двісітківки, стовбуровіімовірно, ніші – у пігментному епіСтовбуровий потенціал також регулює сигнальний Sonic hedgehog і забезпeчує процес поширення клітинтелії шлях і в променевих гліоцитах сітківки, за рахунок активності попередниць і сприяє досягти регенеpації сітківки [132,сітківки 133]. S.G.після Gianelli et al. [134] яких можна відновлення її травми чи виростили палички з променевих гліоцитів людини і будь-якого пошкодження при захворюваннях [137 - 139].мишей, трансплантували мишам з імунодефіцитом і палички вижили. Суперечливими є результати порівняння вирощених у кульEкспериментально виконані спроби трансплантації клітин сітківки позитивні, турі пігментоцитів непігментованих клітин Установале застосування пересадкиі клітин-попередниць сітківкисітківки. ще остаточно не лено,вщо ці клітини експресують маркери нейральнихархітектури мультипо розроблене зв'язку зі складністю компонентів багатошарової тентних попередників, у тому числі Sox2, Pax6, CHX1 i Notch, сітківки [135, 136]. але нестин+ нейронів булитварин, лише променеві гліоТаким чином,і зякмаркерами у нижчих, так і у вищих для регенерації сітківки існує дві стовбурові ніші – у пігментному епітелії і в променевих гліоцитах сітківки, за рахунок активності яких можна досягти відновлення

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

399

цити. Тобто клітини-попередниці променевих гліоцитів можуть диференціюватися в нейрони [140]. Виявлено, що трансплантація ембріональних СК може відно вити деякі зорові функції [141], тому триває розробка методів трансплантації ембріональних СК сітківки на експериментальних моделях, але як і при їхньому застосуванні в інших органах, існують етичні проблеми і можливість розвитку пухлин [142]. Диференціація ембріональних СК мишей у культурі в пігменто цити і фоторецептори триває 28 діб, а людини – 120 і 150 діб відповідно [143]. Кришталик є прозорою, безсудинною структурою ока, яка оточена капсулою, і забезпечує функцію світлозаломлення і фокусування світла на сітківку. Під капсулою локалізується одношаровий плоский епітелій. У напрямку екватора епітеліоцити стають кубічними або цилиндричними і утворюють росткову (гермінативну) зону кришталика, від якої нові клітини мігрують на передню і задню поверхню кришталика. Регенерація кришталика має місце у хребетних, завдяки процесам клітинної дедиференціації та трансдиференціації [144]. Вивчення регенерації кришталика починалися від експериментів на тритонах. Але незважаючи на досягнутий прогрес у вивченні цього питання, на сьогодні є багато маловивчених аспектів. Було встановлено, що після видалення кришталика відновлення відбувається за рахунок пігментних епітеліоцитів дорсальної частини райдужки під впливом FGF2 i FGF4, тоді як вентральна не бере участі в цьому процесі [145, 146]. Головним регулятором регенерації кришталика визначено Рах6, Prox1 i Six3 [147]. На думку T. Hayasi et al. [148], регенерація кришталика має два етапи: І - FGF2-залежна проліферація пігментного епітелію райдужки і активація ранніх генів (Pax6, Sox2, Maf1B) по всьому периметру райдужки і ІІ – активація канонічного Wnt шляху (включаючи Wnt2b i Frizzeld4), що призводить до локальної експресії кінцевих (пізніх) генів (Prox1, Sox1, β-crystallin). Експресія Рах6 збігається з процесом проліферації і подальшої диференціації волокон кришталика [149]. У гермінативній зоні серед епітеліоцитів містяться СК [150, 151]. Після виділення з епітелію на екваторі кришталика ви-

400

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

явили клітини, які експресують ABCG2 (ATP-binding cassette transporter G2), p75 NTR (p75 – neutrophin receptor), нестин, Bcl2 (B-cell lymphoma) невелику кількість поверхневого антигену (Sca1 mRNA), що дозволяє припустити наявність серед них СК [152]. Описані спроби виділення клітин із росткової зони кришталика осіб із віковою катарактою, які мали маркери плюрипотентності Oct4, Sox2, KLZ4. На наступному етапі провели три послідовні індукційні процедури і індуковані плюрипотентні СК диференціювали на велику кількість клітин-попередниць кришталика з факторами Noggin, BMP i FGF-2. Ці клітини експресували маркери, специфічні для кришталика – Pax6, Sox2, Six3, CRGAA, BESP1 i MIP. Sox2 маркує дорослі СК в багатьох епітеліальних органах, у тому числі й кришталику [153]. При цьому в індукованих СК кришталика зменшилась експресія маркерів епітеліо-мезенхімного переходу [154, 155]. Для росту клітин-попередниць кришталика та їхньої диференціації вирішальне значення має трансдукційний сигнал Notch, недостатність чи надлишок якого призводить до дисгенії кришталика в зв'язку з втратою функції і схильністю до постнатальної дегенерації [156, 157]. Диференціація волокон кришталика відбувається під впливом рецептора1 фактора росту фібробластів (Egfr1) [158]. Важливу роль також відіграють фактори теплового шоку (HSF), а недостатність HSF-4b призводить до порушення їхнього дозрівання і розвитку катаракти [159]. Важливим є насичення кришталикових волокон специфічними білками - кристалінами. Регенерація кришталика починається з периферії капсули до центру протягом 1-2 тижнів після його видалення. Протеомний аналіз у кролів показав, що експресія кристаліна подібна до умов без оперативного втручання [160]. Диференціація волокон кришталика повторює їхній ембріональний розвиток із проліферацією епітеліоцитів по периметру капсули, видовженням задніх епітеліоцитів і диференціацією у волокна кришталика. Відновлений кришталик містить білки і транскрипційні фактори, подібні до таких у нормальному кришталику [161, 162]. Із віком під впливом різних негативних чинників білки піддаються окисленню, дезамінуванню, глікозуванню, метилюванню, відбувається агрегація кристалінів, волокна

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

401

розгалужуються, через що порушується проходження світла і формування зображення [163, 164, 165]. Рання диференціація первинних волокон кришталика регулюється балансом ВМР і FGF- сигналів. Завдяки перехресним взаємодіям між ВМР і FGF сигналами, ВМР-2,4 і 7 можуть індукувати експресію маркерів диференціації кришталикового волокна [166]. Але для повної диференціації окрім FGF сигналів потрібна експресія нової секреторної молекули Equarin, яка спостерігається винятково в районі екватора [167, 168]. Підтримання цілісності кришталикових волокон забезпечують позаклітинні протеїнази, які опосередковують клітинні взаємодії і клітинну сигналізацію за допомогою модуляції адгезії і розщеплення білків клітинної поверхні і молекул позаклітинного матриксу. Для цього в нативних непошкоджених кришталиках експресуються ADAM (desintegrin + металопротеїнази) i ADAMATS (desintegrin + металопротеїнази + тромбосподин-подібні мотиви) - позаклітинні протеїнази [169]. Таким чином, більшість дослідників вважає, що СК кришталика локалізуються в ніші на його екваторі, хоча S.G. Remington, R.A. Meyer [170] висловили гіпотезу, що СК кришталика містяться в епітелії війкового тіла. • Матеріали опубліковані в статті Чайковський Ю.Б. Стовбурові клітини органа зору та їх участь у регенерації тканин очного яблука / Ю.Б. Чайковський, С.Б. Геращенко, О.І.Дєльцова // Офтальмологический журнал. - 2013. - №3. - С.83-91. Література 1. Progenitors for the corneal endothelium and trabecular meshwork: a potential source for personalized stem cell therapy in corneal endothelial diseases and glaucoma / W.Y. Yu, C. Sheridan, I. Grierson [et al.] // J. Biomed. Biotechnol. – 2011. – 2011:412743. 2. Stem cells of the adult cornea: from cytometric markers to therapeutic applications / L. Takacs, E. Toth, A. Berta [et al] // Cytometry A. – 2009. – Vol. 75(1). – P. 54-66. 3. Oligopotent stem cells are distributed throughout the mammalian ocular surface / F. Maio, A. Rochat, M. Nicolas [et al.] // Nature. – 2008. – Vol. 456(7219). – P. 250-254.

402

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

4. Lavker R.M. Corneal epithelial stem cells at the limbus: looking at some old problems from a new angle / R.M. Lavker, S.C. Tseng, T.T. Sun // Exp. Eye Res. – 2004. – Vol. 78(3). – P. 433446. 5. Sun T.T. Corneal epithelial stem cells: post, present and future / T.T. Sun, R.M. Lavker // J. Invest. Dеrmatol. Symp. Proc.– 2004. – Vol. 9(3). – P. 202-207. 6. Sun T.T. Location of corneal epithelial stem cells / T.T. Sun, S.C. Tseng, R.M. Lavker // Nature. – 2010. – Vol. 463(7284). – P. E10-11. 7. Corneal Goblet Cells and Their Niche: Implacations for Corneal Stem Cell Deficiency / A. Pajoohesh-Ganji, S. Pal-Ghosh, G. Tadvalkar [et al.] // Stem Cells. – 2012. Jul.2012. DOI: 10, 1002 (stem) 0,1176. 8. Epithelial stem cells of the eye surface / R.P. Revoltella, S. Papini, A. Rosellini [et al.] // Cell Prolif. – 2007. – Vol. 40(4). – P. 445-461. 9. Stem cell activity in the developing human cornea / S.B. Davies, J. Chui, M.C. Maligan [et al.] // Stem Cells. – 2009. – Vol. 27(11). – P. 2781-2792. 10. In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy / M. Notara, A. Alatza, J. Gilfillan [et al.] // Exp. Eye Res. – 2010. – Vol. 90(2). – P. 188-195. 11. Interaction between hedgehog signalling and PAX6 dosage mediators maintenance and regeneration of the corneal epithelium / R. Kucerova, N. Dora, R.L. Mort [et al.] // Mol. Vis. – 2012. – Vol. 18. – P. 139-150. 12. Scholtzer-Schrehardt U. Identification and characterization of limbal stem cells / U. Scholtzer-Schrehardt, F.E. Kruse // Exp. Eye Res. – 2005. – Vol. 81(3). – P. 247-264. 13. Ahmad S. Corneal epithelial stem cells: characterization, culture and transplantation / S. Ahmad, F. Figueiredo, M. Lako // Regen. Med. – 2006. – Vol. 1(1). – P. 29-44. 14. Characterization of the limbal epithelial stem cell niche: novel targeted biopsy of limbal epithelial stem cells / A.J. Shortt, G.A. Secker, P.M. Munro [et al.] // Stem Cells. – 2007. – Vol. 25(6). – P. 1402-1409.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

403

15. Nerve growth factor and its receptor TrkA serve as potential markers for human corneal epithelial progenitor cells / H. Qi, D.Q. Li, H.D. Shine [et al.] // Exp. Eye Res. – 2008. – Vol. 86(1). – P. 34-40. 16. Pang K. Identification, purification and culture of limbal epithelial stem cells / K. Pang, X. Wu // Cheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Xhi. – 2009. – Vol. 26(2). – P. 452-456. 17. IL6 and the human limbal stem cell niche: a mediator of epithelial-stromal interaction / M. Notara, A.J. Shortt, G. Galatowicz [et al.] // Stem Cell Res. – 2010. – Vol. 5(3). – P. 188-200. 18. Interactive 3D computer model of the human corneolimbal region: crypts, projections and stem cells / R.K. Molvaer, A. Andreasen, S. Heegard [et al.] // Acta Ophthalmol. – 2012. Режим доступу до журналу : www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22682073. 19. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche / H.S. Dua, V.A. Shanmuganathan, A.O. Powell-Richards [et al.] // Br. J. Ophthalmol. – 2005. – Vol. 89(5). – P. 529-532. 20. Comparative transcriptional profiling of the limbal epithelial crypt demonstrates its putative stem cell niche characteristics / B.B. Kulkami, P.J. Tighe, I. Mohammed [et al.] // BMC Genomics.– 2010. – Vol. 11. – P. 526. 21. Comparison of the histology, gene expression profile, and phenotype of cultured human limbal epithelial cells from different limbal regions / T.P. Uthheim, Raeder S., O.K. Ostald [et al.] // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2009. – Vol. 50(11). – P. 5165-5172. 22. Reconstruction of corneal epihelium with cryopreserved corneal limbal stem cells in a goat model / S. Mi, X. Yang, Q. Zhao [et al.] // Mol. Reprod. Dev. – 2008. – Vol. 75(11). – P. 1607-1616. 23. Reconstruction of corneal epithelium with cryopreserved corneal limbal stem in a rabbit model / L. Qu, X. Yang, X. Wang [et al.] // Vet. J. – 2009. – Vol. 179(3). – P. 392-400. 24. Echevarria T.J. Tissue-regenerating, vision-restoring corneal epithelial stem cells // T.J. Echevarria, N. Di Girilamo // Stem Cell Rev. – 2011. – Vol. 7(2). – P. 256-268. 25. Notara M. Biological principals and clinical potentials of limbal epithelial stem cells / M. Notara, J.T. Daniels // Cell Tissue Res. – 2008. – Vol. 331(1). – P. 135-143.

404

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

26. Evaluation of molecular markers in corneal regeneration by means of autologous cultures of limbal cells and keratoplasty / R.A. Colabelli Gisoldi, A. Pocobelli, C.M. Villani [et al.] // Cornea. – 2010. – Vol. 29(7). – P. 715-722. 27. O'Callaghan A.R. Concise review: limbal epithelial stem cell therapy: contoversies and challenges / A.R. O'Callaghan, J.T. Daniels // Stem Cells. – 2011. – Vol. 29(12). – P. 1923-1932. 28. Shortt A.J. Corneal stem cells in the eye clinic / A.J. Shortt, S.J. Tuft, J.T. Daniels // Br. Med. Bull. – P. 147-155. 29. Limbalstem-cell therapy and long-term corneal regeneration / P. Rama, S. Matuska, G. Paganoni [et al.] // N. Engl. J. Med. – 2010. – Vol. 363(2). – P. 209-225. 30. Notara M. The porcine limbal epithelial stem cell niche as a new model for the study of translanted tissue-engineering human limbal epithelial cells / M. Notara, S. Schrader, J.T. Daniels // Tissue Eng. Part A. – 2011. – Vol. 17(5-6). – P. 741-750. 31. Long-term effectiveness of autologous cultured limbalstem cell grafts in patients with limbalstem cell deficiency due to chemical burns / G. Marchini, E. Pedrotti, M. Pedrotti [et al.] // Clin. Experim. Оphthalmol. – 2012. – Vol. 40(3). – P. 255-267. 32. Joyce N.S. Proliferative capacity of the corneal endothelium / N.S. Joyce // Prog. Retin. Eye Res. – 2003. – Vol. 22(3). – P. 359-389. 33. Evidence suggesting the existence of stem cells for the human corneal endothelium / D.R. Whitehart, C.H. Parikh, A.V. Vaughn [et al.] // Mol. Vis. – 2005. – Vol. 11. – P. 816-824. 34. Stem cells in the trabecular meshwork: present and future promises / M.J. Kelly, A.Y. Rose, K.E. Keller [et al.] // Exp. Eye Res. – 2009. – Vol. 88(4). – P. 747-751. 35. Progenitors for the corneal endothelium and trabecular meshwork: a potential source for personalized stem cell therapy in glaucoma / W.Y. Yu, C. Sheridan, I. Griersson [et al.] // J. Biomed. Biotechnol. – 2011:2011:412743. Режим доступу до журналу: www. ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22187525. 36. Paull A.C. Expression of the p53 family of proteins in central and piripheral human corneal endothelial cells / A.C. Paull, D.R. Whikehart // Mol. Vis. – 2005. – Vol. 11. – P. 328-334.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

405

37. Isolation and distribution of rabbit keratocyte precursors / T. Mimura, S. Amano, S. Yokoo [et al.] // Mol. Vis. – 2008. – Vol. 14. – P. 197-203. 38. Stem cells markers in the human posterior limbus and corneal endothelium of unwounded and wounded corneas / S.L. McGowen, H.F. Edelhauser, R.R. Pfister [et al.] // Mol. Vis. – 2007. – Vol. 13. – P. 1984-2000. 39. Identification and characterization of mesenchymal stem cells derived from the trabecular meshwork of the human eye / C.Y. Tay, P. Sathiyanathan, S.W. Chu [et al.] // Stem Cells Dev. – 2012. – Vol. 21(9). – P. 1381-1390. 40. Engelman K. Prospects for endothelial transplantation / K. Engelman, J. Bernarz, M. Valtink // Exp. Eye Res. – 2004. – Vol. 78(3). – P. 573-578. 41. Pan F. Proliferative capacity of the corneal endothelium / F. Pan, Y.F. Yao // Prog. Retin. Eye Res. – 2011. – Vol. 22(3). – P. 359-389. 42. Zhu C. Proliferative response of corneal endothelial cells from young and older donors / C. Zhu, N.C. Joyce // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2004. - Vol. 45(6). – P. 1743-1751. 43. Multipotent stem cells from trabecular meshwork become phagocytic TM cells / Y. Du, D.S. Roh, M.M. Mann [et al.] // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2012. – Vol. 53(3). – P. 1566-1575. 44. Human corneal endothelial cell precursors isolated by sphere-forming assay / S. Yokoo, S. Yamagami, Y. Yanagi [et al.] // Invest. Ophthalmol. – 2005. – Vol. 46(5). – P. 1621-1631. 45. Corneal stromal and endothelial cell precursors / S. Amano, S. Yamagami, T. Mimura [et al.] // Cornea. – 2006. – Vol. 25 (Suppl.1). – P. 573-577. 46. Characterization of free-floating spheres from human trabecular meshwork (HTM) cell culture in vivo / P. Gonzales, D.L. Epstein,C.Luna[etal.]//Exp.EyeRes.–2006.–Vol.82(6).–P.959-967. 47. Isolation of human corneal endothelial cell precursors and construction of cell sheets by precursors / S. Yamagami, T. Mimura, S. Yokoo [et al.] // Cornea. – 2006. – Vol. 25 (Suppl. 1). – P. S90-92. 48. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye / N. Polisetti, A. Fatima, S.L. Madhira [et al.] // Mol. Vis. – 2008. – Vol. 14. – P. 431-442.

406

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

49. Mesenchymal Stem Cells in the Human Corneal Limbal Stroma / M.J. Branch, K. Hashmani, P. Dhillon [et al.] // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2012. Режим доступу до журналу : www. ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/22736610. 50. Pinnamameti N. Concise review: Stem cells in the corneal stroma / N. Pinnamameti, J.L. Funderburgh // Stem Cells. – 2012.Vol. 30(6). – P. 1059-1063. 51. Multipotent stem cells in human corneal stroma / Y. Du, M.L. Funderburg, M.M. Mann [et al.] // Stem Cells. – 2005. – Vol. 23(9). – P. 1266-1275. 52. Pax6 expression identifies progenitor cells for corneal keratocytes / M.L. Funderburg, Y. Du, M.M. Mann [et al.] // FASEB J. – 2005. – Vol. 19(10). – P. 1371-1373. 53. Sosnova M. CD34+ corneal stromal cells are bone marrowderived and express hemopoietic stem cells markers / M. Sosnova, M. Bradl, J.V. Forrester // Stem Cells. – 2005. – Vol. 23(4). – P. 507-515. 54. A novel population of repair cells identified in the stroma of the human cornea / N. Till, K. Schlanger, S. Altenahr [et al. ] // Stem Cells. – 2007. – Vol. 16(5). – P. 733-745. 55. Keratosan and lumican regulate neutrophil infiltration and corneal clarity in lipopolysaccharide-induced keratitis by direct interaction with CXCL1 / E.C. Carlson, M. Lin, C.Y. Liu [et al.] // J. Biol. Chem. – 2007. – Vol. 282(49). – P. 35502-35509. 56. West-Mays Y.A. The keratocyte: corneal stromal cell with variable repair phenotypes / Y.A. West-Mays, D.J. Dwivedi // Int. J. Biochem. Cell Biol. – 2006. – Vol. 38(10). – P. 1625-1631. 57. Characterization of extracellular matrix components in the limbal epithelial stem cell compartment / U. Schlotzer-Schrehardt, T. Dietrich, K. Saito [et al.] // Exp. Eye Res. – 2007. – Vol. 85(6).– P. 845-860. 58. Identification of multipotent stem/progenitor cells in murine sclera / C.L. Tsai, P.C. Wu, M.E. Wini [et al.] // Invest. Ophthalmol. – Vol. 52(8). – P. 5481-5487. 59. Effects of fibroblast origin and phenotype on the proliferative potential of limbal epithelial progenitor cells / S.L. Ainscough, M.L. Linn, Z. Barnard [et al.] // Exp. Eye Res. – 2011. – Vol. 92(1). – P. 10-19.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

407

60. Human forniceal region is the stem-rich zone of the conjunctival epithelium / M.H. Harun, S.N. Sepian, K.H. Chua [et al.] // Hum. Cell. – 2011. Режим доступу до журн. www.ncbi.nlm. nih.gov/pubmed/21748521. 61. Putative rabbit conjunctival epithelial stem/progenitor cells preferentially reside in palpebral conjunctiva / L. Su, H. Cui, C.Xu [et al.] // Curr. Eye Res. – 2011. – Vol. 36(9). – P. 797-803. 62. Clusters of corneal epithelial cells reside ectopically in human conjunctival epithelium / S. Kawasaki, H. Tanioka, K. Yamasaki [et al.] // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2006. – Vol. 47(4). – P. 1359-1367. 63. Potential localization of putative stem/progenitor cells in human bulbar conjunctival epithelium / H. Qi, X. Zeng, X. Yang [et al.] // J. Cell Physiol. – 2010. – Vol. 225(1). – P. 180-185. 64. Comparative analysis of human conjunctival and corneal epithelial gene expression with oligonucleotide microarrays / H.C. Turner, M.T. Budak, M.A. Akincu [et al.] // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2007. – Vol. 48(5). – P. 2050-2061. 65. Li W.W. Progresses of in vitro culture and differentiation in conjunctival epithelial stem cells / W.W. Li, X.G. Sun // Zhonghua Yan Ke Za Zhi. – 2011. – Vol. 47(1). – P. 79-82. 66. The effect of nerve growth factor on differentiation of corneal limbal epithelial cells to conjuctival goblet cells in vitro / W. Li, X. Sun, Z. Wang [et al.] // Mol. Vis. – 2010. – Vol. 16. – P. 2739-2744. 67. Conjunctival epithelial cells maintain stem cell properties after long-term culture and cryopreservation / S. Schrader, M. Notara, M. Beaconsfield [et al.] // Regen. Med. – 2009. – Vol. 4(5).– P. 677-687. 68. Multipotent mesenchymal stem cells from adult human eye conjunctiva stromal cells / S. Nadri, M. Soleimani, J. Kiani [et al.] // Differentiation. – 2008. – Vol. 76(3). – P. 223-231. 69. The eyelid margin: a transitional zone for 2 epithelial phenotypes / S. Liu, J. Li, D.T. Tan [et al.] // Arch. Ophthalmol. 2007. – Vol. 125(4). – P. 523-532. 70. Mucocutaneous junction of eyelid and lip: a study of the transitional zone using epithelial cell markers / A.K. Piay, B.A.

408

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Barathi, R.W. Beurman [et al.] // Curr. Eye Res. – 2008. – Vol. 33(11). – P. 912-922. 71. Knop N. Meibomian glands. Part I : anatomy, embriology and histology of the Meibomian glands / N. Knop, E. Knop // Ophthalmolog. – 2009. – Vol. 108(10). – P. 872-883. 72. Turnover and migration of meibomian gland cells in ratseyelids / Y. Olami, G. Zajicek, M. Cogan [et al.] // Ophthalmol. Res.– 2001. – Vol. 33(3). – P. 170-175. 73. Age-related changes in the meibomian gland / C.J. Nien, J.R. Paugh, S. Massei [et al.] // Exp. Eye Res. – 2009. – Vol. 89(6).– P. 1021-1027. 74. Zoukri D. Mechanisms involved in injury and repair of the murine lacrimal gland: role of programmed cell death and mesenchymal stem cells / D. Zoukri / Ocul. Suf. – 2010. – Vol. 8(2). – P. 60-69. 75. Shatos M.A. Isolation and characterization of progenitorcells in uninjured, adult rat lacrimal gland / M.A. Shatos, L. HaugaardKedstrom, R.R. Hodges // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2012. – Vol. 53(6). – P. 2749-2759. 76. Mechanisms of murine lacrimal gland repair after experimentally induced inflammation / D. Zoukri, A. Fix, J. Alroy [et al.] // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2008. – Vol. 49(10). – P. 4399-4406. 77. Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland / S. You, C.L. Kublin, O. Avidan [et al.] // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2011. – Vol. 52(5). – P. 2087-2094. 78. Role of epithelial-mesenchymal transition in repair of the lacrimal gland after experimentally induced injuri / S. You, O. Avidan, A Tariq [et al.] // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2012. – Vol. 53(1). – P. 126-135. 79. Role of CD44+ stem cells in mural cell formation in the human choroid: evidence of vascular instability due to limited pericyte ensheathment / T. Chan-Ling, M.E. Koina, J.R. McColm [et al.] // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2011. – Vol. 52(1). – P. 399-410. 80. Attenuation of proliferation and migration of retinal pericytes in the absence of thrombospondin-1 / E.A. Scheef, C.M.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

409

Sorenson, N. Sheibani // Am. J. Physiol. Cell Physiol. – 2009. Vol. 296 (4). – P. C724-C734. 81. Yamamoto N. Basic study of retinal stem/progenitor cell separation from mouse iris tissue / Yamamoto N., Tanikawa A., М. Horiguchi // Med. Mol. Morphol. – 2010. – Vol. 43(3). – P. 139-144. 82. Neural crest-derived multipotent cells in the adult mouse iris stroma / M. Kikuchi, R. Hayashi, S. Kanakubo [et al.] // Genes Cells. – 2011. – Vol. 16(3). – P. 273-281. 83. Lord-Grignon J. Identification of genes expressed in retinal progenitor/stem cell colonies isolated from the ocular ciliary body of adult mice / J. Lord-Grignon, M. Abdouh, G. Bernier // Gene Expr. Patterns. - 2006. - Vol. 6(8). – P. 992-999. 84. Properties of growth and molecular profiles of rat progenitor cells from ciliary epithelium / Y. Yanagi, Y. Inoue, Y. Kawase [et al.] // Exp. Eye Res. – 2006. – Vol. 82(3). – P. 471-478. 85. Sphere formation of ocular epithelial cells in the ciliary body is a reprogramming system for neural differentiation // R. Kohno, Y. Ikeda, Y. Yonemitsu [et al.] // Brain Res. - 2006. – Vol. 1093(1). – P. 54-70. 86. Comparative analysis of progenitor cells isolated from the iris, pars plana, and ciliary body of the adult porcine eye / A. MacNeil, R.A. Pearson, R.E. MacLaren [et al.] // Stem Cells. – 2007. – Vol. 25(10). – P. 2430-2438. 87. Otx2 homeobox gene induces photoreceptor-specific phenotypes in cells derived from adult iris and ciliary tissue / T. Akagi, M. Mandai, S. Ooto [et al.] // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.– 2004. – Vol. 45(12). – P.4570-4575. 88. Iris-derived cells from adult rodents and primates adopt photoreceptor-specific phenotypes / T. Akagi, J. Akita, M. Haruta [et al.] // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2005. – Vol. 46(9). – P. 3411-3419. 89. Ciliary margin transdifferentiation from neural retina is controlled by canonical Wnt signaling / H. Liu, S. Xu, Y. Wang [et al.] // Dev. Biol. – 2007. – Vol. 308(1). – P. 54-67. 90. Characteristics of progenitor cells derived from adult ciliary body in mouse, rat, and human eyes // H. Xu, D.D. Sta Iglesia, J.L. Kielczewski [et al.] // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2007. – Vol. 48(4). – P. 1674-1682.

410

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

91. A comparison of epithelial and neural properties in progenitor cells derived from the adult human ciliary body and brain / M.C. Moe, R.S. Kolberg, C. Sandberg [et al.] // Exp. Eye Res. – 2009. – Vol. 88(1). – P. 30-38. 92. Isolation and culture of adult ciliary epithelial cells, previously identified as retinal stem cells, and retinal progenitorcells // S. Gualdoni, M. Baron, J. Lakowski [et al.] // Curr. Protoc. Stem Cell Biol. – 2011. – Chapter 1(Unit 1). - P. 4. 93. Rodriguez F.D. Stem cell plasticity, neuroprotection and regeneration in human eye diseases / F.D. Rodriguez, E. Vecino // Curr. Stem Cell Res. Ther. – 2011. – Vol. 6(1). – P. 73-81. 94. Abburi C. Ciliary epithelium: an underevaluated target for therapeutic regeneration // C. Abburi, A. Anand // Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. – 2012. – Vol. 22(2). – P. 87-95. 95. Gene expression profiles and retinal potential оf stem/ progenitor cells derived from human iris and ciliary pigment epithelium / S. Jasty, P. Srinivasan, G.Pasricha [et al.] // Stem Cell Rev. – 2012. – Vol. 8(4). – P. 1163-1177. 96. Potential application of adult stem cells in retinal repairchallenge for regenerative medicine / A. Machalinska, B. Baumert, L. Kuprjanowisz [et al.] // Curr. Eye Res. – 2009. – Vol. 34(9). – P. 748-760. 97. Baillios B.G. Biology and therapeutic potential of adult retinalstem cells / B.G. Baillios, D. van der Kooy // Can. J. Ophthalmol. – 2010. – Vol. 45(4). – P. 342-351. 98. A decade of mammalian retinal stem cell research / M. Loker, W. El Yakoubi, N. Mazurier [et al.] // Arch. Ital. Biol. – 2010. – Vol. 148(2). – P. 59-72. 99. Limb G.A. Ocular regeneration by stem cells: present status and future prospects / G.A. Limb, J.T. Daniels // Br. Med. Bull. – 2008. – Vol. 85. – P. 47-61. 100. Stem cells as tools in regenerative therapy for retinal degeneration / V. Enzmann, E. Yolcu, H.J. Kaplan [et al.] // Arch. Ophthalmol. – 2009. – Vol. 127(4). – P. 563-571. 101. Wohl S.G. Neurogenic potential of stem/progenitor-like cells in the adult mammalian eye / S.G. Wohl, C.W. Schmeer, S. Isemann // Prog. Retin. Eye Res. – 2012. – Vol. 31(3). – P. 213-242.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

411

102. Retinalstem/progenitor properties of iris pigment epithelial cells / G. Sun, M. Asami, H. Ohta [et al.] // Dev. Biol. -2006. – Vol. 289(1). – P. 243-252. 103. Valtink M. Culturing of retinal pigment epithelium cells / M. Valtink, K. Engelmann // Dev. Ophthalmol. – 2009. – Vol. 43. – P. 109-119. 104. Coles B.L. Isolation of retinal stem cells from the mouse eye / B.L. Coles, D. van der Kooy // J. Vis. Exp. – 2010. – Vol. 43. – P. 2209. 105. Cells previously identified as retinal stem cells are pigment ciliary epithelial cells / S.A. Cicero, D. Jonhson, S. Reyntjens S. [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci USA. – 2009. – Vol. 106(16). – P. 6685-6690. 106. Isolation of retinal progenitor and stem cells from the porcine eye / P. Gu, L.J. Harwood, X. Zhang [et al.] // Mol. Vis. – 2007. – Vol. 13. – P. 1045-1057. 107. Genereating retinal neurons by reprogramming retinal pigment epithelial cells / S.Z. Wang, W. Ma, R.T. Yang [et al.] // Exp. Opin. Biol. Ther. – 2010. – Vol. 10(8). – P. 1227-1239. 108. Microscopic characterization of rat progenitor cells / H.J. Sneedlo, A. Heath, A.M. Brun [et al.] // Brain Res. – 2007. – Vol. 1185. – P. 59-67. 109. Characteristics of progenitor cells derived from adult ciliary body in mouse, rat and human eyes / H. Xu, D.D. Sta Iglesia, J.L. Kielczewski [et al.] // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2007. – Vol. 48(4). – P. 1674-1682. 110. The expression of retinalcell markers and their augmentation by the synthetic retinoid fenretinide / A.J. Kapp, A.A. Vulger, L. Yu [et al.] // Mol. Vis. – 2011. – Vol. 17. – P.17011715. 111. Activation of neural progenitor cells in human eyes with proliferative vitreoretinopathy / E.O. Johnsen, R.C. Froen, R. Albert [et al.] // Exp. Eye Res. – 2012. – Vol. 98. – P. 28-36. 112. Expression of multipotent and retinal markers in pigment epithelium of adult human in vitro / L.A. Milijushina, B.I. Verdiev, A.V. Kuznetsova [et al.] // Bull. Exp. Biol. Med. – 2012. – Vol. 153(1). – P. 157-162.

412

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

113. Reprogramming retinal pigment epithelium to differentiate toward retinal neurons with Sox2 / V. Ma, R.T. Yan, X. Li [et al.] // Stem Cells. – 2009. – Vol. 27(6). – P. 1376-1387. 114. In vitro differentiation of retinal pigment epithelium from adult retinal stem cells / C. Aruta, F. Giordano, A. De Marzo [et al.] // Pigment Cell Melanoma Res. – 2011. – Vol. 24(1). – P. 233-240. 115. Generation of immature retinal neurons from proliferating cells in the pars plana after retinal histogenesis in mice with retinal degeneration / K.M. Nishiguchi, H. Kaneko, M. Nakamura [et al.] // Mol. Vis. – 2009. – Vol. 15. – P. 187-199. 116. Sequeira R.C. Autologous transplantation of retinal pigment epithelium in age related macular degeneration / R.C. Sequeira // Arq. Bras. Ophthalmol. – 2009. – Vol. 72(1). – P. 123130. 117. Pigment epithelial cells isolated from human peripheral irideectomies have limited properties of retinalstem cells / R.C. Froen, E.O. Johnsen, G. Petrovski [et al.] // Acta Ophthalmol. – 2011. – Vol. 89(8). – P. E635- 644. 118. Molecular and Morphological Evidence for Cadaver Vitreous-Stimulated Transphormation of Differentiation-competent Retinal Pigment Epithelial Cells into Neuron-like Cells / S. Khera, A. Tiwari, R. Srinivasan [et al.] // Curr. Eye Res. – 2012. – Vol. 37(7). – P. 606-616. 119. Neural stem niches in health and diseases / I. Decimo, F. Bifari, M. Krampera [et al.] // Curr. Pharm. Des. – 2012. – Vol. 18(13). – P. 1755-1783. 120. Yamamoto N. Basic study of retinal stem/progenitor cell separation from mouse iris tissue / N. Yamamoto, A. Tanikawa, M. Horiguchi // Med. Mol. Morphol. – 2010. – Vol. 43(3). – P. 139144. 121. Nestin expresson – a property of multi-lineage progenitor cells? / C. Wiese, A. Rolletschek, G. Kania [et al.] // Cell Mol. Life Sci. – 2004. – Vol. 61(19-20). – P. 2510-2522. 122. Potential for neural regeneration after neurotoxic injury in the adult mammalian retina / S. Ooto, T. Akari, R. Kageyama [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2004. – Vol. 101(37). – P. 13654-13659.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

413

123. Ooto S. Potential for neural regeneration in the adult mammalial retina / S. Ooto // Nihon Ganka Gakkai Zasshi. – 2006. – Vol. 110(11). – P. 864-871. 124. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells / R.L. Bernardos, L.K. Barthel, J.R. Meyers [et al.] // J. Neurosci. – 2007. – Vol. 27(26). – P. 7028-7040. 125. Ficher A.J. Turning Muller glia into neural progenitors in the retina / A.J. Ficher, R. Bongini // Mol. Neurobiol. – 2010. – Vol. 42(3). – P. 199-209. 126. Ficher A.J. Potential of Muller glia to become neurogenic progenitor cells / A.J. Ficher, T.A. Reh // Glia. – 2003. – Vol. 43(1). – P. 70-76. 127. Karl M.O. Studying the generation of regenerated retinal neuron from Muller glia in the mouse eye / M.O. Karl, T.A. Reh // Methods Mol. Biol. – 2012. – Vol. 884. – P. 213-227. 128. Nelson C.M. Muller glia as a source of neuronal prigenitor cells to regenerative the damaged zebrafish retina / C.M. Nelson, D.R. Hyde // Adv. Exp. Med. Biol. -2012. – Vol. 723. – P. 425-430. 129. Goureau O. Retinal stem cells: mechanism of differentiation and therapeutic application / O. Goureau, J.A. Sahel // Pathol. Biol. – 2006. – Vol. 54(2). – P. 64-71. 130. Distribution of Muller stem cell within the neural retina: evidence for the existence of a ciliary margin-like zone in the adult human eye / B. Bhatia, S. Singal, J.M. Laurence [et al.] // Exp. Eye Res. – 2010. – Vol. 89(3). – P. 373-382. 131. Characterization of Muller glia and neuronal progenitors during adult zebafish retinal regeneration / R. Thummel, S.C. Kassen. J.M. Enright [et al.] // Exp. Eye Res. – 2008. – Vol. 87(5).– P. 433-434. 132. Sonic hedgehog promotes stem-cell potential of Muller glia in the mammalian retina / J. Wan, H. Zheng, H.L. Xiao [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2007. – Vol. 363(2). – P. 347354. 133. Wallace V.A. Proliferative and cell fate effects of Hedgehog signaling in the vertebrate retina / V.A. Wallace // Brain Res. – 2008. – Vol. 1192. – P. 61-75.

414

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

134. Adult human Muller glia cells are a highly efficient source of rod photoreceptors / S.G. Gianelli, G.C. Demontis, G. Pertile [et al.] // Stem Cells. – 2011. – Vol. 29(2). – P. 344-356. 135. Wallace V.A. Stem cells: a source for neuron repair in retinal disease / V.A. Wallace // Can. J. Ophthalmol. – 2007. – Vol. 42(3). – P. 442-446. 136. Rodriguez F.D. Stem cell plasticity, neuroprotection and regeneration in human eye diseases / F.D. Rodriguez, E. Vecino // Curr. Stem Cell Ther. – 2011. – Vol. 6(1). – P. 73-81. 137. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish / P.A. Raymond, L.K. Barthel, R.L. Bernardos [et al.] // BMC Dev. Biol. – 2006. – Vol. 6. – P. 36. 138. Activation of retinal stem cells in the proliferating marginal region of RCS rats during development of retinites pigmentosa / Q. Jian, H. Xu, H. Xie [et al.] // Neurosci. Lett. – 2009. – Vol. 465(1).– P. 41-44. 139. Adult ciliary epithelial cells previously identified as retinal stem cells with potential for retinal repair, faie to differentiate into new rod / S. Gualdoni, M. Baron, J. Lakowski [et al.] // Stem Cells.– 2010. – Vol. 28(6). – P. 1048-1059. 140. Differences between the neurogenic and proliferative abilities of Muller glia with stem cell characteristics and the ciliary epihelium from the adult human eye / B. Bhatia, H, Jayaram, S. Singhal [et al.] // Exp. Eye Res. – 2011. – Vol. 93(6). – P. 852861. 141. Osakada F. Stem cell biology and cell transplantation therapy in the retina / F. Osakada, Y. Hirami, M. Takahashi // Biotechnol. Genet. Eng. Rev. – 2010. – Vol. 26. – P. 297-334. 142. Ong J.M. A review and update on the current status of stem cell therapy and the retina / J.M. Ong, L. da Cruz // Br. Med. Bull. – 2012. – Vol. 102. – P. 133-146. 143. Stepwise differentiation of pluripotent stem cells into retinalcells / F. Osakada, H. Ikeda, Y. Sasai [et al.] // Nat. Prоtoc.– 2009. – Vol. 4(6). – P. 811-824. 144. Henry J.J. The cellular and molecular bases of vertebrate lens regeneration / J.J. Henry // Int. Rev. Cytol. – 2003. – Vol. 228. – P. 195-265.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

415

145. Regulated lensregeneration from isolated pigmented epithelial cells of newt iris in culture in response to FGF 2/4 / T. Hayashi, N. Mizuno, K. Owarible [et al.] // Differentiation. – 2002.– Vol. 70(2-3). – P. 101-108. 146. Newt's eye of lensregeneration / P.A. Tsonis, M. Madhavan, E.E. Tancous [et al.] // Int. J. Dev. Biol. – 2004. – Vol. 48(8-9). – P. 975-980. 147. Анализ экспрессии регуляторных генов Рах6, Prox1 и Six3 во время регенерации структур глаза у тритона / Л.В. Маркитантова, Е.О. Макарьев, Л.Ф. Смирнова [и др.] // Изв. АН Сер. Биология. – 2004. – Том 5. – С. 522-531. 148. Hayashi T. Determinate roles of FGF and Wntsignals in iris-derived lensregeneration in newt eye / T. Hayasi, N. Mizuno, H. Kondoh // Dev. Growth Differ. – 2008. – Vol. 50(4). – P. 279287. 149. The role of Pax-6 in lensregeneration / M. Madhavan, T.L. Haynes, N.C. Frisch [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2006.– Vol. 103(40). – P. 14848-14853. 150. A hierarchy of proliferative cells exists in mouse lens epithelium: implications for lens mainterance / M. Zhou, J. Lieberman, J. Xu [et al.] // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2006. – Vol. 47(4). – P. 2997-3003. 151. Yamamoto N. A study of the proliferativing activity in lens epithelium and the identification of tissue-type stem cells / N. Yamamoto, K. Majima, T. Marunouchi // Med. Mol. Morphol. – 2008. – Vol. 41(2). – P. 83-91. 152. Characterization and localization of side population cells in the lens / M. Oka, C. Toyoda, Y. Kaneko [et al.] // Mol. Vis. – 2010. – Vol.18. – P. 945-953. 153. Sox2(+) adult stem and progenitor cells are important for tissue regeneration and survival of mice / K. Arnold, A. Sarkar, M.A. Yram [et al. ] // Cell Stem Cell. – 2011. – Vol. 9(4). – P. 317329. 154. Regulation of gene expression by Pax6 in ocular cells: a case of tissue-prefered expression of crystallins in lens / A. Cvekl, Y. Yang, B.K. Chauhan [et al.] // Int. J. Dev. Biol. – 2004. – Vol. 48(8-9). – P. 829-844.

416

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

155. Efficient generation of lens progenitor cells from cataract patient-specific induced pluripotent stem cells / X. Qiu, J. Yang, T. Lin [et al.] // PLoS One. – 2012. – Vol. 7(3). – P. e32612. 156. Notch signaling regulates growth and differentiation in the mammalian lens / S. Rowan, K.W. Conley, T.T. Le [et al.] // Dev. Biol. - 2008. – Vol. 321(1). – P. 111-122. 157. Le T.T. Jagged 1 is necessary for normal lens formation / T.T. Le, K.W. Conley, N.L. Brown // Dev. Biol. – 2009. – Vol. 328(1). – P. 118-126. 158. Fibroblast growth factor receptors is esscutial for lens fiber cell differentiation / H. Zhao, T. Yang, B.P. Madakashira [et al.] // Dev. Biol. – 2008. – Vol. 318(2). – P. 276-288. 159. SKAP2, a novel target of HSF-4b, associates with NCK2/ F-actin at membrane ruffles and regulates actin reorganization in lenscell / L. Zhou, Z. Zhang, Y. Zheng [et al.] // J. Cell Mol. Med.– 2011. – Vol. 15(4). – P. 783-795. 160. Proteomic analysis of regenerated rabbit lenses reveal crystallin expression characteristic of adult rabbits / X. Liu, M. Zhang, Y. Liu [et al.] // Mol. Vis. – 2008. – Vol. 14. – P. 2404-2412. 161. Gwon A. Lens regeneration in mammals: a review / A. Gwon // Surv. Ophthalmol. – 2006. – Vol. 51(1). – P. 51-62. 162. Huang Y. Expression of transcription factors and crystallin proteins during rat lens regeneration / Y. Huang, L. Xie // Mol. Vis. – 2010. – Vol. 16. – P. 341-352. 163. The ageing lens / A.J. Bron, G.F. Vrensen, J. Koretz [et al.] // Ophthalmologica. – 2000. – Vol. 214(1). – P. 86-104. 164. Sharma K.K. Lens ageing: effects of crystallins / K.K. Sharma, P. Santhoshkumar // Biochem. Biophys. Acta. – 2009. – Vol. 1790(10). – P. 1095-1108. 165. Michael R. The ageing lens and cataract: a model of normal and pathological ageing / R. Michael, A.J. Bron // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. – 2011. – Vol. 366 (1568). – P. 1278-1292. 166. Boswell B.A. Essential role of BMPs in FGF-induced secondary lensfiber differentiation / B.A. Boswell, P.A. Overbeek, L.S. Musil // Dev. Biol. – 2008. – Vol. 324(2). – P. 202-212. 167. Jarrin M. A balance of FGF and BMP signals regulates cell cycle exit and Equarin expression in lens cells / M. Jarrin, T.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

417

Pandit, L. Gunhaga // Mol. Biol. Cell. – 2012. – Vol. 23(16). – P. 3266-3274. 168. Equarin is involved as an FGF signaling modulator in chick lens differentiation / X. Song, Y. Sato, A. Felembau [et al.] // Dev. Biol. – 2012. – Vol. 368(1). – P. 109-117. 169. ADAM and ADAMTS gene expression in native and wound healing humanlens epithelial cells / L.M. Hodgkinson, L. Wang, G. Duncan [et al.] // Mol. Vis. – 2010. – Vol. 16. – P. 2765-2776. 170. Remington S.G. Lens stem cells may reside outside the lens capsule: an hypothesis / S.G. Remington, R.A. Meyer // Theor. Biol. Med. Model. – 2007. – Vol. 4. – P. 22. Стовбурові клітини для лікування глухоти. Учені з Національного Центру регенеративної медицини (National Center for Regenerative Medicine) зуміли виділити кохлеарні стовбурові клітини з тканини завитки внутрішнього вуха новонароджених мишей і розмножити їх у культурі. Клітини формували характерні сфери і експресували специфічні маркери стовбурових, нейропрогеніторних і волоскових клітин. За матеріалами EurekAlert. Джерело: http://www.cmbt.su/ http://doctor.wpoonline.com/article.php?sid=30486

Орган слуху. Втрата однієї з головних сенсорних систем слухової може мати руйнівні наслідки у взаємодії людини з нав колишнім світом. Вважають, що основна проблема полягає в тому, що критична маса клітин завитки і нейронів спірального ганглія формуються тільки в процесі ембріогенезу, а після пошкодження вони не можуть бути замінені. У даний час варіанти для лікування цього стану дуже обмежені, і в основному представлені протезами - слуховими апаратами та кохлеарними імплантатами. Існує необхідність у терапевтичному прориві лікування глухоти, який допоможе мільйонам людей, які постраждали від втрати слуху. Досягнення в галузі стовбуровоклітинних технологій пропонують проблиск надії для цієї недуги. У зростаючому обсязі літератури проводиться спроба прокласти шлях для терапії глухоти СК. Багато факторів слід мати на увазі при розробці цього підходу, два з яких мають першорядне значення. По-перше, різні осередки СК потенційно будуть використані, усі з яких мають свої переваги і недоліки. По-друге, із метою виявлення такого маленького

418

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

і відокремленого органу, як завитка, технічно важкі хірургічні методи повинні бути розроблені [1-3]. Орган слуху належить до органів чуття другого типу (вторинно-чутливі). Сприймаючими елементами є спеціалізовані епітеліальні клітини (сенсорно-епітеліальні), збудження від яких передається до нервових клітин спірального ганглія [4]. Сенсорно-епітеліальні клітини слухової частини лабіринту внутрішнього вуха називаються волосковими (внутрішні і зовнішні кохлеоцити) (додаток 21). Сенсорно-епітеліальні клітини і нейрони спірального ганглія розвиваються зі слухової плакоди (ділянка ектодерми по боках зачатка довгастого мозку). Нейрогенез регулюється мережею зов нішніх і внутрішніх факторів, які включають трофічні фактори (фактор росту фібробластів, нейротрофіни, родину інсуліно-по дібних пептидів) та транскрипційні шляхи [5]. Розуміння і визначення ключових факторів і генних мереж у розвитку і функції внутрішнього вуха являє собою важливий крок у напрямку подолання глухоти, яка зумовлена пошкодженням сенсорно-епітеліальних і нервових структур внутрішнього вуха. Певну роль у розвитку внутрішнього вуха, як і в ембріональ ному розвитку інших клітин, відіграють транскрипційні фактори родини SoxE [6]. Sox10 спочатку експресується в слухових пухирцях і пізніше в підтримувальних клітинах під час диференціації клітин спірального органа. Наводяться генетичні докази того, що Sox10, у залежності від концентрації, може відігравати певну роль у регуляції Jagged1 гену, як відомо, важливого для prosensory розвитку внутрішнього вуха. Представлені результати показують, що Sox10 регулює біологію раннього розвитку кохлеарних попередників у внутрішньому вусі, але, на відміну від клітин, отриманих із нервового гребеня, цей транскрипційний фактор є необов'язковим для їхньої диференціації, а його ефект реалізується за рахунок активації гена Jagged1. Основу вивчення відтворення клітин спірального органа було закладено в 1975 році, коли Н.М. Sobkowicz і співавт. [7] описали довгострокову органотипову культуру клітин органа Корті новонародженої миші з детальним описом методів дисекції і вирощування спірального органа разом із спіральним ганглієм.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

419

Була висловлена гіпотеза, що у внутрішньому вусі, незважаючи на обмежені можливості, існують СК - слухові і вестибулярні [8, 9]. Ці клітини здатні до утворення нейросфер і в подальшому з використанням маркерів клітин-попередниць їх можна диференціювати на волоскові і нервові клітини присінкового і завиткового лабіринту [10 - 13]. Проліферація СК у культурі надає їм здатності самооновлення і формування нейросфер, які утворилися з клонально відтворених клітин. Однак, їх пошкодження in vivo нелегко відновити, оскільки слухові СК для регенерації отримати важко. СК cпірального ганглія є плюрипотентними з потенціалом диференціації на волоскові клітини і нейрони кохлеарного осередку, втрата яких викликає глухоту [14]. Диференціація клітин-попередниць у культурі повторює шляхи розвитку ембріональних сенсорних нейронів. Ретиноє ва кислота збільшує можливості утворення нейронів і частки отриманих сенсорних клітин, що викликано різким збільшенням Pax2, який є ключовим фактором транскрипції черепних плакод. Маркери ембріональних слухових та інших сенсорних нейронів (GATA3, Brn3a і islet1) можуть бути виявлені через 3 доби диференціації клітин і маркери фенотипу сенсорних клітин (peripherin, кальретинін, TrkC, і TrkB) - через 10 діб . Для диференційованих клітин із рецепторами функціонального типу AMPA-глутамату, додатково вказано, що ці клітини далі розвиваються як клітини з нейронними рисами. Водночас, нейрони, які диференціювалися від цих СК, можна спрямувати на ріст у культурі в напрямку волоскових клітин. Розвиток функціональної активності клітин із маркерами сенсорних нейронів припускає потенціал СК внутрішнього вуха в заміні пошкоджених у результаті нейрональної дегенерації клітин [15]. Про мультипотентні кохлеарні клітини-попередниці нейронів та умови їхньої диференціації є не так багато відомостей. J. Lin et al. [16] повідомили, що відразу після народження в мишей у спіральному органі виявлено клітини, здатні до самовідновлення і до диференціації в нейроно- і волосковоподібні клітини (експресія факторів Sonic hedgehog, епідермального фактору росту, ретиноєвої кислоти і нейрофічного фактору головного мозку) із можливістю симетричного і асиметричного поділу клонованих

420

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

нащадків. Диференціація цих клітин у волоскові клітини залежала від сигнального шляху ERK. Але автори не виявили їхніх можливостей подальшої диференціації в нейрони. Останні дослідження показали, що мультипотентні СК клітини і клітини-попередниці, які здатні до проліферації і регенерації, присутні в завитці ссавців. Досліджено проліферативний потенціал клітин, отриманих із завитки новонароджених щурів різного віку. Визначення розходжень між проліферативними клітинами щурів різного віку може дати ключ до розгадки механізмів, контролюючих долю цих клітин. Проліферативні клітини були ізольовані від завитки щурят віком 1, 7 і 14 днів та ідентифіковані на підставі даних ультраструктури клітин із кожної вікової групи методами проточної цитометрії та трансмісійної електрон ної мікроскопії. Протягом перших двох тижнів після народження кількість проліферативних клітин поступово зменшилася до нуля. Це зниження відбулося паралельно з погіршенням стану проліферативного потенціалу клітин і накопиченням клітин у G0/ G1 фазах циклу. Крім того, деякі з клітин вийшли з клітинного циклу шляхом апоптозу [17]. Під час диференціації кохлеарних СК у них від немовлят до дорослих зменшується рівень цикліну А2, який відіграє велику роль у модуляції клітинного циклу [18]. Декілька груп дослідників у даний час вивчають можливості для ембріональних та дорослих СК для заміни пошкоджених сенсорних елементів у завитці глухих людей. Останніми досягненнями в галузі наших знань про СК і розвиток індукованих плюрипотентних СК є те, що Такахасі і Яманака в 2006 році, відкрили нову галузь науки, орієнтовану на використання індукованих плюрипотентних СК у терапевтичних цілях. Існують потенційні вигоди при використанні плюрипотентних клітин у поєднанні з кохлеарними імплантатами для лікування втрати слуху, у тому числі й диференціації плюрипотентних клітин у слухові нейронного походження, та клінічно значущі підходи до їхньої трансплантації [19]. При вивченні потенціалу індукованих плюрипотентних СК для використання в якості джерела трансплантатів для відновлення слухових нейронів спірального ганглія було простежено ex vivo за зростанням аксонів від індукованих клітин-поперед

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

421

ниць – нейронних похідних до волоскових клітин до і в результаті їхньої трансплантації мишам in vivo. Нейрони, отримані з плюрипотентних клітин, спрямовували нейрити до кохлеарних волоскових клітин. Урегулювання стану нейронів, отриманих з індукованих СК, відбувалося через один тиждень після трансплантації в завитку. У деяких трансплантатах виявили везикулярно-глутаматний транспортер 1, який є маркером глутаматергічних нейронів. Ці результати показують, що плюрипотентні клітини можуть бути використані в якості джерела трансплантатів для регенерації нейронів спірального ганглія [20]. Можливості і швидкість росту аксонів у дисоційованому спіральному ганглії та його культурі можна проаналізувати в сканувальному електронному мікроскопі і за допомогою відеомік роскопії. Рух аксонів був оцінений за появою конусів росту на їхніх ламелоподіях, появою мікрошипиків, які перемежовувалися з круговими спайками. Нейрони та їхні конуси росту експресували DCC-рецептор задля дії на молекулу Netrin-1 і було висловлено припущення, що цей атрактант у дорослих впливає на процес регенерації нейритів нейронів спірального ганглія [21, 22]. Імуноцитохімічний і сповільнений аналіз проліферації клітин спірального ганглія виявив пересування слухових нейронів і їхніх конусів росту групами, подібними до гангліонарних утворень. Аксони, що локалізувалися пучками, інколи були "склеєні" S-100/гліальним кислим фібрилярним білком, який експресується клітинами. Деякі нейрони були нестин+, а іноді виявляли маркери проліферації клітин Ki67 і 5'-бром2-дезоксиуридин. Нейрони під час цього процесу експресували маркери і транскрипційні фактори, характерні для нейрального розвитку - neurogenin 1, нейрогенний фактор диференціації 1, Brn3a і GATA-зв'язуючий білок 3, а також нейронні маркери βIII-тубулін, NeuN і нейрофиламентів 160 [23]. K. Rak et al. [24] вивчали потенційні нейральні СК із нейро сфер кохлеарного ядра і проаналізували гістологічні зрізи, щоб довести здатність до самооновлення і диференціації в клітинипопередниці нейронної лінії. Для цього клітини з кохлеарного ядра щурів (віком день після народження) виділяли і культивували для утворення первинних нейросфер. СК виявляли метода-

422

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

ми підрахунку та аналізу після BrdU визначення. Нейральні клітини-попередниці виявили різні маркування для Nestin і Atoh1. Позитивне фарбування в них bIII-тубуліну, гліального кислого фібрилярного білка і основного білка мієліну показало їх диференціацію в нейрони, астроцити і олігодендроцити. Крім того, Nestin і BrdU-мічені клітини також були виявлені в гістологічних зрізах. Автори зробили висновок, що ізольовані зі спірального ганглія клітини мають усі ознаки нейральних СК. До цього часу мало відомо про сигнальні шляхи, крім ней ротрофічних факторів, які діють у нейронах спірального ганглія. У хворих із нейросенсорною приглухуватістю, такі шляхи в кінцевому підсумку можуть бути спрямовані на стимулювання та напрямки росту аксонів від залишків спірального ганглія до кохлеарного імпланту, тим самим підвищуючи точність передачі звуку. Виявлено наявність трансмембранних рецепторів нейронів, які представляють шляхи ephrin, Netrin, semaphorin, Wnt у зрілій завитці. Wnt сигналізація, зокрема, виступає як кандидат для спрямування росту аксонів до кохлеарного імпланта після нейросенсорної втрати слуху [25]. У спіральному ганглії глухих (із пошкодженням завитки гентаміцином) морських свинок нервові клітини експресують NOB1 - транскрипційно-асоційований білок, що складається з одного домену стрічки цинку. Тобто NOB1 може відігравати роль у слуховій трансдукції [26]. Нейральні, ембріональні або СК червоного кісткового мозку виживають у внутрішньому вусі ссавців після трансплантації. Пересаджені нейральні СК можуть набути морфологічних фенотипів волоскових клітин, що було досягнуто у відповідних дослідженнях. Ембріональні стовбурово-похідні нейрони мають потенціал для формування синапсу зі слуховими волосковими клітинами і реіннервації слухового епітелію. При цьому коливання об'єму виживаності і відновлення функцій нейронів спірального ганглія, інтеграції в тканини господаря, і потенційні імунні бар'єри мають першорядне значення [27, 28]. Із різних ділянок сенсорного слухового епітелію в новонароджених мишей виявили маркери для клітин-попередниць нервових і слухових клітин [29].

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

423

Глухота зазвичай виникає в результаті ураження не тільки нейронів, але й сенсорних клітин слухової частини внутрішнього вуха. У даний час немає схем лікування для призупинення втрати слуху або його повернення. Основною метою при розробці терапії нейросенсорної приглухуватості є визначення стратегії для заміни втрачених волоскових клітин (кохлеоцитів). Раніше вважали, що в завитці ссавців, кохлеоцити утворюються тільки під час ембріогенезу. У хребетних внутрішнє вухо розвивається зі слухової плакоди і проходить складну серію морфо-генетичних процесів при диференціації механосенсорного епітелію за участю волоскових клітин - механорецепторів слуху і рівноваги. Багато досліджень були проведені для того, щоб продемонструвати наяв ність ендогенних клітин-попередниць у дорослих. Розуміння механізмів, що лежать в основі утворення волоскових клітин є важливою передумовою до визначення терапевтичної стратегії для відновлення цих клітин у внутрішньому вусі дорослих [30-33]. Показано, що попередниці волоскових клітин існують у спіральному органі і вони могли би стати найліпшими для заміни втрачених сенсорних клітин за відповідних умов їхньої проліферації та диференціації в дорослих і відновлення слуху [34, 35]. Потенційні клітини, які могли би мати застосування в регенеративній терапії органа слуху, виявлені в спіральному органі тварин. У людини такі зусилля на отримання терапевтичних кандидатів обмежені через етичні і технічні труднощі. Нещодавно ізольовані популяції слухових СК від плоду людини, які могли б стати ідеальною моделлю для вирішення деяких із проблем, що лежать попереду - очищення, розширення і технічного обслуговування кохлеарних СК [36]. Терапія СКї швидко розвивається і має потенціал застосуван ня в лікуванні розладів внутрішнього вуха. Перші спроби вивчення можливості такої терапії в лікуванні порушень внутрішнього вуха були виконані з використанням нейральних СК. Трансплантовані нейральні СК можуть вижити у внутрішньому вусі і диференціюватися в фенотипи нейронних, гліальних та/ або волоскових клітин, що робить їх трансплантацію для відновлення клітин внутрішнього вуха потенційно ефективним методом лікування.

424

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Подальші дослідження показали, що ембріональні СК, клітини спинномозкового ганглія і клітини ліній, отримані з внут рішнього вуха плоду, можуть бути використані для відновлення пошкодженого внутрішнього вуха. СК також було запропо новано в якості стратегії для доставки ліків до внутрішнього вуха [37]. В останні кілька років було досягнуто значного прогресу в розумінні основних механізмів, що беруть участь у пошкодженні внутрішнього вуха і були розроблені різні потенційні терапевтичні підходи. Було показано, що волоскові клітини втрачаються через вплив шуму або токсичних препаратів. Цьому можна запобігти шляхом застосування антиоксидантів, інгібіторів внут рішньоклітинних шляхів стресу і нейротрофічними факторами / блокаторами нейротрансмісії. Крім того, є надія, що СК можуть бути використані для створення нових волоскових клітин. Однак, незважаючи на величезний прогрес, більшість із концепцій, що обговорюються, усе ще знаходяться в експериментальній стадії і важко передбачити, який підхід буде, нарешті, введений у клінічну практику [38, 39]. У втраті сенсорних і нейрональних клітин із наступним погіршенням слуху, що відбувається під впливом різних генетичних мутацій та чинників навколишнього середовища, велику роль відіграють інгібітори клітинного циклу, які зумовлюють вступ клітин у мітоз і їхню диференціацію [40]. Недавні дослідження показали, що після народження в мишей у завитці зберігаються клітини-попередниці, які можуть утворювати сфери (отосфери) у культурі (рис. 26). Клітини ото сфер здатні до самооновлення і диференціації клітинних ліній внутрішнього вуха, тим самим їх можна пропонувати як перспективне джерело для регенерації волоскових клітин [41]. Клітини отосфер виявляють маркери стовбурових кохлеарних клітин. Ці сфери містять ABCG2, Jagged1 і Notch1 позитивні клітини-по передниці. Вони можуть проліферувати і створити нове покоління волоскових клітин - імунопозитивних для кон крет них маркерів популяції волоскових клітин, у тому числі міозину VI, міозину VIIa, Math1 і мають здатність до поглинання FM1-43 [42].

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

425

У волоскових клітинах-попередницях, взятих із завитки новонароджених щурів, раніше були виявлені маркери такі, як у клітинах зовнішньої спіральної борозни завитки в живому організмі, у тому числі ZO1, Islet1, Hes1 і Hes5. Коли ці клітини починають індукувати експресію Hath1, вони виявляють потенціал до диференціації у волоскові клітини. Волоскові клітини-попередниці в сферах проявляють свою проліферативну активність і експресують тільки епітеліальні маркери. Якщо ці сфери допов нити дисоційованими мезенхімними клітинами, то можна отримати епітеліальні попередниці клітин, здатні диференціюватися ми мезенхімними клітинами, то можна отримати епітеліальні в клітини з експресієювмаркерів клітин, здатні диференціюватися клітини волоскових з експресієюі підтримувальних клітин, які характерні для сенсорного епітелію внутрішнього скових і підтримувальних клітин, які характерні для сенсорного що потенціал саморішнього вуха вуха вв природних природних умовах умовах [43]. [43]. Виявлено, Виявлено, що ооновленняоновлення клітин отосфер з кожним новим клітинзменшується отосфер зменшується з кожним новим покопробірці [44]. лінням у пробірці [44] (рис. 27). При культивуванні ізольованих із спірального органа миМультипотентні шей і морських свинок (віком стовбурові клітини 3 доби постнатального періоду) Eya1 клітин у середовищі, доповнеSox2 ному епідермальним фактором Notch росту, основним фактором росJagged1 ту фібробластів або трансфорКлітини- попередниці муючим фактором росту α, ↓Notch установили, що при додаванні ↑Notch трансформуючого фактору рос↓Sox2 ↑Sox2 ↑Atoh1 ту α утворюється більше ото ↓Atoh1 ↑Fgfr1 сфер, ніж при введенні основно↑Fgf20 го фактору росту фібробластів. ↑Bmp4? В отосферах спостерігали рівноПідтримувальні Волоскові мірний розподіл Sox2 і нестин+ клітини клітини клітин. При ідентифікації цих клітин виявилося, що вони наРис. 27. Самооновлення клітин лежать до волоскових і підтриКортієвого органа. мувальних клітин [45]. Виявлено, що Notch шлях має велике значення для збере6. Самооновлення Кортієвого органа. женняклітин градієнту підтримувальні/сенсорні клітини і запобігає

культивуванні ізольованих із спірального органа мишей і ок (віком 3 доби постнатального періоду) клітин у середовищі, епідермальним фактором росту, основним фактором росту бо трансформуючим фактором росту α. Встановили, що при

426

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

надмірній регенерації останніх [46]. Цей комплекс мозаїки СК і клітин-попередниць спірального органу потребує латерального гальмування опосередкованого шляху Notch сигналізації. Кілька досліджень були виконані по вивченню Notch сигналізації в попередній індукції prosensory домену, який лежить по довжині каналу завитки і який відповідає за диференціацію волоскових і підтримувальних клітин [47, 48]. Щоб дослідити роль Notch сигналізації в prosensory формування домену, був умовно інактивований транскрипційний посередник канонічного шляху Notch сигналізації – RBPjκ на протязі внутрішнього вуха і отримано результати, які доводять, що канонічна Notch сигналізація не є необхідною для prosensory специфікації завитки миші, припускаючи, що інші сигнальні шляхи можуть бути більш специфічними для цього високоорганізованого органа чуття [49]. Водночас, N. Yamamoto et al. [50] вважають, що порушення Jagged1-опосередкованої Notch сигналізації призводить до втрати і пошкодження окремих сенсорних ділянок, що вказує на її роль у деяких моментах prosensory розвитку. Тим не менш, збереження окремих сенсорних ділянок дозволяє припустити, що невеликий рівень Notch діяльності зберігається у відсутності Jagged1. Ці результати вказують на важливу роль Rbpj i Notch сигналізації в розвитку, диференціації і виживанні клітин внут рішнього вуха. Якщо блокувати Notch сигналізацію γ-секретазним інгібітором, збільшується перетворення СК внутрішнього вуха у волоскові клітини за механізмом, в якому бере участь bHLH транскрипційний фактор Math1 (мишачий Atoh1), диференціація клітин нейральні лінії активується завдяки експресії Notch внутрішньоклітинного домену. Перехід до нейронної лінії можна частково пояснити проліферацією клітин, які не пройшли сенсорно-клітинної диференціації у зв'язку з високим рівнем Notch сигналізації, із залученням регуляторного впливу Ngn1. Notch внутрішньоклітинний домен через вплив Ngn1 непрямо опосередковує регуляцію Sox2, який експресується багатьма нейральними попередницями клітин [51]. Білки родини Sonic hedgehog мають важливе значення для розвитку каналу завитки. Установлено, що Sonic hedgehog сиг-

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

427

нальний шлях сприяє диференціації кохлеарних нейральних попередників. При додаванні Sonic hedgehog збільшується формування епітеліо-клітинних острівців з одночасною активацією експресії Math1, який є чинником транскрипції для початкової диференціації слухових волоскових клітин. Підвищена експресія Math1 пізніше регулюється промотором діяльності Brn3.1 - іншим транскрипційним фактором, який керує подальшою диференціацією і виживанням слухових волоскових клітин. Тобто сигнальний шлях Sonic hedgehog відіграє важливу роль у диференціації слухових волоскових клітин через вплив на Math1Brn3.1 сигнальні шляхи [52]. У процесі регуляції диференціації волоскових клітин на Math1 негативно впливає Hes1. Цe показує, що баланс між Math1 і негативними регуляторами, такими як Hes1, має вирішальне значення для утворення відповідної кількості волоскових клітин внутрішнього вуха [53, 54]. Є докази того, що при втраті волоскових клітин можливим механізмом їхнього поновлення може стати трансдиференціація підтримувальних клітин на сенсорні. Цього можна досягнути з місцевим використанням генної терапії Math1 і найбільш перспективними вважаються вірусні вектори, такі як аденовек тор [55]. Стабільність таких процесів підтримують інгібітори клітинного циклу Cip/Kip і Notch сигналізація [56]. Тобто, транс диференціація ендогенних клітин, що залишилися непошкодже ними у внутрішньому вусі і стимуляція проліферативної діяль ності може стати одним із шляхів боротьби з втратою слуху [57, 58, 59]. У внутрішньому вусі мишей віком 60 діб спостерігали помірну експресію клітинами нестин-зеленого флуоресцентного білка, який ідентифікує СК і клітини-попередниці - у стромі ампульних крист і в мішечку, але не в рамках сенсорного епітелію. В органі Корті була знайдена помірна експресія цього білка в декількох клітинах Дейтерса. Вираз нестин-зеленого білка у внутрішньому вусі мишей пов'язаний із розвитком і є регульованим. Проте в дорослому внутрішньому вусі є окремі нестин+ клітини, що підкреслює можливість потенціалу внутрішньої регенерації, хоча і в меншій мірі, ніж у ранньому постнатальному періоді від 4-ї до 15 –ї доби [60].

428

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

На 3-ю добу після народження в спіральному органі мишенят виявлено GFAP-GFP сигнал у всіх підтримувальних клітинах, у той час як нестин-GFP був обмежений внутрішніми підтримувальними клітинами. На даному етапі, GFAP і окремі стовбурові/прогеніторні маркери відображають перекриття експресії в підтримувальних клітинах. У дорослих експресія GFAP переміщається до зовнішніх волоскових клітин. Експресія Sox2 і Jagged1 зберігається в зрілих підтримувальних клітинах, водночас ABCG2 була знижена в цих клітинах. На противагу, експресія GFAP і ABCG2 виросла в лімбальних клітинах внутрішньої борозни [61]. Установлено, що від 3-ї до 15-ї доби після народження у внутрішньому вусі мишей виявляються клітини, які експресують GFAP (гліальний фібрилярний кислий білок, що ідентифікує проміжні філаменти астроцитів і шванноцитів). Ці клітини локалізуються в спіральному органі відразу після народження в ділянці розташування фалангових і волоскових клітин, їхній градієнт знижується від основи до верхівки завитки, а після 15-ї доби цей маркер спостерігається лише у внутрішніх волоскових, фалангових і клітинах-стовпах. Як видно, ці клітини подібні до астроцитів або шванноцитів і необхідні для підтримки нормального розвитку і життєздатності не тільки нейронів, але й сенсорних клітин внутpішнього вуха [62]. Проведені також експерименти з отриманням незрілих ней ральних попередниць із фетальної нервової системи мишей, вирощенням їхньої культури до 14,5-ї доби і проаналізовані зміни імуногістохімічних особливостей клітин культури після диференціації. Установлено, що у волоскових клітинах імунофенотипово ідентифікуються епітопи з маркерними білками міозину VIIa і Brn-3c і в підтримувальних клітинах - маркером є панцитокератин. Таким чином, у нейральних попередників є потенціал, щоб диференціюватися у волоскові і підтримувальні клітини внyтрішнього вуха [63]. Перспективними джерелами для автотрансплантації для відновлення слуху запропоновані також епендимні, індуковані плюрипотентні стовбурові і нюхові нейроепітеліальні клітини, які не піддаються імунному відторгненню [64].

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

429

Щоб використати весь потенціал СК для регенерації волоскових клітин, фундаментальна наука та клінічна медицина повин ні працювати разом, щоб прискорити перехід від експерименту до ліжка хворого по з'ясуванню механізмів розвитку волоскових клітин внутрішнього вуха з акцентом на ролі мікроРНК і адаптації цих знань безпечно і ефективно для стовбуровоклітинних технологій [65 - 67]. • Матеріали опубліковані в статті Чайковський Ю.Б. Стовбу рові клітини спірального органа внутрішнього вуха / Ю.Б. Чайковський, О.І. Дєльцова, С.Б. Геращенко // Журнал вушних, носових і горлових хвороб. - 2013. - №5. - С. 80-89. Література 1. Brigande J.V.Quo vadis, hair cell regeneration? / J.V. Brigande, S. Heller // Nat. Neurosci. – 2009. – Vol. 12(6). – P. 679-685. 2. Jongkamonwiwat N. Stem cell based therapy in the inner ear: appropriate donor cell types and routes for transplantation / N. Jongkamonwiwat, A. Zine , M.N. Rivolta // Curr. Drug Targets. – 2010. – Vol. 11(7). – P. 888-897. 3. El-Amraoui A. Stem cell therapy in the inner ear : recent achievements and prospects / А. El-Amraoui, С. Petit // Med. Sci. (Paris). – 2010. – Vol. 26(11). – P. 981-985. 4. Гістологія людини / [підр. для студ. вищих мед. навч. закл. ІІІ-ІV рівнів акредитації] / О.Д. Луцик, А.Й. Іванова, К.С. Кабак, Ю.Б. Чайковський. - Київ: Книга плюс, 2010. – 584 с. 5. A network of growth and transcription factors controls neuronal differentation and survival in the developing ear / H. Sanchez-Calderon H., M. Milo, Y.Leon [et al.] // Int. J. Dev. Biol.– 2007. – Vol. 51(6-7). – P. 557-570. 6. Sox10 promotes the survival of cochlear progenitors during the establishment of the organ of Corti / I. Breuskin, M. Bodson, N. Thelen [et al.] // Dev. Biol. – 2009. – Vol. 335(2). – P. 327-339. 7. Sobkowicz H. M. Tissue culture of the organ of Corti / H.M. Sobkowicz, J.M. Loftus, S.M. Slapnick // Acta Otolaryngol. Suppl.– 1993. – Vol. 502. – P. 3-36.

430

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

8. Differential distribution of stem cells in the auditory and vestibular organs of the inner ear / K. Oshima, C.M. Grimm, C.E. Corrales [et al.] // J. Assoc. Res. Otolaryngol. – 2007. – Vol. 8(1).– P. 18-31. 9. Bermingham-McDonogh O. Regulated reprogramming in the regeneration of sensory receptor cells / O. Bermingham-McDonogh, T.A. Reh // Neuron. – 2011. – Vol. 71(3). – P. 389-405. 10. Malgrange B. Differentiation, protection and regeneration of hair cells and auditory neurons in mammals / B. Malgrange // Bull. Mem. Acad. R. Med. Belg. – 2005. – Vol. 160(5-6). – P. 276-286. 11. Martinez-Monedero R. Stem cells for the replacement of inner ear neurons and hair cells / R. Martinez-Monedero, A.S. Edge // Int. J. Dev. Biol. – 2007. Vol. 51(6-7). – P. 655-661. 12. Senn P. Stem-cell-based approaches for treating inner ear diseases / P. Senn, S. Heller // HNO. – 2008. – Vol. 56(1). – P. 21-26. 13. Groves A.K. The challenge of hair cell regeneration / A.K. Groves//Exp.Biol.Med.(Maywood).–2010.–Vol.235(4).–P.434-446. 14. Li H. Pluripotent stem cells from the adult mouse inner ear / H. Li, H. Liu, S. Heller // Nat. Med. – 2003. – Vol. 9(10). P. 1293-1299. 15. Differentiation of inner ear stem cells to functional sensory neurons / R. Martinez-Monedero, E. Yi, K. Oshima [et al.] // Dev. Neurobiol. – 2008. - Vol. 68(5). – P. 669-684. 16. Directed differentiation of mouse cochlear neural progenitors in vitro / J. Lin, L. Feng, Y. Hamajima [et al.] // Am. J. Physiol. Cell Physiol. – 2009. – Vol. 296(3). – P. 441-452. 17. A comparison of the proliferative capacity and ultrastructure of proliferativecells from the cochleae of newborn rats of different ages / C. Zhong, Y. Han, J. Qiu [et al.] // Int. J. Pediatr. Otorhinolaryngol. – 2010. – Vol. 74(2). – P. 192-197. 18. Decreased level of cyclin A2 in rat cochlea development and cochlear stem cell differentiation / J. Chen, F. Wang, X. Gao [et al.] // Neurosci. Lett. – 2009. – Vol. 453(3). – P. 166-169. 19. Gunewardene N. The convergence of cochlear implantation with induced pluripotent stem cell therapy / N. Gunewardene, M. Dottori, B.A. Nayagam // Stem Cell Rev. – 2012. – Vol. 8(3). – P. 741-754.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

431

20. Transplantation of mouse induced pluripotent stem cells into the cochlea / K. Nishimura, T. Nakagawa, K. Ono [et al.] // Neuroreport. – 2009. – Vol. 20(14). – P. 1250-1254. 21. Regeneration of human auditory nerve. In vitro/in video demonstration of neural progenitor cells in adult human and guinea pig spiral ganglion / Н. Rask-Andersen, М. Boström, В. Gerdin [et al.] // Hear Res. – 2005. – Vol. 203(1-2). – P. 180-191. 22. Structure and locomotion of adult in vitro regenerated spiral ganglion growth cones - a study using video microscopy and .. SEM / М. Anderson, М. Bostrom, К.Pfaller [et al.] // Hear Res. – 2006. – Vol. 215(1-2). – P. 97-107. 23. Neural network and "ganglion" formations in vitro: a video microscopy and scanning electron microscopy study on adult .. cultured spiral ganglion cells // M. Bostrom, M. Anderson, D. Lindholm [et al.] // J. Otol. Neurotol. – 2007. – Vol. 28 (8). – P. 1109-1119. 24. Isolation and characterization of neural stem cells from the neonatal rat cochlear nucleus / K. Rak, N.V. Wasielewski, A.Radeloff [et al.] // Cell Tissue Res. – 2011. – Vol. 343(3). – P. 499-508. 25. Expression of Wnt receptors in adult spiral ganglion neurons: frizzled 9 localization at growth cones of regenerating neurites / S.M. Shah, Y.J. Kang, B.L. Christensen [et al.] / Neuroscience. – 2009. – Vol. 164(2). – P. 478-487. 26. The expression of NOB1 in spiral ganglion cells of guinea pig / Y. Han, L. Hong, C. Zhong [et al.] // Int. J. Pediatr. Otorhinolaryngol.- 2009. – Vol. 73(2). – P. 315-319. 27. Lef'ebvre P. Regeneration of hair cells and auditory neurons in the ear / P. Lef'ebvre, M.B. Malgrange, M.G. Moonen // Bull. Mem. Acad. R. Med. Belg. – 2008. – Vol. 163(7-9). - P. 391-397. 28. Sensory cell regeneration and stem cells: what we have already achieved in the management of deafness / P.V. Vlastarakos, T.P. Nikolopoulos, E. Tavoulari [et al.] // Otol. Neurotol. – 2008. – Vol. 29(6). – P. 758-768. 29. Diensthuber M. Characterization of stem cells derived from the neonatal auditory sensory epithelium // M. Diensthuber, S. Heller // HNO. – 2010. – Vol. 58(11). – P. 1056-1066.

432

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

30. Ozeki H. Development and regeneration of hair cells / Н. Ozeki, К. Oshima, Р. Senn [et al.] // Acta Otolaryngol. Suppl. – 2007. – Vol. (559). – P. 38-44. 31. Strategies to regenerate hair cells: identification of progenitors and critical genes / І. Breuskin, М. Bodson, N. Thelen [et al.] // Hear Res. – 2008. – Vol. 236(1-2). – P. 1-10. 32. Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells / К. Oshima, К. Shin, М. Diensthuber [et al.] // Cell. – 2010. – Vol. 141(4). – P. 704-716. 33. Warchol M.E. Sensory regeneration in the vertebrate inner ear: differences at the levels of cells and species / M.E. Warchol // Hear Res. – 2011. – Vol. 273(1-2). – P. 72-79. 34. Kelley M.W. Cellular commitment and differentiation in the organ of Corti / M.W. Kelley // Int. J. Dev. Biol. – 2007. – Vol. 51(6-7). – P. 571-583. 35. Hair cell progenitors: identification and regulatory genes / M. Bodson, I. Breuskin, P. Lefebvre [et al.] // Acta Otolaryngol. – 2010. – Vol. 130(3). – P. 312-317. 36. Rivolta M.N. Stem cells and cell lines from the human auditory organ: applications, hurdles and bottlenecks in the development of regenerative therapies for deafness / M.N. Rivolta // Drug Discov. Today. – 2010. – Vol. 15(7-8). – P. 283-286. 37. Nakagawa T. Cell therapy for inner ear diseases / T. Nakagawa, J. Ito // Curr. Pharm. Des. – 2005. – Vol. 11(9). – P. 1203-1207. 38. Bodmer D. Protection, regeneration and replacement of hair cells in the cochlea: implications for the future treatment of sensorineural hearing loss / D. Bodmer // Swiss. Med. Wkly. – 2008. – Vol. 138(47-48). – P. 708-712. 39. Jero J. Future therapeutic options for inner ear diseases / J. Jero, A. Aarnisalo // Duodecim. – 2011. – Vol. 127(8). – P. 848-853. 40. Liu Z. Cell cycle regulation in hair cell development and regeneration in the mouse cochlea / Z. Liu, J. Zuo // Cell Cycle. – 2008. – Vol. 7(14). – P. 2129-2133. 41. Oshima K. Isolation of sphere-forming stem cells from the mouse inner ear / K. Oshima, P. Senn, S. Heller // Methods Mol. Biol. – 2009. – Vol. 493. – P. 141-162.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

433

42. Cochlear stem/progenitor cells from a postnatal cochlea respond to Jagged1 and demonstrate that notch signaling promotes sphere formation and sensory potential / E. Savary, J.C. Sabourin, J. Santo [et al.] // Mech. Dev. – 2008. – Vol. 125(8). – P. 674-686. 43. Isolation and culture of hair cell progenitors from postnatal rat cochleae / S. Zhai, L. Shi, B.E. Wang [et al.] // J. Neurobiol. – 2005. – Vol. 65(3). – P. 282-293. 44. Otospheres derived from neonatal mouse cochleae retain the progenitor cell phenotype after ex vivo expansions / X.X. Lou, T. Nakagawa, H. Ohnishi [et al.] // Neurosci. Lett. – 2012. - Dec 10. pii: S0304-3940(12)01518-2. 45. Retention of progenitor cell phenotype in otospheres from guinea pig and mouse cochlea / J. Oiticica, L.C. Barboza-Junior, A.C. Batissoco [et al.] // J. Transl. Med. – 2010. – Vol. 8. – P. 119. 46. Notch regulation of progenitor cell behavior in quiescent and regenerating auditory epithelium of mature birds / N. Daudet, R. Gibson, J. Shang [et al.] // Dev. Biol. – 2009. – Vol. 326(1). – P. 86-100. 47. Zine A. Molecular mechanisms that regulate auditory haircell differentiation in the mammalian cochlea / A. Zine // Mol. Neurobiol. – 2003. – Vol. 27(2). – P. 223-238. 48. Notch-Hes1 pathway contributes to the cochlear prosensory formation potentially through the transcriptional down-regulation of p27Kip1 / J. Murata, T. Ohtsuka, A. Tokunaga [et al. ] // J. Neurosci. Res. – 2009. – Vol. 87(16). – P. 3521-3534. 49. Canonical Notch signaling is not necessary for prosensory induction in the mouse cochlea: insights from a conditional mutant of RBPjkappa / M.L. Basch, T. Ohyama, N. Segil [et al.] // J. Neurosci. – 2011. – Vol. 31(22). – P. 8046-8058. 50. Yamamoto N. Rbpj regulates development of prosensory cells in the mammalian inner ear / N. Yamamoto, W. Chang, M.W. Kelley // Dev. Biol. – 2011. – Vol. 353(2). – P. 367-379. 51. Notch signaling alters sensory or neuronal cell fate specification of inner ear stem cells / S.J. Jeon, M. Fujioka, S.C. Kim [et al.] // J. Neurosci. – 2011. – Vol. 31(23). – P. 8351-8358. 52. Sonic hedgehog (SHH) promotes the differentiation of mouse cochlear neural progenitors via the Math1-Brn3.1 signaling

434

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

pathway in vitro / X. Hu, J. Huang, L. Feng [et al.] // J. Neurosci. Res. – 2010. – Vol. 88(5). – P. 927-935. 53. Hes1 is a negative regulator of inner ear hair cell differentiation / J.L. Zheng, J. Shou, F. Guillemot [et al.] // Development. – 2000. – Vol. 127(21). – P. 4551-4560. 54. Zine A. Notch/Notch ligands and Math1 expression patterns in the organ of Corti of wild-type and Hes1 and Hes5 mutant mice / A. Zine, F. de Ribaupierre // Hear Res. – 2002. – Vol. 170(1-2). – P. 22-31. 55. Pfannenstiel S. Protection and regeneration of sensory epithelia of the inner ear / S. Pfannenstiel, M.Praetorius // HNO. – 2008. – Vol. 56(1). P. 13-20. 56. Kwan T. Development and regeneration of the inner ear / T. Kwan, P.M. White, N. Segil // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2009. – Vol. 1170. – P. 28-33. 57. Edge A.S. Hair cell regeneration / A.S. Edge, Z.Y. Chen // Curr. Opin. Neurobiol. – 2008. – Vol. 18(4). – P. 377-382. 58. Cell- and gene-therapy approaches to inner ear repair / M.M. de Felipe, A.F. Feijoo Redondo, J. García-Sancho [et al.] // Histol. Histopathol. – 2011. – Vol. 26(7). – P. 923-940. 59. Nestin-expressing cells in the developing, mature and noiseexposed cochlear epithelium / R. Watanabe, M.H. Morell, J.M. Miller [et al.] // Mol. Cell Neurosci. – 2012. – Vol. 49(2). – P. 104-109. 60. Stem/progenitor cells in the postnatal inner ear of the GFPnestin transgenic mouse / I.A. Lopez, P.M. Zhao, M. Yamaguchi [et al.] // Int. J. Dev. Neurosci. – 2004. – Vol. 22(4). – P. 205-213. 61. Expression of candidate markers for stem/progenitor cells in the inner ears of developing and adult GFAP and nestin promoterGFP transgenic mice / I. Smeti, E. Savary, V. Capelle [et al.] // Gene Expr. Patterns. – 2011. – Vol. 11(1-2). – P. 22-32. 62. Glial fibrillary acidic protein expression and promoter activity in the inner ear of developing and adult mice / C. Rio, P. Dikkes, M.C. Liberman [et al.] // J. Comp. Neurol. – 2002. – Vol. 442(2). – P. 156-162. 63. Liu X.W. Primary culture of neurospheres obtained from fetal mouse central nervous system and generation of inner ear hair cell immunophenotypes in vitro / X.W. Liu,J.W. Sun // J. Laryngol. Otol. – 2011. – Vol. 125(7). – P. 686-691.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

435

64. Wei D. Regeneration of the mammalian inner ear sensory epithelium / D. Wei, E.N. Yamoah // Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. – 2009. – Vol. 17(5). – P. 373-380. 65. Regenerating cochlear hair cells: quo vadis stem cell / K. Beisel, L. Hansen, G. Soukup [et al.] // Cell Tissue Res. – 2008. – Vol. 333(3). – P. 373-379. 66. Stem cells and molecular strategies to restore hearing / S. Pauley, B. Kopecky, K. Beisel [et al.] // Panminerva Med. – 2008. – Vol. 50(1). – P. 41-53. 67. Kopecky B. Regeneration of Hair Cells: Making Sense of All the Noise / B. Kopecky, B. Fritzsch // Pharmaceuticals (Basel). – 2011. – Vol. 4(6). - P. 848-879. Невідомі раніше стовбурові клітини виявили в слизовій оболонці язика людини. Опубліковано 15.02.2013. Дослідники з США виявили невідомі раніше стовбурові клітини, що є попередницями всіх основних типів смакових клітин. http://www.dimoz.kiev.ua/novini-medicini/nevidomi-ranishestovburovi-klitini-vijavili-na-jazici-ljudini.html

Орган смаку. Сприйняття смакових відчуттів тісно пов'язано зі смаковими бруньками, які розташовуються в сосочках верхньої і бічної поверхні язика. Смакова брунька являє собою кластер поляризованих сенсорних клітин, які вбудовані в епітелій ротової порожнини і складається з 40-60 клітин, серед яких розрізняють смакові чутливі епітеліоцити І, ІІ, ІІІ і ІV типу, опорні і основ ні (базальні) клітини [1]. Верхівки рецепторних клітин смакової бруньки і прилеглі до них епітеліоцити слизової оболонки ротової порожнини формують смакову пору [2, 3]. Слід зауважити, що відчуття смаку зумовлено експресією компонента трансдукції фосфоліпази Cbeta2 (PLCbeta2) як маркера диференціації [4]. При цьому чутливі смакові епітеліоцити містять рецептори G-білка і вторинні месенджери сигнальних механізмів [5, 6]. Стабільність смакових рецепторів ссавців підтримується за рахунок безперервного оновлення клітин, які постійно генеруються з клітин-попередниць протягом усього життя. Дорослі CК органу смаку на сьогоднішній день мало вивчені, хоча епітелій слизової оболонки язика має регенеративні властивості [7, 8].

436

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

За даними L.M. Stone et al. [9], стовбурова ніша клітин смакових бруньок розташовується в епітелії основи сосочка і для кожної смакової бруньки налічується приблизно 8 СК/клітинпопередниць (додаток 22). Вважалося, що середня тривалість життя смакових клітин становить приблизно 10 діб. Останніми дослідженнями встановлено, що різні клітини смакової бруньки мають різний термін життя. У жолобуватих сосочках клітини живуть від 2 діб до 3 тижнів. Серед них розрізнили два типи клітин - коротко- і триваложивучі [10]. У них визначали маркер ранньої диференціації Mash1 і встановили, що він експресується протягом 3 тижнів, а короткоживучі існують подібно до навколишніх епітеліоцитів. На основі одержаних останнім часом результатів учені дійшли висновку, що існують клітини навколо смакової бруньки, які експресують специфічні маркери СК такі як Lgr5. Ці клітини локалізуються на дні рівчачка навколо жолобуватих сосочків і в основі листоподібних сосочків і дають початок усім трьом основ ним типам клітин органу смаку в дорослих (смаковим чутливим, опорним і основним епітеліоцитам). Lgr5-експресуючі клітини задньої частини спинки язика є підмножиною кератин-14+ епітеліальних клітин [11]. Клітини-попередниці клітин смакової бруньки і в ембріональному, і в постембріональному розвитку експресують ВМР-4 (кісткові морфогенетичні білки 4) і Sox2. Їх багато в грибоподібних сосочках і мало в жолобуватих. Ці транскрипційні фактори мають значення в диференціації 3 типів смакових чутливих епітеліоцитів (І, ІІ і ІІІ типу) [12]. У диференціації клітин смакових рецепторів ембріона беруть участь три основних регуляторних гена: 1) Sonic Hedgehog - його експресують основні (базальні) клітини смакових рецепторів, що є сигналом для проліферації клітин-попередників, 2) Mash1, який експресують як чутливі смакові незрілі клітини II і III типу, так і зрілі клітини III типу, і 3) експресія нервовозалеж них генів у смакових бруньках [13, 14]. У дорослих мишей клітинна диференціація регулюється Wnt /β-катенін сигнальним шляхом і тим самим забезпечує регенерацію клітин смакової бруньки. Зниженням активності каноніч-

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

437

ної Wnt сигналізації в старих мишей можна частково пояснити втрату смакової чутливості і його причетності до сповільнення оновлення смакових чутливих епітеліоцитів [16, 16]. У смакових чутливих епітеліоцитах ІІ типу виявили імуногістохімічно Six1 і Six2 із сімейства генів, які експpесуються в різних тканинах, включаючи органи чуття, зокрема внутрішнє вухо і нюховий епітелій. Кількість таких клітин у дорослих після перерізки язикоглоткового нерва різко зменшується аж до повного їхнього зникнення [17,19]. У жолобуватих сосочках щурів поділ клітин спостерігали в базальному шарі епітелію, який локалізувався за межами смакових бруньок. Клітини-попередниці мігрували в апікальному напрямку вздовж сосочка і в них підтримувалася експресія цитокератину 14. У подальшому при диференціації в цих клітинах виявляли цитокератин 8. Зрілі клітини не виявляють імунореактивності цитокератину 14 [19]. Здійснені спроби культивувати клітини сосочків. Були виділені 3 лінії клітин: смакові, епітеліальні язика і мезенхімні. Отримані з сосочків клітини поміщали в колагеновий гель і з них утворювалися тривимірні кластери з порожниною всередині. Клітини між собою були пов'язані щільними контактами, містили структури з мікроворсинками і ламінін-позитивний шар навколо кластера. Клітини були подібні до епітеліоцитів і експресували білки смакових клітин - gustducin і NCAM [20]. Таким чином, смакові бруньки містять пул СК, самооновлюються і здатні до фізіологічної регенерації. • Матеріали опубліковані в статті Геращенко С.Б. Стовбурові клітини органа смаку (огляд літератури) / С.Б. Геращенко, Ю.Б. Чайковський, О.І. Дєльцова // Мат-ли міжнародної науковопрактичної конференції "Сучасний вимір медичної науки і практики" (24-25 травня 2013 р.). - Дніпропетровськ, 2013. - С. 6-9. Література 1. Perea-Martinez I. Functional cell types in taste buds have distinct longevities // I. Perea-Martinez, T. Nagai, N. Chaudhari // PLoS One. - 2013. - Vol. 8(1). - P.e53399.

438

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

2. Гістологія людини / [підруч. для студ. вищих мед. навч. закладів ІІІ-ІV рівнів акредитації] / О.Д. Луцик, А.Й. Іванова, К.С. Кабак, Ю.Б. Чайковський. - Київ:Книга плюс, 2010. - 584 с. 3. Establishment of clonal cell lines of taste buds from a p53 (-/-) mouse tongue / H. Sako, M. Hori, I. Masuho [et al.] // In Vitro Cell Dev. Biol Anim. - 2011. - Vol. 47(4). - P. 333-340. 4. Yamada Y. Development and cell dynamics of PLCbeta2 positive cells in mouse taste buds / Y. Yamada // Kokubyo Gakkai Zasshi. - 2005. - Vol. 72(1). - P. 62-70. 5. Palmer R.K. The pharmacology and signaling of bitter, sweet, and umami taste sensing / R.K. Palmer // Mol. Interv. 2007. - Vol. 7(2). - P. 87-98. 6. Kinnamon S.C. Taste receptor signalling - from tongues to lungs / S.C. Kinnamon // Acta Physiol (Oxf). - 2012. - Vol. 204(2).P. 158-168. 7. Miura H. Taste bud regeneration and the search for taste progenitor cells // H. Miura, L.A. Barlow // Arch. Ital. Biol. 2010.- Vol. 148(2). - P. 107-118. 8. Sullivan J.M. Stem and progenitor cell compartments within adult mouse taste buds / J.M. Sullivan, A.A. Borecki, S.Oleskevich // Eur. J. Neurosci. - 2010. - Vol. 31(9). - 1549-1560. 9. Stone L.M. Analysis of cell lineage relationships in taste buds / L.M. Stone, S.S. Tan, P.P.Tam // J. Neurosci. - 2002. - Vol. 22(11). - P. 4522-4529. 10. Hamamichi R. Taste bud contains both short-lived and long-lived cell populations // R. Hamamichi, M. Asano-Miyoshi, Y. Emori // Neuroscience. - 2006. - Vol. 141(4). - P. 2129-2138. 11. Lgr5-EGFP Marks Taste Bud Stem/Progenitor Cells in Posterior Tongue // K.K. Yee, Y. Li, K.M. Redding [et al.] // Stem Cells. - 2013. - Vol. 31(5). - P. 992-1000. 12. Expression of the basal cell markers of taste buds in the anterior tongue and soft palate of the mouse embryo / A. Nakayama, H. Miura, Y.Shindo [et al.] // J. Comp. Neurol. - 2008. - Vol. 509(2). P. 211-224. 13. Co-expression pattern of Shh with Prox1 and that of Nkx2.2 with Mash1 in mouse taste bud / H. Miura, Y. Kusakabe, H. Kato [et al.] //Gene Expr. Patterns. - 2003. - Vol. 3(4). - P. 427-430.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

439

14. Miura H. Cell lineage and differentiation in taste buds / H. Miura, S. Kusakabe, S. Harada // Arch. Histol. Cytol. - 2006. - Vol. 69(4). - P. 209-225. 15. Iwatsuki K. Wnt signaling interacts with Shh to regulate taste papilla development // K.Iwatsuki, H.X. Liu, A. Grónder [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. - 2007. - Vol. 104(7). - P. 2253-2258. 16. Gaillard D. Taste bud cells of adult mice are responsive to Wnt/β-catenin signaling: implications for the renewal of mature taste cells / D. Gaillard, L.A. Barlow // Genesis. - 2011. - Vol. 49(4). - P. 295-306. 17. Suzuki Y. Expression of Six1 and Six4 in mouse taste buds / Y. Suzuki, K.Ikeda, K. Kawakami // J. Mol. Histol. - 2010. - Vol. 41(4-5). - P. 205-214. 18. Suzuki Y. Expression of Sox2 in mouse taste buds and its relation to innervation / Y. Suzuki // Cell Tissue Res. - 2008. - Vol. 332(3). - P. 393-401. 19. Asano-Miyoshi M. Cytokeratin 14 is expressed in immature cells in rat taste buds / M. Asano-Miyoshi, R. Hamamichi, Y. Emori // J. Mol. Histol. - 2008. - Vol. 39(2). - P. 193-199. 20. Nguyen H. M. Differential expression of a BMP4 reporter allele in anterior fungiform versus posterior circumvallate taste buds of mice / H.M. Nguyen, L.A. Barlow // BMC Neurosci. - 2010. Vol. 11. - P.129. Орган нюху. У нюховій частині слизової оболонки носової порожнини існує можливість відновлення епітелію і нюхового нерву після його пошкодження під впливом декількох факторів росту – TGF-α, FGF2, ВМР і TGF-β. Реіннервація нюхових цибулин у тварин швидка і надійна з відновленням нюхових рецепторів на поверхні клітин нюхових клубочків, які розташовуються у вигляді кластерів із клубочкових клітин [1]. У нюховому епітелії дорослих містяться ніші з проліферуючими клітинами трьох типів клітин – СК і двома популяціями клітин–попередниць у базальній частині епітелію, які в подальшому розвиваються в два типи гліоцитів і клітини, які оточують нюховий нерв [2]. При бульбектомії останні можуть мігрувати з периферійної ділянки нюхового нерва і заповнювати нюхову цибулину [3].

440

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

У нюховому епітелії дорослих серед базальних клітин виділили горизонтальні базальні клітини, як нейральні СК. Динаміку роз витку СК, як і в інших епітеліях, регулює транскрипційний фак тор р63 з родини р53 – супресорів пухлин. Його дія проявляється в обмеженні клітинної диференціації при самооновленні нюхових СК, що дає підстави для правильного розуміння цих процесів [4]. Поєднання методів маркування, імуноцитохімії, електронної мікроскопії, функціональної візуалізації кальцію і бромдезоксиуридину (BrdU) виявило експресію пуринергічних рецепторів у базальних клітинах і нуклеотид–індукованої Ca (2+) сигналізації в цих клітинах, які беруть участь у регуляції клітинного оновлення в нюховому епітелії [5]. Показано, що регулювання нюхового нейрогенезу критично залежить від декількох сигнальних молекул із двох різних факторів росту – фібробластів і трансформуючого фактора росту β. Ці молекули, по-перше, регулюють проліферацію та диференціа цію і, по-друге, відіграють ключову роль у зворотному зв'язку, обумовлюють об'єми пулів клітин–попередниць і таким чином і кількість нейронів у процесі розвитку і регенерації [6]. У дорослих тварин у регуляції спеціалізації, міграції та диференціації нюхового епітелію значну роль відіграє транскрипційний фактор Рах6 [7]. Транскрипційні фактори Sox2 і Рах6 виявлені в декількох видах клітин нюхового епітелію – опорних і основних (базальних) епітеліоцитах. Нюховий епітелій миші є ідеальною моделлю системи регенерації нервових структур. У нейронній лінії нюхового епітелію розглядають 4 етапи розвитку нейральних СК: 1) СК, локалізуються в базальному шарі епітелію і експресують Sox2. Ті з них, які взяли на себе зобов'язання перетворитися на нейрони, ранні клітини–попередниці експресують пронейральний ген Mash1; 2) останні проліферують і переходять у стадію транзитних (безпосередніх) клітин–попередниць і експресують другий пронейральний ген NGn1, 3) дочірні від останніх клітини піддаються кінцевій (термінальній) диференціації в постмітотичні клітини і експресують NCAM [8]. Як і в інших епітеліях, диференціація відбувається від базального шару до поверхневого. Автори зауважили, що при

ни є більш ефективними для приживлення мультипотетних попередниць, порівняно з культуральними [11]. Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

441

культивуванні клітин епітелію без сироватки, вони інтенсивно проліферують протягом 1-2 діб, а після цього швидко втрачають здатність до нейрогенезу. Це спостереження викликало численні дослідження Ранні клітиниMASH1 для пошуку сигнальних впливів, попередниці важливих для самооновлення і підтримки нейрогенного потенціалу нюхового епітелію (рис. 28). Із нюхової ділянки слизової обоКлітиниNgn1 лонки носової порожнини можна попередниці селективно виділити і культивувати клітини–попередниці з різними маркерами (нейральні і не–нейральні) із подальшою трансплантацією Нюхові в пошкоджену слизову оболонку NCAM+ нейросекреторні для відновлення нюхових клітин епітеліоцити [9, 10]. Використовуються методи створення плаваючих культур у виРис. 28. нервових Етапи диференціації тапи диференціації стовбурових гляді клітиннейросфер. нюхового Найкраще нюхові нервових стовбурових клітин нейросфери розвиваються від клінюхового епітелію. тин новонароджених, а від дорослих an et al. [12] ізолювали і культивували популяцію клітин утворюється У клітинах сфер локалізуються клітини з ю від трупів дорослихмало і відсфер. пацієнтів, які перенесли маркерами (цитокератинами), иносових епітеліальними пазухах, і виявили, що вона представлена нейрон–специфічедницями нейронів і гліоцитів. Клітини–попередниці з цих ними антигенами, E–кадгеринами, Sox2 і Sox9. Клітини сфер, ували розмножуватися і формували нейросфери з нестин+ вирощених у кондиціонованому середовищі (із використанням ри використали клональний і популяційний аналізїхньої для трансплантації вифорбол-активованого ефіру LM) після сів самооновлення і визначення мультипотентності клітин. являють виражену проліферацію. Вони є більш ефективними для ність клітин визначали за допомогою бромдезоксиуридину приживлення нюхових клітин-попередниць, пофікації нейронів і гліоцитівмультипотетних використовували різні антитіла: рівняно молекули з культуральними ипів III, нейронні клітинної [11]. адгезії (NCAM) і M. Othman al.астроцитів [12] ізолювали і культивували популяцію з мікротрубочками (MAP2), et для – GFAP, для клітин нюхового епітелію від трупів дорослих і від пацієнтів, – galactocerebroside (Galc). У результаті спостережень пресія нестина кожним поділом зменшується, але авторипазухах, і виявили, які зперенесли операцію на приносових к, що отримані клітини можуть служити унікальним що вона представлена клітинами–попередницями нейронів і гліоцитів. Клітини–попередниці з цих культур продовжували розмножуватися і формували нейросфери з нестин+ клітиSox2

Стовбурові клітини

442

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

нами. Автори використали клональний і популяційний аналіз для визначення процесів самооновлення і мультипотентності клітин. Мітотичну активність клітин оцінювали за допомогою бромдезоксиуридину (BrdU). В ідентифікації нейронів і гліоцитів використовували різні антитіла: SS–тубуліну ізотипів III, нейронні молекули клітинної адгезії (NCAM) і білки, пов'язані з мікротрубочками (MAP2), для астроцитів – GFAP, для олігодендроцитів – galactocerebroside (Galc). У результаті спостережень виявлено, що експресія нестина з кожним поділом зменшується, але автори зробили висновок, що отримані клітини можуть служити унікальним джерелом нейральних клітин–попередниць для майбутніх стратегій заміни клітин при лікуванні нейротравм і нейродегенеративних захворювань. Нюхова слизова оболонка може стати джерелом отримання дорослих нейральних СК із метою вивчення молекулярних аномалій у мозку при різних захворюваннях. Вона є доступною для забору біопсійного матеріалу і забезпечує "відкрите вікно" у дорослої людини для виконання порівняльного аналізу – геномного, транскриптомного, епігеномного, протеомного [13]. Цікавими виявилися спроби автологічної трансплантації нервових клітин нюхової цибулини або нюхової ділянки слизової оболонки носової порожнини для регенерації пошкодженого спинного мозку і периферійного нерва у тварин, і встановлено, що вони здійснюють нейротрофічну і нейропротекторну дію через секрецію хемокінів [14, 15]. За останніми даними, у регенераційних процесах у спинному мозку при пересадці клітин зі слизової оболонки велику роль відіграють мезенхімні СК власної пластинки слизової оболонки, що було показано в дослідах in vitro. У кондиціонованих середовищах ефект промієлінізації був виразнішим, у порівнянні з фібробластами [16]. Тобто, можна отримати нюхові СК, виростити їх у культурі у вигляді нейросфер, трансплантувати/імплантувати при травматичних і нейродегенеративних пошкодженнях ЦНС і обійти етичні проблеми використання ембріональних СК чи донорських СК [17]. Використання малоінвазивних методів виділення нюхового епітелію людини має важливе значення для клінічної практики, оскільки він стає джерелом автологічних клітин для

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

443

трансплантації і виключає імунну реакцію відторгнення, ризик передачі вірусних інфекцій і генетичних дефектів, які можуть бути пов'язані з алотрансплантацією [18]. • Матеріал опубліковано в статті Геращенко С.Б. Нюхові нервові стовбурові клітини (нейрогенез у дорослих) / С.Б. Геращенко, О.І. Дєльцова, Ю.Б. Чайковський // Вісник морфології.2013.- №2, Т.19. - С. 456-462. Література 1. Schwob J.E. Neural regeneration and the peripheral olfactory system / J.E. Schwob // Anat. Rec. – 2002. – Vol. 269(1). – P. 33–49. 2. Identification and molecular regulation of neural stem cells in the olfactoryepithelium / C.L. Beites, S. Kawauchi, C.E. Crocker [et al.] // Exp. Cell Res. – 2005. – Vol. 306(2). – P. 309–316. 3. Two phases of replacement replenish the olfactory ensheathing cell population after injury in postnatal mice / F. Chehrehasa, J.A. Ekberg, K. Lineburg [et al.] // Glia. – 2012. – Vol. 60(2). – P. 322–332. 4. p63 regulates olfactory stem cell self-renewal and differentiation / R.D. Fletcher, M.S. Prasol, J. Estrada [et al.] // Neuron. – 2011. – Vol. 72(5). – P. 748–759. 5. Purinergic signaling regulates cell proliferation of olfactory .. epithelium progenitors / T. Hassenklover, P. Schwartz, D. Schild [et al.] // Stem Cells. – 2009. – Vol. 27(8). – P. 2022–2031. 6. Molecular signals regulating proliferation of stem and progenitor cells in mouse olfactory epithelium / S. Kawauchi, C.L. Beites, C.E. Crocker [et al.] // Dev. Neurosci. – 2004. – Vol. 26(2– 4). – P. 166–180. 7. Nomura T. Role of a transcription factor Pax6 in the developing vertebrate olfactorysystem / T. Nomura, H. Haba, N. Osumi // Dev. Growth Differ. – 2007. – Vol. 49(9). – P. 683–690. 8. Feedback Regulation of Neurogenesis in the Mammalian Olfactory Epithelium: New Insights from Genetics and Systems Biology / K.K. Gokoffski, S. Kawauchi, H.H. Wu [et al.] // In "The Neurobiology of Olfaction". – Boca Raton (FL): CRC Press; 2010.– Chapter 10.

444

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

9. Othman M.M. Identification and culture of olfactory neural progenitors from GFP mice / M.M. Othman, K.M. Klueber, F.J. Roisen // Biotech. Histochem. – 2003. – Vol. 78(2). – P. 57–70. 10. Chen X. Multipotency of purified, transplanted globose basal cells in olfactoryepithelium / X. Chen, H. Fang, J.E. Schwob // J. Comp. Neurol. – 2004. – Vol. 469(4). – P. 457–474. 11. Krolewski R.C. The generation of olfactory epithelial neurospheres in vitro predicts engraftment capacity following transplantation in vivo / R.C. Krolewski, W. Jang, J.E. Schwob // Exp. Neurol. – 2011. – Vol. 229(2). – P. 308–323. 12. Clonal analysis of adult human olfactory neurosphere forming cells / M. Othman, C. Lu, R. Klueber [et al.] // Biotech. Histochem. – 2005. – Vol. 80(5–6). – P. 189–200. 13. Isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans / S.D. Girard, A. Dev'eze, E. Nivet [et al.] // J. Vis. Exp. – 2011. – Vol. (54). – P. 2762. 14. Combined transplantation of neural stem cells and olfactory ensheathingcells for the repair of spinal cord injuries / Q. Ao, A.J. Wang, G.O. Chen [et al.] // Med. Hypotheses. – 2007. – Vol. 69(6).– P. 1234–1237. 15. Transplantation of olfactory ensheathing cells as adjunct cell therapy for peripheral nerve injury / C. Radtke, K. Wewetzer, K. Reimers [et al.] // Cell Transplant. – 2011. – Vol. 20(2). – P. 145–152. 16. Human mesenchymal stem cells isolated from olfactory biopsies but not bone enhance CNS myelination in vitro / S.L. Lindsay, S.A. Johnstone, J.C. Mountford [et al.] // Glia. – 2013. – Vol. 61(3). – P. 368–382. 17. The therapeutic potential of human olfactory–derived stem cells // C.T. Marshall, C. Lu, W. Winstead [et al.] // Histol. Histopathol. – 2006. – Vol. 21(6). – P. 633–643. 18. Multipotent stem and progenitor cells of the olfactory epithelium / I.V. Viktorov, E.A. Savchenko, O.V. Ukhova [et al.] // Bull. Exp. Biol. Med. – 2006. – Vol. 142(4). – P. 495–502.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

445

Система для швидкого відтворення двохшарових моделей шкіри створена в 2011 році в Інституті інженерії і біотехнології імені Фраунгофера, згідно якої клітини шкіри людини вирощуються в лабораторії і поміщаються на колагеновий каркас. http://telegrafist.org/2013/07/25/74529 Групі науковців із Токійського університету вдалося перетворити стовбурові клітини на волосся та пересадити їх мишам. Опубліковано 19.04.2012. http://24tv.ua/home/showSingleNews.do?yaponski_vcheni_ peretvorili_stovburovi_klitini_na_volossya&objectId=210881&yapons ki_vcheni_peretvorili_stovburovi_klitini_na_volossya

3.10. Загальний покрив організму Шкіра утворює зовнішній покрив тіла, складається з епідермісу, власне шкіри (дерми) і гіподерми та має похідні – волосся, потові і грудні залози, сальні залози і нігті. Шкіра виконує багато важливих функцій – захисну, чутливу, бере участь в обміні води та електролітів, газо– і теплообміні, є місцем синтезу і депонування вітаміну D, має екскреторну функцію, є суцільним рецепторним полем [1]. Cьогодні активізуються зусилля на розробку медичних заходів для захисту від радіаційного, температурного, токсичного, травматичного пошкодження шкіри, а також її злоякісних пухлин, які часто стають неконтрольованими, і тільки хірургічні втручання є останнім варіантом лікування, що часто призводить до інвалідності. Розробка стратегій, покликаних сприяти лікуванню таких пошкоджень за допомогою стовбуровоклітинних технологій є одним із основних напрямів розробки нових терапевтичних схем лікування цих захворювань. Епідерміс є багатошаровим плоским зроговілим епітелієм. До його епітеліального (епідермального) диферону входять базальні клітини (СК епідермісу, клітини–попередниці кератиноцитів), шипуваті, зернисті та лускаті кератиноцити (епідермальні корнеоцити), зроговілі лусочки. Епідерміс належить до тканин, які швидко самооновлюються, повне його відтворення триває 10-30 діб [2 - 4] (рис. 29). СК шкіри дорослих – мультипотентні, локалізуються в різних нішах, мають конкретні молекулярні і функціональні озна-

ділянках, волосини – у валику бруньки і в перeшийку волосяного фолікула [7].

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

446

Роз'єднаний шар Роговий шар Зернистий шар Шипуватий шар

Диференціація Notch, C/EBPα/β PPARα, AP2α/γ Проліферація с-Myc, β1 integrin, p63, TGFα, TGFβ(-)

Епідерміс. Основний шар. Стовбурові клітини

? Стовбурові клітини валика бруньки волосяного фолікула

Стовбурові клітини зовнішньої кореневої піхви

Проліферація BMP(-) hedgehog NFATc1(-) PTEN(-) Стрижень волоса. Клітини внутрішньої кореневої піхви

Диференціація ВКП: Notch, BMP, CDP, GATA3 СВ: Wnt, Lef1, Notch EM: Mcx1/2, Ovo1,

Проліферація Blimp1(-), c-Myc Shh, Wnt(-) Диференціація PPARγ Сальна залоза

Рис. 29. Самооновлення і диференціація стовбурових клітин шкіри. Позначення: ВКП - внутрішня коренева піхва, СВ - стрижень волоса, ЕМ - епіте Рис. 28. Самооновлення і диференціація стовбурових клітин шкіри. ліальний матрикс.

Позначення: ВКП - внутрішня коренева піхва, СВ - стрижень волоса,

ки. СК та їхніЕМ клітини–попередниці підтримують дискретні епі- епітеліальний матрикс. дермальні компартменти, aле точні механізми, які контролюють баланс між проліферацією і диференціацією епідермальних СК залишаються маловивченими [5].

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

447

I.A. Ivanova et al. [6] вважають, що центральне місце в контролі клітинної проліферації епідермальних СК посідає E2F транскрипційний фактор регyляторної мережі. Його порушення може призвести до трансформації в пухлини. СК епідермісу знаходяться в інтерфолікулярних ділянках, волосини – у валику бруньки і в перeшийку волосяного фолікула [7]. У базальному шарі інтерфолікулярних ділянок епідермісу містяться базальні СК/епідермальні попередниці базальних кера тиноцитів, основна роль яких полягає у фізіологічному оновленні епідермісу [8]. Тут для них створені ніші, які включають СК, їх потомство і елементи мікрооточення, що координують нормальну і гомеостатичну продукцію функціонально зрілих клітин [9 - 11]. У межах епідермальної ніші клітини знаходяться під впливом розчинних біохімічних інгредієнтів, матриксних лігандів, визначеного рН і напруження кисню, молекул міжклітинної взаємодії, механічних та електричних факторів [12, 13]. Одним із перших маркерів передбачуваних СК епітелію шкіри людини визначили β1 інтегрин [14] і α6 інтегрин [15]. Крім них потенційним маркером СК епідермісу E. Fuchs, V. Horsley [16] вважають р63. Для шкіри потужною стовбуровою нішею є валик бруньки волосяного фолікула (додаток 23), за рахунок клітин якої відбувається її ріст і регенерація волосини. До цього часу вважали, що СК для волосяного фолікула знаходяться в матриксі волосини (волосяна цибулина, бульбарна частина фолікула). Нині доведено, що СК, які локалізуються у валику бруньки волосяного фолікула, є потенціалом, який започатковує СК/клітини–попередниці, що мігрують у напрямку матриксу волосини для регенерації волосяного фолікула при його постійному переході від анагени (І фаза, період росту) через фазу катагени (ІІ фаза, перехід від анагени до телогени) до фази телогени (ІІІ фаза, період спокою) [17 - 21, 13]. СК цієї ніші характеризуються мультипотентністю і високим потенціалом проліферації, їх можна культивувати для тканинної інженерії придатків шкіри. У телогені в СК волосяної ніші експресується фактор росту фібробластів (FGF), який регулює цикл росту волосини [22]. На ранніх стадіях розвитку волосяного фолікула в дорослих мишей маркером СК є MTS24 [23]. СК собаки і миші також ло-

448

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

калізуються у валику бруньки волосяного фолікула, звідки випливає унікальна можливість пристосування цих знань для дослідження створених моделей захворювань у людини [24, 25]. СК валика бруньки волосяного фолікула людини експресують CD200+, PHLDA1+, follistatin, клітини за межами валика – CD24+, CD34+, CD71+, CD146+ [26]. K.K. Lin, B. Andersen [27] виявили, що СК із валика бруньки експресують Lgr5, який характерний для кишкових СК, але вони локалізуються за межами валика бруньки. Ці клітини активно проліферують, є мультипотентними, можуть породити нові фолікули і зберегти всі клітинні лінії з волосяного фолікула протягом тривалого часу [28, 29]. Нещодавно H.J. Snippert et al. [30] ідентифікували Lgr6 – близького родича Lgr5 у ранніх ембріональних волосяних зачатках. У дорослих Lgr6 виявили в клітинах міжфолікулярних ділянок епідермісу і сальних залоз, на підставі чого зробили висновок що клітини, які експресують Lgr6 є "найпримітивнішими" СК. Найбільш позитивними маркерами у волосяних фолікулах шкіри голови людини є К15+, К19+ і CD200+, водночас негативними маркерами - CD34, сonnexin43 і нестин [31]. K. Inoue et al. [32] запропонували спочатку сортувати СК за маркерами CD200+, CD34+. Для уточнення і порівняння далі визначати маркери клітин базальної: K15+, CD200+, CD34–, CD271– і супрабазальної: К15–, CD200+, CD34–) Cd271– ділянок валика бруньки. Автори виявили, що в субпопуляції CD200+, CD34– клітини мали більш високу колонієутворювальну здатність. Ці маркери корисні для характеристики біомаркерів свіжовиділених клітин волосяного фолікула в людини на різних стадіях їхнього диференціювання. Раніше C.S. Trempus et al. [33] показали, що СК у валику бруньки волосяного фолікула, марковані CD34+, знаходилися в G0/ G1 фазах, а CD34– y G2/M i S фазах клітинного циклу. До того ж у CD34+ і кератин-6+ клітин був більшим вміст α6-інтегрину, a кератин6+ клітини утворювали великі колонії при посіву в культурі. Розвиток і регенерація волосяних фолікулів залежать від міжклітинних взаємодій і сигналів, спрямованих на СК та їх найближчих нащадків, але часто при цьому поведінка СК є не-

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

449

зрозумілою [34]. Активація СК волосяного фолікула є циклічною і включає періодичну активність β–катеніну, ВМР-2, BMP4 (bone morphogenetic protein), p63, TGF-β, Tcc i Wnt [35, 36, 13]. β–катенін-індуковані фолікули містять клоногенні кератиноцити, які експресують маркери СК валика бруньки фолікула. Hовоутворені фолікули, у свою чергу, індукують ріст дермальних сосочків, забезпечують нішу для меланоцитів і підлягають 4ОНТ–залежним циклам росту і регресії [37]. ВМР у цей час пригнічують активацію та експансію СК з епідермальних ніш. Антагоніст ВМР – Noggin звільняє епітеліальні клітини епідермісу від ВМР–опосередкованого обмеження, що призводить до ініціації анаген–фази [38]. Перехід від телоген–фази до анаген–фази волосяного фолікула контролюється ВМР і трансформуючим фактором росту β (TGF-β) сигнальних шляхів. Нові дослідження показують, що TGF18 сигналізація в СК волосяного фолікула здійснює синергічний ефект із ВМР–опосередкованою рефрактерністю, тоді як TGF-β2 сигналізація – його врівноважує. Втрата TGF18 сигналу помітно прискорює ініціацію анагену, тоді як втрата TGF–β2 сигналу значно сповільнює його, підтримуючи ключову роль цих шляхів у часовому циклі волосся [35]. Тобто, підтверджується думка L.Yang, R.Pang [39] про те, що ВМР і TGF–β шляхи є необхідними для підтримки стабільності стовбурової ніші во лосини. Важливим є питання обмеження мітотичного поділу СК валика бруньки волосяного фолікула для виникнення надмірної регенерації епідермісу. Notch сигнальний шлях контролює перехід і диференціацію цих клітин в епідерміс [40]. Стало відомо, що Sox9 не є обов'язковим для волосся, але він спрямовує диференціацію клітин зовнішньої кореневої піхви і є необхідним для формування компартменту СК волоса. Було виявлено, що цей ген долучається до виникнення базальноклітинної карциноми шкіри [41, 42]. При пошкодженні шкіри за необхідності клітини–попередниці з валика бруньки волосяного фолікула можуть взяти участь "у ремонті" епідермісу, але вони не є типовими для забезпечення гомеостазу епідермісу [43, 44]. Численні внутрішні і зовнішні фактори впливають на активність і характеристики

450

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

клітин валика волосяної бруньки і, ймовірно, додають свій внесок у розвиток пухлин шкіри. Серед СК валика бруньки волосяного фолікула виявили СК із маркером нестин–GFP. Цікаво, що при експлантації цих клітин in vitro виникають нейросферо–подібні структури і, якщо піддати їх певним умовам подальшого розвитку, вони диференцію ються на нейрони, астроцити, олігодендроцити, гладкі міоцити, адипоцити та клітини інших фенотипів [45]. В останній час дослідники сходяться в думці, що у валику бруньки волосяного фолікула локалізуються також і СК меланоцитів, звідки клітини–попередниці мігрують у двох напрямках – до епідермісу і до волосяної цибулини [46, 47]. У мишей виживання, проліферація і диференціація меланоцитів, які регулюються мікрооточенням, відбуваються в нішах волосяного фолікула [48]. Ці СК забезпечують волосину пігментом при кожному циклі її розвитку [49]. Анатомічна ніша СК меланоцитів вивчена недостатньо, хоча це необхідно для подальшого розуміння розвитку більш ефективних стратегій лікування пухлин, які походять із них [50]. У ніші виявлено колаген XVII (COL 17a1/BP180/BPAG2), який потрібний для підтримки як СК волосяного фолікула, так і меланоцитів [51]. Одні з авторів вказують на окрему локалізацію ніш для СК волосяного фолікула і меланоцитів [52], інші пишуть за спільну нішу для цих клітин [53]. Розвиток меланоцитів знаходиться під контролем складної мережі транскрипційних факторів – Pax3, Sox10, MITF i Wnt сигналу. Pax3 і MITF регулюють баланс між вмістом меланіну і сивим волоссям, що потребує подальшого вивчення [54]. Синтез меланіну у волосяному фолікулі строго пов'язаний зі зростанням фази циклу росту волосини і переривається під час регресії фолікула (катаген–фаза) і відпочинку [55]. На звання маркерів СК меланоцитів претендують Kit+, Fzd4+, Fzd7+. Дослідники показали, що Kit маркує меланобласти (клітини–попередниці меланоцитів). Kit+ (CD117+) є рецептором, який задіяний у клітинній сигнальній трансдукції в різних типах клітин, що призводить до активації інших транскрипційних факторів із регулюванням апоптозу, клітинної диференціа-

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

451

ції, проліферації, хемотаксису та клітинної адгезії [56, 57]. Гени, які кодують Kit i Kit–ліганд відіграють суттєву роль у диференціації меланобластів і в підтримці вмісту меланіну у волосяному фолікулі людини протягом циклу в анаген–фазі і беруть участь у фізіологічному старінні пігментного механізму волосини [58]. При цьому в регуляцію експресії Kit активно залучається ВМР– 4 [59]. Порушення c–Kit/сигнального фактору СК перешкоджає виживанню, міграції та диференціації меланоцитів при формуванні пігментації волосини [60]. Щодо клітин із маркерами Fzd4+, Fzd7+, то для них потрібен більш тривалий час для диференціації в культурі, ніж із Kit+, вони є більш незрілими і тому, можливо, виправдовують статус СК меланоцитів [61]. При кількісному імуногістохімічному аналізі виявили лінії маркерів меланоцитів в епідермісі, лійці волосини, волосяній цибулині (матриксі) і в середній частині зовнішньої кореневої епітеліальної піхви [62]. Загалом, меланогенез епідермальних і волосяних меланоцитів різняться. Циклічні конструкції на шкірі голови нормально функціонують протягом лише 10 циклів волосся, тобто приблизно до 40 років життя. Після цього відбувається генетичне виснаження пігментного потенціалу кожного волосяного фолікула, що проявляється посивінням. В епідермісі такі процеси відтерміновані [63]. Стан меланобластів регламентується міжклітинними взаємодіями з епідермальними кератиноцитами, хоча точні механізми ще недостатньо вивчені. Вважають, що Notch сигнальний шлях підтримує СК меланоцитів, відіграє вирішальну роль у виживанні незрілих меланобластів шляхом запобігання ініціювання апоптозу [64], регулює гомеостаз і диференціацію меланоцитів під час циклічного розвитку волосяного фолікула [65], Notch1 i Notch2 співпрацюють для регуляції гомеостазу меланоцитів після народження в дорослих [66]. Notch, беручи участь у диференціації меланоцитів, не дозволяє їхнього дострокового дозрівання раніше, ніж вони досягнуть волосяної цибулини [67]. Цікавими є результати дослідження L. Li et al. [68, 69], які виділили з шкіри новонароджених із ділянки передньої шкірочки статевого члена (крайньої плоті) при відсутності волосяних фолікулів мультипотентні дермальні СК і в культурі виростили

452

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

їхньої лінії з диференціацією в меланоцити. Для цих клітин типовою була тривимірна модель (утворення сфер) із клітинами, які мали маркери NGF Rp75, нестин і Оct4 – спільні з похідними нервового гребеня. Автори вважають, що це клітини, що здатні мігрувати з дерми в епідерміс, поселятися серед базальних клітин базального шару епідермісу і диференціюватися в меланоцити. Дерма складається з гетерогенних матриць колагену, еластину і глікозаміногліканів. Шкірний блок містить унікальні популяції клітин–попередниць, які характеризуються фактором транскрипції Sox2. Sox2–експресуючі клітини по'вязані з Wnt, Bmp сигнальними шляхами і фактором росту фібробластів, тоді як Sox2– клітини використовують Shh, інсуліноподібний фактор росту (IGF) та інтегрин. Ці клітини in vitro можуть бути диференційовані в адипоцити, гладкі міоцити та нейрони і беруть участь у відновленні шкірних сосочків. Периваскулярні сайти, переважно, біля волосяних фолікулів дерми можуть діяти, як ніші з вмістом СК мезенхімного походження: маркери NG2 – перицитів і CD34 – клітин гематопоетичного генезу [13]. У гіподермі визначають жирову нішу, мультипотентні клітини якої тісно пов'язані з периваскулярним оточенням і створюють потенціал для диференціації гладких міоцитів, ендотеліоцитів, адипоцитів, хрящової та кісткової тканин. Їхніми маркерами є STRO–1, Wnt5a, SSEA1. Регулюючу дію тут виконують VEGF (фактор росту ендотелію судин), FGF2 (фактор росту фібробластів), BMP-2 (кістковий морфогенетичний білок) i MMP (металопротеїнази) разом із PDGFR-β (тромбоцитарний фактор росту) [13]. Щодо сальних залоз шкіри існує погляд, що за відновлення себоцитів відповідають уніпотентні СК, які локалізуються у валику бруньки волосяного фолікула. Автори виявили, що кожний себоцит із маркером SZ95, який пройшов клональний ріст у культурі, може диференціюватися в себоцит або ж у клітину, яка експресує інволукрин і корніфін – маркери клітин міжфолікулярного епітелію і волосяного сосочка [70 - 72]. У постнатальному періоді в дорослих у сальних залозах виявили клітини з маркером Lgr6 [30]. Маркером популяції уніпотентних клітин–попередниць себоцитів запропоновано BLIMP1 (factor

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

453

B lymphocyte–induced maturation protein1), який регулює їхній розмір і активність [73], хоча К. Sellheyer, D. Krahl [74] не погоджуються з цим. Типовим маркером для себоцитів, які знаходяться в процесі диференціації в шкірі людини, є маркер MC5R (рецептор мелакортину) [75, 76]. Мелакортини зв'язуються з ре цепторами і мелакортиновий сигнал через збільшення цАМФ викликає біологічні ефекти [77]. Серед сигнальних шляхів для розвитку себоцитів називають Sonic hedgehog [78]. У такому придатку шкіри, як потова залоза, спостерігали клітини з ознаками стовбуровості в їхніх протоках (мульти потентні) і в кінцевому секреторному відділі (уніпотентні) [79]. Універсальний маркер СК CD133+ у людини виявили в секретуючих і протокових клітинах [80] на фоні епітеліоцитів, які експресують цитокератини 8, 18, 19, характерні для епітеліальної тканини [84, 41, 3]. Як показали A.E. Petschnik et al. [69], СК потових залоз також експресують нестин. Були зроблені спроби культивувати СК потових залоз людини, отриманих із пахвової ділянки. Вони утворювали сферичні структури з трубочкою всередині, але загалом, регенерація потових залоз вивчена мало [72, 53]. Важливу роль у відновленні епідермісу і придатків шкіри відіграють скоординовані дії різних факторів і серед них стабільний морфо–функціональний стан власне шкіри. У розвит ку і оновленні мезенхімних за походженням клітин шкірних сосочків бере участь епідермальний PDSF–A (тромбоцитарний фактор росту), а Sonic hedgehog викликає "збірку" шкірних сосочків [46]. Частково за індуктивність клітин шкірного сосочка відповідають ВМР–6 і Wnt3a [25]. У шкірі ссавців фактор СК (SCF) регулює проліферацію і дозрівання клітин дерми, де серед клітин сполучної тканини шкірного сосочка і анагенного волосяного фолікула ідентифікуються Kit+ клітини [47]. За даними K. Hamada, V.A. Randall [35], клітини шкірних сосочків виробляють інгібувальні фактори, які впливають на ріст волоса – затримують початок анагенного фолікула в мишей у природних умовах. Про епітеліо-мезенхімні взаємодії свідчить той факт, що в культурі кератиноцити не втрачають своїх властивостей, якщо їх вирощувати з фактoром росту фібробластів [54].

454

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

• Матеріали опубліковані в статті Геращенко С.Б. Сучасні погляди на стовбурові клітини дорослих та їхня участь у регенерації загального покриву тіла / С.Б. Геращенко, Ю.Б. Чайковський, О.І. Дєльцова // Український журнал дерматології, венерології, косметології. - 2013. - №2(49). - С. 79-83. Література 1. Гістологія людини / [підр. для студ вищих мед. навч. закл. ІІІ-ІV рівнів акредитації] / О.Д. Луцик, А.Й. Іванова, К.С. Кабак, Ю.Б. Чайковський. – Київ: Книга плюс,2010. – 584 с. 2. Gambardella L. The multifaceted adult epidermal stem cell / L. Gambardella, Y. Barrandon / Curr. Opin. Cell Biol. – 2003. – Vol. 15(6). – P. 771–777. 3. Fuchs E. The tortoise and the hair: slow–cycling cells in the Stem cell race / E. Fuchs // Cell. – 2009. – Vol. 137(5). – P. 811–819. 4. Васильев Р.Г. Мультипотентные стволовые клетки из бульбарного региона волосяного фолликула со свойствами произ водных нервного гребня / Р.Г. Васильев // Проблемы криобио логии. - 2012. - Т.22,№2. - С. 165-168. 5. Beck B. Mechanisms regulating epidermal stem cells / B. Beck, C. Blanpain / EMBO J. – 2012. – Vol. 31(9). – P. 2067–2075. 6. Ivanova I.A. Signalling in the epidermis: the E2F cell cycle regulatory pathway in epidermal morphogenesis, regeneration and transformation / I.A. Ivanova, S.J. D'Souza, L. Dagnino // Int. J. Biol. Sci. – 2005. – Vol. 1(2). – P. 87–95. 7. Quatressoz P. The thousand and one facets of skin stem cells / P. Quatressoz, C. Pierard–Franchimont, G.E. Pierard // Rev. Med. Liege. – 2012. – Vol. 67(3). – P. 143–146. 8. Isolation of mesenchymal cell population from murine dermis that contains progenitor of multiple cell lineages / L. Criger, A. Kazhane, T.J. Yoon [et al.] // FASEB J. – 2007. – Vol. 21(9). – P. 2050–2063. 9. Moore K.A. Stem cells and their niches / K.A. Moore, I.R. Leminska // Science. – 2006. – Vol. 311(5769). – P. 1880–1885. 10. Braun K.M. Distinct epidermal stem cell compartments are maintained by independent niche micro–environments / K.M.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

455

Braun, D.M. Pravse // Stem Cell Rev. – 2006. – Vol. 2(3). – P. 221–231. 11. Yan X. The skin: a home to multiple classes of epithelial progenitor cells / X. Yan, D.M. Owens // Stem Cell Dev. – 2008. – Vol. 4(2). – P. 113–118. 12. Goldstein J. Home sweet home: skin stem cell niches / J. Goldstein, V. Horsley // Cell Mol. Life Sci. – 2012. – Vol. 69(15). – P. 2573–2582. 13. Stem cell niches for Skin Regeneration / V.W. Wong, B. Levi, J. Rajadas [et al.] // Int. J. Biomat. – 2012. Режим доступу до журналу www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ DOI: 10.1155/2012/926059. 14. Watt F.M. Epidermal stem cells: markers, patterning and the control of stem cell fate / F.M. Watt // Philos. Trans. R. Soc. London B Biol. Sci. – 1997. – Vol. 353(1370). – P. 831–837. 15. Webb A. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin / A. Webb, A. Li, P. Kaur // Differentiation. – 2004. – Vol. 72(8). – P. 387–395. 16. Fuchs E. More than one way to skin / E. Fuchs, V. Horsley // Genes. Dev. – 2008. – Vol. 22(8). – P. 976–985. 17. Вlanpain C. Epidermal stem cells of the skin / C. Blanpain, E. Fuchs // Annu Rev. Cell Dev. Biol. – 2006. – Vol. 22. – P. 339–373. 18. Cotsarelis G. Epithelialstem cells: a folliculocentric view / G. Cotsarelis // J. Invest. Dermatol. – 2006. – Vol. 126(7). – P. 1459–1468. 19. Krause K. Biology of the hair: the basics / K. Krause, K. Foitzik // Semin. Cutan. Med. Surg. – 2006. – Vol. 25(1). – P. 2–10. 20. Ohyama M. Hair follicle budge: a fascinating reservoir of epithelialstem cells / M. Ohyama // J. Dermat. Sci. – 2007. – Vol. 46(2). – P. 81–89. 21. Abbas O. Epidermal stem cells: practical perspectives and potential uses / O. Abbas, M. Mahalingam // Br. J. Dermatol. – 2009. – Vol. 161(2). – P.228–236. 22. Hair cycle resting phase is regulated by cycle epithelial FGF18 signaling / M. Kimuro–Ueki, Y. Oda, J. Oki [et al.] // J. Invest. Dermatol. – 2012. – Vol. 132(5). – P. 1338–1445.

456

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

23. Cell surface marker MTS24 identifies a novel population of follicular keratinocytes with characteristics of progenitor cells / J.G. Nijhot, K.M. Braun, A. Giangreco [et al.] // Development. – 2006. - Vol. 133(115). – P. 3027–3037. 24. Canine follicle stem cell candidates reside in the bulge and share characteristic features with human bulge cells / T. Kobayashi, T. Iwasaki, M. Amagai [et al.] // J. Invest. Dermatol. – 2010. – Vol. 130(8). – P. 1988–1995. 25. Pasolli H.A. The hair follicle bulge: a niche for adult stem cells / H.A. Pasolli // Microsc. Microanal. – 2011. – Vol. 17(4). – P. 513–519. 26. Characterisation and isolation of stem cell–enriched human hair follicle bulge cells / M. Ohyama, A. Terunuma, Cl. Tock [et al.] // J. Clin. Invest. – 2006. – Vol. 116(1). – P. 249–260. 27. Lin K.K. Have hair follicle stem cells shed their trianquil image? / K.K. Lin, B. Andersen // CellStem Cell. – 2008. – Vol. 3(6). – P. 581–582. 28. Lgr5 marks cycling, yet long–lived, hair follicle stem cells / V. Jaks, N. Barked, M. Kasper [et al.] // Nat. Genet. – 2008. – Vol. 40(11). – P. 1291-1299. 29. Haegebarth A. Wnt signaling, lgr5, and stem cells in the intestine and skin / A. Haegebarth, H. Clevers // Am. J. Pathol. – 2009. – Vol. 174(3). – P. 715–721. 30. Lgr6 marks stem cells in the hair follicle that generate all cell lineages of the skin / H.J. Snippert, A. Haegebarth, M. Kasper [et al.] // Science. – 2010. – Vol. 327(5971). – P. 1385–1389. 31. Immunophenotyping of the human bulge region: the quest to define useful in situ markers for human epithelial hair follicle stem cells and their niche / J.F. Kloepper, S. Tiede, J. Brinckmann [et al.] // Exp. Dermatol. – 2008. – Vol. 17(7). – P. 592–609. 32. Differential expression of stem–cell–associated markers in human hair follicle epithelial cells / K. Inoue, N. Aoi, T. Sato [et al.] // Lab. Invest. – 2009. – Vol. 89(8). – P. 844–856. 33. Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34 / C.S. Trempus, R.J. Morris, C.D. Bother [et al.] // J. Invest. Dermatol. – 2003. – Vol. 120(4). – P. 501–511.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

457

34. Live imaging of stem cell and progeny behaviour in physiological hair–follicle regeneration / P. Rompolas, E.R. Deschene, G. Zito [et al.] // Nature. – 2012. Jul.1. Доступ до електронного ресурсу DOI:10.1038/ nature 11218. 35. Cyclic dermal BMP signaling regulates stem cell activation during hair regeneration / M.V. Plicus, J.A. Mayer, D. de la Cruz [et al.] // Nature. – 2008. – Vol. 451 (7176). – P. 360–364. 36. Plikus M.V. New activators and inhibitors in the hair cycle clock: targeting stem cell' state of competence / M.V. Plikus // J. Invest. Dermatol. – 2012. – Vol. 132(5). – P. 1321–1324. 37. Beta–catenin and Hedgehog signal strength can specify number and location of hair follicles in adult epidermis without recruitment of bulge stem cells // V. Silva–Vergas, C. Lo Costo, A. Giangreco [et al.] // Dev. Cell. – 2005. – Vol. 9(1). – P. 121–131. 38. Bone morphogenetic protein signaling inhibits hair follicle anagen induction by restricting epithelial stem / progenitor cell activation and expansion / J. Zhang, X.C. He, W.G. Tong [et al.] // Stem Cells. – 2006. – Vol. 24(12). – P. 2826–2839. 39. Yang L. Unveiling hair follicle stem cells / L. Yang, R. Pang // Stem Cell Rev. – 2010. – Vol. 6(4). – P. 658–664. 40. Aubin–Honzelstein G. Notch signaling and the developing hair follicle / G. Aubin–Honzelstein // Adv. Exp. Med. Biol. – 2012. – Vol. 727. – P. 142–160. 41. Sox9 is essential for outer root sheath differentiation and the formation of the hair stem cell compartment / V.P. Vidal, M.C. Chaboissier, S. Lutzkendorf [et al.] // Curr. Biol. – 2005. – Vol. 15(15). – P. 1340–1351. 42. Hair follicle stem cells are specified and function in early skin morphogenesis // J.A. Nowak, L. Polak, H.A. Pasolli [et al.] // CellStem Cell. – 2008. – Vol. 3(1). – P. 33–43. 43. Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis / M. Ito, Y. Lin, Z. Yang [et al.] // Nat. Med. – 2005. – Vol. 11(12). – P. 13511354. 44. Distinct stem cell populations regenerate to follicle and interfollicular epidermis / V. Levy, C. Lindon, B.D. Harfe [et al.] // Dev. Cell. – 2005. – Vol. 9(6). – P. 855–861.

458

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

45. Neural potential of a stem cell population in the hair follicle / J.L. Mignone, J.L. Roig-Lopez, N. Fedtsova [et al.] // Cell Cycle.– 2007. – Vol. 6(17). – P. 2161–2170. 46. Botchkareva N.V. Fate of melanocyte during development of the hair follicle pigmentary unit / N.V. Botchkareva, V.A. Botchkarev, B.A. Gilchrest // J. Invest. Dermatol. Symp. Proc. – 2003. – Vol. 8(1). – P. 76–79. 47. Zhang R.Z. Advancements in melanocytes in hair follicle / R.Z. Zhang, W.Y. Zhu // Zhongguo Ji Xue Ke Xue Yuan Xue Bao.– 2007. – Vol. 29(2). – P. 268–271. 48. Nishikawa–Torikai S. Functional characterization of melanocytestem cells in hair follicles / S. Hishikawa–Torikai, M. Osawa, S. Nishikawa // J. Invest. Dermatol. – 2011. – Vol. 131(12).– P. 2358–2367. 49. Nishimura S. Melanocyte stem cells: a melanocyte reservoir in hair follicles for hair and skin pigmentation / S. Nishimura // Pigment Cell Melanoma Res. – 2011. – Vol. 24(3). – P. 401–410. 50. Robinson K.C. Specification and loss of melanocytestem cells / K.C. Robinson, D.E. Fisher // Semin. Cell Dev. Biol. – 2009.– Vol. 20(1). – P. 111–116. 51. Hair follicle stem cells provide a functional niche for melanocytestem cells / S. Tanimura, Y. Tadokoro, K. Inomata [et al.] // CellStem Cell. – 2011. – Vol. 8(2). – P. 177–187. 52. Dominant role of the niche in melanocytestem cell fate determination / E.K. Nishimura, S.A. Jordan, H. Oshima [et al.] // Nature. – 2002. – Vol. 416(6883). – P. 854–860. 53. Blanpain C. A dominant role of the hair follicle stemcell niche in regulating melanocyte / C.A. Blanpain, P.A. Sotiropoulou // CellStem Cell. – 2010. – Vol. 6(2). – P. 95–96. 54. Sommer L. Cheskpoints of melanocyte stem cell development / L. Sommer // Sci. STKE. – 2005. – Vol. 298. – P. e42. 55. Changes in different melanocyte populations during hair follicle involution (catagen) / A. Sharov, D.J. Tobin, T.Y. Sharov [et al.] // J. Invest. Dermatol. – 2005. – Vol. 125(6). – P. 1259– 1267. 56. Miettenen M. KIT (CD117): a review on expression in normal and neoplastic tissues, and mutantions and their clinicopathologic

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

459

correlation / M. Mittenen, J. Lasota // Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. – 2005. – Vol. 13(3). – P. 205–220. 57. The usefulness of c–Kit in the immunohistochemical assessmemt of melanocytic lesions / L. Pilloni, P. Bianco, E. Difelice [et al.] // Eur. J. Histochem. – 2011. – Vol. 55(2). – P. e20. 58. Stem cell factor–KIT signalling plays a pivotal role in regulating pigmentation in mammalian hair / A. Hochiya, P. Sriwiriyanont, T. Kobayashi [et al.] // J. Pathol. – 2009. – Vol. 218(1). – P. 30–39. 59. BPP–4 upregulates Kit expression in mouse melanоblast prior to the Kit–dependent cycle of malanogenesis / T. Kawakami, S. Kimura, Y. Kawa [et al.] // J. Invest. Dermatol. – 2008. – Vol. 128(5). – P. 1220–1226. 60. Migration of melanoblasts into developing murine hair follicle is accompanied by transient c–Kit expression / E.M. Peters, D.J. Tobin, N. Botchkareva [et al.] // J. Histochem. Cytochem. – 2002. – Vol. 50(6). – P. 751–766. 61. Melanosytestem cells express receptors for canonical Wnt– signaling pathway on their surface / T. Yamada, H. Akamatsu, S. Hasegama [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Common. – 2010. – Vol. 396(4). – P. 837–842. 62. Stem cell factor/c–Kit signalling in normal and androgenic alopecia hair follicles / V.A. Randall, T.J. Jenner, N.A. Hibberts [et al.] // J. Endocrinol. – 2008. – Vol. 197(1). – P. 11–23. 63. Neural potential of a stem cell population in the hair follicle / J.L. Mignone, J.L. Roig-Lopez, N. Fedtsova [et al.] // Cell Cycle. – 2007. – Vol. 6(17). – P. 2161–2170. 64. Notch signaling via Hes1 transcription factor maintains survival of melanoblasts and melanocytestem cells / M. Moriyama, M. Osawa, S.S. Mak [et al.] // J. Cell Biol. – 2006. – Vol. 173(3). – P. 333–339. 65. Schouwey K. Notch pathway: hair graying and pigment cell homeostasis / K. Schouwey, F. Beermann // Histol. Histopathol. – 2008. – Vol. 23(5). – P. 609–619. 66. Both Noth1 and Noch2 contribute to the regulation of melanocyte homeostasis / K. Kumano, S. Masuda, M. Sata [et al.] // Pigment Cell Melanoma Res. – 2008. – Vol. 21(1). – P. 70–78.

460

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

67. Melanoblasts' proper location and timed differentiation depend on Notch/RPB–J signaling in postnatal hair follicles / G. Aubin–Hauzelstein, J. Dijan–Zaouche, F. Bernex [et al.] // J. Invest. Dermatol. – 2008. – Vol. 128(11). – P. 2686–2695. 68. Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes / L. Li, M. Fukuhara–Kalabis, H. Yu [et al.] // J. Cell Sci. – 2010. – Vol.123 (Pt6). – P. 853–860. 69. Isolation and culturation of dermal stem cells that differentiate into functional epidermal melanocytes / L. Li, M. Fukuhara–Kalabis, M. Herlyn [et al.] // Methods. Mol. Biol. – 2012. – Vol. 806. – P. 15–29. 70. Characterization of bipontential epidermal progenitors derived from human sebaceous gland: contrasting roles of c–Myc and beta–catenin / C. Lo Celso, M.A. Berta, K.M. Braun [et al.] // Stem Cells. – 2008. – Vol. 26(5). – P. 1241–1252. 71. Multi–potentiality of a new immortalized stem cell line derived from human hair follicles / S. Roh, M. Roche, Z. Guo [et al.] // In Vitro Cell Dеv. Biol. Anim. – 2008. – Vol.44. – P. 236–244. 72. Human skin stem cells and ageing process / C.C. Zouboukis, J. Adiaye, H. Akamatsu [et al.] // Exp. Gerontol. – 2008. – Vol. 43(11). – P. 986–997. 73. Horsley V. Blimp1 Defines a Progenitor Population that Governs Cellular Input to Subaceous Gland / V. Horsley, D. O'Carrdl, R. Tooze // Cell. – 2006. – Vol. 126. – P. 597–609. 74. Sellheyer K. Blimp–1: a marker of terminal differentiation but not of sebocyte progenitor cells / K. Sellheyer, D. Krahl // J. Cutan. Pathol. – 2009. – Vol. 37(3). – P. 362–370. 75. Melacortin–5 receptor: a marker of human sebocyte differentiation / L. Zhang, W.H. Li, M. Anthonavage [et al.] // Peptides. – 2006. – Vol. 27(2). – P. 413–420. 76. A melanocortin receptor 1 and 5 antagonist inhibits sebaceous gland differentiation and the production of sebum-specific lipids / M. Eisinger, W.H. Li, M. Anthonavage [et al.] // J. Dermatol. – 2011. – Vol. 63(1). – P. 23–32. 77. Melacortin–5 receptor and sebogenesis / L. Zhang, W.H. Li, M. Anthonavage [et al.] // Eur. J. Pharmacol. – 2011. – Vol. 660(1). – P. 202–206.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

461

78. Hedgehog Signaling Regulates Subaceous Gland Development / M. Allen, M. Grachtchou, H. Sheng [et al.] // Am. J. Pathol. – 2003. – Vol. 163(6). – P. 2173–2178. 79. Identification of stem populations in sweat glands and ducts reveals roles in homeostasis and wound repair / C.P. Lu, L. Polak, A.S. Rocha [et al.] // Cell. – 2012. – Vol. 150(1). – P. 136–150. 80. Stemcell marker CD133 (Prominin–1) is expressed in various human glandular epithelia / J. Karbanova, E. Missol–Kolka, A.V. Fonseca [et al.] // J. Histochem. Cytochem. – 2008. – Vol. 56(11).– P. 977–993. 81. Tao K. In vitro isolation, cultivation and identification of sebocytes and eccrine sweat gland cells from human fetal skin / K. Tao, B. Chen, S.T. Xie // Zhonghua Shao Shang Za Zhi. – 2005. – Vol. 21(5). – P. 343–346. 82. Immunohistochemical studies on cytokeratin 8 and 18 expressions in canine subcutaneous adnexus and their tumor / K. Kato, K. Uchida, K. Nibe [et al.] // J. Vet. Med. Sci. – 2007. – Vol. 69(3). – P. 233–239. 83. A new way for isolation and cultivaion of sweat gland ductal cells from human split–thichness in vitro / Y.H. Lei, X.B. Fu, Z.Y. Sheng [et al. ] // Zhonghua Wai Ke Za Zhi. – 2009. – Vol. 47(20). – P. 1574-1577. 84. Phenotypic indications that human sweat glands are a rich source of nestin-positive stemcell populations / A.E. Petschnik, J.E. Klatte, L.H. Evers [et al.] // Br. J. Dermatol. – 2010. – Vol. 162(2). – P. 380–383. 85. Preliminary study on formation of eccrine sweat gland-like structure in three–dimensional cell culture / L. Zhou, J. Wu, X. Lei [et al.] // Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. – 2009. – Vol. 23(2). – P. 156–160. 86. Matrigel–induced Tubular Morphogenesis of Human Eccrine Sweat Gland Epithelial Cells / X. Lei, B. Lin, J. Wu [et al.] // Anat. Rec. (Hoboken). – 2011. – Aug 1. Доступ до електронного ресурсу DOI:10.1002/ar. 21459. 87. Karlsson L. Roles for PDAF-A and sonic hedgehog in development of mesenchymal components of the hair follicle / L.

462

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Karlsson, C. Bondijers, C. Betsholtz // Development. – 1999. – Vol. 126(12). – P. 2611–2621. 88. Effects of murine dermal cells on the regulation of hair growth is dependent on the cell number and post–natal age of newborn mice / K.C. Park, H.R. Choi, J.I. Na [et al.] // Ann. Dermatol. – 2012. – Vol. 24(1). – P. 94–98. 89. Kit is expressed by epithelial cells in vivo / E.M. Peters, M. Maurer, V.A. Botchkarev [et al.] // J. Invest. Dermatol. – 2003. – Vol. 121(5). – P. 976–984. 90. Hamada K. Inhibitory autocrine factors produced by the mesenchyme-derived hair follicle dermal papilla may be a key to male pattern baldness / K. Hamada, V.A. Randall // Br. J. Dermatol. – 2006. – Vol. 154(4). – P. 609–618. 91. Matsuzaki T. Role of hair papilla cells on induction and regeneration processes of hair follicles / T. Matsuzaki, K. Yoshizato // Wound Repair Regen. – 1998. – Vol. 6(6). – P. 524–530. Британські вчені навчилися "вирощувати" груди за допомогою стовбурових клітин. Опубліковано 01.03.2013. http://lacruax.com/britanski-ucheni-navchilisya-viroshhuvati-grudi-zadopomogoyu-stovburovix-klitin/

Грудна залоза. У грудній (молочній) залозі дорослої людини і тварин виявлені СК, які були ізольовані згідно специфічних маркерів клітинної поверхні та трансплантовані in vivo в очищені від жиру ділянки. При серійних пересадках ці клітини виявили здатність до самооновлення [1, 2]. При вирощуванні СК грудної залози утворюються маммосфери, клітини яких експресують маркери стовбуровості і за своїми характеристиками відповідають "золотому стандарту" СК [3]. Установлено, що СК грудної залози, які взяті під час другої половини вагітності і при лактації, при культивуванні формують маммосфери або двохвимірні культури епітелію грудної залози і після трансплантації також здатні повністю відтворювати грудну залозу [4, 5]. Первинні сфери в людини, в основному, містять рідкісні СК попередниці, а вторинні і третинні сфери в результаті наступних пасажів – клітини-попередниці, отримані від спільного предка,

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

463

але вже частково диференційовані. Сфери ферментативно і механічно дисоційовані і їхні клітини можна згодом висівати і вирощувати далі [6]. J. Stingl et al. [7] ідентифікували три види і напрямки розвитку клітин-попередниць у грудній залозі: 1. СК епітеліоцитів стінки вивідних проток, галактоцитів (молочних екзокриноцитів) та міоепітеліоцитів. 2. Біпотентні – клітини, унаслідок розвитку яких виростають "змішані" колонії в одному взірці клітин. У цих колоніях у центрі локалізуються епітеліоцити, а по периферії є клітини з маркером кератин14 (К14+), характерним для міоепітеліальних клітин. 3. Іn vitro від біпотентних клітин відбувається послідовний перехід від клітин-попередниць до клітин переважно міоепітеліальної лінії. В їхніх СК найбільш виразним є маркер Mus1+, який є досить консервативним РНКбілком. Уперше він був визначений у дрозофіли і має здатність регулювати сенсорний розвиток органів і асиметричний поділ клітин. У ссавців Mus1 контролює сотні цілей, формуючи мережі для контролю над апоптозом, диференціацією, проліферацією і клітинним циклом. Mus1 виконує роль специфічного маркера СК і забезпечує рівновагу між самовідновленням і диференціацією. Надмірний вираз Mus1 пов'язаний із численними типами пухлин не тільки грудної залози, але й товстої кишки, медулобластоми і гліобластоми [8]. По мірі диференціації в них з'являється EpCam i CD49f 9 (α6integrin). Такі співвідношення характерні для мишей і людини [9]. Усі дослідники, які вивчали СК грудної залози, сходяться в думці, що зі СК грудної залози відтворюються дві клітинні лінії – епітеліальна і міоепітеліальна [10 - 15]. Але A. Van Keymeulen et al. [16] висловили думку про те, що мультипотентні СК виявляються тільки під час ембріонального маммогенезу, а після народження ці клітини cтають уніпотентними. Існують переконливі докази того, що СК і клітини/поперед ниці грудної залози локалізуються в нішах (додаток 24). Ніша захищає СК від неналежного поширення і спрямовує їхні основ ні функції (рис. 30). Автори вважають, що стовбурова зона (ніша) локалізується у стінці внутрішньочасточкової протоки. Маркерами клітин-по-

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

464

Стовбурові клітини грудної залози Мультипотентні клітинипопередниці Chondroitin sulfate/Sca-1 SSEA-4+/CD49f hi /CD29 hi /CD24+ / / Muc1- / K6a+ / K15+/ K14+ / K19+

Клітини- попередниці міоепітеліоцитів CD49f+ / EpCam low/CD24 low/- K14 + / K19-

Клітини- попередниці епітеліоцитів CD49f low/- EpCam+/ Muc1+ / β3 integrin+/ CD24+ / K14- / K19+

Вивідні протоки

Комірки (альвеоли)

Вивідні протоки

Комірки (альвеоли)

K17+/ K14+

WT1+ / K14+

Muc+ / K6a+/ K19+

Muc1+ / К19+/ BCA-225+

Рис. 30. Ієрархія розвитку паренхіматозних і міоепітеліальних клітин

Рис. 29. Ієрархія розвитку паренхіматозних і міоепітеліальних клітин зі стовбурових клітин грудної залози. зі стовбурових клітин грудної залози.

передниць, з яких будуть розвиватися епітеліоцити проток і гаІєрархічно – це СК, біпотентні клітини-попередниці, з яких лактоцити є CD49f low/–/, EpCam+, Muc1+/β3integrin+, CD24+, розвиваються соматичні диференційовані клітини в часточках (галактоцити, K14–, K19+, а міоепітеліоцитів – MyoRP, CD49f+, Epam low/–, молочні екзокриноцити) і протоках (епітеліоцити) залози та з другої лінії – міоепітеліальні клітини часточок і вивідних проток [17,диференціації 18]. CD24low/–, K14+, K19–. При подальшій епітеліо утворювалися маммосфери, клітини яких здатні – При проток культивуванні цити експресують Muc1+, K6a+, K19, галактоцити поділитися 4-6 разів без порушень. Тобто, усі клітинні лінії грудної залози Muc1+, BCA-225+, K19+, міоепітеліоцити проток – K17+, K14+, можна отримати з однієї СК [19, 20]. Для опису розвитку різних клітинних a міоепітеліоцити часточок – WT1+, K14+. ліній і функціональних одиниць у грудній залозі R. Villadsen [21] Ієрархічно – це СК, біпотентні клітини-попередниці, з яких запропонував термін "маммопоез" розвиваються соматичні диференційовані клітини в часточках

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

465

(галактоцити, молочні екзокриноцити) і протоках (епітеліоцити) залози та з другої лінії – міоепітеліальні клітини часточок і вивідних проток [17, 18]. При культивуванні утворювалися маммосфери, клітини яких здатні поділитися 4-6 разів без порушень. Тобто, усі клітинні лінії грудної залози можна отримати з однієї СК [19, 20]. Для опису розвитку різних клітинних ліній і функціональних одиниць у грудній залозі R. Villadsen [21] запропонував термін "маммопоез". За останніми даними, маркерами СК грудної залози визнано Lin–, CD29(i), CD24 (+/mod), CD 49f, CCC-1 [22, 23]. Автори вважають, що маркери OA4, Sох2, Nanog i BRCA-1 можуть звузити пошук СК. CD24+ маркер СК грудної залози має великий ступінь вираженості в епітеліоцитах і слабий – у міоепітеліоцитах і схоже на те, що він відіграє роль у розгалуженні вивідних проток у морфогенезі [24]. За ступенем експресії CD24 розрізняють три популяції клітин: CD–, CD24 слабо+ i CD24 високо+. K.E. Sleeman et al. [25] ідентифікують ці клітини, як неепітеліальні (1), міоепітеліальні (2) і галактоцити (3). У доповнення до характеристики клітин-попередниць слід додати, що СК грудної залози можуть бути збагачені у вигляді суспензії культур – маммосфер. Для цього підходять клітини з визначеними маркерами – CD44 (високий вміст)/CD24 (низький), тоді як клітини з CD24 (низький)/CD44 (низький) маммосфери не утворюють. Із кожним пасажем (від першого до четвертого) величина маммосфер зменшується, а проліферація і диференціація клітин зсувається в бік міоепітеліальних зі зростанням кількості клітин, які старіють [26]. У клініці важливо визначити естроген-позитивні і естроген-негативні СК. Це необхідно для випробування нових лікарських засобів, які можуть прицільно вбивати СК раку грудної залози [27]. У нішах серед СК грудної залози, які диференціюються в епітеліоцити і міоепітеліоцити, містяться і клітини мезенхімного походження, що зберігаються протягом усьoго життя [28]. За певних умов останні можуть бути перепрограмовані на епітеліоцити і галактоцити [29]. Макрофаги, які тут визначаються, беруть участь у нормальному морфогенезі грудної залози [30].

466

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Клітини стовбурової ніші розвиваються в тісній взаємодії з позаклітинним матриксом (колаген і гіалуронова кислота) [31]. Вважають, що ніші СК змінюються в залежності від стадії розвитку і гормонального середовища [32], оскільки грудна залоза є унікальним органом, який після народження розвивається під постійним контролем системних гормонів. Статеві гормони є основними детермінантами активації СК. Під час вагітності СК грудної залози мають свої особливості. Стероїдні гормони діють паракринно, що викликає в клітинах зміни, які полягають у виробленні нових стимулів і призводять до зміни поведінки клітин, необхідної для морфогенезу і диференціації. Гормони можуть викликати і негативні зрушення в нішах СК [33]. СК грудної залози модернізуються з кожною вагітністю, тому ризик раку молочної залози зростає зі збільшенням кількості менструальних циклів до першої вагітності [34, 35]. Сигнальними шляхами для росту і диференціації СК вважають Wnt, Hedgehog, Notch та інші [36]. Wnt/β-катенін сигнальний шлях загалом бере участь у забезпеченні населення клітин-попередниць у шкірі, кишці та інших тканинах, а його аберантна активація може стати причиною виникнення пухлин. У грудній залозі така активація призводить до передчасної тубуло-альвеолярної диференціації і викликає аденокарциноми. Інші сигнали є специфічними для грудної залози – amphiregulin i RANKL [33]. Останній є паракринним медіатором прогестеронового мітогенетичного сигналу, виявлений у мишей і в людини, викликає проліферацію клітин грудної залози. У нормі він регулюється і обмежується власне організмом, тому слід жорстко контролювати RANKL шлях, щоб уникнути гіперпластичних змін у грудній залозі [37 – 39]. Notch шлях бере також участь у розвитку раку грудної залози [40, 41]. Сигнальний шлях Hedgehog у нормі є основним регулятором багатьох фундаментальних процесів в ембріональному розвитку хребетних, у тому числі і в забезпеченні життєздатності СК, клітинної диференціації, полярності і їхньої проліферації, а його активація може призвести до туморогенезу в напрямку базальноклітинної карциноми і медулобластоми. Цільове гальмування цього сигнального шляху може бути ефективним в ліку-

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

467

ванні і попередженні багатьох типів злоякісних пухлин грудної залози [42]. Окремо слід окреслити значення міоепітеліальних клітин грудної залози. Міоепітеліальні клітини локалізуються назов ні від альвеолярних галактоцитів у часточках залози та зовні від епітеліоцитів вивідних проток [43]. У нормі міоепітеліоцити складають несуцільний шар клітин, який є свого роду кордоном між проліферуючими епітеліальними клітинами і стінкою кро воносних мікрогемосудин і забезпечує епітеліо-стромальні взаємовідношення. У міоепітеліальних клітинах дослідники виявили маркери епітеліоцитів (цитокератин-5), залозистих клітин (цитокератин 8/18-19) і гладких міоцитів (α-актин) [44]. Пізніше ці ж автори, розширивши дослідження міоепітеліальних клітин, встановили в них експресію CD10+, SMA, SMM-HC i Calponin [45]. Міоепітеліальні клітини отримали назву "природних супресорів" пухлин. Але під час розвитку і прогресувaння пухлини вони втрачають свої властивості, їх стає мало і пухлина стає інвазивною [46]. Раніше було висловлено припущення, що міоепітеліальні клітини можуть моделювати пухлинну інвазію, контро люючи експресію гена матричних металопротеїназ [47]. S.H. Barsky, N.J. Karlin [48] показали, що міоепітеліоцити виділяють ряд молекулярних супресорів, включаючи велику кількість інгібіторів різних протеїназ та інгібіторів ангіогенезу. Міоепітеліальним клітинам відводять велику роль у розвитку "базальноклітинного раку" грудної залози [49]. У дорослих міоепітеліоцити грудної залози мають спільну СК з епітеліоцитами. Інтерес до СК грудної залози стимулюється через їхню потенційну роль у патогенезі раку грудей [50]. Від типу СК залежить прогноз ризику і перебігу цього захворювання [51]. Вони мають свої особливості, які скоріше за все залежать від мутацій у генах [52]. У грудній залозі, як і в пухлинах інших органів людини, виявлені ракові СК [53]. Ракові СК характеризуються онкогенними властивостями і здатністю до самовідновлення, утворюють диференційованих нащадків і в них розвивається резистентність до протиракової терапії. Ракові СК використовують такі самі сигнальні шляхи, що й у нормі – Wnt, Notch, Hedgehog, тобто мають багато спільного з нормальними СК [54 - 56]. Ці СК

468

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

із фенотиповою пластичністю характеризуються неоднорідністю і резистентністю до лікувальних засобів. Виявлення рис їхньої будови може привести до більш ефективної боротьби з пухлинними захворюваннями, спрямовуючи лікування на найагресивніші клітини [57]. Із цієї позиції виявлення ракових СК є одним із пріоритетів дослідження раку грудної залози. Таким чином, у дорослих у грудній залозі є ніші зі СК і клітинами-попередницями, які експресують відповідні маркери і розвиваються згідно сигнальних шляхів у галактоцити, епітеліоцити вивідних проток і міоепітеліоцити. Знання закономірностей проліферації і диференціювання цих клітин, визначення ракових СК має велике значення для розуміння процесів неоморфогенезу з утворенням пухлин грудної залози та їх коректного, патогенетичного лікування. • Матеріали опубліковані в статті Чайковський Ю.Б. Стовбу рові клітини грудної залози та їх участь у канцерогенезі / Ю.Б. Чайковський, О.І. Дєльцова, С.Б. Геращенко // Прикарпатський вісник наукового товариства НТШ. Пульс. – 2012. – № 4(20). – С. 18–26. Література 1. Smith G.H. Mammary stem cells come of age, prospectively / G.H. Smith // Trends Mol. Med. – 2006. – Vol. 12(7). – P. 287–289. 2. The emerging picture of the mouse mammary stem cell / F. Vaillant, M.L. Asselin-Labat, M. Shackleton [et al.] // Stem Cell Rev. – 2007. – Vol. 3(2). – P. 114–123. 3. Bandypadhyay A. Stem/Progenitor cells in murine mammary gland: isolation and functional characterization / A. Bandypadhyay, Q. Dong, L.Z. Sun // Methods Mol. Biol. – 2012. – Vol. 879. – P. 179-193. 4. Both B.W. Alveolar progenitor cells develop in mouse mammary glands independent of pregnancy and lactation / B.W. Both, C.A. Boulanger, G.H. Smith // J. Cell Physiol. – 2006. – Vol. 212(3). – P. 729–736. 5. Matulka L.A. Parity-induced mammary epithelial cells are multipotent and express cell surface markers assosiated with stem cells / L.A. Matulka, A.A. Triplet, K.U. Wagner // Dev. Biol. – 2007. – Vol. 303(1). – P. 29–44.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

469

6. A protocol to quantity mammary early common progenitors from long-term mammosphere culture / F. Bachelard-Cascales, M. Chapellier, E. Delay [et al.] // Curr. Protoc. Stem Cell Biol. – 2012.– Chapter 1: Unit 1E. – Р.7. 7. Epithelial progenitors in the normal human mammary gland / J. Stingl, A. Raouf, J.T. Emerman [et al.] // J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. – 2005. – Vol. 10(1). – P. 49–59. 8. Glazer R. Musashi 1: an RBP with vesatile functions in normal and cancer stem cells / R. Glazer, D.T. Vo, L.O. Penalva // Front. Diosci. – 2012. – Vol. 17. – P. 54–64. 9. Deciphering the mammary epithelial cell hierarchy / J. Stingl, A. Raouf, P. Eirew [et al.] // Cell Cycle. – 2006. – 2006. – Vol. 5(14). – P. 1519–1522. 10. Smith G.H. Mammary epithelial stem cells / G.H. Smith, G. Chepko // Microsc. Res. Tech. – 2001. – Vol. 15(2). – P. 190–203. 11. Clayton H. Growth and differentiation of progenitor/stem cells derived from the human mammary gland / H. Clayton, J. Titley, M. Vivanco // Exp. Cell Res. – 2004. – Vol. 297(2). – P. 444-460. 12. Holland M.S. The cellular perspective on mammary gland development stem/progenitor cells and beyond / M.S. Holland, R.E. Holland // J. Dairy Sci. – 2005. – Vol. 88. Suppl. 1. – P. E1–8. 13. Blanpain C. Epithelial stem cells: turning over new leanes / C. Blanpain, V. Horsley, E. Fuch // Cell. – 2007. – Vol. 128(3). – P. 445–458. 14. Keller P.J. Stem cells maintance of the mammary gland: it takes two / P.J. Keller, L.M. Arendt, C. Kuperwasse // CellStem Cell. – 2011. – Vol. 9(6). – P. 496–497. 15. Joshi P.A. Mammarystem cell comedrum: is it unipotent or multipotent / P.A. Joshi, R. Knokha // Вreast Cancer Res. – 2012.– Vol. 14(2). – P. 305. 16. Distinct stem cells contribute to mammary gland development and maintenance / A. Van Keymeulen, A.S. Rosha, M. Ontsset [et al.] // Nature. – 2011. – Vol. 479(7372). – P. 189–193. 17. La Barge M.A. Of microenvironments and mammary stem cells / M.A. La Barge, O.W. Petersen, M.J. Bissel // Stem Cell Rev.– 2007. – Vol. 3(2). – P. 137–146.

470

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

18. Delineating the epithelial ierarchi in the mouse mammary gland / M.L. Asselin-Labat, F. Vaillant, M. Shalkton [et al.] // Cold Spring Harb. Symp. Quant Biol. – 2008. – Vol. 73. – P. 469–478. 19. Bruno R.D. Functional characterization of stem cell activity in the mouse mammary gland / R.D. Bruno, G.H. Smith // Stem Cell. – 2011. – Vol. 7(2). – P. 238–247. 20. Visvader J.E. Murine mammary epithelial stem cells: discovery, function, and current status / J.E. Visvader, G.H. Smith // Cold Sprinh. Harb. Perspect. Biol. – 2011. – Vol. 3(2). – P. 55-58. 21. Villadsen R. In search of a stem cell hierarchy in the human breast and its relevance to breast cancer evolution / APMIS. 2005.– Vol. 113(11–12). – P. 903–921. 22. Guest I. Preparation of epithelial and mesenchimal stem cells from murine mammary gland / I. Guest, Z. Ilic, J. Ma // Curr. Protoc. Toxicol. – 2011. – Chapter 22: Unit 22. – Р.3. 23. Kaimala S. Mammary gland stem cells: more puzzles than explanation / S. Kaimala, S. Bisana, S. Kimar // J. Biosci. – 2012. – Vol. 37(2). – P. 349–358. 24. Cremers N. Loss of CD24 expression promotes ductal branching in the murine mammary gland / N. Cremers, M.A. Deugnier, J. Sleeman // Cell Mol. Life Sci. – 2010. – Vol. 67(13). – P. 2311-2322. 25. CD24 staining of mouse mammary gland cells defines luminal epithelial, myoepithelial/basal and non-epithelial cells / K.E. Sleeman, H. Kendrick, A. Ashworth [et al.] // Breast Cancer Res. – 2006. – Vol. 8(1). – P. R7. 26. Phenotypic and functional characterization of human mammary stem/progenitor cells in long term culture / D. Dey, M. Saxena, A.N. Paranijape [et al.] // PLoS One. – 2009. – Vol. 4(4).– P. e5329. 27. Regan J. Prospective isolation and functional analysis of stem and differentiated cells from the mouse mammary gland / J. Regan, M. Smalley // Stem Cell Rev. – 2007. – Vol. 3(2). – P. 124–136. 28. The mouse mammary microenvironment redicts mesodermderived bone marrow cells to a mammary epithelial progenitor cell fate / C.A. Boulander, R.D. Bruno, M. Rosu-Myles [et al.] // Stem Cell. – 2012. – Vol. 21(6). – P. 948–954.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

471

29. Boulander C.A. Reprogramming cell fates in the mammary microenvironment / C.A. Boulander, G.H. Smith // Cell Cycle. – 2009. – Vol. 8(8). – P. 1127-1132. 30. Resident macrophagus influence stem cell in the mammary gland / D.E. Gyorki, M.L. Asselin-Labat, N. van Rooigen [et al.] // Breast Cancer Res. – 2009. – Vol. 11(4). – P. R62. 31. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology / J.J. Campbell, N. Davidenko, M.M. Caffared [et al.] // PLoS One. – 2011.– Vol. 6(9). – P. e25661. 32. Brisken C. Stem cells and the stem cell niche in the breast: an integrated hormonal and developmental perspective / C. Brisken, S. Duss // Stem Cell Rev. – 2007. – Vol. 3(2). – P. 147–156. 33. Щепотин И.Б. Стволовые клетки: достижения, проблемы и решения / И.Б. Щепотин // Журн. НАМН України. - 2011. Т.17, №1. - С. 54-61. 34. Joshi P.A. Active allies: hormone, stem cells and the niche in adult mammopoiesis / P.A. Joshi, M.A. Di Grappa, R. Knokha // Trends Endocrinol. metab. – 2012. – Vol. 23(6). – P. 299–309. 35. Chepko G. Ultrastructure of the putative stem cell niche in rat mammary epithelium / G. Chepko, R.B. Dickson // Tissue Cell.– 2003. – Vol. 35(2). – P. 83–93. 36. Tanos T. What signals operate in the mammary? / T. Tanos, C. Brisken // Breast Dis. – 2008. – Vol. 29. – P. 69–82. 37. The RANKL signaling axis is sufficient to elicit ductal side-branching and alveologenesis in the mammary gland of virgin mouse / R. Fernandez-Valdivia, A. Mukherjee, Y. Ying [et al] // Dev. Biol. – 2009. – Vol. 328(1). – P. 127–139. 38. RANK ligand mediates progestin-induced mammary epithelial proliferation and carcinogenesis / E. Gonzalez-Suarez, A.P. Jacob, J. Jones [et al.] // Nature. – 2010. – Vol. 468(7320). – P. 103–107. 39. Obr A.T. The biology of progesterone receptor in the normal mammary gland and in breast cancer / A.T. Obr, D.P. Edwards // Mol. Cell Endocrinol. – 2012. – Vol. 357(1-2). – P. 4–17. 40. Farmie G. Mammary stem cells and breast cancer – role of notch signalling / G. Farmie, R.B. Clarke // Stem Cell Rev. – 2007.– Vol. 3(2). – P. 169–175.

472

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

41. Reedijk M. Notch signaling and breast cancer / M. Reedijk // Adv. Exp. Med. Biol. – 2012. – Vol. 427. – P. 241–247. 42. Gupta S. Targeting the Hedgehog pathway in cancer / S. Gupta, N. Takebe, P. Lorusso // Ther. Adv. Med. Oncol. – 2010. – Vol. 2(4). – P. 237–250. 43. Mammary gland development: Role of basal myoepithelial cells / M.M. Faraldo, I. Taddei–De Hosseraye, J. Teuliere [et al.] // J. Soc. Biol. – 2006. – Vol. 2000(2). – P. 193–198. 44. Common adult stem cells in the human breast give rise to glandular and myoepithelial cell lineages: a new cell biological concept / W. Boker, R. Moll, C. Poremba [et al.] // Lab. Invest. – 2002. – Vol. 82(6). – P. 737–744. 45. Boker W. Anatomy of the breast / W. Boker, D. Hungermann, T. Decker // Pathologe. – 2009. – Vol. 30(1). – P. 6–12. 46. Polyak K. Do myoepithelial hold the key for breast tumor progression? / K. Polyak, M. Hu // J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. – 2005. – Vol. 10(3). – P.231–247. 47. Primary breast myoepithelial cells exert an invasion-suppressor effect on breast cancer cells via paracrine down-regulation of MMP expression in fibroblasts and tumor cells / J.L. Jones, J.A. Shaw, J.H. Pringle [et al.] // J. Pathol. – 2003. – Vol. 201(4). – P. 562–572. 48. Barsky S.H. Myoepithelial cells: autocrine and paracrine supressors of breast cancer progression / S.H. Barsky, N.J. Karlin // J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. – 2005. – Vol. 10(3). – P. 249-260. 49. Clarke C. Myoepithelial cells: pathology, cell separation and markers of myoepithelial differentiation / C. Clarke, J. Sandle, S.R. Lakhani // J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. – 2005. – Vol. 10(3). – P. 273–280. 50. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell / M. Shakleton, F. Valliant, K.J. Simpson [et al.] // Nature. – 2006. – Vol. 439(7072). – P. 84–88. 51. Maintenance of cell type diversification in the human breast / A.J. Fridriksdottir, R. Villadsen, T. Gudjonsson [et al.] // J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. – 2005. – Vol. 10(1). – P. 61–74. 52. Stem cells in normal mammary gland and breast cancer / J. Luo, X. Jin, T. Ma [et al.] // Am. J. Med. Sci. – 2010. – Vol. 339(4). – P. 366-370.

Розділ 3. С товбурові

клітини органів і систем дорослого організму

473

53. Oliveira L.R. Stem cells in human breast cancer / L.R. Oliveira, S.S. Jeffrey, A. Ribeiro-Silva // Histol. Histopathol. – 2010. – Vol. 25(3). – P. 371–385. 54. Shared signaling pathways in normal and breast cancer stem cells / G.K. Malhotra, X. Zhao, H. Band [et al.] // J. Carcinog. – 2011. – Vol. 10. – P. 38. 55. Targening cancer stem cells by inhibiting Wnt, Notch, and Hedgehog pathways / N. Takebe, P.J. Harris, R.Q. Warren [et al.] // Nat. Rev. Clin. Oncol. – 2011. – Vol. 8(2). – P. 97–106. 56. Targeted activation of beta-catenin signaling in basal mammary epithelial cell effects mammary development and leads to hyperplasia / J. Teuliere, M.M. Faraldo, M.A. Deugnier [et al. ] // Development. – 2005. – Vol. 132(2). – P. 267–277. 57. Cancer stem cell markers in breast neoplasias: their relevance and distribution in distinct molecular subtypes / F. Schmitt, S. Ricardo, A.F. Viera [et al.] // Virchows Arch. – 2012. – Vol. 460(6).– P. 545–553.

474

ЗАМІСТЬ ПІСЛЯМОВИ Текст монографії, як правило, закінчується Післямовою. Автори даної книги зібралися під час однієї наукової конференції, щоб обговорити зміст цієї глави. Був тихий вечір, м’яке світло лилося на стіл з розставленими на ньому гаджетами та розстеленими аркушами паперу, крісла зігрівали нас ніжним велюром, кава була напрочуд духм’яною і смачною. І от що ми вирішили написати: На попередній сторінці поставлено крапку в розповіді про СТОВБУРОВУ КЛІТИНУ. Це означає, що книгу написано і можна нести рукопис до видавництва. Але історія нашої героїні не закінчується і, мабуть, не закінчиться ніколи. У вивченні стовбурових клітин крапку поставити неможливо. Кожен день завершуються одні експериментальні дослідження і починаються інші, із трибун наукових форумів учені роблять важливі доповіді, з’являються нові публікації в журналах, сенсаційні повідомлення в Інтернеті. Попереду так багато цікавого! У практичному застосуванні стовбурових клітин зроблено лише перші обережні кроки, але на нас чекають неймовірні результати. Варто набрати запит Stem cell у пошуковій системі Google, щоб переконатися в актуальності, перспективності і важливості даної проблеми. Нами отримана «скромна» цифра – близько 126 000 000 посилань. Під час підготовки даної книги до друку ми обробили лише декілька тисяч журнальних статей і матеріалів з Інтернету. Це – крапля в океані інформації. Тим не менше, ми сподіваємося, що наша монографія є своєчасною і буде корисною як для студентів і молодих учених, так і для старших і досвідчених колег. Отже, Післямова полягає в тому, що Післямова для даної книги не потрібна . Ми продовжуємо займатися проблемою стовбурових клітин і запрошуємо Вас, дорогі Читачі, до співпраці. До нових зустрічей!

Із повагою, автори

475

ГЛОСАРІЙ. ЗАГАЛЬНІ ТЕРМІНИ ТА ФРАЗИ Акцептор – об'єкт, що сприймає щось від іншого об'єкта, який називається донором. Ампліфікація сигналу – значна відповідь на відносно слабкий стимул. Гематопоетичні стовбурові клітини – одна з груп постнатальних стовбурових клітин, мультипотентні стовбурові клітини, які започатковують клітини мієлоїдного і лімфоїдного рядів. Їхнім різновидом є пуповинні стовбурові клітини. Гени плюрипотентності – Oct4, Nanog, REX1, TDGF1 (CRIPTO), SALL4, LECT1, BUB1. Дедиференціація – процес, зворотний до диференціації; повернення диференційованої клітини до менш диференційованого стану; зазвичай, є частиною регенераторного процесу і частіше спостерігається в нижчих тварин і рослин. Детермінація – процес визначення шляху, напрямку, програми розвитку ембріональних зачатків з утворенням спеціалізованих тканин. Види детермінації: оотипова, зачаткова, тканинна і клітинна. Диференціація – стійке структурно-функціональне перетворення клітин у різні спеціалізовані клітини, процес реалізації генетично обумовленої програми формування спеціалізованого фенотипу клітин, який віддзеркалює їхню здатність до тих чи інших профільних функцій. По-іншому – фенотип клітини є результатом координованої експресії (тобто узгодженої функціональної активності визначеного набору генів). У процесі диференціації менш спеціалізована клітина стає більш спеціалізованою. Експресія генів – процес, у ході якого спадкова інформація від гена перетворюється у функціональний продукт (РНК чи білок). Регуляція експресії генів дозволяє клітинам контролювати власну структуру і функцію і є основою диференціювання клітин, морфогенезу та адаптації. Ембріональні стовбурові клітини – клітини, які отримані з внутрішньої клітинної маси бластоцисти (ембріобласта) на ранніх стадіях розвитку (50-100 бластомерів), є плюрипотентними, не експресують HLA (human leucocyte antigen - антиген тканинної сумісності), їх можна

476

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

трансплантувати з незначним ризиком відторгнення. Але ембріональні стовбурові клітини можуть утворювати пухлини складної багатотканинної будови – тератоми, деякі з яких можуть стати злоякісними. Клінічні дослідження з використанням ембріональних стовбурових клітин підлягають особливій біоетичній експертизі, а в деяких країнах обмежені законодавством. Один із головних недоліків – неможливе використання автологічного матеріалу для трансплантації, оскільки його виділення з ембріону несумісне з подальшим розвитком зародка. Індуковані стовбурові клітини – стовбурові клітини, отримані з будь-яких інших (соматичних, репродуктивних чи плюрипотентних ) клітин шляхом епігенетичного перепрограмування. У залежності від ступеня дедиференціації при перепрограмуванні розрізняють такі клітини: індуковані тотипотентні, індуковані плюрипотентні стовбурові клітини та індуковані прогеніторні (мульти- чи уніпотентні стовбурові клітини), індуковані соматичні стовбурові клітини, які отримані шляхом прямого перепрограмування. Класифікація стовбурових клітин: ембріональні, фетальні і постнатальні стовбурові клітини (див. 1.1). Кластер диференціації (CD-антиген, CD-маркер) – номенклатура антигенів лейкоцитів людини для ідентифікації поверхневих мембранних білків лейкоцитів. CD-антигенами можуть бути білки, які служать рецепторами чи лігандами, що беруть участь у взаємодії клітин між собою і які є компонентами каскаду визначених сигнальних шляхів. Можуть виконувати функції білків клітинної адгезії. Список CDантигенів нині містить 350 CD-антигенів та їхніх підтипів і постійно поповнюється. Маркери стовбурових клітин - CD34+ і CD31-. Ліганд – атом чи молекула, які зв'язані з якимось центром (акцептором). Маркери клітин – білки, які використовуються в якості маркерів диференційованих і стовбурових клітин: альфа-актин гладких міоцитів (α-SMA) - білок, який в організмі людини кодується АСТА2 геном, бере участь у скороченні клітин м'язової тканини, виявляється в міофібробластах, маркер стовбурових клітин склери. - інволукрин – білок, що в людини кодується IVLгеном, експресується остистими клітинами багатошарового плоского зроговілого епітелію. - маркери CD: CD49f – в епідермальних стовбурових клітинах, CD29 (субодиниці β1інтегринів) – у стовбурових клітинах епідермісу,

Г лосарій . З агальні

терміни та фрази

477

волосяного фолікула, базальних клітинах лімба, CD104 (субодиниці β4інтегринів) – в епідермальних стовбурових клітинах миші, CD117 (с-kit) маркує серцеві, гематопоетичні та базальні епітеліальні стовбурові клітини, CD44 – маркер клітин-попередниць простати та інші. - нестин – тип VІ білка проміжних філаментів, в основному, у нейронах. Використовується в якості маркера клітин-попередниць центральної нервової системи, клітин ендотелію (ангіогенезу). - філагрин – білок, який експресується епідермоцитами зернистого шару епідермісу і здатний склеювати цитокератинові мікрофіламенти з утворенням гранул кератогіаліну. - цитокератин (ЦК, К) – білок кератин у проміжних мікрофіламентах цитоскелету клітини. - цитокератини кислотні – К10, К12, К13, К14, К16, СК17, К18, К19 і К20. - цитокератини основні - К1, К2, К3, К4, К5, К6, К7, К8 і К9. Їхня експресія залежить від органу, у клітині містяться пари К (кислотний+основний), маркери епітеліальних клітин. К 1/3, АЕ 1/3 – загальний маркер клітин епідермісу. К19- маркер стовбурових клітин епідермісу, лактоцитів молочних залоз, базальних клітин лімба рогівки. - Кі-67 - імуногістохімічний маркер проліферації, білок, який асоціюється з проліферацією, важливий для діагностики пухлинних клітин. - kit (CD117) – маркер на поверхні клітин (цитокіновий рецептор) для ідентифікації певного типу кровотворних мультипотентних попередників у червоному кістковому мозку. Клітини мієлоїдної лінії експресують високі рівні CD117, лімфоїдної лінії – низькі. У мишей CD117 маркує стовбурові клітини простати, тучні клітини, меланоцити шкіри та інтерстиційні клітини Кахаля в шлунково-кишковому тракті - Lgr5 – маркер стовбурових клітин епітелію пілоричних залоз шлунка, тонкої і товстої кишки, волосяного фолікула. - Lgr6 – маркер стовбурових клітин епідермісу і сальних залоз шкіри. - NG2 - маркер перицитів капілярів. - р53 – мастер-ген епідермальної диференціації і маркер стовбурових клітин/клітин-попередниць, проапоптичний, координує процес репарації ДНК, бере участь у запуску процесу апоптозу шляхом стимуляції рецепторів смерті. Родину р53 складають три гени – ТР53, ТР63 і ТР73. р53 захищає організм від розвитку новоутворів, забез-

478

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

печує генетичний гомеостаз багатоклітинного організму ("сторож геному"), регулює клітинний поділ. Мезенхімні стовбурові клітини – мультипотентні, морфологічно характеризуються малим тілом із декількома відростками, довгими і тонкими. Для визначення мезенхімних стовбурових клітин ISCT (International Society for Cellular Therapy) запропонувало набір стандартів, у культурі цих клітин на поверхні визначаються CD73, CD90 i CD105, при відсутності CD11b, СD14, CD19, CD45, CD79a i HLA-DR –поверхневих антигенів. Мезенхімні (стромальні) стовбурові клітини – походять із мезенхіми (ембріональної сполучної тканини). Диференціюються в остеобласти, хондроцити, адипоцити. Метаплазія – зворотна заміна одного диференційованого ти-пу клітин на інший тип зрілих диференційованих клітин. Мультипотентні стовбурові клітини – започатковують клітини, чисельність яких обмежена одним зародковим листком. Нейросфера – сфероподібне скупчення нейральних стовбурових клітин або клітин-попередниць (при їхньому вирощуванні в середовищі без сироватки). Оксид азоту – сполука, що проникає через мембрану, зв'язується з розчинною (цитозольною) гуанілатциклазою, яка водночас є і рецептором оксиду азоту, і ферментом, що синтезує вторинний посередник - цГМФ. Олігопотентні стовбурові клітини – із цих клітин можуть диференціюватися лише деякі, близькі за типом клітини, наприклад клітини лімфоїдного та мієлоїдного рядів, що беруть участь у процесі кровотворення. Перепрограмування епігенетичне – шлях утворення стовбурових клітин, отриманих з будь-яких інших (соматичних, репродуктивних чи плюрипотентних). Перепрограмування пряме – пряме трансдиференціація під впливом визначених факторів (наприклад вплив 5-азацитидіну, який викликає деметилювання ДНК або активація одного гену) без попереднього проходження клітини через стадії плюрипотентності. Отримані мультипотентні соматичні стовбурові клітини більш придатні для клітинної терапії, оскільки не утворюють тератоми. Плюрипотентні стовбурові клітини – клітини, які є нащадками тотипотентних і можуть започатковувати практично всі тканини і ор-

Г лосарій . З агальні

терміни та фрази

479

гани (за винятком позаембріональних). Із плюрипотентних стовбурових клітин розвиваються зародкові листки (екто-, ендо- та мезодерма). Посередники трансдукції (сигналу) первинні – хімічні сполуки чи фізичні фактори (кванти світла), які здатні активувати механізм передачі сигналу в клітині. Групи первинних посередників: гормони, цитокіни, нейротрансмітери, фактори росту, хемокіни. Посередники трансдукції (сигналу) вторинні – низькомолеку лярні речовини, які вивільняються в результаті ферментативної активності одного з компонентів ланцюга передачі сигналу і спри яють подальшій передачі й ампліфікації. Це іони кальцію, цАМФ і гАМФ, інозитолтрифосфат, ліпофільні гранули, оксид азоту. Постнатальні стовбурові клітини – стовбурові клітини дорослого зрілого організму, які представлені трьома групами: гематопоетичними (кровотворними), мезенхімними (стромальними) і тканиноспецифічними клітинами-попередницями (див.). Потентність (потенціал диференціації) – здатність відтворювати визначену кількість різних типів клітин. У залежності від потентності стовбурові клітини мають такі групи: тотипотентні (омніопотентні), плюрипотентні, мультипотентні, олігопотентні, уніпотентні. Проліферація – розростання тканин організму шляхом розмноження клітин поділом. Рецептори внутрішньоклітинні – як правило, фактори транскрипції чи білки, які взаємодіють із факторами транскрипції. Більшість із них зв'язується з лігандами в цитоплазмі, переходить в активний стан, транспортується разом із лігандом в ядро клітини, де зв'язується з ДНК або індукує чи пригнічує експресію одного чи кількох генів. Рецептори клітинні – особливі білки, для яких первинні посередники є лігандами. Це молекула на поверхні клітини, клітинній органелі чи розчинена в цитоплазмі, яка специфічно реагує змінами своєї просторової конфігурації на приєднання до неї молекули визначеної хімічної речовини, що передає зовнішній регуляторний сигнал і, у свою чергу, передає цей сигнал усередину клітини чи клітинної органели часто з залученням вторинних посередників чи трансмембранних іонних струмів. Класи рецепторів: мембранні (рецепторні тирозинкінази, рецептори з G-білками, іонні канали), цитоплазматичні та ядерні. Рецептори мембранні (трансмембранні) – мембранні білки, які локалізуються і працюють не тільки в зовнішній клітинній мембрані, але й у мембранах компартментів і органел клітини. Типи мембранних рецепторів: 1.Іонотропні – зв'язані з іонними каналами, бе-

480

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

руть участь у швидкій електричній передачі синаптичних сигналів. 2.Мембранотропні, які передають хімічні сигнали, серед них – рецептори супряжені з G-білками (7ТМ-рецептори, в органах чуттів і адренорецептори) і рецептори, супряжені з ферментами (тирозинові кінази, серин-протеїнові кінази, зв'язані з гістидіновими кіназами, рецепторні гуанілатциклази, рецептороподібні тирозинфосфатази). Рецептори тирозинкіназ – важлива ланка на шляху передачі сигналу в клітині, активують внутрішньоклітинні сигнальні шляхи: EGFR – епідермального фактору росту, IGF-1R – інсуліноподібного фактору росту- 1, HGFR – гепатоцитарного фактору росту, PDGFRβ – тромбоцитарного фактору росту, HER-2 – рецептор-2 епідермального фактору росту людини, VEGR2 – рецептор судинного ендотеліального фактору росту, Tie-2 – тирозинкіназа з імуноглобуліном і повторами 2 епідермального фактора росту. Самооновлення – здатність зберігати незмінний фенотип після поділу (без диференціації); механізми, які підтримують популяцію стовбурових клітин в організмі: 1.Асиметричний поділ, при якому продукується одна стовбурова і одна диференційована клітина. 2.Стохастичний (симетричний) поділ, при якому стовбурова клітина ділиться на дві більш спеціалізовані. Сигнальні системи клітин - набір механізмів, за допомогою яких клітина переводить один тип сигналів в інший та координує роботу систем, що відповідають за реакцію клітин. Сигнальний шлях (сигналізування клітин, сигналінг, клітинні сигнальні мережі, передача сигналу) – шлях, який складається з ланцюга посередників при передачі регуляторного стимулу всередині клітини: JAK/STAT – сигнальний шлях –передає інформацію від хімічних сигналів за межами клітини, через клітинну мембрану та в гені промоутерів на ДНК в ядрі клітини, що призводить до транскрипції ДНК, є альтернативою до вторинних месенджерних систем. Його порушення задіяне у виникненні синдрому імунодефіциту та пухлин. Notch - сигнальний шлях – універсальний у тваринному світі, короткий механізм передачі, у результаті якого клітина синтезує інші білки, змінює свою поведінку і виконує функцію регулятора транскрипції. Суть Notch у проведенні сигналу з поверхні клітини в ядро. Notch- білок експресується під час розвитку клітин, які диференціюються: під час ембріогенезу, починаючи з бластули і далі в популяціях клітин, що діляться. Sonic Hedgeborg (Shh) – cигнальний шлях – білки родини Shh вважаються учасниками клітинної детермінації і диференціація, по-

Г лосарій . З агальні

терміни та фрази

481

ділу клітини, посередниками багатьох основних процесів ембріонального росту і розвитку. Wnt - сигнальний шлях – мережа з білків, яка проводить сигнали від рецепторів на поверхні клітини до ядра і експресії ДНК. Контролюється β-катеніном, який проникає в ядро, зв'язується з ДНК і включається в процес експресії генів. Wnt-білки відіграють важливу роль в ембріональному розвитку, клітинній диференціації і клітинної полярності покоління, можуть діяти як стовбурові фактори росту клітин, індукують диференціацію плюрипотентних стовбурових клітин у клітини мезо- та ендодерми. •Wnt- канонічний описує ряд подій, які відбуваються, коли Wnt-білки зв'язуються з рецепторами клітинної поверхні з Frizzledродини, далі в процес включається β-катенін і досягає ядра. •Wnt- неканонічний - ліганд класу Wnt впливає на поведінку клітини, не викликаючи змін концентрації β-катеніну. Стовбурові клітини – недиференційовані (незрілі) клітини, які є в усіх багатоклітинних організмах, здатні до самооновлення, утворення нових стовбурових клітин, поділу за допомогою мітозу і диференціації у спеціалізовані клітини різних органів і тканин. Стовбурових клітин в організмі мало: в ембріона – одна на 10000 клітин, у людини віком 60-80 років - одна на 5-8 млн. клітин. Сфера – сфероподібне скупчення стовбурових клітин або клітинпопередниць при їхньому культивуванні (нейросфера, маммосфера та інші). Тканинноспецифічні стовбурові клітини (прогеніторні) – ма лодиференційовані оліго- або уніпотентні клітини. Їхнє самооновлення обмежене кількома поділами. Тотипотентні (омніопотентні) стовбурові клітини – клітини, які можуть диференціюватися в клітини ембріона і позаембріональні тканини та органи, у вигляді тривимірних зв'язаних структур (тканин, органів, систем органів в організмі). До них належить запліднена яйцеклітина – зигота та клітини перших її поділів. Трансдетермінація – зміна шляхів диференціації клітини. Трансдиференціація – здатність дорослої регіональної стовбурової клітини диференціюватися в клітини іншого органа і/чи іншого зародкового листка. Транскрипція – створення РНК-копії, досягається з допомогою спеціальних білків, які зв'язані зі стартовою послідовністю генів, що мають бути транскрибовані.

482

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Трансдукція – (передача сигналу, сигнальна трансдукція, сигналінг, сигналізація) – у молекулярній біології термін відноситься до будь-якого процесу, за допомогою якого клітина перетворює один тип сигналу чи стимулу в інший. Трансдукція всередині клітини здійснюється, переважно, у вигляді біохімічних реакцій за допомогою ферментів, частина яких активується вторинними посередниками. Тривалість трансдукції : кілька мілісекунд через іонні канали, кілька хвилин у випадку активації протеїнокіназ і ліпiд-опосередкованих кіназ, години і доби при експресії генів. Трансфекція – процес введення нуклеїнової кислоти в клітини людини і тварин невірусним шляхом. Трансфекція включає утворення в плазматичній мембрані отворів, через які досередини клітини може проникнути позаклітинний матеріал, а також білки, наприклад антитіла. Трансфікованим може бути генетичний матеріал (ДНК чи РНК). Для трансфекції використовується сильне електричне поле (електропорація) чи електростатично заряджені ліпіди, які здатні утворювати ліпосоми. Перший зміст слова "Трансфекція" – введення в клітину вірусного геному, у результаті чого починається інфекція. Запропоновано вживати термін "Трансфекція" як заміну терміну трансформація в контексті змін фенотипу шляхом введення чужерідної нуклеїнової кислоти. Уніпотентні стовбурові клітини (клітини-попередниці, клітинибласти) – незрілі клітини, які вже не є стовбуровими по суті, оскільки відтворюють один тип клітин, але здатні до самооновлення, що відрізняє їх від нестовбурових клітин водночас кількість їхніх поділів обмежена, що відрізняє їх від стовбурових клітин. Фактори росту – клас невеликих природних пептидів та білків, що беруть участь у сигнальних системах організму еукаріотів, зв'язуючись із рецепторами на поверхні клітин із головною метою стимулювання їхнього росту та диференціації. Конкретний ефект на клітину та тип клітин, на які діє фактор росту, залежить від конкретного фактору. Наприклад: білок морфогенезу кісток (ВМР) стимулює диференціацію клітин кісток, тоді як фактор росту фібробластів і васкулоендотеліальний фактор росту – диференціацію кровоносних судин (ангіогенез). Фактори росту на відміну від гормонів секретуються локально і мають обмежену дію. Найбільш відомі фактори росту (ФР): трансформувальний ФР (TGF-B), колонієстимулювальний ФР гранулоцитів (G-CSF), колонієстимулювальний ФР гранулоцитів і макрофагів (GMCSF), нервовий ФР (NGF), нейротрофіни, тромбоцитарний ФР (PDGF),

Г лосарій . З агальні

терміни та фрази

483

еритропоетин (EPO), тромбопоетин (TPO), міостатин (GDF-8), фактор диференціації і росту-9 (GDF9), кислий ФР тромбоцитів (aFGF або FGF-1), основний ФР фібробластів (bFGF або FGF-2), епідермальний ФР (EGF), ФР гепатоцитів (HGF). Фактори транскрипції – фактори, які сприяють транскрипції: 1. Базальні (убіквітарні), присутні рівномірно в усіх клітинах організму (TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH). 2. Cпецифічні – "повідомляють" РНК-полімеразі, який саме ген необхідно активувати. Численні фактори транскрипції у відповідь на отриманий сигнал "вмикають" або "вимикають" транскрипцію генів, що призводить до зміни морфології клітини і визначає її диференціацію, задіяні в регуляції клітинного циклу, у тварин відіграють роль у рості клітини та її апоптозі. Найбільш відомі з них: Nanog – експресується в ембріональних стовбурових клітинах, є одним із головних генів плюрипотентності разом із Oct4, REX1, бере участь у самооновленні ембріональних недиференційованих стовбурових клітин та забезпечує їхній статус. NPM1 – білок нуклеофозмін (NPM) відомий як ядерцевий фосфопротеїн В23 або numatrin (білок, який кодується в людини геном NPM1), бере участь у проліферації клітин. Oct4 (POU5F1) – бере участь у самооновленні недиференційованих ембріональних і дорослих соматичних стовбурових клітин, використовується як маркер недиференційованих клітин, може бути маркером ракових клітин. Sox2 (SRYbox2) – необхідний для підтримки самооновлення, або плюрипотентності, недиференційованих ембріональних стовбурових клітин. Родина Sox2 відіграє важливу роль на багатьох етапах розвитку ссавців: його участь достатня для отримання індукованих плюрипотентних стовбурових клітин, має значення в генерації нервових попередників. Дефекти Sox2 призводять до мікрофтальму. Фактори транскрипції (класифікація) – класифікуються за механізмом дії, за регуляторною функцією і за структурою ДНКзв'язувального домена. Фактори транскрипції за механізмом дії – поділяються на головні; ті, які взаємодіють з upstreаm ділянками ДНК та індуковані факторами транскрипції. Фактори транскрипції за механізмом функції – поділяють-ся на: 1. Конститутивні – присутні завжди в усіх клітинах – Sp1, NF1, CCAAT.

484

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

2. Ті, які активуються за певних умов: 2.а. – які беруть участь у розвитку організму (клітинно-специфічні) – експресія строго контролюється, не вимагають додаткової активації (GATA, HNF, PIT-1, MyoD, Myf5, Hox, Winged, Helix). 2б. сигнал-залежні – вимагають зовнішнього сигналу для активації. 2.2.1. – позаклітинні сигнал-залежні (ядерні рецептори). 2.2.2. – внутрішньоклітиннні сигнал-залежні (активуються низькомолекулярними внутрішньоклітинними сполуками). 2.2.3. мембранозв'язані рецептор-залежні, фосфорилюються кіназами сигнального каскаду. 2.2.3.1. – резидентні ядерні фактори, знаходяться в ядрі, незалежно від активації (GREB, AP-1, Mef2. 2.2.3.2. – латентні цитоплазматичні фактори, у неактивному стані локалізовані в цитоплазмі, після активації транспортуються в ядро (STAT, NF-KB, Notch, TUBBY, NFAT). Фактори транскрипцiї за будовою ДНК-домена належать до 5 надкласів: 1. Надклас Basic Domens (Basic-loop-helix). 2. Надклас Zinc- coordinating DNA-bindings domains. 3. Надклас: Спіраль –поворот – спіраль. 4. Надклас: Beta Scafford Factors with Minor Groove Contacts. 5. Надклас 0 – Інші фактори транскрипції. Фетальні стовбурові клітини – стовбурові клітини, які отримані з плодового матеріалу після аборту, що породжує етичні проблеми. Шляхи перепрограмування – існує три шляхи перепрограму вання: 1. Пересадка ядер, взятих із соматичної клітини, у запліднену яйцеклітину, з якої попередньо видалено ядро. 2. Злиття соматичної клітини з плюрипотентною стовбуровою клітиною. 3. Модифікація соматичної клітини, яка індукує її перетворення в стовбурову клітину з допомогою генетичного матеріалу, кодуючого білкові репрограмувальні фактори; рекомбінантних білків, мікроРНК і низькомолекулярних біологічно активних речовин. Найчастіше для перепрограмування використовують фібробласти (отримані при біопсії шкіри) і клітини крові.

Г лосарій . З агальні

терміни та фрази

ДОДАТКИ

485

486

Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б.

Додаток 1

Додаток 1. Жирова тканина великого чепця людини. Жирова тканина великого чепця людини. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144.

Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144.

Додаток 1. Жирова тканина великого чепця людини. Додаток Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144.

Додаток 2. Гіаліновий хрящ ребра кроля. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144.

Додаток 2. Гіаліновий хрящ ребра кроля. Гіаліновийстовбурової хрящ ребра Локалізація нішікроля. (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144.

Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144.

487

Додаток 3

Додаток 3. Посмугована несерцеватканина м'язова (скелетні тканина (скелетні м'язикроля). язика Посмугована несерцева м'язова м'язи язика кроля). Локалізація ніші (↓). (↓).Заб.: Заб.: залізний гематоксилін. Зб.: х144. Локалізаціястовбурової стовбурової ніші залізний гематоксилін. Зб.: х144.

Додаток 3. Посмугована несерцева м'язова тканина (скелетні м'язи язика кроля). Додаток 4 Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: залізний гематоксилін. Зб.: х144.

Додаток 4. Посмугована серцева м'язова тканина (серце коня). Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: залізний гематоксилін. Зб.: х144.

Додаток 4. Посмугована серцева м'язова тканина (серце коня).

Локалізація стовбурової ніші (↓). тканина Заб.: залізний гематоксилін. Зб.: х144. Посмугована серцева м'язова (серце коня). Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: залізний гематоксилін. Зб.: х144.

488

Додаток 5

Додаток 5. Артерія м'язового типу людини. Артерія м'язового типу людини. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144.

Додаток 5. Артерія м'язового типу людини. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144. Додаток

Додаток 6. Щитоподібна залоза собаки. Локалізація стовбурової ніші (↓ ). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144.

Додаток 6. Щитоподібна залоза собаки. Щитоподібна залоза собаки. Локалізація стовбурової ніші (↓ ). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144.

489

Додаток 7

Додаток 7. Надниркова залоза собаки. Надниркова залоза собаки. Локалізація ніші (↓).(Заб.: залізний гематоксилін. Зб.: х144. Локалізаціястовбурової стовбурової ніші ↓). Заб.: залізний гематоксилін. Зб.: х144. Додаток 7. Надниркова залоза собаки. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: залізний гематоксилін.Додаток Зб.: х144.

Додаток 8. Привушна слинна залоза людини. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144.

Додаток 8. Привушна слинна залоза людини.

Привушна слинна залоза людини. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144.

490

Додаток 9

Додаток 9. Стравохід собаки. Стравохід собаки. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144.

Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144.

Додаток 9. Стравохід собаки. Додаток Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144.

Додаток 10. Дно шлунка собаки. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і конго червоний. Зб.: х144. Додаток 10. Дно шлунка собаки. Дно шлунка собаки. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і конго червоний. Зб.: Локалізація х144. стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і конго червоний. Зб.: х144.

491

Додаток 11

Додаток 11. Тонка кишка собаки.

Тонка кишка собаки. ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144. Локалізація стовбурової Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144. Додаток 11. Тонка кишка собаки. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144. Додаток

Додаток 12. Товста кишка собаки. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144.

Товста собаки. Додатоккишка 12. Товста кишка собаки. Локалізація стовбурової ніші (↓).(Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144. Локалізація стовбурової ніші ↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144.

492

Додаток 13

Додаток Печінка людини. Печінка13. людини. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х288.

Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х288.

Додаток 13. Печінка людини. Додаток Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х288.

Додаток 14. Підшлункова залоза людини. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х 144.

Додаток 14. Підшлункова залоза людини. Підшлункова залоза людини. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х 144.

Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х 144.

493

Додаток 15

Додатоклюдини. 15. Трахея людини. Трахея Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144. Додаток 15. Трахея людини. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин.Додаток Зб.: х144.

Додаток 16. Бронх малого калібра людини. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144.

Додатокмалого 16. Бронх малоголюдини. калібра людини. Бронх калібра Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144.

494

Додаток 17

Додатокщура. 17. Нирка щура. Нирка Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144. Додаток 17. Нирка щура. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин.Додаток Зб.: х144.

Додаток 18. Яєчник кішки. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144. Додаток 18. Яєчник кішки.

Яєчник кішки. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144.

495

Додаток 19

Додаток 19. Рогівка.

Рогівка. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144. Додаток 19. Рогівка. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Додаток Зб.: х144.

Додаток 20. Сітківка собаки. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144.

Сітківка собаки. Додаток 20. Сітківка собаки. Локалізація ніші (↓).(↓ Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144. Локалізація стовбурової стовбурової ніші ). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144.

496

Додаток 21

Спіральний орган миші. Додаток 21. Спіральний орган миші. Локалізація нішініші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин.і Зб.: х144. Локалізаціястовбурової стовбурової (↓). Заб.: гематоксилін еозин. Зб.: х144. Додаток 21. Спіральний орган миші. Додаток Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144.

Додаток 22. Смакові бруньки язика кішки. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144.

Додаток Смакові бруньки язика кішки. Смакові22.бруньки язика кішки. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144.

Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144.

497

Додаток 23

Додаток 23. Шкіра людини. Шкіра людини. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144.

Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144.

Додаток 23. Шкіра людини. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Додаток Зб.: х144.

Додаток 24. Грудна залоза корови. Локалізація стовбурової ніші (↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144.

Грудна залоза корови.

Додаток 24. Грудна залоза корови. Локалізаціястовбурової стовбурової ніші ↓). Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144. Локалізація ніші (↓).(Заб.: гематоксилін і еозин. Зб.: х144.

498

Чайковський Ю. Б. – член-кореспондент НАМН Укра їни, Заслужений діяч нау ки і техніки України, доктор медичних наук, професор, лауреат Державної премії України в галузі науки і техніки, премії імені В.П. Комі с аренка НАН України, премії НАМН України, завідувач кафедри гісто логії та ембріології Національного медичного університету імені О.О.Богомольця.

Дєльцова О. І. – доктор медичних наук, професор, лау реат премії імені В.П. Комісаренка НАН України, премії НАМН України, професор кафедри гістології, цитології та ембріології Івано-Франківського національного медичного університету.

Геращенко С. Б. – доктор медичних наук, профе сор, лауреат премії імені В.П. Комісаренка НАН України, премії НАМН України, завідувач кафедри гістології, цитології та ембріології Івано-Франківського національного медичного університету.

499

Наукове видання ЧАЙКОВСЬКИЙ Ю.Б., ДЄЛЬЦОВА О.І., ГЕРАЩЕНКО С.Б.

СТОВБУРОВІ КЛІТИНИ Монографія

Дизайн обкладинки: Катерина Щербак Технічний редактор: Михайло Дмитрук

Підписано до друку 15.01.2014 Формат 60ч84/16. Папір офсетний. Друк офсетний Гарнітура "UkrainianSchoolBook". Умовн. друк. арк. 29,06 Наклад 300 прим. Зам. № 6536

500

Видавництво "Місто НВ" 76000, м. Івано-Франківськ, вул. Незалежності, 53, тел.: (0342) 55-94-93.

Свідоцтво суб’єкта видавничої справи ІФ № 9 від 02.02.2001 р.

Віддруковано: Друкарня "Місто НВ" 76000, м. Івано-Франківськ, вул. Незалежності, 53.