TESIS DE MAESTRIA EN CIENCIAS by Alejandro Ley de Coss

COLEGIO DE POSTGRADUADOS INSTITUCIÓN DE ENSEÑANZA E INVESTIGACIÓN EN CIENCIAS AGRÍCOLAS INSTITUTO DE RECURSOS GENETICOS Y PRODUCTIVIDAD PROGRAMA EN GANADERÍA

"EVALUACIÓN DE TÉCNICAS IN VITRO PARA EL ESTUDIO DE LA CAPACIDAD DESFAUNANTE DE FÁRMACOS Y PLANTAS”

ALEJANDRO LEY DE COSS

T E S I S PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO DE:

MAESTRO EN CIENCIAS

MONTECILLO, TEXCOCO, EDO DE MÉXICO

2003

AGRADECIMIENTOS Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por el financiamiento, para la realización y culminación de mis estudios de maestría. Al CONACyT-SAGARPA por el financiamiento, de esta investigación a través del proyecto No. 1149 intitulado “Tratamiento de acidosis ruminal subclínica (ARS) en ganado lechero y de carne mediante el uso de un bacteriófago especifico contra Streptococcus bovis” a cargo del Dr. Mario A. Cobos Peralta. Al Colegio de Postgraduados, especialmente a la Especialidad de Ganadería, por haber permitido realizar mis estudios de postgrado. Al Ph D. Mario A. Cobos Peralta, por su empeño y dedicación para la culminación de esta investigación. Además por toda su comprensión, tiempo dedicado a mi formación profesional y por su amistad. Al Dr. David Hernández Sánchez, por el apoyo y valiosas sugerencias, para el buen desarrollo esta investigación. A la Dra. Ma. Esther Ortega Cerrilla, por sus valiosas sugerencias para editar la presente investigación. A la MC. Ma. Magdalena Crosby Galván, por sus valiosas sugerencias para hacia esta investigación A los compañeros y amigos del laboratorio de Microbiología: Enrique Guerra Medina, Marcos Pérez Sato, Serafín López Garrido y Edgar E. Chi Moreno, por sus valiosas sugerencias y apoyo para el desarrollo de esta investigación. Al técnico de laboratorio de microbiología: José A. Hernández Romero, por su apoyo en el desarrollo de las técnicas requeridas en la presente investigación.

DEDICATORIA

A MI HIJA: ALEJANDRA LEY ARCE Y ESPOSA: CONSEPCIÓN ARCE ESPINO

A MIS PADRES Y HERMANOS

A MIS AMIGOS:

CONTENIDO

Página

Índice de cuadros ……………………….…………….………………………………

Resumen ………………………………….…………….………………………………

Summary ………………………………………...…………………………………….

vii

Introducción ………………………………...........……………………………………

Objetivos ……………………………….……….………………………………..

Hipótesis ……………………………….……….………………………………..

Revisión de literatura ………………………..……….………………………………

Protozoarios del rumen ………………………..………………………………………

Cultivo in vitro de protozoarios ruminales ……..………….………………………….

Problemas actuales en el estudio in vitro de los protozoarios ruminales ...……....

Viabilidad de los protozoarios ruminales …………………….…………………...….

Estudios de desfaunación …………………………………………..….…………..….

Efecto de la desfaunación ……………………………………………….………….…

Efecto sobre el medio ambiente ruminal ………………………..……….……

Efecto sobre el metabolismo ruminal ………………………….………….…..

Efecto de la desfaunación en rumiantes …………………….……………..…

Ventajas de la desfaunación …………………………………….………..……

Desventajas de la desfaunación ………………………………….……….…..

Métodos de desfaunación ………………………………………………….……….…

Métodos químicos para desfaunar ……………………………….…………...

Métodos físicos para desfaunar rumiantes ………………………..………….

Métodos desfaunantes por medio de leguminosas y arbustivas forrajeras

Método químico-farmacológicos…………………………….…….………..….

Evaluaciones con secnidazol ………………………………………..………………...

Mecanismos de acción del secnidazol ………………………..……………....

Farmacocinética del secnidazol ……………………………….…………..…..

Página

Materiales y métodos …………………………….………………………………..…

Ubicación geográfica del estudio …………………………..…………………………

Desarrollo de un medio de cultivo testigo para la sobrevivencia de protozoarios .

Obtención de la fracción soluble …………………………….………………...

Obtención del concentrado de protozoarios viables ………….…………..…

Técnica de inoculación de los medios de cultivo ……………….……………

Procedimiento de conteo de protozoarios ……………………….………..….

Capacidad desfaunante in vitro de las plantas seleccionadas …..…….………..…

Área de colección de material vegetal ……………………………….….……

Condiciones de cultivo y tratamiento ………………………………..…….…..

Capacidad desfaunante in vitro e in vivo de los fármacos antiprotozoarios ……..

Obtención de los fármacos ………………………………………….…….…...

Dosis desfaunante …………………………………………………….……..….

Efecto sobre la degradación de sustrato del secnidazol ………….……..….

Efecto sobre concentración de bacterias totales y celulolíticas ………...….

Capacidad y dosis desfaunante in vivo del secnidazol ……………….….…

Diseño y análisis estadístico …………………………………………………..……....

Resultados y discusión …………………………………………………….………..

Medio de cultivo anaerobio para crecimiento y sobrevivencia de protozoarios ….

Capacidad desfaunante in vitro de las plantas evaluadas …………….…...………

Efecto de la fracción soluble en agua sobre protozoarios ruminales..……..

Efecto en la concentración de protozoarios ………………….………..

Efecto en la viabilidad de protozoarios ………………………….…......

Efecto de la fracción insoluble de las plantas sobre la concentración y viabilidad de los protozoarios …………………………..……………...………

Capacidad desfaunante in vitro e in vivo de fármacos antiprotozoarios ………....

Efecto in vitro sobre la concentración y viabilidad de los protozoarios .......

Capacidad desfaunante in vitro del secnidazol …………….………………..

Efecto del secnidazol sobre la digestibilidad in vitro de sustratos…..

Pagina

Efecto sobre la concentración de bacterias totales y celulolíticas del secnidazol …………………………………………………………………

Capacidad desfaunante in vivo del secnidazol ………….…………………...

Conclusiones ………………………….……………………………………………….

Literatura citada ….…………...…………….…………………………………………

INDICE DE CUADROS

Cuadro

Titulo

Página

Protozoarios ciliados de mayor importancia en el rumen ………………….

Efectos de la desfaunación sobre el ambiente ruminal ……………......….

Efectos de la desfaunación sobre otros parámetros del ambiente ruminal

Efecto de la desfaunación sobre la digestibilidad ruminal ……..…..……...

Efecto de la desfaunación sobre variables productivas del animal…..…...

Métodos químicos utilizados para eliminar protozoarios del rumen …..….

Métodos físicos de desfaunación evaluados en rumiantes ……..………...

Métodos dietarios para desfaunar animales …………………..………..…..

Efecto de toxinas de algunas plantas sobre protozoarios del rumen …….

Composición del medio cultivo base (GCA-FR) para crecimiento y supervivencia de protozoarios ……………………………..…..……………..

Nombre común y científico de las plantas evaluadas ………….…..……...

Composición del medio para determinar degradación de sustrato …..…..

Evaluación de medio de cultivo anaerobio y sustratos sobre concentración (104 mL-1) y viabilidad (%) de protozoarios ruminales ...….

Evaluación de medio de cultivo anaerobio y sustratos sobre concentración (104 mL-1) y viabilidad (%) de protozoarios ruminales….…

Efecto de la fracción soluble de las plantas evaluadas sobre la concentración (104 mL-1) de protozoarios totales ……………..……..……..

Características nutritivas de plantas con capacidad desfaunante …..……

Porcentaje y concentración (104 mL-1) de protozoarios viables y pH en medios de cultivo adicionados con la fracción soluble de las plantas evaluadas ……………………….…………………...………………….………

14 15

Cuadro

Titulo

Página

Efecto in vitro sobre la concentración de protozoarios totales incubados con la fracción insoluble de diferentes plantas (104 mL-1) …………………………………………………………………………………….

Porcentaje y concentración (104 mL-1) de protozoarios viables y pH en medios de cultivo adicionados con la fracción insoluble de las plantas evaluadas ……………………………………………………………………….

Efecto in vitro sobre la concentración de protozoarios totales incubados con diferentes fármacos antiprotozoarios (104 mL-1)…………………….....

Porcentaje y concentración (104 mL-1) de protozoarios viables y pH en medios de cultivo adicionados con fármacos antiprotozoarios …………...

Proporción y concentración (104 mL-1) de protozoarios viables en medios de cultivo adicionados con secnidazol ….………………………….

pH en medios de cultivo adicionados con secnidazol ..………………...….

Efecto del secnidazol sobre la proporción de materia seca (MS) digestible de maíz, alfalfa, soya y rastrojo de maíz…………….…………..

Efecto del secnidazol sobre la concentración de bacterias totales y celulolíticas en medios de cultivo incubados con maíz, alfalfa, soya ó rastrojo de maíz (108) ………….………………………………………………

Capacidad desfaunante in vivo del secnidazol, concentración (104 mL-1) de protozoarios y proporción respecto al testigo ……….…………....…….

20 21 22

RESUMEN Con el objetivo de desarrollar un medio de cultivo para protozoarios ruminales, se evaluaron diferentes medios de cultivo anaerobios, adicionados con el extracto soluble en agua de: avena, kikuyo, alfalfa o leche. El medio con avena mantuvo mayor concentración de protozoarios (103–104 mL-1) y viabilidades (>90%) por 72 h de incubación. Utilizando dicho medio como testigo, se evaluó la capacidad desfaunante de diferentes plantas incluyendo: Baccharis vaccinioides, Montanoa leucanta, Verbesina perymenioides, Buddleia cordata, Morus alba, Yucca schidigera, Chenopodium ambrosioides, Marrubium vulgare, Mentha piperita, Argemone mexicana, Chenopodium ambrosioides y Datura inoxia. También se estimó la capacidad desfaunante de los desparasitantes quinfamida, etofamida y secnidazol. La propiedad desfaunante se estimó inoculando 0.5 mL de un concentrado de protozoarios en 9 mL de medio de cultivo, adicionado con 150 µL del extracto soluble de cada planta. El conteo de protozoarios se hizo en una cámara Neubauer a las 0, 24, 48 y 72 h. Para la quinfamida se evaluaron dosis de 0.15 y 0.83 mg, y para etofamida y secnidazol de 0.65 mg por 10 mL de medio. El secnidazol mostró capacidad desfaunante y se evaluaron dosis de 0.08, 0.16, 0.32 y 0.65 mg en cultivos in vitro y 2 g en una prueba in vivo. La capacidad desfaunante se clasificó como: alta capacidad desfaunante (ACD) y mediana capacidad desfaunante (MCD). En comparación con el tratamiento testigo, C. ambrosioides, M. vulgare, M. piperita, Y schidigera, A. mexicana y V. perymenioides redujeron (P<0.05) la concentración de protozoarios a menos de 102 mL-1 de medio de cultivo entre 24 y 72 h de incubación y se clasificaron como plantas con ACD. De los desparasitantes evaluados, solamente el secnidazol presento ACD in vitro a una concentración de 0.65 mg por 10 mL de medio de cultivo; mientras que, in vivo se requirió de 2 g por animal, equivalente a 2.6 mg por 10 mL de fluido ruminal. Se concluye que el extracto soluble en agua de algunas plantas tiene ACD; sin embargo, el secnidazol presenta ACD en menor tiempo (3 a 6 h). Por lo que, se estima un mejor potencial del fármaco en estudios de desfaunación. Aunque es conveniente realizar futuras evaluaciones sobre su inocuidad en la salud del animal. Palabras claves: Medio de cultivo anaerobio, protozoarios, desfaunación.

SUMMARY Different anaerobic culture media added with the water soluble extract of: oat, kikuyu, alfalfa or milk powder, were evaluated with the objective of develop a culture medium for rumen protozoa. The medium containing oat, maintained the highest protozoa concentration (103-104 mL-1) and viability (>90%) after 72 h of incubation. Using this medium as control, the defaunation capacity of different plants including: Baccharis vaccinioides, Montanoa leucanta, Verbesina perymenioides, Buddleia cordata, Morus alba, Yucca schidigera, Chenopodium ambrosioides, Marrubium vulgare, Mentha piperita, Argemone mexicana, Chenopodium ambrosioides and Datura inoxia was avaluated. Also, defaunation capacity of drugs against intestinal parasites (quinfamide, etofamide and secnidazol) was evaluated. Defaunation capacity was estimated by inoculation 0.5 mL of a protozoa concentrated sample in 9 mL of culture medium, added with 150 ÎźL of the water soluble extract of each plant. Protozoa were counted with a Neubauer chamber at 0, 24, 48 and 72 h. A dosage of 0.15 and 0.83 mg of quinfamide, and 0.65 mg of etofamide or secnidazol per 10 mL of medium were evaluated. The secnidazol showed defaunation capacity, and dosage of 0.08, 0.16, 0.32 and 0.65 mg in vitro, and 2 g in an in vivo study were estimated. The defaunation capacity was classified as: high defaunation capacity (HDC), and medium defaunation capcity (MDC). Compared with the control treatment, C. ambrosioides, M. vulgare, M. piperita, Y schidigera, A. mexicana and V. Perymenioides reduced (P<0.05) protozoa concentration to less than 102 mL-1 of culture medium, between 24 to 72 h of incubation, and they were classified as HDC plants. From the drugs evaluated, only secnidazol showed HDC in vitro at 0.65 mg per 10 mL of medium; while in vivo it was required 2 g per animal, that is equivalent to 2.6 mg per 10 mL of rumen fluid. It is concluded that the water soluble extract of some plants have HDC; however, the secnidazol drug develops HDC in less time (3 to 6 h). Therefore it is expected a better potential of this drug in defaunation studies. Although, it is suggested to do future evaluations about the product harmless in animal health. Key words: Anaerobic culture medium, protozoa, defaunation.

INTRODUCCIÓN

Entre los microorganismos presentes en el rumen se encuentran los protozoarios ciliados a los cuales se les atribuyen diversas funciones. Las primeras investigaciones los consideraban esenciales para el animal hospedero, pero, en la actualidad se ha demostrado que los rumiantes pueden sobrevivir sin su presencia, sin ningún riesgo para su salud o su fisiología digestiva (Coleman, 1986). Las investigaciones que buscan esclarecer la función de los protozoarios en el rumen, son difíciles de realizar debido a la dificultad de mantenerlos vivos fuera del ambiente ruminal, ya que no, se ha establecido con certeza que nutrientes y factores de crecimiento son esenciales para su cultivo in vitro; además de que los protozoarios, requieren de la presencia de bacterias vivas en el medio de cultivo para su crecimiento. Diferentes medios de cultivo a base de carbohidratos solubles, estructurales, soluciones minerales, soluciones reductoras entre otras, han sido evaluados en diversos trabajos, sin la obtención de resultados concluyentes, ya que, aunque muchos autores reportan largos periodos de sobrevivencia, no se ha podido mantener una concentración de protozoarios similar a la del rumen.

Por otro lado, en la búsqueda de técnicas para disminuir o eliminar a los protozoarios ruminales, se han probado diversos métodos físicos y químicos, que en la mayoría de los casos han producido problemas en la salud de los animales tratados, incluso la muerte, sin que se logre obtener una disminución significativa en la concentración de protozoarios ruminales. El uso de productos químicos y algunas estrategias de

alimentación a base de leguminosas y arbustivas han demostrado reducir la concentración de protozoarios en los animales que consumen estas plantas, pero en la mayoría de los casos, con poca eficacia. Otra posibilidad de la cual existen muy pocas referencias es el uso de fármacos utilizados como desparasitantes en humanos, que en teoría pueden tener efecto desfaunante en los rumiantes. Estos fármacos tienen una alta eficiencia y un mínimo efecto secundario en la salud, lo que amerita que se evalúen como agentes desfaunantes.

La presente investigación tuvo como un objetivo encontrar un medio de cultivo anaerobio que permitiera cultivar a los protozoarios ruminales en concentraciones al menos de 104 mL-1 de medio de cultivo por 48 a 72 h, a partir de un medio de cultivo glucosa-celobiosa-almidón más fluido ruminal (GCA-FR), más diversos sustratos y complementado con una dosis de antibióticos que regulan el crecimiento de bacterias sin llegar a su total eliminación. Una vez obtenido el medio, se realizaron pruebas in vitro para estimar la capacidad desfaunante del extracto soluble e insoluble en agua de diversas plantas. También se evaluó la capacidad desfaunante de desparasitantes de uso en humanos. Finalmente, se seleccionó un fármaco que mostró una alta capacidad desfaunante in vitro (secnidazol) y se evaluó su potencial in vivo como agente desfaunante.

Objetivos 1. Evaluar un medio de cultivo anaerobio con diversas fuentes de energía que permita mantener una concentración de protozoarios similar a la del rumen.

2. Evaluar la capacidad desfaunante de algunas plantas mediante pruebas in vitro.

3. Evaluar in vitro la capacidad desfaunante en rumiantes de los fármacos antiprotozoarios secnidazol, quinfamida y etofamida.

4. Estimar el efecto de la desfaunación sobre la concentración de protozoarios viables a diferentes horas de incubación.

5. Estimar mediante pruebas in vitro el efecto del secnidazol sobre la concentración de bacterias totales y celulolíticas; así como, sobre la degradabilidad anaerobia de diferentes ingredientes alimenticios.

6. Evaluar in vivo la capacidad desfaunante del secnidazol en ovinos tratados con una dosis única

Hipótesis •

Es posible producir un medio de cultivo anaerobio que permita mantener concentraciones de protozoarios similares a las que se presentan en el rumen por al menos 72 h de incubación.

•

En la fracción soluble e insoluble en agua de arbustivas y leguminosas se encuentran los compuestos tóxicos para los protozoarios.

•

Fármacos de uso permitido en humanos para el tratamiento de enfermedades parasitarias son efectivos para eliminar protozoarios del rumen sin efecto negativo en la salud del animal.

•

El fármaco seleccionado por su alta capacidad desfaunante no tienen efectos secundarios negativos sobre la concentración de bacterias totales y celulolíticas.

•

El fármaco con capacidad desfaunante no afecta negativamente la degradación bacteriana de ingredientes de uso común en la formulación de dietas para rumiantes.

REVISIÓN DE LITERATURA

Protozoarios del rumen En el rumen existe una amplia variedad de flora y fauna microbiana que mantiene un equilibrio en su composición (Ogimoto e Imai, 1981), predominando principalmente bacterias y protozoarios ciliados y una población menor de protozoarios flagelados, hongos y bacteriófagos. La microfauna, al igual de la microflora depende para su desarrollo, de una variedad de factores que incluyen tipo, cantidad y frecuencia de alimentación, manejo de los animales y de las interacciones entre los microorganismos ruminales (Church, 1993; Dehority, 1998).

La microfauna que habita el rumen de acuerdo a su morfología está dividida en protozoarios flagelados y ciliados, siendo los de mayor importancia por su concentración y actividad los ciliados, con cerca de 30 géneros y alrededor de 300 especies y una concentración de 105 a 106 protozoarios por mL de fluido ruminal (Ogimoto e Imai, 1981; Williams y Coleman, 1992). Así mismo los protozoarios ciliados se han clasificado de acuerdo a su morfología en tres ordenes de importancia: Prostomatida, Trichostomatida y Entodiniomorphida, la cual considera número y posición de los cilios, posición y forma del macro y micronúcleo, presencia y número de placas esqueléticas, así como de vacuolas contráctiles. Dentro de la familia Isotrichidae, orden Trichostomatida, sobresalen por su concentración los géneros Isotricha, Dasytricha y Oligoisotricha, los cuales presentan cilios en la totalidad o mayor parte de su superficie, y utilizan material soluble como alimento. De la orden Entodiniomorphida prevalece la familia Ophryoscolecidae con los géneros Entodinium, Diplodinium,

Epidinium y Ophryoscolex, estos se caracterizan por presentar cilios localizados en la zona cercana al peristomo (orificio bucal), los cuales le ayudan en la motilidad e ingestión de partículas de alimento y bacterias (Ogimoto e Imai, 1981; Yokohama y Johnson, 1988; Dehority, 1993).

Cuadro 1. Protozoarios ciliados de mayor importancia en el rumen. Reino: Protista Phylum: Ciliophora Clase: Kinetofragminophora Orden 1: Prostomatida Familia: Buetschliidae Género: Buetschlia Orden 2: Trichostomatida Familia: Isotrichidae Géneros: Isotricha, Oligoisotricha y Dasytricha Orden 3: Entodiniomorphida Familia: Ophryoscolecidae Géneros: Entodinium, Diplodinium, Eodinium, Eremoplastron Eudiplodinium, Diploplastron, Polyplastron, Metadinium Enoploplastron, Ophryoscolex, Epidinium, Caloscolex Ogimoto e Imai, (1981).

Los protozoarios son organismos unicelulares complejos, que presentan dentro de su citoplasma un núcleo diferenciado, aparato de Golgi, retículo endoplásmico, vacuolas de digestión, hidrogenosomas y placas esqueléticas. Su biomasa es similar a la de las bacterias (Hobson y Jouany, 1988) e inclusive puede ser superior hasta tres veces, dependiendo de la dieta, se calcula que los protozoarios representan el 2% del peso del contenido del rumen, el 40% de nitrógeno microbiano total y proporciona el 60% de los productos de la fermentación microbiana del rumen (Hungate, 1966; Yokohama y Johnson, 1988). Abe et al. (1981) indican que existe una gran masa de protozoarios principalmente holotrícos en el retículo-rumen de novillos después de un largo período de ayuno. Su velocidad de división es lenta, entre 6 a 38 h para holotricos (Coleman,

1979), y de 13.5 hasta 58 h para Entodinomorfos (Dehority, 1998). Se han observado reducción en la concentración de entodiniomorfidos después de la alimentación; mientras que, la concentración de holotricos se incrementa al doble una hora antes de la alimentación de los animales (Abe et al., 1981). La tasa de generación de los protozoarios es muy lenta comparada con la de las bacterias ruminales que va de 0.25 a 0.5 h-1 (Orpin y Greenwood, 1986), las cuales además tienen mayor predominancia y diversidad metabólica (Lee et al., 2000). Por tanto, los protozoarios evitan su salida del rumen a través de su migración hacia el retículo durante la alimentación fenómeno conocido como “secuestro” de protozoarios, también se ha demostrado una firme adherencia de los protozoarios a las partículas de alimento (Orskov y Ryle, 1990).

Cultivos in vitro de protozoarios ruminales Existe una variedad de sustratos disponibles para el cultivo de protozoarios, Coleman (1981) evaluó el crecimiento de ciliados en harinas de plátano, yuca y arroz, reportando el desarrollo de Entodinium caudatum, Epidinium ecaudatum, Ophryoscolex caudatus y Eudiplodinium maggii a concentraciones de 1.20X104, 2.90X103 y 4.60X103 respectivamente. Trabajos citados por Coleman (1981) indican la utilización de forrajes secos de alfalfa, ryegrass perenne y pasto bromo como substratos para el crecimiento de protozoarios en medios de cultivo anaerobios. Los medios inoculados se incubaron a 38º C y cada semana se transferían a medios de cultivo frescos. Yokohama y Johnson (1988) en un estudio determinaron que los protozoarios son muy versátiles en la capacidad para degradar y fermentar una amplia gama de sustratos, así mismo, también se sabe que ingieren partículas de alimento de granos y forrajes fraccionados.

A pesar de su versatilidad para nutrirse de diferentes sustratos, todavía no se cuenta con un medio de cultivo adecuado para realizar estudios in vitro, de manera que diversas investigaciones han utilizado una variedad de compuestos tales como: NaCl, NaHCO3, CH3COONa, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4-7H2O y CaCl2-2H2O, con la finalidad de mantener un pH de 6.7 a 7.2 en los medios de cultivo. También se han utilizado diferentes agentes reductores como por ejemplo, el sulfido de sodio, cisteina y ditiotreitol, que permiten mantener un ambiente altamente reductivo libre de oxígeno (Hungate, 1950; Coleman, 1981; Williams y Coleman, 1992; Dehority, 1993).

El desarrollo de medios de cultivo adecuados se complica, ya que, de acuerdo a Coleman (1979), algunos protozoarios por ejemplo Polyplastron spp. requieren de la presencia de otros protozoarios del genero Epidium y Diplodinium como fuente de alimento para su crecimiento. Este fenómeno establece una relación antagonista entre Polyplastron multivesiculatum y Epidinium ecaudatum, que resulta en una reducción en la concentración de E. ecaudatum en el medio de cultivo (Coleman, 1980). Otro factor importante a considerar para el cultivo in vitro de protozoarios ruminales, es que no tienen la capacidad de sintetizar aminoácidos del medio y por tanto no pueden ser cultivados in vitro en ausencia de bacterias, las cuales parecen ser su principal fuente de compuestos nitrogenados (Coleman, 1980; Dehority 1993, 1998). También se ha reportado que los protozoarios requieren ciertos factores de crecimiento como ciliatina (ácido 2-aminoetilfosfónico) como estimulador del crecimiento en cultivos in vitro (Hino y Russell, 1986).

Problemas actuales en el estudio in vitro de los protozoarios ruminales El conocimiento acerca del metabolismo de los protozoarios es limitado, principalmente, debido a su dependencia de bacterias en el medio de cultivo, esto, ha complicado su cultivo in vitro afectando principalmente el tiempo de generación y la sobrevivencia de protozoarios ruminales por largos periodos de incubación, aunque se ha sugerido que esta dependencia de bacterias, no es principalmente como una fuente de alimento, si no más bien, por otros factores desconocidos (Onodera y Henderson, 1980). Coleman (1979) y Dehority (1998) indican que un factor muy relacionado con la dificultad de cultivar protozoarios es su lenta tasa de generación, la cual disminuye el establecimiento de un crecimiento logarítmico in vitro importante, lo que explica que se hayan reportado tasas de generación de hasta 58 h (Warner 1962, citado por Dehority 1998). Mientras que Hungate (1950), reporta que un organismo puede sobrevivir en un sistema de cultivo siempre y cuando su tasa de generación sea igual o menor de 0.69 h. Al respecto Dehority (1998) coincide en que el crecimiento logarítmico, se encuentra influenciado por la duración de la fase Lag, la cual puede ser indefinida en el cultivo de protozoarios in vitro.

Otros factores que complican aún más el cultivo de protozoarios son la acumulación de productos finales del metabolismo, reducción de pH del medio, falta de sustratos alimenticios (fuentes de energía) y posiblemente la deficiencia de algunos nutrientes o factores de crecimiento indispensables para los protozoarios. Por otro lado Fondevila y Dehority (2001) indican que la falta de crecimiento de los protozoarios en medios de cultivo anaerobios evaluados a la fecha, se debe principalmente a la disminución en la concentración de nutrientes presentes originalmente en el medio, por lo que

recomienda la adición de medio de cultivo fresco (50%) durante intervalos de tiempo de cultivo que pueden ir de los 13.3 h a 24 y 48 h, pero que pueden llegar a ser de 30.8 h cuando el período de incubación es de 120 h.

Otro problema en el cultivo de protozoarios ruminales es el excesivo crecimiento de las bacterias (Dehority 1998), que resulta en una disminución en pH y por consiguiente una inhibición en el crecimiento de protozoarios. Una manera de prevenir la alta concentración de bacterias en los medios, se basa en adicionar pequeñas cantidades de alimento al medio de cultivo o usando un sustrato particulado que los protozoarios ingieran fácilmente y a su vez limiten la disponibilidad de alimento para las bacterias. Williams y Coleman (1992), Dehority (1998), Fondevila y Dehority (2001), han reportado el uso de antibióticos en los medios de cultivo para eliminar a las bacterias. Sin embargo, es más recomendable adicionar antibióticos en una concentración que sólo disminuya su crecimiento sin que provoque su total eliminación, ya que son indispensables para el crecimiento de los protozoarios (Fondevila y Dehority, 2001)

Williams y Coleman (1992), reportan que actualmente no existe una técnica comprobada que sea capaz de permitir el crecimiento de todos o la mayoría de los protozoarios del rumen.

Viabilidad de los protozoarios ruminales Dehority (1998), al evaluar los tiempos de generación de protozoarios entodinomorfos mediante la técnica anaeróbica de Hungate (1950), indicó que el tiempo de generación está influenciada por la duración de la fase Lag, los productos finales del metabolismo,

la reducción de pH, la deficiencia de nutrientes y factores de crecimiento. Fondevila y Dehority (2001), evaluaron la adición de antibióticos (estreptomicina y penicilina) en medios de cultivo que tenían como sustrato almidón de arroz, maíz o heno de orchard, sobre la concentración de entodinomorfos, reportando que la concentración de protozoarios no fue afectada por la ausencia de bacterias hasta las 48 h, pero después de 72 h la concentración y digestibilidad del almidón fue mayor en medio con bacterias vivas, indicando una posible dependencia de bacterias por parte de los protozoarios. Williams y Coleman (1992), indican que la ingestión de bacterias por parte de los protozoarios incrementa su concentración y la digestibilidad de las fuentes de energía. Fondevila y Dehority (2001), reportan crecimiento y sobrevivencia de protozoarios de las 0 a las 96 horas, con mayores concentraciones en los medios con bacterias viables, seguido por los de bacterias muertas y por último los medios sin bacterias tratados con antibióticos.

Williams y Coleman (1992) reportan que en diversos estudios, en los cuales se adicionaron diferentes mezclas de antibióticos como penicilina, ampicilina, neomicina, cloranfenicol, estreptomicina en medios de cultivos para protozoarios, disminuyó la concentración de bacterias, sin observarse efectos sobre la viabilidad y concentración de protozoarios, mientras que, en otras investigaciones en donde se utilizaron altas concentraciones de antibióticos, se produjo la eliminación total de las bacterias y se limitó la sobrevivencia de los protozoarios, indicando la necesidad de que en los medios de cultivo exista cierta concentración de bacterias viables. Fondevila y Dehority (2001), reportan un tiempo de sobrevivencia de protozoarios de 90 a 120 horas en medios de cultivo donde las muestras para conteos fueron fijadas en una solución con

formaldehído. Sin embargo, aunque el tiempo de sobrevivencia reportado por los autores es suficiente para realizar estudios in vitro con protozoarios, la técnica utilizada para fijar las muestras y determinar la concentración de protozoarios, tiene la desventaja de que al utilizar formaldehído todos los protozoarios mueren y no es posible diferenciar entre protozoarios viables y no viables.

Estudios de desfaunación Desde su descubrimiento en 1843, se asumió que los protozoarios ruminales eran importantes en el metabolismo y nutrición de los rumiantes, dado que constituyen una parte integral en la masa microbiana presente en el rumen, lo cual, es reflejado por su participación en los procesos de fermentación del alimento consumido por el animal. Sin embargo, el beneficio de los protozoarios para los rumiantes, hasta el momento sigue siendo tema de debate (Williams y Coleman, 1992). Algunos trabajos han demostrado que la digestibilidad del alimento y la ganancia de peso es más eficiente cuando el rumen contiene protozoarios (Bird y Leng, 1984). Las concentraciones de amoniaco y de ácidos grasos volátiles totales son mayores cuando están presentes los protozoarios, indicando una mayor fermentación y digestibilidad del alimento. Por otro lado, estudios realizados con animales desfaunados demuestran que su carencia no afecta a los animales de forma adversa, sugiriendo que los protozoarios no realizan funciones específicas que sean esenciales para el rumiante (Yokohama y Johnson, 1988).

Incluso, se ha reportado que la presencia de protozoarios en el rumen tiene efectos negativos sobre variables

productivas de los animales (Cottle, 1988a; Williams y

Coleman, 1992). Por lo que actualmente existe a nivel mundial una línea de investigación que intenta disminuir o eliminar a los protozoarios, condición a la que se denomina desfaunación.

Según Orskov y Ryle (1990), los protozoarios parecen tener los mismos requerimientos fisicoquímicos del ambiente ruminal que las bacterias, pero tienen otras características como mayor movilidad, colonizan el substrato más rápidamente que las bacterias, presentan mayor capacidad de almacenar carbohidratos, son más susceptibles a condiciones ácidas, no son esenciales para la fermentación y vida del rumiante, no pueden sintetizar aminoácidos a partir de NNP, siendo las bacterias del rumen su principal fuente de aminoácidos; además, debido a su lento tiempo de generación, permanecen más tiempo en el rumen (Coleman, 1980; Hobson y Jouany, 1988). Se ha reportado que de la masa microbiana que llega al duodeno solo un 15 a 30% son protozoarios (Coleman, 1979; Towne y Nagaraja, 1990), por lo que los protozoarios no constituyen un importante suplemento de nutrientes para el rumiante (Nagaraja et al., 1992).

Los estudios de desfaunación ruminal total o parcial permiten evaluar el desempeño de los rumiantes en presencia o ausencia de protozoarios, lo que permitirá aclarar la controversia actual que existe sobre la importancia de los protozoarios tanto en la degradación del alimento ingerido, como en la productividad del rumiante (Veira e Iván, 1983; Chaudhary y Srivastava, 1995). Existen reportes sobre diversos tratamientos químicos, físicos o dietarios que se han utilizado con el propósito de eliminar a los

protozoarios del rumen, los métodos utilizados para desfaunar deben ser selectivos y no deben tener efectos adversos sobre los animales o sobre otros microorganismos del rumen. Sin embargo, los resultados obtenidos con diferentes tratamientos utilizados para desfaunar indican que no existe hasta el momento un método satisfactorio que permita tal práctica sin efectos secundarios (Williams y Coleman, 1992). Muchos tratamientos han provocado efectos negativos sobre la salud del animal causandoles incluso la muerte (Lovelock et al., 1982; Jouany et al., 1988) o bien, han sido poco efectivos, por ejemplo, los protozoarios del omaso no son eliminados y pueden reiniciar la inoculación de protozoarios en el rumen (Towne y Nagaraja, 1990).

Efectos de la desfaunación La importancia de los protozoarios del rumen en la salud, crecimiento y desarrollo de los rumiantes, ha sido tema de gran debate desde Becker en 1929, quien fue el primer investigador en reportar que los rumiantes pueden sobrevivir normalmente cuando los protozoarios ciliados son retirados del rumen por medios químicos. Sin embargo también existen evidencias de que el crecimiento de borregos y terneros se incrementa ligeramente por la presencia de protozoarios. Otros autores reportan que los efectos de la desfaunación dependen del tipo de alimentación, por ejemplo en dietas de pobre calidad, lo protozoarios pueden afectar negativamente el crecimiento de animales jóvenes (Williams y Coleman, 1992).

Normalmente se espera que el efecto de la desfaunación se refleje en variables productivas (ganancia de peso, consumo de alimento, conversión alimenticia). Sin

embargo, es importante que se considere como un efecto en cascada, donde primeramente, la eliminación de los protozoarios, provocará un aumento en la concentración de bacterias ruminales, que a su vez, aumenta la tasa de síntesis microbiana y la cantidad de masa bacteriana ruminal que llega al duodeno (Kayouli et al., 1984; Itabashi et al., 1984; Veira, 1986); el cambio en la concentración de bacterias y en sus poblaciones, puede iniciar un cambio en la degradación y tipo de fermentación bacteriana de los carbohidratos de la dieta, lo cual repercutirá en la digestibilidad ruminal del alimento ingerido y en la cantidad de AGV disponibles para el animal como fuente de energía (Kreuzer et al., 1986; Jouany et al., 1988). Por lo anterior, es importante que los efectos de la desfaunación sean estudiados y analizados parcialmente como efectos en el ambiente ruminal (químicos y microbianos), metabólicos y sobre variables productivas del animal. La información generada debe ser a su vez analizada de manera conjunta con la meta de tener una mejor interpretación de las ventajas o desventajas de la desfaunación.

Efectos sobre el medio ambiente ruminal Williams y Withers (1991) reportan que las actividades enzimáticas implicadas en la hidrólisis del alimento se encuentran ampliamente distribuidas entre los protozoarios del rumen. Aunque se continua especulando que su acción se debe en parte, a las enzimas de las bacterias que son fagocitadas por los protozoarios (Cobos, 2002, Apuntes de curso). En el Cuadro 2, se reporta algunos efectos en el ambiente ruminal debido a la desfaunación.

Cuadro 2. Efectos de la desfaunación sobre el ambiente ruminal. Concentración de NH3 ↓ ↓ ↓

% molar de propiónico

% molar de butirico

↑

↓

↑

↓

% molar de acético

% molar de lactato

AGV

Metano ↓

↑

↑ NS NS ↑

NS ↑

↑ NS ↓

↓ NS NS

↑

↓

↑

↓

↑

↓

↑

↓

Referencia Bird y Leng, 1984 Whitelaw et al., 1984 Ushida et al., 1986 Jouany et al., 1988 Bird y Leng, 1978 Rowe et al., 1985 Van Nevel et al., 1993 Demeyer y Van Nevel, 1979 Mendoza et al., 1993 Nagaraja et al., 1992.

NS: no significativo; ↑: aumento; ↓; disminución

Se ha reportado una menor concentración de amoniaco en borregos desfaunados en dietas altas en granos (Bird y Leng, 1984) y en dietas con alto contenido de heno de alfalfa (Ushida et al., 1986). Con relación a la fermentación de carbohidratos Whitelaw et al. (1984), reportan una mayor producción de AGV y lactato (Van Nevel et al., 1993) y un cambio en la proporción molar de AGV, reflejada en un aumento en la concentración de propionato y valerato y una reducción de acético, butírico, isovalerato. Mendoza et al. (1993) reportan resultados similares pero sin cambios en lactato y valerato. La modificación en la proporción de ácidos grasos volátiles, por ausencia de protozoarios, también se ha relacionado con una disminución en la concentración de metano (ver cuadro 2) en dietas bajo alimentación restringida. En cultivos in vitro la menor concentración de AGV en presencia de protozoarios es debida a que estos microorganismos ingieren y almacenan gránulos de almidón protegiéndolos de la degradación y fermentación bacteriana. Sin embargo Rowe et al. (1985) y Ushida et al. (1986), reportan que no hay diferencias significativas en la concentración de AGV cuando se aumentó la cantidad de heno en la dieta, además, Bird y Leng (1978)

encontraron mayor proporción de butirato en animales desfaunados, así mismo Rowe et al. (1985), reportaron que no hay diferencias significativas en la concentración de ácido acético, propiónico y butírico. Mientras que Demeyer y Van Nevel (1979) y Jouany et al. (1988), indican que la desfaunación incrementa la concentración ruminal de amoniaco y AGV. Nagaraja et al. (1992) encontraron resultados similares, pero no encontraron diferencias significativas en la concentración de amoniaco.

En general la desfaunación como se muestra en el Cuadro 3 incrementa la concentración de bacterias ruminales, además Rowe et al. (1985) reportaron mayor proporción de bicarbonato (HCO3) y bióxido de carbono (CO2) en animales desfaunados, sin variación del pH entre desfaunados y faunados, y concluyen que el 80% del metano producido en el rumen libre de protozoarios fue derivado del HCO3.

Cuadro 3. Efectos de la desfaunación sobre otros parámetros del ambiente ruminal. Población bacteriana ↑

HCO3

CO2

pH ruminal

↑

Flujo de NH3 a duodeno ↑

Nitrógeno microbiano ↑ ↑

↓ ↑ ↑ ↑

NS ↓ ↑↓ ↓

NS: no significativo; ↑: aumento; ↓; disminución

Referencia Rowe et al., 1985 Van Nevel et al., 1993 Demeyer y Van Nevel, 1979 Newbold et al., 1997 Hungate, 1966 Kayouli et al., 1984 Nagaraja et al., 1992. Groummer et al., 1983 Itabashi et al., 1989 Kreuzer, 1986

Aunque existen pocos estudios sobre el efecto de la desfaunación en bacterias ruminales especificas, se ha reportado que la desfaunación provoca un aumento en la concentración de bacterias amilolíticas (Itabashi et al., 1989), mientras que Moore y Dehority (1993), Navas-Camacho et al. (2001) encontraron un aumento en la concentración de bacterias celulolíticas, con aumento en la cantidad de nitrógeno de origen bacteriano que llega al duodeno (Van Nevel et al., 1993), debido a la reducción en actividad desaminativa y proteolítica de los protozoarios y un incremento en el flujo de salida de proteína bacteriana (Ushida et al., 1986), aunado con un aumento en la cantidad bacterias ruminales que llegan al duodeno (Hungate, 1966; Kayouli et al., 1984). También se ha indicado un incremento en la proteína de origen microbiano disponible para el rumiante cuando se utiliza amoníaco como fuente de nitrógeno, e incrementos en la concentración de nitrógeno en rumen como consecuencias de la desfaunación (Ushida et al., 1986; Veira, 1986; Bird et al., 1994).

Ushida et al. (1984 citado por Demeyer, 1988) reportan que cuando los animales desfaunados recibieron una dieta rica en almidón, se redujo la concentración de AGV en el rumen en comparación con animales faunados, pero, se mantuvo sin diferencias cuando los animales recibieron dietas ricas en forraje, sin efectos en el pH ruminal; mientras que, Groummer et al. (1983) y Kreuzer et al. (1986) observaron reducciones en el pH: además, Itabashi et al. (1989), indican que la disminución del pH también se relaciona con mayores fluctuaciones en los valores de pH ruminal en animales desfaunados que faunados. Newbold et al. (1997) también encontraron una reducción en el pH ruminal de animales desfaunados. Mientras que Rowe et al. (1985) y Nagaraja

et al. (1992) reportaron que no hay diferencia significativa en los cambios de pH ruminal entre animales desfaunados y faunados.

Efectos sobre metabolismo ruminal Desde el trabajo de Gruby y Delafond en 1843, se han realizado varios trabajos sobre el metabolismo de los protozoarios y sobre los efectos de la desfaunación en la digestibilidad ruminal de diferentes nutrientes de la dieta. Ushida et al. (1986) y Van Nevel et al. (1993) encontraron una disminución por efecto de la desfaunación en la digestibilidad ruminal de la materia orgánica (MO), también se ha observado una disminución en la digestibilidad de materia seca (MS), celulosa, fibra detergente ácido (FDA), fibra detergente neutro (FDN) y hemicelulosa (Itabashi et al., 1984; Veira e Iván, 1983; Bird et al., 1994; Chaudhary y Srivastava, 1995).

Cuadro 4. Efecto de la desfaunación sobre la digestibilidad ruminal. Digest. de MO ↓

Digest. de MS

Digest. de Celulosa

Digest. de FDA

Digest. de FDN

Digest. de Hemicelulosa

Flujo de N2 ↑

Digest. de Almidón

↑

↓ ↓ ↓

↓

↓ ↓

↓

NS ↑ ↓

↓

↑

↑ ↓

↓ ↑

NS: no significativo; ↑: aumento; ↓; disminución

Referencia Ushida et al., 1986 Rowe et al., 1985 Van Nevel et al., 1993 Bird et al., l994 Chaudhary y Srivastava, 1995 Cottle, 1988b Mendoza et al., 1993 Itabashi et al., 1984 Bird et al., 1994 Veira e Iván, 1983 Jouany et al., 1988

Sin embargo Jouany et al. (1988) y Mendoza et al. (1993) reportan incrementos en la digestión del almidón en animales desfaunados. Los resultados de los diferentes reportes indican como se puede ver en el cuadro 4, aunque no de manera concluyente, que la desfaunación disminuye la digestibilidad de carbohidratos estructurales y aumenta la de carbohidratos de reserva o fácil degradación (almidón). Esta información debe ser considerada al investigar bajo qué condiciones alimenticias es conveniente desfaunar a los animales.

Efecto de la desfaunación en rumiantes En el Cuadro 5 se presenta algunas respuestas obtenidas en animales que fueron sometidos a diferentes tratamientos desfaunantes. En la mayoría de los reportes sobre desfaunación se indica un incremento en la ganancia de peso (Bird y Leng, 1979; Bird y Leng, 1984; Díaz et al., 1993), aunque también existen otros trabajos en los cuales la desfaunación redujo la ganancia de peso (Ravo y Raghavan, 1981 citado por Bird et al., 1994) o no se mostraron diferencias significativas (Veira e Iván 1983; Chaudhary y Srivastava 1994; Bird et al., 1994). Así mismo, se reporta que no existen diferencias significativas en cuanto a consumo de alimento y conversión alimenticia (Bird y Leng, 1984). Bird et al. (1994) reportaron aumento en la producción de lana en animales desfaunados. Lo que concuerda con lo reportado por Bird y Leng (1979) y Bird y Leng (1984), debido a un aumento en el flujo de aminoácidos azufrados hacia el intestino delgado de los animales desfaunados. El mayor flujo de proteína microbiana hacia tubo digestivo (Veira et al., 1983), tiene un marcado efecto en el desarrollo del rumiante sobre todo en dietas bajas en proteína (Ushida et al., 1986), ya que en animales

desfaunados existe un incremento en el flujo de masa microbiana y del nitrógeno de la dieta comparado con animales faunados.

Navas-Camacho et al. (2001) indican que la desfaunación aumenta la ganancia de peso y que la respuesta a la eliminación de protozoarios se encuentra condicionada a la calidad de la dieta (ver cuadro 5), concluyendo que solamente se incrementa la ganancia de peso, cuando la cantidad de proteína que llega al duodeno incrementa en dietas altas en energía (Ushida et al., 1991).

Cuadro 5. Efecto de la desfaunación sobre variables productivas del animal. Ganancia de peso

Consumo de alimento

Conversión alimenticia

Producción de lana

↑

↓

↑

↓

↑

Veira e Iván, 1983

↑

Bird y Leng, 1984 Díaz et al., 1993 Navas-Camacho 2001

↑

al.,

Bird et al, 1994 Ushida et al., 1991

Chaudhary y Srivastava, 1995

Moore y Dehority, 1993

↑

Bird y Leng, 1979 Ravo y Raghavan, 1981

↑ NS

Referencia

↑

Fahmy et al., 2000

NS: no significativo; ↑: aumento; ↓: disminución

Por otro lado, se ha sugerido que la desfaunación tiene poco o ningún efecto sobre la producción animal, aunque los estudios se han realizado en dietas altas en almidón y

con altos niveles de proteína (Bird y Leng, 1979). Bird y Leng (1979, 1984) reportan que animales alimentados con bajos niveles de proteína en la dieta y desfaunados, incrementaron su crecimiento y la conversión alimenticia, los mismos autores observaron que dicho resultado no se presentó en animales con altos niveles de proteína y concluyen que la ausencia de protozoarios incrementa la disponibilidad tanto de energía como de aminoácidos y la eficiencia en la utilización del alimento. Estos resultados indican que la cantidad de proteína microbiana puede ser reducida por la presencia de protozoarios debido a su actividad bacteriófaga, limitando la productividad del animal, en particular cuando los niveles de proteína de la dieta son bajos.

En general no se ha reportado un aumento en consumo de alimento pero si, una mejor conversión alimenticia en animales desfaunados alimentados con una dieta baja en proteína. Es importante señalar que los tratamientos utilizados para desfaunar incluidos en el cuadro 5 no fueron 100% eficientes o afectaron la salud de los animales desfaunados, por lo que los efectos de la desfaunación en variables productivas no están cabalmente demostrados.

Ventajas de la desfaunación En general los efectos positivos de la desfaunación son: reducción en la metanogénesis (Whitelaw et al., 1984; Kreuzer et al., 1986; Domínguez et al., 1993), aumento en el flujo de compuestos nitrogenados hacia el duodeno (Leng y Nolan, 1984; Bird y Leng, 1984; Veira, 1986; Cottle, 1988b; Itabashi et al., 1989; Ushida et al., 1991). Demeyer y Van Nevel (1979) y Bird et al. (1994), indican que existe aumento en la eficiencia en la utilización del nitrógeno debido a una reducción de la actividad depredadora de los

protozoarios hacia las bacterias. Itabashi et al. (1984) reportan mayor concentración de péptidos en el rumen de animales desfaunados, mayor concentración de aminoácidos esenciales y no esenciales en plasma, mayor concentración de gástrina, alantoína y aumento en la degradación de lignocelulosa.

Parece ser que al eliminar los protozoarios del rumen se puede mejorar el rendimiento de los animales bajo determinadas condiciones dietéticas, como pueden ser dietas ricas en almidón, con elevado contenido de nitrógeno no proteínico (NNP). Además, al evitar la actividad depredadora sobre las bacterias, se aumenta la concentración de bacterias ruminales; como consecuencia hay un aumento en la tasa de síntesis de proteína bacteriana en el rumen y en la cantidad de proteína microbiana que sale del rumen (Yokohama y Johnson, 1988; Bird et al., 1994).

En dietas con altos niveles de energía y bajo de proteína Bird et al. (1994) observaron una ineficiente utilización del alimento ingerido por borregos faunados con respecto a los desfaunados, aunque indican que los efectos encontrados con animales libres de protozoarios no pueden atribuirse totalmente al agente desfaunante o a la falta de protozoarios en el rumen, con excepción del aumento en la producción de lana, la cual incrementada, debido a un incremento en la disponibilidad de proteína digestible que llega al intestino delgado como resultado de una reducción en el consumo de bacterias por parte de los protozoarios, un incremento en la disponibilidad de masa bacteriana en el duodeno y una reducción en el reciclaje de nitrógeno proteínico bacteriano en el rumen. También se ha encontrado, que los protozoarios reducen la disponibilidad de

nutrientes, principalmente de proteína al ingerir bacterias y pequeñas partículas de alimento que son retenidos en el rumen (Coleman, 1979, Rowe et al., 1985).

Desventajas de la desfaunación Los protozoarios ejercen un efecto estabilizador en la fermentación ruminal, al ingerir partículas de alimento y almacenarlas como polisacáridos de reserva, de esta manera, controlan el nivel de substrato disponible para la fermentación microbiana, lo que permite mantener una fermentación más uniforme entre tomas de alimento. La ingestión de bacterias por lo protozoarios también sirve como un control de la tasa de fermentación cuando las dietas son ricas en cereales (Yokohama y Johnson, 1988), así también se ha reportado que la fauna ruminal puede disminuir los problemas de acidosis ruminal por reducción en la velocidad y digestión del almidón (Mendoza et al., 1993).

En dietas con bajo contenido de proteína los protozoarios pueden constituir una fuente continua de proteína en el rumen, debido a su retención en el rumen, lo que permite que tanto el animal como las bacterias, dispongan de una fuente de nitrógeno contínuo con la muerte y lisis de los protozoarios (Yokohama y Johnson, 1988). Los protozoarios además, presentan un mejor balance de aminoácidos en comparación con las bacterias.

Por otro lado, las ventajas de la presencia de protozoarios en rumen, es variable debido a que las diferentes especies de protozoarios ruminales tienen diferentes funciones metabólicas y afectan de manera distinta la fermentación ruminal. Por ejemplo, Iván et

al. (2000) inocularon fluido ruminal que contenía diferentes grupo de protozoarios ruminales a animales desfaunados, y obtuvieron efectos diversos por cada grupo de protozoarios inoculados. En cada grupo el pH vario, siendo más alto con el grupo que contenía Dasytricha ruminantium, Polyplastrum multivesiculatum, Isotricha intestinales y Entodinium caudatum, y mas bajo en el grupo Dasytricha ruminantium, Polyplastrum multivesiculatum, Epidinium ecaudatum y Eudiplodinium maggi, al igual que en los animales libres de ciliados. Los mismos autores observaron también una mayor concentración de AGV en este último grupo y en el de animales libres de protozoarios. En cuanto a la concentración ruminal de nitrógeno amoniacal, aminoácidos totales y nitrógeno bacteriano, fue mayor a medida que se aumentó la concentración de ciliados en el rumen, aunque el flujo de nitrógeno amoniacal, aminoácidos totales y nitrógeno bacteriano hacia el tubo digestivo posterior fue estadísticamente menor cuando se agregaron los grupos de protozoarios en comparación con los desfaunados. En esa misma investigación Iván et al. (2000), no encontraron diferencias en la digestibilidad de la MO en los animales inoculados con el primer grupos de protozoarios, pero si para el segundo, sin diferencias en digestibilidad de FDN para animales faunados y desfaunados.

La mayoría de la literatura reporta inhibición en la digestibilidad de materia orgánica (DMO), materia seca (DMS), celulosa (DC), fibra detergente ácida (DFDA), fibra detergente neutro (DFDN), y de hemicelulosa (DH) en el rumen cuando los animales son desfaunados. Demeyer (1988), establece que son varias las razones por la que se da tal situación entre ellos; tipo de pared celular de la parte vegetal de la dieta, técnica

de desfaunación, régimen de alimentación, método para determinar la digestibilidad, población bacteriana y protozoaria presente en animales faunados y la especie animal utilizada en el experimento.

Métodos de desfaunación. Para obtener animales libres de protozoarios, se han probado diferentes métodos, que podemos agrupar en físicos, químicos y alimenticios. Otro método con potencial, es el uso de fármacos con acción desparasitante. Bird y Leng (1984), mencionan que los métodos de desfaunación utilizados hasta la fecha para estudiar y evaluar la función de los protozoarios en el rumen y la productividad del rumiante, presentan en la mayoría de los casos el inconveniente de tener efectos negativos en la salud del animal.

Métodos químicos para desfaunar Los primeros estudios para eliminar protozoarios del rumen incluían el uso de ácido clorhídrico, ácido acético y sulfato de cobre (Becker, 1929; citado por Williams y Coleman, 1992), el uso de estos compuestos fue posteriormente eliminado cuando se demostró con estudios in vitro que varias infusiones orgánicas de estos compuestos eran tóxicas no sólo para los protozoarios del rumen, si no también, para las bacterias (Eadie y Oxford, 1957). Los surfactantes aniónicos como sal de sodio y alfil sulfato, fueron también usados para destruir ciliados (Oxford 1951; Williams y Coleman, 1992). Actualmente existen reportes de una amplia gama de productos químicos utilizados como agentes desfaunantes, por ejemplo: detergentes surfactantes aniónicos

(sulfosuccinato de sodio, alkanatos) y no-aniónicos (téricos; etoxilatos de nonilfenol, alcoholcetiloleil, polipropilenglicol), y alcoholes sintéticos de cadena ramificada (Campbell et al., 1982; Williams y Coleman, 1992). Uno de los procedimientos más efectivos para desfaunar rumiantes es la adición de químicos como el sulfosuccinato dioctil de sodio (DSS, por sus siglas en inglés) directamente al rumen (Rowe et al., 1985; Bird et al., 1994) el cual ha tenido gran efectividad in vitro a dosis de 30 µg /mL (Orpin, 1977).

En una prueba en caballos con dosis de 240 mL de una solución que contenía 5% de DSS por día, se mantuvo a los animales libres de protozoarios por los 112 días del período experimental, aunque el único efecto no deseado fue la reducción en la concentración de bacterias, las cuales retornaron a su concentración normal a las dos semanas de iniciado el tratamiento (Moore y Dehority, 1993). Debido a que algunos tratamientos químicos son nocivos para el animal, en algunos estudios se recomienda que los animales desfaunados descansen durante cuatro semanas, lo que permite una recuperación del rumen, que de acuerdo con Orpin y Letcher (1984), permite que las bacterias del rumen se recuperen y no influyan en los resultados de la desfaunación. En el cuadro 6 se da una lista de diferentes compuestos químicos utilizados para desfaunar y algunas de sus características.

Cuadro 6. Métodos químicos utilizados para eliminar protozoarios del rumen. Tratamiento

Técnica/Dosis

Efectividad (%)

Efecto sobre el animal

Días sin protozoarios

Referencia

Ac. Acético o Sulfato de cobre

Directa al rumen

100

Daños en anatomía digestiva

Durante el tratamiento

Becker, 1929, citado por Williams y Coleman, 1992

Peroxido de calcio

Directa al rumen

100

No reporta efecto

Durante el tratamiento

Demeyer, 1988

Sulfosuccinato dioctil de sodio (DSS)

In vitro dosis 30µg/mL

100

Redujo concentración de bacterias

Sulfosuccinato dioctil de sodio

240 mL/día en caballos con fístulas en ciego y colon

100

Sin efectos negativos en el animal

112 días de tratamiento

Moore y Dehority, 1993

Nonil fenol etoxilato

Dosis de 100 g en 800 mL de agua

100

Sin efectos negativos, refaunación

Dos semanas

Bird y Leng, 1978; Veira e Iván, 1983

Nonil fenol etoxilato

Directa al rumen

Sulfosuccinato dioctil de sodio

120 mL solución al 10% por 3 días

100

Sulfosuccinato dioctil de sodio

10 g en 250 mL de agua vía ruminal

Baja (Contaminación a las dos semanas)

Pérdida de apetito y muerte del 50% de los animales

Máximo 24 horas

Lovelock et al., 1982

Sulfosuccinato dioctil de sodio

10 g/ 100 kg de PV en 200 mL de agua vía ruminal por dos días

Baja el consumo de MS hasta los 10 días

120 días con aislamiento de los animales

Chaudhary y Srivastava, 1995

Lauril dietoxilato sulfato de sodio

20 mL en 100 mL de agua directa al rumen por 3 días

Muerte de animales y refaunación

Durante el tiempo de estudio

Bird y Leng, 1984

Sulfosuccinato dioctil de sodio

8 g en días consecutivos

100

8 semanas

Rowe et al., 1985

Nonil fenol etoxilato

15 g en 120 mL de agua

75 hasta las 4 semanas y 100 con una segunda dosis

Durante toda la prueba

Bird y Leng, 1979

ácido láctico

20 a 30 g por día

Orpin, 1977

Sin efectos negativos

después de los 80 días

Bird et al., 1994 Bird et al., 1994

Sin efecto negativo Reducción del consumo

Mendoza et al., 1993

Diferentes reportes en los cuales se trabajó con desfaunación de ovejas, indican que no hay un procedimiento efectivo para eliminar protozoarios del rumen por un extenso período de

tiempo. Algunos reportes puntualizan la dificultad de obtener animales

desfaunados usando tratamientos con detergentes como el sulfosuccinato dioctil de sodio (Bird et al., 1994). Los efectos adversos en la salud del animal que se han asociado particularmente con este compuesto químico, comprometen la validez de este

método de desfaunación (Lovelock et al., 1982). También se ha reportado la muerte de animales al usar tratamientos desfaunantes (Bird y Leng, 1984; Jouany et al., 1988). Es evidente que los métodos de desfaunación de rumiantes no son confiables a la fecha, es por ello, que para obtener animales libres de protozoarios es necesario seleccionar cuidadosamente algún producto o metodología.

En varios estudios (Abou y El-Shazly, 1964; Lovelock et al., 1982; Moore y Dehority, 1993), reportan que el uso del detergente sulfosuccinato dioctil de sodio (DSS) es efectivo para desfaunar y no presenta efectos negativos en la salud del animal y mantiene a los animales libres de ciliados por lo menos dos semanas. También Orpin (1977), señala que el DSS y el alcohol etoxilato tienen una buena toxicidad contra protozoarios ciliados del rumen sin efectos negativos en las ovejas desfaunadas.

El nonil fenol etoxilato se ha usado exitosamente para desfaunar rumiantes grandes (Bird y Leng, 1978) y pequeños (Bird y Leng, 1979; Veira e Iván, 1983). Este producto no produjo problemas en la salud de los animales a dosis de 100g en 800 mL de agua o 15 g en 120 mL de agua. No obstante, se ha observado que con un mal manejo en las dosis, se puede provocar una intoxicación en los animales, así como, repercusiones secundarias sobre las bacterias ruminales (Lovelock et al., 1982). El uso de DSS ha sido usado eficientemente como desfaunante, a dosis de 20 a 30 µm mL-1 en cultivos in vitro, con gran efectividad contra holotricos y entodinomorfos (Abou et al., 1968). Sin embargo, otro estudio in vivo Williams y Coleman (1992) indican que dosis de 10 g de DSS, 24 h antes de alimentar el animal y 5 g después de 24 h, redujeron

inmediatamente el consumo voluntario de borregos, en comparación con animales no tratados. Actualmente se han evaluado alrededor de 170 agentes con actividad antiprotozoario, como detergentes aniónicos y no aniónicos, de los cuales se concluye que los primeros son más efectivos. Otro agente el nonil fenol etoxilato del grupo de surfactantes no aniónicos (alcoholes de cadena larga que contienen oxido de etileno, alcohol etoxilato) tienen una alta efectividad para desfaunar (Bird y Leng, 1978 y 1979). Aunque se han reportado efectos negativos sobre los animales, así como también efectos negativos sobre la población de bacterias (Orpin, 1977; Lovelock et al., 1982). Otros aditivos alimenticios no surfactantes que tienen potencial para desfaunar incluyen peróxido de calcio (Demeyer, 1988) y aceites (Van Nevel et al., 1993), aunque el uso de aceites redujo el consumo en los primeros días de tratamiento (Seng et al., 2001) y cambios en el metabolismo fermentativo del rumen (Van Nevel et al., 1993).

Métodos físicos para desfaunar rumiantes Diversos estudios de desfaunación, se han efectuado mediante el uso de métodos mecánicos y subsecuentemente el uso de compuestos químicos. Eadie y Oxford (1957) reportan una técnica que consistió en el vaciado del rumen, filtración del contenido por medio de gasas, calentamiento de los sólidos a 55 ºC por 15 minutos y finalmente reingreso del contenido al rumen. Jouany y Senaud (1979), usaron un método similar al anterior, con la diferencia de que en este proceso, después del retiro del contenido ruminal, la cavidad ruminal fue lavada con formaldehído o ácido acético (Jouany et al., 1988). Aunque pudieran considerarse como métodos efectivos, los resultados obtenidos indican que no eliminan en su totalidad a los protozoarios, además de que, dañan la salud del animal. Abou y El-Shazly (1964) y Whitelaw et al. (1984), mencionan que el

método más eficaz para mantener a los animales libres de protozoarios, consiste en separar al animal recién nacido del hato y mantenerlo aislado en instalaciones especiales libres de protozoarios como medida para evitar la inoculación natural que se efectúa mediante el contacto con animales portadores de protozoarios. En el cuadro 7 se describen algunos métodos físicos de desfaunación reportados.

Cuadro 7. Métodos físicos de desfaunación evaluados en rumiantes. Técnica

Efectividad (%)

Efecto sobre el animal

Días libre de protozoarios

Referencia

Vaciado, calentamiento y filtración del contenido ruminal

Alto estrés, reducción del consumo y alteración de la salud del animal

Ninguno, existe refaunación rápida

Eadie y Oxford, 1957

Estrés, reducción del consumo y daños a la salud y muerte de animales

Ninguno, existe refaunación rápida

Jouany et al., 1988

Vaciado ruminal y posterior lavado del rumen con ácido acético Aislamiento del recién nacido

100

Sin efecto nocivo

Durante tratamiento

Whitelaw et al., 1984

Remoción del contenido del rumen y lavado del rumen con formaldehído al 0.15% en agua

Reducción del consumo del alimento, muerte de animales

16 días los respondieron al tratamiento y 24 horas en otros animales

Lovelock et al., 1982

Vaciado ruminal y posterior lavado del rumen con una dilución de formaldehído, más agua

100

Poco efecto sobre la salud del animal

6 meses

Jouany y Senaud, 1979

Métodos desfaunantes por medio de leguminosas y arbustivas forrajeras Muchos agentes químicos antiprotozoarios evaluados experimentalmente, no son de uso práctico debido a problemas de toxicidad secundaria, tanto en bacterias ruminales como en el propio animal (Williams y Coleman, 1992). Se ha sugerido que metabolitos naturales contenidos en plantas tienen un efecto tóxico hacia protozoarios ruminales por lo que dichas plantas tienen potencial como agentes desfaunantes (NavasCamacho, 1994; Espinosa, 1999). Dentro de los componentes químicos que se han encontrado en diferentes plantas están: alcaloides, aminoácidos no proteínicos,

micotoxinas, terpenoides, esteroides, lecitinas, inhibidores de proteasas y fenoles que son producidos naturalmente en ciertas plantas como un mecanismo de defensa contra otras plantas, animales, insectos depredadores e infecciones microbianas (Newbold et al., 1997; D’Mello, 1992). Se ha encontrado que Sesbania sesban, una leguminosa de clima tropical contiene un compuesto tóxico capaz de eliminar fácilmente a los protozoarios del rumen, resultando en un aumento de la productividad de los animales tratados (Navas-Camacho, 1994).

La búsqueda de opciones para lograr una total desfaunación a partir del manejo de dietas que contengan leguminosas o arbustos forrajeros tóxicos para protozoarios, tiene la ventaja de que se pueden utilizar como suplementos proteínicos, además de lograr el efecto desfaunante, lo que

puede proporcionar un beneficios extra para rumiantes

alimentados con forrajes de baja calidad nutritiva. En el cuadro 8, se dan algunas características de diferentes métodos dietarios utilizados para desfaunar.

Cuadro 8. Métodos dietarios para desfaunar animales. Tratamiento

Técnica

Efectividad (%)

Efecto sobre los animales

Referencia

Aceite mineral

Adición de 5 mL / kg de peso vivo vía ruminal

Sin efecto

Seng et al., 2001

Dietas altas en concentrados

Provoca acidosis crónica

Afecta variables productivas

Whitelaw et al., 1984

Dietas altas en concentrados

Dietas con 40% de concentrado y 60% de forraje

Reducciones en la concentración de protozoarios

Sin efecto

Moore y Dehority, 1993

Enterolobium ciclocarpon

Complemento en dietas como forraje con dosis de 100 a 300 g/día

Reducciones en la concentración de protozoarios

Aumento de flujo de proteína con mayor absorción en duodeno

Navas-Camacho et al., 2001

Sesbania sesban

Complemento en dietas como forraje con dosis de 250 g/día

100

Sin efecto

Newbold et al., 1997

Dieta alta en granos

40 y 60% de concentrado

Sin efecto

Franzolin y Dehority,1996

Dietas con alto contenido de grano (60%) han producido una desfaunación parcial (Cottle, 1988a), otros autores mencionan que dietas con 75% de concentrados disminuyen el crecimiento de protozoarios, mientras que dietas a base de heno no presentaron efectos desfaunantes y la concentración de protozoarios fue normal (7.6 X 105 mL-1). En una dieta a base de paja de avena se reporta 3.5 X 105 protozoarios por mL, indicando que dietas altas en forraje no tienen efectos negativos (Newbold et al., 1997). Varios factores influyen sobre la composición y concentración de protozoarios del rumen, incluyendo composición de la dieta, pH, tasa de degradación ruminal, frecuencia y nivel de alimentación, entre otros. Dietas con 40 y 60% de concentrados mantienen altas concentraciones en número y especies de protozoarios (Franzolin y Dehority, 1996). Se ha observado que entre 2 o 3 semanas los protozoarios son eliminados del rumen cuando los animales han sido alimentados con dietas altas en concentrado

ofrecidas

libitum,

pero

algunos

pequeños

protozoarios

inexplicablemente reaparecen 15 semanas después en animales que continuaron con el mismo régimen alimenticio (Hristrov et al., 2000). Lo que indica un proceso de adaptación y pone en duda trabajos previos que indican que dietas altas en granos mantienen un rumen libre de protozoarios (Moore y Dehority, 1993). También Franzolin y Dehority (1996), demostraron la presencia de protozoarios en dietas altas en granos; pero Eadie et al. (1970), reportan una desfaunación completa con dietas altas en grano de cebada en consumo ad limitum, y la presencia de algunos protozoarios (Epidinium e Isotricha) en dietas de mediana y alto contenido de cebada, mientras que, Dasytricha sp. no fue encontrada en las diferentes muestras de líquido ruminal.

Es importante mencionar que no todos los metabolitos secundarios de las plantas son tóxicos para los protozoarios. Por ejemplo, análogos de la tirosina (mimosina y productos de su degradación). El 3,4 dihidroxipiridina, es la forma activa de la mimosina que se encuentra en Leucaena leucocefala, Mimosa púdica y Pithecelobium ondulatum, se ha demostrado que la forma activa de la mimosina es tóxica para el rumiante, pero no, para los protozoarios, resultados similares se han reportado con el 3,4 dihidroxifenilalanina (DOPA), que se encuentra en Vicia faba, Mucuna spp

Stizolobium deeringiamin. Los efectos de estos compuestos como se puede ver en el Cuadro 9, producen cambios en el metabolismo ruminal con aumentos en la concentración de ácidos grasos volátiles y reducción de amoniaco en la mayoría de los casos, pero sin ningún efecto sobre la concentración de protozoarios existiendo en algunos casos incremento en la población de los mismos (Domínguez et al., 1993 y Navas-Camacho et al., 2001).

Cuadro 9. Efecto de toxinas de algunas plantas sobre los protozoarios del rumen. Toxina

Dosis

Efecto en rumen

Amoniaco en rumen

Efecto en protozoarios

3,4 Hidroxipiridina

4 y 8 mg/L

↑ pH

↓

Nulo

3,4 Dihidroxifenilalanina

4 y 8 mg/L

↑

AGV

↓

Nulo

Mimosina

4 y 8 mg/L

↑

AGV

↑

↑ 25%

Canavannina

0.6 y 1.2 mg/L

↑

AGV

↓

↑

Ac. Nicotínico

4 y 8 mg/L

↑

AGV

↓

Nulo

CAMECOL

4 y 8 mg/L

↓

Nulo

(DOPA)

↓ AGV, ↑ pH

25%

↑: Aumento; ↓:Reducción; AGV: Ácidos grasos volátiles (Domínguez et al. 1993; Navas-Camacho et al. 2001).

El uso de plantas arbustivas y árboles como fuente de nutrientes para los rumiantes, no es una práctica reciente (Benavides, 1994). Sin embargo, el efecto sobre la población

ruminal es un tema que ha retomado interés en forma reciente. De acuerdo con El Hassan et al. (1995) y Domínguez et al. (1993) los protozoarios ruminales son afectados por los compuestos químicos presentes en algunas plantas utilizadas como forrajes. Al evaluar la fracción saponígea de Sesbania sesban se encontró que el extracto redujo la concentración de los protozoarios al 16% con respecto al tratamiento testigo, después de cuatro horas de incubación, por lo que, se concluye que las saponinas de la planta son las responsables de la capacidad desfaunante. Lo mismo observó Espinosa (1999) quién encontró que esta planta redujo (in vitro) la concentración de protozoarios en casi 100%. Cabe señalar que en algunas de las plantas con efecto desfaunante sobre los protozoarios ruminales, no se detectó la presencia de compuestos químicos que se han reportado como tóxicos para los protozoarios (saponinas, alcaloides o taninos; Espinosa, 1999). Por lo que se estima que el efecto desfaunante en algunas plantas se debe a la presencia de metabolitos diferentes a los reportados en la literatura.

Métodos químicos-farmacológicos La efectividad para lograr una desfaunación con diferentes métodos ha sido variable y actualmente no se conoce un procedimiento efectivo que a su vez no ponga en riesgo la salud del huésped. En teoría, es posible experimentar con fármacos utilizados para el tratamiento de parásitos internos en humanos. Estos fármacos han sido evaluados en cuento a su inocuidad, o efectos no deseables en la salud, y existe la posibilidad de que sean efectivos para desfaunar rumiantes sin que afecte su salud.

Al respecto Padilla et al. (1995), Rodríguez y Rodríguez (1994) indican que el producto 1-dicloro acetil quinolinol (quinfamida) y el dicloroacetamida (etofamida) utilizados comercialmente para el tratamiento de parásitos internos en humanos, tienen la característica de ser eliminados en un 90% en heces y el 10% en orina, una vez administrados en dos tomas con una eficacia desparasitante del 96%. En cuanto a su inocuidad, los tratamientos fueron aplicados a pacientes con quistes de Entamoeba histolytica, y se determinó que ambos medicamentos presentaron efectos secundarios en 10% de los pacientes que presentaron síntomas de dolor abdominal, nauseas, hipoxia, distensión abdominal y diarreas. En otro estudio Padilla et al. (1995) encontraron una efectividad desparasitante del 100%, reduciéndose por completo la presencia de síntomas secundarios, concluyendo que la quinfamida es una buena opción para el tratamiento de la amibiasis intestinal no disentérica. Otro factor que debe considerarse para su posible uso en rumiantes, es la facilidad en la aplicación del tratamiento bajo condiciones de campo, por ejemplo la etofamida presenta la desventaja de que debe aplicarse por 3 o 5 días consecutivos a diferencia de la quinfamida que sólo se aplica una vez en dos tomas.

Evaluaciones con secnidazol Estudios efectuados en humanos para el tratamiento de infestaciones fuertes de Entamoeba histolytica, parásito que en ocasiones, además de invadir el intestino grueso, puede infestar órganos como el hígado, pulmón y cerebro, demuestran que el tratamiento con secnidazol, a dosis de 30 mg kg-1 de peso vivo en una dosis única, han presentado una efectividad del 85.19%, la cual es muy alta si se considera que cuando

un protozoarios migra del intestino delgado a otros órganos es muy difícil de erradicar (Latham et al., 2000).

Terashima et al. (2000) reportan una efectividad del 100% para el control de amibiasis intestinal aguda utilizando 2 g de secnidazol en dosis única y 1.5 g para amibiasis hepática, aunque es posible, que dosis elevadas de secnidazol produzcan efectos secundarios como las glositis (inflamación de la lengua), irritación del tracto gastrointestinal, vómito, nauseas, diarreas, disminución del apetito y en casos raros orina oscura. Alvar (2001), determinó que para el control del protozoario flagelado intestinal Giardia intestinales, la administración de una dosis única de 2 g de secnidazol tiene alta efectividad. Estudios realizados con el secnidazol en animales de laboratorio han demostrado, que una dosis de 30 mg kg-1 de peso vivo por vía oral y en dosis única es suficiente para el tratamiento de amibiasis cólica disentérica e invasora sin que se presenten efectos secundarios (Latham et al., 2000).

Mecanismos de acción del secnidazol Los nitroimidazoles que incluyen al metronidazol, tinidazol, ornidazol y secnidazol son profármacos de acción tisular. El secnidazol, posee una toxicidad selectiva sobre organismos anaeróbicos y células hipóxicas o anóxicas, debido a que se activa en el interior de las células sensibles reduciendo su grupo nitro, que a su vez, sustituye o reacciona con la ferrodoxina del parásito, formando un compuesto reactivo que interfiere en el transporte de electrones, inhibe la síntesis de ADN ó lo hidroliza,

haciéndole perder su estructura helicoidal. Este grupo de fármacos poseen actividad contra protozoarios y algunas bacterias, el espectro antibacteriano y antiprotozoario de los

nitroimidazoles

incluyen

microorganismos

como:

Bacteroides

fragilis,

Fusobacterium, Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Gardenella vaginalis, Helicobacter pylory, Entamoeba histolitica, Giardia lamblia, Tricomona vaginalis. (Ciencia Fisiológica, 2000).

El secnidazol es administrado comúnmente por vía oral, se absorbe en el intestino delgado y se difunde vía sanguínea en los tejidos, parte de la droga que no es absorbida y de los metabolitos absorbidos por diferentes tejidos son eliminados por la bilis, lo que permite una acción parcial contra parásitos presentes en la luz intestinal. Debido a su rápida asimilación, la concentración sérica del secnidazol es elevada entre 48 y 72 horas después de administrar una dosis única de 2 g por vía oral (Aventis 2001). Estudios clínicos reportan una efectividad en pacientes con colitis amibiana no disentérica y en giardiasis, superior a la de otros fármacos, al igual que en la tricomoniasis. Este medicamento se presenta comercialmente en comprimidos de 500 mg y se recomienda una dosis única de 2 g para el tratamiento de amibiasis y giardiasis (Álvarez et al., 1988).

Farmacocinética del secnidazol Después de la administración oral única de 2 g de secnidazol en forma de comprimidos de 500 mg, los niveles séricos máximos del fármaco se presenta a las 3 h, la vida media

en plasma del producto es de alrededor de 25 h. La eliminación es lenta y principalmente vía orina (alrededor del 50% de la dosis ingerida se excreta en 120 horas).

secnidazol,

actúa

reduciendo

enzima

piruvato-ferredoxin-

oxidorreductasa del parásito, también actúan como aceptor de electrones uniéndose de forma covalente a las moléculas del ADN provocando la pérdida de su estructura helicoidal, con la consiguiente muerte del trofozoíto. Además, son capaces de inhibir la respiración del trofozoíto y liberan radicales tóxicos que reaccionan con componentes celulares esenciales de G. lamblia.

Existen otros fármacos del grupo de los nitroimidazoles como por ejemplo: metronidazol, timidazol, ornidazol (Álvarez et al., 1988) que por su efectividad también podían ser utilizados como desfaunantes. Aunque en la literatura consultada no se encontraron trabajos efectuados con rumiantes, es de interés estimar si los fármacos antiprotozoarios para uso en humanos, tienen efecto tóxico sobre los protozoarios ruminales. Es importante destacar que estos productos presentan una efectividad cercana al 100% sobre protozoarios de alta resistencia presentes en el tubo digestivo y mínima presencia de efectos secundarios, lo que sustenta el objetivo de evaluar su efectividad para producir una desfaunación ruminal sin que se afecte negativamente la salud del animal.

MATERIALES Y MÉTODOS

1) Ubicación geográfica del estudio

El presente trabajo de investigación se desarrolló en las instalaciones de la granja experimental y laboratorio de microbiología aplicada a producción animal del Programa de Ganadería, IREGEP, del Colegio de Postgraduados, ubicada en Montecillo, Texcoco, Estado de México.

2) Desarrollo de un medio de cultivo testigo para la sobrevivencia de protozoarios

Con la finalidad de contar con un medio de cultivo anaerobio que permitiera la sobrevivencia de protozoarios por al menos 72 h, con una concentración de 103 ó 104 protozoarios por mL de medio, se evaluó mediante pruebas de ensayo-error la adición de la fracción soluble e insoluble en agua de avena, alfalfa, pastos kikuyo (P. clandestinum) o leche en polvo, además se evaluó el efecto de la adición de acetato de sodio al 1.5 % (Dehority, 1998), penicilina y estreptomicina, así como también se prepararon medios con o sin 0.1% de agar. Los medios fueron preparados usando la técnica anaeróbica descrita por Hungate (1950). Los componentes del medio de cultivo GCA-FR se describen en el cuadro 10.

Cuadro 10. Composición del medio cultivo base (GCA-FR) para crecimiento y supervivencia de protozoarios. Compuesto Cantidad por cada 100 mL de medio Agua destilada 47.42 mL Líquido ruminal clarificado (1) 30.0 mL (2) 5.0 mL Solución mineral I Solución mineral II (3) 5.0 mL 5.0 mL Carbonato de sodio, solución 8% (4) (5) 5.0 mL Acetato de sodio, 1.5 % Solución sulfido-cisteína (6) 2.0 mL 0.1 mL Solución rezarsurina al 0.1% (7) Tripticasa-peptona 0.20 g Extracto de levadura 0.10 g Glucosa 0.06 g Celobiosa 0.06 g Almidón 0.06 g (1) Líquido ruminal clarificado previamente filtrado en una gasa triple y centrifugado a 10, 000 rpm, por 15 minutos a 4 °C, esterilizado 20 minutos a 15 psi, 121°C; (2) Conteniendo (por 1000 mL) 6 g de K2HPO4; (3) Conteniendo (por 1000 mL) 6 g de * KH2PO4; 6 g (NH4)2SO4; 12 g NaCl; 2.45 g MgSO4 y 1.6 g de CaCl2 H2O; (4) 8 g de carbonato de sodio en 100 mL de agua destilada; (5) 1.5 g de acetato de sodio en 100 mL de agua destilada; (6) 2.5 g de L–cisteína (disuelta en 15 mL de 2N NaOH) + 2.5 g de Na2S-9H2O (en 100 mL de H2O); (7) 0.1 mL de resazurina en un volumen final de 100 mL, calentado hasta que el indicador pierde su coloración y esterilizado.

Para cada sustrato, (avena, alfalfa, kikuyo y leche en polvo) se procedió de la siguiente manera. En tubos de ensayo de 18 X 150 mm se adicionaron 9.5 mL de medio de cultivo GCA-FR a los cuales se agregaron 0.1 g del sustrato alimenticio o 0.10 a 0.15 mL de la fracción soluble en agua de los mismos, además 20000 UI de penicilina y 25 mg de estreptomicina al medio de cultivo (cantidades previamente evaluadas que permiten mantener cierta concentración de bacterias viables en los medios de cultivo sin que lleguen a constituir la población microbiana dominante). Se evaluó también el efecto que tiene la posición de tubo al momento de incubarlos, haciendo pruebas con medios acomodados verticalmente u horizontalmente con 10º de inclinación en charolas construidas especialmente para este fin.

Obtención de la fracción soluble Para la obtención del extracto soluble de los sustratos evaluados, se pesaron 2 g (Base seca) y se colocaron en tubos de ensayo (18 X 150 mm), se agregaron 20 mL de agua destilada, después se agitaron en un vortex durante 3 minutos y se dejaron reposar por 30 minutos. Posteriormente se obtuvo el sobrenadante (fracción soluble), se colocaron en tubos de ensayo (13 X 100 mm). Este método también se utilizó para obtener la fracción soluble de las plantas que se evaluaron para estimar su capacidad desfaunante.

Obtención del concentrado de protozoarios viables Se obtuvieron 250 mL de fluido ruminal de borregos alimentados con una dieta a base de concentrado (20%) de paja de avena (80%), mediante una sonda esofágica, posteriormente se depositaron 10 mL de fluido ruminal en un tubo de ensayo de 18 X 150 mm que contenía 9.0 mL de medio de cultivo base (GCA-FR, Cuadro 10). Para obtener el concentrado de protozoarios viables, se dejó sedimentar la muestra durante 15 minutos en baño María a 39 ºC, para evitar la muerte de protozoarios por enfriamiento. Después se retiró el sobrenadante (aproximadamente 16 mL) y el material precipitado (masa blanquecina) representó el concentrado de protozoarios que se utilizó como inóculo.

Técnica de inoculación de los medios de cultivo Los tubos con cada medio de cultivo anaerobio adicionado con el sustrato alimenticio a evaluar, se mantuvieron en baño María a una temperatura de 39 ºC, con la finalidad de mantener una temperatura similar a la del ambiente ruminal. La inoculación de los

medios de cultivo con el concentrado de protozoarios viables (0.5 mL), se realizó bajo flujo de CO2, para mantener un ambiente de anaerobiosis. Posteriormente, para el conteo de protozoarios se homogenizo el medio y se retiró un mL de medio de cultivo inoculado a las 0, 24, 48 y 72 h bajo flujo de CO2. Para efectuar el conteo y determinar la concentración de protozoarios existentes en el medio de cultivo se utilizó una cámara Neubauer y un microscopio de contrastes (Zeiss) a 400 magnificaciones totales para cada tiempo de conteo, también se tomó una muestra de 2 mL del medio de cultivo para determinar el pH mediante un potenciómetro (Orión 250A).

Procedimiento de conteo de protozoarios El procedimiento para conteo de protozoarios fue el siguiente: con una pipeta Pasteur se extrajo de 0.5 mL a 1 mL de medio inoculado con protozoarios y se llenaron las dos cámaras Neubauer por capilaridad, posteriormente se observaron en un microscopio de contraste de la marca Zeiss (objetivo 40X). El conteo se realizó primeramente en la cámara uno, registrando el numero total de los protozoarios de los nueve cuadros. El mismo procedimiento se hizo en la cámara dos, en total se contaron los protozoarios de 18 cuadros. El número de protozoarios por mL de medio de cultivo se estimó de acuerdo con la siguiente fórmula: Protozoarios mL-1 = (Promedio de las cámaras) (104)

Al momento de realizar el conteo, se diferenciaron entre protozoarios vivos y muertos, con la finalidad de determinar el porcentaje de viabilidad en los medios de cultivo evaluados. Los conteos se realizaron por triplicado de cada tratamiento evaluado, y los resultados se calcularon y analizaron estadísticamente mediante el programa Microsoft

Excel

procedimiento

mediciones

repetidas

Wilcoxon

(SAS,

1999),

respectivamente.

3) Capacidad desfaunante in vitro de las plantas seleccionadas Mediante esta prueba se pretendió demostrar la capacidad desfaunante de la fracción soluble e insoluble en agua de cada planta, para lo cual, se siguió el procedimiento descrito anteriormente.

Área de colección de material vegetal Las muestras de plantas, se recolectaron en la región de Texcoco y en los Estados de Chiapas y Tabasco. Se recolectaron un total de 15 plantas (ver cuadro 11).

Cuadro 11. Nombre común y científico de las plantas evaluadas. Nombre común Nombre científico Avena Avena sativa Bacaris Baccharis vaccinioides Montanoa Montanoa leucanta Verbesina Verbesina perymenioides Buddleia Buddleia cordata Morera Morus alba Tulipán Hibiscus rosa-sinesis Yuca Yucca schidigera Yuca Maninot esculenta Kikuyo Penicetum clandestinum Hierbabuena Mentha piperita Chicalote Argemone mexicana Epazote Chenopodium ambrosioides Manrrubio Marrubium vulgare Tolohache Datura inoxia Pino Pinus sp

Todas las muestras se deshidrataron por un período 72 horas en estufa de secado a 60º C hasta obtener una humedad constante de 10 a 20%, posteriormente se molieron en un molino Willey (criba de 1 mm) y se almacenaron en recipientes de vidrio hasta su posterior uso.

Condiciones de cultivo y tratamientos La capacidad desfaunante in vitro de cada planta se analizó por triplicado, haciendo conteos de protozoarios con el uso de la cámara Neubauer mediante la técnica anteriormente descrita. Las concentraciones totales como el porcentaje de viabilidad de los protozoarios se determino a las 0, 24, 48 y 72 h después de haber adicionado 150 µL de extracto soluble ó 0.1 g del extracto insoluble de cada planta. Los medios inoculados se incubaron a una temperatura de 39º C y siempre se manipularon bajo flujo de CO2. Los diferentes muestreos se realizaron lo más rápido posible para evitar que el medio se enfriara y se produjera la muerte de protozoarios.

El tratamiento testigo consistió en adicionar al medio de cultivo base (9.5 mL) 150 µL de extracto soluble de avena, 20000 UI de penicilina y 25 mg de estreptomicina, inoculado 0.5 mL del concentrado de protozoarios. Cada 24 horas a partir de la hora inicial se efectuó el conteo de protozoarios, en un cuarto tubo (para cada tratamiento) se retiraba la cantidad de 2 mL para determinar el pH de medio a las diferentes horas de muestreo. Los tratamientos desfaunantes fueron similares al tratamiento testigo, pero en lugar de adicionar avena, se adicionó 150 µL del extracto soluble de cada planta ó 0.1 g de la fracción insoluble. Los extractos tanto solubles e insolubles en agua de cada planta, en

todos los casos, se adicionaron únicamente a la hora 0. El procedimiento de conteo de protozoarios fue similar al descrito anteriormente.

4) Capacidad desfaunante in vitro e in vivo de los fármacos antiprotozoarios

Obtención del fármaco La quinfamida se obtuvo en forma de sal pura (Lab. Química Alkano, S.A.), el secnidazol y la etofamida se compraron en su presentación comercial en una farmacia.

Dosis desfaunante La dosis toxica de los fármacos secnidazol, quinfamida, etofamida, fueron avaluadas por separado en un medio de cultivo similar al testigo (con avena) donde se adicionó 150, 300 µg de quinfamida, 0.65 mg de etofamida ó secnidazol por cada 10 mL del medio de cultivo inoculado. Todos los medio inoculados se incubaron a 39º C. La evaluación se realizó por triplicado, y un cuarto tubo de cultivo inoculado se utilizó para determinar cambios en el pH del medio. Los conteos de protozoarios se realizaron a las 0, 24, 48 y 72 horas posteriores a la adición de inóculo concentrado de protozoarios.

Una vez que se comprobó el efecto desfaunante del secnidazol a dosis elevada (0.65 mg), en una evaluación posterior se probaron dosis menores 0.65, 0.325, 0.1625 y 0.08125 mg de secnidazol en 10 mL de medio de cultivo, con la finalidad de estimar la dosis mínima efectiva del fármaco.

Efecto sobre la degradación de sustratos del secnidazol Con la finalidad de evaluar si el fármaco que presentó actividad desfaunante (secnidazol) afectaba la degradación bacteriana de ingredientes de uso común en la formulación de dietas para rumiantes, se realizó la siguiente prueba.

En tubos de ensayo de 18 X 150 mm (por triplicado) se adicionó 0.05 g de maíz, alfalfa, soya o rastrojo de maíz, previamente esterilizados, se agregaron 9 mL del medio (Cuadro 12), bajo flujo de CO2, de acuerdo a Hungate (1950) y Cobos y Yokohama (1995). La degradabilidad bacteriana de los sustratos se midió a las 0, 24, 48 y 72 horas de incubación a 39 ºC, después de inocular con 1 mL de fluido ruminal fresco bajo flujo de CO2. Los tratamientos consistieron en adicionar secnidazol (0.65 mg) o no (testigo) a cada sustrato inoculado. Los diferentes tratamientos se realizaron por triplicado y se preparó un blanco (medio sin sustrato) para restar el material adicionado al momento de la inoculación (masa bacteriana y partícula de alimento del líquido ruminal). Cuadro 12. Composición del medio para determinar degradación de sustrato. Compuesto Cantidad por cada 100 mL de medio Agua destilada 52.6 mL Líquido ruminal clarificado (1) 30.0 mL 5.0 mL Solución mineral I (2) (3) Solución mineral II 5.0 mL Carbonato de sodio, solución 8% (4) 5.0 mL 2.0 mL Solución sulfido-cisteína (5) (6) 0.1 mL Solución rezarsurina al 0.1% Tripticasa-peptona 0.2 g Extracto de levadura 0.1 g (1) Líquido ruminal clarificado previamente filtrado en una gasa triple y centrifugado a 10, 000 rpm, por 15 minutos a 4 °C, esterilizado 20 minutos a 15 psi, 121°C; (2) Conteniendo (por 1000 mL) 6 g de K2HPO4; (3) Conteniendo (por 1000 mL) 6 g de * KH2PO4; 6 g (NH4)2SO4; 12 g NaCl; 2.45 g MgSO4 y 1.6 g de CaCl2 H2O; (4) 8 g de carbonato de sodio en 100 mL de agua destilada; (5) 2.5 g de L–cisteína (disuelta en 15 mL de 2N NaOH) + 2.5 g de Na2S-9H2O (en 100 mL de H2O); (6) 0.1 mL de resazurina en un volumen final de 100 mL, calentado hasta que el indicador pierde su coloración y esterilizado.

Una vez concluidos los diferentes tiempos de incubación (0, 24, 48 y 72 h) se filtró el material residual en papel filtro Whatman No 541 (previamente pesado), con ayuda de una bomba de vacío. Para medir material residual (no degradado), se seco en una estufa por 24 horas hasta peso constante, después se pesó el residuo en una balanza analítica, el porcentaje de sustrato no degradado se calculó por medio del programa Microsoft Excel.

Efecto sobre concentración de bacterias totales y celulolíticas Para estimar si el secnidazol también tiene efectos tóxicos en bacterias ruminales, se estimó la concentración de bacterias totales y celulolíticas a las 48 h después de la incubación en cada uno de los sustratos evaluados (maíz, alfalfa, soya y rastrojo de maíz) con o sin la adición de secnidazol (0.65 mg en 10 mL de medio), se utilizó el medio de cultivo anaerobio (GCA-FR) para bacterias totales y para celulolíticas, se sustituyó el contenido de glucosa, celobiosa y almidón por una tira de papel Whatman como fuente única de carbohidratos (Cobos y Yokohama, 1995), todos los medios se prepararon mediante técnicas de anaerobiosis. Todos los medios se inocularon (0.5 mL) con fluido ruminal fresco de borregos alimentados con una dieta a base de concentrado (20%) y paja de avena (80%). Se incubaron a 39 ºC y se estimó la concentración de bacterias totales a las 48 h y a los 10 días, para celulolíticas mediante la técnica del NMP (Harrigan y Mc Cance, 1979).

Capacidad y dosis desfaunante in vivo del secnidazol Seis borregos criollos machos de 22 kg de peso promedio, recibieron una dieta a base de concentrado (20%) y paja de avena (80%). A tres animales se les suministró por sonda esofágica 2000 mg de secnidazol disueltos en 500 mL de agua. Posteriormente por la misma vía se extrajo a todos los animales 200 mL de fluido ruminal a las 0, 6, 12, 24, 48, 72, 120 y 168 h después de aplicar el tratamiento, con la finalidad de medir la concentración de protozoarios y detectar el efecto desfaunante con relación al tiempo de aplicación del fármaco. A las muestras de líquido ruminal colectadas se les adicionó solución para conteo de protozoarios (3:3 vol:vol); compuesto de 100 mL de agua destilada más 5 mL de solución mineral I y II. Además de 200 µL de formaldehído (37%), se homogenizaron las muestras y se procedió al conteo de protozoarios (Dehority, 1984), así como también, se midió pH en el liquido ruminal.

Diseño y análisis estadístico Todos los tratamientos tuvieron un diseño completamente al azar. La evaluación del medio de cultivo anaerobio, así como la capacidad desfaunante in vitro de los fármacos y las plantas se analizaron mediante el procedimiento de mediciones repetidas de Wilcoxon (SAS, 1999). Todas las medias fueron comparadas por medio de la prueba de Tukey (Steel y Torrie, 1988).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Medios de cultivo anaerobios para el crecimiento y sobrevivencia de protozoarios El método utilizado para concentrar protozoarios a partir de fluido ruminal fresco y el medio de cultivo anaerobio (cuadro 11) adicionado con la fracción soluble de diferentes sustratos, resultó adecuado para mantener una buena concentración y viabilidad de los protozoarios ruminales. En el cuadro 13 se puede notar que al inicio la concentración y proporción de protozoarios viables fue similar (P > 0.05) entre los diferentes tratamientos. Sin embargo, a medida que aumentó el tiempo de incubación, se observaron reducciones en la concentración de protozoarios viables en todos los tratamientos. A partir de las 24 h de incubación el medio de cultivo con leche en polvo fue en el que se redujo en mayor medida (P<0.05) la concentración y viabilidad de los protozoarios. A las 48 h de incubación la disminución en el porcentaje de viabilidad fue menor (P<0.05) en los medios con avena que en los que contenían kikuyo, alfalfa y leche. A final del período de incubación (72 h) se encontró que los medios adicionados con avena y alfalfa fueron los que mantuvieron una mayor viabilidad de protozoarios, comparados con el kikuyo y la leche. En este último sustrato, no se determinó la presencia de protozoarios a las 72 h de incubación. Cuadro 13. Evaluación de medio de cultivo anaerobio y sustratos sobre concentración (104 mL-1) y viabilidad (%) de protozoarios ruminales. Tiempo (h)

a,b,c,d

O 24 48 72

Avena [] 0.89 0.44 0.19 0.082

% 97a 85a 65a 40b

Alfalfa [] 0.72 0.38 0.13 0.085

% 93a 62b 44b 59a

Kikuyo [] % 0.70 0.25 0.074 0.097

95a 66b 21c 24c

Leche [] 1.0 0.22 0.88 0

Valores con diferente letra en la misma hilera, son diferentes (P < 0.05); [ ]:Concentración de protozoarios

% 93a 48c 25c 0d

En evaluaciones posteriores solo se, utilizó la fracción soluble de la avena y la alfalfa (ver cuadro 14), la adición de agar al medio de cultivo no causó diferencias (P<0.05) en la concentración y proporción de protozoarios viables en los tratamientos y tiempos de conteo (0, 24, 48 y 72 h), lo que indica que el desarrollo de protozoarios ruminales no se beneficia con la adición de agar al medio. Se confirmó mediante observaciones al microscopio que los sustratos utilizados favorecieron una alta concentración de protozoarios y la continuidad de su reproducción por división asexual a través de los diferentes períodos de incubación; lo que puede ser interpretado como una adaptación de los protozoarios al medio utilizado. Cuadro 14. Evaluación de medio de cultivo anaerobio y sustratos sobre concentración (104 mL-1) y viabilidad (%) de protozoarios ruminales. Tiempo (h)

O 24 48 72

Avena * [] % 0.83 0.51 0.58 0.32

98a 92a 93a 89a

Alfalfa * [] % 1.5 0.53 0.47 0.35

97a 88a 95a 96a

Avena ** [] % 1.4 0.38 0.84 0.63

97a 96a 96a 94a

Alfalfa ** [] % 1.1 0.44 0.61 0.56

96a 94a 92a 92a

Valores con diferente letra en la misma hilera, son diferentes (P < 0.05); [ ]:Concentración; * Medio con agar; ** Medio sin agar.

A diferencia del estudio de Fondevila y Dehority (2001), donde se reporta el desarrollo de un medio de cultivo especifico para cierta clase de ciliados (Entodinium sp), con el medio utilizado se observó el crecimiento de protozoarios tanto de la familia Entodinomorphida como Isotrichidae, por tanto, los medios evaluados en esta investigación permiten mantener poblaciones múltiples de ciliados. Considerando que la avena es un sustrato menos variable en su composición química que la alfalfa, se decidió utilizarla como tratamiento testigo en las siguientes evaluaciones.

Capacidad desfaunante in vitro de las plantas evaluadas Efecto de la fracción soluble en agua sobre protozoarios ruminales Efecto en la concentración de protozoarios El análisis estadístico de mediciones repetidas indicó que existen diferencias en las concentraciones de protozoarios por mL de medio de cultivo, entre plantas y por tiempo de incubación como se presenta en el cuadro 15, donde se observa la población total de protozoarios totales en los diferentes períodos de incubación. Cuadro 15. Efecto de la fracción soluble de las plantas evaluadas sobre la concentración (104 mL-1) por mL de protozoarios totales. Tratamiento Avena sativa (Testigo)

0 6.7b

Hora de incubación 24 48 4.7b 2.1b

72 1.0c

Argemone mexicana

1.1de

5.3ab

0.03e

0.07f

Baccharis vaccinioides

2.5c

2.2e

1.2cd

0.32e

Buddleia cordata

2.0cd

1.9e

1.2cd

0.31e

Chenopodium ambrosioides

1.7d

0.55g

0.06e

Datura inoxia

1.4d

3.2d

3.1a

1.6b

Marrubium vulgare

1.6d

0.37g

0.14e

0.04f

Mentha piperita

1.5d

0.47fg

0.04e

0.04f

Montanoa leucanta

2.3c

1.6ef

0.72de

0.42de

Morus alba

7.0b

7.4a

1.7dc

1.1c

Pinus sp

1.7d

2.3e

2.1ba

1.1c

Verbesina perymenioides

2.5c

1.5ef

0.9cde

0.38e

Maninot esculenta

2.6c

3.9cd

3.4a

3.2a

Yucca schidigera*

3.7c

1.3ef

0.17e

0.005f

Coeficiente de variación

3.2

7.9

8.9

6.7

abcdefg

Distinta letra en la misma columna son diferentes (P< 0.05).* Contiene polietilenglicol y benzoato de sodio.

La alta concentración de protozoarios mantenida durante los distintos períodos de incubación en el tratamiento testigo confirma la efectividad del medio de cultivo base

(MCB) para mantener a estos microorganismos en forma viable. Varias de las plantas evaluadas presentaron una reducción significativa (P<0.05) en la concentración de protozoarios ó mantuvieron una concentración similar con respecto al testigo. La reducción en la concentración de protozoarios en dichas plantas, es mas probable que se deba a una baja disponibilidad de nutrientes requeridos por los protozoarios, más que aun efecto desfaunante. Sin embargo, en algunas plantas la diferencia estadística fue mayor numéricamente por ejemplo, en el extracto soluble de Y. schidigera.

En el estudio de Espinosa (1999), se reporta una capacidad desfaunante a partir de las 24 h de incubación en medios de cultivo in vitro, así también, determinaron la composición química de las plantas V. perymenioides, B. vaccinioides, M. leucanta, B. cordata y Sesbania sesban. Como podemos observar en el cuadro 16, hay diferencias en la composición química nutritiva de cada planta, también se observa que, a medida que aumenta el contenido de paredes celulares y lignocelulosa, se reduce la digestibilidad de la planta, lo que podría provocar reducción de nutrientes disponibles para un período mayor de tiempo (48 o 72 h), y que coincide con el tiempo en el cual estas plantas presentaron una eliminación total de protozoarios. Aunque el contenido de PC en las plantas es aceptable para la nutrición animal, estas plantas también contienen elevadas cantidades de paredes celulares, lignocelulosa, lo que reduce fuertemente la proporción de carbohidratos solubles, que son indispensables para el crecimiento y sobrevivencia de los protozoarios del rumen.

Cuadro 16. Características nutritivas de plantas con capacidad desfaunante. Composición química V. B. M. B. perymenioides vaccinioides leucanta cordata Materia Seca (MS) 94.7 94.5 93.1 92.9 Proteína Cruda (PC) 12.4 15.8 21.9 7.5 Paredes celulares 39.2 41.1 51.1 48.8 Lignocelulosa 37.7 37.2 47.6 39.9 Digestibilidad 59.7 54.6 56.9 65

S. sesban 93.3 22.2 32.7 21.6 64.1

Espinosa, 1999.

Por lo anterior y con la finalidad de no confundir un efecto desfaunante con un efecto de falta de nutrientes, se clasifica como planta con mediana capacidad desfaunante (MCD), a aquellas que redujeron la concentración de protozoarios en 103 mL-1 de medio, y como plantas con alta capacidad desfaunante (ACD), a aquellas que redujeron la concentración de protozoarios en 102 mL-1 de medio o menos. De esta manera a las 24 h sólo 3 plantas mostraron MCD: C. ambrosioides, M. vulgare y M. piperita. A las 48 h, 4 plantas presentaron MCD: M. vulgare, M. leucanta, V. perymenioides y Y. schidigera, e inicia a detectarse la presencia de plantas con ACD en A. mexicana, C. ambrosioides y M. piperita. A las 72 h de incubación estas plantas mantienen su ACD y se suman otras dos: M. vulgare y Y. schidigera. Tanto M. leucanta como V. perymenioides se reportan como desfaunantes (Espinosa, 1999). Sin embargo, como se puede ver existen plantas con una mayor capacidad desfaunante.

Cabe hacer mención que con la yuca comercial (M. esculenta) la concentración de protozoarios fue superior al tratamiento testigo, mientras que con la yuca (Y. schidigera) que se utiliza para el tratamiento de malos olores en explotaciones porcinas se observó capacidad desfaunante. Este producto contiene además de Yuca, polietilenglicol y

benzoato de sodio, por lo que se estima que estos productos tienen efecto desfaunante. Esta suposición se basa en el hecho de que una amplia gama de productos químicos utilizados como agentes desfaunantes, contienen polipropilenglicol y otros alcoholes sintéticos (Williams y Coleman, 1992).

Efecto en la viabilidad de los protozoarios En la mayoría de los estudios de desfaunación, la metodología que se usa para conteo de protozoarios incluye el tratamiento de la muestra en una solución que contiene glutaraldehído (Dehority, 1984; Bird et al., 1994; Fondevila y Dehority, 2001). La fijación con glutaraldehído, tiene por objeto mantener la integridad de la célula hasta por 30 días en refrigeración o a temperatura ambiente, hasta su lectura. La desventaja de la fijación con glutaraldehído, es que mata al instante a todos los protozoarios de manera que no es posible, distinguir que porcentaje de la concentración total de protozoarios estaba viva o viable en la muestra. En este estudio, no se fijaron las muestras con glutaraldehído, por lo que se pudo observar y cuantificar la cantidad de protozoarios viables durante los diferentes períodos de incubación. En el cuadro 17 se indica la proporción y concentración de protozoarios que se encontraban vivos al momento de realizar el conteo de protozoarios incubados con las diferentes fracciones solubles de las plantas evaluadas.

Cuadro 17. Porcentaje y concentración (104 mL-1) de protozoarios viables y pH en medios de cultivo adicionados con la fracción soluble de las plantas evaluadas. Tratamiento

[]

Hora de incubación 24 48 % [] pH % []

98ª

6.6

6.9

96ª

0 Testigo

4.5

6.7

92ab

1.9

6.7

85cd ab

72 []

0.84

6.7

0.07

6.6

A. mexicana

97ª

1.2

6.9

91ª

4.8

6.6

100ª

0.03

6.6

100

B. vaccinioides

92ª

2.3

7.0

86ab

1.9

6.9

68c

0.82

6.9

41f

0.13

6.9

7.1

6.9

0.22

6.8

6.6

B. cordata

95ª

1.9

1.5

6.9

ab d

1.0

C. ambrosioides

98ª

1.6

6.8

0.48

6.7

0.03

6.5

D. inoxia

94ª

1.3

6.9

98ª

3.1

6.6

92ab

2.9

6.6

88bcd

6.9

6.7

M. vulgare

98ª

1.6

0.33

0.11

6.5

1.4

6.6

0.02

6.6

0.02

6.7

0.25

6.6

0.99

6.6

M. piperita

94ª

1.4

6.9

94ª

0.44

6.8

100ª

0.04

6.7

M. leucanta

98ª

2.2

7.1

91ab

1.46

6.8

82ab

0.59

6.7

60e

1.5

6.7

2.0

6.6

97abc

M. alba

94ª

6.6

6.9

6.7

6.8

Pinus sp

96ª

1.6

6.8

95ab

2.2

6.6

93ab

6.6

V. perymenioides

M. esculenta

96ª 97ª b

Y. schidigera*

Coef. de variación

2.3

2.4 2.5 2.2

7.0

87ª

6.9

98ª

6.9

4.2

1.3 3.8 0.13

6.7 6.7

97ª c

4.9

0.78 3.3 0.09

6.7 6.6 6.7

abc

1.1

6.6

0.23

6.7

abc

3.1

6.5

6.6

60 97

4.9

a b c d e f g Distinta letra en la misma columna son diferentes (P< 0.05); [ ]: Concentración de protozoarios.* Contiene polietilenglicol y benzoato de sodio.

A las 24 h, cuatro plantas presentaron MCD, la diferencia con la clasificación que se realizó considerando la concentración total de protozoarios (cuadro 15) es que se suma a esta lista la Y. schidigera. A las 48 h de incubación, cuatro plantas presentaron MCD: B. vaccinioides, M. vulgare, M. leucanta y V. perymenioides y otras cuatro ACD: A. mexicana, C. ambrosioides, M. piperita y Y. schidigera. Finalmente a las 72 h de incubación se estableció una ACD en la fracción soluble en agua de cinco plantas: A. mexicana, C. ambrosioides, M. vulgare, M. piperita y Y. schidigera. En comparación con la clasificación realizada con base a la concentración total de protozoarios (cuadro 15),

la clasificación de MCD y ACD con base a la concentración de protozoarios viables es más estricta. De acuerdo a estos resultados, se puede ver con más claridad el efecto desfaunante de algunas de las plantas evaluadas. En caso de la Y. schidigera la disminución en la viabilidad de los protozoarios fue más marcada (60, 10, 5 y 0% a las 0, 24, 48 y 72 h, respectivamente). Para la planta C. ambrosioides la disminución en la viabilidad de protozoarios fue menos acelerada, hasta las 48 h se determinó una disminución del 50% de viabilidad, pero a las 72 h no se detectó la presencia de protozoarios viables en el medio. De acuerdo a los valores de pH estimados en las diferentes horas de incubación, se estima que el pH de los medios (6.6 a 7.0), se mantuvo valores dentro del rango óptimo (Hobson y Jouany, 1988), por lo que, la disminución en el porcentaje de viabilidad en los diferentes tratamientos no se asoció con efectos negativos del pH.

La capacidad desfaunante de las plantas evaluadas, se asocia a la presencia de compuestos químicos tóxicos presentes de forma natural. Semarnap-Procymaf (2000) indica, por ejemplo que la chicalota (A. mexicana) es una planta toxica para el ganado por el contenido de alcaloides tóxicos como berberina, protopina, argemonima, sanguinarina, dihydro-sanguinarina y celeriterina. En el epazote (C. ambrosioides) se señala la presencia de compuestos antihelmínticos, antitripanosoma y amebicida conocidos como monoterpentenos (ascaridole) y aceites esenciales, para la hierbabuena (M. piperita) se reportan más de 100 compuestos químicos con amplia variedad de efectos (antibacterial, antiviral, antifungal y vermífugo). Entre los identificados se encuentran aceites esenciales como mentol, mentona, metil-esteres y monoterpentenos (puleguna, piperitona, mentofurano y jasmona). En bacaris (B.

vaccinioides) se indica la presencia de taninos y en Verbesina (V. perymenioides) de saponinas más taninos (Espinosa, 1999). Así también se ha observado que la fracción soluble en agua de la Yuca (Y. schidigera) contiene una alta concentración de saponinas, resveratrol (3,4,5 trihydroxistilbeno), fenoles, 3,3,5,5, tetrahidroxi-4metoxitilbeno y yucaols A y C. (Sen et al., 1998).

Efecto de la fracción insoluble de plantas sobre la concentración y viabilidad de los protozoarios. Se evaluó la fracción insoluble en agua, esperando encontrar en esta fracción compuestos capaces de eliminar protozoarios ruminales, en el Cuadro 18 se presentan algunos efectos sobre las concentraciones de protozoarios en cultivos in vitro a los cuales se les adicionó la fracción insolubles en agua de algunas plantas que presentaron efectos desfaunantes en la fracción soluble en agua (Cuadro 15 y 17). Aunque se muestran diferencias estadísticas en la concentración de protozoarios totales, las concentraciones observadas indican MCD en V. perymenioides, M leucanta y Y. schidigera, ya que existió una reducción en la concentración de protozoarios de 104 a 103 mL-1 de medio de cultivo a partir de las 24 h de incubación. Solo la Y. schidigera** (producto comercial que contiene polietilenglicol y benzoato de sodio), mostró ACD, incluso la reducción en la concentración total de protozoarios por mL de medio fue más notable llegando a 0 a las 72 h de incubación. El extracto insoluble en agua de la Y. schidigera, se puede clasificar como MCD, ya que se observó reducción en la concentración de protozoarios, lo que indica que la propiedad desfaunante de la yuca se encuentra en la fracción insoluble en agua. Aunque varias plantas presentaron capacidad desfaunante no es importante, se estima que su utilidad práctica o de campo

puede ser limitada, ya que, se requieren hasta 72 h para que se active el o los compuestos tóxicos para los protozoarios. Dicho tiempo coincide con el tiempo máximo promedio de permanencia de sólidos en rumen, por lo que a medida que se activan los metabolitos tóxicos, también estarán saliendo del rumen. Cuadro 18. Efecto in vitro sobre la concentración de protozoarios totales incubados con la fracción insoluble de diferentes plantas (104 mL-1). Hora de incubación Tratamiento 0

Testigo (Avena sativa)

1.80b

0.90bc

0.80b

Hibiscus rosa-sinesis

7.30a

6.70a

2.50a

1.90a

Verbesina perymenioides

2.40b

0.85bc

1.20b

0.85b

Montanoa leucanta

2.30b

0.52c

0.54c

0.61b

Yucca schidigera

1.20b

0.65c

0.39d

0.14c

Yucca schidigera**

1.30b

0.074d

0.014e

12.2

4.4

6.1

5.7

Coeficiente de variación

Distinta letra en la misma columna son diferentes (P< 0.05). ** Producto que contiene polietilenglicol y benzoato de sodio (aplicado sin retirar la fracción soluble)

a b c d e

Es importante destacar que la fracción insoluble de las plantas V. perymenioides, M. leucanta, presentaron un efecto desfaunante similar al reportado en la fracción soluble en agua (Cuadro 15 y 17) lo que indica que el compuesto tóxico es de estructura bipolar. En cuanto a la proporción de protozoarios viables, no se determinaron efectos negativos del pH, ya que mantuvo valores de 6.3 a 6.9 que no afectan la viabilidad de los protozoarios (Hobson y Jouany, 1988) en el medio de cultivo (ver cuadro 19). Aunque la Y. schidigera, presentó capacidad desfaunante se, estima que dicho efecto puede estar influido por la presencia de polietilenglicol y benzoato de sodio en la harina de esta planta. Sin embargo, Wang et al. (1998), evaluaron in vitro un extracto de saponina proveniente de Y. schidigera (dosis de 0.5 mg mL-1 de medio de cultivo) y

reportaron que la concentración de protozoarios fue reducida drásticamente, aunque no se logró una desfaunación total. En un trabajo similar Klita et al. (1996) evaluaron un extracto de saponina de la alfalfa y reportaron que hubo una reducción lineal en la concentración de ciliados de rumen 16.5 hasta 1.9 X104 protozoarios por mL de fluido ruminal a medida que se aumentó la proporción del extracto en la dieta (0 a 4%). Por lo anterior, es posible que la Y. schidigera tenga un efecto desfaunante debido a la presencia de saponinas, sin embargo, es necesario que se realicen estudios con el extracto soluble o insoluble en agua, que no tenga la presencia de polietilenglicol o benzoato de sodio.

Cuadro 19. Porcentaje y concentración (104 mL-1) de protozoarios viables y pH en medios de cultivo adicionados con la fracción insoluble de las plantas evaluadas. Tratamiento

0 []

Testigo

98ª 1.76 6.9

H. rosa-sinesis

95ª

V. perymenioides

72 []

1.76 6.6

95ª 0.86 6.6

97ª 0.78 6.5

5.8

6.7

80b

2.0

6.6

95ª

99ª 2.37 6.8

98ab 0.83 6.6

100ª

1.2

6.3

98ª 0.83 6.0

M. leucanta

97ª 2.23 6.9

100ª 0.52 6.5

100ª 0.54 6.4

100ª 0.61 6.3

Y. schidigera

75b 0.90 6.8

94ab 0.61 6.6

100ª 0.39 6.7

100ª 0.14 6.6

Y. schidigera**

75b 0.98 6.8

Coef. de variación

5.4

6.9

6.8

Hora de incubación 24 48 [] pH % []

87b

0c 3.9

6.7

3.9

6.6

1.8

6.6

6.5

3.2

Distinta letra en la misma columna son diferentes (P< 0.05)); [ ]: Concentración de protozoarios; ** Producto tal cual que contiene polietilenglicol y benzoato de sodio (aplicado sin retirar la fracción soluble)

abc

En otros estudios se ha reportado capacidad desfaunante de plantas forrajeras y leguminosas como Sesbania sesban (Newbold et al., 1997),

V. perymenioides, M.

leucanta, B. cordata y B. vaccinioides (Espinosa, 1999), al adicionar 150 µL de un extracto soluble de cada planta. En esta investigación también se encontró efecto

desfaunante para V. perymenioides, B. vaccinioides, M. leucanta y B. cordata al adicionar una dosis similar de la fracción soluble en agua a los medios de cultivo. Sin embargo la reducción en la concentración de protozoarios viables o totales fue de 103 mL-1 del medio de cultivo a las 72 h de incubación. Por lo que la capacidad desfaunante de las plantas no es alta y se pueden clasificar como plantas con MCD.

Existen varios trabajos que han evaluado la capacidad desfaunante de leguminosas y arbustivas forrajeras como: Sesbania sesban, Acacia angustissima, A. saligna, Chamaecysticus palmensis, Leucaena pallida (Odenyo et al., 1997; Newbold et al., 1997) Sapindus saponaria (Díaz et al., 1994), donde se adicionaron dichas plantas a una dieta base para animales en sistemas de producción extensivo principalmente como fuente de proteína. Los mismos autores reportan que no hay una eliminación total de protozoarios ruminales, únicamente una reducción en la concentración, similar a lo presentado en algunas plantas evaluadas en esta investigación, que aunque, no tienen uso en producción animal, se ha demostrado su efecto tóxico en humanos (usados como desparasitantes naturales). En este estudio, se observó que A. mexicana, C. ambrosioides, M. vulgare, M. piperita y Y. schidigera presentaron alta capacidad desfaunante (ACD) en los medios de cultivo con efectos considerables sobre la viabilidad de los protozoarios en los diferentes períodos (0, 24, 48 y 72 h) de incubación.

En este estudio se estimó que no todas las plantas tienen propiedades desfaunantes y que la disminución en la concentración de protozoarios puede estar más relacionada con la poca disponibilidad de nutrientes de las plantas. Es importante remarcar que

para clasificar con mayor veracidad la capacidad desfaunante in vitro de plantas, es más recomendable hacer los conteos sobre la concentración de protozoarios viables que sobre la concentración de protozoarios totales. Esta técnica ya ha sido utilizada recientemente en algunas investigaciones donde han mantenido protozoarios viables por más de un mes (Dehority, 1998; Fondevila y Dehority, 2001), con la diferencia de que el medio utilizado en el presente estudio permitió mantener una concentración de protozoarios que incluye tanto Entodinomorfos como Holotrícos.

Capacidad desfaunante in vitro e in vivo de fármacos antiprotozoarios Efecto in vitro sobre la concentración y viabilidad de los protozoarios Como se mencionó en la sección de materiales y métodos se evaluaron 3 fármacos que se utilizan como desparasitantes en humanos. En el cuadro 20 se presenta el efecto in vitro sobre la concentración de protozoarios de la quinfamida, etofamida y secnidazol a diferentes períodos de incubación (0, 24, 48 y 72 h), utilizando diferentes dosificaciones de estos fármacos: 0.30 y 0.83 mg para quinfamida, y de 0.65 mg por tubo de 10 mL de medio de cultivo para etofamida y secnidazol. Cuadro 20. Efecto in vitro sobre la concentración de protozoarios totales incubados con diferentes fármacos antiprotozoarios (104 mL-1). Hora de incubación Tratamiento 0

Testigo (A. sativa)

1.80ab

1.70bc

1.50b

0.88ab

Quinfamida 1

1.30b

1.30c

0.63c

0.30b

Quinfamida 2

1.10b

1.10cd

0.74c

0.45b

Etofamida 3

2.80a

2.90a

2.00b

1.30a

2.90a

1.40e

0.018d

0.018c

4.6

7.8

8.6

Secnidazol

Coeficiente de variación abcde

5.6 4

Distinta letra en la misma columna son diferentes (P< 0.05); : 0.30 mg; : 0.83 mg; : 0.65 mg; .

Se encontraron diferencias estadísticas (P<0.05) con una disminución en la concentración de protozoarios en los diferentes periodos de incubación (0, 24, 48 y 72 h). De acuerdo a los resultados, solamente el secnidazol presentó una ACD, ya que a partir de las 48 h de incubación, redujo la concentración de protozoarios a 102 mL-1 de medio de cultivo. Mientras que la quinfamida sólo disminuyó la concentración de protozoarios totales de 103 mL-1 del medio de cultivo, por lo que se pueden clasificar como fármaco con MCD. En la etofamida, no presento capacidad desfaunante en ninguno de los periodos de incubación evaluados.

Al analizar los datos con base a la concentración de protozoarios viables (cuadro 21), se confirmó que el secnidazol es un fármaco con ACD, pero además, se observó que el efecto inicia desde las 24 h de incubación. En el mismo cuadro se puede observar que el pH de los medios se mantuvo dentro del rango óptimo para el desarrollo de protozoarios (Hobson y Jouany, 1988). Por lo tanto, la disminución en la concentración de protozoarios no fue afectada por el pH de los medios. Cuadro 21. Porcentaje y concentración (104 mL-1) de protozoarios viables y pH en medios de cultivo adicionados con fármacos antiprotozoarios. Tratamiento

0 %

Testigo Quinfamida

[]

96ª 1.72 7.0 1

97ª 1.26 7.2

Hora de incubación 24 48 % [] pH % []

96ª 1.63 6.8 62

72 []

1.30 6.8

85ª 0.75 6.8

0.33 7.2

60b 0.18 7.2

0.81 7.2

Quinfamida2 96ª 1.06 7.3

73b 0.80 7.1

42e

0.31 7.1

50b 0.23 7.2

Etofamida 3

95ª 2.70 6.9

96ª 2.78 6.5

89ª

1.78 6.5

91ª 1.18 6.5

Secnidazol4

92ª 2.66 6.9

3.1

6.6

4.5

6.5

6.8 1

6.6

6.5 2

Distinta letra en la misma columna son diferentes (P< 0.05); : 0.30 mg; : 0.83 mg; : 0.65 mg; : 0.65 mg; [ ]: Concentración de protozoarios.

abcdef

Aunque los fármacos utilizados en esta prueba, no son para uso en animales, la investigación pretendía encontrar un producto con una capacidad de eliminar protozoarios del rumen similar a la que se ha reportado para eliminar infecciones parasitarias en humanos, principalmente amibiasis (Entamoeba histolytica), giardiasis (Giardia lamblia) y triconomiasis (Tricomonas vaginalis) (Álvarez, 1994). Los resultados indican que la efectividad de la quinfamida, etofamida contra protozoarios ruminales no es importante y mucho menos se acerca a la efectividad que estos fármacos han demostrado contra la enfermedades parasitarias en humanos, donde estos derivados nitroimidazólicos de acción intestinal y luminar presentan una efectividad del 92 al 98% con dosis de 1000 y 300 mg día-1 para la etofamida y quinfamida, respectivamente (Aguilar, 1994). Sin embargo, el secnidazol, también pertenece a este grupo de fármacos conocidos como nitroimidazoles. Es posible que la mejor respuesta obtenida con el secnidazol, se deba en parte a que tiene una vida de 19 a 20 horas y mantiene concentraciones séricas importantes por más de 72 h; además de que el fármaco tiene una efectividad del 96 a 98% con una sola dosis, mientras que, en los otros fármacos evaluados (etofamida y quinfamida) se recomienda mantener una dosis por 3 días para lograr la misma efectividad (González, 1989; Aguilar, 1994).

Capacidad desfaunante in vitro del secnidazol De acuerdo a la efectividad mostrada por el secnidazol para eliminar protozoarios ruminales, se decidió estimar el tiempo en que empieza a actuar para disminuir la concentración y viabilidad de los protozoarios; así, como la dosis mínima necesaria (0.08125, 0.1625, 0.325 y 0.65 mg por 10 mL de medio de cultivo) para que se presente una ACD.

Como se puede observar en el Cuadro 22, existe efecto del secnidazol a partir de las 3 h de incubación sobre el porcentaje de protozoarios viables de 37, 43, 1 y 1% para las dosis de 0.08125, 0.1625, 0.325 y 0.65 mg por 10 mL de medio de cultivo respectivamente, en comparación con el tratamiento testigo (94% de viabilidad). Sin embargo, a medida que pasó el tiempo de incubación (48 a 72 h) con las dosis de 0.08125, 0.1625 y 0.325 mg de secnidazol, las concentraciones de protozoarios viables fueron aumentando paulatinamente, sobre todo con la dosis de 0.08125 mg recuperando una viabilidad del 72% que representa una concentración de 1.73X104 de protozoarios vivos en el medio de cultivo. Este aumento sugiere tres posibilidades: 1) que no hay efecto desfaunante severo del secnidazol a las dosis arriba indicada, 2) que los protozoarios se volvieron resistentes al fármaco y 3) que la vida media del fármaco es de solo 24 h.

Cuadro 22. Proporción y concentración (104) de protozoarios viables en medios de cultivo adicionados con diferentes dosis de secnidazol. Tratamiento Hora de incubación 0 %

3 %

[]

97ª 6.21

96ª

6.4

90ª 2.52

Secnidazol(1) 96ª 5.85

37b 2.22

53b 2.49

80b 3.76

90ª 4.41

72b 1.73

Secnidazol(2) 96ª 5.47

43b 2.19

47b 2.30

60c 2.58

49b 1.91

65b 0.72

Secnidazol(3) 97ª 5.72

0.05

10c 0.39

13d 0.39

20c 0.40

46c 0.92

Secnidazol(4) 97ª 5.43

0.05

Coef. variación

5.6

5.4

Distinta letra en la misma columna son diferentes (P< 0.05); :0.65 mg; [ ]: Concentración de protozoarios.

abcde (4)

(1)

7.8

[]

94ª 6.01

mg;

[]

94ª 6.01

2.9

99ª 5.94

Testigo

[]

9.8

: Dosis de 0.08125 mg;

0 (2)

[]

9.5

:0.1625 mg;

(3)

:0.325

Mientras que la dosis de 0.65 mg, presentó una ACD y eliminó los protozoarios ruminales a partir de las 3 h de incubación, causando una total desfaunación a partir de

las 6 h de incubación (ver cuadro 22). A partir de esta prueba se indica que el secnidazol es un agente desfaunante de rápida acción, pero que, se requiere de una dosis de 0.65 mg por 10 mL de medio de cultivo para que mantenga su efecto. La efectividad del secnidazol para eliminar protozoarios del rumen, se encuentra ampliamente relacionada con su efectividad bajo condiciones anaerobias (Levandowsky y Hutner, 1980; Pascuzzo, 2002) reportaron que el modo de acción de los nitroimidazoles (metronidazol, timidazol, ornidazol y secnidazol), sobre microorganismos anaerobios es debido a la reducción del grupo nitro del fármaco por el microorganismo y la consecuente producción de ferrodoxina, seguidas por reacciones de fosforilación hasta que el compuesto nitro es completamente reducido, en este proceso de reducción se producen compuestos intermediarios que alteran macromoléculas del protozoario, en especial el ADN, inhibiendo la división por fisión binaria del protozoario.

En este estudio también se midió el pH en los medios de cultivo a diferentes horas. No se determinaron variaciones importantes. El rango se encontró entre valores de 6.5 a 6.9 (ver cuadro 23) que son normales en el ambiente ruminal y que favorecen el crecimiento de los microorganismo ruminales, por lo tanto no se considera que el pH de los medios de cultivo estén relacionados con la disminución en la concentración y viabilidad de los protozoarios determinada en cada tratamiento.

Cuadro 23. pH en medios de cultivo adicionados con secnidazol. tratamiento 0 3 6 12 pH pH pH pH Testigo 6.9 6.7 6.7 6.7

24 pH 6.6

48 pH 6.6

Secnidazol(1)

6.8

6.7

6.5

Secnidazol

(2)

6.8

6.7

6.5

Secnidazol

(3)

6.7

6.5

(1)

6.9 (2)

: Dosis de 0.1625 mg; :0.325 mg;

(3)

:0.65 mg.

Efecto del secnidazol sobre la digestibilidad in vitro de sustratos Con excepción de la pasta de soya se determinó una diferencia estadísticas (P<0.05) en la digestibilidad a las 24 y 72 h de incubación para el maíz, y a las 72 h en la alfalfa y rastrojo de maíz. En los tratamientos con (0.65 mg) o sin secnidazol. Se puede observar en el Cuadro 24, que la digestibilidad fue mayor (P<0.05) en los tratamientos con el agente desfaunante en los sustratos maíz, alfalfa y rastro de maíz, incluso en la pasta de soya pero sin diferencias estadísticas en los diferentes tiempos de incubación. Los resultados obtenidos indican que la desfaunación producida por el secnidazol, aumenta la digestibilidad in vitro de la MS de ingredientes de uso común en el balanceo de dietas. Dicho resultado es importante, debido que la mayoría de la literatura, indica reducción en la digestibilidad de la materia seca y materia orgánica (ver cuadro 4) por efecto de la desfaunación (Chaudhary y Srivastava, 1995; Ushida et al., 1986; Veira e Iván, 1983), ó sin un efecto significativo (Cottle, 1988b; Rowe et al., 1985; Matsmuto et al., 1994). Los datos de esta investigación coinciden con lo reportado por Luther et al. (1966), y Kurar y Madhu (1990), quienes reportan una tendencia a incrementar la digestibilidad de la MO y MS en animales desfaunados, pero sin diferencia estadística significativa. Considerando que en los tratamientos con secnidazol, no existían

protozoarios, se atribuye el aumento en la degradación in vitro de los ingredientes evaluados, a la actividad de las bacterias ruminales presentes en los medios de cultivo. Cuadro 24. Efecto del secnidazol sobre la proporción de materia seca digestible (MSD) de maíz, alfalfa, soya y rastrojo de maíz. Hora

Tratamiento Alfalfa Soya Ss Cs Ss

Maíz

R. Maíz Ss Cs

Ss*

Cs*

0.63d

0.27d

1.35d

0.93c

16.83c

38.96b

18.12c

24.21bc

16.66c

18.31c

0.54c

0.92c

36.00b

41.02b

25.84bc

29.00b

35.90b

37.60b

30.85b

34.53ab

43.50b

53.70a

27.75b

38.01a

48.69ab

58.00a

32.85b

45.05a

a b c d Distinta letra en la hilera de cada sustrato son diferentes (P< 0.05); * Ss: Sin secnidazol; Cs: Con secnidazol (0.65 mg/10 mL de medio de cultivo)

Efecto del secnidazol sobre la concentración de bacterias totales y celulolíticas Como se puede observar en el Cuadro 25 a las 48 h de incubación no hay diferencias estadísticas (P>0.05) significativas en cuanto a la concentración de bacterias totales y celulolíticas para el grano de maíz y rastrojo de maíz, mientras que, para la alfalfa y la pasta de soya la concentración de bacterias totales y celulolíticas respectivamente, fue superior (P<0.05) en los tratamientos que se adicionó el secnidazol. Cuadro 25. Efecto del secnidazol sobre la concentración de bacterias totales y celulolíticas a las 48 h de incubación en medios de cultivo con maíz, alfalfa, soya ó rastrojo de maíz (108). Bacterias

Tratamiento

Maíz

Totales

Ss*

Cs*

1100a

Celulolíticas 0.0014b 0.0014b

Alfalfa Ss Cs

1.1b

75a

0.014c 0.014c

Soya Ss

110a

R. Maíz Ss Cs

140a

4.5a

15a

0.0002c 0.11b

1.1b

1.2b

Distinta letra en la hilera de cada sustrato son diferentes (P< 0.05)* Ss: Sin secnidazol; Cs: Con secnidazol (0.65 mg/10 mL de medio de cultivo)

abc

El incremento significativo (P<0.05) en la concentración de bacterias totales en los medios con alfalfa mas secnidazol, con respecto al tratamiento sin secnidazol (7.5X109 contra 1.1X108 respectivamente), pueden explicar el aumento en la degradabilidad de la MS de la alfalfa, aunque la concentración de bacterias celulolíticas (1.4X106) fue similar para ambos tratamientos. Para el rastrojo de maíz también se observó aumento en la concentración de bacterias totales en los medios que se adicionó secnidazol, con respecto a los medios sin secnidazol (1.5X109 contra 4.5X108, respectivamente), aunque la diferencia (P>0.05) no fue estadísticamente significativa. En general, resultados obtenidos indican que el secnidazol tiene un efecto selectivo sobre protozoarios ruminales, sin efecto secundario sobre las poblaciones de bacterias ruminales, aunque, algunos autores han reportado que los nitroimidazoles como el secnidazol, pueden afectar a bacterias anaerobias (Levandowsky y Hutner, 1980; Pascuzzo, 2002). Todavía queda por explicar, a que se debe que haya aumentado la degradación in vitro de la MS del rastrojo de maíz y el grano de maíz, sin que esté involucrado un aumento en la concentración de bacterias totales o celulolíticas. Es probable que las bacterias ruminales tengan una mayor eficiencia en la degradación cuando no hay protozoarios en el medio, sin embargo esta posibilidad debe ser evaluada en otro estudio.

Capacidad desfaunante in vivo del secnidazol Inicialmente y considerando un volumen promedio de 7.7 l, se evaluó una dosis única de secnidazol de 500 mg animal-1 similar a la utilizada en los estudios in vitro (0.65 mg por 10 mL de medio de cultivo). Sin embargo, no se detectaron efectos en la concentración de protozoarios en el rumen de los animales tratados con el fármaco.

Con base a estos resultados y después de realizar otras pruebas preliminares de incremento en la dosis, se determinó que una dosis única de 2 g de secnidazol vía ruminal tiene efecto desfaunante in situ, y equivale a aplicar 2.6 mg de secnidazol por cada 10 mL de fluido ruminal.

En el cuadro 26 se presentan los resultados obtenidos con la dosis mencionada. La concentración de protozoarios en rumen se estimó antes de dosificar a los animales y posteriormente cada 24 h hasta que se reestableció la concentración de protozoarios ruminales, con el objetivo de estimar la duración del efecto desfaunante del fármaco. A partir de las 24 h después de tratar a los animales con secnidazol, se determinó una disminución en la concentración de protozoarios equivalente al 98.53% de la concentración de los animales del tratamiento testigo. El efecto desfaunante se mantuvo hasta las 48 h después de la dosificación y posteriormente a las 72 y 96 h la concentración de protozoarios comenzó a aumentar representando el 11 y 14% respectivamente, de la concentración de protozoarios determinada en el rumen de los animales del tratamiento testigo. A partir de las 120 h, la concentración de protozoarios se igualó a la de los animales del tratamiento testigo. En promedio, se observó que el pH ruminal de los animales tratados con secnidazol fue más elevado y con excepción de la medición hecha a las 120 h post-tratamiento, la cual fue baja en los tratamientos con o sin secnidazol. Sin embargo el valor promedio de pH ruminal del que presenta el rumen de animales faunados y desfaunados cumplió con el mínimo requerido para una máxima actividad de los microorganismos ruminales (Hobson y Jouany, 1988).

Cuadro 26. Capacidad desfaunante in vivo del secnidazol, concentración (104 mL-1) de protozoarios y proporción respecto al testigo Tiempo (h)

Tratamientos Sin secnidazol Concentración pH

Con secnidazol* % respecto al inicial

28.0a

6.4

38.0a

135

6.3

17.0a

6.3

0.25b

1.47

6.7

17.0a

6.6

0.95b

5.59

6.9

17.0a

6.4

1.90b

11.18

6.8

18.0a

6.5

2.60b

14.44

6.7

120

8.6a

5.7

8.40a

97.67

6.0

168

7.3b

5.7

10.0a

136.99

6.2

Media ab

Concentración

6.23

6.51

Distinta letra en la misma hilera son diferentes (P< 0.05); * 2000 mg de secnidazol por animal

Dado el mecanismo de acción del secnidazol (Levandowsky y Hutner 1980; Pascuzzo, 2002), se sugiere que la acción del fármaco es sobre trofozoitos, que son los que pueden reproducirse y desarrollarse. Debido a que el secnidazol es un agente antiamibiano luminal (trofozoitos del colon) y tisular (trofozoitos en la mucosa del colon o de otros tejidos), seria importante evaluar si el secnidazol tienen efecto en otras secciones del tubo digestivo. Aunque se estima que dada su rápida absorción de 19 a 20 h (Aguilar, 1994), la interacción con microorganismos intestinales puede ser mínima, por lo que su efecto puede estar limitado al rumen. El corto período de acción desfaunante del secnidazol (48 h post-tratamiento), puede deberse a varios factores incluyendo: la rápida absorción tisular del producto, a su inactivación en rumen ó a su salida en la fase líquida del contenido ruminal, todo lo anterior limita el contacto del fármaco con los protozoarios del rumen; por tanto, se requiere de otros estudios que permitan establecer la dosis ruminal adecuada para desfaunar y mantener el efecto por

un mayor tiempo, que además consideren posibles efectos no deseados en el animal, ya que como mencionan Aguilar (1994) y Pascuzzo (2002), dosis elevadas del fármaco pueden provocar toxicidad, causando diversos trastornos gastrointestinales, desde irritación intestinal, reducción del consumo, náuseas, vómitos, oscurecimiento de la orina, hasta padecimientos como mutagénesis y/o carcinogénesis.

Con la dosis de 2 g de secnidazol aplicada a los animales, no se detectó ningún signo clínico como: salivación excesiva, temblores musculares, anoxia o dolor abdominal, que indicara problemas en la salud de los animales tratados. Sin embargo es importante evaluar su efecto por un mayor periodo de tiempo. En parte para evaluar si el secnidazol mantiene su efecto con dosis continúas por ejemplo cada 48 a 72 h y no menos importante, para evaluar los efectos en la productividad y salud de los animales tratados. Comparado con otros tratamientos químicos desfaunantes el secnidazol presentó una mayor eficiencia que el reportado con sulfosuccinato dioctil de sodio (Chaudhary y Srivastava, 1995), con nonil fenol etoxilato (Bird et al., 1979) o con lauril dietoxilato sulfato de sodio (Bird y Leng, 1984), en donde este último incluso produjo la muerte de los animales tratados.

CONCLUSIONES Los resultados obtenidos, bajo las condiciones experimentales de este estudio, permite concluir que:

1) Es posible mantener una alta concentración y viabilidad de protozoarios ciliados del rumen por 72 h, utilizando un medio de cultivo anaerobio adicionado con la fracción soluble en agua de la avena.

2) Las plantas evaluadas tienen diferente capacidad desfaunante, la fracción soluble de A. mexicana, B. vaccinioides, C. ambrosioides, M. vulgare, M. piperita, V. perymenioides, Y. schidigera, y la fracción insoluble de Y. schidigera y M. leucanta presentaron alta capacidad desfaunantes en los cultivos in vitro a partir de las 48 o 72 h de incubación, con reducción en la proporción y concentración de protozoarios viables respecto al tratamiento testigo.

3) La fracción soluble en agua de las plantas B. cordata, M. leucanta, M. alba, e insoluble de B. vaccinioides, V perymenioides presentaron una mediana capacidad desfaunante a las 48 y 72 h de incubación con reducciones en la concentración y viabilidad de los protozoarios, sin llegar a un efecto desfaunante importante en los medios de cultivo.

4) De los fármacos evaluados in vitro únicamente el secnidazol tuvo una alta capacidad desfaunante, a dosis de 0.65 mg en 10 mL de medio de cultivo Sin encontrarse efectos negativos en las concentraciones de bacterias totales y celulolíticas.

5) En los tratamientos con secnidazol en medio de cultivo anaerobio se observó mayor digestibilidad in vitro de la MS y MO con los sustratos maíz, alfalfa y rastrojo de maíz a las 72 h de incubación, con excepción de la pasta de soya.

7) El secnidazol a una dosis única de 2 g por animal, mostró una importante acción desfaunante a las 24 y 48 h de aplicado el fármaco, con una reducción en las concentraciones de protozoarios del 1.47 a 5.59% con respecto a la determinada en los animales del tratamiento testigo. A las 72 y 96 horas de aplicado el secnidazol todavía se detecta una baja concentración de protozoarios en el rumen de animales tratados.

8) Se requieren otros estudios que permitan determinar la dosis adecuada para mantener el efecto desfaunante por mayor tiempo, aunado a una prueba que permita estimar posibles efectos no deseados en la salud de los animales tratados.

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