O CÂNCER PELA RAIZ A TERAPIA GÊNICA
SUMÁRIO
3O CÂNCER
PELA RAIZ: A TERAPIA GÊNICA
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A DRA. EUGENIA E O CÂNCER
14 PARA SABER MAIS
3PEQUENO
4 COMO O
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HISTÓRICO
CÂNCER PODE OCORRER
SUPRESSORES COMO DE TUMOR E FUNCIONA ONCOGENE A TERAPIA GÊNICA
O CÂNCER PELA RAIZ: A TERAPIA GÊNICA No Instituto de Ciências Biomédicas da USP, a Profa. Dra. Eugenia Costanzi-Strauss tem dedicado vários anos de trabalho juntamente com a sua equipe, na linha de pesquisa da terapia gênica, em especial, a do câncer. Segundo ela, “o objetivo da terapia é tratar a doença pela raiz, podendo ser aplicada para várias moléstias”, ou seja, “usar a tecnologia de transferir genes sadios ou ligeiramente modificados para as células somáticas de um paciente com o objetivo de alterar o curso de uma doença”.
PEQUENO HISTÓRICO Em 1953, a revista Nature anunciou a decifração da estrutura do ácido nucléico desoxirribose (DNA) pelos cientistas James Dewey Watson e Francis Harry Compton Crick. Os autores foram distinguidos com o prêmio Nobel de Medicina, em 1962, junto, com Maurice H. F. Wilkins. Tal sucesso desencadeou uma série de pesquisas que visavam entender como aquela estrutura química e os seus ácidos nucléicos relacionavam-se com as enfermidades que assolavam a sociedade. (Veja figura 1) JAMES DEWEY WATSON (1928-) (FIGURA 1)
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Na década de 1970, em tempos de Guerra Fria, as ameaças nucleares e biológicas impulsionaram o desenvolvimento da Engenharia Genética e do meio técnico-científicoinformacional, neste cenário surgiram as primeiras ideias sobre Terapia Gênica. Mas, se passaram cerca de 20 anos de estudos para que os pesquisadores, na década de 1990, conseguissem a aprovação do primeiro protocolo clínico de terapia gênica humana nos Estados Unidos. A responsabilidade do protocolo estava nas mãos de M. Blaese e W. F. Anderson no National Institute of Health (NIH, Bethesda, EUA). Naquele ano uma menina de quatro anos com deficiência na enzima adenosina deaminase (ADA), popularmente conhecida como a menina da bolha, recebeu a primeira infusão de células transduzidas ex vivo com retrovírus recombinante portador do codificador da proteína ADA humana. Em janeiro de 1991, um segundo paciente, um menino de nove anos, também iniciou o mesmo protocolo gênico. Ambos receberam, no período de dois anos, cerca de 11 a 12 infusões. Após dez anos da última infusão, em abril de 2003, foi publicada sob coordenação de M. Blaese, uma coletânea de dados daqueles dois pacientes pioneiros. Tratou-se do mais longo acompanhamento clínico de um protocolo de terapia gênica já realizado (doze anos). Verificou-se pelo protocolo que houve 50% de êxito na cura da doença, porém, a terapia não conseguiu evitar o óbito do menino. A terapia gênica pode ser aplicada para inúmeras doenças desde hemofilia, hipertensão, diabetes, asma, artrite reumatóide, neuropatologias degenerativas ao ADA. Podendo ser usada até para ajudar na resistência muscular de atletas em competições esportivas de alta performance.
COMO O CÂNCER PODE OCORRER O câncer é uma doença bastante estudada mundialmente pelos cientistas. Ele é uma enfermidade democrática, porque pode alcançar pessoas de todos os níveis sociais. Desde artistas famosos, jogadores de futebol milionários, empresários bem sucedidos até crianças pobres da periferia. Esta doença aterroriza tanto os indivíduos portadores dela, quanto uma pessoa que escuta e compreende o quão incerta é a sua aparição. 4
No Brasil, segundo levantamentos do Instituto Nacional de Câncer (INCA), estimam-se 17.210 novos casos de câncer de pulmão em homens e 10.110 em mulheres para o ano de 2012. Esses valores correspondem a um risco estimado de 18 casos novos a cada 100 mil homens e 10 a cada 100 mil mulheres. Estima-se também cerca de 52.680 casos novos de câncer de mama com um risco de 52 casos a cada 100 mil mulheres; e de 60.180 casos novos de câncer de próstata, correspondendo a 62 casos novos a cada 100 mil homens para o ano de 2012. O câncer pode ser explicado da seguinte forma: a célula, assim como toda a vida na Terra, cumpre um ciclo vital de nascer, crescer, desempenhar uma função e morrer. Nossas células, durante sua vida funcional, têm papéis importantes como diferenciar-se de outras formando tecidos específicos. Por exemplo, o intestino, que proporciona uma absorção de água e nutrientes; as células do coração, que irrigam o sangue para todo o corpo. Sendo assim, elas têm uma função fundamental de se multiplicar para manter as células em quantidade ótima para o funcionamento dos órgãos e sistemas. E é neste momento da multiplicação das células que o câncer se apresenta, impedindo que a célula morra, mesmo já tendo cumprido seu ciclo vital. Em poucas palavras, podemos dizer que o câncer é pertencente a um grupo de doenças que surgem na perda do controle da divisão celular. Ele proporciona uma multiplicação maior do que uma célula saudável conseguiria em situações normais. É o resultado de múltiplas mutações, ou seja, não é uma doença monogênica. Há uma grande diversidade de causadores destas mutações que favorecem o surgimento do câncer. Estes podem ser fatores externos, tais como a irradiação, as substâncias químicas, tabagismo e os vírus. Mas também fatores internos, tais como predisposição genética, hormônios ou condições imunológicas. O que torna esta doença ainda mais assustadora é o fato da possibilidade de ser induzida por um ou mais destes fatores citados. Existe uma variedade de denominações para os cânceres. Há inúmeros tipos e localidades podendo ser benigno ou maligno. Por exemplo, a neoplasia (crescimento novo) do músculo liso (involuntário) benigna é chamada de leiomioma, porém a neoplasia maligna é chamada de leiomiossarcoma, assim como a neoplasia benigna das 5
vias respiratórias é chamada de adenoma brônquico, entretanto, a neoplasia maligna é chamada de carcinoma broncogênico ou brônquico. Portanto, o tumor (neoplasia) é benigno quando não tem a potencialidade de “infectar” e invadir outros tecidos (conjunto de células que mantém uma função), por meio de uma mudança de um lugar para outro, gerando assim, outro foco tumoral cancerígeno. Já o tumor maligno, consegue invadir outro lugar e torná-lo também canceroso.
A DRA. EUGENIA E O CÂNCER A professora Eugenia interessou-se pelo estudo gênico do câncer durante a sua pós-graduação, no final da década de 1980. Sua tese de doutorado foi dedicada ao estudo de crianças que sofriam de um tumor maligno ocular chamado de retinoblastoma, também conhecido como “brilho de gato”. Para evitar o óbito dessas crianças, elas eram submetidas a uma rápida, porém onerosa cirurgia de extração ocular. Com isso, a Dra Eugenia, engajada com o compromisso social, queria intervir e, de alguma maneira, contribuir para a qualidade de vida dos pacientes que sofriam dessa enfermidade. Após voltar de Boston, no término do seu doutorado, Costanzi-Strauss iniciou seus trabalhos no Instituto de Química da USP. Naquele momento, o gene da suscetibilidade do retinoblastoma (RB) foi clonado, gerando uma série de especulações sobre a possibilidade dele ser o primeiro anti-oncogenese; pois, seguindo o raciocínio lógico, se uma proteína é capaz de iniciar um fator de proliferação de células, então, também deveria existir uma proteína com capacidade de impedir sua excessiva multiplicação. No caso do modelo RB diz a Dra. Eugênia: “o gene perdido causava o tumor maligno, logo, se colocássemos o gene normal, poderíamos suprimir o tumor. Daí surgiram as primeiras discussões sobre os genes supressores de tumor para a terapia gênica, visto que os resultados nas tentativas de inibir a formação dos tumores (oncogênese) específicos eram insatisfatórios, por isso eu busquei estudar essa estratégia genômica para o tratamento de tumores de forma universal, cuja finalidade é remediar o defeito, ou seja fazer a terapia na sua essência”. 6
SUPRESSORES DE TUMOR E ONCOGENE A célula que se apresenta como câncer, teve uma mudança na sua estrutura fundamental, que é o DNA (composto por milhares de genes). Com o DNA modificado (mutante), a célula ganha outras capacidades que por vezes são nocivas ao resto do sistema, como nos casos de câncer. O DNA carrega genes que detêm um potencial para serem causadores de câncer, que são os oncogenes. Estes genes são responsáveis por processos de divisão celular, diferenciação e tradução protéica. Os oncogenes podem ser genes que um dia tiveram suas funções específicas ou que ainda têm função metabólica, mas por estresse celular sofreram mudança de lugar no genoma, aumentaram a atividade ou mesmo sofreram pequenas mudanças na própria estrutura que modificaram sua função dentro da atividade ou sua longevidade celular. Os avanços biotecnológicos permitiram que muitos oncogenes fossem conhecidos, tal como um tipo muito estudado chamado ras e suas variantes H-ras, K-ras e N-ras. Estes oncogenes não são “deletados” do genoma, mantendo o potencial para desenvolver um tumor. É muito normal que ocorram mutações em nosso DNA durante nossa vida, seja ao tomar sol ou mesmo respirar o ar poluído de uma grande cidade. Porém nossas células têm um sistema de reparação de DNA, que é composto por genes chamados anti-oncogenes ou genes supressores de tumor. Eles vistoriam o genoma durante o ciclo celular protegendo as mutações, tornando o câncer um evento raro, considerando a quantidade de células que compreendem o corpo e nas inúmeras reparações promovidas pela “máquina de reparo celular”. Os genes supressores de tumor atuam no ciclo celular em fases específicas de “pausa” chamados checkpoint em que podem matar a célula ou deixá-la num estado chamado senescente, no qual a célula não tem metabolismo, ou então, “arrumar” o gene que foi modificado, devolvendo para esta célula sua atividade normal não ofensiva. Os anti-oncogenes são amplamente estudados atualmente. Podemos destacar o gene P53; que, por meio de técnicas como a terapia gênica, focalizada no ciclo celular, é recolocado ou reativado para que, por si só, conserte os genes defeituosos. 7
Podemos fazer a seguinte analogia com relação aos supressores de tumor: suponha que tenhamos um balde (célula) de plástico cheio de água, mas que possui algum defeito: um furo (câncer), por exemplo. Este pode ter ocorrido ou na fabricação, ou devido ao seu constante uso ou na exposição aos fatores que tem o potencial de fazer um furo nele. Para evitar o vazamento de água (proliferação de células) podemos tapar o orifício com um pedaço de plástico e cola especial (supressor + veículo de transmissão) que fará com que o balde fique aparentemente normal. Assim, grosseiramente, podemos dizer que a terapia gênica é uma espécie de “curativo gênico”.
COMO FUNCIONA A TERAPIA GÊNICA A princípio existem dois tipos de terapia gênica: a somática e a germinal. Mas apenas a somática é viável porque “a intervenção gênica ao nível germinal não é uma opção, pois o transgene será transmitido do paciente aos seus descendentes o que acarreta discussões éticas e sociais. Nos ensaios de terapia somática, a manipulação do genoma fica restrito as células do paciente e o transgene não é transmitido aos descendentes” diz Dra. ConstanziStrauss. Os tumores tratados atualmente pela Dra. CostanziStrauss, em seu laboratório, são: o glioblastoma multiforme (GBM) e o carcinoma pulmonar (tumor de pulmão). Tais cânceres perderam a atividade guardiã do P53 e, também, tem prognóstico trágico para o paciente, proporcionando uma pesquisa de suma importância para o futuro terapêutico de tumores fatais como estes. De acordo com o comentário dos pesquisadores do ICBUSP, Dr. Carlos Frederico Martins Menck e Dr. Armando Morais Ventura, na Revista USP (2007), as etapas envolvidas em um experimento de terapia gênica são: o isolamento do gene, a construção de um vetor, a transferência para células no tecido-alvo e a produção da proteína codificada e expressa pelo gene terapêutico nessas células. 8
Há vários caminhos que podem ser tomados na terapia gênica, pois a mesma depende da estratégia e do gene a serem utilizados pelo especialista. Sabendo-se que, aproximadamente, 70% dos tumores humanos tem o gene P53 danificado; a Profª Eugenia utiliza-se deste método bastante elegante da terapia gênica: de inserção do gene natural (selvagem) da P53 em uma célula que, eventualmente tenha câncer (P53 danificada), para que ele possa ser utilizado pela célula em sua função primeira, que é de vistoriar o DNA em replicação, intervindo em caso de necessidade. Em outras palavras, ela utiliza o gene (P53) que o próprio corpo possui para tratamento do câncer. Tal estratégia procura inibir a proliferação do câncer e induzir a apoptose da célula. Sendo complementada com doses menores de quimioterapia ou radioterapia para erradicar o tumor, assim, pode-se dizer que a terapia proporciona uma janela terapêutica. (Veja a tabela 1) ESTRATÉGIAS E MECANISMOS DA TERAPIA GÊNICA DO CÂNCER (TABELA 1) ESTRATÉGIA
Reposição
Inibição
Citotóxica
GENE
Supressor de tumor TP53, CDKN2A
Anti-sense RAS, MYC
Gene suicida tk/GCV, CD/5FC
MECANISMO
Endógeno: inibir a proliferação, induzir apoptose, cooperação com quimio e radioterapia
Endógeno: bloquear atividade de oncogenes
Exógeno: conversão de uma pró-droga inativa para a forma tóxica da droga
Rv, Ad
Rv, Ad
Rv, Rv/VPC, Ad
VEÍCULO
Abreviaturas: tk - timidina quinase; VPC - virus produce cells; GCV - ganciclovir; CD - citosina deaminase Fonte (adaptado): Bryan Eric Strauss e Eugenia Costanzi-Strauss
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Para a técnica utilizando P53 é usado um sistema viral de transferência gênica. São vírus convertidos em vetores terapêuticos (patenteados pela USP) utilizados como veículos que procuram a célula portadora do gene cancerígeno. Eles invadem a célula e inserem o gene selvagem no DNA, proporcionando na célula uma releitura do gene “defeituoso”. Podendo assim, efetuar o desempenho esperado de um gene natural; e no caso do P53, proteger a célula de replicações incessantes ou mudanças celulares não desejadas. (Veja a figura 2) ETAPAS DA TERAPIA GÊNICA DO CÂNCER (FIGURA 2)
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Inibe proliferação e induz apoptose na célula
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1
Estudo bioquímico da doença alvo e preparação do gene terapêutico
Inserção do gene, por meio do vetor, numa célula danificada pelo câncer
2
Adenovírus, capazes de transportar grandes sequências de DNA, mas que despertam intensa reação imunológica. Ambos os vírus não replicam no organismo, pois tem neutralizada a sua capacidade de produzir doenças; eles também apresentam como vimos acima, dificuldades de eficiência na tranfêrencia gênica. Talvez este seja um dos maiores entraves da terapia. (Veja a tabela 2 e a figura 3) CARACTERÍSTICAS IDEAIS PARA UM VETOR DE TRANSFERÊNCIA GÊNICA (TABELA 2) PARÂMETRO
IDEAL
Título
8 Alto, >10 partículas/ml
Integração
Sim, quando expressão sustentada é necessária
Imunogenicidade
Baixa, para escapar detecção do sistema imune e permitir futura readministração do vírus
Capacidade codificante
Alta, >4kb, para permitir a inserção de múltiplos genes e cDNAs longos
Tropismo
Infecção específica para célula tumoral
Expressão
Alta e com especificidade para célula tumoral
Produção
Fácil, em larga escala, sem uso de protéinas de origem animais, como soro e fatores de crescimento
Confecção do vetor de transferência gênica
Purificação
Existem vários tipos de vetores terapêuticos que poderiam ser utilizados para o estudo da Profª Eugenia, virais ou não. No entanto, eles são escolhidos de acordo com o gene terapêutico e via de administração. Os vetores que melhor se adequam à pesquisa da professora, ainda no laboratório, são: os Retrovírus (Rv) recombinantes derivados do vírus da Leucemia Murina de Moloney (MuMLV), que dada a sua facilidade de manuseio e por infectarem apenas as células em divisão, têm infecção muito específica; e os 10
Fácil e sem perda de atividade viral
Fonte: Bryan Eric Strauss e Eugenia Costanzi-Strauss
Para a introdução do gene P53 selvagem em organismos, por meio dos vetores, podem ser utilizadas duas estratégicas básicas: ex vivo e in vivo. O trabalho começa com a estratégia ex vivo, pois ela baseia-se na retirada 11
Terapia gênica do câncer (FIGURA 3) Imagens ilustram produção de vetores virais recombinantes no laboratório e modelo aminal para teste de estratégia de terapia gênica para o tratamento de tumor cerebral (glioma). (A) Eletromocrografia de células produtoras de vírus recombinandes. As setas apontam partículas virais sendo liberadas pela célula produtora. (B) Imagem de glioma em corte de cérebro de rato. (d) Tumor hemisfério esquerdo tratado com vírus recombinante portador de gene anticâncer. (e) Tumor hemisfério direito não – tratado. Observe a redução da massa tumoral após tratamento com vírus terapêutico.
A
de células de um tecido alvo de um camundongo, que são cultivadas em laboratório (in vitro) para a inserção do gene terapêutico e reintrodução no animal. Depois de uma série de testes, o segundo passo é a estratégia in vivo. Nesta existe uma aplicação dos vetores no organismo dos camundongos com o gene selvagem (transgene) diretamente no órgão-alvo adequado. Não podemos fazer a aplicação direta em seres humanos porque há necessidade de formalizar um protocolo clínico, seguindo padrões internacionais. Segundo a Dra. Eugenia “não podemos mergulhar um paciente numa banheira de retrovírus ou adenovírus, e pensar que ele ficará normal, pois a execução dos testes pré-clínicos exige condições especiais de trabalho capazes de garantir um rigoroso controle de qualidade, documentação e análise dos dados”. No Brasil não existe um protocolo de terapia gênica do câncer. No entanto, a pesquisa é de importância vital para o desenvolvimento do primeiro protocolo clínico de terapia gênica do câncer no Brasil para que, no futuro, pacientes que sofrerem de glioblastoma multiforme e carcinoma pulmonar (tumor de pulmão) tenham a oportunidade de um tratamento cada vez mais efetivo. Pois “a terapia gênica do câncer tem limitações, mas intermináveis possibilidades” diz a Dra. Eugenia.
B
e d
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PARA SABER MAIS A NATUREZA DO ESPAÇO: TÉCNICA E TEMPO, RAZÃO E EMOÇÃO Milton Santos. 4ª ed. São Paulo: EDUSP. 2008. PATOLOGIA: BASES PATOLÓGICAS DAS DOENÇAS Kumar, Fausto, Abbas. Rio de Janeiro: Elsevier. 2005. 1616 p. ROBBINS & COTRAN - PATOLOGIA, BASES PATOLOGICAS DAS DOENCAS DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO (vol. 3) Antônio Carlos Lopes. Barueri: Manole. 2007. Revista BIOTECNOLOGIA, CIÊNCIA E DESENVOLVIMENTO: TERAPIA GÊNICA DO CÂNCER Ano 5, Nº28, Setembro/Outubro 2002. Eugênia Costanzi-Strauss e Bryan Eric Strauss Revista USP: MANIPULANDO GENES EM BUSCA DE CURA - O FUTURO DA TERAPIA GÊNICA Nº75, Setembro/Novembro 2007. Revista NATURE: A STRUCTURE FOR DEOXYRIBOSE NUCLEIC ACID Watson, Crick, Nº171, p. 737-738, 1953. www.nature.com/nature/dna50/archive.html INSTITUTO NACIONAL DO CÂNCER www.inca.gov.br MANUAL DE PATOLOGIA GERAL Pontificia Universidad Católica del Chile www.escuela.med.puc.cl
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Equipe do Laboratório de Terapia Gênica, coordenado pela Profa. Dra. Eugenia Costanzi Strauss Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento ecostanz@usp.br 11 3091-7301 Av. Prof. Lineu Prestes, 1524, CEP 05508-900, Cidade Universitária,São Paulo, Brasil
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO REITOR João Grandino Rodas PRÓ-REITORA DE CULTURA E EXTENSÃO Maria Arminda do Nascimento Arruda DIRETOR DO ICB Rui Curi PRESIDENTE DA COMISSÃO DE CULTURA E EXTENSÃO DO ICB Edna Teruko Kimura
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