1 Familia Enterobacteriaceae DEFINICIĂ“N Se define como bacilos Gram negativo fermentadores de glucosa, oxidasa negativa que reducen los nitratos a nitritos. Actualmente se han descrito 27 gĂŠneros, 102 especies y 8 grupos entĂŠricos. Los gĂŠneros mĂĄs destacados son: Escherichia coli. Salmonella spp. Yersinia spp. Shigella spp.
Fig. 1-3. Estructura enterobacterias.
antigĂŠnica
de
las
HABITAD: Las enterobacterias estĂĄn ampliamente distribuidas en la naturaleza, se encuentran en el intestino de humanos y animales, suelo, agua y plantas.
GĂŠnero: Escherichia coli. Fig. 1-1. Enterobacterias
CARACTERĂ?STICAS FUNDAMENTALES CARACTERĂ?STICAS FUNDAMENTALES Bacilo Gram negativo de 0.3-1.0 x 1.0-6.0 đ?œ‡đ?‘š. Usualmente mĂłviles con flagelos peritricos. No esporulados. Son catalasa positivos y oxidasa negativos. Fermentan la glucosa con producciĂłn de ĂĄcido o ĂĄcido y gas. Reducen nitrato a nitrito. Tienen un contenido de G+C del 39-59% (contenido de guanina y citosina). Requerimientos nutricionales simples. Crecimiento a las 18-24 horas de incubaciĂłn en una gran variedad de medios selectivos.
Son bacilos pequeĂąos. MĂłviles por medio de flagelos peritricos o inmĂłviles. No forman esporas. Crecen fĂĄcilmente en medios de laboratorio. Fermentan muchos carbohidratos y alcoholes, fermentan la lactosa a 44.5ÂşC con producciĂłn de ĂĄcido y gas dentro de 24 horas. Generalmente anaerobias facultativas. Catalasa positiva y oxidasa negativa. Forman parte de microbiota.
Fig. 1-4. Bacteria Escherichia coli aislada
CLASIFICACIĂ“N Y HABITAD ClasificaciĂłn de E. coli EnteropatĂłgena (ECEP)
Fig. 1-2. Pared Celular de bacteria Gram negativa.
CLASIFICACIĂ“N SEROLĂ“GICA AntĂgeno flagelar o antĂgeno H: AntĂgeno flagelados proteicos y termolĂĄbiles. AntĂgeno capsular o antĂgeno K: Capsulas bien definidas, propiedades antĂfagocitarias. AntĂgeno somĂĄtico o LPS O: Termoestable, constituciĂłn polisacĂĄrida.
EnterotoxigĂŠnico (ECET)
Enteroinvasivo (ECEI)
EnterohemorrĂĄgico (ECEH) Enteroagregativa (ECEA)
Habitad usual Humanos y Animales de sangre caliente Humanos y Animales de sangre caliente Humanos y Animales de sangre caliente Humanos y Animales de sangre caliente Humanos y Animales de sangre caliente
FACTORES QUE INFLUYEN EL CRECIMIENTO La temperatura: Una temperatura optima 37ºC, un rango de 7-50ºC. pH: un pH casi neutro es mejor para su crecimiento, puede crecer a un pH inferior a 4. aw: La mínima de crecimiento es de 0.95.
- Formación de una biopelícula sobre las células epiteliales. - Factor de virulencia: Adherencia agregativa, toxina Pet y Pic, sideróforos. - Codificación de virulencia: plásmidos de 60 mDa.
FACTORES DE VIRULENCIA E. coli Enteropatógena (ECEP): Contagio por alimentos y aguas contaminadas. Afecta a los lactantes. Tipo de diarrea: secretora Serotipos: O26:H11, O55:H6, O66:H34, O111:H2, O114:H y O127:H9 - Factor de virulencia: Adherencia localizada, adherencia íntima y esfacelamiento. - Codificación de virulencia: plásmidos de 60 mDa y genes cromosomales. -
-
-
E. coli Enterotoxigénico (ECET): Afecta a personas mayores a 5 años. Serotipos: O6:H11, O6:H9, O11:H27, O20: NM, O25:H42 y O76:H11. Factor de virulencia: enterotoxinas ST y/o LT, factores antigénicos de colonización. Codificación de virulencia: plásmidos de 60 mDa. Causa principalmente la diarrea de los viajeros. Síntomas: Ligera diarrea febril, hasta un síndrome grave como el cólera, dolor epigástrico, vómitos y heces acuosas sin sangre ni moco. Período de incubación: 12-36 hrs.
Fig. 1-5. Esquema de la patogenicidad intestinales de Escherichia coli.
MEDIOS DE CULTIVOS PARA E. coli Agar MacConkey: El medio es de color rojizo. Las colonias de las bacterias fermentadoras de lactosa se ven de color rojo o rosadas, rodeadas de una zona de precipitación de sales biliares. Esto es debido a que al fermentar la lactosa se produce acidez la cual hace precipitar las sales biliares y absorber el rojo.
E. coli Enteroinvasiva (ECEI): - Contagio por la ingesta de carne de hamburgués y leche sin pasteurizar. - Afecta a todas las edades. - Tipo de diarrea: Inflamatoria. - Serotipos: O28ac: NM, O29: NM, O112ac: NM, O115: NM y O124:H30 - Factor de virulencia: Invasividad. - Codificación de virulencia: plásmido de 130 mDa. - Síntomas: fiebre, dolor abdominal, malestar, diarrea acuosa, deposición con sangre. Moco y leucocitos fecales. - Poseen plásmidos enteroinvasores. - Enterotoxinas termoestables y termolábiles estimulan la hipersecreción. Fig. 1-6. Colonias de E. coli en agar MacConkey -
E. coli Enterohemorrágico (ECEH): Contagio por la ingesta de carne, leche y alimentos marinos. Afecta a todas las edades. Tipo de diarrea: inflamatoria Serotipos: O26:H11, O45:H2, O111:H8, O121:H19 y O157:H7 Factor de virulencia: Citotoxinas similares a la toxina shiga. Codificación de virulencia: Fagos. Síntomas: Colitis hemorrágica, síndrome urémico hemolítico y purpura trombocitopénica trombótica. Incubación de 3 a 4 días. Duración de 4 a 10 días.
E. coli Enteroagregativa (ECEA): - Afecta a todas las edades. - Tipo de diarrea: persistente y aguda. - Serotipos: O44:H18, O55, O111, O125, O126 y O128
Agar eosina azul de metileno (EMB): Los gérmenes fermentadores de lactosa y/o sacarosa dan colonias oscuras o bien con centro oscuro y periferia traslúcida. Escherichia coli suele presentar un brillo metálico característico. El color de las colonias se debe a la reacción de la eosina con el azul de metileno, formando un colorante compuesto neutro y la producción por parte de las colonias fermentadoras de un pH suficientemente bajo en el cual las colonias absorben el colorante.
AISLAMIENTO
Agar Tergitol 7: Fig. 1-7. Colonias de E. coli en agar EMB Permite diferencias especies fermentadoras de lactosa de las especies no fermentadoras. Presenta colonias rojizas o amarillas.
Fig. 1-8. Colonias de E. coli en agar Tergitol 7 Agar Hektoen: Contiene indicadores de fermentación de lactosa y producción ácido sulfhídrico, así como inhibidores que previenen el crecimiento de bacterias grampositivas.
Fig. 1-9. Colonias de E. coli en agar Hektoen
Género: Salmonella spp. CARACTERÍSTICAS FUNDAMENTALES Tiene forma de bacilos. Móvil anaerobio facultativo. No formadores de esporas. Las formas móviles tienen flagelos peritricos. Producen ácido y a veces gas a partir de glucosa, catalasa positiva y oxidasa negativa. Reduce los nitratos a nitritos. Descarboxila la lisina, arginina y ornitina y produce H2S.
Fig. 1-12. Bacteria Salmonella spp.
CLASIFICACIÓN Y HABITAD Clasificación de Salmonella spp.
Fig. 1-11. Resultado de las colonias
N.º de serotipos de la especie
S. enterica subsp. entérica (I)
1531
S. enterica subsp. salamae (II)
505
S. entérica subsp. arizonae (III a)
99
S. enterica subsp. diarizonae (III b)
336
S. enterica subsp. houtenae (IV)
73
S. enterica subsp. indica (VI)
13
S. bongori (V)
22
total
Habitad usual Humanos y Animales de sangre caliente Animales de sangre fría y ambiente Animales de sangre fría y ambiente Animales de sangre fría y ambiente Animales de sangre fría y ambiente Animales de sangre fría y ambiente Animales de sangre fría y ambiente
2579
FACTORES QUE INFLUYEN EL CRECIMIENTO La temperatura: Una temperatura mínima de 5,2°C, óptima 35-43ºC, un rango máximo de 46,2°C pH: un pH mínimo 3,8, óptimo a 7 – 7,5. aw: La mínima de crecimiento es de 0,94, óptima 0,99 y máxima >0,99.
FACTORES DE VIRULENCIA -
Salmonelosis: Contagio por ingesta de alimentos y agua contaminada. Reservado: Heces del hombre y animales. Incubación: 6 a 72 horas. Síntomas: Dolor abdominal, diarreas, vómitos, escalofríos, fiebre y náuseas. Duración: varios días. Modo de control: Control de la matanza de animales térmico adecuado, evitar contaminación cruzada, evitar proliferación. Serotipos: S. entritidis, S. typhimurium y S. virchow. Factor de virulencia: Exotoxinas y citotoxinas interrumpiendo la producción proteica.
MEDIOS DE CULTIVOS PARA Salmonella spp. Agar Desoxicolato: Supresor del crecimiento de coliformes y Gram positivas. Las colonias son pequeñas e incoloras; algunas cepas producen precipitado negro en el centro.
Fig. 1-15. Agar Desoxicolato en Salmonella Agar MacConkey (McK): Medio selectivo para bacterias Gram negativas, inhibe el crecimiento de bacterias gram positivas por las sales biliares y cristal violeta. Indicador rojo neutro permite identificar bacterias que fermentan lactosa. La Salmonella no fermentan lactosa, forman colonias incoloras o blancas. Fig. 1-13. Salmonelosis en el organismo Fiebre Tifoidea: - Contagio por ingesta de alimentos y agua contaminada con materia fecal. - Reservado: El hombre - Incubación: 10 - 20 horas. - Síntomas: Infección sistémica, fiebre alta, dolor abdominal, cefalea, vómitos y diarreas - Duración: varias semanas. - Modo de control: Control de la matanza de animales térmico adecuado, evitar contaminación cruzada, evitar proliferación. - Serotipos: S. typhi. - Factor de virulencia: Enterotoxina (causa diarrea) similar a la toxica del cólera.
PATOGENICIDAD - Salmonella invade la luz del intestino delgado, donde se multiplica. - Penetran el íleon y en menos extensión el colon, donde ocurre una inflamación. - Los folículos linfáticos pueden llegar a agrandarse y ulcerarse. Los ganglios mesentéricos frecuentemente se hinchan. La Salmonella a veces sobrepasa las barreras mucosas y linfáticas y llega a la corriente sanguínea y da un aumento a los abscesos en varios tejidos.
Fig. 1-16. Agar MacConkey en Salmonella Agar bismuto sulfito: Utilizado como un inhibidor de la mayoría de organismos comensales. Generalmente aceptado como medio de rutina para la detección de la mayoría de Salmonella, en particular Salmonella typhi. Las colonias pueden ser café, gris o negras con o sin brillo metálico.
Fig. 1-14. Mecanismo de patogenicidad Fig. 1-17. Agar Bismuto sulfito en Salmonella
Agar Salmonella – Shigella (SS): Inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas. Las colonias son traslúcidas, algunas con negro por la producción de ácido sulfhídrico.
Fig. 1-18. Agar Salmonella-Shigella en Salmonella
Fig. 1-19. Flujograma de ISO 19250:2010 análisis de Salmonella en agua
Preparación de la muestra por placa petri
Género: Yersinia spp.
Esquema para Aislamiento y Tipificación de Salmonella spp.
Fig. 1-21. Yersinia pestis
CARACTERÍSTICAS FUNDAMENTALES Tiene forma de bacilos cortos. Inmóviles. Capsulados: Posee una cubierta mucilaginosa. Anaerobio y anaerobios facultativo. Catalasa positiva y lactasa negativa. Carecen de motilidad. Coloración Giemsa: forma bipolar.
Fig. 1-20. Bacteria Yersinia spp.
CLASIFICACIÓN Y HABITAD
Clasificación de Yersinia
Y. pestis Y. enterocolitica
Y. pseudotuberculosis
Habitad usual Estómago de varias especies de pulgas o en la sangre o tejidos de los roedores hospedadores Los roedores son el principal reservorio natural, cerdos y conejos. Roedores, animales salvajes y aves de caza
FACTORES QUE INFLUYEN EL CRECIMIENTO La temperatura: Una temperatura mínima de -1°C, óptima 25-32ºC y un rango máximo de 42°C pH: un pH mínimo 4, óptimo de 7,6 y máximo de 10. aw: La mínima de crecimiento es de 0,95 y óptima 0,97.
FACTORES DE VIRULENCIA -
Yersinia pestis: Contagio por picadura de la pulga. Reservado: Heces del hombre y animales. Incubación: 1a 7 horas. Síntomas: Tos, con sangre en la expectoración (esputo), falta de aliento, náuseas, vómitos, fiebre alta, dolor de
cabeza, debilidad y dolor en el pecho.
- Formas clínicas: bubónica y neumónica Factor de virulencia: Proteínas que les permite crecer en un ambiente con niveles bajos de Ca, toxina murina (exotoxina) inhibe la respiración celular y activador de coagulasa. Yersinia enterocolitica: - El humano se infecta por consumir alimentos contaminados con excretas de alimentos. - Se encuentra en el intestino de diversos animales. - Ingresa vía oral y se multiplican en la mucosa intestinal. - Incubación: 1a 7 horas. - Síntomas: Fiebre, diarreas con presencia de leucocitos, dolor abdominal y sangre en heces. - Formas clínicas: bubónica y neumónica. - Factor de virulencia: Invasivo, adherencia e invasión (3 proteínas).
MEDIOS DE CULTIVOS PARA Yersinia spp. Agar MacConkey (McK): Medio selectivo para bacterias Gram negativas, inhibe el crecimiento de bacterias gram positivas por las sales biliares, separa las bacterias no fermentadoras; forman colonias de color transparente y rosadas.
Fig. 1-24. Yersinia en Agar MacConkey.
Fig. 1-22. Virulencia de Yersinia enterocolitica Yersinia pseudotuberculosis: -
Agar sangre: El agar sangre es una combinación de un agar base con el agregado de 5 % de sangre ovina, también puede usarse sangre humana, para cultivos en una placa de Agar. El agar sangre aporta muchos factores de enriquecimiento. Se usa también para ver la capacidad hemolítica de los microorganismos patógenos. Las colonias son de color rojos, halos verdosos y algunos incoloros .
El humano se infecta por consumir alimentos contaminados con excretas de alimentos como la rata. Ingresa vía oral y se multiplican en la mucosa intestinal. Síntomas: Fiebre, sarpullido y dolor abdominal, incluido el síndrome de falsa apendicitis. Factor de virulencia: Pilis adherencia e invasión. Lugar de acción: zona torácica o en los espacios interarticulares. PATOGENICIDAD - Cepas virulentes, colonizan e ID. - Llega a nódulos linfáticos mesentéricos. Mucho dolor abdominal derecho simula apendicitis. - Atraviesan la mucosa y penetran en el interior de las células presentadores de antígenos de las placas de Peyer.
Fig. 1-25. Yersinia en Agar de sangre. Agar chocolate: Es un medio de cultivo enriquecido y no selectivo. Es una variante del agar sangre. Contiene glóbulos rojos que han sido lisados por el suave calentamiento a 56 °C.
Fig. 1-23. Mecanismo de patogenicidad.
Fig. 1-26. Yersinia en Agar Chocolate.
2 Familia Micrococcaceae Este género tiene por lo menos 45 especies, de las cuales 4 son encontradas con mayor frecuencia y las más importantes en términos clínicos son: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis Staphylococcus lugdunensis Staphylococcus saprophyticus.
Especie: Staphylococcus aureus
La Familia Micrococcaceae comprende cocos Gram positivos, catalasa positiva, con agrupación en racimos de 0.5 a 3.5 u de diámetro, Son aerobia o anaerobios facultativos. Producen ácidos sin gas a partir de la glucosa, todas sus cepas crecen en presencia de 7.5% hasta 20% de NaCL como máximo. La presencia de este microorganismo en un alimento son indicadores de una contaminación a partir de la piel, boca, y fosas nasales debido a una mala manipulación en los alimentos. Los géneros más destacados son: ❖ Streptococcus ❖ Planococcus ❖ Staphylococcus ❖ Micrococcus
Género: Staphylococcus
Se caracterizan por ser células esféricas grampositivas formando generalmente racimos irregulares, son no flagelados y no forman esporas. Se desarrollan mejor en condiciones aeróbicas, pero son facultativamente anaerobios. Producen catalasa (enzima capaz de desdoblar el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno libre); característica que se utiliza para diferenciar el Staphylococcus del Streptococcus y del Enterococcus que son catalasa negativos. Crecen en condiciones con elevada concentración de NaCl (10%) por esto puede crecer en el agua del mar y en una temperatura entre 18℃ y 40 ℃. Poseen un poder fermentativo alto degradando muchos azúcares como la glucosa, sacarosa y la fructosa. Crecen bien en medios generales y son bastantes resistentes a muchos agentes externos. Se encuentran en partes de las mucosas y de la piel e incluso en procesos infecciosos como intoxicaciones alimentarias, heridas y en general en distintos procesos patógenos produciendo supuración, formación de abscesos, infecciones piógenas hasta causar septicemia letal. El tipo de intoxicación alimentaria más frecuente se debe a las enterotoxinas estafilocócicas termoestables.
Es una bacteria patógena ubicua. Tamaño de los cocos son de 0.8 a 1 mm de diámetro. Son tolerantes a concentraciones de 7,5% de sal. Staphylococcus aureus es un microorganismo que se encuentra ampliamente diseminado en el ambiente ya que posee características particulares de virulencia y resistencia contra antibióticos, lo cual representa un grave problema de salud. En los humanos, causa una amplia variedad de enfermedades infecciosas y su principal impacto es ocasionado por las cepas de S. aureus, que son sumamente resistentes a la meticilina (MRSA) y otros antibióticos que antes eran eficaces contra el tratamiento de las infecciones que le han permitido convertirse en una de las bacterias más importantes en la clínica y en las enfermedades transmitidas por alimentos. La patogenicidad de las infecciones por Staphylococcus aureus se relaciona con diversos componentes de la superficie bacteriana; de manera general, los componentes del microbio son peptidoglicanos y ácidos teicoicos, además de la proteína A. Así pues, la patogenia provocada por este microorganismo surge cuando se produce la combinación de los factores de virulencia con la disminución de las defensas del huésped; Sin embargo, Staphylococcus aureus es importante no solo porque ocasiona infecciones en diversas partes del organismo humano, sino porque es una de las principales bacterias implicadas en enfermedades transmitidas por alimentos (ETA). Tales enfermedades son causadas por diversas acciones, incluyendo la capacidad del patógeno de producir toxinas y las infecciones ocurren por la ingesta de alimentos contaminados con las toxinas. Se encuentran presentes en el aire, la leche, el agua potable, aguas residuales y, desde luego, la comida o en el equipo donde los alimentos han sido elaborados.
Estructura Son uniformemente grampositivas y de tamaño regular. La pared celular del Staphylococcus aureus consiste en un típico peptidoglicano grampositivo entreverado con cantidades considerables de ácido teicoico. El peptidoglicano de la pared celular por lo común se encuentra cubierto de polisacáridos y proteínas superficiales. El peptidoglicano (mureína) representa la mitad del peso de la pared celular y proporciona forma y estabilidad al microorganismo e interviene de forma importante en la patogenia de la infección. Los ácidos teicoicos representan el 40% del peso de la pared y estos son polímeros compuestos por ribitol y N-acetil-glucosamina (polisacárido A). La mayoría de las cepas de Staphylococcus aureus están recubiertas por
Catalasa: Cataliza la formación de agua y oxígeno a partir del peróxido de hidrógeno. Hialuronidasa: Hidroliza los ácidos hialurónicos en el tejido conectivo, facilitando la diseminación de los estafilococos en los tejidos. Coagulasa: Desnaturaliza la fibrina del plasma para protegerse de la opsonización y la fagocitosis. Estafilocinasa: Enzima fibrinolítica que disuelve los coágulos. la proteína A. Otra proteína asociada a la pared celular es la coagulasa, que puede encontrarse ligada a la célula (coagulasa ligada) o de forma libre en el medio (coagulasa libre). Ambos tipos de coagulasa se encarga de convertir el fibrinógeno en fibrina. La membrana citoplasmática está formada por un complejo de proteínas, lípidos y carbohidratos que sirven de barrera osmótica para la célula y en la cápsula algunas cepas del S. aureus están recubiertas por una capa de polisacáridos externos, denominada slime o cápsula mucoide que confiere en ciertas condiciones una mayor capacidad de adherencia.
Factores de virulencia Estructura antigénica La especie de Staphylococcus ha adquirido muchos elementos genéticos móviles que determinan tanto su patogenicidad como su resistencia antimicrobiana. Los estafilococos contienen polisacáridos antigénicos y proteínas, al igual que otras sustancias importantes en la estructura de la pared celular. El peptidoglucano, un polímero polisacárido grueso que contiene subunidades importantes en la estructura de la pared celular, se destruye con acidez potente o exposición a lisozima. La proteína A es un componente de la pared celular de las cepas de S. aureus y es una proteína de la superficie bacteriana que se ha descrito de entre un grupo de adhesinas llamadas MSCRAMMS. La adhesión bacteriana a las células anfitrionas es mediada por MSCRAMMS y estos son los factores de virulencia más importantes. En el caso de la proteína A junto con las moléculas de IgG dirigidas contra un antígeno bacteriano específico aglutinaron bacterias que tienen ese antígeno(“coaglutinación”). La proteína A también es capaz de estimular citocinas, plaquetas y células B, alterar la función ciliar, estimular la respuesta inflamatoria, media en el daño tisular con producción de radicales tóxicos de oxígeno.
Toxinas Staphylococcus aureus es un microorganismo capaz de producir componentes superficiales llamados toxinas. Estos componentes son capaces de provocar severas intoxicaciones alimentarias dependiendo de la cantidad ingerida de alimento. Muchas de las toxinas están sujetas al control genético de los plásmidos; algunos pueden estar sujetas al control cromosómico y extracromosómicos. Esta especie produce una variedad de toxinas citolíticas identificadas (α, β, δ,) de las que la toxina α (α-hemolisina), es una citotoxina formadora de poros que lisa la membrana citoplasmática mediante inserción directa en la bicapa lipídica para formar transmembranales. La toxina α no es activa contra neutrófilos, pero produce lisis de una amplia variedad de otras células, incluso queratinocitos. Otra toxina es la leucocidina que causa necrosis del tejido.
Toxina α
La toxina exfoliatina (ETA y ETB) Enzimas Los estafilococos pueden producir enfermedad por su capacidad para multiplicarse y diseminarse ampliamente en los tejidos y por su producción de muchas sustancias extracelulares. Algunas de estas sustancias son enzimas; otras se consideran toxinas; aunque pueden funcionar como enzimas. Entre ellas tenemos:
Es una proteasa producida por una pequeña proporción de cepas de la especie. Se une al gangliósido de membrana celular específico que solo se encuentra en el estrato granuloso de la epidermis queratinizada. Ahí causa división intercelular de la epidermis entre el estrato espinoso y el estrato granuloso, probablemente por alteración de uniones intercelulares.
Toxinas estafilocócicas Los superantígenos son una familia de proteínas secretadas que pueden estimular efectos sistémicos al absorberse del
tracto intestinal después de su ingestión o a partir de una localización en la que se producen in vivo por multiplicación bacteriana. En la actualidad hay 15 toxinas superantigénicas, las más importantes son las variantes antigénicas que son conocidas como enterotoxinas estafilocócicas y la toxina del síndrome del choque térmico (TSST-1). Como superantígenos son poderosamente mitogénicos para los linfocitos T y no requieren de procesamiento proteolítico antes de unirse con las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad. Las enterotoxinas estimulan síntomas gastrointestinales en humanos y animales. Una vez formadas estas toxinas estables pueden retener su actividad aún después de hervirse o exponerse a enzimas gástricas y del yeyuno. La enterotoxina A es una de las toxinas que comúnmente ha estado implicada en los brotes de intoxicación alimentaria, ya que es extremadamente potente y con una cantidad tan pequeña como 100 ng es suficiente para causar síntomas de intoxicación.
Pruebas de Identificación
Tinción de gram para Staphylococcus aureus La
Para la identificación del Staphylococcus aureus se utilizan pruebas bioquímicas y medios de cultivo que permitan su fácil determinación. Esta identificación se basa en las enzimas y las toxinas que produce el microorganismo. Entre los medios para aislar al estafilococo se tiene al Baird Parker y el agar manitol salado.
tinción que obtendremos será de un color violeta, ya que esta bacteria es gram positiva.
Medios de cultivos
Prueba de la coagulasa Esta prueba es para la identificación del Staphylococcus aureus ya que es el único de su especie que produce coagulasa positiva y DNAsa positiva, produce ácido de la lactosa, maltosa y manitol, reduce los nitratos, hidroliza la urea y reduce el azul de metileno. . En esta prueba se añade una suspensión densa de bacterias a un tubo pequeño con plasma y se incuba a 37 °C. La prolongación de la incubación puede dar lugar a la desaparición de coágulos por digestión (fibrinólisis). Se observa la coagulación entre las 4 y 24 horas.
Los estafilococos crecen con rapidez en casi todos los medios bacteriológicos bajo condiciones anaerobias o microaerófilos. La temperatura óptima es de 37°C. Sus colonias en medio sólidos son redondas, lisas, elevadas y brillantes o también colonias de color gris a amarillo dorado profundo. Asimismo, produce diversos grados de hemólisis.
Staphylococcus aureus en Agar Manitol Salado El agar manitol salado es un medio de cultivo sólido, selectivo gracias a la alta concentración de sal que posee, la salinidad actúa como sustancia inhibitoria y evita el crecimiento de las bacterias gramnegativas, y es diferencial porque permite diferenciar a las coagulasas positivas de los negativas gracias a la presencia del carbohidrato manitol y al indicador de pH rojo de fenol. Como fuente de energía y carbono se tiene al extracto de carne y a las peptonas. En este medio de cultivo, las bacterias que son coagulasa positiva fermentan el manitol produciendo ácidos y estos acidifican el medio, tornando las colonias y al medio de color amarillo, esta reacción es característica de los estafilococos patógenos. Las coagulasas negativas no fermentan el manitol, formando colonias pequeñas y su coloración permanece de color rojo que es del indicador (rojo de fenol) o ligeramente rosadas sin cambio alguno al medio. Staphylococcus aureus se presenta de color amarillo mientras que el S. epidermidis de color rosa.
Prueba de la catalasa La prueba de la catalasa es un método rápido y fácil de diferenciación. Todas las especies de Staphylococcus son catalasa positiva, mientras que las de Streptococcus son catalasa negativa. Excluyendo al género Streptococcus, Clostridium y algunos otros, la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen catalasa. La producción de burbujas indica la presencia de la enzima catalasa.
Staphylococcus aureus en agar sangre En este agar el estafilococo presenta un halo transparente alrededor de las colonias, ya que produce una enzima llamada hemolisina y está lisa los glóbulos rojos.
El agar sangre aporta muchos factores de enriquecimiento y se usa para ver la capacidad hemolítica de los microorganismos patógenos. El Staphylococcus aureus presenta hemólisis alfa y hemólisis beta, aunque mayormente la última. La hemólisis alfa presenta una lisis parcial de eritrocitos que produce una coloración verde que se observa alrededor de las colonias (debido a la liberación de un producto de degradación de la hemoglobina llamado biliverdina) Agar sangre después de una incubación de 24 horas. Las colonias tienen de 3 a 4 mm de diámetro en la placa de 10 cm. Las colonias están rodeadas por zonas claras de hemólisis de casi 1 cm de diámetro.
Staphylococcus aureus en Baird Parker Medio selectivo para la detección y recuento de Staphylococcus aureus en muestras biológicas. Los aros formados en las colonias es por la reacción que ocurre entre la lipasa de S. aureus y la lipoproteína de la emulsión del huevo. En el caso de la coloración negra es por la reducción de telurito.
En medio de Baird – Parker después de 24 horas, Staphylococcus aureus forma colonias negras, brillantes, convexas y las colonias están rodeadas por un halo (zona clara).
La hemólisis beta presenta un halo de color claro, colonias redondas blanco amarillentos y completas
Epidemiología
INFECCIONES POR SARM La infección por Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) se produce a causa de un tipo de estafilococo que se volvió resistente a muchos de los antibióticos utilizados para tratar las infecciones comunes por estafilococo. Mucha gente tiene este tipo de bacterias viviendo sobre la piel y/o dentro de la nariz sin que le provoquen ningún problema. Si estas bacterias entran en el interior del cuerpo de una persona a través de un corte, una rozadura, un rasguño o una erupción, pueden provocar infecciones cutáneas. Interacción del SARM (bacterias verdes) con una célula blanca humana. La bacteria mostrada es la cepa MRSA 25
eningitis estafilocócica Es una infección de las membranas que cubren el cerebro y la médula espinal, causada por bacterias conocidas como estafilococos. En general, la meningitis causada por S. aureus o por S. epidermidis se desarrolla como una complicación de un procedimiento quirúrgico o de la diseminación de la infección por vía sanguínea desde otro sitio infectado.
Síntomas Fiebre, dolor de cabeza intenso, náuseas y vómito, erupciones cutáneas.
Síndrome de shock tóxico (SST) Es una enfermedad severa causada por la toxina producida por el Staphylococcus aureus y que se caracteriza por shock y disfunción orgánica múltiple. Los factores de riesgo incluyen una menstruación reciente, el uso reciente de anticonceptivos de barrera tales como diafragmas y esponjas vaginales, el uso de tampón vaginal (prolongado principalmente), parto reciente, cirugía reciente e infección actual por Staphylococcus aureus.
Síntomas Fiebre alta y acompañada en algunas ocasiones por escalofríos, malestar profundo, náuseas, vómitos y/o diarrea, erupción roja y difusa que asemeja una quemadura solar seguido por una descamación de la piel.
Staphylococcus aureus en los alimentos Las enfermedades transmitidas por alimentos son originadas por consumir alimentos contaminados con toxinas microbianas o con una o varias bacterias patógenas. Dicha contaminación generalmente se presenta por el contacto del alimento con los manipuladores. Sin embargo, las enfermedades entéricas no solo se contagian de esta manera, sino que la gravedad del problema se pone en evidencia al considerar que los agentes patógenos potenciales se encuentran en diversos ambientes, Asimismo, se ha sabido que existe una amplia variedad de alimentos capaces de albergar al estafilococo, pero cabe destacar que los más susceptibles son aquellos que tienen contacto con la piel del animal, tal es el caso de la leche, el huevo, los productos cárnicos como el jamón e, incluso, la carne de pollo; este último es muy susceptible a la contaminación bacteriana, porque tiene características fisicoquímicas que permiten que su superficie se contamine fácilmente, especialmente en la etapa de evisceración. Aun así, no solo la carne de pollo es ideal para la proliferación de Staphylococcus aureus sino también el chorizo, ya que las materias primas con que se elabora, de las que destacan la carne y la tripa, tienen excesiva manipulación por parte del productor.
Se recomienda lavarse bien las manos antes y después de preparar cualquier tipo de alimento.
Mantener los alimentos con pH inferior a 5 para evitar la formación de las enterotoxinas. Según la OMS, se recomienda las siguientes medidas para la prevención del Staphylococcus aureus en casa: -
PREVENCIÓN En toda la cadena de producción, distribución y almacenamiento de alimentos, se deben aplicar buenas prácticas agrícolas (BPA) y buenas prácticas higiénicas (BPH) que contribuyen a reducir el número de S. aureus, así como un sistema de autocontrol basado en el Análisis de Peligros y Puntos de Control Crítico (APPCC). Durante la transformación de los alimentos, es importante cumplir con los criterios microbiológicos de las materias primas que puedan ser contaminadas con S. aureus Mantener la cadena de frío (por debajo de 6ºC) durante el transporte, almacenamiento y distribución de los alimentos para evitar el crecimiento de la bacteria.
-
Lavar bien con agua corriente las frutas y hortalizas que vayan a consumirse crudas. Refrigerar los alimentos a temperaturas inferiores a 5°C para limitar el crecimiento potencial de Staphylococcus aureus en alimentos susceptibles a la contaminación por dicha bacteria. Mantener la limpieza con la consiguiente desinfección de las superficies, utensilios y tablas para cortar. Separar alimentos crudos y cocinados para evitar la contaminación cruzada. Refrigerar los alimentos a temperaturas inferiores a 5°C para limitar el crecimiento potencial del Staphylococcus aureus en alimentos susceptibles a la contaminación por dicha bacteria.
Especie: Staphylococcus epidermidis
Son bacterias grampositivas, se caracterizan por ser coagulasa, catalasa negativa, anaerobia facultativa y es inmóvil. Es reconocido como un patógeno oportunista nosocomial importante y es considerado el agente causal de diferentes entidades clínicas, entre ellas: Infecciones urinarias intrahospitalarias, endocarditis de válvula nativa, infecciones de dispositivos médicos o cuerpos extraños (catéteres endovenosos, válvulas cardiacas protésicas en implantes de mama). Otra característica importante de esta bacteria es la susceptibilidad antimicrobiana que presenta, ya que el S. epidermidis ha desarrollado resistencia a la meticilina en forma paralela al desarrollo de resistencia del S. aureus, pero mostrando tasas mucho más elevadas que esta última. También se reconoce como característica la formación de un biofilm fabricado en base al ácido teicoico, el cual normalmente forma parte de la pared del estafilococo. Esta capa los protege de la acción de los neutrófilos y a su vez disminuye la penetración de los antibióticos.
Factores de virulencia
permite unirse a superficies como catéteres vasculares, sondas, prótesis, además este biofilm forma una barrera que confiere protección frente a los mecanismos de defensa del hospedador y protegerlos de la acción de los agentes antimicrobianos.
Exopolisacárido PIA: Proporcionan protección frente a las defensas del huésped, contribuyen a la formación de biopelículas e inhiben la fagocitosis. Modulinas: Tienen actividad lítica frente a leucocitos y a eritrocitos, están implicadas en la formación del biofilm y son solubles en fenol. Ácido poliglutámico gamma (PGA): Actúa como osmoprotector. El PGA protege a la bacteria de péptidos antimicrobianos, mientras que el PIA y los ácidos teicoicos presentan al menos una parte de su papel en la protección de las defensas del huésped a través de su contribución a la formación de biopelículas.
Enzimas Exoenzimas: Produce una serie de proteasas, las cuales pueden contribuir a la virulencia de la bacteria a través de la destrucción del tejido y proteínas del huésped.
Prueba de identificación Tinción del gram
Biofilm: Es un polisacárido extracelular que promueve la adhesión célula-célula y es un factor importante de virulencia de S. epidermidis. Le confiere a la bacteria una adherencia muy eficiente, lo que le
En la especie de Staphylococcus epidermidis la tinción es de color morado por lo tanto es grampositiva.
Prueba de identificación “API” Prueba basada en reacciones enzimáticas. Se incuba de 33°C a 37°C durante 24 horas, y se aplica los reactivos NIT 1 y 2, VP 1 y 2 a las galerías de nitrato de potasio y piruvato de sodio
respectivamente. Para leerse mediante una carta de colores; en caso de positividad, se asignó un valor numérico ya establecido en el sistema API STAPH que fue confrontado con valores
numéricos
del
AGAR SANGRE: No produce hemólisis así que es gamma hemolítica. Sus parámetros de incubación son en una atmósfera de 5% de CO2 a 35 °C y se caracteriza por tener colonias redondeadas con borde entero.
catálogo.
Prueba de coagulasa Esta bacteria no puede desnaturalizar la fibrina del plasma, así que es coagulasa negativa.
Medios de cultivos Agar manitol salado: Las colonias obtenidas son de color rojo con borde entero, esto se debe que no fermentan manitol y su coloración permanece igual al del indicador. Este medio inhibe el crecimiento de bacterias gram negativas, pero no para Staphylococcus epidermidis por ser grampositiva. Las condiciones para su crecimiento son de 37°C durante 36 horas.
Se
observan colonias puntiformes redondeadas de color blanco.
3 Familia Bacillaceae
DEFINICIÓN Es una familia de bacterias Gram positivas que se caracterizan por su forma de bastón y por producir endosporas. Actualmente abarca 62 géneros compuestos de al menos 457 especies. Los dos géneros principales son los: Bacillus (Bacilos aeróbicos o anaerobios facultativos). Clostridium (B. anaerobios obligados).
Endosporas A menudo referidas por la forma abreviada, "esporas". Es la forma más simplificada de la bacteria, sirviendo como un vehículo ideal para la dispersión generalizada a través de corrientes de aire o agua. Inducida por la privación de nutrientes, alto contenido de células, densidades de población, factores ambientales como cambios de pH, actividad de agua y temperatura.
Fig. 3-2. Microfotografía de Bacillus anthracis de un cultivo de agar que muestra esporas; Tinción de esporas de fucsinaazul de metileno.
Género Bacillus Es el género más grande dentro de las Bacillaceae, consta de al menos 226 especies.
CARACTERÍSTICAS FUNDAMENTALES
Fig. 3-1. Micrografía electrónica que muestra la estructura de una endosporas (Bacillus cereus).
REPRESENTANTES Existen representantes termofílicos y psicrófilos, acidófilos y alcalófilos y halófilos son capaces de crecer en condiciones extremas que destruirían a otros organismos vivos.
CARACTERÍSTICAS FUNDAMENTALES Son de bajo G + C% (contenido de guanina y citosina). La mayoría son móviles por flagelos peritricosos. En su mayoría son saprófitos, por lo que tienen que alimentarse de materia orgánica preformada. Su esporo deforma o no el soma bacteriano según la especie de que se trate. Característica más distintiva: La habilidad para forman endosporas resistentes a condiciones físicas y químicas adversas (calor, radiación, productos químicos y sequía), permitiendo que estas bacterias sobrevivan durante un período prolongado de tiempo. Se encuentran entre las bacterias más robustas de la Tierra.
HABITAD Suelo, agua dulce y marina, en lodos activados, en tracto gastrointestinal humano y animal, y en varios alimentos (incluidos los alimentos fermentados).
Gran tamaño, 1 por 3 a 10 μm. Los miembros son heterótrofos aeróbicos estrictos o anaerobios facultativos. Forma de varillas corta (bacilos). Saprófitos (capaces de degradar un rango de sustancias carbonosas poliméricas). Producen catalasa. Móviles excepto B. anthracis. Beta-Hemolíticos (se refiere a un halo de hemólisis completamente claro alrededor de las colonias) excepto B. anthracis.
HABITAD Crecen en una variedad de compuestos simples. Comúnmente aislados del polvo, el suelo, el aire y el agua, paja, alimentos (arroz), los animales y las plantas. Se han identificado hábitats muy variados. Ej. B. subtilis, B. licheniformis y B. cereus se han aislado de suelos pobres en nutrientes, sobre paja o arroz, mientras otras especies son más exigentes.
IMPORTANCIA EN LOS ALIMENTOS Se detectan tanto en las materias primas utilizadas en la industria alimentaria como en los productos alimenticios en el punto de venta. Sobreviven y crecen en los alimentos, debido a la formación de endosporas que mejoran la supervivencia y su capacidad de utilizar una variedad de fuentes de carbohidratos y nitrógeno.
Sus esporas resisten, o se activan durante, el procesamiento de alimentos, y, además, las cepas psicrotróficas (microorganismos que crecen a temperaturas < a 7°C) son capaces de crecer en leche y productos alimenticios almacenados correctamente a temperaturas de refrigeración. Participan favorablemente en la producción de probióticos para humanos y animales, y fuentes de enzimas de grado alimenticio.
CLASIFICACIÓN I. II. III. IV. V.
Basada en la morfología de las esporas se divide en seis taxones: Grupo Bacillus polymyxa Grupo B. subtilis Grupo B. brevisgrupo Grupo B. sphaericus Grupo B. termófilos
Fig. 3-3. Bacillus subtilis, tinción Gram.
Bacillus cereus Es un enteropatógeno de origen alimentario reconocido y agente causante de intoxicación alimentaria en humanos.
CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS Ubicuo, de gran tamaño de 0.5 a 2.5 por 1.2 a 10 μm. Forma de bastón alargado. Los esporos son bastantes resistentes al calor, pueden soportar tratamientos culinarios habituales. Agente causal de muchas intoxicaciones alimentarias en el hombre. Tipo de metabolismo: Aerobio y anaerobio facultativo Positivo a la prueba de la catalasa y son saprofitas.
CARACTERÍSTICAS ESTRUCTURALES Las esporas son centrales, forma elipsoide y al formarse en el interior de la célula dan lugar al hinchamiento de esta. Poseen antígenos somáticos, flagelares y de esporas. Los antígenos de las esporas son termoresistentes al igual que las propias esporas.
Fig. 3-4. Bacillus cereus esporulante. Frotis hechos de una colonia (agar sangre).
CRECIMIENTO Algunas psicotrofas, crecen de 4º a 5ºC, otras mesófilas crecen de 15 a 50ºC. Lo óptimo es 37ºC. Las esporas son termoresistentes. Se eliminan por esterilización. pH = 4.9 – 9.3 Actividad de agua mínima de 0.93
Fig. 3-5. Cultivo de Bacillus cereus
FACTORES DE VIRULENCIA Enzima: Fosfolipasa C (una potente lecitinasa) tiene actividad catalítica. Toxina emética o cereulida: Producida bajo condiciones aeróbicas o microaerofílicas se expresa al inicio de la fase estacionaria del B. cereus; consiste de un polipéptido cíclico altamente hidrofóbico y termoestable. Es activa en un rango de pH entre 2 y 11. Enterotoxinas Son producidas después de la colonización del intestino delgado por B. cereus. La Toxina hemolítica BL–HBL, es considerada el factor de virulencia más importante porque tiene efecto hemolítico, citotóxico, dermonecrótico y puede inducir permeabilidad vascular. Otras toxinas implicadas son: • Toxina no hemolítica - NHE • Citotoxina K – CytK: Tiene actividad necrotizante y citotóxica. • Enterotoxina FM - EntFM
INTOXICACIÓN ALIMENTARIA Más de 104 – 105 UFC por gramo causan intoxicación.
Cantidad Toxina
Toxina Emética (crecimiento estacionario)
Toxina Diarreica (crecimiento logarítmico)
Causa
Péptido termoestable
Grupo de proteínas lábiles
Alimento implicado
Arroz (alimentos con alto contenido de almidón).
Carne, leche (polvo), vegetales, puré de papas, sopas y postres.
Período de incubación
< 6 horas
> 6 (8-16) horas
Síntomas
Vómitos, náuseas, espasmos abdominales
Diarrea acuosa, náuseas, espasmos abdominales
Duración
8-10 horas
12-36 horas
Tratamiento Calor
Se cura a las 24 horas sin tratamiento alguno Termoestable o cereulida (121 ºC < de 90 minutos).
Termolábil (La toxina se destruye a 60 ºC * 5min.)
MEDIOS Y CARACTERÍSTICAS DE CULTIVO AGAR MYP (Manitol) - Colonias irregulares aprox. 5 mm de ø. - Halo blanco (Lecitinasa+). - Fondo rosa-rojo-violeta (manitol-). - pH: 7.2 ± 0.2 a 25° C - 24 h a 30°C: colonias circulares y lisas. - 48 h a 30°C: C. rugosas con estrías.
AGAR BACARA - Colonias color rosa-naranja. - Rodeadas con un halo opaco. - Lecitinasa positiva. - Incubación 24 +/- 2h a 37 °C.
AGAR SANGRE - Actividad hemolítica. - Colonias de 3-8 mm de diámetro. - De color rojo opaco, esmerilado. - pH: 7,0±0,2 a 25° C - Incubación 24h a 35 °C
AGAR NUTRIENTE - Colonias con cabello largo. - Colonias en forma de galaxias-Rough. - Color de gris a verde. - Incubación 48 horas a 30 °C
ESPECIES DEL GÉNERO Bacillus: MORFOLOGÍA MACROSCÓPICA Y MICROSCÓPICA
Bacillus cereus
B. subtilis
B. anthracis
B. thuringiensis
B. anthracis
Colonias de 3 a 8 mm de diámetro beta hemolíticas con hemólisis completa, de color de gris a verde, con aspecto de vidrio esmerilado y bordes regulares, que forman agrupaciones en cadenas que se pueden observar macroscópicamente.
Colonias de 2 a 4 mm de diámetro, betas hemolíticas con hemólisis completa, de aspecto liso, color blanco cremas translúcidas y bordes regulares.
Gram 24 horas: bacilos Gram positivos, de 1,2 mm de diámetro por 3 a 5 mm de largo, con borde redondeados y que forman cadenas cortas. Se observan esporas elipsoidales y centrales que no deforman el bacilo.
Gram 24 horas: bacilos Gram positivos de 1 mm de diámetro por 1,5 a 5 mm de largo, con bordes redondeados. Se observan esporas esféricas, terminales, que deforman el bacilo y le dan aspecto de raqueta.
Colonias no hemolíticas de 4 a 5 mm de diámetro, con apariencia de vidrio esmerilado y bordes irregulares. Las colonias se extienden sobre el medio. Colonias de 3-8 mm de diámetro, beta hemolítica con hemólisis completa, de color gris a verde, aspecto de vidrio esmerilado y márgenes onduladas. Las colonias se extienden por el medio.
Colonias, de 2 a 4 mm de diámetro, beta hemolítica con hemólisis completa, que pueden ser de aspecto liso, mucoide o rugoso; los bordes pueden ser ondulados o extendidos en el medio y ocasionalmente dan la apariencia de cultivos mixtos.
Gram 24 horas: bacilos Gram positivos, de 1 a 1,3 mm de diámetro por 3 a 10 mm de largo, con bordes cuadrados o cóncavos que forman cadenas largas con la apariencia de vara de bambú.
Gram 24 horas: bacilos Gram positivos de 1,3 mm de diámetro por 3 a 5 mm de largo con bordes redondeados, que forman cadenas cortas. Se observan esporas cilíndricas subterminales.
Gram 24 horas: bacilos Gram positivos de 0,8 mm de diámetro por 2 a 3 mm de largo con bordes redondeados. Presentan esporas esféricas y centrales que no deforman el bacilo.
Gram 48 horas: bacilos Gram positivos con esporas de forma elipsoidal en posición subterminal que no deforman el bacilo.
Género Clostridium DEFINICIÓN Representa uno de los géneros más grandes de procariotas. Comprende al menos 12 linajes y más de 200 especies de las cuales 20 son patógenas.
Endosporas Pueden ser ovales o esféricas, de posición terminal o ecuatorial que generalmente son más anchas que los organismos vegetativos en los que surgen, deformando al bacilo y dando a las células las formas características del huso.
CARACTERÍSTICAS FUNDAMENTALES Son bacilos anaeróbicos estrictos, Gram-positivas, capaces de producir fermentación y esporular. Son saprofitos inocuos. Móviles por flagelos peritrícos. Amplio rango de 21-54 % en moles de contenido de G + C% de su ADN (respalda la heterogeneidad de este grupo de organismos). Reductor de nitrato a nitrito. Se encuentran entre las bacterias más robustas de la Tierra.
CRECIMIENTO En alta cantidad de proteínas. Baja concentración de sal. En pH menor a 4,5. En usencia de oxígeno (como alimentos envasados al vacío). De 3ºC a 45-60º C (sobrevive en congelación).
La termoresistencia de los esporos varía según la especie.
Clostridium botulinum CARACTERÍSTICAS FUNDAMENTALES Anaerobios, sin cápsula. Bacilos rectos o ligeramente curvados de 2-10 x 0,5-2 micras. Esporas ovales, subterminales y deforman la célula cuando se producen. El comportamiento metabólico no es uniforme referente a la proteólisis y a la producción de exotoxinas. La mayor parte de cepas fermentan carbohidratos No reducen los nitritos a nitratos Producen sulfhídrico y acetil metil carbinol (VP+). Las esporas son más resistentes al calor, resisten 105° durante 10 minutos, a excepción de las esporas de las cepas E que se inactivan a 80º durante 6-10 minutos. Posee 4 antígenos distintos: Somático, Flagelar, Esporas. Endotoxinas.
CRECIMIENTO pH óptimo de 4,6 - 8 para la célula vegetativa. Temperatura óptima de 25-35°C Sensible a la sal, necesitan una concentración de sal inferior al 10% y Aw > 0,935 y condiciones de anaerobiosis.
FACTORES DE VIRULENCIA Existen 8 tipos de toxinas: A, B, C1, C2, D, E, F, G. Solo tipos A, B, E y F en el ser humano. Siendo las más potentes A y B. La principal es la toxina botulínica, una proteína trimodular, termolábil (100ºC 30 min). Las toxinas son proteicas y termolábiles, se destruyen a 100° durante 5 minutos, a 80° durante 30 minutos o a 70° durante 60 minutos.
PATOGENIA: BOTULISMO La intoxicación por la toxina botulínica es conocida como “Botulismo”, afecta al sistema neuromuscular provocando parálisis progresiva que puede producir insuficiencia respiratoria (5-10% mortalidad). Hay 2 formas de botulismo: La intoxicación botulínica Debida a la ingestión de toxina botulínica preformada en un alimento. Esta es la forma más frecuente en los adultos. Fig. 3-6. Fotomicrografía de un cultivo teñido con Gram de Clostridium feseri. Las estructuras redondas mal teñidas son endosporas.
HABITAD Ampliamente distribuidos en la naturaleza, parecen tener dos hábitats principales: el suelo y el tracto intestinal de los animales y el hombre.
La toxiinfección botulínica Originada por la ingestión de bacterias y/o esporas, principalmente por lactantes y bebés menores de 1 año, que, debido a la inmadurez del sistema digestivo, germinan, colonizan el intestino y liberan la toxina botulínica. Por ejemplo, se ha descrito el botulismo infantil asociado a la ingestión de miel.
CARACTERÍSTICAS DE CULTIVO Se cultivan en medios bacteriológicos comunes bajo estrictas condiciones de anaerobiosis Son nutricionalmente exigentes. La tolerancia al oxigeno varía según las especies; algunas son anaerobias estrictas, otras presentan una alta aerotolerancia y la mayoría tienen exigencias intermedias soportando del 2- 8% de oxígeno. Pueden crecer entre 4°C (C. botulinum, tipo E) y 69°C (clostridios termófilos), pero la mayoría posee una TOC de 30 – 37°C. Fig. 3-7. Esta es una ilustración de una microfotografía de Clostridium botulinum teñido con violeta de genciana.
Clostridium perfringens
ESPECIES DEL GÉNERO Clostridium: MEDIOS Y CARACTERÍSTICAS DE CULTIVO Clostridium botulinum
CARACTERÍSTICAS FUNDAMENTALES Bacilo grampositivo, con extremos cuadrados, que se pueden encontrar aislado o en parejas. Es inmóvil y presenta cápsula. Los esporos son de gran tamaño, ovales, centrales o subterminales, deformando ligeramente la bacteria. Es una bacteria anaerobia estricta relativamente aerotolerantes. La capacidad de Clostridium perfringens para producir gas tiene un propósito beneficioso: se utiliza como agente leudante en productos horneados.
- Medio sólido: Colonias circulares de 1 – 6 mm de ø, con bordes irregulares, translúcidas o semiopacas. - Rodeada de una estrecha zona de hemólisis. - Crecimiento optimo: Fuente de carbono fermentable y se inhibe por la adición de NaCl al 6,5% y bilis al 20%. - TOC es de 30 – 37°C. Doble hemólisis.
AGAR McClung-Toabe
CRECIMIENTO Temperatura óptima de 43-47°C Para la producción de enterotoxinas la temperatura optima es de 35°a 40°C, con un pH optimo 6 a 7 (es el pH de la carne cocida).
FACTORES DE VIRULENCIA Existen cinco cepas designadas desde A hasta E. Cada cepa produce un espectro de toxinas único de carácter necrotizante, enterotoxina, citotoxina y hemolisina. En humanos, por lo general la enfermedad la provoca las cepas tipo A, típicamente asociadas con intoxicación de alimentos sin complicaciones. La toxina alfa es una toxina necrotizante producida por las cinco cepas es letal por su efecto dermonecrótico y hemolítico. Enzimas: colagenasa, gelatinasa, proteasa y hialuronidasa.
AGAR BASE
Clostridium perfringens Fig. 3-8. Esta es una microfotografía de Clostridium perfringens
SUPERVIVENCIA Temperatura: las células vegetativas son destruidas fácilmente por la cocción. Pero las esporas pueden sobrevivir al menos una hora en ebullición. Las células vegetativas son susceptibles a la congelación (90% aprox. mueren luego de 30 días a -17°C). Las esporas, en cambio sobreviven a esta temperatura.
- Medio líquido: Produce gas, estimulada por presencia de azucares fermentables. - Crece: 20-50ºC, pH de 5.5 a 8. TOC. 37-45ºC, 5% de oxígeno. - Agar sangre: Colonias circulares, lisas, de color grisáceo y aparecen dos zonas de hemolisis. - Producen: Gelatinasa, proteasa y fosfolipasa C (no produce lipasa). - Fermenta: Glucosa, maltosa, lactosa y sacarosa.
AGAR TSC
PATOGENIA Gangrena gaseosa: Producida por la alfa-toxina, provocando la destrucción muscular progresiva y toxemia. Celulitis necrotizante en tejidos blandos. Intoxicación alimentaria: Enteritis necrosante producida por la beta-toxina y diarreas enterotoxicas.
AGAR SANGRE
Fig. Morfología de C. perfringens en doble hemólisis típica en agar sangre
3. AISLAMIENTO Diagrama de flujo para el aislamiento y enumeraciĂłn de bacilos de acuerdo al 2°volumen de Anmat Aislamiento y enumeraciĂłn de Bacillus cereus PREPARACIĂ&#x201C;N DE LA MUESTRA x g de muestra + 9 x ml de diluyente (diluciĂłn 1/10). Transferir 1ml de la suspensiĂłn inicial en un tubo con 9 ml del diluyente, para obtener la diluciĂłn 10-2.
PREPARACIĂ&#x201C;N DE SUSPENSIĂ&#x201C;N INICIAL Y DILUCIONES DECIMALES
INOCULACIĂ&#x201C;N E INCUBACIĂ&#x201C;N Seleccionar las placas con < de 150 colonias caracterĂsticas y contar las colonias presuntas de B. cereus. Seleccionar 5 colonias caracterĂsticas.
MĂŠtodo de cĂĄlculo despuĂŠs de la confirmaciĂłn: đ???=
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La norma ISO 6887-1:1999 y las normas especĂficas para el alimento en cuestiĂłn.
Transferir por duplicado 0.1 ml de las diluciones preparadas en placas de Petri con Agar MYP, incubar a 30°C, 18-48 h
RECUENTO Y SELECCIĂ&#x201C;N DE LAS COLONIAS
CONFIRMACIĂ&#x201C;N
Selección y purificación de las colonias para confirmación: en Agar MYP a 30°C, 18 -24 h
CĂ LCULO Y CONFIRMACIĂ&#x201C;N DEL RECUENTO
Test de hemólisis en Agar sangre de oveja: a 30°C, 24 h ¹ 2 h
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EXPRESIĂ&#x201C;N DE RESULTADOS
Bacillus cereus. UNE-EN ISO 7932:2005 Recuento de colonias a 30oC. Revisada y confirmada en 2015.
Suspensión inicial y diluciones Véase la ISO 6887-1 dependiendo del producto de que se trate.
Siembra e Inoculación
Se toman dos placas de MYP Agar y se transfiere a cada una 0,1 ml de la muestra si es líquida o 0,1 ml de la suspensión inicial en otros productos. Inocular también desde diluciones decimales si fuera necesario.
Si hay una estima de números bajos, inocular, también por duplicado, en tres placas de MYP Agar 1 ml de la muestra si es líquida o 1 ml de la suspensión inicial en otros productos.
CM0929B MYP AGAR (Mannitol Egg Yolk Polymyxin Agar) (ISO) (500 g) SR0099E Polymixin B Supplement (ISO) (10 viales) PO5133A Agar MYP (Mannitol Egg Yolk Polymyxin Agar) (ISO) (20 placas)
Extender bien el inóculo y dejar durante 15 min a T a ambiente.
Incubación
Se incuban las placas a 30ºC durante 18 - 24 h
Recuento
Se realiza el recuento en placas que contengan menos de 150 colonias típicas (grandes, de color rosa, con halo de precipitación).
Confirmación
Se toman al menos 5 colonias presuntivas y se siembran en agar sangre de carnero. PB5039A Agar sangre de cordero (20 placas) Se incuban las placas a 30ºC durante 24 h ± 2 h. Bacillus cereus produce una reacción positiva de hemólisis.
Método horizontal para el recuento de Bacillus cereus. Basado en la norma ISO 7932 (Enero 1994)
1 mL
DÍA 1
Muestra líquida 100 Dilución madre (10–1)
1 mL
10–1 (10–2)
1 mL
10–2 (10–3)
10–3 (10–4)
0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL MYPA – Agar Manitol yema de huevo con polimixina
100 (10–1)
DÍA 2
10–1 10–2 10–3 –2 –3 (10 ) (10 ) (10–4) Tapar y dejar absorber durante 15 min Incubar a 30°C ± 1°C durante 18 h-24 h (+ 24 h si es necesario) Retener las placas con menos de 150 colonias
100 (10–1)
10–1 (10–2)
10–2 (10–3)
10–3 (10–4)
Contar las colonias de presuntos B. cereus
Elegir al azar 5 colonias presuntas de cada placa y sembrar en:
DÍA 3
MR-VP AG (regenerado) MN (a 308C ± 1°C) Medio Voges-Proskauer Agar glucosado Medio nitrato Incubar a 30°C ± 1°C durante 24 h (+ 24 h para MN-VP)
VP si aparece coloración rosa
AG si aparece coloración amarilla
Nitritos si aparece coloración roja o si después de añadir Zn no se colorea
Método horizontal para el recuento de Bacillus cereus. Basado en la norma XP V 08-058 (Noviembre 1995)
1 mL
1 mL
1 mL
DÍA 1
Muestra líquida 100 Dilución madre (10–1)
10–1 (10–2)
10–2 (10–3)
10–3 (10–4)
0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL MYPA – Agar Manitol yema de huevo con polimixina
DÍA 2
100 (10–1)
10–1 (10–2)
10–2 (10–3)
10–3 (10–4)
Tapar y dejar absorber durante 15 min Incubar a 30°C ± 1°C durante 18 h-24 h (+ 24 h si es necesario) Retener las placas con menos de 150 colonias
100 (10–1)
10–1 (10–2)
10–2 (10–3)
10–3 (10–4)
Contar las colonias de presuntos B. cereus
Elegir al azar 5 colonias presuntas de cada placa y sembrar en:
AS-Agar sangre AM-Agar movilidad Incubar a 30°C ± 1°C durante 18 H-24 H
Lectura y expresión de resultados
Diagrama de flujo para el aislamiento y enumeración de bacilos de acuerdo al 2°volumen de Anmat
Aislamiento y enumeraciĂłn de Clostridium perfringens PREPARACIĂ&#x201C;N DE LA MUESTRA x g de muestra + 9 x ml de diluyente (diluciĂłn 1/10). Transferir 1ml de la suspensiĂłn inicial en un tubo con 9 ml del diluyente, para obtener la diluciĂłn 10-2.
PREPARACIĂ&#x201C;N DE SUSPENSIĂ&#x201C;N INICIAL Y DILUCIONES DECIMALES INOCULACIĂ&#x201C;N E INCUBACIĂ&#x201C;N
Seleccionar las placas con menos de 150 colonias y contar como presunto C. perfringens. Seleccionar 5 colonias caracterĂsticas.
RECUENTO Y SELECCIĂ&#x201C;N DE LAS COLONIAS
Inocular cada una de las colonias seleccionadas en medio de tioglicolato fluido. Incubar a 37ÂşC durante 18h a 24h en anaerobiosis. Si la reacciĂłn es positiva (producciĂłn de gas y precipitado negro) se considera que se trata de C. perfringens.
OPCIĂ&#x201C;N 1. CONFIRMACIĂ&#x201C;N BIOQUĂ?MICA USANDO EL MEDIO LS.
OPCIĂ&#x201C;N 2. CONFIRMACIĂ&#x201C;N BIOQUĂ?MICA NITRATOMOVILIDAD
CĂ LCULO Y CONFIRMACIĂ&#x201C;N DEL RECUENTO
La norma ISO 6887-1:1999 y las normas especĂficas para el alimento en cuestiĂłn. Transferir por duplicado 1 ml de las diluciones preparadas en placas de Petri vacĂas, verter 10-15 ml de Agar SC, mezclar suavemente. Cuando haya solidificado agregar una doble capa de 10 ml de Agar SC. Incubar a 37°C Âą 0.5ÂşC, 20 h Âą 2 h en anaerobiosis
La formaciĂłn de un color rojo confirma la reducciĂłn de nitrato a nitrito. Si hay reducciĂłn, con movilidad negativa se considera que se trata de C. perfringens. MĂŠtodo de cĂĄlculo despuĂŠs de la confirmaciĂłn: đ???=
EXPRESIĂ&#x201C;N DE RESULTADOS
â&#x2C6;&#x2018;đ??&#x161; đ??&#x2022;Ă&#x2014;đ?&#x;?,đ?&#x;?Ă&#x2014;đ???
Clostridium perfringens en aguas UNE-EN ISO 14189:2017
Procedimiento Pretratamiento para seleccionar esporas
Calentar un volumen de mayor que la muestra a analizar y calentar a 60ºC ± 2ºC durante 15 ± 1 min
Filtración por membrana
Filtrar 100 ml de agua en TSC Agar. Realizar diluciones si fuera necesario (ver ISO 8199) CM0587B TSC Agar base (ISO) (500 g) + SR0088E TSC Selective Supplement (ISO) (10 viales) PO5315A Tryptose Sulfite Cycloserine Agar (TSC Agar ISO) (20 placas) BO0634M Perfringens Agar Base (TS Agar sin cicloserina) (10 x 100 ml) De manera alternativa se puede añadir una capa de 5 a 10 ml de TSC sin antibióticos fundido y mantenido a 45ºC ± 1ºC.
Incubar anaeróbicamente a 44ºC ± 1ºC durante 21 ± 3 h AN0025A AnaeroGen 2,5 l (10 sobres) AG0025A AnaeroJar 2,5 l (Unidad)
Recuento
Tras la incubación, enumerar los C. perfringens presuntivos, contando aquellas colonias que muestren un color de negro o gris a marrón amarillento.
Confirmación presuntivos
Si 1-10 colonias negro / gris a marrón amarillento, subcultivar todas las colonias en agar sangre PB5039A Agar sangre (20 placas)
Incubar anaeróbicamente a 36ºC ± 2ºC durante 21 ± 3 h
Seleccionar colonias crecidas anaeróbicamente y realizar la prueba de fosfatasa ácida (TN1519 70 test) sobre papel de filtro. Se considera positivo un cambio de color a violáceo (rojo oscuro a marrón, según reactivo) en 3 – 4 minutos
Recuento de colonias totales y confirmadas (C. perfringens presuntivos y C. perfringens confirmados)
Si >10 colonias negro / gris a marrón amarillento, subcultivar al menos 10 colonias en agar sangre PB5039A Agar sangre (20 placas)
Clostridium perfringens en alimentos. Recuento UNE EN ISO 7937:2005. Revisada y confirmada en 2015.
Procedimiento Preparación de la muestra Diluyente, véase ISO 6887-1,2,3,4:2004, o ISO 8261 En Peptona Salina ISO: CM0733B Maximum Recovery Diluent (Peptone Saline Diluent) ISO 500 g TV5016D Maximum Recovery Diluent ISO 50 x 9 ml Inoculación e incubación 1 ml de la dilución inicial o de la muestra si es líquida en placas Petri vacías por duplicado Verter en cada placa 15 ml agar SC, rotar. Una vez solidificado, añadir otra capa de 10 ml de agar SC CM0587B Perfringens Agar Base (ISO) 500 g + SR0088E Perfringens (TSC) Selective Supplement 10 viales Incubar en anaerobiosis a 37ºC durante 20 h ± 2 h AN0025, AN0035A Sobres de anaerobiosis Recuento y Selección de colonias Se seleccionan placas con < 150 colonias y se cuentan las colonias características. Seleccionar 5 colonias característica Confirmación mediante una de estas dos vías o galerías comerciales Sembrar cada una de las cinco colonias en Tioglicolato TV5001D Thioglycollate Medium USP 50 tubos Incubar en anaerobiosis a 37ºC durante 18 h - 24 h Depositar 5 gotas sobre medio LS 4015792 Lactose Sulfite Medium ISO 500 g Incubar en anaerobiosis a 46ºC durante 18 h - 24 h Examinar los tubos para: - Producción de gas - Precipitado de color negro - Gas en la campana de Durham
Sembrar por picadura cada una de las colonias seleccionadas en Agar Movilidad desgasificado 4017262 Motility Nitrate C Medium ISO 500 g Incubar en anaerobiosis a 37ºC durante 24 h
Sembrar las colonias seleccionadas en Agar Lactosa-Gelatina desgasificado BO1068F Lactose Gelatin Medium 24x15 ml Incubar en anaerobiosis a 37ºC durante 24 h
Examinar los tubos para: - Movilidad desde la picadura - Presencia de Nitrito con el reactivo de detección (5-2 ANSA) y aparición de color rojo
Examinar los tubos para: - Presencia de gas - Color amarillo Enfriar los tubos 1 h a 5 ºC y comprobar la licuefacción de la gelatina
R8311002 R8325102 R8309002 R20413
Galerías de identificación RapID ANA II Galerías RapID Ana II 20 galerías RapID Inoculation fluid 20 viales RapID Spot Indol Reagent 15 ml McFarland Tubidity Estándar 3 Unidad
Método horizontal para el recuento de Clostridium perfringens. Basado en la norma en 13401 (Abril 1999)
1 mL
DÍA 1
Muestra líquida 100 Dilución madre (10–1)
1 mL
1 mL
10–1 (10–2)
10–2 (10–3)
10–3 (10–4)
0,1 mL
0,1 mL
0,1 mL
0,1 mL
100 (10–1)
10–1 (10–2)
10–2 (10–3)
10–3 (10–4)
En menos de 15 min, verter 15 mL de TSC a 47°C ± 0,5°C Cubrir con 10 mL de TSC Incubar a 37°C ± 1°C durante 20 h ± 2 h en jarras para anaerobios
DÍA 2 Retener las placas con menos de 150 colonias
100 (10–1)
10–1 (10–2)
10–2 (10–3)
10–3 (10–4)
Contar las colonias negras Elegir 5 colonias de cada placa y sembrar en medio TIO regenerado
DÍA 3
Incubar a 37°C ± 1°C durante 18 h-24 h en jarras para anaerobios Transferir con pipeta Pasteur 5 gotas al medio LS regenerado + reactivos
DÍA 4
Incubar a 46°C ± 0,5°C durante 18 h-24 h en un baño de agua
Lectura y expresión de resultados
Método horizontal para el recuento de Clostridium perfringens. Basado en la norma NF V 08-056 (Abril 1994)
1 mL
DÍA 1
Muestra líquida 100 Dilución madre (10–1)
DÍA 2
1 mL
1 mL
10–1 (10–2)
10–2 (10–3)
10–3 (10–4)
0,1 mL
0,1 mL
0,1 mL
0,1 mL
100 (10–1)
10–1 (10–2)
10–2 (10–3)
10–3 (10–4)
En menos de 15 min, verter 15 mL de TSC a 47°C ± 0,5°C Cubrir con 10 mL de TSC Incubar a 37°C ± 1°C durante 20 h ± 2 h en jarras para anaerobios Retener las placas con menos de 150 colonias
100 (10–1)
10–1 (10–2)
10–2 (10–3)
10–3 (10–4)
Contar las colonias negras Elegir 3 colonias de cada placa y sembrar en medio TIO regenerado
DÍA 3
Incubar a 37°C ± 1°C durante 20 h ± 2 h en jarras para anaerobios Transferir con pipeta Pasteur 5 gotas al medio LS regenerado + reactivos
DÍA 4
Incubar a 46°C ± 0,5°C durante 24 h ± 2 h en un baño de agua
4 Familia Pseudomonadaceae
El orden Pseudomonadales del análisis filogenético de secuencia de ARNr 16S; este orden de Proteobacteria contiene la familia Moraxellaceae, Branhamaceae y Pseudomonadaceae.
DEFINICIÓN La familia Pseudomonadaceae es una de las bacterias tiene forma de bacilos rectos o ligeramente curvos, Gram negativo, aeróbico su metabolismo es respiratorio jamás fermentativo.
CARACTERÍSTICAS FUNDAMENTALES Posee un organismo quimiorganotrofo ya que utilizan compuestos orgánicos como fuente de carbono y energía. La mayoría son móviles mediante flagelos polares. Descompone el peróxido de hidrogeno en agua y oxigeno gracias a la enzima catalasa que poseen citromos, el desprendimiento de burbujas procedentes del oxígeno indica que la prueba es positiva Son ubicuos. Resistentes a los antimicrobianos. No formadores de esporas. Cuenta con un género capaz de fijar nitrógeno además este forma quistes de pared gruesa. Psicrótrofos, son aquellos que crecen a temperaturas inferiores a 7°C
L a familia Pseudomonadaceae incluye a diferentes géneros de bacterias dentro de las cuales tenemos a Pseudomonas, Azomas, Azotobacter, Cellvibrio, Mesophilobacter, Rhizobacter, Rugomonas y Serpens.
DEFINICIÓN Hablando específicamente del genero Pseudomonas, se denominan así porque se suelen disponer en parejas que recuerdan a una célula única, el género sigue incluye casi 200 especies. Si nos referimos a la etimología griega pseudo (falso) y monas (unidad) es decir unidad falsa.
CARACTERÍSTICAS FUNDAMENTALES Su morfología colonial es característica identificación en algunos medios de cultivo, por ejemplo, medio agar Cetrimida, es un bacilo curvo o recto, aislado o pareja o cadenas cortas. Esta bacteria tiene motilidad positiva gracias a flagelo (solo cuenta con uno).
de en en su
La familia Pseudomonadaceae se divide en 5 grupos genéticos taxonómicamente diferentes que se agrupan según su análisis de ARNr. GRUPO I
Grupo Fluorescente Grupo Stutzeri Grupo Alcaligenes
GRUPO II
Grupo Pseudomallei
GRUPO III
Grupo Acidovorans Grupo Facilis-delafieldii
GRUPO IV
Grupo Diminuta
GRUPO V
Stenotrophomonas maltophilia
HABITAD Podemos encontrarlo principalmente en el suelo y agua como también en alimentos, vegetales y animales.
Fig. 4-2. Pseudomonas electrónico.
vista
desde
el
microscopio
FISIOLOGÍA Y ESTRUCTURA Conocido por ser un patógeno oportunista, pero resulta sorprendente que no sean patógenos más frecuentes dada su presencia ubicua, la capacidad de crecer en casi todos los entornos Son Mega plásmidos con una constante de basicidad (kb) de 500. Miden de (0.5 – 1.0 μm diámetro por 1.5 – 5.0 μm longitud) Contiene 58-69 mol% G+C
METABOLISMO MICROBIANO Se describen como aerobios obligados, pero pueden crecer de forma anaerobia utilizando nitratos o arginina como aceptor alternativo para los electrones. Secreta sustancias coloridas hidrosolubles que explican su aspecto característico en el cultivo y simplifican la identificación preliminar. Piocianina; azul Pioverdina; verde-amarillento ante la luz UV es fluorescente. Piorrubina; pardo-rojizo Piomelanina; Color marrón
FACTOR DE VIRULENCIA Fig. 4-1. En esta imagen se observa bacilos cortos a largos, Gram (-), sin agrupación aparente.
Estos microorganismos tienen muchos factores estructurales, toxinas y enzimas que lo hacen resistentes a los antibióticos y potencian su virulencia.
Pseudomonas aeruginosa Respecto a la etimologĂa de Pseudomonas aeruginosa viene derivado de la palabra Aerugo (ÂŤel Ăłxido de cobreÂť color verde) y la palabra Ĺ?sus (abundancia) se llama asĂ por el color azul verdoso de las colonias bacterianas.
CARACTERĂ?STICAS MORFOLĂ&#x201C;GICAS Altamente patĂłgeno. Anteriormente denominada Bacillus pyocyaneus. Con un tamaĂąo de 0.5â&#x20AC;&#x201C;1 diĂĄmetro x 3-4 đ?&#x153;&#x2021;m longitud.
CARACTERĂ?STICAS ESTRUCTURALES La mayorĂa posee un solo flagelo polar, pero algunos poseen 2 o 3. Reducen nitritos usando la glucosa. MultiplicaciĂłn por fisiĂłn binaria Sensible a la acciĂłn de EDTA. Sistema de secreciĂłn tipo III Forma 2 tipos generales de biopelĂcula â&#x20AC;&#x153;plana o inicialâ&#x20AC;? y biopelĂcula â&#x20AC;&#x153;estructurada o maduraâ&#x20AC;?.
Pseudomonas fluorescens hemolĂtica en las infecciones causado por factores de virulencia como las fosfolipasas.
CARACTERĂ?STICAS MORFOLĂ&#x201C;GICAS Con un tamaĂąo de 0.5â&#x20AC;&#x201C;2.5 diĂĄmetro x 1.2-10 đ?&#x153;&#x2021;m longitud. Bacilo recto ligeramente curvado, pero no vibroide.
MOTILIDAD La estructura locomotora de este microorganismo son los flagelos polares, que estĂĄn presentes en mĂşltiples nĂşmeros. Cuando los quimio-atrayentes como el azĂşcar, el ĂĄcido orgĂĄnico y los aminoĂĄcidos se usan en concentraciĂłn diluida, esta bacteria se mueve hacia ellos con la ayuda de flagelos.
CRECIMIENTO T°: 20-43°C pH: de 4.5 a 9.5 En altas concentraciones de sal. Fig. 4-4. MicrografĂa electrĂłnica de P. fluorescens. Las cuerdas son los flagelos que la bacteria usa para moverse.
CARACTERĂ?STICAS ESTRUCTURALES
Fig. 4-3. Proceso de formaciĂłn de la biopelĂcula en P. aeruginosa.
PATOGENIA Adhesinas: Facilitan esta adherencia: Flagelos y pili (Influyen sobre la movilidad de esta), lipopolisacĂĄridos (LĂpido A es responsable de la actividad de la endotoxina). Alginato: Protege al microorganismo de la fagocitosis y de la destrucciĂłn por los antibiĂłticos. Toxinas secretadas: Endotoxina A: Altera la sĂntesis de proteĂna al inhibir la elongaciĂłn de la cadena peptĂdica en las cĂŠlulas eucariotas. La Pioverdina: Es un sideroforo, tambiĂŠn regula la secreciĂłn de otros factores de virulencia, incluida la ETA. Enzimas Elastasas A y B: ActĂşan de manera sinĂŠrgica para degradar elastina. Proteasa alcalina: Participa en la destrucciĂłn tisular y en la diseminaciĂłn de P. aeruginosa, tambiĂŠn interfiere en la respuesta inmunitaria del hospedador. Fosfolipasa C: Degrada lĂpidos y la lecitina, que facilita la destrucciĂłn tisular, se ha visto asociada con la producciĂłn de hemolisina. Las exoenzimas S y T: Son toxinas extracelulares, esta citotoxicidad esta medida por una reorganizaciĂłn de la actina. Es menos comĂşn que cause infecciones comparĂĄndola con P. aeruginosa y P. putida, sin embargo, si llega a ver casos clĂnicos donde P. fluorescens muestra una gran actividad
Es saprofito (es un organismo cuya alimentaciĂłn consiste en ingerir sustancias orgĂĄnicas en estado de descomposiciĂłn) Rica en prolina. Rara vez muestra hemolĂtica en infecciĂłn. Solubiliza fosforo por dos vĂas; ProducciĂłn de ĂĄcidos orgĂĄnicos (Ă cido cĂtrico, acido oxĂĄlico, ĂĄcido glucĂłnico) y a travĂŠs de las fosfatasas que son enzimas hidrolasas (Monoesterasas y diesterasas fosfĂłrica) Forma BiopelĂcula.
CRECIMIENTO T°: Temperatura Ăłptima es 25-30°C aunque puede crecer desde los 5-42°C pH: Necesita preferentemente pH neutros. No crece en condiciones acidas (pHâ&#x2030;¤ 4.5)
CONTAMINANTE ALIMENTARIO Es uno de los mås comunes, especialmente para productos låcteos y otros alimentos que se almacenan en condiciones de baja temperatura (a 4°C). Secreta enzimas estables al calor (lipasa y proteasa), que provoca la agrupación de la leche.
MEDIOS Y CARACTERÍSTICAS DE CULTIVO DE P. aeruginosa AGAR SANGRE DE OVEJA En atmosfera aeróbica. A las 24h a 37C° se observa una coloración gris-plata en la superficie del crecimiento bacteriano.
AGAR SANGRE TRIPTICO DE SOJA A las 24 horas a 37 ° C + 24 horas a temperatura ambiente, se observa un centro más denso y borde irregular.
P. aeruginosa
ENDO AGAR Colonias sin lactosa Cultivo 24 horas, 37 ° C en atmósfera aeróbica. Pequeños puntos rosas pálidos con bordes irregulares.
AGAR MACCONKEY Aparecen como lactosa (-) con pigmentación verde o brillantes.
P. aeruginosa
MEDIOS Y CARACTERÍSTICAS DE CULTIVO P. fluorescens AGAR MACCONKEY Muestra un resultado negativo (el microorganismo no tiene la capacidad de degradar la lactosa, no hay cambio de color del indicador de ph rojo neutro) , con un crecimiento abundante.
AGAR B DE KING Producción de fluorescencia, en atmosfera aeróbica a 37°C por 24-48 horas. Se observa un centro denso con un borde irregular de color fluorescente bajo la luz UV.
AGAR CITRATO DE SIMMONS Que muestra un resultado positivo (el microorganismo tiene la capacidad de usar citrato
Bajo luz UV AGAR NUTRIENTE P. fluorescens incubado25°C en intervalos de 24H. El crecimiento intenso puede producir un pigmento fluorescente de oro verdoso.
Aislamiento Pseudomonas aeruginosa en aguas. Detección y enumeración por filtrado de membrana. UNE EN ISO 16266-2008. Confirmado en 2015 Procedimiento Filtración e incubación
Filtrar los volúmenes de la muestra de agua a través de un filtro de membrana de éster de celulosa de 45 µm (ver ISO 8199) y colocar la membrana sobre una placa con agar CN CM0559B Pseudomonas Agar base (ISO) (500 g) + SR0102E Pseudomonas CN Selective Supplement (ISO) (10 viales) PO5076A Agar Cetrimida (20 placas) Incubar a 36ºC ± 2ºC durante 44 ± 4 h Examinar el crecimiento en las membranas tras 22 ± 2 h y 44 ± 4 h
Bajo luz natural Contar todas las colonias con color azul / verde (piocianina), como Pseudomonas aeruginosa.
Bajo luz U.V Contar todas las colonias rojo / marrón como presuntivas Pseudomonas aeruginosa.
Contar todas las colonias fluorescentes no productoras de piocianina como presuntivas Pseudomonas aeruginosa.
Confirmación Confirmación Subcultivo en Nutrient Agar CM00003B Nutrient Agar 500 g PO5025A Nutrient Agar 20 placas Incubar a 36ºC ± 2ºC durante 22 ±2h Reacción de la oxidasa (+): MB0266 Oxidase Detection Strips ISO 50 tiras Caldo Acetamida. 40101012 Acetamide Broth ISO (500 g) Incubar a 36ºC ± 2ºC hasta 5 días
Subcultivo en Nutrient Agar CM00003B Nutrient Agar 500 g PO5025A Nutrient Agar 20 placas Incubar a 36ºC ± 2ºC durante 22 ± 2 h Caldo Acetamida. 40101012 Acetamide Broth ISO (500 g) Incubar a 36ºC ± 2ºC hasta 5 días
Medio King’s B. 4019612 Pseudomonas Agar F (King’s B modificado (500 g) Incubar a 36ºC ± 2ºC durante 22 ± 2 h Recuento: Contar todas las colonias que producen piocianina, o que sean oxidasa (+), fluorescentes bajo luz U.V. y productoras de amoniaco en Caldo Acetamida.
Pseudomonas. Carne y productos cárnicos. Recuento de Pseudomonas spp. presuntas. UNE EN ISO 137202011 (Confirmada en 2016).
Procedimiento Dilución inicial y suspensiones de acuerdo a la ISO 6887-2 CM0733B Maximum Recovery Diluent (Peptone Saline Diluent ISO) 500 g TV5016D Maximum Recovery Diluent ISO 50 x 9 ml
Utilizar una placa por dilución. Si solo se utiliza una dilución, utilizar dos placas. Añadir 0,1 ml de la dilución inicial y 0,1 ml de las diluciones sucesiva a una placa de Agar CFC y extender. CM0559B Pseudomonas Agar base (ISO) (500 g) + SR0103E Pseudomonas CFC Selective Agar Supplement (ISO) (10 viales) PO5132A Pseudomonas CFC Agar ISO (20 placas)
Incubar a 25ºC ± 1ºC durante 44 ± 4 h
Examinar el crecimiento en las placas con < 150 colonias. Se toman 5 colonias para realizar la confirmación
Confirmación
Reacción de la oxidasa: MB0266 Oxidase Detection Strips ISO 50 tiras (+) Color violeta a púrpura en 5 - 10 s Las colonias oxidasa +, se consideran colonias presuntas Pseudomonas spp. .
Infección crónica de la vía aérea por Pseudomonas aeruginosa a largo plazo en ratones
Preparación de bacterias para la infección crónica (tres y dos días antes del desafío con ratones) Seleccione la cepa apropiada de P. aeruginosa para analizar. Inocular un bucle lleno de P. aeruginosa de un cultivo de reserva a -80 ° C en una placa de agar de tripticasa de soja (TSA) e incubar a 37 ° C durante la noche. Elija una sola colonia e inocúlela en 5 ml de caldo de soja tripticasa (TSB) en un tubo de 15 ml con tapa a presión e incube a 37 ° C durante la noche en un agitando la incubadora a 200 rpm. Incrustación de bacterias en granos de agar para infección crónica (un día antes de la infección)
500C 6 min
Pseudomonas aeruginosa
TSA
Aceite mineral
Formación de cuentas
Desafío del ratón Infección pulmonar crónica
Descripción general de la preparación de perlas de agar y la infección del ratón. Las células de P. aeruginosa se resuspenden en 1 ml de PBS y se agregan a 9 ml de TSA líquido (50 ° C). Esta mezcla se agrega a 150 ml de aceite mineral pesado a 50 ° C en un matraz y se agita a alta velocidad durante 6 minutos a temperatura ambiente. Cuando el matraz se enfría a 4 ° C con agitación lenta durante 35 minutos, el agar se solidifica creando perlas, y las bacterias presentes en la mezcla se incrustan en las perlas de agar. Se muestra el detalle de una perla de agar que contiene células bacterianas (A). Después de eliminar el aceite mineral con varios lavados usando PBS estéril, la suspensión de perlas de agar está lista para la inoculación en los pulmones de los ratones mediante una inyección intratraqueal (B).
5. Familia Listeriaceae Género Listeria Parámetros de Desarrollo Género Listeria Las especies de Listeria están muy extendidas en el medio ambiente. Se han aislado del suelo, materia vegetal en putrefacción, comida animal, pollo fresco y congelado, alimentos frescos y procesados, queso, leche no procesada. Los alimentos contaminados son los principales vehículos de transmisión de la listeriosis.
Parámetro
Min.
Ópt
Max.
T°
4
34-37
55
ph
4
6-8
9.6
aw
0.90
0.97
-
Principales Especies de Listeria a) Listeria monocytogenes Es la más representativa del género ya que es el principal causante de infecciones en humanos, produce una toxina que destruye una importante maquinaria celular, la SUMO ilación.
b) Listeria ivanovii
Características
❏ ❏ ❏ ❏ ❏ ❏
Patógena usualmente en rumiantes, aunque existen raros casos de infecciones en humanos
Son bacilos Gram-Positivas.
c)Listeria innocua
Son anaerobias facultativas.
Es inofensiva hacia otros organismos, carece del factor de virulencia 10-kb que se necesita para ser patogénica, puede sobrevivir a ph y temperaturas extremas así también como a una alta concentración de sal.
Producen ácido de la D-glucosa y de otros azúcares. No producen endosporas El contenido de guanina-citosina de su ADN es bajo, entre el 36% y el 38%.
c)
Presentan de 1 a 5 flagelos peritricos que les confieren movilidad a 28ºC.
Carácter Patógeno en Humanos
Nivel
Especie
Alta
L.monocytogenes
Media
L.ivanovii
L.welshimeri
Baja
L.seeligeri
L.grayi
Nula
L.innocua
a)
b)
c)
DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO ➔ Toma de Muestras En derivados lácteos y carnes las muestras deben ser desinfectados en el sitio de la incisión inmediatamente antes de realizar la misma para la toma de muestra. Pesar 25 g de la muestra en una bolsa de stomacher, agregar 225 ml de caldo UVM y homogeneizar durante 2 minutos ± 0.2 minutos en Stomacher. Incubar durante 22 h ± 2 h a 30ºC ± 2ºC
➔ Pruebas Presuntivas Tinción de Gram. - la coloración de Gram. Listeria spp. se presenta como bacilos Gram positivos cortos y delgados. Test de Confirmación Preliminar. - A partir de colonias aisladas mediante el cultivo, al menos 1 colonia debe ser confirmada usando técnicas de reacción PCR, Extracción de ADN Cromosomal, Marcador de Talla Molecular ➔ Enriquecimiento Caldo Listeria Fraser ISO 11133 / ISO 11290 La Base de Caldo Listeria Fraser se utiliza como enriquecimiento selectivo de Listeria monocytogenes y otras especies de Listeria en todos los tipos de alimentos, el digerido enzimático de la caseína, el digerido enzimático de los tejidos animales y el extracto de carne proporcionan nitrógeno, vitaminas, minerales y aminoácidos esenciales para el crecimiento, el cloruro de litio inhibe el crecimiento de enterococos que pueden hidrolizar la esculina. Enriquecimiento primario: Pesar 25 g (o 25 ml) de la muestra y agregar 225 ml de Caldo Listeria 1/2 Fraser . Homogeneizar e incubar a 30 °C durante 25±1 horas Enriquecimiento secundario: Inocular 0,1 ml de cultivo del Caldo Listeria 1/2 Fraser incubado (independientemente de su color) en 10 ml de Base de Caldo Listeria Fraser junto con el Suplemento Citrato Ferroamónico. Incubar a 37 ºC durante 24±2 horas en condiciones aeróbicas. Una vez enriquecida las muestras se procede al método de cultivo a elección del laboratorio.
➔ METODO AISLAMIENTO EN AGAR OXFORD Todas las especies de Listeria hidrolizan la esculina en esculetina, que reacciona con los iones hierro produciendo colonias negras y un ennegrecimiento del medio. Otra ventaja de este medio es que las peptonas y el almidón de maíz proporcionan una base nutritiva rica para el crecimiento, y la adición de citrato de amonio férrico mejora el desarrollo de Listeria monocytogenes. El cloruro de litio es un agente inhibidor, que junto con los otros antibióticos del suplemento, inhiben el crecimiento de bacterias Gram negativas y una gran parte de las Gram positivas ➔
MÉTODO SELECTIVO SIEMBRA EN AGAR LISTERIA OTTAVIANI Y AGOSTI (ALOA)
Medio selectivo para el presunto aislamiento e identificación de Listeria spp. en alimentos y muestras. La presencia del componente cromogénico X-glucósido, un sustrato para la detección de la enzima ß-glucosidasa, es común a todas las especies de Listeria dando a las colonias su color azul. La actividad diferencial se obtiene mediante el sustrato de la lipasa C exclusiva de Listeria monocytogenes que hidroliza fosfotidiliosiol o lecitina produciendo un halo opaco blanquecino alrededor de la colonia, esto nos permite diferenciar las colonias de Listeria monocytogenes del resto de Listeria spp.
IDENTIFICACIÓN DE Listeria spp.
Especie
HE
Prueba Camp
Producción de Ácidos de Azúcares
S. aureus
R. euqui
D- manitol
L- rhamnosa
D xilosa
monocytogenes
+
+
-
-
+
-
ivanovii
++
-
+
-
-
+
innocua
-
-
-
-
v
-
Fuentes de Transmisión Alimentaria Listeria es un contaminante común de una alta gama de alimentos por su capacidad de producir biofilm en alimentos, crecer a temperaturas de refrigeración y altas concentraciones de NaCl. Los alimentos de alto riesgo son los siguientes: A. B. C. D.
Medidas de Prevención en Alimentos La solución infalible para prevenir la contaminación de Listeria en alimentos por completo, no existe, sin embargo, los siguientes tratamientos contribuyen a un control efectivo de la bacteria: A.
Carne de rumiantes y aves cruda o cocida. Leche y derivados lácteos. Frutas y verduras Alimentos Refrigerados
B. C.
D.
Pasteurización: Eficaz a 75°C en leche y carnes. Esterilización (120°C por 4 min) Uso de bacteriófagos: Lisa el 95% de Listeria spp. Bacterias ácido lácticas productoras Bacteriocinas: Causan un descenso del
de pH
intracelular y muerte celular del patógeno.
MECANISMO DE ACCIÓN
SINTOMATOLOGÍA
TRATAMIENTO
La L. monocytogenes se adhiere a la célula hospedera, escapa de las vacuolas hacia el citoplasma, se replica en el citosol y por último, se produce la propagación célula-célula y el reinicio del ciclo.
Entre las manifestaciones clínicas más frecuentes son las siguientes: -Gastroenteritis aguda febril
El tratamiento intravenoso con antibióticos como penicilina, ampicilina o trimetoprim con sulfametoxazol es el recomendado para la forma invasiva de la enfermedad.
-Infecciones embarazo
durante
el
-Infección del sistema nervioso central
Género Campylobacter Es un patógeno alimentario considerada por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como el primer agente etiológico de diarrea en el ser humano en los países desarrollados, y el segundo o tercero en los países en vías de desarrollo, además son las bacterias más comunes causantes de gastroenteritis en el mundo entero.
Especies Termófilas -Campylobacter jejuni -C. coli
-C. lari -C. upsaliesis
Principales enteropatógenos
Aisladas fundamentalmente de muestras intestinales
Parámetros
Mín.
Ópt.
Máx.
T (°C)
32
42-43
45
pH
4.9
6,5-7,5
9,5
Aw
0,987
0,997
-
Campylobacter jejuni Es una de las especies más importantes, y desde 1970, se la reconoce como la bacteria más aislada en humanos con gastroenteritis; es microaerófilo capaz de crecer en una atmósfera de composición 5% de oxígeno, 10% de dióxido de carbono y 85% de nitrógeno; no utiliza los hidratos de carbono
Especies No Termófilas Factores de virulencia: -C. fetus
Aisladas fundamentalmente de muestras de sangre
La membrana externa contiene un lipopolisacárido (LPS) con la típica actividad endotóxica; la cápsula es importante para la virulencia; el lipooligosacárido (LOS) es también muy variable y participa en la resistencia, la adherencia a las células epiteliales; antígenos O que contienen ácido siálico; y toxinas extracelulares.
Toxinas: -
1 enterotoxina citotónica que induce un aumento de la excreción de iones y agua. 2 enterotoxinas citotóxicas (termolábil y termoestable). 1 toxina citoletal distensora
Campylobacter coli: Características: Son bacilos Gram negativo. Poseen metabolismo respiratorio microaerófilo. Móviles por la presencia de uno o dos flagelos polares. No son esporulados. Generalmente son oxidasas positivas. Bacterias de pequeño tamaño. Tienen forma de “S” o espiral, pero pueden adquirir
Junto a Campylobacter jejuni son las especies con mayor incidencia en los alimentos. Campylobacter coli es más resistente que Campylobacter jejuni frente a condiciones estresantes debido a que son más aerotolerantes. Clínicamente, C. coli y C. jejuni son indistinguibles, por lo que es necesario realizar pruebas bioquímicas para su diferenciación
DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
Toma de Muestras Frotis rectales y/o contenido del ciego, o bien en el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Cuando se utilizan frotis, se debe utilizar un medio de transporte (como Amies, Cary Blair o Stuart).
Enriquecimiento: Caldo Bolton (ISO 10272:12006) Posee nutrientes para Campylobacter spp. como hidrolizado de lactoalbúmina, ClNa, peptona, hemina, entre otros. Además, inhibe a otros microorganismos pues posee suplementos selectivos como: vancomicina, cefoperazona, anfotericina B. Se introduce la muestra y el caldo bolton en una bolsa esteril en relación de 1:10, cumpliendo lo siguiente: 1° Por 6 horas, se mantiene a 37°C en condiciones de microaerofilia (se usan jarras de anaerobiosis). 2° Por 48 horas, se mantiene a 41,5°C (rango óptimo de crecimiento) en condiciones de microaerofilia (se usan jarras de anaerobiosis). Se procede realizando el cultivo en placa y aislamiento de Campylobacter spp., se pueden usar medios selectivos con sangre o medios con base de carbón.
Pruebas Presuntivas ● Tinción de Gram de las colonias: Gram negativas. La confirmación preliminar de las cepas aisladas puede llevarse a cabo mediante examen de la morfología y la motilidad empleando la microscopía óptica: forma de comas o espirilas cortas, en forma de S
Aislamiento -Siembra en Agar selectivo Butzler: Contiene mezcla de peptonas, extracto de carne, levadura, ClNa y sangre de oveja al 5% (nutrientes). La selectividad de este medio viene dada por la presencia de antibióticos como la colistina y rifampicina; y por la presencia de antifúngicos como la anfotericina B. Con un periodo de incubación de 48 horas a 37°C (T° óptima a 42°C, refuerza el efecto selectivo) en condiciones de microaerofilia. Características culturales: colonias redondas, prominentes y brillantes. Se observa una extensión característica a lo largo
de la línea de inoculación
Siembra en Agar selectivo CSM: Consiste en base Columbia, carbón activado, hematina, piruvato de sodio y tres agentes antimicrobianos. El carbón, la hematina y el piruvato de sodio mejoran la aerotolerancia de las especies de Campylobacter, por otro lado el carbón, la hematina, el sulfato ferroso y el piruvato de sodio sirven como sustitutos de la sangre en los medios de crecimiento. Con un periodo de incubación de 48 a 72 horas en condiciones microaerófilas a 42°C. Características culturales: las colonias típicas son grisáceas, planas y húmedas, con tendencia a extenderse, y pueden tener brillo metálico.
IDENTIFICACIÓN DE Campylobacter spp.
FUENTES DE TRANSMISIÓN ALIMENTARIA
MEDIDAS DE PREVENCIÓN EN ALIMENTOS
Campylobacter spp. está entre los patógenos con mayor importancia en las ETAs. Más del 50% de ganado, pollos y patos excreta Campylobacter jejuni. Los alimentos de alto riesgo son los siguientes:
Campylobacter jejuni y C. coli son las especies con mayor incidencia en alimentos, incluso pueden mantenerse viables a condiciones de refrigeración. Las medidas de prevención para Campylobacter spp. son las siguientes:
A. Aves de corral mal cocidas. B. Leche cruda o mal pasteurizada. C. Carne de cerdo mal cocida.
A. B. C. D.
Irradiación Cloración del agua Correcta cocción Pasteurización
CUADRO CLÍNICO
MECANISMO DE ACCIÓN
SINTOMATOLOGÍA
TRATAMIENTO
- Invaden el intestino delgado, se adhieren y colonizan la mucosa, destruyéndola. - Si la bacteria es resistente (protegida por proteínas de superficie), puede llegar a la circulación portal.
-Diarrea acuosa y sanguinolenta con olor pestilente.
-Generalmente no requiere terapia antimicrobiana. -Puede requerir de hidratación adecuada. -En casos de bacteriemia, se recomienda tratamiento con eritromicina.
-En pacientes inmuno_ deficientes puede causar bacteriemia (bacterias en la sangre). - Síndrome de Guillain- Barre.
6. Familia Brucellaceae Género: Brucella
Son patógenos intracelulares facultativos que infectan una gran variedad de mamíferos. La bacteria se transmite por ingestión o contacto con materiales contaminados provenientes de animales enfermos. Conocido principalmente por producir la enfermedad brucelosis, una de las zoonosis más importantes en la actualidad. Actualmente el género Brucella incluye 6 especies: B. abortus, B. melitensis, B. canis, B. neotomae, B. ovis y B. suis.
CARACTERISTICAS
patogenicidad
B. melitensis
alta
B. abortus
alta
B. suis
alta
B. ovis
ninguna
B. neotomae
ninguna
B. canis
moderada
Principales especies de la Brucella a)Brucella abortus
❏ ❏ ❏ ❏ ❏
Bacteria Gram negativa inmóvil
❏
Es aeróbica estricta, es catalasa positiva y oxidasas positivas
❏
especie
Es una zoonosis ampliamente distribuida a nivel mundial que afecta principalmente al ganado bovino, causando esterilidad en machos y abortos en hembras en gestación.
No suelen presentar coloración bipolar. Su lípido A es poco endotóxico No producen cápsulas, ni esporas y flagelos. Bacilos cortos o cocobacilos de 0,5 a 0,7 µm de diámetro y de 0,5 a 1,5 µm de largo.
No son ácido resistente, aunque pueden resistir a la decoloración por los ácidos débiles o por los álcalis
PARÁMETRO
Min.
Opt.
Máx.
T (°C)
20°C
37°C
40°C
Ph
6,6
6,6 – 7,4
7,4
Aw
0.98
0,99
> 0,99
b)Brucella melitensis La brucelosis ovina y caprina causada por la bacteria Brucella melitensis, provoca abortos en los pequeños rumiantes, con pérdidas económicas considerables. Esta infección causa pérdidas significativas debido a la disminución de la productividad y las pérdidas comerciales en muchos países en desarrollo.
DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO Toma de muestra Las muestras de elección ante la sospecha de brucelosis son la sangre, médula ósea o tejidos infectados. En ocasiones a partir de muestras fetales (hígado, pulmón, bazo y contenido gástrico) es posible realizar el aislamiento en medios nutritivos comunes como el Agar Sangre.
MÉTODOS SELECTIVOS -Agar Brucella Para su detección se ha utilizado el medio de Castañeda o cualquier frasco de hemocultivo con medio bifásico. Con los sistemas automatizados actuales, el crecimiento se ha acelerado. El medio Agar brucella, enriquecido con un 5% de sangre de caballo, fue diseñado originariamente para el aislamiento de Brucella spp.
Pruebas presuntivas -TINCION GRAM Realizada a un cultivo de Brucella melitensis. 1000 aumentos.Se observan cocobacilos diminutos (0.5 × 0.6 a 1.5 μm), gram negativos o mal teñidos. Test de confirmación preliminar Tras la tinción de Gram de estas colonias para observar su aspecto característico, se realizará la reacción de la oxidasa (positiva) y aglutinación con suero específico frente a Brucella, suficiente para identificar el aislamiento.
Enriquecimiento de caldo brucella (APHA) Rico en nutrientes y tiene un factor de crecimiento, es muy adecuado para cultivar y aislar microorganismos exigentes. Es ampliamente utilizado para aislar Brucella de diversos especímenes contaminados con microflora, ya sea saprófitos o comensales. También se puede usar en sistemas de botellas de cultivo de sangre. Las peptonas de carne y de caseína proporcionan nitrógeno, vitaminas, minerales y aminoácidos esenciales para el crecimiento. El extracto de levadura es una fuente de vitaminas, particularmente del grupo B. El bisulfito sódico es el agente reductor. El cloruro de sodio suministra electrolitos esenciales para el transporte y el equilibrio osmótico. La dextrosa es el carbohidrato fermentable que proporciona carbono y energía. Preparación Suspender 28,1 gramos del medio en un litro de agua destilada. Mezclar bien y disolver calentando con agitación frecuente. Hervir durante un minuto. Dispensar en los recipientes apropiados y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.
-Agar Thayer Martin modificado Este medio de cultivo es ampliamente nutritivo por la presencia de Agar Base GC, hemoglobina y el suplemento de enriquecimiento Britalex. Esta constituido por GC (Gonococcus medium base), un 1 % de hemoglobina y los siguientes antibióticos: 3 mg de Vancomicina, 7.5 mg. de Colistina, 12.500 U.I. de Nistatina y 10 mg de Nitrofurantolna. de Castañeda o cualquier frasco de hemocultivo con medio bifásico. Con los sistemas automatizados actuales, el crecimiento se ha acelerado. El medio Agar brucella, enriquecido con un 5% de sangre de caballo, fue diseñado originariamente para el aislamiento de Brucella spp.
FUENTES DE TRANSMISIÓN ALIMENTARIA Brucella spp. El microorganismo proviene fundamentalmente del ganado enfermo. La brucelosis es una zoonosis de origen alimentaria, es decir que se transmite a los humanos a través del consumo de los productos alimenticios derivados. Los alimentos de altos riesgos son los siguientes: A. B. C.
Leche cruda o derivados lácteos Frutas y verduras Carnes pocos cocinadas
MEDIDAS DE PREVENCIÓN EN ALIMENTOS La brucelosis puede ser erradicada si se mantienen medidas de control sanitario, vacunación de todos los hatos, eliminación de todos los animales enfermos. Las medidas de prevención para Brucella son los siguientes: A. B.
Tratamientos térmicos a 60°C Pasteurización
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