蛋白質體學 一、蛋白質的結構 1.蛋白質的功能 連接（binding）
催化（catalysis）
構形轉換（switch）
結構（structure）
2.肽鍵 肽鍵的形成：
由於胺基酸分子之間會共振，因此肽鍵之間會產生 暫時性的雙鍵，此性質會增加肽鍵的極性，影響蛋 白質的摺疊。 此外，暫時雙鍵的性質也會影響到肽鍵的旋轉，在 多肽鏈中 N-Cα 與 C-Cα 鍵為自由旋轉的，因此 N-Cα 鍵與連接鍵結之間的角度為 Φ；而 C-Cα 鍵 與連接鍵結之間的角度為 Ψ。 3.穩定鍵結的力 在蛋白質之中有六種的作用力（鍵結） 可以穩定蛋白質的結構，以下逐一介 紹： 1.共價鍵：共價鍵的形成是由於鍵結電 子共用之不平均，常見於非金屬原子 與金屬元子之間。EX：C-Cα 2.雙硫鍵：在蛋白之中，雙硫鍵為重要 穩定蛋白質結構的鍵結，常見於半胱 氨酸（Cys）之間。EX：Cys-S-S-Cys 3.離子鍵：離子鍵的形成通常有提供電 子者與接收電子者組成。EX：N-O 4.氫鍵：與離子鍵類似通常有提供質子者與接收質子者組成。EX：H-N 5.靜電力：在非極性區時呈現高作用力，但在水中則減少許多。EX：O-O 6.凡德瓦力：短距離，形成短暫。 4.α-helix 每3.6 個胺基酸捲繞一圈，成為右手旋的螺旋構造，但遇Pro 則中止； 由相鄰兩胜鍵平面所夾的角度，可以準確預測 α 螺旋或其它二級構造的生成 (Ramachandran Plot)。分子內氫鍵可在螺旋骨架間加上支架，更使得 α 螺旋成為 圓筒狀，有堅固的構形，也是三級構造的主要組成單位。肌紅蛋白 由八段長短 不等的 α 螺旋所組成。
5.β-sheet 像彩帶的構形，多由數條彩帶組成，相鄰彩帶之間以 氫鍵 接合，編成一片堅固的盾形平面。依相鄰彩 帶的N→C 方向，可分為 同向 (parallel) 及 逆向(antiparallel) 兩大類。β長帶多由R基團較小的胺基酸(如 Ala,Gly,Ser)組成。
6.連接性二級結構 a. Turn 轉折：連接 α 螺旋或 β 長帶時，胜肽鏈 需做劇烈的轉折，以接近 180 度的方式折返，這些轉 折點通稱為 turns；其中βturn 由四個胺基酸組成 (多 含有 Gly)；γturn 則由三個胺基酸組成，且必須由 一個 Pro 造成主要轉折。Turns 多分佈在蛋白質的表 面，也很容易誘生抗體。 b. 不規則形：除上述構造外，尚有構形不規則的片 段，稱為 不規則形。而在蛋白質分子兩端附近，其 活動性較大，形狀經常變化，則為 任意形 (random coil)。 7.蛋白質摺疊 通常由一個蛋白質的初級結構，我們就可以大致上瞭解一個蛋白質在摺疊之 後的雛形，當核醣體將多肽鏈製造出來之後，多肽鏈沒有辦法自動摺疊，要 靠一類輔助性蛋白質來進行正確的摺疊。這一大群輔助蛋白質，統稱為 chaperonin；某些熱休克蛋白質就有chaperonin 的功能，是因為在高溫下蛋白 質的構形不易維持，要特別誘生chaperonin 來防止蛋白質進行不正確摺疊。 而當某些蛋白質老化之後，蛋白質會被接上泛素，而細胞中的蛋白脢體會 辨識這個訊息將蛋白質分解掉，而這個機制也與免疫細胞中MHC分子的形 成有關。 8.三級結構 蛋白質的三級構造大致捲繞 成 球狀 (globular)，已是有特 定構形的活性分子。 a. 分子內的二級構造再相互 組合，構成完整球狀的 三級 構造 (tertiary structure)；其構 成的作用力有 離子鍵、氫 鍵、疏水鍵、金屬離子 等作 用力；其中 疏水鍵 對水溶性 蛋白質三級構造之穩定性，貢 獻很大。 b. 水溶性蛋白質的核心緊
密，多由疏水性胺基酸組成。由於疏水性胺基酸為外界水環境所排斥，可以穩定地包埋在分子內部，維 持蛋白質的構造。 c. 蛋白質分子內兩個Cys 上的 -SH 可經氧化而成 雙硫鍵 (-S-S-)，雙硫鍵可加強蛋白質的立體構造。在 細胞中，雙硫鍵的形成可能需要靠酵素的催化。 9.膜蛋白 膜上的蛋白質通常有其結構上的特性，例如像跨膜蛋白鑲嵌在脂雙層之間的部份，胺基酸支鏈通常為疏 水性的，而靠近膜外的胺基酸支鏈則為親水性的。膜蛋白之結構可分為兩型，皆為單一種主要二級結構： α-helix 跨膜型與，β-sheet 網。在 α-helix 跨膜型中，多個 α-helix 會穿過膜，而兩個 α-helix 之間則由 turn 來做連接，例如像電子傳遞鏈中的細胞色素複合體 bc1 及視網膜的視紫質蛋白。β-sheet 網則為多條 β-sheet 互相交錯形成，此類結構多為通道，而 α-helix 也可以作為通道的結構，鉀離子通道即由 4 組 α-helix 組成。 10.domain 很多蛋白質在其三級構造中，可發現還會分成幾個獨立的小區域，每個區域稱 為domain (功能區塊)。較小的蛋白質通常只有一個domain，大形蛋白質則含有兩 個以上domains。同一類似的domain 可能經常重複出現在不同蛋白質，有其特定 功能；domain 可能早期是獨立基因，後來因為基因之複製與組合，與其他功能 的domain 組成新的蛋白質。 11.motif 某些二級構造經常會聚在一起，例如 αααα, βαβ 或 α8β8 筒狀構造 等，而且經常出現在不同蛋白質中，可視為一種二級構造的再現單位 (motif)。 這些再現單位可能對蛋白質的構造及其功能，有某種特定的貢獻。 12.四級結構 有些蛋白質再聚合成四級構造，以調節其自身的功能，或組成巨大的結構分子。 a. 若數個相同或不同的三級構造分子，再結合成一較大的複合體，才能進行完整的活性功能，則稱為 四 級構造 (quaternary structure)。構成四級構造的每一單位分子，稱為 次體 (subunit)，通常各次體之間是以 二級鍵為主要結合力量。請注意，每單位次體都是由一個獨立的基因所轉錄、轉譯出來的。 b. 若四級構造的任一次體與受質結合之後，會誘導增強其它次體與受質之結合能力，而加速反應，則稱 為 正協同作用 (positive cooperativity)，反之為 負協同作用。四級構造在 調控 蛋白質的活性上非常重 要，許多酵素是重要例子，但典型具四級構造且有複雜調控機制的血紅蛋白並非酵素。 c. 病毒的蛋白質外殼，或動物的肌肉、毛髮、角質等，具有規律而巨大的構造組成。 13.X-ray 與結構
14.NMR 與結構
二、特殊的結構與功能 1.蛋白質的功能與結構 一般來說，細胞內的蛋白質通常有多種的細胞生理或是生化的功能，例如微管蛋白（tubulin）就有下列 四種功能：1.微管聚合 2.與動力蛋白（dynein）結合 3.鞭毛運動 4.細胞內物質的運輸。當然酵素也不例 外，光合作用卡爾文循環中的 Rubisco 就有加氧酶及羧化酶的功能，而這種情況就牽涉到活化位的數量， 有些為單一活化位，有些則是分開的活化位，左圖是一種沙門氏菌的色胺酸合成酶，在酵素中有一個通 道，受質可以經由通道從一個活化位通到另一個去。 2.變色龍序列 在蛋白質的結構中，二級結構通常可以由蛋白質的胺基 酸序列來預測，有一些蛋白質常因為環境的改變（pH） 或者是與其它的分子或蛋白質接觸之後造成二級結構 的改變，右圖為一個可以與 DNA 接合的蛋白質 Fis，當 Fis 與 DNA 接觸時，結構中的 β-摺版會變成 α-螺旋。 當有有些蛋白質的構型改變是因為病理上的緣故，例如 像普恩蛋白（Prion）或是阿茲海默症中的澱粉體。PrPc 為正常的普恩蛋白，當 PrPc 及 PrPSc 兩個蛋白質碰在一 起時，PrPSc 會改變 PrPc 的結構，變成有害的結構並聚 集在一起；絲胺酸分解酶的一個抑制物 Serpin 與絲胺酸分解酶結合時也會改變結構使絲胺酸分解酶的酵 素活性被抑制
三、蛋白質結構的預測 1.序列比對與比較 當我們要預測一個未知蛋白的結構時，常會拿它與其它的蛋白質進行序列的比對，並經過 Hidden-Markov 模型求出 E 值，當 E 值小於 10-50 時，兩個蛋白質的結構應該十分相似，當 E 值大於 10-10 時，兩個蛋白質 的關係將隨 E 值的增大漸漸減少，透過蛋白質序列比對，我們也可以畫出演化樹來分析蛋白質的同源性。 當然我們也可以根據蛋白質資料庫中的資料進行 Protein Profiling，由資料庫中的結構與序列的再現單位 及特殊的功能區塊來判斷蛋白質的功能。當兩個蛋白質間的序列超過 40％相同，我們即可將這兩個蛋白 質劃作同一個超家族，例如像人類的激酶超家族（Kinome Superfamily）
2.趨異演化與趨同演化 就如一般的生物一樣，蛋白質也是會 做結構上的演化，例如像 benzoylformate decarboxyase 和丙酮酸 羧化酶只有 21％的序列相似度，但他 們摺疊方式卻十分相似，這個例子即 為趨同演化。趨異演化常會出現兩個 結構相似的蛋白質，但他們的功能是 截然不同的，我們可以應用電腦模擬 未知蛋白的相似物（homology modeling）來預測一個蛋白質的功 能。Profile-Based Threading 是目前最常用的電腦模擬方法，電腦首先由 序列模擬各種蛋白質的構型，而其中與序列相符度最高的結構變可能是 未知蛋白質的結構；Rosetta 為另一個從序列預測結構的方式，我們將序 列分為幾段根據蒙地卡羅模擬（Monte Carlo procedure）【蒙地卡羅模擬 是根據統計力學的方式來模擬蛋白質的結構】下去模擬，之後再將幾段 結構拼湊出來成為一個合理的結構模型。 3.找出結合位與催化位 結合位的辨識有兩個方向，一個是使 用電腦模擬，一個則是將一些有機分 子當做探針（probe）接合到待測蛋白質上面去，將待測蛋白質結晶之 後利用 X 光繞射的原理觀察蛋白質的構型。通常電腦模擬與 X 光繞射 都是辨識結合位必須做的實驗，由兩者的數據則可更詳細推出結合位 的構型。 催化位的辨識是由電腦模擬，電腦會做出一個三度的空間，並將官能 基擺上成為一個模型，再根據形狀擺上不同的分子進行計算，與結合位的辨識方法相似。 四、轉譯後修飾 1.轉譯後修飾的介紹 分子生物學中的中心法則：DNA→RNA→蛋白質，但是在生物體中許多蛋白質生產出來之後並沒有完全 的活性，例如像胃主細胞所分泌出來的胃蛋白酶原必須經過壁細胞所分泌鹽酸的切割之後才成為有活性 的胜肽，因此轉譯後修飾為一個十分重要的步驟，轉譯後修飾能在胜肽的特定胺基酸上作官能基的修 飾，是蛋白質活化及具有功能，有些修飾作用還具有穩定結構的功能，或是固定在胞膜上的作用。大部 份修飾作用具有可逆性，故可以調控細胞生理的狀態，例如 G 蛋白的磷酸化，酵素輔因子的修飾，組蛋 白的乙醯化及甲基化；而有些則是不可逆的反應，例如裂解、泛素化。轉譯後修飾的分子機制極為複雜， 為目前蛋白質體學上重要的研究課題。 生化學家時常運用下列幾個方法來檢查轉譯後修飾的現象：1.X 光繞射技術，X 光繞射技術利用電子的 分布不均來觀察蛋白質的 3D 立體構型，生化學家也可以利用此方法來檢查蛋白質上是否有特定的官能 基團；2.質譜儀：利用質譜儀的方法觀察蛋白質在游離後在電場的運動軌跡，判定蛋白質的分子量是否 有增減，例如像甲基化的蛋白質會增加 14 道爾吞的重量；胺基化則會減少 1 道爾吞的重量。轉譯後修 飾發生的位置會與胺基酸的本性有關，例如酪氨酸即是一個十分常見出現轉譯後修飾的地方，脯氨酸由 於其亞胺基構造的關係，除了羫基化之外就沒有其他的轉譯後修飾。有些胺基酸也會被修飾後再進行轉 譯作用，例如像硒化的半胱氨酸，也有人認為硒化的半胱氨酸是第 21 種胺基酸。
2.磷酸化（Phosphorylation）磷酸化是細胞體中最常見的轉譯後修飾，是一種可逆的轉譯後修飾，通常出 現在酪氨酸、蘇胺酸及絲胺酸上。以細胞上常見的一個例子，生長因子結合 到受器後會引起 Ras-GTP 的作用，Ras-GTP 會磷酸化 c-Raf 蛋白，之後 c-Raf 蛋白再磷酸化下游的 MKK1 蛋白，最後 MKK1 蛋白磷酸化 ERK1/2，ERK1/2 蛋白可以對 p90R6K 此基因產生影響，因此此一連串的反應也稱為級聯反 應，另一個磷酸化的例子是免疫細胞中的 STAT 複合體，免疫細胞接收到介 白素的訊號後，使兩個 STAT 單體以磷酸化方式結合，STAT 複合體匯進入 細胞核中調控有關免疫細胞的轉錄。磷酸化中提供磷酸根的是 ATP，當 ATP 水解後形成 ADP，磷酸根即接到蛋白上面，接下來介紹幾個蛋白質會接至磷 酸化側鏈的功能域，SH2 及 PHB 都是會接到磷酸化的酪氨酸上面，這樣的功 能與常出現在細胞表面的受體上，另外有些蛋白質磷酸化後會產生構型上的 改變增加它的化學活性。 3.硫基化與硫的氧化還原（Sulfuryl transfer） 硫基化與磷酸化是非常相像的，它們都會作用在酪氨酸上，硫基化的亞硫酸根源自於一種特殊的分子， 即 ADP-O-SO3-，通常要分泌到細胞外的蛋白質會在內質網進行硫基化，因此硫基化的蛋白質幾乎可以說 是細胞分泌至胞外的蛋白質。CCR5 是 HIV 的醣蛋白 gp120 與 T 輔助細胞受器 CD4 的輔受器，沒有這輔 受器，HIV 無法進入 T 細胞中，其中 CCR5 上面 7 處的酪氨酸被硫基化被認為能與 gp120 有更緊密的接 觸，科學家有些 CCR5 的犖諳酸的密碼子突變的人較不容易得到愛滋病。 20 中胺基酸中含有硫的胺基酸為甲硫胺酸及半胱氨酸，其中常參予硫的氧化還原的胺基酸為半胱氨酸， 在細胞中參予氧化還原的蛋白，是由麩胺酸，半胱氨酸及甘胺酸組成的三肽鏈，還原態稱為 GSH，而氧 化態稱為 GSSG，當兩個 GSH 被氧化時，它們半胱氨酸上面的兩個-SH，會形成 S-S（雙硫鍵），因此兩 個 GSH 會組成一個二聚體稱為 GSSG，GSH 及 GSSG 常見於細胞的氧化還原中，而它們常與 NADPH 產 生偶聯反應。 4.甲基化（Methylation） 甲基化最著名的就是 DNA 組蛋白的甲基化，DNA 組蛋白的甲基化使基因較不易被表現，在鹼基上的甲 基化也有此功能，甲基化主要發生在離胺酸上面，甲基化提供甲基的化學物質稱為 S-腺苷甲硫胺酸 （SAM），S-腺苷甲硫胺酸提供一個甲基之後會形成 S-腺苷同半胱氨酸（SAH）。 5.乙醯化（N-Acetylation） 乙醯化也是一個發生 DNA 組蛋白上面的轉譯後修飾，主要也是在離胺酸上面，組蛋白的乙醯化及去乙 醯化是由細胞中兩類的調控轉錄的蛋白所負責（HAT 與 HDAC），HAT 是組蛋白乙醯基轉移酶的簡稱， 它們負責將乙醯基轉移至組蛋白上，HDAC 則是組蛋白去乙醯化酶的簡稱，功能為移除組胺酸的乙醯化。 6.脂基化（Lipidation） 蛋白質的脂基化，是將 14-20 個碳鏈長的脂肪酸附 加到蛋白質上，有些也有結構上的用途，例如像有 些蛋白質棕櫚酸化後可幫助它們附著在細胞膜上， 例如像 G 蛋白相關受器（GPCR）就是在肽鍊上有 脂基化的現象，以也蛋白質的脂基化則伴隨著醣基 化，形成的是醣脂蛋白質，這種醣脂化的蛋白與醣 基化一樣，均是先在內質網中作初步修飾後，再送 進高基氏體作修剪。
7.蛋白質裂解（Proteolysis）蛋白質的裂解發生在許多酵素的活化，如上文所舉的胃蛋白酶的活化，由圖 則是胰凝乳酶的蛋白質裂解，它會經過兩次的裂解，第一次裂解是胰蛋白酶 從精胺酸與異白胺酸之間切開，第二次是胰凝乳酶進行的裂解，這樣的機制 可以調控一次酵素被活化的程度，越多的酵素被裂解成有活性的，就代表有 越多的原蛋白酶會被接著裂解。通常裂解會發生在特定的胺基酸上面，例如 像鹼性胺基酸之間的肽鍵（精胺酸與離胺酸之間），有些裂解會送到專門的 場所去裂解，如送到溶體或是蛋白酶體中去裂解，通常送至這些地方裂解就 代表著這些蛋白質大多已經不堪使用，將要被裂解後重新在利用。有些裂解 也會影響到訊息的傳遞，例如像細胞中有些蛋白質被裂解後其小片段會附到 DNA 上調控轉錄的效率，在細胞間的蛋白質要是被自我裂解後也有可能附著 到臨近的細胞上造成鄰近細胞的生理活動改變。細胞凋亡中的自劊蛋白酶體 及血液中的凝血因子等也會因為裂解的關係被活化。 8.醣基化（Glycosylation）醣基化也是一種十分常見的轉譯後修飾，主要發生在天門冬胺酸的 N link 醣基 化；及絲胺酸或是蘇胺酸上的 O link 醣基化，N-link 醣基化起始於 dolichol phosphate 這個起始物，它會先在內質網外面接醣類，等到基本型 2 個葡 萄糖醯胺及 5 個甘露醣都接好後，起始體會轉進內質網中進行接下來的 接醣步驟，最後形成 3 個葡萄糖 9 個甘露醣 2 個葡萄糖醯胺的結構，之 後此結構會進入高基氏體由醣苷鍵酶進行接下來的修剪（trim） ，此時醣 基化醣類會被轉接到天門冬胺酸上。醣基化廣泛發現於細胞外的基質 中，即許多與免疫有關的蛋白質，如選擇素（selectin）及凝集素等，許 多細胞及微生物的受器均是醣蛋白構成的，紅血球上的血型抗原也是由 岩藻醣及半乳糖構成的醣蛋白。 9.ADP-核醣基化（ADP-Ribosylation） ADP-核醣基主要發現在真核細胞中，ADP-核醣基化是由 NAD 當作醣基的提供者，許多的細菌的毒素也 許蛋白質的 ADP-核醣基化有關，如霍亂弧菌的毒素使 GTPase 的精胺酸 ADP-核醣基化。霍亂弧菌的毒素 是一種 AB5 形式的蛋白質，B 次單元會在細胞膜上開一個孔道讓 A 蛋白進入，A 蛋白會與 GTPase 的精胺 酸 ADP-核醣基化，這樣會導致 G 蛋白無法關閉，間接使得細胞類第二傳訊物質的濃度居高不下，這項 的現象使得細胞大量的將水送出細胞外，排到腸中，造成霍亂常見的症狀，即是水瀉。 10.氫氧根的修飾（Hydroxylation） 氫氧根的修飾發生在脯胺酸上，膠原蛋白是以 gly-X-Y 的結構重複排列，而 X 及 Y 通常為脯胺酸，脯胺 酸的氫氧基修飾會使得膠原蛋白連在一起，這是一種遺傳性的病理特徵，另外許多組織能感知氧氣的濃 度，HIF 是一種轉錄因子，會影響且血管上皮生成因子基因的轉錄，當 HIF 羫化酶，在有氧氣的情況下 就會把 HIF 羫基化，它就不會活化，若 HIF 未被羫基化，它就會活化血管上皮生成因子基因的轉錄，使 組織得到足夠的氧氣。 11.自身修飾（Automodification）RNA 的修飾（RNA-splicing）常見於真核基因中，其實蛋白質也會行剪接 作用，Intein 就好比是 intron 會被蛋白質自行切掉，而留下 extein 互相接 在一起，蛋白質也會形自身磷酸化反應，目的即增加級聯反應的速率， 在一些特殊的情況下，胺基酸也可以在不需核醣體的幫助下合成簡短的 片段。