“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
INFORME FINAL DEL PROYECTO PROCYT 338-2007-CONCYTEC-OAJ
“IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS DEL GÉNERO BACILLUS AISLADAS DE LA CADENA PRODUCTIVA DE ESPÁRRAGO BLANCO (ASPARAGUS OFFICINALIS)”
INVESTIGADORES:
Dra. Carmen Velezmoro
UNALM
Dra. Doris Zuñiga
UNALM
Dr. Arthur Teixeira
U. Florida (USA)
Ing. Edgar Benites
South Science S.A.C.
Ing. Adis Gomero
South Science S.A.C.
ASISTENTES DE INVESTIGACIÓN:
Blga. Elena Ramos
UNALM
Bach. Blgo. Carlos García
UNALM
COLABORADORES
Dr. Ernesto Ormeño
CCG – UNAM, México
Bach. Blgo. César La Torre
UNALM
Bach. Blgo. Minoru Matsubara
UNALM
INSTITUCIÓN EJECUTORA PRINCIPAL: Universidad Nacional Agraria La Molina. Av. La
Molina s/n - La Molina – Lima – Perú
CORRESPONDENCIA:
Dirección: Calle Segovia 160 Dpto. 301 Urbanización Higuereta, Surco – Lima Correo electrónico: cevs@lamolina.edu.pe Telefax: 349 - 5678
FUENTE DE FINANCIAMIENTO: Consejo Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación
Tecnológica CONCYTEC. 1
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
RESUMEN
Para la identificación de cepas del género Bacillus aisladas de diferentes etapas en el cultivo y procesamiento de espárragos blancos, se emplearon técnicas moleculares (BOX-PCR), a fin de agrupar los perfiles obtenidos. Se estandarizó la extracción del DNA mediante el kit AxyPrep Bacterial Genomic DNA Miniprep (Axygen Scientific, Inc. – USA). Se determinó que la cantidad óptima de DNA para la realización de la amplificación BOX-PCR fue de 1 a 8 µL de DNA. Se utilizó el marcador molecular GeneRuler 1 kb DNA Ladder Plus (Fermentas Inc. USA) para comparar los perfiles. Una vez formados los grupos se tomaron representantes y se realizó la amplificación del gen ribosomal 16S. Los productos de reacción fueron purificados con el kit AxyPrep PCR Cleanup y enviados al Laboratorio Macrogen Inc. (Korea) para su secuenciamiento. Las secuencias fueron procesadas mediante los programas BIOEDIT, CHROMAS y MEGA4 para observar las relaciones filogenéticas entre cepas evaluadas y de referencia. Se obtuvieron perfiles de 169 cepas, que formaron 29 grupos de acuerdo al patrón de bandas de la amplificación BOX-PCR. El procesamiento de las secuencias de 34 perfiles, representantes de los grupos anteriores, dio como resultado la identificación de 7 especies del género Bacillus y 1 del género Paenibacillus. En el muestreo de validación de espárragos en la línea de envasado se obtuvieron 34 perfiles de los cuales 23 correspondieron a perfiles de 5 especies de Bacillus obtenidas en las evaluaciones previas y 11 no correspondieron a ninguna de las especies identificadas. La identificación bioquímica mediante el Kit API 50 CHB coincidió al 99,9% de seguridad con el 64,71% de las cepas ensayadas, que previamente fueron identificadas por la técnica molecular. En este trabajo también se obtuvieron curvas de crecimiento de B. pumilus, B. licheniformis y B. subtilis mediante técnicas espectrofotométricas. Se calculó el tiempo de generación de estas tres bacterias, para B. pumilus 0.531 h, para B. licheniformis 0.585 h y para B. subtilis 0.442 h. Palabras clave: espárragos blancos, Bacillus, amplificación BOX-PCR, secuenciamiento, curvas de crecimiento
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ABSTRACT
Identification of Bacilli strains isolated from several stages of white asparagus breeding and processing, were performed by molecular techniques (BOX-PCR) to group obtained profiles. DNA extraction was standardized through AxyPrep Bacterial Genomic DNA Miniprep kit (Axygen Scientific, Inc. – USA) and the optimal amount of DNA in BOX-PCR reaction was between 1 and 8 µL of DNA. Molecular marker GeneRuler 1 kb DNA Ladder Plus (Fermentas Inc. USA) was used to compare different profiles. Once grouping was finished, representative of each group were chosen to amplify 16s ribosomal gene. The reaction products were purified by AxyPrep PCR Cleanup kit and sent to Macrogen Inc. Laboratory (Korea) for its sequencing. Resulting sequence were process with BIOEDIT, CHROMAS and MEGA4 software to observe phylogenetic relations between evaluated and reference strains. 169 BOX-PCR were obtained which formed 29 groups according to bands patterns in BOXPCR amplification. Sequence processing of 34 profiles, representing those groups, resulted in 7 species from genus Bacillus and 1 from genus Paenibacillus. Validation sampling of asparagus from the packaging line resulted in 34 BOX-PCR profiles, 23 of which corresponded to profiles of 5 species of Bacillus obtained in the previous evaluation. 11 profiles did not correspond to none of the identified species by molecular techniques. 64,71% of the species identified with Biochemical test API 50 CHB were the same as molecular identification with 99,9% security. In this project growth curve of B. pumilus, B. licheniformis and B. subtilis were also obtained through spectrophotometrical techniques. Generation time was calculated from growth curves of 3 Bacillus species, for B. pumilus was 0.531 h, for B. licheniformis 0.585 h and for B. subtilis 0.442 h. Keywords: White asparagus, Bacillus, BOX-PCR amplification, sequencing, gowth curves
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I.
INTRODUCCIÓN
Las bacterias del género Bacillus están presentes en la mayoría de alimentos de origen vegetal. Estas especies forman parte del ecosistema natural, comportándose algunas veces como benefactoras en el crecimiento de las plantas, pero en otras ocasiones como causantes de enfermedades del tracto intestinal de los humanos. En un trabajo anterior, el grupo de investigación que presenta este informe, logró aislar 220 cepas pertenecientes a este género a partir del muestreo de la cadena productiva de espárragos blancos en conserva. Si bien estas bacterias no generan un peligro mortal, como en el caso del Clostridium botulimun, su destrucción es importante para la salud, por los disturbios intestinales que pueden generar y también desde el punto de vista comercial, pues se puede presentar un desarrollo de las esporas que sobreviven al tratamiento térmico, causando el deterioro de los vegetales o hinchamiento de los envases. En el monitoreo de las buenas prácticas de manufactura de alimentos enlatados, el conocimiento de las especies del género Bacillus responsables del deterioro del producto sería de vital importancia ya que estos poseen diferentes rangos de resistencia térmica (Stumbo, 1973). De ahí la importancia de su identificación. Para la identificación de las cepas hoy en día se emplean técnicas bioquímicas estandarizadas, que permiten en corto tiempo la identificación de la especie, dentro de cada género. Sin embargo debido al alto costo que significa emplear estas técnicas para todas las cepas aisladas, es que se plantea el uso de técnicas moleculares que permitan la identificación a nivel de especie por medio del análisis de las secuencias de nucleótidos del gen ribosomal 16s (Weisburg, 1991), el cual es muy conservado entre especies. El estudio de la evolución a nivel molecular ha permitido la construcción de arboles filogenéticos con mayor precisión y por ende una mayor especificidad al momento de identificar especies. Reva et al. (2001) realizaron la identificación fenotípica simplificada de bacterias xenófilas, aerobias, formadoras de esporas, del género Bacillus, entre otros. Los autores recomendaron emplear técnicas de identificación rápidas para ayudar a la selección de las cepas y posteriormente aplicar técnicas modernas de identificación más precisa. Entre las cepas identificadas se tuvieron 4 grupos, dos correspondientes a anaerobios facultativos, incluyendo aquellos que hidrolizan y no hidrolizan el almidón; y los otros dos de aerobios obligados diferenciados también por su capacidad de hidrolizar el almidón. Las claves para la identificación fueron presentadas en un medio interactivo mediante una página web. El entendimiento de la ecología de las especies de Bacillus y otros formadores de esporas, a través de la cadena alimentaria, es necesario para prevenir o reducir su presencia en los alimentos procesados (Durak et al. 2006). Con este fin es esencial identificar las especies y los géneros de bacterias formadoras de esporas, de una manera reproducible y estandarizada. El perfeccionamiento y la aplicación de estas técnicas aún no empleadas en nuestro país, permitirá a las empresas dedicadas al rubro de alimentos en conserva, diseñar sus procesos térmicos de una manera segura y confiable. Así como el monitoreo de la carga microbiana durante la línea de producción, referido a una especie en particular (análisis de riesgo).
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El objetivo general del proyecto fue la identificación de la diversidad de especies de Bacillus sp. presentes en las diferentes etapas del procesamiento de espárragos blancos para conserva. Los objetivos específicos fueron los siguientes: a. Agrupar e identificar a través de técnicas moleculares - PCR y secuenciamiento las cepas aisladas a partir de la cadena productiva de espárrago blanco en conserva. b. Validar la presencia de los microorganismos identificados en un nuevo muestreo bajo condiciones normales de proceso en la industria. c. Confirmar a través de pruebas bioquímicas - API la identificación de cepas representativas de algunas especies encontradas en espárrago blanco durante su procesamiento en una planta industrial.
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II.
REVISIÓN LITERARIA
Son varias las razones por las cuales las especies de Bacillus causan dificultades en las industrias de alimentos, entre ellas podemos mencionar las siguientes: 1. Son difíciles de eliminar de los productos alimenticios y sistemas de procesamiento de alimentos, debido a su formación de esporas, las cuales son ubicuas y altamente resistentes a condiciones adversas como calor, deshidratación y otras formas de estrés físico (Kamat et al., 1989; Anderson et al., 1995; Larsen & Jørgensen, 1999). 2. Las esporas, tanto como las células viejas son hidrofóbicas y tienen características adhesivas, las cuales facilitan su adhesión a las superficies de los equipos de procesamiento, con el resultado de la formación de biofilms (Anderson et al., 1995; Granum & Rönner, 1998, Peng et al., 2001; Heyndrickx & Scheldeman, 2002). 3. Tanto esporas como células vegetativas parecen haber incrementado su tolerancia o resistencia al estrés ambiental, lo que les ha permitido su supervivencia bajo condiciones o a través de tratamientos considerados para detener el crecimiento o inactivar todos los microorganismos viables (Heyndrickx & Scheldeman, 2002). Técnicas moleculares empleadas en la identificación de microorganismos La identificación y clasificación de bacterias es de crucial importancia en microbiología ambiental, industrial, médica, agrícola y ecología microbiana. Existen diferentes métodos fenotípicos y genotípicos (Louws et al., 1996) que son empleados para la identificación y clasificación microbiana (Figura 1). Cada uno de estos métodos nos permite obtener un cierto nivel de identificación filogenético de género, especie, subespecie, biovar, hasta llegar a nivel de una cepa específica. Familia Géneros
Especies Secuenciamiento DNA
Subespecies Cepa
Secuenciamiento 16S rDNA ARDRA Reasociación DNA-DNA tRNA-PCR ITS-PCR RFLP LFRFA PFGE Isosima multilocus Perfil proteico de la célula total AFLP RAPD’s APPCR rep - PCR Fuente: Rademaker y De Bruijn, 1997
FIGURA 1. Resolución relativa de varios perfiles y técnicas de DNA 3
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Actualmente los métodos moleculares son más confiables, simples y baratos en la identificación de microorganismos; de hecho, la asignación de género/especie ha sido tradicionalmente basada en la hibridación DNA-DNA (Wayne et al., 1987) y en la filogenia moderna el método más difundido en la actualidad está basado en el análisis del secuenciamiento del gen ribosomal 16S (Woese, 1987; Stackebrandt & Goebel, 1994). Sin embargo, autores como Schloter et al. (2000), Stackebrandt & Goebel (1994) mencionan que este método provee solo una resolución limitada. Ellos remarcan que el uso no crítico de los resultados de la comparación del gen ribosomal 16S pueden llevarnos a una identificación incorrecta y peor aún a la asociación incorrecta de secuencias de DNA con especies particulares, lo cual multiplicaría el error muchas veces. El empleo conjunto de métodos moleculares y bioquímicos son útiles para corroborar la identificación obtenida del secuenciamiento del gen ribosomal 16S (Reva et al., 2001). La introducción de la PCR, en diagnóstico microbiano, establece una alternativa viable a los métodos tradicionales de cultivo (Marlony et al., 2003). Esta técnica presenta diversas ventajas en relación a los métodos tradicionales, como mayor poder de tipificación y discriminación, mayor rapidez, buen límite de detección, mayor selectividad, especificad, potencial para automatización y la posibilidad de trabajar con bacterias que no son cultivables en medios de cultivo normalmente utilizados (Bush & Nitschcao, 1999). Los principales obstáculos en la implementación de la técnica en la rutina de laboratorios, son la incapacidad del método de diferenciar células vivas y muertas, la presencia de inhibidores de enzima polimerasa en algunos alimentos, la alta inversión en equipamiento y reactivos y la falta de aprobación y reglamentación por parte de los órganos oficiales (Marlony et al., 2003). Otra desventaja es la complejidad del método, principalmente para ser utilizado en análisis de rutina, a pesar del reciente desarrollo de kits básicos en PCR, que han facilitado su utilización y difusión (Boer & Beumer, 1999). Otros factores pueden influenciar en la eficiencia de la PCR, pudiendo resaltar entre ellas la concentración de iones de magnesio, la temperatura de cada ciclo, la duración de cada una de las etapas de un ciclo, números de ciclos, la concentración de los dNTPs y la concentración de la polimerasa. Contaminantes presentes en la atmósfera también pueden inhibir la reacción (Clarke, 1992) y enzimas termoestables producidas por microorganismos pueden degradar los productos de la amplificación (Nakajima et al., 1994; Destro, 1995). Por otro lado, la reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction) es una técnica altamente sensible por medio de la cual son obtenidas millones de secuencias de ácidos nucleicos, por medio de una reacción enzimática, a partir de pequeñas cantidades de secuencias de DNA ó RNA específicas. Desarrollado inicialmente por Kary B. Mullis en 1985 (Avila et al., 2008), esta técnica permite obtener millones de copias en un segmento específico de DNA por medio de la acción de la enzima Taq DNA polimerasa y de oligonucleótidos iniciadores (primers) sobre un DNA molde. Es realizado en un equipo automatizado y computarizado, denominado termociclador, que promueve la alternancia de temperaturas por determinados periodos de tiempo, posibilitando la ocurrencia de ciclos repetitivos de desnaturalización y síntesis de DNA (Konemam et al., 2001). La descripción de la reacción en cadena de la polimerasa (Mullis & Faloona, 1987) ha posibilitado un gran avance en las técnicas de biología molecular. Se ha transformado en las últimas décadas en un instrumento de investigación altamente especializado y en una técnica aplicada en diversas áreas como microbiología, inmunología, oncología, genética, medicina 4
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forense, transplantes de órganos entre otros (Destro, 1995). Así mismo, diversos autores han descrito la utilización de técnicas fundamentadas en PCR para la detección directa de microorganismos en alimentos (Rossen et al., 1991; Jensen et al., 1994; Destro, 1995; Gandra, 2006). Además, debe señalarse que las familias de elementos repetitivos intergénicos han sido descritas en diversas especies bacterianas (Gillings & Holley, 2003), estos elementos son secuencias genómicas conocidas, conservadas, repetitivas y de concenso, denominadas REP (Repetitive Extragenic Palindromic), ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) y secuencias repetitivas conservadas, denominadas simplemente BOX (Farber et al., 2001). Los primers para estas secuencias son llamados primers “de consenso” han sido diseñados y utilizados para amplificar regiones entre estos elementos repetitivos por medio de PCR, generando perfiles específicos (fingerprinting), que pueden ser utilizados para tipaje e identificación de especies bacterianas. Extracción de DNA La lisis bacteriana es un procedimiento común a muchas áreas de investigación en microbiología (Chassy & Giuffrida, 1980), así, la preparación de membranas intactas, protoplastos, esferoplastos, ácidos desoxirribonucleicos de alto peso molecular (DNA) y plásmidos constituyen unos pocos ejemplos que requieren de un procedimiento de remoción o debilitamiento de la pared celular. Para efecto de nuestros ensayos moleculares, la correcta liberación del DNA es el paso fundamental para el éxito de las pruebas de amplificación, para ello partimos de un cultivo puro de crecimiento overnight (12 – 16 horas de incubación), pues ha sido observado que la resistencia a lisozima de muchas células en fase estacionaria es mayor que en cultivos en crecimiento (Brumfitt et al., 1958 y Holden & Van Balgooy, 1965), lo cual es atribuido al incremento de grupos O-acetil y la disminución de los grupos N-acetil en la pared celular. La lisozima, (mucopéptido N-muramil-hidrolasa) hidroliza repetitivamente los enlaces Nacetilglucosamina-β-1 4-N-ácido acetil murámico, presentes en la pared celular bacteriana. Esta hidrólisis causa frecuentemente la lisis de bacterias Gram negativas a menos que estén presentes estabilizadores osmóticos que protejan los esferoplastos osmo frágiles que resultan de la acción de la muramidasa. Para el caso de bacterias Gram positivas, al cual pertenece el género Bacillus, la resistencia a la acción de la lisozima es mayor, debido al grosor y densidad de su pared celular. Chassy & Giuffrida (1980) han reportado que son muchos los factores que pueden influenciar la eficiencia de lisis, por ejemplo, la duración de la incubación con exposición a lisozima, mejora el proceso. Sin embargo, la exposición prolongada de las células a 37ºC puede ocasionar degradaciones en el interior celular. Así, periodos de incubación de 60 minutos han sido ensayados para Streptococcus mutans y 90 minutos para Lactobacillus casei 64H. En la misma investigación de Chassy & Giuffrida (1980), la elección de buffers se mostró determinante en el éxito de los experimentos de lisis. Basados en su experiencia con Gram negativos, muchos investigadores han inchuído el ácido etilendiamin-tetra acético (EDTA) en los buffers para incubación con lisozima para microorganismos Gram positivos, práctica que disminuye la extensión de la lisis. Amplificación BOX BOX-PCR, es un método de Repetitive Extragenic Polymorphism (REP) PCR, utilizado para diferenciar cepas de bacterias, utiliza un primer oligonucleótido simple para producir un 5
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arreglo específico de bandas por amplificación de secuencias entre repeticiones extragénicas conservadas entre la mayoría de genomas bacterianos. Esta técnica ha sido utilizada para evaluar la diversidad genotípica de Bacillus cereus en miel (López & Alippi, 2007) la prevalencia y diversidad de cepas de B. licheniformis en plumajes de aves (Whitaker et al, 2005), entre otros Secuenciamiento El término secuenciamiento se refiere a métodos para determinación del orden de las bases de nucleótidos (adenina, guanina, citosina y timina) en una molécula de DNA. Las primeras secuencias de DNA fueron obtenidas utilizando métodos basados en cromatografía bidimensional a principios de 1970. Posteriormente, el desarrollo de secuenciamientos basados en bases nitrogenadas teñidas permitió que se realice de manera fácil y rápida. Estos métodos emplean bases nitrogenadas marcadas (dye dNTPs), que permiten el secuenciamiento en una sola reacción de polimerización, la cual da como resultado una molécula de DNA con bases que emiten diferentes longitudes de onda o fluorescencia, proporcionanando un cromatograma en el cual cada base nitrogenada presenta un color característico que permite la lectura de la secuencia (Figura 2).
FIGURA 2. Secuencia de nucleóticos proporcionada por un cromatograma
Caracterización Bioquímica mediante kits de identificación API 50 CHB La galería API 50 CHB permite el estudio de la fermentación de sustratos pertenecientes a la familia de los carbohidratos y derivados (heterósidos, polialcoholes, ácidos urónicos). Los ensayos de fermentación se inoculan con API 50 CHB/E Medium que rehidrata los sustratos de los microtubos. Durante el periodo de incubación, la fermentación se traduce en un cambio de color en el tubo, debido a una producción de ácido en anaerobiosis revelada por el indicador de pH del medio elegido. El primer tubo sin principio activo, sirve como testigo negativo. En la Tabla 1, se detallan las pruebas bioquímicas que sirven para la identificación de las cepas del género Bacillus.
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TABLA 1. Composición de la galería API 50 CH TUBO
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
ENSAYO
COMPUESTO ACTIVO
TUBO
ENSAYO
COMPUESTO ACTIVO
GLY ERY DARA LARA RIB DXYL LXYL ADO MDX GAL GLU FRU MNE SBE RHA DUL INO MAN SOR MDM MDG NAG AMI ARB
Testigo Glicerol Eritritol D-Arabinosa L-Arabinosa D-Ribosa D-Xilosa L-Xilosa D-Adonitol Metil-βD-Xilopiranosida D-Galactosa D-Glucosa D-Fructosa D-Mamnosa D-Sorbosa L-Rhamnosa Dulcitol Inositol D-Manitol D-Sorbitol Metil-αD-Manopiranosida Metil-αD-Glucopiranosida N-Acetilglucosamina Amigdalina Arbutina
25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49
ESC SAL CEL MAL LAC MEL SAC TRE INU MLZ RAF AMD GLYG XLT GEN TUR LYX TAG DFUC LFUC DARL LARL GNT 2KG 5KG
Esculina citrato férrico Salicina D-Celobiosa D-Maltosa D-Lactosa D-Melibiosa D-Sacarosa D-Trehalosa Inulina D-Melezitosa D-Rafinosa Almidón Glicógeno Xilitol Gentiobiosa D-Turanosa D-Lixosa D-Tagatosa D-Fucosa L-Fucosa D-Arabitol L-Arabitol Gluconato potásico 2-Cetogluconato potásico 5-Cetogluconato potásico
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III.
MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. MATERIAL BIOLÓGICO Las cepas de Bacillus sp. empleadas para la identificación mediante la aplicación de técnicas moleculares, fueron obtenidas como producto del proyecto PROCOM - CONCYTEC “Evaluación de microorganismos de importancia para el tratamiento térmico en la cadena productiva de conservas de espárrago blanco (Asparagus officinalis)” desarrollado en el 2006 (Velezmoro et al., 2007) en una empresa agroindustrial dedicada al cultivo y procesamiento de espárragos para exportación, Trujillo – Perú, de donde se tomaron muestras en toda la cadena productiva de espárragos blancos en conservas, desde los suelos del campo de cultivo, hasta el producto envasado antes de su esterilización. Para la construcción de curvas de crecimiento, empleando técnicas espectrofotométricas y de recuento, se ensayaron las especies identificadas en el mismo proyecto anterior, mediante API 50 CHB que tuvieron una excelente identificación con 99.9 % ID (Tabla 2). La validación de la presencia de las especies identificadas (técnicas moleculares y bioquímicas) fue realizada empleando cepas aisladas de las muestras tomadas en el segundo semestre del 2008, durante diferentes etapas de la producción en la misma industria mencionada anteriormente (Trujillo, Perú). TABLA 2. Cepas de Bacillus ensayadas, identificadas con el sistema API 50 CHB Código
2M3BE12
2M3BE23
2M2CE
Grupo Esporogénico
Procedencia de la cepa
Taxón significativo (API 50 CHB)
EMANA
Espárragos blancos envasados (frasco 315) con 3 horas de espera (muestra 9) II Etapa, Muestreo 3
B. pumilus Excelente identificación 99.9 % ID
Espárragos blancos frescos. recepción (muestra 2, provenientes de suelo Módulo III, Turno 4, Lote 77- 78) II Etapa, Muestreo 3
B. licheniformis Excelente identificación 99.9 % ID
Caldo púrpura de bromocresol - Control de esterilidad II Etapa, Muestreo 2
B. subtilis/amyloliquefaciens Excelente identificación 99.9 % ID
EMANA
EMANA
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3.2. OBTENCION DE CURVAS DE CRECIMIENTO DE CEPAS BACILLUS POR TECNICAS ESPECTROFOTOMÉTRICAS, DE RECUENTO Y PRODUCCIÓN DE ESPORAS EN MEDIO LÍQUIDO Materiales y equipos
Shaker a 125 rpm Espectrofotómetro a 600 nm Estufa de incubación a 35ºC Baño de agua para templar el agar fundido, 44 – 46ºC Vórtex Asa de siembra Matraces con 100 mL de caldo TGE Botellas con 100 mL de Agar TGE Placas Petri de pyrex, 100 x 15 mm, estériles Micropipetas de 10 -100 µL y de 100 – 1000 µL Tips de 100 µL y 1000 µL Tubos de vidrio estériles Tubos Eppendorf Pipetas graduadas de 1mL, 5 mL y 10 mL
Procedimiento A. PREPARACIÓN DEL INÓCULO: 1. Se realizó un lavado con solución salina de las colonias puras de la cepa seleccionada, crecidas previamente en placas de Agar TGE e incubadas por 18 - 24 horas a 35 ± 1ºC (Figura 3). 2. La suspensión obtenida fue traspasada a tubos de vidrio conteniendo solución salina estéril, homogenizando la muestra. 3. Se ajustó la suspensión a una transmitancia de 90% medida al espectrofotómetro a una longitud de onda de 600 nm. correspondiente a una concentración aproximada de 107 UFC/mL. 4. Se traspasó a los matraces con caldo TGE una alícuota de la suspensión anterior que contenía aproximadamente entre 1 - 100 UFC/mL, incubándose a 28 ± 1ºC en agitación constante a 125 rpm. 5. Se determinó la concentración inicial del inóculo.
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Lavar con solución salina las cepas puras y traspasar la suspensión obtenida a tubos de vidrio.
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Ajustar la suspensión a una transmitancia de 90% (600 nm.), correspondiente a una concentración aproximada de 107 UFC/mL
Traspasar a matraces con caldo TGE (1 100 UFC/mL)
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Incubar a 28 ± 1ºC en agitación constante a 125 rpm.
FIGURA 3. Preparación del inóculo
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B.
ENUMERACIÓN DE CÉLULAS TOTALES POR ESPECTROFOTOMETRÍA Y RECUENTO EN PLACA
En cada tiempo de evaluación, se retiró de los matraces 2.5 mL de inóculo y se traspasó a un tubo de vidrio estéril, este volumen sirvió para medir la densidad óptica en el espectrofotómetro a 600 nm, realizar el recuento de células totales, recuento de bacterias esporogénicas, recuento directo y tinción de esporas.
B.1 RECUENTO DE CÉLULAS TOTALES Materiales y Equipos
Placas Petri de pyrex, 100 x 15 mm, estériles Micropipetas de 10 - 100 µL y de 100 – 1000 µL Tips de 100 µL y 1000 µL Tubos Eppendorf Pipetas graduadas de 1mL, 5 mL y 10 mL Baño de agua para templar el agar fundido, 44 - 46° C Estufa de incubación, 35 ± 1ºC Agar TGE (Triptona Glucosa Extracto de carne)
Procedimiento 1. Se traspasó una alícuota de 100 µL de la suspensión preparada en tubos eppendorf conteniendo un volumen de diluyente igual a 9 veces la suspensión (dilución 10-1). Se homogenizó haciendo uso de vórtex (Figura 4). 2. Se realizó diluciones sucesivas, sembrando por duplicado, en placas Petri estériles, alícuotas de las diluciones menos concentradas. 3. Se incorporó agar TGE licuado y temperado a 46ºC, a cada una de las placas Petri inoculadas. 4. Se dejó solidificar el medio de las placas, invirtiéndolas e incubándolas en estufa a 35 ± 1ºC por 24 -48 horas.
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Tomar 100 µL del inóculo en 900 µL de solución salina.
100 µL
Realizar diluciones y sembrar en placas petri las diluciones menos concentradas, agregar agar TGE.
100 µL
100 µL
100 µL
Incubarlas en estufa a 35 ± 1ºC por 24 -48 horas.
FIGURA 4. Recuento de células totales
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B.2 RECUENTO DE BACTERIAS ESPOROGENICAS (APHA, 1992) Materiales y equipos
Placas Petri de pyrex, 100 x 15 mm, estériles Micropipetas de 10 -100 µL y de 100 – 1000 µL Tips de 100 µL y 1000 µL Tubos Eppendorf Pipetas graduadas de 1mL, 5 mL y 10 mL Baño de agua para templar el agar fundido, 44-46° C Estufa de incubación, 35± 1ºC Baño María de 80 - 100ºC Botellas de vidrio conteniendo 100 mL de Agar TGE (Triptona Glucosa Extracto de carne), estéril
Procedimiento 1. Se fundieron las botellas que contenían los 100 mL de agar TGE y se temperó el medio de cultivo en baño de agua a 45° C. 2. En un juego de tres frascos de TGE se inoculó: 10 mL en el primero, 1 mL en el segundo y 0.1 mL en el tercero, como lo visto en la Figura 5. Se pueden requerir un mayor número de diluciones, de acuerdo a la concentración esperada de esporas. 3. Se agitó vigorosamente los frascos para dispersar la muestra en el medio de cultivo. 4. Se llevaron los frascos al baño maría a una temperatura de 80° C por 30 minutos. 5. Luego se colocaron los frascos en Baño María a 45° C, por 10 minutos como máximo. 6. El medio de cultivo fue plaqueado en cinco placas, homogenizando previamente. Se dejó solidificar el agar, las placas fueron invertidas e incubadas a 35° C por 48 horas. 7. Para expresar los resultados se realizó el recuento de las colonias superficiales y subsuperficiales de cada una de las cinco placas; la suma de ellas representó el número de bacterias esporogénicas mesófilas aerobias por dilución. El número de colonias fue multiplicado por el factor de dilución, para calcular la cantidad de UFC/ mL.
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Agar TGE Suspensión en solución salina. Medir 90 - 93% Transmitancia Medio de esporulación 10 mL.
1 mL.
0.1 mL.
Inocular en tres frascos con agar TGE. Agitar
Incubar a 80° C por 30 minutos
Enfriar hasta 45º C
Repartir el contenido de cada botella en 5 placas. Incubar 35° C por 48 horas
FIGURA 5. Recuento de bacterias esporogénicas
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B.3 RECUENTO DIRECTO DE CÉLULAS Materiales y Equipos
Microscopio Vórtex Asa de siembra Cámara de Neubauer Micropipetas de 10 -100 µL y de 100 – 1000 µL Tips de 100 µL y 1000 µL Tubos de vidrio estériles Láminas portaobjeto Set de coloración para esporas Set de coloración Gram
Procedimiento 1. Se traspasó 0.5 mL de los matraces con el inóculo a otro tubo para el recuento
celular en cámara de Neubauer. Se hicieron diluciones en caso fuera necesario, éstas fueron realizadas con caldo TGE. La lectura se hizo con ayuda de un colorante de contraste (Azul de metileno). 2. Se realizó el recuento de células de cada uno de los tubos con la ayuda de la cámara
de Neubauer. Para calcular la cantidad de UFC/ mL se multiplicó el número de células totales contadas por el factor de dilución (si lo hubiera) y luego se dividió entre el factor proveniente de la cámara de Neubauer.
UFC/mL = Nº Cél. x 25 x 50 x 1000
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B.4 TINCIÓN DEL INÓCULO B.4.1 TINCIÓN DE ESPORAS (Método de WIRTZ) Materiales y Equipos
Microscopio Mechero de Bunsen Láminas portaobjetos Asa de Kölle Pinzas de madera Verde de malaquita 5 % Safranina Agua destilada Aceite de inmersión
Procedimiento Fijación de la muestra 1. Se rotularon convenientemente cada una de las láminas portaobjetos, cuidándose que las láminas utilizadas se encontraran bien limpias. 2. Se colocó una gota de solución salina 0.85% sobre la lámina portaobjetos. 3. Extensión por calor: Con ayuda de un asa de Kölle previamente esterilizada a la llama, se llevó una pequeña cantidad del cultivo sobre la gota de solución salina. Se extendió el cultivo sobre la superficie de la lámina portaobjetos y se expuso a la llama del mechero hasta el secado (Figura 6). Coloración de la muestra 1. Se agregó colorante verde de malaquita 5 % hasta cubrir toda la lámina. 2. La lámina fue calentada hasta emisión de vapores, repitiendo dicho calentamiento por tres veces (no se permitió que hierva ni que se seque el colorante. En caso de riesgo de secado, se agregó colorante sobre el preexistente, hasta cubrirlo nuevamente. 3. Se enjuagó con agua destilada 4. Se agregó colorante safranina y se dejó actuar 30 segundos. 5. Se lavó la lámina con abundante agua corriente. 6. Una vez que la preparación estuvo totalmente seca, se colocó sobre ella una gota de aceite de inmersión y se observó al microscopio con el objetivo de inmersión.
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1
A
A Colocar una colonia o una asada del inóculo en una lámina portaobjeto
C
2
A
Fijar la muestra al calor
3
A
A
Agregar verde de malaquita
A
4
A
5 Flamear la muestra 3 veces A
A
Lavar con agua destilada 6 A
A
7
Agregar safranina x 30 seg A
A
Lavar con agua destilada 8 A
A
Observación al microscopio
FIGURA 6. Tinción de esporas
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B.4.2 TINCIÓN DE BACTERIAS (Método de GRAM) Materiales y Equipos
Microscopio Mechero de Bunsen Láminas portaobjetos Asa de Kölle Pinzas de madera Cristal violeta Lugol Alcohol-acetona (80:20) Safranina Agua destilada Aceite de inmersión
Procedimiento Fijación de la muestra Como lo descrito en el procedimiento de la técnica anterior Coloración de la muestra 1. Se agregó cristal violeta sobre la muestra fijada, dejando reposar por 1 minuto (Figura 7). 2. Se enjuagó con agua destilada. 3. Se agregó lugol, dejando expuesto por 1 minuto. 4. Se realizó la decoloración con alcohol – acetona (80:20). 5. Se lavó con agua destilada. 6. Se adicionó colorante safranina, dejando reposar por 30 segundos. 7. Se lavó con agua corriente. 8. Una vez que la preparación estuvo totalmente seca, se colocó una gota de aceite de inmersión y se observó al microscopio con el objetivo de inmersión.
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1
A
A
C
2
A
Colocar una colonia o una asada del inóculo en una lámina portaobjeto Fijar la muestra al calor
3 A
A
4
Agregar cristal violeta x 1 min A
A
5
Lavar con agua destilada A
A
6
Agregar lugol y dejar x 1 min
A
A
Decolorar con alcohol – acetona (80:20) x 15 seg
7 A
A
Lavar con agua destilada
8 A
A
Agregar safranina x 30 seg.
9 A
A
Lavar con agua destilada
10 A
A
Observación al microscopio
FIGURA 7. Tinción Gram 19
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3.3 REACTIVACIÓN DE CEPAS DE BACILLUS Y PREPARACIÓN DE CULTIVOS PARA EXTRACCIÓN DE DNA Materiales y Equipos
Placas Petri 100 x 15 mm con Agar Triptona Glucosa Extracto de carne (TGE) Tubos 13 x 100 mm con caldo TGE Asas de Kölle Estufa incubadora a 35 ± 1ºC
Procedimiento 1. Las cepas a ensayarse fueron crecidas por estría en placas de agar TGE e incubadas por 18 - 24 horas a 35 ± 1ºC (Figura 8). 2. De las colonias puras se tomó una asada y se colocó en tubos con caldo TGE y se incubaron por 12 - 16 horas a 35 ± 1ºC.
Agar TGE Caldo TGE De un cultivo puro en agar TGE traspasar una colonia a caldo TGE
Incubar 12-16 h a 35 ± 1ºC.
FIGURA 8. Reactivación y preparación de cultivos para extracción de DNA de cepas de Bacillus sp.
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3.4. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE CEPAS DE BACILLUS SP.
3.4.1 EXTRACCIÓN DE DNA DE CEPAS DE BACILLUS SP. El aislamiento del DNA genómico bacteriano por este kit, se basa en la liberación del DNA por un buffer de lisis celular (Buffer G-A). Además, la separación del DNA de proteínas, polisacáridos y lípidos se logra durante la separación de fases (Paso 6 de la técnica de extracción). El DNA genómico purificado en la fase inferior es atrapado por la columna Miniprep (Paso 8) la cual contiene una resina selectiva que captura el DNA y permite el paso de otras moléculas y/o residuos. Después de lavar sucesivamente con Buffer W1 y W2 para remover impurezas residuales y sales, el DNA purificado es eluído con Buffer Tris. Este kit es adecuado para la purificación de hasta 20 µg de DNA genómico a partir de 109 células bacterianas. El DNA purificado es predominantemente mayor a 30 kb y es adecuado para una variedad de aplicaciones que demandan DNA altamente puro y de elevado peso molecular, como PCR, análisis de Southern blot, RAPD, AFLP, RFLP, etc. Materiales y Equipos Cultivo overnight de cepas de Bacillus sp. en caldo TGE Vórtex Baño de agua a 37° C Baño de agua a 65° C Microcentrífuga Micropipetas de 0.1 – 2 µL, 1 – 10 µL, 10 -100 µL y de 100 – 1000 µL Tips de 10 µL, 100 µL y 1000 µL (estériles y de primer uso) Kit para extracción de DNA, AxyPrep Bacterial Genomic DNA Miniprep Kit (Axygen Scientific, Inc. – USA) Columnas AxyPrep Columnas de filtración Microtubos de 2 mL Microtubos de 1.5 mL Lisozima 50 mg/mL en glicerina al 50% Buffer S + RNAsa A (50 mg/mL) EDTA 0.25 M Buffer G-A Buffer G-B Buffer DV (2 mL de buffer DV-A + 125 mL de isopropanol* + 75 mL de isobutanol*) Buffer BV Buffer W1 Buffer W2 (24 mL d buffer W2 concentrado + 168 mL de etanol Q.P.*) Eluente (Tris-HCl 2.5 mM, pH=8.5) (*) Reactivos no provistos en el Kit
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Procedimiento 1. Se colocó 1.5 mL del caldo TGE con las cepas crecidas (incubadas a 35 ± 1ºC) en microtubos de 2 mL (ver Figura 9), se centrifugaron a 12000 g x 2 minutos. Se descartó totalmente el sobrenadante cuidando de no perturbar el pellet, y este se resuspendió con 150 mL de buffer S conteniendo la RNAsa A. Posteriormente se procedió a homogenizar, sin dejar flóculos. 2. Se agregaron 20 µL de lisozima y se homogenizó bien. Se incubó a 37ºC por 30 minutos. 3. Se le incorporó 30 µL de EDTA 0.25 M (pH=8). Se mezcló bien y se incubó inmediatamente en hielo por 5 minutos. 4. Se añadieron 450 µL de buffer G–A, agitando luego en vórtex por 15 segundos. Posteriormente se llevó a baño de agua a 65ºC por 10 minutos. 5. Se agregaron 400 µL de buffer G–B, seguido de 1 mL de buffer DV (previamente enfriado a 4ºC). Se homogenizó vigorosamente y se procedió a centrifugarlo a 12000 x g por 2 minutos. 6. Después de la formación de dos fases se procedió a extraer y descartar la fase superior (color azul). Se transfirió la fase inferior al interior de una columna de filtración colocada en un microtubo de 2 mL, centrifugando a 12000 x g por 1 minuto. 7. Se descartó la columna de filtración adicionando al filtrado 400 µL de buffer BV. 8. Se colocó una columna AxyPrep en otro microtubo de 2 mL al cual se transfirió el filtrado anterior. Se centrifugó a 12000 x g por 1 minuto. 9. Se descartó el filtrado del tubo. A la columna anterior se le añadió 500 µL de buffer W1 y se centrifugó a 12000 x g por 1 minuto. Se descartó el filtrado y se agregó 700 µL de buffer W2 y se centrifugó a 12000 x g por 1 minuto. Adicionalmente se agregaron 700 µL de buffer W2 a la columna AxyPrep y se centrifugó a 12000 x g por 1 minuto para remover las sales, eliminando problemas potenciales en reacciones enzimáticas subsecuentes. 10. Se descartó el filtrado y se colocó nuevamente la columna AxyPrep en el microtubo de 2 mL. Se procedió a centrifugarlo a 12000 x g por 1 minuto. 11. Se transfirió la columna AxyPrep a un microtubo de 1.5 mL limpio. Para eluir el DNA se agregaron 200 µL de eluente (previamente temperado a 60ºC para aumentar la eficiencia de la elución), teniendo cuidado de verterlo al centro de la membrana. Se dejó reposar por 1 minuto a temperatura ambiente, para luego centrifugarlo a 12000 x g por 1 minuto. 12. Las muestras de DNA fueron almacenadas a -20ºC.
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Centrifugar 1.5 mL de caldo TGE con cepas crecidas a 12000 g x 2 minutos.
Agregar 150 μl de Buffer S + RNAsa A Agregar 20 μl de lisozima Agregar 30 μl de EDTA 0.25 M Agregar 450 μl de Buffer G-A Agregar 400 μl de Buffer G-B
Lisis
Agregar 1 mL de Buffer DV Repetir extracción con Buffer DV
Formación de dos fases. Descartar la fase superior
Agregar 400 μl de Buffer BV
Filtrado
Agregar 500 μl de Buffer W1 Agregar 700 μl de Buffer W2 Repetir el lavado con Buffer W2
Agregar 100-200 μl del Eluente
Elución
FIGURA 9. Extracción de DNA
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3.4.2 VERIFICACIÓN DE LA CALIDAD DE DNA EXTRAÍDO (CONTROL DE CALIDAD) Materiales y Equipos
Balanza digital de 200 g de capacidad Probetas de 100 y 1000 mL Micropipetas de 0.1 - 2 µL y 1 - 10 µL Tips de 10 µL Cámaras electroforéticas con bandejas para gel de agarosa de 15 x 10 cm Fuente de poder de voltaje y tiempo regulable Transluminador de luz UV Cámara digital Buffer de carga (6X DNA Loading dye, Fermentas Inc. USA) Marcador molecular Lambda DNA 500 µg, Fermentas Inc. USA Buffer TBE 1X Agarosa Solución acuosa de bromuro de etidio (0.5 µg/mL) Agua destilada
Procedimiento A. Preparación del gel de agarosa 1% 1. Se realizó el pesado de 0.75 g de agarosa y se mezcló con agua destilada (c.s.p. 75 mL) y se licuó en el horno microondas hasta la completa disolución de los cristales de agarosa. 2. La preparación anterior, temperada a 50º C, fue vertida en una bandeja electroforética de 15 x 10 cm, previamente nivelada, a la cual se fue puesta el peine respectivo Se dejó solidificar, evitando la formación de burbujas. 3. Luego de solidificar se retiraron las paredes de goma y el peine, teniendo cuidado de no dañar los pocillos de vertido de la muestra. 4. Se transfirió la bandeja con el gel a la cámara de electroforesis. 5. La cámara de electroforesis fue cargada con buffer TBE 1X, hasta cubrir los pocillos de muestra.
B. Corrida electroforética de las muestras 1. Se mezcló 1.0 µL de buffer de carga con 5 µL de la muestra. 2. Se utilizó como marcador molecular Lambda DNA (1 µL), el cual se mezcló con 1 µL de buffer de carga. 3. Se procedió a cargar las mezclas realizadas con una micropipeta de 1 – 10 µL, dispensando cada muestra en un pocillo del gel. 24
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
4. Se cerró la cámara de electroforesis y se conectaron los cables en sus electrodos correspondientes. 5. Se programó la fuente de poder a 80 V por 60 minutos, iniciando la corrida.
C. Tinción del gel 1. Concluido el tiempo de corrida, se trasladó cuidadosamente el gel a una bandeja de solución acuosa de bromuro de etidio (0.5 µg/mL), dejando reposar durante 15 minutos. Trascurrido el tiempo anterior, se trasladó el gel a la bandeja con agua destilada y se dejó reposar durante 10 minutos para su lavado. 2. Se colocó el gel sobre el transluminador, encendiendo la luz UV 3. El gel revelado fue fotografiado.
3.4.3 AMPLIFICACIÓN BOX El análisis de los perfiles de bandas de la caja BOX se realizó de acuerdo a Versalovic et al., 1991. Materiales y Equipos
Termociclador Eppendorf Micropipetas de 0.1 - 2 µL, 1 - 10 µL, 10 - 100 µL y de 100 - 1000 µL Tips de 10 µL, 100 µL y 1000 µL (estériles y de primer uso) Microtubos de 1.5 mL Tubos para PCR de 0.2 mL (estériles y de primer uso) Buffer de carga (6X DNA Loading dye, Fermentas) BOX A1R (5' – CTACGGCAAGGCGACGCTGACG - 3') 10 pmol/mL Buffer Taq KCl 10X DMSO 100% MgCl2 25 mM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP 10 mM cada uno) Taq DNA polimerasa 5U/µL Agua miliQ
Procedimiento La PCR fue realizada en una mezcla de reacción de 25 µL contenidos en tubos para PCR debidamente rotulados (Figura 10). A. Mezcla de Reacción A continuación se detalla la formulación de la mezcla de reacción requerida para una amplificación BOX (Tabla 3). El volumen final por reacción fue de 25 µL.
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“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
TABLA 3. Mezcla para reacciones de amplificación BOX Reactivos Buffer KCl (X) MgCl2 (mM) DMSO (%) dNTPs (mM) Primer BOX A1R (pmol/mL) Taq DNA Polimerasa (U/µL) DNA (µL) Agua miliQ (µL)
Concentración Concentración Inicial Final 10 1,00 25 7,50 100 10,00 25 1,25 10 0,80 5 0,08
Volumen (25 µL) 2,50 7,50 2,50 1,25 2,00 0,40 1-8 c.s.p. 25,00
Dado el volumen de muestras, se realizó un master mix, multiplicando todos los volúmenes requeridos por el número de muestras a ensayar más una. Luego de dispensar la mezcla obtenida, se procedió a colocar el volumen respectivo de DNA y agua miliQ (c.s.p. 25 µL de reacción). La cantidad de DNA dependió de la concentración del mismo en el eluente de extracción, el cual fue evaluado previamente en la verificación del DNA.
B. Reacción de amplificación Los tubos para PCR fueron introducidos en el termociclador, previamente programado para la reacción de amplificación BOX. El perfil de temperatura fue el siguiente:
Desnaturalización inicial a 95º C por 3 min; 25 ciclos de desnaturalización a 93º C por 45 segundos, annealing a 53º C (BOX) por 1 min y extensión a 65º C por 8 min Extensión final a 65º C por 16 min.
C. Comprobación de la amplificación por electroforesis Materiales y Equipos
Balanza digital de 200 g de capacidad Probetas de 100 y 1000 mL Micropipetas de 0.1 - 2 µL y 1 - 10 µL Tips de 10 µL Cámaras electroforéticas con bandejas para gel de agarosa de 15 x 15 cm Fuente de poder de voltaje y tiempo regulable Transluminador de luz UV Cámara digital Buffer de carga (6X DNA Loading dye, Fermentas) Marcador molecular Gene Ruler 1 kb DNA Ladder Plus, Fermentas Inc. USA Buffer TBE 1X
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“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
Agarosa Solución acuosa de bromuro de etidio (0.5 µg/mL) Agua destilada
Procedimiento 1. Se preparó agarosa al 1.5 % en buffer TBE 1X y se vertió en una bandeja electroforética para gel de 15 x 15 cm, la cual fue dispuesta dentro de la cámara de electroforesis conteniendo la misma solución buffer anteriormente mencionada. 2. Se mezcló 1.2 µL del buffer de carga con 7 µL del amplificado 3. Se utilizó como marcador molecular GeneRuler 1 kb DNA Ladder Plus (1 µL), el cual se mezcló con 1.2 µL de buffer de carga. 4. Se procedió al cargado de las muestras y los marcadores moleculares. 5. Se cerró la cámara de electroforesis y se conectaron los cables en sus electrodos correspondientes. 6. Las muestras fueron corridas a 80 V por 180 minutos. 7. El gel fue revelado, como lo descrito en 3.2, C. 8. Se tomaron las fotografías del gel revelado.
3.4.4 AGRUPAMIENTO DE PERFILES BOX-PCR SEMEJANTES Materiales
Fotografías de los geles BOX revelados
Procedimiento 1. Los perfiles BOX de cada una de las cepas ensayadas, luego de haber sido revelados, son comparados entre ellos, buscando bandas en común que muestren un mismo peso molecular. 2. Se formaron agrupamientos de alta similitud, de manera que los patrones de los diferentes grupos obtenidos se diferenciaron uno del otro.
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Extracción de DNA
Verificación de la calidad de DNA extraído
BOX - PCR Desnaturalización inicial: 95º C / 3 min Ciclaje: 93º C / 45 seg. (25 ciclos)
Primer BOX A1R (5' – CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC G - 3')
53º C / 60 seg. 65º C / 8 min. Extensión final: 65º C / 16 min.
Gel de Agarosa al 1.5%
Comprobación de la amplificación por electroforesis
Tinción con Bromuro de Etidio
Revelado con transluminador y tomas fotográficas
Agrupamiento de perfiles similares
FIGURA 10. Caracterización molecular de cepas de Bacillus sp. 28
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
3.4.5 AMPLIFICACIÓN 16S Se eligieron representantes de cada agrupamiento (Sección 3.4) para el secuenciamiento del gen ribosomal 16s, el cual fue amplificado por medio de una reacción de PCR con los primers fD1 y rD1, posteriormente se procedió a limpiar las secuencias obtenidas con el kit PCR Cleanup de Axygen, La reacción de amplificación del gen ribosomal 16S se realizó con el fin de secuenciarlo y determinar la especie de las cepas ensayadas. Materiales y Equipos
Termociclador Eppendorf Micropipetas de 0.1 - 2 µL, 1 - 10 µL, 10 - 100 µL y de 100 - 1000 µL Tips de 10 µL, 100 µL y 1000 µL (estériles y de primer uso) Microtubos de 1.5 mL Tubos para PCR de 0.2 mL (estériles y de primer uso) Buffer de carga (6X DNA Loading dye, Fermentas) Primers: fD1: 5’ – CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG – 3’ rD1: 5’ – CCCGGGATCCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCC – 3’
Buffer Taq KCl 10X MgCl2 25 mM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP 10 mM cada uno) Taq DNA polimerasa 5U/µL Agua miliQ
Procedimiento La PCR fue realizada en una mezcla de reacción de 25 µL contenidos en tubos para PCR debidamente rotulados. A. Mezcla de Reacción A continuación se detalla la formulación de la mezcla de reacción requerida para una amplificación 16s (Tabla 4). El volumen final por reacción fue de 25 µL. TABLA 4. Mezcla para reacciones de amplificación 16S Reactivos Buffer KCl (X) MgCl2 (mM) dNTPs (mM) Primer fD1 (pmol/mL) Primer rD1 (pmol/mL) Taq DNA Polimerasa (U/µL) DNA (µL) Agua miliQ (µL)
Concentración Concentración Inicial Final 10 1,00 25 1,50 10 0,50 10 0,50 10 0.50 5 0.50
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Volumen (25 µL) 2,50 1,50 0,20 0,20 0,20 0,10 5 c.s.p. 25,00
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
Dado el volumen de muestras, se realizó un master mix, multiplicando todos los volúmenes requeridos por el número de muestras a ensayar más una. Luego de dispensar la mezcla obtenida, se procedió a colocar el volumen respectivo de DNA y agua miliQ (c.s.p. 25 µL de reacción). Una vez estandarizado el protocolo de extracción de DNA se llevaron los volúmenes de muestras de DNA a 5 µL.
B. Reacción de amplificación Los tubos para PCR fueron introducidos en el termociclador, previamente programado para la reacción de amplificación del gen ribosomal 16s. El perfil de temperatura fue el siguiente:
Desnaturalización inicial a 93º C por 2 min; 30 ciclos de desnaturalización a 93º C por 45 segundos. Annealing a 62º C por 45 seg. y extensión a 72º C por 2 min. Extensión final a 72º C por 5 min.
C. Comprobación de la amplificación por electroforesis Materiales y Equipos
Balanza digital de 200 g de capacidad Probetas de 100 y 1000 mL Micropipetas de 0.1 - 2 µL y 1 - 10 µL Tips de 10 µL Cámaras electroforéticas con bandejas para gel de agarosa de 15 x 15 cm Fuente de poder de voltaje y tiempo regulable Transluminador de luz UV Cámara digital Buffer de carga (6X DNA Loading dye, Fermentas) Marcador molecular Gene Ruler 1 kb DNA Ladder Plus, Fermentas Inc. USA Buffer TBE 1X Agarosa Solución acuosa de bromuro de etidio (0.5 µg/mL) Agua destilada
Procedimiento 1. Se preparó agarosa al 1 % en buffer TBE 1X y se vertió en una bandeja electroforética para gel de 15 x 10 cm, la cual fue dispuesta dentro de la cámara de electroforesis conteniendo la misma solución buffer anteriormente mencionada. 2. Se mezcló 1.2 µL del buffer de carga con 7 µL del amplificado.
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3. Se utilizó como marcador molecular Gene Ruler 1 kb DNA Ladder Plus (1 µL), el cual se mezcló con 1.2 µL de buffer de carga. 4. Se procedió al cargado de las muestras y los marcadores moleculares. 5. Se cerró la cámara de electroforesis y se conectaron los cables en sus electrodos correspondientes. 6. Las muestras fueron corridas a 60 V por 150 minutos aproximadamente hasta que la banda más oscura del buffer alcance la mitad del largo del gel. 7. El gel fue revelado, como lo descrito en 3.2, C. 8. Se tomaron las fotografías correspondientes.
3.4.6 PURIFICACIÓN DEL PRODUCTO DE PCR Este kit emplea una solución especial, que en combinación a una columna de PCR AxyPrep, contiene una resina con alta selectividad y recuperación de fragmentos de DNA lineal. El producto está diseñado para purificar fragmentos de DNA mayores a 75 bp de reacciones de PCR y otras reacciones enzimáticas, con una recuperación esperada de 70 – 90 %. Cada columna posee la capacidad de atrapar hasta 8 μg. El protocolo de purificación puede remover los primers no constituidos (<50 nucleótidos), enzimas y mononucleótidos marcados con algún colorante fluorescente o sin marcar. Los fragmentos de DNA purificado estarán disponibles para una variedad de aplicaciones, tales como secuenciamiento, ligamientos, análisis de restricción, trascripción in vitro, microinyección y microarrays.
Materiales y Equipos Producto de la reacción de amplificación del gen ribosomal 16S Vórtex Baño de agua a 65° C Microcentrífuga Micropipetas de 10 -100 µL Tips de 100 µL (estériles y de primer uso) Kit para purificación de DNA, AxyPrep PCR Cleanup Kit (Axygen Scientific, Inc. – USA) Columnas de PCR AxyPrep Microtubos de 2 mL Microtubos de 1.5 mL Buffer W2 (24 mL d buffer W2 concentrado + 168 mL de etanol Q.P.*) Eluente (Tris-HCl 2.5 mM, pH=8.5) (*) Reactivos no provistos en el Kit
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Procedimiento 1. Añadir a la muestra un volumen triple de buffer PCR – A. Para volumenes menores a 100 μL, como el trabajado, agregar 100 μL de buffer PCR – A y agitar en vortex brevemente para mezclar el contenido (Figura 11). 2. Colocar una columna en el interior de un tubo de microcentrífuga de 2 mL (provisto en el kit). Pipetear la reacción del Paso 1 dentro de la columna de PCR. Centrifugar a 12000 x g por 1 minuto. 3. Descartar el filtrado del tubo de microcentrífuga. Colocar nuevamente la columna de PCR dentro del mismo tubo. Pipetear 700 μL de buffer W2 dentro de la columna y centrifugar a 12000 x g por 1 min. Nota: Asegurarse que el volumen especificado de etanol haya sido agregado previamente al buffer W2 concentrado. 4. Descartar el filtrado. Colocar nuevamente la columna de PCR en el tubo de microcentrífuga de 2 mL. Pipetear 400 μL de buffer W2 dentro de la columna y centrifugar a 12000 x g por 1 min. Nota: Se utilizan dos enjuagues con buffer W2 para asegurar la completa remoción de sales, eliminando problemas potenciales en las subsiguientes reacciones enzimáticas. 5. Transferir la columna de PCR al interior de de un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL (provisto en el kit). Para eluir el DNA, añadir 25 – 30 μL del Eluente (pre-calentado a 65ºC) hacia el centro de la membrana. Dejar reposar por 1 minuto a temperatura ambiente. Centrifugar a 12000 x g por 1 min.
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Agregar 100 μl de Buffer PCR - A
Agregar 700 μl de Buffer W2
Filtrado
Repetir el lavado con Buffer W2
Agregar 25-30 μl del Eluente
Elución
FIGURA 11. Purificación del producto de amplificación PCR – 16S
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3.4.7 SECUENCIAMIENTO Para la identificación por secuenciamiento del gen ribosomal 16s, las muestras obtenidas fueron enviadas a Macro Gen Inc. (Seúl, Korea), laboratorio que brinda dicho servicio. Tras la llegada de los resultados se procedió a limpiar y unir las secuencias dadas por cada Primer (fD1 y rD1), esto se realizó mediante el empleo de los programas BIOEDIT y CHROMAS y el banco de datos con el cual se obtuvieron las posibles especies fue adquirido por medio de la “National Center for Biotechnology Information”. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Los programas BIOEDIT y CHROMAS fueron utilizados para alinear las secuencias de las muestras con secuencias de especies ya conocidas y detectar posibles errores en el cromatograma (Figuras 12 a 15), ya que muchas veces este tiene bases solapadas o extras y la corrección ayuda a la definición de las posibles especies con mayor afinidad.
FIGURA 12. Secuencias del banco de genes (genebank, NCBI) y cepa en estudio. Tras la obtención de secuencias similares a las secuencias en estudio por medio de la NCBI, se procedió a limpiar las secuencias por medio de los programas BIOEDIT (arriba) y CHROMAS (abajo), el primero se empleo para comparar la semejanza entre las bases de la secuencia de la muestra con las secuencia extraídas de la NCBI y el segundo se empleo para corroborar esta información con el cromatograma, ya que en este se puede observar los posibles errores de secuenciamiento
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“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
FIGURA 13. Secuencias del banco de genes (genebank, NCBI) y cepa en estudio. Aplicación de ClustalW para la alineación de secuencias. La aplicación ClustalW permite alinear todas las secuencias en el archivo, permitiendo asi la comparación entre estas.
FIGURA 14. Secuencias alineadas para la corrección de posibles errores. El programa CHROMAS, es determinante al momento de realizar las correcciones necesarias, ya que el cromatograma permite determinar si la diferencia en una base es real o un error en la lectura de este.
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“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
FIGURA 15. Ejemplo de cromatograma de un secuenciamiento
3.4.8 ELABORACIÓN DE DENDOGRAMAS 1. Se obtuvieron datos de secuencias del gen ribosomal 16s de distintas cepas patrón del género Bacillus con el fin de alinearlas con las secuencias limpias de las muestras. 2. Se alinearon todas las secuencias mediante la aplicación ClustalW Multiple Alignment del programa BIOEDIT (Figura16) antes mencionado. Esta aplicación es un sistema ampliamente empleado para alinear series homólogas de secuencias de nucleótidos. Para la alineación de múltiples secuencias, ClustalW utiliza métodos de alineación progresiva, donde las secuencias más parecidas se alinean primero. Después, se van alineando grupos de secuencias cada vez más distantes hasta obtener una alineación global. 3. Una vez alineadas se cortaron los extremos para que todas las secuencias tengan la misma longitud. 4. Posteriormente se empleó el programa MEGA4, el cual utiliza distintos métodos estadísticos para la construcción de árboles filogenéticos. 5. Para la construcción de la filogenia se utilizó el método estadístico “NEIGHBOR JOINING”, el cual es ampliamente empleado en estudios de evolución basados en técnicas moleculares. Este tiene la capacidad de manejar un amplio conjunto de datos, por lo que es uno de los pocos métodos que permite la rápida inclusión de todas las secuencias homólogas en un solo árbol. En resumen este método utiliza una matriz de distancias, la cual va agrupando en parejas según la divergencia promedio hasta llegar a una base.
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“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
6. Para evaluar la fidelidad del árbol filogenético construido, se empleó el test de filogenias inferidas “bootstrap”, el cual crea un número arbitrario de posibles dendogramas por medio del cambios puntales en diferentes bases de las secuencias y elige uno de consenso, así, en cada divergencia se muestra un porcentaje el cual representa el número de ramas que se han repetido del total de árboles creados.
FIGURA 16. Alineación de cepas de referencia y cepas en estudio para la creación del dendograma. Se empleó nuevamente el programa BIOEDIT para al alineación de todas las secuencias en estudio corregidas y las secuencias de cepas tipo o de referencia para la construcción del dendograma.
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3.5. MUESTREO DE LA CADENA PRODUCTIVA DE CONSERVAS DE ESPÁRRAGO BLANCO Se tomaron muestras en diferentes puntos de la cadena productiva para procesamiento de conservas de espárragos blancos de la empresa Green Perú S.A. (Trujillo - Perú), desde el suelo de cultivo, pasando por las diferentes etapas de procesamiento de los espárragos, hasta el paso previo a la esterilización de los mismos. Materiales y Equipos
Bolsas plásticas Ziploc guantes, mandiles, botas lampas y baldes cooler geles refrigerantes plumones marcadores termómetros.
Procedimiento MUESTREO DEL SUELO (Carter, 1993) 1. Se recorrieron los lotes a lo largo y cada 50 metros se tomó una submuestra entre los 20 y 30 cm de profundidad, limpiando la superficie del terreno y depositándola en el balde. 2. Luego de tener todas las submuestras en el balde (de 15 a 20) se mezclaron homogéneamente y se tomó 1 Kg. aproximadamente que fue colocado en una bolsa Ziploc, cerrada herméticamente y rotulada inmediatamente. 3. Las bolsas fueron colocadas en el cooler con geles de refrigeración, manteniendo una temperatura de 4ºC aproximadamente.
MUESTREO DE LOS ESPÁRRAGOS EN LA PLANTA DE PROCESAMIENTO 1. Se escogieron como puntos de muestreo (Figura 17) los espárragos frescos en recepción de planta, después de pasar por el baño de burbujas, después del hidrocooler, los espárragos frescos sin pelar y cortados y aquellos pelados y cortados. Siguiendo con la línea de producción se muestrearon espárragos frescos pelados y cortados después de blanqueado, envasados (frasco 315) con 1, 3 y 4 horas de espera previo al proceso de esterilización. 2. Las consideraciones para la toma de muestras y los procedimientos detallados del muestreo se describen en Velezmoro et al., 2007.
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“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
MUESTREO
COSECHA SUELO CAMPO PLANTA DE PROCESAMIENTO
RECEPCIÓN PESADO MUESTREO
LAVADO
BAÑO DE BURBUJAS MUESTREO
HIDROCOOLER MUESTREO
SELECCIÓN ALMACENAMIENTO
PELADO CORTADO Y PELADO
CORTADO Y SIN PELAR
MUESTREO
MUESTREO
BLANQUEADO
ENVASADO 1 h DE ESPERA
MUESTREO
3 h DE ESPERA
MUESTREO
4 h DE ESPERA
MUESTREO
ESTERILIZACIÓN
FIGURA 17. Diagrama de flujo de la línea de procesamiento de conservas de espárrago blanco en la planta de Green Perú S.A. 39
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3.5.1 RECUENTO DE MICROORGANISMOS ESPORULADOS DEL GÉNERO Bacillus sp. Y DE ANAEROBIOS SULFITO REDUCTORES Los parámetros microbiológicos ensayados en las muestras tomadas fueron:
Recuento de esporogénicos mesófilos aerobios (EMA) Recuento de esporogénicos mesófilos anaerobios (EMANA) Recuento de esporogénicos termófilos aerobios (ETA) Recuento de esporogénicos termófilos anaerobios (ETANA) Recuento de anaerobios sulfito reductores
La metodología empleada para la cuantificación de las poblaciones de esporogénicos (Figura 18), siguió los lineamientos de APHA (1992) y la del recuento de anaerobios sulfito reductores, la del FDA (2001). (Figura 19)
40
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
50 g -1
10
450 mL AP 0.1%
Muestra 1 mL
10 mL
0.1 mL
Frascos con 100 mL de Agar TGE Baño María a 80 ºC x 30 minutos Baño María a 45 ºC x 10 minutos
Repartir el contenido de cada frasco en 5 placas Petri
INCUBACIÓN EMA
EMANA
ETA
Introducir en jarras de anaerobiosis
ETANA Introducir en jarras de anaerobiosis
Incubar a 35ºC x 48 horas
Incubar a 55ºC x 48 horas
Lectura de cada una de las 5 placas por dilución y reporte de resultados
FIGURA 18. Recuento de microorganismos esporulados 41
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
1 mL
1 mL
25 g
9 mL AP 0.1%
9 mL AP 0.1%
10-1
10-2
225 mL AP 0.1%
10-3 1 mL
Placas con la base cubierta con medio TSC
Adicionar agar TSC con yema de huevo
Incubar en jarra de anaerobiosis a 35 ± 1 ºC por 24 horas Elegir las placas con 20 – 200 colonias negras
Test de Confirmación de colonias típicas
Expresión de Resultados: UFC/g alimento
FIGURA 19. Recuento de anaerobios sulfito reductores
42
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3.5.2 AISLAMIENTO, CARACTERIZACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE CEPAS DE BACILLUS SP. Materiales y Equipos
Agar Triptona-Glucosa-Extracto de Carne (TGE) Caldo Casoy Placas Petri descartables con agar TGE Tubos de ensayo Sistemas de anaerobiosis: Anaerocult e indicador Anaerotest Cajas criogénicas Viales criogénicos de 2 mL Glicerol Asa de Kolle Jarras de anaerobiosis Autoclave Cabina de bioseguridad Incubadoras a 35ºC y 52.5ºC Congeladora a -80ºC
Procedimiento Aislamiento de las cepas de Bacillus sp. 1. Con ayuda de un asa de Kolle, picar las cepas más representativas de cada muestra analizada. Sembrar en medio para Bacillus TGE. Aislar y reaislar las veces necesarias para obtener las cepas puras. Caracterización morfológica y crecimiento de las cepas a 35ºC y 52.5ºC en condiciones aerobias y anaerobias 1. Se determinó: a. b. c. d.
Características morfológicas de las cepas de Bacillus en agar TGE Crecimiento a 35ºC en condiciones de anaerobiosis y aerobiosis Crecimiento a 52.5ºC en condiciones de anaerobiosis y aerobiosis Crecimiento y viraje en TGE con púrpura de bromocresol.
2. Las características morfológicas de las cepas de Bacillus fueron evaluadas a las 24 horas de incubación en agar TGE incubado a 35ºC. Se toman en cuenta características de tamaño, borde, forma y textura de las colonias aisladas. 3. En los ensayos de crecimiento en anaerobiosis se usó el medio Mossel dispensado en placas petri. Sembrar por estría las cepas de Bacillus aisladas. Colocar las placas en jarras con sistemas de anaerobiosis Anaerocult e indicador Anaerotest. Incubar a 35ºC y 52.5ºC. 4. En los ensayos de crecimiento en aerobiosis se usó medio TGE dispensado en placas petri. Se r las cepas bacterianas e incubar luego a 35ºC y 52.5ºC. 43
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
5. En el ensayo de crecimiento y viraje en TGE con púrpura de bromocresol estriar en el medio mencionado las cepas bacterianas e incubar de 35ºC. Al término del periodo de incubación, reportar como positivo (+) aquellas cepas que hagan virar el medio hacia amarillo.
Almacenamiento de las cepas en glicerol Materiales y Equipos Cultivos puros de cepas de Bacillus Tubos con 5 mL de caldo Casoy Cajas criogénicas Viales criogénicos de 2 mL Glicerol al 87% Asa de Kolle Cabina de bioseguridad Incubadora a 35ºC Congeladora a -80ºC Procedimiento 1. Sembrar una asada de la cepa pura de Bacillus en caldo Casoy e incubar a 35ºC durante 24 horas. 2. Tomar una alícuota de 1 mL del caldo bacteriano y dispensar en un vial criogénico Luego adicionar 0.5 mL de glicerol al 87%. Las cepas se guardan por duplicado. 3. Colocar los viales en cajas criogénicas y almacenar en congeladora a -80ºC.
44
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
3.6 CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA (API 50 CHB) Se empleó la metodología de identificación API – Referencia para Identificación estandarizada de Biomeriux (España) obtenida por intermedio de la Empresa Química Suiza. Esta prueba está basada en 49 ensayos bioquímicos para investigación del metabolismo de azúcares en los microorganismos. La base de datos del sistema API 50 CHB v 2.1 incluye 24 especies o taxones.
Materiales y Equipos
Galerías API 50 CH Cámaras de incubación para API 50 CH Medio de inoculación: API 50 CHB/E Medium Solución salina 0.85% Aceite de parafina Agua destilada o desmineralizada Pipetas Gradillas Estufa incubadora a 30ºC Mechero Bunsen Cartilla para anotación de resultados Plumón marcador Escala Standard de McFarland Programa informático de identificación APIWEB TM
Procedimiento (ver Figura 20) Selección de las colonias 1. Verificar la pureza de la cepa. 2. Verificar su pertenencia al género Bacillus: bacilo formador de esporas, aeróbico, usualmente Gram positivo. 3. Cultivar el microorganismo sobre un agar base adecuado para su crecimiento (Ejm.: Agar Peptona de Caseína – Glucosa – Extracto de Carne, TGE). 4. Las cepas mesófilas deben incubarse entre 25-45ºC por 16-18 horas, mientras que las cepas termófilas deben crecer a 55ºC por 12-16 horas. Preparación de las galerías Cada galería está constituída por 5 filas, conteniendo cada una 10 tubos numerados. 1. Preparar una cámara de incubación (fondo y tapa). 2. Anotar la referencia de las cepas en la lengüeta lateral de la cámara. 3. Repartir unos 10 mL de agua destilada o desmineralizada en los alveolos del fondo de la cámara, para crear una atmósfera húmeda. 4. Sacar cada una de las filas que constituyen las galerías de su embalaje, separar en dos las filas 0-19 y 20-29 y colocarlas en el fondo de la cámara de incubación. 5. Completar la galería con la fila 40-49.
45
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
Preparación del inóculo 1. Verificar la pureza de la cepa. 2. Abrir un tubo conteniendo 1 mL de solución salina 0.85% y preparar una suspensión densa, picando todas las colonias del cultivo. 3. Abrir cuidadosamente una ampolla de API 50 CHB/E Medium e inocularle una cantidad adecuada de la suspensión anterior, para obtener una turbidez equivalente a escala 2 de McFarland. 4. Homogeneizar. Inoculación de las galerías 1. Repartir la suspensión bacteriana con ayuda de una pipeta estéril en cada uno de los 50 tubos de la galería, llenar los tubos (no las cúpulas), evitando la formación de burbujas apoyando la punta de la pipeta en el borde de la cúpula. 2. La adición de aceite mineral es opcional pero recomendable, permite una mejor visualización del color y de esta manera, una mejor distinción de los resultados. Sin embargo, para especies aerobias estrictas debe omitirse su uso. Incubación 1. Incubar las galerías a la temperatura óptima de crecimiento: - Mesófilos a 30-37ºC por 48 horas. - Termófilos a 55ºC por 24 horas. Para especies termófilas muy activas deben leerse luego de 3-6 horas de incubación, ya que podría ser dificultosa la interpretación luego de las 24 horas. Lectura e interpretación de las galerías 1. Transcurrido el periodo de incubación determinado, efectuar las lecturas de las galerías. 2. Un ensayo positivo corresponde a la acidificación del medio de inoculación, evidenciada por el cambio de color del indicador rojo de fenol (contenido en el medio) hacia amarillo. 3. Para el ensayo de esculina (tubo Nº 25) un ensayo positivo se observa cuando se da un cambio de color rojo hacia negro. 4. Ocasionalmente, un ensayo positivo puede evidenciarse como negativo en una segunda lectura, esto debido a la producción de amonio a partir de peptona, lo cual neutraliza los ácidos. Estas pruebas deben ser reportadas como positivas 5. Anotar cada ensayo en la cartilla de resultados como positivo (+), negativo (-) ó dudoso (?). 6. El perfil bioquímico así constituido sirve para la identificación de Bacillus y microorganismos próximos, con ayuda del programa informático de identificación APIWEBTM.
46
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
FIGURA 20. Procedimiento API 50 CHB
a. Sacar de su embalaje cada una de las filas de ensayo que constituyen la galería, colocándolas en orden numérico sobre el fondo de la cámara de incubación.
b. Preparar una suspensión bacteriana densa en un tubo conteniendo 1 mL de solución salina 0.85%, para ello picar todas las colonias del cultivo.
c. Inocular una cantidad adecuada de la suspensión anterior en una ampolla de API 50 CHB/E Medium, la turbidez alcanzada debe ser equivalente a escala 2 de McFarland. Homogeneizar. 47
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
d. Repartir la suspensión bacteriana en cada uno de los 50 tubos de la galería, llenar los tubos (no cúpulas), evitar la formación de burbujas.
e. Incubar las galerías a la temperatura óptima de crecimiento por 24/48 h.
f. Efectuar la lectura de las galerías.
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“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
g. El perfil obtenido de la combinación de resultados (+) y (-), determina las especie del microorganismo en ensayo, haciendo uso del programa informático APIWEBTM.
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“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
IV.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 CURVAS DE CRECIMIENTO Y PRODUCCIÓN DE ESPORAS DE BACILLUS EN MEDIO LÍQUIDO A continuación se describen los resultados encontrados para las curvas de crecimiento y producción de esporas ensayadas en: B. pumilus, B. licheniformis y B. subtilis / amyloliquefaciens.
4.1.1 PRIMER ENSAYO PARA CURVAS DE CRECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO 1. Bacillus pumilus : 2M3B12 En la Tabla 5 se muestran los resultados obtenidos por recuento directo durante el proceso de crecimiento de B. pumilus en medio líquido. Se partió con una concentración de 23 x 103 cél/mL llegando hasta 29 x 105 cél/mL después de 63 horas. Se puede apreciar que la D.O.600nm llega a un máximo de 1.059 de absorbancia a las 12 horas. TABLA 5. Densidad óptica y recuento directo del inóculo de B. pumilus para el primer ensayo (28 ± 1º C, pH=7) Tiempo
D.O. 600 nm
Horas
Absorbancia
0 12 20 38
Recuento directo Cél/mL
0.000
4.362
5
6.806
6
7.169
6
7.072
6
23 x 10
1.059
64 x 10
0.836
15 x 10
0.868
Log (UFC/mL)
3
12 x 10
46
0.600
11 x 10
7.029
63
0.134
29 x 105
6.465
En la Figura 21 se puede observar que la fase estacionaria se da a partir de las 12 horas manteniéndose constante hasta el final del ensayo coincidiendo con la densidad óptica que obtuvo el mayor valor a la misma hora.
50
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
B . pu m ilu s - 2M 3B E12 1.2
L o g1 0 (C é l / m L )
1 6.000 0.8 4.000
0.6 0.4
2.000
D .O . (A b so r b a n c i a )
8.000
0.2
Ti e m po (h ) Re c u e n t o d ire c t o
60
54
48
42
36
30
24
18
12
6
0
0
0.000
D .O .
FIGURA 21. Curva de crecimiento y densidad óptica del inóculo de B. pumilus para el primer ensayo (28 ± 1º C, pH=7)
2. Bacillus licheniformis: 2M3BE23 En la Tabla 6 se puede observar que la fase estacionaria de B. licheniformis se da a las 12 horas obteniéndose 88 x 105 Cél/mL al final del ensayo, lo mismo que se refleja en la Figura 22. TABLA 6. Densidad óptica y recuento directo del inóculo de B. licheniformis para el primer ensayo (28 ± 1º C, pH=7) Tiempo
D.O. 600 nm
Horas
Absorbancia
0 12 20 38 46 63
0.000 0.540 0.625 0.865 0.886 0.417
Recuento directo Cél/mL
4.114
5
6.601
5
6.524
5
6.938
5
6.744
5
6.944
13 x 10 40 x 10 33 x 10 87 x 10 56 x 10 88 x 10
51
Log (UFC/mL)
3
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
B. licheniformis - 2M3BE23
1 0.8
Log10 (Cél/mL)
6.000
0.6 4.000 0.4 2.000
D.O.(Absorbancia)
8.000
0.2
Tiempo (h) Recuento directo
60
54
48
42
36
30
24
18
12
6
0
0
0.000
Absorbancia
FIGURA 22. Curva de crecimiento y densidad óptica del inóculo de B. licheniformis para el primer ensayo (28 ± 1º C, pH=7)
3. Bacillus subtilis / amyloliquefaciens La fase estacionaria de este microorganismo, al igual que los microorganismos anteriores se da a las 12 horas de haberse dado la inoculación del caldo TGE (Tabla 7, Figura 23). TABLA 7. Densidad óptica y recuento directo del inóculo de B. subtilis / amyloliquefaciens para el primer ensayo (28 ± 1º C, pH=7) Tiempo D.O. Horas Absorbancia 0.000 0 12 20 38
Recuento directo Cél/mL Log (UFC/mL) 3 15 x 10 4.176
0.365
30 x 105
6.480
0.825
5
6.438
5
6.932
5
1.151
27 x 10 86 x 10
46
0.994
45 x 10
6.653
63
0.634
99 x 106
6.998
52
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
B. subtilis / amyloliquefaciens 8.000
1.4
1 0.8
4.000 0.6 0.4
2.000
D.O. (Absorbancia)
Log10 (Cél / mL)
1.2 6.000
0.2
Tiempo (h) Recuento directo
60
54
48
42
36
30
24
18
12
6
0
0
0.000
Absorbancia
FIGURA 23. Curva de crecimiento y densidad óptica del inóculo de B. subtilis / amyloliquefaciens para el primer ensayo (28 ± 1º C, pH=7)
4.1.2 SEGUNDO ENSAYO PARA CURVAS DE CRECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO
1.
Bacillus pumilus : 2M3BE12 En la Tabla 8 se puede observar que partiendo de una concentración inicial de 80 UFC/mL células viables en caldo de cultivo TGE, se alcanzó una concentración máxima de células a las 12 horas de evaluación (70 x 107 UFC/mL), cantidad que permaneció relativamente constante hasta el final del ensayo. También se puede apreciar que el proceso de esporulación se inicia aproximadamente a las 24 horas de inoculado el caldo consiguiéndose un 104.71% de esporas con respecto a las células totales después de las 223 horas. Los valores de densidad óptica no son muy notables al inicio del ensayo llegando a un pico máximo a las 12 horas coincidiendo con el inicio de la fase estacionaria.
53
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
TABLA 8. Densidad óptica, recuento directo, recuento de células totales y recuento de esporas del inóculo de B. pumilus para el segundo ensayo (28 ± 1º C, pH=7) Tiempo
D.O.
Horas
Absorbancia
(Cél/mL)
0
0.000
<10
3
0.000
<10
0.302
Recuento Esporas
0.000
80
0.000
-
<10
0.000
0.00%
-
-
-
-
4
5.415
30 x 10
5.477
<10
0.000
0.00%
4
5.974
-
26 x 10 94 x 10
5
4
1.903
-
-
-
-
7
0.000
0.00%
12
0.760
26 x 10
6.416
70 x 10
8.844
<10
24
0.155
16 x 106
7.197
47 x 107
8.669
3.5
0.350
6
7.072
7
-
94 x 10
3.972
56.71%
6.908
-
-
-
-
-
5
6.961
14 x 10
8.134
15 x 10
3.176
39.04%
5
6.903
-
-
-
92 x 10 80 x 10 -
7
6
-
-
64 x 10
-
2
7.806
6
50 x 10
-
-
3
4.491
57.53%
7
8.065
104.71%
31 x 10
7.702
12 x 10
En la Figura 24 se puede apreciar que existe una diferencia de aproximadamente 1 ciclo logaritmico entre el recuento directo y el recuento de células totales siendo la última la más exacta. La producción de esporas alcanza su punto máximo a las 223 horas después de inoculado el caldo TGE.
B. pumilus - 2M3BE12 1
10
5
0.4
4
0.3
3
0.2
2
0.1
1
0
0 20 0
6
0.5
18 0
7
0.6
16 0
8
0.7
14 0
9
0.8
12 0
0.9
10 0
223
0.126
7.004
80
147
0.247
39.31%
10 x 10
60
80
0.286
3.315
2
20 x 10
6.767
81 x 10
6
40
73
0.316
8.431
5
59 x 10
20
55
0.324
27 x 10
6.27%
5
0
48
12 x 10
D. O. (Ab s or ba nc i a)
32
0.544 2
Lo g 1 0 ( UF C/ mL )
9
0.002
Recuento Células totales
Log10(Cél/mL) (UFC/mL) Log10(UFC/mL) (UFC/mL) Log10(UFC/mL) Esporas(%)
22 0
6
Recuento Directo
Tiempo (horas) D.O.
Directo
Células totales
Esporas
FIGURA 24. Curva de crecimiento, aparición de esporas y densidad óptica del inóculo de B. pumilus para el segundo ensayo (28 ± 1º C, pH=7)
54
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
2. Bacillus licheniformis: 2M2B23 En la Tabla 9 podemos observar que la concentración inicial de células viables fue de 37 UFC/mL obteniéndose 65 x 105 UFC/mL al término de la fase exponencial (a las 6 horas de incubación). El proceso de esporulación se inició entre las 24 y 32 horas de incubación. El mayor valor obtenido en las lecturas de densidad óptica fue 1.138 correspondiente a las 48 horas de incubación. En la Figura 25 se ha representado la variación del logaritmo de UFC/mL en el tiempo donde se aprecia el incremento de las células esporuladas a través de las horas. El recuento de células totales se empleó para determinar el porcentaje de esporulación.
TABLA 9. Densidad óptica, recuento directo, recuento de células totales y recuento de esporas del inóculo de B. licheniformis para el segundo ensayo (28 ± 1º C, pH=7) Tiempo Horas
D.O.600nm.
Recuento Directo
0.000
<1
3
0.002
11 x 104
0.007
4
5.781
5
6.225
9 12
Recuento de Esporas
Absorbancia (Cél/mL) Log10(Cél/mL) (UFC/mL) Log10(UFC/mL) (UFC/mL) Log10(UFC/mL) Esporas(%)
0
6
Recuento de Células totales
0.263 0.569
60 x 10 17 x 10
5
20 x 10
5
0.000
37
5.033
-
6.294
1.567
<10
0.000
0.00%
-
-
-
-
65 x 10
6.813
<10
0.000
0.00%
-
5
-
-
-
-
7
8.004
<10
0.000
0.00%
7
0.000
0.00%
1.185
13.35%
10 x 10
24
0.483
40 x 10
6.602
22 x 10
8.338
<10
32
0.592
51 x 105
6.703
75 x 107
8.875
15
48
1.138
6
11 x 10
7.021
7
55 x 10
8.740
42 x 10
3.621
41.43%
55
1.025
12 x 106
7.072
-
-
-
-
-
0.865
6
7.220
26 x 10
8.415
25 x 10
5.405
64.23%
6
-
-
73
17 x 10
7
2
4
80
0.782
24 x 10
7.365
-
-
-
147
0.554
-
-
96 x 106
7.982
18 x 106
7.257
90.91%
-
6
7.919
6
7.533
95.12%
223
-
-
83 x 10
55
34 x 10
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
D.O.
Tiempo (horas) Directo Células totales
22 0
20 0
18 0
16 0
14 0
12 0
10 0
80
60
40
20
Lo g10 (UF C/ mL )
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0
D. O. (Ab s o r ba n c i a)
B. licheniformis - 2M3BE23 1.2 1.1 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
Esporas
FIGURA 25 Curva de crecimiento, aparición de esporas y densidad óptica del inóculo de B. licheniformis para el segundo ensayo (28 ± 1º C, pH=7)
3. Bacillus subtilis / amyloliquefaciens: 2M2CE En la Tabla 10 se muestran los resultados obtenidos durante el proceso de crecimiento de B. subtilis / amyloliquefaciens en caldo TGE. Se observa que se alcanzó el 98.08% de esporulación a las 223 horas partiendo de una población con 68 x 10 UFC/mL. Su proceso de esporulación se dio entre las 12 y 24 horas después de la inoculación del caldo TGE. Se puede observar también un rápido crecimiento de este microorganismo llegando a su fase estacionaria antes de las 12 horas. El pico máximo de absorbancia se dio a las 32 horas. La Figura 26 muestra el crecimiento de células (Log UFC/mL) con respecto al tiempo de esporulación en caldo TGE donde se observa claramente que aproximadamente a las 223 horas se obtuvo cerca del 100% de esporulación.
56
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
TABLA 10. Densidad óptica, recuento directo, recuento de células totales y recuento de esporas del inóculo de B. subtilis / amyloliquefaciens para el segundo ensayo (28 ± 1 ºC, pH=7) Tiemp o
D.O.600nm.
Horas
Absorbanci a
(Cél/mL)
Log10(Cél/ mL)
0
0.000
<1
Recuento Directo
Recuento de Células totales (UFC/mL Log10(UFC/m ) L)
Recuento de Esporas (UFC/mL )
Log10(UFC/m L)
Esporas(% )
0.000
68 x 10
2.835
<10
0.000
0.00%
3
3
0.000
66 x 10
4.820
-
-
-
-
-
6
0.119
15 x 105
6.171
40 x 106
7.602
<10
0.000
0.00%
0.596
5
6.268
-
-
-
-
-
7.544
<10
9 12 24
19 x 10
5
0.715
20 x 10
6
0.829
33 x 10
6
6.292 7.517
6
35 x 10
7
11 x 10
7
8.057
0.000
0.00%
2
3.101
38.48%
2
13 x 10
32
1.196
26 x 10
7.413
40 x 10
8.602
32 x 10
3.500
40.68%
48
0.826
91 x 105
6.959
97 x 106
7.987
88 x 103
4.943
61.88%
55
0.739
6
14 x 10
7.160
-
-
-
-
-
73
0.701
14 x 106
7.143
46 x 106
7.664
46 x 104
5.660
73.85%
0.648
6
7.112
-
-
-
80
13 x 10
6
-
-
5
147
0.470
-
-
45 x 10
7.653
67 x 10
6.829
89.23%
223
-
-
-
79 x 106
7.902
53 x 106
7.751
98.08%
B. subtilis / amyloliquefaciens - 2M2CE 1.2
10
8 7
0.8
6 0.6
5 4
0.4
Lo g10 (UF C / mL )
D. O. (Ab s o r ba n c i a)
9 1
3 2
0.2
1 220
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0 0
0
Tiempo (horas) D.O.
Directo
Células totales
Esporas
FIGURA 26. Curva de crecimiento, aparición de esporas y densidad óptica del inóculo de B. subtilis / amyloliquefaciens para el segundo ensayo (28 ± 1º C, pH=7)
57
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
4.2.3 TERCER ENSAYO PARA CURVAS DE CRECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO
1. Bacillus pumilus : 2M3BE12 En la Tabla 11 se pude observar que partiendo de una concentración inicial de 17 UFC/mL células viables en caldo de cultivo TGE, se alcanzó una concentración máxima de células a las 12 horas de incubación (11 x 107 UFC/mL), cantidad que permaneció relativamente constante al finalizar el periodo de evaluación. Los datos obtenidos nos permiten calcular el tiempo de generación de dicha bacteria, que fue de 0.531 horas. El ensayo nos permite apreciar también que el proceso de esporulación ya se había iniciado a las 24 horas de inoculado el caldo (fase estacionaria del cultivo), llegando a contabilizarse 2 UFC/mL provenientes de esporas obtenidas luego de tratamiento térmico y llegando hasta 62 x 106 UFC/mL pasadas 456 horas, lo cual representa el 103.61% de esporulación. TABLA 11. Densidad óptica, recuento de células totales y recuento de esporas del inóculo de Bacillus pumilus para el tercer ensayo (28 ± 1º C, pH=7) Recuento Células Totales
Recuento Esporas
Tiempo (h)
Densidad Óptica (Absorbancia)
0 2.5
0.000 0.016
17 90 x 10
1.238 2.954
<10 <10
0.000 0.000
0.00% 0.00%
05
0.018
37 x 103
4.567
0.7
0.000
0.00%
0.021
4
5.679
1.0
0.000
0.00%
5
6.820
1.0
0.000
0.00%
24
0.161 0.920
7
11 x 10 40 x 107
8.041 8.605
1.0 2.3
0.000 0.362
0.00% 4.20%
28.5
0.977
11 x 107
8.041
23
1.362
16.93%
33 49
1.145 0.301
7
12 x 10 13 x 107
8.076 8.100
22 x 10 20 x 10
2.346 2.301
29.05% 28.41%
55.5 74.5
0.326 0.294
10 x 107 66 x 106
8.017 7.820
14 x 103 15 x 104
4.093 5.170
51.06% 66.12%
119
0.29
11 x 107
8.025
69 x 103
4.840
60.31%
0.293 0.325
6
66 x 10 62 x 106
7.869 7.792
4
70 x 10 44 x 105
5.845 6.644
74.28% 85.27%
-
71 x 106 67 x 106 12 x 107 95 x 106 82 x 106 33 x 106
7.851 7.826 8.093 7.978 7.914 7.519
12 x 106 20 x 106 18 x 106 32 x 106 27 x 106 62 x 106
7.091 7.305 7.248 7.507 7.431 7.790
90.32% 93.35% 89.55% 94.09% 93.90% 103.61%
7.5 10 12
151 175 293 319 343 367 391 456
0.040
(UFC/mL) Log10(UFC/mL) (UFC/mL) Log10(UFC/mL)
48 x 10 66 x 10
58
Esporulación (%)
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
Las mediciones de la densidad óptica, fueron casi imperceptibles durante las primeras horas de incubación del medio, mientras las mayores concentraciones se obtuvieron entre las 24 y 33 horas de evaluación, periodo en el que según el recuento de células viables ya se había alcanzado la fase estacionaria; sin embargo, mediciones posteriores revelan una disminución de la turbidez del medio de cultivo, algo que podría deberse a la formación de agregados celulares y precipitados en el medio. La Figura 27 muestra el crecimiento de células (Log UFC/mL) con respecto al tiempo de esporulación en caldo TGE donde se observa claramente que aproximadamente a las 391 horas se obtuvo cerca del 100% de esporulación.
B. pumilus - 2M3BE12 10.0
1.2
Lo g10 (UF C/ mL )
8.0
1.0
6.0 0.8
4.0
0.6 0.4
D. O. (Ab s or ba ncia)
1.4
2.0 0.2
45 0
40 0
35 0
30 0
25 0
20 0
15 0
10 0
50
0.0 0
0.0
Tiempo (horas) Recuento Esporas
Recuento Células Totales
D.O.
FIGURA 27. Curva de crecimiento, producción de esporas y densidad óptica del inóculo de B. pumilus para el tercer ensayo (28 ± 1º C, pH=7)
2. Bacillus licheniformis: 2M3BE23 En este ensayo la concentración inicial de células viables fue de 9 UFC/mL y la fase de crecimiento exponencial se prolongó por 12 horas, alcanzando 13 x 106 UFC/mL y obteniéndose 97 x 106 UFC/mL después de 456 horas. El tiempo de generación calculado para B. licheniformis es: 0.585 horas. En el transcurso de la fase estacionaria, a partir de las 24 de horas de incubación, se pudo apreciar la aparición de esporas en una concentración de 1.9 UFC/mL y llegando a 33 x 106 UFC/mL a partir de esporas después de 456 horas. De los microorganismos estudiados, es el que esporula más lentamente. La Tabla 12 y la Figura 28 muestran el crecimiento de células (Log UFC/mL) con respecto al tiempo de esporulación en caldo TGE donde se aprecia que en la medida de la densidad óptica, se pudieron observar picos a las 49 y 119 horas de incubación.
59
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
TABLA 12. Densidad óptica, recuento de células totales y recuento de esporas del inóculo de B. licheniformis para el tercer ensayo (28 ± 1º C, pH=7)
Recuento de Células Totales Tiempo (h)
Densidad Óptica (Absorbancia)
(UFC/mL)
0
0.000
9
2.5 05 7.5 10
0.019 0.016 0.011 0.019
Recuento de Esporas
Log10(UFC/mL Log10(UFC/mL (UFC/mL) ) )
Esporulación (%)
0.930
<10
0.000
0.00%
2
3.043
<10
0.000
0.00%
3
4.143
<10
0.000
0.00%
4
5.188
<10
0.000
0.00%
5
6.462
<10
0.000
0.00%
6
11 x 10 14 x 10 15 x 10 29 x 10
12
0.081
13 x 10
7.107
<10
0.000
0.00%
24
0.316
28 x 106
7.447
1.9
0.279
3.74%
28.5
0.417
54 x 106
7.732
2.8
0.447
5.78%
33
0.387
65 x 106
7.813
1.0
0.000
0.00%
49
0.700
27 x 107
8.433
30
1.477
17.52%
55.5
0.546
28 x 107
8.450
10 x 10
2.000
23.67%
74.5
0.76
22x 108
9.348
40 x 102
3.602
38.53%
119
0.943
32 x 107
8.498
43 x 104
5.630
66.27%
151
0.778
24 x 107
8.382
21 x 103
4.322
51.57%
175
0.753
10 x 106
7.004
60 x 104
5.778
82.49%
293
-
12 x 106
7.079
60 x 104
5.778
81.62%
-
6
7.806
4
5.944
76.15%
5
6.086
76.29%
5
6.274
79.18%
5
6.299
78.03%
6
7.128
89.24%
319 343 367 391 456
-
64 x 10
6
95 x 10
6
84 x 10
7
12 x 10
6
97 x 10
7.978 7.924 8.072 7.987
60
88 x 10 12 x 10 19 x 10 20 x 10 13 x 10
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
0.0 0
45 0
0.0 40 0
0.2
35 0
2.0
30 0
0.4
25 0
4.0
20 0
0.6
15 0
6.0
10 0
0.8
50
8.0
Lo g10 (UF C/ mL )
1.0
D. O. (Ab s or ba ncia)
B. licheniformis - 2M3BE23 10.0
Tiempo (horas) Recuento Esporas
Recuento Células Totales
D.O.
FIGURA 28. Curva de crecimiento, producción de esporas y densidad óptica del inóculo de B. licheniformis para el tercer ensayo (28 ± 1º C, pH=7)
3. Bacillus subtilis / amyloliquefaciens: 2M2CE En la Tabla 13 se pudo observar que la concentración inicial de células viables fue de 11 UFC/mL, obteniéndose 69 x 106 UFC/mL al término de la fase exponencial (a las 10 horas de incubación). Su tiempo de generación fue de 0.442 horas, por lo que puede afirmarse que B. subtilis / amyloliquefaciens, posee el menor tiempo de generación respecto a las otras cepas estudiadas (Tabla 14). El proceso de esporulación de B. subtilis / amyloliquefaciens se inicia entre las 24 y 28.5 horas de incubación. La mayor densidad óptica se dio a las 33 horas de incubación (A= 1.290), luego de lo cual declina dado la aparición de precipitados en el caldo TGE. La Figura 29 muestra el crecimiento de células (Log UFC/mL) con respecto al tiempo de esporulación en caldo TGE.
61
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
TABLA 13. Densidad óptica, recuento de células totales y recuento de esporas del inóculo de B. subtilis / amyloliquefaciens para el tercer ensayo (28 ± 1º C, pH=7)
Tiempo (h)
D. O. (Absorbancia)
0 2.5 05 7.5 10 12 24 28.5 33 49 55.5 74.5 119 151 175 293 319 343 367 391 456
0.000 0.018 0.017 0.052 0.455 0.639 0.934 1.094 1.290 0.933 0.838 0.782 0.673 0.573 0.551 -
Recuento de Células Totales
Recuento de Esporas
(UFC/mL)
Log10(UFC/mL)
(UFC/mL)
Log10(UFC/mL)
Esporulación (%)
11 56 x 10 67 x 103 22 x 105 69 x 106 20 x 106 15 x 107 97 x 106 91 x 106 87 x 106 14 x 107 11 x 107 38 x 106 28 x 106 17 x 106 40 x 106 36 x 106 61 x 106 30 x 106 59 x 106 19 x 106
1.03 2.75 4.84 6.33 7.84 7.31 8.18 7.99 7.96 7.94 8.14 8.05 7.58 7.45 7.238 7.602 7.556 7.785 7.477 7.771 7.279
<10 <10 <10 <10 <10 <10 0.2 11 x 10 17 x 102 26 x 103 11 x 104 82 x 103 36 x 105 71 x 104 34 x 105 14 x 106 14 x 106 21 x 106 18 x 106 17 x 106 16 x 106
0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 2.04 3.23 4.42 5.05 4.91 6.56 5.85 6.531 7.152 7.140 7.330 7.248 7.236 7.212
0.00% 0.00% 0.00% 0.00% 0.00% 0.00% 0.00% 25.54% 40.64% 55.70% 62.10% 61.05% 86.50% 78.57% 90.24% 94.08% 94.49% 94.16% 96.94% 93.11% 99.09%
62
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
B. subtilis / amyloliquefaciens - 2M2CE 10.0
1.2
Lo g10 (UF C/ mL )
8.0
1.0
6.0 0.8
4.0
0.6 0.4
D. O. (Ab s or ba ncia)
1.4
2.0 0.2
45 0
40 0
35 0
30 0
25 0
20 0
50
0
15 0
0.0 10 0
0.0
Tiempo (horas) Recuento Esporas
Recuento Células Totales
D.O.
FIGURA 29. Curva de crecimiento, producción de esporas y densidad óptica del inóculo de B. subtilis / amyloliquefaciens para el tercer ensayo (28 ± 1º C, pH=7)
TABLA 14. Tiempo de generación de los microorganismos ensayados Especie
Tiempo de Generación (h)
B. pumilus
0.531
B. licheniformis
0.585
B. subtilis / amyloliquefaciens
0.442
63
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
4.2. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE CEPAS DE BACILLUS SP. Con el fin de estandarizar la técnica de extracción de DNA empleando el Kit AXYGEN, se realizaron extracciones del DNA de 171 cepas de Bacillus. Estos ensayos se realizaron con el apoyo del Dr. Ernesto Ormeño Orrillo, del Centro de Ciencias Genómicas, de la Universidad Autónoma de México (Cuernavaca). Se realizaron varios ensayos hasta determinar la metodología que se muestra en el acápite de materiales y métodos. En la verificación de la calidad del DNA se obtuvieron imágenes semejantes a la Figura 30. En el centro aparece el marcador fago Lambda (Fermentas Inc. USA) y hacia la derecha e izquierda las bandas correspondientes a los DNA extraídos, en las que se observa que a mayor concentración las bandas aparecen más definidas. En general, la verificación de la calidad de DNA extraído permitió estimar la concentración adecuada del mismo para los ensayos de amplificación, empleándose entre 1 y 8 μL del lisado para las pruebas de amplificación BOXPCR.
FIGURA 30. Gel de control del DNA extraído, cepas 9-18
En la Figura 31, se aprecia el gel revelado con perfiles de amplificación BOX –PCR, donde se observa el marcador molecular Gene Ruler 1 kb DNA Ladder Plus (Fermentas Inc. USA) en el centro (M) y hacia los lados los perfiles obtenidos, para las cepas codificadas, de 1 a 6 y 67 con diferentes disposiciones de bandas, lo que significa que se trata de especies diferentes.
64
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
5000 pb
1500 pb
1000 pb
500 pb
75 pb
FIGURA 31: Perfil de amplificación BOX de diferentes cepas de Bacillus sp. (izquierda), con marcador GeneRuler 1kb DNA Ladder Plus (derecha), el cual permite determinar el peso molecular aproximado de cada una de las bandas obtenidas, es una herramienta fundamental al momento de agrupar perfiles de diferentes geles, ya que permite la asociación de bandas comunes de acuerdo a su posición con respecto al marcador.
65
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
Cuando se quiere comparar múltiples muestras, de geles diferentes, uno con otro, los mejores resultados son obtenidos cuando todos los parámetros experimentales son estandarizados. Esto es especialmente importante cuando existe o se genera una gran base de información o se necesita comparar información generada por diferentes laboratorios (Rademaker J. y Bruijn F., 1997). Las condiciones estandarizadas deberían incluir la preparación y procesamiento de la muestra, uso de condiciones de crecimiento similares, el mismo método de aislamiento de DNA y el uso de las mismas condiciones REP – PCR. El uso de condiciones estandarizadas de electroforesis y el tamaño de los marcadores es esencial, así como el modo de capturar la imagen del revelado. En el desarrollo de la metodología empleada en este trabajo se cuidó de seguir todas las medidas anteriormente numeradas. Mediante ensayos previos, con algunas de las cepas aisladas, empleadas en este trabajo, se determinó la relación que existe entre la intensidad de banda obtenida en el gel de control de calidad y la cantidad de DNA óptima para las pruebas de amplificación BOX. Las cepas así caracterizadas inicialmente sirvieron de control para todos los ensayos subsiguientes. De las 224 cepas aisladas en el proyecto anterior (Velezmoro et al., 2007), se extrajo el DNA de 171 de ellas y se obtuvo el perfil BOX - PCR de 169 cepas (71.88 % del total). Cabe señalar que la diferencia entre el número de perfiles y el total de cepas aisladas se debió a las dificultades para la obtención de bandas bien definidas en los perfiles de amplificación BOX, por lo que se dio preferencia a la obtención de perfiles de las cepas aisladas a partir de espárragos (Tabla 15)
TABLA 15. Cantidad de perfiles de amplificación BOX-PCR obtenidos a partir de las cepas aisladas en el proyecto anterior (Velezmoro et al., 2007)
MUESTREO
CEPAS AISLADAS Suelo Espárragos
1era Etapa 2da Etapa Total
DNA EXTRAÍDO
PERFILES BOX - PCR
Total
Suelo
Espárragos
Total
Suelo Espárragos
Total
M-1 M-2 M-3 M-1 M-2
23 52 32 0 14
10 9 9 10 31
33 61 41 10 45
23 40 32 0 12
10 8 8 6 27
33 48 40 6 39
23 40 31 0 12
10 8 8 5 27
33 48 39 5 39
M-3
6
28
34
1
4
5
1
4
5
224
171
169
Del total de perfiles obtenidos el 63.31 % provinieron del suelo de cultivo de espárrago blanco y el 36,69 % del espárrago en diferentes puntos de la cadena productiva de conservas del mismo. En la Tabla 16, mostrada a continuación, se muestran los agrupamientos de las cepas ensayadas de acuerdo a sus perfiles de amplificación BOX-PCR. Se obtuvieron 29 agrupamientos de cepas (denominados de la letra A a la X), el grupo correspondiente a la denominación K, fue el de mayor frecuencia, con 31 representantes, seguidos del grupo A, dentro del cual se agruparon 22 cepas y el grupo M con 14 cepas. 7 perfiles fueron únicos y no fueron agrupados con otros.
66
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
TABLA 16. Agrupamientos de 169 perfiles de amplificación BOX-PCR GRUPO
A
A'
B
B'
C
D
COD. DE CEPA
COD. PERFIL
M3BE32 M3BE36 2M1BE3 2M1BE4 2M2BE1 2M2BE4 2M2BE10 2M2BE14 2M2BE16 2M2BE22 2M2BE25 2M2BE26 2M2BE28 2M2BE30 2M2BE31 2M2BE33 2M2BE40 2M2BE41 2M2BE42 2M2CE 2M3BE14 2M3BE19 M1BE4 M1BE11 M1BE15 M1BE16 M1BE20 M1BE22 M1BE30 M1BE31 M1BE32 M1BE33 M2BE8 M2BE10 M2BE11 M2BE17 M2BE26 M2BE27 M2BE32 M2BE34 M2BE36 M2BE37
220 25 64 26 226 229 234 237 238 244 246 247 248 250 251 252 259 260 261 11 23 4 142 146 149 150 154 166 172 173 180 181 187 188 189 162 201 202 205 207 209 210
GRUPO
D
D'
E
F
G
G´
67
COD. DE CEPA
COD. PERFIL
M2BE40 M2BE50 M2BE53 M2BE59 M3BE10 M3BE11 M3BE30 M3BE31 M2BE30 M3BE4 M3BE18 M3BE19 M3BE23 2M2BE19 2M2BE39 2M2BE20 2M2BE34 M2BE33 M2BE35 M2BE47 M2BE52 M2BE60 M2BE61 M3BE1 M3BE22 M3BE25 M3BE26 M3BE27 M3BE35 M3BE38 2M2BE21 2M2BE36 2M2BE37 2M2BE29 M1BE24 M2BE5 M1BE8 M1BE18 M1BE25 M1BE27 M2BE4 M2BE21
211 136 123 124 130 113 122 131 204 128 117 118 119 241 258 242 253 206 208 213 138 139 140 125 216 45 218 120 223 224 243 255 256 249 168 185 143 152 169 171 184 164
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
GRUPO
COD. DE CEPA
COD. PERFIL
G´
M2BE28 M3BE33 M3BE34 2M2BE38 M2BE48 M1BE21 M2BE41 M2BE49 2M2BE35 M1BE28 M2BE15 M1BE29 2M2BE13 2M2BE17 2M1BE2 2M2BE5 2M2BE44 2M3BE12 2M2BE6 M1BE9 M2BE16 M2BE25 M3BE8 M3BE29 2M2BE2 2M2BE9 2M2BE12 2M2BE43 M1BE2 M3BE3 M1BE5 M1BE7 M1BE12 M1BE14 M1BE23 M3BE6 M3BE7 M3BE12 M3BE28 M3BE39 M3BE40 M3BE41
203 221 222 257 135 165 17 28 254 179 191 197 236 239 20 230 263 9 231 144 161 195 112 219 227 233 235 262 155 127 175 177 147 178 167 110 111 24 121 132 133 134
2M2BE3
228
H I
J
J'
K
GRUPO
COD. DE CEPA
COD. PERFIL
L
M3BE13 2M3BE23 M1BE6 M2BE1 M2BE22 M2BE23 M2BE24 M2BE7 M3BE21 2M1BE6 M3BE20 2M3BE14 M2BE55 2M1BE5 M2BE56 M3BE5 M3BE17 M2BE51 M1BE13 M1BE17 M1BE19 M2BE13 M2BE14 M1BE26 M2BE42 2M2BE7 2M2BE18 2M2BE23 M3BE2 M2BE9 M2BE12 M2BE19 M1BE10 M3BE24 M2BE18 M3BE14 M3BE16 M3BE15 M2BE6 M1BE3 M2BE3 M1BE1
114 10 176 182 192 193 194 198 2 19 21 23 50 62 68 109 116 137 148 151 153 159 160 170 212 232 240 245 126 199 190 200 145 217 163 214 215 115 186 141 183 196
M
N
O
P
Q
R S T U V W X
68
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
Las 34 cepas, representantes de cada agrupamiento (Ver formato de envío a secuenciamiento en la sección Anexos) fueron enviadas a secuenciar y como producto de la caracterización molecular se identificaron 7 especies de Bacillus y 1 de Paenibacillus. Para la confirmación de las especies identificadas mediante el secuenciamiento realizado por Macro Gen Inc. (Seúl, Korea), se elaboró el dendograma o árbol filogenético mostrado en la Figura 32. En la Tabla 17 se muestran los resultados de la identificación molecular de las cepas secuenciadas y trabajadas de acuerdo a lo explicado en la metodología (ver 3.4.7 Secuenciamiento). TABLA 17. Identificación de cepas secuenciadas y su procedencia ESPECIE
B. subtilis
B. subtilis / B. amyloliquefaciens B. pumilus
B. licheniformis B. megaterium B. thurigensis / B. cereus / B. anthracis (Grupo cereus) B. endophyticus Paenibacillus polymyxa N.D.
CÓD. DE PERFIL
CEPA SECUENCIADA
PROCEDENCIA
011 113 149 172 117 120 143 184 208 213 203 204 123 138 140 135 165 179 009 147 114 010 109 159 212 126 145 163 214
2M2CE M3BE11 M1BE15 M1BE30 M3BE18 M3BE27 M1BE8 M2BE4 M2BE35 M2BE47 M2BE28 M2BE30 M2BE53 M2BE52 M2BE61 M2BE48 M1BE21 M1BE28 2M3BE12 M1BE12 M3BE13 2M3BE23 M3BE5 M2BE13 M2BE42 M3BE2 M1BE10 M2BE18 M3BE14
Espárragos (control comercial) Suelo Suelo Suelo Espárragos (cosecha) Suelo Suelo Suelo Suelo Suelo Espárragos (cosecha) Suelo Suelo Suelo Suelo Suelo Espárragos (cosecha) Espárragos (cosecha) Espárragos (envasado, 3h espera) Suelo Suelo Espárragos (recepción) Suelo Suelo Espárragos (cosecha) Suelo Suelo Suelo Suelo
115
M3BE15
Suelo
186 141 183 129
M2BE6 M1BE3 M2BE3 M3BE9
Suelo Suelo Suelo Suelo
N.D. : No determinado
69
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
M3BE11 113
FIGURA 32. Dendograma ó arbol filogenético basado en el gen ribosomal 16S para 34 cepas secuenciadas de Bacillus
M3BE18 117 M2BE53 123 26
M1BE15 149 EF433402 Bsub spizizenii BCRC17366
28
Se observa la posición de las cepas evaluadas respecto a las cepas de referencia dentro de los géneros Bacillus y Paenibacillus. El árbol se construyó mediante el algoritmo Neighbour-Joining (Saitou & Nei, 1987) a partir de una
M1BE30 172 M2BE30 204 AF318900 Bsub spizizenii N10 W23 derivat
26
46 EF433403 Bsub spizizenii BCRC10447
2M2CE 011 66 EF433405 Bmoj BCRC17124 53
matriz de distancia corregida por sustituciones múltiples por el método Jukes & Cantor (1969).
DQ993678 Bmoj BCRC17531 74 49
DQ993670 Baxa CIP108772
49 DQ993672 Bmal CECT5687
M2BE52 138 M3BE27 120 M2BE4 184 M1BE8 143
43
EF423595 Bsub subtilis BCRC14716 EF423598 Bsub subtilis BCRC17435 70
60 M2BE47 213
EF423592 Bsub subtilis BCRC10255 M2BE28 203 AL009126 Bsub subtilis 168 rrnA M2BE61 140 10 M2BE35 208
EF433406 Bamy BCRC11601 66
DQ993675 Bamy BCRC17038
58
85
EF423607 Bamy BCRC14711 EF433404 Bval BCRC17183
71
EF433408 Bamy BCRC14193 EF433407 Bvel BCRC17467
51
M1BE28 179
40 M2BE48 135
99
M1BE21 165 EF433409 Batr BCRC17123 99 DQ993677 Batr BCRC17530
M3BE5 109
87
M2BE42 212 94 EF433411 Bson BCRC17416
100
99
DQ993679 Bson BCRC17532 EF433410 Blic BCRC11702
71
2M3BE23 010 96 EF423609 Blic BCRC14353
M2BE13 159 96 2M3BE12 009
51
M1BE12 147 M3BE13 114
100
AY876289 Bpum ATCC7061
99
AF234854 Bsaf FO 036b 87 AE017334 Bant Ames Ancestor Ba16SA 43
M3BE15 115 AF290545 Bthu ATCC10792
100 40
DQ207729 Bcer CCM2010 AB021192 Bmyc ATCC6462
36 100
Z84578 Bwei WSBC10204T
AF295302 Bend 100
M2BE6 186
D16273 B meg IAM13418 M2BE18 163
100 61 47
M3BE2 126 M1BE10 145
50 M3BE14 214
NBRC15309 Ppol 100
M1BE3 141 91 M2BE3 183
0.05
FIGURA 32. Dendograma ó arbol filogenético basado en el gen ribosomal 16S para 34 cepas secuenciadas de Bacillus
70
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
Se decidió reagrupar los 169 perfiles BOX-PCR de acuerdo a su similitud con los de las cepas secuenciadas e identificadas. En el caso de B. subtilis se obtuvieron cinco grupos, denominados S1, S2, S3, S4 y S5. Se presentaron 2 grupos diferentes para las cepas identificadas como B. megaterium y P. polymyxa, en tanto que las demás especies únicamente presentaron un perfil. Los agrupamientos dentro de cada especie se diferenciaron de acuerdo a la intensidad de bandas específicas del perfil (Figura 33)
FIGURA 33. Agrupamiento de cepas de acuerdo a sus perfiles de amplificación BOXPCR para su identificación
A. Perfiles de amplificación BOX – PCR de B. subtilis - Grupo S1
B. Perfiles de amplificación BOX – PCR de B. subtilis - Grupo S2
71
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
C
D
Perfiles de amplificación BOX – PCR de B. subtilis C. Grupo S3, D. Grupo S4
E. Perfiles de amplificación BOX – PCR de B. subtilis - Grupo S5
72
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
F. Perfiles de amplificación BOX – PCR de B. pumilus
G. Perfiles de amplificación BOX – PCR de B. amyloliquefaciens
73
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
H. Perfiles de amplificación BOX – PCR de B. licheniformis
Grupo M
Grupo M1
I. Perfiles de amplificación BOX – PCR de B. megaterium
74
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
J
K
L
J. Perfiles BOX de Bacillus sp. (Grupo cereus), K. Perfiles BOX de B. endophyticus, L. Perfiles BOX de Paenibacillus polymyxa
B. subtilis fue la especie con la mayor frecuencia alcanzada (52.07%), seguida de B. pumilus (18.93%) y B. licheniformis (15.98%), también fueron encontrados B. megaterium (5.33%), B. subtilis / amyloliquefaciens (4.73%), Bacillus sp. (Grupo cereus) (0.59%), B. endophyticus (0.59%). Así mismo, Paenibacillus polymyxa representó el 1.78% de las cepas caracterizadas (Tabla 18) Bacillus megaterium, Bacillus sp. (Grupo cereus), B. endophyticus y Paenibacillus polymyxa sólo fueron identificados en suelo; en tanto las demás especies de Bacillus fueron encontradas tanto en suelo como en espárragos en las diferentes etapas en la cadena productiva. Dentro de la especie identificada como Bacillus subtilis, el grupo S2 fue el de mayor incidencia (29 cepas); el 89.7% de estas provinieron de muestras de suelo, todos de la primera etapa de muestreos del proyecto anterior (Velezmoro et al., 2007). El grupo S2 (Figura 33 B) se caracterizó por poseer una banda por debajo de los 5000 pb, otra por debajo de los 1500 kb y 3 bandas por encima de los 2000 pb respecto al marcador Gen Ruler DNA Ladder Plus 1kb. Dentro del grupo S1 de esta especie se agruparon 22 cepas y el mayor porcentaje de ellas (63.64%) se aislaron a partir de muestras de espárragos en las diferentes etapas de la cadena de envasado de conservas. El perfil presenta dos bandas características y bien definidas por debajo de los 1500 pb y dos bandas tenues por encima de los 2000 pb. En los carriles 220, 224, 229, 234, 237, 238 (Figura 33 A) las bandas de menor peso molecular presentaron muy 75
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
baja intensidad. Cabe señalar, que la cepa correspondiente al carril 011, pertenece a la cepa 2M2CE, identificada anteriormente y enviada a secuenciar, confirmando la identidad obtenida mediante el kit de pruebas bioquímicas API 50 CHB. Esta cepa fue utilizada en las pruebas de curvas de crecimiento. El grupo S3 estuvo constituido por solo 4 perfiles (Figura 33 C), es el de menor cantidad de representantes de la especie B. subtilis, todos provenientes de espárragos. Los perfiles presentaron una banda muy definida por arriba de 1500 pb, otra por encima de los 2000 pb y una a la altura de los 4000 pb aproximadamente. Además un patrón de bandas múltiples por debajo de los 1000 pb. La especie B. subtilis del grupo S4 presentó 20 representantes, 16 de los cuales fueron de suelo (80%). Los perfiles se caracterizaron por la presencia de 2 bandas por debajo de los 2000 pb (Figura 33 D), además presentaron múltiples bandas equidistantes entre los 1500 y 700 pb, las cuales no fueron bien percibidas en los perfiles correspondientes a los carriles 140, 218, 223 y 224. En los carriles 253 y 255 las 2 bandas características mencionadas anteriormente no tienen la misma intensidad que el resto de carriles. El grupo S5 presentó 13 cepas representantes, de las cuales 10 provinieron de muestras de suelo (76.9%). Su patrón de bandas fue muy parecido al del grupo S4, sin embargo, no se encontraron las múltiples bandas equidistantes características del grupo anterior, en cambio presentó 2 bandas tenues a la altura de los 1000 pb (Figura 33 E). El grupo de perfiles identificados como B. pumilus (Figura 33 F) estuvo constituido por 32 cepas, 16 provenientes de espárragos y 16 de muestras de suelo. Los perfiles presentaron un arreglo característico constituido por 3 bandas bien definidas, la de mayor intensidad localizada a la altura de los 1500 pb, otra entre 1500 y 2000 pb y la última por debajo de los 1000 pb. También posee una cuarta banda definida por debajo de los 700 pb. En los carriles 167 y 177, esta no se encuentra muy marcada. Los perfiles identificados como B. amyloliquefaciens agruparon 8 cepas (Figura 33 G), 5 de las cuales provinieron de cepas de aislamientos de espárragos. Se caracterizaron por la presencia de 3 bandas entre 2000 y 3000 pb y una banda bien definida entre 4000 y 5000 pb. Otras 2 bandas de bajo peso molecular se ubican por arriba de 500 pb. En la Figura 33 G, las cepas de los carriles 017 y 028 muestran algunas bandas de alto peso molecular muy tenuemente. Se obtuvieron 27 perfiles BOX-PCR de la especie B. licheniformis (14 de suelo y 13 de espárragos). Estos mostraron un arreglo compuesto de 3 bandas muy definidas entre 5000 y 3000 pb, otro, también constituido de 3 bandas, que incluye una de mayor intensidad a la altura de los 2000 pb. Los perfiles de los carriles 116, 137, 148, 151 muestran un barrido de bandas, por lo cual los perfiles se aprecian no muy definidos (Figura 33 H). El grupo identificado como B. megaterium, agrupó 9 cepas, todas ellas provenientes de muestras de suelo del cultivo de espárragos. Se observaron 2 grupos de perfiles para esta especie. El grupo M, constituido por 6 representantes, posee dos bandas a la altura de 3000 pb, Además otras dos bandas muy marcadas a 2000 y 1500 pb. El grupo M1 también comparte las mismas bandas representativas que el grupo M, sin embargo presentaron además un arreglo de múltiples bandas por debajo de los 1000 pb.
76
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
La especie Bacillus sp. (Grupo cereus) tuvo un representante dentro de las 169 cepas evaluadas, en este perfil se pudo observar 2 bandas por debajo de 2000 pb y una banda muy definida por debajo de los 1000 pb. B. endophyticus tuvo un solo representante, el perfil mostró una banda gruesa ligeramente por encima de los 1000 pb, otra banda entre los 1500 pb y 2000 pb y una tercera a los 3000 pb. La especie identificada como Paenibacillus polymyxa se caracteriza por poseer una banda entre los 4000 y 5000 pb, otra ligeramente mayor a 3000 pb y 3 bandas entre los 1500 kb y 1000 kb; presenta además una banda muy definida entre 500 y 700 pb. La especie identificada agrupó 3 cepas aisladas de muestras de suelo.
TABLA 18. Especies identificadas y su procedencia de aislamiento Procedencia Especie
GRUPOS
Suelo
Espárrago
Total
Porcentaje Total
Cantidad Porcentaje Cantidad Porcentaje
B. subtilis
B. subtilis / amyloliquefaciens B. pumilus B. licheniformis
B. megaterium Bacillus sp. (Grupo cereus) B. endophyticus Paenibacillus polymyxa TOTAL
S1 S2 S3 S4 S5
8 26 0 16 10 60 3 3 16 16
4,73% 15,38% 0,00% 9,47% 5,92% 35,50% 1,78% 1,78% 9,47% 9,47%
14 3 4 4 3 28 5 5 16 16
8,28% 1,78% 2,37% 2,37% 1,78% 16,57% 2,96% 2,96% 9,47% 9,47%
22 29 4 20 13 88 8 8 32 32
14 14
8,28% 8,28%
13 13
7,69% 7,69%
27 27
15,98%
6 3 9
3,55% 1,78% 5,33%
0 0 0
0,00% 0,00% 0,00%
6 3 9
5,33%
1 1
0,59% 0,59%
0 0
0,00% 0,00%
1 1
0,59%
E
1 1
0,59% 0,59%
0 0
0,00% 0,00%
1 1
0,59%
Pol Pol1
1 2 3
0,59% 1,18% 1,78%
0 0 0
0,00% 0,00% 0,00%
1 2 3
1,78%
107
63,31%
62
36,69%
169
100.00%
Amy P L M M1 GC
77
52,07% 4,73% 18,93%
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
En la Tabla 19, se muestra la caracterización morfológica y procedencia de cada una de las cepas identificadas, así como la codificación perteneciente al informe del Proyecto PROCOM–CONCYTEC 2006–2007, realizado por Velezmoro et al (2007). Durak et al. refieren que históricamente los géneros Bacillus y Clostridium han sido considerados los únicos géneros capaces de formar esporas resistentes al calor de importancia en microbiología de alimentos. Sin embargo, estudios recientes, han demostrado que muchos organismos anteriormente clasificados dentro del género Bacillus, actualmente representan un número de géneros dentro de la clase Bacilli. Se han definido por lo menos 12 nuevos géneros de bacterias aerobias formadoras de esporas, incluyendo Paenibacillus (Ash et al., 1993), Brevibacillus (Shida et al., 1996), Geobacillus (Nazina et al., 2001) Amphibacillus (Niimura et al., 1990), Alicyclobacillus (Wisotzkey et al., 1992), Aneurinibacillus (Shida et al., 1996), Filobacillus (Schlesner et al., 2001), Halobacillus (Spring et al., 1996), Gracilibacillus, Salibacillus (Wainø et al., 1999) Ureibacillus (Fortina et al., 2001) y Virgibacillus (Heyndrickx et al., 1998). La especie Paenibacillus en particular se encuentra relacionada a la contaminación de alimentos, ha sido reportado su aislamiento tanto de productos leche fresca como tratada al calor (Scheldeman et al., 2004). El grupo de B. subtilis (B. licheniformis, B. subtilis y B. pumilus) ha sido asociado con un rango de condiciones clínicas, tanto como deterioro de alimentos. Así mismo, B. anthracis es una especie de Bacillus considerada patogénica para humanos y animales (US EPA, 1997). B. licheniformis ha sido asociado a enfermedades sistémicas serias tales como septicemia, peritonitis y oftalmitis (Salkinoja-Salonen et al., 1999). La contaminación de alimentos por B. licheniformis está frecuentemente asociada con alimentos preparados y vegetales. Su periodo de incubación es de 2 - 14 horas y el síntoma predominante es diarrea, con vómitos en la mitad de los casos (Lund, 1990; Tatzel et al., 1994; Granum & Baird-Parker, 2000) Después de B. cereus, B. subtilis, es el más asociado con contaminación de alimentos, frecuentemente en carnes, productos de pastelería, platos de arroz con carne o productos marinos; y en números superiores a 105 UFC/g se han reportado casos de enfermedades (Lund, 1990; Shinagawa, 1990; Granum & Baird-Parker, 2000). Se han investigado muchos episodios de contaminación de alimentos por B. subtilis en Japón (Shinagawa, 1990) y el Reino Unido (Lund, 1990). Los síntomas de los pacientes han sido vómitos en la mayoría de los casos y un corto periodo de incubación (Lund, 1990; Jenson & Moir, 2003) Paenibacillus polymyxa se encuentra comúnmente asociado a alimentos vegetales en descomposición, degrada la pectina y los polisacáridos de las plantas, fijan nitrógeno bajo condiciones anaeróbicas. Sus colonias son mucosas y tienden a expandirse (Kenneth, 2008)
78
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
TABLA 19.
Listado de cepas agrupadas por especie identificada y caracterización morfológica
A. Bacillus subtilis Cód. de Perfil
Cód. de Cepa
Procedencia
Grupo (Perfil)
Grupo Esporogénico
Tamaño
Forma
Color (PBC)
Borde
Textura
Viraje (PBC)
142
M1BE4
Suelo
S2
EMA
grande
aplanada
blanco
irregular
seca
no
143
M1BE8
Suelo
S5
ETANA
grande
aplanada
blanco
irregular
seca
no
146
M1BE11
Suelo
S2
EMANA
grande
aplanada
morado
irregular
seca
no
149
M1BE15
Suelo
S2
EMA
mediano
convexa
morado
N.D.
mucosa
N.D.
150
M1BE16
Suelo
S2
EMANA
pequeño
aplanado
morado
irregular
seca
no
152
M1BE18
Suelo
S5
ETANA
pequeño
aplanada
morado
irregular
seca
no
154
M1BE20
Suelo
S2
ETANA
mediano
aplanada
morado
irregular
seca
no
166
M1BE22
Suelo
S2
ETANA
pequeño
aplanada
amarillo
irregular
seca
sí
168
M1BE24
Esparrago C.
S5
ETANA
pequeño
redonda
blanco
irregular
seca
no
169
M1BE25
Suelo
S5
ETANA
pequeño
redonda
blanco
irregular
seca
no
171
M1BE27
Suelo
S5
ETANA
pequeño
aplanada
amarillo
irregular
seca
sí
172
M1BE30
Suelo
S2
EMANA
grande
redonda
morado
irregular
acuosa
no
173
M1BE31
Suelo
S2
EMANA
grande
aplanadas
morado
irregular
seca
no
180
M1BE32
Suelo
S2
EMANA
grande
redondas
blanco
irregular
acuosa
no
181
M1BE33
Esparrago C.
S2
ETANA
grande
aplanadas
blanco
irregular
seca
no
184
M2BE4
Suelo
S5
EMA
grande
aplanada
Blanco
irregular
seca
no
185
M2BE5
Esparrago C.
S5
EMA
grande
aplanada
Blanco
irregular
seca
no
187
M2BE8
Suelo
S2
EMA
mediano
aplanada
Blanco
irregular
seca
N.D.
188
M2BE10
Suelo
S2
EMA
grande
aplanada
Blanco
irregular
seca
no
189
M2BE11
Suelo
S2
EMA
mediano
aplanada
Blanco
irregular
seca
no
162
M2BE17
Suelo
S2
EMA
grande
aplanada
Blanco
irregular
seca
no
164
M2BE21
Suelo
S5
ETANA
pequeño
redonda
Blanco
irregular
seca
no
201
M2BE26
Esparrago C.
S2
EMANA
mediano
redonda
Morado
irregular
seca
no
79
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
Cód. de Perfil
Cód. de Cepa
Procedencia
Grupo (Perfil)
Grupo Esporogénico
Tamaño
Forma
Color (PBC)
Borde
Textura
Viraje (PBC)
202
M2BE27
Suelo
S2
ETA
mediano
aplanada
Blanco
irregular
seca
no
203
M2BE28
Suelo
S5
ETA
pequeño
redonda
Blanco
irregular
seca
no
204
M2BE30
Suelo
S2
ETA
grande
aplanada
Morado
irregular
seca
no
205
M2BE32
Suelo
S2
ETA
grande
aplanada
Blanco
irregular
seca
no
206
M2BE33
Suelo
S4
EMA
mediano
aplanada
Morado
N.D.
N.D.
N.D.
207
M2BE34
Suelo
S2
ETANA
grande
aplanada
Blanco
irregular
seca
no
208
M2BE35
Suelo
S4
ETANA
grande
aplanada
Morado
irregular
seca
no
209
M2BE36
Suelo
S2
ETANA
grande
aplanada
Blanco
irregular
seca
no
210
M2BE37
Suelo
S2
EMANA
grande
aplanada
Blanco
irregular
seca
no
211
M2BE40
Suelo
S2
EMANA
mediano
redonda
Morado
irregular
acuoso
no
213
M2BE47
Suelo
S4
EMA
mediano
aplanada
Blanco
irregular
seca
no
136
M2BE50
Suelo
S2
EMA
grande
aplanada
Morado
irregular
seca
no
138
M2BE52
Suelo
S4
EMANA
mediano
redondas
Morado
irregular
acuoso
no
123
M2BE53
Suelo
S2
ETA
pequeño
aplanada
Amarillo
irregular
seca
sí
124
M2BE59
Suelo
S2
EMA
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
139
M2BE60
Suelo
S4
EMA
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
140
M2BE61
Suelo
S4
EMA
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
125
M3BE1
Suelo
S4
EMA
mediano
convexa
morado
N.D.
acuosa
N.D.
128
M3BE4
Esparrago C.
S3
EMA
grande
aplanada
blanco
N.D.
seca
N.D.
130
M3BE10
Suelo
S2
EMA
grande
aplanada
morado
N.D.
seca
N.D.
113
M3BE11
Suelo
S2
EMA
mediano
convexa
morado
N.D.
seca
N.D.
117
M3BE18
Esparrago C.
S3
ETA
grande
aplanada
morado
N.D.
seca
N.D.
118
M3BE19
Esparrago C.
S3
ETA
mediano
convexa
morado
N.D.
mucosa
N.D.
216
M3BE22
Suelo
S4
ETA
grande
aplanada
morado
N.D.
seca
N.D.
119
M3BE23
Esparrago C.
S3
ETA
grande
convexa
morado
N.D.
mucosa
N.D.
45
M3BE25
Suelo
S4
ETA
pequeño
aplanada
morado
N.D.
seca
N.D.
80
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
Cód. de Perfil
Cód. de Cepa
Procedencia
Grupo (Perfil)
Grupo Esporogénico
Tamaño
Forma
Color (PBC)
Borde
Textura
Viraje (PBC)
218
M3BE26
Suelo
S4
EMANA
mediano
120
M3BE27
Suelo
S4
EMANA
grande
convexa
blanco
convexa
morado
N.D.
seca
N.D.
N.D.
acuosa
N.D.
122
M3BE30
Esparrago H.
S2
EMANA
mediano
convexa
morado
N.D.
mucosa
N.D.
131
M3BE31
Suelo
S2
220
M3BE32
Suelo
S1
EMANA
mediano
EMANA
mediano
convexa
morado
N.D.
acuosa
N.D.
convexa
morado
N.D.
acuosa
N.D.
221
M3BE33
Suelo
S5
EMANA
pequeño
convexa
blanco
N.D.
seca
N.D.
222
M3BE34
223
M3BE35
Suelo
S5
Suelo
S4
EMANA
mediano
convexa
morado
N.D.
mucosa
N.D.
EMANA
grande
convexa
morado
N.D.
seca
N.D.
25
M3BE36
Suelo
S1
EMANA
mediano
convexa
blanco
N.D.
mucosa
N.D.
224
M3BE38
Suelo
S4
EMANA
grande
convexa
morado
N.D.
mucosa
N.D.
64
2M1BE3
Esparrago 3hrs.
S1
EMA
pequeño
redondeada
regular
N.D.
cremosa
N.D.
26
2M1BE4
Esparrago 3hrs.
S1
EMA
mediano
aplanada
irregular
N.D.
seca/cremosa
N.D.
226
2M2BE1
Esparrago R.
S1
EMA
grande
aplanada
irregular
N.D.
seca
N.D.
229
2M2BE4
Esparrago H.
S1
EMANA
pequeño
aplanada
regular
N.D.
seca
N.D.
234
2M2BE10
Esparrago 1hrs.
S1
EMANA
pequeño
difusa
irregular
N.D.
cremosa
N.D.
237
2M2BE14
Esparrago H.
S1
EMANA
pequeño
aplanada
regular
N.D.
cremosa
N.D.
238
2M2BE16
Esparrago 1hrs.
S1
EMANA
mediano
aplanada
irregular
N.D.
seca
N.D.
241
2M2BE19
Esparrago 1hrs.
S4
EMANA
pequeño
aplanada
regular
N.D.
cremosa
N.D.
242
2M2BE20
Esparrago H.
S4
EMANA
pequeño
aplanada
regular
N.D.
cremosa
N.D.
243
2M2BE21
Suelo
S4
ETA
grande
aplanada
regular
N.D.
cremosa
N.D.
244
2M2BE22
Suelo
S1
EMANA
grande
aplanada
irregular
N.D.
seca/cremosa
N.D.
246
2M2BE25
Suelo
S1
EMANA
mediano
traslúcida
irregular
N.D.
mucosa
N.D.
247
2M2BE26
Suelo
S1
EMANA
mediano
redondeada
regular
N.D.
seca
N.D.
248
2M2BE28
Suelo
S1
EMANA
grande
aplanada
irregular
N.D.
mucosa
N.D.
249
2M2BE29
Esparrago 3hrs.
S5
EMANA
grande
aplanada
irregular
N.D.
cremosa/seca
N.D.
250
2M2BE30
Esparrago 3hrs.
S1
EMANA
mediano
convexa
irregular
N.D.
seca
N.D.
251
2M2BE31
Esparrago R.
S1
EMANA
mediano
aplanada
irregular
N.D.
cremosa
N.D.
81
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
Cód. de Perfil
Cód. de Cepa
Procedencia
Grupo (Perfil)
Grupo Esporogénico
Tamaño
Forma
Color (PBC)
Borde
Textura
Viraje (PBC)
252
2M2BE33
Esparrago R.
S1
EMA
mediano
aplanada
irregular
N.D.
seca/mucosa
N.D.
253
2M2BE34
Esparrago R.
S4
EMA
mediano
aplanada
irregular
N.D.
seca
N.D.
255
2M2BE36
Suelo
S4
EMA
mediano
aplanada
irregular
N.D.
cremosa
N.D.
256
2M2BE37
Suelo
S4
EMA
mediano
aplanada
regular
N.D.
cremosa
N.D.
257
2M2BE38
Suelo
S5
EMA
mediano
aplanada
irregular
N.D.
cremosa
N.D.
258
2M2BE39
Esparrago B.
S4
EMANA
pequeño
redondeada
regular
N.D.
cremosa
N.D.
259
2M2BE40
Suelo
S1
EMANA
pequeño
redondeada
regular
N.D.
cremosa
N.D.
260
2M2BE41
Esparrago 1hrs.
S1
EMANA
pequeño
redondeada
regular
N.D.
cremosa
N.D.
261
2M2BE42
Esparrago R.
S1
EMANA
pequeño
redondeada
regular
N.D.
cremosa
N.D.
11
2M2CE
CPB
S1
CE
mediano
redondeada
irregular
N.D.
seca/cremosa
N.D.
23
2M3BE14
Suelo
S1
ETA
grande
aplanada
irregular
N.D.
seca/mucosa
N.D.
4
2M3BE19
Esparrago 1hrs.
S1
EMANA
grande
aplanada
irregular
N.D.
seca
N.D.
B. Bacillus pumilus Cód. de Perfil
Cód. de Cepa
Procedencia
Grupo (Perfil)
Grupo Esporogénico
Tamaño
Forma
Color (PBC)
Borde
Textura
Viraje (PBC)
155
M1BE2
Suelo
P
EMA
mediano
aplanada
blanco
irregular
seca
no
127
M3BE3
Suelo
P
EMA
mediano
convexa
morado
N.D.
seca
N.D.
175
M1BE5
Suelo
P
EMA
mediano
aplanada
blanco
irregular
seca
no
177
M1BE7
Suelo
P
ETANA
grande
aplanada
blanco
irregular
seca
no
144
M1BE9
Esparrago C.
P
EMANA
grande
aplanada
morado
irregular
seca
no
147
M1BE12
Suelo
P
EMA
pequeño
redonda
blanco
irregular
mucosa
no
178
M1BE14
Suelo
P
EMA
pequeño
aplanada
amarillo
irregular
seca
sí
167
M1BE23
Suelo
P
ETANA
pequeño
redonda
amarillo
irregular
seca
sí
82
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
Cód. de Perfil
Cód. de Cepa
Procedencia
Grupo (Perfil)
Grupo Esporogénico
Tamaño
Forma
Color (PBC)
Borde
Textura
Viraje (PBC)
161
M2BE16
Esparrago C.
P
EMA
grande
aplanada
Blanco
irregular
seca
no
195
M2BE25
Esparrago C.
P
ETANA
pequeño
redonda
Blanco
irregular
seca
no
110
M3BE6
Suelo
P
EMA
pequeño
aplanada
morado
N.D.
seca
N.D.
111
M3BE7
Suelo
P
EMA
pequeño
aplanada
morado
N.D.
seca
N.D.
112
M3BE8
Esparrago C.
P
EMA
pequeño
aplanada
morado
N.D.
seca
N.D.
24
M3BE12
Suelo
P
EMA
pequeño
aplanada
morado
N.D.
seca
N.D.
114
M3BE13
Suelo
P
EMA
mediano
aplanada
N.D
N.D.
seca
N.D.
121
M3BE28
Suelo
P
EMANA
mediano
convexa
morado
N.D.
mucosa
N.D.
219
M3BE29
Esparrago C.
P
EMANA
pequeño
convexa
morado
N.D.
mucosa
N.D.
132
M3BE39
Suelo
P
EMANA
pequeño
N.D.
morado
N.D.
mucosa
N.D.
133
M3BE40
Suelo
P
EMANA
mediano
N.D.
morado
N.D.
mucosa
N.D.
134
M3BE41
Suelo
P
EMANA
mediano
N.D.
morado
N.D.
mucosa
N.D.
20
2M1BE2
Esparrago 3hrs.
P
EMA
mediano
redondeada
N.D.
regular
cremosa
N.D.
227
2M2BE2
Esparrago R.
P
EMANA
grande
redondeada
N.D.
regular
cremosa
N.D.
228
2M2BE3
Suelo
P
ETA
grande
difusa
N.D.
irregular
seca
N.D.
230
2M2BE5
Esparrago 3hrs.
P
EMANA
pequeño
aplanada
N.D.
regular
cremosa
N.D.
231
2M2BE6
Esparrago B.
P
EMANA
pequeño
aplanada
N.D.
regular
cremosa
N.D.
233
2M2BE9
Esparrago R.
P
EMANA
pequeño
redondas
N.D.
regular
cremosa
N.D.
235
2M2BE12
Esparrago R.
P
EMA
grande
aplanada
N.D.
irregular
cremosa
N.D.
236
2M2BE13
Esparrago 1hrs.
P
EMANA
pequeño
aplanada
N.D.
irregular
seca
N.D.
239
2M2BE17
Esparrago 1hrs.
P
EMANA
pequeño
aplanada
N.D.
irregular
seca
N.D.
262
2M2BE43
Esparrago R.
P
EMANA
pequeño
redondeada
N.D.
regular
cremosa
N.D.
263
2M2BE44
Esparrago 3hrs.
P
EMANA
pequeño
redondeada
N.D.
regular
cremosa
N.D.
9
2M3BE12
Esparrago 3hrs.
P
EMANA
pequeño
redondeada
N.D.
regular
cremosa
N.D.
83
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
C. Bacillus licheniformis Cód. de Perfil
Cód. de Cepa
Procedencia
Grupo (Perfil)
Grupo Esporogénico
Tamaño
Forma
Color (PBC)
Borde
Textura
Viraje (PBC)
176
M1BE6
Esparrago C.
L
ETANA
grande
148
M1BE13
Esparrago C.
L
EMA
grande
aplanada
blanco
irregular
seca
no
aplanada
morado
irregular
seca
no
151
M1BE17
Suelo
L
EMANA
pequeño
aplanada
morado
irregular
seca
no
153
M1BE19
Esparrago C.
L
ETA
mediano
aplanada
blanco
irregular
seca
no
170
M1BE26
Esparrago C.
182
M2BE1
Suelo
L
ETANA
pequeño
redonda
rosado
irregular
mucosa
no
L
EMA
pequeño
aplanada
Morado
irregular
seca
no
198
M2BE7
159
M2BE13
Suelo
L
EMA
mediano
redonda
Morado
irregular
acuosa
no
Suelo
L
EMA
mediano
aplanada
Blanco
irregular
seca
no
160
M2BE14
Esparrago C.
L
EMA
mediano
aplanada
Blanco
irregular
acuoso
no
192 193
M2BE22
Suelo
L
ETANA
pequeño
redonda
Blanco
irregular
seca
no
M2BE23
Esparrago C.
L
ETANA
pequeño
redonda
Blanco
irregular
seca
no
194
M2BE24
Suelo
L
ETA
pequeño
redonda
Blanco
irregular
seca
no
212
M2BE42
Esparrago C.
L
EMANA
mediano
aplanada
Morado
irregular
seca
no
137
M2BE51
Suelo
L
EMANA
pequeño
aplanada
Amarillo
irregular
seca
sí
50
M2BE55
Suelo
L
ETANA
mediano
aplanada
Morado
N.D.
seca
N.D.
68
M2BE56
Suelo
L
EMANA
mediano
aplanada
Morado
irregular
seca
N.D.
109
M3BE5
Suelo
L
EMA
grande
convexa
morado
N.D.
acuosa
N.D.
116
M3BE17
Esparrago C.
L
ETA
grande
convexa
morado
N.D.
acuosa
N.D.
21
M3BE20
Suelo
L
ETA
grande
aplanada
morado
N.D.
seca
N.D.
2
M3BE21
Suelo
L
ETA
mediano
aplanada
morado
N.D.
seca
N.D.
62
2M1BE5
Esparrago 3hrs.
L
EMA
pequeño
aplanada
regular
N.D.
cremosa
N.D.
19
2M1BE6
Esparrago 3hrs.
L
EMA
pequeño
aplanada
regular
N.D.
cremosa
N.D.
232
2M2BE7
Esparrago R.
L
ETA
grande
aplanada
irregular
N.D.
cremosa
N.D.
240
2M2BE18
Suelo
L
ETANA
grande
aplanada
irregular
N.D.
seca/cremosa
N.D.
245
2M2BE23
Suelo
L
ETA
grande
redondeada
irregular
N.D.
cremosa
N.D.
84
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
Cód. de Perfil
Cód. de Cepa
Procedencia
Grupo (Perfil)
Grupo Esporogénico
Tamaño
Forma
Color (PBC)
Borde
Textura
Viraje (PBC)
10
2M3BE23
Esparrago R.
L
EMANA
grande
aplanada
irregular
N.D.
cremosa
N.D.
23
2M3BE14
Esparrago R.
L
EMANA
grande
aplanada
irregular
N.D.
cremosa
N.D.
D. Bacillus megaterium Cód. de Perfil
Cód. de Cepa
Procedencia
Grupo (Perfil)
Grupo Esporogénico
Tamaño
Forma
Color (PBC)
Borde
Textura
Viraje (PBC)
145
M1BE10
Suelo
M
EMANA
mediano
redonda
amarillo
irregular
mucosa
sí
199
M2BE9
Suelo
M
EMA
mediano
redondas
Blanco
irregular
seca
no
190
M2BE12
Suelo
M
EMA
mediano
redonda
Morado
irregular
mucosa
no
163
M2BE18
Suelo
M
EMA
grande
aplanada
Blanco
irregular
seca
no
200
M2BE19
Suelo
M
EMA
mediano
aplanada
Morado
N.D.
N.D.
N.D.
126
M3BE2
Suelo
M
EMA
mediano
convexa
morado
N.D.
seca
N.D.
214
M3BE14
Suelo
M
EMA
grande
aplanada
blanco
N.D.
seca
N.D.
215
M3BE16
Suelo
M
EMA
mediano
convexa
morado
N.D.
mucosa
N.D.
217
M3BE24
Suelo
M
ETA
grande
aplanada
morado
N.D.
seca
N.D.
E. Bacillus. amyloliquefaciens Cód. de Perfil
Cód. de Cepa
Procedencia
Grupo (Perfil)
Grupo Esporogénico
Tamaño
Forma
Color (PBC)
Borde
Textura
Viraje (PBC)
165
M1BE21
Esparrago C.
Am
EMA
grande
aplanada
blanco
irregular
seca
no
179
M1BE28
Esparrago C.
Am
EMA
grande
aplanada
blanco
irregular
seca
no
197
M1BE29
Esparrago C.
Am
EMA
grande
aplanada
blanco
irregular
seca
no
191
M2BE15
Suelo
Am
EMA
N.D.
aplanada/convexa
Blanco
N.D.
N.D.
N.D.
85
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
Cód. de Perfil
Cód. de Cepa
Procedencia
Grupo (Perfil)
Grupo Esporogénico
Tamaño
Forma
Color (PBC)
Borde
Textura
Viraje (PBC)
17
M2BE41
Esparrago C.
Am
EMANA
grande
aplanada
Blanco
irregular
seca
no
135
M2BE48
Suelo
Am
EMA
mediano
aplanada
Morado
irregular
seca
no
28
M2BE49
Suelo
Am
EMANA
mediano
aplanada
Blanco
irregular
seca
no
254
2M2BE35
Esparrago 3hrs.
Am
EMANA
mediano
aplanada
irregular
N.D.
seca
N.D.
F. Bacillus sp. (Grupo cereus) Cód. de Perfil
Cód. de Cepa
Procedencia
Grupo (Perfil)
Grupo Esporogénico
Tamaño
Forma
Color (PBC)
Borde
Textura
Viraje (PBC)
115
M3BE15
Suelo
GC
EMA
pequeño
aplanada
morado
N.D.
seca
N.D.
G. Bacillus endophyticus Cód. de Perfil
Cód. de Cepa
Procedencia
Grupo (Perfil)
Grupo Esporogénico
Tamaño
Forma
Color (PBC)
Borde
Textura
Viraje (PBC)
186
M2BE6
Suelo
E
EMA
pequeño
aplanada
Blanco
irregular
seca
no
H. Paenibacillus polymyxa Cód. de Perfil
Cód. de Cepa
Procedencia
Grupo (Perfil)
Grupo Esporogénico
Tamaño
Forma
Color (PBC)
Borde
Textura
Viraje (PBC)
196
M1BE1
Suelo
Pol
EMA
mediano
aplanada
blanco
irregular
seca
no
141
M1BE3
Suelo
Pol
EMA
mediano
aplanada
blanco
irregular
seca
no
183
M2BE3
Suelo
Pol
EMA
pequeño
aplanada
Morado
irregular
seca
no
86
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
4.3
VALIDACIÓN DE LA PRESENCIA DE MICROORGANISMOS IDENTIFICADOS EN LA CADENA PRODUCTIVA DE CONSERVAS DE ESPÁRRAGO BLANCO
4.3.1 Recuento de microorganismos esporulados El recuento de microorganismos esporogénicos y anaerobios sulfito reductores, realizado en toda la cadena productiva de conservas de espárrago, realizado en el presente proyecto, confirmó que el suelo, en especial, la muestra circundante a los turiones, presentó una mayor población de microorganismos formadores de esporas que la encontrada en los mismos espárragos. Las poblaciones de EMANA en espárrago, variaron desde 82 UFC/ g en la recepción de la planta, hasta 4 UFC/ g a 1 hora de espera de la conserva lista para el esterilizado. En el caso de los termófilos, la mayoría de muestras de espárrago en las diferentes operaciones de la planta industrial, no presentaron esporas de estos microorganismos, sin embargo, se observaron 4 UFC/ g de ETANA en los espárragos envasados con 1 hora de espera. En las etapas de espera previa a la esterilización, los anaerobios sulfito reductores no se presentaron de acuerdo al método utilizado (FDA, 2001) TABLA 20. Resultados de recuento de microorganismos esporulados RESULTADOS DE ANÁLISIS MICROBIOLOGICO (UFC / g)
MUESTRA
Suelo Módulo 8, Turno 1, Lote 228 Suelo circundante a los espárragos frescos recién cosechados Espárragos frescos en recepción de planta (lote 28) Espárragos frescos después de baño de burbujas Espárragos frescos después de hidrocooler Espárragos frescos sin pelar y cortados Espárragos frescos pelados y cortados Espárragos frescos pelados y cortados después de blanqueado Espárragos envasados (Frasco 315) con 1 hora de espera Espárragos envasados (Frasco 315) con 3 horas de espera Espárragos envasados (Frasco 315) con 4 horas de espera
EMA
EMANA
ETA
ETANA
Anaerobios Sulfito Reductores
12 x 103
36 x 102
39 x 10
52 x 10
90
27 x 102
47 x 10
38 x 102
30 x 102
66 x 10
47 x 102
82
45
39
20
57 x 10
8
6
3
10
21 x 10
6
1
<1
<10
22 x 10
18
1
<1
20
12 x 10
6
<1
<1
<10
8
3
<1
<1
<10
2
4
<1
4
<10
1
<1
1
<1
<10
<1
<1
<1
<1
<10
87
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
4.3.2 Aislamiento de cepas de Bacillus sp. Se aislaron 220 cepas de Bacillus sp., de las cuales 70 provinieron del suelo de cultivo y 150 cepas de los espárragos en sus diferentes etapas dentro de la cadena productiva (Tabla 21). De las cepas obtenidas, el mayor porcentaje perteneció al grupo esporogénico EMA (55.91%), seguidos de EMANA (32.73%), ETANA (5.91%) y ETA (5.45%). TABLA 21. Cantidad de cepas aisladas de Bacillus sp en suelo y en espárragos Grupo esporogénico EMA EMANA ETA ETANA Total %
Procedencia de la cepa SUELO
ESPÁRRAGOS
40 20 5 5 70 31.82
83 52 7 8 150 68.18
Total Cepas/Grupo Cantidad % 123 55.91 72 32.73 12 5.45 13 5.91 220 100 100
4.3.3 Caracterización morfológica de las cepas aisladas La caracterización morfológica de las colonias crecidas en TGE para cada una de las cepas aisladas se muestra a continuación (Tabla 22). TABLA 22. Caracterización morfológica de las cepas aisladas en el muestreo de validación Cód. de Cepa 3MBE1 3MBE2 3MBE3 3MBE4 3MBE5 3MBE6 3MBE7 3MBE8 3MBE9 3MBE10 3MBE11 3MBE12 3MBE13 3MBE14 3MBE15 3MBE16 3MBE17 3MBE18 3MBE19 3MBE20
Gpo. Esporogénico EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA
Tamaño
Borde
Forma
Textura
mediano grande pequeño pequeño mediano grande mediano mediano mediano grande grande pequeño mediano grande mediano pequeño pequeño mediano grande mediano
irregular irregular regular regular irregular irregular irregular irregular irregular irregular irregular irregular regular irregular regular irregular regular irregular irregular irregular
redonda arrocetada redonda redonda arrocetada convexa convexa aplanada redondeada convexa redonda redondeada redondeada redondeada redondeada difusa redonda redondeada estrellada redondeada
mucoso seca mucoso mucoso/seca seca acuosa/seca mucoso/seca mucoso/seca seca/mucoso acuosa/seca seca mucoso mucoso/seca seca seca seca/mucosa mucosa/seca seca seca/mucoso mucoso seca
88
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
Cód. de Cepa 3MBE21 3MBE22 3MBE23 3MBE24 3MBE25 3MBE26 3MBE27 3MBE28 3MBE29 3MBE30 3MBE33 3MBE34 3MBE35 3MBE36 3MBE37 3MBE38 3MBE39 3MBE40 3MBE42 3MBE43 3MBE44 3MBE45 3MBE46 3MBE47 3MBE48 3MBE49 3MBE50 3MBE51 3MBE52 3MBE53 3MBE55 3MBE56 3MBE57 3MBE58 3MBE60 3MBE61 3MBE63 3MBE64 3MBE65 3MBE66 3MBE67 3MBE68 3MBE69 3MBE70 3MBE71 3MBE72
Gpo. Esporogénico EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA
Tamaño
Borde
Forma
Textura
mediano mediano mediano mediano mediano mediano mediano mediano mediano pequeño grande mediano mediano pequeño pequeño grande mediano mediano mediano pequeño pequeño pequeño pequeño grande pequeño grande mediano pequeño pequeño mediano mediano mediano mediano pequeño mediano mediano mediano mediano mediano grande mediano mediano pequeño mediano grande grande
irregular irregular regular regular regular irregular irregular irregular irregular irregular irregular irregular regular irregular regular irregular irregular irregular irregular irregular regular irregular irregular irregular regular regular irregular irregular irregular irregular irregular irregular irregular regular regular irregular irregular irregular irregular irregular irregular regular regular irregular irregular irregular
redondeada redondeada redondeada redondeada convexa aplanada difusa redondeada redondeada aplanada aplanada aplanada redondeada redonda redonda aplanada redondeada redonda aplanada estrellada redonda estrellada estrellada redonda redonda redonda redondeada aplanada aplanada aplanada aplanada aplanada aplanada redondo redondo aplanada redondeada redondeada aplanada redondeada redondeada redonda redonda redondeada redondeada estrellada
seca seca mucosa/seca mucosa mucosa cremoso seca seca seca seca seco acuosa seco mucoso mucoso/seco seco mucoso mucoso seco mucosa/seca mucoso mucoso mucoso seca mucoso seca mucoso mucoso mucosa/seca cremoso mucoso seco mucoso mucoso mucoso seco seco seco acuoso mucoso seco/mucoso mucoso mucoso/seco seco seco translucida/seco
89
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
Cód. de Cepa 3MBE73 3MBE74 3MBE75 3MBE76 3MBE77 3MBE78 3MBE79 3MBE80 3MBE81 3MBE82 3MBE83 3MBE84 3MBE85 3MBE86 3MBE87 3MBE89 3MBE90 3MBE92 3MBE93 3MBE94 3MBE95 3MBE96 3MBE97 3MBE98 3MBE99 3MBE100 3MBE101 3MBE102 3MBE103 3MBE104 3MBE105 3MBE106 3MBE107 3MBE109 3MBE110 3MBE111 3MBE112 3MBE113 3MBE114 3MBE115 3MBE116 3MBE117 3MBE118 3MBE119 3MBE120 3MBE121
Gpo. Esporogénico EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA
Tamaño
Borde
Forma
Textura
mediano mediano mediano pequeño mediano grande mediano mediano pequeño pequeño mediano mediano mediano pequeño pequeño pequeño pequeño mediano pequeño mediano mediano pequeño pequeño mediano mediano pequeño pequeño pequeño mediano mediano mediano mediano mediano pequeño pequeño pequeño mediano mediano mediano mediano mediano pequeño pequeño pequeño mediano mediano
regular irregular irregular irregular irregular irregular irregular irregular irregular irregular regular regular regular regular irregular regular regular irregular regular irregular irregular irregular irregular regular regular regular irregular irregular irregular regular irregular irregular irregular irregular irregular irregular regular regular irregular regular regular regular regular irregular regular irregular
redonda redonda estrellada estrellada estrellada redonda redondeada redondeada estrellada redondeada redondeada redonda redonda redonda aplanada redonda redonda aplanada redonda convexa aplanada redondeada redondeada redonda redonda redonda redonda redondeada redonda redonda redondeada convexo redondeada redondeada redondo aplanada redonda redonda redondeada redonda redonda redonda redonda redondeada redonda aplanada
mucoso seco seco seca/mucosa seca/mucosa seco mucoso seco/mucoso seco/mucoso mucoso seca mucoso mucoso mucoso mucoso mucoso mucoso seco mucoso mucoso/seco seco mucoso mucoso mucoso mucoso mucoso mucoso mucoso/seco seco mucoso mucoso/seco mucoso/seco seco mucoso/seco mucoso mucoso seco mucoso/seco seco mucos/seco mucoso mucoso mucoso seco mucoso mucoso
90
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
Cód. de Cepa 3MBE122 3MBE123 3MBE124 3MBE125 3MBE126 3MBE127 3MBE128 3MBE130 3MBE131 3MBE133 3MBE134 3MBE137 3MBE138 3MBE141 3MBE142 3MBE143 3MBE144 3MBE145 3MBE146 3MBE147 3MBE148 3MBE150 3MBE151 3MBE152 3MBE153 3MBE154 3MBE155 3MBE156 3MBE157 3MBE158 3MBE159 3MBE160 3MBE161 3MBE163 3MBE164 3MBE165 3MBE166 3MBE167 3MBE168 3MBE169 3MBE170 3MBE171 3MBE173 3MBE174 3MBE175 3MBE176
Gpo. Esporogénico EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA ETANA ETANA ETANA ETANA ETANA ETANA ETANA ETANA ETANA ETANA ETANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA
Tamaño
Borde
Forma
Textura
grande grande mediano mediano mediano mediano mediano mediano mediano mediano mediano pequeño pequeño pequeño pequeño mediano pequeño pequeño pequeño pequeño mediano mediano pequeño pequeño mediano mediano pequeño grande mediano mediano mediano mediano pequeño pequeño mediano pequeño mediano pequeño pequeño mediano mediano pequeño mediano mediano mediano pequeño
irregular irregular irregular irregular irregular irregular irregular irregular irregular regular irregular irregular irregular irregular irregular irregular irregular irregular regular irregular regular irregular irregular irregular irregular irregular irregular irregular regular regular regular irregular irregular irregular irregular regular irregular irregular regular irregular irregular regular irregular regular irregular irregular
aplanada aplanada redondeada redondeada redondeada convexa redondeada aplanada redondeada redondeada redondeada aplanada aplanada aplanada aplanada aplanada aplanada aplanada aplanada aplanada redondeada aplanada convexa convexa aplanada aplanada convexa aplanada redonda redonda redonda redonda estrellada aplanada aplanada aplanada aplanada aplanada convexo aplanada aplanada aplanada aplanada redonda aplanada aplanada
mucoso mucoso seco/mucoso seco seco mucoso/seco mucoso mucoso mucoso mucoso/seco mucoso/seco mucoso/seco seco seco/mucoso seco/mucoso seco seco seco seco mucoso mucoso seco mucoso mucoso seco mucoso mucoso seco seco seco mucoso mucoso mucoso seco/mucoso cremoso mucoso mucoso mucoso/seco mucoso cremoso seco mucoso seco cremoso seco acuosa
91
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
Cód. de Cepa 3MBE177 3MBE178 3MBE180 3MBE182 3MBE183 3MBE184 3MBE187 3MBE188 3MBE189 3MBE190 3MBE191 3MBE192 3MBE193 3MBE194 3MBE195 3MBE196 3MBE197 3MBE198 3MBE199 3MBE202 3MBE203 3MBE204 3MBE205 3MBE206 3MBE207 3MBE208 3MBE209 3MBE210 3MBE211 3MBE212 3MBE216 3MBE217 3MBE218 3MBE219 3MBE220 3MBE221 3MBE222 3MBE223 3MBE224 3MBE225 3MBE226 3MBE227 3MBE228 3MBE229 3MBE230 3MBE231
Gpo. Esporogénico EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA
Tamaño
Borde
Forma
Textura
pequeño mediano mediano pequeño mediano pequeño mediano mediano pequeño mediano pequeño mediano mediano mediano pequeño mediano pequeño pequeño pequeño pequeño mediano mediano pequeño mediano pequeño mediano pequeño pequeño mediano pequeño mediano mediano mediano pequeño pequeño pequeño pequeño pequeño mediano mediano pequeño pequeño mediano mediano pequeño grande
regular irregular irregular regular regular regular irregular irregular irregular irregular regular regular regular regular regular irregular regular regular irregular irregular irregular irregular regular regular regular irregular regular irregular regular irregular irregular irregular irregular irregular irregular regular regular regular irregular irregular irregular irregular irregular irregular regular irregular
aplanada convexo aplanada convexo redonda redonda aplanada aplanada aplanada redonda redondeada redonda redonda redonda redonda aplanada convexa aplanada aplanada aplanada aplanada aplanada redonda redonda redonda aplanada redonda convexo convexo aplanada aplanada aplanada aplanada aplanada redonda redonda redonda redonda aplanada aplanada aplanada redonda convexa convexa redonda aplanada
mucoso mucoso seco mucoso cremoso mucoso cremoso mucoso acuosa seca acuosa mucoso mucoso seco mucoso seco mucoso mucoso mucoso translucida seco seco mucoso mucoso mucoso translucida mucoso mucoso mucoso mucoso cremoso mucoso/seco seco/mucoso mucoso mucoso mucoso mucoso mucoso seco/mucoso cremoso/seco seco mucoso mucoso mucoso mucoso seco
92
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
Cód. de Cepa 3MBE232 3MBE233 3MBE234 3MBE235 3MBE237 3MBE238 3MBE239 3MBE248 3MBE249 3MBE250 3MBE252 3MBE253 3MBE254 3MBE255 3MBE256 3MBE257
Gpo. Esporogénico ETANA ETANA ETA ETA ETA ETA ETA EMANA EMANA ETA ETA ETA ETA ETA ETA ETA
Tamaño
Borde
Forma
Textura
pequeño pequeño pequeño mediano mediano pequeño pequeño pequeño pequeño pequeño pequeño pequeño pequeño pequeño pequeño pequeño
regular irregular irregular regular irregular irregular irregular regular regular regular irregular irregular irregular irregular irregular irregular
aplanada aplanada convexo convexo aplanada aplanada aplanada aplanada redondo redondo convexo convexo convexo convexo convexo redondo
mucoso mucoso seco/mucoso mucoso seco acuosa mucoso mucoso mucoso mucoso mucoso mucoso seco/mucoso mucoso mucoso mucoso
4.3.4 Crecimiento de cepas de Bacillus sp. a 35.0ºC y 52.5ºC en medio aerobio y anaerobio En la Tabla 23 se resume la cantidad de cepas aisladas según su temperatura de crecimiento y presencia de oxígeno. Se aislaron 123 EMA, de los cuales, el 82.93 % (102 cepas) crecieron además en condiciones anaerobias, por lo que puede decirse que se trata de anaerobios facultativos; 37 cepas crecieron a 52.5ºC, en aerobiosis (termófilos facultativos) y 28 fueron termófilos anaerobios facultativos. Del grupo de los EMANA (72 cepas), 34 fueron termófilos tolerantes y 25 fueron además anaerobias facultativas a 52.5ºC. 13 cepas aisladas inicialmente de las placas de recuento del grupo de EMANA no crecieron a 35ºC en condiciones de anaerobiosis (3MBE155, 3MBE157, 3MBE158, 3MBE182, 3MBE184, 3MBE191, 3MBE195, 3MBE197, 3MBE198, 3MBE209, 3MBE216, 3MBE222, 3MBE224) De las 12 cepas aisladas de ETA, todas demostraron ser mesófilos aerobios facultativos, 10 fueron anaerobios facultativos a esta temperatura y 3 desarrollaron en condiciones de anaerobiosis a 52.5ºC. Durante las pruebas de caracterización, 3 de las cepas aisladas de placas de recuento de ETA (3MBE235, 3MBE237, 3MBE239) no crecieron a temperatura de termófilos.
93
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
TABLA 23. Cepas de Bacillus bajo dos diferentes temperaturas en condiciones aerobias y anaerobias Grupo esporogénico EMA EMANA ETA ETANA Total %
Crecim. 35ºC Aerob. Anaerob. 123 102 72 56 12 10 13 12 220 180 100 81.45
Crecim. 52.5ºC Viraje Aerob. Anaerob. TGE+PBC 37 28 1 34 25 3 9 3 0 8 5 1 88 61 5 40 27.73 2.27
En cuanto a las cepas de ETANA (13), se determinó que 4 de las cepas consideradas dentro de este grupo, después de repiques sucesivos y caracterización, no desarrollaron a 52.5ºC (3MBE142, 3MBE143, 3MBE144, 3MBE145, 3MBE232). 12 de las cepas fueron mesófilos anaerobios. Solo el 2.27% del total de cepas aisladas mostró viraje en el medio TGE con púrpura de bromocresol (Tabla 23) En la Tabla 24, mostrada a continuación se observa en detalle la caracterización del crecimiento de las cepas de Bacillus bajo las dos diferentes temperaturas consignadas, en condiciones aerobias y anaerobias.
TABLA 24. Crecimiento de cepas de Bacillus bajo dos diferentes temperaturas en condiciones aerobias y anaerobias Código 3MBE1 3MBE2 3MBE3 3MBE4 3MBE5 3MBE6 3MBE7 3MBE8 3MBE9 3MBE10 3MBE11 3MBE12 3MBE13 3MBE14 3MBE15 3MBE16 3MBE17 3MBE18
Nº Grupo Muestra Esporogénico 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA
Crecim. 35ºC Aerob. + + + + + + + + + + + + + + + + + +
Anaerob. + + + + + + + + + + + + + + + +
94
Crecim. 52.5ºC Aerob. + + + + + + -
Anaerob. + + + + + + + + + -
TGE+PBC Viraje crecimiento TGE+PBC
+ + + + + + + + + + + + + + + + + +
-
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
Código 3MBE19 3MBE20 3MBE21 3MBE22 3MBE23 3MBE24 3MBE25 3MBE26 3MBE27 3MBE28 3MBE29 3MBE30 3MBE33 3MBE34 3MBE35 3MBE36 3MBE37 3MBE38 3MBE39 3MBE40 3MBE42 3MBE43 3MBE44 3MBE45 3MBE46 3MBE47 3MBE48 3MBE49 3MBE50 3MBE51 3MBE52 3MBE53 3MBE55 3MBE56 3MBE57 3MBE58 3MBE60 3MBE61 3MBE63 3MBE64 3MBE65 3MBE66 3MBE67 3MBE68 3MBE69 3MBE70 3MBE71 3MBE72 3MBE73
Nº Grupo Muestra Esporogénico 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4
EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA
Crecim. 35ºC
Crecim. 52.5ºC
Aerob.
Anaerob.
Aerob.
Anaerob.
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
+ + + + + + + -
+ + + + + -
95
TGE+PBC Viraje crecimiento TGE+PBC
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
-
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
Código 3MBE74 3MBE75 3MBE76 3MBE77 3MBE78 3MBE79 3MBE80 3MBE81 3MBE82 3MBE83 3MBE84 3MBE85 3MBE86 3MBE87 3MBE89 3MBE90 3MBE92 3MBE93 3MBE94 3MBE95 3MBE96 3MBE97 3MBE98 3MBE99 3MBE100 3MBE101 3MBE102 3MBE103 3MBE104 3MBE105 3MBE106 3MBE107 3MBE109 3MBE110 3MBE111 3MBE112 3MBE113 3MBE114 3MBE115 3MBE116 3MBE117 3MBE118 3MBE119 3MBE120 3MBE121 3MBE122 3MBE123 3MBE124 3MBE125
Nº Grupo Muestra Esporogénico 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7
EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA
Crecim. 35ºC
Crecim. 52.5ºC
Aerob.
Anaerob.
Aerob.
Anaerob.
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + +
+ + + + + + + + + + + -
96
TGE+PBC Viraje crecimiento TGE+PBC
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
+ -
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
Código 3MBE126 3MBE127 3MBE128 3MBE130 3MBE131 3MBE133 3MBE134 3MBE137 3MBE138 3MBE141 3MBE142 3MBE143 3MBE144 3MBE145 3MBE146 3MBE147 3MBE148 3MBE150 3MBE151 3MBE152 3MBE153 3MBE154 3MBE155 3MBE156 3MBE157 3MBE158 3MBE159 3MBE160 3MBE161 3MBE163 3MBE164 3MBE165 3MBE166 3MBE167 3MBE168 3MBE169 3MBE170 3MBE171 3MBE173 3MBE174 3MBE175 3MBE176 3MBE177 3MBE178 3MBE180 3MBE182 3MBE183 3MBE184 3MBE187
Nº Grupo Muestra Esporogénico 8 8 8 8 9 10 10 1 1 2 2 2 3 3 3 3 4 4 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
EMA EMA EMA EMA EMA EMA EMA ETANA ETANA ETANA ETANA ETANA ETANA ETANA ETANA ETANA ETANA ETANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA
Crecim. 35ºC Aerob. Anaerob. + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
97
Crecim. 52.5ºC TGE+PBC Viraje Aerob. Anaerob. crecimiento TGE+PBC + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
Código 3MBE188 3MBE189 3MBE190 3MBE191 3MBE192 3MBE193 3MBE194 3MBE195 3MBE196 3MBE197 3MBE198 3MBE199 3MBE202 3MBE203 3MBE204 3MBE205 3MBE206 3MBE207 3MBE208 3MBE209 3MBE210 3MBE211 3MBE212 3MBE216 3MBE217 3MBE218 3MBE219 3MBE220 3MBE221 3MBE222 3MBE223 3MBE224 3MBE225 3MBE226 3MBE227 3MBE228 3MBE229 3MBE230 3MBE231 3MBE232 3MBE233 3MBE234 3MBE235 3MBE237 3MBE238 3MBE239 3MBE248 3MBE249 3MBE250
Nº Grupo Muestra Esporogénico 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 6 6 6 6 7 7 7 7 7 7 7 7 9 9 9 9 9 9 2 2 4 4 4 8 8 1
EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA EMANA ETANA ETANA ETA ETA ETA ETA ETA EMANA EMANA ETA
Crecim. 35ºC
Crecim. 52.5ºC
Aerob.
Anaerob.
Aerob.
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
98
TGE+PBC
Viraje
Anaerob. crecimiento TGE+PBC + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
+ + + -
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
Código 3MBE252 3MBE253 3MBE254 3MBE255 3MBE256 3MBE257
Nº Grupo Muestra Esporogénico 1 ETA 1 ETA 3 ETA 3 ETA 3 ETA 3 ETA
Crecim. 35ºC Aerob. Anaerob. + + + + + + + + + + +
Crecim. 52.5ºC TGE+PBC Viraje Aerob. Anaerob. crecimiento TGE+PBC + + + + + + + + + + + + + + -
4.3.5 Caracterización molecular de las cepas de Bacillus aisladas en el muestreo de validación A continuación se muestran los perfiles de 34 cepas del género Bacillus (Figura 34 y Tabla 25), todas ellas fueron aisladas a partir de muestras de espárragos blancos en las diferentes etapas del proceso industrial de elaboración de conservas (Agosto de 2008). Veintitres de los perfiles obtenidos fueron agrupados de acuerdo a su similitud con 5 especies identificadas previamente a través del secuenciamiento del gen ribosomal 16S. Se identificaron las especies de B. pumilus, B. megaterium, B subtilis (grupos S1, S3 y S5), Bacillus sp. (grupo cereus) y B licheniformis. Dentro de los perfiles de la especie de B. pumilus (Figura 29 A), l. a cepa 3MBE219 (carril 30) se pudo observar la ausencia de una banda definida hacia los 700 kb. Este grupo fue el más numeroso dentro de los Bacillus identificados en esta etapa de validación, con el 23.53 % del total de cepas evaluadas durante este periodo (Tabla 27). Los perfiles agrupados dentro de B. megaterium (correspondiente a 5 cepas), mostraron 2 patrones de bandas, el carril 22 y 25 presentan un mismo patrón, en tanto que el resto de ellos pertenecen a otro grupo, el cual presenta una banda intensa de 1000 kb aproximadamente. Dentro de los perfiles correspondientes a B. subtilis, se observaron 3 grupos (S1, S3 y S5), los grupos S1 y S5 presentaron 3 perfiles cada uno de ellos, en tanto que S3 presentó tan solo un perfil. El grupo correspondiente a Bacillus sp. (grupo cereus) presentó 2 cepas representantes. Sus perfiles BOX-PCR presentaron 3 bandas características alrededor de 1000 kb y 3 más alrededor de 1500 kb. La cepa 3MBE228 fue agrupada dentro de la especie B. licheniformis y su perfil presentó el mismo patrón que el de las cepas identificadas como dicha especie en muestreos anteriores. Se obtuvieron además tres grupos de perfiles BOX-PCR de 2 cepas cada uno y cinco perfiles únicos que no fueron identificados (Figura 34 B, Tabla 26) pues su patrón de bandas no coincidió con el de ninguna de las cepas aisladas e identificadas a través del secuenciamiento del gen ribosomal 16S provenientes de la investigación previa realizada en la misma empresa procesadora de espárragos blancos. La limitación del presupuesto no permitió enviar estas cepas a secuenciar, pero se espera poder realizarlo en el futuro a través del financiamiento de nuevos proyectos de investigación.
99
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
A. CEPAS IDENTIFICADAS B. pumilus
B. megaterium
B. subtilis (S1, S3 y S5)
Bacillus sp. (Gpo cereus)
B. licheniformis
B. CEPAS NO IDENTIFICADAS
FIGURA 34. Perfiles de amplificación BOX-PCR de las cepas aisladas en el muestreo de validación
100
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
TABLA 25. Agrupamiento de por perfil molecular de las cepas aisladas en el muestreo de validación Bacillus subtili s Código
Cepa
Procedencia
Grupo (Perfil)
Gpo. Esporogénico
Tamaño
Borde
Forma
Textura
3
3MBE131
Espárrago 1hr.
S1
EMA
mediano
irregular
redondeada
mucoso
11
3MBE120
Espárrago PC
S1
EMA
mediano
regular
redonda
mucoso
38
3MBE238
Espárrago B
S1
ETA
pequeño
irregular
aplanada
acuosa
18
3MBE105
Esparrago SPC
E
EMA
mediano
irregular
redondeada
mucoso/seco
13
3MBE122
Espárrago PC
S5
EMA
grande
irregular
aplanada
mucoso
14
3MBE124
Espárrago PC
S5
EMA
mediano
irregular
redondeada
seco/mucoso
19
3MBE111
Espárrago B
S5
EMA
pequeño
irregular
aplanada
mucoso
Bacillus pum ilus Código
Cepa
Procedencia
Grupo (Perfil)
Gpo. Esporogénico
Tamaño
Borde
Forma
Textura
10
3MBE119
Espárrago PC
P
EMA
pequeño
irregular
redondeada
seco
20
3MBE112
Espárrago B
P
EMA
mediano
regular
redonda
seco
28
3MBE217
Espárrago SPC
P
EMANA
mediano
irregular
aplanada
mucoso/seco
30
3MBE219
Espárrago SPC
P
EMANA
pequeño
irregular
aplanada
mucoso
32
3MBE213
Espárrago H
P
EMANA
34
3MBE203
Espárrago B
P
EMANA
mediano
irregular
aplanada
seco
35
3MBE204
Espárrago B
P
EMANA
mediano
irregular
aplanada
seco
43
3MBE176
Espárrago R
P
EMANA
pequeño
irregular
aplanada
acuosa
Bacillus li cheniform is Código
Cepa
Procedencia
Grupo (Perfil)
Gpo. Esporogénico
Tamaño
Borde
Forma
Textura
21
3MBE228
Espárrago 1hr.
L
EMANA
mediano
irregular
convexa
mucoso
Bacillus m egateri um Código
Cepa
Procedencia
Grupo (Perfil)
Gpo. Esporogénico
Tamaño
Borde
Forma
Textura
2
3MBE134
Espárrago 3hrs.
M
EMA
mediano
irregular
redondeada
mucoso/seco
17
3MBE104
Espárrago SPC
M
EMA
mediano
regular
redonda
mucoso
22
3MBE222
Espárrago PC
M
EMANA
pequeño
regular
redonda
mucoso
25
3MBE227
Espárrago PC
M
EMANA
pequeño
irregular
redonda
mucoso
36
3MBE205
Espárrago B
M
EMANA
pequeño
regular
redonda
mucoso
Bacillus sp. (Grupo cereus) Código
Cepa
Procedencia
Grupo (Perfil)
Gpo. Esporogénico
Tamaño
Borde
Forma
Textura
41
3MBE174
Espárrago R
GC
EMANA
mediano
regular
redonda
cremoso
101
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
42
3MBE175
Espárrago R
GC
EMANA
mediano
irregular
aplanada
seco
TABLA 26. Cepas con perfiles moleculares diferentes a los identificados mediante secuenciamiento Bacillus sp. (Cepas no identificadas) Codigo
Cepa
Procedencia
Grupo (Perfil)
Gpo. Esporogénico
1 5 7 40 8 37 24 33 27 29 39
3MBE133 3MBE126 3MBE128 3MBE173 3MBE129 3MBE150 3MBE226 3MBE202 3MBE216 3MBE218 3MBE239
Esparrago 3hrs. Esparrago BPC Esparrago BPC Esparrago R Esparrago BPC Esparrago B Esparrago PC Esparrago B Esparrago SPC Esparrago SPC Esparrago B
A B C C D D F F G H I
EMA EMA EMA EMANA EMA ETANA EMANA EMANA EMANA EMANA ETA
Tamaño
Borde
Forma
Textura
mediano mediano mediano mediano
regular irregular irregular irregular
redondeada redondeada redondeada aplanada
mucoso/seco seco mucoso seco
mediano pequeño pequeño mediano mediano pequeño
irregular irregular irregular irregular irregular irregular
aplanada aplanada aplanada aplanada aplanada aplanada
seco seco translucida cremoso seco/mucoso mucoso
TABLA 27. Cepas identificadas en el muestreo de validación Especies
Cantidad Porcentaje (%)
B. subtilis B. pumilus B. licheniformis B. megaterium Bacillus sp. (Grupo cereus) No identificados Total
7 8 1 5 2 11 34
20,59 23,53 2,94 14,71 5,88 32,35 100
4.3.6 Caracterización bioquímica con el kit de identificación API 50 CHB Se ensayaron 17 cepas de Bacillus provenientes de espárrago en sus diferentes etapas de procesamiento en la planta industrial, 8 de estas cepas fueron aisladas en el año 2007 y conservadas en gliecerol a -80ºC; las 11 cepas restantes fueron obtenidas durante el muestreo realizado en el presente proyecto (Agosto de 2008) en la misma planta de proceso (Green Peru S.A., Trujillo) En la Tabla 28, se muestran los resultados obtenidos para la identificación bioquímica a través de API 50 CHB, en comparación con la identificación molecular, donde se aprecia la correspondencia de ambas técnicas de identificación. Once de las cepas analizadas fueron identificadas con una seguridad mayor al 99%, 2 cepas presentaron buena identificación aunque con con una seguridad alrededor del 97%, en tanto que 4 cepas mostraron perfiles 102
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
dudosos, sin embargo entre las alternativas de identificación se encontró la misma especie identificada por la técnica molecular. Según Durak et al. (2006), el API 50 CHB puede incurrir en algunos errores de identificación, para el caso de cepas de Paenibacillus spp., identificadas por este método como B. circulans. Finalmente, en la Figura 35 se compara la ocurrencia de las especies identificadas en las diferentes etapas de la cadena productiva de espárragos, correspondientes a los años 2007 (A) y 2008 (B). Se aprecia que B. subtilis estuvo presente en todas las etapas del proceso (Figura 35 A), en tanto que para el muestreo de validación, si bien no está presente en todas las etapas, se mantiene hasta el final de la cadena productiva (Figura 35 B). Cabe señalar que durante el año 2007 se presentó una lata hinchada a la que se le hizo un control de esterilidad, donde se aisló una cepa identificada mediante el secuenciamiento como B. subtilis. Se aprecia también que durante el año 2008, la especie presente en todas las etapas de producción fue B. pumilus. Algunas otras especies de menor ocurrencia fueron identificadas en las etapas previas al envasado, como el caso de B. megaterium y Bacillus sp. (Grupo cereus). Se observó que en la etapa de espera de los envases listos para la esterilización se identificaron las especies del grupo subtilis B. subtilis, B licheniformis, B. pumilus y B. subtilis / amyloliquefaciens.
103
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
TABLA 28. Resultados de la identificación bioquímica a través del kit API 50 CHB
CEPA
GRUPO ESPOROGÉNICO
PROCEDENCIA DE LA CEPA IDENTIFICADA
Espárragos envasados (Frasco 315) con 3 horas de espera Espárragos frescos después de hidrocooler Espárragos envasados (Frasco 315) con 3 horas de espera Espárragos frescos después de baño de burbujas Espárragos envasados (Frasco 315) con 3 horas de espera
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR
2M1BE6
EMA
2M2BE4
EMANA
2M2BE5
EMANA
2M2BE6
EMANA
2M2BE29
EMANA
2M2BE41
EMANA
Espárragos envasados (Frasco B. subtilis (S1) 315) con 1 hora de espera
3MBE104
EMA
3MBE122
EMA
3MBE131
EMA
3MBE134
EMA
3MBE174
EMANA
3MBE176
EMANA
IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA (API 50 CHB) TAXÓN SIGNIFICATIVO
% ID
CALIFICATIVO
B. licheniformis
B. licheniformis
99.9
Buena identificación
B. subtilis (S1)
B. subtilis / amyloliquefaciens
99.5
Muy buena identificación
B. pumilus
B. pumilus
99.9
Excelente identificación
B. pumilus
B. pumilus
99.9
Excelente identificación
B. licheniformis B. subtilis / amyloliquefaciens B. subtilis / amyloliquefaciens B. licheniformis B. megaterium
53.2 34.6 89.5 9.3 1.1
Muy buena identificación en el género
Espárragos frescos sin pelar y B. megaterium cortados
B. megaterium
99.9
Excelente identificación
Espárragos frescos pelados y B. subtilis (S2) cortados
B. subtilis / amyloliquefaciens B. licheniformis B. megaterium
88.1 6.4 4.8
Perfil dudoso
B. subtilis / amyloliquefaciens
97.3
Buena identificación
B. megaterium
99.9
Muy buena identificación
Espárragos frescos en N.D. recepción de planta (Lote 28)
B. anthracis B. mycoides B. cereus 1
79.6 15.3 3.5
Buena identificación en el género
Espárragos frescos en B. pumilus recepción de planta (Lote 28)
B. pumilus
99.9
Excelente identificación
B. subtilis (S5)
Espárragos envasados (Frasco B. subtilis (S1) 315) con 1 hora de espera Espárragos envasados (Frasco B. megaterium 315) con 3 horas de espera
104
Excelente identificación en el género
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
PROCEDENCIA DE LA CEPA IDENTIFICADA
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR
IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA (API 50 CHB)
CEPA
GRUPO ESPOROGÉNICO
3MBE204
EMANA
Espárragos frescos después B. pumilus de baño de burbujas
B. pumilus
99.9
Excelente identificación
3MBE213
EMANA
Espárragos frescos después B. pumilus de hidrocooler
B. pumilus
99.9
Muy buena identificación
3MBE217
EMANA
B. pumilus
99.9
Excelente identificación
3MBE222
EMANA
B. megaterium
97.9
Buena identificación
3MBE228
EMANA
B. licheniformis
99.8
Muy buena identificación
Espárragos frescos sin pelar y B. pumilus cortados Espárragos frescos pelados y B. megaterium cortados Espárragos envasados (Frasco N.D. 315) con 1 hora de espera
105
TAXÓN SIGNIFICATIVO
% ID
CALIFICATIVO
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5
A
4
S
3
Am 2 P L
1
0 Rec epc i on
Burbuj eo Hi droc ool er 1 hora de 3 hora s de Control de es pera es pera Es teri l i da d
Es pa rra gos Fres c os
Es pa rra gos Enva s a dos
B
5
4
3
S M P
2
L GC
1
0 Recepcion
Burbujeo Hidrocooler
Pelado cortado
Esparragos Frescos
Sin pelar cortado
1 hora de espera
3 horas de espera
Esparragos Envasados
FIGURA 35. Frecuencia de aparición de especies de Bacillus en la cadena productiva de conservas de espárrago blanco. a partir de cepas aisladas (A) en el 2007, (B) en el 2008. S: B. subtilis, Am: B. subtilis / amyloliquefaciens, P: B. pumilus, L: B. licheniformis,M: B. megaterium, GC: Bacillus sp. (Gpo. cereus)
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Cabe resaltar que de las 150 cepas aisladas de espárragos en el muestreo de validación del presente proyecto, solo se identificaron 23, las que fueron seleccionadas de las diferentes etapas de la cadena productiva, pero la limitación del tiempo y del presupuesto no permitió la identificación total de las cepas aisladas; sin embargo, esto se considerará para un futuro cercano.
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V.
CONCLUSIONES
1. Los tiempos de generación estimados para cada uno de los microorganismos ensayados fueron: B. pumilus, 0.531 horas; B. licheniformis, 0.585 horas y B. subtilis/amyloliquefaciens, 0.442 horas. 2. La técnica espectrofotométrica sirvió para determinar la fase exponencial de las curvas de crecimiento de cepas del género Bacillus desarrolladas en medio líquido. 3. El tiempo en el cual los cultivos en medio líquido (28 ºC) alcanzaron la mayor densidad óptica fue: B. pumilus, 33 horas; B. licheniformis, 49 horas y B. subtilis/amyloliquefaciens, 33 horas. 4. Se determinó que la cantidad óptima extraída de DNA para las pruebas de amplificación BOX-PCR fue de 1 a 8 µL. 5. Se aislaron 220 cepas del género Bacillus a partir de muestras de espárrago blanco del proceso productivo de conservas, en el muestreo de validación (2008) 6. Se obtuvieron 169 perfiles, producto de la amplificación BOX-PCR en cepas de Bacillus sp. aislados de la cadena productiva de conservas de espárrago blanco del año 2007 y 34 perfiles del muestreo de validación (2008). 7. De acuerdo a la caracterización molecular BOX-PCR, de los primeros 169 perfiles, se encontraron 16 grupos de cepas dentro de los cuales se identificaron 7 especies de Bacillus y 1 de Paenibacillus, donde el 52.07 % correspondió a la especie B. subtilis, seguido de B. pumilus (18.93 %) y B. licheniformis (15.98 %), B. megaterium (5.33 %), B. subtilis / amyloliquefaciens (4.73 %). Así también, se encontró que Bacillus sp. (Grupo cereus) y B. endophyticus fueron los de menor ocurrencia, con 0.59 % cada uno. Se identificó también Paenibacillus polymyxa (1.78 %) en muestras provenientes del suelo. 8. Las cepas de B. pumilus, B. licheniformis y B. subtilis/amyloliquefaciens, identificadas en un trabajo previo a través de pruebas bioquímicas, fueron confirmadas por técnicas moleculares. 9. De los 34 perfiles de amplificación BOX-PCR caracterizados a partir de cepas aisladas de las etapas del procesamiento industrial de espárragos blancos en conserva durante el muestreo de validación (2008), el 23.53 % correspondió a B. pumilus, el 20.59 % a B. subtilis, 14.71 % B. megaterium, el 5.88 % a Bacillus sp (Grupo cereus) y el 2.94 % a B. licheniformis. Así también se encontraron 8 grupos de perfiles BOX-PCR, que no correspondieron a las especies identificadas a través de métodos moleculares. 10. De 17 cepas caracterizadas por métodos bioquímicos (API 50 CHB), el 64.71 % coincidieron (al 99,9% de seguridad) con la identificación molecular.
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11. En la etapa de tiempos de espera de los espárragos envasados listos para la esterilización, se identificaron B. subtilis, B licheniformis, B. pumilus y B. subtilis / amyloliquefaciens 12. Mediante pruebas de control de esterilidad, se comprobó que la especie B. subtilis, sobrevivió a tratamientos de esterilización de conservas de espárrago blanco realizados en envases de vidrio y metálicos, siendo causante del deterioro del producto.
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VI.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. American Public Health Association (APHA). 1992. Compendium of methods for the microbiological examination of food. 3rd edition. U.S.A. 2. Anderson A., Rönner U & Granum P. 1995. What problems does the food industry have with the spore-forming pathogens Bacillus cereus and Clostridium perfringens?. International Journal of Food Microbiology. 28: 145-155. 3. Ash C., Priest F., Wallbanks S. & Collins M. 1993. Molecular identification of rRNA group 3 bacilli (Ash, Wallbanks and Collins) using a PCR probe test. Antonie van Leeuwenhoek. 64: 253-260. 4. Ávila E, Valente T, De Mello W & Da Silva H. 2008. Técnicas moleculares aplicadas à microbiologia de alimentos. Acta Sci. Technol. 30: 109-118. 5. Boer E. & Beumer R. 1999. Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms. International Journal of Food Microbiology 50:119-130. 6. Brumfitt W, Wardlaw A & Park J. 1958. Development of lysozyme-resistance in Micrococcus lysodiekticus and its association with increased O-acetyl content of the cell wall. Nature (London) 181:1783-1784. 7. Bush, U. & Nitschko, H. 1999. Methods for the differentiation of microorganisms Journal Chromatography 722:263-278. 8. Chassy B. & Guiffrida A. 1980. Method for the lysis of Gram-Positive, Asporogenous Bacteria with Lysozyme. Applied and Environmental Microbiology 39:153-158. 9. Clarke A. 1992. Molecular biology made easy: the polymerase chain reaction. Hitochem. J. 24:913-916. 10. Destro M. 1995. Listeria monocytogenes em camarão (Penaeus brasiliensis): marcadores sorológicos e genéticos no monitoramento de sua disseminação em uma unidade processadora de pescado. Tese (Doutorado em Ciência de Alimentos) Universidad de São Paulo. 11. Durak M, Fromm H, Huck J, Zadoks R & Boor K. 2006. Development of molecular typing methods for Bacillus spp. and Paenibacillus spp. Isolated from fluid milk products. Journal of food science. 71: 50-56. 12. Farber J, Gendel S, Tyler K, Boerlin P, Landry W, Fritschel S. & Barrett T. 2001. Molecular typing and differentiation. In: Farber J. et al. Compendium of methods for the microbiological examination of foods. Washington, D.C.: APHA, 2001. Cap. 11:127-158. 13. Food and Drug Administration (FDA – BAM). 2001. Bacteriological Analytical Manual Online. 8th edition. AOAC. U.S.A. 14. Fortina M., Pukall R., Schumann P., Mora D., Parini C., Manachini P. & Stackebrandt, E. 2001. Ureibacillus gen. nov., a new genus to accommodate Bacillus thermosphaericus (Andersson et al. 1995), emendation of Ureibacillus thermosphaericus and description of Ureibacillus terrenus sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol 51: 447–455.
110
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
15. Gillings M. & Holley M. 1997. Repetitive element PCR fingerprinting (rep-PCR) using enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC) primers is not necessarily directed at ERIC elements. Letters in Applied Microbiology 25:17-21. 16. Granum P. & Baird-Parker T. 2000. Bacillus spp. In: The microbiological safety and quality of food (eds. B. Lund, T.C. Baird-Parker and G.W. Gould). pp. 1029-1039. Aspen Publisher. Gaitherburg, M.D. 17. Granum P. & Rönner U. 1998. The adhesion of Bacillus cereus spores spores to epithelial cells might be an additional virulence mechanism. International Journal of Food Microbiology. 39: 93-99. 18. Heyndrickx M., Lebbe L., Kersters K., De Vos P., Forsyth G. & Logan NA. 1998. Virgibacillus: a new genus to accommodate Bacillus pantothenticus (Prom. and Knight, 1950). Emended description of Virgibacillus pantothenticus. Int. J. Syst. Bacteriol. 48: 99-106. 19. Heyndrickx M. & Scheldeman P. 2002. Chapter 6. Bacilli associated with spoilage in Dairy products and other food. In: Applications and systematics of Bacillus and relatives (eds. R. Berkeley, M. Heyndrickx, N. Logan and P. De Vos). Pp. 64-79. Blackwell Science Ltd., UK. 20. Higgins D., Thompson J., Gibson T. Thompson J., Higgins D., Gibson T. & Clustal W: 1994. Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680. 21. Holden J. & Vanbalgooy J. 1965. Effect of nutritional and physiological factors on the reaction between Lactobacillus plantarum and muramidase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 19:401-406. 22. Jensen M., Jackson R., Noszek J., Philip A. & Tice, G. 1994. The application of a PCR-based assay for the detection of Salmonella. In: General Meeting of the American Society for Microbiology. 94., 1994, Las Vegas. Abstracts. Las Vegas: ASM, p. 369. abstr. p-2. 23. Jenson I & Moir C. 2003. Bacillus cereus and other Bacillus species. In: Foodborne microorganisms of public health significance (eds. A.D. Hocking). pp. 445-478. Southwood Press. Australia. 24. Jukes T. & Cantor C. 1969. Mammalian protein metabolism, Chapter Evolution of protein molecules. pp 21-132. Academic Press. New York 25. Kamat A., Nerkkar D. & Nair P. 1989. Bacillus cereus in some Indian Foods, incidence and antibiotic, heat and radiation resistance. Journal of Food Safety. 10: 3141. 26. Kenneth T. 2008. Gram-positive, Aerobic or Facultative Endospore-forming Bacteria (formerly, "The Genus Bacillus"). En: Todar´s Online Textbook of Bacteriology. http://www.textbookofbacteriology.net/Bacillus.html. Febrero de 2009. 27. Konemann E., Allen S., Janda W., Hreckenberger P. & Winn J. 2001. Diagnóstico microbiológico. Sao Paulo: Medsi. 28. Larsen H. & Jørgensen K. 1999. Growth of Bacillus cereus in pasteurizad milk products. International Journal of Food Microbiology. 46; 173-176.
111
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
29. Lopez A & Alippi A. 2007. Phenotypic and genotypic diversity of Bacillus cereus isolates recovered from honey. Int J Food Microbiol, 117: 175-84. 30. Louws F, Schneider M, & De Bruijn F. 1996. Assessing genetic diversity of microbes using repetitive sequence-based PCR (rep-PCR). In: Nucleic acid amplification methods for the analysis of environmental microbes. G. Toronzos, ed. Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA. p. 5-30. 31. Lund B. 1990. Food borne disease due to Bacillus and Clostridium species. Lancet 336: 982-986. 32. Marlony B., Tassios P., Rådström P., Cook N., Wagner M. & Hoorfar J. 2003. Standarization of diagnostic PCR for detection of foodborne pathogens. International Journal of Food Microbiology 83:39-48. 33. Mullis K. & Faloona F. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via polyremerasecatalyzed chain reaction. Method. Enzymol. 155:335-350. 34. Nakajima H., Itoh K, Arakawa E, Inoue M, Mori T & Watanabe H. 1994. Degradation of polymerase chain reaction (PCR) product by heat-stable desoxyribonuclease (Dnase) produced from Yersinia enterocolitica. Microbiol. Imunol. Tokyo. 38: 153156. 35. Nazina T., Tourova T., Poltaraus A., Novikova E., Grigoryan A., Ivanova A., Lysenko A., Petrunyaka V., Osipov G., Belyaev S. & Ivanov M. 2001. Taxonomic study of aerobic thermophilic bacilli: descriptions of Geobacillus subterraneus gen. nov., sp. and Geobacillus uzenensis sp. nov. from petroleum reservoirs and transfer of Bacillus stearothermophilus , Bacillus thermocatenulatus, Bacillus thermoleovorans, Bacillus kaustophilus, Bacillus thermoglucosidasius and Bacillus thermodenitrificans to Geobacillus as the new combinations G. stearothermophilus, G. thermocatenulatus, G. thermolerovorans, G. kaustophilus, G. thermoglucosidasius and G. thermodenitrificans. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51: 433-446. 36. Niimura Y., Koh E., Yanagida F., Suzuki K., Komagata K. & Kozaki M. 1990. Amphibacillus xylanus gen. nov., sp. nov., a facultatively anaerobic spore-forming xylan-digesting bacterium which lacks cytochrome, quinone, and catalase. Int J Syst Bacteriol 40: 297–301 37. Peng J., Tasi W. & Chou C. 2001. Surface characteristics of Bacillus cereus and its adhesion to stainless steel. International Journal of Food Microbiology. 65: 105-111. 38. Rademaker J & De Brujin F.1997. Characterization and classification of microbes by rep_PCR genomic fingerprinting and computer assisted pattern analysis In: CaetanoAnollés G, and Gresshoff PM. DNA Markers. New York: Wiley-VCH; p:1-26. 39. Reva O, Sorokulova I & Smirnov V. 2001. Simplified technique for identification of the aerobic spore-forming bacteria by phenotype. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 51: 1361-1371. 40. Rossen L, Holmstrom K, Olsen J & Rasmussen O. 1991. A rapid polymerase chain reaction (PCR)-based assay for the identification of Listeria monocytogenes in food samples. Int J Food Microbiol. 2:145-51. 41. Saitou N & Nei M 1987 The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-425.
112
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
42. Salkinoja-Salonen M., Vuorio R., Andersson M., Kämpfer P., Andersson M., Honkanen-Buzalski T.& Scoging A. 1999. Toxigenic strains of Bacillus licheniformis related to food poisoning. Applied and Environmental Microbiology. 65: 4637-4645. 43. Scheldeman P., Goossens K., Rodriguez-Diaz M., Pil A., Goris J., Herman L., De Vos P., Logan NA. & Heyndrickx M. 2004. Paenibacillus lactis sp. nov., isoled from raw and heat-treated milk. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: 885-891. 44. Schlesner H., Lawson P., Collins, M., Weiss, N., Wehmeyer, U., Vo¨lker H. & Thomm, M. 2001. Filobacillus milensis gen. nov., sp. nov., a new halophilic sporeforming bacterium with Orn-D-Glu-type peptidoglycan. Int J Syst Evol Microbiol 51: 425–431. 45. Schloter M, Lebuhn M, Heulin T & Hartmann A. 2000. Ecology and evolution of bacterial microdiversity. FEMS Microbiology Reviews 24:647-660. 46. Shida O., Takagi H., Kadowaki K. & Komagata K. 1996. Proposal for two new genera, Brevibacillus and Aneurinibacillus gen. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 46: 939946. 47. Shinagawa K. 1990. Analytical methods for Bacillus cereus and another Bacillus species. International Journal of Food Microbiology. 10: 125-142. 48. Spring S., Ludwig W., Marquez M., Ventosa, A. & Schleifer, K. 1996. Halobacillus gen. nov., with descriptions of Halobacilluslitoralis sp. nov. and Halobacillus trueperi sp. nov., and transfer of Sporosarcina halophila to Halobacillus halophilus comb. nov. Int. J. Syst. Bacteriol 46: 492–496. 49. Stackebrandt, E & Goebel, B. 1994. Taxonomic note: a place for theDNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int. J. Syst Bacteriol. 44: 4: 846-849. 50. Stumbo C. 1973. Thermobacteriology in food Processing. 2nd edition. New York. Academic Press. 51. Tatzel R., Ludwig W., Schleifer K & Wallnöfer P. 1994. Identification of Bacillus strains isolated from milk cream with classical and nucleic acid hybridization methods. Journal of Dairy Reaserch. 61: 535-539. 52. US EPA. 1997. Bacillus subtilis Final risk assessment. biotechnology program under toxic substances control act (TSCA). Revisado en: http://www.epa.gov/biotech_rule/pubs/fra/fra009.htm. Febrero de 2009. 53. Velezmoro C, Ramos E, Benites E, Teixeira A, Gomero A & Zuñiga D. 2007. Informe técnico final “Evaluación de microorganismos de importancia para el tratamiento térmico en la cadena productiva de conservas de espárrago blanco” Proyecto de investigación en Ciencia y Tecnología Concytec-PROCOM. 54. Versalovic J, Koeuth T & Lupski J. 1991. Distribution of repetitive DNA sequence in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids Research 19: 6823-6831. 55. Wainø, M., Tindall, B., Schumann, P. & Ingvorsen, K. 1999. Gracilibacillus gen. nov., with description of Gracilibacillus halotolerans gen. nov., sp. nov.; transfer of Bacillus dipsosauri to Gracilibacillus dipsosauri comb. nov., and Bacillus salexigens to the genus Salibacillus gen. nov., as Salibacillus salexigens comb. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 49: 821–831.
113
“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”
56. Wayne L, Brenner D, Colwell R, Grimont P, Kandler O, Krichevsky M, Moore L, Moore W, Murray R, Stackebrant E, Starr M & Trüper H. 1987. Report of the ad hoc committee on reconciliation of approaches to bacterial systematics. Int. J. Syst. Bacteriol. 37, 463-464. 57. Weisburg W., Barns S., Pelletier D. & Lane D. 1991. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study, J. Bacteriol. 173: 697–703. 58. Whitaker J, Cristol D & Forsyth M. 2005. Prevalence and genetic diversity of Bacillus licheniformis in avian plumage. Journal Field 76:264-270. 59. Wisotzkey J., Jurtshuk, P., Fox G., Deinhard G. & Poralla K. 1992. Comparative sequence analyses on the 16S rRNA (rDNA) of Bacillus acidocaldarius, Bacillus acidoterrestris, and Bacillus cycloheptanicus and proposal for creation of a new genus, Alicyclobacillus gen. nov. Int J Syst Bacteriol 42: 263–269 60. Woese C. 1987. Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51, 221-271.
114