L A B O R A T O R I O D E C O L I F O R M E S P O R N U M E R O M A S P R O B A B L E
I N T E G R A N T E S : A N D R E A M O R E N O B E K S Y H E R N A N D E Z L A U R A V A R G A S M I C R O B I O L O G I A L A B O R A T O R I O N U M E R O 5
F U N D A M E N T O T E O R I C O El método del número más probable fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente sigue siendo ampliamente utilizado. En un principio este método fue empleado para estimar el número de microorganismos en muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que también puede ser aplicado para la determinación de microorganismos aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos contaminados, por tanto este método es aplicable para estimar el número de microorganismos en muestras de suelo y agua, tanto para bacterias aerobias como anaerobias. Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, capaces de fermentar la lactosa a 44º C en vez de 37 ºC como lo hacen los totales. Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en heces están formados por Escherichia coli y ciertas especies de Klebsiella. Ya que los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de los animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor la presencia de contaminación fecal. Éstos últimos se denominan termo tolerantes por su capacidad de soportar temperaturas más elevadas. Esta es la característica que diferencia a Coliformes Totales y Fecales. La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotérmicos es favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de materia orgánica, pH, humedad. Desde hace mucho tiempo se han utilizado como indicador ideal de contaminación fecal. Su presencia se interpreta como una indicación de que los organismos patógenos pueden estar presentes y su ausencia indica que el agua o el alimento estudiado se hallan exentos de organismos productores de enfermedades.
OBJETIVOS * Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua o alimentos mediante la búsqueda de microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli. * Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos coliformes fecales. * Organizar e interpretar los resultados. JUSTIFICACION DEL LABORATORIO La técnica del (NMP) comprende una prueba presuntiva y otra confirmativa. Esto es así porque una positividad en un tubo de la prueba presuntiva no indica. Necesariamente la presencia del grupo bacteriano a determinar (Coliformes Totales, Coliformes Fecales o Estreptococos Fecales), sino tan solo es una presunción, que habrá de confirmarse posteriormente. Sin embargo, una negatividad en la prueba presuntiva permite dictaminar la ausencia de dicho grupo bacteriano en el agua examinada. La denominada prueba presuntiva consiste en una metodología de tipo general para cualquier grupo de bacterias, mientras que la prueba confirmativa es específica.
MATERIALES Y EQUIPOS 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
Tubos de ensayo tapa rosca. Campanas Durham. Gradilla. Micro pipetas. Caldo Bills verde brillante. Incubadora. Autoclave. Mechero. Vidrio reloj.
PROCEDIMIENTO 1.Prepare 90mL de caldo bilis verde brillante 2.Prepare 110 ml de agua peptona da 3.Inserte en cada tubo; la campana Durham para evitar la presencia de gases (9 tubos de ensayo con tapa rosca). 4.Transfiera 10ml de medio Bilis Verde Brillante en cada tubo. 5.Esterilice los medios y materiales, correspondientes. 6.Prepare la solución madre (10g de muestra en 90ml de agua peptona da) dilución 10-1 (Homogenice) 7.Agregue 1ml de la solución madre a 9ml de agua peptona da para dilución 10-2 (Homogenice) 8.Tome de 1ml de la dilución 10-2 en 9ml de agua peptona da para dilución 10-3 (Homogenice) 9.Agregue 1ml de la dilución 10-1 en un tubo de contenga el Caldo Bilis Verde Brillante (repetir procedimiento para realizar un triplicado). 10.Repita el paso 9 para las diluciones 10-2 y 10-3.
11.Incube a 35°C por 48 horas. Realice repiques en caldo BVB de 44.5°C por 24-48H para los tubos que presentaron turbidez.
TABLA DE RESULTADOS A N A L I S I S
DETERMINACIO N DE COLIFORMO TECNICA DE (NMP)
M E D I O D E CULTIV O
CALDO BILIS VERDE BRILLANT E.
CARACTERIS T I C A S MICROSCOPI C A S Y MACROSCOPI C A S PRESENTA T U R Q U IDEZ, COLOR MAS CLARO Y PRESENCIA DE GAS EN LAS CAMPANAS.
DISOLU C I O N
10 ML DE CALDO BILIS EN CADA TUBO DE 10-2
N U M E R O D E C O L O N I A S
I M A G E N
PRESENTA TURVIDEZ Y DESPLAZANIENTO DE GAS EN LAS CAPA MAS DA COMO RESULTADO POCITIVO
DETERMINACIO N DE COLIFORMO TECNICA DE (NMP)
DETERMINACIO N DE COLIFORMO TECNICA DE (NMP)
CALDO BILIS VERDE BRILLANT E.
CALDO BILIS VERDE BRILLANT E
PRESENTA T U R Q U IDEZ, COLOR MAS CLARO Y PRESENCIA DE GAS EN LAS CAMPANAS
PRESENTA T U R Q U IDEZ, COLOR MAS CLARO Y PRESENCIA DE GAS EN LAS CAMPANAS
10ML DE CALDO BILIS EN CADA TUBO DE 10-1
10ML DE CALDO BILIS EN CADA TUBO DE 10-3
PRESENTA TURVIDEZ YDESPLAZAMINT O DE GAS EN LAS CAMPANAS DA COMORESULTAD O POCITIVO.
PRESENTA TURVIDEZ YDESPLAZAMINT O DE GAS EN LAS CAMPANAS DA COMORESULTAD O POCITIVO
CONCLUCIONES DEL RESULTADO En el medio de cultivo, y la peptona que utilizamos para este laboratorio aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano, el caldo bilis y el verde brillante son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativas a excepción de coliformes, y la lactosa es el hidrato de carbono fermentable. Es una propiedad del grupo coliformes, la fermentación de la lactosa con producción de ácido y gas. Este método se usa para contar microorganismos difíciles de cultivar en medio sólido, o para determinar el número de células que pueden crecer en un medio líquido determinado, como el análisis para determinar la contaminación del agua potable, determinando el número de bacterias Escherichia coli que pueden crecer en un medio con lactosa. La presencia de E. coli en el agua potable es una prueba de contaminación. En microbiología, el método se emplea habitualmente realizando diluciones en serie de un cultivo de bacterias en un medio de crecimiento, y luego divisiones adicionales en serie hasta obtener partes alícuotas. Los cultivos son incubados y evaluados a ojo,
eludiendo el tedioso recuento de colonias, o el caro y tedioso recuento microscópico. Según el resultado del laboratorio tenemos 3 de 3 tubos que dieron positivo presencia de coliformes fecales según el resultado del EMB donde se presento colonias color verde metalizado extensivo en toda la placa. Según la norma y la tabla de clasificación según los resultados del los tubos.
DEFINICIONES NUMERO MAS PROBABLE: ( N M P ) Es una forma de obtener datos cuantitativos en concentraciones de elementos discretos a partir de datos de incidencia positiva/negativa. Es una estrategia eficiente para estimar densidades de población que se emplea cuando una evaluación cuantitativa de elementos individuales no es factible. El método se basa en determinar la presencia o ausencia (positivo o negativo) de atributos específicos de microorganismos en copias obtenidas por diluciones consecutivas a partir de muestras de suelo u otros ambientes. Se basa en el principio de que una única célula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio. El método requiere la realización de una serie de diluciones en serie de la muestra de cultivo, en un medio líquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo de un volumen diez veces mayor. Luego, se incuban las muestras de esos tubos y, pasado un tiempo, se examinan los tubos. Aquellos tubos que recibieron una o más células microbianas procedentes de la muestra, se pondrán turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna célula permanecerán transparentes CALDO VERDE BRILLANTE: Medio selectivo recomendado para la prueba confirmatoria en la detección del grupo coliforme en aguas, leche, derivados lácteos y otros productos de importancia sanitaria, mediante la determinación del NMP. La bilis y el verde brillante inhiben el desarrollo indeseable de la flora acompañante de los coliformes e inclusosuprimen el crecimiento de los anaerobios fermentadores de la lactosa como es el caso de Clostridium perfringens. BIBLIOGRAFIA: www.monografias.com › Biología es.wikipedia.org/wiki/Número_más_probable