Sadržaj
Nukleinske kiseline
Nukleinske kiseline su biomakromolekuli koji učestvuju u čuvanju, prenosu i ekspresiji genetičkih informacija. Naziv su dobile prema jedru (lat. Nucleusu) u kome su u najvećoj meri zastupljene, premda su prisutne i u citoplazmi kao i u plastidima (hloroplastima i mitohondrijama).
Nukleinske kiseline je po prvi put izolovao fiziolog Fridrih Mišer 1869. godine iz jedra ćelija semene tečnosti lososa. Uloga nukleinskih kiselina u prenošenju naslednih informacija je otkrivena mnogo kasnije, istraživanjima bakteriologa Frederika Grifita, koji je otkrio fenomen genetičke transformacije na primeru bakterije Streptococcus pneumoniae. Grifit je eksperimentom pokazao da pneumokoka može da se transformiše iz jedne vrste u različitu vrstu. To opažanje je pripisano jednom nedefinisanom transformišućem faktoru. Taj faktor je kasnije identifikovan kao DNK. Osvald Ejveri je 1944. godine pokazao da su geni i hromozomi sačinjeni od DNK.
Nastanak nukleinskih kiselina
Hemijska građa zajednička je za svu živu i neživu prirodu. Ukoliko „pomešamo“ u epruveti sve elemente iz ćelije nećemo dobiti živo biće. Zbog toga se kaže da je život posebna organizacija hemijske materije i najsloženija forma kretanja materije. Dakle, život je omogućen posebnim interakcijama među neživim molekulima, koji zajedno funkcionišu tako da oforme, održe i obnavljaju živi sistem. Kako nukleinske kiseline učestvuju u svim biohemijskim procesima, u abiogenoj evoluciji se velika pažnja posvećuje nastanku i razvoju nukleinskih kiselina. Takođe, genetička informacija je smeštena upravo u molekulima nukleinskih kiselina i zahvaljujući njima se prenosi na druge makromolekule živih sistema.
Prebiotička supa
U eksperimentu su simulacijom uslova sredine mlade zemljestvoreniorganskimolekuli. Vodepraokeanasu bile zasićene organskim materijama koje su obrazovale tzv. „prebiotičku supu“. U toj „supi“ obrazovali su se organski sistemi u kojima su preovladavali proteini. Očigledno je da u današnjem živom svetu, DNK i proteini ne mogu postojati i raditi jedni bez drugih. Zbog toga se nameće logično pitanje – koji molekul je prvi nastao: DNK ili proteini? Na ovo pitanje prvi odgovara Džon Holdejn: ni DNK ni proteini, prvo je nastala RNK. Većina naučnika je danas saglasna da je prvo nastala RNK. Kao prvi molekulkojijeimaosposobnostdaseudvajaidanosi genetičku informaciju i istovremeno ima ulogu enzima. Evolutivno najmlađi molekul je DNK. Nastao je kao potreba za prelazak na stabilniju strukturu od RNK. Osim stabilnosti, proces njihovog udvajanja je mnogo tačniji od udvajanja RNK. Pojava DNK omogućila je razdvajanje procesa replikacije i translacije,njihovuvećutačnostiefikasnost.
Nukleinske kiseline, kao i svi polimeri, imaju monomere, a to su nukleotidi. Oni se jakim fosfodiestarskim vezama povezuju u dugačke polinukleotidne nizove i tako grade okosnice DNK i RNK lanca.
Nukleotidi se sastoje od:
Azotne baze
Pentoznog šećera (riboze u RNK ili dezoksiriboze u DNK)
Ostatka fosfatne kiseline
Azotna baza povezana sa pentoznim šećerom N-glikozidnom vezom gradi nukleozid – manji gradivni činilac nukleotida. Fosforilacijom nukleozida nastaju nukleotidi. U zavisnosti od broja vezanih fosfata mogu biti nukleozid-monofosfati, difosfati i trifosfati. U sastav DNK i RNK ulaze samo nukleozid-monofosfati.
Azotne baze mogu biti purinske ili pirimidinske. Purinske azotne baze su adenin i guanin, dok su pirimidinske citozin, timin i uracil. Azotne baze su nepolarna jedinjenja sa slabim baznim karakterom koji potiče od slobodnog elektronskog para atoma azota. U molekulu DNK purinske i pirimidinske baze se vodoničnim vezama povezuju i tako grade sekundarnu strukturu DNK.
RNK se po hemijskom sastavu od DNK razlikuje ne samo po pentoznom šećeru koji sadrži – ribozi, već i po azotnim bazama koje ga grade. U sastav RNK lanca od purinskih baza ulaze, isto kao kod DNK, adenin i guanin, a od pirimidinskih citozin i uracil, koji je komplementaran adeninu, umesto timina kao kod DNK. Ribonukleinska kiselina je nukleinska kiselina koja ima značajnu ulogu u kodiranju, dekodiranju, regulaciji i ekspresiji gena. RNK je posrednik i prenosilac genetičke informacije sa DNK u sintezi proteina. Molekul RNK, kao i sve nukleinske kiseline, ima dva kraja – 3' kraj i 5' kraj. Pošto su nukleotidi povezani lančano, na jednom kraju lanca ostaje slobodna hidroksilna grupa (-OH), a na drugom kraju ostatak fosfatne kiseline. OH grupa je vezana za C3' atom pentoze, pa se ovaj kraj naziva 3' krajem, a ostatak fosfatne kiseline je vezan za C5' atom pentoze, pa se ovaj kraj naziva 5' krajem molekula. Početak svakog polipeptidnog lanca je 5' kraj pošto se svi biološki i hemijski procesi u organizmu odvijaju u smeru 5'→3'. RNK je uglavnom jednolančani molekul koji nastaje povezivanjem nukleotida fosfodiestarskim vezama. Ovakva lančana struktura molekula naziva se primarnom strukturom. Jedan od osnovnih bioloških principa jeste da je struktura određena funkcijom. Stoga u velikoj meri od strukture RNK molekula zavisi njegova uloga u ćeliji. RNK u svojim različitim strukturama ima različite funkcije i uloge u svim glavnim ćelijskim procesima.
Osnovu sekundarne strukture čini dvolančana zavojnica. Dva lanca DNK su antiparalelna što znači da se naspram 5’ kraja jednog lanca nalazi 3’ kraj drugog, i obrnuto. Lanci su uvijeni jedan oko drugog tako da se duž dvolančane zavojnice prostiru dva žljeba: veliki i mali. DNK zavojnica ima celom dužinom isti prečnik. Purinske i pirimidinske baze se nalaze u unutrašnjosti zavojnice gusto spakovane jedna nad drugom, a ravni baza su normalne na osu zavojnice. Fosfatne grupe su okrenute prema spoljašnjoj strani i zajedno sa pentozama čine skelet zavojnice. Princip komplementarnosti, na kome se zasniva sekundarna struktura DNK, omogućava da redosled baza u jednom lancu automatski određuje redosled u drugom. Zato je zastupljenost adenina jednaka učestalosti timina, kao što je jednaka zastupljenost guanina i citozina
Protok genetičke informacije kroz ćeliju
Translacija
Translacija, ili sinteza proteina, je proces u kojem se genetička informacija iz redosleda nukleotida u iRNK prevodi u redosled aminokiselina u polipeptidnom lancu. Kod prokariota, translacija se odvija istovremeno sa transkripcijom jer geni nemaju introne, dok je kod eukariota translacija prostorno i vremenski odvojena od transkripcije.
Translacija se kao i transkripcija odvija u tri faze:
Inicijacija
Elongacija
Terminacija
Replikacija
Replikacija predstavlja proces dupliranja molekula DNK, pri kome od jednog nastaju dva potpuno identična molekula DNK. Replikacija se odvija u Sfazi interfaze i omogućava kasniju podelu svakog hromozoma na dve hromatide.
Transkripcija - iRNK
Informaciona RNK (iRNK) nastaje transkripcijom gena koji nose uputstva za sintezu proteina. Njena uloga je prenos genetičke informacije od DNK do ribozoma, gde se proteini sintetišu. Kodirajuće sekvence iRNK određuju redosled aminokiselina u proteinima, ali su isprekidane nekodirajućim sekvencama. Egzoni su kodirajući delovi gena, dok su introni nekodirajući. Geni s intronima nazivaju se diskontinuirani. Sinteza iRNK počinje kada ćeliji zatreba protein, a nakon što se postigne dovoljna količina, iRNK se razgrađuje.
Reverzna transkripcija- nov pogled na centralnu dogmu
Prema centralnoj dogmi molekularne biologije, genetička informacija se u procesu transkripcije prepisuje na RNK, a procesom translacije se na osnovu informacione RNK (koja služi kao matrica) sintetišu proteini. Međutim kod virusa iz grupe Retrovirusa usled delovanja enzima reverzna transkrpitaza moguća je transkripcija informacija sa RNK na DNK Reverzna transkriptaza, odnosno RNK zavisna DNK polimeraza, je enzim koji transkribuje jednolančanu RNK u jednolančanu DNK. U laboratorijskim uslovima ovaj enzim se koristi za molekularnu detekciju infektivnih agenasa u RTPCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) metodi.
Replikacija 05
Replikacija predstavlja proces dupliranja molekula DNK, pri kome od jednog nastaju dva potpuno identična molekula DNK. Replikacija se odvija u S-fazi interfaze i omogućava kasniju podelu svakog hromozoma na dve hromatide.
Semikonzervativnost
Semikonzervativnost replikacije DNK znači da se pri udvajanju DNK svaki roditeljski lanac odvaja i služi kao matrica za sintezu novog komplementarnog lanca. Tako svaki novi molekul DNK sadrži jedan stari i jedan novi lanac. Meselson-Stahlov eksperiment je potvrdio ovu teoriju. Bakterije su prvo gajene na medijumu sa teškim izotopom azota (N15), a zatim prebačene na medijum s lakim azotom (N14). Nakon jedne deobe DNK, analiza je pokazala prisustvo oba izotopa u jednakim količinama, potvrđujući semikonzervativnostreplikacije.
Bidirekciona i semidiskontinuirana
Replikacija DNK je bidirekciona, što znači da se odvija u oba smera od mesta početka, isključivo u 5'-3' smeru. Zbog antiparalelnosti lanaca, replikacija jednog lanca teče kontinuirano, dok je na drugom isprekidana. Kod prokariota, sa kružnom DNK, replikacija počinje na jednoj tački i odvija se bidirekciono sa formiranjem dve replikacione viljuške koje se kreću u suprotnim smerovima. Kod eukariota, replikacija počinje na više mesta duž hromozoma, omogućavajući brže završavanje procesa, iako se nukleotidi ugrađuju sporije nego kodprokariota.
Proces započinje dejstvom enzima endonukleaze koja zaseca jedan DNK lanac kidajući njegove fosfoestarske veze. Raskidanje vodoničnih veza omogućeno je delovanjem enzima helikaze. Raskidanjem vodoničnih veza između heterocikličnih azotnih baza, lanac se despiralizuje i omogućava se formiranje replikativnih viljuški.
Replikaciona viljuška je asimetrična jer su DNK lanci antiparalelni, a novi lanci se sintetišu u 5’-3’ smeru. Vodeći lanac se sintetiše u pravcu kretanja viljuške, dok lanac koji zaostaje ide u suprotnom smeru. DNK polimeraza, odgovorna za sintezu, prvo se veže na prajmer – oligonukeotidni lanac koji sintetiše enzim primaza. U prokariotskim ćelijama postoje tri DNK polimeraze (I, II, III), pri čemu DNK polimeraza III obavlja glavni deo replikacije, dok eukarioti imaju najmanje pet tipova, od kojih je DNK polimeraza δ najvažnija. DNK polimeraza III povezuje nukleotide fosfoestarskim vezama, prateći komplementarnost roditeljskog lanca.
DNK polimeraza III (ili DNK-poly δ kod eukariota) ima i egzonukleaznu funkciju u smeru 3’-5’. Kada naiđe na pogrešno uparen nukleotid, koristi ovu aktivnost da raskine fosfoestarsku vezu, uklanjajući grešku. Ova funkcija omogućava visoku preciznost replikacije. Lanac koji zaostaje ne sintetiše se kontinuirano, već u Okazakijevim fragmentima. Ti lanci su kraći za oko 2000 nukleotida kod prokariota i 100 kod eukariota. Za njihov nastanak potreban je veći broj prajmera, a nakon sinteze, fragmenti se spajaju enzimom ligazom, tek nakon što DNK polimeraza I ukloni RNK prajmere.
Transkripcija
Ona se, kao i svi procesi u kojima učestvuju nukleinske kiseline, vrši u 5' → 3' smeru. Proces transkripcije se odvija u tri faze: Inicijacija, Elongacija, Terminacija.
Transkripcija predstavlja proces sinteze molekula RNK na osnovu informacije sadržane u delu jednog lanca molekula DNK. To je proces u kojem se deo jednog lanca molekula DNK, po principu komplementarnih azotnih baza, transkribuje u molekul RNK. Molekul RNK prepisan sa matrice DNK naziva se transkript Transkripcijom nastaju sve vrste RNK u ćeliji i to je prvi korak u ekspresiji gena. Od suštinskog je značaja za život. Na primer, otrovna gljiva Amanita phalloides proizvodi toksin koji blokira RNK-polimerazu, zaustavljajući transkripciju, što može dovesti do otkazivanja jetre i smrti zbog nemogućnosti stvaranja novih proteina.
Fazu inicijacije karakteriše vezivanje enzima RNK polimeraze za promotor. Promotor je karakteristična sekvenca nukleotida na DNK molekulu koja sadrži mesto za vezivanje RNK - polimeraze i on se ne prepisuje u procesu transkripcije. Promotor ima dva važna regiona koje enzim RNK polimeraza prepoznaje, prvi region se nalazi na mestu -10, a drugi se nalazi na -35. Oba regiona su dužine šest nukleotida. Na poziciji -35 se nalazi 5'- GCGC -3' kutija, dok se na -10 mestu nalazi TATA blok. Cilj inicijacije je da se DNK molekul pretvori iz zatvorenog u otvoreni kompleks. Sigma faktor usmerava proces transkripcije. Kada za RNK polimerazu ne bi bio vezan sigma faktor, prepisivanje DNK bilo bi potpuno neselektivno. Faza inicijacije se završava kada sigma faktor disosuje od transkripcione mašinerije i kada se u lanac primarnog transkripta ugradi prvi nukleotid. Ova tansformacija je ireverzibilna.
U fazi elongacije RNK polimeraza (DNK zavisna RNK polimeraza) se kreće duž DNK i sintetiše RNK lanac, po principu komplementarnosti, dodajući jedan po jedan ribonukleotid na 3'-kraj rastućeg lanca RNK. Ređanje nukleotida RNK vrši se sve dok RNK polimeraza ne stigne do niza nukleotida, odnosno specifične sekvence, koji se nazivaju terminacioni (stop) signal .Najčešći stop-signal je niz od nekoliko uzastupno poređanih adenina (AAAA...). Na tom mestu se transkripcija zaustavlja, a novonastali molekul RNK se oslobađa sa matrice (do tada je bio za matricu vezan samo svojim 3' krajem). To predstavlja poslednju fazu, fazu terminacije.
Sadakadasmonaučilineštovišeoreplikaciji,vraćamose na našu metodu od interesa. Lančana reakcija polimeraze koristi dva oligonukleotida, odnosno prajmera koji su komplementarni krajevima sekvence koju želimo da umnožimo i međusobno su suprotno orijentisani. Za PCR je neophodna posebna DNK polimeraza koja je izolovana iz jedne ekstremofilne arhee, te je izuzetno pogodna za korišćenje zbog svoje termostabilnosti. Reč je o Taq polimerazi i optimalna temperatura za njenu aktivnost je 72°C. Dodatne komponentekojesupotrebnezainvitrosintezuDNKsu: DNK uzorak koji umnožavamo, prajmeri koji se unapred dizajniraju tako da ograničavaju našu željenu sekvencu, nukleotidi kao gradivna komponenta DNK, joni magnezijuma,kojisuneophodnizaaktivnostpolimeraze i sintezu DNK, kao i pufer, koji takođe obezbeđuje optimalneuslovezaaktivnostTaqpolimeraze.
Zašto je bitna termostabilnost polimeraze za PCR?
Zato što svaka faza PCR reakcije ima određeni temperaturni opseg koji je najoptimalniji za procese koji se dešavaju i te temperature su uglavnom visoke (detaljnije u nastavku teksta) i upravo Taq polimeraza uspeva da do kraja ostane aktivna i ne denaturiše se na tim temperaturama.
PCR ciklus
SvakiPCRciklussesastojiodtrikoraka: denaturacije-raskidanje vodoničnih veza između dva komplementarna lanca, kako bi se za matricuvezaliprajmeri, hibridizacije-vezivanjeprajmerazamatricu, elongacije- proces ugradnje nukleotida na 3’krajevimaprajmeraTaqpolimerazom.
Optimalan broj ciklusa je 25-40, pri čemu nakon svakog broj dobijenih DNK produkata eksponencijalno raste, jer svaki novosintetisani lanac služi kao matrica za sintetisanje u narednom ciklusu. Za otprilike dva sata trajanja PCR reakcije dobije se od milion do milijardu kopija željenog segmentaDNK.
Dizajniranje prajmera
Bitnojenapomenutidapridizajniranjuprajmera trebavoditiračunaotomeda3’-krajeviprajmera nebudumeđusobnokomplementarni,kakobi seizbeglamogućnostdaseonimeđusobno spojeumestosamatricomnašegDNKuzorka. Proizvodspajanjadvaprajmeranazivase prajmer-dajmer.Optimalnadužinaprajmeraje od18do22nukleotida,sabalansiranimGC sastavom.
Elektroforeza
Elektroforeza je metoda razdvajanja naelektrisanih supstanci na osnovu njihove brzine kretanja u električnom polju. Prva elektroforetska razdvajanja izvedena su krajem 1920-ih godina, a pionirski rad na ovom polju pripada švedskom hemičaru Arneu Tiseliusu (1902–1971).
Gel elektroforeza je osnovna tehnika u molekularnoj biologiji koja omogućava razdvajanje DNK, RNK i proteina koristeći električno polje. Ovi molekuli se kreću kroz gel, koji je najčešće napravljen od agaroze, i razdvajaju se na osnovu svojih veličina. Za razdvajanjeproteinakoristiseposebantipgela.
Princip je jednostavan: pod uticajem električnog polja, molekuli DNK se kreću kroz gel, pri čemu se manji fragmenti brže kreću od većih, jer im jelakšedaprolazekrozmrežugela.
Kretanje makromolekula
kroz gel
Pore u gelu se mogu prilagoditi različitim koncentracijama agaroze; veća koncentracija otežava kretanje,naročitovelikihfragmenata.
Brzina kretanja DNK takođe zavisi od oblika molekula. Na primer, spiralno uvijeni DNK molekuli kreću se brže krozgelnegolinearni.Linearnimolekulisaoštećenjima krećusejošsporije.
Agensi koji se dodaju radi praćenja DNK, kao što je etidijum-bromid, mogu usporiti kretanje molekula. Etidijum-bromid se umeće između baza DNK, omogućavajućivizualizacijupodUVsvetlom.
Napon električnog polja takođe utiče na brzinu kretanja. Najčešće se koristi napon od 5-8 V/cm, što omogućavakontrolisanorazdvajanjefragmenata.
Protokol
1. Priprema gela – kuva se agar sa puferom. gel se nalijeukalupiostavljadasestegne,formirajućimrežu porakrozkojećemolekulimigrirati.
2. Priprema uzorka - pre početka elektroforeze, uzorak se boji bojom, koja omogućava praćenje kretanja molekula DNK kroz gel. Ova boja se kreće malo brže od DNK, pa služi kao indikator kada treba zaustaviti elektroforezu kako DNK fragmenti ne bi izašliizgela.
3. Punjenje bunarića –uzorcisenalivajuubunariće, kao i "ladder"– referentna traka koja sadrži fragmente DNK poznatih dužina. Poređenjem uzoraka sa ladderom može se odrediti veličina DNK fragmenata u uzorku.
4. Pokretanje elektroforeze - gel se postavlja u elektroforetskukomoruispunjenupuferom,azatimse primenjuje električno polje. DNK kao negativno naelektrisan molekul kretaće se od katode ka anodi (pozitivnojelektrodi).
5. Vizuelizacija rezultata -konačanrezultatjegelsa razdvojenim DNK fragmentima. Za vizualizaciju DNK koristi se UV svetlost, pod kojom se obojeni fragmenti mogujasnovideti.
Sekvenciranje
Nakon što je reakcija gotova fragmenti se puštaju kroz dugu tanku cev sa gelom u procesu koji se naziva kapilarna gel elektroforeza. Mali fragmenti se kreću brže kroz pore gela, dok su duži fragmenti ujedno i sporiji. Kako svaki fragment pređe “cilj” na kraju cevi, on biva osvetljen laserom, što omogućava detekciju boje nukleotida. Najmanji fragmenti prelaze “cilj” najbrže, a zatim sledeći po veličini, i tako redom. Tim redosledom se detektuju i boje koje nose njihovi kranji nukleotidi, pa na taj način očitavamo DNK sekvencu nukleotid po nukleotid. Detektor registruje intenzitet fluorescencije boja i pravi elektroferogram.
DNK sekvenciranje je proces određivanja sekvence nukleotida u molekulu DNK. Sekvenciranje čitavog genoma (sva DNK jednog organizma) je kompleksan zadatak. Potrebno je iseckati DNK na manje delove, sekvencirati ih, a zatim poređati po redu. Zahvaljujući metodama koje su se razvile od 2003. godine, sada je to mnogo brži i jeftiniji proces.
Sangerovo sekvenciranjemetoda terminacije sinteze
Sangerovo sekvenciranje se zasniva na pravljenju kopija dela DNK koji želimo da sekvenciramo. Sam proces je sličan replikaciji DNK, pa se koriste DNK polimeraza, prajmer, 4 nukleotida i naravno matricakojasesekvencira.
U Sangeorvom sekvenciranju se dodaju posebni dideoksi nukleotidi. Oni se od običnih nukleotida razlikuju zato što nemaju -OH grupu na 3’C atomu šećera. U običnim nukleotidima upravo ova grupa sliži kao “kuka” za koju se kači novi nukleotid prilikom sinteze novog lanca DNK.
Jednom kada se dideoksi nukleotid ugradi u lanac, pošto nema “kuke” na kraju lanca, sinteza lanca se završava
Nakon što su sastojci dodati u smešu za sekvenciranje, ona se prvo zagreva, što dovodi do razdvajanja 2 lanca DNK matrice, a zatim se hladi kako bi se prajmer vezao za jendolančanu matricu. Kada je prajmer vezan, smeša se ponovo zagreva, što omogućava DNK polimerazi da sintetiše novi lanac DNK naspram matrice. DNK polimeraza prvi nukleotid veže za prajmer, i tako redom, sve dok se ne veže dideoksi nukleotid, umesto običnog. U tom trenutku, ne postoji mogućnost daljeg vezivanja nukleotida, pa se lanac završava dideoksi nukleotidom. Ovaj proces se ponavlja na svakom lancu matrice DNK, i odnos dideoksi i običnih nukleotida je podešen tako da se na svakoj poziciji nukleotida DNK nađe barem po jedan dideoksinukleotid. Proizvod reakcije jesu fragmentiDNKrazličtihdužinakojisezavršavaju obeleženimdideoksinukleotidima.
NGS
Sadašnjost i budućnost genomike neraskidivo je vezana za sekvencionisanje genoma primenom tehnologije nove generacije sekvencioniranja (NextGenerationSequencing,NGS).
Razvoj novih generacija sekvencioniranja doneo je značajne prednosti u odnosu na Sagerovu metodu,atosuparalelnoočitavanjevišemiliona fragmenata molekula DNK, manji troškovi, očitavanje sekvence bez upotrebe elektroforeze i uštedavremena.
Ilumina platformasezasnivanamasovnom paralelnomsekvenciranjuiširokojeprihvaćena zbogsvoje pouzdanostiivelikekoličine podatakakojemožedageneriše.
Zašto nam je bitno brzo i jeftino sekvenciranje?
Jedan od primera jeste personalizovana medicina zasnovana na genomu pojedinačnog pacijenta.
Godine 2023. korišćenjem treće generacije sekvencionisanja dostignut je davno zacrtan cilj, a to jemogućnostsekvencionisanjaindividualnihgenoma ljudi u vremenskom periodu od par dana, po ceni manjojodhiljaduameričkihdolara.
Na koji način se mapiraju modifikacije RNK?
Jedna od tehnika NGS je sekvenciranje kroz nanopore. Na membrani se nalaze proteini koji omogućavaju prolaz jednolančane RNK/DNK. Zbog toga pre prolaska molekula nukleinske kiseline kroz poru, enzim helikaza odmotava dvolančani molekul na 2 lanca. Kroz poru konstantno protiče struja. Prilikom prolaska lanca RNK/ DNK kroz poru dolazi do delimičnog blokiranja struje koja protiče kroz poru. Svaki od nukleotida RNK/DNK to radi na specifičan način, pa se tako detektuju i različiti signali za svaki od njih. Ono što je prednost ove metode jeste da se njome mogu detektovati i modifikovani nukleotidi koji drugačije od običnih blokiraju protok jona kroz poru, a takođe ovom metodom se mogu sekvencirati i mnogo duži fragmenti nego Sangerovom metodom. Nedostatak je njena manja preciznost. Ovaj proces je analogan prolasku filmske trake kroz projektor, gde svaki kadar pri prolasku delimičnoblokirasvetlost,panablokiranimdelovima nastajesenka,kojumividimokaosliku.
Tehnologija rekombinantne DNK
Termini tehnologija rekombinantne DNK", „kloniranje DNK", kloniranje gena", molekularno kloniranje", odnose se na proces prenosa odabranog fragmenta DNK iz jednog organizma u samoreplikujući genetički element, kao što je bakterijski plazmid. Odabrani fragment DNK može dalje biti umnožavan u novom domaćinu i na taj način se formira mnogo identičnih kopija fragmenta - klonovi. Samoreplikujući elementi, kao što su plazmidi, virusi, veštački bakterijski hromozomi (BACs), veštački kvaščevi hromozomi (YACs), nazivaju se vektori za kloniranje. Ovi vektori omogućavaju da odabrani fragment, koji nosi određeni gen ili neku drugu sekvencu, bude umnožen - kloniran, i da se na ovaj način dobije dovoljno identičnog materijala zadaljeanalize.
Fragmenti DNK koji se ugrađuju ili insertuju u vektor mogu biti delovi genoma koji nose gene, cDNK, fragmenti dobijeni PCR reakcijom, sintetički oligonukleotidi. Posle obrade istim restrikcionim enzimima i ligacije fragmenta u plazmid (rekombinantna DNK), sledi unošenje vektora (plazmid) u ćeliju domaćina, kao što je E. coli. Proces transformacije kompetentnih ćelija E. coli može se obaviti na više načina, a najčešće primenjivanisuelektroporacijaitoplotnišok.
Protokol
Osnovni postupci u molekularnom kloniranju su: izolovanje fragmenta DNK koji sadrži gen od interesa upotrebom restrikcionih endonukleaza, spajanje datog fragmenta sa vektorom prethodno obrađenim istim restrikcionim enzimom - ligiranje fragmenta. Kad je fragment ligiran - spojen sa vektorom, dobijeni molekul se naziva rekombinantni ili rekombinovani molekul DNK. Vektor se dalje unosi u odgovarajućeg domaćina i fragment DNK se umnožava zajedno sa umnožavanjem DNK domaćina. Plazmidi kao vektorimogudanosedo20.000bpstraneDNK.
Vektori
U molekularnoj biologiji se najčešće kao vektori koriste plazmidi E. coli. E. coli je štapićasta bakterija, koja pored cirkularne genomske DNK sadrži i plazmide. Ova bakterija može da raste na minimalnom medijumu, a u bogatom medijumu raste veoma brzo i broj bakterija se udvostručavasvakih20-30minuta.
Genomika i osnovi bioinformatike
Genomika je naučna oblast koja je nastala kao rezultat dostignuća molekularne biologije i razvoja tehnika kojima je moguće odrediti redosled nukleotida u molekulima nukleinskihkiselina.Predmetistraživanjagenomikesu,pre svega, genomi, odnosno molekuli DNK pojedinačnih vrsta. Istraživanja genomike su po svojoj prirodi multidisciplinarna i obuhvataju: određivanje primarne strukture genoma; utvrđivanje broja i strukture gena, ispitivanje profila ekspresije gena; i određivanje strukture i funkcije proteina. Idealan eksperiment u okviru genomike sastoji se iz tri dela: sekvenciranje molekula DNK , analiza profila genske ekspresije i analiza proteina. Na osnovu dešifrovanjagenomarazličitihvrstarazvilase novanaučna disciplina komparativna genomika. Osnovni cilj ove naučnedisciplinejeupoređivanjegenomarazličitihvrstau cilju identifikacija njihovih sličnosti i razlika, naročito na nivougenaidrugihfunkcionalnihelemenatagenoma,kao štosupromotoriiregulatornielemenati.
Projekat sekvenciranja genoma čoveka
Početak 21. veka obeležen je završetkom najvećeg i najskupljegnaučnogprojektaizoblastimolekularnebiologije„dešifrovanje“ sekvence genoma čoveka. Internacionalni konzorcijum „Genom čoveka“ rezultate svoga rada objavljuje 15. februara 2001. godine u časopisu „Nature“. Samo dan kasnije tim naučnika kompanije Celera Genomics objavljuje svoje rezultate „dešifrovanja“ genoma čoveka u časopisu „Science“. Tom prilikom data je i preliminarna procena da genomi različitih individua poseduju 99,9% identičnu sekvencu. Aprila 2003. godine dobijena je kompletna sekvenca genoma čoveka, dok je broj gena procenjen na oko 30.000uoktobru2004.godine.Odtada,svakegodinesvedoci smonoverevizijebrojagenačoveka.
Mapiranje genoma
Bioinformatičke baze podataka
Dodanas,kompletiranojesekvenciranjevišeod 34.391 genoma,apreko386.000projekatagenomanalaziseu formi permanentnog drafta. Najpoznatija baza podataka nalazi se na sajtu Američkog nacionalnog centra za biotehnološke informacije. Na ovom sajtu dostupnajeisekvencagenomačoveka.
Brojni timovi naučnika danas su angazovani na projektupoznatompodakronimom
ENCODE (eng. The Encyclopedia of DNA Elements, ENCODE). Cilj projekta je registrovanje svih funkcionalnih elemenata genoma čoveka, a to su segmenti genoma koji kodiraju za definisani produkt (RNK i/ili protein) i elementi genoma koji pokazuju “reproducible biochemical signature" (sekvence za vezivanjeproteinailisekvenceodgovornezaformiranje specifičnih struktura hromatina). Krajnji cilj ENDODE je utvrđivanje obrasca ekspresije genoma u svim tipovimaćelijačovekaitousvimfazamarazvića. Skup tehnika koje se primenjuju za određivanje lokacije pojedinačnih DNK markera u specifičnim regionima hromozoma, i njihove međusobne udaljenosto. Kao rezultat nastaje mapa genoma. Može imati različite rezolucije. RezolucijamapejenajmanjaudaljenostizmeđuDNKmarkera koja se može odrediti mapiranjem; mapiranje najveće rezolucijeod1bppostižeseodređivanjemkompletnesekvence genoma.Genetičko mapiranje obuhvata skup tehnika za utvrđivanje relativnih lokacija DNK markera na osnovu učestalosti njihove rekombinacije. Fizičko mapiranje obuhvata skup tehnika za utvrđivanje stvarne, precizne lokacije DNK markeraugenomuinjihovefizičkeudaljenosti.
Literatura:
Savić-Pavićević, D. , Matić, G. (2020). Molekularna biologija 1 (2. izd., стр. 367). NNK internacional.
Brajušković, G. (2010). Molekularna genetika (стр. 246). Biološki fakultet Univerziteta.
Radović, S. , Lozo, J. , Keckarević, D. (2019). Eksperimentalna biohemija: praktikum (4. izmenjeno izd., стр. 146). Univerzitet, Biološki fakultet.
Savić-Pavićević, D. (2016). Анатомија
научили у геномској ери (стр. Стр. 21-57). [САНУ].
Ilustracije:
https://www.yourgenome.org/ https://chem.libretexts.org/ https://commons.wikimedia.org/
Korisni linkovi:
https://biologijakp.com/ https://molekularneprice.biologijakp.com/ https://molekularna.biologijakp.com/ https://www.cpn.edu.rs/ https://www.labxchange.org/ https://www.genome.gov/ https://www.uniprot.org/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
Zahvalnica:
Centar za promociju nauke
Centar za stručno usavršavanje Niš
Centar za obrazovanje Kragujevac Medijski sponzori projekta: Niške Vesti, Gradski portal 018, Biološki blog Tamara Živić, embriološkinja
