epigenetica by Alberto Bolzonetti

Epigenetica: istruzioni per lâ&#x20AC;&#x2122;uso

Epigenetica: istruzioni per l’uso

Introduzione

A,T,C,G: non e’ tutto qui. I meccanismi molecolari dell’epigenetica

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02 Un conflitto tra sessi risolto: l’imprinting genomico

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L’epigenetica nelle generazioni Farmaco(epi)genomica

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Metilazione del DNA Codice istonico Non-coding RNA

Che cos’è l’imprinting genomico? Test molecolare per l’esclusione di UPD

Uomini e topi: epigenetica e ambiente

Epigenetica senza segreti: i metodi di analisi

La metilazione del DNA Le modificazioni della cromatina

Introduzione

Epigenetica: istruzioni per l’uso

“La differenza fra genetica ed epigenetica può essere paragonata a quella che passa tra scrivere e leggere un libro. Una volta scritto, il testo (le informazioni memorizzate nel DNA) sarà identico in tutte le copie; ma ogni lettore potrà provare emozioni personali e interpretare la trama in modo leggermente differente da un altro lettore. In modo simile, l’epigenetica permette interpretazioni diverse di un modello fisso (la sequenza del DNA genomico) che possono esprimersi in letture diverse, a seconda delle condizioni con cui il modello viene interrogato”. 1 Mettendo a confronto la sequenza genomica di individui diversi, osserviamo che esiste una variabilità che, seppur piccola (<1%) giustifica parte delle differenze fenotipiche tra le persone, compresa la suscettibilità alle malattie complesse, le attitudini, la risposta individuale ai farmaci e più in generale all’ambiente. La variabilità in termini di sequenza di basi non è però sufficiente a spiegare tutto. Ad esempio, i gemelli monozigoti, ovvero i “cloni genetici naturali” possono essere suscettibili in modo diverso alle malattie o essere non perfettamente identici nell’aspetto. Studi recenti hanno dimostrato che gran parte della variabilità tra gemelli è legata a differenze del loro assetto epigenetico, ovvero della struttura tridimensionale e delle modificazioni chimiche della cromatina e del DNA (metilazione del DNA): “signatures” che influenzano la trascrizione dei nostri geni, sia qualitativamente che quantitativamente. Allo stesso modo, il profilo di espressione delle cellule è il risultato di specifiche marcature epigenetiche che “danno voce” o “silenziano” i geni: la sequenza genetica non cambia, ciò che varia è l’azione di “lettura” dei geni. Il silenziamento dei geni, così come la trascrizione, è un processo attivo, vitale che, come le pause di un’orchestra, partecipa all’armonia della composizione.

Thomas Jenuwein, Max-Planck-Institut, Freiburg.

Introduzione

Sono le marcature epigenetiche del genoma che guidano e mantengono le differenze tra le cellule di uno stesso organismo pluricellulare. Le cellule dei diversi tessuti di un individuo, pur condividendo il medesimo patrimonio genetico della cellula di origine, lo zigote, hanno morfologia e funzioni molto diverse tra loro: un’ampia variabilità cellulare che è il risultato di complessi processi di differenziamento che conducono a specifiche modulazioni dell’espressione dei geni, silenziando quelli che non fanno parte del repertorio specifico di una determinata cellula e mantenendone attivi quelli specifici. Così, confrontando il profilo d’espressione di un linfocita con quello di un neurone, ci troviamo di fronte a differenze anche estreme riconducibili a differenze epigenetiche. Oltre al differenziamento, l’epigenetica controlla altre funzioni biologiche fisiologiche: la rigenerazione tissutale, il silenziamento di un cromosoma X nelle donne, l’imprinting genomico e l’invecchiamento. Se l’ epigenetica è così importante nei processi vitali delle cellule e per la modulazione armonica dell’espressione genica, ci aspettiamo che modificazioni del corretto pattern epigenetico possano essere causa di dissonanze nell’armonia del repertorio dei loci espressi e avere effetti patologici. Numerose condizioni sia costitutive (malattie epigenetiche) (tab. 1) sia acquisite (come il cancro, le malattie neurodegenerative e autoimmuni) possono essere associate in diversa misura a errori epigenetici. L’errato silenziamento di un gene, come nel caso di un gene oncosoppressore, o l’eccessiva espressione di un oncogene sono eventi patogenetici che possono scatenare o contribuire al processo di cancerogenesi (Tab. 2). La comprensione del tipo e del peso delle epimutazioni nell’eziologia in molte malattie non solo incrementa la conoscenza dei meccanismi patogenetici, ma offre innumerevoli spunti per disegnare strategie terapeutiche innovative, mirate ed estremamente promettenti, per individuare farmaci che possano ristabilire un assetto epigenetico compromesso, o molecole naturali (ad es. micronutrienti) capaci di salvaguardare il nostro patrimonio epigenetico, contribuendo a prevenire patologie degenerative. L’idea si basa sul principio, estremamente incoraggiante che, a differenza delle mutazioni genomiche, le signature epigenetiche sono, per loro natura intrinseca, reversibili. Almeno in linea teorica, questa peculiarità fa immaginare lo sviluppo di farmaci in grado di indurre la reversione del danno epigenetico e quindi della malattia. In altre parole, conoscendo il danno a livello di conformazione della cromatina, è possibile utilizzare molecole in grado di rimodellare la cromatina riportandola al suo stato fisiologico. Un esempio di questo tipo di terapia è l’uso degli inibitori delle acetilasi degli istoni nella cura di tumori ( Vorinostat,

Introduzione

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un inibitore delle deacetilasi degli istoni impiegato nel trattamento dei linfomi a cellule T, rappresenta un esempio di questi nuovi farmaci). Per quanto riguarda la prevenzione, studi recenti hanno dimostrato che alcuni alimenti contengono molecole bioattive capaci di inibire la crescita delle cellule cancerose; alcuni esempi sono i polifenoli del tè verde, la genisteina presente nella soia, il resveratrolo nell’uva e nel vino e i sulforani, di cui sono ricche le crucifere. Studi in vitro su cellule tumorali hanno dimostrato che queste molecole sono in grado di ristabilire il corretto pattern epigenetico. L’epigenetica promette quindi di spiegare l’azione preventiva e protettiva della dieta vegetariana contro il cancro. Che sostanze presenti nell’alimentazione possano avere un effetto sul fenotipo è evidente dall’osservazione sull’effetto sorprendente che la pappa reale ha sulle larve delle api; solo le larve alimentate con pappa reale diventeranno api regine, le altre, operaie. Le prime sono fertili, di grosse dimensioni e vivono a lungo, le operaie sono sterili e hanno una vita significativamente più breve delle api regine. Studi recenti hanno dimostrato che la pappa reale, che è secreta dalle ghiandole mandibolari delle api operaie, contiene una molecola capace di rimodellare la cromatina. Si tratta della molecola 10HDA, un inibitore della deacetilasi degli istoni (HDACi). E’ stato recentemente dimostrato che 10HDA è in grado di riattivare nei mammiferi l’espressione di geni epigeneticamente silenziati. Api regine e operaie sono geneticamente uguali, eppure fenotipicamente ben distinguibili e la differenza è determinata da ciò di cui si sono nutrite all’inizio della loro esistenza. Va sottolineato, infine, che le variazioni epigenetiche non sono solo alla base di malattie, ma cooperano, insieme alle variazioni di sequenza del DNA, a definire il patrimonio genetico di un individuo e, quindi, le risposte individuali a farmaci (farmaco-epigenetica), nutrienti (nutrigenomica), ambiente (epigenetica ambientale) e suscettibilità alle malattie complesse. A questo proposito, l’Editore dell’autorevole rivista Nature Review Genetics (vol 12, August 2011) scrive: “Applying the principles of genome-wide association studies to variation in DNA methylation offers the exciting prospect of filling in some of the blanks in our understanding of common disease. This new direction highlights the fascinating recent transition from epigenetic phenomena being largely viewed as isolated curiosities to being seen as an integral part of complex traits.”

Introduzione

Tabella 1

Alcune patologie

congenite che comportano errori epigenetici

Tabella 2 Esempi nei tumori di geni silenziati per ipermetilazione

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Epigenetica è l’informazione contenuta nella cromatina determinata da eventi che non comportano cambiamenti nel codice del DNA, bensì variazioni chimiche del DNA e degli istoni. Tali modificazioni chimiche hanno lo scopo di modulare l’espressione genica; le più importanti sono la metilazione del DNA, la metilazione, l’acetilazione e ubiquitinizzazione degli istoni. Durante la divisione cellulare le marcature epigenetiche sono mantenute e quindi sono trasmesse alle cellule figlie. L’espressione genica può essere inoltre modulata, principalmente a livello post-trascrizionale, dall’azione di piccole molecole di RNA non tradotto, i miRNA. Nel loro complesso, le marcature epigenetiche determinano l’accessibilità fisica del genoma da parte di complessi molecolari deputati alla trascrizione genica e quindi regolano il grado di funzionamento dei geni.

La metilazione del Dna Il DNA dei mammiferi può essere metilato dagli enzimi DNMT (DNA MetilTransferasi) a livello della Citosina dei dinucleotidi CpG producendo la 5‐metil Citosina, (5‐mCyt), senza che questo evento modifichi l’appaiamento con la Guanina durante la replicazione del DNA.

Fig. 1.1 Citosina e 5-metil Citosina

Il di nucleotide CpG è simmetrico rispetto ai due filamenti del DNA, ed è solitamente metilato su entrambi i fronti della doppia elica. Dinucleotidi CpG si trovano spesso all’interno di regioni di DNA altamente ripetuto, che sono definite generalmente CpG repeats. Queste sono ulteriormente classificabili in base alla localizzazione e ai livelli di metilazione. In prossimità o all’interno dei promotori di molti geni si possono osservare regioni ricche in ripetizioni CG, definite “isole CpG” (CpG islands). Si stima che il 40-70% dei geni abbia un promotore ricco in isole CpG. Queste isole arricchite in CpG rispetto al resto del genoma si sono originate perché, nei dinucleotidi CpG la citosina metilata è chimicamente instabile e può subire eaminazione spontanea, con conseguente modificazione in Timina. Durante l’evoluzione si è verificata una selezione negativa con conseguente scomparsa progressiva delle coppie CpG, ad eccezione delle regioni dove questo dinucleotite è generalmente demetilato, cioè a livello dei promotori di geni sempre espressi: principalmente i geni Housekeeping ma anche alcuni geni tessuto‐specifici. Le isole CpG sono generalmente demetilate, in particolar modo i livelli di metilazione si attestano intorno al 10- 15%, tuttavia, un incremento della metilazione, gioca un ruolo importante nel controllo della trascrizione genica attraverso vari meccanismi: - la presenza di gruppi metile funge, in particolari regioni del genoma, da sito di legame per proteine MBDs (methyl binding proteins). Il legame di queste proteine alla sequenza bersaglio è in grado di indurre ulteriori modificazioni della fibra cromatinica, favorendone la condensazione; - i gruppi metilici inducono il legame con altre proteine che riconoscono il DNA metilato. Questo può impedire il legame dei fattori di trascrizione con i promotori dei geni. La metilazione delle isole CpG, quindi, è coinvolta nel silenziamento genico, infatti i livelli di metilazione gene‐specifici correlano inversamente con l’attività trascrizionale. Accanto alle isole CpG troviamo altri tipi di CpG repeats che comprendono un insieme estremamente eterogeneo di sequenze, tra queste si possono distinguere gli elementi trasponibili come le sequenze LINE e SINE e il DNA satellite caratteristico delle regioni cromosomiche telomeriche e centromeriche. Contrariamente alle precedenti, queste regioni ricche in CG si trovano in uno stato di estesa metilazione ed i livelli possono raggiungere il 40-60%. La metilazione di queste regioni gioca un ruolo importante a vari livelli, permettendo il mantenimento dello stato eterocromatico di numerose regioni del genoma e favorendo la stabilità del genoma bloccando la capacità di trasposizione dei numerosi elementi trasponibili. Il meccanismo che porta alla metilazione del DNA è molto semplice, il grup-

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po metile viene legato alla citosina in posizione 5’ ad opera di enzimi noti come DNA metiltransferasi. Le metiltranferasi sono una famiglia di enzimi che intervengono in ambiti differenti: - DNMT1 ha il compito di mantenere lo stato di metilazione del DNA. Ad ogni ciclo di replicazione del DNA l’enzima è in grado di riconoscere l’elica neosintetizzata e di copiare più o meno fedelmente lo schema di metilazione presente sull’elica stampo; - DNMT3a e DNMT3b hanno una attività metil-transferasica de novo che è importante nei primi stadi di sviluppo embrionale, quando ad esempio viene ristabilito il pattern di metilazione o nelle cellule germinali per determinare il corretto livello di metilazione, spesso sesso-specifico. - DNMT3L non possiede attività enzimatica, ma può associarsi alle altre DNMT incrementandone l’affinità per il DNA nel processo di metilazione de novo. Il ruolo della metilazione del DNA nella regolazione genica è noto da tempo e non solo negli animali. Esperimenti chiave che hanno svelato il suo ruolo sono stati eseguiti da botanici che lavorando per modificare geneticamente le piante di petunia ottennero fiori blu intenso o screziati (Fig. 1.2). L’ “inconsapevole” scoperta, così come fu per Fleming con gli antibiotici, aprì nuovi orizzonti.

Fig. 12

La screziatura

delle petunie e il colore bianco sono determinati dalla metilazione del promotore del gene della calcone sintasi.

The colour comes from the blue Nel 1990 due diversi gruppi di ricerca che studiavano la selezione delle piante pubblicano dati sorprendenti ottenuti da esperimenti condotti per selezionare piante di petunia dai fiori blu intenso. I ricercatori, introdussero nelle cellule di petunia rosa alcune copie aggiuntive del gene che codifica per la chalcone synthase, un enzima chiave per la pigmentazione di questi fiori che generalmente sono rosa o viola pallido. Inspiegabilmente, molte piantine transgeniche non avevano il colore atteso, ma fiori dai petali parzialmente o completamente bianchi. Piuttosto che aumentare il color viola del fiore della petunia, l’aumento del numero di copie del gene responsabile della pigmen-

tazione provocava una splendida varietà di fiori, alcuni variegati di viola su sfondo bianco, altri completamente bianchi. Misurando la quantità di mRNA del gene manipolato, si è osservato che i fiori bianchi avevano un livello molto basso, perché le copie in più del gene determinavano lo spegnimento del gene endogeno attraverso la metilazione delle regioni regolatrici. Si è dimostrato che questo fenomeno,detto della co-soppressione del gene endogeno è dovuto ad un effetto di RNA interference. Nella maggior parte degli eucarioti la metilazione del DNA è il processo epigenetico meglio studiato. La molecola donatrice del gruppo metile è la di S-adenosylmethionine (SAM), molecola sintetizzata dalla metionina adenosiltransferasi a partire da adenosina trifosfato (ATP) e metionina. I precursori della SAM devono essere assunti attraverso l’alimentazione (Fig.1.3).

Figura 1.3 Esemplificazione dei processi metabolici per la metilazione del DNA che evidenzia la correlazione tra alimentazione ed epigenetica.

L’aspetto peculiare dei difetti epigenetici è che un metilazione inadeguata può essere ripristinata da molecole anche presenti in natura e che possiamo assumere con l’alimentazione; un esempio tra tutti è l’effetto sorprendente di una sostanza che si trova nel tè verde, la epigallocatechina-gallato (EGCG), capace di riattivare (demetilare) nelle cellule tumorali i geni oncosoppressori RAR-alfa, p16, MGMT e hMLH1. Alterazioni nella metilazione delle citosine possono essere causa di malattia, perché alterano i livelli di espressione. Pensiamo, ad esempio, ai geni

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oncosoppressori: il loro silenziamento ne impedisce la funzione fisiologica che è quella di protezione contro la crescita incontrollata o di preservare le cellule dall’accumularsi di errori del DNA. Difetti congeniti della metilazione sono anche causa di malattie epigenetiche presenti già alla nascita o talvolta diagnosticabili in epoca prenatale, come i sindromi Beckwith Wiedemann (BWS), caratterizzata da iper-accrescimento corporeo e degli organi, difetti di chiusura della parete addominale e suscettibilità allo sviluppo di tumori durante l’infanzia. Il difetto patogenetico principale riguarda un’anomala metilazione nella regione cromosomica 11p15, a livello di regioni che regolano l’espressione di geni regolati dall’imprinting genomico. Squilibri della metilazione determinano uno alterato dosaggio tra geni che inibiscono la crescita (es. H19) e geni che la stimolano (es.: IGF2).

Codice istonico Gli istoni sono proteine basiche ricche in lisina e arginina, le cui cariche positive sono in grado di neutralizzare le cariche negative del DNA, consentendo il compattamento della cromatina. Ogni tratto di DNA contenente 146 paia di basi è avvolto su un ottamero proteico, formato da due molecole di ciascuno dei quattro istoni H2A, H2B, H3 e H4. Questa struttura di DNA e istoni costituisce il nucleosoma, unità elementare della cromatina (Fig. 1.4). Come concetto generale, il rimodellamento della cromatina consente di neutralizzare le cariche positive delle code istoniche, l’effetto che ne consegue è la riduzione dell’attrazione tra istoni e cariche negative del DNA che porta ad un’apertura della struttura della cromatina che diventa accessibile alla macchina trascrizionale.