GenĂŠtica Forestal 2018
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Genética Forestal 2018
Introducción…….…………………...….……………….…………………………..4 Justificación…….…..………………………………………………………………….5 Objetivos……….……….…………………………………………………………..…..6 Desarrollo……..………………………………………………………………………..7 Fases…………………………....………………………………………………..11 Equipo necesario para el cultivo in vitro………….…………......13 Condiciones del cultivo in vitro……....…................................14 Conclusiones………………………..………...……………………................15 Bibliografia……………….………………………………………………………….16
Figura 1…………………………………………..…………………………………….5 Figura 2………………………………………………………………………………...6 Figura 3………………………………………………………………………………12 Figura 4………………………………………………………………………………13 Figura 5………………………………………………………………………………13 Figura 6………………………………………………………………………………13 Figura 7………………………………………………………………………………14
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El cultivo in vitro (término que literalmente significa en vidrio), incluye muchas técnicas destinadas a introducir, multiplicar y regenerar, entre otros recursos, material vegetal o animal en condiciones controladas y asépticas. El cultivo in vitro, constituye un paso fundamental en la obtención y regeneración de plantas genéticamente modificadas, o transgénicas, mediante técnicas de ingeniería genética. Es decir que existe una estrecha relación entre el cultivo de tejidos vegetales y la biotecnología moderna. Normalmente se utilizan cultivos de tejidos, seguido de la regeneración de la planta completa, y la subsiguiente expresión de los genes introducidos, o transgenes. A diferencia de las técnicas tradicionales de cultivo, esta poderosa herramienta permite la propagación de grandes volúmenes de plantas en menor tiempo; así como el manejo de las mismas en espacios reducidos. Por otro lado, la técnica es de gran utilidad en la obtención de plantas libres de patógenos; plantas homocigotas, en la producción de plantas en peligro de extinción, en estudios de ingeniería genética, etc. El enorme potencial que posee esta metodología ha propiciado que en los últimos 25 años se haya incrementado el número de laboratorios de cultivo de tejidos en el país para la producción comercial de plantas ornamentales y frutales al lo que ha motivado que algunos floricultores la estén utilizando como una alternativa viable en sus programas de producción.
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El conocimiento de la planta y su funcionamiento, adquiere cada vez mayor importancia. El último termino, la supervivencia del género humano depende y probablemente dependerá siempre de la abundancia de los vegetales. Las plantas constituyen el único medio de cual disponen los organismos vivos. Para estudiar las plantas se emplean métodos experimentales tan precisos como los usados en la física; a fin de comprender las interrelaciones que son la esencia de su vida, hay que enfocarse en un nivel y de una manera característica de las ciencias biológicas.
Fig. 1 Técnica In Vitro
El propósito de la propagación clonal es la obtención de plantas con cualidades uniformes y alta calidad. El cultivo de tejidos es más rápido que los procedimientos tradicionales generalmente conocidos. La selección de líneas celulares, la criopeservacion, los bancos de germoplasma y la obtención de metabolitos secundarios para la farmacología mediante el cultivo de tejidos vegetales in vitro se ha convertido en uno de los soportes tecnológicos de Ing. Genética y la biotecnología. El campo de la investigación aplicada en cultivos in vitro debe convertirse en una alternativa a los métodos tradicionales de propagación y mejoramiento vegetal ya que presentan ventajas en lo que respecta a: ahorro de tiempo, ya que muchos procesos pueden ser acelerados en el laboratorio: economía de espacio y mano de obra, pues se trabaja en áreas pequeñas y relativamente con poco personal dando como resultado una disminución considerable de los costos que implica el trabajar directamente en el campo en condiciones naturales. Los cultivos in vitro que hace unos 20 años era muy complicado montarlos, hoy en día están a nuestro alcance y existe el personal calificado para trabajar en este campo; si a esto se le agrega la gran capacidad de los investigadores, solo resta esperar que las instituciones privadas y oficiales apoyen de manera efectiva a los grupos de trabajos para que se puedan implementar programas que permitan la utilización de nuestros recursos humanos y naturales en beneficio de nuestro país.
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Establecer una metodología para la Micropropagación in vitro a gran escala
Considerar la importancia de los metabolitos secundarios en condiciones de cultivo in vitro
Proyectar una propuesta de negocios sobre la propagación in vitro masiva de la especie
Fig. 2 Fases In Vitro
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El cultivo in vitro consiste en tomar una porción de una planta (ej. el ápice, una hoja o segmento de ella, segmento de tallo, meristemo, embrión, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un medio nutritivo estéril (usualmente gelificado, semisólido) donde se regenerará una o muchas plantas. Durante las últimas décadas, la técnica del cultivo “in vitro” ha ganado especial interés para el establecimiento de diversas plantas para la producción de compuestos o la obtención de cultivos más sanos y con características genéticas específicas. El cultivo in vitro de vegetales se basa en el aislamiento de órganos, tejidos o células vegetales y en el ajuste de las condiciones necesarias para la obtención de respuestas fisiológicas o morfo génicas a partir de estos explantes (Höxtermann, 1997). El cultivo de células y tejidos in vitro (CCTV) involucra diferentes técnicas a partir de diferente material vegetal tales como cloroplastos, células, tejidos, órganos e incluso plantas completas. La toti potencia es la capacidad de una célula de generar un individuo completamente idéntico a la célula madre, la cual tiene la misma información genética y la misma función (Kieran & Col, 1997), es decir, indica que cualquier célula vegetal contiene una copia íntegra del material genético de la planta a la que pertenece sin importar su función o posición en ella, y por lo tanto tiene el potencial para regenerar una nueva planta completa (Ferl y Paul, 2000). El CCTV es una forma de reproducción asexual, la cual se puede realizar gracias al mecanismo de división mitótico de las células vegetales. La división celular mitótica implica una replicación de los cromosomas de las células hijas, por lo que poseen un genotipo idéntico al de la célula madre. La potencialidad de una célula diferenciada para generar tejidos nuevos y eventualmente un organismo completo, disminuye con el grado de diferenciación alcanzado por esa célula, pero puede revertirse parcial o completamente según las condiciones de cultivo a las que se la someta. De este modo y desde la óptica de la conservación de especies vegetales la aparición de la variación espontánea no controlada y al azar durante el proceso del cultivo in vitro se convierte en un fenómeno inesperado y no deseado en la mayoría de los casos. Contrariamente a estos
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Genética Forestal 2018 efectos, su utilidad en la mejora de los cultivos mediante la creación de nuevas variantes también ha sido bien documentada (Bouharmont, 1994; Mehta y Agra, 2000; Predieri, 2001). El cultivo se incuba bajo condiciones de luz, temperatura y humedad controladas, que junto con las fisicoquímicas y nutricionales conducen el desarrollo del explante hacia la formación de una masa celular amorfa denominada callo, o hacia la diferenciación en un tejido organizado que producirá órganos o embriones. Los callos obtenidos mediante este procedimiento pueden subcultivarse para su mantenimiento y propagación o inducir su diferenciación para formar órganos (organogénesis), embriones (embriogénesis) o pasarse a un medio de cultivo líquido para obtener células y pequeños agregados en suspensión. Los factores que se deben tener presentes para obtener una respuesta adecuada del explante incluyen:
Posición de la planta donadora Edad ontogenética (juvenilidad/madurez) de la planta Estado fisiológico de
la
misma.
Aunado, se deberá considerar la especie con la que se está trabajando y los objetivos que se buscan. La reproducción asexual de plantas por cultivo de tejidos es posible gracias a que, en general, las células de un individuo vegetal poseen la capacidad necesaria para permitir el crecimiento y el desarrollo de un nuevo individuo, sin que medie ningún tipo de fusión de células sexuales o gametos. Así, las células vegetales crecidas en condiciones asépticas sobre medios de cultivo adicionados con hormonas vegetales, pueden dividirse dando dos tipos de respuesta:
Organogénesis / embriogénesis indirecta. Una des diferenciación celular acompañada de crecimiento tumoral, que da lugar a una masa de células indiferenciadas denominada callo, la cual bajo las condiciones adecuadas es capaz de generar órganos o embriones somáticos (llamados así porque son estructuras similares a un embrión pero que no se originaron por unión de gametos). Organogénesis / embriogénesis directa. Una respuesta morfo genética por la cual se forman directamente órganos (organogénesis) o embriones (embriones somáticos).
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Genética Forestal 2018 La formulación del medio cambia según se quiera obtener un tejido des diferenciado (callo), yemas y raíces, u obtener embriones somáticos para producir semillas artificiales. El éxito en la propagación de una planta dependerá de lograr la expresión de la potencialidad celular total, es decir, que algunas células recuperen su condición meristemática. Para lograrlo, debe inducirse primero la des diferenciación y luego la re diferenciación celular. Un proceso de este carácter sucede durante la formación de las raíces adventicias en el enraizamiento de estacas, la formación de yemas adventicias. Entre los factores más importantes a tener en cuenta para lograr la respuesta morfo genética deseada, es la composición del medio de cultivo. En todo intento de propagación vegetal, ya sea in vitro o in vivo, el carácter del proceso de diferenciación depende del genoma de la especie, y está regulado por el balance hormonal propio y por el estado fisiológico del órgano, tejido o célula puesta en cultivo. Sin embargo, también se sabe que ese balance puede ser modificado por el agregado de compuestos que imiten la acción de las hormonas vegetales. Esos compuestos, denominados reguladores del crecimiento, son los que se emplean en los medios de cultivo para conseguir la Micropropagación de una planta. Las principales aplicaciones de la técnica de cultivo de células, tejidos y órganos vegetales son en los campos de Micropropagación, obtención de plantas libres de patógenos, preservación de germoplasma, mejoramiento genético, biosíntesis de metabolitos e investigación básica en áreas como la genética, fisiología y bioquímica (Fowler 1987, Carpita y McCann, 2000). La clonación debe utilizarse para evitar el empobrecimiento genético de las especies, teniendo el cuidado de introducir nuevos clones, variedades e híbridos de manera permanente. Ventajas de la técnica de CCTV
Producción de gran número de plantas. Obtención de plantas en cualquier época del año Almacenamiento de plantas en poco espacio Producción de plantas libres de contaminación, enfermedades y plagas Herramienta para el fitomejoramiento: plantas mejoradas Propagación de especies de difícil propagación por otros métodos, o en vías de extinción Clonación de individuos "élite", son desempeño agronómico destacado Obtención de plantas libres de virus Producción de semillas sintéticas Conservación de germoplasma: material de un conjunto de individuos que representa la variabilidad genética de una población vegetal Obtención de metabolitos secundarios Producción de nuevos híbridos Mejora genética de plantas
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Germinación de semillas Producción de haploides y dobles haploides Estudios fisiológicos
diversos
Desventajas de la técnica in vitro
No todas las especies son viables de propagar recalcitrantes Cada especie requiere de métodos específicos La estandarización de protocolos resulta costosa
in vitro; algunas
son
Casos de éxito Esta técnica ha tenido gran éxito en especies como el Agave tequilana Weber var. "Azul", donde la industria tequilera requiere de sembrar varios millones de plantas cada año y enfrenta diversos problemas propios del agave (tiempos de cosecha largos, baja variabilidad de material genético, etc.). Otro caso, es en el cultivo de papaya, donde la diversidad sexual de la planta produce plantas que darán frutos no comerciales. En ambos casos, el Dr. Cuauhtémoc Navarro, Director de Operaciones de la compañía NSIP (antes Agromod in vitro), ha trabajado en su propagación por estas técnicas. Se trata de la infraestructura más grande en América Latina para la Micropropagación y mejoramiento vegetal, entregando anualmente millones de plantas de agave, plátano, café, papaya y ornamentales libres de enfermedades; con lo cual se demuestra que es una técnica totalmente viable comercial y técnicamente hablando. En el Sexto Congreso de Nutrición y Fisiología Vegetal Aplicadas de Intagri, el Dr. Cuauhtémoc Navarro hablará de su experiencia y aprendizaje con estas técnicas de propagación.
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Fases Fase I: Establecimiento de los cultivos in vitro Para la realización de este proyecto se implementó un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales con el equipo y materiales básicos para estos fines. El material biológico inicial consistió en plantas de gloxinia (Gloxinia speciosa) las cuales se adquirieron en viveros de la localidad. Predesinfestación: los explantes iniciales se obtuvieron de tejido foliar para lo cual se separaron las hojas jóvenes más vigorosas y se lavaron con agua y detergente. Desinfestación: dentro de una campana de flujo laminar las hojas de gloxinia se sumergieron en una solución de hipoclorito de sodio al 1% en constante agitación durante 10 minutos, se aplicaron tres enjuagues de tres minutos cada uno con agua destilada estéril. Después se cortaron y se sembraron secciones de tejido de aproximadamente 1 cm 2. Paralelamente se adquirieron semillas de gloxinia híbrida F1 doble, mezcla de colores y se desinfestaron de la misma manera que las hojas. Tanto la siembra de tejidos como de semillas se realizó en un medio nutritivo de acuerdo a la formulación de Murashige & Skoog (1962) complementado con 100 mg/l de myo-inositol glysina 2 mg/l, ácido nicotínico 0.5 mg/l, pyridoxina 0.5 mg/l, tiamina 0.1 mg/l, sacarosa 30 gr/l, agar 7 gr/l, el pH se ajustó a 5.8. La esterilización de los medios de cultivo fue a 20 libras de presión durante 20 minutos en todos los casos. El medio para germinación de semillas fue el mismo pero a la mitad de la concentración original y adicionado con 1.5 gr/l de carbón activado, el medio para las secciones de tejido se complementó con 1 mg/l de benzilaminopurina (BAP) y 0.3 mg/l de alfa ácido naftalenacetico (µ ANA). Los tejidos se trasladaron a una cámara de incubación a una temperatura de 25 ± 2º C, y bajo una intensidad luminosa de 2000 lux (lámparas slime line marca Phillips). Las semillas fueron incubadas a la misma temperatura pero en ausencia de luz.
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Genética Forestal 2018 Fase II: Multiplicación Debido a que las secciones de tejido foliar de gloxinia sufrieron oxidación muy severa, no fue posible lograr la diferenciación de plántulas, esto motivó a que la multiplicación de propágulos se hiciera a partir de las plántulas obtenidas por germinación aséptica. El medio de cultivo utilizado en esta fase fue el mismo MS (1962) aumentando la concentración de BA a 2 mg/l y (µ ANA) 0.3 mg/l mg/l. Para alcanzar el número acordado de plántulas, se realizaron dos resiembras. Las condiciones de incubación fueron las mismas que se describieron con anterioridad. Fase III: Enraizamiento de plántulas Para esta fase, se utilizaron las mismas sales MS en el medio de cultivo, omitiéndose las citocininas (BA). Complementado con 1.5 gr/l de carbón activado y 20 gr/l de sacarosa. Las condiciones de incubación fueron las mismas que para las etapas anteriores.
Fig. 3 Fases In Vitro
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Equipo necesario para el cultivo in vitro
Autoclave
Cámara de flujo laminar
Medio de cultivo
Planta
Cámara de cultivo
- Autoclave Es donde se "esteriliza" todo lo que vamos a utilizar: agua, algunos nutrientes, material, etc. No se pueden meter proteinas. Es como una olla a presión, pero de mayor tamaño, donde se controla la presión y la temperatura (hasta 120º). Fig. 4 Autoclave
- Cámara de flujo laminar Es donde se realizan todas las manipulaciones con la planta. Es un habitáculo con un operario en un ambiente estéril. Se usan rayos ultravioletas para esterilizar el aire.
Fig. 5 Cámara de Flujo Laminar - Medio de cultivo El material vegetal de partida puede ser del campo, pero esto conlleva un alto riesgo de enfermedades y contaminación, aunque se lave mucho y bien. Lo más corriente es utilizar brotes que crecen en condiciones controlada para que haya menos infecciones.
Fig. 6 Medio de Cultivo
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Genética Forestal 2018 - Cámara de cultivo La cámara de cultivo es una habitación de dimensiones muy variables, en la que se controlan las condiciones de luz, temperatura, humedad, variación día-noche, etc.
Fig. 7 Cámara de Cultivo
Condiciones del cultivo in vitro
En la cámara de flujo laminar no puede entrar material contaminado. El problema más importante en todo el proceso del cultivo in vitro son las contaminaciones. En el autoclave no se pueden meter determinadas sustancias, como vitaminas, antibióticos, ácido giberélico, sacarosa, encimas, extractos vegetales, etc., ni tampoco recipientes que no soporten altas temperaturas. El vidrio ha de ser de muy buena calidad para que no suministre a las medias sustancias contaminantes para la planta. Normalmente se prepara el medio y se filtra directamente. El problema es que se absorben en el filtro determinadas sustancias. Los reguladores de crecimiento (hormonas) son imprescindibles, ya que sin ellos no se puede hacer el medio de cultivo. El pH ideal es 6, pero puede oscilar entre 5,5 y 6,5. Se necesita agar y medio sólido 0,6-0,9%. El medio de cultivo realmente sólo tiene que llevar agua, fuente de energía (azúcares) y reguladores de crecimiento. El medio de cultivo es secreto, y se pueden tardar dos años en prepararlo. En la cámara de cultivo se aplican cantidades variables de luz (16-20 horas). También existen plantas que se desarrollan en la oscuridad. Las temperaturas también varían. Lo normal son 2226ºC, aunque en ocasiones se exigen fríos de 4ºC y también 28-30ºC para plantas tropicales. Igualmente, en el éxito de esta técnica de propagación también influyen determinadas características de la planta, como el tipo, genética e incluso el tipo de implante, parte más juvenil o más adulta. En cuanto a los recipientes, deben permitir el intercambio de gases, pero evitar la pérdida de agua, lo que provocaría un aumento de la concentración de sales, y por tanto la muerte de la planta. De ahí la importancia del cierre.
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De este trabajo se deben destacar los siguientes aspectos fundamentales: o
Que el desarrollo sustentable del estado de Veracruz, requiere de la aplicación de estrategias agresivas, siendo una de ellas la transferencia de biotecnologías a procesos productivos, de base social, en el medio rural.
o
Que la vinculación entre las instancias productoras de biotecnologías y los sectores marginados, puede lograrse en la medida en que se establezcan los canales adecuados en cuanto a localización y adquisición de apoyos de todo tipo: de investigación, de inversión social, administrativos, financieros y de capacitación.
o
Que en base a la integración de grupos de autogestión productiva, es posible constituir empresas sociales generadoras de empleos como alternativa a los fenómenos de marginalidad y depredación de los recursos naturales.
o
Que los proyectos de autogestión productiva y de aplicación interinstitucional, son capaces de integrar recursos y apoyos con un elevado efecto sinérgico, propiciando la sustentabilidad del grupo y del proyecto mismo.
Los resultados obtenidos permitirán en el futuro aplicar esta metodología a otras comunidades con problemas de marginación con lo cual se contribuirá por una parte a la creación de empleos y por otra a impulsar fuertemente la actividad de la floricultura en el estado de Veracruz , produciendo plantas ornamentales de calidad para ser más competitivos en esta área.
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