PENUNTUN PRAKTIKUM
BIOKIMIA METABOLISME (Prodi Pendidikan Kimia)
OLEH:
TIM BIOKIMIA LABORATORIUM BIOKIMIA JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI PADANG 2019
PEDOMAN UMUM PRAKTIKUM
A. Peraturan dasar di laboratorium 1. Sebelum memasuki ruangan laboratorium, anda harus memakai jas praktikum / lab coat 2. Praktikan dilarang memakai sandal dan sejenisnya 3. Tidak diperbolehkan makan, minum dan meludah di laboratorium 4. Bagi yang tidak berkepentingan, dilarang masuk ke laboratorium 5. Buanglah sampah pada tempat yang sudah disediakan 6. Dilarang membuang sampah di saluran air 7. Pahami semua aturan penggunaan alat dan bahan sebelum digunakan 8. Bicara seperlunya 9. Setelah bekerja, ruangan dan alat harus dibersihkan 10. Hati-hati menggunakan zat 11. Selalu berhati-hati ketika membawa dan bekerja dengan zat 12. Tidak dibenarkan bekerja sendirian di laboratorium 13. Tidak masuk praktikum 3 kali berturut-turut, dianggap mengundurkan diri 14. Datang 15 menit sebelum praktikum dimulai
B. Kewajiban praktikan 1. Mempelajari penuntun praktikum dan bersiap untuk di tes 2. Tidak diperkenankan masuk laboratorium sebelum ada izin dari pembimbing praktikum atau asisten praktikum 3.
Membuat jurnal setiap kali praktikum dengan urutan sebagai berikut: •
Judul praktikum
•
Tujuan praktikum
•
Teori dasar
•
Alat dan bahan yang diperlukan
•
Prosedur praktikum dalam bentuk skema atau diagram alir
•
Pengamatan dalam bentuk tabel
•
Jawaban pertanyaan (jika ada)
•
Daftar pustaka ii
4.
Membawa lap atau tisu
5.
Mengganti alat yang hilang atau rusak
6.
Melaporkan setiap terjadi kecelakaan di laboratorium pada asisten atau pembimbing praktikum
7.
Menyerahkan surat keterangan dari dokter jika sakit
8.
Menyerahkan laporan lengkap pada waktu praktikum berikutnya pada asisten atau pembimbing praktikum dengan isi laporan praktikum sebagai berikut: •
Judul praktikum
•
Tujuan praktikum
•
Teori dasar
•
Alat dan bahan
•
Prosedur kerja dalam bentuk diagram alir atau skema
•
Pengamatan
•
Pembahasan
•
Kesimpulan
•
Daftar pustaka
•
Jawaban pertanyaan
iii
DAFTAR ISI
Hal 1. Pedoman Umum Praktikum Biokimia …………………………………
i
2. Daftar Isi ………………………………………………………………
iii
3. Penentuan Kadar Glukosa Secara Spektrofotometri…………………. 4. Analisa Kualitatif Kandungan Urin………………………………….
1 5
5. Analisa Kulaitatif Kandungan Empedu……………………………… 6. Penentuan Kadar Kolesterol……………..……………………………
iv
Praktikum Biokimia Percobaan 01
PENENTUAN KADAR GLUKOSA DARAH SECARA SPEKTROFOTOMETRI
A. Standar Kompetensi Mahasiswa dapat menentukan kadar glukosa darah secara spektrofotometri.
B. Kompetensi Dasar 1. Mahasiswa dapat mediskripsikan konsep dasar karbohidrat. 2. Mahasiswa dapat membuat reagen yang berkaitan dengan percobaan di atas. 3. Mahasiswa dapat mengoperasikan alat spektrofometer. 4. Mahasiswa dapat melakukan percobaan penentuan kadar glukosa darahsecara spektrofotometri. 5. Mahasiswa dapat mengumpulkan data dan menganalisa data. 6. Mahasiswa dapat merumuskan kesimpulan. 7. Mahasiswa dapat mengkomunikasikan hasil percobaan.
C. Dasar Teori Darah selain mengandung glukosa juga mengandung biomolekul lain seperti protein. Penentuan kadar glukosa darah akan dipengaruhi oleh adanya protein dalam darah, untuk itu protein harus diendapkan terlebih dahulu. Protein darah dapat diendapkan dengan menambahkan Seng sulfat (ZnSO4) dan Barium hidroksida (Ba(OH)2). Hasil reaksi reduksi ion kupri oleh glukosa dalam suasana basa dengan reagen arsenomolibdat memberikan warna biru yang kekuatan intensitasnya sesuai dengan konsentrasi glukosa dalam darah tersebut. Pengukuran absorbansi dari sampel berwarna ini dilakukan pada 1
panjang gelombang maksimum yaitu 660 nm dengan menggunakan spektrofotometer. Berdasarkan hukum Lambert-Beer dapat dihitung kadar glukosa dalam darah.
D.Alat dan Bahan . 1. Alat Tabung reaksi kecil
2 buah
Tabung sentrifuga
2 buah
Tabung reaksi besar
10 buah
Pipet takar 2 ml
1 buah
Pipet takat 10 ml
1 buah
Pipet tetes
2 buah
Labu ukur 10 ml
6 buah
Batang pengaduk
1 buah
Rak tabung reaksi
1 buah
Penjepit tabung reaksi
7 buah
Gelas kimia 250 ml
2 buah
Alat setrifuga
1 set
Spektrofotometer spektronik 21
1 set
Kuvet
2 buah
Penangas air
1 buah
Botol semprot
1 buah
2. Bahan Darah merah segar (non diabetes dan diabetes) masing-masing1 ml 2
Larutan standar glukosa 1,0 mg/ml Larutan Ba(OH)2 0,3 N Larutan Zn SO4 5 % Reagen Arsenomolibdat Larutan Nelson A Larutan Nelson B Larutan Cu alkalis Aquades Catatan Pembuatan reagen Arsenomolibdat 2,5 gram kristal amonium molibdat dilarutkan dalam 50 ml aquades, ditambah dengan 4,2 ml H2SO4 pekat sambil diaduk, dinginkan. Sebanyak 0,6 gram kristal Na2HasO4.7 H2O dilarutkan dalam 5 ml aquades. Larutan ini dicampur dengan larutan yang pertama dan aduk. Larutan berwarna kuning bening ini disimpan dalam botol berwarna coklat dan diinkubasi selama 24 jam – 48 jam pada suhu 37 0
C. Setelah itu simpan dalam lemari es.
Larutan Nelson A. 1,5 gram garam Rochlle, 3 gram Na2CO3 anhidrat, 2 gram NaHCO3 dan 18 gram Na2SO4 anhidrat dilarutkan dalam aquades sambil diaduk dan diencerkan hingga volume total 100 mL.
Larutan Nelson B 2 gram CuSO4.5H2O dilarutkan dalam aqudes lalu ditambahkan 18 gram Na 2SO4 anhidrat, aduk hingga larut semuanya. Tambahkan 1 - 2 tetes H2SO4 pekat dan encerkan hingga volume 100 mL.
3
Larutan Cu Alkali Campurkan 4 volume sampel Nelson A dengan 1 volume Larutan Nelson B aduk. Larutan ini harus dibuat saat akan digunakan (segar).
E. Prosedur Kerja 1. Pembuatan filtrat darah bebas protein Ambil dengan teliti 0,1 mL darah segar atau yang “oxalated“ (darah yang telah diberi natrium oksalat) masukkan ke dalam tabung sentrifuga, tambahkan 1,90 mL aquades, aduk sampai homogen, kemudian tambahkan 1,50 mL Ba(OH)2 0,3 N aduk. Tambahkan lagi 1,50 mL larutan ZnSO4 5%, aduk sampai homogen, biarkan selama 5 menit. Setelah itu sentrifuga selama 20 menit. Pisahkan filtrat dari endapan. Filtrat yang bening itu digunakan untuk percobaan selanjutnya (Berapa kali pengenceran pada percobaan ini ?). 2. Pembuatan larutan standard dan Macing kuvet. a. Buat larutan standar glukosa dari larutan induk (1,0 mg/mL), masing- masing dengan konsentrasi 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, dan 0,1 mg/mL dalam labu takar 10 mL b. Ambil beberapa kuvet dan pilihlah kuvet yang mempunyai sifat optik yang sama (macing kuvet). Gunakan aqudes untuk macing kuvet. Dalam pengukuran gunakan 2 buah kuvet yang macing (satu untuk larutan standar, satu untuk blanko). 3. Pembuatan Kurva Standar. 1). Sediakan 7 buah tabung reaksi, ke dalam tabung reaksi 1-6 masing-masing diisi dengan 1 mL larutan standar sesuai konsentrasi yang telah disediakan, dan tabung reaksi ke 7 diisi dengan blangko. Tambahkan masing-masing dengan 1,0 mL larutan Cu-alkalis, panaskan tabung reaksi pada air mendidih dalam penangas air selama 20 menit. Dinginkan dalam air (sebaiknya pakai batu es). Setelah dingin pada setiap tabung reaksi tambahkan 1,0 mL reagen Arsenomolibdat, aduk sampai homogen. Tambahkan lagi aquades 7,0 mL, 4
kocok sampai gas C02-nya habis. Simpan larutan tersebut untuk penentuan Îťmaks dan kurva standar (kurva kalibrasi) 2). Tentukan Îťmaksdari larutan yang akan digunakan dengan menggunakan konsentrasi yang mewakili larutan standar. Atur panjang gelombang mulai dari 600 nm sampai 750 nm dengan range 10 nm 3). Ukur absorbansi masing-masing larutan standar pada Îťmaks.Alurkan kedalam grafik Absorbansi vs Konsentrasi. (sumbu X konsentrasi, sumbu Y absorbansi). 4).Cari persamaan regresi linier, dan tentukan besar koefisien regresinya (r). 4. Penentuan Kadar Glukosa Darah. Sediakan 2 buah tabung reaksi, ke dalam tabung reaksi 1 masukkan 1 mL filtrat darah bebas protein (sampel diabetes), dan ke dalam tabung reaksi ke 2 1mL filtrat darah bebas protein (darah normal). Ke dalam masing-masing tabung reaksi tambahkan 1,0 mL larutan Cu alkalis, panaskan tabung reaksi pada air mendidih dalam penangas air selama 20 menit. Dinginkan dalam air (sebaiknya pakai batu es). Setelah dingin pada setiap tabung reaksi tambahkan 1,0 mL reagen arsenomolibdat, aduk sampai homogen. Tambahkan lagi aquades 7,0 mL, kocok sampai gas CO2-nya habis. Setelah itu ukur serapan masing-masing larutan dengan spektronik pada panjang gelombang maksimum. Pada langkah ini darah telah diencerkan berapa kali ?. Hitung kadar glukosa darah dalam setiap 100 mL darah. F. Pertanyaan 1. Apa yang dimaksud dengan larutan standard dan apa fungsinya ? 2. Apa yang dimaksud dengan Îťmaks , dan kenapa pengukuran absorbansi dilakukan pada Îťmaks ? 3. Apa fungsi penambahan natrium oksalat pada sampel darah ? 4. Pada percobaan ini mengapa protein harus diendapkan dan dipisahkan dari filtrat darah ? 5
5. Setelah penambahan reagen arsenomolibdat terbentuk gas CO 2. Tuliskan reaksi yang terjadi ? 6. Apa fungsi hormon insulin dan glukagon dalam tubuh manusia ? G. Tugas Pendahuluan 1. Selain glukosa dan protein, zat-zat apa saja yang terdapat di dalam darah ? 2. Berapa kadar glukosa darah normal orang dewasa ? 3. Berapakah volume larutan glukosa 1,0 mg/ml yang dibutuhkan untuk masingmasing larutan standar ? Tuliskan perhitungannya. 4. Kenapa seseorang dapat terkena penyakit diabetes mellitus, jelaskan apa penyebabnya , dan apa usaha yang harus dilakukan untuk mencegah agar penyakit tersebut dapat di atasi. H. Daftar Pustaka Dotti, Louis B; Orten, JM (1997), Laboratorium Instructions in Biochemistry, S Louir: Mosby Company. Harrow, Benjamin, et.al, Laboratorium Manual og Biochemistry, fifth edition, London: Saunder Company. Somogy, M, (1952), “ Notes on sugar Determination�, Journal of Biochemistry, 195, pp. 19-23.
Praktikum Biokimia Percobaan 02
6
ANALISA KUALITATIF KANDUNGAN URIN
A. Standar Kompetensi Mahasiswa dapat melakukan analisa kualitatif kandungan urin.
B. Kompetensi Dasar 1. Mahasiswa dapat mengetahui kandungan kimia urin. 2. Mahasiswa dapat membuat reagen yang berkaitan dengan percobaan di atas. 3. Mahasiswa dapat menggunakan peralatan yang berkaitan dengan percobaan di atas 4. Mahasiswa dapat menganalisa data hasil percobaan. 5. Mahasiswa dapat mengambil kesimpulan dari hasil percobaan. 6. Mahasiswa dapat mengkomunikasikan hasil percobaan.
C. Dasar Teori Urine diproduksi oleh ginjal . Sifat dan susunan urine dipengaruhi oleh beberapa faktor fisiologis (seperti masukan diet, suhu lingkungan, proses dalam tubuh, stress mental dan fisik) , dan faktor patologis (seperti adanya gangguan metabolisme, penyakit ginjal. Oleh karena itu pemeriksaan urine berguna untuk menunjang diagnosis suatu penyakit. Dalam keadaan normal pada orang dewasa akan dibentuk 1.200 – 1.500 mL urin ssdalam satu hari. Pembentukan urin dipengaruhi oleh cairan yang masuk dan jenis makanan. Diet protein tinggi akan meningkatkan pembentukan urin, sebab urea yang terbentuk pada proses metabolisme protein mempunyai efek diuretik. Pada suhu lingkungan tinggi , volume urin berkurang. Poliuria (volume urin meningkat) ditemukan 7
pada berbagai keadaan. Pada diabetes insipidus, akibat tidak adanya hormon antidiuretik, volume urin tiap hari mencapai 10 – 20 L. Pada diabetes melitus, volume urin dapat mencapai 5 – 6 L dalam 1 hari. Oligourea (volume urin berkurang), ditemukan pada keadaan demam, diare, gagal jantung, dll. Anuri (tidak terbentuk urin), terjadi pada saat syok, keracunan air raksa atau batu ginjal. Pada keadaan normal, urine yang terbentuk berwarna kuning muda dan jernih dengan bau khas. Berat jenis urin 1,003 – 1,030, pH bersifat asam (pH = 6) dan sangat berpariasi antara 4,9 sampai 8,0. Kandunga zatv padat dalam urin 24 jam adalah klorida sebagai NaCl, ion Ca2+, M g2+, Iodium, Urea, Kreatini, amonia, asam urat, sulfat, fosfat, oksalat, asam amino, vitamin, hormon, dan enzim. Pada keadaan abnormal dapat ditemukan glukosa, keton, protein, dan berbagai senyawa lain seperti pigmen mepedu, darah, forfirin. Pada wanita hamil dalam urin ditemukan hGG (human Chorionic Gonadotropin) yang dihasilkan oleh plasenta. Hormon ini memberi hasil positif pada uji kehamilan
D. Alat dan Bahan Alat: Tabung reaksi besar
10 buah
Rak tabung reaksi
1 buah
Pipet takar 10 mL
1 buah
Penjepit kayu
5 buah
Batang pengaduk
1 buah
Pipet tetes
2 buah
Sendok plastik
1 buah
Penangas air
1 set
Botol semprot
1 buah 8
Bahan Urin normal 24 jam dan urin patologis Kristal amonium sulfat Larutan natrium nitroprusida 5% Larutan ammonium hidroksida pekat Asam nitrat pekat Larutan Benedict Larutan Glukosa 0,5 %, 1,0 %, 2,0 %, dan 5,0 % Aquades Larutan albumin 1%
E. Prosedur Kerja 1. Uji Glukosa dalam Urin (Uji Bennedict) a. Sediakan 5 buah tabung reaksi, ke dalam masing-masing tabung reaksi masukkan 2,5 mL larutan Benedict dan 10 tetes urin normal. Ke dalam tbg reaksi 2 -5 tambahkan berturut-turut larutan glukosa 0,5% , 1% , 2% dan 5% masing-masing 5 tetes b. Panaskan tabung reaksi tersebut selama 5 menit dalam penangas air mendidih. c. Dinginkan perlahan-lahan. d. Perhatikan endapan atau warna yang terbentuk Warna
Penilaian
Konsentrasi
Biru/ hijau keruh
-
-
Hijau/ hijau kekuningan
+1
Kurang dari 0,5%
9
Kuning kehijauan/kuning
+2
0,5 – 1,0 %
Jingga
+3
1,0 – 2,0 %
Merah
+4
Lebih dari 2 %
Hasil percobaan Uji Benedict
Warna
Penilaian
Konsentrasi
Urin normal Urin mengandung glukosa 0,5% Urin mengandung glukosa 1,0% Urin mengandung glukosa 2,0% Urin mengandung glukosa 5,0%
2. Uji Protein dalam Urin (Uji Heller). a. Sediakan 2 buah tabung reaksi, isi dengan 3 mL urin normal. Pada tabunh reaksi 2 tambahkan larutan albumin sebanyak 10 tetes b. Dengan perlahan-lahan (dengan pipet tetes) masukkan 3 mL asam Nitrat pekat ke dalam tabung di atas melalui dinding reaksi (hati-hati ). c. Perhatikan cincin putih yang terbentuk pada perbatasan
Catatan. Urea, asam urat dan garamnya dapat menghasilkan cincin putih, tetapi dapat dibedakan dengan memakai urin yang telah diencerkan 3-4 kali, sehingga pengaruh ini dapat dihilangkan. Hasil Percobaan 10
Sampel
Pengamatan
Kesimpulan
Urin normal Urin patologis
3. Uji Senyawa keton dalam Urin ( Uji Rother) a. Sediakan 2 buah tabung reaksi, masing diisi dengan 5 mL urin. Ke dalam tabung reksi 2 tambah kan 10 tetes aseton. Tambahkan kristal ammonium sulfat kedalam urin normal atau urin patologis hingga jenuh. b. Tambahkan 2 – 3 tetes larutan natrium nitroprusida 5 % (dalam keadaan segar) dan 1 mL ammonium hidroksida pekat. Aduk dan biarkan minimal 30 menit. c. Perhatikan perubahan warna yang terjadi. Hasil Percobaan Sampel
Pengamatan
Kesimpulan
Urin normal Urin patologis
F. Pertanyaan 1. Tuliskan reaksi yang terjadi antara glukosa dengan Benedict 2. Berdasarkan percobaan , apakah kadar glukosa yang terdapat dalam sampel yang dianalisis termasuk dalam keadaan normal atau tidak ? 3. Apa yang menyebabkan kadar glukosa dalam urin bervariasi 4. Apakah uji Heller spesifik terhadap protein ? dan tuliskan reaksi yang terjadi . 5. Dalam kondisi bagaimanakah kadar protein tinggi dalam urin ?
11
6.Berdasarkan percobaan , jenis urin manakah yang mengandung senyawa keton tertinggi ? dan pada keadaan bagaimana senyawa keton ditemukan dalam urin ? G. Tugas Pendahuluan: 1. Jelaskan apa yang dimaksud dengan urin normal dan patologis 2. Tuliskan komposisi urin normal manusia 3. Tuliskan reaksi terbentuknya urea di dalam tubuh manusia 4. Dari hasil analisa urin seorang pasien, ternyata di dalam urinnya mengandung senyawa keton. Jelaskan kenapa hal itu dapat terjadi.
12
Praktikum Biokimia Percobaan 03
ANALISA KUALITATIF KANDUNGAN EMPEDU
A. Tujuan
1. Mengetahui keadaan fisik empedu yang meliputi warna, bau, keadaan wujudnya, derajat keasaman dan berat jenisnya. 2. Mengetahui kandungan musin dan senyawa anorganik pada empedu. 3. Mengetahui zat warna empedu melalui test Gmelin dan Smith. 4. Mengetahui kandungan asam pada empedu.
B. Dasar Teori
Kandungan empedu merupakan kantong otot kecil yang berfungsi untuk menyimpan empedu (cairan pencernaan berwarna kuning kehijauan yang dihasilkan oleh hati). Empedu mengalir dari hati melalui duktus hepatikus kiri dan kanan, lalu keduanya bergabung membentuk duktus hepatikus utama bergabung dengan saluran yang berassal dari kantung empedu (duktus sistikus) membentuk saluran empedu utama. Saluran empedu utama masuk ke usus bagian atas pada sfingter Oddi, yang terletak beberapa centimeter di bawah lambung. Cairan empedu terdiri dari asam emped, protein, garam empedu, kalsium dan lemak. Fungsi dari cairan empedu adalah untuk membentuk penyerapan lemak, dan vitamin A,D,E dan K. Cairan empedu merupakan cairan jernih, berwarna kuning, agak kental dan mempunyai rasa pahit. Caoran empedu mengandung zat-zat anorganik, yaitu HCO3, Cl-, Na+ dan K+ serta zat-zat organic, yaitu asam-asam empedu, bilirubin dan kolesterol. Asam-asam empedu yang penting ialah asam kolat dan asam deoksikolat. 13
Beberapa fungsi asam empedu antara lain: sebagai emulgator dalam proses pencernaan lemak dalam usus; dapat mengaktifkan lipase dalam cairan pancreas; membantu mengadsorbsi asam-asam lemak, kolesterol, vitamin D dan K serta karoten; sebagai perangsang aliran cairan empedu dari hati; dan menjaga agar kolesterol tetap larut dalam cairan empedu sebab bila perbandingan asam empedu dengan kolesterol rendah, akan menyebabkan terjadinya beberapa endapan kolesterol (Anna Poedjiadi, 1994; 244).
C. Alat dan Bahan Alat: 1. Gelas ukur 10 ml dan 25 ml 1 buah 2. Gelas kimia 50 ml dan 100 ml 1 buah 3. Tabung reaksi 8 buah 4. Rak tabung reaksi 5. Corong biasa 6. Picnometer 50 ml 7. Neraca analitik 8. Oven 9. Penjepit tabung 10. Botol semprot 11. Pipet tetes 12. Gunting Bahan 1. Empedu ayam 2. Asam asetat 10 % 3. Perak nitrat 4. Barium klorida 5. Ammonium molibdat 6. Asam nitrat pekat 7. Iodida 5 % 8. Sukrosa 9. Asam sulfat pekat 14
10. Aquadest 11. Indikator universal
D. Cara Kerja 1. Tes Keadaan Fisik Empedu Memperhatikan dan memeriksa warna, bau, keadaan wujud, derajat keasaman (dengan indikator universal). Tabel Pengamatan Gelas kimia berisi empedu asali Warna empedu Bau/Aroma pH Tingkat kekentalan
Encer/agak kental/kental
2. Tes Sifat Asam / Basa dari Empedu a.
Menambahkan 5 mL larutan empedu yang telah diencerkan ke dalam tagung reaksi.
b. Tambahkan 5 tetes larutan sukrosa 5% ke dalam tabung reaksi. c.
Miringkan tabung reaksi, alirkan dengan hati-hati 3 mL asam sulfat pekat melalui dinding tabung reaksi, sehingga terbentuk 2 lapisan . Perhatikan cincin yang terbentuk pada perbatasan antara kedua lapisan.
d. Mencatat hasilnya. Tabel pengamatan Tabung reaksi
Jumlah zat
Larutan enpedu
5 mL
Larutan glukosa
5 tetes
Asam sulfat
3 mL
Hasil Pengamatan
3. Tes Zat Warna Empedu (Uji Gmelin) a. Masukkan 3 mL HNO3 pekat ke dalam tabung reaksi
15
b. Miringkan tabung reaksi , dengan menggunakan pipet tetes, secara hatihati alirkan 3 mL larutan empedu encer melalui dinding tabung reaksi, sehingga kedua larutan tersebut tidak tercampur (jangan digoyang) c. Perhatikan warna yang terbentuk pada perbatasan antara kedua cairan. d. Tulis hasil pengamatan anda.
4. Empedu sebagai emulgator. a. Sediakan 2 buah tabung reaksi , masing-masing diisi dengan air suling sebanyak 3 mL. b. Pada kedua tabung tambahkan 1 tetes minyak goreng, c. Pada tabung ke-2 tambah kan 3 mL larutan cairan empedu encer. d. Kecok kedua tabung , perhatikan apa yang terjadi pada masing-masing tabung Tabel Pengamatan. Tabung
1
2
Air suling
3 mL
3 mL
Minyak goring
1 tetes
1 tetes
Larutan empedu cair
-
3 mL
Hasil
E. Pertanyaan. 1. Apa yang menyebabkan uji Gmelin dapat menghasilkn warna ?, tulis persamaan reaksinya. 2. Apa guna penambahan sukrosa pada percobaan uji asam empedu? F. Tugas Pendahuluan. 1. Hasil analisis labor seorang pasien, ternyata menderita penyakit batu empedu. Jelaskan apa penyebabnya seseorang terkena penyakit batu empedu? 2. Apa fungsi cairan empedu bagi manusia ?
16
Praktikum Biokimia Percobaan 04
PENGUKURAN KADAR KOLESTEROL (METODE LIEBERMAN-BURCHARDS)
A. Tujuan
1. Untuk mengetahui prinsip pengukuran kadar kolesterol dengan menggunakan metode Liebermen-Burchards. 2. Untuk mengetahui kadar kolesterol dalam otak, kulit, hati, dan daging B. Dasar Teori Kolesterol merupakan sterol yang paling banyak terdapat dalam badan manusia, terutama pada otak, jaringan syaraf, cairan empedu dan darah. Senyawa ini merupakan penyusun utama batu empedu. Kolestrol banyak dijumpai pada lemak binatang, tetapi tidak pernah ditemukan pada lemak tumbuhan. Tumbuhan mempunyai sterol yang disebut fitosterol.
Kolesterol merupakan senyawa yang memiliki inti empat cincin siklopentano – fenantren. Termasuk lemak dengan daya larut yang sangat kecil dalam air. Kadarnya dalam plasma darah 150-200mg/ml, sekitar 2x kadar glukosa darah. Dalam plasma darah 30% berikatan dengan lipoprotein yang mampu menambah daya larutnya dalam darah. Sebanyak 70% lagi kolesterol darah berada berupa kolesterol ester. Kolesterol juga banyak terdapat dalam empedu, dengan kadar 390mg/100ml (Yatim. 2003: 205). Kolesterol tidak larut dalam air tetapi dapat diekstraksi dari jaringan dengan kloroform, eter, benzena dan alkohol panas.
17
Kadar kolestrol didalam darah: Nilai normal : < 132 mg/dL 132 â&#x20AC;&#x201C; 200 mg/dL >200 mg/dL
= rendah = normal = tinggi
C. Alat dan Bahan Alat: Beacker glass
5 buah
Tabung reaksi
10 buah
Tabung sentrifuge
1 set
Penggerus porselin (mortal)
1 set
Batang pengaduk
5 buah
Pipet takar 1 mL
1 buah
Pipet takar 10 mL
2 buah
Filler
1 buah
Pipet tetes
5 buah
Penangas
1 set
Sentrifuge
1 set
Timbangan elektrik
1 set
Spektrofotometer
1 set
Tabung cuvet
2 buah (maching cuvet)
Rak tabung reaksi
1 buah
Vortex
1set 18
Bahan : Alkohol absolut Aseton Kloroform Asam sulfat pekat Asetat anhidrat Sampel (otak, kulit, daging , dan hati ayam)
D. Cara Kerja Preparasi sampel 1. Sampel 1 mL/1 gr dimasukkan ke dalam tabung sentrifuge yang telah berisi 10 mL aseton:alkohol (1:1) kemudian diaduk sampai rata. 2. Tabung yang berisi bahan tadi dipanaskan pada waterbath sampai mendidih. Tabung kemudian diangkat dan didinginkan dalam temperatur kamar, setelah dingin disentrifuge pada kecepatan 1750 rpm selama 15 menit. 3. Supernatan (bagian bening) yang terbentuk dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian diuapkan dengan dipanaskan dalam waterbath sampai kering dan akan terbentuk pasta (residu). 4. Residu dilarutkan dalam kloroform dan dihomogenisasi (langkah ini merupakan langkah pengenceran yang disesuaikan dengan volume pengenceran dari masing-msaing sampel yang diperiksa. Setelah diencerkan sampel ditambah dengan 2 mL campuran asam sulfat dan asetat anhidrat (1:30)). 5. Larutan residu yang telah diencerkan tadi ditempatkan pada ruang gelap selama 5 menit hingga terbentuk warna hijau. Hasil warna yang diperoleh dibaca dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 680 nm. Laboratorium Biokimia FMIPA UNP
19
6. Membuat larutan blanko yang berisi 2 mL kloroform dan 2 mL campuran asam sulfat dan asetat anhidrat (1:30) 7. Hasil pembacaan dimasukkan ke dalam persamaan regresi dari kadar kolesterol standart. a) Residu otak : 60 kali 1. Residu + 3 mL kloroform (dihomogenisasi) 2. 0,1 mL larutan residu + 1,9 mL kloroform + 2 mL campuran asam sulfat dan asetat anhidrat (1:30) (dihomogenisasi) b) Residu hati : 40 kali 1. Residu + 2 mL kloroform (dihomogenisasi) 2. Menambahkan larutan Lowry A 0,5 ml pada masing â&#x20AC;&#x201C; masing tabung, divortex dan dibiarkan 30 menit c) Residu kulit dan daging : 10 kali 1. Residu + 2 mL kloroform (dihomogenisasi) 2. 0,4 mL larutan residu + 1,6 mL kloroform + 2 mL campuran asam sulfat dan asetat anhidrat (1:30) (dihomogenisasi) d) Pembuatan larutan kolesterol standar 1. Membuat larutan kolesterol murni dengan konsentrasi 2 mg/mL, sebanyak 10 mL dan diencerkan dengan 40 mL kloroform sehingga terbentuk larutan dengan konsentrasi 0,4 mg/nL (larutan). 2. Larutan tadi diambil 20 mL dimasukkan tabung reaksi dan ditambah kloroform 20 mL sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 0,2 mg/mL (larutan B). dari larutan B diambil masing-masing 9 mL, 7 mL, 6 mL, 5 mL, 4 mL, 2 mL. dari pengenceran larutan B ini akan diperoleh larutan dengan konsentrasi 0,18; 0,14; 0,12; 0,10; 0,08; 0,06; 0,04 mg/mL. 3. Larutan tadi diambil lagi sebanyak 30 mL (larutan A). dari larutan A ini diambil 8, 7, 6, 5, 4 mL. Masing-masing dimasukkan ke dalam larutan enam konsentrasi 0,32; 0,28; 0,24; 0,20 dan 0,16 mg/mL Laboratorium Biokimia FMIPA UNP
20
4. Larutan standart tersebut masing-masing diambil 3 mL dan ditambahkan 3 mL asetat anhidrat â&#x20AC;&#x201C; asam sulfat 30: 1, ditempatkan pada ruangan yang gelap selama 5 menit hingga larutan menjadi hijau, diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 680 nm. E. Kepustakaan Astuti. 2007. Petunjuk Praktikum Analisis Bahan Biologi. Yogyakarta : Jurdik Biologi FMIPA UNY Dawiesah, I. S. 1989. Petunjuk Laboratorium Penentuan Nutrien Dalam Jaringan dan Plasma tubuh , Yogyakarta : PAU pangan dan gizi UGM. Linstromberg, Walter W. 1966. Organik Chemistry, A Brief Course. Boston ; D.C. Heath ang Company. Schunack, Walter; Mayer, Klaus and Haake; Manfred. 1990. Senyawa Obat, Buku Pelajaran Kimia Farmasi. Edisi kedua. (Terjm. Joke R. Wattimena dan Sriwoelan Soebito). Yogyakarta : GMU-Press.
Laboratorium Biokimia FMIPA UNP
21
Laboratorium Biokimia FMIPA UNP
22
Laboratorium Biokimia FMIPA UNP
23
Laboratorium Biokimia FMIPA UNP
24
Laboratorium Biokimia FMIPA UNP
25
Laboratorium Biokimia FMIPA UNP
26
Laboratorium Biokimia FMIPA UNP
27