На правах рукописи
Белоусова Анастасия Ивановна РОЛЬ ПРОАПОПТОТИЧЕСКИХ ПОЛИМОРФИЗМОВ р53(С72G), р21 (С31А) и TNF(G308A) В ПАТОГЕНЕЗЕ ПЕРВИЧНОЙ ОТКРЫТОУГОЛЬНОЙ ГЛАУКОМЫ У РЕЗИДЕНТОВ ЗАБАЙКАЛЬСКОГО КРАЯ
14.03.03 - патологическая физиология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Чита-2010 1
Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com)
Работа выполнена в ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия Росздрава.
Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор
Витковский Юрий Антонович
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор
Цыбиков Намжил Намзатович
кандидат медицинских наук Гармаева Александра Алексеевна
Ведущая организация: Институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (г. Санкт-Петербург)
Защита диссертации состоится "29" июня 2010 г. в 9-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.118.01 при ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия Росздрава (672090, г. Чита, ул. Горького, 39-А). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия Росздрава.
Автореферат разослан "___"____________2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор 2
Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com)
И.Н. Гаймоленко
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Проблема глаукомы в настоящее время остается одной из наиболее актуальных в современной офтальмологии. Число больных глаукомой на земном шаре составляет 105 млн., из них слепых на оба глаза - 9,1 млн. (Quigley Н., 2006). По расчетным данным J.Goldberg (2000) к 2030 году число больных глаукомой может увеличиться в два раза. 80% этих больных живут в развивающихся странах. C возрастом число больных увеличивается от 0,1-1,5% в 40-45 лет до 10-14% в 75 лет и выше (Куроедов А.В., 2004). Такое положение обусловлено многообразием клинических проявлений, сложностью патогенеза, трудностью ранней диагностики и лечения, а также серьезностью прогноза и медико-социальной значимостью заболевания (Кириленко Ю.А., Березников А.И., 2003). Несмотря на серьезный прорыв в понимании проблем глаукомы до настоящего времени не предложено достаточно эффективных методов предупреждения заболевания и его раннего выявления. На сегодняшний день, практически половина людей, приходящих с серьезными жалобами к офтальмологу, страдают глаукомой либо имеют подозрения на это заболевание. При этом в 90% случаев, глаукома обнаруживается на поздних стадиях (Егоров Е.А., 2007). Учитывая тот факт, что в ранней фазе глаукома протекает почти бессимптомно, выявление данного заболевания в большинстве случаев происходит на стадиях, сопровождающихся уже необратимыми изменениями зрительного нерва. Сложившаяся ситуация ставит вопрос о необходимости поиска и разработки новых эффективных молекулярно-генетических методов ранней диагностики глаукомы и внедрения их в повсеместную практику. В настоящий момент есть все основания относить первичную открытоугольную глаукому (ПОУГ) к группе мультифакторных заболеваний, развивающихся на фоне апоптоза, связанного с активацией проапоптических генов и белковой перестройкой содержимого клеток. Следовательно, именно первичные генетические эффекты определяют интенсивность патологических изменений в ганглиозных клетках сетчатки, местную реакцию глаз на возрастные сдвиги и анатомические особенности дренажной системы и диска зрительного нерва (Кириленко Ю.А., Березников А.И., 2003). За последние годы проводилось энергичное исследование картографии ПОУГ-генов. В результате проводимых комбинированных исследований было обнаружено более 20 генов, непосредственно влияющих на развитие первичной открытоугольной глаукомы. Также было идентифицировано множество генов, потенциально связанных с ПОУГ (Bao J.F., 2005). Таким образом, исследования в этом направлении в дальнейшем смогут обеспечить хорошие 3
Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com)
ресурсы для анализа мутации в ассоциированных исследованиях, углубить представления о патогенезе и разработать новые эффективные методы прогнозирования и ранней диагностики данного заболевания (Dimasi D.P., 2006). Цель и задачи исследования. Основной целью исследования явилось изучение роли проапоптотических полиморфизмов генов р53(С72G), р21(С31А) и TNF(G308A) в патогенезе первичной открытоугольной глаукомы и оценка их прогностического значения для развития заболевания у резидентов Забайкальского края в этническом аспекте. Решались следующие задачи: 1. Выявить и оценить частоту встречаемости, экспрессивность и пенетрантность проапоптотических аллельных вариантов генов TNF, р53, р21 у больных первичной открытоугольной глаукомой и здоровых резидентов в русской и бурятской этнических группах. 2. Оценить прогностическое значение проапоптотических аллелей р53(С72G), р21(С31А) и TNF (G308A) для развития ПОУГ у представителей этнических групп Забайкальского края. 3. Сравнить степень риска возникновения первичной открытоугольной глаукомы у лиц-носителей различных аллельных вариантов генов TNF, р53, р21. 4. Изучить влияние проапоптотических вариантов р53(С72G), р21(С31А) и TNF (G308A) на особенности течения первичной открытоугольной глаукомы в русской и бурятской этнических группах. 5. Сравнить содержание провоспалительных цитокинов IL-1 и TNF в слезной жидкости больных-носителей различных аллельных вариантов генов TNF, р53, р21 и здоровых резидентов в русской и бурятской этнических группах. Научная новизна. Впервые обнаружено, что проапоптотические аллельные варианты р53(С72G), р21(С31А) и TNF(G308A) предрасполагают к развитию первичной открытоугольной глаукомы, влияют на скорость прогрессирования и тяжесть течения заболевания в русской и бурятской этнических группах. Обнаружено, что экспрессивность изучаемых полиморфизмов выявляется в максимальной степени в сочетании с проапоптотическим вариантом гена р53. Впервые установлено, что проапоптотические полиморфизмы р53(С72G), р21(С31А) и TNF(G308A) повышают риск развития первичной открытоугольной глаукомы среди русских в более значительной степени, по сравнению с представителями бурятской этнической группы. Впервые предложен механизм формирования толерантного внутриглаз4
Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com)
ного давления у лиц-носителей различных вариантов гена р53. Теоретическая и практическая значимость работы. В результате исследования получены новые данные о патогенезе первичной открытоугольной глаукомы, демонстрирующие роль проапоптотических полиморфизмов р53(С72G), р21(С31А) и TNF (G308A) в механизме развития заболевания. Носительство проапоптотических аллелей оказывает влияние на тяжесть течения ПОУГ среди представителей русской и бурятской этнических групп Забайкальского края. Выявленные факты позволяют оценить риск заболевания ПОУГ в этническом аспекте и разработать новые методы прогнозирования и ранней диагностики глаукомы среди резидентов русской и бурятской популяции. Полученные сведения о наличии р53(С72G), р21(С31А) и TNF (G308A) могут быть включены в генетический паспорт индивидуумов и совместно с другими полиморфизмами использоваться для оценки риска развития глаукомы. Внедрение результатов работы. Теоретические положения, раскрываемые в диссертации, внедрены в учебный процесс на кафедрах нормальной и патологической физиологии ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия, а также в перечень диагностических мероприятий по выявлению наследственной предрасположенности к глаукоме в офтальмологическом отделении Диагностической поликлиники при ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия и Краевой детской клинической больницы Забайкальского края. Публикации. По теме диссертации опубликовано пять печатных работ, в том числе одна - в издании, определенном ВАК Министерства образования и науки РФ. Апробация диссертации. Результаты исследований доложены на Всероссийской конференции, посвященной 55-летию Читинской медицинской академии (Чита, 2008), на Межрегиональной конференции, посвященной 100-летию офтальмологической службы Забайкальского края (Чита, 2009), конференции, посвященной 80-летию Дорожной клинической больницы на ст. ЧитаII (Чита, 2007), на заседании Читинского отделения Физиологического общества им. И.П. Павлова. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 279 работ, из них - 48 отечественных и 131 зарубежных авторов, иллюстрирована 21 таблицей, 14 рисунками. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Распределения полиморфизмов генов р53(С72G), р21(С31А) и TNF(G308A) 5
Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com)
у резидентов Забайкальского края имеет этнические особенности. Частота встречаемости проапоптотических аллельных вариантов генов р53, р21 и TNF относительно выше среди лиц бурятской национальности, как среди больных ПОУГ, так и среди здоровых резидентов. 2. Экспрессивность и пенетрантность проапоптотических полиморфизмов р53 и TNF выше среди представителей русской этнической группы. Наиболее высокая экспрессивность проапоптотических аллельных вариантов выявляется у носителей сочетанных полиморфизмов гена р53. 3. Полиморфизм проапоптотических генов р53(С72G), р21(С31А) и TNF (G308A) влияет на риск развития первичной открытоугольной глаукомы и определяет тяжесть течения заболевания у представителей русской и бурятской этнических групп. Носительство проапоптотических аллельных вариантов р53(С72G), р21(С31А) и TNF(G308A) влияет на скорость прогрессирования глаукоматозного процесса и предрасполагает к развитию двустороннего поражения глаз. 4. Полиморфизм гена р53 детерминирует резистентность ганглиозных клеток сетчатки к воздействию повышенного офтальмотонуса и определяет уровень толерантного внутриглазного давления. Здоровые резиденты русской и бурятской национальности с проапоптотическим полиморфизмом р53 имеют более низкий уровень толерантного внутриглазного давления, чем лица с антиапоптотическими аллельными вариантами. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клиническая характеристика обследованных больных первичной открытоугольной глаукомой и здоровых резидентов В работе с обследуемыми людьми соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинской Декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki 1964, 2000 ред.). Методом сплошной выборки в процесс исследования были включены 178 (90 женщин, 88 мужчин) больных первичной открытоугольной глаукомой (ПОУГ) русской национальности, а также 78 (39 женщин и 39 мужчин) больных бурятской национальности, проживающих на территории Забайкальского края. В качестве контрольной группы обследовано 190 русских (99 женщин, 91 мужчина) и 80 резидентов бурятской национальности (42 женщины, 38 мужчин), не имеющих острых и хронических заболеваний глаз и соматической патологии, приводящей к вторичному поражению глаз. Все больные ПОУГ имели характерные изменения диска зрительного нерва, открытый иридокорнеальный угол и типичные дефекты полей зрения. Па6
Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com)
циенты с вторичной глаукомой любой этиологии, а также пациенты с закрытым иридокорнеальным углом были исключены из группы обследуемых. Средние показатели внутриглазного давления (ВГД) среди русских больных ПОУГ составили 22,8 ± 0,9 мм, среди пациентов бурятской национальности - 21,6 ± 0,6 мм, в группе контроля - 18,7 ± 0,9 мм и 17,9 ± 0,8 мм соответственно. Среднее значение экскавации диска зрительного нерва для группы больных ПОУГ - 0,8, для группы контроля - 0,3. В группе русских больных ПОУГ двусторонний процесс (поражены оба глаза) выявлен у 85 человек (47,8%), односторонний процесс - у 93 человек (52,2%). Среди резидентов бурятской национальности - у 41 человека (52,6%) и 37 человек (47,4%) соответственно. Методы исследования Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для молекулярно-генетического исследования были выбраны 3 точечные мутации: р53(С72G), р21(С31А) и TNF (G308A). Для получения образцов ДНК использовался буккальный эпителий. Выделение ДНК проводилось с помощью набора "Минипреп", версия с магнитными частицами, "Силекс" (Москва), реактивы "Евроген" (Москва), "Литех" (Москва). Амплификацию проводили на термоциклере модель 110 (ООО "Биоком", Москва). Анализ продуктов амплификации произведен методом электрофореза. Для проведения электрофореза использовался 2% агарозный гель с добавлением бромистого этидия. Иммуноферментный анализ. В слезной жидкости больных глаукомой и здоровых резидентов определяли концентрацию TNF и IL-1 методом иммуноферментного анализа с применением коммерческих тест-систем (ЗАО "Вектор-Бест", Новосибирск). Клинические методы исследования. Больные первичной открытоугольной глаукомой и здоровые резиденты прошли офтальмологическое обследование: рефрактометрию, биомикроскопию, периметрию, тонометрию, визометрию, гониоскопию. Статистическая обработка материала. Полученные данные обрабатывались методом вариационной статистики с применением пакета прикладной программы "BIOSTAT" и программы статистического анализа Microsoft Excel, версия ХР, с определением достоверности различий при достигнутом уровне значимости p<0,05. Параметры цитокинов приведены в виде средних величин со стандартным отклонением (M±SD), достоверность различий оценивалась по парному t-критерию Стьюдента для нормально распределенных переменных. Для сравнения частот и групп по качественному бинарному признаку 7
Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com)
применялся критерий 2 (Пирсона). Для измерения силы и направления связи между изучаемыми явлениями использовался коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Вычислялся абсолютный риск развития глаукомы в группе носителей проапоптотических и антиапоптотических вариантов исследуемых генов, а также относительный риск (ОР) и отношение шансов. Для определения частот аллельных вариантов генов применялся закон Харди-Вейнберга. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Полиморфизм 72 кодона р53 среди представителей русской и бурятской этнической группы Среди здоровых представителей русской этнической группы выявлено: 160 Arg гомозигот (84,2 %), 25 Pro/Arg гетерозигот (13,2 %), пять Pro гомозигот (2,6 %). Из 30 обследуемых, у которых выявлены аномальные гены, мужчины составили 19 человек (63,3%), женщины - 11 человек (36,7%). В группе русских пациентов, страдающих ПОУГ, распределение генотипов имело следующий вид: 82 Arg гомозиготы (46,1%), 72 Pro/Arg гетерозигот (40,4%), 24 Pro гомозиготы (13,5%) (рис.1). Частота аллели Pro среди больных ПОУГ составила q=0,32, что значительно выше, чем среди здоровых резидентов, q=0,08 (р<0,01). В то же время аллель Arg оказалась менее распространенной в группе больных глаукомой (p = 0,68), по сравнению с контрольной группой, p = 0,92 (р<0,05) (табл. 1). 100% 84.20%
46,10%* 50%
40,40%** 13.20%
13,50%** 2.60%
0%
Группа контроля Нормальные гомозиготы
Гетерозиготы
Больные ПОУГ Аномальные гомозиготы
Рис. 1. Полиморфизм кодона72 р53 среди русских резидентов. Примечание: достоверность различий между группами носителей мутаций условно здоровых и больных - (2-тест) ** - р<0,01, * - р<0,05. 8
Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com)
Таким образом, 53,9% больных первичной открытоугольной глаукомой имели проапоптотический аллельный вариант гена р53, в то время как среди здоровых резидентов данный полиморфизм встречался только в 15,8% случаев (р<0,05). Следовательно, носительство пролиновой аллели в русской этнической группе предрасполагает к апоптозу ганглиозных клеток сетчатки и развитию первичной открытоугольной глаукомы. Значительный процент гетерозиготного состояния проапоптотического варианта р53 в группе больных ПОУГ, можно объяснить тем, что мутации в одной из аллелей гена р53 вызывают инактивацию продукта второй, неповрежденной аллели. Коэкспрессирующиеся нормальный и мутантный белок р53 образуют неактивные гетеромерные комплексы, что приводит к подавлению функции нормального белка р53 по доминантно-негативному механизму (Reed J., 1995). Среди обследуемых бурятской национальности, распространенность проапоптотической С-аллели (Pro) оказалась выше как среди больных ПОУГ, так и среди здоровых резидентов по сравнению с русской этнической группой (р<0,05). В группе здоровых бурят выявлено 24 Arg гомозиготы (30%), 40 Pro/ Arg гетерозигот (50%) и 16 Pro гомозигот (20%). В группе больных первичной открытоугольной глаукомой бурятской национальности гомозиготное носительство Arg выявлено у 16 человек (20,7%), гетерозиготы Pro/Arg составили 22 человека (28 %), гомозиготное носительство Pro обнаружено у 40 человек (51,3%) (рис. 2). 60%
51,30%*
50,20%
40% 28,00%*
30.10% 19.70%
20%
20,70%*
0%
Группа контроля Нормальные гомозиготы
Гетерозиготы
Больные ПОУГ Аномальные гомозиготы
Рис. 2. Полиморфизм кодона72 р53 среди лиц бурятской национальности. Примечание: достоверность различий между группами носителей мутаций условно здоровых и больных - (2-тест) * - р<0,05, ** - р<0,01. 9
Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com)
Установлено, что частота Pro-аллели среди больных ПОУГ составила q=0,55, что незначительно выше, чем среди здоровых резидентов, q=0,45 (р<0,05), частота Arg аллели - p=0,45 и p=0,55 соответственно (табл. 1). В группе русских больных ПОУГ корреляционная связь между наличием проапоптотичесой С-аллели р53(С72G) и заболевания сильно выражена (r = 0,85; 0,7<r<0,9, коэффициент ранговой корреляции Спирмена). Относительный риск развития первичной открытоугольной глаукомы в группе носителей проапоптотической аллели р53 в 3,4 раза выше (ОР>1), чем среди лиц с нормальными аллельными вариантами. Отношение шансов (ОШ) равно 6,32. В группе больных ПОУГ бурятской национальности корреляционная связь между наличием проапоптотической аллели С72G р53 и наличием заболевания значительна (r = 0,55; 0,5<r<0,7). Относительный риск развития первичной открытоугольной глаукомы в группе носителей проапоптотической аллели р53 в 1,25 раз выше (ОР>1), чем среди лиц с С-аллельным вариантом. Отношение шансов равно 1,66 (табл.2). Таким образом, наряду с более высокой распространенностью проапоптотической аллели р53 в бурятской этнической группе, пенетрантность С-варианта (Pro) выше у лиц русской национальности. Среди больных с поражением обоих глаз частота проапоптотической аллели выше как среди бурят, так и среди русских резидентов (р<0,05). Из 85 русских пациентов, имеющих поражение обоих глаз, 68 человек (80%) явились носителями проапоптотического полиморфизма р53, из них 20 обследуемых (23,5%) - в гомозиготном состоянии. Частота встречаемости Pro-аллели в группе больных с двусторонним поражением глаз составила q=0,55, что выше, чем в общей группе больных ПОУГ, q=0,32 (р<0,05). Из 41 пациента бурятской национальности, имеющего поражение обоих глаз, 33 человека (80,5%) оказались носителями проапоптотического варианта р53, из них 20 обследуемых (48,9%) - в гомозиготном состоянии. В то же время частота встречаемости Pro-аллели в группе больных с двусторонним поражением глаз составляет q=0,56, что незначительно превышает показатель в общей группе больных ПОУГ, q=0,55 (p>0,05). Принимая во внимание более высокую распространенность проапоптотической аллели у больных с двусторонним глаукоматозным процессом, можно предположить, что пролиновый вариант р53 влияет на скорость прогрессирования и тяжесть течения заболевания. Вместе с тем, экспрессивность проапоптотического полиморфизма р53 выше в русской этнической группе. В группе здоровых носителей пролиновой аллели р53 (С-вариант) русской национальности отмечался более низкий уровень внутриглазного давления по сравнению остальными резидентами. Среди представителей группы 10
Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com)
контроля с проапоптотическими полиморфизмами р53 средний уровень ВГД составил 16,2±0,9 мм, в то время как в общей группе здоровых - 18,7±0,9 мм (р<0,05). Аналогичная тенденция, наблюдается и у здоровых лиц бурятской национальности. Среди бурятских резидентов с С-аллельным вариантом, средний уровень ВГД составил 16,7±0,9 мм, в то время как в общей группе здоровых индивидуумов - 17,9±0,8 мм (р<0,05). Известно, что повышение внутриглазного давления опосредованно запускает процесс апоптоза ганглиозных клеток сетчатки и приводит к поражению зрительного нерва (Kaiser H. et al., 1996). Проапоптотическая активность гена р53 варьирует у разных индивидуумов в связи с генетическим полиморфизмом. Из полученных данных видно, что здоровые резиденты с проапоптотическим полиморфизмом р53 имели более низкий уровень внутриглазного давления, чем индивидуумы с антиапоптотическим полиморфизмом. Таким образом, можно предположить, что именно имеющийся низкий уровень ВГД позволял данным индивидуумам избежать развития глаукоматозного процесса, в то время как лица с антиапоптотическим полиморфизмом р53 оставались здоровыми при более высоком уровне внутриглазного давления. Следовательно, полиморфизм р53, обуславливая проапоптотическую предрасположенность клетки, детерминирует резистентность ганглиозных клеток сетчатки к воздействию повышенного внутриглазного давления и определяет уровень толерантного внутриглазного давления. Полиморфизм TNF G308A среди представителей русской и бурятской этнической групп Среди здоровых представителей русской этнической группы выявлено 168 нормальных гомозигот (88,4%), 19 гетерозигот (10%), 3 патологические гомозиготы (1,6 %). Частота встречаемости проапоптотической A-аллели среди здоровых резидентов составила q=0,04, распространенность нормальной G-аллели - p = 0,96. В группе русских пациентов, страдающих ПОУГ, распределение генотипов имело следующий вид: 5 патологических гомозигот (2,8%), 63 гетерозиготы (35,4%), 110 нормальных гомозигот (61,8%). Частота проапоптотической A-аллели среди больных ПОУГ составила q = 0,18, что значительно выше, чем среди здоровых резидентов, q = 0,04 (р<0,01), в то же время нормальная Gаллель оказалась менее распространенной в группе больных глаукомой (p = 0,82) по сравнению с контрольной группой, p = 0,96 (р<0,01) (табл. 1). В бурятской этнической группе наблюдалась аналогичная тенденция. В контрольной группе выявлено 67 нормальных гомозигот TNF (84,2%) и 13 гетерозигот (15,8%). 11
Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com)
Среди пациентов, страдающих первичной открытоугольной глаукомой, распределение генотипов оказалось следующим: 43 нормальные гомозиготы (55,2%), 27 гетерозигот (35,4%), 8 патологических гомозигот (9,4%). Частота аномальной A-аллели TNF среди больных ПОУГ составила q = 0,26, что значительно выше, чем среди здоровых резидентов, q = 0,08 (р<0,01), в то же время нормальная аллель менее распространена в группе больных глаукомой (p = 0,74), по сравнению с контрольной группой, p = 0,92 (р<0,05) (табл. 1). В целом, доля генотипов с проапоптотическим вариантом TNF в бурятской этнической группе выше, чем среди представителей русской национальности (р<0,05). Корреляционная связь между наличием аномальной аллели TNF и глаукомой сильно выражена в обеих этнических группах (r = 0,80 и r = 0,85; 0,7<r<0,9). Относительный риск развития первичной открытоугольной глаукомы в группе русских носителей проапоптотической аллели в 3,29 раз выше (ОР>1), чем среди лиц с нормальным аллельным вариантом ( р<0,05). Отношение шансов (ОШ) равно 4,72. В бурятской этнической группе относительный риск развития первичной открытоугольной глаукомы среди носителей патологической аллели TNF в 2,75 раз выше (ОР>1), чем среди резидентов с нормальными аллельными вариантами. Отношение шансов (ОШ) равно 4,19 (табл.2). Распространенность проапоптотической аллели в группе русских пациентов с двусторонним поражением глаз составила 0,38, что больше, чем в общей группе пациентов русской национальности - q=0,18 ( р<0,01). Частота встречаемости аномальной аллели в группе бурят с двусторонним поражением глаз оказалась q = 0,31, что также несколько выше, чем в общей группе бурят, страдающих ПОУГ, q = 0,26 (р<0,05). Таким образом, полиморфизм TNF влияет на риск развития и на тяжесть течения глаукомы в обеих этнических группах. В то же время, сравнивая частоту встречаемости проапоптотических полиморфизмов и степень риска развития заболевания среди русского и бурятского населения Забайкальского края, можно отметить, что пенетрантность гена TNF выше в русской этнической группе. Экспрессивность аномального полиморфизма высока в обеих этнических группах, с незначительным преобладанием среди русских резидентов. Полиморфизм С31А р21 среди представителей русской и бурятской этнических групп Забайкальского края Нами был проведен анализ частоты мутаций 31 кодона гена р21 среди 270 здоровых резидентов, 178 русских больных и 78 больных бурятской национальности. 12
Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com)
Среди здоровых представителей русской этнической группы выявлено 144 Ser гомозиготы (75,8 %), 32 Ser/Arg гетерозиготы (16,8 %) и 14 Arg гомозигот (7,4 %). В группе русских пациентов, страдающих ПОУГ, генотипы распределились следующим образом: 123 Ser гомозиготы (69,1%), 41 Ser/Arg гетерозигота (23%), 14 Arg гомозигот (7,9%). Частота проапоптотической аллели Arg среди больных ПОУГ составила q = 0,28, что выше, чем среди здоровых резидентов - q = 0,13 (р<0,01), в то же время аллель Ser оказалась менее распространенной в группе больных глаукомой (p = 0,72), по сравнению с контрольной группой , p = 0,87 (р<0,05) (табл. 1). Доля генотипов с проапоптотическим вариантом р21 в бурятской этнической группе в целом незначительно выше, чем среди представителей русской национальности. Частота аллели Arg среди бурят, страдающих ПОУГ составила q = 0,29, что больше, чем среди здоровых резидентов - q = 0,19 (р<0,05). Частоты Ser аллели для лиц с ПОУГ и здоровых людей: p = 0,71 и p = 0,81 соответственно (р<0,05) (табл. 1). Корреляционная связь между наличием аномальной аллели р21 и глаукомой сильно выражена в русской этнической группе (r = 0,8; 0,7<r<0,9), в то время как среди резидентов бурятской национальности менее значительна (r = 0,5; 0,3<r<0,5). Относительный риск развития первичной открытоугольной глаукомы среди русских носителей проапоптотической аллели р21 в 1,4 раза выше (ОР>1), чем среди лиц с нормальными аллельными вариантами. Риск развития заболевания у носителей аргининовой аллели в бурятской Таблица 1 Частоты аллельных вариантов р53, р21 и TNF среди больных ПОУГ и здоровых индивидуумов в различных этнических группах
р53 TNF р21
G (Arg) C (Pro) G-вариант А-вариант А (Ser) С (Arg)
Русские Больные Группа ПОУГ контроля 0,68* 0,92 0,32** 0,08 0,82* 0,96 0,18** 0,04 0,72* 0,87 0,28* 0,13
Буряты Больные Группа ПОУГ контроля 0,45* 0,55 0,55* 0,45 0,74* 0,92 0,26** 0,08 0,71* 0,81 0,29* 0.19
Примечание: достоверность различий между группами носителей мутаций условно здоровых и больных (2-тест) - * - р<0,05, ** - р<0,01. 13
Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com)
этнической группе в 1,1 раза выше (ОР>1), чем среди лиц с нормальными аллельными вариантами. Отношение шансов (ОШ) равно 1,1 (табл.2). Полученные результаты демонстрируют роль полиморфизма р21(С31А) в развитии первичной открытоугольной глаукомы в обеих этнических группах. Частота проапоптотической С-аллели (Arg) выше среди больных ПОУГ русской и бурятской национальности, чем среди здоровых резидентов ( р<0,01). В группе больных распространенность С-варианта среди русских и бурят практически одинакова (р>0,05), но принимая во внимание частоту проапоптотической аллели в этнической группах в целом (р<0,05), а также показатели относительного риска, можно утверждать, что пенетрантность проапоптотического полиморфизма р21 ниже у лиц бурятской национальности. Из 85 русских пациентов, имеющих поражение обоих глаз, 43 человека (50,6%) явились носителями патологического варианта С31А р21, из них 11 обследуемых (12,9%) - в гомозиготном состоянии. Частота встречаемости Arg-аллели в группе больных с двусторонним поражением глаз - q = 0,36, что выше, чем в общей группе, страдающих ПОУГ (q=0,28) (р<0,05). В бурятской этнической группе 29,3% пациентов - носители проапоптотического варианта р21, из них 14,6% обследуемых - в гомозиготном состоянии. Частота встречаемости Arg аллели в группе бурят с двусторонним поражением глаз составила q=0,38, что также выше, чем в общей группе больных ПОУГ, q = 0,29 (р<0,05). Таким образом, наряду с влиянием полиморфизма р21 на риск развития глаукомы, проапоптотические варианты данного гена также могут определять скорость прогрессирования и тяжесть течения глаукоматозного процесса как у русских больных ПОУГ, так и у бурят, причем на экспрессивность проапоптотических полиморфизмов р21 этнический фактор не оказывает значительного влияния. Таблица 2 Относительный риск и отношение шансов возникновения ПОУГ у носителей нормальных и аномальных аллелей р53, TNF и р21 в различных этнических группах р53 Относительный риск Отношение шансов
TNF Русские Буряты
Русские
Буряты
3,4*
1,25
3,29*
6,32**
1,66
4,72*
р21 Русские
Буряты
2,75
1,4
1,1
4,19
1,5
1,1
Примечание: достоверность различий между русской и бурятской этнической группой - * - р<0,05, ** - р<0,01. 14
Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com)
Сочетание проапоптотических полиморфизмов р53(С72G), р21 (С31А) и TNF (G308A) в русской и бурятской этнических группах Сочетание проапоптотических аллелей в гомозиготном состоянии имели шесть русских больных ПОУГ, из них: пять человек - сочетание двух аллелей, один пациент - гомозиготные варианты по трем генам. Из трех резидентов, имеющих сочетание прапоптотических аллелей р53 и р21, один обследуемый наблюдался с развитой стадией глаукомы, два пациента - с терминальной стадией глаукомы, причем у всех пациентов выявлено поражение обоих глаз. Из двух резидентов с сочетанием С-аллельного варианта р53 и А-аллельного варианта TNF один имел терминальную, а другой - далекозашедшую стадию глаукомы. Больной мужского пола с аномальным полиморфизмом трех генов страдал поражением обоих глаз, с развитой стадией глаукомы на одном и далекозашедшей стадией - на другом глазу. Таким образом, в русской этнической группе наиболее прогностически неблагоприятным является гомозиготное сочетание проапоптотических полиморфизмов генов р53и р21, на втором месте находится сочетанный полиморфизм р53(С72G) и TNF(G308A). Из 178 русских больных первичной открытоугольной глаукомой 44 обследуемых имели сочетание двух полиморфизмов и два пациента - сочетание трех полиморфизмов в гетерозиготном состоянии. Также были обследованы два пациента с сочетанием аномальных аллелей р21 и TNF в гетерозиготном состоянии и проапоптотической гомозиготы р53. 25 пациентов (56,8%) с проапоптотическим вариантом двух генов в гетерозиготном состоянии имели двустороннее поражение глаз, причем у 20 из них - на одном отмечалась далекозашедшая стадия. Из двух пациентов с сочетанием гетерозигот с проапоптотическими гомозиготами р53, один резидент также имел двустороннее поражение глаз в далекозашедшей стадии. Один из пациентов с сочетанием трех полиморфизмов имел двустороннее поражение глаз с развитой и далекозашедшей стадией глаукомы, другой - развитую стадию на обоих глазах. Сочетание двух аномальных аллелей в гомозиготном состоянии выявлено у семи пациентов бурятской национальности, страдающих первичной открытоугольной глаукомой, из них четыре резидента (57%) имели сочетание р53 и TNF, два обследуемых - р21 и р53, один пациент - TNF и р21. У всех носителей сочетанного полиморфизма TNF и р53 наблюдалось поражение обоих глаз. Пациенты с проапоптотическими полиморфизмами р21 и р53 имели двустороннее поражение глаз с далекозашедшей стадией на одном глазу. Носитель сочетанных вариантов TNF и р21 имел терминальную стадию на одном глазу и начальную - на другом. Необходимо отметить, что три из четырех случаев терминальной глауко15
Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com)
мы в бурятской популяции представлены сочетанными вариантами проапоптотических полиморфизмов р53 и TNF, и TNF и р21 в гомозиготном состоянии. Сочетание полиморфизмов в гетерозиготном состоянии наблюдалось у 18 пациентов, у восьми из них: р53 и TNF, р21 и р53 - в двух случаях, TNF и р21 - у восьми резидентов. Сочетание гетерозиготного варианта р21 с аномальной гомозиготой р53 выявлено в шести случаях. У десяти пациентов (55,6%) с сочетанными гетерозиготами отмечалось поражение обоих глаз, у 11 резидентов (61,1%) выявлена далекозашедшая стадия глаукомы, семь из них имели сочетанный вариант полиморфизма р53 и TNF. У больных с сочетанием гетерозиготного варианта р21 с аномальной гомозиготой р53 отмечалась развитая стадия глаукомы, у четырех (67,7%) пациентов заболевание протекало с поражением обоих глаз. Полученные результаты демонстрируют усугубляющее влияние сочетанных вариантов проапоптотических полиморфизмов на тяжесть течения глаукомы среди русских и бурят. Наиболее неблагоприятное влияние на риск развития и тяжесть течения глаукомы в обеих этнических группах оказывали сочетанные варианты полиморфизма р53. Таким образом, проапоптотические полиморфизмы р53(С72G), р21(С31А) и TNF (G308A) предопределяют поражение ганглиозных клеток сетчатки при воздействии пусковых факторов и повышают риск развития первичной открытоугольной глаукомы, скорость прогрессирования глаукоматозного процесса и тяжесть течения заболевания у представителей русской и бурятской этнических групп (рис. 3). Содержание провоспалительных цитокинов TNF и IL-1 в слезной жидкости русских больных ПОУГ и здоровых резидентов В слезной жидкости больных первичной открытоугольной глаукомой содержание провоспалительных цитокинов оказалось повышенным по сравнению с группой контроля. Концентрация IL-1 в группе обследуемых в 1,52 раза больше по сравнению с группой здоровых, а TNF в слезной жидкости превышает нормальные уровни от 3 до 6 раз (р<0,05). Содержание цитокинов среди пациентов-носителей различных аллельных вариантов р21, р53 и TNF, страдающих ПОУГ различается (р<0,05). Среди русских больных ПОУГ содержание TNF максимально повышено у носителей проапоптотических вариантов TNF и р53, и составляет 381,7±58,7 пкг/мл и 384,8±52,7пкг/мл соответственно. Наиболее высокий уровень IL-1 выявлен у резидентов с А-аллельным вариантом TNF, 59,6±8,1пкг/мл. Необходимо отметить, что высокие концентрации данного цитокина наблюдались у 16
Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com)
17
Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com)
Рис. 3. Концептуальная схема роли полиморфизмов р53, р21 и TNF в патогенезе первичной открытоугольной глаукомы.
больных с сочетанием аномальных полиморфизмов р53 и TNF. В группе больных с полиморфизмами TNF и р53 в гетерозиготном и гомозиготном состоянии уровни цитокинов различались незначительно (p>0,05), из чего можно предположить, что экспрессия проапоптотических полиморфизмов в гомо- и гетерозиготном состоянии одинаково влияет на содержание IL-1 и TNF. Концентрации провоспалительных цитокинов в слезе русских пациентов с антиапоптотическими вариантами генов р21, р53 и TNF отличаются от здоровых резидентов в меньшей степени (р<0,05). В группе контроля показатели IL-1 и TNF отличались от больных ПОУГ, но внутри группы здоровых резидентов, в зависимости от генотипа варьировали менее значительно. Максимальное их содержание наблюдалось у резидентов с проапоптотическим А-аллельным вариантом TNF: IL-1 - 37,5±9,1 пкг/ мл, TNF - 71,6±8,3 пкг/мл. Минимальная концентрация IL-1 выявлена у носителей G-аллельного варианта гена TNF, содержание TNF - у обследуемых с нормальным вариантом гена р21, 18,4±7,8 пкг/мл и 48,9±9,7 пкг/мл соответственно (р<0,05). В группе больных-носителей проапоптотических полиморфизмов русской национальности уровни провоспалительных цитокинов в слезной жидкости повышены более значительно по сравнению с носителями аналогичных вариантов в бурятской этнической группе. Следовательно, экспрессия проапоптотических аллелей более выражена среди русских больных ПОУГ по сравнению с представителями бурятской этнической группы. Содержание провосполительных цитокинов TNF и IL-1 в слезной жидкости больных ПОУГ и здоровых резидентов бурятской национальности В слезной жидкости больных первичной открытоугольной глаукомой бурятской национальности содержание IL-1 и TNF повышено по сравнению с группой контроля, но различия концентрации прововосполительных цитокинов среди здоровых и больных менее значительны по сравнению с русской этнической группой (р<0,05). В то же время в группе здоровых бурят уровень IL-1 и TNF ниже по сравнению с аналогичной группой русских обследуемых (р<0,05). Концентрация TNF максимально увеличена у носителей проапоптотических вариантов генов TNF и р53, и составила 378,7±68,3пкг/мл и 374,8+45,9 пкг/мл соответственно (р<0,01). Наиболее высокий уровень IL-1 отмечался у резидентов с A-аллельным вариантом TNF и составил 54,4±8,7пкг/мл. Минимальное содержание IL-1 выявлено в группе больных с G-аллельным вариантом TNF, а TNF - у носителей G-вари18
Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com)
анта р53 (36,3±8,8 пкг/мл и 151,4±59,2 пкг/мл соответственно). Необходимо отметить, что наиболее высокие концентрации как IL-1, так и TNF наблюдались у больных-носителей сочетаний проапоптотических полиморфизмов р53 и TNF (р<0,01), что повторяет аналогичную тенденцию в русской этнической группе. В группе контроля отмечались более низкие концентрации провоспалительных цитокинов в слезной жидкости, как по сравнению с больными ПОУГ, так и со здоровыми резидентами русской национальности (р<0,05). В то же время максимальные уровни TNF и IL-1, 70,7±10,4 пкг/мл и 32,7±8,3, наблюдались у представителей группы контроля с аномальным полиморфизмом TNF G308A (р<0,01). Таким образом, в слезной жидкости больных первичной открытоугольной глаукомой бурятской национальности содержание IL-1 и TNF ниже, чем в группе русских пациентов, что может свидетельствовать о менее интенсивном течении апоптотического процесса и меньшей экспрессивности проапоптотических полиморфизмов у представителей данной этнической группы. Концентрации провоспалительных цитокинов в слезной жидкости здоровых людей с проапоптотическим полиморфизмом р53 были выше, чем с антиапоптотическими вариантами (р<0,05). Данное явление можно расценивать как дополнительный аргумент в пользу генетической детерминированности проапоптотической предрасположенности ганглиозных клеток сетчатки и уровня толерантного внутриглазного давления, обусловленного этой предрасположенностью. ВЫВОДЫ 1. Распределение частот проапоптотических аллельных вариантов р53(С72G), р21(С31А) и TNF (G308A) у резидентов Забайкальского края имеет этнические особенности. Частота встречаемости р53(С72G), р21(С31А) и TNF (G308A) относительно выше среди лиц бурятской национальности, как в группе больных ПОУГ, так и здоровых лиц. 2. Больные первичной открытоугольной глаукомой в обеих этнических группах являются носителями исследуемых проапоптотических полиморфизмов р53, р21 и TNF чаще, чем здоровые резиденты. Частота встречаемости неблагоприятных аллельных вариантов выше в группе больных ПОУГ бурятской национальности, что связано с высокой распространенностью проапоптотических аллелей среди бурятского населения в целом. Экспрессивность и пенетрантность проапоптотических полиморфизмов р53 и TNF выше среди русского населения. 3. Риск развития первичной открытоугольной глаукомы выше у лиц-носителей 19
Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com)
проапоптотических аллельных вариантов генов TNF, р53, р21 в обеих этнических группах. Относительный риск развития первичной открытоугольной глаукомы выше у носителей проапоптотических аллельных вариантов р53, р21 и TNF среди русских резидентов в сравнении с лицами бурятской национальности. Максимальная вероятность возникновения первичной открытоугольной глаукомы наблюдается в группе русских носителей проапоптотических полиморфизмов гена р53. 4. Сочетанные формы проапоптотических полимоморфизмов генов р53, р21 и TNF являются более прогностически неблагоприятными для риска развития глаукомы среди русского и бурятского населения Забайкальского края. 5. Частота встречаемости проапоптотических полиморфизмов р53, р21 и TNF выше в группе больных с поражением обоих глаз русской и бурятской национальности. Наиболее неблагоприятное влияние на прогрессирование глаукоматозного процесса и развитие двухстороннего поражения глаз оказывает сочетанный полиморфизм р53 в обеих этнических группах. 6. В обеих этнических группах содержание провоспалительных цитокинов в слезной жидкости больных ПОУГ повышено по сравнению со здоровыми резидентами. Концентрации IL-1 и TNF у лиц-носителей проапоптотических полиморфизмов значительно больше, чем у носителей антиапоптотических вариантов. В слезной жидкости русских больных концентрации провоспалительных цитокинов выше, чем у пациентов бурятской национальности. Содержание IL-1 и TNF максимально у носителей проапоптотических аллельных вариантов генов TNF и р53. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. С целью повышения эффективности ранней диагностики ПОУГ следует включить определение проапоптотических полиморфизмов генов р53(С72G), р21(С31А) и TNF(G308A) в алгоритм обследования больных с подозрением на глаукому, а также осуществлять медико-генетическое консультирование лиц с отягощенной наследственностью по данному заболеванию. 2. С целью прогнозирования скорости прогрессирования глаукоматозного процесса и тяжести течения заболевания следует проводить исследование полиморфизмов р53(С72G), р21(С31А) и TNF(G308A) при обследовании больных с первичной открытоугольной глаукомой.
20
Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com)
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Белоусова А. И. Генетические механизмы апоптоза в патогенезе первичной открытоугольной глаукомы /А.И. Белоусова, Ю.А. Витковский// Дальневосточный медицинский журнал. - 2008. - №4. - С. 113-115. 2. Белоусова А. И. Генетические маркеры первичной открытоугольной глаукомы в различных этнических группах /А.И. Белоусова, Ю.А. Витковский / / Забайкальский медицинский вестник. - 2008. - №2. - С. 38-43. 3. Белоусова А. И. Полиморфизм гена р21 как фактор риска первичной открытоугольной глакомы среди населения Забайкальского края /А.И. Белоусова, Ю.А. Витковский, Н.А. Логунов, В.В. Комаров //Забайкальский медицинский вестник. - 2009. - №3. - С. 19-21. 4. Белоусова А. И. Генетические механизмы апоптоза в патогенезе первичной открытоугольной глаукомы в различных этнических группах/ А.И. Белоусова, Ю.А. Витковский// Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины: Тез. докл. Всероссийской научно- практической конференции. - Чита, 2008. - С.168 -169. 5. Белоусова А. И. Генетические механизмы первичной открытоугольной глаукомы в различных этнических группах /А.И. Белоусова, Ю.А. Витковский // Сборник научно-практических статей третьей межрегиональной конференции, посвященной 100-летию офтальмологии Забайкальского края. - Чита, 2009. - С.75 - 76. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВГД - внутриглазное давление ГКС - ганглиозные клетки сетчатки ДЗН - диск зрительного нерва ПОУГ - первичная открытоугольная глаукома ОР - относительный риск ОШ - отношение шансов Cdk - циклин-зависимая киназа IL - интерлейкин TNF - фактор некроза опухолей
21
Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com)
22
Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com)
Лицензия ИД №03077 от 23.10.00. Подписано в печать 19.05.10. Бумага офсетная. Формат 60 х 84 1/16. Усл.печ.л-1,0 Тираж 100. Заказ № 832010. Отпечатано в информационно-издательском центре ЧГМА 672090, Чита, ул. Горького, 39а. 23
Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com)