Онкогематология 2012 год № 4 by Maxim Popach

ОНКО Г Е М А ТО Л О Г И Я ISSN 1818-8346

Н А У Ч Н О - П Р А К Т И Ч Е С К И Й

Е Ж Е К В А Р Т А Л Ь Н Ы Й

Р Е Ц Е Н З И Р У Е М Ы Й

Ж У Р Н А Л

Новые направления медицинской науки Хронический миелолейкоз Материалы VIII симпозиума «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний»

2012

Издательский дом «АБВ-пресс» специализируется на выпуске периодической научной медицинской литературы, книгопечатной продукции и создании сайтов медицинского направления НАШИ ЖУРНАЛЫ и ГАЗЕТЫ

НАШИ КНИГИ

Книги и наши издания можно заказать и приобрести в редакции по адресу: г. Москва, Каширское ш., д. 24, стр. 15 и по телефону: +7 (499) 929-96-19. Адрес электронной почты: abv@abvpress.ru

НАШИ САЙТЫ

www.oncoproct.ru

www.roou.ru

www.netoncology.ru

Москва, 2012

www.hnonco.ru

www.urotoday.ru

www.neuromuscular.ru

Журнал включен в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов, в которых публикуются основные научные результаты диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук

ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР проф., д.м.н. Е.В. Самочатова Заместители главного редактора проф., д.м.н. В.В. Птушкин, проф., д.м.н. Б.В. Афанасьев Ответственный секретарь д.м.н. Ю.В. Румянцева РЕДАКЦИОННАЯ КОЛЛЕГИЯ проф., д.м.н. О.В. Алейникова (Минск) проф., д.м.н. А.К. Голенков (Москва) проф., д.м.н. А.И. Карачунский (Москва) д.м.н. Е.Н. Паровичникова (Москва) проф., д.м.н. Ю.А. Криволапов (С.-Петербург) доц., д.м.н. М.Л. Минков (Австрия) д.м.н. Н.В. Мякова (Москва) к.м.н. Е.А. Никитин (Москва) проф., д.м.н. О.А. Рукавицын (Москва) проф., д.м.н. С.А. Румянцев (Москва) д.м.н. Л.П. Менделеева (Москва) к.м.н. Л.Г. Фечина (Екатеринбург) д.м.н. А.Л. Усс (Минск) РЕДАКЦИОННЫЙ СОВЕТ проф., д.м.н. Е.А. Лукина (Москва) чл.-корр. РАМН И.В. Поддубная (Москва) чл.-корр. РАМН А.Г. Румянцев (Москва) к.м.н. В.А. Россиев (Самара) проф., д.м.н. А.Г. Талалаев (Москва)

Адрес редакции:

115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24, стр. 15, НИИ канцерогенеза, 3-й этаж. Тел./факс: +7 (499) 929-96-19 www.abvpress.ru e-mail: abv@abvpress.ru Заведующая редакцией Т.В. Клюковкина Корректор В.В. Калинина Дизайн Е.В. Степанова Верстка О.В. Гончарук Служба подписки и распространения И.В. Шургаева, +7 (499) 929-96-19 e-mail: baza@abvpress.ru Служба рекламы В.А. Клюковкин, +7 (499) 929-96-19 e-mail: gm@abvpress.ru Журнал зарегистрирован в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор) ПИ № ФС77-36928 от 21 июля 2009 г.

EDITOR-IN-CHIEF Prof. Ye.V. Samochatova Deputy Editors Prof. V.V. Ptushkin, Prof. B.V. Afanasiev Executive Secretary D. Sci. Yu.V. Rumyantseva EDITORIAL BOARD Prof. O.V. Aleynikova (Minsk) Prof. A.K. Golenkov (Moscow) Prof. A.I. Karachunskiy (Moscow) D. Sci. Ye.N. Parovichnikova (Moscow) Prof. Yu.A. Krivolapov (St.-Petersburg) D. Sci. M.L. Minkov (Austria) D. Sci. N.V. Myakova (Moscow) PhD Ye.A. Nikitin (Moscow) Prof. O.A. Rukavitsyn (Moscow) Prof. S.A. Rumyantsev (Moscow) D. Sci. L.P. Mendeleeva (Moscow) PhD L.G. Fechina (Yekaterinburg) D. Sci. A.L. Uss (Minsk) EDITORIAL COUNCIL Prof. Ye.A. Lukina (Moscow) Prof. I.V. Poddubnaya (Moscow) Prof. A.G. Rumyantsev (Moscow) PhD V.A. Rossiyev (Samara) Prof. A.G. Talalayev (Moscow)

При полной или частичной перепечатке материалов ссылка на журнал «Онкогематология» обязательна. Редакция не несет ответственности за содержание публикуемых рекламных материалов. В статьях представлена точка зрения авторов, которая может не совпадать с мнением редакции. ISSN 1818-8346 Онкогематология. 2012. № 4. 1–72 © ООО «ИД «АБВ-пресс», 2012 Подписной индекс в каталоге «Пресса России» — 42167 Отпечатано в типографии ООО «Графика» Тираж 3000 экз.

2012

СОДЕРЖАНИЕ

От редакции . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

НОВЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ НАУКИ М.А. Орлова, Т.П. Трофимова, А.П. Орлов, О.А. Шаталов, А.А. Свистунов, Ю.К. Наполов, В.П. Чехонин Производные фуллерена как модуляторы процессов клеточной пролиферации и апоптоза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 М.А. Орлова, Т.П. Трофимова, А.П. Орлов, О.А. Шаталов, А.А. Свистунов, Ю.К. Наполов, В.П. Чехонин Фуллерены и оксидативный стресс . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ Е.Г. Овсянникова, К.Д. Капланов, Т.Ю. Клиточенко, А.В. Мисюрин, И.Л. Давыдкин, Л.В. Заклякова, Е.А. Попов, Б.Н. Левитан Мутационный статус резистентных к иматинибу больных хроническим миелолейкозом . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 О.Ю. Виноградова, Е.А. Асеева, А.В. Воронцова, А.Г. Туркина, А.Л. Неверова, О.В. Лазарева, Е.Ю. Челышева, Г.А. Гусарова, Т.И. Колошейнова, Л.Ю. Колосова, С.Р. Горячева, М.В. Вахрушева, С.М. Куликов, И.А. Тищенко, Л.В. Дяченко, А.И. Удовиченко, Г.А. Алимова, Е.В. Клеина, Л.А. Гребенюк, М.Л. Коннова, С.Ю. Смирнова, Н.Д. Хорошко, Е.В. Домрачева Влияние различных хромосомных аномалий в Ph-позитивных клетках костного мозга на течение хронического миелолейкоза при терапии ингибиторами тирозинкиназ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 И.И. Калинина, У.Н. Петрова, О.В. Горонкова, Д.Д. Байдильдина, В.В. Синицына, Л.А. Хачатрян, М.А. Масчан, Г.А. Клясова, А.А. Масчан Инфекции, вызванные редкими плесневыми грибами, в гематологии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

РЕДКИЕ БОЛЕЗНИ: ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА Е.Л. Сахаровская, И.Б. Резник, М.М. Дубровин, Г.П. Павлова, А.Ю. Щербина Рентгенологическая картина злокачественного остеопетроза на ранних и поздних стадиях развития заболевания . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ Д.Д. Панков, А.Г. Румянцев Оптимизация экспериментальных моделей заболевания лейкозом у человека (обзор литературы) . . . . . . . . . . . . . . . . 48

КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ Материалы VIII симпозиума «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний», Москва, 1–3 февраля 2013 г. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

CONTENTS

From edition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

NEW TRENDS IN MEDICAL SCIENCE M.A. Orlova, T.P. Trofimova, A.P. Orlov, O.A. Shatalov, A.A. Svistunov, Yu.K. Napolov, V.P. Chekhonin Fullerene derivatives as modulators for the cell proliferation and apoptosis processes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 M.A. Orlova, T.P. Trofimova, A.P. Orlov, O.A. Shatalov, A.A. Svistunov, Yu.K. Napolov, V.P. Chekhonin Fullerene and oxidative stress . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

HEMATOLOGIC MALIGNANCIES: DIAGNOSIS, TREATMENT, SUPPORTIVE CARE E.G. Ovsyannikova, K.D. Kaplanov, T.Yu. Klitochenko, A.V. Misyurin, I.L. Davydkin, L.V. Zaklyakova, E.A. Popov, B.N. Levitan Mutation status of refractory to imatinib patients with chronic myeloid leukemia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 O.Yu. Vinogradova, E.A. Aseeva, A.V. Vorontsova, A.G. Turkina, A.L. Neverova, O.V. Lazareva, E.Yu. Chelysheva, G.A. Gusarova, T.I. Kolosheinova, L.Yu. Kolosova, S.R. Goryacheva, M.V. Vakhrusheva, S.M. Kulikov, I.A. Tishchenko, L.V. Dyachenko, A.I. Udovichenko, G.A. Alimova, E.V. Kleina, L.A. Grebenyuk, M.L. Konnova, S.Yu. Smirnova, N.D. Khoroshko, E.V. Domracheva Influence of different chromosomal abnormalities in Ph-positive bone marrow cells on the chronic myeloid leukemia course during tyrosine kinase inhibitors therapy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 I.I. Kalinina, U.N. Petrova, O.V. Goronkova, D.D. Baidildina, V.V. Sinitsina, L.A. Khachatryan, M.A. Maschan, G.A. Klyasova, A.A. Maschan Infections caused by rare mold fungi in hematology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

RARE DISEASES: DIFFERENTIAL DIAGNOSIS E.L. Sakharovskaya, I.B. Reznik, M.M. Dubrovin, G.P. Pavlova, A.Yu. Shcherbina Radiological features of malignant osteopetrosis at early and late stages of disease . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

BASIC RESEARCH D.D. Pankov, A.G. Rumyantsev Optimization of experimental human leukemia models (review) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

CONFERENCES, SYMPOSIUMS, MEETINGS Proceedings of the VIII Symposium «Biological bases for the therapy of oncological and hematological diseases», Moscow, February 1–3, 2013 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

’2012

ОТ РЕДАКЦИИ / FROM EDITION Поздравляем читателей журнала «Онкогематология» с наступившим Новым годом! Желаем всем успешного решения деловых и личных проблем, уважения и доверия коллег и па циентов, новых знаний и умений. В минувшем году мы старались всесторонне осветить вопросы практической онкогематологии и уделяли серьезное внимание научным проблемам, которые лежат в основе достижений этой области медицины. Журнал продолжит эту практику. Как и год назад, когда в журнале был опубликован образова тельный цикл лекций, посвященных молекулярным основам лейкемогенеза, в текущем году мы также хотим познакомить читателей журнала «Онкогематология» с новой для большинства из них областью знаний – наномедициной. Мало кто в наше время не слышал или каким бы то ни было образом не соприкасался с достижениями науки о наночастицах, однако только едини цы представляют себе хотя бы основные ее позиции и тем более, какое отношение нанотехно логии имеют к практической медицине. Редакция посчитала своевременным открыть для вас первые страницы науки о наночастицах и начинает публиковать цикл лекций специалистов в этой области. Ждем ваших откликов и вопросов.

Главный редактор журнала «Онкогематология» д.м.н., проф. Е.В. Самочатова

Производные фуллерена как модуляторы процессов клеточной пролиферации и апоптоза

’2012

НОВЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ НАУКИ

М.А. Орлова1, Т.П. Трофимова1, А.П. Орлов2, О.А. Шаталов3, А.А. Свистунов3, Ю.К. Наполов3, В.П. Чехонин2 Химический факультет, кафедра радиохимии ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова»; 2 медико-биологический факультет, кафедра медицинских нанобиотехнологий ГБОУ ВПО «Российский научно-исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, Москва; 3 фармацевтический факультет, кафедра фармакологии ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России 1

Контакты: Марина Алексеевна Орлова orlova.radiochem@mail.ru

Fullerene derivatives as modulators for the cell proliferation and apoptosis processes M.A. Orlova1, T.P. Trofimova1, A.P. Orlov2, O.A. Shatalov3, A.A. Svistunov3, Yu.K. Napolov3, V.P. Chekhonin2 1 M.V. Lomonosov Moscow State University; 2 N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow; 3 I.M. Sechenov Moscow State Medical University

Нанотехнологии, т. е. технологии создания и использования наноразмерных (~ 1–100 нанометров (10-9 метра) (нм)) объектов, при которых для достижения практического результата размер имеет принципиальное, даже критическое значение, открывают новые возможности, занимая особую нишу в различных областях науки и промышленности [1], закономерно проникая в область фармации и медицины. Особое место среди таких продуктов занимает сравнительно недавно (1985) открытый класс фуллеренов. Фуллерен – это одна из аллотропных* форм углерода (другие — алмаз, карбин и графит), представляет собой выпуклые замкнутые многогранники, составленные из четного числа трехкоординированных атомов углерода. Своим названием фуллерены обязаны инженеру и дизайнеру Ричарду Бакминстеру Фуллеру, в чьих конструкциях используется такая форма. Первоначально данный класс соединений был ограничен лишь структурами, включающими только пятии шестиугольные грани. Самый симметричный и наи более полно изученный представитель класса фулле-

ренов — фуллерен (C60), в котором углеродные атомы образуют усеченный икосаэдр, состоящий из 20 шестиугольников и 12 пятиугольников и напоминающий футбольный мяч размером 1,6–1,8 нм (рисунок). Следующим по распространенности является фуллерен C70, отличающийся от фуллерена C60 вставкой пояса из 10 атомов углерода в экваториальную область C60, в результате чего молекула C70 оказывается вытянутой и напоминает своей формой мяч для игры в регби. Так называемые высшие фуллерены, содержащие большее число атомов углерода (до 400), встречаются реже и часто имеют довольно сложный изомерный состав. Среди наиболее изученных высших фуллеренов можно выделить Cn, где n = 74, 76, 78, 80, 82 или 84. Если в состав молекулы фуллерена помимо атомов углерода входят атомы других химических элементов, то, если они расположены внутри углеродного каркаса, такие фуллерены называются эндоэдральными, если снаружи – экзоэдральными. Наночастицы размером менее 100 нм (1–50 нм) имеют совершенно уникальные физико-химические

*Аллотропия (от др.-греч. αλλος – «другой», τροπος – «поворот, свойство») – существование одного и того же химического элемента в виде 2 и более простых веществ, различных по строению и свойствам, – так называемых аллотропических (аллотропных) модификаций или форм. Явление аллотропии обусловлено либо различным составом молекул простого вещества (аллотропия состава), либо способом размещения атомов или молекул в кристаллической решетке (аллотропия формы). Углерод имеет множество модификаций: алмаз, графит, фуллерен, карбин, графен, углеродные нанотрубки, лонсдейлит и др. Точное число модификаций указать затруднительно вследствие разнообразия форм связывания атомов углерода между собой. Наиболее многочисленны молекулярные структуры фуллеренов и нанотрубок.

НОВЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ НАУКИ

’2012

Структура фуллерена C60

параметры, механизмы и точки биомедицинского приложения. Это связано с нахождением большинства атомов на межфазной, внешней поверхности частиц, что обуславливает особые квантово-механические закономерности их действия. Фуллерены, в отличие от других углеродных наночастиц и материалов, могут вступать в реакции присоединения по двойным связям (с получением экзопроизводных), внедрения атомов и кластеров внутрь углеродной сферы (эндопроизводные) и способны к образованию гетерофуллеренов (металлофуллеренов) и супрамолекул. Они обладают целым спектром разнообразных свойств, влияющих на человеческий организм. Многие представители обширного семейства водорастворимых производных фуллеренов и созданных на их основе наночастиц привлекают внимание как средства адресной доставки лекарств, противовирусные и противоопухолевые агенты. Сегодня получено огромное количество таких производных фуллерена С60. Однако для внедрения фуллереновых производных в медицинскую практику необходимо понимание причин и механизмов прямых и отдаленных последствий их эффектов in vivo, основанных на внедрении в регуляцию процессов пролиферации, апоптоза и некроза клеток. Большое влияние на последующие свойства фуллереновых наночастиц имеет способ их получения и функционализации, а также морфология – их размеры, форма, рельеф поверхности, аффинность к клеточным структурам, т. е. параметры, в зависимости от которых биологические эффекты наночастиц могут меняться от цитопротекторного до цитотоксического. Основным эффекторным воздействием фуллеренов долгое время считалась индукция образования активных форм кислорода, однако в последние годы показано, что в зависимости от размеров фуллерены могут внедряться в органеллы клеток, встраиваться в структуры молекул белков и ДНК, изменяя их конформационную лабильность и оказывая воздействие на их функ-

ционирование, что ведет к изменениям параметров метаболизма и клеточного цикла. Так, фуллерен (С60) и его водорастворимые производные, полученные присоединением разнообразных функциональных групп к сетке фуллерена, в различных условиях могут выступать как цитопротекторы, так и как цитотоксические агенты [2]. В частности, ряд гидроксилированных производных С60 и С60-малонаты ведут себя как поглотители (акцепторы, губки) радикалов и защищают клетки от повреждений, опосредованных оксидативным стрессом [2–7]. Однако при более высоких концентрациях, а также под действием излучения в ультрафиолетовом спектре они же способны приводить к клеточной смерти через активные формы кислорода (АФК) – АФК-зависимые и АФК-независимые механизмы [7–10]. Для некоторых производных фуллерена описано цитотоксическое влияние на определенные (в частности, раковые) клетки [11]. Это может быть целенаправленно использовано в терапии опухолей без заметного повреждения здоровой ткани [12]. Все производные фуллерена, несущие S-триазиновый фрагмент, в разной степени ингибировали рост бактерий [13]. Коллоидные растворы С60 при взаимодействии с водой способны образовывать агрегаты различного размера и, соответственно, различной токсичности. Поэтому наряду с повышением привлекательности фуллеренов для использования в медицинских целях существует также некоторая неопределенность относительно их токсичности и отдаленных последствий их применения. Функционализация (сужение и усиление направленности конкретной функции за счет прикрепления соответствующих молекул) С60 при уменьшении видимой токсичности может существенно влиять на характер взаимодействия фуллеренов с биологическими системами [14], что повышает неопределенность последствий, а иногда даже создает эффект «троянского коня». Поэтому очень важно правильно оценить риски и последствия развития фуллерен-нанотехнологий. Споры о токсичности наночастиц С60 и гидроксилированных фуллеренов подробно описаны в ряде источников [15]. В последнее время особый интерес лежит в области доставки функциональной лекарственной составляющей в отдельные органы и ткани организма (drug delivery). Производные фуллеренов, особенно порфириновые и супрамолекулярные, способны выполнять функции как транспортера, так и самого лекарства. Последнее обусловлено тем, что фуллерены обладают собственным влиянием на оксидативный стресс, пролиферацию, апоптоз, экспрессию генов и другие функции клеток и систем орга низма. В 2005 г. издан ряд монографий, подробно описывающих органическую химию фуллеренов [16, 17] и результаты их применения в биомедицинских исследованиях [18]. Написано и немало обзоров по изуче-

Кроме того, в последнее время резко увеличилось производство и применение инженерных фуллеренов в различных отраслях промышленности. Все это повышает важность проблемы всесторонней оценки их токсичности для окружающей среды и здоровья человека. Мы представляем цикл лекций, где попытались сконцентрировать внимание на основных аспектах воздействия фуллеренов на живые организмы, в том числе связанных с апоптозом и пролиферацией нормальных и опухолевых клеток, которые особенно важны для диагностики и терапии злокачественных опухолей и нейродегенеративных заболеваний. Мы также рассмотрим тенденции интенсивно развивающихся направлений использования фуллереновых наночастиц для адресной доставки лекарств. Цикл лекций состоит из 4 частей, посвященных: 1) оксидативному стрессу; 2) влиянию на сигнальные пути апоптоза; 3) противоопухолевой активности; 4) возможности использования фуллеренов для адресной доставки лекарств и 5) применению в фотодинамической и радиотерапии опухолей.

Л И Т Е Р А Т У Р А 1. Duncan R., Gaspar R. Nanomedicine(s) under the microscope. Mol Pharmaceutics 2011;8:2101–41. 2. Harhaji L., Isakovic A., Raicevic N. et al. Multiple mechanisms underlying the anticancer action of nanocrystalline fullerene. Eur J Pharmacol 2007;568:89–98. 3. Dugan L.L., Turetsky D.M., Du C. et al. Carboxyfullerenes as neuroprotective agents. Proc Natl Acad Sci (USA) 1997;94:9434–9. 4. Monti D., Moretti L., Salvioli S. et al. C60 carboxyfullerene exerts a protective activity against oxidative stress-induced apoptosis in human peripheral blood mononuclear cells. Biochem Biophys Res Commun 2000;277:711–7. 5. Dugan L.L., Gabrielsen J.K., Yu S.P. et al. Buckminsterfullerenol free radical scavengers reduce excitotoxic and apoptotic death of cultured cortical neurons. Neurobiol Dis 1996;3:129–35. 6. Isakovic A., Markovic Z., Nikolic N. et al. Inactivation of nanocrystalline C60 cytotoxicity by γ-irradiation. Biomaterials 2006;27:5049–58. 7. Isakovic A., Markovic Z., Todorovic-Markovic B. et al. Distinct cytotoxic mechanisms of pristine versus hydroxylated fullerene. Toxicol Sci 2006;91:173–83. 8. Yamawaki H., Iwai N. Cytotoxicity of water-soluble fullerene in vascular endothelial cells. Am J Physiol Cell Physiol 2006;290:C1495–C1502.

9. Yang X.L., Fan C.H., Zhu H.S. Photoinduced cytotoxicity of malonic acid [C60] fullerene derivatives and its mechanism. Toxicol in Vitro 2002;16:41–6. 10. Rancan F., Rosan S., Boehm F. et al. Cytotoxicity and photocytotoxicity of a dendritic C60 mono-adduct and a malonic acid C60 tris-adduct on Jurkat cells. J Photochem Photobiol B 2002;67:157–62. 11. Bosi S., Feruglio L., Da Ros T. et al. Hemolytic effects of water-soluble fullerene derivatives. J Med Chem 2004;47:6711–5. 12. Chen C., Xing G., Wang J. et al. Multihydroxylated [Gd@C82(OH)22]n nanoparticles: antineoplastic activity of high efficiency and low toxicity. Nano Lett 2005;5(10):2050–7. 13. Darwish A.D. Fullerenes. Annu Rep Prog Chem A 2010;106:356–75. 14. Gao J., Wang H.L., Shreve A., Iyer R. Fullerene derivatives induce premature senescence: A new toxicity paradigm or novel biomedical applications. Toxicol Appl Pharmacol 2010;244:130–43. 15. Jung H., Wang C., Jang W. Nano-C60 and hydroxylated C60: Their impacts on the environment. Toxicol Envir Health Sci 2009;1:132–9. 16. Сидоров Л.Н., Юровская М.А., Борщевский А.Я. и др. Фуллерены. М.: Экзамен, 2005. 17. Hirsch A., Brettreich M. Fullerenes: chemistry and reactions. Weinheim, WileyVCH, 2005.

18. Пиотровский Л.Б., Киселев О.И. Фуллерены в биологии. СПб.: Росток, 2006. 19. Трошин П.А., Любовская З.Н. Органическая химия фуллеренов: основные реакции, типы соединений фуллеренов и перспективы их практического применения. Успехи химии 2008;77:324–69. 20. Ema M., Kobayashi N., Naya M., Hanai S. et al. Reproductive and developmental toxicity studies of manufactured nanomaterials. J Reprod Toxicol 2010;30:343–52. 21. Markovic Z., Trajkovic V. Biomedical potential of the reactive oxygen species generation and quenching by fullerenes (C60). Biomaterials 2008;29:3561–73. 22. Grausova L., Vacik J., Vorlicek V. et al. Fullerene C60 films of continuous and micropatterned morphology as substrates for adhesion and growth of bone cells. Diamond Relat Mater 2009;18:578–86. 23. Aschberger K., Johnston H.J., Stone V. et al. Review of fullerene toxicity and exposure – Appraisal of a human health risk assessment, based on open literature. Regul Toxicol Pharmacol 2010;58:455–73. 24. Da Ros T., Spalluto G., Prato M. Biological applications of fullerene derivatives: a brief overview. Croat Chem Acta 2001;74:743–55. 25. Da Ros T. Twenty Years of Promises: Fullerene in Medicinal Chemistry. In.: Medicinal Chemistry and Pharmacological

’2012

нию синтеза новых соединений этого класса [19–24] и их возможного медицинского применения [25–31]. Рассмотрено антимикробное действие фуллеренов и их производных [32]. Особое значение для медицины имеют водорастворимые фуллерены, среди которых значительное место занимают их порфириновые производные [33, 34] и фуллеролы (гидроксифуллерены, фуллеренолы) [35]. В силу того, что основное направление исследований по фуллеренам связано с синтезом новых конструкций, информация о биохимических результатах во многих случаях носит хаотичный характер. Вопрос о том, являются ли фуллерены полезными с точки зрения практической медицины или они представляют собой еще один фактор риска, активно дискутируется в научной литературе и пока не имеет однозначного ответа. Нельзя не учитывать экологическую и техногенную составляющую воздействия фуллеренов, поскольку эти соединения появляются в окружающей среде из природных и антропогенных источников, таких как извержения вулканов, лесные пожары и сжигание углеродных материалов [36, 37].

НОВЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ НАУКИ

’2012

НОВЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ НАУКИ Potential of Fullerenes and Carbon Nanotubes. Series: Carbon Materials: Chemistry and Physics, Vol. 1, 2008. Pp. 1–21. 26. Bakry R., Vallant R.M., Najam-ul-Haq M. et al. Medicinal applications of fullerenes. Int J Nanomed 2007;4:639–49. 27. Satoh M., Takayanagi I. Pharmacological Studies on Fullerene (C60), a Novel Carbon Allotrope, and Its Derivatives. J Pharmacol Sci 2006;100:513–8. 28. Chawla P., Chawla V., Maheshwari R., Saraf A. Fullerenes: from carbon to nanomedicine. Mini Reviews in Med Chem 2010;10:662–77. 29. Partha R., Conyers J.L. Biomedical applications of functionalized fullerenebased nanomaterials. Int J Nanomed 2009;4:261–75.

30. Yan L., Zhao F., Li S. et al. Low-toxic and safe nanomaterials by surface-chemical design, carbon nanotubes, fullerenes, metallofullerenes, and graphenes. Nanoscale 2011;3:362–82. 31. Parveen S., Misra R., Sahoo S.K. Nanoparticles: a boon to drug delivery, therapeutics, diagnostics and imaging. Nanomedicine 2012;8(2):147–66. 32. Huh A.J., Kwon Y.J. «Nanoantibiotics»: A new paradigm for treating infectious diseases using nanomaterials in the antibiotics resistant era. J Control Release 2011;7:128–45. 33. Койфман О.И., Мамардашвили Н.Ж., Антипин И.С. Синтетические рецепторы на основе порфиринов и их конъюгатов с каликс[4]аренами. М.: Наука, 2006.

34. Satake A., Kobuke Y. Dynamic supramolecular porphyrin system. Tetrahedron 2005;61:13–41. 35. Tykhomyrov A.A., Nedzvetsky V.S., Klochkov V.K., Andrievsky G.V. Nanostructures of hydrated C60 fullerene (C60HyFn) protect rat brain against alcohol impact and attenuate behavioral impairments of alcoholized animals. Toxicology 2008;246:158–65. 36. Buseck P.R. Geological fullerenes: review and analysis. Earth Planet Sci Lett 2002;203:781–92. 37. Shinohara N., Gamo M., Nakanishi J. Fullerene C60: inhalation hazard assessment and derivation of a period-limited acceptable exposure level. Toxicol Sci 2011;123:576–89.

Контакты: Марина Алексеевна Орлова orlova.radiochem@mail.ru Многие представители обширного семейства водорастворимых аддуктов фуллеренов и наночастиц на их основе привлекают серьезное внимание как противовирусные агенты, противоопухолевые агенты и средства адресной доставки лекарств. Сегодня получено огромное количество таких производных фуллерена С60. Однако для внедрения фуллереновых производных в медицинскую практику необходимо понимание причин и механизмов прямых и отдаленных последствий их эффектов in vivo. В первую очередь это касается их влияния на регуляцию процессов пролиферации, апоптоза и некроза. Огромное значение имеют способ получения, функционализации и морфология фуллереновых наночастиц (их размеры, форма, рельеф поверхности, аффинность к клеточным структурам), т. е. параметры, в зависимости от которых биологические эффекты наночастиц могут меняться от цитопротекторного до цитотоксического. Одним из основных эффектов фуллеренов на живые системы считается индукция образования активных форм кислорода. В данной лекции содержится анализ современных представлений о влиянии фуллеренов и их производных на образование активных форм кислорода и модуляции процессов пролиферации и апоптоза нормальных и опухолевых клеток. Ключевые слова: фуллерены, апоптоз, оксидативный стресс

Fullerene and oxidative stress M.A. Orlova1, T.P. Trofimova1, A.P. Orlov2, O.A. Shatalov3, A.A. Svistunov3, Yu.K. Napolov3, V.P. Chekhonin2 1 M.V. Lomonosov Moscow State University; 2 N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow; 3 I.M. Sechenov Moscow State Medical University Fullerene derivatives superfamily attracts a serious attention as antiviral and anticancer agents and drug delivery carriers as well. A large number of such fullerene С60 derivatives obtained to date. However, there is an obvious deficit of information about causes and mechanisms of immediately and long-term consequences of their effects in vivo which is a true obstacle on the way leading to their practical medical using. First, this concerns their impact on the proliferation, apoptosis and necrosis regulation. Fullerene nanoparticle functionalization type, their sizes and surface nanopathology are of great importance for further promoting of either cytoprotective or cytotoxic effects. One of the main effects of fullerenes on living systems is the reactive oxygen species (ROS) formation induction. This lecture provides a modern concept analysis regarding fullerenes effects on ROS formation and modulation of proliferation and apoptosis in normal and tumor cells. Key words: fullerenes, apoptosis, oxidative stress

Одним из основных факторов воздействия внешней среды, влияющих на апоптоз, является окси дативный стресс, выражающийся в образовании активных форм кислорода (АФК), среди которых наибольшее действие производят синглетный кислород, супероксид-анион-радикал, пероксид водорода и гидроксильные радикалы, дополнительно появляющиеся в катализируемых металлами реакциях Фентона и Хабера–Вейса. АФК участвуют в запуске как рецепторного, так и нерецепторного механизмов апоптоза, аутофагии, перекисного окисления липидов и опосредованно влияют на многие сигнальные пути молекулярно-биологических реакций [1, 2]. Известно, что основное воздействие наночастиц вообще и фуллереновых в частности заключается как раз в индук-

ции оксидативного стресса, возникающего при их попадании в организм [3]. Конкретные последствия воздействия наночастиц сильно зависят от их физикохимических свойств: размера, формы, диспергированности в растворителе, растворимости в воде, состава боковых цепей и т. д. Их действие варьирует в широком диапазоне – от токсического до протективного. Концентрационная зависимость является одним из важнейших показателей, определяющих послед ствия введения фуллеренов. Благодаря своей уникальной сферической структуре С60 имеет возможность принимать до 6 электронов [4]. Эти электроны быстро двигаются вокруг структуры (фуллереновой сетки) за счет дипольных моментов. Когда C60 находится под воздействием

’2012

Фуллерены и оксидативный стресс

НОВЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ НАУКИ

’2012

НОВЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ НАУКИ

с вета, электрон поднимается на более высокий энергетический уровень, продуцируя возбужденный синглетный C60, который реагирует с молекулой кислорода (О2) с образованием синглетного кислорода (1О2) – кислорода со свободным электроном на внешней орбите. Фуллерены являются чрезвычайно эффективными генераторами синглетного кислорода с квантовым выходом SО2, близким к единице. Они сильно поглощают свет в ультрафиолетовой и умеренно в видимой области спектра [5], что позволяет использовать их в фотодинамической терапии. Увеличение количества функциональных групп, добавленных к фуллерену, приводит к снижению квантового выхода синглетного кислорода и АФКопосредованной цитотоксичности [6]. Токсичность заметно снижена или даже полностью отсутствует и у гидрофильных фуллеренов [7]. Производные фуллерена способны контролировать как экзогенные, так и эндогенные АФК [8]. Токсичность С60 оценивалась в разных экспериментах на клеточных культурах и экспериментальных животных [9–13]. Практически во всех экспериментах цитотоксического эффекта не было, либо он был минимальным, однако во многих экспериментах от мечалось снижение пролиферативного потенциала клеток. Чтобы модулировать токсичность наночастиц n-C60 и улучшить возможности их медицинского применения, фуллерены различными способами пытаются сделать либо реально, либо псевдорастворимыми в воде. Этот процесс помимо прочих свойств влияет на способность к агрегации и сильно зависит от типа боковых цепей, при этом образуются морфологически различные структуры: стержни, пузырьки, шарики, мембраны и линейные структуры [14, 15]. Морфология агрегатов производных С60 в основном связана с гидрофобными взаимодействиями и водородными

связями. Различия в сродстве к электрону и физиче ские свойства (степень агрегации) сильно влияют на биологическую и биомедицинскую активность конформационных производных фуллеренов [16]. Такие изменения могут способствовать увеличению сродства к радикалам. Для приготовления растворимых образцов С60 используют различные методы придания фуллерену функции растворимости: гидро- и амфифильности, которые в разной степени влияют на их последующую гено- и цитотоксичность (рис. 1) [5]. 1. Химическая модификация фуллеренового каркаса путем присоединения различных гидрофильных функциональных групп (дериватизация или функцио нализация фуллерена) [17]. 2. Включение фуллерена в водорастворимые супрамолекулярные структуры с помощью поливинилпирролидона-PVP [18], каликсаренов или циклодекстринов (CD) [19–21], когда ядро фуллерена полностью покрыто модификатором и не имеет контакта с водой. 3. Метод обмена растворителей (MОР) [22, 23] использует летучие, смешивающиеся с водой растворители, которые растворяют фуллерен, а после добавления воды испаряются, оставляя суспензию n-С60 [24]. 4. Длительное (более 2 недель) перемешивание чистого С60 с водой. Однако при этом могут образовываться крупные агрегаты, а концентрация фуллерена снижается [25]. Ранее считалось, что более сильные растворители способствуют более высокой токсичности. Биологические эффекты С60, суспендированного в растворе, определяли на культурах E. coli. По этим данным, наиболее безопасным растворителем при необходимости биосовместимости оказался N,N-диметил формамид, причем растворимость не связана напрямую с цитотоксичностью, зато озонирование n-C60

γ-cyclodextrin

20–400 nm Рис. 1. Основные способы солюбилизации аддуктов фуллерена С60

олученными в реакциях ксантин/ксантин-оксидаза п и Фентона. У липофильных производных С60 обнаружен защитный эффект даже больший, чем у природного антиоксиданта – витамина Е. Антиапоптотиче ские функции таких производных фуллерена могут быть независимыми от их АФК-акцепторной роли. Так, трис-карбокси-С60 является мощным ингибитором апоптоза в человеческих кожных эпителиальных клетках (НЕК), блокируя клеточный цикл в G0/G1фазе и вызывая клеточное старение. При этом наблюдается снижение уровня экспрессии убиквитин лигазы HERC5, участвующей во врожденном иммунном ответе на вирусные и бактериальные инфекции. В клетках, обработанных гекса-карбокси-С60 и γ-CD-С60 в этих же условиях, никаких изменений в пролиферации не наблюдалось. Показано, что 10 μмоль/л карбоксифуллеренов уменьшают апоптоз мононуклеаров крови [35], а протокатеховая кислота-С60 [36] снижает апоптоз клеток феохромоцитомы крыс (линия PC12). Уровень концентрации зависит от химического строения производного, которое определяет его дальнейшую способность к агрегированию и связыванию с различными сайтами биологических компонентов, и от характеристик используемой клеточной линии. Конформационная компонента играет существенную (если не определяющую) роль в этих процессах. Сравнение антиоксидантных свойств различных производных С60 (PEG (полиэтиленгликоль)-С60, PVP-С60, CD-С60, C60, содержащего ОН-группы и С60-изостеариновая кислота) по отношению к кератиноцитам кожи человека выявило мощный антирадикальный акцепторный потенциал всех этих соединений [37]. Из-за декларируемого многими авторами отсут ствия видимой токсичности и уникальных физикохимических свойств особый интерес вызывают фуллеролы. Гидроксилированный водорастворимый С60(С60HyFn) благодаря антиоксидантному действию ингибирует катаболическую стресс-индуцированную продукцию матричных металлопротеиназ ММР-1, ММР-3 и ММР-13, а также апоптоз и преждевременное старение в культурах человеческих хондроцитов. Это позволяет предполагать возможность его использования в качестве защитного агента против остео артрита [38]. При определенных условиях такие высокогидроксилированные фуллерены могут существенно снижать накопление жира и генерацию АФК [39]. Акцепторную активность по отношению к супероксидрадикалу в системе ксантин/ксантин- оксидаза проявлял фуллерол С60(ОН)24, не оказывая генотоксических эффектов и демонстрируя цитопротекторные свойства в широком диапазоне концентраций (11–221 μмоль/л). Однако по другим данным, при исследовании доксорубицин-индуцированной кардио токсичности этот же фуллерол размером 7 нм при концентрации 1–100 μмоль/мл вызывает морфологи-

’2012

явно и значительно увеличивало инактивацию E. coli [26, 27]. При изучении противоопухолевого действия n-C60 (МОР в диметилсульфоксиде) в высокой концентрации (1 μг/мл n-C60) на клетках глиомы человека (линия U251) и клетках глиомы крыс (линия С6) наблюдали индукцию оксидативного стресса, приводящего к некрозу с повреждением мембраны, опосредованному внеклеточной сигнал-регулируемой киназой (ERK), и смерти клеток [28]. Аналогичная картина наблюдалась в клетках саркомы у мышей. При низкой концентрации (0,25 μг/мл n-C60) имела место аутофагия и остановка пролиферации в G2/M-фазе. Концентрационно-зависимым образом С60 влияет и на дифференцировку мышиных эмбриональных стволовых клеток [29]. В определенных условиях нано-C60 способны вызывать лизис эритроцитов человека дозо- и время- зависимым образом, который мог быть остановлен применением N-ацетил-L-цистеина (NAC), что указывает на роль АФК в этом процессе [30]. Введение С60 может изменять токсическое действие других микропримесей. В клетках, культивируемых с добавлением С60 и As(III), содержание As(III) было выше (эффект «троянского коня»), так как благодаря фуллерену не происходило повышения клеточной токсичности [31]. Азотсодержащие соединения фуллерена могут обладать сильно различающимися свойствами в зависимости от строения вплоть до значительной токсичности. Присоединение к фуллеренам С60 пиридинов и пиримидинов усиливает их избирательную нейротропную активность и в 3–5 раз повышает общую токсичность. Активно исследуют производные фуллерена, модифицированные различными аминокислотами, а также карбоксифуллерены. Например, цистин-С60 – производное фуллерена [32] – показал высокую эффективность антиоксидантного действия против супероксид-анион- и гидроксильных радикалов, предотвращая H2O2-индуцированный апоптоз клеток феохромоцитомы крыс (линия PC12) при концентрации 5 μг/мл. Из-за гидрофобных взаимодействий многие производные (например, аминокислота-С60) самостоятельно собираются в сферические агрегаты, при этом морфология агрегатов существенно влияет как на цитотоксический, так и на цитопротективный эффект этих соединений против Н2О2-индуцированного апоптоза [33]. При рассмотрении разных вариантов модификации С60 остатками гексакарбоновой кислоты (С3 или D3 конформации) наблюдаются [34] важные различия между липофильными и гидрофильными частицами (С3/D3–C60). В качестве модельной системы использовали антиоксидантное действие фуллеренов против перекисного окисления липидов и разрушения целост ности мембран клеток, вызываемых радикалами,

НОВЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ НАУКИ

SK-N-MC cells

T3SS

’2012

A2A

Рис. 2. Аденозиновые рецепторы в SK-N-MC линии клеток нейроэпителиомы человека во взаимодействии с аддуктом фуллерена С60 [49]

ческие изменения в клетках сосудов эндотелия, ингибирует их пролиферацию и активирует аутофагию. Это сопровождается накоплением в клетках полиубиквитированных белков, что активирует аутофагию [40, 41]. Другой гидроксилированный фуллерол C60(OH)22 в диапазоне наномолярных концентраций вызывал ингибирование роста клеток. Эффект зависел от характеристик конкретной клеточной линии, дозы и времени его действия. В то же время C60(OH)22, как и С60(ОН)24, значительно подавлял индуцированную доксорубицином цитотоксичность при любых концентрациях независимо от времени добавления фуллерола. Считается, что эти свойства С60(ОН)22 опосредованы его высокой акцепторной активностью по отношению именно к ОН-радикалам [41]. При концентрациях более 10 μмоль/л фуллеролы в ряде экспериментов проявляли выраженную цитотоксичность [42]. Некоторые водорастворимые фуллерены [43] способны проникать через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и, противодействуя оксидативному стрессу, влиять на пролиферацию клеток мозга [44]. In vitro было смоделировано взаимодействие наночастиц водорастворимого карбоксифуллерена С60(С(СООН)2)2 с клетками ГЭБ в условиях окислительного стресса, вызван-

ного пероксидом водорода, которое показало, что частицы этого соединения селективно проникают преимущественно в окисленные (а не нормальные) клетки эндотелия микрососудов, сохраняя их целостность за счет подавления Н2О2-индуцированной деполимеризации F-актина [45]. Карбоксифуллерены продемонстрировали in vivo свою эффективность в предотвращении нейродегенерации при амиотрофическом латеральном склерозе [46]. Водорастворимые фуллеролы считаются главным достижением нанотехнологий для нейромедицины [47]. При концентрациях от 10 до 100 μмоль/л они на 10–80 % ингибируют активность глутаматных рецепторов. Однократная обработка клеток нейроэпителиомы человека (линия SK-N-MC) нетоксичной концентрацией водорастворимого С60-бис-аддукта (рис. 2) вызывала модуляцию экспрессии аденозиновых рецепторов с увеличением экспрессии A2Aи A2B-рецепторов мРНК и повышением уровня А1 и А2А белков [48]. Однако нельзя забывать, что наряду с нейропротекторным возможно и нейротоксическое действие фуллеренов, проявления которого пока изучены далеко недостаточно.

Л И Т Е Р А Т У Р А 1. Orlova M.A., Orlov A.P. Role of zinc in an organism and its influence on processes leading to apoptosis. Br J Med Res 2011;1:239–305. 2. Portt L., Norman G., Clapp C., Greenwood M. Anti-apoptosis and cell survival. Biochim Biophys Acta 2011;1813:238–59.

3. Shvedova A.A., Kagan V.E., Fadeel B. Close encounters of the small kind: adverse effects of man-made materials interfacing with the nano-cosmos of biological systems. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2010;50:63–88. 4. Markovic Z., Trajkovic V. Biomedical potential of the reactive oxygen species

generation and quenching by fullerenes (C60). Biomaterials 2008;29:3561–73. 5. Yamakoshi Y., Umezawa N., Ryu A. et al. Active oxygen species generated from photoexcited fullerene (C60) as potential medicines: O2-* versus 1O2. J Am Chem Soc 2003;125:12803–9.

22. Dhawan A., Taurozzi J.S., Pandey A.K. et al. Stable colloidal dispersions of C60 fullerenes in water: evidence for genotoxicity. Environ Sci Technol 2006;40:7394–401. 23. Deguchi S., Alargova R.G., Tsujii K. Stable dispersions of fullerenes, C60 and C70, in water: preparation and characterization. Langmuir 2001;17:6013–7. 24. Lyon D.Y., Adams L.K., Falkner J.C., Alvarez P.J. Antibacterial activity of fullerene water suspensions: effects of preparation method and particle size. Environ Sci Technol 2006;40:4360–6. 25. Brant J.A., Labille J., Bottero J.Y., Wiesner M.R. Characterizing the impact of preparation method on fullerene cluster structure and chemistry. Langmuir 2006;22:3878–85. 26. Cook S.M., Aker W.G., Rasulev B.F. et al.Choosing safe dispersing media for С60 fullerenes by using cytotoxicity tests on the bacterium Escherichia coli. J Hazar Mater 2010;176:367–73. 27. Cho M., Fortner J.D., Hughes J.B., Kim J.H. Escherichia coli inactivation by water-soluble, ozonated С60 derivative: kinetics and mechanisms. Envir Sci Technol 2009;43:7410–5. 28. Каркищенко Н.Н. Нанобезопасность: новые подходы к оценке рисков и токсичности наноматериалов. Биомедицина 2009;1:5–27. 29. Nishimura T., Kubota R., Tahara M. et al. Biological effects of fullerene С60 in mouse embryonic stem cells. Toxicol Lett 2006;164S:S214. 30. Trpkovic A., Todorovic-Markovic B., Kleut D. et al. Oxidative stress-mediated hemolytic activity of solvent exchangeprepared fullerene (С60) nanoparticles. Nanotechnol 2010;21(37):375102. 31. Costa C.L.A., Chaves I.S., Ventura-Lima J. et al. In vitro evaluation of co-exposure of arsenium and an organic nanomaterial (fullerene, С60) in zebrafish hepatocytes. Comp Biochem Physiol C 2012;155:206–12. 32. Hu Z., Guan W., Wang W. et al. Protective effects of a novel cystine С60 derivative on hydrogen peroxide-induced apoptosis in rat pheochromocytoma PC12 cells. Chem Biol Interact 2007;167:135–44. 33. Hu Z., Guan W., Wang W. et al. Synthesis of amphiphilic amino acid С60 derivatives and their protective effect on hydrogen peroxide-induced apoptosis in rat pheochromocytoma cells. Carbon 2008;46:99–109. 34. Wang I.C., Tai L.A., Lee D.D. et al. С60 and water-soluble fullerene derivatives as antioxidants against radical-initiated lipid peroxidation. J Med Chem 1999;42: 4614–20. 35. Monti D., Moretti L., Salvioli S. et al. С60 carboxyfullerene exerts a protective activity against oxidative stress-induced apoptosis in human peripheral blood mononuclear cells. Biochem Biophys Res Commun 2000;277:711–7.

36. Guan S., Bao Y., Jiang B., An L. Protective effect of protocatechuic acid from Alpinia oxyphyllaon hydrogen peroxideinduced oxidative PC12 cell death. Eur J Pharmacol 2006;538:73–9. 37. Xiao L., Takada H., Maeda K. et al. Antioxidant effects of water-soluble fullerene derivatives against ultraviolet ray or peroxylipid through their action of scavenging the reactive oxygen species in human skin keratinocytes. Biomed Pharmacotherapy 2005;59:351–8. 38. Alcaraz M.J., Megías J., García-Arnandis I. et al. New molecular targets for the treatment of osteoarthritis. Biochem Pharmacol 2010;80:13–21. 39. Bal R., Turk G., Tuzcu M. et al. Protective effects of nanostructures of hydrated С60 fullerene on reproductive function in streptozotocin-diabetic male rats. Toxicology 2011;282:69–81. 40. Mirkov S.M., Djordjevic A.N., Andric N.L. et al. Nitric oxide-scavenging activity of polyhydroxylated fullerenol, С60(OH)24. Nitric Oxide 2004;11:201–7. 41. Bogdanovic G., Koji V., Dordevic A. et al. Modulating activity of fullerol С60(OH)22 on doxorubicin-induced cytotoxicity. Toxicol In Vitro 2004;18: 629–37. 42. Wielgus A.R., Zhao B., Chignell C.F. et al. Phototoxicity and cytotoxicity of fullerol in human retinal pigment epithelial cells. Toxicol Appl Pharmacol 2010; 242:79–90. 43. Cagle D.W., Kennel S.J., Mirzadeh S. et al. In vivo studies of fullerene-based materials using endohedral metallofullerene radiotracers. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96:5182–7. 44. Oberdorster E. Manufactured nanomaterials (fullerenes, C60) induce oxidative stress in the brain of juvenile largemouth bass. Environ Health Perspect 2004;112:1058–62. 45. Lao F., Chen L., Li W. et al. Fullerene nanoparticles selectively enter oxidationdamaged cerebral microvessel endothelial cells and inhibit JNK related apoptosis. Acs Nano 2009;3:3358–68. 46. Lin J., Wu C. Surface characterization and platelet adhesion studies on polyurethane surface immobilized with C60. Biomaterials 1999;20:1613–20. 47. Linazasoro G. Potential applications of nanotechnologies to Parkinson’s disease therapy. Parkinson Relat Disor 2008; 14:383–92. 48. Morimoto Y., Hirohashi M., Ogami A. et al. Inflammogenic effect of wellcharacterized fullerenes in inhalation and intratracheal instillation studies. Part Fibre Toxicol 2010;7:4–22. 49. Lee Y.T., Chiang L.Y., Chen W.J., Hsu H.C. Water-soluble hexasulfobutyl-[60]-fullerene inhibits low-density lipoprotein oxidation in aqueous and lipophilic phases. Proc Soc Exp Biol Med 2000;224:69–75.

’2012

6. Sayes C.M., Gobin A.M., Ausman K.D. et al. Nano- C60 cytotoxicity is due to lipid peroxidation. Biomaterials 2005;26:7587–95. 7. Scrivens W.A., Tour J.M., Creek K.E., Pirisi L. Synthesis of 14C-labeled C60, its suspension in water, and its uptake by human keratinocytes. J Am Chem Soc 1994;116:4517–8. 8. Maeda R., Noiri E., Isobe H. et al. A water-soluble fullerene vesicle alleviates angiotensin II-induced oxidative stress in human umbilical venous endothelial cells. Hypertension Res 2008;31:141–51. 9. Kolosnjaj J., Szwarc H., Moussa F. Toxicity studies of fullerenes and derivatives. Adv Exp Med Biol 2007;620:168–80. 10. Jia G., Wang H., Yan L. et al. Cytotoxicity of carbon nanomaterials: singlewall nanotube, multi-wall nanotube, and fullerene. Environ Sci Technol 2005;39:1378–83. 11. Sayes C.M., Marchione A.A., Reed K.L., Warheit D.B. Comparative pulmonary toxicity assessments of C60 water suspensions in rats: few differences in fullerene toxicity in vivo in contrast to in vitro profiles. Nano Lett 2007;7:2399–406. 12. Baker G.L., Gupta A., Clark M.L. et al. Inhalation toxicity and lung toxicokinetics of C60 fullerene nanoparticles and microparticles. Toxicol Sci 2008;101:122–31. 13. Horie M., Nishio K., Kato H. et al. In vitro evaluation of cellular responses induced by stable fullerene C60 medium dispersion. J Biochem 2010;148:289–98. 14. Zhou S., Burger C., Chu B. et al. Spherical bilayer vesicles of fullerene-based surfactants in water: a laser light scattering study. Science 2001;291:1944–7. 15. Sawamura M., Kawai K., Matsuo Y. et al. Stacking of conical mesogens with a fullerene apex into polar columns in crystals and liquid crystals. Nature 2002;419:702–5. 16. Yin J.J., Lao F., Fu P.P. et al. The scavenging of reactive oxygen species and the potential for cell protection by functionalized fullerene materials. Biomaterials 2009;30:611–21. 17. Husebo L.O., Sitharaman B., Furukawa K. et al. Fullerenols revisited as stable radical anions. J Am Chem Soc 2004;126:12055–64. 18. Yamakoshi Y.N., Yagami T., Sueyoshi S., Miyata N. Acridine adduct of [60]fullerene with enhanced DNA-cleaving activity. J Org Chem 1996;61:7236–7. 19. Makha M., Purich A., Raston C.L., Sobolev A.N. Structural diversity of hostguest and intercalation complexes of fullerene C60. Eur J Inorg Chem 2006;3:507–17. 20. Deguchi S., Mukai S.A., Tsudome M., Horikoshi K. Facile generation of fullerene nanoparticles by hand-grinding. Adv Mater 2006;18:729–32. 21. Quaranta A., Zhang Y., Filippone S. et al. Photophysical studies of six amphiphilic 2:1 cyclodextrin:[60]fullerene derivatives. Chem Phys 2006;325:397–403.

НОВЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ НАУКИ

ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ

Мутационный статус резистентных к иматинибу больных хроническим миелолейкозом

’2012

Е.Г. Овсянникова1, К.Д. Капланов2, Т.Ю. Клиточенко2, А.В. Мисюрин3, И.Л. Давыдкин4, Л.В. Заклякова1, Е.А. Попов1, Б.Н. Левитан1 1

ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздрава России; 2 ГБУЗ «Волгоградский областной клинический онкологический диспансер № 1»; 3 ООО «ГеноТехнология», Москва; 4 НИИ гематологии, трансфузиологии и интенсивной терапии ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России Контакты: Елена Георгиевна Овсянникова elenaagma@mail.ru

В исследовании проводится анализ мутационного статуса у 36 больных Ph+ хроническим миелолейкозом (ХМЛ) в хронической стадии с первичной и вторичной резистентностью к терапии иматинибом. Мутации гена BCR-ABL определены методом прямого секвенирования ДНК. В результате исследования мутации киназного домена BCR-ABL были обнаружены у 30,5 % (у 11 из 36) этих больных. Большинство выявленных мутаций относились к миссенс-мутациям: Q252H, M244V, G250E, Y253F/H, E255K/V, T315I, M351T, F359V, F359C, F486S. Показана значительно более низкая бессобытийная 4-летняя выживаемость больных ХМЛ с обнаруженными мутациями гена BCR-ABL по сравнению с больными ХМЛ без мутаций (18 % vs 53 %; р = 0,003). Результаты исследования могут быть использованы в качестве справочного материала при принятии решений о тактике лечения резистентных к иматинибу больных ХМЛ с клинически значимыми мутациями гена BCR-ABL. Ключевые слова: хронический миелолейкоз, мутации гена BCR-ABL, резистентность, иматиниб

Mutation status of refractory to imatinib patients with chronic myeloid leukemia E.G. Ovsyannikova1, K.D. Kaplanov2, T.Yu. Klitochenko2, A.V. Misyurin3, I.L. Davydkin4, L.V. Zaklyakova1, E.A. Popov1, B.N. Levitan1 1 Astrakhan State Medical Academy; 2 Volgograd Regional Clinical Oncological Dispensary № 1; 3 LLC «GenoTehnologiya», Moscow; 4 Research Institute of Hematology, Transfusiology and Intensive Care, Samara State Medical University, Ministry of Health of Russia Mutation status of 36 chronic myeloid leukemia (CML) patients in chronic phase with primary and secondary imatinib resistance was analyzed. BCR-ABL mutations identified by direct DNA sequencing. BCR-ABL kinase domain mutations were detected in 30.5 % (11 of 36) of those patients. Most of identified mutations were missense mutations: Q252H, M244V, G250E, Y253F/H, E255K/V, T315I, M351T, F359V, F359C, F486S. Patients with BCR-ABL mutations have significantly lower 4-year event-free survival compared with CML patients without mutations (18 % vs. 53 %; р = 0.003). The results can be used as reference information in deciding on therapy in imatinib resistant CML patients with clinically relevant BCR-ABL mutations. Key words: chronic myeloid leukemia, BCR-ABL mutations, resistance, imatinib

Таргетная терапия хронического миелолейкоза (ХМЛ) не только значительно улучшила качество жизни, но и позволила увеличить выживаемость больных ХМЛ [1]. В то же время у части больных развивается резистентность к лечению ингибиторами тирозинкиназы (ИТК) BCR-ABL как первого, так и последующих поколений. В настоящее время широко обсуждается один из аспектов BCR-ABL-зависимого механизма резистентности к иматинибу – мутации гена BCR-ABL [2, 3]. Однако не все из более чем 90 [4, 5] описанных in vitro мутаций киназного домена BCR-ABL являются клинически значимыми. Неоднозначной считается и интерпретация данных по степени чувствительности in vitro разных мутантных клонов к воздействию иматиниба,

разработанных на основе половинной максимальной ингибирующей концентрации IC50 (inhibitory concent ration 50 %) [6–8]. В связи с этим большое значение имеют данные клинических исследований. Так, результаты исследования GIMEMA показали, что на увеличение частоты возникновения мутаций гена BCR-ABL влияет не только предлеченность больных ХМЛ и стадия заболевания, но и степень резистентности к иматинибу [2, 9]. Определение мутационного статуса у резистентных к терапии иматинибом больных ХМЛ в настоящее время входит в необходимый перечень исследований согласно критериям European Leukemia Net (ELN), опубликованным в 2009 г. [10]. В 2011 г. ELN были разработаны рекомендации по мониторингу мутаций ге-

Материалы и методы В анализ был включен 141 пациент из популяции больных ХМЛ в хронической фазе (Астраханская и Волгоградская области). Исследование мутаций в локусе гена BCR-ABL было проведено у 36 резистентных к иматинибу пациентов. Мутации гена BCR-ABL определены методом прямого секвенирования ДНК (ООО «ГеноТехнология», Москва). При сравнении 2 групп больных с мутациями гена BCR-ABL и без мутаций по полу, возрасту на момент диагностики ХМЛ, сроку предлеченности, длительности терапии иматинибом статистически значимых различий не обнаружено. Преобладали больные с первичной резистентностью к лечению, как в группе больных ХМЛ с обнаруженными мутациями, так и в группе больных без мутаций (табл. 1). Таблица 1. Сравнительный анализ резистентных к иматинибу больных ХМЛ с мутациями и без мутаций гена BCR-ABL

Показатель

Мутации обнаружены, n = 11

Мутаций нет, n = 25

Число мужчин (%)

8 (73)

10 (40)

Число женщин (%)

3 (23) χ = 2,91; р = 0,08

15 (60) χ = 1,28; р = 0,25

Возраст на момент диагноза, Ме (годы)

47 (39; 61)

55 (45; 62)

р = 0,6*

Предлеченность, Ме (мес)

6,4 (1,7; 46)

2,9 (1,7; 23)

р = 0,3**

Длительность терапии иматинибом, Ме (мес)

40 (27; 48)

39 (30; 61)

р = 0,7*

Первичная резистентность, %

73 (8 из 11)

88 (22 из 25)

Вторичная резистентность, %

23 (3 из 11) χ2 = 2,91; р = 0,08

12 (3 из 25) χ2 = 8,73; р = 0,003

Статистиче ская значимость

χ2 = 2,09; р = 0,15

χ2 = 0,42; р = 0,5

Примечание. * – критерий Стьюдента; ** – критерий Манна–Уитни.

В группе из 11 больных ХМЛ, резистентных к лечению иматинибом с обнаруженными мутациями гена BCR-ABL, было 8 мужчин и 3 женщины. Медиана возраста составила 47 (39; 61) лет. На момент начала терапии иматинибом все больные находились в хро-

нической фазе ХМЛ. Медиана длительности заболевания от момента установления диагноза до момента проведения мутационного анализа в группе больных ХМЛ с обнаруженными мутациями составила 64 (23; 93) мес – минимум 18 мес, максимум более 8,5 лет. Большинство больных были предлечены, 1 пациент сразу начал лечение иматинибом. По длительности предлеченности больные разделились на 2 равные группы: 1-я группа – пациенты предлечены менее 6 мес, 2-я группа – более 29 мес (до 72 мес – 6 лет). Медиана времени предлеченности (гидроксикарбамид, бусульфан, интерферон (ИФ), химиотерапия (ХТ) с включением цитарабина) ХМЛ до начала терапии иматинибом составила 6,4 (1,7; 46) мес, что сопо ставимо с медианой предлеченности общей группы обследованных больных ХМЛ – 4 мес. Медиана длительности терапии иматинибом составила 40 (28; 48) мес. Первичная резистентность к иматинибу констатирована у 73 % (у 8 из 11), вторичная резистентность – у 23 % (у 3 из 11) пациентов. Статистическая обработка полученных нами данных проводилась с использованием компьютерного пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 и SPSS [13]. При сравнении групп пациентов по категориальным признакам применяли критерий χ2 с поправкой Йетса. Для оценки статистической значимости различий в 2 несвязанных группах применялся t-критерий Стьюдента или непараметрический критерий Манна– Уитни. Расчет кумулятивной общей (ОВ), беспрогрессивной (БПВ) и бессобытийной (БСВ) выживаемости проведен по методу Каплана–Майера. Выживаемость рассчитывалась от даты начала терапии иматинибом до даты наступления неблагоприятного события или последнего контакта с пациентом. При оценке ОВ событием являлась смерть больного от любой причины. При оценке БПВ событием являлась прогрессия заболевания (факт трансформации хронической фазы ХМЛ в фазу акселерации или в бластный криз, смерть больного). При расчете БСВ событиями считались: потеря полного гематологического ответа (ПГО), потеря полного цитогенетического ответа (ПЦО), потеря большого молекулярного ответа (БМО), смерть больного. Одномерный анализ на предмет выявления прогно стических факторов для ОВ, БПВ, БСВ проводился с использованием логарифмического рангового критерия. Различия между сравниваемыми параметрами считали статистически значимыми при р ≤ 0,05. Результаты и обсуждение В результате исследования мутации киназного домена BCR-ABL были обнаружены у 30,5 % (у 11 из 36) больных ХМЛ, резистентных к иматинибу. Большин ство выявленных мутаций относились к миссенс-мутациям, приводящим к замене аминокислотных остатков, – Q252H, M244V, G250E, Y253F/H, E255K/V, T315I, M351T, F359V, F359C, F486S. Всего выявлено 12 мутаций (табл. 2).

’2012

на BCR-ABL [11]. В 2012 г. рабочая группа ESMO (Европейское общество медицинской онкологии) представила новые рекомендации по диагностике, лечению и мониторингу ХМЛ, где также освещены аспекты мутационного мониторинга [12]. В нашей работе анализируются результаты лечения резистентных к иматинибу больных ХМЛ в хронической фазе с выявленными мутациями гена BCR-ABL.

ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ

’2012

ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ Таблица 2. Мутации гена BCR-ABL у больных ХМЛ, резистентных к лечению иматинибом Код больного

Расположение

Мутация

М.

промежуточная последовательность

T315I

В.

M244V, G250E

Б.

Q252H

О.

П.

E255K/V

С.

Y253Н

Т.

G250E

Св.

И.

Ка.

№

11.

К.

P-петля

каталитический домен

M244V

F359V F359C F486S

А-петля

del 1086-1157 (делеция 72 нуклеотидов 7-го экзона ABL гена BCR/ABL в положении 1086-1157, соответствующей мРНК)

Как представлено в табл. 2, 58 % (7 из 12) мутаций, выявленных в нашем исследовании, расположены на участке гена BCR-ABL, кодирующем Р-петлю. По данным S. Branford et al. мутации в локусе гена BCR-ABL, ответственном за кодировку P-петли, являются причиной высокой степени резистентности к иматинибу у пациентов с ХМЛ [14]. Основанием для этого является то, что в Р-петле располагается «цель» иматиниба – АТФ-связывающий карман. Как след ствие данных мутаций, происходит нарушение связывания иматиниба с белком – BCR-ABL тирозинкиназой. У 2 (17 %) больных выявлены мутации в зоне каталитического домена. Мутации в данной зоне приводят к чрезмерно высокой тирозинкиназной активности, так как каталитический домен участвует во взаимодействии с белками-регуляторами и передаче внутриклеточных сигналов. Мутации гена BCR-ABL на участке, кодирующем А-петлю, выявлены у 17 % (у 2 из 12) больных. Регион A-петли (активационный домен) – участок тирозинкиназы, который закрывает каталитический центр при сохранении неактивной конформации BCR-ABL [15]. Мутации в регионе А-петли, так же как и Р-петли, могут изменить конфигурацию петлевой структуры и перевести белок в активную конформацию. Это приводит к снижению эффективности иматиниба, так как иматиниб взаимодействует только с неактивной формой BCR-ABLкиназы. Благодаря исследованиям in vitro доказана различная степень чувствительности измененного под влия-

нием мутаций гена BCR-ABL к воздействию иматиниба и других ИТК. Однако «прямой» перенос данных из исследований, проведенных in vitro, в клиническую практику не всегда возможен. Мутацией, неопровержимо подтвердившей в клинической практике данные о чрезвычайно высокой резистентности к воздействию ИТК, полученные in vitro, остается мутация T315I [16, 17]. Выявление мутации T315I является абсолютным противопоказанием к терапии иматинибом и ИТК 2-го поколения. В нашем исследовании мутация T315I зарегистрирована у 1 больного из 12 (8 %). Обнаруженные нами мутации относятся к семи наиболее часто встречающимся мутациям гена BCRABL: M244V, G250E, Y253F/H, E255K/V, T315I, M351T, F359V. В работе S. Soverini et al. показано, что именно эти мутации составляют 85 % всех ассоциированных с резистентностью к иматинибу мутаций [2]. Из 12 выявленных нами мутаций к данной группе относятся 9, что составляет 75 %. Был проведен анализ ОВ, БПВ и БСВ больных с обнаруженными мутациями гена BCR-ABL и без мутаций. Общая 5-летняя выживаемость больных ХМЛ с обнаруженными мутациями гена BCR-ABL (1-я группа) равна 67 %. Умерло 27 % (3 из 11) больных. В группе больных ХМЛ без мутаций гена BCR-ABL (2-я группа) общая 5-летняя выживаемость составила 94 %. Умерло 4 % (1 из 25) больных. Различия между группами статистически значимы, р = 0,05 (рис. 1). Анализ кривых БПВ показал, что 5-летняя БПВ больных ХМЛ с обнаруженными мутациями гена BCRABL (1-я группа) составляет 45 %. Прогрессия заболевания констатирована у 36 % (у 4 из 11) больных. В группе больных ХМЛ без мутаций гена BCR-ABL (2-я группа) заболевание прогрессировало у 1 из 25 больных (4 %). Пятилетняя выживаемость равна 94 %. Выживаемость 2 р = 0,05 1

Событие: смерть больного

Мес Рис. 1. ОВ в зависимости от мутационного статуса (1 – мутации обнаружены, 2 – нет мутаций)

Выживаемость

2 р = 0,02

1 Событие: – переход в фазу акселерации; – бластный криз; – смерть больного

Мес Рис. 2. БПВ в зависимости от мутационного статуса (1 – мутации обнаружены, 2 – нет мутаций)

Выживаемость

р = 0,003

Событие: – потеря ПГО; – потеря БМО; – потеря ПЦО; – смерть больного

Мес Рис. 3. БСВ в зависимости от мутационного статуса (1 – мутации обнаружены, 2 – нет мутаций)

Наши данные созвучны с результатами исследования A. Quintas-Cardama et al., в котором показано, что 4-летняя БСВ пациентов в хронической фазе ХМЛ, не имеющих мутаций, с одной мутацией гена BCR-ABL или более составила 56 %, 49 % и 0 % соответственно (р = 0,02); ОВ – 91 %, 69 % и 75 % соответственно (р = 0,13) [18]. В табл. 3 представлены сводные данные о течении заболевания у больных ХМЛ с выявленными мутациями на фоне коррекции терапии. Таблица составлена таким образом, что первыми представлены больные, имеющие мутации гена BCR-ABL, которые, по данным исследования in vitro, способствуют высокой резистентности к терапии иматинибом, т. е. мутантный клон не чувствителен к лечению. Графы, содержащие данные о таких больных, окрашены в красный цвет (по аналогии с таблицами половинной максимальной ингибирующей концентрации IC50 ИТК). Графы пациентов с мутациями, умеренно снижающими чувствительность к иматинибу в тестах in vitro, окрашены в желтый цвет. Мутаций, характеризующих высокую чувствительность к иматинибу, в нашем исследовании не было. Под обозначением мутаций указано значение IC50 иматиниба [6, 7]. Как представлено в табл. 3, мутация T315I обнаружена у 1 больного ХМЛ (код пациента – М.). Больной был предлечен гидреа, цитарабином в течение 31 мес, иматиниб получал в нарастающей дозе до 800 мг. Зарегистрирована первичная резистентность к лечению иматинибом. В связи с отсутствием ЦО в течение 47 мес лечения, проведено исследование мутационного статуса и назначен нилотиниб. Учитывая имеющиеся на сегодняшний день данные о том, что присут ствие мутации T315I влечет за собой полное отсутствие чувствительности как к иматинибу, так и к ИТК 2-го поколения, по получении результата мутационного анализа нилотиниб был отменен, больной переведен на терапию гидроксикарбамидом. На терапии гидро ксикарбамидом получен малЦО. Больному рекомендовано проведение трансплантации костного мозга. Определение мутационного статуса для данного пациента было крайне важным, так как продолжение назначенной терапии нилотинибом (после неэффективности иматиниба) в присутствии мутации T315I могло бы привести к появлению дополнительных мутаций, быстрой прогрессии заболевания. Мутация Y253Н выявлена у 1 больного (код пациента – С.). Данная мутация относится к мутациям, способствующим развитию полного отсутствия чувст вительности к лечению иматинибом. По результатам исследований in vitro мутация Y253H приводит к увеличению IC50 в пролиферативном тесте (более чем в 30 раз) и в биохимическом тесте на фосфорилирующую активность (в 18 раз) [6, 19]. Иматиниб данному больному был назначен через 1 мес от даты диагноза (предлеченность – ИФ, гидреа).

’2012

азличия между группами статистически значимы, Р р = 0,02 (рис. 2). Четырехлетняя БСВ больных ХМЛ с обнаруженными мутациями гена BCR-ABL (1-я группа) равна 18 %. Событие зарегистрировано у 9 из 11 больных (82 %). Медиана выживаемости – 15 (4; 26) мес. В группе больных ХМЛ без мутаций гена BCR-ABL (2-я группа) 4-летняя БСВ составила 53 %. События зафиксированы у 9 из 25 больных (36 %). Медиана выживаемости – 58 (28; 88) мес. Различия между группами статистически значимы, р = 0,003 (рис. 3). Анализ выживаемости в зависимости от мутационного статуса показал, что 5-летние ОВ и БПВ, 4-летняя БСВ достоверно ниже у больных ХМЛ с наличием мутаций гена BCR-ABL. Таким образом, в нашем исследовании наличие мутаций гена BCR-ABL является прогностически неблагоприятным фактором отдаленной выживаемости при ХМЛ.

ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ

’2012

ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ Таблица 3. Клинический анализ группы больных ХМЛ с мутациями гена BCR-ABL Код больного

Мутация, Срок предлеIC50, нм ченности, мес

Предлеченность

Срок лечения иматинибом до даты анализа, мес

Иматиниб ЦО

БМО

Резис тент ность

Смена терапии после мутационного анализа, срок (мес)

Исход

доза

срок, мес 32 6 9 1

нет

первичная

гидреа, 23

малЦО

гидреа, ХТ

400 600 800 нилотиниб

Y253Н > 6400

ИФ, гидреа

400 600 800

14 8 9

минЦО, потеря ГО

нет

первичная

гидреа, 2

умер

П.

E255K 5200/V > 6400

ИФ, гидреа, ХТ

400 600 800

9 6 22

нет

первичная

ИФ, 16 ХТ, 16 гидреа, 16

умер

Б.

Q252H 1325

гидреа, ХТ ИФ

400 600 800

7 29 11

нет

первичная

нилотиниб, 2 ХТ, 1

умер

нилотиниб, 5

минЦО потеря ГО

иматиниб, 6

нет ЦО, бластный криз

гидреа, 16

нет ЦО

нилотиниб, 3

потеря ЦО

дазатиниб, 11

ЧЦО ПГО

М.

T315I > 6400

С.

О.

M244V 2000

гидреа, ИФ, миелосан

400 600 800

23 10 6

нет малЦО

нет

первичная

Т.

G250E 1350

гидреа

400 600

9 3

малЦО

нет

первичная

В.

M244V 2000 G250E 1350

гидреа, ХТ, миелосан

400 600 800

22 26 25

нет минЦО

нет нет

первичная

–

минЦО

Св.

F359V 1825

гидреа

400 600

13 19

ПЦО, потеря ПЦО

нет

вторичная

–

ЧЦО

И.

F359C 1825

400 600 800

13 16 25

ЧЦО

нет

первичная

–

Ка.

F486S 8,10

гидреа

400 600 800

26 24 11

ПЦО ЧЦО

К.

del 10861157

гидреа

400 600

18 29

гидреа

ПМО, втопотеря ричная ПМО

потеря потеря втоПЦО, ПМО, ричная ПЦО БМО

ЧЦО

дазатиниб, 6

ПЦО БМО

–

ПЦО БМО

Примечание. ЦО – цитогенетический ответ; ГО – гематологический ответ; ПМО – полный молекулярный ответ; ЧЦО – частичный цитогенетический ответ; малЦО – малый цитогенетический ответ; минЦО – минимальный цитогенетический ответ.

В процессе лечения констатирована первичная рези стентность к иматинибу. На дозе 600 мг к 22 месяцам терапии иматинибом достигнут минЦО, доза иматиниба увеличена до 800 мг. Однако заболевание быстро прогрессировало, был потерян ГО. После выявления мутации Y253H терапия иматинибом прекращена, назначено лечение гидроксикарбамидом. С учетом данных исследований о снижении чувствительности к лечению нилотинибом у больных с мутацией Y253H [8, 11, 12] больному планировалось лечение дазатини-

бом. Через 2 мес лечения гидреа развился бластный криз, больной умер. У 1 больного (код пациента – П.) выявлена мутация E255K/V. Пациент в течение 6 мес был предлечен гидреа, ИФ, ХТ (цитарабин). Иматиниб в нарастающей дозировке до 800 мг получал в течение 37 мес. ЦО не достигнут, констатирована первичная резистентность к иматинибу. Определение мутационного статуса выявило наличие мутации E255K/V, которая вызывает высокую степень резистентности к иматинибу.

снижения чувствительности к иматинибу [6, 20] и в равной степени чувствительны к ИТК 2-го по коления. Больному был назначен нилотиниб. Через 3 мес терапии нилотинибом констатирована потеря ЦО и больной переведен на дазатиниб. На терапии дазатинибом получен кратковременный ЧЦО, в то же время произошло снижение уровня транскрипта BCRABL почти в 2 раза, с 15 до 8 %, сохраняется ПГО. Сочетание мутаций М244V и G250E было обнаружено у 1 больного (код пациента – В.). Пациент имел большой срок предлеченности – 70 мес (более 5 лет) миелосаном, гидреа, ХТ. Получал иматиниб в дозе 400 мг, а затем 600 мг. Констатирована первичная резистентность к иматинибу. До момента проведения мутационного анализа срок терапии составил 31 мес. Учитывая возраст больного на момент определения мутационного статуса (73 года), выраженную сопут ствующую патологию и имеющиеся литературные данные о чувствительности клеток, измененных под влиянием мутации М244V и G250E, коррекция терапии проведена путем эскалации дозы иматиниба до 800 мг. На этом фоне был достигнут минЦО. Мутация F359V обнаружена у 1 больного (код пациента – Св.). Лечение иматинибом начато после 2 мес терапией гидреа. Достигнутый в срок 9 мес терапии ПЦО был утрачен. Констатирована вторичная резистентность к иматинибу, доза увеличена до 600 мг. При проведении мутационного исследования выявлена мутация F359V. При продолжении терапии иматинибом в той же дозе 600 мг у пациента был достигнут ЧЦО. По данным исследований, в том числе клинических, при выявлении мутации F359V предпочтительнее назначение дазатиниба [8, 11, 12]. В 1 случае выявлена мутация F359С (код больного – И.). Предлеченность гидреа у данного пациента составляла 46 мес. Зарегистрирована вторичная резистентность к терапии иматинибом. На дозе 600 мг более чем через 18 мес от начала лечения был достигнут ЧЦО. Повышение дозы иматиниба до 800 мг не привело к улучшению ЦО. Исследование мутационного статуса проведено через 47 мес от начала терапии иматинибом, выявлена мутация F359С. Данная мутация из группы F359V/C/I относится к числу клинически подтвержденных мутаций, снижающих чувствительность к нилотинибу. Больной продолжает получать иматиниб в дозе 800 мг, сохраняется ЧЦО. В данном случае показано назначение дазатиниба [8, 11, 12]. У 1 больного обнаружена мутация F486S (код пациента – Ка.). Больной был предлечен гидреа в течение 5 мес. На дозе 600 мг иматиниба произошла потеря ПМО, затем ПЦО, у больного констатирована вторичная резистентность к иматинибу. Доза иматиниба увеличена до 800 мг. При проведении мутационного анализа обнаружена мутация F486S, обладающая способностью умеренно снижать чувствительность измененного клона BCR-ABL к терапии иматинибом. Чувствительность данной мутации in vitro к ИТК 2-го

’2012

Иматиниб отменен, больной получал ИФ-терапию – 16 мес, ХТ – 16 мес, гидроксикарбамид – 16 мес без эффекта. Развилась прогрессия ХМЛ, больной умер. По результатам исследований клетки с мутацией E255K/V имеют чувствительность к дазатинибу [12]. У 1 пациента была выявлена мутация Q252H (код больного – Б.). Предлеченность гидреа, ИФ, ХТ (цитарабин) составила 29 мес. У больного была зарегистрирована первичная резистентность к ХТ. Мутационный анализ указал на присутствие мутации Q252H. Так как эта мутация относится к мутациям с промежуточной или умеренной чувствительностью к иматинибу [6, 7], была проведена эскалация дозы иматиниба до 800 мг. Повышение дозы иматиниба не привело к улучшению результатов лечения. Исходя из исследования IC50 нилотиниба и дазатиниба, оба препарата обладают умеренным воздействием на клон BCR-ABL, измененный под влиянием мутации Q252H. Менее чувствителен к данной мутации дазатиниб [8]. Больному был назначен нилотиниб, однако заболевание прогрессировало, пациент умер. Пациент с обнаруженной мутацией М244V (код больного – О.) имел длительный срок предлеченности – 72 мес (6 лет) гидреа, ИФ, миелосаном. У больного была констатирована первичная резистентность к терапии иматинибом. Через 33 мес лечения иматинибом при проведении мутационного анализа была выявлена мутация М244V. Мутация М244V обладает промежуточной чувствительностью к иматинибу. Мнения исследователей в отношении данной мутации несколько разнятся. Увеличение дозы иматиниба может привести к улучшению результатов лечения – указывают A. Corbin et al. [20], T. O’Hare et al. [6] рекомендуют раннее использование ИТК 2-го поколения. В данном клиническом случае было проведено увеличение дозы иматиниба до 800 мг. Корректировка терапии привела к достижению только малЦО. Так как клетки с мутацией М244V имеют равную чувствительность к нилотинибу и дазатинибу, больному был назначен нилотиниб. На фоне терапии нилотинибом в течение 5 мес пациент потерял ЦО и ГО. В связи с отсутствием возможности назначить другой ИТК возобновлено лечение иматинибом, однако заболевание прогрессировало до бластного криза. Иматиниб был отменен, больной переведен на терапию гидроксикарбамидом, получает ее в течение 16 мес, прогрессия заболевания приостановлена, однако ЦО более не достигнут. У 1 пациента обнаружена мутация G250E (код больного – Т.). Срок предлеченности у данного больного 2 мес с использованием гидреа. Через 12 мес терапии иматинибом в увеличенной дозе 600 мг у больного констатирована первичная резистентность к иматинибу, был достигнут малЦО. Клетки, измененные под воздействием мутации G250E, характеризуются, по данным различных исследований, от промежуточного до высокого уровня

ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ

’2012

ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ

поколения почти равноценна [6, 7]. По данным от дельных исследований in vitro, более эффективен при данной мутации нилотиниб [21]. Больному был назначен дазатиниб, достигнуты ПЦО и БМО. У 1 больного обнаружена мутация в А-петле, del 1086-1157 – делеция 72 нуклеотидов 7-го экзона ABL гена BCR/ABL в положении 1086-1157, соответствующей мРНК (код пациента – К.). Больной был предлечен гидреа в течение 4 мес. Достигнутые на дозе 400 мг иматиниба ПЦО и ПМО были утрачены, констатирована вторичная резистентность. Доза иматиниба увеличена до 600 мг. Оценка мутационного статуса проведена через 18 мес от начала терапии иматинибом, обнаружена del 1086-1157. Больной продолжил лечение иматинибом в дозе 600 мг, достигнуты ПЦО и БМО. В литературе клинических случаев с описанием этой мутации нами не обнаружено. Заключение Резюмируя анализ ответа на терапию иматинибом у резистентных больных ХМЛ в хронической фазе заболевания, имеющих мутации гена BCR-ABL, и результаты коррекции терапии в нашем исследовании, а также используя литературные данные и исследования in vitro, можно сделать следующие выводы: 1. Наличие мутаций гена BCR-ABL является прогностически неблагоприятным фактором отдаленной выживаемости при ХМЛ. 2. Исследование мутационного статуса показано всем больным ХМЛ в хронической фазе заболевания с наличием первичной и вторичной резистентности к лечению иматинибом. Коррекция лечения без учета мутационного статуса может привести к возникновению новых мутаций, назначению неэффективной терапии и прогрессии заболевания. 3. Обнаружение мутации T315I является прямым противопоказанием к назначению ИТК и показанием к трансплантации костного мозга, альтернативным методам лечения. 4. Обнаружение мутации Y253H требует пре кращения терапии иматинибом и назначения даза тиниба.

5. При обнаружении мутации E255K/V терапию иматинибом прекратить, необходимо назначение ИТК 2-го поколения, по данным исследований, предпочтительнее дазатиниба. 6. При наличии мутаций F359V/С рекомендован перевод больных на ИТК 2-го поколения, с учетом исследований, предпочтительнее на дазатиниб. 7. При выявлении мутации Q252H лечение иматинибом необходимо прекратить, показано назначение ИТК 2-го поколения, по данным отдельных исследований, предпочтительнее нилотиниба (в нашем наблюдении нилотиниб был неэффективен). 8. При наличии мутации М244V иматиниб рекомендуется отменить, назначить ИТК 2-го поколения, с учетом исследований in vitro, предпочтительнее дазатиниб. 9. Выявление мутации G250E требует отмены иматиниба и назначения ИТК 2-го поколения, по данным исследований, предпочтительнее дазатиниба. 10. При обнаружении мутации F486S требуется отмена иматиниба и перевод больного на ИТК 2-го поколения, по данным отдельных исследований in vitro, большая чувствительность к нилотинибу (в нашем исследовании наблюдался положительный эффект от дазатиниба). 11. В исследовании мы наблюдали пациента с вторичной резистентностью к иматинибу с del 1086-1157. Эффективным было увеличение дозы иматиниба до 600 мг. 12. При обнаружении мутаций у больных старше 70 лет смену терапии необходимо проводить после оценки степени тяжести сопутствующей патологии. В нашем исследовании при наличии сочетания мутаций М244V и G250E у пациентки 73-летнего возраста эффект достигнут эскалацией дозы иматиниба. Результаты исследования могут быть использованы в качестве сравнительного материала при принятии решений о дальнейшей тактике лечения резистентных к иматинибу больных ХМЛ с клинически значимыми мутациями гена BCR-ABL. Статья подготовлена при информационной поддержке компании «Бристол-Майерс Сквибб»

Л И Т Е Р А Т У Р А 1. Deininger M., O’Brien S.G., Guilhot F. et al. International randomized study of interferon vs STI571 (IRIS) 8-year follow up: sustained survival and low risk for progression or events in patients with newly diagnosed chronic myeloid leukemia in chronic phase (CML-CP) treated with imatinib. Blood 2009;114:1126 (abstr.). 2. Soverini S., Colarossi S., Gnani A. et al. Contribution of ABL kinase domain mutations to imatinib resistance in different subsets of Philadelphia-positive patients:

by the GIMEMA Working Party on Chronic Myeloid Leukemia. Clin Cancer Res 2006;12(24):7374–9. 3. Nicolini F.E., Corm S., Le Q.H. et al. Mutation status and clinical outcome of 89 imatinib mesylate-resistant chronic myelogenous eukemia patients: a retrospective analysis from the French intergroup of CML (Fi(phi)-LMC GROUP). Leukemia 2006;20(6):1061–6. 4. Branford S. Chronic myeloid leukemia: molecular monitoring in clinical practice.

Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2007:376–83. 5. Apperley J.F. Part I: Mechanisms of resistance to imatinib in chronic myeloid leukaemia. Lancet Oncol 2007;8:1018–29. 6. O’Hare T., Eide C.A., Deininger M.W. BCR-ABL kinase domain mutations, drug resistance, and the road to a cure for chronic myeloid leukemia. Blood 2007;110:2242–9. 7. Redaelli S., Piazza R., Rostagno R. et al. Activity of bosutinib, dasatinib, and nilotinib against 18 imatinib-resistant

12. Baccarani M., Pileri S., Steegmann J.-L. et al. Chronic myeloid leukemia: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol 23 (Supplement 7):vii72–vii77, 2012. 13. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.: МедиаСфера, 2002. 312 с. 14. Branford S., Rudzki Z., Walsh S. et al. Detection of BCR-ABL mutations in patients with CML treated with imatinib is virtually always accompanied by clinical resistance, and mutations in the ATP phosphate-binding loop (P-loop) are associated with a poor prognosis. Blood 2003;102:276–83. 15. Челышева Е.Ю., Шухов О.А., Лазарева О.В. др. Мутации киназного домена BCR-ABL при хроническом миелолейкозе. www.genetechnology.ru 16. Минниахметов И.Р., Исламгулов Д.В., Рябчикова Н.Р. и др. Анализ мутации T315I в гене BCR-ABL1 у больных хроническим миелолейкозом из Республики Башкортостан. Известия Самарского научного центра Российской академии наук, 2011. Т. 13, № 5(3). С. 263–267.

17. Ломаиа Е.Г., Романова Е.Г., Горюнова Е.Н. и др. Длительное течение заболевания у больного хроническим миелолейкозом с мутацией T315I гена BCR-ABL. Клиническое наблюдение и обзор литературы. Клин онкогематол 2010;3(4):375–9. 18. Quintas-Cardama A., Ravandi F., Verstovsek S. et al. Outcome of patients with chronic myeloid leukemia with multiple ABL1 kinase domain mutations receiving tyrosine kinase inhibitor therapy. Haematologica 2011;96(6):918–24. 19. Куцев С.И., Вельченко М.В. Значение анализа мутаций гена BCR-ABL в оптимизации таргетной терапии хронического миелолейкоза. Клин онкогематол 2008;1(3):190–9. 20. Corbin A., La Rose P., Stoffregen E. et al. Several BCR-ABL kinase domain mutants associated with imatinib mesylate resistance remain sensitive to imatinib. Blood 2003;101(11):4611–4. 21. Redaelli S., Mologni L., Rostagno R. et al. Three novel patient-derived BCR-ABL mutants show different sensitivity to second and third generation tyrosine kinase inhibitors. Am J Hematol 2012;87(11):E125–8.

’2012

BCR/ABL mutants. J Clin Oncol 2009; 27:469–71. 8. Soverini S., Rosti G., Iacobucci I. et al. Choosing the best second-line tyrosine kinase inhibitor in imatinib-resistant chronic myeloid leukemia patients harboring Bcr-Abl kinase domain mutations: how reliable is the IC50? The Oncologist 2011; 16:868–76. 9. Soverini S., Vitale A., Poerio A. et al. Philadelphia-positive acute lymphoblastic leukemia patients already harbor BCR-ABL kinase domain mutations at low levels at the time of diagnosis. Haematologica 2011 Apr;96(4):552–7. 10. Baccarani M., Cortes J., Pane F. et al. Chronic myeloid leukemia: an update of concepts and management recommendations of European LeukemiaNet. J Clin Oncol 2009;27(35):6041–51. 11. Soverini S., Hochhaus A., Nicolini F.E. et al. BCR-ABL kinase domain mutation analysis in chronic myeloid leukemia patients treated with tyrosine kinase inhibitors: recommendations from an expert panel on behalf of European LeukemiaNet. Blood 2011;18(5):1208–15.

ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ

’2012

ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ

Влияние различных хромосомных аномалий в Ph-позитивных клетках костного мозга на течение хронического миелолейкоза при терапии ингибиторами тирозинкиназ О.Ю. Виноградова, Е.А. Асеева, А.В. Воронцова, А.Г. Туркина, А.Л. Неверова, О.В. Лазарева, Е.Ю. Челышева, Г.А. Гусарова, Т.И. Колошейнова, Л.Ю. Колосова, С.Р. Горячева, М.В. Вахрушева, С.М. Куликов, И.А. Тищенко, Л.В. Дяченко, А.И. Удовиченко, Г.А. Алимова, Е.В. Клеина, Л.А. Гребенюк, М.Л. Коннова, С.Ю. Смирнова, Н.Д. Хорошко, Е.В. Домрачева ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России, Москва Контакты: Ольга Юрьевна Виноградова olgavinz@mail.ru Возникновение дополнительных молекулярных и хромосомных аномалий в Ph-позитивных клетках обычно рассматривается как генетический маркер прогрессии хронического миелолейкоза (ХМЛ). Исследовано 457 больных в разных фазах ХМЛ, получающих терапию ингибиторами тирозинкиназ (ИТК) 1-го и 2-го поколения. В процессе терапии выявлено 50 случаев присутствия дополнительных хромосомных аномалий (ДХА) в Ph+ клоне, их них в хронической фазе ХМЛ – 22 больных (Ме наблюдения с момента диагностики ХМЛ составила 117 мес, Ме терапии иматинибом – 62 мес). У 86 % пациентов в хронической фазе с аномалиями в Ph+-клетках наблюдали цитогенетическую резистентность, при этом их общая 5-летняя выживаемость составила 80 %, что достоверно ниже, чем у пациентов без ДХА (p < 0,005). Результаты терапии ИТК зависели от характера хромосомной аномалии в Ph+-клетках: при дополнительной хромосоме 8 терапия иматинибом эффективна, хотя получение полного цитогенетического ответа (ПЦО) возможно лишь в поздние сроки терапии; при дополнительных транслокациях иматиниб или ИТК 2-го поколения также позволили достигнуть ПЦО; при возникновении дополнительной Ph-хромосомы или амплификации гена BCR/ABL добиться полного подавления Ph-позитивного клона возможно только у трети больных лишь при использовании ИТК 2-го поколения; а присутствие дополнительных аномалий хромосомы 7 и комплексных нарушений кариотипа с вовлечением изохромосомы i(17) (q10) является признаком неблагоприятного прогноза, подразумевающего отсутствие эффекта от терапии ИТК и 1-го, и 2-го поколения. Ключевые слова: хронический миелолейкоз, дополнительные хромосомные аномалии в Ph-позитивных клетках

Influence of different chromosomal abnormalities in Ph-positive bone marrow cells on the chronic myeloid leukemia course during tyrosine kinase inhibitors therapy O.Yu. Vinogradova, E.A. Aseeva, A.V. Vorontsova, A.G. Turkina, A.L. Neverova, O.V. Lazareva, E.Yu. Chelysheva, G.A. Gusarova, T.I. Kolosheinova, L.Yu. Kolosova, S.R. Goryacheva, M.V. Vakhrusheva, S.M. Kulikov, I.A. Tishchenko, L.V. Dyachenko, A.I. Udovichenko, G.A. Alimova, E.V. Kleina, L.A. Grebenyuk, M.L. Konnova, S.Yu. Smirnova, N.D. Khoroshko, E.V. Domracheva Hematological Research Center, Ministry of Health of Russia, Moscow The additional molecular and chromosomal abnormalities (ACA) in Ph-positive cells usually considered as a genetic marker of chronic myeloid leukemia (CML) progression. 457 patients in different CML phases received tyrosine kinase inhibitors (1st and 2nd generation) were studied. During therapy 50 cases with additional chromosomal abnormalities in Ph+ clone (22 of them in chronic CML phase) were revealed (median follow-up from CML diagnosis – 117 months, median imatinib therapy – 62 months). 86 % of patients in chronic phase with Ph+cell abnormalities were cytogenetic resistance, and their 5-years overall survival was 80 % which was significantly lower than in patients without ACA (p < 0.005). The treatment results depend on chromosomal abnormalities detected. In patients with additional chromosome 8 imatinib therapy is effective, although complete cytogenetic response (CCR) is achieved only in the later therapy stages. In patients with additional translocations CCR also achieved with imatinib or 2nd generation TKI. Only a third of patients with additional Ph-chromosome or BCR/ABL amplification achieved complete suppression of Ph+ clone using 2nd generation TKI. The presence of additional chromosome 7 abnormalities and complex karyotype disorders involving isochromosome i(17)(q10) are poor prognostic factors of TKI treatment failures. Key words: chronic myeloid leukemia, additional chromosomal abnormalities, Ph+-cells

Введение Согласно современным представлениям активность аномальной BCR-ABL тирозинкиназы – продукта экспрессии гена BCR/ABL, образующегося в результате транслокации t(9;22)(q34;q11), – инициирует опухолевую трансформацию клеток костного мозга, ведущую к развитию хронического миелолейкоза (ХМЛ). В этом случае последующее возникновение

дополнительных молекулярных и хромосомных аномалий в Ph-позитивных клетках (хорошо известное явление при ХМЛ) с полным основанием рассматривается как генетический маркер прогрессии заболевания. Их появление представляется отражением ге нетической нестабильности в опухолевых клетках с высоким уровнем пролиферации [1]. Этому в немалой степени способствует и аномально высокая

ния пациентов с дополнительными аномалиями в Ph-позитивном клоне иматиниба и других ИТК, специфической мишенью которых является BCR-ABL тирозинкиназа [1]. Ряд исследователей подчеркивают значение появления ДХА в Ph-позитивных клетках как проявление наиболее общего механизма резистентности к лечению ИТК у пациентов, прогрессирующих в ФА и БК [21, 22]. Таким образом, на сегодняшний день у исследователей нет окончательного представления о прогнозе для больных с ДХА в Ph-позитивных клетках, получающих ИТК. Нам представляется необходимым учитывать не только сам факт появления ДХА, но и характер выявляемых аномалий. Поэтому в ходе проведенного нами исследования мы попытались предварительно оценить степень возможного влияния различных по характеру ДХА на течение ХМЛ и эффективность проводимой терапии. Материалы и методы Исследуемая когорта составила 457 больных, наблюдаемых и получающих терапию ИТК в ГНЦ. Цитогенетические исследования, включающие диагностику и мониторинг эффективности получаемой терапии, проведены в лаборатории кариологии ГНЦ. Анализ результатов исследования использован для оценки возможного влияния дополнительных клональных хромосомных аномалий в Ph-позитивных клетках на течение ХМЛ в условиях терапии ИТК. Присутствие транслокации t(9;22)(q34;q11), а также других аномалий кариотипа определяли при стандартном цитогенетическом исследовании клеток костного мозга, основанном на методе G-дифференциального окрашивания хромосом. Проводился анализ не менее 20 метафазных пластинок в каждом исследуемом образце костного мозга. При отсутствии или недостаточном количестве пригодных для анализа метафаз, а также при проведении необходимых дополнительных исследований применяли метод флуоресцентной гибридизации in situ с использованием соответствующих ДНК-зондов фирмы Abbott Mol. При исследовании проводился анализ не менее 200 интерфазных ядер. Цитогенетический мониторинг с целью оценки эффективности терапии ИТК проводили в сроки, определяемые рекомендациями European LeukemiaNet для ХМЛ [23]. Результаты исследования и их обсуждение I. Общая характеристика пациентов с ДХА в Ph-позитивных клетках и результаты их терапии Для предварительной оценки возможного влияния дополнительных клональных хромосомных аномалий в Ph+-клетках на течение ХМЛ в условиях применения препаратов с антитирозинкиназной активностью были использованы результаты ретроспективного анализа выборки из 457 пациентов во всех фазах заболевания ХМЛ, наблюдаемых в ГНЦ.

’2012

т ирозинкиназная активность патологического белка BCR-ABL, которая приводит к усилению процессов образования свободных радикалов кислорода, по вреждающих ДНК, при одновременной дестабилизации репарационных систем, ответственных за восстановление возникающих двойных разрывов нити ДНК, а также к ингибированию апоптоза [2–10]. В клинической практике до начала лечения α-интерферонами и ингибиторами тирозинкиназ (ИТК) появление дополнительных хромосомных аномалий (ДХА) однозначно ассоциировали с опухолевой прогрессией, переходом заболевания в терминальную стадию и быстрой гибелью пациентов. У 85 % больных, развивших бластный криз (БК) ХМЛ, и у трети пациентов в фазе акселерации (ФА) в Ph-позитивных клетках обнаруживали различные клональные ДХА [1, 11, 12]. Использование α-интерферонов и ИТК для лечения ХМЛ позволило добиться избирательного подавления Ph-позитивного клона, вплоть до его полного исчезновения. Однако у больных ХМЛ, получавших α-интер ферон, появление ДХА в Ph-позитивных клетках описывалось как этап, предшествующий наступлению ФА ХМЛ, и прогноз лечения по-прежнему оставался крайне неблагоприятным [11]. В некоторых исследованиях, однако, было продемонстрировано, что в отсутствие других признаков акселерации наличие ДХА не влияет на результаты аллогенной трансплантации костного мозга [13]. После появления иматиниба прогностическое значение появления ДХА в Ph-позитивных клетках явно нуждалось в пересмотре. В целом прогноз оказался более оптимистичным. В ряде крупных исследований было показано, что результаты лечения иматинибом пациентов без ДХА и с ДХА в отсутствие других признаков акселерации вполне сравнимы [14]. Согласно данным Гематологического научного центра (ГНЦ), основанным на 4-летнем опыте применения иматиниба у больных в ФА ХМЛ, достоверных различий в частоте получения и характеристике цитогенетиче ского ответа (ЦО) на терапию в группах больных, имевших и не имевших ДХА до начала терапии иматинибом, не получено. Их 4-летняя выживаемость составила 56 % и 62 % (р > 0,05) соответственно [15, 16]. К настоящему времени возникновение ДХА перестали расценивать как однозначный признак наступления ФА. Тем не менее, факт появления ДХА продолжают выделять в разряд неблагоприятных (настораживающих) факторов при лечении ИТК [17–20]. В самом деле, результатом появления дополнительных генетических аномалий является образование потенциально более злокачественного клеточного фенотипа. Пролиферация и выживаемость такого клеточного клона уже зависит не только от присутствия в клетках BCRABL тирозинкиназы. Этот момент имеет прямое отношение к эффективности использования для лече-

ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ

’2012

ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ Таблица 2. Выявление ДХА в зависимости от этапа терапии и фазы ХМЛ

Таблица 1. Распределение больных по фазам ХМЛ и по полу Число больных (% больных с ДХА от общего числа)

Число мужчин : женщин

358/78/21/457

220 : 237

ХФ

30 (9 %)

ФА

Фаза

До начала терапии, n

–

19 : 11

До терапии иматинибом (интерферон-α/миелосан/ гидреа), n

11 (14 %)

10 : 1

В процессе терапии иматинибом, n

БК

9 (43 %)

5:4

3+3

–

Всего

50 (11 %)

34 : 16

После лечения иматинибом, при ИТК 2 (нилотиниб, дазатиниб), n

Общая выборка больных ХМЛ ХФ/ФА/БК/всего

Больные с ДХА в Ph+-клетках

Общее число ХФ ФА БК больных

Период лечения

В данной группе больных выявлено 50 случаев присутствия ДХА в Ph+ клоне. Распределение пациентов по полу и фазам ХМЛ представлено в табл. 1. Среди больных с ДХА в Ph+ клоне – 34 мужчины и 16 женщин в возрасте от 16 до 77 лет в момент выявления ДХА. Срок наблюдения этих пациентов с момента диагностики ХМЛ – от 19 до 255 мес. В образовавшейся группе пациентов с ДХА в Ph+-клетках обращает на себя внимание нарушение гендерного соотношения. В то время как в общей группе из 457 наблюдаемых больных примерно равное соотношение мужчин и женщин с небольшим перевесом в сторону последних, среди пациентов с ДХА в Ph+-клетках наблюдается значительное преимущест во мужчин, в основном среди больных в ФА и хронической фазе (ХФ). Обнаруженное нарушение гендерного соотношения наблюдается и при отдельном рассмотрении наиболее распространенных случаев с удвоением числа копий гена BCR-ABL и дополнительной хромосомой 8 в Ph+ клоне. Этот факт необычен и, несомненно, требует дальнейшего изучения. Основным периодом выявления ДХА в Ph+-клетках пациентов является ХФ ХМЛ – наиболее длительный этап лечения иматинибом. При этом частота появления ДХА закономерно нарастает в более продвинутых фазах заболевания. В наибольшей степени ДХА в Ph+-клетках характерны, как и следовало ожидать, для пациентов в БК ХМЛ (43 % общего числа пациентов в этой фазе). Однако следует отметить, что этот процент существенно ниже частоты выявления ДХА у пациентов в БК, наблюдавшейся до начала эпохи терапии ИТК и составлявшей 85 %. Это различие, повидимому, связано со сдерживанием прогрессии ХМЛ под воздействием ИТК, несмотря на появление ДХА. Зависимость появления ДХА в Ph+-клетках от этапа проводимой терапии с учетом фазы заболевания представлена в табл. 2. Следует отметить, что у 11 пациентов ДХА в Ph+-клетках появились до начала терапии иматинибом, причем у 2 больных они были обнаружены в ранней ХФ до начала какой-либо терапии, а у 9 пациентов – на фоне терапии, предшествующей применению ИТК.

У 6 больных ДХА были впервые выявлены лишь на фоне использования для лечения ХМЛ ИТК 2-го поколения (ИТК 2). Однако у большинства пациентов ДХА в Ph+клетках были обнаружены в период приема иматиниба, причем 67 % пациентов находились в ХФ ХМЛ (n = 22). Медиана их наблюдения с момента диагностики ХМЛ составила 117 мес, медиана терапии иматинибом – 62 мес. Именно в этой группе был статистически возможен и проведен анализ частоты достижения ЦО и показателей выживаемости у пациентов с ДХА. Результаты анализа частоты достижения ЦО у больных в ХФ ХМЛ с ДХА в Ph+-клетках представлены на рис. 1. Согласно полученным данным полный ЦО (ПЦО) в процессе терапии иматинибом был достигнут лишь у 5 (24 %) пациентов с ДХА в Ph+-клетках, что достоверно ниже (p < 0,05) частоты достижения ПЦО у больных в ХФ ХМЛ без ДХА (56 %). Причем у всех 22 больных (14 – с дополнительной Ph) иматиниб (доза > 400 мг – 60 % больных) поздний ПЦО

первичная цитогенетическая резистентность 17 (77 %) больных

5 больных

12 больных

потеря ПЦО 2 больных (1 – с дополнительной Ph)

5 больных не на ИТК 2, из них у 1 – прогрессия до БК

14 больных ИТК 2 (11 – с дополнительной Ph) Рис. 1. Характеристика ответа на терапию у больных в ХФ ХМЛ с ДХА в Ph-положительных клетках, резистентных к терапии иматинибом

II. Особенности течения ХМЛ в зависимости от типа наблюдаемой ДХА в Ph+-клетках Спектр наблюдаемых хромосомных аномалий в Ph-позитивных клетках в анализируемой выборке 457 пациентов представлен на рис. 3.

Вероятность выживания

1– 0,8 – Выявление ДХА у больных в ХФ во время терапии иматинибом

0,6 – 0,4 – 0,2 –

время жизни

0– 0

годы 6

Рис. 2. Общая выживаемость у больных в ХФ ХМЛ (n = 22) от момента обнаружения ДХА в Ph-позитивных клетках

2Ph 34 %

inv(9) 8%

5 пациентов ПЦО достигнут в поздние (через год и позднее от начала терапии иматинибом) сроки, а у 2 из них он был потерян (вторичная цитогенетическая резистентность). В 77 % случаев (n = 17) у пациентов с ДХА в Ph+-клетках выявлена первичная цитогенетическая резистентность к терапии иматинибом. Таким образом, в целом цитогенетическую резистентность наблюдали у 86 % больных с ДХА в Ph+-клетках. В случаях, когда дополнительная хромосомная аномалия была представлена удвоением Ph-хромосомы, цитогенетическая резистентность к терапии иматинибом развивалась в 100 % случаев. У пациентов с другими дополнительными аномалиями в Ph+-клетках цитогенетическая резистентность развивалась в 50 % случаев. Проведенный анализ общей и 5-летней выживаемости пациентов с ДХА в Ph+-клетках представлен на рис. 2. У больных в ХФ ХМЛ после обнаружения ДХА общая 5-летняя выживаемость составила 80 %, что достоверно ниже, чем у пациентов в ХФ без ДХА (p < 0,005). С помощью модели Кокса с переменным по времени фактором риска была проанализирована зависимость риска смерти от возникновения ДХА. Появление ДХА рассматривалось как появляющийся неблагоприятный фактор, исходя из предположения, что риск летального исхода до и после появления ДХА различен. Было показано, что риск смерти в единицу времени увеличивается с появлением ДХА более чем в 16 раз. Однако, несмотря на теоретические расчеты, появление ДХА не сопровождалось быстрой прогрессией ХМЛ. Таким образом, появление ДХА в эру лечения ХМЛ ИТК не является фактором быстрого развития БК и гибели пациентов.

’2012

ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ

Комплексные перестройки 28 %

Дополнительные транслокации 8 %

i17 6%

del 7 4%

Трисомия 8 12 %

Рис. 3. Частота выявления различных ДХА в Ph-положительных клетках у больных ХМЛ (n = 50)

В данном исследовании можно выделить 2 наиболее часто встречающихся варианта ДХА: удвоение Ph-хромосомы и появление дополнительной хромосомы 8. Удвоение Ph-хромосомы наблюдается у 58 % пациентов с ДХА в виде одиночной аномалии или в составе комплексного кариотипа. Дополнительная хромосома 8 зарегистрирована у 24 % пациентов с ДХА либо как одиночная аномалия, либо в составе комплексного кариотипа. Остальные аномалии можно отнести к разряду редких событий. Группу больных с выявленной inv(9)(p13;q22) в данной статье не рассматривали, так как она относится к конституционным аномалиям кариотипа. 1. Часто встречающиеся варианты ДХА. Удвоение Ph-хромосомы Удвоение Ph-хромосомы в опухолевом клоне ранее всегда связывали с прогрессией заболевания. Появление дополнительной Ph-хромосомы и в настоящее время может представлять немалый прогностический интерес, поскольку приводит к увеличению числа копий гена BCR/ABL – основной молекулярной мишени для антитирозинкиназных препаратов, применяемых при лечении ХМЛ. Среди наших пациентов с ДХА в Ph+-клетках чаще всего выявляли именно эту аномалию. Она обнаружена в 34 % случаев наблюдения ДХА. Надо отметить, что у 17 больных дополнительная Ph-хромосома встречалась изолированно, а у 12 пациентов – в сочетании с другими хромосомными ано малиями в составе комплексных кариотипов. Так, в 8 случаях она наблюдалась в сочетании с дополнительной хромосомой 8, в 2 случаях – в сочетании с делецией q-плеча или моносомией хромосомы 7 и в 2 случаях – с другими хромосомными перестройками у пациентов в ФА и БК ХМЛ. Началу терапии иматинибом предшествовало длительное (до выявления дополнительной Ph-хромосомы Ме составила 5 лет) лечение (гидреа, бусульфан, 6-меркаптопурин, полихимиотерапия, интерферон).

’2012

ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ

биться получения БЦО или ПЦО у большинства больных, несмотря на увеличение дозы препарата. В связи с резистентностью к терапии иматинибом 14 больных переведены на терапию ИТК 2 (дазатиниб – 10 пациентов, нилотиниб – 3 пациента, бозутиниб – 1 больной). Перевод больных в ХФ на терапию ИТК 2 оказался перспективным: у 79 % (n = 11) больных достигнут ПГО, у 36 % – БЦО (n = 5), у 29 % – ПЦО (n = 4). Только у 3 больных наблюдали прогрессию заболевания до ФА, у 2 из них впоследствии выявлена мутация Т315I в киназном домене, чем, вероятно, обусловлена неудача проведенной терапии. Наибольший интерес вызывает динамика Ph+ кло нов c удвоением Ph-хромосомы при применении ИТК первого и второго поколений. Например, у больного С.П.И. дополнительная Ph-хромосома была выявлена еще при терапии интерфероном, потом ее находили во время терапии иматинибом в ХФ заболевания и дазатинибом в ФА, далее она была зарегистрирована за 8 мес до смерти больного в результате прогрессии ХМЛ. Размер клона при этом колебался от 20 до 100 %. На рис. 5 представлена динамика ЦО у 4 больных (А.С.А., М.А.Н., С.В.В., Г.В.П.), получавших ИТК 1-й и 2-й линии. Во время приема иматиниба у всех был выявлен клон клеток с удвоением Ph-хромосомы, размер которого варьировал от 10 до 100 % клеток. Клон выявлялся у некоторых больных постоянно, как, например, у больного Г.В.П. в течение 72 мес (размер клона варьировал в пределах 25–100) или мог персистировать, как у больного А.С.А., то появля ясь, то исчезая. После назначения ИТК 2-й линии (нилотиниб, дазатиниб, бозутиниб) во всех случаях удалось добиться подавления клона с удвоением Ph-хромосомы, а у больных Г.В.П. и М.А.Н. полного подавления Ph-позитивного клона и достижения

16 больных иматиниб 3 больных непереносимость дозы > 400 мг

13 больных повышение дозы до 60–800 мг

2 больных ЧЦО-1 ПЦО-1

11 больных резистентны к увеличению дозы

14 больных ИТК 2

Рис. 4. Выбор терапии у больных с удвоением Ph-хромосомы в ХФ, резистентных к терапии иматинибом

К моменту анализа данных 15 из 29 больных умерли, что составило 52 %. В их число вошли все 8 (100 %) пациентов в фазе БК, 4 (24 %) пациента в ХФ и 3 (60 %) пациента в ФА. Особый интерес представляет анализ течения заболевания у больных в ХФ ХМЛ с удвоением Ph-хромосомы, достижения ими ответа на лечение (частота получения большого ЦО (БЦО) и ПЦО) и стабильность полученного ЦО. На рис. 4 представлены результаты лечения пациентов в ХФ ХМЛ с дополнительной Ph-хромосомой ИТК. У 16 больных, находившихся в ХФ, продолжительность терапии иматинибом до выявления дополнительной Ph-хромосомы различна – от 6 мес до 5,5 лет, длительность наблюдения за указанными больными составляет от 26 до 176 мес. У всех 16 больных, получающих терапию иматинибом, достигнут полный гематологический ответ (ПГО) в срок от 3 до 6 мес. При возникновении дополнительной Ph-хромосомы во время лечения иматинибом не удалось доА.С.А. % иматиниб

М.А.Н. % иматиниб

бозутиниб

100

10 0

С.В.В. 100

иматиниб

Г.В.П.

нилотиниб

100

10 0

дазатиниб

100

иматиниб

0 0

мес 90

-Ph

дазатиниб

-2Ph

10 0

0 мес 96

Рис. 5. Длительность и стабильность ЦО у больных ХМЛ в ХФ, имеющих удвоение Ph-хромосомы, при лечении ИТК 1-го и 2-го поколения

Дополнительная хромосома 8 в Ph+-клетках Появление дополнительной хромосомы 8 в Ph+клетках считалось неблагоприятным признаком, свидетельствующим о быстрой прогрессии заболевания [11, 24, 25]. Среди наших больных трисомия хромосомы 8 в Ph- позитивных клетках обнаружена у 18 человек. Вновь обращает на себя внимание соотношение мужчин и женщин в этой группе: 14 и 4 соответственно. У 6 пациентов дополнительная хромосома 8 выявлена как изолированная аномалия в Ph+-клетках. У 14 больных она идентифицирована в составе комплексных нарушений кариотипа: в сочетании с удвоением Ph-хромосомы (n = 5), другими хромосомными нарушениями (n = 9). На момент выявления дополнительной хромосомы 8 в ХФ ХМЛ находились 6 пациентов, в ФА ХМЛ – 7 пациентов, в БК ХМЛ – 5 пациентов. У 4 пациентов дополнительная хромосома 8 впервые обнаружена до начала лечения иматинибом, у большинства пациентов (n = 13) – в период лечения иматинибом, у 1 пациента – после перехода на терапию ИТК 2-й линии. Все пациенты получали терапию иматинибом (рис. 6). Однако 12 больным (в ФА и БК) иматиниб изначально был назначен в повышенных дозах 600– 800 мг. Из 6 пациентов в ХФ ХМЛ, начавших прием препарата в стандартной дозе 400 мг, 3 больным доза иматиниба также была увеличена до 600 мг в процессе терапии (см. рис. 6). При применении высокой дозы препарата у 11 (73 %) больных удалось достичь БЦО или ПЦО. Следует отметить, что ПЦО достигнут у 2 па циентов, находящихся в ФА ХМЛ. Характерной особенностью лечения иматинибом больных в ХФ с дополнительной хромосомой 8 можно считать более длительные сроки достижения ЦО (БЦО был получен к 12–30 месяцам, ПЦО – к 18–30 месяцам), который, однако, был стабильным. Интересно,

6 больных

3 больных

ПЦО

(иматиниб 400 мг)

3 больных резистентность к дозе иматиниб 400 мг – повышение дозы до 600 ПЦО

Рис. 6. Результаты терапии иматинибом у больных в ХФ ХМЛ с трисомией хромосомы 8

что после ухода Ph-позитивного клона у 3 больных трисомия хромосомы 8 регистрировалась в Ph-негативном клоне клеток. Наоборот, у больных в ФА, несмотря на быстрое достижение БЦО (к 6 месяцам) и ПЦО (к 12 месяцам), ответ не был стабильным. Четверо таких больных были переведены на терапию ИТК 2-й линии. Таким образом, все пациенты в ХФ ХМЛ с трисомией хромосомы 8 живы, у всех достигнут ПЦО, но сроки его достижения продолжительные и не соответствуют критериям оптимального ответа на терапию ИТК [23]. 2. Редкие варианты ДХА в Ph+-клетках. Аномалии хромосомы 7 Моносомия 7 обычно встречается у больных острым миелобластным и бифенотипическим острым лейкозом, при миелодисплазиях. При ХМЛ, по данным литературы, моносомия 7 и del(7q) в Ph-позитивных клетках выявляются, как правило, в период БК [26]. В данном исследовании среди больных с ДХА в Ph-позитивных клетках в 7 случаях были обнаружены различные аномалии с участием хромосомы 7. Кариотипы пациентов в момент выявления дополнительной аномалии приведены в табл. 3. Таблица 3. Кариотипы больных с аномалиями хромосомы 7 в Ph-позитивных клетках ФИО

Кариотип

Ш.Т.В.

46,ХХ, ider(7q), inv(7), del(5q31), t(9;22)[7] / 46,ХХ, t(9;22)[18]

В.Н.В.

46,ХХ, t(9;22), del(7)(p13)[7] / 46,ХХ, t(9;22)[13]

Б.Ю.А.

46,ХY, del(7)(q10), t(9;22) [3] / 46,ХY, t(9;22)[22]

Г.Е.С.

46,ХХ, t(9;22), -7, +8[7] / 46,ХХ, t(9;22)[25]

С.С.И.

46,ХХ, t(9;22) der(7) [2] / 46,ХХ, t(9;22) [17]

Ф.Г.Г.

46,ХY, del(7)(q22) [12] / 46,ХY, t(9;22) [10] / 46,ХY[2]

О.С.В.

51,ХXY +9, t(9;22), +13,+19, +21[5] / 46,ХY, t(9;22) del(7)(p12)[3] / 47,ХY, t(9;22), der(22) t(9;22) [1] / 46,ХY, t(9;22)[12]

Среди аномалий хромосомы 7 наблюдались делеции длинных и коротких плечей, моносомия хромосомы 7, ider(7q), inv(7). В 3 из анализируемых случаев короткое плечо (p) хромосомы 7 было либо делетировано (пациенты В.Н.В. и О.С.В.), либо полностью отсутствовало (пациент Ш.Т.В.). Известно, что на отсутствующем участке плеча (р12 – р13) расположен ген EGFR, относящийся к генам тирозинкиназ рецепторного типа, который играет важную роль в клеточной пролиферации, дифференцировке и апоптозе. У 3 больных наблюдались делеции длинного (q) плеча. Обращает на себя внимание тот факт, что у больного Ф.Г.Г. del(7)(q22) изначально была обнару-

’2012

ПЦО к 3 и 40 месяцам терапии ИТК 2-й линии. У 2 других больных (А.С.А. и С.В.В.) добиться подавления Ph-позитивного клона к 30 месяцам терапии ИТК 2-й линии не удалось. Таким образом, переход на терапию ИТК 2-й линии оказался эффективным для достижения ЦО у пациентов с удвоением Ph-хромосомы. Различия в поведении клонов с дополнительной Ph-хромосомой не повлияли на успешность терапии ИТК.

ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ

ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ Таблица 4. Характеристика больных ХМЛ с аномалиями хромосомы 7 (n = 7)

ФИО

На момент выявления ДХА

Пол

’2012

Фаза

Терапия

Возраст, лет

Длительность терапии до ДХА, мес

Длительность заболевания, мес

Статус

Ш.Т.В.

ХФ

миелосан

умер

В.Н.В.

ХФ

иматиниб

умер

Б.Ю.А.

ХФ

иматиниб

жив*

Г.Е.С.

ФА

интерферон-α

умер

С.С.И.

ФА

интерферон-α

умер

Ф.Г.Г.

ФА

иматиниб

умер

О.С.В.

БК

иматиниб

умер

* – выявлена мутация гена BCR/ABL – T315I.

жена в Ph-негативных клетках, однако через 12 мес у него был выявлен клон с del(7)(q22) и удвоением Phхромосомы, а еще через 3 мес констатирована смерть от прогрессии заболевания. Все больные получали иматиниб. У 3 пациентов аномалия хромосомы 7 была выявлена до начала терапии иматинибом, в то время как у остальных 4 больных – в процессе проводимой терапии иматинибом (табл. 4). Только у 1 больной в этой группе удалось получить БЦО и ПЦО, который сохранялся 18 мес. Двое больных переведены в связи со вторичной гематологиче ской резистентностью на терапию ИТК 2 (дазатиниб – 1, нилотиниб и дазатиниб – 1), однако и у них не удалось достичь ЦО. Из 7 больных с аномалиями хромосомы 7 шестеро умерли от прогрессии заболевания. После выявления ДХА длительность заболевания составила от 1 до 40 мес, с медианой 2 года. У единственного оставшегося пациента отмечается гематологическая резистентность к терапии ИТК (иматинибу, нилотинибу и дазатинибу), что, вероятно, связано с присутствием у него мутации T315I в гене BCR/ABL (см. табл. 4). Этот пациент также получал терапию ингибитором аурора-киназы без длительного положительного эффекта, в течение 2 последних лет проводится терапия гидреа, поддерживающая сохранение гематологической компенсации.

В целом создается впечатление, что аномалии хромосомы 7, как изолированные, так и в составе комплексных нарушений кариотипа, являются весьма неблагоприятным признаком. Изохромосома 17 Изохромосома 17 состоит из зеркально отображенных копий q-плеча хромосомы 17 (i(17)(q10)) с потерей р-плеча, на котором расположен ген р53. Продукт его экспрессии – белок р53 – регулирует транскрипцию и активирует экспрессию генов, ответственных за остановку клеточного цикла и индукцию апоптотиче ской гибели клеток [27]. Характерной особенностью больных с перестройками хромосомы 17 в период до применения ИТК являлась низкая частота достижения ремиссий и их непродолжительность [28]. Следует отметить, что в данном исследовании изохромосома 17 впервые выявлена при терапии мие лосаном – у 1 пациента, интерфероном в сочетании с миелосаном – у другого, при лечении иматинибом – у третьего (табл. 5). При назначении терапии ИТК все пациенты принимали иматиниб в дозе 400–600 мг в сутки. Больной А.С.В. после диагностики заболевания получал терапию миелосаном и интерфероном в течение 10 лет. После чего при цитогенетическом исследо-

Таблица 5. Характеристика больных ХМЛ с изохромосомой i(17)(q10) в Ph-положительном клоне (n = 3) На момент выявления ДХА ФИО

ДХА

Пол Фаза

Терапия

Возраст, лет

Длительность терапии до ДХА, мес

Длительность заболевания, мес

Статус

А.С.В.

i(17)

ХФ

интерферон + миелосан

125

214

жив

Т.Н.А.

i(17)

ФА

миелосан

108

115

умер

Б.А.И.

8+, i(17), Рh+

БК

иматиниб

умер

и комплексным кариотипом с присутствием изохромосомы i(17)(q10) имеют неблагоприятный прогноз, что согласуется с наблюдениями других исследователей [1].

вании была выявлена i(17)(q10) во всех Ph-позитивных клетках. Далее ему в течение 9 лет проводилась терапия иматинибом, в результате которой, на поздних сроках терапии, был достигнут ЦО (БЦО – к 4 годам, ПЦО – к 5 годам проведения терапии ИТК). У пациента Б.А.И. изохромосома 17 выявлена в момент БК наряду с другими неблагоприятными нарушениями кариотипа, включающими удвоение Ph-хромосомы. Пациент прожил только 7 мес. У больной Т.Н.А. ХМЛ был диагностирован в ХФ. Терапия была начата с 2 курсов полихимиотерапии с последующим длительным приемом миелосана. Через 7 лет заболевания была диагностирована ФА. При цитогенетическом исследовании выявлена дополнительная хромосомная перестройка – изохромосома i(17)(q10). Далее пациентка получала иматиниб в дозе 600 мг. Через 1,5 года терапии иматинибом у нее был обнаружен комплексный кариотип с присутствием i(17) в 78 % Ph-позитивных клеток. Через 3 мес диагностирован БК ХМЛ и еще через 3 мес наступила смерть от прогрессии заболевания. Динамика изменений карио типа в процессе терапии приведена в табл. 6. Следует отметить, что у пациентки изначально была выявлена сложная транслокация с участием не только стандартных локусов 9q34 и 22q11, но и хромосомы 15. В дальнейшем на фоне прогрессии заболевания наблюдалось развитие множественных нарушений и образование нескольких опухолевых клонов, что характерно для опухолевой прогрессии. В целом анализ этой небольшой группы пациентов показал, что больные в продвинутых фазах (ФА и БК)

ДХА в виде транслокаций В исследуемой группе 4 пациента имели дополнительные клональные транслокации в Ph-позитивных клетках. Все больные в момент их выявления были в ХФ ХМЛ. Общая характеристика пациентов с дополнительными клональными транслокациями приведена в табл. 7. У больной О.А.Ч. при цитогенетическом исследовании в момент первичной диагностики обнаружили дополнительную транслокацию t(5;15) во всех исследованных клетках костного мозга. Кариотип больной: 46,ХX,t(9;22)(q34;q11),t(5;15)(q31;q21) [16]. Проводили терапию иматинибом в дозе 400 мг/сутки, которая в дальнейшем была снижена в связи с негематологической токсичностью II–III степени. Через 6 мес терапии иматинибом был получен ПЦО, а к 12 месяцам терапии – полный молекулярный ответ (МО), который сохранялся 1,5 года. Через 2 года терапии иматинибом в связи с токсичностью был сделан перерыв в терапии длительностью 5 мес, что привело к потере ПЦО и МО. При цитогенетическом исследовании Ph-хромосома была выявлена в 10 % метафаз, дополнительная транслокация не определялась. При возобновлении терапии иматинибом в дозе 400 мг/сутки восстановлен ПЦО и МО, которые сохраняются ко времени анализа данных. Таким образом, выявленная до начала лечения иматинибом дополнительная транс-

Таблица 6. Динамика изменений кариотипа у больной Т.Н.А., выявленных в процессе терапии Терапия

Длительность терапии, мес

Кариотип

Ph-хромосома, %

До начала терапии

–

46XХ,t(9;15;22) (q34;q21;q11) [20]

100

Миелосан

46XХ,t(9;15;22) (q34;q21;q11) [19]/46XХ, t(9;15;22) (q34;q21;q11), i(17)(q10)[3]

100

Иматиниб

37-48 XХ, +8, +8, der(9), t(9;15;22) (q34;q21;q11), i(17)(q10) [10]/ 41-46 XХ, +8,-10, der(9) t(9;15;22)(q34;q21;q11)[ 3] / 48, XХ, +8, +8, der(9), t(9;15;22) (q34;q21;q11), -13, i(17)(q10)[1] / 46XХ [4]

Таблица 7. Характеристика больных ХМЛ с дополнительными транслокациями (n = 4)

ФИО

Пол

Дополнительные транслокации

’2012

ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ

На момент выявления дополнительных транслокаций Возраст, лет

Терапия

Длительность терапии, мес

Другие перестройки

Статус

О.А.Ч.

t(5;15)(q31;q21)

нет

жив

Е.А.Х.

t(1;7)(q10;p10)

нилотиниб

dup(3p)

жив

М.Г.Л.

t(1;15)(q21;q22)

иматиниб

нет

жив

А.П.Ю.

t(5;16)(q31;p13)

иматиниб

del(5)(p13)

умер

’2012

ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ

локация t(5;15) в течение последующих 5 лет ни разу не определялась, и не повлияла на сроки достижения ПЦО и ПМО. Пациентка Е.А.Х. в течение 1 года получала терапию иматинибом в дозе 400–800 мг, однако после развития вторичной гематологической резистентности больной был назначен ИТК 2-й линии – нилотиниб, в дозе 800 мг. Через 12 месяцев терапии нилотинибом при цитогенетическом исследовании в кариотипе выявлены дополнительные аномалии: транслокация t(1;7)(q10; p10) и dup(3p), которые сохранялись в течение 9 месяцев (табл. 8). При контрольном цитогенетическом анализе через 30 месяцев терапии у больной был зарегистрирован нормальный кариотип, т. е. получен ПЦО, а к 33 месяцам – полный МО. Транслокация t(1;7) встречается у больных острыми, чаще индуцированными, лейкозами, при миелодиспластическом синдроме и является неблагоприятным прогностическим признаком [29]. В случае с больной Е.А.Х. дополнительная транслокация t(1,7) не оказала неблагоприятного влияния, хотя необходимо отметить, что больная была резистентна к терапии иматинибом. Стабильный ПЦО получен при терапии нилотинибом поздно (30 мес терапии) и со храняется пока только 6 мес. Больной М.Г.Л. получал химиотерапию и терапию интерфероном-α, далее переведен на терапию иматинибом в дозе 300–400 мг в сутки. Через 4,5 года терапии иматинибом в Ph-позитивных клетках выявлена ДХА – транслокация t(1;15)(q21;q22), которая определялась на протяжении 1 года (табл. 9). В связи с вторичной гематологической резистентностью к терапии иматинибом, больной переведен на лечение дазатини-

бом в дозе 100 мг в сутки. Через 6 мес терапии был достигнут БЦО, а через 12 мес – ПЦО и большой МО. Таким образом, у данного пациента удалось получить ЦО и МО при переходе на терапию ИТК 2. Присут ствие дополнительной транслокации t(1;15) не оказало неблагоприятного воздействия на течение за болевания. У больного А.П.Ю. после работ по ликвидации аварии на Чернобыльской АЭС был установлен диагноз острая лучевая болезнь III степени, а через 21 год выявлен ХМЛ. На момент диагностики в кариотипе, помимо Ph-хромосомы, определялась del(5) (p13). Терапия иматинибом в дозе 400–600 мг в сутки в течение 11 мес позволила получить ПГО, который потом был утерян. При цитогенетическом иссле довании во всех клетках, помимо Ph-хромосомы, определялась дополнительная транслокация t(5;16) (q31;p13). Динамика изменений в кариотипе пациента представлена в табл. 10. В связи с вторичной гематологической резистентностью к иматинибу больной был переведен на лечение нилотинибом. В результате был достигнут только ПГО, однако через 6 мес ответ был вновь утерян и констатирована ФА ХМЛ. Пациенту был назначен дазатиниб в дозе 100–140 мг в сутки, который позволил добиться лишь гематологической компенсации. Через 4 мес терапии дазатинибом при цитогенетическом исследовании была обнаружена Ph-хромосома в 90 % клеток костного мозга без дополнительных аномалий. Однако в 20 % Ph+-клеток методом FISH выявлена амплификация гена BCR/ABL. Таким образом, в данном клиническом случае наблюдалась гематологиче ская резистентность к терапии тремя ИТК: к имати-

Таблица 8. Динамика изменений кариотипа у больной Е.А.Х. Терапия

Продолжительность, мес

Кариотип

Phхромосома, %

Дополнительные хромосомные перестройки

нилотиниб

46XХ,t(1;7)(q10;p10),dup(3p),t(9;22)(q34;q11), [18]/ 46XХ[2]

t(1,7), dup(3p)

нилотиниб

46XХ,t(1;7)(q10;p10),dup(3),t(9;22)(q34;q11) [11]/ 46XХ[9]

t(1,7), dup(3p)

нилотиниб

46XХ,t(1;7)(q10;p10),dup(3),t(9;22)(q34;q11) [3]/ 46XХ[17]

t(1,7), dup(3p)

нилотиниб

46XХ[20]

нет

Таблица 9. Динамика изменений кариотипа у больного М.Г.Л. Терапия

Продолжительность, мес

Кариотип

Ph-хромосома, %

Дополнительные транслокации

иматиниб

46XY,t(1;15)(q21;q22),t(9;22) (q34;q11) [18]/ 46XY [2]

t(1;15)

иматиниб

46XY,t(1;15)(q21;q22),t(9;22) (q34;q11)[20]

t(1;15)

иматиниб

46XY,t(1;15)(q21;q22),t(9;22) (q34;q11)[20]

t(1;15)

дазатиниб

46XY,t(9;22)(q34;q11)[6]/ 46XY [14]

нет

дазатиниб

46XY [20]

нет

Таблица 10. Динамика изменений кариотипа у больного А.П.Ю. Длительность ХМЛ, мес

Кариотип

Ph-хромосома, %

Дополнительные хромосомные перестройки

начало заболевания

46XY, t(9;22)(q34;q11), del (5)(p13) [16]

100

del (5p)

иматиниб

46XY, t(9;22)(q34;q11), t(5;16)(q31;p13) [20]

100

t(5;16)

дазатиниб

46XY, t(9;22)(q34;q11) [18]/46XY [2]

Терапия

’2012

ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ

нибу, нилотинибу и дазатинибу. Смерть больного в результате прогрессии заболевания наступила через 2 года с момента установления диагноза ХМЛ. Следует отметить, что в данном случае имел место случай вторичного индуцированного лейкоза, возникшего через 20 лет после воздействия ионизирующей радиации. У пациента была выявлена дополнительная хромосомная перестройка на момент диагностики ХМЛ, что могло свидетельствовать о развитии нестабильности генома. Это единственный из 4 наблюдавшихся пациентов, у которого последовательная терапия тремя различными ИТК на протяжении 2 лет не позволила получить ЦО и закончилась прогрессией заболевания и летальным исходом. Таким образом, дополнительные транслокации у 4 исследованных больных выявлялись в разное время, как в процессе применения иматиниба или других ИТК, так и до начала лечения ИТК. В 3 из 4 случаев получен ПЦО, который достигнут в различные сроки (6–30 мес) при терапии различными ИТК (иматиниб, дазатиниб, нилотиниб). Заключение До начала терапии ИТК появление ДХА в Ph-позитивных клетках костного мозга означало быструю гибель больных от прогрессии заболевания. Результаты проведенного нами анализа свидетельствуют, что в условиях применения ИТК 62 % таких больных продолжают жить, несмотря на неблагоприятный прогноз и неудачи терапии у большинства из них. Появление ДХА зарегистрировано не только до начала терапии иматинибом, но и в период лечения, а в ряде случаев при использовании ИТК 2-й линии, однако эффективность достижения ЦО не зависит ни от времени возникновения ДХА, ни от динамики изменений Ph-позитивного клона с ДХА в процессе лечения. Однако, как показал

20 % амплификация гена BCR/ABL

анализ, результаты терапии ИТК у больных с ДХА в Ph-позитивном клоне зависят от характера ДХА. Так, если в качестве ДХА наблюдается дополнительная хромосома 8, то терапия иматинибом остается эффективной, хотя получение ПЦО возможно лишь в поздние сроки терапии. Нами показано, что в случае выявления дополнительных транслокаций терапия иматинибом или ИТК 2-й линии в 3 из 4 рассмотренных случаев также позволила достигнуть ПЦО. Однако следует отметить, что мы наблюдали разные хромосомные перестройки. Из них лишь 1 транслокация t(1;7)(q10;p10) относится к числу перестроек, характерных для индуцированных миелопролиферативных заболеваний, остальные носят случайный характер. Было бы опрометчиво пытаться прогнозировать результаты терапии для редких случаев наблюдения случайных хромосомных перестроек в Ph-позитивных клетках. При возникновении дополнительной Ph-хромосомы или амплификации гена BCR/ABL можно вполне определенно рекомендовать использовать ИТК 2, которые в конечном итоге позволяют добиться полного подавления Ph-позитивного клона. Вместе с тем, присутствие дополнительных аномалий хромосомы 7 и комплексных нарушений ка риотипа с вовлечением изохромосомы i(17)(q10) является признаком неблагоприятного прогноза, подразумевающего отсутствие эффекта от терапии ИТК как первой (иматиниб), так и 2-й (нилотиниб, дазатиниб, бозутиниб) линии. Полученные результаты, несомненно, требуют подтверждения дальнейшими исследованиями на большем числе пациентов. Однако они позволяют ставить вопрос о прогностической значимости кон кретных дополнительных аномалий в Ph-позитивном клоне в условиях лечения пациентов ИТК.

Л И Т Е Р А Т У Р А 1. Cortes J., O’Dwyer M.E. Clonal evolution in chronic myelogenous leukemia. Hematol Oncol Clin N Am 2004;18(3):671–84. 2. O'Hare T., Eide C.A., Deininger M.W. Bcr-Abl kinase domain mutations, drug

resistance, and the road to a cure for chronic myeloid leukemia. Blood 2007;110(7):2242–9. 3. Sattler M., Verma S., Shrikhande G. et al. The BCR/ABL tyrosine kinase induces production of reactive oxygen species in

hematopoietic cells. J Biol Chem 2000;275(32):24273–8. 4. Branford S., Rudzki Z., Walsh S. et al. Detection of BCR-ABL mutations in patients with CML treated with imatinib is virtually

’2012

ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ always accompanied by clinical resistance, and mutations in the ATP phosphate-binding loop (P-loop) are associated with a poor prognosis. Blood 2003;102(1):276–83. 5. Willis S.G., Lange T., Demehri S. et al. Highsensitivity detection of BCR-ABL kinase domain mutations in imatinib-naive patients: correlation with clonal cytogenetic evolution but not response to therapy. Blood 2005;106(6):2128–37. 6. Quintás-Cardama A., Kantarjian H., Cortes J. et al. Dasatinib early intervention after cytogenetic or hematologic resistance to imatinib in patients with chronic myeloid leukemia. Cancer 2009;115(13):2912–21. 7. Koptyra M., Falinski R., Nowicki M.O. et al. BCR/ABL kinase induces self-mutagenesis via reactive oxygen species to encode imatinib resistance. Blood 2006;108(1):319–27. 8. Nowicki M.O., Falinski R., Koptyra M. et al. BCR/ABL oncogenic kinase promotes unfaithful repair of the reactive oxygen speciesdependent DNA double-strand breaks. Blood 2004;104(12):3746–53. 9. Dierov J., Sanchez P.V., Burke B.A. et al. BCR/ABL induces chromosomal instability after genotoxic stress and alters the cell death threshold. Leukemia 2009;23(2):279–86. 10. Skorski T. BCR/ABL, DNA damage and DNA repair: implications for new treatment concepts. Leuk Lymphoma 2008;49(4):610–4. 11. Cortes J.E., Talpaz M., Giles F. et al. Prognostic significance of cytogenetic clonal evolution in patients with chronic myelogenous leukemia on imatinib mesylate therapy. Blood 2003;101(10):3794–800. 12. Calabretta B., Perotti D. The biology of CML blast crisis. Blood 2004;103:4010–22. 13. Clift R.A., Buckner C.D., Thomas E.D. et al. Marrow transplantation for patients in

accelerated phase of chronic myeloid leukemia. Blood 1994;84(12):4368–73. 14. O’Dwyer M.E., Mauro M.J., Kurilik G. et al. The impact of clonal evolution on response to imatinib mesylate (STI571) in accelerated phase CML. Blood 2002;100(5):1628–33. 15. Круглов С.С. Резистентность к ингибитору тирозинкиназ BCR-ABL у пациентов в фазе акселерации хронического миелолейкоза. Автореф. дис. … канд. мед. наук. М., 2005. 16. Круглов С.С., Туркина А.Г., Хорошко Н.Д. Резистентность при терапии гливеком у больных хроническим миелолейкозом в фазе акселерации. Гематол и трансфузиол 2005;50(4):17–24. 17. Baccarani M. // Chronic Myeloid Leukemia: An Update of Concepts and Management Recommendations of European Leukemia-net. // JCO, 2009, W. 27, № 35, P. 6041-51. 18. Домрачева Е.В., Захарова А.В., Асеева Е.А. Прогностическое значение дополнительных цитогенетических аномалий при хроническом миелолейкозе. Гематол и трансфузиол 2005;50(4):37–42. 19. Мартынкевич И.С., Мартыненко Л.С., Иванова М.П. и др. Дополнительные хромосомные аберрации у пациентов с хроническим миелолейкозом. Гематол и трансфузиол 2007;52(2):28–35. 20. Куцев С.И., Морданов С.В., Зельцер А.Н. Прогностическое значение дополнительных хромосомных аномалий в Ph-позитивных клетках в терапии иматинибом хронического миелолейкоза. Мед ген 2009; 8(10):23–8.

21. Hochhaus A., Kreil S., Corbin A.S. et al. Molecular and chromosomal mechanisms of resistance to imatinib (STI571) therapy. Leukemia 2002;16(11):2190–6. 22. Marktel S., Marin D., Foot N. et al. Chronic myeloid leukemia in chronic phase responding to imatinib: the occurrence of additional cytogenetic abnormalities predicts disease progression. Haematologica 2003;88:260–7. 23. Baccarani M., Saglio G., Goldman J.M. et al. Evolving concepts in the management of chronic myeloid leukemia. Recommendations from an expert panel on behalf of the European Leukemianet. Blood 2006;108:1809–20. 24. Fialkow P.J., Jacobson R.J., Papayannopoulou T. Chronic myelocytic leukemia: clonal origin in a stem cell common to the granulocyte, erythrocyte, platelet and monocyte/macrophage. Am J Med 1997;63(1):125–30. 25. Hild F., Freund M., Fonatsch C. Chromosomal aberrations during interferon therapy for chronic myelogenous leukemia. N Engl J Med 1991;325:132. 26. Heim S., Mitelman F. Cancer Cytogenetics. Chromosomal and molecular genetic aberrations of tumor cells. Wiley-Liss, New York, 1995. 27. Levine A.J. p53, the cellular gatekeeper for growth and division. Cell 1997;88(3):323–31. 28. Wattel E., Preudhomme C., Hesquet B. et al. P53 are mutation associated with resistanse to chemotherapy and short survival in gematological malignancies. Blood 1994;84:3148–57. 29. Ольшанская Ю.В., Домрачева Е.В. Хромосомные перестройки при острых лейкозах. М.: МЕДпресс-информ, 2006. С. 112.

Инфекции, вызванные редкими плесневыми грибами, в гематологии

’2012

ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ

И.И. Калинина1, У.Н. Петрова1, О.В. Горонкова1, Д.Д. Байдильдина1, В.В. Синицына1, Л.А. Хачатрян1, М.А. Масчан1, Г.А. Клясова2, А.А. Масчан1 1

ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России, Москва; 2 ФГБУ ГНЦ Минздрава России, Москва Контакты: Ирина Игоревна Калинина burbir@mail.ru

Повсеместное распространение плесневых грибов и их смертельная опасность для иммунокомпроментированных больных делает данную проблему до настоящего времени одной из нерешенных в онкогематологии. В статье представлено описание 3 случаев развития редких плесневых грибковых инфекций у детей с онкогематологическими заболеваниями. Первый случай – девочка с острым миелобластным лейкозом и развитием Acremonium spp., данный инфекционный эпизод был купирован при применении антимикотической терапии вориконазолом и восстановлении уровня гранулоцитов. У второго пациента с апластической анемией развился инвазивный микоз, вызванный Fusarium spp.; несмотря на проводимую комбинированную противогрибковую терапию и трансфузии донорских гранулоцитов, данная инфекция привела к смерти пациента. В третьем случае у больного с Mucor spp. диагноз был установлен только на аутопсии. Ключевые слова: редкие плесневые грибы, Acremonium spp., Fusarium spp. и Mucor spp., дети с онкогематологическими заболеваниями

Infections caused by rare mold fungi in hematology I.I. Kalinina1, U.N. Petrova1, O.V. Goronkova1, D.D. Baidildina1, V.V. Sinitsyna1, L.A. Khachatryan1, M.A. Maschan1, G.A. Klyasova2, A.A. Maschan1 1 Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology named after Dmitry Rogachev, Ministry of Health of Russia, Moscow; 2 Russian Hematological Research Center, Ministry of Health of Russia, Moscow Worldwide distribution of mold fungi and their extremely danger for immune compromise patients makes this issue one of the unsolved problems in modern oncology. Three cases of rare fungal infections in children with hematological malignancies are described. In the first case infection caused by Acremonium spp. in AML patients was controlled after voriconazole therapy and granulocytes recovery. The second patients with aplastic anemia died as a result of invasive fungal infection caused by Fusarium spp. despite of combined antifungal therapy and granulocytes transfusions. In the third case diagnosis of Mucor mycosis was made only at autopsy. Key words: rare mold fungi, Acremonium spp., Fusarium spp., Mucor spp., children, oncohematological diseases

Введение Прогресс, достигнутый в последние годы в лечении гематологических и онкологических заболеваний, связан не только и не столько с усовершенствованием специфического медикаментозного лечения, сколько со значительным увеличением возможностей сопроводительной терапии. Особые успехи достигнуты в области контроля грибковых инфекций, при которых разработка четких диагностических и лечебных алгоритмов вкупе с появлением новых, более эффективных препаратов позволила существенно снизить летальность при инвазивных кандидозах и аспергиллезах, которая до недавнего времени достигала 60 % [1, 2]. Хотя спектр возбудителей инвазивных микозов остается неизменным и характеризуется явным доминированием кандидоза и аспергиллеза, отмечается рост доли редких инфекций, вызванных широко распространенными в окружающей природе мицелиальными грибами, принадлежащими к гиалогифомицетам и зигомицетам [3–5]. Данные грибковые осложнения

объединяют редкость возникновения, низкая чувствительность к применяемым системным антимикотикам и чрезвычайно тяжелое течение и плохой прогноз, особенно у иммунокомпрометированных пациентов. Данный обзор мы посвятили грибковым инфекциям, вызванным такими редкими патогенами, как Acremonium spp., Fusarium spp. и Mucor spp. Описание клинических случаев Случай № 1. З.К., 8 лет, диагноз: острый миелоидный лейкоз, М4-вариант, первый острый период. В качестве противогрибковой профилактики получала итраконазол 5 мг/кг/сут. На 18-й день от окончания двойной индукции ADE-HAM в режиме «интенсивного тайминга» на фоне глубокой миелосупрессии у ребенка развились фебрильная лихорадка, тонзиллит, гингивит и стоматит и высыпания на коже. Высыпания имели пятнистопапулезный характер, некоторые с везикуляцией (рис. 1). В гемокультуре, взятой в первый день фебрилитета, выявлен рост Enterococcus spp. Получала лечение меропе-

ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ

’2012

Рис. 1. Элементы сыпи у больной ОМЛ, осложненным инфекцией, вызванной Acremonium spp.

немом, амикацином, клиндамицином и валацикловиром. На 21-й день от окончания полихимиотерапии (ПХТ) (4-й день фебрилитета) появилось слезотечение из левого глаза. По данным компьютерной томографии (КТ) придаточных пазух носа: утолщена слизистая в передних отделах решетчатого лабиринта слева и пирамиде височной кости слева, что вкупе с клинической картиной трактовалось как синусит, по поводу чего к проводимой терапии добавлен филграстим в суточной дозе 5 мкг/кг/с подкожно. Однако состояние ребенка ухудшалось, сохранялась фебрильная лихорадка, увеличилось количество элементов сыпи на коже. На 23-й день после ПХТ отмечено появление асимметричного отека мягких тканей лица слева в периорбитальной области с переходом на мягкие ткани щеки, нарастающего в динамике, а также гиперемия и отек в области внутреннего угла левого глаза, сужение глазной щели и слезотечение. Кроме того, развилась пневмония, а также клиника бурсита правого локтевого и левого коленного сустава. В гемо грамме: Le 0,7 × 10 9/л, Hb 93 г/л, Plt 17 × 109/л. CRP 8,39 мг/дл. Учитывая выраженную отрицательную динамику, к терапии были добавлены линезолид, ципрофлоксацин и амфотерицин В (амфо-В) в дозе 1 мг/кг в сутки. Была выполнена биопсия кожных образований с отправкой материала на гистологическое и микробиологическое исследование, по результатам которого через 11 дней был получен рост Acremonium spp. Выполнена коррекция антибактериальной и противогрибковой терапии: амфо-В, ципрофлоксацин, меропенем и линезолид отменены, добавлен вориконазол 14 мг/кг/сут и продолжен филграстим. На 4-й день приема вориконазола достигнут афебрилитет и прекратилось появление новых высыпаний. Однако на 35-й день после ПХТ и 14-й день приема вориконазола на фоне начала «выхода» из гранулоцитопении состояние девочки ухудшилось – с отрицательной динамикой за счет новой «волны» высокого фебрилитета и усугубления симптоматики бурсита (рис. 2) в виде увеличения отека, болезненности и ограничения движений в пораженных суставах.

На серии изображений левого коленного сустава, полученных при помощи магнитно-резонансной томографии (МРТ), было выявлено: большое количество свободной воспалительной жидкости в полости сустава; множест венные очаговые поражения бедренной, большеберцовой и малоберцовой костей (рис. 3). Выполнена пункция левого коленного сустава, получено 42 мл вязкой мутной жидкости. Цитологический анализ жидкости: цитоз 1360/мм3, лимфоциты 24 %, моноциты 10 %, с/я 58 %, п/я 3 %, эоз 4 %, баз 1 %. При микробиологическом исследовании роста микроорганизмов не получено. Таким образом, у пациентки основными проявлениями грибковой инфекции, вызванной Acremonium spp., были: поражение кожи, синусит, пневмония, артрит, остеомиелит. Все они были полностью купированы через 47 дней от момента развития на фоне восстановления гемопоэза: Le 4,8 × 10 9 /л (гранулоциты 3840/мкл), Hb 122 г/л, Plt 90 × 10 9/л. В дальнейшем была продолжена

Рис. 2. Поражение левого коленного сустава у больной ОМЛ, осложненным инфекцией, вызванной Acremonium spp.

’2012

ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ

Рис. 3. МРТ костей больной ОМЛ, осложненным инфекцией, вызванной Acremonium spp. Видны множественные мелкие литические изменения

Рис. 4. Элемент сыпи у больного апластической анемией, осложненной инфекцией, вызванной Fusarium spp. (правый глаз)

терапия основного заболевания и пациентка умерла от сепсиса, вызванного синегнойной палочкой. Случай № 2. Г.С., 16 лет, диагноз: приобретенная идиопатическая апластическая анемия, сверхтяжелая форма. Агенезия левой почки. При осмотре на момент поступления – пациент афебрилен, однако в области левого гребня подвздошной кости в точке выполнения трепанобиопсии был выявлен инфильтрат около 1 см в диаметре, с гнойным стержнем в центре, а также увеличение и болезненность регионарного пахового лимфатического узла. С целью профилактики грибковой инфекции больной получал позаконазол по 200 мг 3 раза в сутки. Учитывая наличие очага инфекции мягких тканей, получал антибактериальную терапию цефепимом и левофлоксацином. При проведении двукратного микробио логического исследования отделяемого из инфильтрата роста микроорганизмов получено не было. В дальнейшем, учитывая отрицательную динамику со стороны инфильтрата, – увеличение размеров до 1,5 см, появление болезненности – произведена смена антибактериальной терапии на цефоперазон/сульбактам и ванкомицин, достигнута положительная динамика в виде разрешения инфильтрата и купирования болезненности. Сохранялось изменение цвета кожных покровов в этой области в виде гиперпигментации. Пациенту был проведен курс терапии антитимоцитарным глобулином (АТГ) (атгам в суммарной дозе 160 мг/кг) с коротким курсом метилпреднизолона 1 мг/кг/сут в течение 19 дней (профилактика и лечение сывороточной болезни) и назначен циклоспорин А в дозе 2 мг/кг/сут. На основании данных КТ легких, выявившей очаг перибронховаскулярной инфильтрации 5 мм в диаметре в средней доле правого легкого, доза позаконазола была увеличена до 800 мг/сут. После завершения курса АТГ отмечались нейтропенический энтероколит с септическим шоком без микробиологического подтверждения, язвенно-некротический

стоматит, гингивит с ростом Stenotrophomonas maltophilia. Пациент получал различные комбинации антибактериальных препаратов с учетом клинической картины и чувствительности St. maltophilia. На 27-й день от начала курса АТГ появились фебрилитет, плохое самочувствие, жалобы на оссалгии и миалгии в покое. На 35-й день от начала курса АТГ отмечалось появление мелких инфильтративных элементов на коже лица, живота, груди; болезненного инфильтрата размером до 0,8 см в диаметре, с последующим увеличением, на внутренней стороне нижней трети голени. На 39-й день появился элемент диаметром 0,5 см с гиперемией окружающих тканей на нижнем веке правого глаза (рис. 4), увеличение размеров очагов на голени, что свидетельствовало о диссеминации инфекции неустановленной этиологии. Продолжена комбинированная антибактериальная и противогрибковая терапия. С 42-го дня от начала курса АТГ, учитывая присоединение отечного синдрома (пастозность мягких тканей лица, поясничной области, голеней, стоп), уплотнение дельтовидных мышц, дальнейшую прогрессию инфильт ративных элементов в виде увеличения прежних и присоединения новых элементов, к проводимой терапии добавлен каспофунгин 50 мг/сут, отменен позаконазол и назначен вориконазол 12 мг/кг/сут. На 44-й день присоединились признаки дыхательной недостаточности, увеличилось количество «отсевов» на коже. Выполнено КТ легких: отмечено появление зон сниженной пневматизации разных размеров по типу «матового стекла», преимущественно в левом легком. Терапия: меропенем, тикарциллин/клавулановая кислота, ципрофлоксацин, каспофунгин, вориконазол, лосек, морфин, лазикс, инфузионная и трансфузионная терапия. На 46-й день от начала курса АТГ выполнена биопсия двух инфильтратов – в области нижней трети правой голени и на левом предплечье. В дальнейшем, учитывая диссеминацию инфекции на фоне антибактериальной терапии широкого

’2012

ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ

спектра действия и 8 дней комбинированной противогрибковой терапии вориконазолом и каспофунгином, медленный рост микроорганизмов при культуральном исследовании (плесневые грибы?), подозрение на диссеминированную грибковую инфекцию с поражением кожи, слизистых задней стенки глотки, мышц, легких, был добавлен липидный комплекс амфо-В. Кроме того, проводили трансфузии донорских гранулоцитов в режиме 2–3 раза в неделю. При микробиологическом исследовании крови на 52-й день от начала АТГ получен рост мицелиальных грибов. Из биоптата (инфильтрат кожи) идентифицирован плесневый гриб Fusarium spp. Произведена смена центрального венозного катетера (ЦВК), микробиологическое исследование конца удаленного ЦВК – роста микроорганизмов не получено. С 56-го дня от начала курса АТГ начата стимуляция гранулоци топоэза ленограстимом 10 мкг/кг/сут внутривенно с последующим переходом на пег-филграстим в дозе 100 мкг/кг подкожно, без эффекта. На фоне проводимой антибактериальной (меропенем, тикарциллин с кла вулановой кислотой), противогрибковой (каспофунгин 75 мг/сут, вориконазол 12 мг/кг/сут, липосомальная форма амфо-В 1,5 мг/кг/сут, амфо-В 10 мг/сут) терапии, обезболивания морфином, введения колониестимулирующего фактора (G-CSF) и трансфузий донорских гранулоцитов была отмечена положительная динамика в состоянии пациента: уменьшение кратности фебрильных подъемов до 1–2 в сутки, отсутствие новых «отсевов» на коже, купирование дыхательной недостаточности, уменьшение болевого синдрома (стоматит, миалгии, болезненные очаги). Однако, несмотря на стимуляцию гранулоцитопоэза G-CSF, сохранялся агранулоцитоз (максимальное количество гранулоцитов составляло 20–120/мкл). С 64-го дня от начала курса АТГ вновь отмечалось появление новых «отсевов» на коже (2 инфильтративных болезненных элемента в области левой стопы с невозможностью вставать на левую ногу), а также болезненность в области локтевых суставов с невозможно стью их полного разгибания. При рентгенографии левой стопы выявлен остеолитический очаг 1 см в диаметре в V плюсневой кости (грибковый остеомиелит?) (рис. 5); при рентгенографии локтевых суставов в локтевых отростках обеих локтевых костей определялись очаги разрежения без четких контуров, а также единичный очаг деструкции в дистальном метафизе плечевой кости по латеральной поверхности и в медиальном надмыщелке. Изменения структуры костей те же, что и в костях стоп. С конца января отмечалось снижение зрения справа (правый глаз). Осмотр окулиста: на OD желтоватый очажок в макуле сетчатки, складчатость сетчатки в папилломакулярном пучке – центральный хориоретинит (вероятнее всего, грибковой этиологии). К проводимой противогрибковой терапии (липидный комплекс амфо-В 1,5 мг/кг/сут, каспофунгин 75 мг/сут, вориконазол по 12 мг/кг/сут) добавлен тербинафин (ламизил) 500–750 мг/сут перорально. По данным гемограммы сохранялась аплазия кроветворения (Le 0,6–1,0 × 10 9/л,

Рис. 5. Рентгенологические изменения в V плюсневой кости у больного аплас тической анемией, осложненной инфекцией, вызванной Fusarium spp.

Hb 91 г/л, Plt 26 × 10 9/л), проводили ежедневные трансфузии препаратов крови, гранулоцитарной массы – 2–3 раза в неделю. Клиническая картина – фебрилитет, болевой синдром в левой стопе (остеолитический грибковый очаг в кости), правой голени (обширный болезненный инфильтрат мягких тканей на задней поверхности голени 3 × 4 см), множественные мелкие грибковые «отсевы» на коже (пятнисто-папулезные гиперемированные плотные элементы), 4 обширных болезненных инфильтрата мягких тканей, выступающих над поверхностью кожи, багрово-синюшного цвета (на задней поверхности правой голени 4 × 3 см (рис. 6), на передней поверхности левой голени 1 × 1 см под черным струпом, на правой ягодице 1,5 × 2 см с черным струпом в центре, в области наружной поверхности левого голеностопного сустава 2 × 2 см), эрозивно-язвенный стоматит. Учитывая отсутствие ответа на иммуносупрессивную терапию через 90 дней от начала курса АТГ, тяже-

Рис. 6. Некротический очаг на задней поверхности правой голени у больного апластической анемией, осложненной инфекцией, вызванной Fusarium spp.

водилось обезболивание морфином (боль в грудной клетке, животе). С 9-го дня от начала терапии АТГ отмечено появление дыхательной недостаточности – одышка до 35 дыханий в минуту, снижение Sat O2 до 89 %. Фебрильная лихорадка до 3 подъемов за сутки. На 10-й день выявлены проявления пареза кишечника, отечного синдрома. В анализе крови: Le 1,0 × 10 9/л, Hb 89 г/л, Plt 23 × 10 9/л. Гипоальбуминемия 20 г/л, CRP 34,7 мг/дл. На 11-й день от начала курса АТГ ухудшение состояния за счет появления неврологической симптоматики: правосторонний гемипарез, клонические судороги (подергивания мышц правых конечностей, мышц живота). Ребенок в сознании, выполняет простые команды. Зрачки OD > OS, сглаженность правой носогубной складки. Осмотр невропатолога: острое нарушение мозгового кровообращения? Грибково-бактериальный энцефалит? Выполнена КТ головного мозга (рис. 8) – в левой теменной доле визуализировалось массивное округлое псевдокистозное включение с высокоплотными капсулоподобными включениями. Общий размер патологической зоны 54 × 61 мм. Левый боковой желудочек сдавлен. Срединные структуры не смещены. Ликвородинамика не нарушена. Субарахноидальные пространства сужены только в месте локализации патологического образования. Краниовертебральный переход без особенностей. Наиболее вероятно грибковое поражение центральной нервной си стемы – аспергиллез? Таким образом, у ребенка со сверхтяжелой апластической анемией, вероятной инвазивной грибковой инфекцией легких (аспергиллез?) диагностировано поражение головного мозга, вероятно, также грибковой этиологии. Продолжена противогрибковая терапия (вориконазол, каспофунгин), отменен преднизолон. В дальнейшем состояние мальчика стремительно ухудшалось, нарастала дыхательная недостаточность и неврологическая симптоматика (судороги, кома), потребовавшие перевода в отделение реанимации и проведения искусственной вентиляции легких. На 13-й день от начала терапии констатирована смерть больного.

Рис. 7. КТ легких больного апластической анемией, осложненной инфекцией, вызванной Mucor spp.

’2012

лое течение грибковой инфекции – диссеминированного инвазивного фузариоза на фоне аплазии кроветворения, частично поддающегося контролю на фоне лечения противогрибковыми препаратами и трансфузий донорских гранулоцитов, от проведения повторного курса АТГ было решено отказаться. Инициирован поиск неродственного HLA-совместимого донора в международном регистре. Однако донор найден не был. Дальнейшее ухудшение состояния с 133-го дня от начала курса АТГ за счет прогрессирования грибковой инфекции, сепсиса: на фоне сохраняющейся лихорадки отмечалось нарастание симп томов интоксикации, появление множественных новых грибковых «отсевов» на коже, не поддающихся подсчету, отечного синдрома, нарастание геморрагического синдрома, выраженного болевого синдрома в мышцах. На 136-й день на фоне развития септического шока с полиорганной недостаточностью наступила смерть. Случай № 3. Больной З.И., 2 года, диагноз: приобретенная идиопатическая апластическая анемия, сверхтяжелая форма. Проведен курс комбинированной иммуносупрессивной терапии атгамом (АТГ) в суммарной дозе 160 мг/кг и солу-медролом 1 мг/кг/сут. Профилактика грибковых инфекций проводилась итраконазолом 5 мг/кг/сут. Со 2-го дня от начала курса АТГ у пациента выявлена субфебрильная лихорадка до 37,7 °С, пятнистая сыпь на коже туловища и конечностей, была назначена эмпирическая антибактериальная терапия: цефоперазон/сульбактам и левофлоксацин. На 4-й день введения АТГ у ребенка выявлена фебрильная лихорадка, слабость, вялость, кожный геморрагический синдром, мелкопятнистая сыпь на конечностях и ягодицах (аллергическая реакция на АТГ? сверхранняя сывороточная болезнь с болевым синдромом?), влажный кашель. В легких аускультативно выявлены единичные, сухие хрипы, дыхательной недостаточности не было. К терапии был добавлен ванкомицин. На 7-й день от начала АТГ – усиление фебрильной лихорадки до 3–4 подъемов за сутки, болевого синдрома, появился влажный кашель, Sat O2 97 %. При аускультации легких – влажные хрипы, больше слева. Гемодинамика стабильная. Живот напряжен, печень + 2 см, селезенка + 1 см. Стул 2 раза в сутки, жидкий. Диурез адекватный. Посев крови выполнялся 1 раз в 2–3 дня, роста микроорганизмов не выявлено. CRP 22,3 мг/дл. Получал различные комбинации антибактериальной терапии. По данным КТ грудной клетки (рис. 7): выявлены крупные сливные зоны пневматической инфильтрации с перифокальным снижением пневматизации, с положительной воздушной бронхографией, с инфильтрацией костальной плевры в задних отделах левого легкого. В правом легком кроме крупных инфильтратов присутствовало несколько более мелких периваскулярных уплотнений. Плеврального выпота не было. С 8-го дня в терапию добавлены противогрибковые препараты: вориконазол 14 мг/кг/сут, каспофунгин 50 мг/м2/сут. Доза преднизолона снижена в 2 раза (0,5 г/кг/сут), однако введение препарата было продолжено с целью профилактики сывороточной болезни, про-

ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ

’2012

Рис. 8. КТ головного мозга больного апластической анемией, осложненной инфекцией, вызванной Mucor spp.

При проведении культурального исследования ауто псийного материала (ткани легких, головного мозга, печени, почек) получен рост Mucor spp. (Zygomycetes). Обсуждение Повсеместное распространение мицелиальных грибов – в почве, на растениях, на пищевых продуктах и их безопасность для не иммунокомпрометированных больных, но смертельная опасность для больных онкогематологического профиля требует высокой настороженности от врачей-клиницистов в развитии инвазивного микоза, вызванного редкими мицелиальными грибами. Усовершенствование методов микробиологиче ского выделения и идентификации патогенных организмов; широкое применение противогрибковых препаратов, особенно азолов и амфо-В, которые подавляют чувствительные виды и ведут к повышению вероятности инфекций, вызванных резистентными видами; более широкое применение интенсивной ПХТ и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) от неродственного или частично совместимого донора стали причиной повышения частоты редких грибковых возбудителей. Даже несмотря на большую настороженность, диагноз инвазивного микоза порой устанавливается поздно в связи с неспецифичностью клинических проявлений и тяжестью состояния больного, что не позволяет провести инвазивные диагностические процедуры. Факторы риска развития инвазивного поражения одинаковы для всех грибковых патогенов: длительная нейтропения, применение глюкокортикоидов и/или иммуносупрессоров, реакция «трансплантат против хозяина» у реципиентов ГСК [3, 5–9]. Диагностика данных видов

мицелиальных грибов основана преимущественно на выявлении мицелия в материале из очага поражения, фунгемия выявляется редко. Серологические методы диагностики не разработаны. Чаще достоверный диагноз устанавливается лишь на аутопсии, поскольку инвазивная биопсийная диагностика крайне затруднена у пациентов в тяжелом клиническом состоянии и с тяжелой тромбоцитопенией. Фактически безопасное патогистологическое исследование можно выполнить только при наличии кожного поражения, как это было сделано у пациентов № 1 и № 2. Acremonium spp. – мицелиальные грибы, светлоокрашенные гиалогифомицеты. Отличаются резистентностью in vitro к амфо-В, эхинокандинам, флуконазолу и итраконазолу. Могут быть чувствительны к вориконазолу in vitro, однако клинический успех зависит не только от чувствительности к антимикотикам, но прежде всего от восстановления нарушенных факторов иммунитета. У иммунокомпрометированных пациентов основными клиническими проявлениями являются поражение легких, придаточных пазух носа, фунгемия и диссеминация. Пути проникновения грибов в организм больного – ингаляционный (легкие, придаточные пазухи), желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), внутрисосудистый катетер. Особенно стью гематогенной диссеминации является частое поражение кожи и подкожной клетчатки [10–12]. Fusarium spp. – так же как и Acremonium spp., являются мицелиальными грибами, светлоокрашенными гиалогифомицетами, могут проникать через поврежденную кожу. В структуре плесневых грибов занимают 2-е место после инвазивного аспергиллеза. Резистент ны in vitro к эхинокандинам, флуконазолу, итраконазолу. Чувствительны к вориконазолу, позаконазолу, амфо-В. Чаще всего возбудитель попадает в организм больного ингаляционным путем, реже – через по врежденную кожу. Диссеминация фузариоза происходит на фоне длительной и глубокой гранулоцито пении. Особенностью является поражение глаз (специфический кератит) и поражение кожи (до 70 %) при диссеминации, элементы представляют собой болезненные эритематозные папулы, подкожные узелки с очагом некроза в центре, которые превращаются в длительно незаживающие язвы с дном, покрытым черным струпом. В гемокультуре данный возбудитель определяется у 40–60 % больных. Данный патоген является ангиоинвазивным, может поражать артерии с последующим развитием тромбозов, инфарктов. Клинические и рентгенологические проявления поражения легких сходны с инвазивным аспергиллезом [6, 13, 14]. Mucor spp. – мицелиальный грибок, относящийся к классу Zygomycetes. Возбудитель резистентен к азолам (кроме позаконазола), эхинокандинам. In vitro чувствителен к амфо-В. Клиническое течение характеризуется быстрым разрушением всех тканевых барьеров, поражением сосудов, гематогенной диссеминацией с последующим развитием тромбозов и некрозов

тропенией. В данной группе летальность составляет до 100 %. В случае № 1 эпизод грибковой инфекции (Acremonium spp.) был купирован с помощью проведения антимикотической терапии вориконазолом, и наиболее важным фактором явилось восстановление количества лейкоцитов. Хочется отметить, что поражение костей было установлено только после проведения МРТ-исследования, тогда как по данным рентгено графии и КТ изменений выявлено не было. В связи с развитием данного осложнения ребенку длительное время не проводилась специфическая терапия острого миелоидного лейкоза. Случай № 2 (Fusarium spp.). Возможно, заражение пациента произошло до поступления в стационар, о чем говорит наличие очага (внешне похожего на очаги, развившиеся позже) в месте выполненной по месту жительства трепанобиопсии, однако микро биологическое исследование материала, взятого специальным тампоном из некротических тканей, оказалось негативным, а наличие Fusarium spp. было выявлено только после проведения биопсии очагов. Следует подчеркнуть, что пациент получал позаконазол в дозе 600 мг/сут, затем 800 мг/сут, однако это не остановило прогрессии грибковой инфекции. Случай № 3 (Mucor spp.). Тяжесть состояния, неспецифичность клинических проявлений, быстрота течения инфекционного процесса не позволили спасти жизнь ребенка; диагноз грибкового поражения был установлен только после проведения аутопсии. От момента развития первых клинических симптомов поражения легких до смерти прошло 7 дней. Таким образом, развитие грибковой инфекции, вызванной редкими патогенами, является до настоящего времени нерешенной проблемой в терапии пациентов с различными гематологическими заболеваниями.

Л И Т Е Р А Т У Р А 1. Groll A.H., Lehrnbecher T. New antifungal drugs and the pediatric cancer patient: current status of clinical development. Klin Padiatr 2005;217(3): 158–68. 2. Groll A.H., Walsh T.J. Fungal infections in the pediatric patient. In: Anaissie E., McGinnis M., Pfaller M., eds. Clinical mycology. 1-st ed. N.Y.: Churchill Livingstone, 2003. Рp. 417–42. 3. Marr K.A., Carter R.A., Crippa F. et al. Epidemiology and outcome of mould infections in hematopoietic stem cell transplant recipients. Clin Infect Dis 2002;34:909–17. 4. Pagano L., Caira M., Candoni A. et al. The epidemiology of fungal infections in patients with hematologic malignancies: the

SEIFEM-2004 study. Haematologica 2006;91:1068–75. 5. Kontoyiannis D.P., Wessel V.C., Bodey G.P. et al. Zigomycosis in the 1990-s in a tertiary – care cancer center. Clin Infect Dis 2000;30:851–6. 6. Musa M.O., Al Eisa A., Halim M. et al. The spectrum of Fusarium infection in immunocompromized patients with haemotological malignancies and in nonimmunocompromized patients: a single institution experience over 10 years. Br J Haematol 2000;108:544–8. 7. Nenoff P., Kelermann S., Schober R. et al. Rhinocerebral zygomycosis following BMT in chronic myelogenous leukemia. Report of a case and review of the literature. Mycoses 1998;41:365–72.

8. Gonzales C.E., Couriel D.R., Walsh T.J. Disseminated zygomycosis in a neutropenic patient: successful treatment with amphotericin B lipid complex and granulocyte colonystimulating factor. Clin Infect Dis 1997;24:192–6. 9. Singh N., Aguado J.M., Bonatti H. et al. Zygomycosis in solid organ transplant recipients: a prospective, matched case-control study to assess risk for disease and outcome. J Infec Dis 2009;200(6): 1002–11. 10. Fincher R.M., Fisher J.F., Lovell R.D. et al. Infection due to the fungus Acremonium (Cephalosporium). Medicine (Baltimore) 1991;70:398–409. 11. Schell W.A., Perfect J.R. Fatal, disseminated Acremonium strictum infection

’2012

тканей. Путь инфицирования преимущественно ингаляционный, может попадать через поврежденную кожу (травмы, ожоги) и через ЖКТ. Основными клиническими вариантами являются: риноцеребральный – 40–50 % случаев (вовлечение в процесс тканей орбиты, лица, твердого неба, головного мозга); легочный – 15–25 % (кашель, боль в груди, кровохарканье, легочное кровотечение); с поражением кожи и подкожной клетчатки – 10–20 % (отек, гиперемия, боль, некротические язвы с черным струпом); ЖКТ – 2–7 % (боль в животе, кровотечение, некроз, перфорация); диссеминированный зигомикоз – 2–23 % (поражение любых органов и тканей) [9, 15]. Терапия. Несмотря на доступность новых эффективных антимикотиков лечение редких грибковых инфекций остается чрезвычайно трудным. Для успешной терапии необходимо раннее начало антимикотической терапии и восстановление противоинфекционной защиты [16]. Без разрешения нейтропении выздоровление от грибковой инфекции практически невозможно, медикаментозная терапия лишь препят ствует прогрессии процесса. Таким образом, основная роль в терапии принадлежит лечению основного заболевания, применению G-CSF и трансфузий донорских гранулоцитов [17–19]. Особую роль в терапии зигомикоза и фузариоза играет хирургическое иссечение пораженных тканей [20]. Основным препаратом выбора для терапии Acremonium spp. является вориконазол 14 мг/кг/сут; для терапии Fusarium spp. – вориконазол 14 мг/кг/сут или позаконазол 800 мг/сут, липидные формы амфо-В 3–5 мг/кг/сут; для терапии Mucor spp. – липидные формы амфо-В 3–5 мг/кг/сут [21] и позаконазол 800 мг/сут [22, 23]. Возможно проведение комбинированной антимикотической терапии [24]. Прогноз при всех плесневых грибковых инфекциях неблагоприятный, особенно у пациентов с ней-

ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ

’2012

ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ in a neutropenic host. J Clin Microbiol 1996;34:1333–6. 12. Roilides E., Bibashi E., Acritidou E. et al. Acremonium fungemia in two immunocompromised children. Pediatr Infect Dis J 1995;14:548–50. 13. Raad I., Tarrand J., Hanna H. et al. Epidemiology, molecular mycology and invironmental sources of Fusarium infection in patients with cancer. Infect Control Hosp Epidemial 2002;23:532–7. 14. Boutati E.I., Anaissie E.J. Fusarium, a significant emerging pathogen in patients with hematologic malignancy: ten years’ experience at a cancer center and implications for management. Blood 1997;90:999–1008. 15. Gonzales C.E., Rinaldi M.G., Sugar A.M. Zygomycosis. Infect Dis Clin 2002;16:895–914.

16. Caillot D., Mannone L., Cuisenier B., Couaillier J.F. Role of early diagnosis and aggressive surgery in the management of invasive pulmonary aspergillosis in neutropenic patients. Clin Microbiol Infect 2001;7 Suppl 2:54–61. 17. Liles W.C., Huang J.E., Van Burik J.A. et al. Granulocyte colony-stimulating factor administered in vivo augments neutrophilmediated activity against opportunistic fungal pathogens. J Infect Dis 1997;175:1012–5. 18. Sahin B., Paydas S., Cosar E. et al. Role of granulocyte colony-stimulating factor in the treatment of mucormycosis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1996;15:866–9. 19. Bodey G.P., Anaissie E., Gutterman J. et al. Role of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor as adjuvant therapy for fungal infection in patients with cancer. Clin Infect Dis 1993;17:705–7.

20. Tedder M., Spratt J.A., Anstadt M.P. et al. Pulmonary mucormycosis: results of medical and surgical therapy. Ann Thorac Surg 1994;57:1044–50. 21. Walsh T.J., Hiemennz J.W., Seibel N.L. et al. Amphotericin B lipid complex for invasive fungal infections: analysis of safety and efficacy in 556 cases. Clin Infect Dis 1998;26:1383–96. 22. Alexander B., Perfect J., Daly J. et al. Posaconazole as salvage therapy in patients with invasive fungal infections after solid organ transplant. Transplantation 2008;86:791–6. 23. Peel T., Daffy J., Thursky K. et al. Posaconazole as first line treatment for disse minated zygomycosis. Mycoses 2008;51:542–5. 24. Walsh T.J., Kontoyiannis D.P. What is the role of combination therapy in management of zygomycosis? Clin Infect Dis 2008;47:372–4.

Е.Л. Сахаровская1, И.Б. Резник1, 2, М.М. Дубровин1, Г.П. Павлова1, 3, А.Ю. Щербина1 ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, Москва; Израильский Университетский медицинский центр «Хадасса», Иерусалим, Израиль; 3 Республиканская детская клиническая больница, Чебоксары, Республика Чувашия 1

Контакты: Екатерина Леонидовна Сахаровская sakharovskay@yandex.ru Инфантильная форма остеопетроза (злокачественный остеопетроз) – самая тяжелая форма остеопетроза. Специфическая рентгенологическая картина при этом заболевании позволяет не только заподозрить, но и подтвердить диагноз. Нами были проанализированы данные 17 пациентов с инфантильной формой остеопетроза. У 13 из 17 пациентов была выявлена мутация с.807+5 G>A в гене TCIRG1 (наиболее часто встречаемая мутация остеопетроза у чувашей и марийцев). Рентгенологическое исследование было выполнено всем пациентам, при этом специфические признаки остеопетроза были описаны в 100 % случаев. В исследуемой группе у всех детей независимо от возраста при рентгенологическом исследовании отмечалось повышение рентгенологической плотности костей и ранняя оссификация. Детали рентгенологической картины в значительной степени различались в разных возрастных группах. Вероятнее всего, «чувашская» мутация обуславливает и более мягкое течение заболевания, чем другие варианты злокачественной формы остеопетроза. Продолжительность жизни без лечения может достигать 6–8 лет, что позволяет обнаружить рентгенологические признаки, ранее описанные только при взрослой (доброкачественной) форме остеопетроза. Ключевые слова: остеопетроз, мутация, рентгенологическое исследование, дети

Radiological features of malignant osteopetrosis at early and late stages of disease E.L. Sakharovskaya1, I.B. Reznik1, 2, M.M. Dubrovin1, G.P. Pavlova1, 3, A.Yu. Shcherbina1 Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology named after Dmitry Rogachev, Ministry of Health of Russia, Moscow; 2 Hadassah Hebrew University Medical Center, Jerusalem, Israel; 3 Republic Children Clinical Hospital, Cheboksary

Infantile form of osteopetrosis (malignant osteopetrosis) is the most severe form of the disease. Specific radiological signs allow to suspect and confirm the diagnosis. We analyzed the data of 17 patients with infantile osteopetrosis. In 13 from 17 patients we detected с.807+5 G>A mutation in TCIRG1 gene (most commonly seen in Chuvash and Mari). In all patients X-ray examination was performed with specific osteopetrosis signs in 100 % of cases. Regardless of age increased bone density and early ossification in this group of children were described. Details of radiological picture were significantly differing in different age groups. Most probably «Chuvash» mutation causes a less severe disease than other types of malignant osteopetrosis. Without treatment patients can survive 6–8 years that can detect radiological signs previously described only in adult (benign) osteopetrosis. Key words: osteopetrosis, mutation, radiological examination, children

Введение Инфантильная форма остеопетроза (злокачественный остеопетроз) – генетически детерминированное заболевание, характеризующееся неспособностью остеокластов осуществлять резорбцию костной ткани. На сегодняшний день описаны наиболее часто встречаемые мутации, что делает возможным проведение пренатальной диагностики [1–5]. Клиническая презентация заболевания начинается в первые месяцы жизни. Развивается депрессия костно-мозгового кроветворения, гепатоспленомегалия, неврологические нарушения, изменение формы черепа и лицевого скелета [6–8]. При рентгенологическом исследовании

выявляются патогномоничные признаки остеопетроза. Специфическая рентгенологическая картина позволяет с высокой достоверностью предположить основной диагноз и оценить динамику развития осложнений заболевания [9, 10]. Скорость прогрессирования заболевания зависит от варианта генетического нарушения. В большинстве случаев продолжительность жизни пациентов со злокачественной формой остеопетроза без лечения составляет 2–3 года. Тактика лечения нацелена на максимально быстрое проведение трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК), до развития необратимых осложнений [11, 12].

’2012

Рентгенологическая картина злокачественного остеопетроза на ранних и поздних стадиях развития заболевания

РЕДКИЕ БОЛЕЗНИ: ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА

’2012

РЕДКИЕ БОЛЕЗНИ: ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА

В настоящей работе нами систематизированы рент генологические данные 17 пациентов с инфантильной формой остеопетроза различных возрастных групп (рис. 1). Пациенты и методы В исследуемую группу вошло 17 пациентов с инфантильной формой остеопетроза, диагностированных в РДКБ Республики Чувашия (n = 10), РДКБ Республики Марий Эл (n = 5), Федеральном научно-клиническом центре детской гематологии, онкологии и иммунологии (n = 1), РДКБ Республики Бурятия (n = 1). Средний возраст больных составил 3,5 года (39,8 мес; от 6 месяцев до 7,5 лет). Мальчики составили 70,6 % (n = 12), а девочки – 29,4 % (n = 5). Средний возраст детей на момент установления диагноза составил 6,5 месяцев (от 1 до 20 месяцев). При оценке симптомов заболевания было установлено, что преобладающими признаками были: гематологические нарушения (n = 17), наличие гепато спленомегалии (n = 17), нарушения зрения (n = 17), гидроцефалия (n = 17). У большинства пациентов присутствовало нарушение дыхания в виде периодических эпизодов апноэ, храпящего дыхания (n = 13). В 12 случаях отмечалось отставание психомоторного развития. Нарушение слуха к моменту диагностики наблюдалось только у 7 больных. Четырнадцати пациентам из 17 было выполнено молекулярно-биологическое исследование ДНК на наличие мутации с.807+5 G>A в гене TCIRG1. В 13 случаях была выявлена данная мутация, ответственная за развитие аутосомно-рецессивного остеопетроза среди чувашей и марийцев. У 1 ребенка азербайджанской национальности данная мутация обнаружена не была,

но при молекулярно-генетическом анализе всего гена TCIRG1 методом секвенирования были выявлены 2 ранее не описанные мутации в гомозиготной форме: c.479G>A и c.2415-1G>C, что подтвердило основной диагноз у этого пациента. Рентгенологическое исследование было выполнено всем пациентам, при этом специфические признаки остеопетроза были описаны в 100 % случаев. Результаты В описываемой группе у всех детей независимо от возраста при рентгенологическом исследовании отмечалось повышение рентгенологической плотности костей и ранняя оссификация. Детали рентгенологической картины при злокачественном остеопетрозе в значительной степени зависят от возраста пациента, что связано с врожденным характером заболевания. В первые месяцы жизни наибольшие изменения отмечались в костях с преобладанием губчатого вещества: основания черепа, позвоночника, ребер, верхних и нижних конечностей. У пациентов старше 6 месяцев повышение рентгенологической плотности носило уже генерализованный характер (рис. 2). В 16 случаях из 17 определялся патогномоничный признак остеопетроза – двойной контур трубчатых костей, описываемый как «кость в кости» (рис. 3). У самого старшего пациента (7,5 лет) четких признаков данного симптома не наблюдалось, что связано с постепенным разрастанием и перестройкой костной ткани. При оценке динамики развития рентгенологиче ской картины нам удалось отследить постепенное сужение костномозгового канала, начиная с 3-месячного возраста вплоть до полного его закрытия к 2–3 годам жизни (рис. 4).

Повышенная плотность

Ранняя оссификация

Кость внутри кости

Сужение костно-мозгового канала

Диффузный склероз

Трубчатые кости по типу «колбы Эрленмейера»

Позвоночник по типу «сэндвича»

Неоднородность костной ткани

5 0%

12 20 %

40 %

60 %

80 %

Рис. 1. Частота встречаемости рентгенологических признаков инфантильной формы остеопетроза (n = 17)

100 %

Есть Нет

’2012

РЕДКИЕ БОЛЕЗНИ: ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА

Рис. 3. Рентгенограмма нижних конечностей мальчика в возрасте 1 год с инфантильной формой остеопетроза. Признак «кость в кости», начало формирования «колб Эрленмейера»

Рис. 4. Рентгенография нижних конечностей мальчика в возрасте 1,5 лет с инфантильной формой остеопетроза. Сужение костномозгового канала

Рис. 5. Рентгенография нижних конечностей 6. Рентгенография позвоночника мальчика мальчика в возрасте 1 год с инфантильной фор- в возрасте 1 год 9 месяцев с инфантильной мой остеопетроза. Костная мозоль на месте формой остеопетроза. Позвоночник – «симпперелома правой берцовой кости том сэндвича»

Рис. 7. Рентгенография нижних конечностей мальчика в возрасте 3 года 8 месяцев с инфантильной формой остеопетроза. Костный склероз от эпифизарного хряща к диафизу в виде чередующихся участков уплотнения и участки нормальной кости

Рис. 2. Рентгенография грудной клетки мальчика в возрасте 6 месяцев с остеопетрозом. Генерализованный характер поражения костной системы, повышение рентгенологической плотности костей

Повышенная ломкость костей во многом может объясняться диффузным склерозом и нарушением строения балок остеоидов костной ткани, которые отмечались в 16 из 17 случаев. Частой находкой были не только очаги остеосклероза, но и патологические переломы с разрастанием толстой костной мозоли в местах повреждения (рис. 5). Последнее объясняется отсутствием процесса резорбции и ремоделирования костной ткани в ходе регенерации. В губчатых костях: основания черепа, костей таза и в особенности позвоночника с большей частотой отмечались участки фокального склероза. В боковой проекции позвонки с фокальным склерозом

выглядят как «два эллипсоида, нависающие друг над другом» и описываются как «симптом сэндвича» (рис. 6). Этот признак присутствовал у 8 из 17 пациентов. В длинных трубчатых костях развитие костного склероза чаще происходит от эпифизарного хряща в направлении к диафизу. В рентгенологическом изображении подобное развитие процесса выглядело в виде ряда чередующихся участков уплотнения и участков нормальной кости, расположенных параллельно эпифизарной линии (рис. 7). В некоторых случаях определялась осевая слоистость с полосами различной ширины.

’2012

РЕДКИЕ БОЛЕЗНИ: ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА

Изменение формы трубчатых костей по типу «колбы Эрленмейера» было описано только при взрослой (доброкачественной) форме остеопетроза, презентирующей не раньше подросткового возраста [6]. В нашем исследовании данный признак присутствовал более чем в половине случаев – у 9 пациентов из 17, у пациентов начиная с 2,5 лет, т. е. существенно раньше подросткового возраста (рис. 8).

Рис. 8. Рентгенография нижних конечностей мальчика в возрасте 6 лет с инфантильной формой остеопетроза (слева). Длинные трубчатые кости по типу «колбы Эрленмейера» (справа)

Обсуждение Остеопетроз относят к группе орфанных (редких) заболеваний. Частота встречаемости инфантильной (злокачественной) формы в общей популяции составляет 1 случай на 250 000 новорожденных (в эндемичных зонах до 1 на 4000), встречаемость доброкачественной формы 1 случай на 20 000 новорожденных [2, 5, 6]. Тяжесть течения, прогноз и подходы к лечению принципиально отличаются в зависимости от формы остеопетроза. Инфантильная (злокачественная) форма наследуется по аутосомно-рецессивному типу, развивается с рождения, без лечения пациенты погибают в раннем возрасте [13, 14]. Взрослая (доброкачественная) форма остеопетроза имеет аутосомнодоминантный тип наследования, диагностируется в подростковом возрасте. Характерны менее выраженные структурные изменения в костях, значительно более мягкое клиническое течение [6, 15]. Однако

многие рентгенологические признаки, которые описаны при доброкачественной форме, были нами найдены у пациентов со злокачественной формой в возрасте старше 2–3 лет. В подавляющем большинстве случаев (n = 13)в исследуемой группе заболевание было обусловлено наиболее часто встречаемой («чувашской») мутацией гена TCIRG1 – с.807+5 G>A. Трем пациентам генетическое исследование не проводилось, однако все трое по национальности чуваши. Один ребенок азербай джанской национальности 1 года 3 месяцев имел другую мутацию. В связи с тем, что ТГСК вошедшим в эту группу пациентам не проводилась, нам удалось проследить развитие заболевания до поздних стадий. Вероятнее всего, «чувашская» мутация приводит к более мягкому течению заболевания, чем при других вариантах злокачественной формы остеопетроза. Продолжительность жизни без лечения может достигать 6–8 лет, что позволяет обнаружить рентгенологиче ские признаки, ранее описанные только при взрослой форме остеопетроза. Атрофия зрительных нервов у этих больных наступала примерно к двум годам жизни, т. е. позже «стандартной» инфантильной формы заболевания. Из-за отсутствия резорбции происходит разрастание костной ткани в сторону костного канала [16, 17], что рентгенологически видно с одной стороны, как сужение его просвета, а с другой стороны, виден второй, «внутренний» контур кости (признак «кость внутри кости»). Подтверждением данного предположения может служить то, что, по нашим наблюдениям, с возрастом к моменту полной облитерации костного мозга этот признак становится менее выраженным, а вещество кости становится однородным и компактным. В ходе естественной прогрессии заболевания процесс разрастания начинает затрагивать в большей степени диафизы костей, постепенно формируя форму «колбы Эрленмейера». Эти этапы развития занимают около 5–7 лет. У детей, прошедших ТГСК, процесс резорбции восстановлен, поэтому дальнейшего патологического разрастания костной ткани не происходит [18, 19]. Таким образом, в зависимости от возраста пациента и формы заболевания рентгенологическая картина остеопетроза значительно отличается. При этом нам удалось показать, что у всех детей независимо от возраста при рентгенологическом исследовании отмечаются патогномоничные признаки остеопетроза: повышение рентгенологической плотности костей и ранняя оссификация. Подобная специфическая рент генологическая картина позволяет не только заподозрить, но и подтвердить диагноз.

1. Pangrazio A., Pusch M., Caldana E. Molecular and clinical heterogeneity in CLCN7-dependent osteopetrosis: report of 20 novel mutations. Hum Mutat 2010;31(1):1071–80. 2. Bhargava A., Blank R. Osteopetrosis. Emedicine Oct 13, 2009; Emedicine. medscape.com/article/123968-overview. 3. Гинтер Е., Краснов М., Кириллов А. Аутосомно-рецессивный остеопетроз. Метод указания. Чебоксары, 2004. 36 с. 4. Близнец И.А., Тверская С.М., Зинченко Р.А. и др. Молекулярно- генетическая причина остеопетроза в Чувашии. Мед ген 2005;4(7):315–21. 5. Кириллов А.Г. Наследственные болезни в Чувашской Республике. Автореф. дис. … докт. мед. наук, 2008. 6. Stark Z., Savarirayan R. Osteopetrosis. Orphanet J Rare Dis 2009;4:5. 7. Steward C.G. Neurological aspects of osteopetrosis. Neuropathol Appl Neurobiol 2003;29(2):87–97. 8. Fasth A. Osteopetrosis – more than only a disease of the bone. Wiley Inter Science 0.1002/ajh.21454. 18 May 2009.

9. Сахаровская Е., Stepensky P., Rheingold L. и др. Клинические проявления инфантильной (злокачественной) формы остео петроза. Онкогематол 2010;4:28–32. 10. Schulz A.S., Moshous D., Steward C.G., Villa A. Osteopetrosis Consensus guidelines for diagnostics, therapy and follow up. Consensus guidelines of the ESID and the EBMT: Version 0.17092009х. 11. Tolar J., Bonfim C., Grewal S., Orchard P. Engraftment and survival following hematopoietic stem cell transplantation for osteopetrosis using a reduced intensity conditioning regimen. Bone Marrow Transplantation 2006;38(12):783–7. 12. Stepensky P., Schulz A.S., Lahr G. et al. Successful second haploidentical SCT in osteopetrosis. Bone Marrow Transplantation 2010 Sep 20 [Epub ahead of print]. 13. Frattini A., Orchard P.J., Sobacchi C. et al. Defects in TCIRG1 subunit of the vacuolar proton pump are responsible for a subset of human autosomal recessive osteopetrosis. Nat Genet 2000;25(3):343–6. 14. Cleiren E., Benichou O., Van Hul E. et al. Albers-Schonberg disease (autosomal

dominant osteopetrosis, type II) results from mutations in the C1CN7 chloride channel gene. Hum Mol Genet 2001;10:2861–7. 15. Pangrazio A., Pusch M., Caldana E. Molecular and clinical heterogeneity in CLCN7-dependent osteopetrosis: report of 20 novel mutations. Hum Mutat 2010;31(1):E1071–80. 16. Ogbureke K.U., Zhao Q., Li Y.P. et al. Human osteopetroses and the osteoclast V-H+-ATPase enzyme system. Front Biosci 2005;10(1):2940–54. 17. Baron R. Anatomy and Ultrastructure of Bone. Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. 4th ed, Philadelphia, 1999. 18. Aker M., Shapira M.Y., Resnick I. et al. Allogeneic stem cell transplantation for the treatment of diseases associated with a deficiency in bone marrow products. Springer Semin Immunopathol 2004;26 (1–2):133–42. 19. El-Tawil T., Stoker D. Benign osteopetrosis: a review of 42 cases showing two different patterns. Skeletal Radiol 1993;22(8):587–93.

’2012

Л И Т Е Р А Т У Р А

РЕДКИЕ БОЛЕЗНИ: ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА

ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ

Оптимизация экспериментальных моделей заболевания лейкозом у человека (обзор литературы)

’2012

Д.Д. Панков1, 2, А.Г. Румянцев1 ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, Москва; Мемориальный онкологический центр им. Слоуна-Кеттеринга, Нью-Йорк 1

Контакты: Дмитрий Дмитриевич Панков pankovd@mskcc.org Данный обзор литературы посвящен актуальной проблеме оценки перспективности иммунотерапии, в том числе антигенспецифической клеточной терапии, при помощи животных моделей. В обзоре рассматриваются разные группы животных моделей, существующих на данный момент, и описываются методы создания этих моделей от разных линий иммунодефицитных мышей до нескольких вариантов приживления опухолевых клеток в организм животного. В обзоре затрагиваются темы возможного изучения стволовых опухолевых клеток с использованием мышиных моделей для лечения лейкоза при помощи адоптивной клеточной терапии, в том числе WT1. Затрагивается вопрос миграции, пролиферации человеческих лейкозных клеток в разных линиях мышей с разной степенью иммунодефицита. Предлагается сравнивать мышиную модель по иммунодефициту с клинической ситуацией у человека после курса химиотерапии, из этого следует оценка возможной эффективности иммунотерапии. Ключевые слова: иммунотерапия, антигенспецифическая клеточная терапия, животные модели иммунодефицитных мышей, NOD/SCID, NSG, WT1

Optimization of experimental human leukemia models (review) 1

D.D. Pankov1, 2, A.G. Rumyantsev1 Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology named after Dmitry Rogachev, Ministry of Health of Russia, Moscow; 2 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, USA

Actual problem of assessing immunotherapy prospects including antigen-specific cell therapy using animal models was covered in this review. Describe the various groups of currently existing animal models and methods of their creating – from different immunodeficient mice to se veral variants of tumor cells engraftment in them. The review addresses the possibility of tumor stem cells studying using mouse models for the leukemia treatment with adoptive cell therapy including WT1. Also issues of human leukemia cells migration and proliferation in a mice with different immunodeficiency degree are discussed. To assess the potential immunotherapy efficacy comparison of immunodeficient mouse model with clinical situation in oncology patients after chemotherapy is proposed. Key words: immunotherapy, antigen-specific cell therapy, animal models, immunodeficient mice, NOD/SCID, NSG, WT1

Значительные шаги, сделанные в направлении онимания молекулярной основы онкогенеза, позвоп лили наметить, а в ряде случаев и реализовать дифференцированные методы лечения этой патологии, проецирующиеся на молекулярный уровень, включая клеточную терапию [1]. Однако многие биологически активные средства, которые при испытаниях in vitro позволяли надеяться на заметный лечебный эффект, оказываются неэффективными при весьма затратных дальнейших клинических испытаниях, что подчер кивает значимость выбора оптимальной экспери ментальной модели заболевания у человека при исследованиях in vivo. Особенно остро стоит вопрос об оптимальном, методически оправданном выборе преклинической экспериментальной модели для тестирования способов лечения онкологических заболеваний, планируемых для использования в детской практике, так как клинические исследования лекарст венных препаратов у детей во многих странах ограничены или запрещены. А потребность в новых эффективных и малотоксичных препаратах, особенно когда

речь идет об онкологии, тем более лейкозе, очень высока [2, 3]. Одним из примеров такой терапии может быть антигенспецифическая адоптивная клеточная терапия, которая активно развивается на данный момент. Поэтому работа с преклинической экспериментальной моделью может дать результаты, которые могут помочь в ближайшем будущем с выбором приоритетного метода лечения в клинике [4]. Мышиные модели играют особенно важную роль для оценки эффективности иммунотерапии перед ее использованием в клинических условиях, таких как, например, адоптивная терапия WT1 Т-клетками для лечения лейкоза. За последние десятилетия приживление человеческих лейкозных клеток мышам с разной степенью дефицита иммунитета проявило себя как очень эффективный инструмент в изучении патогенеза лейкоза. Мышиные модели могут быть в будущем одним из способов прогнозирования эффективности кон кретного метода лечения лейкоза [5]. Это связано с рядом принципиальных обстоятельств:

При использовании мышиной модели как инструмента для прогноза развития и исхода лейкоза у пациента необходимо учитывать, что мы следим за раз витием процесса с самого начала, т. е. от момента введения нескольких миллионов лейкозных клеток до их экспансии до десятков и сотен миллионов. Такая же динамика может наблюдаться у пациента после спровоцированного курсом химиотерапии состояния иммунодефицита. Поэтому считается, что мышиная модель развития опухоли сопоставима по иммунодефициту с ситуацией, возникающей у человека, получившего химиотерапию. Однако необходимо учитывать, что это сопоставление не является адекватным по клону опухолевых клеток. При обсуждении вопроса о целесообразности проведения конкретному пациенту антигенспецифической терапии необходимо знать: являются ли клетки, презентирующие конкретный антиген, стволовыми опухолевыми клетками, которые обеспечивают поддержание опухолевой популяции. Если этот так, то при помощи антигенспецифической терапии принципиально возможно остановить или значительно замедлить рост опухоли, которая является следствием патологического процесса, ведущего к возникновению новообразованной ткани с генетически измененным аппаратом клеток и нарушенной регуляцией их роста. При этом очень важно иметь в виду, что в опухоли имеются собственные стволовые клетки [19]. Их отличает нарушение принципа плюрипотентности [20]. Опухолевые стволовые клетки способны к самооб новлению. Один из наиболее вероятных факторов, который может быть ассоциирован с этим процессом, это – экспрессия внутриклеточного белка WT1 [21–24]. Наиболее благоприятной для применения антигенспецифической терапии является ситуация, возникающая после активного и радикального (например такого, как химиотерапия) лечения больного лейкозом, когда зрелые клетки погибли, а рост новой опухоли (рецидив) может начаться за счет стволовых опухолевых клеток. И если антиген WT1 экспрессируется в достаточном количестве в этих клетках, то они становятся подходящей мишенью для антигенспецифической иммунотерапии [4, 25]. Так, в работах группы Е. Дубровиной, O’Reilly было показано, что антигенспецифичный лизис опухолевых клеток эффекторными WT1-специфичными Т-клетками коррелирует с пропорцией клеток, экспрессирующих этот белок в опухолевой популяции клеток [4, 20, 25]. Для изучения действия антигенспецифической терапии на стволовые опухолевые клетки необходима мышиная модель, в которой влияние NК-клеток будет незначительным, как это имеет место, например, в NSG-линии. Наличие мышей линии NSG, в организме которых подавлена активность NК-клеток, может дать новый импульс для исследований in vivo по такой еще мало изученной и весьма перспективной

’2012

1) схожесть функционирования костного мозга мышей и человека [6]; 2) мышиная модель позволяет размножать опухолевые клетки in vivo для их дальнейшего изучения [7]; 3) после приживления клеток острого лимфобласт ного лейкоза (ОЛЛ) или острого миелобластного лейкоза (ОМЛ) в мышиной модели можно наблюдать все клинические признаки, свойственные развитию заболевания у человека [8]; 4) существует достаточное разнообразие мышиных моделей, отличающихся наличием или отсутствием цитокинов и макрофагов, Т- и В-лимфоцитов и натуральных киллеров (NК-клеток) [9]. Более 25 лет назад у мышей была обнаружена мутация, которая приводит к тяжелому комбинированному иммунодефициту (SCID) [10], что позволило производить им трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) без осложнения в виде отторжения трансплантата. Трансплантация таким мышам лейкозных клеток и лейкозных клеточных линий позволила наблюдать у них динамику развития лейкоза, схожую с человеческой [11, 12]. Однако остаточные иммунные механизмы ограничивали пределы роста опухоли. Тогда было осуществлено скрещивание мышей SCID с особями линии nonobese diabetic (NOD/Lt). В результате была генерирована новая линия мышей NOD/SCID с улучшенной приживаемостью опухолевых клеток (NOD/LtSz-scid/scid) [13]. Хотя трансплантация NOD/SCID мышам клеток ОЛЛ позволила создать модель распространения лейкоза, схожую с аналогичными процессами у человека, работа по совершенствованию данной модели забо левания была продолжена [14, 15]. Линия мышей (NOD/SCID) была модифицирована путем подавления роста и развития NК-клеток и за счет создания дефекта γ-цепей рецептора интерлейкина 2, обозначенная как линия NSG. У таких особей оказалось обеспечено почти 100 % приживление опухоли, и in vivo стала возможной дифференцировка трансплантированных гемопоэтических стволовых клеток, в связи с почти полным отсутствием мышиных иммунных клеток. Иммунодефицитные мыши являются оптимальной моделью для исследования эффективности иммунотерапии. Это позволяет оценивать действие препарата, почти полностью игнорируя вспомогательное участие иммунной системы организма хозяина [16]. Метод приживления мышам лейкемических клеток пациента после курса химиотерапии обладает определенной прогностической ценностью [17]. Однако он не является абсолютно надежным в прогно стическом плане [18]. При разработке терапевтиче ского подхода к лечению лейкоза у конкретного пациента, при сравнительной оценке методических приемов моделирование на экспериментальных животных может быть очень полезным.

ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ

’2012

ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ

теме, как антигенспецифическая иммунотерапия, направленная на опухолегенные стволовые клетки. Исследования in vivo показали, что уровень приживления опухоли и ее развития на мышиной модели связан с агрессивностью опухоли. Приживление опухоли, трансплантированной мышам от пациента с ОЛЛ после химиотерапии, идет менее интенсивно, если у донора имеет место длительная ремиссия и благоприятное течение заболевания [14]. Биологическое и клиническое течение заболевания в мышиной модели зависит не только от вида мыши, но и от тактики получения клеток из костного мозга: используют свежеполученные клетки, т. е. забранные напрямую от пациента, которые приживаются быстрее, или размороженные, или прошедшие генную модификацию, представляющую собой процесс, требующий нахождения клеток несколько дней в пробирке для дальнейшего их использования в животных моделях [26–29]. Способ введения клеток определяет скорость приживления. При этом различают несколько способов введения клеток в организм мыши: а) подкожное введение, особенностью которого является то, что можно достаточно быстро увидеть, как приживляется трансплантат, и определять его размеры по диаметру подкожного образования. Но при этом опухоль находится в неспецифичном для себя микроокружении, что может приводить к ложнопозитивному результату [16], т. е. опухоль может расти в подкожной клетчатке агрессивнее, нежели в естественном для себя окружении. Кроме этого, было продемонстрировано, что подкожное введение не приводит к метастатическому течению заболевания [16], в отличие от естественного развития онкопроцесса; б) при внутривенном введении опухолевые клетки сначала устремляются в легкие, потом направляются в печень, где могут оставаться или полностью оттуда уйти, но основным моментом является активизация хоуминг-эффекта, т. е. миграция лимфоцитов в лимфатические узлы и костный мозг, где начинается их активная продукция и развитие заболевания [30]; в) введение напрямую в костный мозг обеспечивает самый быстрый способ приживления по сравнению с системным введением [31]. При оценке значения состояния самой мышиной особи для приживления лейкоза обращают внимание на следующее: а) облучение иммуносупрессивных мышей перед трансплантацией может улучшить приживление за счет освобождения свободного пространства в кост ном мозге. Но, согласно последним данным, незначительно [15], к тому же в случае с ОЛЛ облучение может нарушать хоуминг-эффект лейкозных клеток [32]; б) остаточные мышиные клетки могут повлиять на приживление человеческих клеток на уровне продукции цитокинов [33];

в) у мышей, которые были трансдуцированы человеческими факторами роста, отмечается лучшая приживаемость клеток ОМЛ [34–36]; г) возраст мыши влияет на скорость и уровень приживления трансплантата. Чем моложе особь, тем больше шансов на приживление [37]. Новорожденные мыши используются для того, чтобы уменьшить влияние собственных мышиных иммунных клеток [38]; д) выбор мышиной линии. Сравнение мышиных линий NOD/SCID и NSG показал, что в мышиной группе NOD/SCID ОМЛ-образцы из криопрезервации, которые были трансплантированы напрямую в костный мозг, дали более быстрое приживление и на более продолжительный период [17]. Однако в случае с NSG мышами ситуация совсем другая, там имела место корреляция исходов у пациентов-доноров и исходов развития заболевания у мыши [9, 17]. В зависимости от цели исследования могут быть использованы разные мышиные модели. Если целью является экспансия клеток или исследование биологических свойств опухоли, то необходимо использовать модель, которая подразумевает наименее рези стентный рост и наиболее удобное место введения клеток. Если целью стоит создание клинической ситуации у пациента, то необходимо осторожно и внимательно относиться ко всем факторам, начиная от выбора мышей и заканчивая способом введения опухолевых клеток. Агрессивный рост опухоли и возможности для ее приживления в живом организме дают возможность не только для параклинических исследований, но также и для изучения биологических основ опухолевого процесса. На примере мышиных моделей мы можем проводить антигенспецифическую терапию, рассчитанную на атаку небольшого числа клеток, несущих на себе конкретный антиген, но если этот антиген находится на стволовой опухолевой клетке, то возможно подавить рост опухоли целиком [39]. Всегда считалось, что стволовые клетки ОЛЛ – это фенотипически незрелые и редко встречающиеся клетки, что было видно на примере NOD/SCID мышей; но в случае с NSG мышами было показано, что более зрелые и более часто встречающиеся клетки также обладают лейкемогенным потенциалом [38, 40, 41]. Существуют факторы, которые заметно уменьшают возможность использования мышиных моделей в преклинических исследованиях. Например, иммуномодулирующие препараты не могут быть использованы при проведении исследований на иммунодефицитных мышах, так как их эффект может быть доказан только в иммунокомпетентном организме. Другим ограничением является факт того, что стромальное окружение опухоли является не человеческим, а мышиным. У препаратов, которым требуется наличие специфических человеческих факторов, смешение человече ских и мышиных факторов может привести к недостоверным результатам. Самой большой проблемой

личных стадиях заболевания, что может, соответственно, обусловить несовпадение результатов. Таким образом, задача выбора оптимальной экспериментальной модели заболевания лейкозом у человека с целью разработки эффективных методов лечения на клеточном и молекулярном уровне является очень важной и актуальной. От ее решения зависит проблема повышения эффективности преклинического этапа тестирования выбранной для пациента терапии. Есть все основания считать, что на сегодняшний день именно мышиные модели заболевания лейкозом являются основой для преклинических исследований и прогнозирования эффективности выбранного метода лечения в каждом индивидуальном случае. Существующее разнообразие мышиных моделей позволяет использовать ту из них, которая в большей степени соответствует поставленной в каждом конкретном случае задаче. При использовании мышиной модели как инструмента прогнозирования развития и исхода опухоли у пациента необходимо учитывать, что при создании этой модели животному пересаживается минимальное необходимое для приживления количество клеток, и в результате имеет место начальный процесс развития опухоли. Поэтому мы считаем, что мышиная модель развития опухоли более всего сопоставима с ситуацией, возникающей у человека, получившего химиотерапию. Мышиная линия NSG может служить инструментом для оценки эффективности и перспективности антигенспецифической терапии, проводимой элиминации стволовых опухолевых клеток. Мышиная модель может быть использована для изучения и понимания биологических характеристик не только лейкозов, но и при разработке лечения больных многими другими онкологическими заболеваниями.

Л И Т Е Р А Т У Р А 1. Maschan A.A., Rumyantsev A.G. Transplantation of hematopoietic stem cells in children. Acad Mia, 2003. 2. Houghton P.J., Adamson P.C., Blaney S. et al. Testing of new agents in childhood cancer preclinical models: meeting summary. Clin Cancer Res 2002;8:3646–57. 3. Pui C.H., Relling M.V., Campana D., Evans W.E. Childhood acute lymphoblastic leukemia. Rev Clin Exp Hematol 2002;6:161–80; discussion 200–2. 4. Doubrovina E.S., Doubrovin M.M., Sangyull L. et al. In vitro stimulation with WT1 peptide-loaded Epstein-Barr viruspositive B cells elicits high frequencies of WT1 peptide-specific T cells with in vitro and in vivo tumoricidal activity. Clinical Cancer Research 2004;10:7207–19.

5. Gutmann D.H., Hunter-Schaedle K. and Shannon K.M. Harnessing preclinical mouse models to inform human clinical cancer trials. J Clin Invest 2006;116(4):847–52. 6. Boxio R., Bossenmeyer-Pourié C., Steinckwich N. et al. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol 2004;75(4):604–11. Epub 2003 Dec 23. 7. Singh P., Hu P., Hoggatt J. et al. Expansion of bone marrow neutrophils following G-CSF administration in mice results in osteolineage cell apoptosis and mobilization of hematopoietic stem and progenitor cells. Leukemia advance online publication 1 June 2012. 8. Baersch G., Möllers T., Hötte A. et al. Good engraftment of B-cell precursor ALL

in NOD-SCID mice. Klin Padiatr 1997;209(4):178–85. 9. Meyer L.H., Debatin K.M. Diversity of human leukemia xenograft mouse models: implications for disease biology. Cancer Res 2011;71:7141–4. Published OnlineFirst November 16, 2011. 10. Bosma G.C., Custer R.P., Bosma M.J. A severe combined immunodeficiency mutation in the mouse. Nature 1983;301:527–30. 11. Kamel-Reid S., Letarte M., Sirard C. et al. A model of human acute lymphoblastic leukemia in immunedeficient SCID mice. Science 1989;246:1597–600. 12. Lücking-Famira K.M., Daniel P.T., Möller P. APO-1 (CD95) mediated apoptosis in human T-ALL engrafted in SCID mice. Leukemia 1994;8:1825–33.

’2012

является фундаментальная разница между метаболизмом человека и мыши. Это ярко продемонстрировано на примере талидомида [42]. Продукты его превращения в организме человека и мыши существенно различаются: будучи абсолютно безвредным у мышей, у человека талидомид приводит к повреждению цепей ДНК и множественным врожденным аномалиям. Поэтому создание новых «человекоподобных» мышиных моделей, в которых присутствие человеческих клеток и факторов максимально увеличено, является очень важной задачей. В своих исследованиях Nomura Inaba из Химиотерапевтического центра в Токио (Япония) показал, что большое количество ложнопозитивных результатов, полученных при тестировании химиопрепаратов на мышах, связано с тем, что доза лекарственного средства, которую можно ввести мыши, в 4–5 раз выше, чем та, что можно дать человеку [43–46]. Скептицизм, связанный с результатами, полученными в исследованиях на мышах, направленных на использование новых лекарств в клинических испытаниях, связан с тем, что некоторые препараты, оказавшиеся эффективными на мышах, «не работают» у людей. Однако надо учитывать тот факт, что пациенты, которые участвуют в клинических испытаниях, чаще всего страдают далеко зашедшим, активно метастазирующим, иногда толерантным к стандартной химиотерапии онкологическим заболеванием, в то время как в экспериментах на мышах лечение начинается через 4–7 дней после трансплантации опухолевых клеток. Таким образом, терапия направлена на весьма небольшой по объему аналог опухоли человека, еще не успевший активно метастазировать и слабо организованный [16]. Следовательно, речь идет о попытке сопоставить эффективность лечения на раз-

ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ

’2012

ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ 13. Shultz L.D., Schweitzer P.A., Christianson S.W. et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J Immunol 1995;154:180–91. 14. Lock R.B., Liem N., Farnsworth M.L. et al. The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mouse model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis and relapse. Blood 2002;99:4100–8. 15. Yan Y., Salomon O., McGuirk J. et al. Growth pattern and clinical correlation of subcutaneously inoculated human primary acute leukemias in severe combined immunodeficiency mice. Blood 1996 Oct 15;88(8):3137–46. 16. Kerbel R.S. Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived – but they can be improved. Cancer Biol Ther 2003;2:134–9. 17. Schmitz M., Breithaupt P., Scheidegger N. et al. Xenografts of highly resistant leukemia recapitulate the clonal composition of the leukemogenic compartment. Blood 2011;118:1854–64. 18. Notta F., Mullighan C.G., Wang J.C. et al. Evolution of human BCR-ABL1 lymphoblastic leukaemia-initiating cells. Nature 2011 Jan 20;469(7330):362–7. 19. Allegrucci C., Wu Y.Z., Thurston A. et al. Restriction landmark genome scanning identifies culture-induced DNA methylation instability in the human embryonic stem cell epigenome. Hum Mol Genet 2007; 16:1253–68. 20. Knoepfler P.S. Deconstructing stem cell tumorigenicity: a roadmap to safe regenerative medicine. Stem Cells 2009 May;27(5):1050–6. 21. Kanato K., Hosen N., Yanagihara M. et al. The Wilms’ tumor gene WT1 is a common marker of progenitor cells in fetal liver. Biochem Biophys Res Commun 2005;326:836–43. 22. Sugiyama H. WT1 (Wilms’ Tumor Gene 1): biology and cancer immunotherapy. Jpn J Clin Oncol 2010;40(5):377–87. 23. Oji Y., Ogawa H., Tamaki H. et al. Expression of the Wilms, tumor gene WT1 in solid tumors and its involvement in tumor cell growth. Jpn J Cancer Res 1999 Feb;90(2):194–204. 24. Abbruzzese J.L., Evans D.B., Willett C.G. et al. Gastrointestinal Oncology 2004. Oxford University press. Pp. 689–90.

25. Doubrovina E., Carpenter T., Pankov D. et al. Mapping of novel peptides of WT-1 and presenting HLA alleles that induce epitopespecific HLA-restricted T cells with cytotoxic activity against WT-1(+) leukemias. Blood 2012 Aug 23;120(8): 1633–46. 26. Pearce D.J., Taussig D., Zibara K. et al. AML engraftment in the NOD/SCID assay reflects the outcome of AML: implications for our understanding of the heterogeneity of AML. Blood 2006;107:1166–73. 27. Meyer L.H., Eckhoff S.M., Queudeville M. et al. Early relapse in all is identified by time to leukemia in NOD/ SCID mice and is characterized by a gene signature involving survival pathways. Cancer Cell 2011;19:206–17. 28. Malaise M., Neumeier M., Botteron C. et al. Stable and reproducible engraftment of primary adult and pediatric acute myeloid leukemia in NSG mice. Leukemia 2011;25:1635–9. 29. Yurasov S.V., Flasshove M., Vladimirskaya E.B. et al. Low density mononuclear cells from umbilical cord blood as a target for retrovirally mediated gene trans fer. Russ J Immunol 1996 Dec;1(1):35–40. 30. Fukuda S., Abe M., Onishi C. et al. Survivin selectively modulates genes deregulated in human leukemia stem cells. J Oncol 2011;2011:946936. doi: 10.1155/2011/946936. Epub 2010 Dec 23. 31. Mazurier F., Doedens M., Gan O.I., Dick J.E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nat Med 2003;9:959–63. 32. Spiegel A., Kollet O., Peled A. et al. Unique SDF-1-induced activation of human precursor-B ALL cells as a result of altered CXCR4 expression and signaling. Blood 2004;103:2900–7. 33. Manz M.G. Human-hemato-lymphoidsystem mice: opportunities and challenges. Immunity 2007;26:537–41. 34. Wunderlich M., Chou F.S., Link K.A. et al. AML xenograft efficiency is significantly improved in NOD/ SCIDIL2RG mice constitutively expressing human SCF, GM-CSF and IL-3. Leukemia 2010;24:1785–8. 35. Bonnet D., Bhatia M., Wang J.C. et al. Cytokine treatment or accessory cells are required to initiate engraftment of purified primitive human hematopoietic cells transplanted at limiting doses into NOD/

SCID mice. Bone Marrow Transplant 1999;23:203–9. 36. Feuring-Buske M., Gerhard B., Cashman J. et al. Improved engraftment of human acute myeloid leukemia progenitor cells in beta 2-microglobulin-deficient NOD/SCID mice and in NOD/SCID mice transgenic for human growth factors. Leukemia 2003;17:760–3. 37. Ballen K.K., Valinski H., Greiner D. et al. Variables to predict engraftment of umbilical cord blood in to immunodeficient mice: usefulness of the non-obese diabetic – severe combined immunodeficient assay. Br J Haematol 2001;114:211–8. 38. Kong Y., Yoshida S., Saito Y. et al. CD34þCD38þCD19 as well as CD34þCD38CD19þ cells are leukemia-initiating cells with self-renewal capacity in human Bprecursor ALL. Leukemia 2008;22(6): 1207–13. 39. Alberta J.A., Springett G.M., Rayburn H. et al. Role of the WT1 tumor suppressor in murine hematopoiesis. Blood 2003 Apr 1;101(7):2570–4. 40. Cox C.V., Evely R.S., Oakhill A. et al. Characterization of acute lymphoblastic leukemia progenitor cells. Blood 2004;104:2919–25. 41. le Viseur C., Hotfilder M., Bomken S. et al. In childhood acute lymphoblastic leukemia, blasts at different stages of immunophenotypic maturation have stem cell properties. Cancer Cell 2008;14:47–58. 42. Parman T., Wiley M.J., Wells P.G. Free radical-mediated oxidative DNA damage in the mechanism of thalidomide teratogenicity. Nat Med 1999;5:582–5. 43. Inaba M., Kobayashi T., Tashiro T., Sakurai Y. Pharmacokinetic approach to rational therapeutic doses for human tumorbearing nude mice. Jpn J Cancer Res 1988 Apr;79(4):509–16. 44. Tashiro T., Inaba M., Kobayashi T. et al. Responsiveness of human lung cancer/nude mouse to antitumor agents in a model using clinically equivalent doses. Cancer Chemother Pharmacol 1989;24(3):187–92. 45. Inaba M., Kobayashi T., Tashiro T. et al. Evaluation of antitumor activity in a human breast tumor/nude mouse model with a special emphasis on treatment dose. Cancer 1989 Oct 15;64(8):1577–82. 46. Maruo K., Ueyama Y., Inaba M. et al. Responsiveness of subcutaneous human glioma xenografts to various antitumor agents. Anticancer Res 1990 Jan– Feb;10(1):209–12.

’2012

КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ

Материалы VIII Российского симпозиума «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний» Москва, 1–3 февраля 2013 г.

’2012

КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ

Молекулярные механизмы движения хромосом в митозе

Моделирование неонатального роста эмбриональной опухоли

Ф.И. Атауллаханов ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России, Москва; Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН, Москва; физический факультет ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова»

И.В. Бегун1, О.В. Красько2, О.И. Быданов1, О.В. Алейникова1 1 ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь; 2 Объединенный институт проблем информатики Национальной академии наук Беларуси, Минск, Республика Беларусь

В последние 5–6 лет был в значительной степени выяснен механизм работы нанодвигателя, обеспечивающего движение хромосомы при делении клетки. Оказалось, что хромосомы двигает машина, механизм работы которой уникален и не имеет аналогов ни в биологии, ни в технике, ни в других областях науки. Главными движителями хромосом являются микротрубочки. Эти трубки, имеющие диаметр в 25 нм и состоящие из одного белка – тубулина, могут запасать химическую энергию в виде механического напряжения, которое потом используется для движения хромосомы. Проведенное нами исследование динамики деполимеризации такой трубки с помощью лазерного динамометра показало, что они могут развивать довольно большие по молекулярным меркам силы – до 70–80 пиконьютон (R. McIntosh, F. Ataullakhanov et al. Cell, 2008; R. McIntosh, F. Ataullakhanov. J Cell Sci, 2010). Эти силы микротрубочка развивает в ходе процесса, называемого «катастрофой», – стенки микротрубочки растрескиваются вдоль ее оси и образующиеся длинные узкие «протофиламенты» изгибаются наружу и толкают специальный комплекс белков, связанных с хромосомой. Кинетохорный комплекс белков, обеспечивающих динамическое сопряжение движения хромосомы с разбирающимся концом микротрубочки, формирует сложное устройство, структуру и работу которого мы только начинаем понимать. Возможные гипотезы об устройстве этого комплекса будут проанализированы и сопоставлены с экспериментальными данными.

Задача исследования. Моделирование динамики роста эмбриональной опухоли в раннем неонатальном периоде. Пациенты и методы. Для выполнения экстраполяции обобщены результаты первичной ультразвуковой визуализации новообразования у 133 детей обоего пола в возрасте от 1 до 729 дней (медиана – 301 день) с морфологически подтвержденными эмбриональными опухолями: гепатобластомой, нейробластомой и нефробластомой. Известно уравнение роста массы t

М(t) = M02 dt , аналогично, разделив массу на плотность ткани и логарифмируя, можно записать

t log2V(t) = dt + log2V0. Принимая гипотезу линейного роста периода у двоения для эмбриона (Г.П. Седова, 2008) и выдвигая гипотезу о подобии параметров роста эмбриональной опухоли и наиболее интенсивно растущего в периоде от зачатия до 2 лет организма, нами рассматривалось уравнение log2V(t) =

t + log2V0 (1), b+k×t

где t – время; V(t) – объем опухоли в зависимости от времени; V0 = V(t = 0) – объем в момент времени; t = 0; DT = b + k × t – время удвоения как линейная функция. Если за t = 0 принять некий момент в раннем неонатальном периоде, то b интерпретируется как DT данного момента, k – постоянная скорость роста DT. Основная задача заключалась в оценке параметров нелинейного уравнения (1): DT (период удвоения опухоли в раннем неонатальном периоде) и k c учетом различий в объемах типов опухолей. Расчеты выполнялись в статистическом пакете R. Результаты. Для характеристики предклинической фазы неонатального роста эмбриональной опухоли построена нелинейная регрессионная модель по уравнению (1), даны оценки параметров в момент времени t = 0 (момент раннего неонатального периода жизни младенца). Расчетные параметры модели:

Для всей группы

25,42

3,96 46,88 0,02183

0,21

верхн.

0,17 0,26 < 0,0001

Полученные данные могут быть полезны для определения «перинатальной визуализационной точки отсчета роста» эмбриональной злокачественной опухоли.

Экспансия ЕК-клеток в присутствии EBV-трансформированной лимфобластоидной клеточной линии и интерлейкина-2 Е.П. Вашкевич, А.В. Тарасова, Т.В. Шман ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь Для экспансии естественных киллерных (ЕК, CD3-CD56+) клеток используют различные стиму ляторы, в том числе фидерные клетки, например, EBV-трансформированную лимфобластоидную клеточную линию (LCL), которую получают путем заражения нормальных В-лимфоцитов вирусом Epstein–Barr. Целью данной работы была оценка влияния LCL, полученной в нашей лаборатории, на рост ЕК-клеток in vitro. Объектом исследования являлись селектированные иммуномагнитным способом ЕК-клетки периферической крови доноров (n = 6). Клетки культивировали в среде AIM-V с добавлением 10 % AB сыворотки человека, L-глютамина и антибиотиков в присутствии или без LCL, облученной дозой 50 Гр, и интерлейкина (ИЛ) 2 (500 МЕ/мл) в течение 21 суток со сменой среды каждые 3–4 дня с добавлением или без ИЛ-2. На 7, 14 и 21-е сутки определяли прирост клеток в культуре с использованием красителя трипанового синего; субпопуляционный состав лимфоцитов (окраска антителами к CD3, CD56, CD69) и противоопухолевую активность против линии К-562 определяли методом проточной цитофлуориметрии. При экспансии селектированных клеток наблюдали активный рост ЕК-клеток в присутствии LCL и/или ИЛ-2 на 2-й неделе культивирования, который увеличивался к 21-м суткам. При этом прирост ЕК в присутствии LCL + ИЛ-2 на 21-е сутки составил 23,5 ± 5,8 раза и был значительно выше, чем в при-

сутствии только ИЛ-2 – 8,8 ± 2,0 (p = 0,08). Чистота популяции ЕК-клеток после экспансии на 21-е сутки составила 81,9 ± 3,5 %. В образцах без добавления ИЛ-2 роста ЕК не наблюдалось. Также было показано, что экспансия с использованием ИЛ-2 и его комбинации с LCL достоверно (p < 0,05) увеличивала количество активированных (CD69+) ЕК-клеток с 3,8 % на 0-й день до более чем 80 % на 21-е сутки. При анализе противоопухолевого действия экспансированных в присутствии LCL и/или ИЛ-2 ЕК-клеток получено достоверное (p < 0,05) повышение их цитотоксичности до 60 % на 21-е сутки по сравнению с таковой на 0-й день. Таким образом, нами показана возможность экспансии и активации обогащенной популяции ЕК-клеток в присутствии LCL.

Эволюция представлений о роли свободных радикалов в патогенезе болезней человека Ю.А. Владимиров Кафедра медицинской биофизики факультета фундаментальной медицины ФГБОУ ВПО МГУ им. М.В. Ломоносова Первые исследования роли свободных радикалов в сложных химических и биологических системах были выполнены под руководством академика РАН Н.М. Эмануэля в Институте химической физики им. Н.Н. Семенова РАН. В основе проводимых исследований было изучение реакций цепного окисления полиненасыщенных жирных кислот. Следующий важный шаг по изучению роли свободных радикалов в биологических системах был сделан Д. Харманом, который исследовал влияние антиоксидантов (перехватчиков свободных радикалов) на продолжительность жизни животных и развитие дегенеративных заболеваний при старении. Результатом этих исследований стало появление свободно-радикальной теории старения. Важным этапом развития представлений о роли свободных радикалов в метаболизме стало обнаружение Фридовичем и МакКордом фермента супероксиддисмутазы – фермента, субстратом которого является супероксидный радикал. Открытие супероксиддисмутазы стало важной вехой на пути детального понимания механизма участия свободных радикалов в реакциях, протекающих в норме в клетках и тканях. Интересным аспектом таких исследований стал тот факт, что реакции взаимодействия радикалов друг с другом сопровождаются свечением и за протеканием и интенсивностью этих реакций можно наблюдать, используя метод хемилюминесценции. Применение метода хемилюминесценции для изучения свободнорадикальных процессов в биологических системах позволило построить схему реакций и смоделировать

’2012

Скорость 95 % ДИ прироста DT (дней за день) нижн.

верхн.

нижн.

Нозологическая форма

DT (средн.) 95 % ДИ для неонатального периода

КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ

’2012

КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ

процессы, протекающие в полиненасыщенных липидных системах, где индукция свободных радикалов происходит под действием ионов двухвалентного железа. Исследование реакций перекисного окисления липидов позволило понять важную роль этого процесса в изменении структуры и функции биологических мембран при развитии патологических процессов. В последние годы благодаря исследованиям, проводимым в нашей лаборатории и в некоторых лабораториях за рубежом, стало известно, что свободные радикалы играют ведущую роль в реакциях запрограммированной клеточной гибели (апоптозе). В основе этих реакций лежит образование комплекса цитохрома и анионных фосфолипидов, и появления у этого комплекса пероксидазной активности. Все перечисленные выше исследования однозначно доказывают, что свободные радикалы занимают важное место в жизнедеятельности организма.

Клеточный биочип для исследования костного мозга детей с острыми лейкозами А.О. Доронина1, 3, А.Н. Хвастунова1, 2, О.С. Федянина2, Ф.И. Атауллаханов1, 2, 3, С.А. Кузнецова1, 2, 3 1 Лаборатория биофизики ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, Москва; 2 ЦТП ФХФ РАН, Москва; 3 лаборатория физической биохимии системы крови ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России, Москва Основополагающими методами при диагностике онкогематологических заболеваний являются микроскопическое (морфологическое) исследование клеток крови и костного мозга и иммунофенотипирование. Однако невозможность проведения этих исследований на одних и тех же клетках может приводить в ряде случаев к противоречиям при формулировке диагноза. Нашей группой разработан метод, совмещающий в себе определение поверхностных антигенов лейкоцитов с возможностью проведения их полноценного морфологического исследования. Метод основан на использовании клеточного биочипа. Биочип представляет собой прозрачную подложку, на которой иммобилизованы антитела к 36 поверхностным антигенам лейкоцитов. При инкубации биочипа с суспензией лейкоцитов клетки, несущие определенный поверхностный антиген, связываются с иммобилизованными антителами. После отмывки на поверхности биочипа остаются области, покрытые лимфоцитами, несущими тот или иной поверхностный антиген, морфология которых затем исследуется стандартными цитологическими методами. Таким образом, биочип позволяет исследовать морфологию клеток крови, для которых известен один из ее поверхностных CD-антигенов.

Данным методом были исследованы лейкоциты, полученные методом гипотонического лизиса эритроцитов из пунктата костного мозга детей с острыми лейкозами, поступивших на лечение в ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева. Показано соответствие определяемых с помощью биочипа морфологии и иммунофенотипа опухолевых клеток результатам, полученным стандартными диагностическими методами (с помощью морфологического исследования клеток в мазке и методом проточной цитометрии). Работа поддержана грантом РФФИ 12-04-31275.

Применение методов MLPA, ПЦР и FISH для выявления амплификации гена MYCN и делеции 1P у пациентов с нейробластомой А.Е. Друй1, 2, 3, Г.А. Цаур1, 3, А.М. Попов1, 3, О.М. Плеханова1, С.Н. Тупоногов1, Е.В. Шориков1, 3, Л.И. Савельев1, 2, 3, С.В. Цвиренко1, 2, Л.Г. Фечина1, 3 1 ГБУЗ СО «Областная детская клиническая больница № 1», Екатеринбург; 2 ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия», Екатеринбург; 3 ГБУЗ СО «Институт медицинских клеточных технологий», Екатеринбург Клиническое течение нейробластомы во многом определяется биологическими свойствами опухолевых клеток. При этом с большой частотой выявляются аберрации, связанные с увеличением или уменьшением числа копий (амплификации и делеции) определенных хромосомных регионов, и ряд из них имеют неблагоприятное прогностическое значение в отношении общей и бессобытийной выживаемости пациентов. К данным молекулярно-генетическим маркерам относятся амплификация гена MYCN и делеция короткого плеча хромосомы 1 (del1p), их точное опреде ление необходимо для корректной стратификации больных на группы риска и выбора оптимальной терапевтической стратегии. На сегодняшний день предложено большое количество молекулярно-генетиче ских методов, служащих для выявления аберраций, связанных с изменением числа копий отдельных генов или хромосомных локусов, среди них полимеразная цепная реакция (ПЦР), ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ), FISH, сравнительная геномная гибридизация, анализ однонуклеотидных полиморфизмов и др. Относительно новой методикой является множественная лигазно-зависимая амплификация зондов (MLPA), основанная на амплификации олигонуклеотидных зондов, специфичных к анализируемым локусам, при условии лигирования их составных частей. Целью исследования явилось проведение качественного сравнения результатов определения количес-

Подбор условий для in vitro дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в хондрогенном направлении А.А. Жерносеченко, Я.И. Исайкина ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) обладают способностью дифференцироваться по хондрогенному пути под воздействием ряда ростовых факторов in vitro. Подтверждением дифференцировки может

служить синтез клетками протеогликанов и различных типов коллагена. Цель – подбор условий для in vitro дифференцировки МСК в хондрогенном направлении. Материалы и методы. МСК, полученные из костного мозга доноров, дифференцировали в 3D-системе под воздействием трансформирующего ростового фактора TGFβ1 или TGFβ3, инсулиноподобного ростового фактора IGF, дексаметазона и аскорбиновой кислоты в течение 28 дней. Оценка экспрессии генов коллагена 1, 10 и аггрекана проводилась методом RT-qPCR. Материалом для иммуногистохимического исследования синтеза коллагена II являлись МСК до и после дифференцировки в присутствии TGFβ1, инкубированные с раствором первичных антител анти-COL2A1 (1 : 50) и раствором вторичных антител: AlexaFluor 488 (1 : 400) с последующим анализом на конфокальном микроскопе Leica. Гистологический анализ проводили окраской толуидином синим и са франином О. Результаты. Гистологическое окрашивание культуры клеток после 7 суток дифференцировки в присут ствии как TGFβ1, так и TGFβ3 показало более интенсивную окраску толуидином синим и сафранином О по сравнению с недифференцированными МСК, что является доказательством синтеза клетками кислых мукополисахаридов, характерных для хондроцитов. Изменение степени интенсивности флуоресценции Col2A в культуре МСК с 16,42 ± 2,38 на 0-й день до 56,15 ± 5,50 на 28-й день дифференцировки свидетельствует об активации клетками синтеза коллагена II, причем характерным является основная его локализация в составе внеклеточного матрикса. При культивировании МСК в присутствии TGFβ3 на 21-е сутки выявлена более интенсивная экспрессия коллагена X (0,09 (00024–2,694)) и аггрекана (0,15 (0,0234–0,158)), но более низкая экспрессия коллагена I (0,0001 (0–256)), чем при использовании TGFβ1 (0,0595 (0,032–0,135), 0,0994 (0,667–0,262) и 0,0029 (0,00159–0,0041) соответственно). Таким образом, полученные нами результаты могут свидетельствовать о том, что приоритетным ростовым фактором для дифференцировки МСК в хондроцитоподобные клетки может быть TGFβ3.

Кинетическая хемилюминесценция как метод оценки антиоксидантной активности Д.Ю. Измайлов, Ю.А. Владимиров Факультет фундаментальной медицины ФГБОУ ВПО МГУ им. М.В. Ломоносова Хемилюминесцентный метод является наиболее информативным для изучения реакций с участием свободных радикалов и действия антиоксидантов, поскольку он позволяет осуществить непосредствен-

’2012

тва копий гена MYCN и del1p методами MLPA, ПЦР, ПЦР-РВ и FISH. Сто двадцать шесть образцов ДНК, выделенной из ткани опухоли 122 больных нейробластомой, были исследованы методом MLPA с использованием наборов SALSA P251 и P252 (MRC Holland) и ПЦР-РВ для выявления амплификации MYCN. Из них 23 образца нейробластомы анализировались методом FISH. Определение del1p было выполнено 70 пациентам с помощью анализа вариабельного числа тандемных повторов микросателлитных локусов в области короткого плеча хромосомы 1 (ПЦР VNTR), 22 пациентам – с помощью FISH. Амплификация гена MYCN была выявлена методами MLPA и ПЦР-РВ в 22 образцах ткани опухоли от 21 пациента. В 6 из 23 образцов нейробластомы, исследованных методом FISH, была выявлена амплификация MYCN. В данных образцах аберрация определялась как с помощью MLPA, так и с помощью ПЦР-РВ. Таким образом, качественная сходимость результатов анализируемых методик достигла 100 %. В 7 из 70 образцов была определена del1p с использованием ПЦР VNTR, в 6 (8,57 %) из них делеция была выявлена MLPA. В 2 (2,86 %) образцах del1p определялась только MLPA и в 1 (1,43 %) – только ПЦР VNTR. В 61 (87,14 %) образце делеция не была обнаружена ни одним методом, качественная сходимость результатов составила 95,71 %. При сравнении результатов выявления del1p методами ПЦР VNTR и FISH расхождения были получены в 2 (9,09 %) случаях, еще в 2 образцах делеция была обнаружена обоими ме тодами. При этом сходимость результатов состави ла 90,91 %. Таким образом, все анализируемые методики, предложенные для выявления аномалий, связанных с изменением числа копий отдельных регионов, продемонстрировали высокую качественную сходимость результатов. Все они, включая технологию MLPA, могут быть применены в клинической практике для определения прогностических биологических маркеров.

КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ

’2012

КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ

ное детектирование свободных радикалов, а также регистрировать кинетику образования свободных радикалов. Антиоксиданты оказывают различное влияние на кинетику хемилюминесценции – одни антиоксиданты преимущественно влияют на интенсивность свечения, другие вызывают появление задержки свечения на начальном этапе (латентный период). Как следствие, в хемилюминесцентных методах до сих пор не существует единых и универсальных характеристик антиоксидантного действия. Наиболее адекватным методом анализа антиоксидантного действия различных веществ может служить математическое моделирование кинетики хемилюминесценции. Показано, что влияние антиоксидантов на кинетику хемилюминесценции может быть описано одной общей реакцией взаимодействия антиоксиданта со свободными радикалами. По значению константы этой реакции антиоксиданты можно условно разделить на «сильные» и «слабые». Сильные антиоксиданты, обладающие высокими значениями константы скорости реакции взаимодействия с радикалами, вызывают полное подавление свечения на начальных этапах. Слабые антиоксиданты имеют низкие значения константы скорости реакции взаимодействия с радикалами и для них характерно частичное подавление интенсивности свечения в течение длительного периода времени. Таким образом, математическое моделирование позволяет объяснить характер влияния антиоксидантов на кинетику хемилюминесценции и предложить универсальный параметр для оценки и сравнения антиоксидантной активности различных веществ.

Получение противоопухолевой вакцины на основе аутологичных дендритных клеток для иммунотерапии пациентов с опухолями головного мозга Я.И. Исайкина, Р.Л. Высоцкая, Т.В. Шман, Е.П. Вашкевич ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь Глиобластома является одной из наиболее агрессивных первичных опухолей головного мозга, поэтому применение иммунотерапии, а именно вакцины на основе дендритных клеток (ДК) в качестве адъювантной, является многообещающим, так как направлено на активацию противоопухолевого ответа пациента. Целью работы было оценить фенотипические и функциональные свойства генерированной in vitro вакцины ДК, разработать схему проведения вакцино-

терапии и осуществить подбор эффективной дозы вводимых клеток. Вакцину ДК генерировали in vitro из моноцитов пациентов, культивируя их в присутствии IL-4 и GM-CSF и нагружая лизатом аутологичных опухолевых клеток. Фагоцитарную активность ДК определяли по степени поглощения ими опухолевого гомогената методами проточной цитофлуориметрии и конфокальной микроскопии. В смешанной культуре с лимфоцитами оценивали противоопухолевую активность вакцины ДК по экспрессии CD107а на лимфоцитах и антигенпрезентирующую функцию – по степени активации и пролиферации Т-лимфоцитов. Результаты. Полученная вакцина содержала 83,55 ± 6,87 % клеток, экспрессирующих CD83+СD209+. После инкубации с опухолевым гомогенатом уровень флуоресценции ДК в области спектра испускания PKH-26, которым был обработан гомогенат, составил 90,8 ± 4,8 %, что свидетельствовало о высокой фагоцитарной активности ДК. При культивировании лимфоцитов в присутствии вакцины ДК наблюдалось увеличение популяции CD3+CD8+, CD3+CD8- и CD3+ в 13,0 ± 6,6; 20,9 ± 8,2 и 17,3 ± 6,0 раз соответственно по сравнению с контролем (p < 0,05), а также достоверное повышение по сравнению с контролем активированных CD3+CD8+CD69+ (p < 0,05). Относительное количество CD3+107a+ и CD3+CD8+107a+ клеток было в 2 раза выше, чем в контроле (p < 0,05). Таким образом, вакцина ДК способна индуцировать активацию и пролиферацию Т-лимфоцитов в смешанной культуре. Установлена рекомендуемая доза ДК для получения иммунологического эффекта, равная 1,0–1,2 × 107 клеток, минимальная доза – 0,5–0,7 × 107 и влияние кумулятивной дозы вакцины ДК на иммунный ответ. Разработан метод вакцинотерапии, включающий получение опухолевого лизата из клеток опухоли пациента, проведение пациенту процедуры лейкафереза после окончания химиолучевой терапии, генерация вакцины ДК in vitro и ее введение в дозе 0,7–1,2 × 107 внутрикожно, в следующем режиме: 1-я вакцина – день 7–8 после лейкафереза; 2-я и 3-я вакцины – с интервалом в 2 недели после первой, 4-я и каждая по следующая вакцина – 1 раз в месяц.

Прогностическая значимость L- и Н-изоферритинов при миелодиспластических синдромах Ж.М. Козич, Л.А. Смирнова, Д.К. Новик ГУ «Республиканский научно-практический центр радиационной медицины и экологии человека», Гомель, Беларусь; ГУ «Белорусская медицинская академия последипломного образования», Минск, Беларусь Миелодиспластический синдром (МДС) – это гетерогенная группа заболеваний, объединенных общи-

Значение молекулярно-генетической диагностики BCR-ABL1 у детей с хроническим миелолейкозом В.А. Лавриненко, Т.В. Савицкая, А.Н. Лилей, Р.И. Юцкевич ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь Молекулярная диагностика химерного онкогена BCR-ABL1 с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени (РВ-ПЦР) является самым чувс-

твительным методом мониторинга ответа на терапию у пациентов с хроническим миелолейкозом (ХМЛ). С началом использования ингибиторов тирозинкиназ (ИТК) (иматиниба и др.), позволяющих достигать молекулярного ответа на лечение, все большее значение приобретает стандартизация лабораторных методов мониторинга и интерпретации результатов, а также изучение механизмов устойчивости к ИТК. Цель работы: анализ молекулярного ответа у детей с ХМЛ и оценка минимальной резидуальной болезни (МРБ), сравнение уровня МРБ в костном мозге (КМ) и периферической крови (ПК), изучение причин потери ответа на ИТК. Материалы и методы. В исследование включены 25 детей с ХМЛ. Мониторинг МРБ на терапии иматинибом проводили методом количественной РВ-ПЦР (EAC, 2003) в образцах КМ и/или ПК. В качестве стандартов использовали наборы Ipsogen (Франция). Метод секвенирования использовали для определения точечных мутаций в гене BCR-ABL1. Цитогенетиче ские исследования проводили с использованием методов FISH и дифференциальной окраски (G). Результаты. Медиана уровня BCR-ABL1/ABL1 на момент постановки диагноза составила 1,3 (0,46–2,05). Медиана уровня МРБ составила на 3-й месяц лечения 5 (0,3–47) %, на 6-й месяц – 0,36 (0,03–35) %, на 12-й месяц – 0,41 (0,001–133) %, на 15-й месяц – 0,065 (0,006–126) %, на 18–24-й месяц – 0,024 (0,0001–150) %. Для определения клинической значимости МРБ в ПК уровни BCR-ABL1/ABL1 сравнивали в 80 парных КМ и ПК. Уровень кор реляции составил r = 0,8805, p < 0,05 (для КМ сред- нее = 1,1622 %, медиана = 0,0189 %; для ПК сред- нее = 1,1044 %, медиана = 0,0192 %). Потерю ответа на иматиниб наблюдали у 5 пациентов, причинами которой явилась мутация BCR-ABL1E255V у 1 пациента; а также могло стать появление дополнительных хромосомных перестроек: +der(22) t(9;22)(q34;q11) у 2 больных и del(21)(q22) у 1 пациента на этапах лечения, появление одновременной экспрессии 2 транскриптов b2a2 + b3a2 у 1 пациента с началом потери ответа на терапию. Выводы. Для мониторинга МРБ у пациентов с ХМЛ возможно использовать ПК. Механизмы резистентности к иматинибу у детей разнообразны и включают как точечные мутации, так и дополнительные хромосомные перестройки.

’2012

ми признаками: цитопенический синдром, наличие дисмиелопоэза и высокая частота трансформации в острый лейкоз. В 1997 г. с целью оценки прогноза и выбора тактики лечения для пациентов с впервые установленным диагнозом МДС была разработана Шкала IPSS (International Scoring Prognostic System – Международная Шкала оценки прогноза). Используя эту си стему, пациентов с МДС подразделяют на группы низкого и высокого риска. Согласно этой Шкале пациенты РАИБ-1 и РАИБ-2 относятся к высокой группе риска с низкой общей выживаемостью, поэтому необходим поиск новых прогностических маркеров для определения тактики ведения и лечения таких пациентов. Гиперферритинемия описана ранее как при различной онкопатологии, так и при ряде гемобластозов. В последние годы обнаружено, что ферритин рассматривают как биомаркер, связанный с пролиферирующим опухолевым клоном. В нашем исследовании мы определяли уровень H- и L-изоферритинов у пациентов с МДС РАИБ-1 и РАИБ-2 и провели оценку взаимосвязи изучаемых показателей с общей выживаемостью пациентов с МДС, рассчитанной с момента постановки диагноза. Оценка взаимосвязи производилась с использованием регрессионного анализа Кокса. При этом только для принадлежности пациентов к одной из подгрупп с высоким (> 1500 мкг/мл) или низким (< 1500 мкг/мл) уровнем L-ферритина (p = 0,01) была достигнута статистическая значимость. Относительный риск смерти при уровне L-ферритина больше 1500 мкг/мл составил 7,06 (95 % ДИ 1,39 – 35,77; p = 0,018). Общая выживаемость у пациентов с МДС с уровнем L-ферритина менее 1500 мкг/мл значительно выше по сравнению с пациентами с уровнем L-ферритина более 1500 мкг/мл, где не только снижена общая выживаемость, но и повышен риск трансформации в острый лейкоз. Уровень содержания L-ферритина может быть использован как дополнительный параметр для выявления вероятности трансформации МДС в острый лейкоз, так как отражает стадию процесса.

КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ

’2012

КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ

Клиническая эффективность комбинации бендамустина и ритуксимаба в лечении пациентов с рецидивами и/или рефрактерными формами хронического лимфолейкоза А.И. Лукина1, С.В. Сёмочкин2, В.Л. Иванова3, Н.К. Хуажева3, Л.А. Муха3, Е.Г. Аршанская3, И.Е. Лазарев3, М.М. Панкрашкина1, В.В. Птушкин1 1 ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, Москва; 2 ГБОУ ВПО «Российский научно-исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, Москва; 3 ГУЗ «Городская клиническая больница им. С.П. Боткина» Департамента здравоохранения г. Москвы Цель настоящего исследования заключалась в оценке клинической эффективности комбинации бендамустина и ритуксимаба у больных с рецидивами и/или рефрактерным течением хронического лимфолейкоза (ХЛЛ). Пациенты и методы. В исследование включено 20 пациентов (мужчин – 15, женщин – 5) с рецидивами и/или рефрактерным ХЛЛ. Семнадцать (85 %) пациентов получили терапию по схеме BR: бендамустин 90 мг/м2 в/в в день 1 и 2 + ритуксимаб 375 мг/м2 в день 1 цикла 1 и 500 мг/м2 в последующие циклы. В 3 (15 %) случаях назначался бендамустин в монорежиме в дозе 100 мг/м2 в дни 1 и 2 каждые 28 дней. Планировалось проводить 6 циклов терапии. Результаты. Медиана возраста больных составила 63,4 (52–77) года. У 10 (50 %) пациентов была установлена стадия С по Binet. В 2 (10 %) случаях пациенты имели del17p. Семь (35 %) были с рецидивами, 13 (65 %) – рефрактерными. Медиана количества линий предшест вующей терапии – 2 (1–6). Большинство пациентов ранее получали флударабин – 15 (75 %), ритуксимаб в комбинации с полихимиотерапией – 17 (85 %) и в качестве поддерживающей терапии – 9 (45 %). Наилучшим ответом на предшествующую терапию была полная ремиссия (ПР) у 5 (25 %), частичная ремиссия (ЧР) – у 8 (40 %) и стабилизация болезни (СБ) – у 5 (25 %) больных. При медиане наблюдения 5,6 мес от начала терапии бендамустином живы все пациенты. Не зарегистрировано ни одной смерти вследствие токсичности. Медиана количества циклов проведенной терапии составила 4 (2–6). Ответ оценен у 17 (85 %) пациентов: ≥ ЧР достигли 9 (53%) из 17 пациентов, СБ – 6 (35 %). Не ответили на лечение 2 (12 %) пациента. Вероятность достижения ≥ ЧР была выше у пациентов, получивших менее 3 линий терапии (p = 0,004), и в случае рецидива заболевания против рефрактерности к предшествующему лечению (p = 0,01). Не влияли на вероятность достижения от-

вета предшествующая терапия флударабином, наличие “bulky disease”, В-симптомов и С-стадия (p < 0,05). Выводы. Комбинация химиотерапии BR является эффективным и безопасным методом лечения рецидивирующего и/или рефрактерного ХЛЛ после флударабинсодержащих режимов.

Влияние профилактического рентгеновского облучения на жизнеспособность резидуальных лейкоцитов компонентов крови Н.П. Масленникова1, М.В. Пешикова2, И.И. Спичак1, 2, Е.В. Жуковская3 1 ГБУЗ «Челябинская областная детская клиническая больница»; 2 ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздрава России; 3 ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева, Москва Актуальность. Для предотвращения развития посттрансфузионной реакции «трансплантат против хозяина» у пациентов с онкогематологическими заболеваниями применяется рентгеновское облучение компонентов крови. Процедура облучения контролируется исключительно дозиметрическими методами. На сегодняшний день нет стандартизованной методики валидации процедуры профилактического облучения компонентов крови с контролем качества конечного продукта. Целью исследования мы поставили изучение количественного и качественного состава резидуальных лейкоцитов компонентов крови, а также динамику изменения этих показателей при воздействии профилактического рентгеновского облучения суммарной дозой 25 Грей. Материалы и методы. Материалом для исследования послужили эритроцитная масса, обедненная лейкоцитами (n = 25) и фильтрованные эритроциты (n = 25). Рентгеновское облучение образцов ком понентов крови проводилось на установке RadGil (Gilardoni, Италия) суммарной дозой 25 Грей за 30 мин. Жизнеспособность остаточных лейкоцитов определялась методом проточной цитометрии на проточном лазерном цитофлюориметре Facs Canto II (Becton Dickinson, США). Гейтирование проводилось по интенсивности экспрессии CD45. Жизнеспособность лейкоцитов оценивалась по включению клетками витального красителя Via-Probe™ (BD Biosciences), содержащего 7-Амино-актиномицин D (7-AAD). Каждый образец анализировался до и сразу же после рент геновского облучения, отсроченный эффект изучали через 4 и 24 ч. Результаты. Особенности цитометрического анализа резидуальных лейкоцитов компонентов крови

Механизмы действия низкоинтенсивного лазерного излучения Т.В. Мачнева, А.Н. Осипов ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва Низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ) нашло широкое применение в различных областях современной медицины. Однако подбор доз и выбор вида излучения осуществляется в основном эмпирическим путем, и результаты лазерной терапии не всегда оказывают положительное действие. Важную роль в этом процессе играют акцепторы лазерного излучения. При этом фотоакцепторами могут являться, например, эндогенные (ЭП) и экзогенные порфирины и другие соединения. Количество ЭП возрастает при целом ряде патологических состояний, в том числе при раневых процессах и при шоковых состояниях. Выявление роли ЭП может позволить добиться большего эффекта в профилактике и лечении многих патологических состояний, например раневых процессов и эндотоксического шока. Кроме того, данные патологические состояния являются показательными моделями исследования эффектов НИЛИ при развитии воспалительных процессов и нарушении микроциркуляции соответственно. Целью работы было исследование роли ЭП в действии лазерного излучения в норме и при экспериментальных патологических состояниях – раневом процессе и эндотоксическом шоке у крыс, а также выявление патофизиологических мишеней действия НИЛИ. В наших экспериментах мы использовали низкоинтенсивное лазерное излучение в красном (632 нм), синем (442 нм) и зеленом (530 нм) диапазонах спектра. Обнаружили, что облучение животных НИЛИ увеличивало супероксиддисмутазную активность, активность раневых экссудатов и плазмы крови, при этом наиболее существенные изменения наблюдали при патологических состояниях. При исследовании лазериндуцированных изменений функциональной актив-

ности полиморфно-ядерных лейкоцитов раневых экссудатов и крови крыс обнаружили аналогичные зависимости. Указанные эффекты зависели от дозы и длины волны излучения. Также исследовали уровень перекисного окисления липидов мембран лейкоцитов и эритроцитов. Обнаружили и исследовали зависимость выявленных эффектов от количества ЭП. Выявили возможную роль ЭП как первичных акцепторов НИЛИ в эффектах на супероксиддисмутазную активность и функциональную активность лейкоцитов.

Измерение экспрессии изоформ гена IKZF1 при остром лимфобластном лейкозе методом RQ-PCR А.Н. Мелешко, И.В. Прохореня ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь Современные методы молекулярно-генетических исследований в диагностике острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) в последние годы выявили нарушения в ряде генов, вовлеченных в патогенез этого заболевания. Среди них интерес представляют гены транскрипционных факторов (ТФ), специфически контролирующие лимфоидную дифференцировку, такие как pax5, EBF-1, IKZF1 (Ikaros), IKZF2 (Helios), IKZF3 (Aiolos). Структурные изменения в этих генах обнаружены у 40 % больных В-линейным ОЛЛ, особенно для pax5-гена (31,7 %) и Ikaros (28,6 %). Ikaros, кодируемый геном IKZF1, является ключевым транскрипционным фактором, регулирующим ранние этапы дифференцировки Т- и В-лимфоцитов, NK-клеток и дендритных клеток. Частичный или полный knock-out гена Ikaros у мышей ведет к высокой частоте спонтанных лейкозов и лимфом, а также к аутоиммунным заболеваниям. Белок Ikaros в ДНК-связывающем домене содержит 4 структуры «цинковых пальцев». Ген Ikaros включает 7 экзонов и транскрибируется в виде по меньшей мере 8 различных изоформ посредством альтернативного сплайсинга с использованием альтернативных экзонов. Так, длинные Ik-1, Ikx, Ik-2 и Ik-3, которые содержат по меньшей мере 3 «цинковых пальца», сохраняют высокоаффинное ДНК-связывание и локализуются в ядре. Короткие изоформы Ik-4–8, которые имеют менее 3 «цинковых пальцев», теряют свою ДНК-связывающую активность и локализуются в цитоплазме. Такие изоформы сохраняют способности образовывать гетеродимеры с полными изоформами, что приводит к потере их транскрипционной активности, поэтому они получили название доминантнонегативных изоформ (DN-Ik). Нами был разработан метод ПЦР-анализа в реальном времени для количественного измерения уровня

’2012

обусловлены следующим: низкая концентрация лейкоцитов (0,23 ± 0,09 × 10 9/л), их низкая жизнеспособность (70,1 ± 4,1 %), изменение морфологических характеристик клеток в процессе заготовки и хра нения. Нами выявлено достоверное снижение количества витальных лимфоцитов в облученной пробе (64,74 ± 4,33 %) сразу после облучения на 5,36 ± 0,63 % (р = 0,04) по сравнению с исходной и необлученной пробами. Выводы. Определение количества жизнеспособных лимфоцитов в компонентах крови методом проточной цитометрии с использованием витального красителя 7-AAD может включаться в контроль качества профилактического облучения гемакомпонентов.

КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ

’2012

КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ

экспрессии отдельных изоформ гена Ikaros. Независимо оценивалась экспрессия длинных изоформ Ik1, Ikx, Ik2 и коротких Ik4, Ik5, Ik8, Ik6. Экспрессия оценивалась в относительных единицах относительно экспрессии контрольного гена ABL. В исследование включены 49 образцов костного мозга от 36 больных ОЛЛ, включая 19 рецидивов и 13 парных случаев. Девять образцов здорового костного мозга составляли контрольную группу. В лейкозных клетках профиль экспрессии изоформ гена Ikaros в большинстве случаев сходен с таковым для нормального костного мозга. При этом отмечено снижение уровня экспрессии изоформ гена Ikaros относительно здорового костного мозга, достоверно для Ikx, Ik2, Ik4 и Ik8. В 31 % случаев ОЛЛ наблюдалась аберрантная сверхэкспрессия Ik6, превышающая средний уровнь экспрессии этой изоформы у остальных пациентов (или здоровый костный мозг) на 2–3 порядка. Это основное качественное изменение в экспрессии гена Ikaros при ОЛЛ. В парных случаях первичный диагноз – рецидив (2-й рецидив) сохраняется сверхэкспрессия Ik6, либо сохраняется его отсутствие. Сверхэкспрессия Ik6 не является фактором возникновения рецидива, но может выступать в качестве инициального события при развитии первичного лейкоза.

Аномалии кариотипа у детей с острым лейкозом в Пермском крае Д.В. Меркурьев , Н.Б. Мерзлова , О.Е. Никонова 1 ГБУЗ ПК «Пермская краевая детская клиническая больница»; 2 ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е.А. Вагнера» 1, 2

Цель исследования – выявить частоту и структуру аномалий кариотипа при остром лимфобластном лейкозе (ОЛЛ) в Пермском крае. Материалы и методы. Цитогенетическое исследование клеток костного мозга проведено у 60 детей с первично диагностированным ОЛЛ в возрасте от 11 месяцев до 14 лет (медиана – 4 года); анализировалось не менее 11 метафаз. Результаты. Клональные аномалии кариотипа выявлены у 38 (63,3 %) детей. Наиболее часто (18 детей, 30 %) диагностировалась высокая гипердиплоидия (51–67 хромосом), встречавшаяся при В-II и B-III вариантах ОЛЛ. У 10 (55,5 %) из 18 больных в составе высокогипердиплоидного кариотипа верифицировались структурные аберрации, самой частой из которых была инвертированная дупликация длинного плеча хромосомы 1 (3 пациента). При этом в 1 случае эта дупликация сочеталась с неслучайной транслокацией t(9;12)(p12;р13). У других пациентов с гипердиплоидией структурные аномалии были представлены транслокациями t(12;14)(p13;q11), t(14;18)(q21;q21),

t(16;17)(p13.3;q11.2), делецией del(6)(q15q22), маркерными хромосомами. Одной из частых аномалий при ОЛЛ явилась транслокация t(4;11)(q21;q23) – она отмечена у 3 детей с B-I ОЛЛ. В 1 случае она являлась единственной аберрацией, в другом сочеталась с изохромосомой 7 (по длинному плечу), у 3-го пациента имелся минорный субклон с дупликацией 1q. У единичных больных при В-линейных ОЛЛ выявлялись транслокации t(9;22)(q34;q11), несбалансированная t(1;19)(q23;p13), t(12;21)(р13;q22), t(6;11)(p21;q13), инверсия inv(12) (p11.2q13). Комплексный кариотип отмечен у 2 детей с В-ОЛЛ. В 1 случае отмечалось сочетание транслокаций t(1;12)(q21;p13) и t(9;12)(p11;р13) с делецией del(9) (q22). У другого пациента верифицированы del(9) (p22), inv(1)(p13q25), моносомия хромосомы 4 и маркерная хромосома. При Т-линейном ОЛЛ чаще выявлялась t(11;14) (p13-p15;q11) – в 1 случае в сочетании с t(X;7)(q22;q34), в другом – в сочетании с t(8;11)(p12;q13). У 2 детей с Т-ОЛЛ наблюдались транслокации с вовлечением 20q – t(2;20)(p21;q12) и t(12;20)(p13;q11.2). Выводы. Клональные аномалии кариотипа диагностировались у 63,3 % детей с ОЛЛ. В структуре аберрантного кариотипа преобладала высокая гипердиплоидия (30 %), сопровождавшаяся в половине случаев наличием структурных хромосомных аномалий.

Факторы прогноза клинического течения хронического лимфолейкоза Е.Л. Назарова, М.Г. Крюкова, В.И. Шардаков, Т.П. Загоскина ФГБУН «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови» ФМБА России Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) – один из вариантов В-клеточных опухолей лимфатической системы, который характеризуется разнообразием клинических проявлений и вариантов течения. В ряде случаев отмечается довольно благоприятное течение заболевания, в других наблюдается крайне агрессивный характер лейкозного процесса. В этой связи большое внимание уделяется поискам маркеров выраженной агрессии опухолей. К ним относится, прежде всего, определение уровня сывороточной тимидинкиназы, принимающей участие в синтезе ДНК и клеточном делении. Ее уровень значительно повышается при опухолях, характеризующихся усиленной пролиферацией клеток, поэтому ее используют в качестве маркера темпа роста злокачественных клеток, а также для контроля лечения, установления стадии заболевания и его прогноза. Целью исследования явилась оценка диагностиче ской и прогностической значимости активности

Иммунологические и генетические особенности при аутоиммунном лимфопролиферативном синдроме А.С. Невмержицкая, А.А. Мигас, С.О. Шарапова, М.В. Белевцев ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь Аутоиммунный лимфопролиферативный синдром (АЛПС) – генетическое заболевание, приводящее к дефекту FAS-зависимого апоптоза лимфоцитов, характеризующееся лимфаденопатией (ЛАП), гепато спленомегалией и аутоиммунной патологией. Вторым после лимфопролиферации, наиболее частым клиническим проявлением АЛПС является аутоиммунная патология, а именно иммуноопосредованные цитопении (иммунная тромбоцитопения (ИТП), аутоиммунная гемолитическая анемия (АИГА), нейтропения), которые встречаются более чем в 70 % случаев. Диагноз АЛПС был выставлен 5 пациентам согласно диагностическим критериям National Institutes of Health International Workshop (2009). Медиана возраста на момент исследования периферической крови составила 5 лет (д – 3, м – 2). Для оценки иммунологических параметров пациентов была взята группа здоровых доноров с соответствующей медианой по возрасту (n – 23, м – 14, д – 10). Исследование субпопуляций лимфоцитов в периферической крови пациентов и доноров (CD3+ Т-лимфоциты, CD19+

-лимфоциты, CD16+CD56+ натуральные килле В ры, CD3+HLADR+ активированные Т-лимфоциты, CD3+CD4+ Т-хелперы, CD3+CD8+ цитотоксические Т-клетки) проводилось методом проточной цитофлуо риметрии. Осуществлено молекулярно-генетическое исследование гена Fas. У пациентов с АЛПС помимо лимфопролиферации в 80 % случаев отмечались аутоиммунные гематологические нарушения в виде АИГА и/или ИТП. Было выявлено, что в группе пациентов с АЛПС достоверно превышают возрастную норму следующие показатели в абсолютных значениях CD3+ Т-лимфо циты (р = 0,0006), CD3+ HLADR активированные Т-лимфоциты (р = 0,01), CD3+CD4+ Т-хелперы (р = 0,006), CD3+CD8+ цитотоксические Т-лимфоциты (р = 0,001), IgG (р = 0,02), IgA (р = 0,001). В относительном составе популяций лимфоцитов достоверные различия обнаружены только для лимфоцитов с фенотипом CD3+CD8+ (р = 0,002) и CD3+ HLADR (р = 0,001). Мутация была найдена у 4 из 5 пациентов. У 3 пациентов мутации в виде аминокислотных замен локализованы в 9-м экзоне гена Fas и были получены по наследству. У 1 пациентки de novo делеция со сдвигом рамки считывания локализована в 7-м экзоне. Особенностью гена Fas является вариабельная пенетрантность. Часто у членов семьи носителей мутации нет клинических проявлений либо они представлены очень мягким фенотипом, не снижающим качество жизни. Так, у двоих пациентов отцы-носители не имели клинической картины заболевания.

Полиморфизм генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и хромосомные аберрации при хроническом лимфолейкозе В.А. Овсепян, В.А. Росин, С.В. Баранчикова ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России Целью настоящей работы являлось изучение возможной ассоциации полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков (ФБК) – цитохрома P450 1A1 (CYP1A1), глутатион-S-трансфераз µ1 (GSTM1), θ1 (GSTT1) и π1 (GSTP1) – с типом наиболее часто приобретаемых хромосомных нарушений лейкозных клеток при хроническом лимфолейкозе (ХЛЛ) на момент диагностики. В анализ включены результаты исследований полиморфизма указанных генов и FISH-анализа 69 больных ХЛЛ (средний возраст 61,2 года). Материалом для исследования полиморфизма послужила ДНК, выделенная из лейкоцитов венозной крови больных стандартным методом фенольно-хлороформной экстрак ции. Детекцию делеционного полиморфизма генов GSTM1 и GSTT1 проводили методом мультиплексной

’2012

т имидинкиназы, а также уровней ряда цитокинов у пациентов с впервые выявленным ХЛЛ. Исследованы сыворотки периферической крови 40 больных в возрасте от 43 лет до 81 года (медиана возраста составила 59 лет). Активность тимидинкиназы определялась с использованием наборов реагентов для радиоферментного анализа. Параллельно проводились исследования содержания сывороточных цитокинов/ хемокинов с помощью иммуноферментного анализа. Уровень тимидинкиназы в исследуемой группе пациентов достоверно превышал соответствующий показатель у здоровых лиц (17,67 Ед/л vs 6,3 Ед/л; p < 0,05). На основании расчета коэффициента ранговой корреляции Спирмена выявлено, что показатель активности тимидинкиназы в сыворотке периферической крови свыше 30 Ед/л коррелировал с повышением концентраций интерлейкинов (IL) 2, IL-10 и IL-18. Следовательно, с учетом того, что высокое содержание тимидинкиназы отражает активный пролиферативный потенциал опухолевых клеток, исследование уровней IL-2, IL-10 и IL-18 в случаях впервые выявленного В-ХЛЛ может быть рекомендовано в качестве критериев неблагоприятного течения опухолевого процесса уже на ранних этапах диагностики.

КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ

’2012

КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ

полимеразной цепной реакции (ПЦР). Генотипирование же полиморфизмов A2455G (Ile462Val) в гене CYP1A1, A1578G (Ile105Val) и в GSTP1 выполняли методом ПЦР с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. Анализ наиболее часто встречающихся хромосомных нарушений у больных ХЛЛ проводился с помощью панели ДНКпроб (зондов), состоящей из 2 коктейлей: LSI p53/LSI ATM (SpectrumOrange/SpectrumGreen) и LSI D13S319/LSI 13q34/CEP 12 (SpectrumOrange/SpectrumAqua/SpectrumGreen). Теоретическим основанием для осуществления настоящей работы послужило предположение, согласно которому полиморфные варианты вышеуказанных генов могут быть вовлечены в патогенез ХЛЛ, в частности за счет влияния на уровень внутриклеточного генотоксического фона, который сам по себе уже способен модулировать стабильность генома. В результате проведенного исследования впервые показана возможная ассоциация гомозиготного носительства мажорного (полноценного) аллеля GSTP1*105Ile с прогностически благоприятной моноаллельной интерстициальной делецией 13q14.3 при ХЛЛ, являющейся на момент диагностики единственным хромосомным нарушением в лейкозных клетках, содержание которых составляет не более 70 % от общего количества проанализированных клеток. Среди больных с подобной делецией гомозиготы по мажорному аллелю встречались чаще, чем носители хотя бы 1 минорного (неполноценного) аллеля (35,7 % против 64,3 % у гомозигот χ2 = 4,09; p < 0,05; OR = 3,40; 95 % CI = 1,00–11,60).

Роль анионных фосфолипидов в передаче сигналов при апоптотических процессах А.Н. Осипов, М.Н. Пучков, Е.А. Корепанова Кафедра общей и медицинской биофизики медико-биологического факультета ГБОУ ВПО НИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва Р Хорошо известно, что в основе многих важнейших заболеваний (например, онкологических или иммунных) лежит нарушение запрограммированной кле точной гибели (апоптоза), которое приводит либо к неполной гибели мутировавших клеток, либо к избыточной гибели клеток, необходимых организму. Научиться управлять такими процессами – одна из актуальных задач современной науки. Благодаря недавним исследованиям молекулярных и клеточных механизмов апоптоза стало известно, что одну из главных ролей в процессе апоптоза играет цитохром С, который может образовывать комплексы с отрицательно заряженными фосфолипидами, и в первую очередь с кардиолипином. Образование комплекса кардиолипин – цитохром С приводит к изменению

структуры активного центра цитохрома С и превращению его в пероксидазу, т. е. появлению у цитохрома С способности окислять различные субстраты в присут ствии пероксида водорода. К таким субстратам в первую очередь относятся липиды мембран митохондрий, окисление которых приводит к появлению в мембранах дефектов, через которые цитохром С может выходить в цитоплазму клетки и активировать каспазы, сериновые протеазы, от которых главным образом и зависит развитие апоптоза в клетке. В предлагаемой работе были проведены исследования пероксидазной активности комплекса цитохрома С и кар диолипина на модельных бислойных липидных мембранах. Опыты показали, что благодаря взаимодействию комплекса цитохрома С и кардиолипина с мембраной могут образовываться каналы шириной около 2 нм, достаточные для выхода цитохрома С в цитоплазму. Полученные результаты позволяют сделать вывод о ключевой роли анионных фосфолипидов в развитии апоптотических процессов и о возможно сти регуляции таких реакций посредством изменения количества анионных фосфолипидов в мембране.

Исследование проапоптогенных механизмов противоопухолевого эффекта флавоноидов корней солодки С.И. Павлова1, 3, М.Д. Цицуашвили1, М.А. Тимаков2, И.Г. Козлов1, 2 1 ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, Москва; 2ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва; 3ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова», Чебоксары, Республика Чувашия В предыдущих исследованиях нами было показано, что флавоноиды корней солодки (ФКС) подавляют пролиферацию как активированных лимфоцитов, так и опухолевых клеток. Ингибирование пролиферации лимфоцитов ФКС не было связано с индукцией апоптоза, а сопровождалось изменением баланса Т-хелперных цитокинов и снижением секреции интерлейкина 2. Однако антипролиферативный эффект ФКС по отношению к опухолевым клеткам мог быть реализован через другие механизмы. Целью настоящей работы являлось исследование проапоптогенных эффектов ФКС в культуре опухолевых клеток различного происхождения. В экспериментах использовались клеточные линии человека: A-431, U-373, GL-6 и U-937, которые культивировали в среде RPMI-1640 (U-937) или DMEM (A-431, U-373, GL-6), содержащей сыворотку и антибиотики. К преинкубированным в течение 24 ч клеткам добавляли ФКС (20 мкг/мл) и продолжали инкубацию 24–72 ч. Апоптоз оценивали путем окрашивания фиксированных клеток пропидий йодидом цитометрическим методом.

Особенности иммунофенотипа острого лимфобластного лейкоза у детей первого года жизни А.М. Попов1, 2, Г.А. Цаур1, 2, Т.Ю. Вержбицкая1, 2, О.В. Стренева1, 2, Е.В. Шориков1, 2, Л.И. Савельев1, 2, 3, Л.Г. Фечина1, 2 1 ГБУЗ СО «Областная детская клиническая больница № 1», Екатеринбург; 2 ГБУЗ СО «Институт медицинских клеточных технологий», Екатеринбург; 3 ГБОУ ВПО УралГМА, Екатеринбург Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) у детей первого года жизни характеризуется высокой частотой выявления перестроек гена MLL, особенным, отличающимся от более старших детей, профилем экспрессии генов и крайне неблагоприятным прогнозом. Цель исследования – описание иммунофенотипа ОЛЛ у детей первого года жизни. В исследование было включено 64 пациента (29 мальчиков и 35 девочек) с острым лейкозом (ОЛ) в возрасте от 0 до 11 месяцев включительно. Частота выявления ОЛЛ составила 67,19 % от всех ОЛ у детей первого года жизни, что было несколько реже, чем у более старших детей (87,69 %). В исследуемой группе преобладал BI-ОЛЛ (60,46 %), на долю же наиболее частого в других возрастных группах BII-ОЛЛ приходилось лишь 30,23 %.

Отсутствие экспрессии или низкая экспрессия CD10, CD20 и CD22, а также высокая экспрессия CD45, CD15, CD65 и NG2 характеризовали иммунофенотип опухолевых клеток при наличии перестроек гена MLL. Диагностическая эффективность выявления экспрессии NG2 для прогнозирования наличия перестроек гена MLL оказалась наиболее высокой. Экспрессия CD34 и CD65 была более характерна для пациентов с наличием MLL-AF4(+). Таким образом, иммунофенотип ОЛЛ из В-линейных предшественников у детей младше 1 года существенно различается в зависимости от наличия или отсутствия перестроек гена MLL. Экспрессия NG2, CD45, CD133, CD15, а также слабая экспрессия или отсутствие экспрессии CD10, CD20 и CD22 позволяют прогнозировать наличие какой-либо перестройки гена MLL при ОЛЛ у детей первого года жизни, при этом наибольшей диагностической эффективностью обладает наличие экспрессии NG2.

Исследования геминовых белков и эритроцитов при помощи термолинзовой и оптоакустической микроспектроскопии М.А. Проскурнин1, Д.А. Недосекин2, В.П. Жаров2, Д.С. Волков1, Е.С. Рындина1, Т.А. Горькова1 1 Химический факультет ФГБОУ ВПО МГУ им. М.В. Ломоносова; 2 лазерные лаборатории Арканзасского университета медицинских наук, Филлипс-Классик, Литл-Рок, Арканзас, США Термолинзовая и оптоакустическая микроспектроскопия (ТОМ) – наиболее чувствительные силовые лазерные методы абсорбционной спектроскопии, дополняющие традиционные, – применены для определения геминовых белков в водных растворах, а также гемоглобина в индивидуальных эритроцитах. Предложены условия термолинзового определения гемоглобина в плазме крови без предварительного концентрирования, а также цитохрома C. Предел обнаружения составляет 0,1 пг для энергии 0,5 мДж и 10 пг для энергии 5 мкДж. Облучаемый объем 80 мкм3 делает возможным использовать ТОМ для определения гемоглобина в отдельных эритроцитах. При помощи ТОМ на модели мышей с нормальной (nu/nu) и с генетически модифицированной кровью (STOCK Hbatm1Paz Hbbtm1Tow Tg(HBAHBBs)41Paz/J) показаны различная концентрация гемоглобина в нормальных эритроцитах и характерных эритроцитах в крови больных серповидной клеточной анемией. Кроме того, показано различное распределение гемоглобина в эритроцитах здоровой крови и в крови с серповидными эритроцитами, а также разная пороговая устойчивость нормальных и серпо-

’2012

Диаграммы флуоресценции ДНК распределялись преимущественно на 3 пика. Через 24 ч после внесения ФКС в культуру уровень апоптоза недостоверно увеличивался на 5–15 %, что сопровождалось значимым (p < 0,05) снижением диплоидного (соответствует G1/G0 фазам клеточного цикла) и повышению тетраплоидного (соответствует G2/M фазам клеточного цикла) пиков гистограмм. Такие изменения могут свидетельствовать о нарушении вхождения клеток в фазу митоза – остановке клеточного цикла в G2/M-фазе. Спустя 48 ч инкубации с ФКС происходило увели чение доли апоптозирующих клеток на 20–40 % (p < 0,05) по сравнению с контрольными пробами. Через 72 ч инкубации этот показатель увеличивался, возрастание апоптоза под влиянием ФКС сопровождалось снижением уровней как пролиферирующих, так и покоящихся клеток, что выражалось в уменьшении численности тетра- и диплоидных клеток по сравнению с 24–48-часовой инкубацией. Таким образом, на основании анализа диаграмм флуоресценции ДНК-пропидий можно заключить, что ФКС обладают проапоптогенным эффектом по отношению к различным линиям опухолевых клеток (A-431, GL-6, U-373, U-937) в условиях in vitro, что, по-видимому, является следствием остановки флавоноидами солодки опухолевых клеток в G2/M-фазе клеточного цикла.

КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ

’2012

КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ

видных эритроцитов к действию низкоэнергетического импульсного лазерного излучения. Это в сумме позволяет разрабатывать методики диагностики состава крови на основе ТОМ.

Генетические субтипы анемии Фанкони. Случай неблагоприятного исхода при мутации в гене FANCC

Оценка функциональной активности нейтрофилов методом хемилюминесценции

А.С. Романцова, С.О. Шарапова, О.В. Алейникова ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь

Е.В. Проскурнина, И.В. Образцов, Ю.А. Владимиров Факультет фундаментальной медицины ФГБОУ ВПО МГУ им. М.В. Ломоносова

Анемия Фанкони (АФ) – это генетически и фенотипически гетерогенное рецессивное заболевание, ко торое характеризуется различными врожденными аномалиями, прогрессивной панцитопенией и предрасположенностью к гемобластозам и солидным опухолям. Генетической основой АФ являются мутации в 15 генах FANC, которые формируют соответствующие комплементарные группы. Мутации чаще всего встречаются в генах FANCA, FANCC и FANCG (65 %, 10 % и 15 % соответственно) и приводят к нарушению пролиферации, повышенной клеточной гибели, увеличению числа генетически поврежденных клеток и повышенному риску развития неоплазий, который коррелирует с возрастом. Целью работы было проведение генетической диагностики наиболее распространенных субтипов АФ, диагностированной в Республике Беларусь. Мутационный анализ генов FANCA, FANCC, FANCG был проведен методом SSCP и с ресеквенированием ДНК из мононуклеаров периферической крови, с последующим сопоставлением результатов с базой данных (www.rockefeller.edu/fanconi/mutate, GenBank: NM_000136.2 (cDNA)). Скрининг гена FANCA был проведен у 9 пациентов. Мутации выявлены у 5 (55,6 %) человек – 2 крупные делеции, 2 аминокислотные замены и 1 со сдвигом рамки считывания. Мутационный анализ генов FANCC, FANCG был выполнен еще у 9 пациентов с АФ. Мутация выявлена у 1 пациента (обнаружены 2 гетерозиготные мутации в гене FANCC). При АФ с мутацией в гене FANCC выявлена новая клинико-генетическая ассоциация. Диагноз АФ (резидент Украины) был выставлен в 11 лет (ДЭБ-индуцированные разрывы наблюдалась в 38 % хромосом) и подтвержден в РНПЦ детской онкологии и гематологии (Минск, Беларусь) в 16 лет на основании клинико-лабораторных и цитогенетических исследований. В 17 лет обнаружена гепатоцеллюлярная аденома правой доли печени (терапия андрогенами не проводилась), а также, как осложнение АФ, выставлен диаг ноз миелодиспластический синдром (МДС), рефрактерная анемия с избытком бластов (МДС, РАИБ), через 5 мес после трансформации в МДС девочка умерла. Мутация в гене FANCC в экзоне 12 с.1207 T>C, обнаруженная в нашем исследовании, описывается при АФ в литературе впервые, так же как и ее сочетание

Хемилюминесценция широко востребована в фундаментальных и прикладных исследованиях в биологии и медицине. Достоинствами хемилюминесцентных методов являются высокая чувствительность, специфичность хемилюминесцентного отклика и относительная простота эксперимента. В большинстве работ, посвященных применению хемилюминесценции в целях медицинской практики, изучаются реакции активных форм кислорода, в частности респираторный взрыв гранулоцитов под действием различных стимулов. Проблема оценки функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов не теряет актуальности до настоящего времени. Эта информация имеет ценность прежде всего при воспалительных процессах, в том числе аутоиммунных и неопластических. Сущест вует ряд методик оценки активности, но большинство из них трудоемки и субъективны или требуют использования сложного дорогостоящего оборудования, что исключает их использование в качестве скрининговых тестов. В исследовании определены оптимальные условия пробоподготовки и хемилюминесцентного анализа нейтрофилов цельной крови. Разработана методика хемилюминесцентного анализа функциональной активности фагоцитов цельной крови, основанная на последовательном внесении 4β-форбол-12-миристат13-ацетата и N-формил-метионил-лейцил-фенил аланина в клеточную суспензию и последующей регистрации активированной люминолом хемилюминесценции. Обследована контрольная группа доноров для использования в качестве базы сравнения при диагностическом использовании хемилюминограмм. Показаны различия в хемилюминограммах, полученных от доноров и пациентов с термической травмой. Предложены критерии оценки хемилюминограмм; построены пределы значений показателей, свидетельствующих о благоприятном прогнозе течения ожоговой болезни.

Роль трансплантации гемопоэтических стволовых клеток в терапии вторичного острого миелоидного лейкоза у детей И.П. Ромашевская1, 2, Н.Н. Савва2, Н.П. Литвинко2, О.В. Алейникова2 1 ГУ РНПЦ РМиЭЧ, Гомель, Беларусь; 2 ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь Введение. Современная стратегия терапии острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) у детей основана на использовании риск-адаптированной интенсивной полихимиотерапии и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК). Больные со вторичным ОМЛ относятся к группе неблагоприятного прогноза. Наибольший противолейкемический эффект наблюдается при аллогенной ТГСК. На основании современных достижений в изучении ОМЛ кооперативной группой Россия – Беларусь был разработан протокол терапии ОМЛ-ММ, по которому в Республике Беларусь с 2000 г. лечились дети и подростки со вторичным ОМЛ. Цель. Оценить результаты лечения и исход вторичного ОМЛ у детей и подростков в ракурсе сравнения с de novo ОМЛ с учетом проведения ТГСК. Материал и методы. В исследование были включены 7 пациентов со вторичным ОМЛ и 103 пациента с de novo ОМЛ, получавших лечение по программе ОМЛ-ММ-2000/2006 в период с 2000 по 2009 г. Анализировались результаты лечения вторичного ОМЛ в ракурсе сравнения с группой высокого риска de novo ОМЛ (n = 40). Статистический анализ выполнен при помощи программного обеспечения STATISTICA 6.0. Результаты и обсуждение. Достижение полной ремиссии отмечено у всех 7 пациентов со вторичным ОМЛ, а в группе высокого риска de novo ОМЛ у 5-й части больных зафиксирована смерть в индукции и отсутствие ответа на лечение, однако различия не были статистически значимыми (p > 0,2). У пациентов группы высокого риска de novo ОМЛ достоверно чаще развивались рецидивы заболевания (p = 0,05) за счет группы больных, получивших аутоТГСК. В полной продолжительной ремиссии находится 71 % пациентов

со вторичным ОМЛ, что выше в сравнении с группой de novo ОМЛ (p = 0,06). В связи с неблагоприятным прогнозом у пациентов со вторичным ОМЛ им всем была показана аллоТГСК, однако она была выполнена у 5 (71,4 %) из 7 детей. Двадцать одному пациенту высокой группы риска de novo ОМЛ была выполнена ТГСК. В группе вторичного ОМЛ ТГСК выполнялась чаще – 71,4 % против 52,5 % пациентов с de novo ОМЛ. Выводы. У пациентов со вторичным ОМЛ ремиссия была достигнута в 100 % случаев. В полной продолжительной ремиссии находится 71 % пациентов со вторичным ОМЛ, что выше в сравнении с группой высокого риска de novo ОМЛ (p = 0,06). У пациентов группы высокого риска de novo ОМЛ достоверно чаще развивались рецидивы заболевания (p = 0,05) за счет группы больных, получивших аутоТГСК. Общая выживаемость для больных вторичным ОМЛ составила 75 %. Рецидивы ОМЛ были ведущими причинами смерти в обеих сравниваемых группах. Посттрансплантационная выживаемость пациентов со вторичным ОМЛ составила 80 % за счет проведения аллоТГСК, но статистически значимых различий не выявлено в сравнении с группой высокого риска de novo ОМЛ, где чаще проводилась аутоТГСК (p > 0,1).

пероксидазная активность цитохрома С, усиленная фосфатидилхолином в присутствии фосфолипазы D Г.О. Степанов, А.Н. Осипов ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва Уже на протяжении многих лет проблема апоптоза не теряет своей актуальности по причине участия данного процесса в патогенезе онкологических заболеваний. При этом все новые особенности молекулярных взаимодействий в этом процессе появляются в мировой научной литературе еженедельно. Одним из ключевых моментов в развитии апоптоза является выход из митохондрий цитохрома С, которому предшествует появление у последнего высокой пероксидазной активности. Данная активность стимулируется при взаимодействии цитохрома С с ненасыщенным кардиолипином или фосфатидной кислотой, но никогда до сегодняшнего дня в этом процессе не участвовал фосфатидилхолин. Более того, ненасыщенный фосфатидилхолин в большинстве исследований выступал как отрицательный контроль. В нашей работе представлен новый факт – фосфатидилхолин может в десятки раз увеличивать пероксидазную активность цитохрома С в присутствии фосфолипазы D, и эта активность может регулироваться при действии оксида азота и лазерного излучения. Мы показали, что в присутствии фосфолипазы D в системе фосфатидилхолин – цитохром С резко по-

’2012

с крайне редкой мутацией в интроне 7 c.844-1 G>C. Ассоциированный с данной генетической аномалией фенотип представлен апластической анемией средней тяжести с синостозом локтевой и лучевой костей обеих рук, а также довольно ранним развитием быстро прогрессирующей доброкачественной опухоли печени (гепатоцеллюлярной аденомы) и прогностически крайне неблагоприятного гемобластоза (МДС, РАИБ).

КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ

’2012

КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ

вышается пероксидазная активность за счет ферментативной наработки ненасыщенной фосфатидной кислоты из фосфатидилхолина, а фосфатидная кислота является сильным активатором пероксидазной активности цитохрома С. При этом, если в системе присутствуют диолеоилфосфатидилхолин и фосфолипаза D, то пероксидазная активность увеличивалась в 90 раз; если липиды предварительно экстрагировались из митохондрий, то в 18 раз; и при работе с целыми митохондриями в 3 раза. Во всех экспериментах при продолжительной инкубации фосфатидилхолина с фосфолипазой D наблюдается незначительное уменьшение пероксидазной активности цитохрома С после ее многократного увеличения. Данный факт опосредован действием стерических факторов межмолекулярного взаимодействия и подтверждается методами флуоресценции триптофана 59 и ЭПР-спектроскопии с этопозидом. Главным результатом нашего исследования стало подтверждение возможности значимого увеличения пероксидазной активности цитохрома С (тесно связанной с инициацией апоптоза) при действии фосфатидилхолина в условиях ее инкубации с фосфолипазой D.

Анализ мутаций гена CEBPA в группе нормального кариотипа при остром миелоидном лейкозе у детей М.В. Стёганцева, А.М. Кустанович, Р.И. Юцкевич, Н.А. Соколова, О.В. Алейникова ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь C/EBPA относится к семейству CCAAT/энхансерсвязывающих белков (CEBP), регулирующих баланс процессов пролиферации и терминальной дифференцировки. с мРНК гена может транслироваться как белок размером 42 кДА, так и доминантно-негативная изоформа размером 30 кДА, в которой отсут ствует N-концевая область, включающая трансактивационный домен 1 (TAD1). Острые миелоидные лейкозы (ОМЛ) с мутацией CEBPA включены в классификацию ВОЗ и составляют 7–24 % от общего числа случаев ОМЛ. Наиболее часто они встречаются у пациентов с нормальным кариотипом (НК). Мутации в ДНК-связывающем домене (bZIP) приводят к нарушению C/EBPA-опосредованной регуляции клеточного цикла, что сопровождается увеличением количества бластных клеток. Если же мутации затрагивают TAD, то экспрессия CEBPA смещается в сторону изоформы р30. Выбор CEBPA в качестве объекта исследования обусловлен возможностью его использования в качестве мишени для мониторинга минимальной остаточной болезни, а также прогностического и классификационного маркера.

Мутации в гене CEBPA были проанализированы у 17 пациентов с НК ОМЛ с использованием секвенирования. Мутации в кодирующей области были обнаружены у 5 человек (35 % НК ОМЛ). В 4/5 случаев (80 %) определялись мутации со сдвигом рамки считывания. У 1 (20 %) из пациентов мутация затрагивала bZIP домен, в 3 случаях – один из TAD-доменов. В 1 случае определялась двойная мутация, приводящая к изменению нуклеотидной последовательности в доменах TAD1 и bZIP, что, как считают, ассоциировано с благоприятным прогнозом (S. Fröhling et al., 2004). У 4 пациентов – 1 c мутацией и 3 без мутации (28 % НК ОМЛ) – определялась вставка 6 нуклеотидов, затрагивающая полиморфную область в домене TAD2 (B.J. Wouters et al., 2007). Пациенты с мутацией CEBPA характеризовались повышенным содержанием лейкоцитов и более высокой частотой экспрессии CD34 (p < 0,05). В 2 раза чаще в группе CEBPA-позитивных лейкозов встречался М2-подтип ОМЛ (80 % vs 40 %, p > 0,05). Анализ выживаемости не выявил достоверных различий между пациентами с наличием и отсут ствием мутации CEBPA в группе с НК ОМЛ. Мутации гена CEBPA встречаются у трети пациентов с НК ОМЛ. CEBPA-позитивные лейкозы характеризуются повышенным лейкоцитозом и уровнем экспрессии CD34. Отсутствие различий по параметрам выживаемости в проанализированной группе может объясняться как малым размером проанализированной выборки, так и тем, что в анализ были включены пациенты с различным типом мутаций (моно-/биаллельные) в гене CEBPA.

Репарация индуцированных разрывов ДНК в нормальных гемопоэтических и лейкемических стволовых клетках in vitro А.В. Тарасова, Т.В. Шман ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь Высокий уровень репарации ДНК в лейкемиче ских стволовых клетках (ЛСК) обеспечивает их рези стентность к химиопрепаратам и облучению. Целью работы было сравнить эффективность репарации ДНК в лейкемических клетках и нормальных гемопоэтиче ских стволовых клетках (ГСК) после воздействия на них этопозида. Исследовали мононуклеарные клетки костного мозга 8 доноров и 10 пациентов с острым лимфобласт ным лейкозом (ОЛЛ). После 3 и 24 ч инкубации с этопозидом (VP-16, 10 мкг/мл) часть клеток окрашивали анти-CD45-PE-Cy7, CD34-PC-5 и CD38-PE антителами. Затем клетки фиксировали параформальдеги

может привести к развитию оксидативного стресса − неконтролируемого усиления свободнорадикальных реакций, в результате которого происходит окислительное повреждение различных биомолекул. Так, установлено, что активация свободнорадикальных реакций играет важную роль в патогенезе нейродегенеративных, сердечно-сосудистых, бронхолегочных и других заболеваний. В связи с этим важной задачей медико-биологических исследований является изучение антиоксидантного потенциала организма человека. Один из подходов, позволяющих оценить состояние антиоксидантной системы человека, заключается в определении антиоксидантной активности (АОА) его биологических жидкостей. АОА биологической жидкости – это интегральный показатель, отражающий способность входящих в ее состав антиоксидантов противодействовать развитию свободнорадикальных реакций в какой-либо модельной системе. Для количественной оценки величины АОА биологической жидкости ее выражают через концентрацию стандартного антиоксиданта, например тролокса или аскорбиновой кислоты. В наших исследованиях с использованием метода хемилюминесценции показано, что АОА биологиче ских жидкостей человека может служить дополни тельным клиническим лабораторным показателем, применение которого повышает эффективность проводимых лечебных мероприятий, в том числе антиоксидантной терапии. При этом объем исследуемой биологической жидкости (например, сыворотки крови) составляет не более 10–20 мкл. Это дает возможность осуществлять забор крови из пальца, что очень важно при динамическом наблюдении за больными.

Антиоксидантная активность биологических жидкостей как критерий функционального состояния антиоксидантной системы человека Ю.О. Теселкин, О.Б. Любицкий Кафедра общей и медицинской биофизики ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва Известно, что оксиданты – свободные радикалы, активные формы кислорода, азота и другие – являются необходимыми участниками многих физиологиче ских процессов в живой клетке. Вместе с тем, высокая реакционная способность делает их чрезвычайно токсичными для биологических систем. В норме регуляция продукции оксидантов в тканях и органах человека осуществляется многоуровневой антиоксидантной системой, которая включает в себя соединения различной химической природы: витамины, пигменты, гормоны, ферменты. Однако нарушение баланса между оксидантами и антиоксидантами в сторону первых

Использование процессного подхода для совершенствования качества получения криопреципитата Л.В. Удалова1, Н.М. Поздеев2 ГУЗ «Липецкая областная станция переливания крови»; 2 ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России

Введение. В современной практике управления качеством производственных процессов наиболее пер спективным является применение процессного подхода. Его использование позволяет рассматривать производственную деятельность как единую систему взаимосвязанных процессов, вносить изменения в одни, не ухудшая при этом другие, производить эффективную оптимизацию использования человеческих и материальных ресурсов. Материалы и методы. Использование процессного подхода для управления технологическими этапами получения криопреципитата с регламентируемым содержанием фактора VIII базировалось на методологии функционального моделирования IDEFO.

’2012

дом и ледяным этанолом, дополнительно окраши вали анти-γH2AX-AlexaFluor488 (Ser139) антителами и анализировали на проточном цитофлуориметре Cytomics FC-500. Клетки с фенотипом СD34+СD38-СD19+ наиболее часто рассматривают в качестве потенциальных ЛСК при ОЛЛ (K. Wilson, 2010). По полученным нами данным, корреляция между количеством лейкозных клеток в популяциях СD34+СD38- и СD34+СD38-СD19+ составила 0,98 (р < 0,05). Было установлено, что через 3 ч инкубации с VP-16 количество ЛСК с фенотипом CD45lowCD34+CD38-, экспрессирующих γH2AX, составило 55,1 ± 8,8 %, а через 24 ч – 36,1 ± 9,3 %. Для ГСК-доноров было характерно отсутствие репаративного ответа – уровень γH2AX-позитивных CD45lowCD34+CD38--клеток составил 22,2 ± 4,4 % через 3 ч и 23,8 ± 4,7 % через 24 ч. Можно предположить, что ранние ГСК с разрывами ДНК элиминируются из организма, чтобы предотвратить передачу поврежденной или «некорректно» репарированной ДНК последующим клеточным поколениям, тогда как эффективная репарация ДНК в ЛСК с фенотипом CD45lowCD34+CD38- обеспечивает их устойчивость к генотоксическому воздействию. При этом клетки доноров с более зрелым CD45lowCD34+CD38+фенотипом характеризовались значительно более высокой способностью репарировать ДНК и снижением количества γH2AX-позитивных клеток с 47,7 ± 9,6 % до 25,4 ± 5,8 %, тогда как лейкемические клетки с данным фенотипом репарировали ДНК менее интенсивно и уровень γH2AX-экспрессирующих клеток снижался с 74,8 ± 6,3 % до 65,1 ± 10,4 %.

КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ

’2012

КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ

Результаты исследования. Разработана функциональная модель получения криопреципитата, позволившая определить в конечном продукте «Крио преципитат» зависимость содержания фактора VIII в количестве не менее 70 МЕ (элемент выхода) от температуры и способа размораживания исходного сырья, в качестве которого используется плазма свежезамороженная (элемент входа). Описание и идентификация технологических этапов с применением процессного подхода позволили организовать работу по производ ству криопреципитата с максимальным сокращением движения полупродукта по отделению и сокращению времени пребывания его в условиях комнатной температуры. Анализ критических точек, определенных в ходе построения функциональной модели, выявил объективную необходимость использования для получения криопреципитата строенных (500/400/400) полимерных контейнеров и внесения изменений в порядок организации работы, исключив ошибки на этапах этикетировки и маркировки. Заключение. Доказана необходимость и возможность управления производством криопреципитата с помощью процессного подхода. Построение функциональной модели получения криопреципитата по зволило стандартизовать процедуру, обозначило необходимость внесения изменений в наиболее важные этапы производства с целью улучшения качества конечного продукта. Процессный подход позволяет оценить влияние внесенных изменений на результаты деятельности, ведет к оптимизации работы оборудования и персонала.

Эффективность лечения по протоколу MLL-Baby прогностически неблагоприятного MLL/AF4 позитивного острого лимфобластного лейкоза у детей младше года Л.Г. Фечина1, 2, Е.В. Шориков1, 2, О.П. Хлебникова1, О.В. Стренева1, 2, М.С. Карачева1, 2, Г.А. Цаур1, 2, А.М. Попов1, 2, Л.И. Савельев1, 2, 3, Д.В. Литвинов4, Н.В. Мякова4, С.Р. Варфоломеева4, К.Л. Кондратчик5, Д.А. Перегудов6, А.В. Шамардина7, Э.Г. Бойченко8, Е.В. Лапотентова9, О.В. Алейникова9, А.И. Карачунский4, Г. Хенце10, А.Г. Румянцев4 1 ГБУЗ СО «Областная детская клиническая больница № 1», Екатеринбург; 2 ГБУЗ СО «Институт медицинских клеточных технологий», Екатеринбург; 3ГБУЗ ВПО УралГМА, Екатеринбург; 4ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, Москва; 5 Морозовская детская городская клиническая больница, Москва; 6ГУЗ «Московский областной онкологический диспансер», Балашиха; 7 ГУ «Нижегородская областная детская клиническая больница», Нижний Новгород;

ГУЗ «Детская городская больница № 1», Санкт-Петербург; 9ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь; 10 Медицинский центр Charite, Университет им. Гумбольдта, Берлин, Германия 8

Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) у детей младше года в 70 % случаев сопровождается перестройками с участием MLL-гена, наиболее неблагополучной из которых является MLL/AF4. По данным международных публикаций ведущих исследовательских групп, результаты лечения детей с этой генетической перестройкой до настоящего времени являются крайне неудовлетворительными. В России был разработан оригинальный протокол MLL-Baby для лечения младенческих ОЛЛ с включением полностью трансретиноевой кислоты (АТРА), с 2003 г. было пролечено 28 детей с перестройкой MLL/AF4, что составило 34 % от числа всех включенных в исследование MLL-Baby пациентов. Медиана возраста больных составила 3 мес (от 0 до 11 мес), инициальный лейкоцитоз 99 × 109/л (1,8 × 109/л – 612 × 109/л). Инициальный нейролейкоз был зарегистрирован у 9 (32 %) пациентов. На этапе индукционной терапии погибло 4 (14,3 %) ребенка, а на этапе консолидирующей терапии, во время проведения блоков высокого риска, погибло также 4 (14,3 %) ребенка в сроки от 1,3 до 2,5 мес с момента начала противоопухолевой терапии. Из 24 младенцев, достигших ремиссии, у 9 (32 %) пациентов были зарегистрированы очень ранние рецидивы. Одиннадцать (39,3 %) пациентов находятся в длительной клинико-гематологической ремиссии. Бессобытийная выживаемость составила 0,38 ± 0,09, а безрецидивная выживаемость – 0,54 ± 0,11. Полученные результаты показали, что на протоколе MLL-Baby удалось добиться снижения частоты развития рецидивов в самой неблагополучной группе пациентов в возрасте до 1 года, страдающих ОЛЛ с t(4;11). Сокращение частоты токсических летальных исходов на терапии путем оптимизации условий и качества лечения младенческих лейкозов позволит добиться улучшения показателей долгосрочной бессобытийной и безрецидивной выживаемости.

А.Н. Хвастунова1, 2, А.О. Доронина1, 3, О.С. Федянина2, Ф.И. Атауллаханов1, 2, 3, С.А. Кузнецова1, 2, 3 1 Лаборатория биофизики ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, Москва; 2 ЦТП ФХФ РАН; 3лаборатория физической биохимии системы крови ФГБУ ГНЦ Минздрава России, Москва Успешная диагностика онкогематологических з аболеваний базируется на сочетании иммунофено типирования, морфологического и молекулярно-биологического анализа клеток крови. Однако невозможность проведения анализа поверхностных антигенов и морфологического исследования на одних и тех же клетках может затруднять дифференциальную диа гностику волосатоклеточного лейкоза и лимфомы из клеток маргинальной зоны селезенки с циркулирующими ворсинчатыми лимфоцитами, для которой необходимо определение иммунофенотипа ворсинчатых лимфоцитов, составляющих в некоторых случаях всего несколько процентов от всех лимфоцитов периферической крови и костного мозга. Клеточный биочип представляет собой прозрачную подложку, на которой иммобилизованы антитела к 36 поверхностным антигенам лейкоцитов. При инкубации биочипа с клеточной суспензией клетки связываются с иммобилизованными антителами. После отмывки на поверхности биочипа остаются области, покрытые лейкоцитами, несущими тот или иной поверхностный антиген, морфология которых исследуется стандартными цитологическими методами. С помощью клеточного биочипа были исследованы лимфоциты периферической крови 27 пациентов с подозрением на волосатоклеточный лейкоз. Показано, что у больных волосатоклеточным лейкозом (у 23 из 27) ворсинчатые лимфоциты связываются с антителами к CD11c (100 % случаев), CD19 (100 % случаев), CD20 (100 % случаев), CD25 (96 % случаев), CD103 (100 % случаев). В периферической крови 3 из оставшихся 4 пациентов было обнаружено небольшое количество ворсинчатых лимфоцитов, положительных по CD19 (1–10 % от общего числа В-лимфоцитов и небольшое количество CD11с+ лимфоцитов, но ворсинчатых клеток среди них не было). У больных данной группы на основании иммунофенотипирования, гистологических и цитохимических исследований была диагностирована лимфома из клеток маргинальной зоны селезенки. Таким образом, клеточный биочип может быть использован для дифференциальной диагностики волосатоклеточного лейкоза. Работа поддержана грантом РФФИ 12-04-31275.

Молекулярно-генетические аспекты прогнозирования острого лимфобластного лейкоза у детей С.А. Ходулева1, И.П. Ромашевская2, Т.В. Хартон1, А.Н. Демиденко2, Е.Ф. Мицура2, О.В. Жук2 1 УО «Гомельский государственный медицинский университет», Беларусь; 2 ГУ РНПЦ РМиЭЧ, Гомель, Беларусь С целью оценки молекулярно-генетических изменений методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией проведено исследование клеток неопластического клона при остром лимфобластном лейкозе (ОЛЛ) у детей. Всего обследовано 35 детей с впервые выявленным ОЛЛ в возрасте от 10 месяцев до 17 лет, средний возраст составил 6 лет и 11 месяцев, соотношение мальчиков и девочек – 1,3 : 1. Молекулярно-генетические аномалии выявлены у 29 % пациентов. В 60 % случаев обнаружена t(12;21)TEL/AML, при этом преимущественно (83 %) у детей в возрастной группе от 1 до 10 лет, и только в 17 % случаев в возрасте старше 10 лет. Все дети с данной транслокацией имели В-клеточную иммунологию бластных клеток, причем пре-пре-В вариант, который относится к факторам с благоприятным прогнозом, встречался в 67 %. Инициальный уровень лейкоцитов у всех пациентов был менее 10 × 109/л. Во всех случаях ОЛЛ с t(12;21) TEL/AML достигнута полная ремиссия, однако в 17 % случаев диагностирован ранний костномозговой рецидив. Период наблюдения составил 10 лет. Транслокация t(9;22) BCR/ABL выявлена у 1 ребенка мужского пола, в возрасте 6 лет, бластные клетки имели В-клеточную природу (пре-В-вариант). Анализ уровня инициального лейкоцитоза показал, что количество лейкоцитов было в пределах до 30 × 109/л. Достигнута полная ремиссия, период наблюдения составил 8 лет. Транслокация t(1;19) E2A/PBX1 диагностирована у 2 детей. Все дети на момент постановки диагноза были старше 10 лет, иммунофенотип бластов в половине случаев соответствовал пре-пре-В варианту, в половине – Т-клеточному варианту. Инициальный лейкоцитоз в 100 % был в пределах 10–30 × 109/л. Несмотря на неблагоприятные факторы, все дети достигли полной ремиссии. Период наблюдения составил от 2 до 6 лет. Транслокация t(11;19)MLL/ENL выявлена в 10 % случаев. Наличие t(11;19)MLL/ENL, ассоциированной с инициальным лейкоцитозом, Т-клеточным вариантом, мужским полом, возрастом до 2 лет, может быть рассмотрена как неблагоприятный прогностический фактор, так как в данном случае наблюдалась резистентность к проводимой полихимиотерапии.

’2012

Использование клеточного биочипа для дифференциальной диагностики волосатоклеточного лейкоза и лимфомы из клеток маргинальной зоны селезенки

КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ

’2012

КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ

Перестройки 11q23/MLL у детей первого года жизни с острым миелоидным лейкозом Г.А. Цаур1, 2, Е.В. Флейшман3, Т.Л. Гиндина4, О.М. Плеханова1, А.М. Попов1, 2, О.И. Сокова3, О.В. Алейникова5, Е.В. Волочник5, А.С. Демина1, 2, О.В. Каленник6, И.И. Калинина7, Н.П. Кирсанова5, К.Л. Кондратчик8, А.М. Кустанович5, Т.В. Наседкина6, В.А. Овсепян9, Ю.В. Ольшанская7, А.В. Попа3, Т.О. Ригер1, 2, Л.И. Савельев1, 2, 10, О.В. Стренева1, 2, Е.В. Шориков1, 2, C. Meyer11, R. Marschalek11, Л.Г. Фечина1, 2 1 ГБУЗ CO «Областная детская клиническая больница № 1», Екатеринбург; 2ГБУЗ СО «Институт медицинских клеточных технологий», Екатеринбург; 3ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина», Москва; 4Институт детской г ематологии и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой ГБОУ ВПО «СанктПетербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова»; 5ГУ «Республиканский научно-практический центр д етской онкологии, гематологии и иммунологии» М инистерства здравоохранения Республики Беларусь; 6ФГБУН «Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта» РАН, Москва; 7 ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, Москва; 8Морозовская детская городская клиническая больница, Москва; 9ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России; 10ГБОУ ВПО УралГМА, Екатеринбург; 11 Diagnostic Center of Acute Leukemia, Institute of Pharmaceutical Biology/ ZAFES, Goethe-University of Frankfurt, Франкфурт-на-Майне, Германия Нами проведен анализ результатов цитогенетиче ского и молекулярно-генетических исследований (FISH, различные варианты полимеразной цепной реакции) у 57 пациентов в возрасте младше 1 года с острым миелоидным лейкозом (ОМЛ). Перестройки 11q23/MLL были выявлены у 28 (49 %) детей. Самыми частыми были транслокации t(10;11)(p12;q23)/MLLMLLT10 – в 32 % случаев и t(9;11)(p22;q23)/MLLMLLT3 – в 28 % случаев. Перестройки 11q23/MLL встречались приблизительно с равной частотой у пациентов младше и старше 6 месяцев (p = 0,904). В группе пациентов с перестройками 11q23/MLL острый монобластный лейкоз (FAB М5) наблюдался достоверно чаще, а острый мегакариобластный лейкоз (FAB М7) – достоверно реже, чем в группе пациентов, у которых изменения 11q23/MLL не были обнаружены (р = 0,024 и р = 0,001 соответственно). У 6 (50 %) из 12 пациентов, которым проводилось определение точки разрыва в гене MLL, она располагалась в интроне 9. Дополнительные хромосомные аномалии у пациентов с наличием перестроек 11q23/ MLL и известным кариотипом были выявлены в 33 % случаев, комплексный кариотип – в 24 %. Также нами дана детальная характеристика редких вариантов пере-

строек MLL, включая MLL-MYO1F, MLL-SEPT6, MLLSEPT9, а также частичного тандемного повтора в гене MLL при ОМЛ у пациентов первого года жизни. Показана важность комбинирования цитогенетического и молекулярно-генетических методов для корректного установления типа перестройки 11q23/MLL.

Сравнение антипролиферативной эффективности флавоноидов корня солодки и доксорубицина in vitro М.Д. Цицуашвили1, С.И. Павлова2, 3, И.Г. Козлов1, 2 1 ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва; 2ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, Москва; 3ФГБОУ ВПО ЧГУ им. И.Н. Ульянова, Чебоксары, Республика Чувашия Противоопухолевый антибиотик доксорубицин широко используется в терапии онкологических заболеваний различного генеза. Однако в ряде случаев отмечено развитие резистентности некоторых опухолей к этому препарату, что представляет существенную проблему для практической онкологии. Известно, что низкомолекулярные полифенольные соединения растительного происхождения, флавоноиды, обладают широким спектром биологической активности. Есть сведения, что в основе механизма антипролиферативного эффекта флавоноидов лежит ингибирование фосфорилирования внутриклеточных сигнальных молекул. Целью данного исследования явилась оценка и сравнение рост-ингибирующей активности флавоноидов корня солодки (ФКС) и доксорубицина (Sigma, США) по отношению к опухолевой линии K-562/DOX, резистентной к данному цитостатику. Оценка пролиферации лейкозных клеток проводилась с помощью радиоизотопного метода. Клетки засевали в 96-луночный планшет в концентрации 1,0 × 104 клеток/лунку и инкубировали в течение 24 ч. Далее в опытные лунки вносили ФКС (0,1–20 мкг/мл) и доксорубицин (10-8–10-5 М). Затем во все лунки добавляли АТФ (100 μМ) и радиоактивную метку 3Н-тимидин (1 мкКю/мл) и продолжали инкубацию еще в течение 24 ч. В контрольные лунки добавляли соответствующие объемы этанола до конечной концентрации 1 %. Пролиферацию оценивали путем измерения радиоактивности включенного в ДНК 3Н-тимидина; результат выражали в процентах к контролю. Исследуемые агенты подавляли пролиферацию клеток дозозависимо: ФКС (10–20 мкг/ мл) – до 30–35 %, доксорубицин (10-6–10-5 М) – до 30– 40 %, при этом он не оказывал эффекта в терапевтиче ских концентрациях 10-8–10-7 М. При совместном введении ФКС (20 мкг/мл) и доксорубицина в опухолевую культуру пролиферация клеток линии K-562/DOX ингибировалась в большей степени: эффект комбинации был равен сумме эффектов отдельных препаратов. Таким образом, комбинация ФКС с доксорубицином приводит к усилению противоопухолевого эффекта in vitro.

ТЕРАПИЯ ВЫСОКИХ ДОСТИЖЕНИЙ

Показания. Неходжкинская лимфома Рецидивирующая или химиоустойчивая В-клеточная, СD20-положительная неходжкинская лимфома низкой степени злокачественности или фолликулярная. Фолликулярная лимфома III-IV стадии в комбинации с химиотерапией у ранее нелеченных пациентов. Фолликулярная лимфома в качестве поддерживающей терапии после ответа на индукционную терапию. СD20-положительная диффузная В-крупноклеточная неходжкинская лимфома в комбинации с химиотерапией по схеме CHOP. Хронический лимфолейкоз в комбинации с химиотерапией у пациентов, ранее не получавших стандартную терапию. Рецидивирующий или химиоустойчивый хронический лимфолейкоз в комбинации с химиотерапией. Ревматоидный артрит (активная форма) у взрослых в комбинации с метотрексатом при непереносимости или неадекватном ответе на текущие режимы терапии, включающие один или более ингибиторов фактора некроза опухолей (ФНО-а). Безопасность и эффективность препарата у детей не установлены. Противопоказания. Гиперчувствительность к ритуксимабу, любому компоненту препарата или к белкам мыши, острые инфекционные заболевания, выраженный первичный или вторичный иммунодефицит. Правила приготовления и хранения раствора. Необходимое количество препарата набирают в асептических условиях и разводят до расчетной концентрации (1-4 мг/мл) в инфузионном флаконе (пакете) с 0.9% раствором натрия хлорида для инфузий или 5% раствором декстрозы (растворы должны быть стерильными и апирогенными). Приготовленный инфузионный раствор Мабтеры физически и химически стабилен в течение 12 ч при комнатной температуре или в течение не более 24 ч при температуре от 2 до 8 °С. Мабтеру вводят внутривенно, инфузионно (медленно), через отдельный катетер. Нельзя вводить в/в болюсно или в виде в/в инъекций. Дополнительная информация в инструкции по применению.

ЗАО «Рош-Москва» Официальный дистрибьютор «Ф. Хоффманн - Ля Рош Лтд.» (Швейцария) Россия, 107031 Москва Трубная площадь, дом 2 Бизнес-центр «Неглинная Плаза» Тел.: + 7 (495) 229-29-99 Факс: + 7 (495) 229-79-99 www.roche.ru