manual laboratorio by yosibel mora

UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL SUR DEL LAGO “Jesús María Semprum” DIRECCIÓN DE DOCENCIA Y ASUNTOS ESTUDIANTILES PROGRAMA INGENIERÍA DE ALIMENTOS Santa Bárbara del Zulia, Abril 2012

MsC. Yani Aranguren Díaz MsC. Elwi Machado Sierra Lic. Yosibel Mora Mendez Dr. Fernando Isea Leon

MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA PARA INGENIERíA DE ALIMENTOS A

Autores

Yani C. Aranguren Díaz Licenciada en Biología de la Universidad de Los Andes (Mérida - Venezuela) con maestría en Biología Celular de la misma universidad, actualmente estudiante de doctorado de la Universidad Estadual Paulista (Jaboticabal - Brasil) y profesora de la cátedra de Microbiología General en la Universidad Experimental Sur del Lago

Elwi G. Machado Sierra Microbiólogo con énfasis en el sector industrial de la Universidad Libre de Colombia (Barranquilla - Colombia) con maestría en Biotecnología de Microorganismos en la Universidad de Los Andes (Mérida - Venezuela), actualmente estudiante de doctorado de la Universidad Estadual Paulista (Jaboticabal - Brasil) y profesor de la cátedra de Microbiología de Alimentos en la Universidad Experimental Sur del Lago

Yosibel C. Mora Mendez Licenciada en Ciencia y Cultura de la Alimentación de la Universidad Nacional Experimental del Yaracuy (San Felipe - Venezuela), Profesora de las cátedras de Microbiología General y Microbiología de Alimentos en la Universidad Experimental Sur del Lago

Fernando R. Isea Leon Ingeniero agrónomo de la Universidad del Zulia (Maracaibo - Venezuela), con una maestría en Ciencia y Tecnología de los Alimentos de la misma universidad y un doctorado en Ciencias Aplicadas de la Universidad de Los Andes (Mérida - Venezuela), actualmente coordinador de la Carrera de Ingeniería de Alimentos en la Universidad Experimental Sur del Lago.

Colaboradores Ing. Claudia Y. Paredes Niño Br. Yanneth Benavides

Figuras e Imágenes Elwi G. Machado Sierra

Agradecimientos A la ilustre Universidad Experimental Sur del Lago A la Dirección de Investigación y Postgrado. A la Coordinación de Ingeniería de Alimentos A los Laboratorios de Química, Biotecnología y Fitopatología y a todo el personal que labora en él. A todos los estudiantes de Microbiología General y Microbiología de Alimentos de la carrera de Ingeniería de Alimentos.

篓S贸lo hay un bien: el conocimiento. S贸lo hay un mal: la ignorancia篓 Socrates.

Introducción La microbiología es una rama muy extensa que tiene como finalidad el estudio de los microorganismos, la diversidad, evolución, interacción con el medio ambiente y la sociedad humana. Posee un amplio campo de estudio y es especialmente importante sus aplicaciones en la tecnología de alimentos, ya que gracias a los conocimiento aportados por dicha ciencia nos ha permitido hacer más eficientes procesos como las fermentaciones, los cuales son llevados a cabo por microorganismos; así como la utilización de los microorganismos para obtener otros tipos de productos alimenticios. Por otra parte, la microbiología tiene gran importancia por su impacto en la salud humana ya que una gran cantidad de enfermedades tienen su origen en infecciones microbianas y su entendimiento ha permitido curarlas, prevenirlas y en algunos casos, erradicarlas. Finalmente, algunos microorganismos como hongos y bacterias han sido utilizados como modelos en biología molecular, gracias a lo cual se han obtenido importantes avances en esta área y otras afines.

Uso correcto del microscopio

Microscopio compuesto Sistema óptico a. Oculares: Lentes situados cerca del ojo del observador. Aumenta la imagen y la proyecta sobre la retina del observador (Monoculares, Binoculares, Trinoculares). b. Objetivos: Lentes situadas cerca de la preparación. Aumenta el tamaño de la muestra y proyectan la imagen al ocular. Se encuentran montadas en el revólver.

Sistema lumínico a. Condensador: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación. b. Diafragma: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. 2

c. Foco o fuente de luz: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.

Sistema mecánico a. Soporte: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: a) El pie o base (Pieza rígida encargada de otorgar estabilidad a todo el conjunto) y b) el brazo (Pieza que une al sistema óptico con la base). b. Platina o carro: Lugar donde se deposita la preparación. Plataforma horizontal con un agujero central que permite el paso de la luz. Los portaobjetos con las preparaciones se colocan sobre ella y se fijan con un par de pinzas. Un sistema de tornillos permite desplazar la platina y la muestra hacia adelante, atrás, izquierda y derecha. c. Cabezal: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular o triocular. d. Revólver: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite al girar, cambiar los objetivos. e. Tornillos de enfoque: entre ellos se encuentran el tornillo macrométrico y tornillo micrométricos (enfoque fino). Estos tornillos que permiten enfocar la muestra, desplazando la platina hacia arriba o abajo f. Tubo: Cámara ocular unida al brazo. g. Distancia focal: Permite abrir y cerrar los oculares dependiendo de la distancia entre los ojos del observador. El aumento total resultante es el producto del aumento del objetivo por el aumento del ocular (Objetivo x Ocular = Aumento). La resolución es la capacidad de distinguir entre dos puntos, el poder de resolución máximo obtenido en un microscopio es de hasta 0,2 micrómetros.

Oculares

Cabezal

Brazo Revolver Platina Objetivos

Tornillo para desplazamiento de la platina

Cierre del Diafragma Condensador

MicromĂŠtrico Iluminador o Fuente de Luz MacromĂŠtrico

Base Figura 1. Microscopio compuesto.

Figura 1. Microscopio Compuesto

Manejo y uso del microscopio compuesto 1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se guardó correctamente en la práctica anterior, ya debería estar en esas condiciones. 2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas. 3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias. 4. Para realizar el enfoque: 

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Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo Macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el Macrométrico y, cuando se observe algo nítida la muestra, girar el Micrométrico hasta obtener un enfoque fino.

5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión (El tornillo a usar obligatoriamente con estos dos objetivos (40x y 100x) es el micrométrico). 6. Empleo del objetivo de inmersión: 

 

Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que agregar el aceite. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de x40. Agregar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.

 

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Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x, por lo que el riesgo de accidente es muy grande. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio.

Mantenimiento del microscopio y precauciones 1. Al finalizar el trabajo hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda. 2. Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo. 3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica. 4. No dejar la lamina portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio. 5. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que

abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción. 6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina, revólver y condensador). 7. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo, ni hacerlo mientras se está observando a través del ocular. 8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido, secarla con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño humedecido en xilol. 9. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión práctica y, al acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión general de los mismos.

PRÁCTICA N° 1 CULTIVO Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Introducción Para aislar y mantener un microorganismo en un laboratorio es necesario cultivarlo. Al realizar un cultivo o siembra de microorganismos es necesario proporcionarles las condiciones físicas, químicas y nutritivas que le permitan obtener energía y elementos químicos para la síntesis de sus constituyentes celulares, y así poder multiplicarse de forma controlada. Como se mencionó anteriormente, los medios de cultivo, son sustratos o soluciones que aportan todos los nutrientes y algunas condiciones físicoquímicas necesarias para el desarrollo y crecimiento del microorganismo. Los medios de cultivo se pueden clasificar según su aspecto físico, su composición y según su función. Con respecto al aspecto físico, pueden ser: líquidos (caldos), semisólidos sólidos, y esta condición depende de la adición de algún agente gelificante que no sea consumible por los microorganismos (normalmente agar). Según su composición química pueden ser: definidos, cuando se conoce la química de su constitución, y complejos, cuando están compuestos por mezclas de extractos de materiales complejos (extracto de levadura, extracto de carne, extracto de papa, etc.). Según la función o los microorganismos que pueden crecer en ellos, los medios pueden ser: selectivos cuando favorecen el crecimiento de ciertos microorganismos mientras suprimen el de otros; diferenciales cuando alguno de sus componentes permite identificar las colonias de un tipo de microorganismos; selectivo-diferenciales cuando combinan las dos características anteriores; medios de enriquecimiento que permiten aislar un tipo determinado de microorganismo a partir de una mezcla una población mixta de gran tamaño; de transporte que se usan para llevar la muestra desde un lugar a otro; y de conservación que son utilizados para conservar por períodos largos de tiempo algunas cepas de interés, como las de una colección. El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales, se realiza en la mayoría de los casos, mediante el procesamiento de la muestra (que depende de su naturaleza) y su cultivo en placas de Petri con medios sólidos para la producción de colonias aisladas. Estas colonias aisladas son células individuales que las dispersarse durante el procesamiento y siembra, se dividen o multiplican sucesivamente, tras un periodo de incubación en condiciones adecuadas, produciéndose una colonia observable a simple vista y formada por individuos idénticos genéticamente (clon bacteriano). Es 8

importante mencionar, que a partir de una sola muestra, se pueden tener colonias aisladas de diferentes cepas o especies. Usualmente después de obtener colonias aisladas, se hacen repiques que consisten en tomar una sola colonia y sembrarla en una nueva caja de Petri. A partir de las colonias aisladas y repicadas se obtienen cultivos axénicos o cultivos puros en los que todos los individuos tienen la misma constitución genética. La obtención de cultivos axénicos es fundamental para poder estudiar las características del microorganismo, identificarlo y conservarlo. Sin embargo, no todos los microorganismos presentes en una muestra son cultivables, debido a dificultades intrínsecas del aislamiento, al desconocimiento de los requerimientos específicos, y a la existencia de grupos de microorganismos que deben mantenerse en equilibrio para poder sobrevivir. Por lo tanto, al momento de aislar microorganismos de una muestra ambiental o de alimentos, hay que buscar el medio de cultivo más adecuado. Es decir, que tenga características y disponibilidad de nutrientes similares al medio natural, o que tenga las exigencias metabólicas del tipo microorganismos que se quieran aislar. Existen distintos métodos de cultivo. Si se realiza en medio contenido en tubos para conservación, transporte o crecimiento, la siembra puede ser por dilución (cuando es en medio líquido); por punción (en tacos); y por punción y estría (en cuñas). Para inoculación primaria, aislamiento y obtención de cultivos puros, la siembra se hace en placas, y las técnicas más usadas son: Siembra por estriado simple, estriado en superficie (por agotamiento), que se realiza con asa en medio sólido, tomando el inóculo (una porción de una muestra o de una población de microorganismos) y rayando en forma de estrías, o rayando en forma de estrías y rotando la placa para conseguir 4 o 5 patrones, respectivamente. Siembra por extensión de superficie, colocando una gota de la muestra, no mayor de 0,1 ml, en el centro de la placa y luego se extiende por toda la superficie, empleando un rastrillo de vidrio. Siembra a profundidad, en la cual se agrega 1 ml en el fondo de la caja de Petri estéril y vacía, luego de le agrega entre 10 y 15 ml de medio de cultivo sólido fundido y a una temperatura a la cual no mate las bacterias; y una vez solidificado el medio se deja incubar. Siembra por dilución, en este caso se siembran por extensión de superficie o a profundidad, pero en diluciones seriadas. Este último, que se usa para hacer recuento de colonias o unidades formadoras de colonias (UFC, número de bacterias vivas a partir de las cuales se formarán colonias) y calcular el título bacteriano (número de bacterias por unidad de volumen).

Objetivos 9

    

Tomar y procesar muestras microbiológicas a partir de distintos materiales. Cultivar y aislar microorganismos empleando diversas técnicas. Caracterizar las colonias aisladas. Aprender las técnicas de cultivo (aislamiento) y manipulación de hongos. Obtener cultivos puros de hongos y/o levaduras.

Materiales y Equipos -

Cultivos bacterianos Muestras problema Placas de Petri con PDA y AM Placas de Petri con AA y AN Tacos y cuñas Asa de platino Aguja de disección Bisturí Tubos con agua peptonada Hipoclorito de sodio 10 Agua destilada estéril

Muestras de alimentos Hojas de planta enferma Algodón Alcohol Pinzas Rastrillo de vidrio Pipetas de vidrio de 0,1; 5 y 10 ml Marcador indeleble Mechero Cajas de petri Papel absorbente estéril

Diluciones seriadas Una dilución seriada es simplemente una serie de pasos secuenciales simples que amplifican el factor de dilución rápidamente en base 10 (1 volumen de muestra en 9 volúmenes de solución diluyente), comenzando con una pequeña cantidad de muestra y una alta concentración de microorganismos (cultivo de bacterianos). La fuente del material para diluir en cada paso viene del material diluido en el tubo anterior. En una dilución seriada el factor de dilución total en cualquier punto es el producto del factor de dilución individual en cada uno de los tubos. Ejemplo: En el laboratorio de microbiología usted realizará una dilución seriada 1:10 de un cultivo de bacterias en tres pasos. El paso inicial combina 10 unidad de volumen del cultivo con 90 unidades de volumen de agua peptonada dando lugar a una dilución de 1:10. En el siguiente paso usted combina 1 unidad de volumen del cultivo diluido 1:10 con 9 unidades de volumen de agua peptonada, usted ahora tiene una dilución 1:100 o 10-2 (1:10 x 10 = 1:100). En el tercer paso usted combina 1 unidad de volumen del cultivo diluido 1:100 con 99 unidades de volumen de agua peptonada obteniéndose una

dilución 1:1.000 o 10-3 (1:100 x 10 = 1:1.000). La concentración del cultivo es ahora una milésima parte menos que la muestra original.

Figura 2. Diluciones seriadas.

Aislamiento bacteriano Siembra por estriado simple Rotular la caja de Petri en la base, con un marcador indeleble. El rotulo debe contener la siguiente información: fecha, medio de cultivo, especie, cepa y/o muestra original, sección, grupo y turno. 1. Tomar una muestra con el asa previamente flameada y fría, inocular la muestra haciendo estrías continuas juntas de lado a lado, pero que no se solapen, en un solo plano sobre la superficie de toda la caja. 2. Flamear el asa de inoculación. 3. Sellar la caja como parafilm. Incubar durante 24-48 hrs a 30 o 37 °C.

a) Siembra por agotamiento o estría en superficie 1. Rotular la caja de Petri en la base, con un marcador indeleble. El rotulo debe contener la siguiente información: fecha, medio de cultivo, especie, cepa y/o muestra original, sección, grupo y turno.

2. Dividir en 4 cuadrantes la parte posterior y exterior de la caja. Tomar una muestra con el asa previamente flameada y fría, inocular la muestra haciendo 4-5 estrías simples muy juntas de lado a lado sobre el primer cuadrante. 3. Flamear el asa de inoculación y hacer girar la caja Petri un cuarto de vuelta. Abrir nuevamente la caja y enfriar el asa de siembra tocando la superficie del medio, lejos de la zona de estrías recién hechas. 4. Rozar con el asa una vez, la superficie del conjunto original de estrías y hacer un segundo grupo de estrías en el segundo cuadrante, esta vez más separadas, sin solaparlas y en una sola dirección. 5. Repetir el paso 2 y 3 para el tercer cuadrante (enfriar en el mismo lugar que el anterior) y para el cuarto cuadrante no se flameará el asa, las estrías serán más separadas o abiertas. 6. Sellar la caja como parafilm. Incubar durante 24-48 hrs a 30 o 37 °C.

Figura 3. Siembra por agotamiento o aislamiento

a) Siembra por extensión de superficie 1. Rotular la caja de Petri en la base, con un marcador indeleble. El rotulo debe contener la siguiente información: fecha, medio de cultivo, especie, cepa y/o muestra original, sección, grupo y turno. 2. Tomar 0,1 ml de la muestra líquida o cultivo bacteriano líquido y colocarlo en el centro del medio sólido en la caja de petri.

3. Empleando un rastrillo de vidrio, construido doblando por calor una varilla de vidrio, expandir la gota depositada previamente, por toda la superficie del medio. Hacer este procedimiento cerca del mechero. 4. Dejar reposar 10 minutos antes de invertir las cajas. 5. Sellar la caja como parafilm. Incubar durante 24-48 hrs a 30 o 37 °C.

Figura 4. Siembra por estriado simple o siembra masiva

d) Siembra a profundidad 1. Rotular la caja de Petri en la base, con un marcador indeleble. El rotulo debe contener la siguiente información: fecha, medio de cultivo, especie, cepa y/o muestra original, sección, grupo y turno. 2. Fundir en un Baño de María el medio de cultivo y mantener a una temperatura entre 40 y 50 °C. 3. Tomar 1 ml de la muestra líquida o cultivo bacteriano líquido y colocarlo en el centro de una caja de Petri estéril y sin medio de cultivo. 4. Agregar entre 10 y 15 ml del medio de cultivo fundido, asegurarse de que esté aproximadamente a 45 °C para no matar las bacterias. Hacer esto abriendo y cerrando rápidamente las cajas frente al mechero. 5. Dejar reposar entre 15 y 20 minutos hasta solidificar, antes de invertir las cajas. 6. Sellar la caja como parafilm. Incubar durante 24-48 hrs a 30 o 37 °C.

Figura 5. Siembra por extensión en superficie y en profundidad.

b) Siembra por dilución 1. 2. 3. 4.

Realizar diluciones seriadas por el método estándar.(Figura 2) Sembrar en profundidad (1ml) o superficie (0,1ml), según se le indique (Figura 5) Incubar las cajas a 35 °C durante 24-48 horas. Hacer la cuenta de colonias de las placas. Contar preferiblemente las placas o diluciones en donde haya entre 3 y 300 colonias. 5. A partir de los triplicados, calcular el número promedio de colonias contadas en cada dilución, y este número se multiplicará por el inverso de la dilución (por ajuste de volumen inoculado) para obtener el título bacteriano o número total de unidades formadoras de colonia (UFC)/ml en la muestra original. Calcular el número total de bacterias, multiplicando el titulo bacteriano por el volumen total del cultivo o muestra original.

f) Siembra en tubos

1. Sembrar en los tubos de agar nutritivo (cuñas), con el asa previamente esterilizada y con el inoculo, realizando una punción seguida de una pequeña estría desde abajo hasta la boca del tubo. En los tubos en taco solo hacer una punción con el asa y el inoculo en el medio. En los tubos con medio líquido, disolver inoculo contenido en el asa. 2. Incubar 3. Los tubos con caldo nutritivo se dejaran en agitación

Figura 6. Siembra en tubos.

g) Obtención del cultivo bacteriano puro 1. Con la ayuda de un asa transfiera una porción de una colonia desarrolladas a tubos de ensayo con medio o cajas con medio, por estriado simple. 2. Incube los tubos a temperatura ambiente por un periodo de 48 horas. 3. Realice las observaciones macroscópicas.

Aislamiento de hongos Aislamiento de hongos presentes en medios de cultivo o creciendo sobre alimentos (ejemplo: pan). 1. De las muestras suministradas por el profesor (en frascos, placas de Petri o alimentos) con la ayuda de una aguja de disección y bisturí se procederá a tomar 15

hifas o micelio del microorganismo que se observe aislado o en colonias separadas. 2. Luego se colocara el tejido seleccionado en el centro de las placas de Petri con PDA o AM y AA, siempre cerca del mechero para evitar contaminación. 3. Colocar las placas en papel o en bolsas plásticas en forma invertida dentro de una incubadora a 28-30 °C o en su defecto en un estante a temperatura ambiente por 5 a 7 días.

Figura 7. Esquema de aislamiento de hongos a partir de alimentos

1. Aislamiento de hongos presentes en tejidos vegetales 1. Desinfección del tejido a) Corte con ayuda del bisturí pequeños fragmentos del tejido (frutos, hoja, raíces) a estudiar (1cm), en el borde más avanzado de la lesión. b) Coloque las porciones del tejido en una capsula de Petri contentiva de una solución de hipoclorito de sodio al 1% por un periodo de 2 minutos, para luego ser transferida a una nueva capsula con agua destilada estéril por 3 minutos, de manera de eliminar todo el exceso de desinfectante. c) Deje secar en un papel absorbente estéril. 2. Siembra del tejido a) Abra la placa de Petri frente al mechero y coloque aproximadamente 4 segmentos desinfectados en placas de Petri contentivas del medio PDA o AM y AA. Los medios PDA y AM deben estar previamente acidificados

b) c)

(añadir 5 gotas de ácido láctico). Las placas se identifican con marcadores indelebles. Incube las placas de Petri a temperatura ambiente por un periodo de tiempo de 48-72 horas. Observe las colonias fúngicas desarrolladas.

2. Obtención del cultivo puro 1. Con la ayuda de un bisturí y aguja transfiera fragmentos de las colonias desarrolladas a tubos de ensayo con medio PDA o AM solidificado en forma de bisel. 2. Incube los tubos a temperatura ambiente por un periodo de 48 horas. 3. Realice las observaciones macroscópicas de los hongos aislados.

Resultados 1. Observar los cultivos cada 24 horas. Tomar las observaciones y compararlas. 2. Hacer la descripción morfológica de los microorganismos y/o colonias observadas en los diferentes medios de cultivo, y los distintos tratamientos con relación a la condición de control. 3. Haga un cuadro comparativo y reportar con las formas y características de crecimiento. 4. Precise las fallas realizadas en el procedimiento, analice las consecuencias, determine y proponga las recomendaciones a seguir, para el buen desarrollo de las técnicas.

Guía de estudio   

¿Cuáles son las ventajas y desventajas de las distintas técnicas de cultivo? ¿Cuál es la utilidad de cada una de las técnicas? ¿Por qué se deben hacer las diluciones de cultivos bacterianos, muestras ambientales o de alimentos, en agua peptonada o solución salina?

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