Bioquímica Estructural UNAM by belen.muñozjdesign

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS SECCIÓN DE BIOQUÍMICA Y FARMACOLOGÍA HUMANA

PAPIME PE Programa de Apoyo a Proyectos Institucionales para el Mejoramiento de la Enseñanza.

CARRERA: QUÍMICA

CLAVE: 1618

PAPIME PE 205615

BIOQUÍMICA ESTRUCTURAL

Q. Arcadia Hernández Beltrán

Nombre del Alumno: Semestre Lectivo:

Grupo:

Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán

Índice Presentación

Bibliografía

Introducción a la bioquímica

Química biológica

Artículo: La extravagancia del agua

Artículo: Importancia biológica de los sistemas amortiguadores

Crucibioq: Agua y pH

Crucibioq: Equilibrio ácido-base

Metodología para el estudio de Biomoléculas

Resumen de carbohidratos

Crucibioq: Carbohidratos

Resumen de lípidos

Lectura breve: Venenos nocivos

Resumen de vitaminas liposolubles

Resumen: Aminoácidos, péptidos y proteínas

Crucibioq: Aminoácidos, péptidos y proteínas

Crucibioq: Estructura de las proteínas

Enzimas y Cinética enzimática

Resumen de vitaminas hidrosolubles

109

Resumen Ácidos nucleicos

110

Crucibioq: Química de los ácidos nucleicos

120

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Presentación Este “Compendio de materiales didácticos para Bioquímica Estructural”, son una serie de materiales de apoyo a la asignatura del mismo nombre que se imparte para la carrera de Químico de la FES Cuautitlán. El compendio no sustituye a las clases presenciales que imparte el profesor, sino que constituyen un complemento, un resumen de la información, imágenes, tablas y cuadros que se presentan durante las clases. Se agradecen los comentarios y el uso de este material por parte de los alumnos, ya que fue elaborado especialmente para ellos, con apoyo de los proyectos PAPIME, y en particular del PE 205615.

Compendio de Materiales Didácticos para Bioquímica Estructural

Bibliografía BIBLIOGRAFÍA BÁSICA Campbell, J., Farrel, S. Bioquímica. 6a edición. Cengage Learning. México. 2010. Devlin, T. M. Bioquímica. 4ª edición. Reverte. España: 2004. Garrido, A., Teijón, J., Blanco, D., Ramírez J., Villaverde, C, Mendoza, C., Ramírez, J. Fundamentos de Bioquímica Estructural. Alfaomega. México. 2005. Laguna, J., Piña, E., Martínez, F., Pardo, J., Riveros, H. Bioquímica de Laguna. 7a. edición. El Manual Moderno. México. 2013. Mathews, C. K., Van Holde, K. E: Bioquímica. 4ª Ed., McGraw-Hill Interamericana. México. 2013. Mckee, T., Mckee, J. R: Bioquímica. La Base Molecular de la Vida. 4ª edición. McGraw-Hill Interamericana. México. 2009. Murray, R., Bender, D., Botham, K., Kennelly, P., Rodwell, V. Harper. Bioquímica Ilustrada. 28a edición. McGraw-Hill Interamericana. México. 2010. Nelson, L. D., Cox, M. M. Lehninger. Principios de Bioquímica. 5ª edición. Omega. España. 2015. Voet, D., Voet, J. G., Pratt. C. W: Fundamentos de Bioquímica: La Vida a Nivel Molecular. 4ª edición. Médica Panamericana. España. 2016. BIBLIOGRAFÍA COMPLEMENTARIA Horton. H. R., Moran, L. A., Scrimgeour. K. G., Perry, M. D., Rawn, J. D.. Principios de Bioquímica. 4ª edición. Pearson Educación. México. 2008. Koolman, J., Klaus-Heinrich, R. Bioquímica Humana. Texto y Atlas. 4ª. Edición. Médica Panamericana. México. 2012. Osgood, M., Ocorr, K. The Absolute,Ultimate Guide to Lehninger Principles of Biochemistry: Study Guide and Solutions Manual. 5th edition. Freeman and Company. USA. 2013. Sadava, D., Hillis, D., Heller, C. Berenbaum, M. Life. The Science of Biology. 9th edition. Sinaver Associates. USA. 2011. Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Stryer, L. Bioquímica con Aplicaciones Clínicas. 7ª edición. Reverte. España. 2013.

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Introducción a la Bioquímica Los seres vivos están integrados por moléculas inanimadas. Cuando se examinan individualmente, estas moléculas aisladas se ajustan a todas las leyes físicas y químicas que rigen el comportamiento de la materia inerte. Sin embargo, los organismos vivos poseen, además, ciertos atributos que no muestran las moléculas inanimadas. Al examina algunas de estas propiedades especiales se puede abordar el estudio de la Bioquímica con una mejor comprensión de los problemas fundamentales que trata de explicar. CARACTERÍSTICAS QUE IDENTIFICAN A LA MATERIA VIVA Uno de los atributos más sobresalientes de los organismos vivos es su complejidad y su alto grado de organización. Poseen estructuras internas intrincadas y contienen muchas clases de moléculas complejas. Se presentan, además, en una variedad asombrosa de especies diferentes. Por contraste, la materia inanimada de nuestro entorno, representada por el suelo, el agua, las rocas, etc. están constituidos habitualmente por mezclas al azar de compuestos químicos relativamente simples. En segundo lugar, cada parte componente de un organismo vivo cumple con un propósito o función específica. Esto es cierto no solamente para las estructuras macroscópicas, tales como el corazón, pulmones, etc. sino también para las estructuras microscópicas intracelulares tales como el núcleo. También los compuestos químicos individuales, como lípidos, proteínas. etc. cumplen funciones específicas. La tercer característica, es que los organismos vivos tienen la capacidad de extraer, transformar y de utilizar la energía de su entorno, ya sea en forma de elementos nutritivos orgánicos corno energía radiante de la luz solar. Esta energía permite a los organismos vivos construir y mantener sus propias estructuras, complicadas y ricas en energía, efectuar trabajo mecánico de locomoción y llevar a cabo el transporte de materiales a través de la membrana. Sin embargo, el atributo más extraordinario de los organismos vivos es su capacidad de auto replicarse con precisión. La materia inerte no muestra capacidad aparente para desarrollarse y reproducirse en formas idénticas en masa, forma, tamaño y estructura interna, generación tras generación. Las moléculas de las que se componen los organismos vivos cumplen todas las leyes familiares de la química, pero también se influyen entre sí de acuerdo con otro conjunto de principios a los que colectivamente se les refiere como La lógica molecular del estado vital, que son un conjunto de relaciones que caracterizan a la naturaleza, la función y las interacciones de las biomoléculas, es decir, la clase de moléculas que se encuentran en los organismos vivos. Todos los organismos vivos contienen macromoléculas orgánicas construidas de acuerdo con un plan común. Los compuestos orgánicos de la materia viva aparecen con una extraordinaria variedad y muchos de ellos son extremadamente grandes y complejos. Aún las células más sencillas y más pequeñas, contienen un número muy grande de moléculas orgánicas diferentes.

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Una sola célula de la bacteria Escherichia colí contiene alrededor de 5000 clases de compuestos orgánicos, entre ellas hasta 3000 clases de proteínas diferentes y 1000 clases diferentes de ácidos nucleicos. Además las proteínas y los ácidos nucleicos son moléculas muy grandes y complejas, es decir, son MACROMOLÉCULAS. Cada especie de organismo posee su propio conjunto de moléculas, de proteínas y ácidos nucleicos, y casi todas son diferentes a las de otras especies. La célula contiene un gran número de moléculas. La estructura de cada molécula determina la reacción química en la que interviene y, por tanto, el papel que desempeña en los procesos vitales celulares. Los tipos más importantes de moléculas biológicas son los ácidos nucleicos, las proteínas, los hidratos de carbono y los lípidos. Los ácidos nucleicos son responsables del almacén y transferencia de la información genética. Son moléculas grandes formadas por cadenas largas de unas subunidades llamadas bases, que se disponen según una secuencia exacta. Éstas, son “leídas” por otros componentes de las células y utilizadas como patrones para la fabricación de proteínas. Las proteínas son moléculas grandes formadas por pequeñas subunidades denominadas aminoácidos. Utilizando sólo 20 aminoácidos distintos, la célula elabora miles de proteínas diferentes, cada una de las cuales desempeña una función altamente especializada. Las proteínas más interesantes para los bioquímicos son las enzimas, moléculas “trabajadoras” de las células Estas enzimas actúan como promotores o catalizadores de las reacciones químicas. Los hidratos de carbono son las moléculas energéticas básicas de la célula. Contienen proporciones aproximadamente iguales de carbono e hidrógeno y oxígeno. Las plantas verdes y algunas bacterias utilizan el proceso de la fotosíntesis para formar hidratos de carbono simples (azúcares) a partir de dióxido de carbono, agua y luz solar. Los animales, sin embargo, obtienen sus hidratos de carbono de los alimentos. Una vez que la célula posee hidratos de carbono, puede romperlos para obtener energía química o utilizarlos como base para producir otras moléculas. Los lípidos son sustancias grasas que desempeñan diversos papeles en la célula. Algunos se almacenan para ser utilizados como combustible de alto valor energético, mientras que otros se emplean como componentes esenciales de la membrana celular. Las células tienen también muchos otros tipos de moléculas. Estos compuestos desempeñan funciones muy diversas, como el transporte de energía desde una zona de la célula a otra, el aprovechamiento de la energía solar para conducir reacciones químicas, y como moléculas colaboradoras en las acciones enzimáticas. Todas éstas, y la misma célula, se hallan en un estado de variación constante. De hecho, una célula no puede mantenerse viva a menos que esté continuamente formando y rompiendo proteínas, hidratos de carbono y lípidos; reparando los ácidos nucleicos dañados y utilizando y almacenando energía. El conjunto de estos procesos activos y dependientes de la energía se denomina metabolismo. Uno de los objetivos principales de la bioquímica es conocer el metabolismo lo suficiente como para predecir y controlar los cambios celulares. Los estudios bioquímicos han permitido avances en el tratamiento de muchas enfermedades metabólicas, en el desarrollo de antibióticos para combatir las bacterias, y en métodos para incrementar

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la productividad industrial y agrícola. Estos logros han aumentado en los últimos años con el uso de técnicas de ingeniería genética. ALGUNAS DEFINICIONES DE BIOQUÍMICA 1

La Bioquímica es la ciencia que se ocupa del estudio de las diversas moléculas, reacciones químicas y procesos que ocurren en las células y los microorganismos vivientes. La palabra Bioquímica proviene del griego Bios - Vida y significa Química de la vida. Es la ciencia que se encarga del estudio de la base química de la vida.

La Bioquímica es la ciencia que se ocupa de los constituyentes químicos de las células vivas y de las reacciones y procesos que experimentan.

La Bioquímica estudia los seres vivientes, aplicando las técnicas y los principios fundamentales de la química al análisis de los fenómenos biológicos.

La Bioquímica es una ciencia de laboratorio con un enfoque fisicobioquímico en todos los tipos de actividades celulares.

Estudio de las sustancias presentes en los organismos vivos y de las reacciones químicas en las que se basan los procesos vitales. Esta ciencia es una rama de la Química y de la Biología. El prefijo bio- procede de bios, término griego que significa “vida”. Su objetivo principal es el conocimiento de la estructura y comportamiento de las moléculas biológicas, que son compuestos de carbono que forman las diversas partes de la célula y llevan a cabo las reacciones químicas que le permiten crecer, alimentarse, reproducirse y usar y almacenar energía. OBJETIVOS DE LA BIOQUÍMICA

El objetivo principal de la Bioquímica es la comprensión integral a nivel molecular, de todos los procesos químicos relacionados con las células vivas. Para lograr este objetivo la Bioquímica ha tratado de aislar las numerosas moléculas que se encuentran en las células, determinar sus estructuras y analizar la forma en que funcionan. El campo de la Bioquímica es muy extenso, como la vida misma. Dondequiera que haya vida, ocurren procesos químicos. Los bioquímicos estudian estos procesos en microorganismos, vegetales, animales inferiores y superiores, y en el hombre. La investigación bioquímica se caracteriza por utilizar los principios del método científico Los estudios bioquímicos son de naturaleza multidisciplinaria, es decir, que el entendimiento de los sistemas biológicos se apoya en principios físicos, biológicos y químicos. Las investigaciones bioquímicas abarcan un amplio espectro de temas que varían de organismos unicelulares a multicelulares de sistemas celulares enteros a sistemas subcelulares

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divididos; y de agregados moleculares subcelulares a las moléculas mismas. La Bioquímica moderna, base de toda la biología moderna, está relacionada con cualquier fenómeno asociado con todo el organismo ya sea, vegetal, animal, bacteriano o viral. El enfoque de la investigación se centra en las moléculas químicas que comprenden la esencia material del estado vivo. PRINCIPALES ÁREAS DE INVESTIGACIÓN EN BIOQUÍMICA Estructura química de los biopolímeros. Anatomía celular y subcelular. Naturaleza de las reacciones catalizadas por enzímas. Bases moleculares de los fenómenos biológicos. Metabolismo intermediario. Desarrollo de procedimientos analíticos.

BIBLIOGRAFÍA Horton. H. R., Moran, L. A., Scrimgeour. K. G., Perry, M. D., Rawn, J. D.. Principios de Bioquímica. 4ª edición. Pearson Educación. México. 2008. Mathews, C. K., Van Holde, K. E: Bioquímica. 4ª Ed., McGraw-Hill Interamericana. México. 2013. Murray, R., Bender, D., Botham, K., Kennelly, P., Rodwell, V. Harper. Bioquímica Ilustrada. 28a edición. McGraw-Hill Interamericana. México. 2010. Nelson, L. D., Cox, M. M. Lehninger. Principios de Bioquímica. 5ª edición. Omega. España. 2015.

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Química Biológica LOS ELEMENTOS DE LA VIDA Todos los seres vivos están constituidos, cualitativa y cuantitativamente por los mismos elementos químicos. De los elementos que se hallan en la corteza terrestre, sólo unos 29 son componentes de los seres vivos. Esto confirma la idea de que la vida se ha desarrollado sobre unos elementos concretos que poseen unas propiedades físico-químicas idóneas acordes con los procesos químicos que se desarrollan en los seres vivos. Se denominan elementos bioelementos a aquellos elementos químicos que forman parte de los seres vivos. De acuerdo a su abundancia (no importancia) se pueden agrupar en tres categorías: BIOELEMENTOS PRIMARIOS O PRINCIPALES: C, H, O, N Son los elementos mayoritarios de la materia viva, constituyen el 95% de la masa total. Las propiedades fisicoquímicas que los hacen idóneos son las siguientes: Forman entre ellos enlaces covalentes, compartiendo electrones. El carbono, nitrógeno y oxígeno, pueden compartir más de un par de electrones, formando enlaces dobles y triples, lo cual les dota de una gran versatilidad para el enlace químico. Son los elementos más ligeros con capacidad de formar enlace covalente, por lo que dichos enlaces son muy estables. A causa de la configuración tetraédrica de los enlaces del carbono, los diferentes tipos de moléculas orgánicas tienen estructuras tridimensionales diferentes. Esta conformación espacial es responsable de la actividad biológica. Las combinaciones del carbono con otros elementos, como el oxígeno, el hidrógeno, el nitrógeno, etc., permiten la aparición de una gran variedad de grupos funcionales que dan lugar a las diferentes familias de sustancias orgánicas. Estos presentan características físicas y químicas diferentes, y dan a las moléculas orgánicas propiedades específicas, lo que aumenta las posibilidades de creación de nuevas moléculas orgánicas por reacción entre los diferentes grupos. Los enlaces entre los átomos de carbono pueden ser simples (C - C), dobles (C = C) o triples. lo que permite que puedan formarse cadenas más o menos largas, lineales, ramificadas y anillos.

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BIOELEMENTOS SECUNDARIOS S, P, Mg, Ca, Na, K, Cl. Los encontramos formando parte de todos los seres vivos, y en una proporción del 4,5%. Se encuentra en dos aminoácidos (cisteína y metionina) , presentes en todas las proteínas. También en algunas sustancias como la Coenzima A. Forma parte de los nucleótidos, compuestos que forman los ácidos nucleicos. Forman parte de coenzimas y otras moléculas como fosfolípidos, sustancias Fósforo fundamentales de las membranas celulares. También forma parte de los fosfatos, sales minerales abundantes en los seres vivos. Forma parte de la molécula de clorofila, y en forma iónica actúa como catalizador Magnesio junto con las enzimas , en muchas reacciones químicas del organismo. Forma parte de los carbonatos de calcio de estructuras esqueléticas. En Calcio forma iónica interviene en la contracción muscular, coagulación sanguínea y transmisión del impulso nervioso. Catión abundante en el medio extracelular; necesario para la conducción Sodio nerviosa y la contracción muscular. Azufre

Potasio

Catión más abundante en el interior de las células; necesario para la conducción nerviosa y la contracción muscular.

Cloro

Anión más frecuente; necesario para mantener el balance de agua en la sangre y fluido intersticial. OLIGOELEMENTOS

Se denominan así al conjunto de elementos químicos que están presentes en los organismos en forma vestigial, pero que son indispensables para el desarrollo armónico del organismo. Se han aislado unos 60 oligoelementos en los seres vivos, pero solamente 14 de ellos pueden considerarse comunes para casi todos, y estos son: Hierro, manganeso, cobre, zinc, flúor, iodo, boro, silicio, vanadio, cromo, cobalto, selenio, molibdeno y estaño. Las funciones que desempeñan, quedan reflejadas en el siguiente cuadro: Fundamental para la síntesis de clorofila, catalizador en reacciones químicas Fierro y formando parte de citocromos que intervienen en la respiración celular, y en la hemoglobina que interviene en el transporte de oxígeno. Interviene en la fotólisis del agua, durante el proceso de fotosíntesis en las Manganeso plantas. Necesario para la síntesis de la tiroxina, hormona que interviene en el Iodo metabolismo

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Flúor Cobalto Silicio

Forma parte del esmalte dentario y de los huesos. Forma parte de la vitamina B12, necesaria para la síntesis de hemoglobina. Proporciona resistencia al tejido conjuntivo, endurece tejidos vegetales como en las gramíneas.

Cromo Zinc

Interviene junto a la insulina en la regulación de glucosa en sangre. Actúa como catalizador en muchas reacciones del organismo. Forma parte de las enzimas vegetales que actúan en la reducción de los nitraMolibdeno tos por parte de las plantas. Actúa sobre neurotransmisores y la permeabilidad celular. En dosis adecuada Litio puede prevenir estados de depresión. Cobre, aluminio, arsénico, boro, níquel, selenio, silicio, vanadio, Galio. Son Otros necesarios en algunos organismos en cantidades mínimas

BIBLIOGRAFÍA Horton. H. R., Moran, L. A., Scrimgeour. K. G., Perry, M. D., Rawn, J. D.. Principios de Bioquímica. 4ª edición. Pearson Educación. México. 2008. Murray, R., Bender, D., Botham, K., Kennelly, P., Rodwell, V. Harper. Bioquímica Ilustrada. 28a edición. McGraw-Hill Interamericana. México. 2010. Nelson, L. D., Cox, M. M. Lehninger. Principios de Bioquímica. 5ª edición. Omega. España. 2015.

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Metodología para el Estudio de Biomoléculas ASPECTOS GENERALES DE LA INVESTIGACIÓN BIOQUÍMICA La bioquímica es el estudio de la química de la vida, es una ciencia de laboratorio con un enfoque físicobioquímico de los procesos celulares. Esto significa que la investigación bioquímica sigue el método científico; tiene una naturaleza multidisciplinaria y abarca temas, que varían desde organismos multicelulares a unicelulares, de sistemas celulares enteros a sistemas subcelulares divididos y de agregados moleculares a las moléculas mismas. La bioquímica está relacionada con cualquier organismo ya sea animal, vegetal, bacteriano o viral y la investigación se centra en las moléculas químicas que comprenden la esencia material del estado vivo. Las investigaciones en Bioquímica están enfocadas al estudio, de una o más de las moléculas que participan en un fenómeno biológico, tratan de explicar cómo participan las llamadas biomoléculas en estos fenómenos. Estas investigaciones se realizan como estudios In vivo, que son los que utilizan sistemas celulares intactos y estudios In vitro, que son los que usan componentes celulares previamente aislados, es decir, sistemas libres de células. IMPORTANCIA DE LOS MÉTODOS Y TÉCNICAS EN ESTA ÁREA CIENTÍFICA Los métodos y técnicas en Bioquímica son muy importantes porque las biomoléculas presentan ciertas características que no permiten la utilización de técnicas de uso común en química. Por ejemplo, las concentraciones de las moléculas en un sistema biológico son muy bajas y las mezclas son complejas; algunas de las propiedades fisicoquímicas de las biomoléculas son parecidas lo que dificulta su separación; las moléculas que comprenden el estado vital son macromoléculas más difíciles de fraccionar y purificar que las de bajo peso molecular y además, sufren un proceso denominado desnaturalización que implica cambios en su estructura y su función al variar las condiciones ambientales naturales como el pH, Temperatura, solventes, etc. El crecimiento de la Bioquímica como ciencia y los avances logrados en esta área científica, están ligados al desarrollo de nuevos y mejores métodos e instrumentos de laboratorio, que se puedan usar en procedimientos cualitativos, cuantitativos o para el aislamiento de diversas sustancias. Los componentes celulares pueden aislarse de las células mediante una técnica de fraccionamiento que normalmente comprende dos etapas: 1) primero se rompen las células utilizando técnicas de lisis o ruptura celular, posteriormente los organelos celulares se pueden aislar mediante técnicas de centrifugación, o pueden separarse los componentes y estudiarse las propiedades de los mismos utilizando diferentes técnicas de separación como centrifugación, cromatografía, electroforesis. Para estudiar los componentes a nivel atómico o molecular se pueden utilizar técnicas espectroscópicas y para elucidar el modo de acción y las relaciones entre los diferentes componentes se emplean técnicas combinadas como la espectroscopia, técnicas radio isotópicas, potenciometría y polarografía entre otras. A pesar de que no existe un esquema universal para el aislamiento, separación, purificación y caracterización de biomoléculas se pueden hacer ciertas generalizaciones que permiten tener

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una idea más clara del procedimiento. Los pasos generales a seguir en un esquema de fraccionamiento celular son: Separación y aislamiento: Son etapas fundamentales en la investigación de sustancias o mezclas de sustancias. Los componentes de la mezcla a investigar deben separarse primero de las células como parte de una fracción subcelular, que a su vez se procesa para lograr el aislamiento del componente puro. Se presentan dificultades cuando la mezcla contiene varias sustancias similares y se debe realizar la separación de uno de los componentes o la resolución de la mezcla en cada uno de sus componentes. Determinación de la pureza: Las determinaciones de pureza se realizan en varias etapas del esquema de aislamiento con la finalidad de seguir la eficiencia del procedimiento y determinar cuándo ha finalizado. El análisis de pureza se realiza demostrando que no hay presentes grandes cantidades de otras sustancias contaminantes. Caracterización o Identificación: Consiste en la determinación de las propiedades fisicoquímicas y biológicas que distinguen a la sustancia en estudio. Determinación de la estructura y correlación con la función: Una meta de los estudios bioquímicos es comprender la base del funcionamiento de la sustancia que se ha caracterizado ya sea una molécula, un agregado poli molecular, una entidad subcelular o la célula entera. Esto requiere una determinación completa de las propiedades físicas, químicas, de la forma y estructura total; después se deben correlacionar las características estructurales específicas, con las actividades bioquímicas, es decir, la función. Mantenimiento de la integridad estructural y funcional: Se deben tomar precauciones durante toda la investigación para evitar que las sustancias en estudio se expongan a procedimientos que dañen su estructura y su función. CUIDADOS AL TRABAJAR MUESTRAS BIOLÓGICAS Para minimizar los efectos causados por el fraccionamiento, se deben mantener las sustancias en condiciones tan próximas como sea posible a las que se considera se encuentran en la célula. Antes de iniciar cualquier esquema de separación, es necesario tomar en cuenta ciertas precauciones: a)

El solvente universal es el agua. El agua es el componente más abundante de los organismos vivos. Su punto de fusión, ebullición, calor de vaporización, tensión superficial, etc. son muy elevados, como resultado de las fuertes interacciones intermoleculares en forma de puentes de hidrógeno entre moléculas de agua vecinas. Su polaridad, sus propiedades de ionización y su capacidad para establecer puentes de hidrógeno hacen del agua un solvente muy poderoso para compuestos iónicos y moléculas neutras.

El pH. Los procesos celulares son sensibles a cambios de pH, pues normalmente ocurren en un medio cuidadosamente regulado por sistemas amortiguadores como las proteínas. Los estudios In vitro requieren el uso de soluciones buffers que pueden no ser fisiológicos, porque en ocasiones los cambios deliberados de pH pueden ayudar en

Compendio de Materiales Didácticos para Bioquímica Estructural la investigación de cierto tipo de moléculas como los aminoácidos, proteínas y ácidos nucleicos. Los criterios para elegir tampones adecuados en investigaciones biológicas son: deben tener adecuada capacidad tampón en la gama de pH requerida, alto grado de pureza, solubles en agua e impermeables a membranas biológicas, enzimática e hidrolíticamente estables, no deben ser tóxicos ni inhibidores biológicos, sus complejos con cationes deben ser solubles y no deben absorber en las regiones del visible y ultravioleta. c)

La concentración de electrolitos. Los experimentos que se realizan con órganos de animales, cortes de tejidos, con organelos celulares o con homogenados requieren de una adecuada composición iónica. Por lo general el medio debe tener la misma presión osmótica que el interior de las células, para garantizar la integridad metabólica. Existen una gran variedad de soluciones salinas fisiológicas como la de Ringer, Young, Meng, etc. La mayoría de las disoluciones salinas contienen NaCl, KCl, Mg SO4, CaCl2, NaHCO3, KH2PO4, y algunas pueden además contener compuestos como: glucosa, piruvato, fumarato, oxalacetato, etc. La utilización de una solución en especial depende de los objetivos del estudio. No existe un medio universal para suspender un tejido durante una homogenización, pero p. ej. la sacarosa se usa generalmente para asegurar un potencial osmótico que evite que las células se hinchen y revienten.

La temperatura. Es otro de los factores que deben cuidarse al trabajar muestras biológicas, porque muchas de las moléculas biológicas se desnaturalizan por el calor, por ello, es conveniente trabajar a temperaturas entre 0 y 4 C para evitar desnaturalización y crecimiento bacteriano, es decir, contaminación, pero no hay que olvidar que algunas enzimas son sensibles a las temperaturas bajas y tienden a suspender su actividad.

Otros aspectos. Para ciertos casos también es importante cuidar factores como la agitación manual o mecánica, presión atmosférica, dependiendo de la investigación en particular y de los objetivos de la misma. RUPTURA O LISIS CELULAR

En un esquema de investigación bioquímica, el primer paso es liberar a la sustancia de interés en forma soluble de la célula o del tejido sin provocar pérdidas de actividad, esto se logra rompiendo a las células para producir un sistema llamado homogenizado u homogenado. La ruptura o lisis celular tiene por objetivo romper la membrana celular para liberar su contenido y formar una suspensión de composición continua, con este procedimiento se pretende lograr la máxima ruptura de las células y el mínimo daño a los componentes celulares y subcelulares. Existen diferentes formas para lisar a las células y la elección de un método en particular depende del objetivo de la investigación y del material a procesar. Las técnicas más comunes son: Homogenización, molienda, exposición a frecuencias ultrasónicas, choque osmótico, uso de detergentes, expulsión a alta presión y tratamiento enzimático. Las primeras dos se emplean para tejidos animales y vegetales y las demás para células bacterianas. El homogenizado se realiza con aparatos eléctricos que tienen aspas afiladas que giran a una determinada velocidad, un aparato de uso común se denomina virtis. En los métodos de

Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán molienda las células se friccionan unas con otras, con un abrasivo, la forma más simple es utilizar un mortero con pistilo y bolitas de vidrio, arena o alúmina como abrasivo. Para muestras pequeñas se utilizan homogenizadores de vidrio, que consisten en un cilindro de vidrio esmerilado con un pistón que puede ser de vidrio pyrex, o de teflón, que se mueve de arriba hacia abajo y al girar el tejido es forzado a pasar a través del intersticio entre el pistón y el cilindro que mide 0.005 pulgadas, uno de los aparatos que existen en el mercado se conoce como potter. Las ondas ultrasónicas de alta frecuencia son útiles para la desintegración celular, porque producen altas presiones transitorias, que provocan el rompimiento de la membrana celular cuando una suspensión se somete a la vibración. En la expulsión a alta presión, se utiliza una cámara de acero inoxidable cerrada que se abre al exterior por una válvula de aguja, la suspensión celular se introduce en la celda y se aplica una cierta presión y las células revientan. La válvula se deja abierta mientras se mantiene la presión de manera que se recoge un hilillo de células rotas. En el choque osmótico las células se suspenden primero en una solución con alta concentración salina (solución hipertónica), que provoca la salida de agua de la célula, y posteriormente se transfieren agua pura, causando que el agua entre rápidamente dentro de la célula y la reviente (turgencia), los eritrocitos se pueden romper suspendiéndolos en una solución hipotónica. Otra forma de lisis celular consiste en el uso de detergentes como el dodecilsulfato de sodio (SDS), que destruyen los componentes lipídicos de la membrana provocando la destrucción de la célula. La lisozima es una enzima que tiene la capacidad de destruir a la pared celular bacteriana, ataca los a los carbohidratos que la constituyen. Algunos tipos de células se han lisado mediante la congelación y el deshielo o con disolventes orgánicos como el acetato de etilo y el tolueno. La homogenización y la molienda, se conocen también como homogenización mecánica; las vibraciones ultrasónicas y la expulsión a alta presión como homogenización física; El choque osmótico y el uso de detergentes como homogenización química y el tratamiento con lisozima como homogenización enzimática. El uso de cualquiera de los métodos descritos permite obtener un homogenado celular, el cual será separado procesado posteriormente por centrifugación. CENTRIFUGACIÓN Las técnicas de separación por centrifugación se basan en el principio fundamental de que partículas que difieren en densidad, tamaño y forma, sedimentan a diferentes velocidades al estar sujetas a una fuerza centrífuga bajo alta velocidad rotacional. La sedimentación depende del campo centrífugo (G) aplicado, que generalmente se expresa como campo centrífugo relativo (CCR), expresado en múltiplos de g, la constante gravitatoria: CCR(ges) = 4 2(r.p.m.)2r/ 3600 x 980 = 1.11x 10 –5(r.p.m.)2 r

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La velocidad de sedimentación de una partícula esférica, depende del campo centrífugo aplicado, del radio y la densidad de la partícula y de la densidad y viscosidad del medio de suspensión. El tiempo que tarda una partícula en sedimentar en el seno de un determinado medio, desde el menisco del líquido hasta el fondo del tubo de la centrífuga es: 2

En donde:

rp2( p- ) ln rb/rt

tiempo de sedimentación en segundos t = =tiempo de sedimentación en segundos rp p

rt rb

= viscosidad del medio de suspensión = radio de la partícula = densidad de la partícula = densidad del medio = distancia radial desde el centro de rotación al menisco del líquido = distancia radial desde el centro de rotación al fondo del tubo

De la ecuación anterior se deduce, que a una determinada velocidad del rotor, el tiempo requerido para sedimentar una mezcla de partículas esféricas homogénea, es inversamente proporcional al cuadrado de su radio y la primera potencia de la diferencia entre su densidad y la densidad del medio, y directamente proporcional a la viscosidad del medio. Una mezcla se puede separar por centrifugación con base en sus densidades o su tamaño. Al realizar una centrifugación para un esquema de fraccionamiento generalmente al indicar las condiciones; se cita la velocidad del rotor, las dimensiones radiales y el tiempo de funcionamiento. Existe un nomograma elaborado por Dole y Cotzias, que sirve para calcular la fuerza centrífuga relativa a partir del radio y la velocidad del rotor. Para realizar una centrifugación, el tubo de centrifuga se llena con el homogenado, se equilibra con otro de igual peso y se introduce en el rotor. Tras la centrifugación se obtienen dos fracciones; el sedimento o pastilla y una solución denominada sobrenadante, ambas pueden separarse por decantación. El sobrenadante se somete a un campo centrífugo mayor, para volver a obtener otra pastilla y otro sobrenadante y así sucesivamente, este procedimiento se conoce como centrifugación diferencial o fraccionada y se basa en las diferentes velocidades de sedimentación entre partículas de distinto tamaño y densidad. El orden de sedimentación de los principales componentes celulares es: primero células enteras, y “restos celulares”, seguidos de núcleos, cloroplastos, mitocondrias, lisosomas y otros microcuerpos, la fracción microsomal que comprende fragmentos de retículo endoplámico liso y rugoso y finalmente ribosomas. Existen dos tipos de centrífugas, las centrifugas preparativas que pueden procesar grandes volúmenes de material y se utilizan para el aislamiento u obtención de fracciones determinadas. y se clasifican en tres grandes grupos: centrifugas de uso general que son aparatos con una velocidad máxima de 6000 r.p.m. y un CCR de 6000 g; las centrifugas de alta velocidad que alcanzan velocidades máximas del orden de 25000 r.p.m. y una fuerza centrífuga de 89000 g, cuentan con refrigeración para evitar la fricción entre el aire y el rotor y las ultracentrífugas preparativas que desarrollan velocidades de hasta 75000 r.p.m. y producen

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una fuerza centrífuga máxima de 510000 g, cuentan con refrigeración y vacío. El segundo tipo, las ultracentrífugas analíticas se utiliza esencialmente para el estudio de las características de la sedimentación de macromoléculas y estructuras biológicas. Cuenta con aparatos capaces de funcionar a velocidades próximas a 70000 r.p.m. generando campos centrífugos de hasta 500000 g. Las técnicas de centrifugación se clasifican en métodos clásicos o de gradiente de densidad. En los métodos clásicos, la sedimentación de los componentes de la mezcla ocurre en un medio de densidad constante. En los métodos de gradiente de densidad, la sedimentación se produce en un medio con una densidad que cambia gradualmente. La técnica de velocidad en gradiente de densidad utiliza un gradiente de densidad preformado, manualmente o con aparatos automáticos, generalmente se usan soluciones de sacarosa. La mezcla a separar se deposita en la parte superior del gradiente y durante la centrifugación los solutos de características de sedimentación diferentes se mueven a través del medio como zonas o bandas discretas. Se detiene la centrifugación antes de que las zonas se junten. En la técnica de equilibrio en gradiente de densidad, el gradiente de densidad no se establece previamente, sino durante la centrifugación, se utiliza una solución de cloruro de cesio, una sal inorgánica muy densa, los solutos individuales buscarán una posición en el tubo donde la densidad del medio sea igual a su propia densidad; las bandas permanecen mientras se mantenga el gradiente. En ambos casos, la posición de las bandas, se puede localizar por separación cuidadosa del contenido del tubo mediante una perforación en el fondo del mismo y recogiendo fracciones pequeñas gota a gota o congelando el tubo y cortándolo después en rodajas. La ultracentrifugación analítica, se utiliza para determinación del peso molecular de biomoléculas, estimación de la pureza de macromoléculas y para detectar cambios en la conformación de las moléculas biológicas. En uno de los métodos para determinar el peso molecular por ultracentrifugación se puede medir el coeficiente de sedimentación (s), que se calcula determinando el desplazamiento del soluto desde el centro de rotación la velocidad a la cual ocurre ese desplazamiento; para la mayoría de los biopolímeros s es del orden de 10-13 seg. Y para eliminar el exponente se multiplica por 10+13 y el número resultante se designa como S, constante de Svedbeg, en honor de T. Svedberg por ser el pionero en el desarrollo de la ultracentrífuga. A medida que aumenta el tamaño de la partícula aumenta el valor de S. El valor numérico de S está influenciado por la forma y el peso molecular y se utiliza para caracterizar a una determinada molécula o estructura. P. Ej. Las lisozimas tienen coeficiente de sedimentación de 2.15 S, la catalasa de 11.35 S, las subunidades de los ribosomas bacterianos 30 S y 50 S y los de eucariotas 40 S y 60 S. CROMATOGRAFÍA En bioquímica continuamente se presentan problemas de separación y purificación de componentes biológicos y entre los métodos más convenientes se encuentra el empleo de las técnicas cromatográficas. La cromatografía es un método de separación, que se basa en las diferencias de migración de los componentes de una mezcla sobre una fase estacionaría por

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influencia de una fase móvil, Todos los sistemas cromatográficos constan fundamentalmente de dos fases; una de ellas es la fase estacionaria, que puede ser sólida, líquida o una mezcla sólido-líquida inmovilizada. La segunda fase, la fase móvil, puede ser líquida o gaseosa. La selección de las fases se hace de forma tal que los compuestos a separar tengan distintos coeficientes de distribución y de acuerdo a las diferentes técnicas:

TIPO DE EQUILIBRIO Y FASES IMPLICADAS

TIPO DE CROMATOGRAFÍA CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN

Es un equilibrio de adsorción que se da entre un sólido estacionario y una fase líquido móvil.

DISTRIBUCIÓN EN CONTRACORRIENTE Y CROMATOGRAFÍA DE PAPEL CROMATOGRAFÍA GAS – LIQUIDO CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO CROMATOGRAFÍA DE PERMEABILIDAD

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

Equilibrio de reparto entre un líquido estacionario (o semilíquido) y una fase líquida móvil. Equilibrio de reparto entre un líquido estacionario y una fase gaseosa móvil Es un equilibrio de intercambio iónico entre una resina de intercambio iónico como fase estacionaria y una fase de electrolito móvil. Equilibrio entre una fase líquida en el interior y en el exterior de una estructura porosa o <tamiz molecular> Es un equilibrio logrado entre una macromolécula y una pequeña molécula por la que tiene una elevada especificidad biológica y por tanto afinidad.

TABLA 1: TIPOS DE CROMATOGRAFÍA Y FASES IMPLICADAS TIPOS DE CROMATOGRAFÍA CROMATOGRAFÍA EN PAPEL: Esta técnica se basa en el principio de que un compuesto se distribuye entre dos fases líquidas. La fase estacionaria la constituye el agua atrapada entre las fibras de celulosa y la fase móvil una mezcla de disolventes orgánicos que se moverán a través del papel por capilaridad arrastrando a los componentes de la mezcla que se distribuyen de acuerdo a sus coeficientes de reparto, para este caso y para la cromatografía en capa fina se puede definir el término Rf, que es una constante para un compuesto determinado bajo condiciones específicas: Rf = distancia recorrida por el soluto/ distancia recorrida por el disolvente La cromatografía en papel es útil para separar y purificar aminoácidos, carbohidratos sencillos, clorofila, carotenoides, etc. y las técnicas pueden ser ascendentes, descendentes o radiales.

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CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA: El principio general implica los fenómenos de adsorción y reparto. Para realizarla se recubre una lámina de vidrio o aluminio con una capa delgada de un adsorbente (con espesor entre 0.25-0.5 mm, dependiendo del tipo de análisis), y se seca en estufa a 100-120 C. La muestra se aplica con micropipeta o jeringa, se introduce la placa en una cámara previamente saturada con la mezcla de disolventes y se permite que se efectúe la separación de los componentes a medida que la mezcla asciende por la placa. Se puede mejorar la resolución de la técnica si efectúa de manera bidimensional; para esto, se desarrolla la placa en una dirección, se saca de la cámara y se deja secar posteriormente se desarrolla en un segundo sistema de solventes introduciendo la placa en ángulo recto respecto al primer desarrollo. Para hacer evidentes los componentes de la mezcla se hace uso de reveladores: luz ultravioleta, vapores de Yodo, pulverización con ácido sulfúrico o colorantes específicos para los compuestos separados por ejemplo: ninhidrina para aminoácidos. Por esta técnica también se pueden separar pigmentos, lípidos y carbohidratos además de aminoácidos. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO: La principal característica de este tipo de cromatografía es la atracción de partículas de carga opuesta. La separación se lleva a cabo en columnas rellenas de una resina de intercambio iónico: la resina catiónica tiene grupos con carga negativa y la aniónica grupos con carga positiva. Los intercambiadores, al poseer cargas atraen a las moléculas de carga opuesta y las van reteniendo a lo largo de la columna dependiendo de su carga neta, lo cual permite su separación. Existen muchos intercambiadores iónicos que se han empleado para separación de moléculas biológicas, aminoácidos y proteínas. Sus nombres comerciales son: Zeocarb 226, Amberlite, IRC 50, Biorex 70, Dowex, etc., que presentan diferentes grados de acidez o basicidad y pueden elegirse para diferentes estudios. CROMATOGRAFÍA DE PERMEABILIDAD O FILTRACIÓN POR GEL: El término filtración por gel se refiere a la separación de moléculas de distinto tamaño utilizando materiales con estructura de gel (polímeros orgánicos que poseen un retículo poroso tridimensional). El principio general, implica una columna rellena de partículas de gel poroso en equilibrio con un disolvente adecuado para las moléculas que se desean separar. Las moléculas grandes son excluidas de los poros del gel a medida que el disolvente los lleva a través de la columna y pasarán por los espacios intersticiales mientras que las moléculas pequeñas, se retardan en su paso a través de la misma porque van siendo retenidos por los poros del gel y pasan por la columna a una velocidad menor. Los materiales utilizados son geles de dextrano (sephadex) , agarosa (sepharosa, Bio-gel A), poliacrilamida (Bio-gel P), poliacriloilmorfina (Enzocryl-Gel) y poliestirenos (Bio-Beads S) por esta técnica se pueden separar y purificar proteínas globulares hasta de 800 000 Daltons, se ha utilizado también para estudio de virus ácidos nucleicos y polisacáridos. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD: La purificación de biomoléculas por cromatografía de afinidad se basa en su especificidad biológica. La técnica consiste en llenar una columna con una resina que lleva fijado un ligando que posee afinidad por la macromolécula que se quiere purificar. Posteriormente se hace pasar a través de la columna la macromolécula impura inmersa en un medio adecuado; la macromolécula es retenida selectivamente, todo lo demás pasa a través de la columna sin ser retenido. Posteriormente sé eluye la macromolécula cambiando el medio ya sea de pH o fuerza iónica y se obtiene pura. La técnica sirve para purificación de proteínas, vitaminas, hormonas, enzimas, receptores, complejos polirribosómicos, complejos multienzimáticos y sustancias represoras.

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ELECTROFORESIS La electroforesis, es un método que se basa en la migración de partículas cargadas en un campo eléctrico. Las técnicas electroforéticas se desarrollaron inicialmente más de 60 años por Arne Tiselius, los avances logrados a partir de entonces en el desarrollo de estos métodos han permitido convertirlos en uno de los más efectivos para separación, purificación y caracterización de biomoléculas. Los requerimientos para que una mezcla se pueda separar por electroforesis son: que los componentes de la mezcla tengan forma iónica y que cada componente tenga carga neta diferente. El desplazamiento de una partícula en un campo eléctrico, se denomina movilidad electroforéticaque para una partícula esférica cargada, no sometida a electroforética ( )= ymovilidad se ha demostrado Q = carga de la partícula ninguna interacción electrostática fuerte con su medio ambiente es igual a la siguiente relación: con su medio ambiente es igual a la siguiente relación: r = radio de la partícula en cm = Q/ 6

Donde:

==movilidad electroforética movilidad electroforética Q ==carga de la partícula carga de la partícula

= viscosidad del medio líquido donde ocurre la migración cm

r = =radio de de la partícula en cmen radio la partícula

Los factores que afectan la velocidad de migración son: la carga, tamaño y forma de la muestra; la intensidad, voltaje y resistencia del campo eléctrico; el pH, composición y concentración de la solución bufffer y el soporte utilizado. Los métodos electroforéticos se pueden clasificar en de límite móvil y zonales. En el método de límite móvil, la electroforesis se realiza en solución, las partículas cargadas migran libremente a través de un canal abierto lleno de una solución salina, pero los solutos no llegan a separarse totalmente unos de otros, la única aplicación práctica de esta técnica es para probar la pureza de una muestra, pues una muestra pura presentará un límite único. En los métodos de electroforesis zonal han tenido una amplia aplicación porque los solutos pueden resolverse en zonas discretas, además que proporcionan una gran pureza. Los soportes utilizados son: papel, acetato de celulosa, capas finas, geles de agar, agarosa, almidón y poliacrilamida y agar. ELECTROFORESIS SOBRE PAPEL. Para realizar una electroforesis en papel, se requiere una fuente de poder, la solución buffer, una cámara de electroforesis y la tira de papel de papel filtro Whatman. La tira de papel se humedece completamente con la solución salina conductora, las muestras se aplican directamente al papel, el resto del área está disponible para la migración electroforética. Después de fijar las condiciones y el tiempo para la técnica, se deja correr y al terminar el proceso se saca la tira, se seca y se utiliza alguna técnica de revelado para hacer evidentes los componentes que se logró separar. ELECTROFORESIS EN GEL. El poder de resolución del gel de almidón es muy superior al de cualquier otra técnica, y se debe al hecho de que la migración no está controlada sólo por las diferencias de carga, sino también por las diferencias de tamaño, puesto que el gel

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es poroso y los solutos pueden difundirse reversiblemente dentro de los gránulos. Los geles de poliacrilamida tienen una resolución comparable a la de los geles de almidón, y además son: termoestables, transparentes, durables, relativamente inertes químicamente, no iónicos y fáciles de preparar en una gran gama de tamaño de poros. Existen algunas técnicas que se consideran variantes de la electroforesis como: Inmunoelectroforesis: técnica que combina la electroforesis con la inmunodifusión, y permite detectar sustancias de movilidad eléctrica similar, mediante reaccione de precipitación específicas entre el antígeno los anticuerpos homólogos, es una técnica de gran importancia para detectar antígenos en mezclas fisiológicas complejas. Enfoque isoeléctrico: Se basa en la electroforesis de frente móvil, en la cual la separación se realiza en una columna vertical que tiene en dirección descendente, un gradiente de pH y uno de voltaje; cada compuesto migra hacia la región de la columna cuyo pH corresponde al de su punto isoeléctrico y queda ahí inmovilizado. La utilidad de las técnicas electroforéticas es muy amplia, la electroforesis sobre papel sirve para separación de aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleótidos, ácidos nucleicos y derivados de carbohidratos que tengan carga eléctrica. Las técnicas que utilizan acetato de celulosa como soporte logra una mejor resolución sobre de la papel, tiene aplicación clínica en la separación de proteínas séricas y para la inmunoelectroforesis. La electroforesis en gel es muy adecuada para separación de mezclas de proteínas y ácidos nucleicos y con ello estas técnicas has contribuido de manera muy importante al desarrollo de la Biología molecular. De hecho, ha sido gracias al desarrollo de las técnicas electroforéticas que se han podido realizar varios avances en el área de la biotecnología o técnicas de recombinación del ADN. MARCAJE CON ISÓTOPOS Los átomos de un elemento con números de masa diferentes se denominan isótopos. En la naturaleza, normalmente existen algunos que son estables y otros que son inestables. Son pocos los isótopos estables de un elemento dado, los inestables se desintegran a una velocidad característica hasta producir isótopos estables. Los isótopos inestables reciben el nombre de radioisótopos y emiten cierto tipo de partículas o radiación electromagnética durante su proceso de desintegración. La radioactividad permite la marca de compuestos para determinar en forma fácil, segura y muy sensible, que le ocurre a un compuesto durante las reacciones in vivo o in vitro. Los radioisótopos, se han utilizado en el diseño de innumerables experimentos en el área de las ciencias biológicas. Las aplicaciones de los estudios con trazadores radioactivos, son muy amplias se utilizan en investigación de rutas metabólicas, estudios de absorción y translocación de compuestos, para determinar tiempos de recambio metabólico, aplicaciones clínicas, farmacológicas, datación, estudios ecológicos, esterilización de alimentos y aparatos, en estudios cinéticos, para la estructura primaria de biomoléculas y como agentes mutagénicos. La radiación es peligrosa, por lo que debe manejarse con cuidado y responsabilidad, las precauciones para el manejo de isótopos varían según el isótopo, pero hay medidas que

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deben considerarse siempre: usar bandejas forradas con papel especial absorbente, guantes desechables, bata de laboratorio, no pipetear directamente con la boca y no consumir alimentos o bebidas y no aplicarse cosméticos, en ese laboratorio, ni fumar. Los isótopos más ampliamente utilizados para estudios bioquímicos se muestran en la siguiente tabla: Isótopo

Partícula Emitida

Vida Media

β β β β β β

ISOTOPO ESTABLE ISOTOPO ESTABLE ISOTOPO ESTABLE 12.26 años 5570 años 87.1dias 14.2 días 25 años 8.05 días

15N

18O 2H 3H 14C 35S 32P 125I 131I

Tabla 2: ISÓTOPOS MÁS UTILIZADOS EN BIOQUÍMICA CUANTIFICACIÓN (TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS) Después de separar y purificar las sustancias o moléculas en estudio, se requiere detectarlas y cuantificarlas, para lo cual están disponibles varias técnicas, pero la que ha resultado de gran utilidad es la espectroscopía. La materia interactúa con la energía radiante (radiación electromagnética) a través de varios fenómenos: reflexión, refracción, difracción, absorción, interferencia, polarización y ionización. Los métodos espectroscópicos para análisis cuantitativo se basan en el fenómeno de absorción. En el estado fundamental los electrones de un átomo ocupan los niveles energéticos más bajos, de acuerdo con las leyes de la mecánica cuántica para hacerlo pasar a un nivel energético excitado ha de elevar su energía, por absorción de un quantum discreto de energía exactamente equivalente al implicado en la transición. Al retornar el electrón excitado a su estado fundamental, emite una radiación de longitud de onda específica. Cuando se producen enlaces entre átomos para formar una molécula, los electrones adquieren nuevas posiciones en el sistema y por lo tanto nuevos niveles de energía, además los átomos en una molécula pueden vibrar y rotar alrededor de un eje de enlace, dando origen a subniveles energéticos vibratorios y rotatorios. Al igual que en los átomos, cada uno de los electrones de una molécula ocupa el nivel de más baja energía. En vista de que en una molécula, cada estado fundamental y excitado esta subdividido en cierto número de subniveles energéticos, los espectros moleculares se ven generalmente como espectros de bandas y los espectros atómicos, más sencillos, como espectros de líneas. Los electrones de una molécula pueden cambiar su nivel de energía solamente cuando la molécula absorbe o emite quantos definidos de energía, por eso los espectros se denominan de absorción y de emisión respectivamente. El espectro de absorción de un compuesto puede demostrarse representando gráficamente

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la cantidad de luz absorbida por el compuesto, frente a las longitudes de onda. Una gráfica de este tipo tendrá uno o más máximos de absorción en la región visible del espectro electromagnético (400-700 nm), los espectros de absorción en la región ultravioleta (200-400 nm) y visible se deben a transiciones de energía de los electrones exteriores de la molécula, participen o no en los enlaces. La gran importancia de las técnicas espectroscópicas basadas en absorción de energía, se debe a dos factores uno cualitativo y otro cuantitativo: primero al patrón de absorción de una sustancia, es exclusivo y se puede utilizar como una característica distintiva para su identificación. Segundo, la cantidad de energía absorbida está directamente relacionada con la concentración de la sustancia. Las mediciones espectrofotométricas cuantitativas se basan en la ley de Beer-Lambert, que establece que la cantidad de energía absorbida por una sustancia a cualquier longitud de onda depende de la concentración del material absorbente y la longitud del paso de luz a través del medio: A = log10 I o/ I t = l c

En donde:

A = Absorbancia c = Concentración l = Longitud del paso óptico y generalmente igual a 1 = Coeficiente de extinción o absorción y es una constante a cierta longitud de onda

El uso más común de los espectrofotómetros consiste en utilizarlos como colorímetros, es decir, como fotómetros para la medición de la cantidad de cromófero producido en una reacción de coloración. Muchas sustancias que no poseen una absorbancia significativa en la región visible reaccionan cuantitativamente con algún reactivo, produciendo un compuesto coloreado, esta propiedad, se utiliza para analizar dichas sustancias, produciendo un color bajo condiciones estándar a partir de cantidades conocidas de sustancias, se miden las extinciones de estas muestras utilizando un “blanco de reactivos” (tiene todos los reactivos excepto la sustancia a determinar), para ajustar a cero el aparato. La absorbancia medida se representa contra la concentración de la sustancia que se ensaya, este gráfico se denomina curva de calibración, tipo o estándar, posteriormente se pueden ensayar cantidades desconocidas de la sustancia en las mismas condiciones, se mide la absorbancia y se utiliza la curva para determinar la cantidad de sustancia que produce. El tipo, fundamento y usos principales de las técnicas espectroscópicas se presentan en el siguiente cuadro: TIPO

Espectrofotometría visible y ultravioleta

FUNDAMENTOS Transiciones energéticas de electrones externos, de enlace y no enlazantes, de moléculas generalmente electrones deslocalizados.

USOS PRINCIPALES Análisis bioquímicos rutinarios cualitativos y cuantitativos, incluyendo un gran número de ensayos colorimétricos. Determinaciones enzimáticas y estudios cinéticos. Espectros diferenciales, espectros de acción, turbidimetría y nefelometría.

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TIPO

Espectrofluorimetría

Espectrofotometría infrarroja y raman

Espectrofotometría de llama (emisión y absorción)

FUNDAMENTOS

Radiación absorbida y emitida a mayores longitudes de onda.

Vibraciones atómicas que implican un cambio en el momento dipolo y un cambio de polarizabilidad, respectivamente.

USOS PRINCIPALES Análisis cuantitativo rutinario, análisis enzimático y cinético, y detección de cambios y conformación proteica. Más sensible a bajas concentraciones que la espectrofotometría de absorción visible y ultravioleta. Análisis cualitativo. Análisis cualitativo y huellas dactilares de moléculas de tamaño intermedio purificadas. Se utilizan principalmente en investigación.

Análisis cualitativo y cuantitativo de metales, principalmente en bioquímica clínica. Técnicas de Transiciones energéticas de emisión: determinación rutinaria electrones externos de átomos, después de su volatilización en una de metales alcalinos. Técnica de absorción. Alta sensibilidad para la llama. determinación de una gran gama de metales.

Espectrometría de resonancia de spin electrónico

Detección del momento magnético asociado con electrones no apareados

Investigación de metal o proteínas, particularmente enzimas y cambios de contorno de radicales libres introducidos en conjuntos biológicos, por ej., membranas.

Espectrometría de resonancia magnética nuclear

Detección del momento magnético asociado con número impar de protones, en un núcleo atómico.

Investigación de la estructura de moléculas de peso molecular inferior a 20 000 daltons.

Determinación de la abundancia de moléculas de fragmentos positivamente ionizados.

Análisis cualitativo de pequeñas cantidades de material, del orden de 10-6 a 10-9 g. Particularmente junto con la cromatografía gas-líquido. Se utiliza principalmente en investigación, pero tiene gran capacidad para la determinación de la estructura primaria de los péptidos.

Espectrometría de masas

TABLA 3: TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS. FUNDAMENTOS Y USOS

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Existen otras técnicas para la cuantificación de compuestos entre ellas se encuentran: volumetría, potenciometría, conductimetría, polarografía, gravimetría, etc. Sin embargo, la mayoría de ellas tienen una aplicación limitada en el estudio de las biomoléculas. MICROSCOPÍA Las técnicas microscópicas se basan en la observación de objetos muy pequeños a través de los microscopios, instrumentos que nos permiten el acceso a un mundo de seres que nuestros sentidos son incapaces de percibir. Existen muy diversos tipos de microscopios: Lupa; Es un microscopio simple que consta de un solo elemento óptico, el Microscopio óptico compuesto común; se compone de tres sistemas: a) Sistema Óptico: Formado por los lentes: objetivos y oculares. b) Sistema mecánico: Pié, brazo, platina, tornillos, cremallera, pinzas, revolver etc. c) Sistema de iluminación: La componen el espejo o lámpara, condensador y diafragma. El principio básico por el que operan los microscopios es que cuando un objeto es iluminado por la radiación se produce una imagen ampliada de la interacción. En el caso del microscopio electrónico, uno de los aparatos más interesantes y útiles, la radiación no consiste en ondas luminosas, sino por haces de electrones de alta velocidad que se enfocan sobre la muestra, bajo la influencia de un campo magnético. La microscopía electrónica ha tenido una valiosa aplicación para establecer relaciones entre estructura y función en el área de la bioquímica. El microscopio parece no ser útil en el campo de trabajo de un Químico que no se dedica a las ciencias biológicas, sin embargo, el microscopio electrónico, que tiene un nivel de resolución del orden de los nanómetros, ha permitido analizar sistemas biológicos como membranas, macromoléculas complejas y no biológicos como complejos cristalinos, fenómenos coloidales, etc., y ha resultado muy útil para la realización de modelos teóricos más adaptados a la realidad molecular. OTRAS TÉCNICAS Otra técnica de gran utilidad para los bioquímicos es la difracción de rayos X, en la cual se expone una muestra sólida en interacción con radiación X de longitud conocida, y los rayos dispersos en cualquier ángulo se detectan fotográficamente. Se obtienen cientos de imágenes, que se analizan y superponiendo esos mapas de contorno bidimensionales se puede construir una representación gráfica tridimensional del sólido. Este método ha resultado una herramienta muy poderosa en la determinación de detalles de la estructura fina submicroscópica como es el nivel molecular. Muchos procesos biológicos terminan con un intercambio de oxígeno o de dióxido de carbono con el medio ambiente. Para efectuar la medición de estos gases tanto en su consumo, como producción se utilizan técnicas manométricas, o través de electrodos de oxígeno y de dióxido

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de carbono que controlan las tensiones de los gases que miden respectivamente. Por medio de esta técnica es posible realizar estudios con mitocondrias, estudios fotosintéticos o para determinar cocientes metabólicos. Las mediciones de pH, tan importantes y necesarias para el control del medio en el que se encuentran las biomoléculas o para titulaciones para seguir por ejemplo la cinética de una reacción enzimática, realizan con las técnicas potenciométricas que también tienen amplia aplicación. La polarografía se utiliza para confirmar la presencia de ciertos materiales como vitaminas, hormonas, aminoácidos, etc.

BIBLIOGRAFÍA Bohinski, R.C. ,Bioquímica. 1991. Iberoamericana. México. Bryan Williams., Principios y Técnicas de Bioquímica Experimental., Clark, J.M., Switzer, R.L., 1977., Experimental Biochemistry., 2a. Ed., W.H. Freeman and Company., San Francisco. Horton. H. L., Moran, R., Ochs, D., Rawn y Scrimgeour. K. Principios de Bioquímica. Person Educación. México. 2008. Lozano Teruel J.A., Tudela Serrano, J., 1988., Prácticas de Bioquímica: Experimentación y Simulación., Editorial Síntesis., Madrid Louisot, P.,1977., Bioquímica estructural., Editorial AC., Madrid. Murray, R., Mayes P., Granner, D. y Rodwell, V. Bioquímica de Harper, 17ª edición. El Manual Moderno. México. 2007.

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Ternyinck, T., Avrameas, S., 1989., Técnicas Inmunoenzimáticas., Ed. Grupo editorial Iberoamericana.,México.

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Resúmen De Carbohidratos CONCEPTO: Los carbohidratos son químicamente polihidroxialdehídos o polihidroxicetonas y compuestos derivados que producen éstos por hidrólisis. Muchos de ellos, - pero no todos- tienen la formúla empirica Cn (H2O)n Otros nombres: CARBOHIDRATOS, HIDRATOS DE CARBONO, SACÁRIDOS, AZÚCARES, ÓSIDOS CLASIFICACIÓN: Hay tres grandes clases de carbohidratos: Monosacáridos: Son azúcares simples, formados por una unidad de polihidroxialdehído o polihidroxicetona Oligosacáridos: Consisten de cadenas cortas de unidades de monosacáridos, los más abundantes son los disacáridos, con dos unidades de monosacárido. Los monosacáridos y disacáridos tienen nombres que terminan en OSA. Polisacáridos: Existen en una gran rango de tamaños. Están formados por más de 10 unidades de monosacáridos; Existen cadenas lineales y ramificadas. PROPIEDADES FÍSICAS ¤ ¤ ¤ ¤ ¤

Solubilidad Punto de fusión (caramelización) Sabor dulce (Poder edulcorante) Sólidos cristalinos Actividad óptica

PROPIEDADES QUÍMICAS ¤ ¤ ¤ ¤ ¤ ¤

Oxidación Reducción Metilación Monosacáridos en: Medio acuoso, medio ácido, medio básico Enlace glucosídico 4 tipos de isomería: Óptica, grupo funcional, epimería, anomería

PROPIEDADES BIOLÓGICAS: FUNCIONES ¤ ¤ ¤ ¤ ¤

Energéticos Estructurales Reserva o almacén Protección Señalización, Comunicación, Reconocimiento celular

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MONOSACÁRIDOS Son los carbohidratos más simples Son aldosas o cetosas Tienen uno o más grupos alcohol Presentan carbono quiral Nomenclatura terminación OSA Las aldosas y cetosas contienen una función aldehído y cetona, respectivamente. De acuerdo al número de carbonos se denominan triosa, tetrosa, pentosa, hexosa, heptosa, etc. Indica número de carbonos 3, 4, 5, 6, 7 respectivamente. Las aldosas con 3C o más y las cetosas con 4C o más son quirales. La estructura de los carbohidratos se representa son proyecciones de Fischer y sistema de D,L

La designación de D, L se refiere a la configuración del centro asimétrico de númera ción mas alto D, L solo se refiere al estereocentro de interés D – y L- gliceraldehído D, L no especifican la dirección de rotación del plano de luz polarizada Los D-azúcares predominan en naturaleza

Algunos conceptos

Los estereoisomeros que son la imagen especular de otro son enantiómeros Los pares de isómeros que tienen configuraciones opuestas a uno o más centros qui rales pero no son imágenes especulares son diasteroisómeros Dos azúcares que difieren en la configuración alrededor de un solo centro quiral son epímeros

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Serie de las aldosas

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Serie de las cetosas

Epimería:

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Anomería

Los monosacáridos en agua, adoptan una conformación cíclica. La Glucosa (una hexosa) puede ciclarse para formar un hemiacetal cíclico. La forma cíclica de glucosa es una piranosa La Fructosa (una Cetosa) puede ciclarse para formar un hemicetal cíclico. La forma cíclica de fructosa es una furanosa

Las formas cíclicas poseen carbonos anoméricos. Al ciclarse se genera un nuevo centro quiral que se denomina carbono anomérico y el tipo de isomería se llama anomería (isómeros alfa y beta). Para los D-azúcares, el isoméro alfa tiene el OH hacia abajo, el isómero beta hacía arriba

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Formación de ácidos

Reducción a alcoholes

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Derivados de importancia biológica

OLIGOSACÁRIDOS: Oligo = “pocos” – normalmente 2 a 10. ¤ ¤ ¤

Maltosa Lactosa Sacarosa

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Formación de enlace glucosídico

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Oligosacáridos

POLISACÁRIDOS

Funciones: almacén estructura,reconocimiento Homopolisacáridos Heteropolisacáridos

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Almidón y glucógeno: Polisacáridos de reserva Almidón: Un polisacárido de glucosa cuya función es reserva en plantas

Dos formas: amilosa (10-30%) y amilopectina (70-90%) La amilosa presenta glucosas unidas por enlace alfa(1,4) y un extremo reductor La amilopectina presenta glucosas unidas por enlace alfa (1-4) y ramificaciones con glucosas unidas por enlace alfa (1- 6) cada 30 residuos de glucosa La amilosa es poco soluble en agua, pero forma suspenciones micelares. En estas suspensiones, la amilosa está en forma helicoidal.

Reacción del lugol. El yoduro se acomoda en las hélices para producir un color azul: El conocido como reactivo de Lugol se debe a Jean Guillaume Auguste Lugol (1786-1851

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Glucógeno: Formado por unidades de glucosa, reserva en animales. El glucógeno se almacena en hígado hasta el 10% y en músculo hasta 1-2% Es una reserva de energía para el organismo Esta formado por glucosas unidas por enlace alfa (1-4) y ramificaciones con glucosas unidas por enlace alfa (1- 6) cada 8-12 residuos de glucose. Se diferencia de la fracción amilopectina del almidón en el número de ramificaciones. Presenta un color rojo-violeta con el iodo Polisacáridos estructurales: La quitina y celulosa Tienen una composición similar a los polisacáridos de reserva, pero una pequeña diferencia estructural provoca una gran influencia en sus propiedades La celulosa: Es el polímero natural más abundante de la tierra .Les da fuerza y soporte a los árboles. Forma el algodón. Está formado por unidades de glucosas unidas por enlace beta (1-4).

Quitina – exoesqueleto de crustaceos, insectos arañas y pared celular de hongos Esta formado por unidades de N-acetilglucosamina unidas por enlace beta (1-4) Las cadenas de celulosa son paralelas y las de la quitina son paralelas o antiparalelas.

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RECONOCIMIENTO Y SEÑALIZACIÓN

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Resumen de Lípidos CONCEPTO: Son un grupo heterogéneo de compuestos orgánicos que pueden extraerse de las células o los tejidos por medio de solventes no polares como el éter, cloroformo tetracloruro de carbono, benceno, etc. Su principal característica es su insolubilidad en agua. No tienen una característica química especialmente distintiva. Desde el punto de vista BQ se consideran *ésteres reales o potenciales de ácidos grasos* PROPIEDADES FÍSICAS

• • • • • •

Solubilidad (insolubles en agua, solubles en solventes no polares). Parcialmente solubles (formación de micelas) P.f de ácidos grasos ( aumenta conforme aumenta el número de átomos de carbono y disminuyen con la presencia de insaturaciones) P.eb elevado ( se usan para baños a temperatura elevada) Presentan color, olor y sabor característico. Estado físico: Grasas (sólidos) Aceites (líquidos) ninguno es sólido cristalino

PROPIEDADES QUÍMICAS • • • • •

Ésteres ----- saponificación Hidroxilados ----- ésterificación Insaturados ----- hidrogenación, oxidación, halogenación Isómero biológico ----- Cis Fosfolípidos----- presentan carga negativa Oxidación ----- 9 Kcal/ mol

PROPIEDADES BIOLÓGICAS: FUNCIONES • • • • • • • • •

Tipo ---------- Ejemplo Estructurales ----- Fosfolípidos Energéticos ------ TAG Protección ------- Ceras Aislante térmico ----- TAG Aislante eléctrico ----- Esfingolípidos Transporte ----- Lipoproteínas Comunicación ----- Hormonas Otras varias ----- Vit, Esteroides, Terpenos, Prostaglandinas, Eicosanoides, Tromboxanos, etc.

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CLASIFICACIÓN

Grasas, ceras, esteres de esteroles Lípidos saponificables

Fosfolípidos, Glucolípidos

Terpenos Esteroides Lípidos no saponificables:

Eicosanoides Vitaminas liposolubles

Lípidos simples Modificada de Bloor

Lípidos Complejos Lípidos derivados

CARACTERÍSTICAS DE LOS ÁCIDOS GRASOS Monocarboxílico Cadena lineal Cadena átomos de carbono generalmente par Cadena saturada o insaturada Producida por células No se encuentran libres en la célula (solo en el orden de trazas)

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Las moléculas lipídicas son anfipáticas. Tienden a formar mono capas superficiales, bicapas, micelas o liposomas cuando entran en contacto con el agua.

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LÍPIDOS SIMPLES: TRIACILGLICÉRIDOS Estructura: Glicerol + Ac. Grasos Función: Reserva y aislante térmico

Mono, di y triacilglicéridos

CERAS: Alcohol cadena larga + ac. Graso de cadena larga

Triacontanoil palmitato, el componente mayoritario de la cera de abeja. Es un éster del ácido palmítico y el alcohol triacontanol. Un panal de abejas, es firme y completamente impermeable al agua a 25 C.

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LÍPIDOS COMPUESTOS: FOSFOLÍPIDOS: Lípidos estructurales de membrana

Estructura general de un fosfolípido

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DIFERENTES TIPOS DE FOSFOLร PIDOS

Especificidad de Fosfolipasas

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ESFINGOLÍPIDOS

Esfingolípido

Fosfolípido

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LÍPIDOS DE TRANSPORTE: LIPOPROTEÍNAS Estructuras esféricas que en la sangre se encargan de transportar a los lípidos (insolubles en agua) a los tejidos para que puedan ser transformados, almacenados y metabolizados.

LÍPIDOS DERIVADOS • Esteroides • Terpenos • Eicosanoides: prostaglandinas

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Esteroides

•

Esteroles

•

Zoosteroles ---Colesterol Fitosteroles--- Ergosterol

Sales biliares (ácidos) •

Hormonas Adrenales

Clasificación de Esteroides

Masculinas •

Hormonas Sexuales

•

Glucósidos Cardiacos

•

Saponinas

Femeninas

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LÍPIDOS TERPENOIDES DE IMPORTANCIA BIOLÓGICA

EICOSANOIDES: TROMBOXANOS, LEUCOTRIENOS, PROSTAGLANDINAS

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Venenos nocivos

Karl Mark, compañeros de cuarto de primer año en una universidad del sur de california, ansiosos por explorar su nuevo ambiente, condujeron su auto hasta el inicio de un sendero para excursionistas en el desierto de Mojave. Karl se burló de Mark porque éste llevaba su teléfono celular, ¿qué clase de experiencia salvaje podía tener uno llevando un teléfono? Mark, a su vez, hizo bromas acerca de la voluminosa guía de campo “Flora y Fauna del Desierto “, que hacía tan pesada la mochila de Karl. Después de caminar varios kilómetros, los jóvenes, animosos y en buena forma, divisaron un farallón rocoso y emprendieron una carrera para ver quién llegaría primero a la cima. El repentino esfuerzo y el calor ambiental hicieron que Karl sintiera un mareo momentáneo y estiró el brazo para apoyarse en una saliente rocosa sólida, se sorprendió al sentir un grueso cuerpo escamoso que se retorcía bajo su mano. Un repentino e inconfundible cascabeleo de advertencia fue seguido casi de inmediato por un intenso dolor ardiente en la base de su dedo pulgar. El grito de Karl hizo que Mark llegara corriendo. Al ver a la enorme serpiente que se refugiaba en una grieta de la roca, Mark ayudó a Karl, quien ya se estaba sintiendo muy mareado y con náuseas; se recostó y después buscó rápidamente el teléfono celular en su mochila. El encargado de servicio de emergencia 911 les dijo que no se movieran de lugar y que esperasen la llegada del helicóptero de evacuación médica. Para cuando escucharon el helicóptero ya habían consultado la guía de campo de Karl para identificar la variedad de serpiente de cascabel que resulto ser dinamita occidental. Antes de llegar al hospital, un área amoratada se extendía por la mano de Karl, su presión arterial había bajado y los médicos le administraban oxigeno porque le costaba trabajo respirar. ¿Por qué se estaba amoratando rápidamente la mano? ¿Por qué le faltaba el aliento? ¿Qué tratamiento recibiría Karl? Los venenos de las serpientes son complejas mezclas de proteínas venenosas. El veneno de la serpiente cascabel diamantina occidental es rico en enzimas llamadas fosfolipasas que descomponen los fosfolípidos de la membrana plasmática de las células y hacen que se rompan hasta que mueran. La muerte celular ennegrece el tejido cercano a la mordedura. En el torrente sanguíneo, las fosfolipasas atacan a los glóbulos rojos, reducen la capacidad de la sangre para transportar oxígeno y hacen que a la víctima le falte aire (o bien que tenga dificultad para respirar). Una vez que las fosfolipasas llegan a los músculos, atacan también a las membranas de las células musculares y dejan al descubierto las complejas proteínas contráctiles del músculo. Las cuales son atacadas por enzimas del veneno que digieren proteínas. Las proteínas que dan resistencia a los vasos sanguíneos son atacadas y podía haber hemorragias si los vasos se rompen. El veneno también contiene enzimas que atacan a las proteínas que intervienen en la coagulación de la sangre lo que hacen más peligrosas las hemorragias. Si el sangrado interno se combina con la perdida de glóbulos rojos portadores de oxígeno, es natural que la víctima sienta que le falta aire y que experimenta un shock. Para Karl fue muy afortunado que Mark llevara su teléfono celular. Si hubieran tratado de regresar caminando al auto, el veneno se habría difundido rápidamente por todo el cuerpo de Karl y el retraso habría reducido su probabilidad de sobrevivir. Por suerte, Mark pudo obtener de inmediato la asesoría de los expertos, mantener a Karl acostado, pues estaba en shock, y lo más inmóvil posible hasta que llegara la ayuda. Como habían identificado a la serpiente, el

Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán hospital ya los esperaba con el contraveneno adecuado. El contra veneno contiene proteínas que se unen a las diversas toxinas del veneno de la serpiente y las neutralizan. Las serpientes de cascabel diamantina occidental, con sus colmillos de 1.3 cm y grandes reservas de veneno, causa más muertes en Estados Unidos que cualquier otra especie de serpiente. De las 7000 a 8000 personas que sufren la mordedura de serpientes venenosas. Cada año en Estados Unidos, sólo entre 10 y 15 a mueren a causa del veneno. Las fosfolipasas y otras enzimas digestivas se encuentran en el tracto digestivo de los animales (incluidos los seres humanos), no sólo en el veneno de las serpientes. ¿Por qué tenemos fosfolipasas en el tracto digestivo? Dado que las serpientes tratan a su presa entera, ¿Cuáles son, en su opinión, los dos papeles muy diferentes que desempeñan las fosfolipasas y demás enzimas del veneno de serpiente?

Texto extraído de: Audesirk, T., Ausedirk, G., Byers, B.E. Biologia. La vida en la tierra. 8ª. Edición.Pearson Education. México. 2008

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Resumen de Vitaminas Liposolubles

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Resumen de Aminoácidos, Péptidos y Proteínas Hay proteínas en todas las células de los organismos vivos, unas que desempeñan funciones de transporte y almacenamiento, construcción y reconstrucción de tejidos de sostén, movilidad, transmisión de información, multiplicación de las células, catalizadores, hormonas etc. En los tejidos animales, las proteínas que se encuentran en mayor cantidad son las que desempeñan una función estructural. La proteína queratina forma parte de todos los vertebrados, es un componente muy importante del cabello, uñas, cuernos, etc. Desde el punto de vista bioquímico se considera que las proteínas más importantes son las que desempeñan una función en los procesos fisiológicos, como es el caso de las hormonas, las enzimas y los anticuerpos, moléculas de estructura globular que contienen secuencias de aminoácidos que son reconocidas por la molécula del sustrato o en la membrana celular a la que se fijan de manera específica. Los eritrocitos contienen grandes cantidades de hemoglobina la proteína transportadora de oxígeno. La luz producida por las luciérnagas es el resultado de una reacción que involucra a la proteína luciferina y el ATP catalizada por la enzima luciferasa. CLASIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Las proteínas pueden clasificarse desde diferentes puntos de vista: por su composición química, por su estructura tridimensional, con base en su solubilidad o de acuerdo a la función que desempeñan. Con base en su composición se clasifican en: Simples y Conjugadas PROTEÍNA

GRUPO PROSTÉTICO

FOSFOPROTEÍNAS

Ácido fosfórico

Caseína, vitelina, histonas

GLUCOPROTEÍNAS

Carbohidrato

Albuminas, globulinas, colágena, Inmunoglobulinas.

NUCLEOPROTEÍNAS

Ácidos nucleicos

Ribonucleoproteínas (ribosomas), desoxirribonucleoproteínas (cromosomas)

HEMOPROTEÍNAS

Hierroprotoporfirinas

Mioglobina, hemoglobina, citocromos.

CLOROFILOPROTEÍNAS

Magnesioporfirinas

Clorofilas

METALOPROTEÍNAS

Metal

Insulina (Zn) anhidrasa carbónica (Zn) Hemocianina (Cu) Ferritina(Fe)

LIPOPROTEÍNAS

Lípidos

Lipoproteínas séricas

EJEMPLOS

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CON BASE EN SU CONFORMACIÓN EN EL ESPACIO LAS PROTEÍNAS SE CLASIFICAN EN: Fibrosas

Constan de un solo tipo de estrucura secundaria. Función estructural. Insolubles en agua. Alfa-queratinas, colágeno y elastina.

Globulares

Constan de varios tipos de estructura secundaria. Solubles en agua. Enzimas y proteínas reguladoras.

CON BASE EN SU SOLUBILIDAD LAS PROTEÍNAS SE CLASIFICAN EN : TIPO

CARACTERÍSTICAS

ALBUMINAS

Solubles en agua y soluciones salinas. Sin aminoácidos distintivos. Ej. seroalbúmina, lactolbúmina, ovolbúmina.

GLOBULINAS

Escasamente solubles en agua pero solubles en soluciones salinas diluidas. Abundan en líquidos biológicos. Ej. globulinas del suero sanguíneo, miosina, lisozima

PROTAMINAS

Solubles en etanol al 70-80 % pero insolubles en agua y en alcohol etílico absoluto. Ricas en arginina. no tienen tyr ni trp

HISTONAS

Solubles en agua y soluciones salinas. Ricas en arginina e histidina, no contienen Trp. Se combinan con los ácidos nucleicos.

ESCLEROPROTEÍNAS

Insolubles en agua o en soluciones salinas y reactivos comunes. Ricas en glicina, alanina y prolina. Proteínas tisulares. Ej. queratinas, colágena, elastina

CLASIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE ACUERDO A SU FUNCIÓN: TIPO

FUNCIÓN

EJEMPLOS

ENZIMAS

CATÁLISIS Fosforilación de la glucosa Transporte de electrones Deshidrogenación de lactato.

Hexocinasa Citocromo Deshidrogenasa láctica

PROTEÍNAS DE ALMACENAMIENTO

ALMACÉN Proteína de la clara de huevo Proteína de la leche Almacén de hierro en hígado

Ovoalbúmina Caseína Ferritina

PROTEÍNAS DE TRANSPORTE

TRANSPORTE Transporta O2 en la sangre de los vertebrados Transporta ácidos grasos en la sangreTransporta lípidos en la sangre

Hemoglobina Seroalbúmina Beta-lipoproteína

PROTEÍNAS CONTRÁCTILES

CONTRACCIÓN Formar filamentos gruesos de la miofibrilla Formar filamentos delgados de la miofibrilla

Miosina Actina

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TIPO

FUNCIÓN

EJEMPLOS

PROTEÍNAS PROTECTORAS EN LA SANGRE DE LOS VERTEBRADOS

PROTECCIÓN Forma complejos con proteínas extrañas. Forma complejos con sistemas de antígeno-anticuerpo. Componente del mecanismo de coagulación

Anticuerpos Complemento Trombina

TOXINAS

TOXINAS Toxina bacteriana Enzimas que hidrolizan fosfolípidos

Toxina Diftérica Venenos de serpiente

HORMONAS

HORMONAL (MENSAJEROS) Regula metabolismo de la glucosa Regula síntesis de corticoesteroides Estimula crecimiento de tejidos

Insulina Hormona adrenocorticotrópica Hormona del crecimiento

PROTEÍNAS ESTRUCTURALES

ESTRUCTURAL Componente principal de fibras de seda y telarañas. Paredes celulares Piel, plumas, uñas, cuernos Tejido conjuntivo fibroso (tendones, huesos cartílagos) Tejido conjuntivo elástico (ligamentos) Pasan moléculas a través de membranas Se unen a hormonas o neurotransmisores y generan un mensaje

Fibroina Glucoproteínas Alfa-queratinas Colágeno Elastina Translocasas Receptores

OTRAS VARIAS

VARIAS Proteína de sabor dulce. Proteína anticongelante de la sangre de peces antárticos. Proteína de propiedades elásticas casi perfectas.

Monelina Proteína anticongelante Resilina

AMINOÁCIDOS En sentido general el término aminoácido se refiere a cualquier molé¬cula que tenga en su estructura química, los grupos funciona¬les amino (-NH2) y carboxilo (-COOH). Sin embargo, en bioquímica este término es la forma de nombrar a las unidades monoméricas de las proteínas: los L- -aminoácidos. Las miles de proteínas que existen en las diferentes células están constituidas por 20 aminoácidos comunes y todas ellas presentan estructura y función muy diferentes. Formula general de los aminoácidos El carbono de los aminoácidos por tener cuatro sustituyentes diferentes es un carbono asimétrico o quiral.

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CLASIFICACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS Los aminoácidos se pueden cla¬sificar con base en diferentes criterios: a) nutricional, b) fisicoquímicos y c) químicos: Desde el punto de vista nutricional, los aminoácidos se agrupan en: aminoácidos esenciales; aminoácidos semiesenciales y aminoácidos no esenciales.

Los aminoácidos esenciales para el hom¬bre son: isoleucina, lisina, fenilalanina, triptófano, leucina, metionina, treonina y valina. Los aminoácidos semiesenciales son: arginina y la histidina. Los aminoácidos no esenciales son: glicina, alanina, prolina, serina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina, ácido aspártico y ácido glutámico.

Desde el punto de vista fisico¬químico se les clasifica de acuerdo a la polaridad de sus cadenas laterales R, a pH de 7 en:

Aminoácidos no polares (contienen radicales hidrófobos) alanina, valina, leucina, prolina, isoleucina, fenilalanina, triptofano y metionina.

Aminoácidos polares (contienen radicales hidrófilos y sus cadenas R son neutras) glicina, serina, treonina, cisteína, asparagina, glutamina y tirosina.

Aminoácidos polares con carga (contienen radicales ionizados o ionizables): aminoácidos básicos (con carga positiva) histidina, lisina y arginina. Aminoácidos ácidos (con carga negativa) ácido aspártico (en forma de aspartato) y ácido glutámico (en forma de glutamato).

Desde el punto de vista quími¬co se pueden clasificar con base en la cadena lateral (grupo R) y la química asociada e influida por este sustituyente, en ocho categorías:

aminoácidos con cadena alifática: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina. aminoácidos cadena hidrocarbonada cíclica: prolina (estrictamente no es un aminoácido). aminoácidos con cadena hidroxílica: serina, treonina. aminoácidos con cadena aromática: fenilalanina, tirosina, triptófano. aminoácidos con cadena ácida: ácido aspártico, ácido glutámico. aminoácidos con cadena amídica: asparagina, glutamina. aminoácidos con cadena básica: lisina, arginina, histidina. aminoácidos con cadena azufrada. cisteína, metionina.

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PROPIEDADES FÍSICAS: Solubilidad Actividad óptica Punto de fusión Absorbancia de luz UV por los aminoácidos aromáticos PROPIEDADES QUÍMICAS La mayor parte de las propiedades químicas generales de los aminoácidos se deben a la proximidad en la molécula de un grupo carboxilo y de un grupo amino. Además la presencia de una cadena lateral reactiva explica que algunos de ellos posean propiedades específicas. Propiedades ligadas al grupo [—COOH] La presencia de un grupo carboxilo confiere a los aminoácidos las propiedades generales de los ácidos orgánicos. Entre ellas se pueden citar: a) La esterificación con un alcohol en presencia de un ácido fuerte:

b) La formación de una amida. Se obtiene por reacción con una amina. Esta reacción reviste una importancia particular cuando la amina proviene de otro aminoácido; pues conduce entonces a la formación del enlace peptídico.

c) La descarboxilación de un aminoácido da lugar a una amina. Es posible por vía química o enzimática.

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Propiedades generales ligadas al grupo [—NH2] Los aminoácidos poseen naturalmente las propiedades de las aminas primarias. Las más importantes desde el punto de vista de la bioquímica son: a) Reacción de la ninhidrina Esta es una reacción fundamental para la detección de los aminoácidos, actual¬mente acoplada a aparatos de valoración automática. Se puede resumir así: la nin¬hidrina (hidrato de tricetohidrindeno) es un oxidante enérgico, que por una desa¬minación oxidativa de los aminoácidos conduce al aldehído correspondiente, con liberación de amoniaco, gas carbónico y formación de ninhidrina reducida (hidrin¬dantina), según la siguiente reacción:

En un segundo paso, el amoniaco reacciona con hidrindantina y con otra mo¬lécula de ninhidrina para dar lugar a un compuesto azul violeta, conocido como púrpura de Ru¬hemann: Esta reacción colorimétrica es extremadamente sensible y la densidad óptica a 570 nm de la solución coloreada obtenida es proporcional a la cantidad de aminoácidos inicialmente presentes. Los iminoácidos originan un compuesto amarillo con el máximo de absorción de la disolución situado en las proximidades de los 440 nm.

b) Reacción del 1-flúor-2, 4-dínitrobenceno. Reacción de Sanger: El 1-flúor-2, 4-dinitrobenceno (FDNB) reacciona fácilmente con las funciona aminas para formar por sustitución nucleofilica un derivado N-2,4-dinitrofenol. Es un compuesto amarillo, fácil de identificar por cromatografía y de valorar por espectrofotometria a 360 nm. El principio de la reacción es el siguiente.

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b) Reacción del fenilisotiocianato. Reacción de Edman: Este compuesto reacciona con la función aminada para dar, en un medio alcalino. un derivado N-feniltiocarbamilado. En medio ácido, este último se cicla dando una feniltiohidantoína, fácil de identificar. El esquema de la reacción es el siguiente:

d) Dansilación de los aminoácidos El cloruro del ácido 1 -dimetilamino-naftalén-5-sulfónico (o cloruro de dansilo) reacciona muy fácilmente con las funciones aminadas de los aminoácidos. Se obtienen derivados del tipo sulfonamida muy fluorescentes (fácilmente detectables) según una reacción cuyo principio es el siguiente:

Esta reacción es cíen veces más sensible que la reacción de Sanger (dinitrofeni¬lación) y permite detectar cantidades ínfimas de un aminoácido. El interés fundamental de estas cuatro últimas reacciones que acaban de ser descritas (ninhidrina, l-flúor-2,4-dinitrobenceno, fenilisotiocianato, cloruro de dansilo) reside en su amplia utilización en la determinación de la estructura primaria de las proteínas.

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COMPORTAMIENTO ÁCIDO- BASE Debido a la presencia de dos grupos potencialmente ionizables, los aminoácidos presentan como mínimo dos valores de pK

Titulación de aminoácidos: neutro- glicina; ácido-glutamato; básico-histidina

PÈPTIDOS Formación del enlace peptídico El enlace peptídico se encuentra como una estructura de resonancia, puesto que se ha demostrado con las medidas de enlace que tiene un 40 % de carácter de enlace doble y un 60 % de carácter de enlace sencillo. Hay momentos en los que el oxígeno del carbonilo tiene una parcial de carga negativa y el nitrógeno amídico una parcial de carga positiva creando un dipolo eléctrico

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Una cadena peptídica se representa de esta manera:

Pentapéptido Seril-glicil-tirosil-alanil-leusina Ser-Gli-Tyr-Ala-Leu SGYAL

PROTEÌNAS Las proteínas son biopolímeros de elevado peso molecular formados por aminoácidos unidos por enlace péptidico que pueden estar o estan realizando una función celular. Las proteínas pueden realizar una amplia variedad de funciones tanto estructurales como funcionales. Datos moleculares de algunas proteínas

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Electroforesis en gel de proteínas

NIVELES DE ESTRUCTURA PROTEICA

ESTRUCTURA PRIMARIA: Se refiere al orden en que se encuentran unidos los aminoácidos a lo largo de la cadena polipeptídica. La estructura primaria esta determinada geneticamente y a su vez determina la estructura secundaria, terciaria, y cuando existe la cuaternaria. Estabilizada por el enlace peptídico Incluye localización de puentes disulfuro, en 1953, Sanger, determinó secuencia de la insulina. Est. Prim. Muy importante porque la variación en un solo aminoácido puede ser determinante para la proteína. Estudios que se le hacen: contenido y secuencia de aminoácidos determinación de carga y peso molecular

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Secuencia aminoácida de la ribonucleasa A Est 1a. es determinante para la función: La hemoglobina F presenta propiedades alteradas que son el resultado de la substituciòn de un aminoácido; valina por glutamico en la posición 6 de las cadena . La cadena R de la valina no tiene carga, mientras que el glutamato tiene una carga negativa a pH 7.4

El contenido de aminoácidos se determina por: Hidrólisis química seguida de separación de los aminoácidos. Para determinar la secuencia de aminoácidos de una proteína: primero se determinan el aminoácido NT y el aminoácido CT; en seguida se fragmenta la cadena polipeptídica y se determina la secuencia de cada fragmento y por último con toda la información recabada de los pasos anteriores se propone la secuencia (se arma el rompecabezas). ESTRUCTURA SECUNDARIA: - HÉLICE La cadena polipeptídica adopta una forma helicoidal con giro a la derecha con 3.6 aminoácidos por vuelta. Estructura estabilizada por puentes de hidrógeno que se forman entre el grupo carbonilo de un enlace peptídico y el grupo amino presente cuatro residuos más adelante. Se desestabiliza por grupos R cargados o ramificados y presencia de Pro y Gli

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 - HOJA PLEGADA, lamina , CONFORMACIÓN , Es una estructura laminar de las proteínas fibrosas en la cual la cadena polipeptídica esta extendida a manera de acordeón, con grupos R proyectados por arriba y debajo del plano que se genera Se pueden asociar dos o más cadenas de manera paralela o antiparalela. Esta estabilizada por puentes de hidrógeno.

Ejemplos estructura secundaria: alfa y beta queratinas

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ESTRUCTURA TERCIARIA Se refiere al superplegamiento de la cadena polipéptidica que forma una estructura compacta de forma esférica, globular. Es un arreglo tridimensional que forma varios repliegues específicos. Esta estabilizada por: atracciones electrostáticas (tipo salino); puentes de hidrógeno; interacción de cadenas no polares (fuerzas hidrófobas); puentes disulfuro. Estructura muy estable se estudia por cristalografía de rayos X.

Mioglobina Proteína típica con Estructura terciaria Características: Compacta (45 x 35 x 25 Å). 75%  hélice dextrógiras. Existen ocho segmentos helicoidales principales A,B,C,D,E,F,G,H. Los residuos se enumeran de acuerdo al segmento en donde se encuentren. Las

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ESTRUCTURA CUATERNARIA Se refiere a la unión de dos o más cadenas polipeptídicas (se denominan dímero, tetrámero, octámero ect.). Conjunto se le denomina oligómero y a las unidades (monómeros, protómeros o subunidades. Esta estabilizada por el mismo tipo de enlaces que la Est. Ter. excepto los covalentes. Estructura relacionada a propiedades reguladoras de las proteínas (Sistemas alostéricos). Hemoglobina: Proteína encargada del transporte de llevar oxigeno de los pulmones a cada una de las células de los tejidos. Formada por cuatro subunidades parecidas a la mioglobina, 1, 2, 1, 2; que se disponen en el espacio de manera simétrica en torno a un hueco central ocupados por moleculas de agua. Cada subunidad esta unida a las otras por interacciones electrostáticas (puentes salinos) siendo las interacciones mas fuertes , 1, 1, 2, 2 respectivamente.

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RELACIÓN ENTRE ESTRUCTURA Y FUNCIÓN

La actividad biológica de una proteína depende del adecuado ordenamiento tridimensional de sus grupos funcionales. Una proteína sólo funciona cuando está plegada es su estructura original o nativa. La estructura nativa puede ser alterada por condiciones ambientales que debiliten las interacciones no covalentes, provocando DESNATURALIZACIÓN. La desnaturalización proteíca se refiere a la pérdida de la estructura NATIVA y por tanto de la función de una proteína por factores como: pH, T, solvente o concentración salina entre otros. en ocasiones el cambio de conformación es pequeño y difícil de detectar, en otros casos ocurren cambios muy importantes. AGENTES DESNATURALIZANTES

Ácidos y bases fuertes Disolventes orgánicos (alcoholes, cetonas, cloroformo) Detergentes (SDS) Agentes reductores (mercaptoetanol) Compuestos polares neutros (urea, guanitidina) Sales a elevada concentración Aumento de temperatura Agresión mecánica (agitación, trituración) ESQUEMA DE DESNATURALIZACIÓN Y RENATURALIZACIÓN PROTEICA

BIBLIOGRAFÍA 1. Horton. H. R., Moran, L. A., Scrimgeour. K. G., Perry, M. D., Rawn, J. D.. Principios de Bioquímica. 4ª edición. Pearson Educación. México. 2008. 2. Murray, R., Bender, D., Botham, K., Kennelly, P., Rodwell, V. Harper. Bioquímica Ilustrada. 28a edición. McGraw-Hill Interamericana. México. 2010. 3. Nelson, L. D., Cox, M. M. Lehninger. Principios de Bioquímica. 5ª edición. Omega. España. 2015.

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Enzimas y Cinética Enzimática

BREVE REVISIÓN HISTÓRICA

El nombre de enzima, fue propuesto en 1867 por el fisiólogo alemán Wilhelm Kühne (18371900), deriva de la frase griega en zyme, que significa “en fermento”. Sin duda, la fermentación alcohólica es la reacción enzimática más antigua que se conoce, se creía que este fenómeno y otros similares eran reacciones espontáneas, hasta que en 1857 el químico francés Louis Pasteur comprobó que la fermentación sólo ocurre en presencia de células vivas. Sin embargo, el químico alemán Eduard Buchner descubrió en 1897 que un extracto de levadura libre de células puede producir fermentación alcohólica, la antigua incógnita se resolvió; - la levadura produce la enzima y ésta lleva a cabo la fermentación -. En 1783 el biólogo italiano Lazzaro Spallanzani había observado que la carne podía ser digerida por jugos gástricos extraídos de halcones. Éste fue el primer experimento en el que se llevó a cabo una reacción vital fuera de los organismos vivos. Tras el descubrimiento de Buchner, los científicos asumieron que en general, las fermentaciones y las reacciones vitales eran producidas por enzimas, pero todos los intentos de aislar e identificar su naturaleza química fracasaron, más tarde en 1926, el bioquímico estadounidense James B. Sumner consiguió aislar y cristalizar la ureasa. Cuatro años después John H. Northrop aisló y cristalizó pepsina y tripsina. Northrop demostró que la enzima era proteína y no un simple transportador de otro compuesto7. En los últimos años, la investigación sobre la química enzimática ha permitido aclarar algunas de las funciones vitales más básicas de las enzimas. La ribonucleasa, una enzima tridimensional simple descubierta en 1938 por el bacteriólogo estadounidense René Jules Dubos y aislada en 1946 por el químico estadounidense Moses Kunitz, fue sintetizada por científicos estadounidenses en 1969. La síntesis consiste en unir 124 moléculas de aminoácidos en una secuencia muy específica para formar la macromolécula. Dicha síntesis permitió identificar aquellas áreas de la molécula que son responsables de sus funciones químicas, e hizo posible crear enzimas especializadas con propiedades de las que carecen las sustancias naturales. Este potencial se ha visto ampliado durante los últimos años por las técnicas de ingeniería genética que han hecho posible la producción de algunas enzimas en grandes cantidades. ¿PARA QUE SIRVEN LAS ENZIMAS? Algunas enzimas, como la pepsina y la tripsina, que intervienen en la digestión de las proteínas de la carne, controlan muchas reacciones diferentes; mientras que otras como la ureasa, son muy específicas y sólo pueden acelerar una reacción. Otras liberan energía para la contracción cardiaca y la expansión y contracción de los pulmones. Muchas facilitan la conversión de azúcar y alimentos en distintas sustancias que el organismo precisa para la construcción de tejidos, la reposición de células sanguíneas y la liberación de energía química para mover los músculos. Además, la pepsina, la tripsina y otras enzimas poseen la propiedad peculiar denominada autocatálisis que les permite originar su propia formación a partir de un precursor inactivo denominado zimógeno.

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El uso médico de las enzimas está ilustrado por la investigación sobre la L-asparaginasa, que se piensa es una herramienta importante para el tratamiento de la leucemia; se ha descubierto que las dextrinasas pueden prevenir la caída de los dientes, y que las alteraciones enzimáticas están ligadas a enfermedades como la fenilcetonuria, la diabetes, la anemia y otros trastornos sanguíneos. Como norma, las enzimas no atacan a las células vivas. Sin embargo, tan pronto muere una célula, ésta es digerida por enzimas que rompen sus proteínas. La resistencia de las células vivas se debe a la incapacidad de las enzimas de atravesar la membrana celular mientras las células tienen vida. Cuando la célula muere, su membrana se hace permeable y la enzima puede penetrar en la célula y destruir las proteínas en su interior. La fermentación alcohólica y otros procesos industriales importantes dependen de la acción de enzimas, sintetizadas por las levaduras y bacterias empleadas en el proceso de producción. Algunas enzimas se utilizan con fines médicos; en ocasiones son útiles en el tratamiento de zonas de inflamación local; la tripsina se emplea para eliminar sustancias extrañas y tejido muerto de las heridas y quemaduras7. IMPORTANCIA DE LAS ENZIMAS Dentro de la gran variedad de funciones que realizan las proteínas, una de las que se puede considerar como de mayor importancia es la capacidad que tienen para actuar como catalizadores. Desde el punto de vista del nivel de estructuración proteica, una enzima es funcional y por tanto debe tener estructura terciaria o cuaternaria. Sin embargo, existen muchas enzimas que no solamente requieren de una parte proteica (apoenzima y por si sola es inactiva) para poder acelerar la velocidad de una reacción, sino que además requieren de una molécula pequeña de peso molecular bajo, que puede ser inorgánica u orgánica (cofactor) y que ayuda a la enzima a realizar su trabajo aceptando o donando grupos químicos.

Al complejo apoezima más cofactor se le conoce como haloenzima y es totalmente activo. El cofactor es una molécula que se va a encargar de ayudar a la enzima en su trabajo enzimático aceptando o donando grupos que la enzima no puede aceptar o donar por que modificaría su estructura y por tanto su función. El cofactor puede ser un ion metálico como: Fe2+, Zn2+, Mn2+, Mg2, Cu2+, etc. o una molécula orgánica como las vitaminas o derivados de las vitaminas y a estas últimas por enlazarse débilmente a la enzima se conocen como coenzimas.

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NOMENCLATURA Y CLASIFICACIÓN La forma de nombrar originalmente a las enzimas se hizo relacionando el nombre del sustrato sobre el cual actúan y adicionando la terminación ASA; p.ej. la enzima que cataliza la hidrolisis de la urea -ureasa-;la enzima que cataliza la hidrólisis de la maltosa a dos moléculas de glucosa - maltasa-; la enzima que realiza la hidrólisis de la sacarosa a una molécula de glucosa y una de fructosa - sacarasa, etc. Posteriormente se combinó el nombre del sustrato o el nombre del producto con el tipo de la reacción que catalizaba, p.ej. la enzima que transforma al ácido láctico en ácido pirúvico se llamó láctico deshidrogenasa, pues realizaba la des hidrogenación del ac. Láctico Actualmente, se ha establecido una forma sistemática de clasificar y nombrar a las enzimas de acuerdo a la recomendación de la Comisión Internacional de Enzimas. Este sistema divide a las enzimas en seis clases principales, cada una de las cuales se divide a su vez en subclases y subsubclases, además cada enzima se le denomina de acuerdo a un nombre recomendado, generalmente corto y apropiado para su uso, un nombre sistemático que identifica a la reacción que cataliza y por un número de clasificación que posee cuatro dígitos y se utiliza cuando es necesaria la identificación precisa de una enzima en especial, como es el caso de los trabajos de investigación que se publican en revistas científicas. T.1 Clases propuestas por la Comisión de Enzimas 1. Oxidoreductasas. Enzimas que catalizan oxido reducciones de los grupos CH-OH, CH-CH, C=O, CH- NH2 y CH= NH. Dos subclases representativas: 1.1 Enzimas que actúan sobre el grupo CH-OH como donador de electrones. Por ejemplo: 1.1.1.1 Alcohol:NAD+ oxidoreductasa [alcohol deshidrogenasa] 1.4 Enzimas que actúan sobre el grupo CH-NH2 como donador de electrones. 2. Transferasas. Enzimas que catalizan la transferencia de grupos (distintos del hidrógeno) de un sólo carbono, residuos aldehídicos o cetónicos, y grupos acilo, alquilo, glucosilo o que contienen fósforo o azufre. Dos subclases representativas: 2.3 Aciltransferasas. 2.7 Enzimas que catalizan la transferencia de grupos que contienen fósforo. Por ejemplo 2.7.1.1 ATP:D-hexosa-6-fosfotransferasa [Hexocinasa]. 3. Hidrolasas. Enzimas que catalizan la hidrólisis de los enlaces de tipo éster, éter, péptido, glucosilo, anhídrido de ácido, C-C, C-halógeno o P-N. Tres subclases representativas: 3.1 Enzimas que actúan sobre los enlaces de tipo éster. Ejemplo: 3.1.1.8. Acilcolina acilhidrolasa [seudocolinesterasa]. 3.2 Enzímas que actúan sobre compuestos glucosílicos.3.4 Enzimas que actúan sobre los enlaces peptídicos. 4. Liasas. Enzimas que catalizan la remoción de grupos de los sustratos por mecanismos diferentes de la hidrólisis, formando dobles ligaduras. Incluyen enzimas que actúan sobre los enlaces C-C, C-O, C-N, C-S, C-halógeno. Dos subclases representativos: 4.2. Carbono oxígeno liasas.

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5. Isomerasas. Esta clase comprende todas las enzimas que catalizan la interconversión de isómeros ópticos, geométricos o de posición. Dos de las subclases: 5.2 Cis-Trans isomerasas.5.3 Enzimas que catalizan la interconversión de aldosas y cetosas. 6. Ligasas o sintetasas. Enzimas que catalizan la combinación de dos compuestos acoplada a la ruptura de un enlace pirofosfórico en el ATP o compuesto semejante. Se incluyen enzimas que catalizan reacciones que forman enlaces C-O, C-S, C-N y C-C.Dos subclases representativas: 6.3 Enzimas que catalizan la formación de enlaces C-N 6.4 Enzimas que catalizan la formación de enlaces C-C.

ENZIMAS OLIGOMÉRICAS E ISOENZIMAS Existen enzimas que constan de una sola cadena polipeptídica integrando un monómero; a este grupo pertenecen enzimas como la lisozima, ribonucleasa, tripsina. Otro grupo de enzimas contienen dos o más subunidades asociadas por enlaces no covalentes; a este grupo pertenecen algunas enzimas de la glicólisis, las isoenzimas y las enzimas alostéricas. T.2 Enzimas Oligoméricas ENZIMAS Fosforilasa a Hexocinasa Ffructocinasa Enolasa Desh. Láctica

NO. SUBUNIDADES 4 4 2 2 4

PM. C/SUBUNIDAD 92,500 27,500 78,000 41,000 35,000

PM TOTAL 370,000 102,000 PM. C/SUBUNIDAD 92,500 150,000

Las isoenzimas o isozimas son diferentes proteínas con la misma actividad enzimática, que se originan en diferentes tejidos y presentan un desplazamiento electroforético diferente. Difieren en su composición aminoácida, por lo que sus diferencias están determinadas genéticamente. El caso más ilustrativo es el de la deshidrogenasa láctica, enzima tetramérica que posee dos subunidades diferentes: H (corazón); M (músculo). estas dos subunidades se combinan en cinco formas diferentes para formar cinco isoenzimas: H4 , H3 M, H2M2, HM3 y M4. Cada una de ellas presenta parámetros cinéticos diferentes T.3 Isoenzimas LDH TIPO LDH-1 LDH-2 LDH-3 LDH-4 LDH-5

COMPOSICIÓN HHHH HHHM HHMM HMMM MMMM

LOCALIZACIÓN Miocardio Miocardio Carebro y riñon Suero Hígado y Musc. Esquelético

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CARACTERÍSTICAS ESPECIALES DE LAS ENZIMAS Las enzimas son catalizadores biológicos de naturaleza proteica que se encargan de acelerar la velocidad con la que ocurren las reacciones que se llevan a cabo en una célula. Realizan la transformación de la molécula sobre la cual actúan a la que se le llama sustrato. Todas las enzimas son proteínas y presentan tres características que no presentan los catalizadores químicos que normalmente se conocen: Son los catalizadores más eficientes que se conocen, pues en pequeñísimas cantidades (del orden de los nanogramos) son capaces de acelerar la velocidad de una reacción termodinámicamente favorable hasta un millón de veces o incluso más; Presentan especificidad que se refiere a la capacidad que tienen las enzimas de actuar sobre un solo sustrato (especificidad absoluta) o sobre dos o más sustratos que generalmente son químicamente parecidos (especificidad relativa) y; Presentan la particularidad de que su actividad está sujeta a regulación, es decir, la presencia de moléculas denominadas moduladoras provoca que la enzima aumente o disminuya notablemente su actividad. SITIO ACTIVO La especificidad enzimática reside en una determinada región de la superficie enzimática, formada por aminoácidos especiales llamado sitio activo. El modelo original del sitio catalítico para referirse al sitio activo, fue propuesto por Fisher y supone la interacción sustrato-enzima como una analogía entre llave-cerradura; el modelo considera al sitio catalítico rígido; pero las proteínas en solución son flexibles, por lo cual no se explica del todo la actividad enzimática. Koshland en 1967 propuso un modelo al que llamo -ajuste inducido- en este caso se propone que el sustrato induce un cambio conformacional en la estructura terciaria de la proteína que produce un acomodo muy particular entre enzima y sustrato, la analogía es como la mano en un guante. El modelo permite explicar la influencia de otros sitios, llamados reguladores o alostéricos, que modifican la actividad al provocar cambios conformacionales en el sitio catalítico.

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LOCALIZACIÓN Y DISTRIBUCIÓN DE LAS ENZIMAS Dentro de un organismo las enzimas se encuentran distribuidas en los diferentes órganos y tejidos donde realizan su función específica. En la célula, algunas enzimas se encuentran compartamentalizadas y ordenadas. P. ej. En células hepáticas, las enzimas de la glicólisis están localizadas en el citoplasma, mientras que las del ciclo de Krebs en las mitocondrias. T.4 Localización intracelular de las principales enzimas y rutas metabólicas REGIÓN CELULAR

RUTAS METABÓLICAS Y ALGUNAS ENZIMAS PRESENTES

Citoplasma

Glucólisis: ruta de las hexosa monofostato; glucogénesis y glucogenólisis: síntesis de ácidos grasos; catabolismo de purinas y pirimidinas. Enzimas: peptidasas; aminotransferasas; aminoacilsintetasas

Mitocondria

Ciclo de los ácidos tricarboxilicos; oxidación de ácidos grasos; oxidación de aminoácidos; alargamiento de ácidos grasos; síntesis de la urea; transporte electrónico y fosforilación oxidativa acoplada.

Lisosomas

Enzimas: Lisozima; fosfatasa ácida; hidrolasas, incluyendo proteasas, nucleasas, glucosidasas, arilsulfatasas, lipasas, fosfolipasas y fosfatasas.

Retículo endoplasmático (microsomas)

Rutas de síntesis de proteínas; síntesis de fosfoglicéridos triacilgliceroles, síntesis y reducción de esteroides Enzimas: NADH y NADPH citocromo c reductasas; oxidasas de función mixta relacionadas con el citocromo b, y el citocromo P450; glucosa 6 fosfatasa; nucleósido difosfatasa; esterasa, glucuronidasa, y glucuroniltransferasa

Golgi

Enzimas: Galactosil y glucosiltransferasa; condroitina sulfotransferasa; 5-nucleotidasa; NADH-citocromo c reductasa, glucosa 6-fosfatasa

Peroxisomas

Oxidación de ácidos grasos de cadena larga.Enzimas: Urato oxidasa; D-aminoácido oxidasa; alfa-hidroxiácido oxidasa; catalasa.

Núcleo

Rutas para la Biosíntesis de ADN y ARN

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¿COMO ACTÚAN LAS ENZIMAS? Un catalizador, actúa disminuyendo la energía de activación que las moléculas reaccionantes requieren para poder transformarse en productos. El catalizador en este caso la enzima se combina transitoriamente con la molécula reaccionante para formar un complejo (Enzimasustrato) que tiene un estado de transición de menor energía de activación que el que tendría la misma reacción no catalizada. Un catalizador ayuda a que un mayor número de moléculas reaccione por unidad de tiempo que las que reaccionarían en ausencia de la enzima.

E + S

En donde: E = Enzima S = Sustrato ES = Complejo Enzima-Sustrato P = Producto

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Para el caso de los catalizadores proteicos como las enzimas es necesario que ocurran una serie de eventos para que pueda existir la formación de un producto: Acercamiento y orientación favorable entre la enzima y el sustrato. Reconocimiento químico, entre enzima y sustrato (puede ser por medio de grupos funcionales). Fijación del sustrato por la enzima (a través de algún tipo de enlace). Transformación química (Ataque nucleofílico, electrofílico, adición o eliminación de un grupo, etc. cualquier tipo de reacción en la cual participe una enzima) Liberación del producto. Después de estos eventos la enzima se encuentra libre y en posibilidad de volver a transformar otra molécula de sustrato, y así sucesivamente. CINÉTICA ENZIMÁTICA La cinética enzimática se encarga del estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas y de los factores que las afectan. El primer tratamiento matemático de cinética enzimática que se realizó, lo llevaron a cabo Michaellis y Menten y llegaron a establecer un modelo matemático que explica de una manera muy aproximada el comportamiento de una reacción enzimática con un solo sustrato.

E + S

ES k2

Se define lo siguiente: [ ET ] = Concentración total de Enzima [ S ] = Concentración de Sustrato [ ES ] = Concentración del complejo Enzima-Sustrato [ P ] = Concentración del producto [ EL ] = Concentración de Enzima libre [ EL ] = [ ET ] - [ ES ]

Velocidad de formación:

V1 = d [ ES ] / d t = K1 ( [ E L ] [ S ] ) ----------------------- (1) = K1 ( [ ET ] - [ ES ] ) [ S ] ----- (2) Velocidad de descomposición: V2 = - d [ ES ] / d t = K2 [ ES ]

------------------------ (3)

V3 = - d [ ES ] / d t = K3 [ ES ]

------------------------ (4)

En el equilibrio: Velocidad de formación = velocidad de descomposición [ ES ] = constante

K1 ( [ ET ] - [ ES ] ) [ S ] = K2 [ ES ] + K3 [ ES ] K1 ( [ ET ] - [ ES ] ) [ S ] = [ ES ] ( K2 + K3 ) ( [ ET ] - [ ES ] ) [ S ] ) / [ ES ] =

( K2 + K3 ) / K1 KM Constante de Michaellis

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( [ ET ] - [ ES ] ) [ S ] = KM [ ES ] ( [ ET ] [ S ] - [ ES ] [ S ] ) = KM [ ES ] [ ET ] [ S ] = KM [ E S ] + [ E S ] [ S ] [ ET ] [ S ] = [ E S ] ( KM + [ S ] ) [ E S ] = [ ET ] [ S ] / KM + [ S ] ------------- (5) Vo = K3 [ E S ]

--------- (6)

Sustituyendo (5) en (6): Vo = K3 [ ET ] [ S ] / KM + [ S ] ------- (7) Vmax = K3 [ ET ] -------- (8) [ ET ] = Vmax / K3 ---- (9) Sustituyendo (9) en (7):

Vo = K3 ( Vmax [ S ] / K3 ) / KM + [ S ] Vo = Vmax [ S ] / KM + [ S ] ECUACIÓN DE MICHAELLIS-MENTEN

Cuando

KM = [ S ]

Vo = ½ Vmax

Vo VMax VMax /2

[S]

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TRATAMIENTO DE LINEWEAVER-BURK Inverso de la ecuación de Michaellis- Menten:

Rearreglando:

1 / V = KM + [ S ] / V Max [ S ] 1 / V = KM / V Max [ S ] + [ S ] / V Max [ S ] 1 / V = KM / V Max 1 / [ S ] + 1 / VMax

Y =

1 / Vo

m = KM / Vmax

b = 1 / VMax 1/[S]

- 1 / KM

FACTORES QUE AFECTAN LA VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN ENZIMÁTICA Las enzimas son proteínas y por tanto su solubilidad se ve modificada al variar ciertos factores ambientales como son el pH, la temperatura, la concentración salina, el solvente, etc. Sin embargo, no todas las proteínas se afectan de la misma forma al variar cada uno de los diferentes factores, así mismo, se puede hablar de un comportamiento general de la variación de la velocidad de reacción enzimática con respecto a cada uno de los factores que la modifican, pero al hablar de enzimas específicas existen algunas cuyo comportamiento puede caer en alguna situación extrema.

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pH Debido a su naturaleza proteica, las enzimas se ven afectadas estructural y funcionalmente al variar el pH del medio en el cual se encuentran y por lo tanto su actividad catalítica se puede regular en la célula por variaciones de este factor. El comportamiento general de la velocidad de una reacción catalizada por enzima con respecto a las variaciones de pH tiene una forma de campana de Gauss; en la cual se puede observar un máximo que indica un valor o un rango de pH, en el cual la actividad catalítica de la enzima es máxima y hacía ambos lados se observa una disminución de actividad, por efecto de la neutralización que puede existir de los grupos cargados que existen en la superficie de la enzima y que en un momento dado pueden llevar a la desnaturalización de la enzima, momento en el cual se observa su mínima actividad lo cual puede ocurrir en valores de pH inferiores o superiores al pH óptimo. TEMPERATURA El efecto que la temperatura puede ejercer sobre la velocidad de una reacción, se debe al aumento de energía cinética de las moléculas reaccionantes que les permite alcanzar más rápidamente la cima energética que deben sobrepasar para transformarse en productos. Se conoce que por cada aumento de 10 grados en la temperatura la velocidad de una reacción se duplica, pero en el caso de las enzimas es necesario considerar el efecto de desnaturalización térmica. Una gráfica de vel de reacción vs temperatura muestra en un principio un efecto positivo, al aumentar la temperatura existe un aumento de la vel de reacción, posteriormente se observa una zona en la cual la velocidad es máxima y después decrece, el punto máximo indica una temperatura óptima de trabajo de la enzima donde existe un mínimo de desnaturalización, después el efecto desnaturalizante es mayor que el efecto de aumento en la energía cinética de los reaccionantes y se observa una disminución de actividad, que en muchas ocasiones puede ser muy drástico. TIEMPO En una gráfica de velocidad de reacción vs tiempo, se observa una línea recta de pendiente positiva es decir a mayor tiempo la velocidad aumenta, siempre y cuando la concentración de sustrato sea mucho mayor que la concentración de enzima. Para una determinada cantidad de enzima se forma una cierta cantidad de producto; al permitir que el sustrato y la enzima interaccionen más tiempo el producto formado es mayor y esto se puede observar como un aumento en la velocidad de reacción.

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CONCENTRACIÓN DE ENZIMA Una gráfica de vel. de reacc vs concentración de enzima, muestra que a mayor concentración de enzima la velocidad de reacción aumenta. Mientras mayor sea la cantidad de enzima presente mayor cantidad del complejo enzima sustrato se va a formar y mayor será la cantidad de producto obtenido, siempre y cuando la concentración de sustrato no sea un factor limitante, es decir, la concentración de sustrato siempre debe ser mayor a la concentración de enzima. Vo

[E]

INHIBICIÓN ENZIMÁTICA Existen dos tipos de inhibición: la inhibición irreversible y la inhibición reversible. En la inhibición irreversible el inhibidor ( I ) se une covalentemente y modifica uno o más grupos funcionales esenciales para la catálisis lo que provoca la inactivación total de la molécula de enzima, la cual no tiene posibilidad de regenerarse, este tipo de inhibición se considera como un envenenamiento enzimático. En el caso de una inhibición reversible existen tres tipos: competitiva, no competitiva y acompetitiva y cada una de ellas se puede reconocer perfectamente por los efectos que el inhibidor provoca sobre la cinética de la reacción. Experimentalmente se realiza por comparación de los parámetros cinéticos en presencia y ausencia de una molécula inhibidora. Para que el estudio cinético sea válido el inhibidor debe combinarse rápida y reversiblemente con la enzima o con el complejo enzima-sustrato. Inhibición competitiva En una inhibición competitiva, el sustrato ( S ) y el inhibidor ( I ) compiten por unirse al sitio activo de la enzima ( E ) . El inhibidor y el sustrato son químicamente parecidos y ambos pueden formar un complejo con la enzima, pero uno de ellos no puede sufrir disociación posterior para formar un producto y regenerar a la enzima. Los efectos inhibitorios disminuyen al aumentar la concentración de sustrato, simplemente por efecto de Ley de acción de masas.

E E

+ +

S I

ES EI

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Los efectos que un inhibidor competitivo provoca sobre la cinética de una reacción, se pueden observar al hacer la representación doble recíproca, en presencia y ausencia del inhibidor. Lo que se puede observar en este caso, es que la gráfica con inhibidor cruza al eje de las Y aproximadamente en el mismo punto que la recta de la cinética normal y al eje de las X en un punto más cercano al origen que el caso de la normal. Esto significa que un Inhibidor competitivo afecta la KM pero no modifica a la VMax. Inhibición no competitiva En la inhibición no competitiva, el inhibidor y el sustrato se unen a la enzima en sitios físicos diferentes; no es necesario que el inhibidor sea químicamente parecido al sustrato pues no existe competencia por el sitio activo. El inhibidor y el sustrato se unen tanto a la enzima libre como al complejo ES. Este tipo de inhibición no disminuye sus efectos con el aumento de concentración del sustrato.

E ES

+ I + I

EI ESI

Al realizar la representación doble reciproca en presencia y ausencia del inhibidor, se puede observar que la recta con inhibidor cruza al eje de las Y en un valor más elevado que la gráfica de la cinética normal y al eje de las X la cruza en un punto más o menos cercano o igual que la gráfica de la cinética normal. Esto significa que un inhibidor no competitivo disminuye a la Vmax pero no modifica a la KM. Inhibición acompetitiva o incompetitiva La inhibición acompetitiva o incompetitiva se presenta generalmente en reacciones enzimáticas con dos o más sustratos. Es un tipo de inhibición compleja en la cual el inhibidor se une unicamente al complejo enzimas sustrato ES para formar un complejo inactivo que no sufre disociación posterior para formar un producto y regenerar a la enzima. ES

ESI

En una representación doble recíproca, se reconoce a este tipo de inhibición porque al comparar las gráficas con y sin inhibidor se observan dos rectas paralelas, es decir, para este tipo de inhibición la pendiente de las rectas permanece constante, pero ambos parámetros cinéticos cambian. Esto significa que un inhibidor acompetitivo provoca que relación KM /VMax permanezca constante.

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1/ Vo

No competitiva Competitiva

Normal

Acompetitiva

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ACTIVIDAD ENZIMÁTICA La actividad de una enzima se expresa en términos de la cantidad de producto formado (o desaparición de sustrato) por cantidad determinada de enzima por unidad de tiempo. La unidad estándar de actividad enzimática (U) es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de un micromol de sustrato por minuto a 25 C en condiciones óptimas d ensayo. La actividad específica se define como el número de unidades de enzima por miligramos de proteína (U/ mg de proteína). El antiguo “número de recambio” fue recientemente sustituido por actividad molecular o molar, se define como el número de moles de sustrato transformado por un mol de enzima por minuto (mol/min/Mol d enzima). La Comisión de enzimas de la Union Internacional de biqouímica ha propuesto una nueva unidad, el Katal (Kat) que se define como la conversión de un mol de ustrato por segundo. T.5 Actividad Molecular de algunas enzimas ENZIMA ACTIVIDAD MOLECULAR Anhidrasa carbónica 36,000,000 Catalasa 5,600,000 Beta- amilasa 1,100,000 Beta-galactosidasa 12,000 Succinato deshidrogenasa 1, 150 REGULACIÓN ENZIMÁTICA En un tubo de ensayo, las enzimas funcionan como un sistema cerrado y se acumula el producto de la reacción. Sin embargo, en la célula, los productos de una reacción no se acumulan, ya que son utilizados como sustratos de otra enzima, y los productos de ésta son sustratos de otra enzima y así sucesivamente hasta llegar al llamado producto final, es decir las reacciones en las células se dan con sistemas multienzimáticos, que son todas las enzimas que participan en una determinada vía o ruta metabólica.

E1 A

E3 C

E4 D

E8 E

I F

E8 E6

J G

E1 enzima alostérico

Los sistemas multienzimáticos (SM) básicamente pueden ser de tres tipos: a) SM. soluble b) Complejo multienzimático c) SM. Asociado a membrana

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Aunque todas las reacciones catalizadas por enzimas son reversibles en el tubo de ensayo, en la célula, la característica secuencial de las vías metabólicas hace que el flujo del metabolismo celular sea irreversible y permanentemente dinámico. En un sistema tan complejo como la célula existen mecanismos muy finos de regulación o control de la multitud de reacciones simultaneas que ocurren. pH Temperatura Presencia o ausencia de moduladores: moduladores + (Activadores); moduladores - (Inhibidores) Inhibición: Irreversible y/o Reversible : competitiva , no competitiva , feed back Regulación alostérica Otros medios de regulación: Algunos enzimas se encuentran en todas las células y otros solo se encuentran en determinados tipos celulares. Las enzimas se encuentran en distintos compartimentos, restringiendo su acción a un lugar y a un sustrato concreto. Organización de las enzimas en distintos niveles de complejidad a. Enzimas independientes en el citoplasma b. Se asocian y funcionan en conjunto. Cada una por separado es inactiva. c. Se asocian a estructuras supramoleculares Existen otras formas de regulación enzimática como la regulación covalente: Fosforilación/ desfosforilación (fosforilasa del glucógeno), entre otras. Regulación alostérica La actividad catalítica de algunas enzimas se ve afectada por ciertas moléculas que producen un cambio en la actividad, pero no se modifican por la acción. Estas moléculas se denominan efectores, modificadores o moduladores, por lo general, estos tienen poca o nula semejanza estructural con el sustrato. Un modulador alostérico cambia la afinidad de la enzima hacia el sustrato. Los efectores alostéricos positivos (+) incrementan la afinidad enzimasustrato y los efectores alostéricos negativos (-) hacen lo inverso. El sitio alostérico donde se une el efector positivo se conoce como centro activador. El sitio alostérico donde se une un efector negativo se denomina centro inhibidor. Una enzima alostérica, es aquella cuya actividad puede ser regulada por la presencia de moduladores. Represión e inducción Los estudios de regulación enzimática han permitido reconocer tres tipos de proteínas enzimáticas: constitutivas, inducibles y reprimibles. Las enzimas constitutivas están presentes en concentraciones constantes durante toda la vida de la célula, debido probablemente a una relación constante entre síntesis y degradación, son las enzimas de las vías metabólicas principales. Las enzimas inducibles son aquellas que normalmente se encuentran en concentración baja en la célula y a medida que se requiere mayor cantidad la velocidad de

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síntesis aumenta, con respecto a su degradación. P. ej. Beta- galactosidasa en E. Coli. El tercer tipo de enzimas es el de las reprimibles. La síntesis de estas enzimas se suspende si está presente en abundancia el producto final de la vía metabólica donde funcionan.. P. ej, Síntesis de histidina en Salmonella.

BIBLIOGRAFÍA 1. Díaz Zagoya, J.C., Hicks Gómez J.J. Bioquímica e Inmunología .Facultad de Medicina de la UNAM. México. 2. Horton, H.R., Moran, L.A., Ochs, J.d., Scrimgeour K.G., Bioquímica. Prentice Hall Hispanoamericana S.A., México. 3. López, A., Quintero, R., Tecnología Enzimática: Aplicaciones en alimentos y Medicina. Universidad Nacional Autonoma de México. México. 4. Murray, R,K., Granner, D.K., Mayes, P.A., Rodwell,V.W. Bioquímica de Harper. 18. ed. Editorial El manual Moderno, México, 5. Pacheco, L. D., Bioquimica. Estructural y aplicada a la medicina ., Instituto Politécnico Nacional., México. 6. Stryer, L. Bioquímica. 5a. ed., Reverté S.A., Barcelona.. 2 tomo

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Resumen de Vitaminas Hidrosolubles

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Resumen de Ácidos Nucleicos

En todos los organismos se encuentran dos clases de ácidos nucleicos: El ácido desoxirribonucleico: DNA El ácido ribonucleico: RNA CONCEPTO:

Los ácidos nucleicos (ADN Y ARN) son biopolímeros de elevado peso molecular formados por nucleótidos púricos y pirimídicos unidos por enlace 3’ – 5’ fosfodiéster, encargados de almacenar, transmitir y expresar la información genética en la célula. NUCLEÓTIDO = BASE NITROGENADA + AZÚCAR + FOSFATO NUCLEÓSIDO = BASE NITROGENADA + AZÚCAR ALGUNOS EXPERIMENTOS QUE MOSTRARON QUE EL DNA ERA LA MOLÉCULA DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA Fecha

Investigador(es)

1868

Friedrich Miescher

1944

1950

1953

Oswald Avery Colin Mac Leod Maclyn Mccarty Alfred Hershey Martha Chase. Erwin Chargaff

Descubrimiento Aisló y estudio una sustancia a la que llamó “nucleina”. Demostraron que el DNA es un componente de los cromosomas y es el principal agente implicado en la transferencia de información genética. Estudiaron la infección de E. Coli con bacteriófago t2, marcado con S35 y P32 Estudió la composición del DNA de diferentes especies y encontró que

A=T y que G=C Estudiaron la difracción de rayos x de cristales Rosalind Franklin-Maurice hidratados de DNA encontrando patrones Wilkins periódicos. Formularon una estructura tridimensional de doble hélice para el DNA, que explicaba todos los datos James Watson-Francis Crick de difracción de rayos X y la equivalencia de bases encontrada por Chargaff.

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Funciones de los nucleótidos: Síntesis de ácidos nucleicos Mono, di y trifosforilados son la forma en la que la célula maneja la energía. Unidos a vitaminas forman las coenzimas En membrana por acción de la adenil ciclasa el ATP se transforma en AMPc → mensajero químico intracelular.

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Gráficos de absorción a 260 nm de los nucleótidos Polimerización de nucleótidos

Unión 3’- 5’ fosfodiéster

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El DNA tiene varios niveles de estructuración: Estructura primaria: secuencia de nucleótidos Estructura secundaria: Doble hélice Estructura terciaria: Cromatina (DNA- proteínas) (desoxiribonucleoproteínas) (nucleosoma) Estructura cuaternaria: Cromosoma Estructura primaria: Secuencia de nucleótidos a lo largo de una cadena polinucleotídica: p. ej:

’ A T G C A 3’

DNA

RNA :

’ UGCCA3’

Estructura secundaria del DNA Características generales de la molécula del DNA 1- Es la molécula de la información genética 2- Controla la síntesis de proteínas 3- Es una molécula muy efectiva para almacenar la información genética 4- Es una molécula con estructura de doble hélice 5- Se duplica a sí misma

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MODELO DE DOBLE HÉLICE DEL DNA (Est 2ª): La molécula de DNA se compone de dos cadenas de polinucleótidos antiparalelas, enrolladas alrededor de un eje central, formando una doble hélice dextrógira. Las bases de purina y pirimidina está ubicadas en el interior de la hélice, mientras que los fosfatos y la desoxirribosa están en el exterior. Las dos cadenas permanecen unidas por puentes de hidrógeno entre adenina y timina y entre guanina y citosina. El diámetro de la hélice es de 0.2 nm. Las bases adyacentes están separadas 0.34 nm. La estructura helicoidal se repite cada 10 residuos, a intervalos de 3.4 nm. La secuencia de nucleótidos a lo largo de la cadena de polinucleótidos no esta restringida. La secuencia precisa de nucleótidos transporta la información genética.

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Rápido

Lento

Desnaturalización del DNA

Tres formas de la doble hélice

Nucleosoma

Estructura terciaria del DNA Cromatina (DNA- proteínas) (desoxiribonucleoproteínas) (nucleosoma)

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RNA El ácido ribonucleico ARN es un polímero de ribonucleótidos purínicos y pirimidínicos unidos por enlace 3’ , 5’- fosfodiéster, desempeña funciones de codificador y decodificador de la información durante la síntesis de proteínas. Sus pesos moleculares varían de 25000 a varios millones con coeficientes de sedimentación de 3 a 30 s Propiedades del ARN Soluble en soluciones diluidas de NaCl. Insoluble en alcohol. Puede disociarse de las proteínas por tratamiento con fenol o detergentes. El ácido ribonucleico ARN se puede hidrolizar en medio alcalino. El RNA está presente en varias formas diferentes en las células: ARN mensajero o mRNA ARN ribosomal o rRNA ARN de transferencia o el tRNA Otros: ARN catalítico y hnARNs ARN mensajero o mRNA Función: Transportar la información genética contenida en el genoma, codificada en forma de tripletes o codones (secuencia de tres bases), hacia los sitios de síntesis de las proteínas . Estructura: lineal Secuencia complementaria del ADN. De una gran actividad metabólica. Heterogéneo en estabilidad y peso molecular. En el extremo 3’ presenta una secuencia de poli A de 20 a 250 nucleótidos y el extremo 5’ esta rematado con un trifosfato de metilguanosina .

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ARN de transferencia o el tRNA Conformación espacial probable: Trebol Tienen de 76 a85 nucleótidos. Peso molecular de ~25000. Coeficiente de sedimentación de 4s. En el extremo 3’ presenta un triplete nucleotídico característico CCA. Tiene de 2 a 5 % de ac. Seudouridílico, ac. Dihidrouridílico diU. Función: Transferir los aminoácidos durante la síntesis de proteínas "lee" la sucesión de aminoácidos en el mRNA y asigna el aminoácido correcto en la cadena proteica creciente. ARN ribosomal o rRNA El ribosoma es una estructura citoplasmática formada por ribonucleoproteínas. Es la Maquinaria especializada en la síntesis de proteínas. El ribosoma se construye de proteínas plegadas ensambladas con moléculas de RNA ribosomal. Es el tipo de ARN que se encuentra en mayor proporción (80%) Los ARN ribosomales son ricos en Guanina y citosina. Su conformación espacial es difícil de establecer se considera que el 70% de la molécula esta en forma de apareamientos pseudohelicoidales tipo G-U y G-C

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La replicación del DNA produce 2 moléculas idénticas a la original, garantizando la transmisión de la información genética a las células hijas con fidelidad excepcional Transcripción. La secuencia de bases del DNA es copiada como una secuencia complementaria de bases en una molécula de cadena simple el mRNA

Traducción. Un codón (tres bases) en el mRNA corresponden directamente a un aminoácido específico en la secuencia de construcción de una proteína. Estos codones son reconocidos por los tRNAs que transportan el aminoácido apropiado. Los ribosomas son la “maquinaria” para la síntesis de proteínas

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