I.
INTRODUCCION
La absorción de radiación ultravioleta o visible proviene de la excitación de los electrones enlazantes y como consecuencia, las longitudes de onda de los picos de absorción pueden correlacionarse con los tipos de enlaces que existen en las especies en estudio. La espectroscopia de absorción molecular es por tanto valiosa para la identificación de los grupos funcionales de una molécula.
Sin
embargo,
son
más
importantes
las
aplicaciones
de
la
espectroscopia de absorción ultravioleta y visible para la determinación cuantitativa de compuestos que contienen grupos absorbentes o también llamados cromóforos. La espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas para la detección específica de moléculas. Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomoléculas, etc) y estado de agregación (sólido, líquido, gas). Los fundamentos físicoquímicos de la espectrofotometría son relativamente sencillos. En esta práctica se determinara la absorbancia del bromocrosol verde, se realizara distintas medidas con distintos volúmenes; con la ayuda del instrumento llamado espectrofotómetro.
I.1
Objetivos -
Objetivo general
Determinar la concentración del bromocrosol verde a través del espectrómetro visible. •
Objetivos específicos
Determinar las concentraciones y absorbancias de cada una de las muestras realizadas.
•
Construir la gráfica de la relación absorbancia vs concentración.
•
Determinar la ecuación de la gráfica de la relación absorbancia vs concentración.
II. II.1
REVISIÓN DE LITERATURA
ESPECTROFOTOMETRÍA UV – VISIBLE
La espectrofotometría de absorción fue uno de los primeros métodos físicos que se aplicó al análisis cuantitativo y la determinación de estructuras, La espectrofotometría UV-vis supera en costo y sencillez al resto de métodos ópticos de análisis cuantitativo y es también una técnica auxiliar útil para la elucidación de estructuras. La región del ultravioleta se divide en 2 partes: ultravioleta próximo o cercano (que comprende de 200 a 400 nm del espectro electromagnético) y el ultravioleta lejano o de vacío (10 a 200 nm). Este último presenta el inconveniente de que el oxígeno atmosférico absorbe en esa región y por ello no es considerado en el análisis por espectrofotometría UV - visible. La división entre las regiones ultravioleta próximo y el visible (400 a 800 nm aproximadamente) se debe a que el ojo humano sólo puede percibir las radiaciones de onda por encima de 400nm (OLSEN, 1990).
II.1.1
FUNDAMENTO
Como es sabido, las técnicas espectroscópicas se basan en la interacción de la radiación electromagnética con la materia. A través de esta interacción las
moléculas pueden pasar de un estado energético (m), a otro
estado energético distinto (l), absorbiendo una cantidad de energía radiante igual a la diferencia energética existente entre los dos niveles: El - Em. Para conseguir esto, las moléculas absorben un fotón de una radiación tal que:
Estos tránsitos energéticos son los que dan origen a los espectros que, en definitiva no son mas que el registro de las distintas u(0k) a las que se producen estos tránsitos energéticos. Debido a la existencia de diferentes tipos de energía de los electrones, de los movimientos vibracionales de las moléculas, de la rotación de las mismas, etc; las moléculas pueden interaccionar con radiaciones electromagnéticas de un rango muy amplio de longitudes de onda, dando lugar a distintos tipos de espectroscopías según las diferentes regiones. Un esquema podría ser el
siguiente: Figura N°1. Espectro de radiación
La espectroscopía UV-Visible (espectros electrónicos), se debe a la transición de los electrones mas externos de los átomos de las moléculas, desde niveles fundamentales a niveles mas altos de energía.
II.2
LEY DE BEERT - LAMBERT
Cuando una onda electromagnética de cierta longitud de onda incide sobre una sustancia, la fracción de la radiación absorbida es función de la concentración de la sustancia que atraviesa el rayo de luz y del espesor de la muestra, que también se llama longitud de paso óptico. La compensación de la reflexión y la absorción en la ventana puede evitarse definiendo I 0 como el poder de radiación que pasa a través de una muestra testigo (blanco) contenida en la misma celda de la muestra. La transmitancia T se define como la relación de las intensidades de la radiación no absorbida I, y de la radiación incidente, de esta forma:
La absorbancia (A) es el logaritmo del recíproco de la transmitancia
Si el porcentaje de T es 100T; el porcentaje de absorción será 100(1T). Las aplicaciones analíticas del comportamiento de absorción de las sustancias pueden ser cualitativas o cuantitativas, como antes se ha mencionado. Las primeras dependen del hecho de que una cierta especie molecular sólo absorbe luz en regiones específicas del espectro y en grado variable característicos de dicha especie, al resultado se le llama espectro de absorción de esa especie molecular y es una huella dactilar para propósitos de identificación. Las aplicaciones cuantitativas dependen de la relación entra la absorbancia y la concentración de la solución. A medida de que un haz de fotones pasa por un sistema de una especie absorbente, el grado de absorción con respecto a la distancia atravesada es directamente proporcional a la potencia (o a la intensidad) del haz de fotones I. La reducción de la intensidad en la trayectoria x, -dI, puede escribirse matemáticamente de la forma siguiente.
Donde k es una contante de proporcionalidad característica de la naturaleza de la especie absorbente y de la energía de los fotones, e I representa el poder de la radiación a cualquier distancia x en el medio absorbente. Reordenando la ecuación anterior.
Este es el enunciado matemático de que la fracción del poder de radiación absorbido es proporcional al espesor atravesado. Si ahora se estipula que I0 es el poder de radiación a x=0, y que I representa el poder de la radiación transmitida que emerge del medio absorbente a x = l. La ecuación puede integrarse con respecto al total del trayecto de la radiación.
Esta es la ecuación de Lambert la cual indica que para una cierta concentración de sustancia absorbente, la intensidad de la luz transmitida disminuye logarítmicamente a medida que la longitud del trayecto aumenta en forma aritmética. Beer determinó que al aumentar la concentración del absorbente, se producía el mismo efecto que un aumento proporcional en la longitud del trayecto de absorción de la radiación. De esta forma, la constante de proporcionalidad k es, a su vez, proporcional a la concentración de la sustancia que absorbe.
Por lo tanto la forma combinada de la ley es:
Donde a incorpora el factor de conversión del logaritmo base 10 a logaritmo natural. Esta expresión es la ley de Lambert-Beer y se puede escribir como:
Donde ϵ es el coeficiente de absortividad molar en unidades de L cm -1 y mol-1, l es la longitud del paso óptico (longitud de la celda) y C es la concentración de la sustancia absorbente en unidades de mol L -1.
Figura N°2. Absorción de la radiación
Si se opera a una longitud de onda dada y con una cubeta de un determinado espesor l, la absorbancia A, medible directamente, es proporcional a la concentración molar de la muestra c, lo que constituye el fundamento del análisis espectrofotométrico cuantitativo. Existen, sin embargo distintos factores que afectan al cumplimiento de la ley de Lambert-Beer, especialmente a concentraciones elevadas. Por ello antes de proceder al análisis de una muestra es preciso comprobar experimentalmente
el rango de concentraciones en que dicha ley se cumple, obteniendo la curva de calibrado que relaciona las absorbancias con las concentraciones. La ley
de
Lambert-Beer puede también aplicarse al análisis
cuantitativo de mezclas de dos o más sustancias, siempre que sus respectivos espectros de absorción sean lo suficientemente distintos. El procedimiento se basa en que la absorbancia es una propiedad aditiva, de tal forma que la absorbancia total de una mezcla es la suma de cada uno de los componentes. Así, para una mezcla de dos componentes, 1 y 2, que absorben radiación de una misma longitud de onda, se cumplirá que:
II.3
CARACTERÍSTICAS DE UN ESPECTROFOTÓMETRO UV -
VISIBLE La medida de la absorbancia se lleva a cabo con la ayuda de un espectrofotómetro, que en esencia consta de un monocromador (prisma o red de difracción) que controla la longitud de onda de la radiación que se hace incidir sobre la muestra. La radiación no absorbida se detecta y mide convenientemente. La absorbancia de la muestra se compara con la de una “referencia” que consta estrictamente de disolvente.
II.3.1 INSTRUCCIONES GENERALES DE MANEJO DE UN ESPECTROFOTÓMETRO
Encendido de lámparas
• Lámpara de tungsteno (zona del Visible, 900 a 340 nm), encendido instantáneo.
• Lámpara de Deuterio (zona del UV, 340 a 200 nm aprox.), necesita un calentamiento previo.
Adaptación del espejo a la lámpara adecuada, atendiendo al
rango de longitud de onda de trabajo (sólo en los espectrofotómetros no automáticos).
Seleccionar el
valor de longitud de onda
con el mando
correspondiente.
Ajuste del cero de transmitancias (tapa levantada) con ayuda
del mando “Ajuste del cero”, hasta que aparezca cero en la pantalla.
Ajuste del 100% de transmitancia (0 de absorbancia) con la
referencia, que normalmente es el disolvente de la muestra, utilizando para ello el mando “A-T”.
Leer el valor de Absorbancia/Transmitancia de la muestra.
Figura N°3. Absorbancia/Transmitancia de la muestra
Las cubetas empleadas en el espectrofotómetro (1.00 cm de espesor) deben estar escrupulosamente limpias y deben cogerse siempre por sus caras esmeriladas u opacas. No es conveniente secarlas o limpiarlas con papel ordinario por el carácter abrasivo de éste sino con un papel suave. Una de las aplicaciones prácticas de mayor interés de la espectrofotometría de absorción UV-Visible es la del análisis cuantitativo, basada en la aplicación de la ecuación de Lambert-Beer. II.4
PUNTO ISOSBESTICO
En la mayoría de los casos durante la duración de una reacción química, una especie absorbente X se transforma en una especie absorbente Y (en el caso que sólo estén involucradas 2, para los casos en donde hay más especies se aplica el mismo concepto). Si los espectros de los componentes puros X e Y se cruzan a una longitud de onda, cualquier espectro registrado durante la reacción química pasará por ese mismo punto, este punto se conoce como punto isosbéstico, este es una buena prueba de que existe más de una especie. En la figura se muestra un ejemplo de los espectros de absorción que corresponde al verde de bromocresol, se puede observar que hay una longitud de onda en que los tres espectros se cortan, este es el punto isosbéstico y corresponde a la longitud de onda en que las dos formas tienen la misma absortividad (HARRIS, 2007).
Figura N°4. Espectros de absorción del bromocrosol verde a diferentes valores de pH, donde se observa el cambio de una especie a otra dejando evidencia el punto isosbéstico
III.
MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 MATERIALES - Bromocrosol verde 3gr. - (4) Tubos de Ensayo - (1) Matraz - (1) Pipeta - (1) Vaso precipitado de 250 ml - (1) Gradilla - Agua Destilada - Libreta de apuntes - Lapicero 3.2 Equipo - Espectrofotómetro 1200 RS FARLAB - Laptop - Cámara digital 3.3 Software -
Microsoft Excel 2013
-
Microsoft Word 2013
3.2 MÉTODOLOGÍA 3.2.1 TRABAJO DE LABORATORIO • Se comenzó añadiendo al matraz 250 ml de Agua destilada, y luego se agregó 3 gramos de Bromocrosol verde y lo mezclamos hasta que se disuelva completamente. • Luego se usó 4 tubos de ensayo con su respectiva gradilla, y se agregó las cantidades de 1, 2, 4 y 8 ml de la mezcla y agregamos agua destilada en cada uno de los 4 tubos de ensayo hasta que en cada uno halla la cantidad de 10 ml (agregamos 9, 8, 6, 2 ml de agua destilada respectivamente). • Posteriormente y previas explicaciones del docente a cargo, se encendió el espectrofotómetro y se calibró colando agua en la cubeta transparente del espectofrotómetro. • Finalmente se colocó cada muestra de los 4 tubos de ensayo en la cubeta transparente del espectofrotómetro para medir la absorbancia. - Trabajo de Gabinete • Con los datos obtenidos del trabajo de laboratorio de concentración y absorbancia, construimos una gráfica de absorbancia vs concentración en Microsoft Excel. • Al construir la gráfica hallamos la línea de tendencia generada por un ajuste de curva lineal.
โ ข Con dicha ecuaciรณn podremos determinar la concentraciรณn para la absorbancia requerida.
3.4 Consideraciones - Si la muestra que analizamos con el espectrofotรณmetro no nos dio un dato de absorbancia, no considerar para encontrar el ajuste de curva. - Debido a que la cubeta transparente del espectofotrรณmetro solo utiliza 3.5ml se tuvo que retirar 6.5ml del total del volumen
IV. IV.1
RESULTADOS
Determinaci贸n de la concentraci贸n inicial m = 3g (Bromocrosol verde) v = 250 ml (Agua) N1= N1=
IV.2
3g 250 ml
m v = 0.012 g/ml
Volumen total V1 = 1 ml (Mezcla) + 9 ml (Agua) = 10 ml V2 = 2 ml (Mezcla) + 8 ml (Agua) = 10 ml V3 = 4 ml (Mezcla) + 6 ml (Agua) = 10 ml V4 = 8 ml (Mezcla) + 2 ml (Agua) = 10 ml VT = 10 ml
IV.3
Determinaci贸n de las distintas concentraciones N1 * V1 = N2 * V2
Donde: N1 = Concentraci贸n inicial
V1 = Volumen de cada concentración N2 = Concentración final V2 = Volumen total IV.3.1 N2-1 =
IV.3.2 N2-2 =
IV.3.3 N2-3 =
IV.3.4 N2-4 =
IV.4
Para la concentración 1 g x 1ml ml 10 ml
0.012
= 0.000012 g/ml
Para la concentración 2 g x 2ml ml 10 ml
0.012
= 0.0024 g/ml
Para la concentración 3 g x 4ml ml 10 ml
0.012
= 0.0048 g/ml
Para la concentración 4 g x 8ml ml 10 ml
0.012
= 0.0096 g/ml
Calculo de la absorbancia
Tabla N°1. Concentración y absorbancia de la muestra en estudio CONCENTRACIÓN N2-1 = 0.000012 g/ml N2-2 = 0.0024 g/ml N2-3 = 0.0048 g/ml N2-4 = 0.0096 g/ml N2-5 = x
ABSORBANCIA 1.294 1.424 1.938 No se efectuó la lectura 1.540
Gráfica N°1. Representación de la absorbancia vs concentración
Dada la siguiente ecuación de la gráfica, podemos hallar el valor de la concentración teniendo como dato la absorbancia. y = 0.0071x – 0.0088 Donde: x = absorbancia y = concentración (g/ml) Y = 0.0071 * (1.540) – 0.0088 Y = 0.002134 g/ml
Por lo tanto, la concentración N2-5 es 0.002134 g/ml
V.
DISCUSIÓN
Según la Ley de Beer (WALTON, 2005); para la obtención de la curva de
calibración,
se
representan
gráficamente
las
absorbancias
y
las
concentraciones de las muestras, cuya relación debe mostrar un comportamiento lineal; concordando con el autor, obtuvimos una ecuación lineal de las concentraciones c1= 0.000012g/ml, c2= 0.00024g/ml, c3= 0.0048 g/ml, c5= 0.000012g/ml, con sus respectivas absorbancias a1= 1.294, a2= 1.424, a3= 1.938, a5=1.540. Según SIERRA (2010), se debe seleccionar la longitud de onda más adecuada para realizar las medidas que corresponden a un máximo de absorbancia, con la finalidad de obtener los resultados dentro de los límites permitidos. Para la práctica se se escogió una longitud de onda de (240 nm) por lo tanto el valor de R² = 0.9549 de la ecuación de la gráfica de la relación absorbancia vs concentración, concordando con el autor, puesto que se trabajó dentro de la medida adecuada.
VI.
CONCLUSIONES
- Se determinó la concentración del bromocrosol verde a través de espectrofotómetro visible, siendo este 0.000012g/ml para una absorbancia de 1.540. −Se determinaron las concentraciones de cada una de las muestras realizadas siendo estas c1= 0.000012g/ml, c2= 0.00024g/ml, c3= 0.0048 g/ml, c5= 0.000012g/ml. −Se obtuvieron las absorbancias de cada una de las muestras, siendo éstas a1= 1.294, a2= 1.424, a3= 1.938, a5=1.540. −Se determinó la ecuación de la gráfica de la relación absorbancia vs concentración, siendo esta y=0.0071x - 0.0088, a partir de la cual se calculó la absorbancia teniendo como dato la concentración. −Se determinó que la relación de la concentración vs absorbancia es directamente proporcional, es decir, a mayor concentración mayor será la absorbancia.
−No se trabajó con la concentración c4=0.0096 g/ml, debido a que el espectrofotómetro no efectuó la medición.
VII.
RECOMENDACIONES
−Diluir completamente la muestra. −Vigilar que al momento del análisis de la muestra en el espectrómetro, en la habitación no se produzca cambios bruscos en la circulación de las masas de aire, para que así no haya interferencia en el análisis. −Esperar que el dato proporcionado por el espectrómetro se vuelva constante para considerarlo valido.
VIII.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
OLSEN E. 1990. Métodos ópticos de análisis. Madrid, España. Editorial Reverte S.A. España. 756 p. HARRIS D. 2007. Análisis químico cuantitativo. 3 ed. Madrid, España, Editorial Reverte S.A. 418 p.
WILLARD H., et al.
1986.
Métodos instrumentales de análisis. México D.F,
México, Editorial Continental S.A. 593 p. CONNOR, K. 1980. Curso de análisis farmacéutico. 1 ed. Madrid, España, Editorial Reverté S.A. 228 p. MIÑONES, J. 1978. Manual de técnicas instrumentales. México D.F, México, Círculo editor Universo. 146 p.
WALTON H. 2005. Análisis químico e instrumental moderno. 4 ed. Barcelona, España, Editorial Reverté. 385 p. UMHE.
2013.
Ley
de
Lambert-Beer
[En
línea]:
(http://repositorio.innovacionumh.es/Proyectos/P_22CursoMateriales/Miguel _Angel_Sogorb/Wimba/Espectroscopia_05.htm, 4 de junio del 2015)
IX.
ANEXOS
Figura N째5. Mezcla del bromocrosol verde con agua
Figura N°6. Pruebas para el análisis con volúmenes de 8ml, 4ml, 2ml, 1 ml respectivamente Figura N°7. Espectrofotómetro
UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE CIENCIAS AMBIENTALES
ANALISIS INSTRUMENTAL
ESPECTROSCOPÍA DE RADIACIÓN UV-VIS
DOCENTE
: Ing. DIONISIO MONTALVO, Franklin
ALUMNOS
: BARRUETA PAUCAR, Mayori CRISTANCHO ARIZA, Krystell FERNÁNDEZ ESCOBAR, Angie MANRRIQUE GUERRA, Luis OSORIO PEDRAZA, Erick POMA CATALÁN, Maribel
CICLO
: I - 2015 JUNIO 2015