Cuaderno biología

Cuaderno de prácticas Biología Molecular

Merodio Martínez, Ainhoa

2º de Laboratorio Clínico y Biomédico, Biología Molecular24 de febrero del 2017

Índice: Introducción ............................................................................................................. 1 Mapa conceptual de las técnicas de Biología Molecular ........................................................ 3 Manejo, mantenimiento y calibración de pipetas automáticas.............................................. 4 Prácticas del laboratorio .................................................................................................... 10 Práctica 1: Extracción de ADN ..................................................................................... 10 Práctica 2: PCR ........................................................................................................... 17 Práctica 3: Electroforesis ............................................................................................ 21 Conclusión......................................................................................................................... 25 Bibliografía ........................................................................................................................ 27

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Introducción: El siguiente portafolios incluye información sobre las prácticas y los trabajos realizados durante la segunda evaluación de Biología Molecular. Entre todas esas prácticas y trabajos se incluyen: -

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Recopilación de información sobre las micropipetas en un laboratorio de biología molecular. Ese periodo de recopilación de información requería conocer el manual de uso del aparataje ya mencionado, realizar la calibración de las micropipetas y su mantenimiento, tanto diario como anual.

Mapa conceptual de las técnicas utilizadas en la Biología Molecular: o PCR o Secuenciación o Clonación o Hibridación Protocolo de las prácticas realizadas en el laboratorio de Biología Molecular: o Extracción de ADN o PCR o Electroforesis

El final de cada apartado del portafolios incluye una sección de aprendizaje.

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MAPA CONCEPTUAL DE LAS TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR En el siguiente link se encuentra el mapa conceptual de las Técnicas utilizadas en Biología Molecular entre las cuales se incluyen:    

PCR Secuenciación Clonación Hibridación

Cada técnica tiene un apartado de fundamento y de principales técnicas. Al final del mapa conceptual hay una diapositiva de aplicaciones generales de las cuatro técnicas explicadas. https://prezi.com/sai0a5bldrbv/mapa-conceptual-bio-molecular/

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MANEJO, MANTENIMIENTO Y CALIBRACIÓN DE PIPETAS AUTOMÁTICAS Al inicio de la evaluación se nos planteó realizar un trabajo sobre las micropipetas del laboratorio. Para ello, hicimos hincapié en los siguientes puntos: 1.

2.

3.

4.

Identificación Manual de uso Calibración y verificación de la calibración (1-11).

Mantenimiento (sólo las que estén mal → ni exactas ni precisas)

Antes de comenzar con el trabajo de las micropipetas hubo que hacer un cronograma del grupo para ver como no teníamos que organizar.

IDENTIFICACIÓN Antes de comenzar con el funcionamiento, la calibración y el mantenimiento de las micropipetas del laboratorio, se debe realizar un proceso de identificación de las pipetas automáticas.

Una vez realizada la identificación, estas son las micropipetas que hay en el laboratorio:    

Labopette Rafer Dragon Med Digipette

MANUAL DE USO 1. Ajustar el volumen girando la rueda hasta que en la escala aparezca el volumen deseado.

2. Colocar una punta de plástico (adecuada a la micropipeta utilizada) en la punta de la pipeta haciendo una leve presión para lograr un buen ajuste.

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3. Oprimir el botón pulsador con el dedo pulgar hasta el primer tope y, sin soltarlo, introducir verticalmente la pipeta en el recipiente hasta que la punta se sumerja un poco dentro del líquido.

4. Liberar lentamente la presión ejercida sobre el botón para absorber el líquido.

5. Retirar, siempre verticalmente, la pipeta del líquido deslizando la punta contra la pared del recipiente.

6. Para verter el líquido, apoyar la punta contra la pared del recipiente donde se quiere depositar.

7. Para liberar el líquido de la punta presionar el botón pulsador hasta el segundo tope.

8. Retirar la pipeta deslizando la punta contra la pared del recipiente.

9. Descartar la punta utilizando el eyector de la micropipeta.

Recomendaciones generales al pipetear * Ángulo de inmersión vertical. Se ha de procurar mantener el ángulo de inmersión de la pipeta lo más cercano a la vertical posible. De otra forma, la columna vertical de líquido será más pequeña y se aspirará demasiada muestra. Por el contrario, al dispensar el líquido, la punta se ha de mantener en un ligero ángulo frente a la pared del vaso para asegurar un correcto vaciado.

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* Profundidad de inmersión de la punta. Es especialmente importante en el uso de volúmenes pequeños. Si la punta se sumerge demasiado se aspirará más líquido debido al aumento de presión. Por el contrario, si la punta no se sumerge lo suficiente, se puede cargar aire con las consiguientes burbujas y volumen inadecuado.

* Uniformidad al pipetear. Es fundamental mantener un ritmo, velocidad y técnica adecuada al mover el émbolo. Una aspiración demasiado rápida e incontrolada puede llevar a la formación de aerosoles, salpicaduras y posible contaminación del eje y del pistón, pudiéndose producir incluso pérdida de volumen de la muestra. * Técnica de dispensación. Para la mayoría de aplicaciones se recomienda dispensar con el extremo de la punta apoyado contra la pared del recipiente. Así se reduce o elimina el hecho de que se quede algo de muestra en el interior de la punta después de acabar la dispensación. Hay que retirar la pipeta deslizando el extremo de la punta hacia arriba por la pared lateral para liberar cualquier gotícula restante en el orificio de la punta.

Otra técnica consiste en dosificar directamente en la superficie del líquido. Es crucial usar una punta de pared fina para que no quede ninguna gotícula en el interior de la punta. Si se dispensa directamente dentro del líquido habrá que sacar la pipeta manteniéndola en el segundo tope para evitar una toma demuestra después de la dispensación.

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* Trabajar sin cambios bruscos de temperatura. Hay que procurar pipetear a una temperatura constante. La temperatura óptima sería de 21,5°C ± 1°C. Debemos evitar repentinos o grandes cambios de temperatura ya que el aire del interior de la pipeta no se puede adaptar rápidamente y esto puede afectar al volumen. Es por este motivo que cuando pipeteamos durante un largo rato nuestra mano puede calentar el aire del interior de la pipeta, expandiéndose y pudiendo reducir la precisión hasta en un 1%. Es por esta razón que se recomienda no sostener continuamente la pipeta en las manos y entre ciclos dejarla en su soporte o en la mesa.

VIDEO USO MICROPIPETA https://youtu.be/NpdPfKTc2gM CALIBRACIÓN Por calibración de pipetas se entiende la comparación entre el volumen real y el volumen teórico, siendo el volumen teórico el marcado por la propia micropipeta (ej: 0,10 mL) y el volumen real el aspirado por la pipeta (ej: 0,09 mL).

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Para calibrar una pipeta necesitaremos agua destilada o desionizada y una balanza adecuada.

Las premisas principales de dicha norma se centran en 3 puntos fundamentales: 1. Condiciones ambientales: sala sin corrientes y temperatura comprendida entre 20°C y 25°C sin variar más de 0,5°C durante el ensayo. Humedad relativa mayor al 50%. Presión atmosférica de 1atm.

2. Utilizar una balanza adecuada.

3. Minimizar el efecto de la evaporación en volúmenes inferiores a 50 microlitros o tomar medidas adicionales para evitarla.

Verificación de calibración * Realizar 10 pipeteos con el volumen mínimo, medio y máximo de la pipeta. * Calcular la exactitud y la precisión, así como la desviación estándar de la misma. Para ello puede diseñarse un documento excel, que facilite la visualización de los datos y los cálculos.

Sabiendo que la densidad del agua es 1 g/mL, pasamos los g a ml. * Comprobar que los resultados estén entre los límites.

Finalmente, las micropipetas que sean menos exactas y tengan menor precisión las calibraremos.

Vídeo verificación https://www.youtube.com/watch?v=NLkKEjEAI9c A continuación se muestra la tabla general de la calibración de las 11 micropipetas. Como se puede apreciar todas eran inexactas e imprecisas, algunas más que otras.

Micropipeta 1 Micropipeta 2 Micropipeta 3 Micropipeta 4 Micropipeta 5 Micropipeta 6 Micropipeta 7 Micropipeta 8 Micropipeta 9 Micropipeta 10 Micropipeta 11

EXACTITUD Inexacta Inexacta Inexacta Inexacta Inexacta Inexacta Inexacta Inexacta Inexacta Inexacta Inexacta

PRECISIÓN Imprecisa Imprecisa Imprecisa Imprecisa Imprecisa Imprecisa Imprecisa Imprecisa Imprecisa Imprecisa Imprecisa

CONFORME No No No No No No No No No No No

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MANTENIMIENTO El mantenimiento consiste en la conservación del buen estado de la micropipeta para evitar su degradación.

Se deben realizar rutinas específicas de los diversos modelos, de acuerdo con las instrucciones de los manuales suministrados por los fabricantes.

Mantenimiento diario Las pipetas son dispositivos que requieren inspecciones frecuentes para detectar desgastes anormales o daños y/o verificar que las mismas se encuentran en buenas condiciones de funcionamiento.

La inspección debe cubrir los siguientes aspectos: 1. Verificar la integridad y ajuste de los mecanismos. Los mismos deben poder moverse de forma suave. El pistón debe desplazarse suavemente. 2. Confirmar que el portapuntas no presente distorsiones o marcas de desgaste, dado que es esencial para la exactitud de las medidas. Verificar el ajuste de las puntas. 3. Colocar una punta y llenarla con agua destilada. La pipeta no debe presentar ningún tipo de fuga. * Limpiar la superficie de la pipeta con un paño humedecido. * Frotar después con otro seco. * Prestar especial atención al soporte de puntas. * Cambiar el filtro cónico si fuera necesario.

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PRÁCTICAS DEL LABORATORIO Una vez trabajado el funcionamiento de las micropipetas y la parte teórica de las Técnicas de Biología Molecular, se realizó la parte práctica de esas técnicas realizando: -

Extracción de ADN en sangre PCR Electroforesis

PRÁCTICA 1: EXTRACCIÓN DE ADN DE SANGRE El ADN (Ácido desoxirribonucléico) está en todas las células con núcleo de nuestro organismo.

Es una molécula compleja formada por dos cadenas de nucleótidos (G, C, T y A) que contienen la información necesaria para el funcionamiento de las células y la formación de los distintos tejidos.

Todas las células de nuestro organismo contienen la misma información genética. En principio, sería posible aislar ADN a partir de cualquier tejido humano. La extracción de ADN se puede realizar a partir de una muestra de sangre, de tejido muscular, de células de mucosa oral (saliva), de un pelo arrancado con raíz, etc. Para esta práctica en concreto, elegiremos la muestra de sangre, ya que es la que se utiliza en los laboratorios de análisis genéticos, porque es un tipo de muestra de la que se puede obtener gran cantidad de ADN debido al gran número de células.

Durante el proceso de aislamiento de ADN, y en general en cualquier proceso de Biología Molecular, es necesario tomar una serie de precauciones para no contaminar las muestras con ácidos nucleicos extraños o con inhibidores.

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Limpiar las áreas de trabajo con lejía al 5% Utilizar guantes como protección personal para evitar contaminar las muestras y para trabajar con materiales y soluciones libres de DNAsas.

Fundamentos del aislamiento de ADN: Existen métodos muy diferentes para obtener ADN a partir de células humanas. Los métodos pueden ser muy sencillos (utilizados para recuperar ADN de restos biológicos mínimos) o más elaborados (permiten la obtención de grandes cantidades de ADN, con un alto grado de pureza a partir de tejidos abundantes).

Todos los protocolos de extracción de ADN incorporan los mismos pasos básicos:   

Lisis celular y posterior lisis nuclear.

Separación del ADN del contenido celular: protección frente a nucleasas.

Purificación del ADN.

Inventario de Material:  Muestra de Sangre  Tampón de lisis (Tris-HCl 10 mM, MgC12 5mM, Sacarosa 0,32 M, Triton-X100 1 %)

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Imagen: Reactivos tampón de lisis      

NaCl 0,9% SDS 20% Proteinasa K 20 mg/ml NaCl saturado (6M) Etanol absoluto Etanol 70%

Imagen: Etanol al 70%  

2 microtubos 1 tubo de fondo cónico 15 ml



Imagen: Tubo con fondo cónico 1 varilla para capturar la madeja de ADN 11



2 pipetas pasteur de 3 ml

Preparación de reactivos: a- Tampón de lisis REACTIVOS Tris-HCl MgCl2.H2O Sacarosa TRiton-X100 Agua (para biología molecular)

CONCENTRACIÓN FINAL 10Mm 5mM 0,32M 1%

CANTIDAD 0,605 g 0,51 g 54,77 g 5 ml Hasta 500 ml

Preparación de 500 ml:  Pesar cada uno de los reactivos según las cantidades específicas en la tabla anterior.  Añadir agua (para uso en biología molecular, suministrada en el kit) hasta 400ml.  Disolver en agitador magnético. Si es necesario, facilitar la disolución mediante la aplicación de calor suave durante la agitación.  Ajustar a pH=7,5 (con HCl).

Imagen: pH al 7,5 tras colocar el tampón de lisis 

Añadir agua hasta 500 ml.

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Imagen: Preparación del tampón de lisis en el agitador.

Almacenamiento:  Almacenar a 4 ºC, durante no más de 15 días Precauciones: 

Esta solución no puede ser autoclavada una vez preparada.

b- NaCl 0,9%: REACTIVOS NaCl Agua (para biología molecular)

CONCENTRACIÓN FINAL 0,9%

CANTIDAD 0,9g Hasta 100ml

Preparación de 100 ml:  Pesar NaCl según la cantidad especificada en la tabla anterior.  Añadir agua (para uso en biología molecular, suministrada en el kit) hasta 100ml.  Disolver en agitador magnético  Si no se va a usar en el momento, conviene autoclavar la solución.

Almacenamiento:  Almacenar a temperatura ambiente c- NaCl saturado: REACTIVOS NaCl Agua (para biología molecular)

CONCENTRACIÓN FINAL 6M

CANTIDAD 3,5g Hasta 10ml

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Preparación de 10ml:  Pesar NaCl según la cantidad especificada en la tabla anterior  Añadir agua (para uso en biología molecular, suministrada en el kit) hasta 10ml.  Disolver en agitador magnético.  Si no se va a usar en el momento, conviene autoclavar la solución.

Almacenamiento:  Almacenar a temperatura ambiente. d- SDS REACTIVOS SDS Agua (para biología molecular)

CONCENTRACIÓN FINAL 20%

CANTIDAD 2g Hasta 10ml

Preparación de 10 ml:  Pesar SDS según la cantidad especificada en la tabla anterior.  Añadir agua (para uso en biología molecular, suministrada en el kit) hasta 8 ml.  Disolver en agitador magnético con aplicación de calor suave.  Una vez disuelto, enrasar a 10ml.

Almacenamiento:  Almacenar a temperatura ambiente. e- ETANOL 70% REACTIVOS Etanol absoluto Agua (para biología molecular)

CONCENTRACIÓN FINAL 70%

CANTIDAD 10,5 ml 4,5ml

Preparación de 15 ml:  Medir el etanol según la cantidad especificada en la tabla anterior.  Añadir agua (para uso en biología molecular, suministrada en el kit) hasta 15 ml.  Mezclar.

Almacenamiento:  Almacenar a temperatura ambiente.

Protocolo de extracción de ADN: 12345-

Partir de 2 ml de sangre periférica en EDTA. Añadir 10 ml de Tampón de lisis. Mezclar por inversión.

Dejar en la nevera (4ºC) durante 30 minutos.

Centrifugar 15 minutos a 2500 rpm.

Eliminar el sobrenadante con pipeta Pasteur o mediante decantación.

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6- Añadir al precipitado NaCl 0,9% hasta 4ml. Disolver completamente el precipitado.

7- Centrifugar 15 minutos a 2500rpm.

8- Eliminar el sobrenadante con pipeta Pasteur o mediante decantación.

Imagen: Tubo cónico antes de quitar el sobrenadante 9- Añadir al precipitado 500µl de Tampón de lisis, 25 µl de SDS 20% y 2,5µl de Proteinasa K. Agitar con vórtex (opcional).

10- Incubar a temperatura ambiente toda la noche.

11- Añadir 160µ de NaCl saturado. Dar un pulso con vórtex (opcional).

12- Añadir 2 volúmenes* de etanol absoluto frío. Mezclar por inversión muy lentamente observando la formación del ovillo de ADN precipitado. *Un VOLUMEN es una medida relativa, de manera que el volumen de líquido contenido en el tubo constituye en volumen, siendo dos volúmenes el doble de lo que haya en el tubo.

13- Capturar la madeja de ADN con una varilla.

14- Lavar la madeja en un microtubo con 1 ml de etanol 70%.

15- Dejar secar el ADN en la varilla durante 30 minutos, apoyando la varilla sobre una gradilla. Pasar la varilla a un microtubo vacío.

16- Resuspender en 300µl agua destilada estéril. Con este procedimiento se obtiene una concentración de ADN promedio de 100-200ng/µl.

PREGUNTAS 1. Enumera y ordena en función de la cantidad de células presentes, los distintos tipos de muestras humanas a partir de las cuales se puede hacer una extracción de ADN. En función de la cantidad de ADN que se puede sacar de esas células, las muestras humanas se orden de este modo de menor a mayor: Células epiteliales < Dientes < Tejidos < Huesos 15

2. ¿Qué cantidad de ADN comparten una célula epitelial, un hepatocito y una neurona?

Una célula epitelial, un hepatocito y una neurona comparten la misma cantidad de ADN porque todas las células del organismo contienen el mismo material genético. Lo que les diferencia es la funcionalidad de cada una de esas células. Es decir, las neuronas se centrarán en crear el impulso nervioso y los hepatocitos en cumplir las funciones del hígado. De modo que, no utilizan el material genético del mismo modo 3. ¿A partir de qué células sanguíneas se puede aislar ADN? El ADN se aislará de los glóbulos blancos puesto que son los que tienen núcleo y el material genético en su interior.

4. ¿En qué parte de la célula está el ADN? En el interior de la célula el ADN se guarda mayoritariamente en el núcleo. No obstante, las mitocondrias y los cloroplastos también disponen de una pequeña cantidad de material genético.

5. En función de la muestra biológica de partida empleada, aproximadamente ¿a partir de cuántos núcleos celulares hemos extraído ADN en esta práctica?

Dependiendo del volumen de muestra obtenido (µl muestra  nº de leucocitos) se cogerá un número de núcleos diferentes.

6. ¿Por qué precipita el ADN en el paso 12?

Porque el ADN es una molécula polar y el alcohol (etanol) es apolar. De modo que el ADN es insoluble en el alcohol.

7. Se podría lavar el ADN en el paso 14 con Etanol al 40%?

Si, lo único que se correría el riesgo de que se disolviera parte del ADN. 8. ¿Cuál es la finalidad de lavar el ADN con Etanol 70%?

El ADN de lava con Etanol 70% para quitar los restos de otras sustancias que pueda haber. En caso de lavar con otro producto que no sea ese, el ADN se disolvería.

9. ¿Por qué es importante que el Etanol se evapore bien en el paso 15?

Porque los restos de Etanol pueden interferir en el resultado de la práctica.

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PRÁCTICA 2: REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Introducción a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR): La PCR se basa en el mecanismo de la replicación in vivo del ADN. Esta técnica consiste en ciclos repetitivos de:   

Desnaturalización del ADN por someterlo a temperatura elevada, a fin de convertir el ADN bicatenario en ADN monocatenario.

Unión (anillamiento) de dos oligonucleótidos, utilizados como cebadores, al ADN diana; Extensión de la cadena de ADN por adición de nucleótidos a partir de los cebadores utilizando ADN polimerasa como catalizador, en presencia de iones Mg2+.

Los oligonucleótidos (cebadores o primers) consisten normalmente en secuencias relativamente cortas, que son diferentes entre sí y complementarias de los sitios de reconocimiento que flanquean el segmento de ADN diana que debe amplificarse. Las fases de desnaturalización del ADN molde, anillamiento del cebador y extensión del cebador constituyen un "ciclo" del método de amplificación por PCR. En esta práctica se va a amplificar un segmento del gen que participa en el diagnóstico de la Homocistinuria, con el fin de analizar la presencia de una variante concreta mediante un análisis postamplificación. El gen de la metil-tetra-hidro-folato-reductasa (MTHFR) se encuentra localizado en el cromosoma 1. Se conocen al menos 40 mutaciones que alteran la función de la enzima o incluso la inactivan y no permiten que la proteína convierta la homocisteína en metionina. Esto produce un acúmulo de homocisteína en plasma, provocando enfermedades vasculares, como tromboembolismo venoso que puede derivar en embolia pulmonar; y un mayor riesgo a desarrollar defectos del tubo neural, espina bífida o fisura labiopalatina en un feto en desarrollo.

Inventario del material:       

Muestras de ADN Enzima Taq. polimerasa Tampón de actividad 5x Cebadores o primers: Forward y Reverse Microtubo de 0,2 ml Gradilla Guantes

Protocolo de la PCR: 

Mezclar en un tubo Eppendorf de 0,2ml los siguientes reactivos, para un volumen total de 25 microlitros. *Mezclar siempre por pipeteo, no emplear el vortex.

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X1 Tubo ADN Taq polimerasa Tampón 5x (con dNTPs y MgCI2) Primers F Agua destilada estéril Primers R  

5 μl 6 μl 75 μl 7,5 μl 204 μl 7,5 μl

5μl de muestra (ADN) + 20μl de mezcla mix Hemos utilizado dos muestras diferentes de ADN:   

ADN de Gorka ADN genérico ADN blanco (agua) *Gen utilizado→ Metriltetra hidrofosfato reductasa

Efectuar la PCR en el termociclador con el siguiente programa:

Imagen: Termociclador

Desnaturalización inicial Desnaturalización Anillamiento Elongación Elongación final

TEMPERATURA

TIEMPO

95ºC 95ºC 57ºC 72ºC 72ºC 14ºC

5min 15s 15s x 40 ciclos 10s 5min

Comprobar el resultado de la reacción mediante una electroforesis en agarosa y explicar los patrones de bandas obtenidos

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Imagen: Pantalla del termobloque a medida que se va realizando la amplificación.

PREGUNTAS 1. ¿Qué particularidad tiene la ADN polimerasa para que pueda emplearse en este procedimiento?

La ADN polimerasa es termoestable con lo que soporta temperaturas elevadas.

2. ¿Cuál es el factor limitante del proceso?  

Cantidad de cebadores disponibles Actividad de la Taq. polimerasa

3. ¿Qué sucede en cada etapa de un ciclo de temperaturas: desnaturalización, anillamiento, elongación?   

Desnaturalización: en primer lugar, se desnaturaliza el ADN, se separan las dos cadenas de las cuales está constituido.

Anillamiento: el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura.

Elongación: actúa la polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN.

4. ¿Cómo podemos asegurar que estamos amplificando el gen que necesitamos analizar?

Mediante la elongación final, etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 °C durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado.

5. Enumera los motivos por los que no se produciría amplificación por PCR. ¿Qué ocurre si hay una mutación en la secuencia complementaria de unión de los cebadores? 

La PCR es una técnica de gran sensibilidad, es decir, necesita una mínima cantidad de ADN para obtener un gran número de copias. Además, puede ser muy propensa a errores si se lleva a cabo en condiciones inadecuadas de esterilidad, que conduzcan a la

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 

 

amplificación de ADN no correspondiente a la muestra a analizar. Se han de tomar una serie de precauciones para evitar la contaminación con ADN extraño.

Las técnicas de diseño de cebadores son importantes en la mejora de la obtención de productos de PCR y en evitar la formación de productos falsos.

Existe una gran variedad de polimerasas disponibles, pudiendo elegir la que más se ajuste a nuestras necesidades. Por ejemplo, algunas tienen actividades inexistentes en otras o las realizan de forma más eficiente, o funcionan en intervalos de temperatura en los cuales otras se desnaturalizan o pierden funcionalidad.

Los componentes del tampón de reacción deberán ajustarse a las exigencias de nuestras enzimas.

El termociclador, por supuesto, debe ser capaz de reproducir correctamente los ciclos de la PCR

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PRÁCTICA 3: ELECTROFORESIS EN AGAROSA Fundamentos de la electroforesis en agarosa Los ácidos nucleicos tienen carga negativa, por lo que cuando se someten a un campo eléctrico migran hacia el polo positivo. Esta migración (electroforesis) se suele llevar a cabo en el interior de un gel (agarosa o poliacrilamida), de manera que los fragmentos de menor tamaño se desplazan con mayor facilidad por la trama del gel que los mas largos. Tras la electroforesis, aparecen varias bandas que corresponden a los fragmentos de distinto tamaño.

Para visualizar el ADN, el gel se debe teñir con marcadores que tienen una gran afinidad por los ácidos nucleicos y además, bajo la luz ultravioleta, emite fluorescencia cuando se hallan unidos a ADN o ARN; por este motivo, son utilizados para la detección de dichas sustancias en la trama del gel.

Inventario de material:   

   

Muestras de ADN para cargar en el gel.

Agarosa Tampón TBE 10x (Tris-HCl, Ácido Bórico, EDTA pH=8,0). Se debe diluir hasta tener TBE 1x, del que se necesitan 50ml para preparar el gel y 250ml para sumergirlo en la cubeta.

MIDORI Green (agente intercalante) Marcador de peso molecular.

Tampón de carga (5µl para cada muestra) Microtubos de 0,6ml.

Preparación de reactivos: a- Tampón de electroforesis: REACTIVOS TBE Agua (para biología molecular o destilada)

CONCENTRACIÓN FINAL 1x

CANTIDAD 30ml Hasta 300ml

Preparación de 300ml: 

 

Medir la cantidad correspondiente de TBE 1x, en función de la cantidad de tampón de electroforesis necesaria para preparar el gel y llenar la cubeta de electroforesis que se vaya a emplear.

Añadir agua hasta 300ml.

Mezclar.

Almacenamiento:

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

Almacenar a temperatura ambiente.

Protocolo de la electroforesis en agarosa: 

Preparación del gel de agarosa:

REACTIVOS GEL 1% GEL 2% Agarosa 0,5g 1g TBE 1X 50ml 50ml *Ajustar las cantidades de agarosa y TBE 1x en función del tamaño de la bandeja donde se vaya a realizar el gel.

1. Preparar la bandeja con el peine.

Imagen: bandeja y peine para realizar la electroforesis 2. Preparar la agarosa directamente en el vaso de precipitados. Añadir el TBE 1x.

Imagen: La agarosa

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3. Hervir en horno microondas hasta la disolución total de la agarosa, agitando el vaso con la mano de vez en cuando.

4. Mantener en agitación hasta alcanzar los 65ºC aproximadamente (temperatura orientativa).

5. Añadir 5µl de Midori Green a la agarosa líquida. Mover para distribuir uniformemente.

6. Servir en la bandeja con el peine colocado.

7. Dejar polimerizar a temperatura ambiente, hasta que la agarosa deje de estar transparente.

8. Quitar el peine levantándolo verticalmente del gel y evitando moverlo hacia los lados para no romper los pocillos.



Realización de la electroforesis: Para preparar el Tampón de Electroforesis (TBE 1x):

REACTIVOS TBE 10X Agua (para biología molecular o destilada)

CANTIDAD 25ml Hasta 250ml

Para preparar las muestras: Por cada alumno: Muestra de ADN Tampón de carga Agua destilada

Según tipo de muestra 5µl 5µl

Por cada peine: Marcador de peso molecular Tampón de carga Agua destilada

4µl 5µl 11µl

1. Preparar el tampón de electroforesis.

2. Mezclar la muestra de DNA (gDNA, producto de PCR, producto de digestión tras RFLP…) con el tampón de carga y agua para aumentar el volumen de muestra a cargar.

3. Introducir gel y tampón de electroforesis en la cubeta e insertar las muestras de ADN en los pocillos, anotando el orden de coloración en el gel, con precaución de no dañar el pocillo.

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Imagen: Muestra para introducir en los pocillos 4. Conectar la cubeta a la fuente y poner a voltaje constante (100-200V) hasta que el frente de la electroforesis haya recorrido las tres cuartas partes del gel.

Imagen: Electroforesis en proceso 5. Desconectar la fuente.



Visualización de resultado: 1. Una vez detenida la electroforesis, sacar el gel de la cubeta con cuidado para que no se rompa y, sin bandeja, colocarlo sobre un transiluminador UV.

Imagen: Transiluminador 2. Analizar el resultado obtenido mediante la visualización del gel, con precaución de proteger cara y ojos de la luz UV, con una pantalla de metacrilato.

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Resultados:

Imagen: Resultado de la electroforesis en el transiluminador Viendo la imagen del resultado, se puede apreciar como la práctica no ha salido bien puesto que las bandas no deberían verse de ese modo. En especial, la banda de la muestra no se diferencia del resto.

Los motivos por los cuales la práctica no ha salido bien son muy amplios.   

Mala purificación de los materiales.

Contaminación de las muestras.

Fallo en la amplificación del ADN.

Conclusión: Una vez finalizado el portafolios y haber reflexionado, el proceso de aprendizaje es mayor de lo que me imaginaba.  

 

He aprendido a manejarme con más soltura en las técnicas de Biología Molecular.

He aprendido que un dato importante para que salga la electroforesis es controlando el tiempo y no dejándola mucho tiempo para no obtener el resultado como el que hemos obtenido.

Reducir temario para abreviarlo y enfocar los datos más importantes.

A nivel informático he mejorado bastante puesto que he aprendido a utilizar programas como el Excell, el Prezi…

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PREGUNTAS 1. Explicar brevemente en qué se basa la electroforesis de ácidos nucléicos.

La electroforesis en gel es un grupo de técnicas empleadas para separar moléculas basándose en el tamaño, forma o el punto isoeléctrico. Una de las aplicaciones de la electroforesis se realiza con los ácidos nucleicos.

En la electroforesis de ácidos nucleicos la dirección de migración es del electrodo negativo al positivo.

2. ¿Qué función tiene el tampón de carga?

Para cargar las muestras, le va a dar color y densidad. Para que cuando introduzcamos la muestra en los pocillos se sepan dónde están y bajen hacia abajo 3. ¿Por qué aparecen bandas con distinta intensidad?

Por el tamaño de los ácidos nucleicos Intensidad: por la cantidad de ADN unido al fluorocromo 4. ¿Por qué no se hace la electroforesis en agua en vez de en tampón TBE? Poruqe el agua no tiene sales ni iones para que corra la corriente eléctrica que arrastra el ADN del polo – al +.

6. ¿Por qué la electroforesis en agarosa es sumergida?

Para que corra la corriente eléctrica.

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Bibliografía: F. Gómez-Aguado, M. L. (2015). Biología molecular y citogenética. Editorial Altamar SL. Biotecnología-Unam, I. D. (Junio de 2004). SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS. Obtenido de http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/secuenciacion_acidos_nucleicos.pdf https://es.scribd.com/doc/101152584/Tutorial-sobre-pipetas-automaticas

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