Умо 2 2015 web

Т О М 2

1

•

2 0 1 5

ISSN 2313-805X

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ КАНЦЕРОГЕНЕЗА ФГБНУ «РОНЦ ИМ. Н.Н. БЛОХИНА»

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ Н А У Ч Н О - П РА К Т И Ч Е С К И Й Е Ж Е К В А Р ТА Л Ь Н Ы Й РЕЦЕНЗИРУЕМЫЙ ЖУРНАЛ

Протеомика в открытии маркеров рака предстательной железы Белки CRABP - родственники или однофамильцы Трабактерии-лиганд узкой бороздки ДНК Межклеточные взаимодействия и развитие резистентности клеток рака молочной железы

У С П Е Х И

М О Л Е К У Л Я Р Н О Й

О Н К О Л О Г И И

Молекулярно-генетические маркеры гастроинтестинальных стромальных опухолей

ТОМ2 № 2 2015

GE Healthcare Life Sciences

Издательский дом «АБВ-пресс» специализируется на выпуске периодической научной медицинской литературы, книгопечатной продукции, создании и поддержке сайтов медицинского направления

Amersham™ WB

НАШИ ЖУРНАЛЫ и ГАЗЕТЫ

Автоматизированный SDS-форез и Вестерн-блоттинг Электрофорез & Сканирование

Вестерн-блоттинг

ഩˁ̛̭̯̖̥̌ Amersham WB – ̨̨̪̣̦̭̯̽̀ ̨̛̛̦̯̖̬̬̦̐̏̌​̦̌́ ̛̭̭̯̖̥̌ ̣̔́ SDS-̴̨̬̖̌̚ ̛ ̖̭̯̖̬̦̏ ̨̣̯̍​̛̯̦̐̌, ̨̨̭̦̦̏̌​̦̌́ ̦̌ ̴̶̨̨̣̱̬̖̭̖̦̯̦̜ ̶̡̛̖̯̖̔​̛ ISSN 1111-2222

ഩʿ̨̬̬̥̐̌​̨̥̦̖ ̸̨̛̖̭̪̖̖̦̖̍ Amersham WB ̸̨̛̖̭̪̖̖̯̍̏̌ ̡̨̨̦̯̬̣̽ ̌̚ ̡̙̼̥̌̔ ̨̯̪̥̾̌ ̶̨̪̬̖̭​̭̌, ̨̨̛̛̯̥̯̬̦̌̏̌̏̌̚​̦̼̜ ̸̡̨̛̣̖̭̯̖̦̏​̦̼̜ ̛̦̣̌̌̚ ̦̔̌​̵̦̼

The Russian oncologist

Рецензируемый научно-практический журнал The Peer-Reviewed Journal for Russian Practicing Oncologists & Researchers

В номере:

Мониторинг каждого этапа

• История, современность, перспективы развития онкологии Московского региона

• Первичная множественность опухолей (синдром Мюир-Торре) в онкологической практике

Новый хирургический корпус Московского областного онкологического диспансера (срок сдачи в эксплуатацию – декабрь 2015)

НАШИ КНИГИ

Книги и наши издания можно заказать и приобрести в редакции по адресу: г. Москва, Каширское ш., 24, стр. 15

ഩʿ̨̖̬̖̦̭: 10-100 ʦ (̡̥̭̌. 400 ̥ʤ, 40 ʦ̯)

Оценка результатов

Amersham WB labeling buffer Amersham WB molecular weight markers Amersham WB loading buffer Amersham WB Cy5 labeling dye

и по телефону:

ഩʧ̶̛̛̛̛̬̍̔̌́̚: ̨̻̖̥̍ ̬-̬̌ ̛̦̯̯̖̣̌ 5-12 ̥̣

+7 (499) 929-96-19.

ഩʦ̛̛̼̭̱̹̦̖̏̌: 10 ̛̥̦, ̡̥̭̌. 45°C

Адрес электронной почты:

ഩʻ̨̬̌̍ ̵̨̨̯̼̐̏ ̨̬̖̖̦̯̌̐̏ ̛ ̵̵̨̬̭̦̼̌̔ ̨̛̥̯̖̬̣̌̌̏ ̣̔́ ̶̛̛̭̯̦̬̯̌̔̌̌̚​̛ ̨̨̡̨̪̬̯̣̌: Amersham WB Cy5 labeling kit, ̸̨̛̯̬̦̼̖̏ ̛̦̯̯̖̣̌̌, ̖̣̐̽- ̛ PVDF-̡̬̯̼̌

abv@abvpress.ru

НАШИ САЙТЫ НАШИ САЙТЫ

ഩʧ̖̣̽-̡̬̯̌̌: ʿʤʤʧ 13.5% ̛ 8–18%; ̡̬̱̌̐̌̚̚ – 14 ̶̨̨̬̍̌̏̚ ̨̨̻̖̥̥̍ 15-30 ̡̥̣ ഩPVDF-̡̬̯̌̌: ̥̖̥̬̦̍̌̌ PVDF ̣̔́ ̨̣̯̍​̛̯̦̐̌ ഩʺ̡̬̖̬̼̌ Amersham WB: 9 ̡̨̖̣̍̏ (10-225 ̡ʪ̌), ̸̥̖̖̦​̵̦̼ Cy3 ̛ Cy5

ООО «ДжиИ Хэлскеа» ʿ̡̬̖̭̦̖̦̭̌́ ̦̌̍, 10 ˁ, ̯̙̾̌ 12 ʺ̨̡̭̏̌, 123317, ˀ̨̭​̛̭́ ˃̖̣. +7 (495) 739-69-31 ˇ̡̭̌ +7 (495) 739-69-32 LSRus@ge.com

www.abvpress.ru

www.oncoproct.ru

www.roou.ru

www.hnonco.ru

www.urotoday.ru

www.neuromuscular.ru

www.breastcancersociety.ru

Москва, 2015

Постановка эксперимента

2015

• Селективная внутриартериальная химиотерапия при метастатическом колоректальном раке

ഩˁ̡̨̛̛̦̬̦̖̌̏̌: ʸ̖̬̦̼̜̌̚ ̨̛̔̔ 635 ̦̥ (Cy5), 10 ̥ʦ ʸ̖̬̦̼̜̌̚ ̨̛̔̔ 532 ̦̥ (Cy3), 10 ̥ʦ ʪ̸̡̛̛̛̦̥̖̭̜̌ ̨̛̪̦̔̌̌̚ – 4,6 ̨̡̨̪̬́̔̏ 65 536 ̨̱̬̦̖̜̏, 16 ̛̯̍ (tif) ʤ̸̨̡̛̯̥̯̖̭̏̌̌́ ̶̡̨̛̛̭̪̾́̚

PVDF-карта

1

oncologist@inbox.ru

К 70 летию онкологической службы России

ഩˑ̴̡̨̨̣̖̯̬̬̖̚: 250-600 ʦ, 20-50 ̥ʤ (̡̥̭̌. 20 ʦ̯ ̦̌ ̖̣̐̽-̡̬̯̱̌)

Гель-карта

РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГ

www.netoncology.ru

С 2014 г. журнал «Успехи молекулярной онкологии» включен в Научную электронную библиотеку и Российский индекс научного цитирования (РИНЦ), имеет импакт-фактор НАУЧНО-ИСС ЛЕДОВАТЕ ЛЬСКИЙ ИНС ТИТ У Т КАНЦЕРОГЕНЕЗА ФГБНУ «РОНЦ ИМ. Н.Н. БЛОХИНА»

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина»

ОНКОЛОГИИ

Oнлайн-версия журнала доступна по адресу: www.ronc.ru

ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР Красильников Михаил Александрович, д.б.н., профессор, заместитель директора по научной работе ФГБНУ «Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина», директор Научно-исследовательского института канцерогенеза, заведующий лабораторией молекулярной эндокринологии (Москва, Россия)

ЗАМЕСТИТЕЛИ ГЛАВНОГО РЕДАКТОРА Зборовская Ирина Борисовна, к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ канцерогенеза ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» (Москва, Россия) Якубовская Марианна Геннадиевна, д.м.н., заведующая отделом химического канцерогенеза НИИ канцерогенеза ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» (Москва, Россия)

ОТВЕТСТВЕННЫЙ СЕКРЕТАРЬ Гудкова Маргарита Владимировна, к.б.н., ученый секретарь НИИ канцерогенеза ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» (Москва, Россия)

РЕДАКЦИОННАЯ КОЛЛЕГИЯ Белицкий Геннадий Альтерович, д.м.н., профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории методов скрининга канцерогенов НИИ канцерогенеза ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» (Москва, Россия) Берштейн Лев Михайлович, д.м.н., профессор, руководитель лаборатории онкоэндокринологии ФГБУ «НИИ онкологии им. Н. Н. Петрова» Минздрава России (Санкт-Петербург, Россия) Боженко Владимир Константинович, д.м.н., профессор, руководитель лаборатории биохимии отдела патоморфологии и лабораторной диагностики ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии Минздрава России», заслуженный врач РФ (Москва, Россия) Глушанкова Наталия Александровна, д.б.н., заведующая лабораторией механизмов канцерогенеза НИИ канцерогенеза ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» (Москва, Россия) Гурцевич Владимир Эдуардович, д.м.н., профессор, заведующий лабораторией вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина», заслуженный деятель науки РФ (Москва, Россия) Имянитов Евгений Наумович, д.м.н., профессор, руководитель отдела опухолевого роста ФГБУ «НИИ онкологии им. Н. Н. Петрова» (Санкт-Петербург, Россия)

2’15 ТОМ 2

Статьи направлять по адресу: Учредители: ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина», e-mail: adv.mol.onc@ronc.ru ООО «ИД «АБВ-пресс»

Адрес редакции: Москва, Каширское шоссе, д. 24, стр. 15, НИИ канцерогенеза, 3-й этаж. Тел./факс: +7 (499) 929-96-19 www.abvpress.ru e-mail: abv@abvpress.ru

Редактор Н.В. Жукова Корректор В.Е. Ефремова Дизайн Е.В. Степанова Верстка Е.А. Прокофьева Служба подписки и распространения И.В. Шургаева, +7 (499) 929-96-19, base@abvpress.ru Служба рекламы С.Р. Аракелян +7 (499) 929-96-19, dir@abvpress.ru

Журнал зарегистрирован в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор) ПИ № ФС 77-57560 от 08.04.2014 г.

При полной или частичной перепечатке материалов ссылка на журнал «Успехи молекулярной онкологии» обязательна. Редакция не несет ответственности за содержание публикуемых рекламных материалов.

В статьях представлена точка зрения авторов, которая может не совпадать с мнением редакции. Успехи молекулярной онкологии. 2015. № 2. 1—68 © ООО «ИД «АБВ-пресс», 2015 Подписной индекс в каталоге «Пресса России» – 93562 Отпечатано в типографии ООО «Тверская фабрика печати» Тираж 1000 экз.

Редакционная коллегия

Казанский Дмитрий Борисович, д.б.н., профессор, заведующий лабораторией механизмов регуляции иммунитета НИИ канцерогенеза ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» (Москва, Россия) Карпухин Александр Васильевич, д.б.н., профессор, руководитель лаборатории молекулярной генетики сложно наследуемых заболеваний ФГБНУ «Медико-генетический научный центр» (Москва, Россия) Киселев Федор Львович, д.б.н., профессор, член-корреспондент РАН, заведующий лабораторией молекулярной биологии вирусов НИИ канцерогенеза ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» (Москва, Россия) Кубасова Ирина Юрьевна, к.м.н., ученый секретарь РОНЦ, заведующая отделением научного планирования и подготовки кадров ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» (Москва, Россия) Кушлинский Николай Евгеньевич, д.м.н., профессор, член-корреспондент РАН, заведующий лабораторией клинической биохимии НИИ клинической онкологии ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» (Москва, Россия) Лазаревич Наталия Леонидовна, д.б.н., профессор, заведующая лабораторией механизмов прогрессии эпителиальных опухолей НИИ канцерогенеза ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» (Москва, Россия) Лихтенштейн Анатолий Владимирович, д.б.н., заведующий лабораторией биохимии опухолей НИИ канцерогенеза ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» (Москва, Россия) Мазуренко Наталья Николаевна, д.б.н., профессор, заведующая лабораторией онкогеномики НИИ канцерогенеза ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» (Москва, Россия) Сергеева Наталья Сергеевна, д.б.н., профессор, руководитель отделения прогноза ФГБУ «Московский научно-исследовательский онкологический им. П. А. Герцена» Минздрава России, заслуженный деятель науки РФ (Москва, Россия) Степанова Евгения Владиславовна, д.м.н., заместитель начальника Управления по взаимодействию с РАН, ответственный секретарь Научнокоординационного совета Федерального агентства научных организаций России (Москва, Россия) Тюляндин Сергей Алексеевич, д.м.н., профессор, заведующий отделением клинической фармакологии и химиотерапии, заместитель директора по научной работе НИИ клинической онкологии ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» (Москва, Россия) Чевкина Елена Максимовна, д.б.н., руководитель лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ канцерогенеза ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» (Москва, Россия) Чердынцева Надежда Викторовна, д.б.н., профессор, заместитель директора по научной работе, заведующая лабораторией молекулярной онкологии и иммунологии ФГБНУ «Томский научно-исследовательский институт онкологии» Сибирского отделения РАН (Томск, Россия)

РЕДАКЦИОННЫЙ СОВЕТ Барышников Анатолий Юрьевич, д.м.н., профессор, заместитель директора по научной работе ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина», директор НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей, член президиума Российского научного общества иммунологов (Москва, Россия) Васильев Юрий Маркович, д.б.н., профессор, член-корреспондент РАН, главный научный сотрудник НИИ канцерогенеза ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина», вице-президент Общества клеточной биологии РАН (Москва, Россия) Гудков Андрей Владимирович, д.б.н., профессор, старший вице-президент по фундаментальной науке и заведующий отделом биологии клеточного стресса Института онкологии им. Розвелла Парка (Баффало, США) Давыдов Михаил Иванович, д.м.н., профессор, академик РАН, член президиума РАН, директор ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина, главный онколог Минздрава России, заслуженный деятель науки РФ (Москва, Россия) Заридзе Давид Георгиевич, д.м.н., профессор, член-корреспондент РАН, заведующий отделом эпидемиологии и профилактики опухолей ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина», заслуженный деятель науки РФ (Москва, Россия) Копнин Борис Павлович, д.б.н., профессор, главный научный сотрудник НИИ канцерогенеза ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» (Москва, Россия)

EDITOR-IN-CHIEF Krasil’nikov Mikhail A., PhD, DSc, Professor, Deputy Director for Research Work of the N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Director of the Research Institute of Carcinogenesis, Head of the Laboratory of Molecular Endocrinology (Moscow, Russia)

DEPUTY EDITOR-IN-CHIEF Zborovskaya Irina B., PhD, Leading Researcher of the Laboratory of Regulation of Cell and Viral Oncogenes of the Research Institute of Carcinogenesis of the N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center (Moscow, Russia) Yakubovskaya Marianna G., PhD, DSc, Head of the Department of Chemical Carcinogenesis of the Research Institute of Carcinogenesis of the N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center (Moscow, Russia)

EDITORIAL BOARD CONTENTS EXECUTIVE EDITOR Gudkova Margarita V., PhD, Scientific Secretary of the Research Institute of Carcinogenesis of the N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center (Moscow, Russia)

EDITORIAL BOARD Belitsky Gennady A., PhD, DSc, Professor, Leading Researcher of the Laboratory of Chemical Carcinogenesis Mechanisms of the Research Institute of Carcinogenesis of the N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center (Moscow, Russia) Berstein Lev M., PhD, DSc, Professor, Head of the Laboratory of Oncoendocrinology of the N. N. Petrov Cancer Research Institute of the Ministry of Health of the Russian Federation (Saint Petersburg, Russia) Bozhenko Vladimir K., PhD, DSc, Professor, Head of the Laboratory of Biochemistry of the Department of Pathomorphology and the Laboratory Diagnostics of the Russian Radiology Research Center of the Ministry of Health of Russia, Honored Doctor of the Russian Federation (Moscow, Russia) Gloushankova Natalia A., PhD, DSc, Head of the Laboratory of Carcinogenesis Mechanisms of the Research Institute of Carcinogenesis of the N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center (Moscow, Russia) Gurtsevitch Vladimir E., PhD, DSc, Professor, Head of the Laboratory of Viral Carcinogenesis of the Research Institute of Carcinogenesis of the N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Honored Scientist of the Russian Federation (Moscow, Russia) Imyanitov Eugeny N., PhD, DSc, Professor, Head of the Department of Tumor Growth of the N. N. Petrov Cancer Research Institute, (Saint Petersburg, Russia) Kazansky Dmitry B., PhD, DSc, Professor, Head of the Laboratory of Immune Regulation Mechanisms of the Research Institute of Carcinogenesis of the N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center (Moscow, Russia) Karpukhin Aleksander V., PhD, DSc, Professor, Head of the Laboratory of Molecular Genetics of Complex Inherited Diseases of the Medical Genetic Research Center (Moscow, Russia) Kisseljov Fedor L., PhD, DSc, Associate Member of RAS, Professor, Head of the Laboratory of Molecular Biology of Viruses of the Research Institute of Carcinogenesis of the N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center (Moscow, Russia) Kubasova Irina Yu., PhD, Scientific Secretary of the N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center (Moscow, Russia), Head of the Department of Scientific Planning and Training of Personnel of the N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center (Moscow, Russia) Kushlinsky Nikolay E., PhD, DSc, Associate Member of RAS, Professor, Head of the Laboratory of Clinical Biochemistry of the Research Institute of Clinical Oncology of the N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, (Moscow, Russia) Lazarevich Natalia L., PhD, DSc, Professor, Head of the Laboratory of Epithelial Tumors Progress Mechanisms of the Research Institute of Carcinogenesis of the N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center (Moscow, Russia) Lichtenstein Anatoly V., PhD, DSc, Head of the Laboratory of Tumors Biochemistry of the Research Institute of Carcinogenesis of the N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center (Moscow, Russia) Mazurenko Natalia N., PhD, DSc, Professor, Head of the Laboratory of Oncogenomics of the Research Institute of Carcinogenesis of the N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center (Moscow, Russia) Sergeeva Natalia S., PhD, DSc, Professor, Head of the Prognostics Department of the P. A. Herzen Moscow Scientific and Research Cancer Institute of the Ministry of Health of Russia, Honored Scientist of the Russian Federation (Moscow, Russia) Stepanova Evgenia V., MD, DSc, Deputy Head of the Department for Interaction with the RAS, Secretary in Charge of the Scientific Coordination Council of the Federal Agency of Scientific Organizations of Russia, (Moscow, Russia) Tjulandin Sergey A., MD, PhD, DSc, Professor, Head of the Department of Clinical Pharmacology and Chemotherapy, Deputy Director for Research Work of the Clinical Oncology Research Institute of N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, (Moscow, Russia) Tchevkina Elena M., PhD, Leading Researcher of the Laboratory of the Regulation of Cell and Viral Oncogenes of the Research Institute of Carcinogenesis of the N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center (Moscow, Russia) Tcherdyntseva Nadezhda V., PhD, DSc, Professor, Deputy Director for Research Work, Head of the Laboratory of Molecular Oncology and Immunology of the Tomsk Cancer Research Institute of Siberian Branch of the RAS (Tomsk, Russia)

EDITORIAL COUNCIL Baryshnikov Anatoly Yu., PhD, DSc, Professor, Deputy Director for Research Work, Director of the Research Institute of Experimental Diagnostics and Tumor Therapy of the N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Member of the Presidium of the Russian Scientific Society of Immunologists (Moscow, Russia) Vasiliev Yury M., PhD, DSc, Professor, Associate Member of RAS, Chief Researcher of Research Institute of Carcinogenesis of N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Vice President of the Cell Biology Society of the RAS (Moscow, Russia) Gudkov Andrey V., PhD, DSc, Professor, Sr. Vice-President for Basic Science and Chair of the Department of Cell Stress Biology of the Roswell Park Cancer Institute (Buffalo, NY, U. S. A.) Davydov Mikhail I., MD, PhD, DSc, Professor, Academician of RAS, Member of the Presidium of the RAS, Director of the N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Chief Oncologist of the Ministry of Health of Russia, Honored Scientist of the Russian Federation (Moscow, Russia) Zaridze David G., PhD, DSc, Professor, Associate Member of RAS, Head of the Department of Epidemiology and Prevention of Tumors of the N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Honored Scientist of the Russian Federation (Moscow, Russia) Kopnin Boris P., MD, PhD, DSc, Professor, Chief Research Assistant of the Research Institute of Carcinogenesis of the N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center (Moscow, Russia)

СОДЕРЖАНИЕ

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ Е. М. Чевкина, И. А. Фаворская Белки CRABP – родственники или однофамильцы? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 В.Е. Шевченко, А.В. Оленич, Н.Е. Арноцкая Протеомика в открытии маркеров рака предстательной железы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 Н. Н. Мазуренко, И. В. Цыганова Молекулярно-генетические особенности и маркеры гастроинтестинальных стромальных опухолей . . . . . . . . . . . . . 29 Г. А. Белицкий, К. И. Кирсанов, Е. А. Лесовая, М. Г. Якубовская Трабектедин – лиганд узкой бороздки ДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ С. Е. Семина, Д. В. Багров, М. А. Красильников Межклеточные взаимодействия и развитие гормональной резистентности клеток рака молочной железы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 В. Э. Гурцевич, Н. Б. Сенюта, В. Н. Кондратова, Е. В. Гончарова, А. В. Игнатова, М. В. Ломая, М. А. Кропотов, А. М. Мудунов, А. В. Лихтенштейн Диагностическая значимость уровней ДНК и антител к капсидному антигену вируса Эпштейна–Барр в плазме крови больных раком носоглотки в неэндемическом регионе . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 А. А. Лушникова, А. В. Балбуцкий, Д. А. Понкратова, Т. П. Казубская Особенности экспрессии лептина и его рецептора при метастатической меланоме кожи. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ АВТОРОВ (ОБНОВЛЕННАЯ)

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

CONTENTS

REVIEWS E. M. Tchevkina, I. A. Favorskaya CRABP proteins – relatives or homonyms?. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 V.E. Shevchenko, A.V.Olenich, N.E. Arnotskaya The proteomics in prostate cancer biomarker discovery. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 N. N. Mazurenko, I. V. Tsyganova Molecular features and genetic markers of gastrointestinal stromal tumors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 G.A. Belitsky, K.I. Kirsanov, E.A. Lesovaya, M.G. Yakubovskaya Trabectedin – the DNA minor groove binder . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

EXPERIMENTAL REPORTS S. E. Semina, D, V. Bagrov, M. A. Krasil’nikov Intercellular interactions and progression of hormonal resistance of breast cancer cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 V. E. Gurtsevich, N. B. Senyuta, V. N. Kondratova, E. V. Goncharova, A. V. Ignatova, M. V. Lomaya, M. A. Kropotov, A. M. Mudunov, A. V. Lichtenstein Diagnostic significance of DNA and antibodies against capsid antigens of anti-Epstein–Barr virus antibodies levels in blood plasma of nasopharyngeal carcinoma patients from non-endemic region. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 A. A. Lushnikova, A. V. Balbutsky, D. A. Ponkratova, T. P. Kazubskaya The features of leptin and its receptor expression in metastatic cutaneous melanoma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

INFORMATION FOR AUTHORS (UPDATED) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

68

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

ТОМ 2

Белки CRABP – родственники или однофамильцы?

2,

2015

6

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

Е. М. Чевкина, И. А. Фаворская Научно-исследоательский институт канцерогенеза ФГБНУ «Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина»; Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24 Контакты: Елена Максимовна Чевкина tchevkina@mail.ru Ретиноевая кислота (РК) – наиболее активный метаболит витамина А (ретинола), регулирующий широкий спектр физиологических процессов в организме, в том числе эмбриональное развитие, формирование иммунного ответа, гемопоэз, метаболизм глюкозы и липидов и др. РК участвует в регуляции важнейших аспектов жизнедеятельности клеток, включая дифференцировку, пролиферацию и программируемую клеточную гибель. Обзор посвящен сравнению 2 высокогомологичных представителей семейства внутриклеточных липидсвязывающих белков CRABP1 и CRABP2, основная и единственно установленная на сегодняшний день функция которых – внутриклеточное связывание РК. Однако значение данного связывания, по-видимому, различно. Связывание СRABP2 с РК приводит к активации ядерных рецепторов (RAR/RXR), являющихся транскрипционными факторами, и последующей стимуляции экспрессии целого ряда ретиноид-респонсивных генов. Значение связывания CRABP1 с РК менее понятно. Есть свидетельства сходного действия белков CRABP1 и CRABP2 в отношении усиления эффекта РК, однако большая часть данных указывает на противоположную роль CRABP1 – снижение внутриклеточной концентрации и/или уменьшение биодоступности РК за счет усиления ее метаболизма или секвестрирования в цитоплазме. Результаты последних исследований указывают на то, что у белков СRABP могут быть функции, не связанные с проведением сигнала от РК. Также противоречивы данные о роли этих белков в канцерогенезе и опухолевой прогрессии. В обзоре рассматриваются функции РК и молекулярные механизмы, опосредующие ее активность, включая различные аспекты функционирования рецепторов РК, приводится сравнительный анализ структурно-функциональных характеристик белков CRABP и рассматриваются возможные механизмы их внутриклеточной активности, как связанные с РК, так и независимые от ретиноевого сигналинга. Особое внимание уделено анализу данных о связи белков CRABP с канцерогенезом и их участию в опухолевой прогрессии, в том числе указывающих как на опухоль-супрессорную функцию, так и на протуморогенную активность. Ключевые слова: ретиноевая кислота, рецепторы ретиноевой кислоты, ретиноид-респонсивные гены, белок CRABP1, белок CRABP2, опухолевая прогрессия

DOI: 10.17 650 / 2313-805X. 2015.2.2.6–16 CRABP proteins – relatives or homonyms?

E. M. Tchevkina, I. A. Favorskaya Research Institute of Carcinogenesis, N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center; 24 Kashirskoe Shosse, Moscow, 115478, Russia Retinoic acid being the most active metabolite of vitamin A (retinol) regulates the wide spectrum of physiological processes including embryonic development, development of immune response, hematopoiesis, glucose and lipids metabolism, etc. Retinoic acid participates in the regulation of such important aspects of life-sustaining activity as cell differentiation, proliferation and programmed cell death. This review is focused on comparison of two highly homological members of lipid-binding proteins family, CRABP1 and CRABP2. Although binding of retinoic acid is the only known function of these proteins the physiological meaning this interaction seems to be rather different. CRABBP2 binding of retinoic acid leads to the activation of RAR/RXR nuclear receptors, that act as transcription factors, and further stimulation of expression of numerous retinoic responsive genes. The meaning of CRABP1 binding of retinoic acid is less clear. Some data evidences for the similar action of CRABP1 and CRABP2 in regard to the potentiation of the retinoic acid effect, while the majority of data points on the opposite role of CRABP1, that is reduction of intracellular concentration of retinoic acid and/or decrease of retinoic acid bioavailability through the potentiation of its catabolism or sequestration in the cytosol. The most recent publications also suggest some additional functions of these proteins that could be independent of retinoic acid signalling. The data concerning the roles of these proteins in carcinogenesis and tumor progression are contradictive as well.

This review covers the functions of retinoic acid as well as the molecular mechanisms mediating its activity including the different aspects of retinoic acid receptors activity. The review also comprises the comparative structural-functional analysis of CRABP proteins and probable mechanisms of their intracellular activity including those associated with retinoic acid signalling and retinoic acid-independent. A special attention is drawn to the analysis of the data on the involvement of CRABP proteins in the carcinogenesis and tumor progression. The data pointing on either oncogenic or tumor-suppressive functions are given for each protein.

Key words: retinoic acid, retinoic acid receptors, retinoic-responsive genes, protein CRABP1, protein CRABP2, tumor progression

Введение Белки CRABP (cellular retinoic acid binding proteins) относятся к семейству iLBPs (intracellular lipid binding proteins), представленному небольшими белками,

обладающими очень сходной структурой, но селективно связывающими лиганды (различные липофильные молекулы) [1–3]. В частности, белки CRABP1 и CRABP2 связывают ретиноевую кислоту (РК),

Основные функции ретиноевой кислоты РК, будучи наиболее активным производным витамина А (ретинола), играет важную роль в самых различных биологических процессах. Прежде всего, она активно участвует в процессах эмбриогенеза, являясь первым обнаруженным морфогеном хордовых животных [4]. РК важна для развития органов и тканей позвоночных благодаря своей способности вызывать дифференцировку клеток и регулировать апоптоз [5]. Показано, что РК играет важную роль в развитии центральной нервной системы [6], легких [7], в формировании конечностей [8], а также в процессах гемопоэза [9]. РК, как и ретинол, участвует в формировании иммунного ответа и способна модулировать широкий спектр иммунных реакций организма. В частности, РК стимулирует дифференцировку B-клеток в плазмоциты, тем самым повышая титр антител [10]. Также известно, что РК усиливает тканеспецифичный хоуминг B- и T-лимфоцитов [11]. Функциональная активность РК в клетке реализуется посредством специфичных ядерных рецепторов, являющихся транскрипционными факторами. С помощью этих белков РК может регулировать экспрессию более 500 генов-мишеней. Среди последних можно выделить гены, участвующие в метаболизме и транспорте самой РК, такие как CRBP1/2, CRABP1/2, CYP26A1, белки RAR; ряд генов семейства HOX, определяющих формирование переднезадней оси в период эмбрионального развития; ген 17β-гидроксистероиддегидрогеназы EDH17B2, задействованной в синтезе стероидов; гены, кодирующие ряд белков внеклеточ-

2015

ного матрикса, например, β3-интегрин и ламинин B1. К генам-мишеням также относят ряд сигнальных молекул и гормонов, мембранных рецепторов, в частности эритропоэтин, гормон роста, тканевой активатор плазминогена, рецептор интерлейкина-2α и др. [12, 13]. Таким образом, РК регулирует экспрессию целого спектра различных генов, что отражает ее вовлеченность во многие биологические процессы. Важно отметить, что существуют различные виды рецепторов, с которыми РК специфически взаимодействует в различных клетках (см. ниже). С учетом продифференцировочной активности РК считают, что в аспекте канцерогенеза она выполняет опухоль-супрессорную функцию. Действительно, многочисленные исследования подтверждают способность РК стимулировать дифференцировку опухолевых клеток [5, 14, 15], а также подавлять клеточную пролиферацию [16, 17]. Так, РК стимулирует остановку клеточного цикла и миелоидную дифференцировку клеток HL-60 (промиелоцитарный лейкоз) [15, 18], дифференцировку клеток B-16 (меланома) [14] и F9 (эмбриональная тератокарцинома) [19], апоптоз зрелых клеток острого промиелоцитарного лейкоза NB4 [20]. Для ряда клеток карциномы молочной железы показано ростингибирующее действие РК посредством остановки клеточного цикла и / или апоптоза [21–23]. Исследования доказывают способность РК подавлять пролиферацию опухолевых клеток [16, 17, 24], а также ингибировать ангиогенез [25, 26]. Способность стимулировать апоптоз также продемонстрирована на целом ряде опухолевых клеток различного происхождения [27–29]. Показано, что РК активирует экспрессию некоторых проапоптотических генов, в частности каспаз-7 и -9 [30], однако механизм РК-зависимой активации программированной клеточной гибели до конца не ясен. На сегодняшний день известно, что РК способна воздействовать на различные стадии апоптоза. Так, РК и ее производные вызывают повышение активации стрессорных MAPK-киназ (в основном JNK), что стимулирует апоптоз в различных клеточных культурах [27]. В клеточных культурах гастроинтестинальных опухолей РК вызывает повышение экспрессии проапоптотического белка Bax и снижает экспрессию известного ингибитора каспаз – белка BIRC5 (сурвивинна) [31]. Важно отметить, что в этом случае не наблюдается активации стрессорных MAPK-киназ. Наконец, РК вызывает повышение экспрессии p21, что в зависимости от клеточного контекста может приводить не только к подавлению пролиферации, но и вызывать апоптоз [24]. В настоящее время активно предпринимаются попытки использования РК и ее аналогов для терапии различных онкологических заболеваний, таких как опухоли головы и шеи [32], шейки матки, яичников и нейробластомы [33], а также саркомы Капоши [34]. Нужно отметить, что есть данные, свидетельствующие о том, что РК может способствовать выживанию

7

2,

в то время как другие белки iLBP, более известные как FABPs (fatty acid binding proteins), связывают различные жирные кислоты и их производные. Несмотря на то, что белки CRABP играют большую роль в реализации эффекта РК, а также, согласно последним данным, обладают и другими важнейшими активностями, не связанными с ретиноевым сигналингом, они исследованы недостаточно, а имеющиеся немногочисленные данные очень противоречивы. Удивительно, но эти близкородственные белки, обладая большим сходством (как по аминокислотной последовательности, так и по третичной структуре), могут выполнять противоположные функции как в аспекте проведения сигналов от РК, так и в целом в отношении малигнизации клеток. Ситуация осложняется еще и тем, что каждый из 2 белков CRABP также может выполнять как протуморогенную, так и супрессорную функцию, что, по-видимому, зависит от конкретного гистологического типа опухоли и клеточного контекста. В данном обзоре мы попытались систематизировать имеющиеся данные и сравнить белки CRABP1 и CRABP2 в отношении их биологической активности и функционального значения в аспекте канцерогенеза и опухолевой прогрессии.

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2,

2015

8

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ и пролиферации клеток, и даже усиливать формирование опухолей. Это прежде всего относится к клеткам кожи [35–37] и нейронам [38–41]. Считается, что РК обладает преимущественно проапоптотической и стимулирующей дифференцировку активностью, что обусловливает ее опухолесупрессорную функцию. При этом РК может способствовать и выживанию опухолевых клеток. Данные различия в действии РК обеспечиваются, по-видимому, ее взаимодействием с различными ядерными рецепторами, что, в свою очередь, определяет активацию транскрипции различных генов-мишеней. Рецепторы ретиноевой кислоты Рецепторы РК относятся к семейству стероидных и тиреоидных гормонов и являются лигандзависимыми транскрипционными факторами. Наиболее известны 2 основных класса ретиноидных рецепторов: RAR (retinoic acid receptor) и RXR (retinoid x receptor). С белками RAR связываются транс-РК и 9-цис-РК, с RXR – только 9-цис-РК. Но так как транс-РК способна превращаться в 9-цис-РК, высокие концентрации транс-РК также активируют RXR [42]. Доставку РК до RAR и RXR осуществляют белки CRABP, строение и особенности функционирования которых будут рассмотрены ниже. В состав каждого класса рецепторов входят 3 подтипа: α, β и γ, кодируемые различными генами. Строение этих белков хорошо охарактеризовано: каждый из них состоит из слабоструктурированного и вариабельного N-концевого домена и 2 высококонсервативных доменов: центрального ДНК-связывающего и C-концевого, ответственного за взаимодействие с РК, димеризацию и взаимодействие с активаторами транскрипции [43]. Белки RXR могут связываться с ДНК и активировать транскрипцию в виде гомодимера, в то время как активация транскрипции белками RAR обычно осуществляется в составе гетеродимера с RXR. После присоединения лиганда (РК) гетеродимер RAR–RXR связывается с определенной последовательностью ДНК в промоторе ретиноид-респонсивных генов – RARE (retinoic acid response element). Последовательность RARE достаточно хорошо охарактеризована, она состоит из 2 гексамерных повторов [A / G]G[G / T]TCA, разделенных 5 (DR5), 2 (DR2) или 1 (DR1) нуклеотидом [44]. В настоящее время предложен следующий механизм регуляции транскрипции гетеродимером RAR–RXR. В отсутствие РК гетеродимер RAR–RXR связан с комплексом белков, ответственных за репрессию транскрипции и конденсацию хроматина [45]. Связывание с РК приводит к изменению конформации в лигандсвязывающем домене гетеродимера, что, в свою очередь, приводит к высвобождению репрессоров и связыванию коактиваторов транскрипции [46]. После модификации гистонов к промотору привлекается РНК-полимераза II и начинается транскрипция.

ТОМ 2 Помимо белков RAR и RXR РК может связываться и с другими ядерными рецепторами. Показано, что РК является лигандом для рецептора PPARβ/δ [47, 48], который принадлежит к подклассу рецепторов, также включающему PPARα и PPARγ, функционирующих, подобно RAR, в гетеродимере с RXR. Селективное связывание РК с PPARβ/δ было предположено на основе данных о существенно большей аффинности взаимодействия РК с PРARβ / δ по сравнению с PPARα или PPARγ [47]. Доставку РК к ядерным рецепторам осуществляют вышеупомянутые белки семейства iLBP. Недавние исследования показали, что 3 белка семейства iLBP: CRABP2, FABP5 и FABP4 (основные представители семейства, способные связывать РК) избирательно взаимодействуют с ядерными рецепторами RARα, PPARβ / δ и PPARγ соответственно. Функции белков, связывающих жирные кислоты Белки iLBP в отсутствие связывания с лигандом находятся в цитоплазме. Связывание с лигандами (в частности, с РК) приводит к конформационным изменениям, активирующим сигнал ядерной локализации, и белки перемещаются в ядро. В ядре происходит взаимодействие с соответствующим рецептором, формируется комплекс, и РК «передается рецептору». Таким образом, белки iLBP не только облегчают связывание РК с соответствующими рецепторами, но и усиливают их транскрипционную активность [49–53]. Активируя ядерный рецептор RAR или PPARβ / δ, РК индуцирует экспрессию различных ретиноид-респонсивных генов. Важно подчеркнуть, что репертуар генов, находящихся под контролем РК, включает в себя RAR- и PPARβ / δ-зависимые. Исследования показали, что распределение РК между этими 2 рецепторами регулируется родственными iLBPs: CRABP2 доставляет РК к RAR, в то время как FABP5 транспортирует ее к PPARβ / δ. Следует отметить, что аффинность взаимодействия комплекса CRABP2– RAR с РК выше, чем у FABP5–PPARβ / δ [49, 53, 54]. Это объясняет тот факт, что в большинстве клеток действие РК через RAR доминирует, и активация FABP5 / PPARβ / δ-пути возможна только в клетках с большим соотношением FABP5 / CRABP2. Так, например, в клетках линии MCF-7, характеризующихся низким соотношением FABP5 / CRABP2, РК активирует RAR, при этом кератиноциты, которые характеризуются высоким соотношением FABP5 / CRABP2, отвечают на РК преимущественной активацией PPARβ / δ. Что касается CRABP1, вопрос его функционального значения в отношении РК и ее доставки к рецепторам остается открытым, и имеющиеся представления будут рассмотрены ниже. Интересно, что, хотя FABP5 кроме РК способен связывать еще целый ряд лигандов, только связывание РК вызывает его ядерную транслокацию и дальнейшее связывание с PPARβ / δ [53].

CRABP2

FABP5

RAR

PPARβ / δ

Остановка клеточного цикла, апоптоз

Пролиферация

Рис. 1. Эффекты РК, опосредуемые взаимодействием с различными рецепторами

Связывание РК с разными рецепторами вызывает активацию разных генов и, соответственно, оказывает различные эффекты. Так, RAR преимущественно активируют гены, индуцирующие дифференцировку, апоптоз или остановку клеточного цикла [30, 55–60], а PPARβ / δ – гены, ответственные за выживание, пролиферацию и ангиогенез [48, 61–64]. В соответствии с этим РК ингибирует рост клеток карцином, в которых высоко экспрессирован CRABP2 [48, 50, 52, 59, 65], но усиливает онкогенный потенциал клеток, экспрессирующих PPARβ / δ [48, 66, 67]. Схематично действие РК, опосредуемое взаимодействием с разными белками iLBP, представлено на рис. 1. Важно отметить, что немногочисленные типы клеток с высоким соотношением FABP5 / CRABP2, в которых происходит преимущественная активация PPARβ / δ, тем не менее сохраняют способность экспрессировать некоторые гены-мишени RAR, в частности Cyp26a, продукт которого катализирует РК. Таким образом, возможно, происходит регулировка, предохраняющая клетку от избыточной РК-зависимой активации PPARβ-сигнального каскада [68]. Эта схема представляется достаточно упрощенной и не объясняет недавно появившиеся данные о РКзависимой активации генов, стимулирующих прохождение клеточного цикла и пролиферацию, включая циклинзависимые киназы и циклин D1, посредством активации рецепторов RAR / RXR [69]. Строение и функции белков CRABP1 и CRABP2 Рассмотрим подробнее основные характеристики белков CRABP1 и CRABP2. Эти высококонсервативные белки очень сходны как по первичной (74 % гомологии по аминокислотной последовательности), так и по третичной структуре. Ген CRABP1 локализован на длинном плече 15-й хромосомы (15q24), с него транскрибируется одна матричная РНК (мРНК). Белок CRABP1 состоит из 137 аминокислот и имеет молекулярную массу 15,5 кДа. CRABP1 обладает характерной для всех белков семейства трехмерной

структурой, состоящей из 4 β-слоев. Активный центр белка CRABP1 представлен 3 аминокислотами, лежащими на поверхности «бочонка», образованного β-слоями. Главную роль в связывании CRABP1 с РК играет аргинин в 131-м положении, так как его положительно заряженный боковой радикал напрямую взаимодействует с карбоксильной группой РК [70]. Ген CRABP2 располагается на 1-й хромосоме (1q21.3). С него транскрибируются 3 различные мРНК. Белок CRABP2 состоит из 138 аминокислот и имеет молекулярную массу 15,7 кДа. Как уже говорилось, оба белка CRABP обладают сходной третичной структурой, имеют сигнал ядерной локализации и даже связывают РК со сходной аффинностью (константа диссоциации различается всего в 2 раза) [49]. Важно отметить, что оба гена, кодирующие белки CRABP, в свою очередь, сами являются мишенями РК, и их экспрессия регулируется РК наряду с другими генами, задействованными в ее метаболизме и транспорте, включая CRBP1 / 2, CRABP1 / 2, CYP26A1, белки RAR и др. Существуют и другие способы регуляции белков CRABP, во всяком случае, это показано для CRABP2, о котором в литературе имеется больше данных. Так, экспрессия CRABP2 может напрямую регулироваться эстрогеном (в клетках матки крыс) за счет имеющегося в промоторе CRABP2 сайта, связывающего эстрогеновые рецепторы [71], и эта регуляция происходит независимо от РК. Сходные данные получены на нескольких клеточных линиях карциномы молочной железы, где эстроген усиливает экспрессию CRABP2 [72]. Белки CRABP обнаружены у всех позвоночных, при этом уровни экспрессии CRABP1 и CRABP2 широко варьируют в зависимости от стадии онтогенеза и типа ткани. В тканях эмбрионов оба белка CRABP экспрессируются достаточно широко, хотя считают, что обычно одновременно они не встречаются в одних и тех же клетках [7, 73]. У взрослых особей CRABP1 экспрессируется убиквитарно, но уровень его экспрессии достаточно низок (за исключением сетчатки глаза). CRABP2 экспрессируется преимущественно в коже, матке, яичниках, яичках [74–76] и сосудистом сплетении мозга [77]. Очевидно, что основная функция белков CRABP (как и других внутриклеточных липидсвязывающих белков) – солюбилизация и транспорт липофильного лиганда (в данном случае РК) в водной фазе цитоплазмы. При этом различия паттернов экспрессии белков CRABP позволяют предположить различие ролей CRABP1 и CRABP2 в реализации функциональной активности РК в организме. Функции CRABP2 Основная доказанная функция белка CRABP2 – транспорт РК из цитоплазмы в ядро к RAR, что, в свою очередь, вызывает активацию RAR-зависимых генов, большая часть которых участвует в антипролиферативных и / или проапоптотических процессах

2015

РК

9

2,

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

2015

в клетке. К одной из таких мишеней относится p53-зависимый ген B-клеточной транслокации Btg2 [59]. В его промоторе был найден РК-связывающий участок, взаимодействующий с гетеродимером RXR– РК и, следовательно, ответственный за РК-индуцированную активацию Btg2. Антипролиферативный эффект Btg2 опосредован его подавляющим действием на экспрессию циклина D1. Другими мишенями, опосредующими РК-индуцированный апоптоз (показано на клетках MCF-7), являются гены каспаз-7 и -9 и их сериновые протеазы [30]. При этом экспрессия каспазы-7 активируется через ряд посредников, а ген каспазы-9 – прямая мишень RAR. Существует еще целый ряд генов, контролируемых РК посредством активации RAR, включая UBE1L (ubiquitin-activating enzyme E1-like protein), C / EBPepsilon (CCAAT / enhancer binding protein), и TNF-зависимый белок TRAIL (tumor necrosis factorrelated apoptosis-inducing ligand, также известный как Apo-2L) [20, 78, 79]. Кроме того, на клетках карциномы молочной железы показано снижение экспрессии ряда генов, ассоциированное с РК-зависимым подавлением пролиферации, таких как Bcl-2 и сурвивин [80, 81], а также повышение экспрессии опухолевого супрессора PDCD4 и транскрипционного фактора SOX9 [55, 56]. К сожалению, детальный механизм РК-зависимой активации этих генов остается до конца не выясненным. В соответствии с основной продифференцировочной и антипролиферативной функцией РК предполагается, что и CRABP2 является опухоль-супрессорным фактором. В пользу этой гипотезы свидетельствует ряд данных. В частности, показано, что отсутствие экспрессии белка CRABP2 ассоциировано с неблагоприятным прогнозом при плоскоклеточном раке головы и шеи [82]. Снижение продукции белка CRABP2 коррелирует с увеличением степени злокачественности астроцитарных глиом и неблагоприятным прогнозом для пациентов [83]. Кроме того, обнаружено, что гиперэкспрессия CRABP2 усиливает чувствительность клеток карциномы молочной железы MCF-7 к РКобусловленной остановке пролиферации [50] и стимулирует TNF-α-зависимый апоптоз после обработки РК кератиноцитов линии HaCaT [48]. Снижение экспрессии CRABP2 также ассоциировано с эндометриозом, что подтверждает роль данного белка в регуляции пролиферации эпителиальных клеток [84]. Наши собственные данные также свидетельствуют в пользу супрессорной роли CRABP2 при немелкоклеточном раке легкого. Так, мы доказали, что снижение экспрессии CRABP2 в образцах опухолей по сравнению с условно нормальной тканью коррелирует с наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы [85]. С другой стороны, есть и данные, свидетельствующие о вовлеченности CRABP2 в прогрессию опухолей. В частности, показано увеличение его экспрессии на поздних стадиях рака молочной железы (РМЖ). Ги-

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2,

10

ТОМ 2 перэкспрессия CRABP2 обнаружена в клетках РМЖ в сравнении с нормальной тканью [86]. Такая же картина наблюдается в клетках лейомиомы матки [87] и промиелоцитарного лейкоза [88, 89]. Кроме того, высокий уровень CRABP2 продемонстрирован при раке мочевого пузыря [90]. Повышенная экспрессия CRABP2 характерна для ретинобластом с выраженными инвазивными свойствами [91]. Интересно, что ранее, в 1998 г. было показано, что экспрессия антисмысловой мРНК CRABP2 в клетках плоскоклеточного рака головы и шеи приводит к снижению инвазивной активности клеток [92]. Гиперэкспрессия CRABP2 также обнаружена в клетках MCF-7, устойчивых к мелфалану [93], и кератиноцитах, устойчивых к форболовому эфиру, что свидетельствует о возможной роли данного белка в приобретении клетками лекарственной устойчивости. Тем не менее в целом большая часть данных указывает на опухолесупрессорное действие CRABP2 путем доставки РК к RAR и активации экспрессии проапоптотических или продифференцировочных генов. Однако не так давно появились данные о том, что этот белок способен проявлять свою активность независимо от РК и ее рецепторов [94]. Например, доказано, что, хотя экспрессия фактора, активирующего апоптотические пептидазы (apoptotic peptidase-activating factor 1, Apaf-1), главного белка апоптосом, не контролируется РК и RAR, эктопическая экспрессия CRABP2 увеличивает его содержание как в культуре клеток, так и in vivo [30, 65, 94]. Было обнаружено также, что экспрессия CRABP2 в клетках РМЖ в отсутствие РК усиливает процессинг некоторых каспаз, что демонстрирует проапоптотическую активность этого белка в отсутствие лиганда [30, 94]. Вообще РКнезависимая функция CRABP2 показана на нескольких типах клеток, например на клетках карциномы молочной железы [50, 52] и промиелоцитарного лейкоза [88, 89]. Таким образом, оба вопроса: можно ли считать CRABP2 опухолевым супрессором, и связана ли активность CRABP2 с его основной функцией – связыванием РК, – остаются открытыми. Как может реализовываться РК-независимая функция СRABP2? Недавно обнаружено, что CRABP2 взаимодействует с белком HuR, одним из наиболее охарактеризованных членов семейства Hu-белков, вовлеченных в посттранскрипционную регуляцию экспрессии генов у животных [95], и это взаимодействие усиливает функциональную активность HuR. HuR – убиквитарно экспрессирующийся белок, связывающий РНК. Он имеет множество биологических функций, среди которых сплайсинг РНК, ядерный экспорт, стабилизация транскриптов. Он осуществляет их, связываясь с AU-богатыми элементами 3’-UTR областей целевой мРНК, тем самым защищая их от деградации и усиливая их экспрессию [96–98]. CRABP2 кооперирует с HuR в стабилизации определенных мРНК, повышая аффинность HuR к некоторым

RAR

Функции CRABP1 Функции CRABP1 на сегодняшний день исследованы еще меньше. Известно, что, помимо классической локализации в цитоплазме, CRABP1 обнаруживается в митохондриях [100] и в перинуклеарном пространстве [101]. Как уже упоминалось, у этого белка, как и у CRABP2, имеется сигнал ядерной локализации. По нашим и по некоторым данным других авторов [102], он, как и CRABP2, может присутствовать в ядрах. При этом в литературе есть сведения, что CRABP1, в отличие от CRABP2, в ядре отсутствует [50]. В целом можно выделить 2 группы данных, одна из которых указывает на различия в функциональной активности CRABP1 по сравнению с CRABP2

+ CRABP1

CRABP1–РК

РК

RAR–РК

RAR CRABP2 + CRABP2–РК

RAR–РК–CRABP2

RAR–РК

Рис. 2. Различия в механизмах передачи РК от белков CRABP1 и CRABP2 к рецепторам RAR. Адаптировано из [105]

2015

и их разное влияние на РК-зависимый эффект, другая – на схожесть функций CRABP1 и CRABP2. Прежде всего, механизм передачи РК от белков CRABP1 и CRABP2 к рецепторам RAR принципиально различается (рис. 2). Как уже говорилось, CRABP2 напрямую взаимодействует с белками RAR, и это взаимодействие существенно облегчает формирование активного комплекса белков RAR–РК, а также усиливает транскрипционную активность рецепторов RAR [103]. СRABP1 не способен взаимодействовать с RAR, и для передачи РК от белка CRABP1 к рецепторам требуется диссоциация комплекса CRABP1–РК с последующей ассоциацией РК с RAR [49]. В соответствии с этой концепцией обнаружено, что экспрессия CRABP2, в отличие от CRABP1, усиливает транскрипцию генов, содержащих последовательности RARE (RAR-responsive elements). Интересно, что в третичной структуре этих 2 белков обнаружены различия непосредственно в участке перед лигандсвязывающим «карманом», а результаты направленного мутагенеза показали, что присутствующие в CRABP2 аминокислотные остатки (GLN75, PRO81 и LYS102), соответствующие этому участку, обеспечивают трансфер РК от CRABP2 к RAR и усиливают транскрипционную активность рецептора [104]. Таким образом, если CRABP1 и способен усиливать передачу сигнала от РК, он осуществляет это менее эффективно. Более того, есть гипотеза, согласно которой CRABP1 выполняет противоположную функцию – не усиливает РК-зависимый эффект, а участвует в регуляции (снижении) внутриклеточного уровня РК, в частности за счет ее метаболизма. Так, показано, что РК в комплексе с CRABP1 гораздо эффективнее взаимодействует с ферментами метаболизма РК, такими как CYP26 [106–108]. Также установлено, что скорость деградации РК в клетках тератокарциномы F9 возрастает по мере увеличения уровня экспрессии CRABP1 [109]. Дальнейшие исследования выявили обратную корреляцию между уровнем экспрессии CRABP1 и РК-опосредованной дифференцировкой

11

2,

транскриптам. CRABP2 таким образом увеличивает экспрессию некоторых генов, включая Apaf-1, Casp7, а также самого HuR. Важно отметить, что эта функция выполняется белком CRABP2 независимо от РК и RAR. Это было доказано в эксперименте с использованием мутантного белка CRABP2, у которого отсутствовал сигнал ядерной локализации. Показано, что обе формы белка (как дикого типа, так и мутантный) в равной степени повышают экспрессию Apaf-1 как на уровне мРНК, так и на уровне белка [94]. Интересно, что и протуморогенная активность CRABP2 не зависит от его функции связывания РК. И в этом случае она, по-видимому, также реализуется при участии белков семейства Hu. В частности, показано значительное повышение уровня CRABP2 в нейробластомах, где имеется амплификация MycN (данная амплификация считается основным критерием неблагоприятного клинического прогноза при нейробластомах). При этом авторы демонстрируют, что MycN напрямую активирует экспрессию CRABP2, связываясь с определенным сайтом в промоторе CRABP2, и этот эффект является РК-независимым.

CRABP2 с помощью не совсем понятного механизма увеличивает продукцию белков HuD и HuB, и это сопровождается усилением экспрессии MycN. Соответственно, возникает петля положительной обратной связи, приводящая к усилению малигнизации клеток. Авторы даже предлагают использовать CRABP2 в качестве мишени для таргетной терапии при данном заболевании [99]. В целом с учетом возможности альтернативных вариантов активации самого CRABP2 (включая RAR, эстрогеновый рецептор, MycN), а также возможности ядерной локализации данного белка можно предположить, что CRABP2 может функционировать в качестве некоего транскрипционного коактиватора и / или мишени определенных транскрипционных факторов и что совокупный эффект этого белка в клетке может определяться тем, какие именно транскрипционные факторы задействованы в конкретном случае.

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

2015

данных клеток. Кроме того, гиперэкспрессия CRABP1 приводила к подавлению экспрессии таких связанных с дифференцировкой ретиноид-респонсивных генов, как RARβ, ламинин B1 и коллаген IV типа [110]. Кроме того, экспрессия гена CRABP1 в клетках линии плоскоклеточного рака головы и шеи AMC-HN-7 увеличивала количество продуктов метаболизма РК (полярных метаболитов РК). Более того, клетки данной линии становились менее чувствительными к РК, а транскрипционная активность рецепторов РК в них даже снижалась [111]. Все это говорит в пользу уменьшения эффектов воздействия РК на клетку в присутствии CRABP1, в частности за счет усиления катаболизма РК или секвестрирования ее в цитоплазме. Таким образом, одна из возможных функций CRABP1 – защита клетки от избытка РК. Тем не менее существуют исследования, свидетельствующие о противоположном влиянии CRABP1 на передачу сигнала от РК, т. е. указывающие на схожесть функций с CRABP2 в РК-зависимой активации генов. Например, X. H. Tang et al. обнаружили, что гиперэкспрессия CRABP1 в супрабазальных кератиноцитах мыши усиливает физиологическое действие РК на клеточную пролиферацию [112]. Эти данные с учетом обнаружения CRABP1 в ядре и наличия у него сигнала ядерной локализации позволяют предположить сходство функций CRABP1 и CRABP2: связывание РК предохраняет ее от ферментативного разрушения, и белок CRABP1 осуществляет ее доставку в ядро, обеспечивая эффективное взаимодействие с ядерными рецепторами. Есть исследования, в которых экспрессия CRABP1 не влияла на эффекты РК. В работе A. C. Chen et al. показано, что гомозиготная делеция CRABP1 в эмбриональных стволовых клетках мыши AB1 не влияет на экспрессию таких ретиноид-респонсивных генов, как HOXA-1, RARβ, ламинин В1 и коллаген IV типа (α1), а также на кинетику метаболизма РК, но вызывает снижение внутриклеточной концентрации РК [113]. Помимо этого, обнаружено, что введение CRABP1 в линии COS-7 и CV-1 не влияет на транскрипционную активность рецепторов РК [49, 114]. Отдельные данные свидетельствуют о том, что у CRABP1, как и у CRABP2, могут быть функции, не опосредуемые RAR. Так, S. D. Persaud et al. показали, что CRABP1 необходим для RAR-независимой (происходящей в цитоплазме) активации ERK1 / 2 РК в эмбриональных стволовых клетках [115]. Результаты наших исследований также свидетельствуют о наличии альтернативных, не связанных с РК, функциях белка CRABP1. В частности, мы впервые обнаружили протуморогенный эффект СRABP1 на экспериментальной модели in vivo и с помощью направленного мутагенеза показали независимость этого эффекта от способности данного белка связывать РК [116].

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2,

12

ТОМ 2 В целом данные о роли CRABP1 в канцерогенезе и опухолевой прогрессии неоднозначны и противоречивы. В ряде работ выявлено снижение экспрессии CRABP1 в солидных опухолях, обусловленное прежде всего метилированием промотора данного гена. Гиперметилирование промотора CRABP1 (островки CpG) часто обнаруживают при раке толстой кишки и раке печени, что коррелирует со степенью злокачественности опухоли [117]. При этом гиперметилирование промотора CRABP1 ассоциируется с неблагоприятным прогнозом течения заболевания и, таким образом, может служить прогностическим фактором для больных [118]. Метилирование промотора CRABP1 также выявлено при раке пищевода. Низкая экспрессия белка CRABP1 по данным иммуногистохимического исследования ассоциировалась с низкой дифференцировкой клеток и наличием метастазов в лимфатических узлах. Авторы предполагают, что в клетках эпителия пищевода CRABP1 может выполнять функцию опухолевого супрессора [119]. Уровень мРНК CRABP1 снижается и при папиллярном раке щитовидной железы за счет гиперметилирования промотора гена [120]. L. Hawthorn et al. оценили профиль экспрессии генов при папиллярном раке щитовидной железы и выделили снижение экспрессии CRABP1 как возможный молекулярный маркер данного типа опухоли [121]. Снижение уровня мРНК и белка CRABP1 также характерно и для фолликулярного рака щитовидной железы [122]. Снижение уровня белка CRABP1 наблюдается в образцах рака почки [123], а также при серозном и светлоклеточном раке яичников. Безрецидивная выживаемость при серозной и светлоклеточной аденокарциноме со сниженной экспрессией CRABP1 оказалась значительно ниже, чем в случаях, когда экспрессия CRABP1 была сохранена. Многофакторный анализ показал, что снижение экспрессии CRABP1 является важным прогностическим фактором в случае данных типов опухолей [124]. В то же время для ряда других опухолей, напротив, характерна повышенная экспрессия CRABP1, которая зачастую коррелирует с агрессивным течением заболевания. Так, высокая экспрессия CRABP1 ассоциирована с неблагоприятным прогнозом при немелкоклеточном раке легкого и глиомах [125]. Выраженное повышение уровня мРНК CRABP1 также отмечается в образцах лейомиомы матки по сравнению с тканью миометрия [126]. Повышение уровня мРНК CRABP1 характерно для эндометриоидного рака яичников [127] и отмечается при синовиальных саркомах и злокачественных опухолях оболочек периферических нервов [128]. Данные наших собственных исследований также свидетельствуют в пользу проканцерогенной активности CRABP1. Так, помимо обнаружения уже упомянутой протуморогенной и прометастатической активности данного белка в экспериментальной модели трансформированных фибробластов, мы показали, что высокий уровень белка CRABP1 характе-

Заключение Следует отметить, что на сегодняшний день функции белков CRABP, особенно CRABP1, недостаточно охарактеризованы, а данные о роли этих белков в формировании ответа на воздействие РК и ее метаболизме противоречивы. Остается открытым вопрос о том,

являются ли функции этих белков сходными, но осуществляемыми в разных типах клеток, или противоположными: с одной стороны, направленными на проведение РК-зависимых сигналов, с другой – на ограничение активности РК. Дальнейшие исследования необходимы для определения роли данных белков в канцерогенезе. Надо сказать, что большая часть приведенных здесь данных получена при сравнении уровней мРНК и основана преимущественно на скрининговых исследованиях с использованием технологий профилирования транскриптомов. Исследований, посвященных анализу функциональной активности данных белков и молекулярных механизмов ее реализации, очень немного. Наряду с этим часто обнаруживаемые и значимые изменения экспрессии CRABP в опухолях человека говорят об их активном участии в процессах опухолевой прогрессии. Очевидно, что молекулярные механизмы, определяющие биологическую активность этих белков и их роль в канцерогенезе, требуют дальнейшего всестороннего изучения.

Л И Т Е Р А Т У Р А 1. Gutierrez-Gonzalez L.H., Ludwig C., Hohoff C. et al. Solution structure and backbone dynamics of human epidermal-type fatty acid-binding protein (E-FABP).

Biochem J 2002;364(Pt 3):725–37.

2. Kleywegt G.J., Bergfors T., Senn H. et al.

Crystal structures of cellular retinoic acid binding proteins I and II in complex with alltrans-retinoic acid and a synthetic retinoid.

Structure 1994;2(12):1241–58.

3. Veerkamp J.H., Maatman R.G. Cytoplasmic fatty acid-binding proteins: their structure and genes. Prog Lipid Res 1995;34(1):17–52.

4. Thaller C., Eichele G. Identification and spatial distribution of retinoids in the developing chick limb bud. Nature 1987;327(6123):625–628.

5. Spinella M.J., Kerley J.S., White K.A. et al. Retinoid target gene activation during induced tumor cell differentiation: human embryonal carcinoma as a model. J Nutr 2003;133(1):273S–6S. 6. Maden M. Role and distribution of retinoic acid during CNS development.

Int Rev Cytol 2001;209:1–77.

7. Maden M. Retinoids in lung development and regeneration. Curr Top Dev Biol 2004;61:153–89.

8. Thaller C., Eichele G. Retinoid signaling in vertebrate limb development. Ann NY Acad Sci 1996;785:1–11.

9. Collins S.J. The role of retinoids and retinoic acid receptors in normal hematopoiesis. Leukemia 2002;16(10): 1896–905.

10. Morikawa K., Nonaka M. All-transretinoic acid accelerates the differentiation

of human B lymphocytes maturing into plasma cells. Int Immunopharmacol 2005;5(13–14):1830–8.

11. Iwata M. Retinoic acid production by intestinal dendritic cells and its role in T-cell trafficking. Semin Immunol 2009;21(1):8–13.

12. Rhinn M., Dolle P. Retinoic acid signalling during development. Development 2012;139(5):843–58.

13. Theodosiou M., Laudet V., Schubert M. From carrot to clinic: an overview of the retinoic acid signaling pathway. Cell Mol Life Sci 2010;67(9):1423–45.

14. Huang Y., Boskovic G., Niles R.M. Retinoic acid-induced AP-1 transcriptional activity regulates B16 mouse melanoma growth inhibition and differentiation. J Cell Physiol 2003;194(2):162–70.

15. Breitman T.R., Selonick S.E., Collins S.J. Induction of differentiation of the human promyelocytic leukemia cell line (HL-60) by retinoic acid. Proc Natl Acad Sci USA 1980;77(5):2936–40.

16. Wu S., Donigan A., Platsoucas C.D. et al.

All-trans-retinoic acid blocks cell cycle progression of human ovarian adenocarcinoma cells at late G1. Exp Cell Res 1997;232(2):277–286.

17. Singh B., Murphy R.F., Ding X.Z. et al.

On the role of transforming growth factorbeta in the growth inhibitory effects of retinoic acid in human pancreatic cancer cells. Mol Cancer 2007;6:82.

18. Battle T.E., Roberson M.S., Zhang T. et al. Retinoic acid-induced blr1 expression requires RARalpha, RXR, and MAPK activation and uses ERK2 but not JNK/ SAPK to accelerate cell differentiation.

Eur J Cell Biol 2001;80(1): 59–67.

19. Strickland S., Mahdavi V. The induction of differentiation in teratocarcinoma stem cells by retinoic acid. Cell 1978;15(2): 393–403.

20. Altucci L., Rossin A., Raffelsberger W. et al. Retinoic acid-induced apoptosis in leukemia cells is mediated by paracrine action of tumor-selective death ligand TRAIL. Nat Med 2001;7(6):680–6.

21. Elstner E., Muller C., Koshizuka K. et al.

Ligands for peroxisome proliferator-activated receptorgamma and retinoic acid receptor inhibit growth and induce apoptosis of human breast cancer cells in vitro and in BNX mice.

Proc Natl Acad Sci USA 1998;95(15): 8806–11.

22. Toma S., Isnardi L., Riccardi L. et al.

Induction of apoptosis in MCF-7 breast carcinoma cell line by RAR and RXR selective retinoids. Anticancer Res 1998;18(2A):935–42.

23. Mangiarotti R., Danova M., Alberici R., Pellicciari C. All-trans retinoic acid (ATRA)induced apoptosis is preceded by G1 arrest in human MCF-7 breast cancer cells. Br J Cancer 1998;77(2):186–91.

24. Luo P., Lin M., Lin M. et al. Function of retinoid acid receptor alpha and p21 in all-trans-retinoic acid-induced acute T-lymphoblastic leukemia apoptosis. Leuk Lymphoma 2009;50(7):1183–9.

25. Kini A.R., Peterson L.A., Tallman M.S. et al. Angiogenesis in acute promyelocytic leukemia: induction by vascular endothelial growth factor and inhibition by all-trans retinoic acid. Blood 2001;97(12):3919–24.

2015

рен для синовиальных сарком, причем в бифазных саркомах экспрессия CRABP1 присутствует только в мезенхимальном компоненте. Кроме того, с учетом данных о влиянии гиперэкспрессии CRABP1 на частоту формирования спонтанных нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы (НЭО ПЖ) у мышей [129] мы сравнили уровень экспрессии данного белка в образцах НЭО ПЖ человека и показали, что увеличение продукции CRABP1 коррелирует с низкой дифференцировкой и высокой степенью злокачественности данного типа опухолей, а также с процессом метастазирования в регионарные лимфатические узлы [116].

13

2,

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

2015

26. Kim M.S., Kim Y.K., Eun H.C. et al. Alltrans retinoic acid antagonizes UV-induced VEGF production and angiogenesis via the inhibition of ERK activation in human skin keratinocytes. J Invest Dermatol 2006;126(12):2697–706.

27. Pfahl M., Piedrafita F.J. Retinoid targets for apoptosis induction. Oncogene 2003;22(56):9058–62.

28. Sadikoglou E., Magoulas G., Theodoropoulou C. et al. Effect of conjugates of all-trans-retinoic acid and shorter polyene chain analogues with amino acids on prostate cancer cell growth. Eur J Med Chem 2009;44(8):3175–87.

29. Lee J.H., Yoon J.H., Yu S.J. et al. Retinoic acid and its binding protein modulate apoptotic signals in hypoxic hepatocellular carcinoma cells. Cancer Lett 2010;295(2):229–35.

30. Donato L.J., Noy N. Suppression of mammary carcinoma growth by retinoic acid: proapoptotic genes are targets for retinoic acid receptor and cellular retinoic acid-binding protein II signaling. Cancer Res 2005;65(18):8193–9.

31. Hoang T.C., Bui T.K., Taguchi T. et al.

All-trans retinoic acid inhibits KIT activity and induces apoptosis in gastrointestinal stromal tumor GIST-T1 cell line by affecting on the expression of survivin and Bax protein.

J Exp Clin Cancer Res 2010;29:165.

32. Khuri F.R., Lippman S.M., Spitz M.R. et al. Molecular epidemiology and retinoid chemoprevention of head and neck cancer.

J Natl Cancer Inst 1997;89(3):199–211.

33. Zuccari G., Carosio R., Fini A. et al.

Modified polyvinylalcohol for encapsulation of all-trans-retinoic acid in polymeric micelles.

J Control Release 2005;103(2):369–80.

34. Caselli E., Galvan M., Santoni F. et al.

Retinoic acid analogues inhibit human herpesvirus 8 replication. Antivir Ther 2008;13(2):199–209.

35. Kang S., Duell E.A., Fisher G.J. et al.

Application of retinol to human skin in vivo induces epidermal hyperplasia and cellular retinoid binding proteins characteristic of retinoic acid but without measurable retinoic acid levels or irritation. J Invest Dermatol 1995;105(4):549–56.

36. Verma A.K., Conrad E.A., Boutwell R.K. Differential effects of retinoic acid and 7,8-benzoflavone on the induction of mouse skin tumors by the complete carcinogenesis process and by the initiation-promotion regimen. Cancer Res 1982;42(9): 3519–25.

37. Zouboulis C.C. Retinoids–which dermatological indications will benefit in the near future? Skin Pharmacol Appl Skin Physiol 2001;14(5):303–15.

38. Henion P.D., Weston J.A. Retinoic acid selectively promotes the survival and proliferation of neurogenic precursors in cultured neural crest cell populations.

Dev Biol 1994;161(1):243–50.

39. Jacobs S., Lie D.C., DeCicco K.L. et al.

Retinoic acid is required early during adult

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2,

14

ТОМ 2 neurogenesis in the dentate gyrus. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103(10):3902–7.

40. Plum L.A., Parada L.F., Tsoulfas P. et al.

Retinoic acid combined with neurotrophin-3 enhances the survival and neurite outgrowth of embryonic sympathetic neurons. Exp Biol Med 2001;226(8):766–75.

41. Rodriguez-Tebar A., Rohrer H. Retinoic acid induces NGF-dependent survival response and high-affinity NGF receptors in immature chick sympathetic neurons. Development 1991;112(3):813–20.

42. Heyman R.A., Mangelsdorf D.J., Dyck J.A. et al. 9-cis retinoic acid is a high affinity ligand for the retinoid X receptor. Cell 1992;68(2):397–406.

43. Duong V., Rochette-Egly C. The molecular physiology of nuclear retinoic acid receptors.

From health to disease. Biochim Biophys Acta 2011;1812(8):1023–31.

44. de The H., Vivanco-Ruiz M.M., Tiollais P. et al. Identification of a retinoic acid responsive element in the retinoic acid receptor beta gene.

Nature 1990;343(6254):177–80.

45. Perissi V., Jepsen K., Glass C.K., Rosenfeld M.G. Deconstructing repression: evolving models of co-repressor action.

Nat Rev Genet 2010;11(2):109–23.

46. le Maire A., Teyssier C., Erb C. et al.

A unique secondary-structure switch controls constitutive gene repression by retinoic acid receptor. Nat Struct Mol Biol 2010;17(7): 801–7.

47. Shaw N., Elholm M., Noy N. Retinoic acid is a high affinity selective ligand for the peroxisome proliferator-activated receptor beta/delta. J Biol Chem 2003;278(43): 41589–92.

48. Schug T.T., Berry D.C., Shaw N.S. et al.

Opposing effects of retinoic acid on cell growth result from alternate activation of two different nuclear receptors. Cell 2007;129(4): 723–33.

49. Dong D., Ruuska S.E., Levinthal D.J. et al.

Distinct roles for cellular retinoic acid-binding proteins I and II in regulating signaling by retinoic acid. J Biol Chem 1999;274(34):23695–8.

50. Budhu A.S., Noy N. Direct channeling of retinoic acid between cellular retinoic acidbinding protein II and retinoic acid receptor sensitizes mammary carcinoma cells to retinoic acid-induced growth arrest. Mol Cell Biol 2002;22(8):2632–41.

51. Sessler R.J., Noy N. A ligand-activated nuclear localization signal in cellular retinoic acid binding protein-II. Mol Cell 2005;18(3):343–53.

52. Manor D., Shmidt E.N., Budhu A. et al.

Mammary carcinoma suppression by cellular retinoic acid binding protein-II. Cancer Res 2003;63(15):4426–33.

53. Tan N.S., Shaw N.S., Vinckenbosch N. et al. Selective cooperation between fatty acid binding proteins and peroxisome proliferator-activated receptors in regulating transcription. Mol Cell Biol 2002;22(14): 5114–27.

54. Sussman F., de Lera A.R. Ligand recognition by RAR and RXR receptors: binding and selectivity. J Med Chem 2005;48(20):6212–9.

55. Afonja O., Raaka B.M., Huang A. et al.

RAR agonists stimulate SOX9 gene expression in breast cancer cell lines: evidence for a role in retinoid-mediated growth inhibition.

Oncogene 2002;21(51):7850–60.

56. Afonja O., Juste D., Das S. et al. Induction of PDCD4 tumor suppressor gene expression

by RAR agonists, antiestrogen and HER-2/neu antagonist in breast cancer cells. Evidence for a role in apoptosis. Oncogene 2004;23(49): 8135–45.

57. Zacheis D., Dhar A., Lu S. et al.

Heteroarotinoids inhibit head and neck cancer cell lines in vitro and in vivo through both RAR and RXR retinoic acid receptors. J Med Chem 1999;42(21):4434–45.

58. Soprano D.R., Qin P., Soprano K.J. Retinoic acid receptors and cancers. Annu Rev Nutr 2004;24:201–21.

59. Donato L.J., Suh J.H., Noy N. Suppression of mammary carcinoma cell growth by retinoic acid: the cell cycle control gene Btg2 is a direct target for retinoic acid receptor signaling. Cancer Res 2007;67(2):609–15.

60. Noy N. Between death and survival: retinoic acid in regulation of apoptosis. Annu Rev Nutr 2010;30:201–17.

61. Di-Poi N., Michalik L., Tan N.S. et al.

The anti-apoptotic role of PPARbeta contributes to efficient skin wound healing.

J Steroid Biochem Mol Biol 2003;85(2–5): 257–65.

62. Di-Poi N., Tan N.S., Michalik L. et al.

Antiapoptotic role of PPARbeta in keratinocytes via transcriptional control of the Akt1 signaling pathway. Mol Cell 2002;10(4):721–33.

63. Aggarwal B.B., Sethi G., Ahn K.S. et al.

Targeting signal transducer and activator of transcription-3 for prevention and therapy of cancer: modern target but ancient solution.

Ann NY Acad Sci 2006;1091:151–69.

64. Montagner A., Delgado M.B., TallichetBlanc C. et al. Src is activated by the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor beta/delta in ultraviolet radiationinduced skin cancer. EMBO Mol Med 2014;6(1):80–98.

65. Schug T.T., Berry D.C., Toshkov I.A. et al.

Overcoming retinoic acid-resistance of mammary carcinomas by diverting retinoic acid from PPARbeta/delta to RAR. Proc Natl Acad Sci USA 2008;105(21):7546–51.

66. Morgan E., Kannan-Thulasiraman P., Noy N. Involvement of Fatty Acid Binding Protein 5 and PPARbeta/delta in Prostate Cancer Cell Growth. PPAR Res 2010; 2010.

67. Levi L., Lobo G., Doud M.K. et al.

Genetic ablation of the fatty acid-binding protein FABP5 suppresses HER2-induced mammary tumorigenesis. Cancer Res 2013;73(15):4770–80.

97. Chen C.Y., Xu N., Shyu A.B. Highly selective actions of HuR in antagonizing AUrich element-mediated mRNA destabilization.

Mol Cell Biol 2002;22(20):7268–78.

98. Lopez de Silanes I., Zhan M., Lal A. et al.

Identification of a target RNA motif for RNAbinding protein HuR. Proc Natl Acad Sci USA 2004;101(9):2987–92.

99. Gupta A., Williams B.R., Hanash S.M., Rawwas J. Cellular retinoic acid-binding protein II is a direct transcriptional target of MycN in neuroblastoma. Cancer Res 2006;66(16):8100–8.

100. Ruff S.J., Ong D.E. Cellular retinoic acid binding protein is associated with mitochondria. FEBS Lett 2000;487(2):282–6.

101. Levadoux-Martin M., Li Y., Blackburn A. et al. Perinuclear localisation of cellular retinoic acid binding protein I mRNA. Biochem Biophys Res Commun 2006;340(1):326–31.

102. Gaub M.P., Lutz Y., Ghyselinck N.B. et al. Nuclear detection of cellular retinoic acid binding proteins I and II with new antibodies.

J Histochem Cytochem 1998;46(10):1103–11.

103. Jing Y., Waxman S., Mira-y-Lopez R. The cellular retinoic acid binding protein II is a positive regulator of retinoic acid signaling in breast cancer cells. Cancer Res 1997;57(9):1668–72.

104. Budhu A., Gillilan R., Noy N. Localization of the RAR interaction domain of cellular retinoic acid binding protein-II. J Mol Biol 2001;305(4):939–49.

105. Noy N. Retinoid-binding proteins: mediators of retinoid action. Biochem J 2000;348 Pt 3:481–95.

106. Fiorella P.D., Napoli J.L. Expression of cellular retinoic acid binding protein (CRABP) in Escherichia coli. Characterization and evidence that holo-CRABP is a substrate in retinoic acid metabolism. J Biol Chem 1991;266(25):16572–9.

107. Napoli J.L. Interactions of retinoid binding proteins and enzymes in retinoid metabolism. Biochim Biophys Acta 1999;1440(2–3):139–62.

108. Napoli J.L., Posch K.P., Fiorella P.D., Boerman M.N. Physiological occurrence, biosynthesis and metabolism of retinoic acid: evidence for roles of cellular retinol-binding protein (CRBP) and cellular retinoic acidbinding protein (CRABP) in the pathway of retinoic acid homeostasis. Biomed Pharmacother 1991;45(4–5):131–43.

109. Boylan J.F., Gudas L.J. The level of CRABP-I expression influences the amounts and types of all-trans-retinoic acid metabolites in F9 teratocarcinoma stem cells.

J Biol Chem 1992;267(30):21486–91.

110. Boylan J.F., Gudas L.J. Overexpression of the cellular retinoic acid binding protein-I (CRABP-I) results in a reduction in differentiation-specific gene expression in F9 teratocarcinoma cells. J Cell Biol 1991;112(5):965–79.

111. Won J.Y., Nam E.C., Yoo S.J. et al. The effect of cellular retinoic acid binding protein-I

2015

82. Calmon M.F., Rodrigues R.V., Kaneto C.M. et al. Epigenetic silencing of CRABP2 and MX1 in head and neck tumors. Neoplasia 2009;11(12):1329–39.

83. Campos B., Centner F.S., Bermejo J.L. et al. Aberrant expression of retinoic acid signaling molecules influences patient survival in astrocytic gliomas. Am J Pathol 2011;178(5):1953–64.

84. Pavone M.E., Reierstad S., Sun H. et al.

Altered retinoid uptake and action contributes to cell survival in endometriosis. J Clin Endocrinol Metab 2010;95(11):E300–9.

85. Favorskaya I., Kainov Y., Chemeris G. et al. Expression and clinical significance of CRABP1 and CRABP2 in non-small cell lung cancer. Tumour Biol 2014;35(10):10295–300.

86. Bertucci F., Houlgatte R., Benziane A. et al. Gene expression profiling of primary breast carcinomas using arrays of candidate genes. Hum Mol Genet 2000;9(20):2981–91.

87. Tsibris J.C., Segars J., Coppola D. et al.

Insights from gene arrays on the development and growth regulation of uterine leiomyomata.

Fertil Steril 2002;78(1):114–21.

88. Delva L., Cornic M., Balitrand N. et al.

Resistance to all-trans retinoic acid (ATRA) therapy in relapsing acute promyelocytic leukemia: study of in vitro ATRA sensitivity and cellular retinoic acid binding protein levels in leukemic cells. Blood 1993;82(7):2175–81.

89. Zhou D.C., Hallam S.J., Lee S.J. et al.

Constitutive expression of cellular retinoic acid binding protein II and lack of correlation with sensitivity to all-trans retinoic acid in acute promyelocytic leukemia cells. Cancer Res 1998;58(24):5770–6.

90. Jin B.Y., Fu G.H., Jiang X. et al. CRABP2 and FABP5 identified by 2D DIGE profiling are upregulated in human bladder cancer. Chin Med J (Engl) 2013;126(19):3787–9.

91. Mallikarjuna K., Sundaram C.S., Sharma Y. et al. Comparative proteomic analysis of differentially expressed proteins in primary retinoblastoma tumors. Proteomics Clin Appl 2010;4(4):449–63.

92. Vo H.P., Crowe D.L. Transcriptional regulation of retinoic acid responsive genes by cellular retinoic acid binding protein-II modulates RA mediated tumor cell proliferation and invasion. Anticancer Res 1998;18(1A):217–24.

93. Hathout Y., Riordan K., Gehrmann M., Fenselau C. Differential protein expression in the cytosol fraction of an MCF-7 breast cancer cell line selected for resistance toward melphalan. J Proteome Res 2002;1(5):435–42.

94. Vreeland A.C., Levi L., Zhang W. et al.

Cellular retinoic acid-binding protein 2 inhibits tumor growth by two distinct mechanisms. J Biol Chem 2014;289(49): 34065–73.

95. Hinman M.N., Lou H. Diverse molecular functions of Hu proteins. Cell Mol Life Sci 2008;65(20):3168–81.

96. Brennan C.M., Steitz J.A. HuR and mRNA stability. Cell Mol Life Sci 2001;58(2):266–77.

15

2,

68. White J.A., Guo Y.D., Baetz K. et al.

Identification of the retinoic acid-inducible all-trans-retinoic acid 4-hydroxylase. J Biol Chem 1996;271(47):29922–7.

69. Liu H.X., Ly I., Hu Y., Wan Y.J. Retinoic acid regulates cell cycle genes and accelerates normal mouse liver regeneration. Biochem Pharmacol 2014;91(2):256–65.

70. Chaudhuri B.N., Kleywegt G.J., BroutinL'Hermite I. et al. Structures of cellular retinoic acid binding proteins I and II in complex with synthetic retinoids. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 1999;55(Pt 11):1850–7.

71. Li X.H., Ong D.E. Cellular retinoic acidbinding protein II gene expression is directly induced by estrogen, but not retinoic acid, in rat uterus. J Biol Chem 2003;278(37):35819–25.

72. Lu M., Mira-y-Lopez R., Nakajo S. et al.

Expression of estrogen receptor alpha, retinoic acid receptor alpha and cellular retinoic acid binding protein II genes is coordinately regulated in human breast cancer cells.

Oncogene 2005;24(27):4362–9.

73. Maden M. Retinoid signalling in the development of the central nervous system.

Nat Rev Neurosci 2002;3(11):843–53.

74. Bucco R.A., Zheng W.L., Davis J.T. et al.

Cellular retinoic acid-binding protein(II) presence in rat uterine epithelial cells correlates with their synthesis of retinoic acid.

Biochemistry 1997;36(13):4009–14.

75. Wardlaw S.A., Bucco R.A., Zheng W.L., Ong D.E. Variable expression of cellular retinol- and cellular retinoic acid-binding proteins in the rat uterus and ovary during the estrous cycle. Biol Reprod 1997;56(1):125–32.

76. Zheng W.L., Ong D.E. Spatial and temporal patterns of expression of cellular retinol-binding protein and cellular retinoic acid-binding proteins in rat uterus during early pregnancy. Biol Reprod 1998;58(4):963–70.

77. Yamamoto M., Drager U.C., Ong D.E., McCaffery P. Retinoid-binding proteins in the cerebellum and choroid plexus and their relationship to regionalized retinoic acid synthesis and degradation. Eur J Biochem 1998;257(2):344–50.

78. Kitareewan S., Pitha-Rowe I., Sekula D. et al. UBE1L is a retinoid target that triggers PML/RARalpha degradation and apoptosis in acute promyelocytic leukemia. Proc Natl Acad Sci USA 2002;99(6):3806–11.

79. Park D.J., Chumakov A.M., Vuong P.T. et al. CCAAT/enhancer binding protein epsilon is a potential retinoid target gene in acute promyelocytic leukemia treatment.

J Clin Invest 1999;103(10): 1399–408.

80. Pratt M.A., Niu M., White D. Differential regulation of protein expression, growth and apoptosis by natural and synthetic retinoids.

J Cell Biochem 2003;90(4):692–708.

81. Raffo P., Emionite L., Colucci L. et al.

Retinoid receptors: pathways of proliferation inhibition and apoptosis induction in breast cancer cell lines. Anticancer Res 2000;20(3A):1535–43.

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

2015

expression on the CYP26-mediated catabolism of all-trans retinoic acid and cell proliferation in head and neck squamous cell carcinoma.

Metabolism 2004;53(8):1007–12.

112. Tang X.H., Vivero M., Gudas L.J. Overexpression of CRABPI in suprabasal keratinocytes enhances the proliferation of epidermal basal keratinocytes in mouse skin topically treated with all-trans retinoic acid.

Exp Cell Res 2008;314(1):38–51.

113. Chen A.C., Yu K., Lane M.A., Gudas L.J. Homozygous deletion of the CRABPI gene in AB1 embryonic stem cells results in increased CRABPII gene expression and decreased intracellular retinoic acid concentration. Arch Biochem Biophys 2003;411(2):159–73.

114. Venepally P., Reddy L.G., Sani B.P. Analysis of the effects of CRABP I expression on the RA-induced transcription mediated by retinoid receptors. Biochemistry 1996;35(31):9974–82.

115. Persaud S.D., Lin Y.W., Wu C.Y. et al.

Cellular retinoic acid binding protein I mediates rapid non-canonical activation of ERK1/2 by all-trans retinoic acid. Cell Signal 2013;25(1):19–25.

116. Kainov Y., Favorskaya I., Delektorskaya V. et al. CRABP1 provides high malignancy of transformed mesenchymal cells and contributes to the pathogenesis of mesenchymal and neuroendocrine tumors.

Cell Cycle 2014;13(10):1530–9.

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2,

16

ТОМ 2 117. Lind G.E., Kleivi K., Meling G.I. et al.

ADAMTS1, CRABP1, and NR3C1 identified as epigenetically deregulated genes in colorectal tumorigenesis. Cell Oncol 2006;28(5–6):259–72.

118. Lee H.S., Kim B.H., Cho N.Y. et al.

Prognostic implications of and relationship between CpG island hypermethylation and repetitive DNA hypomethylation in hepatocellular carcinoma. Clin Cancer Res 2009;15(3):812–20.

119. Tanaka K., Imoto I., Inoue J. et al.

Frequent methylation-associated silencing of a candidate tumor-suppressor, CRABP1, in esophageal squamous-cell carcinoma.

Oncogene 2007;26(44):6456–68.

120. Huang Y., de la Chapelle A., Pellegata N.S. Hypermethylation, but not LOH, is associated with the low expression of MT1G and CRABP1 in papillary thyroid carcinoma.

Int J Cancer 2003;104(6):735–44.

121. Hawthorn L., Stein L., Varma R. et al.

TIMP1 and SERPIN-A overexpression and TFF3 and CRABP1 underexpression as biomarkers for papillary thyroid carcinoma.

Head Neck 2004;26(12):1069–83.

122. Fontaine J.F., Mirebeau-Prunier D., Raharijaona M. et al. Increasing the number of thyroid lesions classes in microarray analysis improves the relevance of diagnostic markers.

PloS One 2009;4(10):e7632.

123. Pfoertner S., Goelden U., Hansen W. et al. Cellular retinoic acid binding protein I:

expression and functional influence in renal cell carcinoma. Tumour Biol 2005;26(6): 313–23.

124. Miyake T., Ueda Y., Matsuzaki S. et al.

CRABP1-reduced expression is associated with poorer prognosis in serous and clear cell ovarian adenocarcinoma. J Cancer Res Clin Oncol 2011;137(4):715–722.

125. Lu Y., Lemon W., Liu P.Y. et al. A gene expression signature predicts survival of patients with stage I non-small cell lung cancer. PLoS Med 2006;3(12):e467.

126. Wu X., Blanck A., Norstedt G. et al.

Identification of genes with higher expression in human uterine leiomyomas than in the corresponding myometrium. Mol Hum Reprod 2002;8(3):246–54.

127. Banz C., Ungethuem U., Kuban R.J. et al. The molecular signature of endometriosisassociated endometrioid ovarian cancer differs significantly from endometriosis-independent endometrioid ovarian cancer. Fertil Steril 2010;94(4):1212–7.

128. Ishibe T., Nakayama T., Aoyama T. et al.

Neuronal differentiation of synovial sarcoma and its therapeutic application. Clin Orthop Relat Res 2008;466(9):2147–55.

129. Perez-Castro A.V., Tran V.T., NguyenHuu M.C. Defective lens fiber differentiation and pancreatic tumorigenesis caused by ectopic expression of the cellular retinoic acid-binding protein I. Development 1993;119(2):363–75.

В.Е. Шевченко1, А.В. Оленич2, Н.Е. Арноцкая1 1

НИИ канцерогенеза ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина»; Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; 2 Медицинский научный центр «МедБиоСпектр»; Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24, стр. 8 Контакты: Валерий Евгеньевич Шевченко vshev@nm.ru

Рак предстательной железы (РПЖ) занимает 2-е место в мире по распространенности среди злокачественных опухолей у мужчин. Протеомика представляет перспективный подход для открытия новых маркеров, которые могут улучшить эффективность лечения больных РПЖ. Для диагностики, прогноза и оценки эффективности терапии заболевания необходимы более специфичные и чувствительные маркеры, чем специфический антиген предстательной железы. Кроме того, протеомика может идентифицировать новые важные молекулярные мишени для терапии РПЖ. В настоящее время изучаются несколько возможных источников биомаркеров РПЖ, каждый из которых имеет свои достоинства и недостатки, включая ткань, мочу, сыворотку и плазму крови, секрет предстательной железы. Инновационные высокотехнологичные протеомные платформы сейчас идентифицируют и количественно определяют новые специфичные и чувствительные биомаркеры для обнаружения, стратификации и лечения РПЖ. Однако многие из них все еще далеки от использования в клинической практике. В этом обзоре обсуждаются последние достижения в протеомных исследованиях РПЖ, уделяется особое внимание открытию биомаркеров и их применению в клинической практике для диагноcтики, прогноза течения заболевания и стратификации больных. Ключевые слова: рак предстательной железы, протеомика, биомаркеры, масс-спектрометрия, опухолевая ткань, жидкости организма

DOI: 10.17 650 / 2313-805X. 2015.2.2.17–28 The proteomics in prostate cancer biomarker discovery V.E. Shevchenko1, A.V. Olenich2, N.E. Arnotskaya1 1

Research Institute of Carcinogenesis, N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center; 24 Kashirskoye Shosse, Moscow, 115478, Russia; 2 Medical Scientific Center “MedBioSpectr”; 24 bldg 8 Kashirskoye Shosse, Moscow, 115478, Russia

Prostate cancer (PC) represents the second most frequent type of tumor in men worldwide. Proteomics represents a promising approach for the discovery of new biomarkers able to improve the management of PC patients. Markers more specific and sensitive than prostate-specific antigen are needed for PC diagnosis, prognosis and response to treatment. Moreover, proteomics could represent an important tool to identify new molecular targets for PC tailored therapy. Now several possible PC biomarkers sources, each with advantages and limitations, are under investigation, including tissues, urine, serum, plasma and prostatic fluids. Innovative high-throughput proteomic platforms are now identifying and quantifying new specific and sensitive biomarkers for PC detection, stratification and treatment. Nevertheless, many putative biomarkers are still far from being applied in clinical practice.

This review aims to discuss the recent advances in PC proteomics, emphasizing biomarker discovery and their application to clinical utility for diagnosis and patient stratification.

Key words: prostate cancer, proteomics, biomarkers, mass spectrometry, tumor tissues, body fluids

Введение Рак предстательной железы (РПЖ) – 2-е наиболее распространенное онкологическое заболевание и 6-е по смертельным исходам у мужчин в мире [1, 2]. Только у 8 % больных РПЖ становится клинически выраженным, а большинство живут с локализованной формой болезни с 5-летним сроком выживаемости [3]. Напротив, в случае агрессивного течения болезни с появлением отдаленных метастазов в печень, легкое, мозг и особенно кости выживаемость уменьшается до 30 % [1]. В настоящее время для диагностики РПЖ у мужчин старше 50 лет рекомендовано определение простатического специфического антигена (ПСА) в крови

вместе с пальцевым ректальным обследованием (ПРО). Эта скрининговая методика помогает обнаруживать РПЖ у больных без любых явных симптомов и приводит к снижению летальности от РПЖ и увеличению выживаемости. К сожалению, высокие уровни ПСА (> 4 нг / мл) в крови не обязательно указывают на наличие РПЖ [4], а могут обнаруживаться также при воспалении (простатит) или доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ). Основная проблема при ПСА-тестировании – число ложноотрицательных результатов, возникающих из-за используемой в настоящее время скрининговой методологии: у 15 % больных при уровне ПСА < 4 нг / мл и отрицательных результатах ПРО все же

2015

Протеомика в открытии маркеров рака предстательной железы

17

2,

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

2015

обнаруживается РПЖ с суммой баллов по шкале Глисона (индекс Глисона) ˃ 7 [4]. По этим причинам ПСА предлагают рассматривать скорее как маркер объема предстательной железы, а не как маркер наличия злокачественной опухоли. Несмотря на то что определение ПСА уменьшило показатель смертности от РПЖ на 20 %, тем не менее в большинстве случаев наблюдается вялотекущая форма РПЖ. Помимо ранней диагностики РПЖ, различия в показателях заболеваемости и смертности на первый план выдвигают дифференциальную диагностику агрессивного и вялотекущего рака в целях адекватного лечения пациентов с агрессивной формой болезни. В настоящее время лечение РПЖ во многом зависит от стадии болезни, вида рака и возраста больного. Стадия РПЖ оценивается по классической системе TNM, обеспечивающей важную информацию о локализации болезни, в то время как вид РПЖ определяется морфологическим анализом, определяющим уровень дифференцировки ткани. Низкий индекс Глисона указывает на дифференцированный рак, который с меньшей вероятностью может метастазировать. Несмотря на существование специфических методов лечения для каждой стадии РПЖ, до сих пор нет никаких маркеров, отличающих агрессивную болезнь от вялотекущей формы, независимо от индекса Глисона. К сожалению, даже если гистологический анализ и индекс Глисона достаточно эффективно предсказывают исход лечения для большинства больных РПЖ с показателями < 6 и > 7, гистология не дает клинически полезную информацию для больных РПЖ с индексом Глисона 6 и 7, для которых эффект терапии все еще остается непредсказуемым. Кроме того, этот вид скрининга не является на 100 % специфичным и чувствительным для идентификации агрессивной болезни при значениях < 6 и вялотекущей болезни при показателе > 7. Андрогеннезависимый РПЖ может возникнуть при клональном отборе из гипермутированных клеток на фоне аблационной терапии, который определяет развитие опухоли и фатальный результат. Избежать развития андрогеннезависимого РПЖ – другая проблема при лечении РПЖ, и с этой целью важно установить, когда опухоль станет гормонорефрактерной, и разработать новую специфическую терапию. Новые биомаркеры РПЖ должны ответить на несколько важных клинических вопросов. Имеет ли пациент рак или доброкачественную опухоль? Требуется ли биопсия? Рак вялотекущий или агрессивный? Какой вид лечения наиболее адекватен? Белковые маркеры рака – протеины, присутствующие в жидкостях организма или в тканях, которые могут отражать наличие злокачественной опухоли и указывать на ее агрессивность, стадию процесса и реакцию на терапию. Биомаркеры можно разделить на несколько категорий [5]: • диагностические скрининговые биомаркеры – белки, которые используются для обнаружения рака

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2,

18

ТОМ 2 у человека. Они должны иметь высокую чувствительность и специфичность; • прогностические биомаркеры, которые используются для предсказания течения заболевания, включая рецидив и агрессивность. Они полезны, когда статус болезни установлен и необходимо провести более адекватное лечение; • биомаркеры стратификации – белки, которые предсказывают реакцию на определенную терапию, позволяя разделять пациентов на отвечающих и не отвечающих на терапию. Они могут быть идентифицированы при анализе молекулярного профиля тканей и могут представлять собой панели определенных белков, коррелирующие с реакцией на терапию. Биомаркеры стратификации не обязательно должны быть опухолеспецифическими [5]. Открытие новых белковых маркеров в крови, моче или ткани может помочь при разработке более чувствительных и специфичных диагностических и прогностических тестов РПЖ, позволяет раньше обнаружить и начать лечение пациентов с агрессивной болезнью и одновременно исключать передозировки для случаев с низким риском. Протеомика вместе с инновационными высокопроизводительными технологиями может быть перспективным подходом при идентификации новых биомаркеров для обнаружения рака и проведения терапии. Недавние достижения в протеомике создают мощные платформы, которые в состоянии не только обнаружить белки, но также определить их количество в ткани и во многих жидкостях организма (моча, кровь, семенная жидкость). В обзоре обсуждаются новые достижения протеомики в области РПЖ, особое внимание уделяется открытию и идентификации биомаркеров и их возможному будущему клиническому применению в диагностике и стратификации пациентов. Биомаркеры ткани Ключ к более эффективному диагнозу, прогнозу и предсказанию эффекта терапии РПЖ находится в анализе самой опухолевой ткани. При анализе протеома ткани можно приоткрыть механизмы, лежащие в основе трансформации нормальных клеток предстательной железы в опухолевые клетки, которые впоследствии приобретают способность к метастазированию. Фактически эти процессы регулируются сложными белковыми сетями, передающими биологические сигналы, и протеомной архитектурой через посттрансляционные эпигенетические модификации, например фосфорилирование. Статус фосфорилирование / активация непосредственно не коррелирует с уровнем транскрипции. По этим причинам, а также потому, что белки – функциональные единицы этих сигнальных путей, протеомные технологии стали мощным инструментом при открытии новых мишеней для лекарственных средств и маркеров для ранней диагностики или кандидатных вакцин.

2015

РПЖ не основаны на определении уровней РА. Главная цель этих усилий – найти специфичные биомаркеры, способные отличать РПЖ от ДГПЖ, идентифицировать агрессивный рак и оптимизировать его лечение, а также предотвратить передозировку препаратами пациентов из группы с низким риском прогрессии. Важная начальная задача протеомного исследования – охарактеризовать молекулярные изменения в пределах онкогенеза РПЖ, используя взятую у тщательно отобранных пациентов нормальную ткань, неопластический эпителий, эпителий, изолированный из инвазивного фронта, и эндотелиальные клетки. Это исследование показало, что анализ SELDI-MS совместно с ЛМД может быть полезным инструментом для идентификации новых диагностических биомаркеров [6]. В дальнейшем другое подобное исследование продемонстрировало, что экспрессия 24 протеинов была специфичной для РПЖ и обнаружена в 16 (94 %) из 17 образцов РПЖ, но не в отобранных нормальных клетках и ни в одном из 12 образцов ДГПЖ [11]. Кроме того, авторы идентифицировали протеин с m / z 24 782 Да, присутствие которого коррелировало с наличием РПЖ. 2D-DIGE c протеомным MS-анализом образцов ткани РПЖ в сравнении с нормальной тканью тех же самых пациентов показал, что дифференциально экспрессируемые белки (ДЭБ) в этих 2 группах тканей вовлечены в развитие опухолевого процесса и принадлежат, по данным Gene Ontology, группам семейства HSP, сигнальных трансдукторов, метаболических ферментов, опухолеассоциированных протеинов и протеинов, контролирующих цитоскелетную перестройку и окислительный стресс. Системный подход к биологическим процессам доказал также, что все эти белки связаны в сети с центральными движущими элементами – c-MYC, p53, РА и ПСА, которые, как известно, являются ключевыми регуляторами при возникновении и прогрессии РПЖ и потенциальными мишенями для терапии [12]. Согласно опубликованным данным, высокодифференцированная простатическая интраэпителиальная неоплазия (ВДПИН) – наиболее вероятный предшественник аденокарциномы предстательной железы. Клеточная морфология ВДПИН подобна аденокарциноме, хотя в отличие от рака она сохраняет клетки базального слоя [13]. Проводился протеомный анализ ЛМД обогащенных клеток из нормальной ткани, ВДПИН и РПЖ (индекс Глисона 3), полученных из 22 образцов после радикальной простатэктомии. При анализе идентифицирован белок GDF15, который был экспрессирован в 19 из 27 случаев РПЖ, 3 из 8 случаев ВДПИН и ни в одном из образцов нормальной ткани. Основываясь на этих данных, авторы предположили, что GDF15 мог быть маркером раннего онкогенеза предстательной железы [14]. В других исследованиях предпринята попытка обнаружить группы маркеров для РПЖ и ДГПЖ. В каче-

19

2,

Важный фактор, который должен учитываться при протеомном анализе, заключается в том, что опухолевая ткань обычно не образуется группой гомогенных клеток. Напротив, она состоит из множества различных клеточных субпопуляций (фибробласты, нервные клетки, эндотелиальные клетки, опухолеинфильтрирующие лимфоциты, эпителиальные клетки и т. д.), которые имеют перекрестные связи друг с другом и взаимодействуют, поддерживая рост опухоли. Для изучения сигнальных путей, ответственных за начало и прогрессию РПЖ, важно демонтировать эту сложную экосистему ткани. Изоляция чистых субпопуляций клеток из гетерогенной ткани являлась проблемой при разработке протеомного анализа, которую преодолели введением таких методов, как сортер клеток и лазерная микродиссекция (ЛМД) [6]. Белки, экстрагированные из отобранных клеток, могут быть проанализированы с помощью прямо-/обратно-фазовых микрочипов или масс-спектрометрии (MS). Наиболее широко используемые MS-платформы включают двумерный электрофорез с последующим MSанализом (2DE-MS), MS c ассоциированной с матрицей лазерной десорбцией / ионизацией (matrix-assisted laser desorption / ionization, MALDI-MS), MS с усиленной поверхностью лазерной десорбцией / ионизацией (surface-enhanced laser desorption / ionization, SELDIMS), а также высокоэффективную хроматографию – тандемную MS (LC-MS/MS), позволяющие проводить качественный анализ протеома [7]. Только совсем недавно был введен метод изобарных мишеней для относительного и абсолютного количественного анализа (isobaric tag for relative and absolute quantitation, iTRAQ), который дает возможность количественно проанализировать изменения протеома [8]. Один из наиболее успешно используемых тканевых белковых маркеров для прогноза и предсказания РПЖ – без сомнения, рецептор андрогенов (РА). РА – ключевые регуляторы роста РПЖ, стимулирующие пролиферацию и торможение апоптоза опухолевых клеток. Однако один только РА-сигнальный путь недостаточен для поддержания роста опухоли и ее прогрессии, особенно в период поздних стадий РПЖ. В действительности прогрессирование РПЖ также поддерживается секреторными стромальными паракринными медиаторами, такими как IGF, FGF и EGF [9]. Перекрестная связь между опухолевым эпителием и его микроокружением активирует ряд тирозинкиназных рецепторов (например, IGFR, FGFR и EGFR), которые вместе с РА-сигналингом стимулируют выживание клеток РПЖ и их пролиферацию [10]. Понимание молекулярных механизмов, стимулирующих возникновение опухоли и ее прогрессию, приведет к идентификации более специфичных и потенциальных РПЖ-диагностических и прогностических биомаркеров, а также терапевтических мишеней. Недавно проведенные протеомные исследования для оптимизации постановки диагноза и прогноза

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

2015

стве примера можно привести исследование A.A. Alaiya et al., которые охарактеризовали экспрессию набора протеинов свежей ткани, взятой от 8 пациентов с РПЖ и 16 – с ДГПЖ. Протеомный анализ был выполнен с использованием анализов 2D-GE и MALDI-MS. Авторы нашли панель из 22 гипотетических биомаркеров, которые были дифференциально экспрессированы между ДГПЖ и РПЖ, и 15 из них, как уже сообщалось ранее, выявлены и в других лабораториях. Обнаруженные уровни disulfide-isomerase, 14-3-3-protein, enoyl CoA-hydrase, prohibitin и B-tubulin β-2 были выше в образцах РПЖ, в то время как уровни Keratin-II, desmin, HSP71, ATP-synthase-β-chain и creatine kinase-βchain – в образцах ДГПЖ. Авторы пришли к заключению, что эта панель может успешно разделить образцы ДГПЖ и РПЖ, а также РПЖ начальной стадии и высокодифференцированный РПЖ [15]. Базальные клетки играют важную, но еще до конца не ясную роль в запуске дифференцировки и росте нормального секреторного эпителия предстательной железы. Хорошо известно, что инвазия РПЖ сопровождается разрушением слоя базальных клеток и инфильтрацией стромы раковыми клетками [16]. Некоторые исследователи предполагают, что потеря функции базальных клеток может иметь важное значение при трансформации интраэпителиальной неоплазии предстательной железы в инвазивный рак.

J. I. Diaz et al. идентифицировали с помощью ЛМД и SELDI-MS специфический протеомный профиль для базальных клеток [17]. Другое недавно проведенное исследование, используя MS, продемонстрировало, что CRABP2 (cellular retinoic acid-binding protein 2) имеет пониженную экспрессию в базальных клетках доброкачественной опухоли предстательной железы в сравнении с РПЖ и простатитом. Аналогичное исследование проводилось для идентификации ДЭБ между эпителиальным и стромальным компонентами при РПЖ, простатите и в нормальной предстательной железе после изоляции различных клеточных субпопуляций. Caspase-1 и interleukin-18 receptor 1 были высокоэкспрессированы в лейкоцитах РПЖ, Wnt-3 имел пониженную экспрессию в эндотелиальных клетках ткани при простатите, tyrosine phosphatase non-receptor type 1 обнаружен только в нормальных и доброкачественных эндотелиальных клетках, poly ADP-ribose polymerase 14 имела пониженную экспрессию в миофибробластах ткани предстательной железы при простатите и, что интересно, integrinα-6 оказался высокоэкспрессирован в эпителии РПЖ, но абсолютно отсутствовал в миофибробластах РПЖ [18]. Некоторые исследователи сообщили об обнаружении потенциальных биомаркеров метастазирования в лимфатические узлы (lymph nodes metastssis, LNM) при РПЖ (LNM). X. Gao et al. показали, что CRPM4 (collapsing response mediator protein-4) является супрессором метастазирования, так как его экспрессия приводит к обратно пропорциональной кор-

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2,

20

ТОМ 2 реляции с LNM у исследованных пациентов [19].

J. Pang et al. идентифицировали 58 белков, которые были ДЭБ между группой LNM и группой больных РПЖ без регионарных метастазов. Среди этих белков 6 имели отношение к метастазированию (e-FABP5, MCCC2, PPA2, Ezrin, SLP2 и SM2) и, видимо, представляют собой новые гипотетические маркеры LNM при РПЖ [20]. Кроме необходимости отличать агрессивный рак от локализованной болезни, другая цель при исследовании РПЖ состоит в том, чтобы различать опухоли c низкими и высокими индексами Глисона. В недавнем исследовании с использованием 2D-DIGE в комбинации с ЛМД и MALDI-MS проанализированы образцы ткани после радикальной простатэктомии доброкачественной и злокачественной опухоли, полученные от 23 больных РПЖ с индексом Глисона 6 и 23 больных с индексом Глисона ≥ 8. В результате идентифицированы 19 ДЭБ, половина из которых была связана с гликолизом и имела повышенную экспрессию в опухолевой ткани. Среди них lamin A с высокой статистической достоверностью различал образцы с низкими и высокими индексами Глисона, и поэтому данный белок может представлять собой новый биомаркер дифференцировки опухоли и прогноза заболевания [21]. В процессе трансформации и прогрессии РПЖ возникает много изменений в структуре белков и путей активации, частично из-за накопления мутаций генов. К настоящему времени зарегистрировано ≥ 600 мутаций для одного только гена AR [22], и многие из них оказывали влияние на образование РА-протеинового комплекса и сигнальную трансдукцию.

M. Paliouras et al. недавно представили результаты протеомного профилирования 3 РА-генетических вариантов. Применив методы системной биологии, исследователи смогли построить профиль сети белкового взаимодействия для каждого РА-варианта, показывающий, что различные изоформы дифференцированно активизируют нисходящие сигнальные пути, влияющие на исход болезни [23]. Вышеупомянутые исследования применяли полуколичественный или качественный методы, однако введение iTRAQ-технологии помогает количественно анализировать протеом, идентифицируя новые потенциальные диагностические и прогностические тканевые маркеры, с использованием методов стабильных изотопов, которые дают возможность непосредственно сравнить результаты протеомного анализа между любыми 2 образцами. В последние несколько лет опубликованы результаты исследований, в которых с помощью этой технологии выполнялся количественный протеомный анализ РПЖ. С. Sun et al. проанализировали биоптаты предстательной железы, используя iTRAQ, и установили, что periostin значительно выше экспрессирован при РПЖ по сравнению с ДГПЖ, что дает возможность рассматривать его как многообещающий прогностический биомаркер и терапев-

Биомаркеры в биологических жидкостях Скрининг, основанный на тестировании биологических жидкостей, очень привлекателен из-за минимальной инвазивности, быстроты и дешевизны процедуры сбора клинических образцов. Моча, секрет предстательной железы и семенная плазма в настоящее время широко изучаются вместе с сывороткой / плазмой для идентификации биомаркеров РПЖ [34–37]. Биологические жидкости не только удобны, но и фактически представляют собой важный источник маркеров опухолевого роста, так как трансформированные клетки могут продуцировать и высвобождать эти белки в циркуляцию. При РПЖ проксимальные жидкости, такие как секрет предстательной железы и семенная плазма, могли бы быть, вероятно, высокочувствительными и специфичными биомаркерами, так как содержат в высокой концентрации белки клеток предстательной железы [38]. Для открытия циркулирующих маркеров использовались 2 главных протеомных подхода: • прямое исследование проксимальных или дистальных жидкостей организма, собранных от больных раком или здоровых контрольных групп [29, 39, 40]; • анализ клеточного супернатанта, который содержит секретируемые белки. Эти белки реализуются

2015

скими биомаркерами и терапевтическими мишенями для РПЖ [30]. К сожалению, до настоящего времени эти данные все еще не валидированы на клинических образцах. Многие авторы подтверждают результаты исследований, использующих ИГХ-методы, при анализе тканей животных и / или клинического материала. А. Glen et al. доказали высокую экспрессию gp96 в образцах метастазов [31], а исследование S. D. Garbis et al. показало, что α-methylacyl CaA racemase (AMACR) и prostate-specific membrane antigen (PSMA) являются маркерами для РПЖ [32]. Некоторые исследователи попытались объединить ряд биомаркеров, специфичных для различных стадий РПЖ, в мультиплексные наборы, которые могли бы различать вялотекущую и агрессивную формы рака. Так, A. K. Yocum et al. [33] использовали метод селективного мониторинга реакций в тандемной MS (SRM-MS/MS) и объединили его с введением меченных стабильными изотопами внутренних стандартов, чтобы обеспечить начальную валидацию открытым биомаркерам. Авторы выбрали 3 различных белка: AMACR – маркер для агрессивной локальной опухоли при переходе к метастатической болезни, EZH2 – биомаркер для агрессивной формы РПЖ и ПСА, протестированных в серии из хорошо изученных клеточных линий РПЖ, и впоследствии в гистологических препаратах. У этой группы белков, вероятно, есть хороший потенциал дифференцировать доброкачественную опухоль от локализованного РПЖ.

21

2,

тическую мишень [24, 25]. Другое исследование, проведенное на экспериментальной модели РПЖ методом количественной протеомики, продемонстрировало, что снижение экспрессии EPLIN (еpithelial protein lost in neoplasm) – важное событие для активации эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП). Особенно EPLIN влияет на процессы образования межклеточных контактов, действуя как отрицательный регулятор ЭМП [26]. Используя метод MALDI-MS в сочетании с микроэкстракцией, J. Quanico et al. обнаружили увеличение экспрессии growth differentiation factor 15, hypoxia upregulated protein 1, periostin и poly (ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1) в биоптатах опухолевой ткани больных РПЖ по сравнению с нормальной тканью [27]. В другом исследовании идентифицировали и валидировали новые потенциальные биомаркеры РПЖ для диагностики пациентов с биохимическим рецидивом и без него. Авторы анализировали образцы ткани предстательной железы с помощью двумерного дифференциального гель-электрофореза и LC-MS / MS и обнаружили снижение экспрессии secernin-1 и значительное увеличение vinculin в опухолевой ткани [28]. Полученные данные подтверждены вестерн-блоттингом и иммуногистохимическими (ИГХ) методами. Результаты исследования указывают на то, что secernin-1 и vinculin относятся к новым тканевым биомаркерам для диагностики и прогноза РПЖ. Для валидации измеряли уровни этих белков в моче вестерн-блоттингом. Уровни vinculin у больных РПЖ были значительно выше, чем у пациентов без рака.

MS-анализ с мониторингом множественных реакций (MRM-МS) показал значительно более высокие концентрации prostatic acid phosphatase в моче у больных РПЖ по сравнению с контролем, в то время как уровни galectin-3 значительно снижены в моче у больных с биохимическим рецидивом по сравнению с таковыми без рецидива. По мнению авторов, техника MRMМS имеет большие перспективы для проведения неинвазивной клинической диагностики РПЖ. Протеомика также используется в фундаментальных исследованиях по поиску новых взаимодействий между белками, которые могли бы помочь при идентификации новых прогностических биомаркеров. В частности, это относится к SOX4, транскрипционному фактору, который требуется для дифференцировки и пролиферации во многих тканях в процессе развития организма. Анализ протеомов множества клеточных линий РПЖ обнаружил взаимодействие между SOX4 и plakoglobin, раскрывающее новую роль SOX4 в прогрессии РПЖ [29]. Другое исследование показало, что экспрессия белков TRK-fused gene (TFG) и РПЖ-специфического Pin1 binding proteins (PINBPs) избирательно повышена в клетках линий РПЖ и тканях, и поэтому эти белки могут быть потенциальными диагностическими и / или прогностиче-

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

2015

в микросреду, откуда могут достигнуть проксимальных жидкостей и кровяного русла [41–43]. Кондиционированные среды линий злокачественных клеток предстательной железы (LNCaP) и клеток ДГПЖ (BPH-1) анализировали двумерным электрофорезом с последующим анализом MALDI-MS. Авторы идентифицировали 11 ДЭБ, которые имели повышенное содержание в кондиционированной среде (LNCaP), включая creatine kinase, brain (CKB), isocitrate dehydrogenase 2 (NADP+) (IDH2), aldo-keto reductase family 1 member A1 (AKR1A1), glyoxalase I (GLO I), triosephosphate isomerase 1 (TPI1) и cyclophilin [42]. Использование кондиционированной среды имеет некоторые преимущества, так как специфичные белки, связанные с опухолевыми клетками, идентифицируются быстро, и эта клеточная среда – очень простая матрица для анализа по сравнению с такой биологической жидкостью, как сыворотка. В то же время клеточная культура не может точно моделировать естественные условия микросреды ткани и особенно организма, и биомаркеры, идентифицированные ex vivo, могут быть не столь полезны в клинике. Тем не менее для идентификации потенциальных маркеров такой подход может быть весьма информативным. Многие высокопроизводительные протеомные подходы, основанные на MS и белковых чипах, разработаны и применялись в преклинических исследованиях с главной целью одновременно анализировать множество образцов или множество протеинов [44–48]. Действительно, онкологические патологии могут быть хорошо поняты только при изучении множества факторов, которые вовлекаются в биологию опухоли. Следовательно, точный скрининговый тест должен анализировать набор биомаркеров, а затем необходимы технологии измерения для выполнения скрининга большого количества образцов в клинических условиях. Капиллярный электрофорез, объединенный с MS (CE / MS), применялся для выполнения протеомного профилирования мочи. Мочу от 51 больного РПЖ и 35 индивидов с отрицательной биопсией анализировали для идентификации группы полипептидов, которые могут детектировать РПЖ. Авторы идентифицировали информативную группу полипептидов мочи, подтверждающую наличие секрета предстательной железы и являющуюся источником соответствующих биомаркеров предстательной железы. Белки, идентифицированные как кандидатные биомаркеры, включали сollagen α-1 (III), сollagen α-1 (I) и рsoriasis susceptibility 1 candidate gene 2 protein [39–68]. Группа биомаркеров была валидирована в слепом тесте на панели из 213 образцов (118 РПЖ и 95 с отрицательной биопсией). РПЖ был обнаружен с чувствительностью 89 % и специфичностью 51 %. Учет возраста и процента свободного ПСА увеличил показатели чувствительности и специфичности протеомного набора (91 и 69 % соответственно) [49]. Эффективность анализа, основанного на CE / MS, оценивали при его использовании

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2,

22

ТОМ 2 в клинике. В группе из 184 пациентов удалось правильно диагностировать 42 из 45 больных раком и 79 из 124 пациентов без рака (чувствительность 86 % и специфичность 59 %). Кроме того, MS-платформа показала хорошую аналитическую точность, в то время как отношение стоимость / эффективность было уменьшено за счет сокращения числа требуемых биопсий и, таким образом, уменьшения риска возникновения РПЖ, связанного с ними [50]. Профилирование сыворотки выполняли, используя микрочипы с антителами, нанесенными в виде пятен на полиакриламидный гидрогель на стекле. При анализе около 180 различных белков идентифицировано 5 потенциальных биомаркеров (von willebrand factor, immunoglobulin M, аlpha1-antichymotrypsin, villin и immunoglobulin G) [51]. Биологические механизмы, поддерживающие развитие рака и его прогрессирование, очень сложные и определяются высокой гетерогенностью опухоли [52, 53]. Сейчас многие исследователи считают, что единичный биомаркер не может обеспечить необходимую чувствительность и специфичность для клинического скринингового теста из-за гетерогенности рака и необходимости отличать онкологическую патологию от значительно более распространенных воспалительных и доброкачественных болезней. Поэтому исследователи начали проверять эффективность тестов, основанных на панели из множества маркеров. Представлен интересный подход, использующий мультимолекулярные тесты или пробы различных жидкостей организма. Недавно прошел оценку мультимолекулярный тест для диагностики РПЖ. Анализ включал измерение уровней антител AMACR и белка MMP-2 в крови больных РПЖ и одновременно анализ статуса гиперметилирования 2 генов GSTP1 / RASSF1A [54]. В работе проанализировали образцы сыворотки и мочи от 113 мужчин. По данным ROC-кривой (receiver operating characteristic curve), чувствительность, специфичность, положительные и отрицательные прогнозирующие величины для мультимолекулярного анализа составили 57,1; 96,6; 88,9, и 82,4 % соответственно при AUC (area under ROC curve) 0,788 ± 0,07. Данные показали значительное уcиление специфичности при диагностике РПЖ по сравнению с одним ПСА (в этом исследовании: специфичность 17,7 %, чувствительность 97,1 %, положительное прогнозирующее значение 33,7 % и отрицательное прогнозирующее значение 93,3 %). За прошедшее время накоплена масса информации по новым кандидатным биомаркерам РПЖ в биологических жидкостях. Большинство экспериментальных исследований все еще должно валидироваться на больших клинических выборках. Поскольку эти маркеры идентифицированы различными методами и с учетом их роли в биологии РПЖ, есть большая уверенность в их полезности. Потенциальные маркеры включают,

Маркеры биологических жидкостей для прогноза рака предстательной железы Beta-2-microglobulin (β2M), beta-цепь главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I, определен как потенциальный маркер агрессивности РПЖ. В 2007 г. М. Gross et al. идентифицировали β2M методом SELDI-TOF MS в питательных средах клеток LNCaP после андрогенной стимуляции [56]. Экспрессия β2M модулирует андрогензависимую реакцию роста в клетках LNCaP [55]. Высокий уровень β2M измеряли в сыворотке [54] и в секрете предстательной железы [37] больных с метастатическим РПЖ с учетом того, что β2M-экспрессия коррелирует с агрессивными патологическими особенностями в образцах с первичным РПЖ [55]. Недавно продемонстрировано, что β2M модулирует ЭМП, усиливая агрессивность рака и провоцируя образование метастазов in vivo [70].

Zinc alpha2-glycoprotein (ZAG) – секретируемый белок, ответственный за деградацию липидов в адипоцитах, присутствует во многих биологических жидкостях, таких как кровь, семенная плазма, моча и слюна. Высокие уровни ZAG были найдены в семенной плазме больных РПЖ в отличие от образцов здоровых доноров [71]. Недавно при исследовании методом 2DDIGE образцов сыворотки крови пациентов с различными стадиями РПЖ нашли увеличение уровня ZAG в 1,3 раза в сыворотке больных РПЖ с индексом Глисона 7 по сравнению с пациентами с более ранними стадиями рака (индекс Глисона 5) [72]. Полученный результат валидирован методом иммуноферментного анализа (ELISA) на большем количестве образцов, но не был подтвержден IHC-анализами, которые фактически демонстрировали обратно пропорциональную зависимость между экспрессией белка и стадией РПЖ. Авторы сообщили о существовании 2 различных форм ZAG в крови и семенной плазме. Первая изоформа, возможно, продуцируется гепатоцитами, в то время как вторая производится столбчатыми эпителиальными клетками предстательной железы, и это, вероятно, объясняет различия между их экспрессией в тканях и сыворотке. Другие исследования идентифицировали новые прогностические факторы для оценки выживания неметастатического резистентного к кастрации РПЖ (mCRPC) [73]. В исследовании использован протеом-

2015

[69]. Авторы обнаружили несколько пептидов, производных osteopontin (SPP1) и prothrombin (F2), уровни которых были снижены у больных РПЖ по сравнению c ДГПЖ. Диагностическая точность по данным AUC для SPP1- и F2-пептидов составила 0,65–0,77 и 0,68– 0,72 соответственно. Кроме того, наблюдались существенные различия в уровнях pyridinoline (PYD) и deoxypyridinoline (DPD) у больных с РПЖ и ДГПЖ. Экскреция DPD и отношение уровней DPD / PYD изменялись в процессе развития РПЖ, увеличиваясь у больных с местно-распространенной опухолью.

23

2,

например, beta 2 microglobulin [55–57], zinc alpha2-glycoprotein (ZAG) [58–60], transforming growth factor-β1 [61–63], interleukin 6 [64–66]. CD90 [67], engrailed-2 (EN2) [68], fibronеctin 1 [57] и много других растворимых факторов и внутриклеточных белков, вовлеченных в структурные или метаболические функции клеток.

Engrailed-2 (EN2) – гомеодоменосодержащий транскрипционный фактор, экспрессирующийся в клеточных линиях и ткани РПЖ, но не в нормальной ткани предстательной железы. Он идентифицирован как кандидатный биомаркер мочи для PCaEN2 и детектирован вестерн-блоттингом у больных РПЖ, но не у индивидов с ВДПИН или ДГПЖ. EN2 измеряли методом ELISA в моче у больных РПЖ и в контрольных группах, зарегистрированных в 2 различных центрах. Уровни белка EN2 оказались в 10,4 раза выше у больных РПЖ по сравнению с контрольными группами. Даже при отсутствии заметной корреляции между экспрессией EN2 и комбинированным индексом Глисона наличие EN2 в моче позволяет отличить больных от индивидов контрольных групп с чувствительностью 66 % и специфичностью 88,2 % (AUC – 0,81) [68]. В свободном от клеток супернатанте, созданном после дайджеста в бессывороточной питательной среде коллагеназной ткани РПЖ и условно нормальной ткани, полученных при хирургической резекции предстательной железы, идентифицированы 3 различных CD90 (Thy-1) N-гликопептида от 2 различных N-гликосайтов [67]. Метод основан на предположении, что клетки остаются активными в питательной среде, продолжая реализовывать специфичные клеточные белки. CD90 показал приблизительно 5-кратное увеличение при раке против образцов неопухолевой ткани. ИГХ-анализ выявил сверхвысокую экспрессию CD90 в связанной с раком строме по сравнению с тканями нормальной стромы. Авторы решили протестировать мочу от больных раком на наличие фрагментов CD90, которые могли встречаться, если белок реализуется из опухолевых клеток. CD90-пептид идентифицировали в моче от больных РПЖ методом ICAT-MS / MS перед простатэктомией, но не после простатэктомии, подтверждая, что CD90 секретируется тканью РПЖ и может являться кандидатным биомаркером для неинвазивного теста [67]. Кроме того, используя анализ LC-SRM-MS, 7 MS/MS фрагментов определенного пептида к CD90, вариантный белок (инвентарный номер NCBI BAD92 446) идентифицирован в дооперационных образцах. Эта разновидность, как оказалось, была специфичной для опухолеассоциированных стромальных клеток, что делает CD90 еще более ценным кандидатным биомаркером в ткани и в моче. Для открытия биомаркеров РПЖ С. Li et al. исследовали образцы мочи после массажа предстательной железы от 28 больных РПЖ, 20 пациентов с ДГПЖ и 6 здоровых добровольцев, используя LC-MS / MS

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

2015

ный скрининг N-связанных гликопротеидов, выполненный на мышиной модели с потерей PTEN, описанной ранее I. Cima [74]. Как отмечалось ранее, потеря PTEN связана с плохим прогнозом для mCRPC. Подход, введенный I. Cima в 2011 г., включает 2 шага: 1) протеомное профилирование сыворотки и ткани от мышей и идентификацию кандидатных биомаркеров; 2) измерение отобранных биомаркеров в человеческих образцах для проверки гипотезы, предложенной при первом шаге. Для обнаружения новых прогностических факторов идентифицировали 79 белков в сыворотке 57 больных метастатическим раком, подвергнутых гормональной аблативной терапии. Белки отбирали по изменению их уровней после потери PTEN с использованием in vivo модели. Методом ELISA измеряли 13 белков, а методом SRM – остальные 66. Оптимальная панель из предсказательных маркеров состояла из 5 белков, включающих thrombospondin 1 (THBS1), CRP, PVRL1, MME и ephrin-A5 (EFNA5). Представленная панель давала AUC 0,955 (95 % доверительный интервал (ДИ) 0,909–0,992) и 0,943 (95 % ДИ 0,894–0,985) для прогнозирования опасности развития рака через 12 и 24 мес. Этот показатель уменьшает ошибку на 15 % по сравнению с прогностической моделью, предсказывающей выживаемость у мужчин с метастатическим РПЖ, предложенной S. Halabi в 2003 г. [57, 75]. Интересное всестороннее исследование для идентификации диагностических и прогностических биомаркеров, которые могли отличить агрессивный и вялолекущий РПЖ, выполнено I. Rehaman et al. [57]. Авторы собрали 4 пула сыворотки, которые включали больных с ДГПЖ, локализованным непрогрессирующим раком, локализованным прогрессирующим раком и метастатическим раком. Объединенные серологические образцы плазмы были обеднены в отношении 14 наиболее представленных протеинов сыворотки и проанализированы с использованием 4-плексного iTRAQ-подхода. Иерархический кластерный анализ данных показал высокое подобие между белковым профилем ДГПЖ и непрогрессирующим раком, в то время как метастатическая группа отличалась от всех других групп. Увеличение уровня eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1 (eEF1A1) наблюдалось при переходе от пациентов с ДГПЖ до больных прогрессирующим раком и поддерживалось у больных метастатическим раком. Afamin и fibronectin идентифицированы как потенциальные диагностические биомаркеры для рака начальной стадии. Действительно наблюдалось увеличение в 1,4 раза этих 2 белков при непрогрессирующем раке по сравнению с ДГПЖ. Много белков уже идентифицировано в качестве кандидатных биомаркеров РПЖ, включая CRP, alpha2-macroglobulin, ceruloplasmin, zinc-alpha-2-glycoprotein, beta-2-microglobulin и fibronectin. В этом исследовании

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2,

24

ТОМ 2 [55] подтвердили ранее полученные данные о повышенной экспрессии beta-2-microglobulin при поздних стадиях метастатического РПЖ [55]. Простасомы как источник биомаркеров рака предстательной железы Микровезикулы (MVB), продуцируемые опухолевыми клетками в биологические жидкости, представляют источник биомаркеров. MVB могут отслаиваться непосредственно от плазматической мембраны клеток (слущенные везикулы) или освобождаться из внутриклеточных мультивезикулярных телец, которые сливаются с плазматической мембраной. Многие физиологические функции связаны с MVB, представляющими собой транспортное средство коммуникации между соседними клетками, перенося молекулы, такие как белки mRNA и microRNA [76, 77]. Большое количество MVB в виде экзосом обнаружено в плазме больных раком по сравнению с контрольными группами при меланоме [78], раке ободочной и прямой кишки [79], РПЖ [78, 80] и других онкологических патологиях. Эти экзосомы, которые содержат белки, реализованные опухолью, и являются в некоторой степени клеточно-специфичными, важный новый материал для поиска новых биомаркеров [81].

MVB обнаружены во многих биологических жидкостях, таких как плазма, моча, семенная жидкость, слюна, грудное молоко и амниотическая жидкость. Однако жидкости организма содержат смесь MVB, происходящих из различных типов клеток, которые делают анализ и интерпретацию протеомных исследований достаточно трудными. Чтобы проанализировать белки, специфично принадлежащие опухолевым клеткам, протеом экзосом/микровезикул, продуцируемых метастатической линией клеток PC-3 в питательную среду, она была обработана SDS-PAGE и проанализирована нанокапиллярной жидкостной хроматографией – тандемной MS (nano LC-MS / MS) [82]. Эксперимент проводили 2 раза для оценки воспроизводимости метода. По 2 или более пептидам были идентифицированны 266 белков из 416. Идентифицированные белки включали integrins, heat shock proteins, белки, вовлеченные в транспорт везикул, клеточный сигналинг, и цитоскелетные белки. В качестве примера приводим 2 MVB-ассоциированных белка: CD63 и эндосомальный сортировочный комплекс (ESCRT), требуемый для транспорта Alix-белка (programmed cell death 6-interacting protein), – они обычно находятся в экзосомах и рассматриваются как экзосомальные маркеры. Интегрины, роль которых при раке активно изучается, как оказывается, вовлечены в закрепление экзосом к внеклеточному матриксу [82]. Белки, идентифицированные в простасомах, подтверждают гипотезу о том, что MVB, реализованные PC-3 клетками, являются экзосомами клеток предстательной железы. Сравнение содержания протеома, полученного из MVB клеток PC-3 с клетками рака

Использование [–2]proPSA для диагностики и прогноза рака предстательной железы Специфичность ПСА составляет только 12,8 %, если использовать пограничное значение для нормы 4 нг / мл [83], что приводит к большому количеству ложноположительных диагнозов и провоцирует до 75 % ненужных биопсий предстательной железы

Заключение Цель открытия биомаркеров состоит в том, чтобы идентифицировать определенные маркерные молекулы, в том числе и белки, которые в состоянии улучшить раннюю диагностику, прогноз и направление развития болезни и предсказать терапевтические результаты, облегчающие развитие новых терапевтических подходов. Некоторые наиболее перспективные биомаркеры обнаружены с помощью протеомных подходов и интенсивно валидируются. Так как РПЖ – гетерогенное заболевание со сложным микроокружением / патологией опухоли и широким диапазоном исходов болезни, усилия по открытию и валидации биомаркеров РПЖ для реальной клинической практики особенно заманчивы. Однако морфологическая гетерогенность самих образцов, индивидуальные особенности, зависящие от конкретного пациента, слабая чувствительность аналитических технологий для открытия биомаркеров и для их валидации делают идентификацию клинически полезных биомаркеров очень трудной.

2015

[84]. Повышенные уровни ПСА приводят к последующей передозировке препаратами при лечении вялотекущего РПЖ более чем в 50 % случаев [85]. Ряд производных ПСА, включая свободный ПСА (fPSA), процент отношения свободного к общему ПСА (%fPSA), плотность ПСА (PSAD) и скорость ПСА (PSAV), в основном улучшили отбор пациентов для назначения биопсии предстательной железы. Однако пока мы имеем ограниченные возможности для определения наличия или агрессивности РПЖ до биопсии предстательной железы [86, 87]. Прилагаются значительные усилия для исследования новых серологических маркеров, которые могли бы преодолеть ограничения ПСА-теста. Предшественник ПСА (proPSA) – одна из идентифицированных форм fPSA, который рассматривается как перспективный кандидатный сывороточный маркер РПЖ [88, 89]. В сыворотке существуют 4 различных изоформы proPSA, известные как [–2] proPSA, [–4]proPSA, [–5]proPSA и [–7]proPSA, с пролидерным пептидом из 7, 5, 4 или 2 аминокислот [90, 91]. Как разновидность свободного ПСА, [–2]proPSA дифференцированно экспрессирован в периферической зоне предстательной железы и, как показано, увеличивается в сыворотке крови у больных РПЖ. Индекс здоровья предстательной железы (PHI), 2 производных от p2PSA и %p2PSA, которые рассчитываются как [(p2PSA / fPSA) × √tPSA] и [(p2PSA / fPSA) × 100] соответственно, увеличиваются при РПЖ и могут отличить РПЖ от доброкачественных опухолей предстательной железы лучше, чем tPSA или fPSA [92, 93]. При 90 % чувствительности, специфичность PHI и %p2PSA составила 31 и 33 % по сравнению с 10 и 11 % для tPSA и %f PSA соответственно [86].

25

2,

мочевого пузыря и рака толстой кишки, показало перекрывание для протеомов только на 35 %. Эти данные подтверждают то, что MVB содержат белки, частично специфичные для клеток, в которых они определяются, и, таким образом, потенциально являются опухолеспецифичными. CUB domain-containing protein 1 (CDCP1) и tetraspanin CD151 были далее исследованы с учетом их участия в онкогенезе [82].

CD151 связывается с интегринами и матричными металлопротеиназами, регулирующими миграцию клеток. CDCP1, уже ранее отмеченный как биомаркер рака, был описан как антиапоптотическая молекула, вовлеченная в выживание метастатических клеток. В этом исследовании оба белка были обогащены в MVB из клеток PC-3 по сравнению с полученными из LNCaP-1 и клеточной линии нормальных эпителиальных клеток предстательной железы RWPE-1. В другом исследовании авторы определили, что средние уровни содержания простасом в плазме 20 пациентов с РПЖ увеличены по сравнению с контрольной группой, включающей 20 индивидов такого же возраста, и эти данные подтверждены валидацией в слепом тесте [80]. Количество простасом в образцах оказалось значительно выше у больных с индексом Глисона 7–9 в сравнении с контрольными группами, в то время как у онкологических пациентов с индексом Глисона ≤ 6 количество простасом было таким же, как у контрольных индивидов. Тест, основанный на обнаружении количества переносимых кровью простасом, вероятно, был бы бесполезным при ранней диагностике РПЖ, но полезным при идентификации прогрессирующего рака, особенно когда текущий анализ ПСА не в состоянии отличить пациентов с индексом Глисона 7 от пациентов с индексом Глисона ≤ 6. Авторы выдвинули гипотезу, что более низкая диффузионная способность простасом по сравнению с величиной ПСА может сделать простасомный тест более специфичным для рака, так как у них меньше возможности реализоваться во внутритканевое пространство (и затем в кровь) при доброкачественной болезни. Таким образом, исследование протеомов простасом и измерение их количества в биологических жидкостях, таких как моча, сыворотка, секрет предстательной железы и семенная жидкость, считается перспективным подходом для открытия новых диагностических и прогностических маркеров РПЖ. Существуют определенные трудности при стратификации экзосом, продуцируемых трансформированными и другими неопухолевыми клетками, что, безусловно, требует дальнейших исследований.

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

2015

Использование и внедрение высокопроизводительных, чувствительных и надежных протеомных технологий для исследования биомаркеров тканей и биожидкостей облегчает поиск более персонифицированного подхода к диагностике болезни и ее лечения. Протеомика будет необходима для продвижения от открытия биомаркера до надежной валидации и применения результатов исследования в клиниче-

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2,

26

ТОМ 2 ских испытаниях. После детектирования агрессивный РПЖ может обрабатываться специфическим набором препаратов для таргетной терапии, разработанным на основе знания молекулярно-генетических параметров для каждого больного. Кроме того, опыт, полученный при применении этих технологий к РПЖ, может впоследствии использоваться при разработке терапии для других солидных форм рака.

Л И Т Е Р А Т У Р А 1. Jemal A., Siegel R., Xu J., Ward E. Cancer statistics 2010. CA Cancer J Clin 2010;60(5): 277–300.

2. Ferlay J., Shin H.R., Bray F. et al.

Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer 2010;127:2893–917.

3. Stamey T.A., Freiha F.S., McNeal J.E. et al. Localized prostate cancer. Relationship of tumor volume to clinical significance for treatment of prostate cancer. Cancer 1993;71(3 Suppl):933–8.

4. Thompson I.M., Pauler D.K., Goodman P.J. et al. Prevalence of prostate cancer among men with a prostate-specific antigen level b or =4.0 ng per milliliter. N Engl J Med 2004;350:2239–46.

5. Kulasingam V., Diamandis E.P. Strategies for discovering novel cancer biomarkers through utilization of emerging technologies.

Nat Clin Pract Oncol 2008;5(10): 588–99.

6. Paweletz C.P., Liotta L.A., Petricoin E.F. New technologies for biomarker analysis of prostate cancer progression: laser capture microdissection and tissue proteomics.

Urology 2001;57(4 Suppl 1):160–3.

7. Aldred S., Grant M.M., Griffiths H.R. The use of proteomics for the assessment of clinical samples in research. Clin Biochem 2004;37(11):943–52.

8. Zieske L.R. A perspective on the use of iTRAQ reagent technology for protein complex and profiling studies. J Exp Bot 2006;57(7):1501–8.

9. Craft N., Shostak Y., Carey M., Sawyers C.L. A mechanism for hormoneindependent prostate cancer through modulation of androgen receptor signaling by the HER-2/neu tyrosine kinase. Nat Med 1999;5(3):280–5.

10. Zhu M.L., Kyprianou N. Androgen receptor and growth factor signaling crosstalk in prostate cancer cells. Endocr Relat Cancer 2008;15:841–9.

11. Zheng Y., Xu Y., Ye B. et al. Prostate carcinoma tissue proteomics for biomarker discovery. Cancer 2003;98(12):2576–82.

12. Ummanni R., Mundt F., Pospisil H. et al.

Identification of clinically relevant protein targets in prostate cancer with 2D-DIGE coupled mass spectrometry and systems

biology network platform. PLoS One 2011;6(2):16833.

13. Montironi R., Mazzucchelli R., LopezBeltran A. et al. Mechanisms of disease: highgrade prostatic intraepithelial neoplasia and other proposed preneoplastic lesions in the prostate. Nat Clin Pract Urol 2007;4(6): 321–32.

14. Cheung P.K., Woolcock B., Adomat H. et al. Protein profiling of microdissected prostate tissue links growth differentiation factor 15 to prostate carcinogenesis. Cancer Res 2004;64(17):5929–33.

15. Alaiya A.A., Al-Mohanna M., Aslam M. et al. Proteomics-based signature for human benign prostate hyperplasia and prostate adenocarcinoma. Int J Oncol 2011;38(4):1047–57.

16. Liu A., Wei L., Gardner W.A. et al.

Correlated alterations in prostate basal cell layer and basement membrane. Int J Biol Sci 2009;5(3):276–85.

17. Diaz J.I., Cazares L.H., Corica A., John Semmes O. Selective capture of prostatic basal cells and secretory epithelial cells for proteomic and genomic analysis.

Urol Oncol 2004;22(4):329–36.

18. Khamis Z.I., Iczkowski K.A., Sahab Z.J., Sang Q.X. Protein profiling of isolated leukocytes, myofibroblasts, epithelial, basal, and endothelial cells from normal, hyperplastic, cancerous, and inflammatory human prostate tissues. J Cancer 2010;1:70–9.

19. Gao X., Pang J., Li L.Y. et al. Expression profiling identifies new function of collapsin response mediator protein 4 as a metastasissuppressor in prostate cancer. Oncogene 2010;29(32):4555–66.

20. Pang J., Liu W.P., Liu X.P. et al. Profiling protein markers associated with lymph node metastasis in prostate cancer by DIGE-based proteomics analysis. J Proteome Res 2010;9(1):216–26.

21. Skvortsov S., Schäfer G., Stasyk T. et al.

Proteomics profiling of microdissected lowand high-grade prostate tumors identifies Lamin A as a discriminatory biomarker.

J Proteome Res 2011;10(1):259–68.

22. Gottlieb B., Beitel L.K., Wu J.H., Trifiro M. The androgen receptor gene mutations database (ARDB): 2004 update.

Hum Mutat 2004;23(6):527–33.

23. Paliouras M., Zaman N., Lumbroso R. et al. Dynamic rewiring of the androgen receptor protein interaction network correlates with prostate cancer clinical outcomes. Integr Biol (Camb) 2011;3(10):1020–32.

24. Sun C., Song C., Ma Z. et al. Periostin identified as a potential biomarker of prostate cancer by iTRAQ-proteomics analysis of prostate biopsy. Proteome Sci 2011;9:22.

25. Sun C., Zhao X., Xu K. et al. Periostin: a promising target of therapeutical intervention for prostate cancer. J Transl Med 2011;9:99.

26. Zhang S., Wang X., Osunkoya A.O. et al.

EPLIN downregulation promotes epithelial– mesenchymal transition in prostate cancer cells and correlates with clinical lymph node metastasis. Oncogene 2011;30(50):4941–52.

27. Quanico J., Franck J., Dauly C. et al.

Development of liquid microjunction extraction strategy for improving protein identification from tissue sections.

J Proteomics. 2013;79:200–18.

28. Geisler C., Gaisa N.T., Pfister D. et al.

Identification and validation of potential new biomarkers for prostate cancer diagnosis and prognosis using 2D-DIGE and MS. Biomed Res Int 2015;2015:454256.

29. Lai Y.H., Cheng J., Cheng D. et al. SOX4 interacts with plakoglobin in a Wnt3adependent manner in prostate cancer cells.

BMC Cell Biol 2011;12:50.

30. Endoh K., Nishi M., Ishiguro M. et al.

Identification of phosphorylated proteins involved in the oncogenesis of prostate cancer via Pin1-proteomic analysis. Prostate 2012;72(6):626–37.

31. Glen A., Gan C.S., Hamdy F.C. et al. iTRAQ-facilitated proteomic analysis of human prostate cancer cells identifies proteins associated with progression.

J Proteome Res 2008;7(3): 897–907.

32. Garbis S.D., Tyritzis S.I., Roumeliotis T. et al. Search for potentialmarkers for prostate cancer diagnosis, prognosis and treatment in clinical tissue specimens using aminespecific isobaric tagging (iTRAQ) with twodimensional liquid chromatography and tandem mass spectrometry. J Proteome Res 2008;7(8):3146–58.

undergoing radical prostatectomy. J Clin Oncol 2001;19(11):2856–64.

62. Ivanovic V., Melman A., Davis-Joseph B. et al. Elevated plasma levels of TGF-beta 1 in patients with invasive prostate cancer. Nat Med 1995;1(4):282–4.

63. Shariat S.F., Kattan M.W., Traxel E. et al.

Association of pre- and postoperative plasma levels of transforming growth factor beta(1) and interleukin 6 and its soluble receptor with prostate cancer progression. Clin Cancer Res 2004;10(6):1992–9.

64. Adler H.L., McCurdy M.A., Kattan M.W. et al. Elevated levels of circulating interleukin-6 and transforming growth factor-beta1 in patients with metastatic prostatic carcinoma. J Urol 1999;161(1):182–7.

65. Michalaki V., Syrigos K., Charles P., Waxman J. Serum levels of IL-6 and TNFalpha correlate with clinicopathological features and patient survival in patients with prostate cancer. Br J Cancer 2004;90(12):2312–6.

66. Nakashima J., Tachibana M., Horiguchi Y. et al. Serum interleukin 6 as a prognostic factor in patients with prostate cancer. Clin Cancer Res 2000;6(7):2702–6.

67. True L.D., Zhang H., Ye M. et al. CD90/ THY1 is overexpressed in prostate cancerassociated fibroblasts and could serve as a cancer biomarker. Mod Pathol 2010;23(10):1346–56.

68. Morgan R., Boxall A., Bhatt A., Bailey M. et al. Engrailed-2 (EN2): a tumor specific urinary biomarker for the early diagnosis of prostate cancer. Clin Cancer Res 2011;17(5):1090–8.

69. Li C., Zang T., Wrobel K. et al.

Quantitative urinary proteomics using stable isotope labelling by peptide dimethylation in patients with prostate cancer. Anal Bioanal Chem. 2015;407(12):3393–404.

70. Josson S., Nomura T., Lin J.T. et al. β2microglobulin induces epithelial to mesenchymal transition and confers cancer lethality and bone metastasis in human cancer cells. Cancer Res 2011;71(7):2600–10.

71. Hassan M.I., Kumar V., Kashav T. et al.

Proteomic approach for purification of seminal plasma proteins involved in tumor proliferation. J Sep Sci 2007;30(12):1979–88.

72. Byrne J.C., Downes M.R., O'Donoghue N. et al. 2D-DIGE as a strategy to identify serum markers for the progression of prostate cancer.

J Proteome Res 2009;8(2):942–57.

73. KälinM., Cima I., Schiess R. et al. Novel prognosticmarkers in the serum of patientswith castration-resistant prostate cancer derived fromquantitative analysis of the pten conditional knockout mouse proteome.

Eur Urol 2011;60(6):1235–43.

74. Cima I., Schiess R., Wild P. et al. Cancer genetics-guided discovery of serum biomarker signatures for diagnosis and prognosis of prostate cancer. Proc Natl Acad Sci USA 2011;108(8):3342–7.

75. Halabi S., Small E.J., Kantoff P.W. et al.

Prognostic model for predicting survival

2015

47. Schiess R., Wollscheid B., Aebersold R. Targeted proteomic strategy for clinical biomarker discovery. Mol Oncol 2009;3(1): 33–44.

48. Saraon P., Musrap N., Cretu D. et al.

Proteomic profiling of androgen-independent prostate cancer cell lines reveals a role for protein S during the development of high grade and castration-resistant prostate cancer. J Biol Chem 2012;287(41):34019–31.

49. Theodorescu D., Schiffer E., Bauer H.W. et al. Discovery and validation of urinary biomarkers for prostate cancer. Proteomics Clin Appl 2008;2(4):556–70.

50. Schiffer E., Bick C., Grizelj B. et al.

Urinary proteome analysis for prostate cancer diagnosis: cost-effective application in routine clinical practice in Germany. Int J Urol 2012;19(2):118–25.

51. Miller J.C., Zhou H., Kwekel J. et al.

Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: antibody screening and identification of potential biomarkers.

Proteomics 2003;3(1):56–63.

52. Marusyk A., Almendro V., Polyak K. Intratumour heterogeneity: a looking glass for cancer? Nat Rev Cancer 2012;12(5):323–34.

53. Mueller C., Liotta L.A., Espina V. Reverse phase protein microarrays advance to use in clinical trials. Mol Oncol 2010;4(6):461–81.

54. Prior C., Guillen-Grima F., Robles J.E. et al. Use of a combination of biomarkers in serum and urine to improve detection of prostate cancer. World J Urol 2010;28(6): 681–6.

55. Mink S.R., Hodge A., Agus D.B. et al.

Beta-2-microglobulin expression correlates with high-grade prostate cancer and specific defects in androgen signaling. Prostate 2010;70(11):1201–10.

56. Gross M., Top I., Laux I. et al. Beta-2microglobulin is an androgen-regulated secreted protein elevated in serum of patients with advanced prostate cancer. Clin Cancer Res 2007;13(7):1979–86.

57. Rehman I., Evans C.A., Glen A. et al. iTRAQ identification of candidate serum biomarkers associated with metastatic progression of human prostate cancer. PLoS One 2012;7(2):e30885.

58. Katafigiotis S.I., Tyritzis., Stravodimos K.G., Alamanis C. et al. Zinc α2-glycoprotein as a potential novel urine biomarker for the early diagnosis of prostate cancer. BJU Int 2012;110(11 Pt B):E688–93.

59. Hassan M.I., Kumar V., Kashav T. et al.

Proteomic approach for purification of seminal plasma proteins involved in tumor proliferation. J Sep Sci 2007;30(12):1979–88.

60. Henshall S.M., Horvath L.G., Quinn D.I. et al. Zinc-alpha2-glycoprotein expression as a predictor of metastatic prostate cancer following radical prostatectomy. J Natl Cancer Inst 2006;98(19):1420–4.

61. Shariat S.F., Shalev M., Menesses-Diaz A. et al. Preoperative plasma levels of transforming growth factor beta(1) (TGFbeta(1)) strongly predict progression in patients

27

2,

33. Yocum A.K., Khan A.P., Zhao R., Chinnaiyan A.M. Development of selected reaction monitoring-MS methodology to measure peptide biomarkers in prostate cancer. Proteomics 2010;10(19):3506–14.

34. Roobol M.J., Haese A., Bjartell A. Tumour markers in prostate cancer III: biomarkers in urine. Acta Oncol 2011;50(Suppl 1):85–9.

35. Shariat S.F., Semjonow A., Lilja H. et al.

Tumor markers in prostate cancer I: bloodbased markers. Acta Oncol 2011;50(Suppl 1): 61–75.

36. Principe S., Kim Y., Fontana S. et al.

Identification of prostate-enriched proteins by in-depth proteomic analyses of expressed prostatic secretions in urine. J Proteome Res 2012;11(4):2386–96.

37. Drake R.R., Elschenbroich S., LopezPerez O. et al. In-depth proteomic analyses of direct expressed prostatic secretions.

J Proteome Res 2010;9(5):2109–16.

38. Teng P.N., Bateman N.W., Hood B.L., Conrads T.P. Advances in proximal fluid proteomics for disease biomarker discovery.

J Proteome Res 2010;9(12):6091–100.

39. Rehman I., Azzouzi A.R., Catto J.W. et al.

Proteomic analysis of voided urine after prostaticmassage frompatients with prostate cancer: a pilot study. Urology 2004;64(6):1238–43.

40. M'Koma A.E., Blum A.E., Norris J.L. et al.

Detection of pre-neoplastic and neoplastic prostate disease by MALDI profiling of urine.

Biochem Biophys Res Commun 2007;353(3): 829–34.

41. Florentinus A.K., Bowden P., Sardana G. et al. Identification and quantification of peptides and proteins secreted from prostate epithelial cells by unbiased liquid chromatography tandem mass spectrometry using goodness of fit and analysis of variance.

J Proteomics 2012;75(4):1303–17.

42. Chen W.Z., Pang B., Yang B. et al.

Differential proteome analysis of conditioned medium of BPH-1 and LNCaP cells. Chin Med J (Engl) 2011;124(22):3806–9.

43. Sardana G., Jung K., Stephan C., Diamandis E.P. Proteomic analysis of conditioned media fromthe PC3, LNCaP, and 22Rv1 prostate cancer cell lines: discovery and validation of candidate prostate cancer biomarkers. J Proteome Res 2008;7(8): 3329–38.

44. Ji L., Jayachandran G., Roth J.A. High throughput profiling of serum phosphoproteins/peptides using the SELDITOF-MS platform. Methods Mol Biol 2012;818:199–216.

45. Schwenk J.M., Igel U., Neiman M. et al.

Toward next generation plasma profiling via heat-induced epitope retrieval and array-based assays. Mol Cell Proteomics 2010;9(11):2497– 507.

46. Hawkridge A.M., Muddiman D.C. Mass spectrometry-based biomarker discovery: toward a global proteome index of individuality.

Annu Rev Anal Chem (Palo Alto Calif) 2009;2:265–77.

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

2015

in men with hormone-refractory metastatic prostate cancer. J Clin Oncol 2003;21(7):1232–7.

76. Valadi H., Ekström K., Bossios A. et al.

Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol 2007;9(6):654–9.

77. Guescini M., Leo G., Genedani S. et al.

Microvesicle and tunneling nanotube mediated intercellular transfer of g-protein coupled receptors in cell cultures. Exp Cell Res 2012;318(5):603–13.

78. Logozzi M., De Milito A., Lugini L. et al.

High levels of exosomes expressing CD63 and caveolin-1 in plasma of melanoma patients. PLoS One 2009;4(4):e5219.

79. Silva J., Garcia V., Rodriguez M. et al.

Analysis of exosome release and its prognostic value in human colorectal cancer. Genes Chromosomes Cancer 2012;51(4):409–18.

80. Tavoosidana G., Ronquist G., Darmanis S. et al. Multiple recognition assay reveals prostasomes as promising plasma biomarkers for prostate cancer. Proc Natl Acad Sci USA 2011;108(21):8809–14.

81. Duijvesz D., Luider T., Bangma C.H., Jenster G. Exosomes as biomarker treasure chests for prostate cancer. Eur Urol 2011;59(5):823–31.

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2,

28

ТОМ 2 82. Sandvig K., Llorente A. Proteomic analysis of microvesicles released by the human prostate cancer cell line PC-3. Mol Cell Proteomics 2012;11(7):M111.012914.

83. Filella X., Foj L., Augé J.M. et al. Clinical utility of % p2PSA and prostate health index in the detection of prostate cancer. Clin Chem Lab Med 2014;52(9):1347–55.

84. Postma R, Schröder FH. Screening for prostate cancer. Eur J Cancer 2005;41(6):825–33.

85. Draisma G., Etzioni R., Tsodikov A. et al.

Lead time and overdiagnosis in prostatespecific antigen screening: importance of methods and context. J Natl Cancer Inst 2009;101(6):374–83.

86. Jansen F.H., van Schaik R.H., Kurstjens J. Prostate-specific antigen (PSA) isoform p2PSA in combination with total PSA and free PSA improves diagnostic accuracy in prostate cancer detection. Eur Urol 2010;57(6):921–7.

87. Guazzoni G., Nava L., Lazzeri M. et al.

Prostate-specific antigen (PSA) isoform p2PSA significantly improves the prediction of prostate cancer at initial extended prostate biopsies in patients with total PSA between 2.0 and 10 ng/ml: results of a prospective study in a clinical setting. Eur Urol 2011;60(2):214–22.

88. Mikolajczyk S.D., Millar L.S., Wang T.J. et al. A precursor form of prostate-specific

antigen is more highly elevated in prostate cancer compared with benign transition zone prostate tissue. Cancer Res 2000;60(3):756–9.

89. Catalona W.J., Bartsch G., Rittenhouse H.G. et al. Serum pro-prostate specific antigen preferentially detects aggressive prostate cancers in men with 2 to 4 ng/ml prostate specific antigen. J Urol 2004;171(6 Pt 1): 2239–44.

90. Jansen F.H., Roobol M., Jenster G. et al.

Screening for prostate cancer in 2008 II: the importance of molecular subforms of prostatespecific antigen and tissue kallikreins. Eur Urol 2009;55(3):563–74.

91. Mikolajczyk S.D., Rittenhouse H.G. Pro PSA: a more cancer specific form of prostate specific antigen for the early detection of prostate cancer. Keio J Med 2003;52(2): 86–91.

92. Lazzeri M., Briganti A., Scattoni V. et al.

Serum index test % [-2]proPSA and Prostate Health Index are more accurate than prostate specific antigen and % fPSA in predicting a positive repeat prostate biopsy. J Urol 2012;188(4):1137–43.

93. Scattoni V., Lazzeri M., Lughezzani G. et al. Head-to-head comparison of prostate health index and urinary PCA3 for predicting cancer at initial or repeat biopsy. J Urol 2013;190(2):496–501.

Н. Н. Мазуренко, И. В. Цыганова НИИ канцерогенеза ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина»; Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24 Контакты: Наталья Николаевна Мазуренко nnmazurenko@mail.ru Гастроинтестинальные стромальные опухоли (ГИСО) – наиболее распространенная группа мезенхимальных опухолей желудочнокишечного тракта, которые имеют особые клинико-морфологические, иммуногистохимические и молекулярные характеристики. Отличительной чертой ГИСО является наличие поверхностного антигена CD117 (рецептора KIT), выявляемого c помощью иммуногистохимического метода. ГИСО представляют гетерогенную группу опухолей, содержащих активирующие мутации в генах KIT (75–80 %) и PDGFRA (5–15 %), кодирующих рецепторные тирозинкиназы (ТК). Многочисленные мутации коррелируют со специфической морфологией ГИСО, гистологическим фенотипом, метастазированием и прогнозом. В 10–15 % ГИСО имеются гены KIT и PDGFRA дикого типа, некоторые содержат активирующие мутации BRAF, IGF1R или PIK3CA. Другие пациенты с ГИСО дикого типа имеют наследственные синдромы (нейрофиброматоз 1-го типа, синдром Карнея–Стратакиса или триаду Карнея) и содержат герминальные мутации в гене NF1 либо SDHA, SDHB, SDHC и SDHD, кодирующих субъединицы комплекса сукцинатдегидрогеназы. ГИСО – первая и наиболее изученная модель для отработки принципов и методов индивидуализированной таргетной терапии солидных опухолей ингибиторами ТК. Ключевые слова: гастроинтестинальные стромальные опухоли, мутации, гены KIT, PDGFRA, BRAF и SDH, таргетная терапия, тирозинкиназные ингибиторы, иматиниб

DOI: 10.17 650 / 2313-805X. 2015.2.2.29–40 Molecular features and genetic markers of gastrointestinal stromal tumors N. N. Mazurenko, I. V. Tsyganova Research Institute of Carcinogenesis, N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center; 24 Kashirskoye Shosse, Moscow, 115478, Russia Gastrointestinal stromal tumors (GISTs) are the most spread mesenchymal tumors located within the gastrointestinal tract that have particular clinico-morphological, immunohistochemical and molecular characteristics. The distinguishing mark of GISTs is the presence of the cell-surface antigen CD117 (KIT receptor tyrosine kinase), identified by immunohistochemistry. GISTs consist of tumors with various activating mutations in KIT (75–80 %) or PDGFRA (5–15 %) receptor tyrosine kinases. Numerous KIT and PDGFRA mutations are associated with specific GIST morphology, histologic phenotype, metastasizing and prognosis. 10–15 % of GISTs contain KIT and PDGFRA wild type genes, some of them have driver BRAF, IGF1R or PIK3CA mutations. The other GISTs patients have familial syndromes (neurofibromatosis type 1, Carney–Stratakis syndrome, Carney triad) and contain germline mutations of NF1 or the genes coding for the succinate dehydrogenase subunits SDHA, SDHB, SDHC, and SDHD. GISTs are first and the most studied model for development of principles and methods of personalized targeted therapy of solid tumors with tyrosine kinase inhibitors.

Key words: gastrointestinal stromal tumors, mutations, KIT, PDGFRA, BRAF, SDH, targeted therapy, tyrosine kinase inhibitors, imatinib

Введение Гастроинтестинальные стромальные опухоли (ГИСО, gastrointestinal stromal tumors, GIST) – наиболее распространенная группа (80 %) мезенхимальных опухолей желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). В мире ГИСО ежегодно выявляется у 12–15 человек на 1 млн населения [1, 2]. Термин «стромальные опухоли ЖКТ» предложен в 1983 г. для обозначения соединительнотканных опухолей с гладкомышечной и нейрогенной дифференцировкой [3]. Несмотря на определенные морфологические особенности, стромальные опухоли ЖКТ выделены в отдельную нозологическую группу только в 2002 г., после того как было установлено, что харак-

терная для ГИСО экспрессия маркера СD117 [4] является результатом активации протоонкогена KIT за счет мутации [5]. Иммуногистохимическое (ИГХ) определение маркера CD117 (KIT) стало необходимым диагностическим тестом, позволяющим отличить ГИСО от других мезенхимальных опухолей ЖКТ – лейомиом, лейомиосарком, шванном, десмоидов и др. [4, 6]. Стромальные опухоли ЖКТ возникают из предшественников интерстициальных клеток Кахаля, регулирующих перистальтику ЖКТ (открыты в 1911 г. испанским патологом С. Р. Кахалем, лауреатом Нобелевской премии 1906 г.) [7]. В интерстициальных клетках Кахаля и окружающей строме находят мутации KIT [8]. Сегодня ГИСО рассматривают как отдельную

2015

Молекулярно-генетические особенности и маркеры гастроинтестинальных стромальных опухолей

29

2,

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

2015

группу сарком, которая имеет особые клинико-морфологические, ИГХ- и молекулярные характеристики, а также профиль клинического поведения, отличный от истинных гладкомышечных и нейрогенных опухолей ЖКТ, что предполагает специальную стратегию их лечения [1, 2, 9–13]. Особый интерес к ГИСО связан с тем, что они считаются первым примером успешной таргетной терапии солидных опухолей ингибиторами тирозинкиназ (ТК). Первый ингибитор ТК, иматиниба мезилат, был создан в 1999 г. для ингибирования слитного продукта киназы BCR-ABL у больных хроническим миелолейкозом. В 2000 г., еще до окончания испытаний, иматиниб был успешно применен финскими врачами для лечения больной с метастатической стромальной опухолью с мутацией KIT [14]. С 2002 г. иматиниб (Гливек) разрешен Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) к применению при стромальных опухолях ЖКТ [2, 9–11]. С тех пор ГИСО – наиболее изученная и удобная модель для отработки принципов и методов таргетной терапии, мишенями для которой являются различные ТК.

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2,

30

Клинико-морфологические особенности гастроинтестинальных стромальных опухолей ГИСО – чрезвычайно гетерогенная группа опухолей, различающихся по локализации, размеру, гистологическому типу клеток, степени злокачественности, риску прогрессии и клиническому течению [1, 2, 9–13]. ГИСО может быть наследуемым заболеванием: в некоторых семьях с высокой частотой ГИСО выявлены герминальные мутации [15]. Встречаются ГИСО и у детей [16]. В США ежегодно выявляют 5–10 тыс. новых случаев ГИСО. Заболеваемость у мужчин в 1,5 раза выше, чем у женщин. Частота ГИСО у людей европеоидной расы в 2 раза ниже, чем у негроидной, и в 1,5 раза ниже, чем у представителей других рас. Средний возраст заболевших – 62,9 года [17]. В России частота ГИСО выше у женщин (57,5 %), средний возраст – 54,4 года [18]. Большинство (60–70 %) ГИСО локализуются в желудке, 20–30 % – в тонкой кишке, 5 % – в прямой кишке. Стромальные опухоли составляют до 94 % сарком желудка (менее 3 % всех опухолей желудка) и до 83 % сарком тонкой кишки. ГИСО также встречаются в брыжейке, сальнике, очень редко в пищеводе и экзогастрально (extragastrointestinal stromal tumor, EGIST) [1, 2, 9–13, 17–19]. ГИСО могут иметь веретеноклеточный, эпителиоидный или смешанный гистологический тип клеток [1, 2, 9–13, 17–19]. Частота веретеноклеточных опухолей в России ниже (57 %) [18, 19], чем в США (60–70 %) [2, 17]. До 20 % ГИСО бессимптомны и являются случайной находкой. Размер опухоли колеблется от 1–2 до 30 см, средний размер опухоли 5–8 см. Нередко выявляют небольшие, диаметром от нескольких миллиметров до 1–2 см,

ТОМ 2 хорошо ограниченные опухоли, окруженные тонкой псевдокапсулой [1, 9–11, 18–20]. Иногда стромальные опухоли желудка остаются нераспознанными при жизни человека (до 10 %) [21], на аутопсиях их обнаруживают с частотой 2 случая на 1000 вскрытий. В специальном исследовании микроскопические ГИСО были выявлены у 35 из 100 больных раком желудка [22]. Такие склерозирующие образования рассматривают как предопухолевые или как гиперплазии инстерстициальных клеток Кахаля, в них находят мутации в 11-м экзоне KIT, характерные для ГИСО [21, 22]. Стромальные опухоли варьируют по степени злокачественности и риску прогрессии, даже небольшие «доброкачественные» опухоли могут прогрессировать. До 30 % пациентов при первичном выявлении ГИСО имеют инфильтраты либо метастазы, чаще всего в брюшной полости или печени, тогда как метастазы в лимфатических узлах встречаются редко, чаще у молодых пациентов [9, 11–13, 23]. Среди российских больных метастазы и рецидивы изначально выявлены в 37,5 % наблюдений, наличие других онкологических заболеваний отмечено у 9,2 % [18, 19]. Хирургическое вмешательство, проведенное как можно раньше, является наилучшим вариантом лечения локальных стромальных опухолей ЖКТ [2, 10–11, 17]. Однако даже после радикальной операции 5-летняя выживаемость составляет 54 %, а безрецидивная выживаемость – 45 %. Существуют и используются несколько систем оценки риска прогрессии ГИСО. К морфологическим критериям прогноза для больных ГИСО относятся локализация, размер опухоли, степень злокачественности и число митозов в 50 полях зрения при 400-кратном увеличении [9, 24]. Благоприятный прогноз имеют опухоли размером ≤ 2 см либо опухоли желудка размером ≤ 5 см с митотическим индексом ≤ 5 в 50 полях зрения (≤ 5 / 50 HPF) [1, 9]. При локализации опухоли размером > 2 см c митотическим индексом > 5 в тонкой, прямой кишке, брыжейке или сальнике риск прогрессии высокий. Так, у опухолей тонкой кишки размером ≥ 10 см с митотическим индексом > 5 риск прогрессии приближается к 90 % [9, 23]. Предложена номограмма расчета прогноза ГИСО [24] и новая система TNM [23]. Гистологический тип клеток, наличие очагов некроза, пролиферативный индекс Ki-67, а также окрашивание с антителами к CD117, CD34 самостоятельными критериями прогноза не являются [18]. Молекулярные маркеры гастроинтестинальных стромальных опухолей Клеточный ген KIT кодирует рецептор фактора роста стволовых клеток. Его вирусный аналог v-KIT выявлен в 1986 г. в составе острого трансформирующего вируса фибросаркомы кошек HZ4-FeSV (Hardy– Zuckerman 4 feline sarcoma virus) [25]. Рецептор KIT экспрессируется как в ряде нормальных тканей, так и в некоторых опухолях (глиомы, ангиосаркомы, се-

Хромосомные и генетические нарушения ГИСО представляют собой опухоли с несколькими молекулярными подтипами, а различные варианты мутаций KIT и PDGFRA являются маркерами биологического многообразия ГИСО. Дополнительно в патогенез ГИСО вовлечены другие гены [36]. Хромосомные аберрации включают утрату 1p, 13q, 14q или 15q, потерю гетерозиготности на 22q, многочисленные аллельные и микросателлитные нарушения. Рассма-

KIT и PDGFRA – молекулярно-генетические маркеры гастроинтестинальных стромальных опухолей Мутации генов KIT и PDGFRA критичны для ГИСО, потому что коррелируют со специфической морфологией, гистологическим фенотипом, метастазированием, прогнозом, а также являются мишенью для таргетной терапии иматинибом и другими ингибиторами ТК. Есть несколько молекулярных классификаций ГИСО, в основе которых лежит мутантный статус опухоли (мутантные гены KIT, PDGFRA или дикого типа) и чувствительность к ингибитору ТК – иматиниба мезилату [1] либо мутантный статус и патогенез [23]. Гены KIT и PDGFRA высокогомологичны, расположены на хромосоме 4q12, состоят из 21 и 22 экзонов соответственно и кодируют рецепторные ТК 3-го типа, которые отличаются наличием 2 ТК-доменов (TK1 и TK2). Первые 9 экзонов KIT кодируют 5 иммуноглобулин-подобных доменов, отвечающих за связывание с лигандом и димеризацию рецептора, 10-й экзон ко-

2015

тривают 3 основных пути цитогенетической эволюции ГИСО: потери на 14q характерны для опухолей желудка с благоприятным прогнозом, на 1р – для опухолей тонкой кишки, делеции на 22q чаще встречаются в сочетании с потерей на 1p в опухолях с высоким митотическим индексом и рецидивами [37–39]. ГИСО с мутациями PDGFRA имеют такие же хромосомные нарушения (70 % потери на 14q, 28 % – на 1p и 17 % – на 22q), что и ГИСО с мутациями KIT, но для них характерна более низкая степень хромосомной нестабильности, что коррелирует с более благоприятным прогнозом [38, 40]. Потери на 9p и 13q и амплификации на 8q, 17q и 20q значительно чаще наблюдаются в злокачественных и / или метастатических ГИСО [37–41]. Молекулярно-генетические нарушения включают потерю гетерозиготности на 9р21 и нарушения экспрессии транскриптов гена CDKN2A: p16 (INK4A) и p14 (ARF), метилирование p15 (INK4B), которые выявлены суммарно в 54–68 % ГИСО [37, 42]. В 10 % ГИСО наблюдается гомозиготная делеция гена Hox11L1, который локализован на хромосоме 2 и играет роль в пролиферации интерстициальных клеток Кахаля [43]. Амплификация генов C-MYC, MDM2, EGFR1 и CCND1 и высокая экспрессия матричная РНМ (мPHK) генов CDK4, RB1, MDM2, TP53 и E2F1 коррелирует с агрессивным поведением и неблагоприятным прогнозом ГИСО [36]. В частности, высокая экспрессия E2F1 ассоциирована с количеством митозов, скоростью пролиферации, мутациями KIT и агрессивным поведением опухоли [36, 44]. Амплификация MDM2 – редкое событие для ГИСО [45]. Хотя высокая экспрессия p53 (> 10 % позитивных клеток при ИГХ-анализе) выявлена в 35 % случаев ГИСО, она не коррелировала с клиническими показателями, за исключением размера первичной опухоли [45].

31

2,

миномы/дисгерминомы, меланомы, мелкоклеточный рак легких и др.) за счет амплификации гена. Мутации KIT – характерная особенность именно стромальных опухолей ЖКТ [1]. В небольшом проценте случаев активирующие мутации KIT обнаружены у пациентов с мастоцитозом, острым миелобластным лейкозом, герминогенными семиномами, акральными, мукозальными или увеальными меланомами и другими редкими онкологическими заболеваниями [26]. В 2003 г. 2 группы исследователей независимо друг от друга установили, что 5–7 % стромальных опухолей ЖКТ с геном KIT дикого типа содержат мутацию в гомологичном гене PDGFRA, кодирующем альфа-рецептор тромбоцитарного фактора роста [27, 28]. В 10– 15 % ГИСО содержатся гены KIT и PDGFRA дикого типа [1, 2, 29]. Экспрессия KIT наблюдается в 95 % ГИСО, и ИГХокрашивание антителами к антигену CD117 служит диагностическим маркером, позволяющим отличить ГИСО от других мезенхимальных опухолей ЖКТ. Однако 5 % ГИСО CD117-негативны, при этом содержат мутации PDGFRA или KIT (чаще в 11-м экзоне) [30]. Считают, что в этих ГИСО образуется небольшое количество мутантных молекул, которые достаточны для прогрессии, но не определяются антителами к CD117. В таком случае именно выявление мутации важно для подтверждения диагноза ГИСО [1, 2, 29]. Характерной для ГИСО считается экспрессия гена DOG1 (11q13), кодирующего трансмембранный белок, связанный с транспортом ионов кальция. Иммунореактивность белка DOG1 составляет 97,8 %, он более чувствителеный и специфиченый, чем CD117, и выявляется также в CD117-негативных опухолях с мутацией PDGFRA [31–33]. Показано, что утрата экспрессии DOG1 связана с переходом от веретеноклеточного к эпителиоидному фенотипу стромальных опухолей желудка с мутациями KIT или PDGFRA, что подтверждает предположение, что фенотипическая гетерогенность ГИСО вторична [34]. Другой маркер ГИСО, PKC theta [35], менее специфичен, чем DOG1, но может быть полезен, особенно в CD117-негативных опухолях [33]. ГИСО обычно диагностируют с помощью ИГХ-метода с панелью маркеров, включающей CD117, CD34, DOG1, десмин, SMA и S-100. Диагноз устанавливается при положительном окрашивании CD117 и / или DOG1, десмина (+ / –), SMA (–) и S-100 (–) [18].

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

ТОМ 2

2015

32

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2,

остатков тирозина во внутриклеточном участке рецептора KIT с передачей фосфата на различные субстратные молекулы, участвующие в передаче сигнала [47] (рис. 1). Мутации в тех или иных участках приводят к лиганднезависимой активации рецепторных ТК KIT или PDGFR-α и активации сигнальных путей RAS/ MAPK, PI3K/AKT и JAK/STAT [47], что вызывает активацию клеточного цикла, пролиферацию и подавление апоптоза (рис. 2). Изучение мутантного статуса KIT и PDGFRA в ГИСО показало, что мутации: • позволяют подтвердить диагноз в трудных случаях; • являются мишенью для таргетных препаратов; • предсказывают ответ на таргетную терапию; • определяют устойчивость к терапии (верно для вторичных мутаций); • имеют прогностическое значение; • важны для назначения адъювантной терапии.

P 568 570

P P

SFK

SHP-2

P

SHP-1 P

ТК1 703 721 730 747

936

P

P

Grb2

P P P P

823 ТК2 900

APS

p110

p85 P

Crk

P P

p85

Cbl P

Grb2 Grb7

APS P

Мутации гена KIT Всего в ГИСО описана 301 мутация KIT [48]. По данным С.L. Сorless и M.C. Heinrich, полученным при исследовании более 2000 пациентов, 78,5 % ГИСО имеют мутации гена KIT, 7,5 % – гена PDGFRA, а 14 % ГИСО содержат KIT и PDGFRA дикого типа [1]. Мутации KIT и PDGFRA – взаимоисключающие. Нами при изучении 312 ГИСО мутации KIT обнаружены в 73,1 % случаев, мутации PDGFRA – в 12,5 %, и 14,4 % ГИСО имели гены KIT и PDGFRA дикого типа [49–51]. Стромальные опухоли ЖКТ с различными мутантными формами белка KIT отличаются по механизму активации. В спорадических ГИСО наиболее часто мутации KIT возникают в 11-м экзоне (65–67 %), ко-

Рис. 1. Схема строения рецептора KIT и субстратных молекул [47]

дирует трансмембранный участок рецептора, 11-й экзон – регуляторный подмембранный домен, 13-й и 14-й экзоны – ТК1, связывающий аденозитрифосфат, затем идет так называемая киназная вставка (15-й и 16-й экзоны), 17-й и 18-й экзоны кодируют ТК2, обладающий ТК-активностью [46, 47]. В норме димеризованный лиганд SCF, связываясь с молекулой рецептора KIT, приводит к его димеризации и последующей активации за счет аутофосфорилирования по остаткам тирозина Y568 и Y570 в регуляторном домене. Далее происходит фосфорилирование других KIT или PDGFRA димер

P

P

P

P

NF-1 GTP

GDP

STAT3

RAS

STAT сигналинг

RAF1

P1P2 P13K P1P3

AKT

MAP2K1/2

Рис. 2. Основные сигнальные пути в ГИСО [10]

PTEN

MAPK3/1

BAD

Транскрипция

Выживаемость

FRA P1

RPS6KBI

Синтез белков и рост клетки

Мутации гена PDGFRA Мутации в гене PDGFRA первоначально описаны в 5–8 % стромальных опухолей ЖКТ с эпителиоид-

2015

они включают от 1 до нескольких делеций или дупликаций, сосуществующих с маленькими вставками. В 11-м и 9-м экзонах KIT также обнаружены уникальные делеции, осложненные вставками комплементарно-инвертированных ДНК-последовательностей, так называемые делеции – инверсии (delinv) [57]. Первично-множественные ГИСО с разными мутациями в гене KIT могут быть поликлональны: в 2 опухолях в сальнике выявлены делеция кодонов M552-K558 и точечная замена V559D в 11-м экзоне [58]. В 9–10 % ГИСО, чаще всего агрессивных стромальных опухолях тонкой кишки веретеноклеточного строения, обнаружены мутации в 9-м экзоне KIT. Мутации представлены преимущественно дупликацией кодонов A502-Y503, F506-F508 [1, 2, 29, 48–51]. Недавно в 2 ГИСО обнаружена дупликация S501-A502, ранее описанная у детей с мастоцитозом или при лейкозе тучных клеток. ГИСО с дупликацией S501-A502 более чувствительны к иматинибу и нилотинибу, чем опухоли с дупликацией A502-Y503 [59]. Хотя мутации в 9-м экзоне KIT характерны для опухолей тонкой кишки, мы обнаружили дупликацию A502-Y503 в опухоли желудка, причем заболевание протекало менее агрессивно, чем ГИСО тонкой кишки [49–51]. Недавно эти данные подтверждены при исследовании более 1500 пациентов: мутации в 9-м экзоне KIT выявлены в 9 % ГИСО, при этом 20 % опухолей с мутациями в 9-м экзоне были локализованы в желудке и прямой кишке, описаны 3 новые мутации [60]. ГИСО с первичными мутациями в 13-м или 17-м экзонах (ТK1 и ТК2 домены KIT) очень редки (1–2 %), при этом более агрессивны стромальные опухоли желудка, чем тонкой кишки [29, 61]. Чаще всего встречается замена K642E, которая может быть герминальной [62]. ГИСО с мутацией K642E – редкое аутосомно-доминантное заболевание. Описаны случаи ГИСО с двойной мутацией K642E и V643I и случай множественной ГИСО с этой мутацией [62]. У пациентов из Азии выявлены уникальные мутации в 13-м экзоне KIT: E635K, L641P, V643A, L647P, M651V и N655K [63, 64]. Мутации K642E и N655K приводят к конститутивному фосфорилированию ТК KIT и отвечают за чувствительность к иматинибу [65]. Нами впервые в ГИСО желудка выявлена мутация T632A [51]. Мутации в 17-м экзоне KIT встречаются не более чем в 1 % случаев первичных ГИСО, чаще всего выявляется замена N822K [61]. Обычно в стромальных опухолях присутствуют гетерозиготные мутации, однако гомозиготные мутации встречаются в 8–15 % опухолей, ассоциированы со злокачественной прогрессией и являются неблагоприятным прогностическим признаком [66].

33

2,

дирующем регуляторный подмембранный домен, и 9-м экзоне (10 %), кодирующем внеклеточный домен рецептора, тогда как 65 % мутаций в гене PDGFRA затрагивают 18-й экзон, кодирующий ТК2. Мутации в 11-м экзоне KIT приводят к постоянной активации рецептора KIT и встречаются в опухолях различной локализации, гистологического типа и клинической картины [1, 29, 48–51]. Чаще всего это делеции или делеции с заменами разного размера без сдвига рамки считывания в районе кодонов 550– 563 на 5’-конце 11-го экзона, кодирующем фрагмент белка, который обеспечивает ингибирование аутофосфорилирования рецептора в отсутствие лиганда [52]. К наиболее частым относятся мутации кодонов W557 и / или K558, именно делеция W557-K558 коррелирует с высокой скоростью прогрессирования опухоли и метастазированием [53]. Делеции могут затрагивать акцепторные сайты сплайсинга в 10-м интроне – 11-м экзоне KIT, делеции на белковом уровне K550-K558 затрагивают акцепторные сайты сплайсинга на 3’-конце пре-мРНК [54, 55] и вызывают постоянное фосфорилирование ТК KIT. Другой тип мутации в 11-м экзоне KIT – крупные делеции (delTyr), включающие сайты аутофосфорилирования Y568 и/или Y570 [41, 49, 50, 56]. Установлено, что делеция W557-K558 чаще встречается в опухолях желудка (75 %), тогда как опухоли с delTyr чаще поражают кишечник (70 %). ГИСО с delTyr в 11-м экзоне KIT независимо от локализации отличаются неблагоприятным прогнозом после хирургического лечения и терапии иматинибом [56]. При сравнении выживаемости пациентов c ГИСО без терапии иматинибом выживаемость больных с мутациями delTyr оказалась хуже, чем с делециями или другими мутациями 11-го экзона KIT [50, 51]. В 12–15 % ГИСО имеются точечные замены (миссенс-мутации) в строго определенных сайтах в 11-м экзоне (W557R, V559D/A/G/I, V560D, L576P), и такие ГИСО отличаются относительно низким риском прогрессии. Некоторые из этих мутаций обнаруживают в редких семейных случаях ГИСО, т. е. эти мутации могут быть герминальными [15]. Мутации на 3’-конце 11-го экзона KIT встречаются реже, примерно 8 % ГИСО имеют дупликации 2–18 кодонов. Эти стромальные опухоли имеют благоприятный прогноз, чаще встречаются в желудке, преимущественно у женщин старшего возраста и обычно не имеют метастазов [1, 29, 50, 51]. Кроме того, на 3’-конце 11-го экзона гена KIT чаще других встречается замена L576P и очень редко делеция (del D579). Вставки в 11-м экзоне KIT очень редки и обнаружены только в положении K558, вставка 3 нуклеотидов приводит к замене K558 на аминокислоты DP или реже на NQ, что является причиной конститутивного фосфорилирования рецептора KIT [29]. Сложные делеции-вставки и дупликации-вставки – относительно редкие мутации 11-го экзона KIT,

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

2015

34

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2,

Дикий тип 10,58 %

8-й экзон KIT 0,15 %

ТОМ 2 9-й экзон KIT 9,33 %

18-й экзон PDGFRA 13,99 % 14-й экзон PDGFRA 0,59 % 12-й экзон PDGFRA 1,85 % 17-й экзон KIT 1,70 % 13-й экзон KIT 1,85 %

11-й экзон KIT 59,96 %

Рис. 3. Частота мутаций KIT и PDGFRA в 1351 ГИСО [69]

ным или смешанным типом клеток, локализованных в желудке, брыжейке или сальнике [27–29, 67]. Частота мутаций PDGFRA в ГИСО варьирует от 1 % на Тайване [36] до 16,4 % в Германии [68], что, очевидно, связано с частотой встречаемости опухолей желудка и этническими особенностями. Мутации PDGFRA выявлены в 9–10 % ГИСО у российских больных [49–51]. Всего описано 60 типов мутаций в 18-м экзоне PDGFRA [68]. На рис. 3 представлена частота мутаций KIT и PDGFRA в 1351 ГИСО у пациентов из регистра Бонна–Кельна (Германия) [69]. Наиболее распространены мутации в 18-м экзоне PDGFRA, кодирующем ТК-домен рецептора [29, 49, 68]. Чаще всего в 5 % ГИСО выявляют миссенс-мутацию D842V в 18-м экзоне, которая обеспечивает устойчивость к терапии иматинибом. Эта мутация составляет до 80 % всех мутаций в 18-м экзоне, реже встречаются делеции D842-H845 либо I843-D846, точечные замены Y849 и другие мутации. В российской популяции мутация D842V также встречается в 5 % ГИСО, но составляет только половину от всех мутаций 18-го экзона [49–51]. В 1–2 % ГИСО выявляют мутации в 12-м экзоне, кодирующем регуляторный домен PDGFR-α, наиболее распространена мутация V561D, которая является герминальной. Частота мутации в 14-м экзоне PDGFRA составляет менее 1 % ГИСО. Установлено, что в то время как фосфорилированный рецептор PDGFR-α дикого типа активирует сигнальные пути PI3K-АКТ, МАРК (ERK 1/2) и PLC-γ [47], мутантные PDGFR-α рецепторы (V561D и D842Y) могут также активировать транскрипционные факторы STAT – STAT1, STAT3 и STAT5, при этом изменяется локализация рецептора – он локализуется внутри клетки на эндоплазматическом ретикулуме [70]. При семейном синдроме ГИСО у человека наследственные мутации KIT или PDGFRА схожи с мутациями, найденными в спорадических ГИСО. Это точечные замены W557R, V559A, V560G, делеции V560, D579 и дупликации Q575-L576 в подмембранном домене KIT [15]. Мутация L576P также является герми-

нальной и встречается у пациентов с синдромом семейного ГИСО [71]. Описаны наследственные мутации в ТК-доменах KIT (K642E и N820Y) [65, 72] и PDGFRА (Y555C и V561D) [68]. Опухоли с мутацией K642E чувствительны к иматинибу [63]. Делеция D419 в 8-м экзоне KIT впервые была описана как герминальная мутация, однако недавно выявлена в спорадических опухолях – в 1,4 % случаях ГИСО, которые относили к дикому типу [69]. Прогностическое значение мутаций KIT и PDGFRA Тип мутации коррелирует с выживаемостью после хирургического лечения ГИСО в отсутствие таргетной терапии. Изучение прогностической роли мутаций проводится до начала таргетной терапии, либо как ретроспективное, либо при изучении контрольных групп пациентов, получавших плацебо [73]. У пациентов с мутациями PDGFRA выживаемость выше, чем у пациентов с мутациями KIT [1, 49, 50, 74, 75]. Точечные мутации и дупликации в 11-м экзоне KIT коррелируют с менее агрессивным поведением ГИСО, так же как и опухоли с мутацими PDGFRA. Опухоли с делециями 11-го экзона и мутациями 9-го экзона KIT отличаются быстрым прогрессированием и неблагоприятным прогнозом [49, 50, 74]. Французские исследователи обнаружили 138 различных мутаций KIT (71 %) и PDGFRA (15 %) при анализе 492 ГИСО, однако среди метастатических опухолей мутации KIT и PDGFRA выявлены в 82,8 и 2,1 % соответственно (p < 0,0001). Мутации в 18-м экзоне PDGFRA и замены в 11-м экзоне KIT (W557R и V559D) чаще выявляли у пациентов с локализованными ГИСО, тогда как дупликации в 9-м экзоне KIT и делеции W557-V559 в 11-м экзоне были характерны для метастатических ГИСО [74].

Pезультаты мультицентрового европейского исследования (Contica GIST) 5-летней безрецидивной выживаемости 1054 пациентов с ГИСО представили убедительные доказательства независимой прогностической роли мутаций [75]. Показано, что негативный прогноз связан с размером опухоли ≥ 10 см, наличием ≥ 10 митозов в 50 полях зрения и наличием мутации в 9-м экзоне (р = 0,037) или делеции в 11-м экзоне, затрагивающей кодоны W557-K558 (р = 0,004), причем негативный прогноз при мутациях в 11-м экзоне был важен только для опухолей желудка (p = 0,001), но не для ГИСО другой локализации, тогда как мутации PDGFRA были индикатором лучшего прогноза ГИСО (р = 0,002). В то же время в крупных американском ACOSOG Z9001 и немецко-скандинавском исследованиях такие результаты не получены [76]. Поэтому вопрос о прогностической значимости мутаций KIT и PDGFRA и возможном включении данных анализа мутаций в качестве дополнительного прогностического фактора активно обсуждается, но официально фактором прогноза ГИСО мутации на сегодня не признаны.

KIT и PDGFR А – мишени таргетной терапии гастроинтестинальных стромальных опухолей Открытие мутаций в рецепторах KIT и PDGFR-α по времени совпало с созданием ингибиторов ТК, что привело к значительным успехам в терапии на основе новых молекулярно-направленных (таргетных) препаратов – иматиниба мезилата (Гливек), cунитиниба (Сутент) и др. При применении иматиниба установлено, что индивидуальный ответ на тот или иной препарат зависит от типа мутации и дозы препарата. Положительный ответ у больных с метастатическими или неоперабельными ГИСО наблюдали уже через 13 нед после начала лечения иматинибом; если эффекта не было, то через 6 мес лечение прекращали. Ответ на иматиниб (400 мг/сут) наблюдали у 80 % пациентов с ГИСО с мутациями в 11-м экзоне KIT и у 50 % – с мутациями в 9-м экзоне, что привело к увеличению дозы иматиниба для ГИСО при мутации в 9-м экзоне до 800 мг/сут [90]. Если до эры иматиниба средняя продолжительность жизни пациентов с метастатическим ГИСО была 19 мес, то после назначения иматиниба период до прогрессирования составил 26 мес, а общая выживаемость – 60 мес [91, 92]. Устойчивостью к иматинибу обладают редкие опухоли с первичными мутациями в ТК-доменах рецептора KIT (13-й и 17-й экзоны), однако ГИСО с мутацией в 13-м экзоне KIT K642E (наследственной или спорадической) в 90 % случаев отвечают на иматиниб [56]. Наиболее яркий пример устойчивости к иматинибу – опухоли с мутацией D842V в 18-м экзоне PDGFRA, тогда как ГИСО с делециями в 18-м экзоне PDGFRA, а также с мутацией V561D в 12-м экзоне чувствительны [1, 27]. Объективный ответ на иматиниб отмечен у 23–40 % больных ГИСО с диким типом KIT и PDGFRA. Таким образом, мутации ТК KIT и PDGFR-α в ГИСО имеют предиктивное значение. На основании данных молекулярного анализа и результатов изучения ответа на таргетную терапию иматинибом была предложена молекулярная классификация ГИСО [1]. ГИСО с мутациями в 11-м экзоне KIT наиболее чувствительны к ингибирующему действию иматиниба, однако степень чувствительности

2015

на уровне белка), в результате которой прерывается синтез белка [89], что вызывает нарушения в комплексе транспорта электронов. Выявлены также новые мутации Q54X, T267M и кодон 1663+3G>C [87]. Установлено, что в опухолях с мутацией SDHA снижена экспрессия как SDHA, так и SDHB [88]. Таким образом, группа пациентов с KIT и PDGFRA дикого типа гетерогенна и требует специального подхода при оказании терапевтической помощи. Выявление типа и локализации мутаций в генах KIT и PDGFRA, а также в ГИСО дикого типа необходимо для уточнения диагноза, оценки прогноза и выбора препаратов индивидуализированной таргетной терапии.

35

2,

Гастроинтестинальные стромальные опухоли с KIT и PDGFRA дикого типа В 10–15 % ГИСО содержатся гены KIT и PDGFRA дикого типа, но они экспрессируют CD117 или DOG1 [1, 2, 29]. Эта группа опухолей также гетерогенна, они встречаются у взрослых, детей, пациентов с наследственными синдромами и первично-множественными опухолями: нейрофиброматозом, триадой Карнея. В 7 % ГИСО с KIT и PDGFRA дикого типа обнаружена мутация серин-треониновой киназы BRAF V600E и имеет место активация сигнального пути RAS-MAPK [77]. Все случаи ГИСО c мутацией BRAF представляли собой высокозлокачественные стромальные опухоли тонкой кишки у женщин в возрасте 49–55 лет. Впервые ингибирование BRAFположительной ГИСО получено при использовании ингибитора BRAF дабрафениба у пациента с мутацией V600E [78]. Однако через 6 мес появилась устойчивость к препарату, которую связывают с мутацией PIK3CA (H1047R) и нарушениями CDKN2A, что было установлено при полноэкзомном секвенировании [78]. Онкогенными «драйверами» ГИСО c KIT и PDGFRA дикого типа также могут быть гены IGF1R (при его мутации или амплификации) [79] и PIK3CA [80]. Другая группа ГИСО c KIT и PDGFRA дикого типа представляет собой наследственные синдромы. Аутосомно-доминантно наследуемый нейрофиброматоз 1-го типа преимущественно поражает тонкую кишку [81, 82]. Пациенты с синдромом Карнея–Стратакиса (чаще молодые женщины) страдают от ГИСО желудка и параганглиом, а при триаде Карнея еще и от хондром легкого [83]. Было показано, что герминальные мутации в генах сукцинатдегидрогеназы (SDH) (SDHA, SDHB, SDHC, SDHD) характерны не только для больных с наследственной параганглиомой или феохромоцитомой, но и для пациентов с ГИСО с параганглиомой, или синдромом Карнея–Стратакиса, или триадой Карнея [84]. ГИСО у детей чаще возникают у девушек 12–19 лет, имеют эпителиоидный фенотип и могут быть мультифокальны, 85 % содержат гены KIT и PDGFRA дикого типа и у некоторых имеется дефицит [85]. Большинство больных ГИСО дикого типа отличаются низкой экспрессией SDH за счет инактивирующих мутаций в генах, кодирующих субъединицы комплекса SDH (SDHA, SDHB, SDHC, SDHD) [86, 87]. Инактивация субъединиц SDH ведет к активации сигнальных путей, связанных с гипоксией и ангиогенезом. В опухолях с дефицитом SDH активируется транскрипционный фактор HIF, повышающий экспрессию фактора роста эндотелия сосудов VEGF, что ведет к пролиферации и ангиогенезу в условиях псевдогипоксии [85]. Мутации SDHA и SDHB могут быть герминальными при синдроме Карнея–Стратакиса или спорадическими [85–89]. Наиболее часто в SDHA-дефицитных ГИСО встречаются мутации SDHA, в частности герминальная мутация SDHA (R31Х

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ Первичные мутации

Белковые домены

ТОМ 2

Вторичные домены

Чувствительность к препарату IM SU

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2,

2015

36

Ligand binding 9-й экзон: 12 % 11-й экзон: 70 % 13-й экзон: 1 % 17-й экзон: 1 %

13-й экзон

14-й экзон Мембрана Подмембранный домен АТФ-связывающий домен 17-й экзон Активационная петля 18-й экзон

V654A T701I Y823D D816A/G/H/V D820A/E/G/Y N822H/K Y823D A829P Устойчивые Промежуточные Чувствительные

Рис. 4. Чувствительность вторичных мутаций в гене KIT к тирозинкиназным ингибиторам иматинибу и сунитинибу [96]

варьирует в зависимости от типа мутации. Так, ГИСО с мутацией L576P в 11-м экзоне имеет минимальную чувствительность к иматинибу по сравнению с другими мутациями 11-го экзона [93], причем это было предсказано in silico. Ингибирующее действие иматиниба может отличаться для мутаций, затрагивающих один и тот же кодон. В исследовании in vitro показано, что при редкой мутации V559I активированный рецептор KIT резистентен к иматинибу в противоположность распространенной мутации V559D [94]. В среднем через 24 мес (6–31 мес) после начала лечения более чем у 60 % пациентов c метастатическими ГИСО, содержащими мутацию в 11-м или 9-м экзоне гена KIT, появляется устойчивость к иматинибу [95, 96]. В первую очередь это связано с появлением вторичных мутаций в 13-, 14- и 17-м экзонах гена KIT, кодирующих ТК-домены рецептора KIT, либо в 15-м или 16-м экзонах, кодирующих ТК-вставку (рис. 4). Чаще всего встречаются мутации KIT V654A (13-й экзон), T670I (14-й экзон), D816A / G / H / V, N822H / K, Y823D (17-й экзон), причем мутация V654A менее устойчива к иматинибу, чем T670I [63, 65]. Вторичные мутации очень редко возникают у пациентов с мутациями PDGFRA и не появляются у больных ГИСО с диким типом KIT и PDGFRA.

Вторичные мутации появляются только в прогрессирующих опухолях [91, 95, 96]. Описаны случаи появления 2–5 разных мутаций в метастазах у 1 больного, а также 2 мутаций одновременно в одном и том же метастазе, что позволило сделать важный вывод о гетерогенности и поликлональности ГИСО [97, 98]. Феномен вторичной устойчивости к ТК-ингибиторам, обнаруженный и изученный на модели ГИСО, позже был подтвержден для рецептора EGFR (мутация Т709М) при немелкоклеточном раке легкого [99] и киназы BCR-ABL при хроническом миелоидном лейкозе (мутация T351I) [100]. Кроме вторичных мутаций KIT устойчивость к действию иматиниба может быть связана с активацией альтернативных сигнальных путей, таких как AKT / mTOR, активацией альтернативного ТК-рецептора (AXL) и утратой экспрессии рецептора KIT, амплификацией гена KIT. Поиск новых ТК-ингибиторов, вызванный наличием первичной или приобретением вторичной устойчивости ГИСО к иматинибу, привел к созданию таких препаратов, как сунитиниб (Сутент), нилотиниб (Тасигна), десатиниб (Спрайцел), сорафениб (Нексавар), маситиниб, регорафениб и креноланиб. Чувствительность к этим препаратам строго коррелирует с типом первичной или вторичной мутации, и генотипирование ГИСО необходимо для выбора препарата для таргетной терапии. В таблице отражена активность ТКингибиторов in vitro на культурах клеток с мутациями KIT или PDGFRA, устойчивых к иматинибу. Сунитиниб с 2006 г. является лицензированным препаратом 2-й линии терапии ГИСО [101–104]. Он обладает активностью против ТК-рецепторов 3-го типа (KIT, PDGFR-α, PDGFR-β), а также антиангиогенными свойствами (подавляет VEGFR1, 2 и 3). В 1-й линии сунитиниб более эффективен в ингибировании ГИСО с мутацией в 9-м экзоне KIT и ГИСО дикого типа, чем с мутацией в 11-м экзоне KIT. Кроме того, сунитиниб более эффективен в ингибировании ГИСО с вторичными мутациями в 13-м и 14-м экзонах KIT, чем в 17-м экзоне. Напротив, нилотиниб более эффективно подавляет фосфорилирование KIT c вторичными мутациями в 17-м экзоне KIT, чем сунитиниб [105],

Активность ингибиторов ТК in vitro KIT, 13-й экзон, V654A

KIT, 14-й экзон, T670I

KIT, 17-й экзон, D816V

PDGFRA, 18-й экзон, D842V

Иматиниб

Нет

Нет

Нет

Нет

Сунитиниб

Есть

Есть

Нет

Нет

Нилотиниб

Есть

Нет

_

Нет

Маситиниб

Есть

Некоторая

Нет

_

Десатиниб

Некоторая

Нет

_

Есть

Мидостаурин

Некоторая

Есть

Есть

Есть

Препарат

в частности у больных с нейрофиброматозом или триадой Карнея. Также не выявлены преимущества адъювантной терапии у больных ГИСО с мутацией в 9-м экзоне гена KIT. Согласно исследованию 317 пациентов, получавших иматиниб в течение 1 года после операции, и 328 пациентов с плацебо, адъювантная терапия иматинибом, скорее всего, не изменяет общую выживаемость [76]. При этом терапия иматинибом была ассоциирована с высокой безрецидивной выживаемостью только у пациентов с различными делециями в 11-м экзоне KIT, но не с точечными заменами или вставками в 11-м экзоне KIT, мутациями в 9-м экзоне KIT, мутациями PDGFRA или ГИСО дикого типа. В 2015 г. опубликованы результаты изучения последствий назначения адъювантной терапии пациентам с ГИСО после операции в 2008 г., при этом учитывали риск прогрессии и возраст [113]. Показано, что 30 % пациентов с низким риском получили адъювантную терапию избыточно, тогда как 26–40 % пациентов с высоким риском недополучили ее. Несомненно, трудно предвидеть результаты заранее, но следует отметить, что в этой работе при назначении адъювантной терапии не указано, принимали ли во внимание результаты генетического анализа. Таким образом, выявление типа и локализации мутаций в генах KIT и PDGFRA в ГИСО необходимо для уточнения диагноза, оценки прогноза и выбора препаратов индивидуализированной таргетной терапии.

Л И Т Е Р А Т У Р А 1. Corless C.L., Heinrich M.C. Molecular pathobiology of gastrointestinal stromal sarcomas. Annu Rev Pathol 2008;3:557–86.

2. Joensuu H., Hohenberger P., Corless C.L. Gastrointestinal stromal tumour. Lancet 2013;382(9896):973–83.

3. Mazur M.T., Clark H.B. Gastric stromal tumors: Reappraisal of histogenesis. Am J Surg Pathol 1983;7(6):507–19.

4. Sarlomo-Rikala M., Kovatich A.J., Barusevicius A., Miettinen M. CD117: a sensitive marker for gastrointestinal stromal tumors that is more specific than CD34. Mod Pathol 1998;11(8):728–34.

5. Hirota S., Isozaki K., Moriyama Y. et al.

Gain of function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors. Science 1998;279(5350):577–80.

6. Hasegawa T., Matsuno Y., Shimoda T., Hirohashi S. Gastrointestinal stromal tumor: consistent CD117 immunostaining for diagnosis, and prognostic classification based on tumor size and MIB-1 grade. Hum Pathol 2002;33(6):669–76.

7. Sircar K., Hewlett B.R., Huizinga J.D. et al. Interstitial cells of Cajal as precursors

of gastrointestinal stromal tumors. Am J Surg Pathol 1999;23(4):377–89.

8. Ogasawara N., Tsukamoto T., Inada K. et al. Frequent c-KIT gene mutations not only in gastrointestinal stromal tumors but also in interstitial cells of Cajal in surrounding normal mucosa. Cancer Lett 2005;230(2):199–210.

9. Miettinen M., Lasota J. Gastrointestinal stromal tumors: pathology and prognosis at different sites. Semin Diagn Pathol 2006;23(2):70–83.

10. Rubin B.P., Heinrich M.C., Corless C.L. Gastrointestinal stromal tumour. Lancet 2007;369(9574):1731–41.

11. Casali P.G., Blay J.Y. Gastrointestinal stromal tumors: ESMO Clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol 2010;Suppl 5: v98–102.

12. Снигур П.В., Анурова О.А., Петровичев Н.Н., Сельчук В.Ю. Клиникоморфологические особенности стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта. Вопросы онкологии 2003;49 (6): 705–10. [Snigur P.V., Anurova O.A.,

Petrovichev N.N., Selchuk V.Yu. Clinical and morphological peculiarities of gastrointestinal stromal tumors. Voprosy onkologii = Oncology Issues 2003;49(6):705–10. (In Russ.)].

13. Стилиди И.С., Архири П.П., Анурова О.А., Мазуренко Н.Н. Стромальные опухоли желудочно-кишечного тракта: клинико-морфологические особенности, патогенез и современные подходы к лечению. Вестник Российской академии медицинских наук 2010;2:46–52.

[Stilidi I.S., Arkhiri P.P., Anurova O.A., Mazurenko N.N. Gastrointestinal stromal tumors: clinical and morphological peculiarities, pathogenesis, and modern approaches to treatment. Vestnik Rossiyskoy akademii meditsinskikh nauk = Herald of the Russian Academy of Medical Sciences 2010;2:46–52. (In Russ.)].

14. Joensuu H., Roberts P.J., SarlomoRikala M. et al. Effect of the tyrosine kinase inhibitor STI571 in a patient with a metastatic gastrointestinal stromal tumor. N Engl J Med 2001;344(14):1052–56.

15. Postow M.A., Robson M.E. Inherited gastrointestinal stromal tumor syndromes:

2015

в то же время нилотиниб не может быть рекомендован в 1-й линии вместо иматиниба для лечения неоперабельных и метастатических ГИСО [106]. Однако в процессе лечения сунитинибом также развиваются вторичные мутации, вызывающие резистентность к препарату (см. рис. 4) [103, 104]. Эти препараты также могут быть более активны, чем иматиниб, при лечении ГИСО дикого типа [107, 108]. Все указанные препараты прошли тестирование в терапии 1-й линии либо в комбинированной терапии с иматинибом в рандомизированных исследованиях у больных ГИСО [104]. Так, после появления через 6 мес мутации в 17-м экзоне и устойчивости к иматинибу была назначена комбинация сорафениба и иматиниба, которая оказалась эффективной в течение 2 лет [109]. Регорафениб был эффективен при назначении в 3-й линии терапии после прогрессирования на фоне иматиниба и сунитиниба [110, 111]. Вопрос о прогностической значимости мутаций связан с вопросом об адъювантной терапии. Рекомендовано проводить адъювантную терапию иматинибом взрослым пациентам только при значительном риске прогрессии (среднем или высоком) [112]. При назначении адъювантной терапии необходимо проводить оценку риска прогрессии с учетом не только локализации, размера, митотического индекса, но и типа мутации. Нецелесообразно назначать адъювантную терапию при наличии мутации D842V в гене PDGFRA и при ГИСО c KIT и PDGFRA дикого типа,

37

2,

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

2015

mutations, clinical features, and therapeutic implications. Clin Sarcoma Res 2012;2(1):16.

16. Janeway K.A., Albritton K.H., Van Den Abbeele A.D. et al. Sunitinib treatment in pediatric patients with advanced GIST following failure of imatinib. Pediatr Blood Cancer 2009;52(7):767–71.

17. Bennett J.J., Rubino M.S. Gastrointestinal stromal tumors of the stomach. Surg Oncol Clin N Am 2012;21(1):21–33.

18. Цыганова И.В., Анурова О.А., Мазуренко Н.Н. Морфологические особенности и критерии прогноза стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта. Архив патологии 2011;73(6):37–42.

[Tsyganova I.V., Anurova O.A., Mazurenko N.N. Morphological peculiarities and prognosis criteria of gastrointestinal stromal tumors.

Arkhiv patologii = Pathology Archive 2011; 73 (6):37–42. (In Russ.)].

19. Анурова О.А., Снигур П.В., Филиппова Н.А., Сельчук В.Ю. Морфологическая характеристика стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта. Архив патологии 2006;1(68):10–13. [Anurova O.A., Snigur P.V., Filippova N.A., Selchuk V.Yu. Morphological characteristics of gastrointestinal stromal tumors. Arkhiv patologii = Pathology Archive 2006;1(68): 10–13. (In Russ.)].

20. Rammohan A., Sathyanesan J., Rajendran K. et al. A gist of gastrointestinal stromal tumors: a review. World J Gastrointest Oncol 2013;5(6):102–12.

21. Agaimy A., Wünsch P.H., Hofstaedter F. et al. Minute gastric sclerosing stromal tumors (GIST tumorlets) are common in adults and frequently show c-KIT mutations. Am J Surg Pathol 2007;31(1):113–20.

22. Kawanowa K., Sakuma Y., Sakurai S. et al.

High incidence of microscopic gastrointestinal stromal tumors in the stomach. Hum Pathol 2006;37(12):1527–35.

23. Agaimy A. Gastrointestinal stromal tumors (GIST) from risk stratification systems to the new TNM proposal: more questions than answers? A review emphasizing the need for a standardized GIST reporting. Int J Clin Exp Pathol 2010;3(5):461–71.

24. Gold J.S., Gönen M., Gutiérrez A. et al.

Development and validation of a prognostic nomogram for recurrence-free survival after complete surgical resection of localised primary gastrointestinal stromal tumour: a retrospective analysis. Lancet Oncol 2009;10(11):1045–52.

25. Besmer P., Murphy J.E., George P.C. et al.

A new acute transforming feline retrovirus and relationship of its oncogene v-kit with the protein kinase gene family. Nature 1986;320(6061):415–21.

26. Beadling C., Jacobson-Dunlop E., Hodi F.S. et al. KIT gene mutations and copy number in melanoma subtypes. Clin Cancer Res 2008:14(21):6821–8.

27. Heinrich M.C., Corless C.L., Duensing A. et al. PDGFRA activating mutations in gastrointestinal stromal tumors. Science 2003;299(5607):708–10.

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2,

38

ТОМ 2 28. Hirota S., Ohashi A., Nishida T. et al.

Gain-of-function mutations of platelet-derived growth factor receptor alpha gene in gastrointestinal stromal tumors.

Gastroenterology 2003;25(3):660–7.

29. Lasota J., Miettinen M. KIT and PDGFRA mutations in gastrointestinal stromal tumors (GISTs). Semin Diagn Pathol 2006;23(2):91–102.

30. Medeiros F., Corless C.L., Duensing A. et al. KIT-negative gastrointestinal stromal tumors: proof of concept and therapeutic implications. Am J Surg Pathol 2004;28(7):889–94.

31. West R.B., Corless C.L., Chen X. et al. The novel marker, DOG1, is expressed ubiquitously in gastrointestinal stromal tumors irrespective of KIT or PDGFR-α mutation status. Am J Pathol 2004;165(1):107–13.

32. Espinosa I., Lee C.H., Kim M.K. et al.

A novel monoclonal antibody against DOG1 is a sensitive and specific marker for gastrointestinal stromal tumors. Am J Surg Pathol 2008;32(2):210–8.

33. Wang C., Jin M.S., Zou Y.B. et al.

Diagnostic significance of DOG-1 and PKC-θ expression and c-Kit/PDGFRA mutations in gastrointestinal stromal tumours. Scand J Gastroenterol 2013;48(9):1055–65.

34. Agaimy A., Wang L.M., Eck M. et al. Loss of DOG-1 expression associated with shift from spindled to epithelioid morphology in gastric gastrointestinal stromal tumors with KIT and platelet-derived growth factor receptor α mutations. Ann Diagn Pathol 2013;17(2):187–91.

35. Kim K.M., Kang D.W., Moon W.S. et al.

PKC theta expression in gastrointestinal stromal tumor. Mod Pathol 2006;19(11): 1480–6.

36. Yang J., Du Х., Lazar A.J. et al. Genetic aberrations of gastrointestinal stromal tumors.

Cancer 2008;113(7):1532–43.

37. Perrone F., Tamborini E., Dagrada G.P. et al. 9p21 locus analysis in high-risk gastrointestinal stromal tumors characterized for c-KIT and platelet-derived growth factor receptor alpha gene alterations. Cancer 2005;104(1):159–69.

38. Бардина Е.М., Беляков И.С., Цыганова И.В. и др. Генетические нарушения в стромальных опухолях ЖКТ. Вопросы онкологии 2009;55:5–6. [Bardina E.M., Belyakov I.S., Tsyganova I.V. et al. Genetic disorders in gastrointestinal stromal tumors.

Voprosy onkologii = Oncology Issues 2009;55:5–6. (In Russ.)].

39. Gunawan B., von Heydebreck A., Sander B. et al. An oncogenetic tree model in gastrointestinal stromal tumours (GISTs) identifies different pathways of cytogenetic evolution with prognostic implications.

J Pathol 2007;211(4):463–70.

40. Schaefer I.M., Delfs C., Cameron S. et al.

Chromosomal aberrations in primary PDGFRA-mutated gastrointestinal stromal tumors. Hum Pathol 2014;45(1): 85–9.

41. Mazurenko N.N., Bardina E.M., Beliakov I.S., Tsyganova I.V. Analysis of KIT and PDGFR-α mutations and microsatellite DNA alterations in gastrointestinal stromal tumors. Eur J Cancer 2009;2:403.

42. Zhang Y., Cao H., Wang M. et al. Loss of chromosome 9p21 and decreased p16 expression correlate with malignant gastrointestinal stromal tumor. World J Gastroenterol 2010;16(37):4716–20.

43. Kaifi J.T., Wagner M., Schurr P.G. et al.

Allelic loss of Hox11L1 gene locus predicts outcome of gastrointestinal stromal tumors.

Oncol Rep 2006;16(4):915–9.

44. Haller F., Gunawan B., von Heydebreck A. et al. Prognostic role of E2F1 and members of the CDKN2A network in gastrointestinal stromal tumors. Clin Cancer Res 2005;11(18):6589–97.

45. Wallander M.L., Layfield L.J., Tripp S.R., Schmidt R.L. Gastrointestinal stromal tumors: clinical significance of p53 expression, MDM2 amplification, and KIT mutation status. Appl Immunohistochem Mol Morphol 2013;21(4):308–12.

46. Mol C.D., Lim K.B., Sridhar V. et al.

Structure of a c-kit product complex reveals the basis for kinase transactivation. J Biol Chem 2003;278(34):31461–4.

47. Rönnstrand L. Signal transduction via the stem cell factor receptor/с-Kit. Cell Mol Life Sci 2004;61(19–2):2535–48.

48. Joensuu H., Rutkowski P., Nishida T. et al.

KIT and PDGFRA mutations and the risk of GI stromal tumor recurrence. J Clin Oncol 2015;33(6):634–42.

49. Беляков И.С., Анурова О.А., Снигур П.В. и др. Мутации генов с-KIT и PDGFRA и клинико-морфологические особенности стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта. Вопросы онкологии 2007;53(6):677–81. [Belyakov I.S., Anurova O.A., Snigur P.V. et al. Mutations of the с-KIT and PDGFRA genes and clinical and morphological peculiarities of gastrointestinal stromal tumors. Voprosy onkologii = Oncology Issues 2007;53(6):677–81. (In Russ.)].

50. Мазуренко Н.Н., Беляков И.С., Цыганова И.В. и др. Значение молекулярно-генетических маркеров для прогноза и лечения стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта. Достижения и перспективы лекарственного лечения злокачественных опухолей. Этюды химиотерапии III. М.: Фармарус Принт Медиа 2011. C. 111–26.

[Mazurenko N.N., Belyakov I.S., Tsyganova I.V. et al. Significance of molecular and genetic markers for prognosis and treatment of gastrointestinal stromal tumors.

Achievements and Prospects of Medicinal Treatment of Malignant Tumors. Etudi himioterapii = Chemotherapy Studies III. Moscow: Pharmarus Print Media, 2011; р. 111–26. (In Russ.)].

51. Цыганова И.В., Беляков И.С., Анурова О.А., Мазуренко Н.Н. Прогностическое значение мутаций KIT и PDGFRA в гастроинтестинальных стромальных опу-

prognostic factor in primary gastrointestinal stromal tumors of gastric origin: A European multicenter analysis based on ConticaGIST. Clin Cancer Res 2014;20(23):6105–16.

76. Corless C.L., Ballman K.V., Antonescu C.R. et al. Pathologic and molecular features correlate with long-term outcome after adjuvant therapy of resected primary GI stromal tumor: the ACOSOG Z9001 trial.

J Clin Oncol 2014;32(15):1563–70.

77. Agaram N.P., Wong G.C., Guo T. et al.

V600E BRAF mutations in imatinib-naive and imatinib-resistant gastrointestinal stromal tumors. Genes Chromosomes Cancer 2008;47(10):853–9.

78. Falchook G.S., Trent J.C., Heinrich M.C. et al. BRAF mutant gastrointestinal stromal tumor: first report of regression with BRAF inhibitor dabrafenib (GSK2118436) and whole exomic sequencing for analysis of acquired resistance. Oncotarget 2013;4(2):310–5.

79. Tarn C., Rink L., Merkel E. et al. Insulinlike growth factor 1 receptor is a potential therapeutic target for gastrointestinal stromal tumors. Proc Natl Acad Sci USA 2008;105(24):8387–92.

80. Daniels M., Lurkin I., Pauli R. et al.

Spectrum of KIT/PDGFRA/BRAF mutations and phosphatidylinositol-3-kinase pathway gene alterations in gastrointestinal stromal tumors (GIST). Cancer Lett 2011;312(1): 43–54.

81. Miettinen M., Fetsch J.F., Sobin L.H., Lasota J. Gastrointestinal stromal tumors in patients with neurofibromatosis 1: a clinicopathologic and molecular genetic study of 45 cases. Am J Surg Pathol 2006;30(1):90–6.

82. Mussi C., Schildhaus H.U., Gronchi A. et al. Therapeutic consequences from molecular biology for gastrointestinal stromal tumor patients affected by neurofibromatosis type 1. Clin Cancer Res 2008;14(14):4550–5.

83. Carney J.A., Stratakis C.A. Familial paraganglioma and gastric stromal sarcoma: a new syndrome distinct from the Carney triad.

Am J Med Genet 2002;108(2):132–9.

84. Pasini B., McWhinney S.R., Bei T. et al.

Clinical and molecular genetics of patients with the Carney-Stratakis syndrome and germline mutations of the genes coding for the succinate dehydrogenase subunits SDHB, SDHC, and SDHD. Eur J Hum Genet 2008;16(1):79–88.

85. Janeway K.A., Kim S.Y., Lodish M. et al.

Defects in succinate dehydrogenase in gastrointestinal stromal tumors lacking KIT and PDGFRA mutations. Proc Natl Acad Sci USA 2011;108(1):314–8.

86. Miettinen M., Killian J.K., Wang Z.F. et al.

Immunohistochemical loss of succinate dehydrogenase subunit A (SDHA) in gastrointestinal stromal tumors (GISTs) signals SDHA germline mutation. Am J Surg Pathol 2013;37(2):234–40.

87. Wagner A.J., Remillard S.P., Zhang Y.X. et al. Loss of expression of SDHA predicts SDHA mutations in gastrointestinal stromal tumors. Mod Pathol 2013;26(2):289–94.

2015

of gastrointestinal stromal tumors in extragastric lesions. Int J Mol Med 2006;18(6):1067–71.

64. Kinoshita K., Hirota S., Isozaki K. et al.

Characterization of tyrosine kinase I domain c-kit gene mutation Asn655Lys newly found in primary jejunal gastrointestinal stromal tumor. Am J Gastroenterol 2007;102(5): 1134–6.

65. Graham J., Debiec-Rychter M., Corless C.L. et al. Imatinib in the management of multiple gastrointestinal stromal tumors associated with a germline KIT K642E mutation. Arch Pathol Lab Med 2007;131(9):1393–6.

66. Lasota J., vel Dobosz A.J., Wasag B. et al.

Presence of homozygous KIT exon 11 mutations is strongly associated with malignant clinical behavior in gastrointestinal stromal tumors. Lab Invest 2007;87(10):1029–41.

67. Wardelmann E., Hrychyk A., MerkelbachBruse S. et al. Association of platelet-derived growth factor receptor alpha mutations with gastric primary site and epithelioid or mixed cell morphology in gastrointestinal stromal tumors. J Mol Diagn 2004;6(3):197–204.

68. Künstlinger H., Binot E., MerkelbachBruse S. et al. High-resolution melting analysis is a sensitive diagnostic tool to detect imatinibresistant and imatinib-sensitive PDGFRA exon 18 mutations in gastrointestinal stromal tumors. Hum Pathol 2014;45(3):573–82.

69. Huss S., Künstlinger H., Wardelmann E. et al. A subset of gastrointestinal stromal tumors previously regarded as wild-type tumors carries somatic activating mutations in KIT exon 8 (p.D419del). Mod Pathol 2013;26(7):1004–12.

70. Bahlawane C., Eulenfeld R., Wiesinger M.Y. et al. Constitutive activation of oncogenic PDGFRα-mutant proteins occurring in GIST patients induces receptor mislocalisation and alters PDGFRα signalling characteristics. Cell Commun Signal 2015;13(1):21.

71. Neuhann T.M., Mansmann V., Merkelbach-Bruse S. et al. A novel germline KIT mutation (p.L576P) in a family presenting with juvenile onset of multiple gastrointestinal stromal tumors, skin hyperpigmentations, and esophageal stenosis. Am J Surg Pathol 2013;37(6):898–905.

72. Bachet J.B., Landi B., Laurent-Puig P. et al. Diagnosis, prognosis and treatment of patients with gastrointestinal stromal tumour (GIST) and germline mutation of KIT exon 13.

Eur J Cancer 2013;49(11):2531–41.

73. Keun P.C., Lee E.J., Kim M. et al.

Prognostic stratification of high risk gastrointestinal stromal tumors in the era of targeted therapy. Ann Surg 2008;247(6):1011–8.

74. Emile J.F., Brahimi S., Coindre J.M. et al.

Frequencies of KIT and PDGFRA mutations in the MolecGIST prospective populationbased study differ from those of advanced GISTs. Med Oncol 2012;29(3):1765–72.

75. Wozniak A., Rutkowski P., Schöffski P. et al. Tumor genotype is an independent

39

2,

холях. Молекулярная медицина 2015;2:64– 70. [Tsyganova I.V., Belyakov I.S., Anurova O.A., Mazurenko N.N. Prognostic significance of the KIT and PDGFRA mutations in gastrointestinal stromal tumors.

Molekulyarnaya meditsina = Molecular Medicine 2015;2:64–70. (In Russ.)].

52. Ma Y., Cunningham M.E., Wang X. et al.

Inhibition of spontaneous receptor phosphorylation by residues in a putative alpha-helix in the KIT intracellular juxtamembrane region. J Biol Chem 1999;274(19):13399–402.

53. Wardelmann E., Losen I., Hans V. et al.

Deletion of Trp-557 and Lys-558 in the juxtamembrane domain of the c-kit protooncogene is associated with metastatic behavior of gastrointestinal stromal tumors.

Int J Cancer 2003;106(6):887–95.

54. Corless C.L., McGreevey L., Town A. et al.

KIT gene deletions at the intron 10-exon 11 boundary in GI stromal tumors. J Mol Diagn 2004;6(4):366–70.

55. Chen L.L., Sabripour M., Wu E.F. et al.

A mutation-created novel intra-exonic premRNA splice site causes constitutive activation of KIT in human gastrointestinal stromal tumors. Oncogene 2005;24(26):4271–80.

56. Bachet J.B., Hostein I., Le Cesne A. et al.

Prognosis and predictive value of KIT exon 11 deletion in GISTs. Br J Cancer 2009;101(1): 7–11.

57. Lasota J., Miettinen M. KIT exon 11 deletion-inversions represent complex mutations in gastrointestinal stromal tumors.

Cancer Genet Cytogenet 2007;175(1):69–72.

58. Terada T. Primary multiple extragastrointestinal stromal tumors of the omentum with different mutations of c-kit gene. World J Gastroenterol 2008;14(47):7256–9.

59. Liu N.N., Ohkouchi M., Hashikura Y. et al. Extracellular domain c-kit mutation with duplication of Ser501Ala502 found in gastrointestinal stromal tumors is more imatinib- and nilotinib-sensitive than that with duplication of Ala502Tyr503. Lab Invest 2013;93(5):502–7.

60. Künstlinger H., Huss S., MerkelbachBruse S. et al. Gastrointestinal stromal tumors with KIT exon 9 mutations: Update on genotype-phenotype correlation and validation of a high-resolution melting assay for mutational testing. Am J Surg Pathol 2013;37(11):1648–59.

61. Lasota J., Corless C.L., Heinrich M.C. et al. Clinicopathologic profile of gastrointestinal stromal tumors (GISTs) with primary KIT exon 13 or exon 17 mutations: a multicenter study on 54 cases. Mod Pathol 2008;21(4):476–84.

62. Yamanoi K., Higuchi K., Kishimoto H. et al. Multiple gastrointestinal stromal tumors with novel germline c-kit gene mutation, K642T, at exon 13. Hum Pathol 2014;45(4):884–8.

63. Cho S., Kitadai Y., Yoshida S. et al.

Genetic and pathologic characteristics

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

2015

88. Pantaleo M.A., Astolfi A., Urbini M. et al.

Analysis of all subunits, SDHA, SDHB, SDHC, SDHD, of the succinate dehydrogenase complex in KIT/PDGFRA wild-type GIST. Eur J Hum Genet 2014;22(1):32–9.

89. Oudijk L., Gaal J., Korpershoek E. et al.

SDHA mutations in adult and pediatric wildtype gastrointestinal stromal tumors. Mod Pathol 2013;26(3):456–63.

90. Debiec-Rychter M., Sciot R., Le Cesne A. et al. KIT mutations and dose selection for imatinib in patients with advanced gastrointestinal stromal tumours. Eur J Cancer 2006;42(8):1093–103.

91. Heinrich M.C., Owzar K., Corless C.L. et al. Correlation of Kinase Genotype and Clinical Outcome in the North American Intergroup Phase III Trial of Imatinib Mesylate for Treatment of Advanced Gastrointestinal Stromal Tumor: CALGB 150105 Study

by Cancer and Leukemia Group B and Southwest Oncology Group. J Clin Oncol 2008;26(33):5360–7.

92. Duensing S., Duensing A. Targeted therapies of gastrointestinal stromal tumors (GIST) – the next frontiers. Biochem Pharmacol 2010;80(5):575–83.

93. Pierotti М.А., Tamborini Е., Negr T. et al.

Targeted therapy in GIST: in silico modeling for prediction of resistance. Nat Rev Clin Oncol 2011;8(3):161–70.

94. Nakagomi N., Hirota S. Juxtamembranetype c-kit gene mutation found in aggressive systemic mastocytosis induces imatinibresistant constitutive KIT activation. Lab Invest 2007;87(4):365–71.

95. Antonescu C.R., Besmer P., Guo T. et al.

Acquired resistance to imatinib in gastrointestinal stromal tumor occurs through secondary gene mutation. Clin Cancer Res 2005;11(11):4182–90.

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2,

40

ТОМ 2 96. Gramza A.W., Corless C.L., Heinrich M.C. Resistance to tyrosine kinase inhibitors in gastrointestinal stromal tumors. Clin Cancer Res 2009;15(24):7510–8.

97. Wardelmann E., Merkelbach-Bruse S., Pauls K. et al. Polyclonal evolution of multiple secondary KIT mutations in gastrointestinal stromal tumors under treatment with imatinib mesylate. Clin Cancer Res 2006;12(6):1743–9.

98. Liegl B., Kepten I., Le C. et al.

Heterogeneity of kinase inhibitor resistance mechanisms in GIST. J Pathol 2008;216(1):64–74.

99. Kobayashi S., Boggon T.J., Dayaram T. et al. EGFR mutation and resistance of nonsmall-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med 2005;352(8):786–92.

100. O'Hare T., Eide C.A., Tyner J.W. et al.

SGX393 inhibits the CML mutant BcrAblT315I and preempts in vitro resistance when combined with nilotinib or dasatinib.

Proc Natl Acad Sci USA 2008;105(14): 5507–12.

101. Joensuu H. Second line therapies for the treatment of gastrointestinal stromal tumor.

Curr Opin Oncol 2007;19(4):353–8.

102. Hopkins T.G., Marples M., Stark D. Sunitinib in the management of gastrointestinal stromal tumours (GISTs). Eur J Surg Oncol 2008;34(8):844–50.

103. Demetri G.D., Heinrich M.C., Fletcher J.A. et al. Molecular target modulation, imaging, and clinical evaluation of gastrointestinal stromal tumor patients treated with sunitinib malate after imatinib failure. Clin Cancer Res 2009;18(15):5902–9.

104. Heinrich M.C., George S., Bauer S. et al.

Optimizing the treatment of gastrointestinal stromal tumors: the role of tumor genotyping, imatinib blood level testing and new therapeutic strategies. Educational book.

ASCO, 2009; р. 454–60.

105. Hsueh Y.S., Lin C.L., Chiang N.J. et al.

Selecting tyrosine kinase inhibitors for gastrointestinal stromal tumor with secondary KIT activation-loop domain mutations. PLoS One 2013;8(6).

106. Blay J.Y., Shen L., Kang Y.K. et al.

Nilotinib versus imatinib as first-line therapy for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumours (ENESTg1): a randomised phase 3 trial. Lancet Oncol 2015;16(5):550–60.

107. Janeway K.A., Albritton K.H., Van Den Abbeele A.D. et al. Sunitinib treatment in pediatric patients with advanced GIST following failure of imatinib. Pediatr Blood Cancer 2009;52(7):767–71.

108. Quek R., George S. Update on the treatment of gastrointestinal stromal tumors (GISTs): role of imatinib. Biologics 2010;4: 19–31.

109. Singeltary B., Ghose A., Sussman J. et al.

Durable response with a combination of imatinib and sorafenib in KIT exon 17 mutant gastrointestinal stromal tumor.

J Gastrointest Oncol 2014;5(1):E27–9.

110. Aprile G., Macerelli M., Giuliani F. Regorafenib for gastrointestinal malignancies: from preclinical data to clinical results of a novel multi-target inhibitor. BioDrugs 2013;27(3):213–24.

111. Ferraro D., Zalcberg J. Regorafenib in gastrointestinal stromal tumors: clinical evidence and place in therapy. Ther Adv Med Oncol 2014;6(5):222–8.

112. Casali P.G., Blay J.Y. Gastrointestinal stromal tumors: ESMO Clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and followup. Ann Oncol 2010;Suppl 5:98–102.

113. Harlan L.C., Eisenstein J., Russell M.C. et al. Gastrointestinal stromal tumors: Treatment patterns of a population-based sample. J Surg Oncol 2015;111(6):702–7.

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

2,

Трабектедин – лиганд узкой бороздки ДНК

41

2015

ТОМ 2

НИИ канцерогенеза ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина»; Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24 Контакты: Геннадий Альтерович Белицкий belitsga@gmail.com

Трабектедин (Trabectedin, ET-743, Yondelis) – алкалоид, который был выделен из беспозвоночного обитателя Карибского бассейна Ecteinascidia turbinate, в настоящее время производится синтетически. Его молекула содержит 3 тетрагидроизохинолиновых функциональных домена, 2 из которых ковалентно связываются с гуанином узкой бороздки ДНК и изгибают молекулу в сторону широкой бороздки, а 3-я находится вне дуплекса и препятствует взаимодействию транскрипционных факторов с ДНК. В результате этого индуцируется каскад событий, нарушающих связывание транскрипционных факторов с ДНК и процессы эксцизионной репарации. Трабектедин, связываясь с обеими цепями ДНК, вызывает межнитевые сшивки, а кроме того, ингибирует работу топоизомераз. Аддукты трабектедина связывают белки эксцизионной репарации, препятствуя их нормальному функционированию и индуцируя разрывы ДНК. Клетки, дефектные по гомологичной рекомбинации, которая репарирует двойные разрывы, особо чувствительны к трабектедину. По этой причине к трабектедину чувствителен ряд опухолей, и в первую очередь миксоидные липосаркомы, а также рак яичников и молочной железы с мутантными генами BRCA1 и BRCA2. У больных с рецидивами сарком, ставшими резистентными к производным платины, трабектедин также оказал терапевтическое действие. Кроме воздействия на опухолевые клетки, трабектедин ингибирует воспалительный процесс путем апоптоза моноцитов и опухолеассоциированных макрофагов, а также опосредованного воздействия на продукцию провоспалительных медиаторов: цитокинов и хемокинов. Трабектедин также ингибирует экспрессию гена MDR-1, ответственного за резистентность опухолевых клеток к химиопрепаратам, и препятствует ангиогенезу. Ключевые слова: трабектедин, узкая бороздка ДНК, лиганд, злокачественная опухоль, химиотерапия, репарация ДНК, рекомбинация, метаболизм, гепатотоксичность

DOI: 10.17 650 / 2313-805X. 2015.2.2.41–49 Trabectedin – the DNA minor groove binder G.A. Belitsky, K.I. Kirsanov, E.A. Lesovaya, M.G. Yakubovskaya Research Institute of Carcinogenesis, N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center; 24 Kashirskoye Shosse, Moscow, 115478, Russia Trabectedin (ET-743, Yondelis) is an alkaloid that was originally isolated from the Caribbean Sea squirt, Ecteinascidia turbinata and is now produced synthetically. Its chemical structure consists in three fused tetrahydroisoquinoline rings. Two of them, A and B, binds covalently to guanine residues in the minor groove of the DNA double helix to bend the molecule toward the major groove and the third ring C protrudes from the DNA duplex, apparently allowing interactions with several nuclear proteins. Binding to the minor groove of DNA, trabectedin trigger a cascade of events that interfere with several transcription factors, DNA binding proteins, and DNA repair pathways in particular nucleotide excision repair.

It acts both as a DNA-alkylating drug and topoisomerase poison. Trabectedin-DNA adduct traps the nucleotide excision repair proteins repairing the DNA damage in transcribing genes and induces DNA strand breaks. Cells deficient in homologous recombination pathway which repairs these double-strand breaks show increased sensitivity to trabectedin. The most sensitive of them were myxoid liposarcomas. Trabectedin is also effective in chemotherapy-experienced patients with advanced, recurrent liposarcoma or leiomyosarcoma as well as in women with ovarian cancer and breast cancer with BRCAness phenotype. Besides of tumor cells Trabectedin inhibits inflammatory cells by affecting directly monocytes and tumorassociated macrophages and indirectly by inhibiting production of inflammatory mediators, the cytokines and chemokines. It inhibits also the MDR-1 gene, which is responsible for the resistance of cancer cells to chemotherapeutic agents and strikes tumor angiogenesis.

Key words: trabectedin, DNA minor groove, ligand, malignant tumor, chemotherapy, DNA repair, recombination, metabolism, hepatotoxicity

Доктор, я изобрел отличное лекарство, подберите к нему болезнь!

Введение Создание противоопухолевых препаратов идет 2 основными путями. Первый направлен на изучение механизмов злокачественного роста и поиск факторов, отличающих злокачественную клетку от нормаль-

ной. На основе найденных отличий создаются препараты с действием определенной избирательности. Основа второго пути – широкий скрининг активных молекул любого происхождения. При их исследовании на клеточных культурах и перевиваемых опухолях обнаруживаются соединения как с широким спектром действия, так и с относительно узким, избирательно направленным на опухоли со специфическими нару-

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

Г.А. Белицкий, К. И. Кирсанов, Е. А. Лесовая, М. Г. Якубовская

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

2015

шениями клеточного метаболизма. В таких случаях для них в мозаике человеческой онкопатологии отыскиваются подходящие варианты. Примером цитостатика, высокоэффективного в отношении узкого круга опухолей, резистентных к другим препаратам, является лиганд узкой бороздки ДНК трабектедин, известный также как Ecteinascidin-743, Yondelis, ET-743, NSC-684766. Он представляет собой алкалоид тетрагидроизохинолинового ряда, найденный в ткани беспозвоночного обитателя Карибского бассейна Ecteinascidia turbinata. Экспериментальные данные о высокой противоопухолевой активности трабектедина известны с 1969 г., но разрешение к его применению в странах Европейского союза было получено только через 38 лет, в конце 2007 г., когда обнаружилась его выдающаяся эффективность при лечении сарком мягких тканей.

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2,

42

Механизм связывания с малой бороздкой ДНК Трабектедин содержит 3 тетрагидроизохинолиновых функциональных домена (рис. 1) и обладает в общей сложности 7 хиральными центрами и 8 циклами, включая один 10-членный гетероцикл, содержащий остаток цистеина. В отличие от других алкилирующих агентов, связывающихся с гуанином ДНК в положениях N7 или О6 в большой бороздке, трабектедин связывается с N2 экзоциклической аминогруппой гуанина в малой бороздке. Другим отличием является то, что при этом ДНК изгибается в сторону большой бороздки [1, 2]. Связывание с ДНК происходит через иминиевую группу, образующуюся путем дегидрирования карбиноламиновой группы – домена А (см. рис. 1). Эта группа играет главную роль в механизме связывания трабектедина с гуанином, так как лишенное его производное (ЕТ-745) не образует аддуктов с ДНК и обладает в 100 раз меньшей цитотоксичностью [3]. Как и в случае других узкобороздочных лигандов, связь трабектедина с ДНК дополнительно стабилизируется по механизму ван-дер-ваальсовых взаимодействий и водородных связей доменов А и В с нуклеотидами обеих цепей ДНК. Преимущественными сайтами связывания являются триплеты TGG, CGG, AGC и GGC, но не CGA (рис. 2) [5]. Анализ аддуктов трабектедина на ДНК показал, что в триплетах он связывается с тем же гуанином, что и цинковый палец транскрипционных факторов типа EGR1, активирующих экспрессию пропролиферативных и провоспалительных генов [6].

Рис. 1. Структура трабектедина (A, B и С) и его взаимодействие с гуанином (адаптировано из [4])

ТОМ 2

Рис. 2. Схема связывания трабектедина с 2 избирательными триплетами: ▬ ковалентная связь; – водородная связь; ТБКТ – трабектедин (адаптировано из [5])

Эксперименты по изучению роли домена С в свойствах трабектедина дали неоднозначные результаты. Этот домен не участвует в связывании с ДНК, так как находится вне дуплекса ДНК. Предполагалось, что такое его расположение препятствует связыванию ДНК с белками репарации и различными транскрипционными факторами и потому необходимо для действия трабектедина. О роли оригинальной структуры домена С для свойств молекулы трабектедина свидетельствуют результаты ряда работ с его химической модификацией, которая приводила к снижению цитотоксичности производных и утрате способности избирательно подавлять систему эксцизионной репарации [3, 7]. При этом в одной из работ описано производное, лишенное домена С, которое, по данным авторов, сохранило цитотоксичность трабектедина [8]. Метаболизм трабектедина и проблема лекарственного взаимодействия Метаболизм трабектедина. Трабектедин является субстратом практически для всех известных изоформ цитохрома P450 (CYP3A, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1, 3A4), кроме CYP1B1, 2C19 и 4A11. Вследствие этого он преобразуется во множество различных метаболитов. Основные окислительные и деметилирующие изменения происходят в домене А. Домен С подвергается О-деметилированию [9]. Среди изученных метаболитов, обозначаемых как ET-745, ET-759A, ETM-259, ETM-217, ETM-204 и ET729, последний (N-дисметилтрабектедин) привлекает внимание как производное, с которым связано гепатотоксическое действие трабектедина. Во 2-й фазе метаболизма часть производных взаимодействует с конъюгирующими ферментами – глутатион-Sтрансферазой (GST-M1) и глюкуронозилтрансферазой (UGT1A1 2B15). Конечные продукты выводятся из организма в основном с калом, а часть с мочой в виде глюкуронидов. В неизмененном виде выводится не более 1 % трабектедина [10]. Ограниченные экспериментальные возможности в клинике поставили вопрос об адекватности моделей,

Механизмы ингибирования роста опухоли Распространенность в геноме триплетов, с которыми связывается трабектедин, обусловливает множественность его эффектов на опухоль. Наиболее существенными для химиотерапии (ХТ) являются: • индукция разрывов ДНК и предотвращение их репарации путем блокады (nukleotide excision repair, NER), связанной с транскрипцией; • блокирование транскрипционной активности химерных белков; • токсическое действие на мононуклеары и ассоциированные с опухолью макрофаги; • ингибирование ангиогенеза.

2015

другие изоформы (CYP2E, CYP2C, CYP2A), влияли на него мало [13]. В то же время клинические исследования с использованием некоторых индукторов и ингибиторов системы метаболизма трабектедина показали, что не все активные в эксперименте соединения эффективны для человека. Это относится к индуктору CYP3A4 рифампину (полусинтетический противотуберкулезный антибиотик) и ингибитору кетоконазолу (противогрибковый препарат имидазольного ряда), которые в отличие от дексаметазона не оказали никакого действия на токсичность и метаболизм трабектедина у больных, хотя на микросомных препаратах ожидаемый эффект ингибирования и стимулирования был обнаружен [14]. Потенциальными ингибиторами изоформы CYP3A4, совместное применение с которыми может повлиять на фармакокинетику трабектедина и его токсичность, являются итраконазол, кларитромицин, атазанавир, индинавир, нефазодон, нелфинавир, ритонавир, саквинавир, телитромицин и вориконазол. Очевидно, что этот список не окончателен, и изучение лекарственного взаимодействия трабектедина с другими препаратами будет продолжено. Следует иметь в виду, что отдельные продукты питания также способны модифицировать эффекты трабектедина. Описан случай, когда больной липосаркомой «подкреплял» действие трабектедина большим количеством сока черноплодной рябины. Это вызвало у него 2 осложнения: рабдомиолиз и тяжелое нарушение функций печени. Отмена средства домашней медицины привела к восстановлению мышц и нормализации ферментов печени [15]. Способностью ингибировать отдельные изоформы CYP обладают и другие растительные препараты. К ним относят применяемые в качестве психостимуляторов женьшень (ингибирующий CYP2С9, CYP2С19, CYP2D6, CYP3А) и гинкго билоба (CYP2D6 и CYP3А4), иммуностимуляторы эхинацею (CYP2D6, CYP3А) и алоэ (CYP3А, CYP2С9), антидепрессант зверобой (CYP2D6, CYP3А, CYPB1, CYP1A2), а также продукты питания, такие как зеленый чай (CYP3А, CYP2C9, CYP3А4), чеснок (CYP3А, CYP2С9, CYP2С19) и др.

43

2,

используемых для изучения метаболизма и механизма действия трабектедина. Поскольку масштабные исследования в фармакологии проводятся на грызунах, метаболизм трабектедина у крыс сравнивали с метаболизмом собак, обезьян и человека. В микросомах печени человека и обезьян трабектедин метаболизировался главным образом изоформой CYP3A4 и в меньшей степени CYP2C9, CYP2D6 и CYP2E1, а в микросомах крысы и собаки – в основном CYP3A2 и CYP2A2. Наиболее чувствительными к гепатотоксическому действию трабектедина оказались самки крыс, у которых морфологические и функциональные изменения в печени были намного более выраженными и длительными, чем у других изученных видов. У пациентов, получавших трабектедин в соответствии с принятыми схемами, эти изменения были менее выражены и нормализовались после отмены препарата. Эти данные послужили основой для коррекции результатов, полученных на крысах. Кроме того, выяснилось, что результаты, получаемые на разных уровнях организации живого: в биохимических системах in vitro, в культуре клеток и на животных – могут существенно отличаться как друг от друга, так и от данных клинических исследований, что ограничивает их прогностическую ценность. Например, у крыс наблюдаются четкие половые различия в чувствительности к гепатотоксическому действию трабектедина. Самки значительно более чувствительны, чем самцы. Это связано с тем, что у самок в печени образуется и выделяется с желчью в 5 раз больше цитотоксичного производного, чем у самцов. В выделенных микросомах человека также обнаруживаются половые различия в метаболизме трабектедина, но в клинике различий в токсичности трабектедина у женщин и мужчин нет, т. е. в данном случае модель с учетом сходства по одному из параметров не имеет прогностической значимости для клиники. Точно так же индивидуальный полиморфизм ферментов CYP (3A4, 2C9, 2D6, 2C19, 2E1, GST-M1, P1, T1 и UGT1A1 2B15), выявленный в препаратах микросом из биоптатов больных, не отразился на общих показателях фармакодинамики и фармакокинетики трабектедина [10–12]. Лекарственное взаимодействие. Система ферментов CYP, метаболизирующая трабектедин, активируется и ингибируется многими соединениями, в том числе и лекарственными препаратами. В связи с этим важно знать их влияние на эффективность действия трабектедина для того, чтобы предвидеть последствия лекарственных взаимодействий. В эксперименте было показано, что предобработка крыс индукторами изоформ типа CYP3A (фенобарбитал, дексаметазон) повышает интенсивность метаболизма трабектедина, тогда как индукция изоформ типа CYP1B1 (20-метилхолантрен) неэффективна. Ингибиторы изоформ CYP3A значительно снижали уровень метаболизма трабектедина, тогда как соединения, ингибирующие

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

2015

Индукция разрывов ДНК и предотвращение их репарации системой NER. Большинство используемых в настоящее время цитостатиков наиболее эффективны в отношении опухолей с нарушенной системой репарации нуклеотидов, связанной с транскрипцией TC-NER, которая необходима для распознавания повреждений структуры ДНК и ее восстановления. Трабектедин в отличие от них в несколько раз более токсичен для клеток с функционирующей TC-NER при нарушенной системе гомологичной рекомбинации [16, 17]. Механизм ингибирования TC-NER связан с тем, что на сайтах избирательной посадки трабектедин блокирует белок эксцизионной репарации G (XPG). При этом образуется прочный функционально неактивный тройной комплекс трабектедина с ДНК и XPG. Это приводит к расщеплению нуклеазой XPF / ERCC1 противоположной нити и, таким образом, к образованию в ранней S-фазе двунитевого разрыва ДНК, который может быть правильно репарирован только в процессе гомологичной рекомбинации. Этот процесс при невозможности восстановления ДНК с помощью системы TC-NER инициируется белками BRCA, которые привлекают белки гомологичной рекомбинации к местам разрывов. Опухоли с нарушениями в системе гомологичной рекомбинации особенно чувствительны к трабектедину. К ним, в частности, относят некоторые формы мягкотканных сарком, в наибольшей степени миксоидные липосаркомы. Неожиданно высокая эффективность трабектедина в отношении этой узкой группы опухолей, резистентных к другим цитостатикам, выдвинула его в ряд перспективных и интенсивно изучаемых соединений [18, 19]. Блокирование аберрантных транскрипционных факторов химерных генов. Особая чувствительность миксоидных липосарком к трабектедину связана еще и с тем, что геном клеток 95 % этих опухолей содержит транслокацию t(12;16)(q13; p11), в результате которой образуется химерный ген FUS-CHOP, экспрессирующий аберрантный белок DDIT3-TLS, или более редкую транслокацию t(12;22)(q13;q12), дающую химерный ген EWSR1-CHOP и белок DDIT3-EWS. Химерные белки, как аберрантные транскрипционные факторы, изменяют экспрессию генов, контролирующих репарацию, пролиферацию, дифференцировку, а также провоспалительные, ангиогенные и другие каскады, что способствует неограниченному агрессивному росту опухоли [20]. Трабектедин блокирует транскрипционную активность онкобелков, конкурируя с ними за связывание с промоторными участками соответствующих генов. В результате этого в клетках миксоидных липосарком среди других процессов, связанных с пролиферацией, нормализуется экспрессия циклинов D1 и E и их киназ CDK4 и CDK2, а также уровень P16 – ингибитора CDK4/6 и P27 и P57 – ингибиторов CDK2. Вследствие разобщения связи FUS-CHOP с промотором гена

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2,

44

ТОМ 2 PTX3 активируется фагоцитоз апоптотических клеток, а разобщение с промотором гена FN1 восстанавливает нормальную экспрессию фибронектина. Кроме того, трабектедин снимает блокаду онкобелком транскрипции генов, необходимых для дифференцировки адипоцитов, что приводит к нормализации морфологии опухоли, т. е. в ткани липосарком атипичные формы липобластов заменяются зрелыми. Механизм этого эффекта подлежит тщательному изучению, поскольку может послужить фундаментальной основой для принципиально нового стратегического направления в химиотерапии [21–23]. Из других опухолей соединительной ткани чувствительность к трабектедину обнаружена при юношеской форме саркомы Юинга, клетки которой в результате транслокации t(11;22)(q24;q12) становятся носителями химерного гена EWS-FLI1. Трабектедин блокирует транскрипционную активность экспрессируемого химерным геном белка EWS-FLI1, который регулирует более 70 генов. Клетки других соединительнотканных опухолей – остеосарком, рабдомиосарком и синовиальных сарком, не имеющие этой аномалии, значительно более резистентны к трабектедину [5, 24]. Среди эпителиальных опухолей сочетание низкой активности гомологичной рекомбинации с сохранением TC-NER имеют некоторые формы рака молочной железы (РМЖ) и яичников. В частности, более чем у 20 % больных с наследственной предрасположенностью к этим опухолям гомологичная рекомбинация нарушена в результате герминативных мутаций BRCA1 и BRCA2, а при спорадическом РМЖ – примерно у 25 % вследствие соматических мутаций. Клинические испытания показали, что в этих случаях трабектедин значительно более эффективен, чем у больных с диким типом генов BRCA. В то же время наличие мутаций XPG в этих опухолях значительно снижает эффективность трабектедина по сравнению с диким типом, поскольку в мутантных клетках не происходит надрезание спирали и связывание комплекса трабектедина с ДНК, а следовательно, и образование разрывов [25–29]. С чувствительностью клеток опухоли к трабектедину коррелирует также наличие синдрома атаксиителеангиэктазии или дефект белков, связанных с анемией Фанкони в результате мутаций генов FANCA, FANCC, FANCF, FANCG или FANCD1 [30, 31]. Среди опухолей кроветворной системы многочисленны варианты с наличием транслокаций и образованием функционально активных химерных генов, причем в ряде случаев это определяет их клинический прогноз [32, 33]. В связи с этим представляется перспективным изучение действия трабектедина на гемобластозы в зависимости от наличия в их клетках такого рода транслокаций. Для этой цели в лаборатории механизмов химического канцерогенеза Научно-исследовательского института канцерогенеза ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» собрана коллекция долго-

Прогноз чувствительности опухоли к трабектедину Поскольку трабектедин обладает выраженной токсичностью и является дорогостоящим препаратом, важен предварительный прогноз его эффективности в каждом конкретном случае. Для его оценки разрабатываются методы, в числе которых определение количества аддуктов трабектедина и периода их персистенции. Последнее особенно важно, так как первоначально в чувствительных и резистентных клетках образуется одинаковое количество аддуктов, но в чувствительных они не репарируются и сохраняются намного дольше. Другими показателями служат характеристики повреждения ДНК в тесте «ДНК-комет», обнаружение эндонуклеазы RAD51 или визуализация двойных разрывов ДНК по накоплению гистона гамма-H2AX, который фосфорилируется вблизи сайта разрыва и маркирует пораженный хроматиновый домен. Прогностическую ценность имеет и определение активности лигазы CUL4A, которая убиквитинирует белки гомологичной рекомбинации. Высокий уровень экспрессии CUL4A в клетках сарком с нарушенной системой гомологичной рекомбинации коррелирует с положительным прогнозом при их лечении трабектедином [5, 42, 43]. Механизмы резистентности к трабектедину Клетки с нарушенной по разным причинам системой TC-NER резистентны к трабектедину. В частности, причиной резистентности клеток одной из линий карциномы прямой кишки была потеря гетерозиготности по 13q33, приводящая к отсутствию функционально активного XPG [16]. Другой вариант приобретения резистентности к трабектедину обнаружен в клетках линии миксоидной липосаркомы, в которых, в отличие от исходных чувствительных клеток, FUS-CHOP был неспособен связываться с промоторами генов PTX3 и FN1. Кроме того, резистентная линия утратила способность экспрессировать O6-метилгуанин-ДНКметилтрансферазу вследствие гиперметилирования ее промотора. В результате эти клетки стали высокочувствительными к темозоломиду, который алкилирует гуанин в положениях О6 и N7 с последующим аберрантным восстановлением метилового остатка. Эти данные указывают на возможную перспективность изучения соединений, изменяющих профиль метилирования, в качестве препаратов для лечения опухолей, резистентных к трабектедину. Кроме того, в большинстве случаев резистентные к трабектедину клетки проявляют повышенную чувствительность к другим цитотоксическим факторам, например к ультрафиолетовому излучению.

2015

гирование ДНК путем ковалентного связывания с топоизомеразой I и ДНК, сохраняют чувствительность к трабектедину [39–41].

45

2,

живущих клеточных линий Т- и В-клеточных лейкозов и лимфом. Результаты предполагается верифицировать путем анализа первичных культур клеток лейкозов больных из отделения химиотерапии ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина». Вероятно, что подобно тому, как из множества гистологических типов опухолей соединительной ткани был выделен узкий сектор миксоидных липосарком, высокочувствительных к трабектедину, так и среди многообразия гемобластозов могут обнаружиться подобные варианты. Другие факторы, связанные с чувствительностью опухолей к трабектедину. Значительную роль в чувствительности клеток к трабектедину играет опухолевый супрессор TP53. На клетках культуры сарком человека различной гистологической структуры показано, что нарушение функций TP53 в 3 раза повышает токсическое действие трабектедина [34]. Помимо способности блокировать клеточный цикл и пролиферацию трабектедин ингибирует экспрессию провоспалительных медиаторов типа хемокинов CCL2 и CXCL8, цитокина интерлейкина 6 (IL-6), а также ангиогенного фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). Ценное свойство трабектедина – блокировка гиперэкспрессии гена множественной лекарственной резистентности (MDR-1). В связи с этим к цитотоксическому действию трабектедина чувствительны клетки, ставшие в процессе лечения резистентными к другим химиопрепаратам (ХП) [35, 36]. Одним из недавно выявленных механизмов терапевтического действия трабектедина является его способность ингибировать функции HMGА – высокомобильной группы негистоновых белков хроматина, регулирующих транскрипцию ряда генов, в том числе гена атаксии-телеангиэктазии (ATM), который связан с репарацией двунитевых разрывов, циклина CCNE1, проапоптотического онкогена E2F1 и регулятора апоптоза Bcl-2. Неупорядоченная гиперэкспрессия HMGА характерна для многих злокачественных опухолей. Она часто коррелирует с их лекарственной резистентностью и отрицательным прогнозом течения заболевания. Трабектедин блокирует взаимодействие HMGА с чувствительными к нему регуляторными районами гена, и его ХТ-действие на клетки опухолей с высокими показателями экспрессии HMGА более выражено, чем с низкими [37, 38]. Ингибирование NER связывают отчасти с действием трабектедина на топоизомеразу I. Показано, что в миллимолярных концентрациях трабектедин образует стабильный комплекс с этим ферментом и блокирует концы разрывов, т. е. работает как ингибитор топоизомераз. В более низких, но фармакологически эффективных наномолярных концентрациях эта реакция не происходит, что позволяет считать ее минорным компонентом в механизме действия трабектедина. Об этом говорит и то, что клетки, резистентные к камптотецину, который предотвращает ли-

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

2015

Следует отметить, что ни в одной из линий, резистентных к трабектедину, это свойство не было связано ни с активацией экспрессии белков MDR, ни с транспортом трабектедина, ни с уровнем глутатиона [44].

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2,

46

Токсичность трабектедина и возможности ее снижения В доклинических испытаниях трабектедина среди серьезных побочных эффектов (анемия, нейтропения, тромбоцитопения) особо отмечена его гепатотоксичность. При однократном внутривенном введении крысам 40 мкг / кг трабектедина через 24 ч развивалось тяжелое повреждение печени по типу холангита. Морфология поражения состояла в некрозе эпителия желчевыводящих протоков, воспалении и последующем фиброзе. Гепатоциты повреждались в значительно меньшей степени. Холангит сохранялся до 3 мес. При этом повышенный в 7 раз уровень билирубина держался около 1 мес, высокий уровень щелочной фосфатазы и аспартатаминотрансферазы – до 2–3 мес. Активность P450 A1 / 2, CYP2E1 и CYP3A2 была понижена на фоне резкого повышения экспрессии аденозинтрифосфатсвязывающей кассеты транспортных генов Abcb1a и Abcb1b [45]. Генетические параметры чувствительности к поражению печени трабектедином изучались на мышах, дефектных по основному ферменту метаболизма трабектедина (CYP3A) и транспортерам Abcb1a/1b, Abcc2, и/или Abcc3. Нокаут CYP3A увеличил гепатотоксичность трабектедина незначительно. Такой же эффект отмечен у мышей Abcc2–/– и чуть меньше у Abcb1a/1b–/– и Abcc3–/–. Наибольшее поражение печени наблюдалось у мышей Abcb1a/1b/Abcc2–/– и Abcc2/Abcc3–/–, а наименьшее – у животных CYP3a/Abcb1a/1b/Abcc2–/–. Это свидетельствует о том, что образование метаболитов трабектедина изоформой CYP3A является необходимым условием гепатотоксичности. Дальнейшие исследования показали, что дефект транспортера Abcc2 при работающей CYP3A имеет следствием накопление в печени токсических метаболитов трабектедина, но не исходного соединения. Таким образом, транспортеры Abcb1, Abcc2 и Abcc3 освобождают клетку от токсических метаболитов трабектедина, образуемых изоформой CYP3A. Главную роль играет Abcc2, меньшую – Abcc3 и минимальную – Abcc1. Оптимальный эффект достигается, если они работают все вместе, дополняя эффект друг друга [46]. Это исследование получило подтверждение в клинической практике, когда от обычной дозы трабектедина у больного с саркомой, имевшего генетический дефект транспортного белка Abcc2, развилось летальное поражение печени. Таким образом, в набор тестов, необходимых для безопасного применения трабектедина, следует ввести молекулярно-генетическое исследование состояния ABC-транспортеров [47]. Эксперименты, направленные на снижение токсичности трабектедина, показали, что в отличие от опухолевых клеток эффект может быть достигнут

ТОМ 2 с помощью некоторых индукторов CYP. В частности, предобработка крыс β-нафтофлавоном или фенобарбиталом снижала гепатотоксическое действие трабектедина. Однако модель in vitro, когда культуру гепатоцитов обрабатывали теми же индукторами, предсказательной силы не имела, так как клетки, обработанные и не обработанные индукторами, были одинаково чувствительны к токсическому действию трабектедина [48]. Наиболее подходящим агентом для снижения токсичности трабектедина оказался дексаметазон. Предобработка самок крыс этим кортикостероидом (5– 20 мг/кг) за 24 ч до введения трабектедина (40 мкг/кг) полностью предотвращала его гепатотоксичность. В то же время дексаметазон не снижал противоопухолевое действие трабектедина на перевиваемую карциному молочной железы и ряд опухолей мышей. Изучение механизма действия дексаметазона показало, что он во много раз увеличивает экспрессию в печени ряда генов CYP3А, в том числе СYP3A11 (в 23 раза), CYP3A16 (в 18 раз), CYP3A25 (в 13 раз) и CYP3A13 (в 10 раз) [49]. Протекторное действие дексаметазона может иметь в своей основе не только изменение метаболизма трабектедина, но и другие процессы, связанные с феноменом множественной лекарственной устойчивости. В частности, изменение транспорта трабектедина через мембрану клеток печени, которое связано с активацией экспрессии и функций аденозинтрифосфатзависимого кассетного транспортного белка, кодируемого геном Mrp2 (Multidrug Resistance-associated Protein), продемонстрировано на первичной культуре гепатоцитов крысы [50]. Предполагается также, что дексаметазон снижает токсичность трабектедина, блокируя воспалительный компонент его действия путем ингибирования NF-κB, который активирует экспрессию провоспалительных генов [35, 51]. Протекторным действием обладал и индол3-карбинол, содержащийся в капусте и других крестоцветных. Он так же, как и дексаметазон, оказался мощным индуктором CYP3А2 у крыс [52]. Индол3-карбинол защищал крыс от токсического действия трабектедина при сохранении его терапевтического действия при РМЖ. Существенно, что защитный эффект индол-3-карбинола не сопровождался снижением содержания трабектедина в печени, что указывает на наличие альтернативных путей его детоксикации [53]. Защитное действие дексаметазона нашло непосредственное применение в клинике, где премедикация дексаметазоном (4 мг перорально за 24 ч до трабектедина) больных с саркомами резко снижала гепатотоксический эффект и миелосупрессию. В одном из клинических исследований после курса лечения трабектедином в группе плацебо у 34 % больных отмечено повышение трансаминазы, у 24 % – нейтропения, у 25 % – тромбоцитопения. Среди пациентов,

Действие трабектедина на строму опухоли и ангиогенез В последнее время значительно возрос интерес к роли опухолеассоциированных макрофагов в прогрессии новообразований. Обильная инфильтрация опухоли макрофагами, которые являются основным источником провоспалительных медиаторов, коррелирует с метастазированием и резистентностью к ХТ. Их ингибирование в эксперименте приводило к замедлению роста опухоли и большей эффективности как цитотоксической, так и антиангиогенной терапии [56–58]. Экспериментальные и клинические данные показали, что даже в нетоксичной дозе трабектедин избирательно ингибирует мононуклеарные фагоциты, в том числе ассоциированные с опухолью. Их апоптоз происходит путем активации каспазы 8. При этом нейтрофилы и лимфоциты не поражаются, так как в отличие от моноцитов у них иначе происходит экспрессия рецепторов фактора некроза опухоли TRAIL, продуцируемых у человека геном TNFSF10. В результате гибели ассоциированных с опухолью макрофагов в опухоли прекращается продукция медиаторов воспаления CCL2 и IL-6. Первый считается ведущим фактором привлечения моноцитов в опухоль, а второй – ростовым фактором. Помимо этих медиаторов, трабектедин ингибирует в культуре клеток миксоидных липосарком продукцию провоспалительного хемокина CXCL8 и белка острой фазы воспаления пентраксина 3 (PTX3). Такие же изменения обнаруживаются и в ксенографтах сарком от больных, получавших трабектедин. В них наряду со снижением инфильтрации опухоли макрофагами отмечен низкий уровень продукции ее клетками VEGF, а также маркера миграции и пролиферации клеток эндотелия сосудов CD31 [59–61]. Комбинация трабектедина с другими цитостатиками Как известно, наибольший эффект противоопухолевых цитостатиков проявляется при первых курсах терапии, особенно в случае опухолей с нарушенной системой репарации. В ходе лечения отбираются клоны с повышенной ее активностью, которые удаляют аддукты из алкилированных цепей ДНК, в результате чего чувствительность к препарату падает. Этот механизм ингибируется трабектедином, поскольку он избирательно токсичен для такого рода клонов. В связи с этим в настоящее время успешно используется комбинация трабектедина с производными платины и доксорубицином при лечении рецидивов опухолей различного происхождения [29, 62–64]. Активно исследуются также и другие комбинации трабектедина с традиционными и новыми ХП [65, 66].

2015

Перспективы использования узкобороздочных лигандов в химиотерапии Удельный вес узкобороздочных лигандов среди используемых в настоящее время противоопухолевых ХП невелик. Это, с нашей точки зрения, отчасти объясняется тем, что их перспективность была скомпрометирована существующей парадигмой выбора ХП, при которой в результате скрининга отбираются соединения, способные ингибировать злокачественный рост на различных моделях. В то же время хорошо известно, что некоторые агенты, не обладающие самостоятельной цитотоксичностью, могут многократно усиливать ее у других ХП при комбинированном применении. В этом смысле узкобороздочные лиганды представляют особый интерес, поскольку они, располагаясь на узкой бороздке ДНК и связываясь с ее последовательностями, важны для экспрессии генов «домашнего хозяйства» и могут блокировать репарацию ДНК-клеток, поврежденных другими агентами. Такой подход, возможно, даст повышенный терапевтический эффект не только в случае комбинации узкобороздочных лигандов с известными ХП, но и при одновременном действии этих лигандов, каждый из которых оказывает слабое действие или вообще неэффективен. В этом плане представляется перспективным исследование комбинированного действия узкобороздочных лигандов, разрешенных к клиническому использованию в качестве антимикробных, антипротозойных и противовирусных препаратов типа диариламинов (DAPI, беренил, пентамидин) и бисбензимидазолов типа Hoechst 33258. В клетках опухолей такие препараты, как Hoechst 33258 и дистамицин, препятствуют конденсации хромосом, особенно в АТбогатых участках гетерохроматина, и вызывают апоптоз путем индукции летальных цитогенетических изменений. Пентамидин, применявшийся ранее для лечения протозойных инфекций, используется в настоящее время при опухолях желудочно-кишечного тракта для ингибирования так называемых фосфатаз регенерирующей печени (PRL-фосфатаз), которые стимулируют пролиферацию и миграцию злокачественных клеток [67, 68]. Особый интерес представляет изучение возможности воспроизвести действие трабектедина на опухоли путем комбинации узкобороздочных лигандов различной тропности к последовательностям ДНК в целях подавления эксцизионной репарации и конкуренции с белками химерных генов. В настоящее время появились данные об успешном применении малых молекул, ингибирующих поли(аденозиндифосфатрибоза)-полимеразу (PARP), для лечения опухолей различного гистогенеза, особенно дефектных по белкам гомологичной рекомбинации (BRCA, RAD51D, ATM PALB2, RAD51C, BRIP1). Эти молекулы подобно трабектедину образуют стабильный комплекс с PARP и ДНК, что, прекращая работу эксцизионной репарации, дает многочи-

47

2,

получавших дексаметазон, указанные осложнения имелись у 2, 2 и 0 % соответственно [54, 55].

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

2015

сленные однонитевые разрывы, которые в процессе репликации становятся двойными и не репарируются [69, 70]. Ранее нами было показано, что классические узкобороздочные лиганды (беренил, пентамидин, DAPI, Hoechst 33342 и 33258) способны ингибировать ДНК-

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2,

48

ТОМ 2 зависимый путь активации PARP in vivo и in vitro. В настоящее время мы предполагаем провести исследование влияния на этот путь вновь синтезированных димерных производных бисбензимидазолов, а также их комбинаций с классическими узкобороздочными лигандами [19, 71].

Работа была поддержана грантами 15-04-04006, 13-04-01707, 15-04-09216 Российского фонда фундаментальных исследований, грантом № ДП-Б-27/15 Фонда некоммерческих программ Дмитрия Зимина «Династия».

Л И Т Е Р А Т У Р А 1. Pommier Y., Kohlhagen G., Bailly C. et al. DNA sequence- and structure-selective alkylation of guanine N2 in the DNA minor groove by ecteinascidin 743, a potent antitumor compound from the Caribbean tunicate Ecteinascidia turbinata. Biochemistry 1996;35(41):13303–9.

2. Zewail-Foote M., Hurley L.H. Ecteinascidin 743: a minor groove alkylator that bends DNA toward the major groove.

J Med Chem 1999;42(14):2493–7.

3. David-Cordonnier M.H., Gajate C., Olmea O. et al. DNA and non-DNA targets in the mechanism of action of the antitumor drug trabectedin. Chem Biol 2005;12(11):1201–10.

4. Basmadjian C., Zhao Q., Bentouhami E. et al. Cancer wars: natural products strike back. Front Chem 2014;2:20.

5. D'Incalci M., Galmarini C.M. A review of trabectedin (ET-743): a unique mechanism of action. Mol Cancer Ther 2010;9(8): 2157–63.

6. Marco E., Garcia-Nieto R., Mendieta J. et al. A 3.(ET743)-DNA complex that both resembles an RNA-DNA hybrid and mimicks zinc finger-induced DNA structural distortions. J Med Chem 2002;45(4):871–80.

7. Guirouilh-Barbat J., Antony S., Pommier Y. Zalypsis (PM00104) is a potent inducer of gamma-H2AX foci and reveals the importance of the C ring of trabectedin for transcription-coupled repair inhibition.

Mol Cancer Ther 2009;8(7):2007–14.

8. Erba E., Cavallaro E., Damia G. et al.

The unique biological features of the marine product Yondelis (ET-743, trabectedin) are shared by its analog ET-637, which lacks the C ring. Oncol Res 2004;14(11–12): 579–87.

9. Vermeir M., Hemeryck A., Cuyckens F. et al. In vitro studies on the metabolism of trabectedin (YONDELIS) in monkey and man, including human CYP reaction phenotyping. Biochem Pharmacol 2009;77(10):1642–54.

10. Beumer J.H., Rademaker-Lakhai J.M., Rosing H. et al. Metabolism of trabectedin (ET-743, Yondelis) in patients with advanced cancer. Cancer Chemother Pharmacol 2007; 59(6):825–37.

11. Reid J.M., Kuffel M.J., Ruben S.L. et al.

Rat and human liver cytochrome P-450

isoform metabolism of ecteinascidin 743 does not predict gender-dependent toxicity in humans. Clin Cancer Res 2002;8(9): 2952–62.

12. Brandon E.F., Sparidans R.W., Guijt K.J. et al. In vitro characterization of the human biotransformation and CYP reaction phenotype of ET-743 (Yondelis, Trabectidin), a novel marine anti-cancer drug. Invest New Drugs 2006;24(1):3–14.

13. Brandon E.F., Meijerman I., Klijn J.S. et al. In vitro cytotoxicity of ET-743 (Trabectedin, Yondelis), a marine anti-cancer drug, in the Hep G2 cell line: influence of cytochrome P450 and phase II inhibition, and cytochrome P450 induction. Anticancer Drugs 2005;16(9):935–43.

14. Machiels J.P., Staddon A., Herremans C. et al. Impact of cytochrome P450 3A4 inducer and inhibitor on the pharmacokinetics of trabectedin in patients with advanced malignancies: open-label, multicenter studies. Cancer Chemother Pharmacol 2014;74(4):729–37.

15. Strippoli S., Lorisso V., Albano A., Guida M. Herbal-drug interaction induced rhabdomyolysis in a liposarcoma patient receiving trabectedin. BMC Complement Altern Med 2013;13:199.

16. Takebayashi Y., Pourquier P., Zimonjic D.B. et al. Antiproliferative activity of ecteinascidin 743 is dependent upon transcription-coupled nucleotide-excision repair. Nat Med 2001;7(8):961–6.

17. Damia G., D'Incalci M. Targeting DNA repair as a promising approach in cancer therapy. Eur J Cancer 2007;43(12):1791–801.

18. Herrero A.B., Martin-Castellanos C., Marco E. et al. Cross-talk between nucleotide excision and homologous recombination DNA repair pathways in the mechanism of action of antitumor trabectedin. Cancer Res 2006;66(16):8155–62.

19. Горбунова В.А. Новые направления лекарственного лечения сарком мягких тканей. Вестник РОНЦ 2009;11:2–3.

[Gorbunova V.A. New ways of drug therapy of soft tissues sarcomas. Vestnik RONC = Bulletin of RCRC (Russian Cancer Research Center) 2009;11:2–3. (In Russ.)].

20. Olofsson A., Willen H., Goransson M. et al. Abnormal expression of cell cycle regulators in FUS-CHOP carrying

liposarcomas. Int J Oncol 2004;25(5): 1349–55.

21. Forni C., Minuzzo M., Virdis E. et al.

Trabectedin (ET-743) promotes differentiation in myxoid liposarcoma tumors. Mol Cancer Ther 2009;8(2):449–57.

22. Charytonowicz E., Terry M., Coakley K. et al. PPARgamma agonists enhance ET743-induced adipogenic differentiation in a transgenic mouse model of myxoid round cell liposarcoma. J Clin Invest 2012;122(3): 886–98.

23. Di Giandomenico S., Frapolli R., Bello E. et al. Mode of action of trabectedin in myxoid liposarcomas. Oncogene 2014;33(44):5201–10.

24. Grohar P.J., Griffin L.B., Yeung C. et al.

Ecteinascidin 743 interferes with the activity of EWS-FLI1 in Ewing sarcoma cells.

Neoplasia 2011;13(2):145–53.

25. Peto J., Collins N., Barfoot R. et al.

Prevalence of BRCA1 and BRCA2 gene mutations in patients with early-onset breast cancer. J Natl Cancer Inst 1999;91(11): 943–9.

26. Turner N., Tutt A., Ashworth A. Hallmarks of 'BRCAness' in sporadic cancers.

Nat Rev Cancer 2004;4(10):814–9.

27. Delaloge S., Wolp-Diniz R., Byrski T. et al. Activity of trabectedin in germline BRCA1/2-mutated metastatic breast cancer: results of an international first-in-class phase II study. Ann Oncol 2014;25(6):1152–8.

28. Massuti B., Cobo M., Camps C. et al.

Trabectedin in patients with advanced nonsmall-cell lung cancer (NSCLC) with XPG and/or ERCC1 overexpression and BRCA1 underexpression and pretreated with platinum. Lung Cancer 2012;76(3):354–61.

29. Monk B.J., Ghatage P., Parekh T. et al.

Effect of BRCA1 and XPG mutations on treatment response to trabectedin and pegylated liposomal doxorubicin in patients with advanced ovarian cancer: exploratory analysis of the phase 3 OVA-301 studydagger. Ann Oncol 2015;26(5):914–20.

30. Guirouilh-Barbat J., Zhang Y.W., Pommier Y. Induction of glutathionedependent DNA double-strand breaks by the novel anticancer drug brostallicin.

Mol Cancer Ther 2009;8(7):1985–94.

31. Casado J.A., Rio P., Marco E. et al.

Relevance of the Fanconi anemia pathway

Nat Rev Immunol 2011;11(11):723–37.

57. Allavena P., Mantovani A. Immunology in the clinic review series; focus on cancer: tumour-associated macrophages: undisputed stars of the inflammatory tumour microenvironment. Clin Exp Immunol 2012;167(2):195–205.

58. Qian B.Z., Li J., Zhang H. et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature 2011;475(7355):222–5.

59. Germano G., Frapolli R., Simone M. et al.

Antitumor and anti-inflammatory effects of trabectedin on human myxoid liposarcoma cells. Cancer Res 2010;70(6):2235–44.

60. Germano G., Frapolli R., Belqiovine C. et al. Role of macrophage targeting in the antitumor activity of trabectedin. Cancer Cell 2013;23(2):249–62.

61. Allavena P., Germano G., Belgiovine C. et al. Trabectedin: A drug from the sea that strikes tumor-associated macrophages.

Oncoimmunology 2013;2(6):e24614.

62. Stevens E.V., Nishizuka S., Antony S. et al.

Predicting cisplatin and trabectedin drug sensitivity in ovarian and colon cancers. Mol Cancer Ther 2008;7(1):10–8.

63. Lopez-Guerrero J.A., Romero I., Poveda A. Trabectedin therapy as an emerging treatment strategy for recurrent platinumsensitive ovarian cancer. Chin J Cancer 2015;34(1):41–9.

64. Pautier P., Floques A., Chevreau C. et al.

Trabectedin in combination with doxorubicin for first-line treatment of advanced uterine or soft-tissue leiomyosarcoma (LMS-02): a non-randomised, multicentre, phase 2 trial.

Lancet Oncol 2015;16(4):457–64.

65. Kawano M., Mabuchi S., Kishimoto T. et al. Combination treatment with trabectedin and irinotecan or topotecan has synergistic effects against ovarian clear cell carcinoma cells. Int J Gynecol Cancer 2014;24(5): 829–37.

66. Riccardi A., Meco D., Ubezio P. et al.

Combination of trabectedin and irinotecan is highly effective in a human rhabdomyosarcoma xenograft. Anticancer Drugs 2005;16(8):811–5.

67. Stephens B.J., Han H., Gokhale V., Von Hoff D.D. PRL phosphatases as potential molecular targets in cancer. Mol Cancer Ther 2005;4(11):1653–61.

68. Cai X., Gray P.J. Jr, Von Hoff D.D. DNA minor groove binders: back in the groove.

Cancer Treat Rev 2009;35(5):437–50.

69. Coward J.I., Middleton K., Murphy F. New perspectives on targeted therapy in ovarian cancer. Int J Womens Health 2015;7:189–203.

70. Collins I.M., Thomas D.M. Novel approaches to treatment of leiomyosarcomas.

Curr Oncol Rep 2011;13(4):316–22.

71. Kirsanov K.I., Kotova E., Makhov P. et al.

Minor grove binding ligands disrupt PARP-1 activation pathways. Oncotarget 2014;5(2):428–37.

2015

myxoid liposarcoma cell line that shows collateral sensitivity to methylating agents.

Int J Cancer 2012;131(1):59–69.

45. Donald S., Verschoyle R.D., Edwards R. et al. Hepatobiliary damage and changes in hepatic gene expression caused by the antitumor drug ecteinascidin-743 (ET-743) in the female rat. Cancer Res 2002;62(15): 4256–62.

46. van Waterschoot R.A., Eman R.M., Wagenaar E. et al. ABCC2, ABCC3, and ABCB1, but not CYP3A, protect against trabectedin-mediated hepatotoxicity. Clin Cancer Res 2009;15(24):7616–23.

47. Laurenty A.P., Thomas F., Chatelut E. et al. Irreversible hepatotoxicity after administration of trabectedin to a pleiomorphic sarcoma patient with a rare ABCC2 polymorphism: a case report.

Pharmacogenomics 2013;14(12):1389–96.

48. Donald S., Verschoyle R.D., Greaves P. et al. Comparison of four modulators of drug metabolism as protectants against the hepatotoxicity of the novel antitumor drug yondelis (ET-743) in the female rat and in hepatocytes in vitro. Cancer Chemother Pharmacol 2004;53(4):305–12.

49. Donald S., Verschoyle R.D., Greaves P. et al. Complete protection by high-dose dexamethasone against the hepatotoxicity of the novel antitumor drug yondelis (ET-743) in the rat. Cancer Res 2003;63(18):5902–8.

50. Lee J.K., Leslie E.M., ZamekGliszczynski M.J., Brouwer K.L. Modulation of trabectedin (ET-743) hepatobiliary disposition by multidrug resistance-associated proteins (Mrps) may prevent hepatotoxicity.

Toxicol Appl Pharmacol 2008;228(1): 17–23.

51. Minuzzo M., Marchini S., Broqqini M. et al. Interference of transcriptional activation by the antineoplastic drug ecteinascidin-743.

Proc Natl Acad Sci USA 2000;97(12):6780–4.

52. Leibelt D.A., Hedstrom O.R., Fischer K.A. et al. Evaluation of chronic dietary exposure to indole-3-carbinol and absorption-enhanced 3,3'-diindolylmethane in sprague-dawley rats.

Toxicol Sci 2003;74(1):10–21.

53. Donald S., Verschoyle R.D., Greaves P. et al. Dietary agent indole-3-carbinol protects female rats against the hepatotoxicity of the antitumor drug ET-743 (trabectеdin) without compromising efficacy in a rat mammary carcinoma. Int J Cancer 2004;111(6):961–7.

54. Grosso F., Dileo P., Sanfilippo R. et al.

Steroid premedication markedly reduces liver and bone marrow toxicity of trabectedin in advanced sarcoma. Eur J Cancer 2006;42(10):1484–90.

55. Paz-Ares L., López-Pousa A., Poveda A. et al. Trabectedin in pre-treated patients with advanced or metastatic soft tissue sarcoma: a phase II study evaluating co-treatment with dexamethasone. Invest New Drugs 2012;30(2):729–40.

56. Murray P.J., Wynn T.A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.

49

2,

in the response of human cells to trabectedin.

Mol Cancer Ther 2008;7(5):1309–18.

32. Chang M., Raimondi S.C., Ravindranath Y. et al. Prognostic factors in children and adolescents with acute myeloid leukemia (excluding children with Down syndrome and acute promyelocytic leukemia): univariate and recursive partitioning analysis of patients treated on Pediatric Oncology Group (POG) Study 8821. Leukemia 2000;14(7):1201–7.

33. Port M., Böttcher M. Thol F. et al.

Prognostic significance of FLT3 internal tandem duplication, nucleophosmin 1, and CEBPA gene mutations for acute myeloid leukemia patients with normal karyotype and younger than 60 years: a systematic review and meta-analysis. Ann Hematol 2014;93(8):1279–86.

34. Moneo V., Serelde B.G., Fominaya J. et al.

Extreme sensitivity to Yondelis (Trabectedin, ET-743) in low passaged sarcoma cell lines correlates with mutated p53. J Cell Biochem 2007;100(2):339–48.

35. Jin S., Gorfajn B., Faircloth G., Scotto K.W. Ecteinascidin 743, a transcriptiontargeted chemotherapeutic that inhibits MDR1 activation. Proc Natl Acad Sci USA 2000;97(12):6775–9.

36. Ganjoo K.N., Patel S.R. Trabectedin: an anticancer drug from the sea. Expert Opin Pharmacother 2009;10(16):2735–43.

37. Fusco A., Fedele M. Roles of HMGA proteins in cancer. Nat Rev Cancer 2007;7(12):899–910.

38. D'Angelo D., Borbone E., Palmieri D. et al.

The impairment of the High Mobility Group A (HMGA) protein function contributes to the anticancer activity of trabectedin. Eur J Cancer 2013;49(5):1142–51.

39. Pommier Y. DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition. Chem Rev 2009;109(7):2894–902.

40. Martinez E.J., Corey E.J., Owa T. Antitumor activity- and gene expression-based profiling of ecteinascidin Et 743 and phthalascidin Pt 650. Chem Biol 2001;8(12):1151–60.

41. Tavecchio M., Simone M., Erba E. et al.

Role of homologous recombination in trabectedin-induced DNA damage.

Eur J Cancer 2008;44(4):609–18.

42. Garcia M.J., Saucedo-Cuevas L.P., Munoz-Repeto I. et al. Analysis of DNA repair-related genes in breast cancer reveals CUL4A ubiquitin ligase as a novel biomarker of trabectedin response. Mol Cancer Ther 2013;12(4):530–41.

43. Soares D.G., Escarqueil A.E., Poindessous V. et al. Replication and homologous recombination repair regulate DNA double-strand break formation by the antitumor alkylator ecteinascidin 743. Proc Natl Acad Sci USA 2007;104(32): 13062–7.

44. Uboldi S., Bemasconi S., Romano M. et al.

Characterization of a new trabectedin-resistant

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

2015

50

Межклеточные взаимодействия и развитие гормональной резистентности клеток рака молочной железы

2, УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

С. Е. Семина1, Д. В. Багров2, М. А. Красильников1 1

НИИ канцерогенеза ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина»; Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; 2 ФГБОУ ВПО МГУ им. М. В. Ломоносова; Россия, 119991, Москва, Ленинские горы, 1 Контакты: Светлана Евгеньевна Семина s.e.semina@gmail.com

Основная задача работы – исследование роли межклеточных взаимодействий в развитии гормональной резистентности злокачественных опухолей, в частности опухолей молочной железы. Около 70 % опухолей молочной железы сохраняют рецепторы эстрогенов (ER) – основную мишень при действии гормональных препаратов на опухолевые клетки, однако эффективность гормонотерапии во многом ограничена развитием резистентности, приводящей к формированию эстрогеннезависимого фенотипа клеток. Различают врожденную и приобретенную гормональную резистентность рака молочной железы (РМЖ) (под последней подразумевают резистентность к гормональным препаратам, развившуюся в процессе терапии). В обоих случаях снижение гормональной зависимости может быть обусловлено как уменьшением содержания ER, так и рядом других факторов, среди которых нарушение баланса между белками-активаторами и супрессорами ER, лиганднезависимая активация ER, а также стимуляция сигнальных путей, идущих в обход ER и поддерживающих тем самым рост опухоли в отсутствие эстрогенов. Вместе с тем практически не исследована роль межклеточных взаимодействий в развитии гормональной резистентности опухолевых клеток. В отдельных работах отмечается участие межклеточных взаимодействий в реализации гормонального ответа опухолевых клеток, однако значение этого механизма для развития гормональной резистентности остается неясным. Мы предположили, что межклеточные взаимодействия могут влиять на формирование резистентного фенотипа клеток, в частности совместный рост гормоночувствительных и резистентных клеток может стимулировать распространение гормональной резистентности и на чувствительные клетки за счет продукции специфических факторов и их воздействия на соседние клетки либо паракринным путем, либо через собственно межклеточные контакты. На моделях клеток эстрогензависимого РМЖ MCF-7 и резистентной субпопуляции MCF-7 / T, полученной путем длительного культивирования клеток MCF-7 с антиэстрогеном тамоксифеном, исследована возможность изменения гормональной чувствительности этих клеток при кокультивировании in vitro. Предварительно гормонорезистентные клетки MCF-7 / Т были трансфицированы плазмидой, содержащей зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein, GFP), что позволило в дальнейшем отличить их от родительских клеток MCF-7. Мы показали, что кокультивирования этих двух линий в течение 10 сут достаточно для развития частичной резистентности к тамоксифену у родительских клеток MCF-7. Примечательно, что уровень гормональной чувствительности резистентных клеток MCF-7 / Т / GFP+ в этих условиях оставался по-прежнему низким. Далее было продемонстрировано, что к аналогичному развитию гормональной резистентности приводит добавление к родительским клеткам MCF-7 препаратов экзосом, полученных от резистентных клеток MCF-7 / Т / GFP+ (но не от родительских клеток), что свидетельствует о непосредственном участии экзосом в формировании гормональной резистентности. Клонирование полученных подобным образом резистентных клеток показало, что вновь приобретенный резистентный фенотип сохраняется на протяжении не менее 80 сут культивирования, иными словами является практически необратимым. В целом мы рассматриваем полученные результаты как свидетельство возможного участия межклеточных взаимодействий в реализации гормонального ответа и развитии гормональной резистентности, что открывает новые подходы в поиске мишеней для таргетной терапии опухолей молочной железы. Ключевые слова: рак молочной железы, гормональная резистентность, тамоксифен, экзосомы, микроРНК, рецептор эстрогена, межклеточные взаимодействия

DOI: 10.17 650 / 2313-805X. 2015.2.2.50–62 Intercellular interactions and progression of hormonal resistance of breast cancer cells S. E. Semina1, D.V. Bagrov2, M. A. Krasil’nikov1 1

Research Institute of Carcinogenesis, N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center; 24 Kashirskoye Highway, Moscow, 115478, Russia; 2 M.V. Lomonosov Moscow State University; 1 Leninskie Gory, Moscow, 119991, Russia

The main goal of the study is the analysis of the role of cell-cell interactions in the formation of the tumor cell resistance to hormonal drugs. About 70 % of breast tumors contain estrogen receptor (ER), a key molecular target for hormone (endocrine) therapy. However, the efficiency of endocrine therapy of breast cancer is limited by the development of hormone resistance which leads to progression of tumor cells to hormone-independent phenotype, increase in tumor malignancy and worse prognosis. Hormonal independence may be accompanied with the loss of the receptors, as well as with the another mechanisms including ligand-independent receptor activation, disbalance between receptor activators and repressors, stimulation of hormone-independent pathways. It is less known about the role of the intercellular interactions in the progression of hor-

Key words: breast cancer, hormonal resistance, tamoxifen, exosomes, microRNA, estrogen receptor, intercellular interactions

Введение Проблеме гормональной резистентности злокачественных новообразований посвящено достаточно много работ, установлены основные пути развития резистентости, подробно исследованы модели резистентности in vitro. Основу современных представлений о механизме действия стероидных гормонов заложила теория E. V. Jensen [1], предложившего двухступенчатую модель действия гормона. В рамках этой модели молекула стероидного гормона, проникая внутрь клетки-мишени, связывается со специфическим белком-рецептором, затем образовавшийся гормонорецепторный комплекс транслоцируется в клеточное ядро, где взаимодействует со специфическими последовательностями ДНК и изменяет экспрессию соответствующих генов. За последующие 40 лет были существенно расширены представления о механизме действия стероидов, расшифрованы доменная структура рецепторов и последовательность рецепторсвязывающих участков ДНК, открыты и описаны эпигеномные эффекты рецепторов, но в целом основные положения модели E.V. Jensen остаются справедливыми и сегодня. Присутствие специфических рецепторов совершенно необходимо для реализации действия гормонов и во многом определяет уровень гормональной зависимости опухолей. Так, содержание рецепторов эстрогенов (ER) является на сегодняшний день основным критерием определения чувствительности больных раком молочной железы (РМЖ) к антиэстрогенам (в частности, к тамоксифену) и другим видам гормонотерапии [2–7]. Различают врожденную и приобретенную гормональную резистентность РМЖ (под последней подразумевают резистентность к гормональным препаратам, развившуюся в процессе терапии). В обоих случаях снижение гормональной зависимости может быть обусловлено как уменьшением содержания ER, так и рядом других факторов, среди которых нарушение баланса между белками-актива-

торами и супрессорами ER, лиганднезависимая активация ER, а также стимуляция сигнальных путей, идущих в обход ER (EGFR, PI3K, NF-κB) и поддерживающих тем самым рост РМЖ в отсутствие эстрогенов [8–12]. Вместе с тем практически не исследована роль межклеточных взаимодействий в развитии гормональной резистентности опухолевых клеток. Влияние межклеточных взаимодействий на метаболизм клеток может реализовываться в нескольких направлениях. Во-первых, это образование собственно контактов между клетками, в частности щелевых, через которые может осуществляться обмен функционально активных факторов [13–15]. Во-вторых, путем паракринной регуляции, в том числе через продукцию в окружающую среду ростовых факторов, способных инициировать сигнальные каскады, отвечающие за рост и пролиферацию клеток [16–18]. И в-третьих, через продукцию клетками экзосом – мельчайших везикул, содержащих как метаболически активные белки, так и некоторые нуклеиновые кислоты, в том числе микроРНК [19–22]. Продемонстрировано значение межклеточных взаимодействий в сенсибилизации опухолевых клеток к цитостатическим препаратам, в частности отмечается участие экзосом в развитии и распространении множественной лекарственной устойчивости [23, 24], изменении клеточной подвижности и миграции [25], однако этот механизм практически не исследовался при развитии гормональной резистентности. В настоящей работе изучалась роль межклеточных взаимодействий в развитии гормональной резистентности клеток РМЖ, в частности возможность «горизонтального» пути регуляции уровня гормонального ответа от клетки к клетке. Мы показали, что кокультивирование гормоночувствительных и резистентных клеток РМЖ приводит к снижению гормональной зависимости чувствительных клеток. Решающим фактором в подобном «горизонтальном»

2015

monal resistance. Several studies demonstrate the involvement of cell junctions in the mediating of cell response to (anti) estrogens, however the significance of cell-cell contacts in the formation of hormonal resistance still not clear.

Here we have hypothesized that the formation of the hormone resistance of tumors may be based, at least in part, on the transferring of the resistant phenotype from the resistant to hormone-sensitive cells – as a result of the secretion of the specific factors acting in the paracrine manner or via the direct cell-cell contacts. Using the estrogen-dependent breast cancer cells MCF-7 and the resistant subline MCF-7 / T developed by long-term cultivation of MCF-7 cells in the presence of antiestrogen tamoxifen, we investigated the possible changes in the hormonal sensitivity of these cells caused by the co-cultivation in vitro. To discern the cell cultures, the MCF-7 / T cells were previously transfected with the plasmid containing the gene of the green fluorescent protein (GFP), and GFP-positive hormone-resistant subline MCF-7 / T / GFP+ was developed. We showed that the co-cultivation of the parent and resistant cells lead to increase in the resistance of the parent cell to tamoxifen.

To further explore the mechanism of such resistance, the analysis of the biological activity of exosomes prepared from the estrogen-sensitive and resistant cells was performed. The exosome preparations isolated from the resistant MCF-7 / T cells were found to induce the similar resistance in the recipient MCF-7 cells – in contrast to the control exosomes isolated from the MCF-7 cells. The subsequent cloning of these newly formed resistant cells showed that the cells retain the resistant phenotype for at least 80 days of cultivation.

Totally, the results presented demonstrate the important role of cell-cell interactions in the progression of hormonal resistance, opening a new perspectives in the development of probable targets for breast cancer therapy.

51

2,

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

2015

пути передачи гормональной резистентности являются межклеточные взаимодействия, реализуемые в том числе с участием экзосом, продуцируемых резистентными клетками.

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2,

52

Материалы и методы Культивирование клеток. Клетки РМЖ человека линии MCF-7 культивировали в стандартной среде DMEM, содержавшей 7 % эмбриональную сыворотку телят (FBS HyClone, США) и гентамицин (50 ед / мл) («ПанЭко», Россия), при 37 °С и 5 % СО2. При анализе скорости роста и чувствительности к тамоксифену количество клеток определяли либо при подсчете в камере Горяева, либо с использованием МТТ-теста, основанного на утилизации живыми клетками реагента МТТ (3-[4,5-диметилтиазол-2]-2,5-дифенилтетразол бромида). Трансфекция клеток. Трансфекцию клеток плазмидой pEGFP-N1 (предоставлена Д.Е. Андреевым, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Москва) проводили в течение 4 ч с использованием реагента Metafectene PRO (Biontex Laboratories GmbH, Германия) при 37 °С. Селекцию клеток выполняли в присутствии G-418 в течение 14 сут. Эффективность трансфекции и последующей селекции оценивали при определении количества флуоресцирующих GFPпозитивных клеток с помощью флуоресцентного микроскопа Axioplan 2 ZEISS (Carl Zeiss, Германия). Выделение и характеристика препаратов экзосом. Экзосомы выделяли из кондиционированной культуральной среды по стандартной методике, как описано J. S. Bonifacino et al. [26]. Коротко, клетки культивировали в течение 4 сут в стандартной среде, затем культуральную жидкость в равных объемах с каждой линии собирали и последовательно центрифугировали 30 мин при 300g и 2000g и 2 ч при 10 000g. После каждого центрифугирования супернатант переносился в новые пробирки, полученные осадки растворяли в 500 мкл PBS. Все работы выполнялись стерильно. Для проведения иммуноблоттинга препараты экзосом лизировали в буфере следующего состава: 50 мM Tris-HCl pH 7,4, 1 % Igepal CA-630; 150 мM NaCl, 1 мM EDTA, 1 мМ DTT, 1 мкг / мл aprotinin, leupeptin и pepstatin, 1 мM NaF и 1 мM ортованадат Na. Образцы центрифугировали (10 000g, 10 мин, 4 °С) и проводили стандартный электрофорез и иммуноблоттинг, как описано ранее [27], с использованием антител к CD81 (BioLegend, США) и β-актину (Cell Signaling, США). Электронная микроскопия экзосом. Для исследования методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) образцы экзосом готовили следующим образом. Медные сетки, покрытые углеродом (TedPella), обрабатывали в тлеющем разряде с помощью установки Emitech K100X. Затем на них в течение 3–5 мин адсорбировали экзосомы, суспендированные в PBS, и препараты контрастировали 1 % раствором

ТОМ 2 уранилацетата. Измерения проводили на ПЭМ Jeol-1011 при ускоряющем напряжении 80 кВ. Статистическая обработка. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica 10.0. Во всех случаях статистические критерии считали достоверными при p < 0,05. Результаты и обсуждение Разработка экспериментальной модели приобретенной гормональной резистентности клеток РМЖ. Клетки аденокарциномы молочной железы человека линии MCF-7 культивировали в стандартной среде DMEM, содержавшей 7 % эмбриональную сыворотку телят (HyClone, CША) и гентамицин (50 ед/мл) («ПанЭко», Россия), при 37 °С и 5 % СО2. Субпопуляция MCF-7/T получена путем длительной (60 сут) селекции клеток MCF-7 в присутствии антиэстрогена тамоксифена. После окончания селекции полученную сублинию культивировали в стандартных условиях в течение не более 6 мес. Уровень гормональной зависимости сублинии MCF-7 / T определяли по изменению скорости пролиферации после добавления к клеткам антиэстрогена тамоксифена. Скорость пролиферации находили с помощью МТТ-теста. Результаты теста показали, что полученная сублиния MCF-7 / T характеризуется относительной резистентностью к антипролиферативному действию тамоксифена по сравнению с клетками родительской линии (рис. 1а). Получение стабильного GFP-позитивного клона гормоннезависимой сублинии MCF-7/T. Целью следующего этапа экспериментов было изучение возможности «горизонтального» пути регуляции уровня гормонального ответа, в том числе развития гормональной резистентности при совместном культивировании резистентных и гормонозависимых клеток. Для решения этой задачи была получена стабильная GFP-продуцирующая гормонорезистентная сублиния, в которой присутствие гена зеленого флуоресцентного белка (green fluorescent protein, GFP) позволяло отличить эти клетки от гормоночувствительных при их совместном культивировании. Коротко, гормонорезистентные клетки MCF-7 / Т были трансфицированы плазмидой pEGFP-N1, содержащей GFP, с последующей селекцией GFP-позитивных клонов. В результате селекции выделен стабильный клон MCF-7 / T с содержанием GFP-позитивных клеток ≥ 98 %, достаточным для проведения дальнейших экспериментов (рис. 1б). Влияние совместного культивирования гормоночувствительных и резистентных клеток на уровень гормонального ответа. В экспериментах по совместному культивированию родительских клеток MCF-7 (GFPнегативных) с резистентными (GFP-позитивными) клетками MCF-7 / Т / GFP+ и последующему определению чувствительности обеих линий к тамоксифену мы обнаружили, что кокультивирование этих двух линий в течение 10 сут приводит к развитию частич-

Контроль Количество клеток, %

100

Тамоксифен

50

0 MCF-7

б I

MCF-7/T

II

Рис. 1. Получение сублинии клеток MCF-7 / T: a – клетки линии MCF-7 культивировали в течение 30 сут с последовательным повышением концентрации тамоксифена от 10–8 M до 10–5 М. Затем клетки переводили в стандартную среду без тамоксифена на срок не менее 10 сут. Чувствительность к тамоксифену определяли с помощью МТТ-теста после однократного добавления тамоксифена в концентрации 5×10–6 М; б – клетки MCF-7 / T были трансфицированы плазмидой pEGFP-N1, содержащей GFP. Далее проводили селекцию и клонирование для получения популяции клеток, стабильно экспрессирующих GFP. Процент GFP-позитивных клеток в популяции составляет ≥ 98 %. I – общий вид клеток MCF-7 / T при световой микроскопии, II – флуоресценция GFP-позитивных клеток MCF-7 / T / GFP+

ной резистентности к тамоксифену у родительских клеток MCF-7 (рис. 2а). Примечательно, что уровень гормональной чувствительности резистентных клеток MCF-7 / Т / GFP+ в этих условиях не изменяется (рис. 2б). а

Контроль

б Контроль

Тамоксифен

100 Количество клеток, %

Количество клеток, %

100

Далее из GFP-негативных клеток MCF-7, прошедших кокультивирование с резистентными клетками MCF-7/Т/GFP+, были клонированы отдельные клетки и проанализирована чувствительность полученного клеточного клона к тамоксифену. Оказалось, что такая культура (MCF-7/clone R) действительно характеризуется относительной резистентностью к тамоксифену по сравнению с родительскими клетками MCF-7 (рис.

3а). Нам не удалось обнаружить реверсии резистентного фенотипа, во всяком случае на протяжении 80 сут последующего культивирования клеток в стандартных условиях, что свидетельствует о развитии долговременных изменений метаболизма в таких клетках (рис. 3б). Роль экзосом в развитии гормональной резистентности клеток РМЖ. Для дальнейшего исследования механизма подобной гормональной резистентности, передаваемой от клетки к клетке, из гормоночувствительных и резистентных клеток были получены препараты экзосом и проанализировано их влияние на уровень гормональной зависимости клеток. Предварительно присутствие экзосом в полученных препаратах было верифицировано с помощью иммуноблоттинга с антителами к специфическому маркеру экзосом – CD81 (рис. 4а) и методом просвечивающей электронной микроскопии (рис. 4б). Оказалось, что регулярное добавление (в течение 10 сут) к клеткам MCF-7 экзосом, полученных от резистентных клеток MCF-7/Т, приводит к развитию частичной резистентности клеток MCF7 к тамоксифену. В то же время экзосомы, полученные от родительских клеток MCF-7, не обладают такой активностью и их добавление не приводит к изменению гормональной чувствительности клеток (рис. 4в). В целом полученные результаты свидетельствуют, что кокультивирование гормоночувствительных и резистентных клеток РМЖ приводит к снижению гормональной зависимости чувствительных клеток. Решающим фактором в подобном «горизонтальном» пути передачи гормональной резистентности являются межклеточные

50

0

Тамоксифен

50

0 MCF-7

MCF -7 + кокульт.

MCF-7/T/GFP+

MCF-7/T/GFP+ + кокульт.

Рис. 2. Влияние совместного культивирования на чувствительность к тамоксифену клеток MCF-7 и MCF-7/T/GFP+. Клетки MCF-7 и MCF7/T/GFP+ кокультивировали в течение не менее 14 сут в стандартной среде. Затем добавляли тамоксифен в концентрации 5×10–6М на 3 сут и определяли количество нефлуоресцирующих и флуоресцирующих клеток в камере Горяева: а – влияние тамоксифена на клетки MCF-7 до и после кокультивирования с резистентными клетками MCF-7/T/GFP+; б – влияние тамоксифена на клетки MCF-7/T/GFP+ до и после кокультивирования с клетками MCF-7/T

2015

а

53

2,

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ а

б Тамоксифен

50

Тамоксифен

100 Количество клеток, % от контроля

Количество клеток, %

100

50

0

0 MCF-7 clone control

Контроль

MCF-7 clone R

20

40

60

80

сут

Рис. 3. Анализ сублинии MCF-7 / R, клонированной из клеток MCF-7 после кокультивирования последних с клетками MCF-7 / T / GFP+: а – клетки MCF-7 после кокультивирования с клетками MCF-7 / T / GFP+ клонированы, и чувствительность к тамоксифену полученной сублинии MCF-7 / R определялась как описано в методах; б – клетки MCF-7 / R после клонирования культивировали в стандартной среде в течение 20–80 сут с последующим определением чувствительности к тамоксифену

а CD81

β-актин Экзосомы MCF-7

Экзосомы MCF-7/T/GFP+

б

Экзосомы MCF-7

Экзосомы MCF-7/T/GFP+

в Количество клеток, %

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

Контроль

2,

2015

54

Тамоксифен

100

50

0 MCF-7

MCF -7 + Exo -К

MCF -7 + Exo-Т

Рис. 4. Экзосомы и чувствительность клеток MCF-7 к тамоксифену: а – иммуноблоттинг образцов экзосом, полученных от клеток MCF-7 и MCF-7/T/GFP+, с антителами к маркеру экзосом CD81; б – ПЭМ препаратов экзосом клеток MCF-7 и MCF-7/T/GFP+/; в – влияние препаратов экзосом (Exo-K), полученных от клеток MCF-7 и MCF-7/T/GFP+ (Exo-Т) на чувствительность клеток MCF-7 к тамоксифену

взаимодействия, реализуемые в том числе с участием экзосом, продуцируемых резистентными клетками. Заключение Целью настоящей работы явилось исследование роли межклеточных взаимодействий в развитии гормональной резистентности опухолевых клеток. Появление в опухоли популяции клеток, резистентных к гормонам, и дальнейший совместный рост гормоночувствительных и резистентных клеток по нашим предположениям может стимулировать распространение гормональной резистентности и на чувствительные клетки за счет продукции специфических факторов и их воздействия на соседние клетки либо паракринным путем, либо через собственно межклеточные контакты. На клетках эстрогензависимого РМЖ (MCF-7) и резистентной субпопуляции (MCF-7 / T), полученной путем длительного культивирования клеток MCF7 с антиэстрогеном тамоксифеном, была продемонстрирована возможность изменения гормональной чувствительности этих клеток при их кокультивировании in vitro. Дальнейшее изучение механизма такой резистентности показало, что в переносе резистентного фенотипа на чувствительные клетки участвуют экзосомы, секретируемые резистентными клетками. В целом мы рассматриваем представленные результаты как впервые полученные свидетельства участия межклеточных взаимодействий в переносе резистентного фенотипа от клетки к клетке и рассчитываем, что дальнейшее продолжение этих исследований позволит установить механизм этого эффекта и его значение в развитии приобретенной гормональной резистентности злокачественных опухолей. Работа финансировалась из средств гранта Российского научного фонда № 14-15-00362 (эксперименты разделов № 2–4) и Российского фонда фундаментальных исследований № 13-04-00284 (эксперименты раздела № 1) и выполнялась с использованием оборудования Центра коллективного пользования Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова.

формации клеток. Биохимия 2000;65(1):68–78. [Krasilnikov M.A. Signal paths regulated with phosphatidylinosit-3-kinase and their significance for growth, survival, and malignant transformation of cells.

Biokhimiya = Biochemistry 2000;65(1): 68–78. (In Russ.)].

10. Kurebayashi J. Endocrine-resistant breast cancer: underlying mechanisms and strategies for overcoming resistance.

Breast Cancer 2003;10(2):112–9.

11. Roop R.P., Ma C.X. Endocrine resistance in breast cancer: molecular pathways and rational development of targeted therapies. Future Oncol 2012;8(3):273–92.

12. Красильников М.А., Щербаков А.М. Сигнальные пути, регулируемые эстрогенами, и их роль в опухолевой прогрессии: новые факты и направления поиска. Успехи молекулярной онкологии 2014;1:18–26.[Krasilnikov M.A., Shcherbakov A.M. Signal paths regulated with estrogens and their role in tumor progression: new facts and directions of search. Uspekhi molekulyarnoy onkologii = Advanses of Molecular Oncology 2014;1:18–26. (In Russ.)].

13. Oshima A. Structure and closure of connexin gap junction channels. FEBS Lett 2014;588(8):1230–7.

14. El-Saghir J.A., El-Habre E.T., El-Sabban M.E., Talhouk R.S. Connexins: a junctional crossroad to breast cancer. Int J Dev Biol 2011;55(7–9):773–80.

15. Rameshwar P. Potential novel targets in breast cancer. Curr Pharm Biotechnol 2009;10(2):148–53.

16. Taipale J., Beachy P.A. The Hedgehog and Wnt signalling pathways in cancer.

Nature 2001;411(6835):349–54.

17. Adjei A.A., Hidalgo M. Intracellular signal transduction pathway proteins as targets for cancer therapy. J Clin Oncol 2005;23:5386–403.

18. Niepel M., Hafner M., Pace E.A. et al.

Analysis of growth factor signaling in genetically diverse breast cancer lines.

BMC Biol 2014;12:20.

19. Kohlhapp F.J., Mitra A.K., Lengyel E., Peter M.E. MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment. Oncogene 2015;13.

20. Falcone G., Felsani A., D’Agnano I. Signaling by exosomal microRNAs in cancer. J Exp Clin Cancer Res 2015; 34:32.

21. Squadrito M.L., Baer C., Burdet F. et al. Endogenous RNAs modulate microRNA sorting to exosomes and transfer to acceptor cells. Cell Rep 2014;8(5): 1432–46.

22. Taylor D.D., Gercel-Taylor C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol Oncol 2008;110(1):13–21.

23. Corcoran C., Rani S., O’Brien K. et al.

Docetaxel-resistance in prostate cancer: evaluating associated phenotypic changes and potential for resistance transfer via exosomes. PLoS One 2012;7(12).

24. Lv M.M., Zhu X.Y., Chen W.X. et al.

Exosomes mediate drug resistance transfer in MCF-7 breast cancer cells and a probable mechanism is delivery of P-glycoprotein. Tumour Biol 2014;35(11):10773–9.

25. Harris D.A., Patel S.H., Gucek M. et al. Exosomes released from breast cancer carcinomas stimulate cell movement. PLoS One 2015;10(3).

26. Bonifacino J.S., Dasso M., Harford J.B. et al. Current Protocols in Cell Biology.

John Wiley & Sons, 2004. 3178 p.

27. Scherbakov A.M., Stefanova L.B., Sorokin D.V. et al Snail/beta-catenin signaling protects breast cancer cells from hypoxia attack. Exp Cell Res 2013;319(20):3150–9.

2,

Л И Т Е Р А Т У Р А 1. Jensen E.V., DeSombre E.R. Estrogenreceptor interaction. Science 1973;182(4108):126–34.

2. Красильников М.А. Современные подходы к изучению механизма эстрогеннезависимого роста опухолей молочной железы. Вопросы онкологии 2004; 50(4):399–405. [Krasilnikov M.A. Stateof-art approaches to studying of the mechanism of estrogen-independent growth of breast tumors. Voprosy onkologii = Oncology Issues 2004;50(4):399–405.

(In Russ.)].

3. Clarke R., Liu M.C., Bouker K.B. et al.

Antiestrogen resistance in breast cancer and the role of estrogen receptor signaling.

Oncogene 2003;22(47):7316–39.

4. Lee M., Lee C.S., Tan P.H. Hormone receptor expression in breast cancer: postanalytical issues. J Clin Pathol 2013; 66(6):478–84.

5. Normanno N., Di Maio M., De Maio E. et al. Mechanisms of endocrine resistance and novel therapeutic strategies in breast cancer. Endocr Relat Cancer 2005;12(4):721–47.

6. Jordan V.C. Targeting antihormone resistance in breast cancer: a simple solution. Ann Oncol 2003;14(7):969–70.

7. Jalava P., Kuopio T., Huovinen R. et al.

Immunohistochemical staining of estrogen and progesterone receptors: aspects for evaluating positivity and defining the cutpoints. Anticancer Res 2005;25(3c): 2535–42.

8. Берштейн Л.М. Современная эндокринология гормонозависимых опухолей. Вопросы онкологии 2002; 48(4):496–504. [Berstein L.M. Modern endocrinology of hormone-dependent tumors. Voprosy onkologii = Oncology Issues 2002;48(4):496–504. (In Russ.)].

9. Красильников М.А. Сигнальные пути, регулируемые фосфатидилинозит3-киназой, и их значение для роста, выживаемости и злокачественной транс-

55

2015

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2,

2015

56

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

ТОМ 2

Диагностическая значимость уровней ДНК и антител к капсидному антигену вируса Эпштейна–Барр в плазме крови больных раком носоглотки в неэндемическом регионе В. Э. Гурцевич1, Н. Б. Сенюта1, В. Н. Кондратова1, Е. В. Гончарова2, А. В. Игнатова2, М. В. Ломая2, М. А. Кропотов2, А. М. Мудунов2, А. В. Лихтенштейн1 1

НИИ канцерогенеза ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина»; Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; 2 Научно-исследовательский институт клинической онкологии ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина»; Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, 23 Контакты: Владимир Эдуардович Гурцевич gurvlad532@yahoo.com

Вирус Эпштейна – Барр (ВЭБ), представитель семейства герпес-вирусов человека, является этиологическим агентом для ряда доброкачественных и злокачественных новообразований человека. Среди последних особое место занимает рак носоглотки (РНГ). В его возникновении ВЭБ играет ключевую роль, стимулируя прогрессирование патологического процесса от предраковых поражений до появления злокачественной опухоли. Для большинства больных РНГ характерны повышенные уровни гуморальных IgI- и IgAантител к капсидному и раннему антигенам ВЭБ, причем титры этих антител поднимаются до высоких уровней задолго до диагностического рака. При учете этого феномена уже многие годы вирусоспецифические антитела используются в качестве маркеров для диагностики РНГ, особенно в случаях невыявленного первичного очага. В последние годы в эндемичных для РНГ регионах (Южный Китай, страны Юго-Восточной Азии) проявлен большой интерес к использованию количественного определения копий ДНК ВЭБ в плазме крови больных РНГ в качестве метода раннего выявления рака и мониторинга опухолевого процесса. Цель исследования – сравнительная оценка клинической значимости уровней ДНК ВЭБ и гуморальных антител к вирусу в плазме крови больных РНГ в неэндемичном регионе (России). Полученные результаты свидетельствуют о том, что оба маркера: ДНК ВЭБ и IgAантитела к капсидному антигену ВЭБ могут быть успешно использованы для диагностики РНГ в неэндемичном регионе. Однако по сравнению с вирусоспецифическими антителами число копий вирусной ДНК в плазме крови больных является более чувствительным и специфическим маркером, отражающим эффективность проведенной терапии, а также состояние ремиссии или рецидива болезни. Ключевые слова: рак носоглотки, вирус Эпштейна–Барр, капсидный антиген, ранний антиген, титры IgG- и IgA-антител, ремиссия, рецидив, стабилизация опухолевого процесса, концентрация ДНК вируса Эпштейна–Барр в 1 мл плазмы крови, диагностика рака носоглотки

DOI: 10.17650/2313-805X.2015.2.2.004–?

Diagnostic significance of DNA and antibodies against capsid antigens of anti-Epstein–Barr virus antibodies levels in blood plasma of nasopharyngeal carcinoma patients from non-endemic region V. E. Gurtsevich1, N. B. Senyuta1, V. N. Kondratova1, E. V. Goncharova2, A. V. Ignatova2, M. V. Lomaya2, M. A. Kropotov2, A. M. Mudunov2, A. V. Lichtenstein1 1

Research Institute of Carcinogenesis, N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center; 24 Kashirskoye Shosse, Moscow, 115478, Russia; 2 Research Institute of Clinical Oncology, N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center; 24 Kashirskoye Shosse, Moscow, 115478, Russia Epstein–Barr virus (EBV), a representative of the herpesvirus family, is the etiological agent for a number of benign and malignant human neoplasms. Among the latter, the nasopharyngeal carcinoma (NPC) occupies a special place. In NPC development EBV plays a key role stimulating the progression of the pathological process from precancerous lesions to the cancer development. For most NPC patients, elevated levels of humoral IgG and IgA antibodies against capsid and early EBV antigens are characteristic and their antibody titers rise to high levels long before the diagnosis of cancer. Using this phenomenon, virus-specific antibodies are used for many years as markers for NPC screening, especially in cases of undiagnosed primary lesion. In recent years, in endemic for NPC regions (South China, South-East Asia) a great attention has been paid to the use of quantitative determination of EBV DNA copies in the blood plasma of patients with NPC as a method of early cancer detection and monitoring. The aim of this study was to compare clinical significance of EBV DNA and humoral antibodies levels in blood plasma of NPC patients in non-endemic region, Russia. The results obtained indicate that both markers DNA/EBV and IgA antibodies against capsid EBV antigens can be successfully used for diagnosis of NPC in non-endemic region. However, in comparison with the virus-specific antibody titers, the viral DNA levels in the patients plasma are more sensitive and specific as NPC marker reflecting the efficacy of the therapy, and the state of remission or relapse.

Key words: nasopharyngeal carcinoma, Epstein–Barr virus, capsid antigen, early antigen, IgG- and IgA-antibody titers, remission, relapse or stabilization of the tumor process, Epstein–Barr virus DNA concentration in 1 ml of blood plasma, nasopharyngeal carcinoma diagnostics

Материалы и методы Клинические образцы. Материалом для исследования служила плазма крови 17 больных РНГ и 24 пациентов с другими опухолями слизистой оболочки полости рта (ДОПР), проходивших лечение в ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина». В качестве контроля изучены образцы плазмы крови 19 доноров. Из 17 больных РНГ 5 были первичными, а 12 – после проведе-

2015

Вирусный геном у этих больных можно обнаружить уже на ранних стадиях опухолевого процесса [14]. Для большинства больных нРНГ характерны повышенные титры гуморальных антител к ВЭБ [15, 16], которые поднимаются до высоких уровней задолго до установления диагноза [17]. Это позволило предположить, что ВЭБ может участвовать в патогенезе нРНГ еще в доклинической фазе болезни. При этом обнаружение антител, относящихся к иммуноглобулину (Ig) класса А против вирусного капсидного и раннего антигенов ВЭБ (ВКА и ВРА соответственно), широко используется для скрининга нРНГ в эндемичных по этому заболеванию регионах Китая [18]. В последнее время наблюдается нарастающий интерес к тестированию в плазме крови ассоциированных с опухолью нуклеиновых кислот в качестве метода, применяемого для раннего выявления рака и мониторинга опухолевого процесса [19–21]. На сегодняшний день ДНК ВЭБ в плазме крови больных РНГ – один из наиболее изученных опухолевых маркеров [22]. Количественное определение копий ДНК представляется особенно полезным методом мониторинга как для идентификации остаточной (клинически скрытой) опухоли после проведенной радиотерапии [23], так и для прогнозирования эффективности лечения [24]. С учетом диагностической значимости обоих указанных выше методов исследования можно ожидать, что в плазме крови больных РНГ между концентрациями ДНК ВЭБ и титрами IgA-антител к ВКА существует корреляция, но такие исследования даже для эндемичных регионов оказались единичными и полностью отсутствуют для неэндемичных регионов. Цель исследования – сравнительная оценка клинической значимости уровней ДНК ВЭБ и гуморальных антител к вирусу в плазме крови больных РНГ в неэндемичном регионе, России. В частности, представляло интерес выяснить, какой из изучаемых маркеров наиболее адекватен для диагностики РНГ и оценки клинического статуса после проведенной химиолучевой терапии. Полученные результаты свидетельствуют о том, что оба маркера: ДНК ВЭБ и IgAантитела к ВКА могут быть успешно использованы для диагностики нРНГ в неэндемичном регионе. Однако число копий ДНК ВЭБ в плазме больных является наиболее чувствительным и специфическим маркером, отражающим эффективность проведенной терапии, а также состояние ремиссии или рецидива болезни.

57

2,

Введение Вирус Эпштейна–Барр (ВЭБ), представитель семейства герпес-вирусов человека, в 1964 г. исходно выделенный из клеток лимфомы Беркитта Майклом Энтони Эпштейном и его коллегой Ивонной Барр, обладает уникальными биологическими свойствами. Им инфицировано более 90 % населения планеты, как правило, без клинических проявлений у вирусоносителей. В то же время вирус признан этиологическим агентом для ряда доброкачественных и злокачественных заболеваний [1]. Среди последних особое место занимает рак носоглотки (РНГ), в возникновении которого ВЭБ играет ключевую роль, стимулируя прогрессирование патологического процесса от предраковых поражений до появления злокачественной опухоли [2]. Заболеваемость РНГ в мире характеризуется географической и этнической вариабельностью [3]. Она наиболее высокая в южных провинциях Китая и странах Юго-Восточной Азии (25–30 случаев на 100 000 населения в год), несколько ниже – в арабских странах Северной Африки, в Гренландии и у эскимосов на Аляске [4]. В западных странах РНГ регистрируют нечасто, реже чем 0,5 случая на 100 000 населения в год [5]. Примерно с такой же частотой РНГ встречается и на территории бывшего СССР, включая Россию, в структуре злокачественных новообразований которой в 2006 г. опухоли носоглотки у мужчин составляли 0,15 %, а у женщин – 0,08 % [6]. Согласно классификации Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) РНГ морфологически подразделяется на 2 типа: плоскоклеточный ороговевающий рак (keratinising squamous cell carcinoma) и неороговевающий рак (non-keratinising squamous cell carcinoma), в состав которого как подтип входит недифференцированный РНГ (нРНГ) (undifferentiated carcinoma) [7]. Для неороговевающего рака обычно характерна обильная лимфоидная инфильтрация, состоящая из лимфоцитов, гистиоцитов, эозинофилов и других реактивных клеточных элементов [8, 9]. Молекулярно-эпидемиологические исследования показали, что для больных РНГ ассоциация с ВЭБ не зависит от географического происхождения и этнической принадлежности [10]. Однако для реализации онкогенной потенции вируса и возникновения опухоли необходимо воздействие на организм ряда вредных факторов внешней и внутренней среды, обладающих мутагенными свойствами, корторые приводят к метилированию генов опухолевых супрессоров, активации или супрессии других генов, а также собственно хозяйских факторов. К последним относят ослабленный иммунный ответ на вирусную инфекцию, ослабленный локальный иммунный ответ, определенный HLAгенотип хозяина, наследственную предрасположенность и т. д. [11–13]. Практически все случаи нРНГ являются ВЭБ-позитивными, при этом вирус присутствует во всех опухолевых клетках в отличие от ряда других патологий, ассоциированных с этим вирусом.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

2015

ния одного или нескольких стандартных курсов химиотерапии (ХТ) с лучевой терапией (ЛТ) или без последней. Соотношение мужчин и женщин было 16:1, средний возраст составил 46,5 года. У всех больных был диагностирован нРНГ согласно классификации ВОЗ (III тип). В состав пациентов с ДОПР вошли больные раком слизистой оболочки полости рта, языка и с некоторыми другими злокачественными поражениями полости рта. Соотношение мужчин и женщин было 3:1, средний возраст составил 57,5 года. Проведенное исследование, в которое пациенты с РНГ и ДОПР вошли с их согласия в результате случайной выборки, одобрено комитетом по этике при ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина». Серологический тест на антитела к ВЭБ. Количественное определение титров IgG- и IgA-антител к ВКА ВЭБ осуществляли непрямым методом иммунофлюоресценции, используя конъюгированные с флуоресцеин изотиоцианатом козьи антитела против IgG и IgA человека (Jackson Immune Research Laboratories, Inc.) Для определения антител к ВКА использовали клеточную линию P3HR1, продуцирующую вирус. Клеточные линии культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10 % эмбриональной сыворотки Gibco, при 37 °С и 5 % СО2. Для усиления экспрессии ВКА клетки в течение 3–6 сут обрабатывали индуктором 12-0-тетрадеканоил-форбол-13-ацетатом (20 нг / мл). Приготовленный таким образом пул клеток наносили на предметные стекла, фиксировали и использовали в качестве антигена. Четырехкратные разведения известной ВЭБ-позитивной сыворотки использовали в качестве контроля. Образцы плазмы также 4-кратно разводили натрий-фосфатным буфером, начиная с 1:10. У здоровых лиц титры IgG-антител к ВКА колеблются от 1:10 до 1:160, а IgA-антитела к ВКА, как правило, присутствуют в низких титрах и в незначительном проценте случаев. Для больных же нРНГ характерны высокие титры антител к ВЭБ обоих классов. Экстракция циркулирующей ДНК. Кровь (5 мл), собранную в пробирки с этилендиаминтетрауксусной кислотой, центрифугировали при 1500g, плазму отбирали и хранили при температуре –60 °С. Полученные образцы плазмы объемом 0,5–1,0 мл депротеинизировали фенолом и хлороформом, после чего обессоливали путем диализа или центрифугирования через фильтры Amicon. Для выделения нуклеиновых кислот из плазмы крови применили оригинальный метод (изотахофорез в агарозном геле), который обеспечивает полное извлечение всех молекул независимо от размера, что особенно важно при исследовании фрагментированной ДНК [25]. Концентрацию ДНК определяли флюориметрически с красителем SYBR Green I на приборе Plate Reader Chameleon V multilabel counter (Hidex O, Финляндия). Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени (ПЦР-РВ). Число копий вирусной ДНК в 1 мл плазмы крови определяли посредством ПЦР-РВ.

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2,

58

ТОМ 2 Для построения калибровочных кривых использовали ДНК диплоидных клеток Namalwa, содержащих 2 интегрированных генома ВЭБ. При этом исходили из соотношения 3,3 пг геномной ДНК – 1 копия вирусной ДНК [26]. Для ПЦР-РВ применяли праймеры к фрагменту размером 76 пар нуклеотидов в области BamHI-W вирусной ДНК (GenBank accession number V01 555): sense primer – W-44F (5’-CCCAACACTCCACCACACC), antisense primer – W-119R (5’-TCTTAGGAGCTGTCCGAGGG), флюоресцентный зонд – W-67T (5’-FAMCACACACTACACACACCCACCCGTCTC-RTQ1) [22]. В качестве контроля способности ДНК плазмы служить матрицей в ПЦР использовали уникальный ген KRAS, как описано ранее [27]. Реакцию вели в 96-луночных планшетах на приборе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США) в 50 мкл реакционной смеси («Синтол», Россия), содержащей 0,3 мкМ каждого из праймеров, 25 нМ флюоресцентного зонда, 4 мМ MgCl2, 200 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 1 ед. Taq-полимеразы, 10 мкл раствора ДНК в буфере ТЕ (соответствует 50 мкл плазмы). В каждый анализ включали 2 негативных контроля (образцы, не содержащие ДНК). Условия ПЦР: денатурация 5 мин при температуре 95 °C, 40 циклов 15 с при температуре 95 °C и 30 с при температуре 56,5 °C. Данные ПЦР-РВ анализировали с помощью программы Bio-Rad CFX manager. Статистический анализ. Содержание тотальной и вирусной ДНК в плазме крови лиц, входящих в состав разных групп, сравнивали посредством непараметрического критерия (U-критерий Манна–Уитни). Рассчитывали точное значение p (различия считали статистически значимыми при p ≤ 0,05). Титры антител представляли в виде их среднегеометрических значений (СГЗ). Статистическую значимость различий частот изучаемых признаков оценивали с помощью критерия χ2, для малых выборок рассчитывали точный критерий Фишера. Меру линейной связи оценивали с помощью коэффициента корреляции рангов Спирмена. Вычисления проводили с помощью статистических пакетов Statistica for Windows 6.0 и SPSS. Результаты Проведенные исследования показали, что частота обнаружения IgG-антител к ВКА в плазме больных РНГ и здоровых лиц составляет 100 % (22 / 22) и лишь незначительно ниже у больных с ДОПР (91,7 %, 22 / 24). Частота же выявления IgA-антител к ВКА в группах пациентов с РНГ и ДОПР различалась существенно. У больных РНГ (первичных и в состоянии рецидива) антитела указанной специфичности обнаружены в 100 % и в 92,3 % (12 / 13) случаев у больных в состоянии ремиссии. У пациентов с ДОПР частота выявления IgA-антител к ВКА оказалось гораздо ниже – 16,7 % (4 / 24) случаев. В плазме крови здоровых лиц антивирусные антитела указанной специфичности отсутствовали. Различие в содержании IgA-антител

Уровни IgG- и IgA-антител к ВКА в плазме крови пациентов с РНГ, ДОПР и здоровых лиц

IgG к ВКА

2,

Титры антител к ВЭБ Группа

IgA к ВКА

всего

%

СГЗ

всего

%

СГЗ

Больные РНГ: первичные после полиХТ / ЛТ (ремиссия) после полиХТ / ЛТ (рецидив)

6 13 3

100 100 100

285,1 356,0 806,3

6 12 3

100 92,3 100

61,2 78,6 201,6

Пациенты с ДОПР

22

91,7

46,7

4

16,7

1,8

Здоровые лица

19

100

50,0

0

0

0

к ВКА у больных РНГ и у представителей 2 контрольных групп было статистически достоверным (р < 0,05, χ2 test) (таблица). Интересно отметить, что СГЗ титров IgG- и IgAантител к ВКА ВЭБ (сочетанные комбинации титров которых используются в качестве серологических маркеров РНГ) в группах первичных больных и больных после проведенной терапии в состоянии стабилизации и ремиссии колебались незначительно. В группе первичных больных они были равны 285,1 и 61,2 соответственно, в группе больных с положительным эффектом после проведенной терапии – 356,0 и 78,6 соответственно. Однако в группе больных с рецидивом опухолевого процесса анализируемые показатели оказались выше более чем в 2 раза (806,3 и 201,6 соответственно). Из этих данных следует, что положительный терапевтический эффект не сопровождался снижением титров вирусоспецифических антител, но они существенно возрастают у больных в состоянии рецидива. У пациентов с ДОПР СГЗ IgG- и IgA-антител к ВКА ВЭБ приближались к нормальным показателям: они равнялись 46,7 и 1,8 соответственно, а в группе здоровых лиц были обнаружены только IgGантитела (СГЗ = 50,0) (см. таблицу). Индивидуальные значения титров IgG- и IgA-антител к ВКА ВЭБ представлены на рис. 1. При анализе уровней ДНК ВЭБ и IgG- и IgAантител к ВКА ВЭБ в периферической крови обследуемых лиц выявлены следующие закономерности. Высокая концентрация вирусной ДНК в крови первичных больных (медиана 33 709 копий / мл; межквартильный интервал (МКИ) 32 254–52 918 копий / мл) падает до фоновых значений у пациентов, находящихся после лечения в состоянии ремиссии или стабилизации процесса (медиана 0 копий / мл; МКИ 0–535 копий/мл), но резко возрастает при рецидиве болезни (медиана 220 955 копий / мл), тогда как у пациентов с ДОПР и у доноров уровень вирусной ДНК не превышает фоновых значений (р < 0,001; U-критерий Манна–Уитни) (рис. 2). При этом гуморальный ответ больных РНГ на антигены ВЭБ не полностью коррелирует с концентрацией вирусной ДНК в крови этих

59

2015

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Титры антител 1400

IgG/ВКА

IgА/ВКА

1200 1000 800 600 400 200 0 Доноры

ДОПР

РНГ (п)

РНГ (ст/пл) РНГ (рец)

Рис. 1. Индивидуальные значения титров IgG- и IgA-антител у пациентов с РНГ, ДОПР и доноров крови. Число образцов: доноров (здоровых лиц) – 19, ДОПР – 24, первичного РНГ (РНГ (п)) – 6, РНГ со стабилизацией процесса после лечения (РНГ (ст/пл)) – 13, рецидива РНГ (РНГ (рец)) – 3

больных. Высокие СГЗ титров IgG- и IgA-антител к ВКА в группе первичных больных (285,1 и 61,2 соответственно) не снижаются у больных в состоянии ремиссии, как это происходит с числом копий ДНК ВЭБ, а скорее даже несколько возрастают (356,0 и 78,6 соответственно). В то же время у больных с рецидивом опухолевого процесса СГЗ титров указанных выше антител, как и число копий вирусной ДНК, возрастают значительно (806,3 и 201,6 соответственно; р < 0,05) (см. таблицу, рис. 1 и 2). С учетом небольшого числа наблюдений изучить наличие корреляции между титрами IgA-антител к ВКА ВЭБ и / или концентрацией в плазме ДНК ВЭБ и классификацией TNM или стадией болезни у больных РНГ не представилось возможным. Все же наличие взаимосвязи между уровнями вирусной ДНК в плазме и титрами IgA-антител к ВКА ВЭБ могут подвердить наблюдения за конкретными больными. В качестве примера на рис. 3 представлены данные титров IgA-антител к ВКА ВЭБ и числа копий ДНК ВЭБ в плазме больного А. 42 лет с РНГ T3NxM0 III стадии, у которого после проведенной терапии наступила ремиссия.

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2,

2015

60

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Копии ДНК ВЭБ/мл

Копии ДНК ВЭБ/мл

160 000

10 000 000

140 000

1 000 000

120 000

100 000

100 000 10 000 80 000 1000 60 000 100

40 000

10

20 000 0

1 1

2

3

4

5

1 – Доноры (19) 2 – ДОПР (24) 3 – РНГ-первичные (6) 4 – РНГ-стабилизация/ремиссия (13) 5 – РНГ-рецидив (3) Рис. 2. Индивидуальные значения числа копий ДНК ВЭБ в плазме крови доноров, пациентов с ДОПР и больных РНГ при различных клинических состояниях после проведенного лечения

Из рис. 3 видно, что концентрация ДНК ВЭБ в плазме больного, высокая до лечения (33 709 копий / мл), уже после 1-го курса ХТ снизилась до нуля и практически сохранялась на этом же уровне после 2-го и 3-го курсов. При этом опухолевый процесс перешел в стадию ремиссии. Высокие до лечения титры IgG- и IgA-антител после 1-го курса ХТ оставались на прежнем высоком уровне, но после 2-го курса ХТ не снизились вслед за снижением уровня вирусной ДНК, а, напротив, резко возросли, возможно, как отТитры антител 1500

Копии ДНК ВЭБ/мл 39 000

1300

34 000

1100

29 000

900

24 000

700

19 000

500

14 000

300

9000

100

4000

ТОМ 2 ражение усиления иммунного ответа на увеличившееся в организме больного количество вирусных белков из разрушенных ХТ опухолевых клеток. После 3-го курса ХТ титры вирусоспецифических антител довольно резко снизились, хотя и не до нормальных показателей, причем более значительно для IgA-антител к ВКА, отражая положительный эффект проведенной терапии. Пример отсутствия эффекта проведенной терапии у больного Б. 44 лет с РНГ T3N2M0 III стадии представлен на рис. 4, из которого видно, что исходный уровень ДНК ВЭБ в плазме крови больного до лечения был высоким (32 254 копии/мл), но после 1-го курса ХТ существенно снизился (1182 копии/мл). По-видимому, этот показатель отразил некоторый положительный ответ на проведенное лечение, сопровождавшееся зарегистрированным уменьшением размеров регионарных лимфатических узлов на 25 %. Однако после 2-го курса ХТ было отмечено резкое увеличение концентрации ДНК ВЭБ в плазме, что сочеталось с прогрессированием заболевания и появлением в костях опухолевых очагов. При этом титры IgG- и IgA-антител с уровнями концентрации ДНК не коррелировали. Высокие их титры, которые обнаружены при поступлении данного пациента в клинику, в отличие от уровней ДНК ВЭБ, отражающих динамику течения болезни, не снизились, а, напротив, повысились после проведенного 1-го курса ХТ. Но они снизились после 2-го курса ХТ, когда у больного было зарегистрировано прогрессирование опухолевого процесса. Последнее можно объяснить иммуносупрессией, обычно возникающей у больных в претерминальной стадии болезни [28]. В работах Y.M. Lo и других авторов [23, 24, 29] также сообщалось об увеличении концентрации ДНК Титры антител

Копии ДНК ВЭБ/мл

750

80 000 70 000 60 000

550

50 000 40 000 350 30 000

– 100

1

2 3 Этапы наблюдения

Антитела IgG к ВКА

4

– 1000

Антитела IgА к ВКА ДНК ВЭБ

Рис. 3. Динамика маркеров ВЭБ у больного А. РНГ с положительным эффектом проведенной терапии: 1 – до начала лечения; 2 – после 1-го курса ХТ; 3 – после 2 курсов ХТ; 4 – после 3 курсов ХТ и ЛТ, завершившихся ремиссией

20 000 150

10 000 0

– 50

1

2 3 Этапы наблюдения

Антитела IgG к ВКА

– 10000

Антитела IgА к ВКА ДНК ВЭБ

Рис. 4. Динамика маркеров ВЭБ у больного Б. РНГ с прогрессированием опухолевого процесса: 1 – до начала лечения; 2 – после 1-го курса ХТ (регресс лимфатических узлов на 25 %); 3 – после 2 курсов ХТ (прогрессирование опухолевого процесса, метастазирование в кости)

Обсуждение Присутствие в плазме (сыворотке) больных со злокачественными опухолями высвобождающихся в кровеносное русло молекул ДНК из гибнущих в организме опухолевых клеток открыло новые возможности для малоинвазивной детекции и мониторинга целого ряда неоплазий [19, 20]. Поскольку РНГ тесно ассоциирован с ВЭБ, измерение концентрации вирусной ДНК в плазме тестируемых лиц стало эффективным методом обнаружения этого новообразования. Впервые высокая ценность уровней ДНК ВЭБ в плазме крови для диагностики РНГ была показана в эндемичных регионах по РНГ (Южном Китае и странах Юго-Восточной Азии). В настоящем исследовании, проводимом в неэндемичном регионе (России), также была показана четкая корреляция концентраций вирусной ДНК в плазме больных РНГ с их клиническим состоянием. У всех первичных больных зарегистрировано высокое число копий ДНК ВЭБ, что может служить важным диагностическим маркером. После проведенной терапии у больных, большинство которых находилось в состоянии ремиссии, этот показатель снижался до фоновых значений, но резко возрастал у всех пациентов с рецидивом опухолевого процесса. Этот факт может быть использован для мониторинга больных РНГ и прогноза. При этом в плазме крови пациентов с ДОПР и здоровых лиц уровни ДНК ВЭБ не превышали фоновых значений. Полученные нами результаты совпадают с данными, опубликованными Y. M. Lo et al. [22] и другими исследователями [23, 24, 29], обнаружившими высокий уровень содержания ДНК ВЭБ в плазме крови пациентов РНГ из эндемичных регионов и предложившими использовать этот тест для диагностики и мониторинга этих больных. Тестирование больных РНГ на присутствие в их плазме (сыворотке) крови IgG-антител к ВКА, ВРА и IgA-антител к ВКА ВЭБ в качестве ценных маркеров для скрининга РНГ нами проводится уже в течение многих лет. Диагноз ставится на основании ре-

шающего правила, учитывающего совокупную значимость выявляемых титров антител обоих классов к ВКА и ВРА вируса. Особенно эффективным для диагностики РНГ оказалось серологическое тестирование больных с метастазами опухоли в лимфатические узлы шеи без выявленного первичного очага. Однако при длительном наблюдении за этими пациентами уровни вирусоспецифических антител не всегда отражали клиническое состояние больного, оставаясь, как правило, на высоком уровне. В настоящем исследовании нами обнаружены высокие уровни IgAантител к ВКА ВЭБ у первичных больных РНГ и больных с рецидивом опухолевого процесса. В то же время у больных после ХТ и ЛТ при стабилизации опухолевого процесса или ремиссии, сопровождаемых падением концентраций вирусной ДНК, титры IgAантител к ВКА ВЭБ не снижались, а по-прежнему оставались на высоком уровне (см. таблицу). Заключение Таким образом, результаты наших исследований, полученные при изучении больных РНГ в неэндемичном регионе, находятся в русле наблюдений Y. M. Lo и других авторов [22–24], проводивших свои исследования в эндемичных регионах и показавших ценность уровня копийности ДНК ВЭБ в качестве маркера, полезного для диагностики и мониторинга опухолевого процесса. Наши данные также позволяют сделать вывод о том, что уровни вирусной ДНК в плазме больных РНГ представляют собой более чувствительный и более специфический маркер, чем упомянутые титры IgG- и IgА-антител к ВКА, особенно для оценки эффективности терапии и прогноза, но последние остаются незаменимым маркером для первичной диагностики заболевания в случае метастазирования опухоли из невыявленного очага. Продолжение этих исследований нацелено на внедрение в клинику измерения вирусной ДНК и IgА-антител к ВКА в плазме крови больных РНГ в качестве полезных маркеров не только для ранней диагностики, оценки эффективности лечения и прогноза, но также для уточнения стадии заболевания, мониторинга локального рецидива и отдаленного метастазирования.

Л И Т Е Р А Т У Р А 1. Young L.S., Rickinson A.B. Epstein-Barr virus: 40 years on. Nat Rev Cancer 2004;4:757–68.

2. Gu A.D., Zeng M.S., Qian C.N. The criteria to confirm the role of Epstein-Barr virus in nasopharyngeal carcinoma initiation.

Int J Mol Sci 2012;13(10):13737–47.

3. Chang C.M., Yu K.J., Mbulaiteye S.M. et al. The extent of genetic diversity of Epstein-Barr virus and its geographic

and disease patterns: a need for reappraisal.

Virus Res 2009;143(2):209–21.

4. Yu M.C., Yuan J.M. Epidemiology of nasopharyngeal carcinoma. Semin Cancer Biol 2002;12(6):421–9.

5. Licitra L., Bernier J., Cvitkovic E. et al.

Cancer of the nasopharynx. Crit Rev Oncol Hematol 2003;45(2):199–213.

6. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Статистика злокачественных новообразова-

ний в России и странах СНГ. Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН 2008;19(2 прил. 1). [Davydov M.I., Axel E.M. Statistics of malignant neoplasms in Russia and CIS Countries. Vestnik RONC im. N.N. Blokhina RAMN = Herald of the N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center with the RAMS 2008;19(2 Suppl 1).

(In Russ.)].

2015

ВЭБ в плазме (сыворотке) больных РНГ, у которых регистрировали рецидив опухоли.

61

2,

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

2015

7. Barnes L., Eveson J.W., Reichart P., Sidransky D. Pathology and genetics of head and neck tumors. Lyon: IARC Press, 2005.

8. Luo S., Zhao L., Wang J. et al. Clinical outcomes for early-stage nasopharyngeal carcinoma with predominantly WHO II histology treated by intensity-modulated radiation therapy with or without chemotherapy in nonendemic region of China.

Head Neck 2014;36(6):841–7.

9. Brennan B. Nasopharyngeal carcinoma.

Orphanet J Rare Dis 2006;1:23.

10. Cho W.C. Nasopharyngeal carcinoma: molecular biomarker discovery and progress.

Mol Cancer 2007;6:1.

11. Hubert A., De-The G. Dietary behavior, way of life, and nasopharyngeal cancer. Bull Cancer 1982;69(5):476–82.

12. Li J., Qian C.N., Zeng Y.X. Regulatory T cells and EBV associated malignancies. Int Immunopharmacol 2009;9(5):590–2.

13. Li X., Fasano R., Wang E. et al. HLA associations with nasopharyngeal carcinoma.

Curr Mol Med 2009;9(6):751–65.

14. Yeung W.M., Zong Y.S., Chiu C.T. et al.

Epstein-Barr virus carriage by nasopharyngeal carcinoma in situ. Int J Cancer 1993;53(5):746–50.

15. Gurtsevitch V., Ruiz R., Stepina V. et al.

Epstein-Barr viral serology in nasopharyngeal carcinoma patients in the USSR and Cuba, and its value for differential diagnosis of the disease. Int J Cancer 1986;37(3): 375–81.

16. Pearson G.R. Epstein-Barr virus and nasopharyngeal carcinoma. J Cell Biochem Suppl 1993;17F:150–4.

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2,

62

17. Ho H.C., Ng M.H., Kwan H.C. Factors affecting serum IgA antibody to Epstein-Barr viral capsid antigens in nasopharyngeal carcinoma. Br J Cancer 1978;37(3):356–62.

18. Song C., Yang S. A meta-analysis on the EBV DNA and VCA-IgA in diagnosis of nasopharyngeal carcinoma. Pak J Med Sci 2013;29(3):885–90.

19. Lichtenstein A.V., Melkonyan H.S., Tomei L.D., Umansky S.R. Circulating nucleic acids and apoptosis. Ann NY Acad Sci 2001;945:239–49.

20. Sidransky D. Emerging molecular markers of cancer. Nat Rev Cancer 2002;2(3):210–9.

21. Skvortsova T.E., Rykova E.Y., Tamkovich S.N. et al. Cell-free and cell-bound circulating DNA in breast tumours: DNA quantification and analysis of tumour-related gene methylation. Br J Cancer 2006;94(10):1492–5.

22. Lo Y.M., Chan L.Y., Chan A.T. et al.

Quantitative and temporal correlation between circulating cell-free Epstein-Barr virus DNA and tumor recurrence in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Res 1999;59(21): 5452–5.

23. Hou X., Zhao C., Guo Y. et al. Different Clinical significance of pre- and posttreatment plasma Epstein-Barr virus DNA load in nasopharyngeal carcinoma treated with radiotherapy. Clin Oncol (R Coll Radiol) 2011; 23(2):128–33.

24. Wang W.Y., Twu C.W., Chen H.H. et al.

Plasma EBV DNA clearance rate as a novel prognostic marker for metastatic/recurrent nasopharyngeal carcinoma. Clin Cancer Res 2010;16(3):1016–24.

ТОМ 2 25. Kondratova V.N., Botezatu I.V., Shelepov V.P., Lichtenstein A.V. Tube gel isotachophoresis: a method for quantitative isolation of nucleic acids from diluted solutions. Anal Biochem 2011;408(2):304–8.

26. Lawrence J.B., Villnave C.A., Singer R.H. Sensitive, high-resolution chromatin and chromosome mapping in situ: presence and orientation of two closely integrated copies of EBV in a lymphoma line. Cell 1988;52(1): 51–61.

27. Botezatu I.V., Kondratova V.N., Shelepov V.P., Lichtenstein A.V. DNA melting analysis: application of the "open tube" format for detection of mutant KRAS. Anal Biochem 2011;419(2):302–8.

28. Гурцевич В.Э., Степина В.Н., Сенюта Н.Б. и др. Гуморальный иммунный ответ к вирусу Эпштейна–Барр в диагностике рака носоглотки (обзор литературы и 30-летний опыт собственных исследований). Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН 2011;22(2):20–30. [Gurtsevich V.E., Stepina V.N., Senyuta N.B. et al. Humoral immune response to Epstein–Barr virus in diagnostics of nasopharyngeal carcinoma (review of references and 30-year experience of own studies). Vestnik RONC im. N.N. Blokhina RAMN = Herald of the N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center with the RAMS 2011;22(2): 20–30. (In Russ.)].

29. Leung S.F., Chan K.C., Ma B.B. et al.

Plasma Epstein-Barr viral DNA load at midpoint of radiotherapy course predicts outcome in advanced-stage nasopharyngeal carcinoma. Ann Oncol 2014; 25(6):1204–8.

А. А. Лушникова, А. В. Балбуцкий, Д. А. Понкратова, Т. П. Казубская ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина»; Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24 Контакты: Анна Александровна Лушникова LAN21@yandex.ru Лептин – многофункциональный гормон с активностью цитокинов, который регулирует важнейшие сигнальные пути и может индуцировать клеточную пролиферацию, инвазию, ангиогенез и опухолевый рост. Лептин играет важную роль в регуляции метаболизма, энергетического обмена и функций нейроэндокринной системы, включая гипофиз, гипоталамус и надпочечники, а также в функционировании иммунной системы. В последнее время появились данные о роли лептина в индукции хронических воспалительных процессов, аутоиммунных патологий, диабета 2-го типа и рака. Повышенный уровень гормона в крови рассматривается как фактор риска различных новообразований. Цель исследования – анализ уровня экспрессии гормона лептина (Lep), длинной и короткой изоформ его рецептора (LepR1 и LepR2) в крови, опухолевых клетках и нормальных фибробластах кожи у больных метастатической меланомой кожи (МК) с различными клинико-патологическими характеристиками для прогностической оценки. Материалы и методы. Исследовано 15 больных метастатической МК (10 женщин и 5 мужчин, в возрасте 22–67 лет с различными индексами массы тела (ИМТ): от нормы до ожирения). Экспрессию Lep / LepR в сыворотке крови, опухоли и нормальных фибробластах кожи и донорской крови определяли с помощью иммуноферментного анализа (ELISA) и метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией на матрице тотальной РНК, выделенной из пар образцов опухолевой и нормальной ткани. Результаты. В среднем содержание лептина в крови больных МК и в опухолевых клетках превышает эти показатели в норме, а его концентрация у женщин с МК была выше, чем у мужчин. Уровень экспрессии гена Lep, а также LepR1 (но не LepR2) в опухолевых клетках оказался сравнительно выше, чем в нормальных фибробластах кожи этих же пациентов, и выше уровня экспрессии гена GAPDH в клетках. У больных с избыточной массой тела (ИМТ = 25,00–29,99 кг/м2) отмечена тенденция к повышению концентрации лептина в крови, причем у женщин с МК этот показатель превышал уровень лептина в сыворотке крови больных мужчин. Подтверждена ранее обнаруженная нами взаимосвязь между концентрацией лептина в крови и уровнем экспрессии длинной изоформы его рецептора в опухолевых клетках. Ключевые слова: метастатическая меланома кожи, лептин, рецептор лептина, экспрессия, сигнальная трансдукция, канцерогенез

DOI: 10.17 650 / 2313-805X. 2015.2.2.63–67 The features of leptin and its receptor expression in metastatic cutaneous melanoma A. A. Lushnikova, A. V. Balbutsky, D. A. Ponkratova, T. P. Kazubskaya N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center; 24 Kashirskoye Shosse, Moscow, 115478, Russia Leptin is a multifunctional hormone with the activity of cytokines, which regulates critical signaling pathways that can induce cell proliferation, invasion, angiogenesis and tumor growth. Leptin plays an important role in the regulation of metabolism, energy exchange, functions of the neuro-endocrine system, including the pituitary, hypothalamus, adrenals, and immune system functions. Recently, some evidences have been appeared concerning the role of leptin in induction of chronic inflammatory processes, autoimmune pathologies, type 2 diabetes and cancer.

An elevated blood level of the hormone is considered as a risk factor for different neoplasm development Objective. Analysis of the hormone leptin (Lep), the long and short isoforms of its receptor (LepR1 and LepR2) expression in blood, tumor cells and normal skin fibroblasts in the patients with metastatic cutaneous melanoma (CM) with various clinico-pathological characteristics for prognostic assessment.

Materials and methods. 15 patients with metastatic CM (10 women and 5 men, aged 22 to 67 years with body mass from normal to obese) have been studied. The expression of Lep/LepR in the patient and donor blood sera, tumor and normal skin fibroblasts were determined using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and RT PCR using total RNAs isolated from pairs of tumor samples and normal tissue.

Results. Average level of leptin in the blood of CM patients and in tumor cells exceeds the normal one. Concentration of lepin in female CM patients was higher than in male patients. The expression level of Lep and LepR1 genes (but not LepR2) in tumor cells was relatively higher than in normal skin fibroblasts of these patients, and above the level of GAPDH gene expression. In the female patients with overweight (body mass index = 25,00–29,99 kg/m2) there was a trend to higher concentrations of leptin in the blood in comparison of the patients with normal body mass and leptin level in the sera of male CM patients. Earlier revealed relationship between the concentration of leptin in blood and the level of expression of the long isoform of its receptor in tumor cells is confirmed.

Key words: metastatic cutaneous melanoma, leptin, leptin receptor, expression, signal transduction, carcinogenesis

2015

Особенности экспрессии лептина и его рецептора при метастатической меланоме кожи

63

2,

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

2015

Введение Меланома кожи (МК) относится к наиболее агрессивным опухолям с высокой вероятностью метастазирования. Около 75 % первичных МК распространяются в регионарные лимфатические узлы (ЛУ), при этом 10-летняя выживаемость пациентов падает с 70–80 % (нераспространенная МК I–II стадий) до 8–10 % (III стадия). Метастатическая МК представлена гетерогенной группой быстро прогрессирующих опухолей с плохим прогнозом. Сравнение на кДНК-микрочипах профилей экспрессии 96 воспалительных цитокинов в 13 непораженных, 10 метастатических сигнальных ЛУ с микрометастазами < 2 мм и в 11 негативных ЛУ выявило в позитивных сигнальных узлах повышенный уровень экспрессии интерлейкина-13 (IL-13), лептина и его рецептора, LTbR и M1P1b. Эти и другие данные указывают на ключевую роль микроокружения метастатических ЛУ в прогрессии ранней МК. Кроме того, сами клетки первичной и метастатической меланомы продуцируют цитокины и хемокины, которые регулируют клеточную пролиферацию, ангиогенез, лимфангиогенез, усиливая злокачественность опухоли [1]. Гормон лептин, кодируемый геном Lep (Ob), в основном секретируется в клетках гипоталамуса, адипоцитах белой и бурой жировой ткани, а также клетках скелетных мышц, желудка и плаценты. Он регулирует тонус симпатической нервной системы, функции щитовидной железы, иммунный ответ, синтез половых гормонов и гормонов роста, массу тела путем модуляции чувства голода или насыщения и ряд других процессов в организме. Лептин участвует в поддержании энергетического баланса и метаболизма, в частности играет важную роль в развитии ожирения и диабета 2-го типа – независимых факторов риска развития опухолей. Недавно выяснилось, что лептин может стимулировать опухолевый рост и метастазирование рака поджелудочной железы, усиливая экспрессию матричной металлопротеиназы-13 (ММР-13) c последующей активацией важнейших сигнальных путей, включая JAK2 / STAT3, MAPK / ERK и PI3K / AKT. Установлено, что высокий уровень экспрессии рецептора лептина LepR (Ob-Rb) на мембране опухолевых клеток при раке поджелудочной железы коррелирует с инвазивным ростом и метастазированием этих опухолей [2]. В клетках рака эндометрия также наблюдалась индуцированная лептином гиперактивация указанных сигнальных каскадов и циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2) [3]. Сходные механизмы индукции гормонозависимого опухолевого роста (рис. 1) показаны при раке молочной железы (РМЖ), простаты, глиобластоме, раке легкого, плоскоклеточном раке пищевода и при некоторых других неоплазиях [4, 5]. Как показывают эпидемиологические исследования и метаанализ факторов риска развития рака, включая МК, существенный вклад в канцерогенез вносят

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2,

64

ТОМ 2 Lep LepR

JAK-STAT

MAPK

PI3K

Пролиферация клеток Миграция клеток АНТИАПОПТОЗ Рис. 1. Высокий уровень лептина, который взаимодействует с соответствующим клеточным рецептором, приводит к активации ключевых сигнальных путей, регулирующих пролиферацию и миграцию клеток. Lep – молекула лептина, LepR – длинная изоформа лептинового рецептора LepR1

ожирение и диабет 2-го типа. В частности, выявлена корреляция между избыточной массой тела (индекс массы тела (ИМТ) > 25–30 кг / м2) и возникновением колоректального рака, РМЖ и / или рака яичников в постменопаузе, рака почек, простаты и меланомы. На мышиных моделях удалось обнаружить, что секреция адипоцитами воспалительных цитокинов рекрутирует макрофаги, которые продуцируют макрофагальный маннозный рецептор, стимулируя ангиогенез и нарушая структуру внеклеточного матрикса. Сходство процессов ангиогенеза при ожирении и раке подтверждает роль лептина в индукции опухолевого роста и в появлении воспалительного инфильтрата [6, 7]. Одной из предпосылок возникновения меланомы при нарушениях липидного обмена ряд авторов считает аберрантные процессы меланогенеза и репарации ДНК в меланоцитах, связанные с резистентностью к лептину, несмотря на высокий уровень этого гормона в сыворотке крови, и гиперэкспрессию в клетках длинной изоформы LepR – основной из 6 изоформ этого рецептора [8]. Оказалось, что инкубация клеток меланомы в среде после культивирования в ней адипоцитов повышает уровень клеточной пролиферации и резистентность меланомы к ДНК-повреждающему препарату цисплатину, а также к доцетакселу и к ингибитору гистоновой деацетилазы SAHA посредством активации сигнальных каскадов PI3K / AKT и MEK / ERK, ослабляющих действие ингибиторов PI3K или MEK. Ингибирование взаимодействия Lep–LepR, избирательно активированного в клетках меланомы, может повысить терапевтическое действие препаратов, нацеленных на перечисленные сигнальные пути [9]. Иммуноферментный анализ (ИФА) (ELISA) образцов сыворотки, полученных от 71 пациента со злокачественной меланомой, выявил повышенную

Материалы и методы Исследовали выборку из 15 больных (5 мужчин и 10 женщин) метастатической МК с уровнем инвазии от II до IV, средний возраст 55,3 ± 17,4 года (22– 67 лет). Первичная опухоль локализовалась на голени (n = 3), бедре (n = 5), в височной (n = 1) и ягодичной (n = 1) областях, на плече (n = 1), в брюшной стенке (n = 2) и на спине (n = 2). У всех пациентов выявлены множественные метастазы в регионарных ЛУ (подмышечных и паховых), а также в печени (n = 2), легких (n = 1), молочной железе (n = 1) и в подкожной жировой клетчатке мягких тканей спины (n = 3). В 6 из 15 случаев отмечено изъязвление опухоли, а в 5 из 15 – воспалительный лимфоцитарный инфильтрат. Образцы периферической крови и сыворотки были получены при сдаче клинических анализов натощак. ИМТ пациентов определяли по формуле Кетле–Брока: I = m / h2, где m – масса тела, кг; h – рост, м. Согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения, нормальная масса тела соответствует индексу 18,50–24,99. В исследуемой выборке у 7 из 15 пациентов была избыточная масса тела (ИМТ = 25,00– 29,99 кг/м2), у 2 пациенток – ожирение I степени (ИМТ = 30,00–34,99 кг/м2), у 6 – масса тела в пределах нормы. Для контроля использовали образцы крови, полученной от 10 доноров без онкологической отягощенности. Тотальную РНК выделяли с помощью набора NucleoSpin RNAII kit (Macherеy–Nagel Gmb, Германия) из свежего биопсийного материала в присутствии ингибитора РНКазы с последующей патологоанатомиче-

ской верификацией гистологических срезов. Для полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) на матрице опухолевых РНК использовали пары праймеров, подобранные к последовательностям генов Lер, LерR1 (длинная изоформа), LерR2 (короткая изоформа). Для контроля качества РНК и ОТ-ПЦР использовали праймеры к гену GAPDH, для положительного контроля – 18S РНК (табл. 1). В ОТ-ПЦР использовали по 20 мкг тотальной свежевыделенной РНК, 5 мкл препарата инкубировали с 50 нг рэндом-праймера (RT-PCR kit, Silex, Москва) 2 мин при 90 °С (отжиг) в 10 мМ HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин- N’-2-этансульфоновая кислота), рН 7,0, 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты в объеме 10 мкл, затем охлаждали во льду и добавляли MMLV-RT-полимеразу (Silex) 20 Ед, инкубируя 90 мин в объеме 20 мкл при 37 °С. ПЦР с указанными праймерами проводили в режиме 25 циклов: 30 с при 94 °С, 45 с при 56 °С, 30 с при 72 °С с терминацией 5 мин при 72 °С, используя амплификатор Терцик (ДНК-технология, Россия). Результаты анализировали в 2 % агарозном геле. Уровень лептина в сыворотках (нг / мл) в лизатах опухоли и нормальных фибробластах (попарно у 5 пациентов) определяли путем ИФА с набором реагентов и коммерческих моноклональных антител по инструкции производителя (ELISA, DRG Diagnostics, США) с последующей регистрацией интенсивности окрашивания на оптическом ридере. Результаты и обсуждение Лептин – многофункциональный гормон с активностью цитокинов, который регулирует важнейшие сигнальные пути и может индуцировать клеточную пролиферацию, инвазию, ангиогенез и опухолевый рост. Повышенный уровень гормона в крови служит фактором риска РМЖ и, возможно, других гормоночувствительных опухолей [11]. Как показывает анализ предварительных данных, средний уровень гормона в крови и в лизатах меланомы у больных МК женщин оказался выше, чем у мужчин. Такое же соотношение наблюдалось в нормальных клетках кожи и донорской крови (табл. 2). В среднем содержание лептина в кро-

Таблица 1. Список использованных для ОТ-ПЦР праймеров и длина соответствующих ампликонов Ген

Последовательность праймеров

Длина ампликонов

Lер

Pr1: 5’–ACCCTGTGCGGATTCTTGTGG–3’ Pr2: 5’–CTCTGTGGAGTAGCCTGAAGC–3’

415 п. н.

LерR1

Pr1: 5’–TGTTGTGAATGTCTTGTGCC–3’ Pr2: 5’–TGCTCCAGTCACTCCAGATTCC–3’

395 п. н.

LерR2

Pr1: 5’–ATAGTTCAGTCACCAAGTGC–3’ Pr2: 5’–GTCCTGGAGAACTCTGATGTCC–3’

340 п. н.

GAPDH

Pr1: 5’–TGAAGGTCGGAGTCAACGG–3’ Pr2: 5’–TGGAAGATGGTGATGGGAT

223 п. н.

2015

секрецию Lep / LepR на ранних стадиях развития опухоли и постепенное ее снижение к IV стадии. Таким образом, аномально экспрессируемый в клетках меланомы лептин и / или его рецептор может рассматриваться как один из предикторов и возможных опухолевых маркеров [10]. Мы впервые проанализировали особенности экспрессии Lep / LepR у российских больных МК с различными клинико-патологическими характеристиками для предварительной оценки их прогностического значения.

65

2,

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

2015

ви больных МК и опухолевых клетках превышает эти показатели в норме. Индивидуальные различия по уровню экспрессии генов Lep / LepR в опухолевых клетках сравнительно невелики, но существенно отличаются от уровня их экспрессии в нормальных клетках. Однако содержание гормона в крови и опухолевых клетках пациентов с МК варьировало более широко (см. табл. 2). Уровень лептина, по-видимому, зависит также от стадии опухолевого процесса. Отмечается тенденция к увеличению уровня лептина в МК с множественными метастазами в отдаленные очаги и в опухолях без изъязвления поверхности (некроза). У 2 пациентов с избыточной массой тела (ИМТ = 25,00–29,99) отмечена тенденция к повышению концентрации лептина в крови, что согласуется с данными, полученными другими авторами [6, 11]. Повышение уровня этого адипокина при ожирении играет важную роль в модуляции клеточного фенотипа при РМЖ вследствие перекреста лептинзависимых сигнальных путей в клетке, включая активацию STAT3 и Hsp90. Оказалось, что у женщин с повышенной массой тела или ожирением в момент постановки диагноза РМЖ общая смертность от заболевания и повторных рецидивов достигает 54 % [12]. По-видимому, этот механизм, включающий гиперэкспрессию лептина с последующией активацией специфичных сигнальных молекул, реализуется и при прогрессии МК. Вторая заслуживающая внимания особенность обнаружена нами в результате анализа данных ОТ-ПЦР на матрице опухолевой РНК и РНК, параллельно выделенной из нормальной ткани (фибробластов кожи) 5 пациентов. Уровень экспрессии гена Lep, а также LepR1 (но не LepR2) в опухолевых клетках оказался сравнительно выше, чем в нормальных фибробластах кожи этих же пациентов, и выше уровня экспрессии гена GAPDH (рис. 2). В молекуле лептина 146 аминокислот, кодируемых уникальным геном, содержащим 167 кодонов. Однако лептиновый рецептор представлен не менее чем 6 изоформами, которые образуются в результате альтернативного сплайсинга транскрипта гена LepR / Ob-R. Так называемая длинная изоформа LepR1 содержит протяженный цитоплазматический домен, необходимый для эффективной сигнальной

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2,

66

Таблица 2. Концентрации лептина у больных МК и в контрольных образцах

Средняя концентрация лептина в крови / в лизате опухоли больных МК (n = 15), нг / мл (p < 0,05)

Средняя концентрация лептина в нормальных фибробластах (n = 5) / в донорской крови (n = 10), нг / мл (p < 0,05)

Женщины

29,2 ± 3,4 / 33,3 ± 4,6

11,9 ± 3,6 / 8,5 ± 1,8

Мужчины

9,5 ± 1,3 / 11,8 ± 3,1

3,6 ± 0,3 / 2,2 ± 0,8

Группа

ТОМ 2 1

2

3

4

5

1

2

3

4

5

LepR1 Lep GAPDH Т

N

Рис. 2. Результаты ОТ-ПЦР с праймерами к генам Lep, LepR1 и GAPDH в опухолевых (Т) и нормальных клетках кожи (N) у 5 больных МК (цифры 1–5 вверху)

трансдукции. В молекулах других изоформ функционально важные домены укорочены и частично утрачивают свою активность. Действительно, результаты ОТ-ПЦР не выявили существенного уровня экспрессии короткой изоформы LepR2 ни в опухолях, ни в нормальных клетках. Однако укороченные изоформы рецептора, включая LepR2, могут служить транспортерами молекул лептина через гематоэнцефалический барьер. Таким образом, подтверждается ранее обнаруженная нами взаимосвязь между концентрацией лептина в крови и уровнем экспрессии длинной изоформы его рецептора в опухолевых клетках [11]. В последнее время предложено несколько подходов, направленных на подавление взаимодействия молекул лептина с длинной изоформой его рецептора, которое приводит к драматической активации сигнальных каскадов и неконтролируемой клеточной пролиферации. В молекуле лептина идентифицировано 3 сайта связывания, которые отвечают за формирование активного комплекса Lep –LepR, в частности, аминокислотная последовательность Leu-Asp-Phe-Ileсайт LDFI. В модельных экспериментах in vitro (культуры клеток РМЖ) и in vivo (ксенографты РМЖ) с использованием низкомолекулярного пептида, несущего сайт LDFI, удалось снизить уровень активации лептинзависимых сигнальных каскадов JAK2 / STAT3 / MAPK / ERK / АKT, а также пролиферативную активность клеток и их миграцию. Этот и подобные ему антагонисты лептина и / или блокаторы лептинового рецептора, например нейтрализующие антитела, представляют интерес для молекулярно-нацеленной терапии опухолей [13, 14]. Другой терапевтический подход предусматривает снижение уровня синтазы жирных кислот (FASN), адипокинов лептина и резистина, активирующих протеиназу AКТ и модулирующих активности FASN / Cav-1, а также гормональный контроль за массой тела [15]. Еще один экспериментальный подход – подавление окислительного фосфорилирования и биогенеза митохондрий в опухолевых клетках, т. е. контроль энергетического обмена и метаболизма. Он основан на результатах опытов с культурой клеток РМЖ линии MCF-7. При добавлении в культуральную среду лептина (50 нг / мл) значительно повышался уровень про-

ланомы. Аутокринная регуляция лептином синтеза NO (оксида азота), защищающего клетки меланомы от апоптоза на продвинутых стадиях заболевания, – еще один пример многофункциональности этого гормона, подтверждающий предположение о нейрогормональной природе меланом [18]. Дальнейший анализ большего количества клинически охарактеризованных образцов МК позволит точнее оценить эти параметры, а также значение экспрессии лептина и его рецептора в прогрессии МК. Заключение Многофункциональный гормон лептин представляет большой интерес в качестве регулятора ключевых сигнальных путей, активация которых стимулирует пролиферацию, инвазию и миграцию опухолевых клеток. Лептин и / или его рецептор могут быть потенциальными мишенями для таргетной терапии меланомы. ИФА экспрессии Lер / LерR и ОТ-ПЦР выявил повышенный уровень лептина и его рецептора в опухолях пациентов с МК и в соответствующих сыворотках крови по сравнению с нормой, что указывает на возможную ассоциацию экспрессии Lер / LерR с развитием меланомы, особенно на ранних стадиях канцерогенеза.

Л И Т Е Р А Т У Р А 1. Torisu-Itakura H., Lee J.H., Scheri R.P. et al. Molecular characterization of inflammatory genes in sentinel and nonsentinel nodes in melanoma.

Clin Cancer Res 2007;13(11):3125–32.

2. Fan Y., Gan Y., Shen Y. еt al. Leptin signaling enchances cell invasion and promotes the metastasis of human pancreatic cancer via increasing MMP-13 production.

Oncotarget 2015;PMID 25948792.

3. Gao J., Tian J., Lv Y. et al. Leptin induces functional activation of through JAK2/ STAT3, MAPK/ERK and PI3K/AKT pathways in human endometrial cancer cells.

Cancer Sci 2009;100(3):389–95.

4. Cirillo D., Rachiglio A.M., Montagna R. et al. Leptin signaling in breast cancer. An overview. J Cell Biochem 2008;105(4):956–64.

5. Lawrence J.E., Cook N.J., Rovin R.A., Winn R.J. Leptin promotes glioblastoma.

Review Neurol Res Int 2012;2012:870807.

6. Gogas H., Trakatelli M., Dessypris N. et al. Melanoma risk in assoсiation with serum leptin levels and lifestyle parameters: a case-control study. Ann Oncol 2008;19(2):384–9.

7. Brandon E.L., Gu J.-W., Cantwell L. et al.

Obesity promotes melanoma tumor growth: role of leptin. Cancer Biol Ther 2009;8(19):1871–9.

8. Morpurgo G., Fioretti B., Catacuzzeno I. The increased incidence of malignant melanoma in obese individuals is due to impaired melanogenesis and melanocyte DNA repair. Med Hypothesis 2012;78(4):533–5.

9. Chi M., Chen J., Ye Y. et al. Adipocytes contribute to resistance of human melanoma cells to chemotherapy and targeted therapy.

Curr Med Chem 2014;21(10):1255–67.

10. Mizutani H., Fukushima S., Masuguchi S. et al. Serum levels of leptin receptor in patients with malignant melanoma as a new tumor marker. Exp Dermatol 2013;22(11):748–9.

11. Передереева Е.В., Лушникова А.А., Фрыкин А.Д., Пароконная А.А. Гормон лептин и проблемы репродукции. Злокачественные опухоли 2012;(1):35–9.

[Peredereeva Е.V., Lushnikova А.А., Frykin А.D., Parokonnaya А.А. Hormone leptin and reproduction problems.

Zlokachestvennye opukholi = Malignant Tumors 2012;(1):35–9.

(In Russ.)].

12. Giordano C., Vizza D., Panza S. et al.

Leptin increases HER2 protein levels through a STAT3-mediated up-regulation of Hsp 90 in breast cancer cells. Mol Oncol 2013;7(3):379–91.

13. Catalano S., Leggio A., Barone I. et al.

A novel leptin antagonist peptide inhibits breast cancer growth in vitro and in vivo.

J Cancer Мol Мed 2015;19(5): 1122–32.

14. McMurphy T., Xiao R., Magee D. et al.

The anti-tumor activity of neutralizing nanobody targeting leptin receptor in a mouse model for melanoma. PLoS One 2014;9(2):e89895.

15. Malvi P., Chaube B., Pandey V. еt al.

Obesity induced rapid melanoma progression is reversed by oristat treatment and dietary intervention: role of adipokines. Mol Oncol 2015;9(3):689–703.

16. Blanquer-Rossello M.D., Santandreu F.M., Oliver J. et al. Leptin modulates mitochondrial function, dynamics and biogenesis in MCF-7 cells. J Cell Biochem 2015;doi 10.1002/jcb.25158.

17. Nepal S., Kim M.J., Hong J.T. et al.

Autophagy induction by leptin contributes to suppression of apoptosis in cancer cells and xenograft model: involvement of p53/ FoxO3A axis. Oncotarget 2015;6(9): 7166–81.

18. Еllerhorst J.A., Diwan A.H., Ulfort S.M. Promotion of melanoma growth by the metabolic hormone leptin. Oncol Rep 2010:23(4):901–7.

2015

лиферации, количество и функциональность митохондрий, устойчивость клеток к оксидативному стрессу, а следовательно, их выживаемость [16]. Другой механизм индукции опухолевого роста лептином связан с аутофагией и повышением экспрессии вовлеченных в этот процесс генов Atg5, LC3 II и др. Лептин активирует p53 / FoxO3A-зависимую аутофагию и опосредует ингибирование апоптоза в клетках гепатомы НерG2 и РМЖ MCF-7 [17]. Несмотря на множество экспериментальных данных, остается много неясных вопросов, касающихся роли и механизмов действия Lep / LepR. Сложность проблемы объясняется плюрипотентностью лептина, регулирующего в организме энергетический баланс, метаболизм, синтез половых гормонов и гормонов роста, функции щитовидной железы, иммунный ответ, воспалительные и другие процессы. Лептин рассматривается как провоспалительный цитокин с широким спектром действия на процесс опухолевого роста и метастазирования по аутокринному или эндокринному пути. Например, один из регуляторных механизмов связан с индукцией секреции опухолью тиреотропного и тиреотропинвысвобождающего гормонов, активирующих МАРК-киназный каскад в клетках ме-

67

2,

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

ТОМ 2

Информация для авторов Уважаемые коллеги! При оформлении статей, направляемых в журнал «Успехи молекулярной онкологии», следует руководствоваться обновленными правилами: 1. Статья должна быть представлена в электронном виде (в отдельных файлах: текст статьи со списком литературы, таблицы, графики, рисунки, подписи к рисункам, резюме) на адрес: adv.mol.onc@ronc.ru. Шрифт – Times New Roman, 14 пунктов, через 1,5 интервала. Все страницы должны быть пронумерованы.

2. На первой странице должно быть указано: название статьи, инициалы и фамилии всех авторов, полное название учреждения (учреждений), в котором (которых) выполнена работа, его (их) полный адрес с указанием индекса. Обязательно указывается, в каком учреждении работает каждый из авторов. В конце статьи должны быть обязательно приведены контактные телефоны, рабочий адрес с указанием индекса, адрес электронной почты и фамилия, имя, отчество полностью, занимаемая должность, ученая степень, ученое звание автора (авторов), с которым редакция будет вести переписку.

3. Объем статей: оригинальная статья – не более 12 страниц; миниобзоры – не более 5 страниц; обзор литературы – не более 30 страниц; краткие сообщения и письма в редакцию – 3 страницы. Структура оригинальной статьи: введение, материалы и методы, результаты исследования и их обсуждение, заключение (выводы). К статьям должно быть приложено резюме на русском и английском языках, отражающее содержание работы, с названием статьи, фамилиями и инициалами авторов, названием учреждений; для оригинальных статей – структурированное резюме (введение, материалы и методы, результаты и т. д.). Объем резюме – 1500–5000 знаков с пробелами. Количество ключевых слов должно составлять от 10 до 50.

4. Иллюстративный материал: • Фотографии должны быть контрастными; рисунки, графики и диаграммы – четкими.

• Фотографии представляются в электронном виде в формате TIFF, JPG, CMYK с разрешением не менее 300 dpi (точек на дюйм).

• Графики, схемы и рисунки должны быть представлены в формате MS PowerPoint.

• Все рисунки должны быть пронумерованы. Подписи к рисункам даются на отдельном листе. Фрагменты рисунка обозначаются строчными буквами русского алфавита – «а», «б» и т. д. Все сокращения и обозначения, использованные на рисунке, должны быть расшифрованы в подписи к рисунку.

• Все таблицы должны быть пронумерованы, иметь название. Все сокращения расшифровываются в примечании к таблице.

• Ссылки на таблицы, рисунки и другие иллюстративные материалы приводятся в надлежащих местах по тексту статьи в круглых скобках.

5. Единицы измерений даются в СИ.

• Все сокращения (аббревиатуры) в тексте статьи должны быть полностью расшифрованы при первом употреблении. Использование не общепринятых сокращений не допускается.

• Название генов пишется курсивом, название белков – обычным шрифтом.

6. К статье должен быть приложен список цитируемой литературы, оформленный следующим образом: • Список ссылок приводится в порядке цитирования. Все источники должны быть пронумерованы, а их нумерация – строго соответствовать нумерации в тексте статьи. Ссылки на неопубликованные работы не допускаются.

• Для каждого источника необходимо указать: фамилии и инициалы авторов (если авторов более 4, указываются первые 3 автора, затем ставится «и др.» в русском или «et al.» – в английском тексте).

• При ссылке на статьи из журналов указывают также название статьи, название журнала, год, том, номер выпуска, страницы. Например: Ornitz D.M., Xu J., Colvin J.S. et al. Receptor specificity of the fibroblast growth factor family. J Biol Chem 1996;271(25):15292–7.

• При ссылке на монографии указывают также полное название книги, место издания, название издательства, год издания. Например: Joёl С.А. Fertility disturbances in men and women: a textbook with special reference to etiology, diagnosis and treatment. Basel: Karger, 1971.

• При ссылке на данные, полученные из Интернета, указывают электронный адрес цитируемого источника. Например: Федякин М.Ю., Хмелькова Д.Н., Серебрийския Т.С. и др. Рецепторы фактора роста фибробластов при злокачественных опухолях. Злокачественные опухоли 2014;(4). URL: http://www.malignanttumours.org/. [Fedyanin M.Yu., Khmelkova D.N., Serebriyskaya T.S. et al. Receptors of fibroblast growth factor at malignant tumours. Zlokachestvennye opukholi = Malignant Tumours 2014;(4).

URL: http://www.malignanttumours.org/. (In Russ.)].

• Все ссылки на литературные источники печатаются арабскими цифрами в квадратных скобках (например, [5]).

• Количество цитируемых работ: в оригинальных статьях желательно не более 30 источников, в обзорах литературы – не более 100.

7. Представление в редакцию ранее опубликованных статей не допускается.

8. Все статьи, в том числе подготовленные аспирантами и соискателями ученой степени кандидата наук по результатам собственных исследований, принимаются к печати в ускоренном виде. Статьи, не соответствующие данным требованиям, к рассмотрению не принимаются. Все поступающие статьи рецензируются. Присланные материалы обратно не возвращаются. Редакция оставляет за собой право на редактирование статей, представленных к публикации.

GE Healthcare Life Sciences

Издательский дом «АБВ-пресс» специализируется на выпуске периодической научной медицинской литературы, книгопечатной продукции, создании и поддержке сайтов медицинского направления

Amersham™ WB

НАШИ ЖУРНАЛЫ и ГАЗЕТЫ

Автоматизированный SDS-форез и Вестерн-блоттинг Электрофорез & Сканирование

Вестерн-блоттинг

ഩˁ̛̭̯̖̥̌ Amersham WB – ̨̨̪̣̦̭̯̽̀ ̨̛̛̦̯̖̬̬̦̐̏̌​̦̌́ ̛̭̭̯̖̥̌ ̣̔́ SDS-̴̨̬̖̌̚ ̛ ̖̭̯̖̬̦̏ ̨̣̯̍​̛̯̦̐̌, ̨̨̭̦̦̏̌​̦̌́ ̦̌ ̴̶̨̨̣̱̬̖̭̖̦̯̦̜ ̶̡̛̖̯̖̔​̛ ISSN 1111-2222

ഩʿ̨̬̬̥̐̌​̨̥̦̖ ̸̨̛̖̭̪̖̖̦̖̍ Amersham WB ̸̨̛̖̭̪̖̖̯̍̏̌ ̡̨̨̦̯̬̣̽ ̌̚ ̡̙̼̥̌̔ ̨̯̪̥̾̌ ̶̨̪̬̖̭​̭̌, ̨̨̛̛̯̥̯̬̦̌̏̌̏̌̚​̦̼̜ ̸̡̨̛̣̖̭̯̖̦̏​̦̼̜ ̛̦̣̌̌̚ ̦̔̌​̵̦̼

The Russian oncologist

Рецензируемый научно-практический журнал The Peer-Reviewed Journal for Russian Practicing Oncologists & Researchers

В номере:

Мониторинг каждого этапа

• История, современность, перспективы развития онкологии Московского региона

• Первичная множественность опухолей (синдром Мюир-Торре) в онкологической практике

Новый хирургический корпус Московского областного онкологического диспансера (срок сдачи в эксплуатацию – декабрь 2015)

НАШИ КНИГИ

Книги и наши издания можно заказать и приобрести в редакции по адресу: г. Москва, Каширское ш., 24, стр. 15

ഩʿ̨̖̬̖̦̭: 10-100 ʦ (̡̥̭̌. 400 ̥ʤ, 40 ʦ̯)

Оценка результатов

Amersham WB labeling buffer Amersham WB molecular weight markers Amersham WB loading buffer Amersham WB Cy5 labeling dye

и по телефону:

ഩʧ̶̛̛̛̛̬̍̔̌́̚: ̨̻̖̥̍ ̬-̬̌ ̛̦̯̯̖̣̌ 5-12 ̥̣

+7 (499) 929-96-19.

ഩʦ̛̛̼̭̱̹̦̖̏̌: 10 ̛̥̦, ̡̥̭̌. 45°C

Адрес электронной почты:

ഩʻ̨̬̌̍ ̵̨̨̯̼̐̏ ̨̬̖̖̦̯̌̐̏ ̛ ̵̵̨̬̭̦̼̌̔ ̨̛̥̯̖̬̣̌̌̏ ̣̔́ ̶̛̛̭̯̦̬̯̌̔̌̌̚​̛ ̨̨̡̨̪̬̯̣̌: Amersham WB Cy5 labeling kit, ̸̨̛̯̬̦̼̖̏ ̛̦̯̯̖̣̌̌, ̖̣̐̽- ̛ PVDF-̡̬̯̼̌

abv@abvpress.ru

НАШИ САЙТЫ НАШИ САЙТЫ

ഩʧ̖̣̽-̡̬̯̌̌: ʿʤʤʧ 13.5% ̛ 8–18%; ̡̬̱̌̐̌̚̚ – 14 ̶̨̨̬̍̌̏̚ ̨̨̻̖̥̥̍ 15-30 ̡̥̣ ഩPVDF-̡̬̯̌̌: ̥̖̥̬̦̍̌̌ PVDF ̣̔́ ̨̣̯̍​̛̯̦̐̌ ഩʺ̡̬̖̬̼̌ Amersham WB: 9 ̡̨̖̣̍̏ (10-225 ̡ʪ̌), ̸̥̖̖̦​̵̦̼ Cy3 ̛ Cy5

ООО «ДжиИ Хэлскеа» ʿ̡̬̖̭̦̖̦̭̌́ ̦̌̍, 10 ˁ, ̯̙̾̌ 12 ʺ̨̡̭̏̌, 123317, ˀ̨̭​̛̭́ ˃̖̣. +7 (495) 739-69-31 ˇ̡̭̌ +7 (495) 739-69-32 LSRus@ge.com

www.abvpress.ru

www.oncoproct.ru

www.roou.ru

www.hnonco.ru

www.urotoday.ru

www.neuromuscular.ru

www.breastcancersociety.ru

Москва, 2015

Постановка эксперимента

2015

• Селективная внутриартериальная химиотерапия при метастатическом колоректальном раке

ഩˁ̡̨̛̛̦̬̦̖̌̏̌: ʸ̖̬̦̼̜̌̚ ̨̛̔̔ 635 ̦̥ (Cy5), 10 ̥ʦ ʸ̖̬̦̼̜̌̚ ̨̛̔̔ 532 ̦̥ (Cy3), 10 ̥ʦ ʪ̸̡̛̛̛̦̥̖̭̜̌ ̨̛̪̦̔̌̌̚ – 4,6 ̨̡̨̪̬́̔̏ 65 536 ̨̱̬̦̖̜̏, 16 ̛̯̍ (tif) ʤ̸̨̡̛̯̥̯̖̭̏̌̌́ ̶̡̨̛̛̭̪̾́̚

PVDF-карта

1

oncologist@inbox.ru

К 70 летию онкологической службы России

ഩˑ̴̡̨̨̣̖̯̬̬̖̚: 250-600 ʦ, 20-50 ̥ʤ (̡̥̭̌. 20 ʦ̯ ̦̌ ̖̣̐̽-̡̬̯̱̌)

Гель-карта

РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГ

www.netoncology.ru

Т О М 2

1

•

2 0 1 5

ISSN 2313-805X

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ КАНЦЕРОГЕНЕЗА ФГБНУ «РОНЦ ИМ. Н.Н. БЛОХИНА»

УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ Н А У Ч Н О - П РА К Т И Ч Е С К И Й Е Ж Е К В А Р ТА Л Ь Н Ы Й РЕЦЕНЗИРУЕМЫЙ ЖУРНАЛ

Протеомика в открытии маркеров рака предстательной железы Белки CRABP - родственники или однофамильцы Трабактерии-лиганд узкой бороздки ДНК Межклеточные взаимодействия и развитие резистентности клеток рака молочной железы

У С П Е Х И

М О Л Е К У Л Я Р Н О Й

О Н К О Л О Г И И

Молекулярно-генетические маркеры гастроинтестинальных стромальных опухолей

ТОМ2 № 2 2015