Fermentación en estado sólido de la caña de azúcar con adición

Fermentación en estado sólido de la caña de azúcar con adición de Pediococcus acidilactici, Lindner

Alejandro Ley de Coss227*, Jaime J. Martínez Tinajero1, Saúl Posada Cruz1, René Pinto Ruíz2, Francisco Guevara Hernández2, Cándido Enrique Guerra Medina3, Federico Villarreal Guerrero4 1Universidad

Autónoma de Chiapas (UNACH), Campus IV, Facultad de Ciencias Agrícolas, Ganadería Tropical Sustentable, entronque carretera costera S/N, Huehuetán, Chiapas, México.

CP. 36670. Tel: 01 (964) 62 70128. aleycoss@gmail.com 2UNACH, Campus V, Facultad de Ciencias Agronómicas, Agroforesteria Pecuaria, carretera Villaflores-Ocozocoautla Km 7.5 AP. 63 Villaflores, Chiapas, México. C.P. 30470.

3 Centro Universitario de la Costa Sur, Universidad de Guadalajara. Independencia Nacional 151, Autlán de Navarro, Jalisco México. C. P. 48900 4Facultad de Zootecnia y Ecología, Universidad Autónoma de Chihuahua, periférico Fco. R. Almada km 1. Chihuahua, Chih. C. P. 31453. *Autor de correspondencia: aleycoss@gmail.com

Resumen En las regiones tropicales, la escasez de forrajes en la época de sequía y de inundaciones, hacen necesario la conservación de alimento para los animales. En México la caña de azúcar es un cultivo importante que se ha utilizado para la alimentación de rumiantes. El objetivo de esta investigación fue evaluar la fermentación de la caña de azúcar en estado sólido (FES) sobre la calidad nutritiva.

El estudio se realizó en la Facultad de Ciencias Agrícolas en Huehuetán Chiapas, México. Se evaluaron cuatro tratamientos: T1 = caña integral molida + 2% urea (CIM-U) + Pediococcus acidilactici + O2; T2 = CIM-U + P. acidilactici + CO2; T3 = CIM-U + O2; T4 = CIM-U + CO2. Se utilizó un diseño factorial 2 x 2 x 3, donde las variables microbiológicas se analizaron mediante suma de rangos de Wilcoxon; para las variables de proteína cruda (PC), proteína verdadera (PV) y pH se utilizó el modelo lineal general (GLM) y la comparación de medias con el procedimiento de

Tukey. El contenido de PC y PV en el producto final aumentó cuando se adicionó CO2 (T2 y T4); además el pH menor se tuvo en T4 (4.17). La concentración de bacterias totales fue menor en T2 a 72 horas de incubación (P<0.05); bacterias acido lácticas fue mayor en T1 (P<0.05) y bacterias celulolíticas fue mayor en T1 y T3 (P<0.05). La adición de P. acidilactici no aumento el contenido de PC y PV.

Palabras clave: Conservación de alimentos, ensilado de caña, aditivos microbianos, nutrición de rumiantes.

Introducción En México, el sector pecuario demanda aproximadamente 20 millones de toneladas de granos forrajeros; de estos, 50% corresponden a maíz amarillo y 40% a sorgo; mismos que son importados en más de 60%. El incremento en el precio de los granos repercute en la industria ganadera debido a la utilización de éstos en la alimentación de los animales, siendo los sistemas de producción intensivo y semiintensivo los más afectados. En el 2006, el precio internacional del maíz era de 87.6 USD por tonelada; para enero del 2008 pasó a 194.32 USD, siendo el incremento cercano al 122%, el Banco Mundial, estima que los precios se mantendrán a la alza hasta el 2015 (FAO, 2007).

La industria azucarera en México atraviesa una crisis de comercialización debido a la disminución del precio del producto en el mercado internacional (Peláez et al., 2008), sin embargo, el valor nutritivo de la caña de azúcar caracterizada por el contenido de carbohidratos solubles (sacarosa) y estructurales (celulosa, hemicelulosa y lignina), componentes principales de la fibra detergente neutro (FDN), además de su rendimiento por hectárea, hace que su elevado contenido de humedad no sea una limitante para ser incluido en la alimentación de rumiantes (Rangel et al., 2015).

El ensilado de caña o “Saccharina” posee deficiencias nutricionales, corregibles mediante la adición de fuentes de nitrógeno no proteico (urea, biuret), subproductos agroindustriales, aditivos microbianos o mezclas minerales (Monroy et al., 2006; Aranda et al., 2012a), por lo que, se ha investigado el efecto de los procesos fermentativos en mejoramiento del contenido proteico, debido a que se ha reportado que la fermentación bajo condiciones aerobias mejora el valor nutritivo de los productos agrícolas representando nuevas opciones para la alimentación animal (Aranda et al., 2012b).

Estudios recientes han demostrado que los procesos de fermentación en estado sólido (FES) mejoran el perfil proteico, además de la relación entre proteína cruda (PC) y proteína verdadera (PV). Peláez et al. (2008; 2011) reportaron valores de PC superiores al testigo tras someter a la caña a dos procesos fermentativos consecutivos en presencia de un hongo lignolítico, por ello la FES con bajo contenido de humedad (menor del 12%) y bajo un estado no aséptico y natural ha sido útil para producir diferentes productos como: enzimas, combustibles y alimentos para animales (GumbinaSaid, 1996; Robinson et al., 2002). En las regiones subtropical y tropical húmeda, la escasez de forrajes en las épocas de sequía y de inundaciones, hacen necesario la conservación de alimento que garantice el aporte energético y proteico para los rumiantes (Monroy et al., 2006; Aranda et al., 2012a). El objetivo de este estudio fue evaluar la FES más urea y un cultivo microbiano en la calidad y en la cantidad de la proteína cruda y verdadera, cambios en la microbiología y el pH en el producto final de la caña de azúcar.

Materiales y métodos Ubicación. El material vegetal se obtuvo en el ejido Plan de Ayala, Huehuetán, Chiapas, México, ubicado a 15° 01’ 18,09” N y 92°22´10,22” O a una altura de 127 msnm. Las pruebas in vitro de FES y microbiológicas se llevaron a cabo en el Laboratorio de Ciencia Animal de la Facultad de Ciencias Agrícolas, Campus IV; mientras que la determinación de PC y PV fue procesado en el Laboratorio de Bromatología en la Facultad de Ciencias Químicas ambas del Campus IV de la

Universidad Autónoma de Chiapas, Chiapas, México, durante el periodo comprendió entre el 25 de mayo al 31 de julio de 2015.

Procesado de material vegetal y tratamientos. La caña de azúcar integral (tallos, hojas y cogollos) de 300 d (días) de desarrollo (por el mayor contenido de azúcares) se procesó en fresco en un molino (Eléctrico ED-5), con criba de 2.54 cm, se obtuvo una partícula de 0.5 cm de largo por 0.1 cm de ancho, en promedio. Para el ensilaje se utilizó el modelo de micro silos de plástico negro a los que se incorporó 5 kg de caña de azúcar integral molida (CAIM) más 2% de urea como fuente de nitrógeno no proteico (NNP), con o sin inocular el microorganismo (Pediococcus acidilactici, Lindner) con flujo de oxigeno (O2; 95% de pureza,) o bióxido de carbono (CO2, 95% de pureza), el material tuvo un espesor de 20 cm sin estar compactados. Los tratamientos (T) evaluados fueron: T1 = caña integral molida + 2% urea (CIM-U) + Pediococcus acidilactici + O2; T2 = CIM-U + P. acidilactici + CO2; T3 = CIM-U + O2; T4 = CIM-U + CO2.

Conteo de carga bacteriana. La concentración bacteriana fue estimada usando el método del número más probable (NMP) según la técnica descrita por Ley de Coss et al. (2013), con tres repeticiones por tubo de cultivo (13 x 100 mm) con 4.5 mL de medio de cultivo para bacterias totales (BT) con: 0.06 g de D-(+)-glucosa + 0.06 g D-celobiosa + 0.06 g de almidón; 30 mL de FR clarificado; 5.0 mL de solución mineral I (6 g K2HPO4 en 1000 mL de H2O); 5.0 mL de solución mineral II [6 g KH2PO4 + 6 g (NH4)2SO4 + 12 g NaCl + 2.45 g MgSO4 + 1.6 g CaCl2·H2O en 1000 mL de H2O]; 2.0 mL de solución al 8% de Na2CO3; 2 mL de solución sulfido-cisteína (2.5 g L–cisteína en 15 mL de 2N NaOH + 2.5 g Na2S-9H2O aforado en 100 mL de H2O); 0.2 g de tripticasa peptona y 0.1 mL de solución al 0.1 % de resazurina.

Mientras que para las bacterias celulíticas (BC) se utilizó el mismo medio, donde se sustituyó la fuente de carbohidratos por 0.5 g de celulosa cristalina como única fuente de energía.

La concentración de bacterias ácido lácticas (BAL) se determinó en medio de cultivo MRS de acuerdo con De Man et al. (1960). El pH se ajustó a 6.4 ± 0.02 con HCl 0.1

N y se midió con un potenciómetro portátil Orion A250. Los medios se esterilizaron durante 15 min a 121 °C y 15 psi, y se depositaron 4.5 mL de medio en tubos de cultivo; los medios estériles se inocularon con 0.5 mL de un extracto obtenido de la mezcla de 5 g de ensilado de los tratamientos (en cada periodo de fermentación) + 5 mL de agua estéril. Después de agregar el inóculo, los tubos de cultivo se mantuvieron en una incubadora (Felisa FE-373) durante 24 h a 38 ± 0.02 ºC para BT y BAL y diez días para BC, los medios positivos fueron aquellos que presentaron turbidez (Harrigan y Mc Cance, 1979).

Análisis de proteína cruda y proteína verdadera. Se tomaron 10 g de muestras que fueron secadas a 60°C en una estufa de aire forzado por 24 h, para determinar el contenido de PC, NNP y PV. Posteriormente las muestras fueron procesadas por digestión según el método micro-Kjeldahl, para conocer la proteína cruda se multiplicó el contenido de

nitrógeno total x 6.25 (Lynch y Barbano, 1999), el

nitrógeno no proteico (NNP) de acuerdo con McCullough (1967), y se calculó la proteína verdadera por diferencia (NT-NNP) x 6.25 según AOAC (2007).

Análisis estadístico. Se utilizó un diseño completamente al azar con arreglo factorial 2 x 2 x 3; dos niveles para indicar fermentación en presencia de O 2 o de CO2, respectivamente, dos niveles para adición o no de P. acidilactici, con tres niveles por los tiempos de FES, con tres repeticiones por tratamiento. Los datos del conteo bacteriano fueron analizados mediante la prueba de Kruskal-Wallis con datos de rangos independientes (Wilcoxon), la PC, la PV y el pH fueron analizadas mediante un procedimiento multifactorial con el modelo lineal general (GLM) utilizando el paquete estadístico SAS, bajo el método de comparación múltiple de Tukey (P ≤ 0.05; SAS, 2009).

Resultados y discusión

Con respecto al pH hubo reducción en los tratamientos con anaerobiosis, este efecto fue independientemente de adición de P. acidilactici al medio; mientras que adición de O2 mantuvo hasta el final de la incubación pH arriba de 6.75. En la cantidad de PC y PV del producto final (ensilado de caña de azúcar), la FES y la adición de urea presento un efecto lineal y cuadrático; sin embargo, únicamente en la PV las condiciones de anaerobiosis permitieron un mayor (P≤0.05) contenido de este nutriente, resultados similares, pero en condiciones aerobias, fueron reportados por Monroy et al. (2006) donde evaluaron la adición de melaza y pulido de arroz sobre la cantidad de PC y PV en el ensilado de caña de azúcar.

Aunque en todos los tratamientos mejoro la cantidad de PC y PV, con respeto a valor reportado para la caña de azúcar (2.47% de PC) hubo mejoras de estos nutrientes a las 72 h de incubación en los T2 (CIM-U con P. acidilactici y CO2) y T4 (CIM-U + CO2). Sin embargo en todos los tratamientos posterior a las 48 h se redujo el contenido de PC; pero no así de la PV, la cual aumento casi en todos los tratamientos, con excepción de T1 (CIM-U con P. acidilactici y O2) sin tener diferencia con T3 (CIM-U y O2) que indica que el flujo de oxígeno en la FES afecto la síntesis de PV en estos tratamientos. Lo que indica la posible presencia de bacterias anaerobias estrictas que sintetizan mayor proporción PV a partir de la PC o NNP presente en el sustrato fermentable.

Los

resultados

encontrados

en

este

estudio

indican

la

existencia

de

microorganismos en la caña de azúcar que sintetizan proteína microbiana a partir del NNP adicionado (urea), con lo que mejora el contenido de PC de la caña sin procesar (Rangel et al., 2015). La adición de P. acidilactici aumentó (P<0,05) el contenido de PV en los tratamientos bajo condiciones anaerobias (T2 y T4), se han reportado diferentes perfiles metabólicos para P. acidilactici (Cobos et al., 2011), pero Barros et al., (2001) reportaron que esta bacteria tienen una fuerte actividad productora de bacteriocinas de naturaleza proteica, por lo que se esperaba cantidad similar de PV en los tratamientos inoculados con esta bacteria, incluso por ser una bacteria anaerobia facultativa (Hardie, 1986;), incluyendo que es una bacteria resistente a condiciones ácidas (Abbasiliasi et al., 2012).

Cuadro 1. Valores de pH, contenido de proteína cruda y proteína verdadera en la caña de azúcar fermentada en estado sólido adicionada con urea y un probiótico, bajo condiciones contraladas de O2 y CO2, Huehuetán, Chiapas, México. 2015.

Tratamientos

Tiempo de fermentación (h) 24

48

72

pH T1

7.32ab

8.60a

8.46a

T2

6.70b

6.10b

5.48c

T3

8.51a

8.58a

6.75b

T4

4.91c

4.20c

4.17d

E.E.M

0.56

0.58

0.25

Proteína cruda (%) T1

13.15b

24.16a

13.10b

T2

14.43b

19.11b

15.75b

T3

22.82a

14.45b

14.23b

T4

21.51a

26.31a

22.75a

E.E.M

1.69

2.25

1.58

Proteína verdadera (%) T1

11.89a

15.47a

12.52b

T2

12.75a

16.61a

17.24a

T3

15.42a

11.05b

12.78b

T4

14.54a

18.12a

18.12a

E.E.M

1.84

2.2

2.4

a, b, c, d: Valores

dentro de una columna que no comparten el mismo superíndice son

diferentes (p ≤ 0.05); E.E.M: error estándar de la media; T1 = caña integral molida + 2% urea (CIM-U) + Pediococcus acidilactici + O2; T2 = CIM-U + P. acidilactici + CO2; T3 = CIM-U + O2; T4 = CIM-U + CO2.

Diversos trabajos de investigación concluyen que es indispensable una síntesis microbiana de PV por arriba del 49.5% (mejorar la relación PV: PC), se ha reportado que la adición de cultivo microbiano mixto (levaduras y bacterias) ayuda a alcanzar el nivel de PC en el ensilado de caña (Valdivie et al., 1997; Cárdenas et al., 2008).

Se han reportado valores de entre 13.72 a 15.18% de PC y de 8.89 a 11.61% de PV cuando a la caña de azúcar se le adicionó melaza y pulido de arroz; y valores de 14.57% de PC y 9.56% de PV a 70 d de conservación; el mayor contenido de proteína se obtuvieron a los 20 d con 15.34 y 10.94% de PC y PV, respectivamente (Monroy et al., 2006), valores similares a los encontrados en este trabajo de investigación.

El contenido de PV fue mayor (P≤0.05) a la hora 72 en los tratamientos con flujo de CO2 (T2 y T4), independiente del probiótico. Estos resultados podrían indicar que aumentar los días (> 3 d) de FES de la caña de azúcar permite mayor síntesis microbiana de PV, con la pérdida de PC, pero con el aumento de ácido láctico, como ocurrió en esta investigación, por lo que pH bajos permiten aumentar la retención de PC y una mayor fermentación de los azucares permite la formación de una mayor cantidad de PV (Ramos, 2006).

En T1 el valor de pH fue mayor de 7.0 en todas las horas y en T3 en la hora 24 y 48. Esto se atribuye al menor desarrollo de bacterias acido lácticas y a un proceso de volatilización del nitrógeno no proteico (NNP) durante el proceso de fermentación, lo que se correlaciona directamente con la menor cantidad de PV detectada en estos tratamientos hasta las 72 h de incubación (Aranda et al., 2012a).

Estos mismos autores evaluaron distintos parámetros bromatológicos de FES de caña de azúcar adicionado con urea, sulfato de amonio, aditivos a base de levaduras, lactobacilos con sus metabolitos, y zeolita mexicana, donde se reporta mayor cantidad de proteína desde las 24 h comparado con aquellos tratamientos que no fueron fermentados, con una reducción en el contenido de PC en las horas siguientes (Aranda et al., 2012a), efecto similar a lo que ocurrió en esta investigación.

Variables microbiológicas. En el Cuadro 2 se muestra que al inicio hubo diferencia (P≤0.05) en la concentración de BAL; por la inclusión del probiótico en los tratamientos T1 (CIM-U con P. acidilactici y O2) y T2 (CIM-U con P. acidilactici y CO2), este grupo de bacterias creció en todos los tratamientos hasta una cantidad similar en un periodo de 48 h; lo que indica la presencia de cepas nativas en la caña de azúcar; sin embargo, al finalizar el tiempo de fermentación (72 h) únicamente el tratamiento T1 tuvo la mayor cantidad de BAL (P≤0.05) que el resto de tratamientos, que implica que la cepa de P. acidilactici es una bacteria anaerobia facultativa, similar a lo reportado por Cobos et al. (2011) y Ley de Coss et al. (2013). Las cepas de BAL nativas y la adicionada mediante inóculo a la hora 48 tuvieron una población similar (T1 y T2), con una concentración de 106 células g-1 de MS, por lo anterior, la FES es un medio de cultivo adecuado para mejorar la calidad nutritiva de la caña de azúcar mediante el desarrollo de bacterias productoras de ácido láctico que permite conservar el ensilado de caña de azúcar para la época de estiaje.

Cuadro 2. Concentración de bacterias ácido lácticas, bacterias celulolíticas y bacterias totales en el producto de la caña de azúcar fermentada en estado sólido adicionada con urea con y sin probiótico, Huehuetán, Chiapas, México. 2015.

Tratamientos

Tiempo de fermentación (h) 24

48

72

Bacterias ácido lácticas (x106) T1

110a

150a

350a

T2

200a

110a

70b

T3

75b

150a

95b

T4

30b

600a

70b

E.E.M

84

160

33

Bacterias celulolíticas (x106) T1

150000a

350a

140a

T2

350000a

700a

2b

T3

140000a

150a

280a

T4

390000a

200a

28b

E.E.M

120000

340

60

Bacterias totales (x109)

a b:

T1

312a

74b

2100a

T2

937a

146a

733b

T3

579a

333a

1000a

T4

491a

237a

2100a

E.E.M

198

88

444

Valores dentro de una columna que no comparten el mismo superíndice son

diferentes (P≤0.05); E.E.M: error estándar de la media; T1 = caña integral molida + 2% urea (CIM-U) + Pediococcus acidilactici + O2; T2 = CIM-U + P. acidilactici + CO2; T3 = CIM-U + O2; T4 = CIM-U + CO2.

Por otra parte, se ha recomendado que el oxígeno en la FES permite un mejor desarrollo de los microorganismos, y con ello mayor producción de metabolitos, además la reducción de la humedad permite el buen manejo de los productos, menor gasto energético y hace eficiente la producción de alimentos para rumiantes (Robinson et al., 2002).

Con relación a la concentración de BC no hubo diferencia (P>0.05) a las 24 y 48 h entre los tratamientos, sin embargo, la concentración fue menor (P≤0.05) en los tratamientos con flujo de CO2 contra los tratamientos con flujo de O2 (Cuadro 2).

Por dichas concentraciones, indica que independientemente de P. acidilactici, las BC tuvieron un crecimiento en la FES de la caña de azúcar más los aditivos y condiciones establecidas. Respecto a la concentración de BT a las 24 h en todos los tratamientos, fue similar (P>0.05), únicamente en el tratamiento T2 (CIM-U con P. acidilactici y CO2) hubo reducción al final de la prueba, sin embargo, la menor concentración estuvo en el orden de las 7.33 x1011 células g-1 de MS, mientras que la mayor fue de 2.10 x1012 células g-1 de MS lo que indica que los microorganismos allí presentes tienen un excelente crecimiento en el proceso de FES establecidas en esta investigación, como fue reportada por Robinson et al., (2001).

Agradecimiento Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por el apoyo a este trabajo de investigación dentro del proyecto “Estimación e impacto ambiental de la captura de carbono en plantaciones de palma de aceite (Elaeis guineensis, Jacq) en el estado de Chiapas” dentro de los Proyectos de Desarrollo Científico para Atender

Problemas

Nacionales

(PDCPN2013-01),

fondo:

I0002,

solicitud

autorizada: 216526.

Literatura citada Abbasiliasi, S., J. Shun Tan, T. Tengku, R. Nagasundara, F. Vakhshiteh, S. Mustafa, T. Chuan, R. Abdul and A. Ariff.

(2012). Isolation of Pediococcus

acidilactici Kp10 with ability to secrete bacteriocin-like inhibitory substance from milk products for applications in food industry. BMC Microbiology. 12:260.

AOAC (Association of Agricultural Chemists). (2007). Official Methods of Annalisys of the Association of Agricultural Chemists. 18th Edition. Publisher by the Official Agricultural Chemists. Washington, DC., USA. Aranda, E., J. A. Ramos, S. Salgado y G. Mendoza. (2012b). Caña de azúcar en la alimentación bovina. Ed. Colegio de Postgraduados-Campus Tabasco.

Tabasco, MEX. Aranda, E., L. E. Georgana, J. A. Ramos y S. Salgado. (2012a). Elaboración de un alimento basado en caña de azúcar a partir de la fermentación en estado sólido y con diferentes niveles de zeolitas. Revista Cubana Ciencias Agrícolas. 46: 2159-163.

Barros, R. R., M. S. Carvalho, J. M. Peralta, R. R. Facklam and L. M. Teixeira.

(2001). Phenotypic and Genotypic Characterization of Pediococcus Strains

Isolated from Human Clinical Sources. Journal Clinical Microbiology.

39:1241–1246.

Cárdenas, J. R., E. Aranda, D. Hernández, L. C. Lagunes, J. A. Ramos y S. Salgado.

(2008). Obtención de un alimento fermentado en estado sólido a partir del bagacillo de retorno, pulido de arroz inóculos. Su utilización en la alimentación animal. Revista Cubana Ciencias. Agrícolas. 42: 173-176.

Cobos, M. A., A. Ley de Coss, N. D. Ramirez, S. S. Gonzalez and R. FerreraCerrato. (2011). Pediococcus acidilactici isolated from the rumen of lambs with rumen acidosis, 16S rRNA identification and sensibility to monensin and lasalocid. Research in Veterinary Science. 90:26-30.

De Man J. C., M. Rogosa and M. E. Sharpe. (1960). A medium for the cultivation of lactobacilli. Journal Applied. Bacteriology. 23:130-135.

FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations). (2007). Evaluación de la situación de la seguridad alimentaria mundial. 33 periodos de sesiones.

Comité de Seguridad Alimentaria Mundial, Roma, Italia.

GumbinaSaid, E. (1996). Packed-bed solid state cultivation systems for the production of animal feed. Journal. Science. Indian. Research. 55:431-438.

Hardie, J. M. (1986). Genus Streptococcus. In: Sneath, P. H. A., N. S. Mair, M. E. Sharpe and J. G. Holt (Eds). Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology, 9th edition. Vol 2. The Williams & Wilkins Co. Baltimore. USA. pp. 1043-1070.

Harrigan, W. F. y E. M. McCance. (1979). Métodos de laboratorio en microbiología de alimentos y productos lácteos. Editorial Academia. León, España. . (2013). Estudio

comparativo entre la cepa de Pediococcus acidilactici aislada del rumen de borregos y un consorcio de bacteria ruminales. Agrociencia. 47: 567-578.

Lynch, J. and D. Barbano. (1999). Kjeldhal Nitrogen Analysis as a Reference Method for Protein Determination in Dairy Products. Journal AOAC Inter. 82: 13891398.

McCullough, H. (1967). The determination of ammonia in whole blood by a direct colorimetric meted. Clinical Chemistry Acta 17:297.

Monroy, J. M., E. Aranda, G. Mendoza, J. A. Ramos, J. Herrera, M. Cobos y F. Izquierdo. (2006). Elaboración y conservación de Saccharina a partir de caña de azúcar integral, con la adición de melaza y pulidura de arroz. Revista Cubana Ciencias. Agrícolas. 40:167-172.

Peláez, A., M. Meneses, L. A. Miranda, M. Ayala, M. M. Crosby, O. Loera y M. D. Megías. (2011). Enzimas Fibrolíticas producidas por fermentación en estado sólido para mejorar los ensilajes de caña de azúcar. Agrociencia, 45:001-012.

Peláez, A., M. Meneses, L. A. Miranda, M. D. Megías, R. Barcena y O. Loera. (2008).

Ventajas de la fermentación sólida con Pleurotus sapidus en ensilajes de caña de azúcar. Archivos de Zootecnia. 57: 25-33.

Ramos, J. A., A. Elías y F. Herrera. (2006). Procesos para la producción de un alimento energético - proteico para animales. Efecto de cuatro fuentes energéticas en la fermentación en estado sólido (FES) de la caña de azúcar.

Revista Cubana Ciencias. Agrícolas. 40: 51-58.

Rangel, A. H., J. M. Campos, S. C. Valadares-Filho, G. S. Difante, D. M. Lima, L. P. Novaes and M. G. Costa. (2015). Nutrient consumption and digestibility of sugar cane diets supplemented with soybean meal or urea. Tropical and Subtropical Agroecosystems. 18: 87 – 94.

Robinson T., D. Singh y P. Nigam. (2002). Fermentación en estado sólido: una tecnología microbiana promisoria para la producción de metabolitos secundarios. Vitae. 9: 27-36.

SAS. Institute Inc. (2009). Statistical Analysis System, SAS, User’s Guide: SAS Inst., Cary, NC., USA. Valdivie, M., L. M. González y A. Elías. (1997). Nuevos tipos de Saccharinas para aves. Revista Cubana Ciencias Agrícolas. 3:231-236.