Montaje de la PCR Materiales reactivos Y cรกlculos de concentraciones
Tubos para PCR Tubo de PCR 0,2 ml
Tira de 8 tubos
Placa de PCR Tubos eppendorff
REACTIVO 1 2 3 4 5 6 7 8
Agua estĂŠril dd (desionizada y destilada) Buffer 10 X dNTPs (Bases nitrogenadas A T G C) Mg Cl2 (Cloruro de magnesio) Primer Forward CTTGACCATTAGAGGACTACGACCTA Primer Reverse ATGCTCATGCAGTACGTACGATAGACG ADN BSA Bovine serum albumin TAQ Comercial o Casera
1
2
3
Locus (ubicación específica de una secuencia de ADN dentro del genoma) : Marcador molecular compuesto por: • 2 primers (una pareja) forward y reverse • La secuencia flanqueada (encerrada entre los primers) Posibilidades de amplificación de secuencias en un programa de PCR 1. Al genoma (ADN) de un SOLO individuo le puedo amplificar una SOLA secuencia (el mismo marcador: o sea el mismo locus). 2. Al genoma (ADN) de varios individuos le puedo amplificar la misma secuencia 3. Al genoma (ADN) de varios individuos le puedo amplificar diferentes secuencias (el mismo marcador: o sea el mismo locus). Un solo individuo X una secuencia (pareja de primer)
POSIBILIDADES PARA LA REACCIÓN
Un solo individuo X una secuencia
COLUMNAS Eg 25 (F y R)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
A
5
B
C
FI D LA E S
F
G
H
POSIBILIDADES PARA LA REACCIÓN
Varios individuos X una secuencia (pareja de primer) o sea un locus
COLUMNAS Eg 25 (F y R)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
5
14
17
45
69
74
85
96 102 103 122 137
B
C
FI D LA E S
F
G
H
POSIBILIDADES PARA LA REACCIÓN Varios individuos X varias secuencias (diferentes parejas de primers) COLUMNAS
1
2
3
4
5
6
7
8
Eg 25 (F y R)
A
5
14
17
45
69
74
85
96 102 103 122 137
Eg 37 (F y R)
B
5
14
17
45
69
74
85
96 102 103 122 137
Eg 56 (F y R)
C
5
14
17
45
69
74
85
96 102 103 122 137
D FIL AS Es 21 (F y R) E
5
14
17
45
69
74
85
96 102 103 122 137
5
14
17
45
69
74
85
96 102 103 122 137
Et 9 (F y R)
F
5
14
17
45
69
74
85
96 102 103 122 137
Es 33 (F y R)
G
5
14
17
45
69
74
85
96 102 103 122 137
Eu 18 (F y R)
H
5
14
17
45
69
74
85
96 102 103 122 137
Eg 99 (F y R)
9
10
11
12
Cómo se prepara una reacción de PCR La PCR se puede diseñar en un buffer de 15 μL (Invitro gen Technologies, Karlsruhe, Germany), 0.2 mM dNTPs, 2.7 mM MgCl2, 0.7 μM de cada primer, 50 ng de DNA molde y una unidad de Taq polimerasa (Invitrogen). Reactivo
1X
105 X
2,0 μL
210 μL
dNTPs
2,0
210
Mg Cl2
0,6
63
Pirmer forward
1,0
105
Pirmer reverse
1,0
105
Agua
7,7
808,5
Taq
1,0
105
DNA (50 ng/μL)
1,0
-
Buffer 10 x
14,69 μL
Cálculos para reacciones de PCR Ci.Vi = Cf.Vf 1. Prepare una solución de 5 litros con MgCl2 a una concentración de 2.5 M. 2. Obtener 10 ml de NaCl a una concentración de 5 M a partir de una sustancia que está a una concentración 10 M.
Cálculos para reacciones de PCR Ci.Vi = Cf.Vf 1. Prepare una solución de 100 µl de ADN a una concentración de 30 ng/µl a partir de una solución que está a 480 ng/µl. 2. Cuánto volumen se debe tomar de una sustancia que esta a una concentración de 236 g/ml para obtener 520 µl a una concentración 100 ng/ml.
Componentes de la reacci贸n de PCR