Tecnología y Calidad de la Leche - Guía de Trabajos Prácticos – 2012
ÁREA DE TECNOLOGÍA Y CALIDAD DE LA LECHE
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INTRODUCCION El análisis de la calidad de leche cruda es una práctica cotidiana y muy utilizada en el sector lácteo. Éste se realiza con diferentes objetivos como el pago al productor según la calidad remitida, control de la materia prima que ingresa a la usina, direccionamiento de leche de diferente calidad a distintos productos, entre otros. La obtención de resultados válidos surge de una secuencia de pasos que se inicia con una correcta toma de muestra de leche y finaliza con la comunicación de los resultados en tiempo y forma al usuario final.
TOMA DE MUESTRA El muestreo de la leche constituye el primer eslabón que condiciona el logro de buenos resultados, para ello es necesario que la muestra cumpla con dos requisitos básicos:
Ser representativa del volumen total de leche de donde se extrajo.
Ser conservada y acondicionada correctamente para mantener sus características originales hasta su procesamiento en el laboratorio.
EXTRACCIÓN DE MUESTRAS Métodos estándar para la toma de muestra de leche (FIL-IDF 50B 1995) EQUIPO DE MUESTREO 1. Muestreo para examen microbiológico. Todo el equipo de muestreo deberá ser estéril. 2. Muestreo para análisis químico y/o físico. Es deseable disponer de material esterilizado, en caso de no ser así, este deberá estar limpio y seco y no deberá influir en las propiedades y composición del producto. TOMA DE MUESTRA DE LECHE Y PRODUCTOS LACTEOS LIQUIDOS Material para la toma de muestra Agitadores
Los agitadores (Fig. 1) para la mezcla de líquidos a granel deben tener una superficie suficiente para remover debidamente el producto sin que se produzca el batido de la materia grasa. Dadas las diversas formas y dimensiones de los recipientes, no es posible recomendar un tipo particular de agitador adaptable a todas las circunstancias; pero deberá estar diseñado de manera que no dañe el interior de los recipientes durante la agitación y permite para evitar fenómenos de oxidación.
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Se puede recomendar un tipo de agitador que se adapte a tarros lecheros y un agitador conveniente para los camiones cisternas y cisternas de leche. Para mezclar el contenido de grandes recipientes se recurrirá a una agitación mecánica aire comprimido limpio. Se utilizará una presión atmosférica y un volumen de aire mínimo para evitar fenómenos de oxidación.
Fig. 1: Agitador utilizado previo a la toma de muestra Cucharones para toma de muestra Para la toma de muestras luego de la agitación, se utilizan cucharones con diferente formato según se muestra en la Fig. 2. Los mismos deben ser esterilizados con alcohol (de la misma forma que los agitadores) para no contaminar la muestra o incorporar microorganismos al recipiente donde se almacena la materia prima.
Fig. 2: Diferentes modelos de muestreadores / cucharones para la toma de muestra de leche Recipientes La capacidad del recipiente no podrá ser inferior de 50 cc. La capacidad de los mismos debe ser tal que prácticamente se llenen con la muestra y permitan una buena mezcla del contenido antes del análisis, evitando el batido durante el transporte. Especificaciones sobre los envases: Los envases y tapas deberán ser de forma y material adecuado para proteger la muestra y que no causen en ella cambios que afecten el resultado de los análisis o
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exámenes posteriores. Los materiales apropiados incluyen vidrio, algunos metales y plásticos. Si es transparente, deberá ser almacenado en un lugar oscuro. Los envases y tapas deberán estar limpios y secos ya sea estériles o no (dependiendo del análisis a realizar). Los más utilizados son envases descartables de plástico (Fig. 3).
Fig. 3: Envases plásticos más utilizados para toma de muestra de leche fluida
TECNICAS DE TOMA DE MUESTRAS 1. De tarros Lecheros Es indispensable mezclar adecuadamente la leche de los tarros lecheros si se quiere obtener una muestra representativa. Mezclar vigorosamente aproximadamente 20 veces mediante el agitador para asegurar un reparto uniforme de la materia grasa. Cuando la leche a examinar se encuentra en más de un recipiente, se tomará una cantidad representativa de cada uno, después de haber mezclado su contenido, y se anotará la cantidad de leche a la que corresponde cada muestra. 2. Del tanque de frío En los tanques de frío (Fig. 4), la leche se agitará mecánicamente hasta que se obtenga una homogeneidad suficiente durante 5 minutos como mínimo. Si la cisterna está provista de un sistema de programación periódica de agitación, dicho tiempo será más corto (1 a 2 minutos). La muestra de leche se tomará de punta de manguera de descarga al camión cisterna cuando queda en el tanque de frío la mitad del volumen total de leche (fig. 4), a fin de obtener una muestra representativa.
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Fig. 4: Imagen de camión cisterna y dibujo de la toma de muestra de punta de manguera Sin embargo, puede ocurrir que la toma de muestra no coincida con la presencia del camión cisterna en el lugar, en cuyo caso debemos realizar los pasos mencionados anteriormente y tomar la misma desde la escotilla (abertura) ubicada en la parte superior del tanque de frío. (Fig. 5, derecha). Si el volumen de leche representa menos del 15% de la capacidad de la cisterna, el agitado se efectuará a mano.
Fig. 5: Tanques de frío. En la imagen de la derecha se observa la toma de muestra desde la escotilla
3. De grandes recipientes, tanques de almacenamiento, camiones cisternas En cada caso se mezclará cuidadosamente la leche antes de efectuar el muestreo, según el método apropiado, por ejemplo, agitación mecánica, agitación por aire comprimido limpio, agitadores. El grado de agitación estará en función del tiempo que ha reposado la leche. Cuando el agitado es manual, se hacen las siguientes recomendaciones: 1. Cuando el muestreo se efectúa dentro de la media hora siguiente al llenado del recipiente, se agitará vigorosamente la leche durante 5 minutos como mínimo. 2. Cuando la leche ha permanecido más tiempo en la cisterna, se agitará como mínimo durante 15 minutos
PRESERVACION, ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE DE MUESTRAS La temperatura de almacenamiento deberá estar comprendida entre 0-4 º C. Esta deberá alcanzarse tan rápidamente como sea posible antes del muestreo. Preferentemente las muestras serán enviadas al Laboratorio de ensayo dentro de las 24 horas después del muestreo, se utilizaran conservadoras de telgopor u otro material aislante y refrigerante, acompañada por la información necesaria. La muestra podrá ser conservada utilizando productos químicos apropiados y autorizados, aunque esto no reemplaza la refrigeración. El conservante químico (Ej., azidiol, bronopol, etc.) será provisto por el laboratorio según el tipo de análisis a efectuar. El laboratorio será el encargado y
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responsable de dosificar el conservante químico dentro del envase, si esto no es posible, la persona que lo haga deberá respetar las indicaciones del laboratorio.
PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA EN EL LABORATORIO EXAMEN DEL ENVASE Se controlará la integridad y el estado de conservación del envase y su higiene, en lo que corresponde a los envases de retorno. Además tratándose de papel resistente, plástico, etc., interesa establecer las influencias recíprocas que pueden existir entre los constituyentes del envase y del producto. HOMOGEINIZACIÓN DE LA MUESTRA PARA EL ANÁLISIS Se lleva la muestra a la temperatura del Laboratorio (20 – 25 °C) y se homogeneiza invirtiendo repetidamente (20 - 25 veces) el recipiente o trasvasando (sin agitación fuerte para evitar la formación de espuma), a los efectos de distribuir bien la grasa, especialmente si no se trata de leche homogeneizada. A veces es necesario elevar la temperatura a 35 - 40°C, para homogeneizar el producto y luego enfriar a la temperatura indicada precedentemente (esto no debe hacerse cuando se requieran análisis microbiológicos). El análisis debe efectuarse de inmediato; en caso contrario se debe mantener la muestra en el refrigerador a una temperatura inferior a 10°C o se le debe agregar algún conservante que no cause modificaciones en los datos analíticos.
TODA DETERMINACIÓN CUANTITATIVA, DEBE SER PRECEDIDA DE UNA NUEVA HOMOGENEIZACIÓN. La leche es una emulsión de grasa en forma de glóbulos y es también una suspensión de proteínas en suero formada por una solución que contiene principalmente lactosa y sales minerales. A ello se añaden numerosos componentes en cantidades pequeñas: vitaminas, enzimas, etc. La leche es un producto que se altera muy fácilmente, bajo la acción del calor numerosos microorganismos pueden multiplicarse en ella, en especial aquellos que descomponen la lactosa produciendo ácido y provocando la coagulación de una parte de la proteína. Su uso para el consumo y para la industria exige medidas para prevenir la acción de los microorganismos y cortar la acción de las enzimas. Se puede definir a la LECHE como:
Es el producto íntegro y fresco del ordeñe completo de una o varias vacas sanas, bien alimentadas y en reposo, exento de calostro y que cumpla con las características físicas y bacteriológicas que se establecen. Se observan diferencias en la composición química porcentual de la leche de diferentes especies de rumiantes como se muestra en la tabla Nº 1
Tecnología y Calidad de la Leche - Guía de Trabajos Prácticos – 2012 Tabla N° 1 Composición química de la leche de diferentes especies de rumiantes Composición por 100g Extracto seco Total CABRA 12,8 VACA 12,5 OVEJA 19,1 BÚFALA 17,8 Fuente: Alais, 1985
Materia Grasa
Proteína
Lactosa
Sales
3,8 3,5 7,5 7,5
3,4 3,3 5,7 4,6
4,5 4,7 4,5 4,7
0,8 0,8 1,1 0,8
Estos valores pueden variar según la raza, época del año, época de lactancia, alimentación, salud del animal, etc. Tenga en cuenta que cuando no se explicita de que especie se esta hablando corresponde a leche bovina. EVALUACION DEL ESTADO DE CONSERVACIÓN Se establecerá si la leche en examen se halla alterada mediante el examen de los caracteres organolépticos, físico-químicos y microbiológicos establecidos por la reglamentación vigente. También se deberá tener en cuenta la contaminación con sustancias tóxicas, gérmenes patógenos, presencia de sustancias extrañas como calostro, sangre, antibiótico, medicamentos, antisépticos etc. ni adulterantes similares a las de sus constituyentes: suero, almidón, colorantes entre otros. EXAMEN ORGANOLÉPTICO
CARACTERES NORMALES
ASPECTO: líquido heterogéneo (contiene componentes en suspensión, en emulsión, en suspensión coloidal y en solución). Posee una fluidez determinada, pero menos móvil que el agua. Su aspecto suele variar con el contenido graso. COLOR: blanco opaco ligeramente amarillento, debido a la suspensión de la grasa en forma de glóbulos y al caseinato de calcio en suspensión coloidal. Suele variar con el contenido de caroteno y xantofila, aunque en algunas especies como la cabra carece de pigmentos. SABOR: característico suave, débilmente azucarado con la propiedad de absorber y retener el gusto de las esencias que se hallan a su alrededor. OLOR: débil, parecido, pero más suave, que el de las glándulas del animal vacuno.
CARACTERES ANORMALES
ASPECTO: líquido heterogéneo, con características especiales: leche cuajada, grumosa, coposa, gomosa, mucosa, etc. COLOR: marcada coloración amarilla (¿calostro?), rosada (¿sangre?), etc. SABOR: amargo (por alimentos: chamico, alcachofas, forrajes ensilados), rancio (presencia de gérmenes ajenos ó extraños a la leche), ácido (productos de fermentación: ácido láctico, cítrico, etc.). OLOR: aromático, fétido, pútrido, rancio, agrio. Todo signo anormal observado en el examen organoléptico se deberá constar en el protocolo analítico.
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EXAMEN FISICO QUIMICO ACIDEZ La determinación de la acidez tanto cualitativa como cuantitativamente es un dosaje importante para determinar la aptitud de la leche para el consumo y su industrialización; ya que un exceso de acidez puede provocar una precipitación de las proteínas en las máquinas pasteurizadoras. La leche tiene elementos ácidos como el ácido carbónico, ácido cítrico, ácido fosfórico, caseína, y componentes básicos como el óxido de sodio, potasio, calcio, etc. Normalmente la cantidad de elementos ácidos y básicos casi están en equilibrio. De esto se deduce que cuando se toma la acidez con papel de tornasol de una reacción anficromática, es decir reacción ácida y básica a la vez. Pero tomada con aparatos electrónicos vamos a encontrar que el pH tiene variaciones que van de 6,6 a 6,8. La leche fresca normal carece de ácido láctico. Bajo la influencia de los gérmenes que la invaden muy rápidamente, la lactosa presente se convierte en ácido láctico, este ácido junto con los que naturalmente tiene la leche, conforman lo que se denomina ACIDEZ. Para determinar la acidez de la leche deben pasar un par de horas, nunca recién ordeñada. La acidez de la leche puede ser determinada por cuatro métodos diferentes: 1) Prueba del alcohol 2) Prueba de la ebullición 3) Medición del pH: ACIDEZ ACTUAL o IONOMÉTRICA 4) Acidez por titulación: ACIDEZ TOTAL o TRITRIMÉTRICA 1) PRUEBA DEL ALCOHOL Es una prueba de alto valor práctico, eficiente para obtener una rápida orientación de algunas alteraciones de la leche y para prever la coagulabilidad de la misma por efecto del calor. Contribuye también a descubrir las leches anormales, por ej. el calostro, la leche del final del ordeño, o la leche cuyo contenido mineral se ha alterado, ya que resulta más coagulable que la leche normal. Se emplea también para diferenciar leches con elevado grado de acidez, leches viejas o mal conservadas, leches viejas mezcladas con frescas, leches con desequilibrios minerales. Hay que tener en cuenta que cuando se hace esta prueba en leches de acidez normal y que no obstante precipitan, puede deberse a un exceso de calcio proveniente de la alimentación. Principio del método En esta prueba, el alcohol activa el poder precipitante del ácido láctico sobre las proteínas del suero (principalmente la caseína), evidenciándose por la presencia de grumos. Material necesario: Tubos de ensayo. Pipetas.
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Reactivos necesarios: Alcohol 68° - 70° Procedimiento: 1. Mezclar en un tubo de ensayo cantidades iguales de alcohol y leche. 2. Invertir varias veces el tubo y observar las paredes del mismo. 3. Si se observan grumos, el resultado es positivo. Estamos en presencia de leche ácida. 2) PRUEBA DE LA EBULLICIÓN Principio del método Un determinado volumen de leche se somete a altas temperaturas y se observa si hubo o no coagulación de las proteínas sobre las paredes del tubo. Material necesario Tubos de ensayo. Pipetas. Mechero. Procedimiento: 1. Colocar una muestra de leche en un tubo de ensayo. 2. Calentar a fuego directo hasta ebullición. 3. Observar el aspecto de la leche haciéndola deslizar a ésta sobre las paredes del tubo, circular y longitudinalmente. 4. La coagulabilidad de la leche (precipitación de caseína) o el comienzo de su floculación, con indicio de su elevada acidez y por lo tanto esta leche se conservará poco y no es apropiada para ser industrializada. Son leches ácidas, viejas o mal conservadas. 3) DETERMINACIÓN DEL pH El pH normal de la leche es 6,6 - 6,8. Se lo puede determinar de varias formas: 1) Utilizando un aparato electrónico (pHmetro) o potenciómetro. 2) Utilizando papeles indicadores de pH. 3) Utilizando reactivos indicadores de pH 4) DETERMINACIÓN DE LA ACIDEZ TITULABLE La acidez titulable de la leche es la acidez expresada convencionalmente como contenido de ácido láctico y determinada mediante procedimientos normalizados. Se puede realizar a los siguientes tipos de leche: leche fresca, leche homogeneizada (pasteurizada o esterilizada), leche descremada y semidescremada. Principio del método: Un volumen conocido de la muestra se titula con una solución alcalina de concentración determinada, con ayuda de un indicador de cambio de pH, el que indica el punto final de la titulación, que será aquel en el cual las cargas acidas y básicas están en equilibrio.
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Instrumental: Erlenmeyer de 125 ml Pipeta volumétrica de 10 ml. Bureta de 10 ml Reactivos: Solución Dornic 0,111 N de NaHO (1 ml de esta solución equivale a 0,01 g de ácido láctico). Solución indicadora de fenolftaleína al 2% en alcohol etílico. Procedimiento: 1. Medir 10 ml de leche con pipeta volumétrica y colocarlos en un Erlenmeyer de 135 ml. 2. Añadir 3 gotas de sol. de fenolftaleína al 2%. 3. Valorar con sol. 0,111 N de NaHO hasta aparición de una débil coloración rosada que persista como mínimo durante 30 segundos. 4. Leer en la bureta el volumen de solución empleada. 5. En la práctica se acostumbra a expresar la acidez en grados Dornic, se utiliza para ello la siguiente ecuación: A= V x 10 A= acidez titulable de la leche, expresada en grados Dornic. V= volumen de la sol. NaHO empleados en la titulación, en ml
También puede expresarse como contenido en acido láctico para lo cual se utiliza la siguiente ecuación % acido lactico= V /10
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PAGO POR CALIDAD DE LA LECHE El sistema base de pago, incluye la calidad composicional, higiénica y sanitaria, además del volumen y la temperatura de entrega de leche.
PARÁMETROS QUE SE TIENEN EN CUENTA PARA LA BASE DEL PAGO: 1. CALIDAD HIGIÉNICA CALIDAD MICROBIOLÓGICA: RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS (UFC/ml) LIBRE DE CONTAMINANTES: INHIBIDORES AGUADO
2. CALIDAD SANITARIA. RECUENTO DE CELULAS SOMÁTICAS/ml (RCS) SANIDAD (libre de Brucelosis y Tuberculosis)
3. CALIDAD COMPOSICIONAL PROTEINA (%) GRASA BUTIROSA (%) VALORES ESPERADOS PARÁMETRO
VALORES ESPERADOS
UFC/ml
25.000
RCS/ml
200.000
TEMPERATURA
4-5ºC
SANIDAD ANIMAL Brucelosis Tuberculosis
Libre Libre
INHIBIDORES
Ausencia
CRIOSCOPÍA
- 0,520ºC
1. CALIDAD HIGIÉNICA CALIDAD MICROBIOLÓGICA RECUENTO TOTAL DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS VIABLES (UFC/ml).
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Método de referencia de recuento en placa: Este método se basa en la presunción de que cada célula bacteriana puede crecer en un medio de cultivo sólido formando colonias. De acuerdo con este criterio en número de colonias desarrolladas en un medio de cultivo sólido puede corresponder al número de células bacterianas viables presentes en una cantidad determinada de muestra que haya sido inoculada. El número de bacterias aerobias mesófilas encontrado en los alimentos es uno de los indicadores microbianos de calidad de los mismos Este índice no es válido para alimentos fermentados: queso, leches fermentadas, yogur, manteca. Esta determinación se utiliza para: Verificar la eficacia de los sistemas de limpieza y desinfección y, averiguar la temperatura a que fueron sometidos los alimentos durante los procesos de tratamiento industrial, transporte y almacenamiento. Tener una idea sobre la alteración incipiente de los alimentos, de su probable vida útil, de la descongelación no controlada de los alimentos congelados o de las fallas en el mantenimiento de la temperatura de refrigeración en los alimentos refrigerados.
Materiales: Equipamiento para mezclas: mezcladores rotativos, mixer (trabaja bajo el principio de rotación excéntrica del contenido de los tubos), frascos o botellas con capacidad suficiente para contener los 90 ml del diluyente de la dilución inicial. Placas de Petri (100 x 15 mm). Pipetas bacteriológicas de 1 ml, 5 ml y 10 ml. Baño de agua regulado a 44 - 46ºC para mantener el agar fundido. Estufa de cultivo regulada a 35 - 37ºC. Contador de colonias. Agar de recuento. Procedimiento: 1. Agitar la muestra invirtiéndola 25 veces en forma rápida de manera que los microorganismos estén uniformemente distribuidos en la misma. El intervalo entre la mezcla y la toma de porción de muestra no debe exceder los 3 minutos Tomar 1 ml de muestra y agregarlo a 9 ml del diluyente a utilizar. El más adecuado es la solución de peptona 0,1%, ( se pueden utilizar otros diluyentes como: peptona/sol. salina, sol. Ringer concentrada al cuarto, sol. buffer de fosfato), 10 ml de muestra a 90 ml de diluyente ó 11 ml de la muestra a 99 ml de diluyente. Agitar esta primera dilución (por ej. 25 veces durante 10 seg. ). Es así obtenida la dilución 1/10. 2. Diluciones decimales siguientes: Transferir por medio de una nueva pipeta 1 ml de la primera dilución a otro tubo de 9 ml de diluyente evitando el contacto de la pipeta con el diluyente. Para cada dilución se debe usar una nueva pipeta. Mezclar cuidadosamente, aspirando 10 veces con una nueva pipeta o usando un agitador mecánico por 5 ó 10 seg. para obtener la dilución 1/100. Repetir las operaciones usando la dilución 1/100 para obtener diluciones 1/1000. 1/10000, etc. hasta obtener el número adecuado de microorganismos. 3. Duración del procedimiento:
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El tiempo transcurrido entre la medición inicial de la muestra o el final de la preparación de la sol. primaria y el mezclado de las diluciones no debe ser mayor que 15 minutos Siembra en placas de Petri: Pipetear por duplicado a placas de Petri estériles alícuotas de 1 ml a partir de dilución 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000 y 1/100000. Se sugiere esta serie de diluciones cuando no se conoce el rango aproximado del número de bacterias. Este proceso se realiza usando diferentes pipetas esterilizadas con las distintas diluciones. Sí se puede utilizar la misma pipeta estéril si se trabaja de la mayor dilución a la menor dilución. Agregado del medio de cultivo: Licuar el agar de recuento (agar nutritivo, Plate Count) en un baño de vapor o de agua hirviente, sin exponerlo a tal calentamiento por un período prolongado. Templar el agar a 44 - 46ºC y controlar cuidadosamente la temperatura para evitar la muerte de las bacterias en la muestra diluida. Agregar rápidamente a las placas el agar licuado y templado de manera de obtener una capa de 3 ó 4 mm de espesor. Mezclar cuidadosamente las alícuotas con el agar mediante movimientos de vaivén y de rotación de las placas de Petri (en favor y en contra de las agujas del reloj y en cruz) con el objeto de obtener las colonias uniformemente dispersas después de la incubación. Para control de esterilidad, adicionar a placas de Petri, agar sin inocular y agar inoculado con el diluyente. Mantener las placas sobre una superficie horizontal y limpia hasta que el medio se solidifique, luego invertirlas y llevarlas a estufa de cultivo durante 48 ± 3 horas. Recuento de colonias en placas: Seleccionar dos placas correspondientes a una dilución que contenga entre 30 y 300 colonias. Tomar la media aritmética de los 2 recuentos y multiplicar por el factor de dilución (recíproco de la dilución utilizada). Informar según el caso, el resultado como número de microorganismos aerobios mesófilos por ml ó gramo.
Ejemplo: dilución 1/100. Placa 1: 72 colonias x 100 = 7200 y placa 2: 77 colonias x 100 = 7700 Se promedia:
(7200 7700) 7450 2
Se informa 7450 colonias /g ó ml
El Código Alimentario Argentino en el art. 558 inciso A, establece las exigencias microbiológicas para la leche de consumo: Leche Entera Pasteurizada, exige que el Recuento total en placa sea menor de 50.000 UFC/ml (desde abril a septiembre inclusive) y menor de 100. 000 UFC/ml (desde octubre a marzo inclusive). Resulta importante aclarar que las exigencias establecidas en el CAA para este parámetro se encuentran totalmente desfasadas de la realidad: Las Usinas consideran que una LECHE CRUDA es de buena calidad, cuando los recuentos en placa son < de 25.000 (UFC/ml). Valores entre 50.000 y 100.000 UFC/ml se los considera elevados y son castigados o no bonificados al momento del pago de leche por calidad.
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Recordar: El valor normal/ esperado para LECHE CRUDA, es de 25.000 (UFC/ml)
LIBRE DE CONTAMINANTES: DETECCION DE INHIBIDORES EN LECHE Existen TEST cualitativos (microbiológicos y enzimáticos) listos para usar en la detección de sustancias inhibidoras en leche. La aplicación de tratamientos antibióticos de enfermedades infecciosas como la mastitis en rodeos lecheros requiere respetar el período de retirada en leche de los animales tratados. En circunstancias normales, las vacas en tratamiento deben ser aisladas durante un cierto período de tiempo, antes de ser ordeñadas (4-5 días aprox.) variando según tipo de antibióticos utilizados, vía y dosificación aplicada. Si este período no es respetado los residuos del antibiótico pasan a la leche. Las penalizaciones por detección positiva de antibióticos son, a menudo, severas. Los residuos de antibióticos plantean un problema importante a la industria láctea, ya que pueden inhibir los cultivos starter en la elaboración de queso y yogur. Aún más importantes y severas, son las consecuencias que afectan a la salud humana, ya que pueden causar resistencia a los antibióticos, alergias e hipersensibilidad. Alcance: Estos kits se pueden utilizar para la detección de residuos antimicrobianos en leche de vaca, cabra y oveja incluyendo leche cruda, leche sometida a un tratamiento térmico y leche en polvo. Fundamento: Los tubos contienen agar pre-sembrado con esporas de Bacillus stearothermophilus var. calidolactis que contiene además un azúcar fermentable (glucosa) y un indicador de pH (Púrpura de Bromocresol). En ausencia de sustancias antimicrobianas en la muestra de leche la espora del bacilo germina y metaboliza el azúcar. El ácido láctico producido por la fermentación de la glucosa hace virar el color violeta del indicador púrpura de bromocresol a un color amarillo. Procedimiento:
Agregar con una pipeta 100µl de la muestra de leche directamente sobre la superficie del agar.
Incubar en una estufa o en baño María a 64ºC±1ºC durante 230 hs-3hs. La leche difunde rápidamente a través del agar.
Lectura:
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Amarillo : Negativo. Ausencia de residuos de antibióticos. Violeta : Positivo. Presencia de residuos de antibióticos. Existen también en el mercado otros kits basados en métodos enzimáticos.
A. DETERMINACIÓN DEL DESCENSO CRIOSCÓPICO DE LA LECHE FLUIDA. Objetivo: Determinar el descenso crioscópico, en grados centígrados, de la leche fluida. Definición: El descenso crioscópico de la leche es el valor, expresado en ºC, del descenso de la temperatura de congelación de la misma, respecto del agua. Alcance: El método es aplicable a leche cruda, pasteurizada y esterilizada; entera o parcialmente descremada. Principio del método: La leche es sobreenfriada a una temperatura apropiada, para luego inducir su cristalización repentina por vibración mecánica. Esto provoca que la temperatura se eleve debido al calor de fusión desprendido, hasta alcanzar un plateau, que corresponde al punto de congelación de la muestra. El aparato se calibra con soluciones estándar que tienen un punto de congelación conocido. Equipos y materiales de Laboratorio: 1. Crióscopo automático ADVANCED modelo 4DII calibrado contra soluciones patrón. 2. Tubos de ensayo de vidrio de 50,8 ± 0,1 mm de alto, 16,0 0,1 mm de diámetro externo y 13,5 ± 0,1 mm de diámetro interno. 3. Pipeta aforada de 2 ml de capacidad. Expresión de los resultados: El resultado final se expresa en ºC. Con 3 cifras decimales y será el promedio de dos determinaciones. Los duplicados no deben diferir en más de 0,002ºC.
El valor normal de descenso crioscópico en leche cruda es de –0,520ºC.
B. DETERMINACIÓN DE DENSIDAD EN LECHE FLUIDA Terminología: Densidad relativa: es la relación entre las masas de iguales volúmenes de leche y agua destilada consideradas ambas a una determinada temperatura.
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En el caso de la leche, la temperatura elegida es de 15°C, ya que así lo reglamenta el Código Alimentario Argentino (C.A.A.). Principio del método: En esta determinación se utiliza un densímetro de flotación provisto de un vástago calibrado a 15°C. El fundamento de su empleo está basado en una aplicación del principio de Arquímedes. La escala cubre un rango de densidades que va desde 1,025 a 1,035 o de 1,015 a 1,040. En algunos casos las graduaciones solo indican las milésimas de la densidad relativa (los dos últimos dígitos), debiéndose convertir la lectura en valores de densidad relativa mediante un sencillo procedimiento, por ejemplo, un valor leído de 28 corresponde a una densidad relativa de 1,028. Generalmente el mismo vástago posee un termómetro que permite determinar simultáneamente la temperatura de la muestra a la que se realiza la experiencia. Al valor de la densidad relativa obtenido se le efectúa posteriormente la corrección por temperatura según las tablas confeccionadas al efecto. Frecuentemente estas son provistas por el fabricante junto con el lactodensímetro. Procedimiento: 1. Llevar la muestra a una temperatura que oscile entre 10 y 20 °C. Si no se puede homogeneizar, se calienta a 40°C y se enfría inmediatamente a 15°C. 2. Manteniendo inclinada la probeta para evitar la formación de espuma, verter la muestra hasta llenar la probeta completamente. Debe evitarse tomar la densidad de una muestra que no haya desbordado, al introducir el lactodensímetro. 3. Sumergir suavemente el lactodensímetro hasta que esté cerca de su posición de equilibrio e imprimirle un movimiento de rotación para impedir que se adhiera a las paredes de la probeta. 4. Esperar que quede en reposo sin rozar las paredes de la misma. 5. Leer la graduación correspondiente en el lactodensímetro juntamente con la temperatura a que se halla la muestra. 6. Buscar en tablas el valor correspondiente a la corrección por temperatura.
El valor normal de la densidad de leche de vaca a 15°C es de 1,028 a 1,034
Componentes de la leche que originan la densidad: La densidad de la leche es la consecuencia del promedio de densidad de c/u de los componentes: Agua Grasa Lactosa Proteínas Minerales Sólidos no grasos
1, 000 0, 930 1, 666 1, 346 5, 500 1, 616
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La grasa es la única constituyente con menor densidad que el agua por lo tanto es el que más influye para bajar la densidad de la leche. Productos con distinto contenido de grasa presentan las siguientes densidades: Leche descremada leche entera crema 20% crema 40%
1, 036 1, 032 1, 011 0, 933
La densidad de la leche puede variar por las siguientes causas: a) POR CAUSAS NORMALES: 1. Con la temperatura: cuando la medición se realiza a temperatura próxima a los 29 ó 34 °C, la temperatura de fusión de la grasa varía y por supuesto su densidad que no se restablece hasta varias horas después. 2. Con el tiempo transcurrido desde el ordeñe: durante las 6 horas que siguen a éste y mientras la leche se enfría, la densidad aumenta. 3. Por la composición de la leche. 4. Por las distintas etapas del ordeñe: la 1º etapa por ser pobre en grasa tendrá mayor densidad que al final por tener mayor porcentaje de materia grasa. b) POR ADULTERACIONES: 1. Por agregado de conservantes sólidos: por ej. , el agregado de dicromato de potasio, incrementa la densidad en 0,0007 por cada gramo de sólido añadido por litro de leche. 2. Por aguado. 3. Por aguado con soluciones preparadas: según tengan éstas densidades mayores, menores o iguales que las de la leche. 4. Por desnatado: como esta adulteración obra en sentido contrario que el aguado conviene estudiarlas conjuntamente porque pueden dejar invariable la densidad. 5. Por aguado con soluciones y desnatado: variará según la densidad de la solución preparada. 6. Por neutralización: depende de la densidad de la solución preparada. 2. CALIDAD SANITARIA RECUENTO DE CELULAS SOMÁTICAS/ml (RCS) A. RECUENTO MICROSCÓPICO DIRECTO: MÉTODO DE BREED
El método de Breed es el método de referencia para el recuento de células somáticas .
MÉTODO DE BREED:
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Procedimiento: Se toman portaobjetos bien limpios y desengrasados. Se extiende sobre una cuadrícula de 1 cm de lado, 0,01 ml de la muestra (leche), bien homogeneizada. Se seca calentando suavemente el portaobjeto. Esta operación no debe prolongarse más de 10 minutos. Para el desengrasado se utiliza una solución de alcohol, xilol y ácido acético (60: 30:10) durante 1 minuto y para la tinción con Azul de metileno al 1%, durante 1 minuto Graduación del campo visual: Se mide el diámetro del campo del Microscopio Óptico con una escala micrométrica objetiva y luego se aplica la fórmula para hallar la superficie. Teniendo en cuenta la dilución y la superficie del cuadrado determinamos la cantidad de campos que hay, o sea “El factor del Microscopio” (es el número de campos en 1 cm, es decir 100 mm) FM
100 mm Area del campo en mm
Determinación del número total de células somáticas: Se procede a contar las células somáticas por campo. A mayor número de células somáticas se contarán menos campos y viceversa. El recuento se hace en diagonal. Se saca el promedio:
N º de células somáticas
Total de células somáticas Cantidadde camposcontados
Nº total de células somáticas/ml = FM x Nº de células somáticas promedio.
B. METODO AUTOMATIZADO (SOMACOUNT 300) El estándar especifica un método para recuento de células somáticas (RCS), tanto en leche cruda como leche químicamente preservada usando instrumentos de recuento como FOSSOMATIC, BENTLEY. El RCS en muestras no preservadas dentro de las primeras 24 hs. posterior al ordeñe podrá dar resultados inexactos. Definición: Célula somática: son aquellas células con una intensidad fluorescente mínimo debido al teñido del ADN del núcleo de la célula. Principio del Equipo Bentley: El recuento de células blancas en leche se hace a través del método denominado citometría de flujo. Este instrumental “Somacount 300” requiere de un colorante fluorescente Bromuro de etidio para
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teñir el núcleo de las células somáticas. También es utilizado el llamado “fluido de transporte” el cual transporta las células teñidas fluorescentemente a través del flujo de leche. El equipo utiliza un sistema óptico, para detectar y contar las células somáticas. El sistema óptico consiste de: un láser de helio neón, espejos, un tubo fotomultiplicador, lentes y filtros. Debido a la tintura fluorescente cada célula que pasa a través de la fuente de luz produce un corto destello de luz. La luz pasa a través de unos filtros ópticos y lentes, los mismos serán convertidos en impulsos eléctricos; y la computadora cuenta los pulsos eléctricos que representan células somáticas. Los resultados obtenidos se visualizan en pantalla. Por medio de una pipeta ubicada en el frente del instrumento, se extrae una muestra (3 ml) desde el vial de leche. A través de jeringas de bombeo y válvulas se detectan y cuentan las células somáticas presentes en leche.
PRUEBA DEL ANILLO EN LECHE (PAL) O RING TEST Técnica estandarizada internacionalmente por la FAO- OMS Principio: La prueba del anillo detecta la presencia de anticuerpos en la leche. Estos anticuerpos reaccionan con el antígeno coloreado de Brucella: forman con él un complejo que se adhiere a la superficie de los glóbulos de grasa de la leche y que asciende con ellos para formar una capa de crema coloreada. En ausencia de anticuerpos específicos, la capa de crema será blanca y la columna de leche estará coloreada. En ausencia de anticuerpos específicos, la capa de crema será blanca y la columna de leche estará coloreada por las células de brucelas teñidas que contiene en suspensión. Esta prueba se emplea para diagnosticar la infección en rebaños. Su sensibilidad es tal que permite detectar la infección en la leche de una sola vaca mezclada con la de muchas vacas sanas.
Objetivo: El objetivo fundamental del empleo de esta prueba, es la de ubicar los rodeos que se infectan en un área de lucha determinada, o mantener una vigilancia permanente sobre rodeos indemnes. Es una prueba poblacional y de aplicación permanente, es decir que se debe aplicar cada 3 o 4 meses. Toma de muestra: a) En el campo: Tan pronto se ha llenado el tarro y antes de que la crema suba, revolver bien el contenido y tomar unos 50ml de leche. Agregar 1 ml de suspensión de formalina al 1% por cada 10 ml de leche. Las muestras, bien identificadas, se transportan refrigeradas hasta el laboratorio. b)
En las plantas pasteurizadoras y lugares de acopio: Elegir los tanques del menor tamaño posible, cuya procedencia pueda ser identificada. Mezclar bien la leche de cada tanque para que la crema represente un término medio y tomar una muestra de unos 50 ml. Agregar 1ml de suspensión de formalina al 1% por cada 10ml de leche.
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Procedimiento: 1. Mezclar cada muestra invirtiendo varias veces el recipiente (tubo o frasco). 2. Colocar 1ml de la muestra en un tubo de 12 x 75mm. 3. Agregar una gota (0.03 ml) de antígeno a cada tubo, homogeneizar varias veces , sin que se llegue a formar espuma. No debe quedar antígeno sobre las paredes. 4. Incubar a 37ºC durante una hora. 5. Lectura: NEGATIVA - : Anillo de crema blanco; columna de leche azul POSITIVA + : Anillo de crema y columna de crema del mismo color o casi igual POSITIVA ++ : Anillo de crema de color más pronunciado que la columna de leche POSITIVA +++: Anillo de crema azul oscuro; columna de leche blanca PAL es una prueba que detecta anticuerpos contra brucela en muestras de leche; muestras que son obtenidas de algunos de la mayoría de los bovinos que componen un rodeo de tambo: las hembras en lactancia, NO de la totalidad de su población. Por lo tanto resulta obvio que no se expide sobre el rodeo, sino sobre una parte de éste. Precauciones:
El exceso o la escasez de crema dificulta la interpretación de la prueba. La agitación vigorosa, leches congeladas, o el uso de leche “homogeneizada” dificulta la realización de la prueba.
El calentamiento de la leche interfiere con los resultados, por lo tanto la prueba no se puede
efectuar sobre leches pasteurizadas, a menos que se les agregue crema de leche sin pasteurizar o que se las diluya con leche fresca de vacas negativas. Cuando la prueba se efectúa el mismo día en que se ha recolectado la leche, se pueden obtener resultados POSITIVOS FALSOS o DUDOSOS. La leche de calostro puede dar resultados FALSOS POSITIVOS. La leche de vacas con mastitis también puede dar FALSOS POSITIVOS o impedir la interpretación de la prueba debido al decoloramiento del antígeno. La leche de vacas próximas a secarse puede dar resultados DUDOSOS o FALSOS POSITIVOS. Hay vacas infectadas con brucelas que no eliminan anticuerpos por leche. Estas vacas son positivas en las pruebas de sangre y negativas en la prueba del anillo.
3. CALIDAD COMPOSICIONAL DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE MATERIA GRASA El método de referencia en lácteos para determinar el tenor graso es el Método de Rosse y Gottlieb. A. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE MATERIA GRASA POR BUTIROMETRIA: Método Gerber para análisis de rutina. Definición:
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Se define como materia grasa en leche fluida a las sustancias extraídas según el procedimiento que se describe a continuación. Este método es un procedimiento empírico por el cual se obtiene un valor de materia grasa, expresado en gramos de grasa por cien gramos de leche o en gramos de grasa por cien mililitros de leche, según la capacidad de la pipeta utilizada. Principio del método: Disolución en ácido sulfúrico de todas las sustancias (hidroliza las proteínas y los fosfatos) excepto la materia grasa que no es capaz de mantenerse en estado de emulsión y sube libremente por diferencia de densidad. El alcohol amílico impide la formación de espuma y consigue que la separación de la columna butirosa sea más nítida. La centrifugación y el calentamiento contribuyen a que el ascenso de la materia grasa sea más rápido y completo. El contenido de materia grasa se determina por lectura directa en el butirómetro, existiendo diferentes tipos según sea para leche fluida o para otros productos lácteos como crema o quesos (Fig. 6 y 7).
Fig. 6: Butirómetro de leche
Fig. 7: Butirómetro para crema/quesos
Equipos y material de laboratorio Butirómetros para leche.
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Pipeta automática de 10 ml. Pipeta automática de 1 ml. Pipeta para leche aforada, de 10,75 ml para obtener resultados en gramos por cien gramos de muestra o de 11 ml para obtener resultados en gramos por cien ml de muestra. Centrífuga para análisis Gerber con velocidad entre 1000 y 1200 r. p. m. Baño de agua, con regulador de temperatura, ajustado a 65º ± 2ºC y de forma tal que los butirómetros puedan ser mantenidos en posición vertical, con sus escalas completas sumergidas.
Reactivos Ácido sulfúrico para análisis de leche, densidad 1820 - 1825 g/l a 15ºC. Alcohol amílico. Preparación de la muestra Se ajusta la temperatura de la muestra entre 20 y 30ºC y luego se mezcla invirtiendo suavemente varias veces el recipiente, evitando la formación de espuma. Si hay dificultad en dispersar la grasa se calienta la leche entre 30 y 40ºC en baño de agua y se mezcla suavemente. Si efectuado el procedimiento anteriormente indicado la grasa no se dispersa se debe descartar la muestra. Si se trata de una muestra que contiene sustancias conservadoras se requiere un calentamiento lento entre 35 y 40 ºC. Cuando se ha alcanzado una distribución uniforme de la grasa, se ajusta rápidamente la temperatura aproximadamente 20 ºC y se deja reposar de 3 a 4 minutos para permitir que las burbujas de aire suban a la superficie del líquido. Procedimiento 1. Se miden 10 ml de Ácido sulfúrico para análisis de leche y se colocan en el butirómetro de tal manera que el ácido no moje el cuello del butirómetro o queden burbujas de aire. 2. Se invierte, suavemente 3 ó 4 veces, el recipiente que tiene la muestra preparada y se mide inmediatamente con la pipeta el volumen de leche requerida. 3. Se debe introducir la pipeta en la muestra, aspirar hasta su enrase y descargar la leche de manera tal que se forme una capa sobre la superficie del ácido, evitando que se mezclen. 4. Verter sobre la leche 1 ml de alcohol amílico en el butirómetro con leche evitando mojar el cuello del butirómetro con alcohol. 5. Tapar herméticamente el butirómetro con tapón de caucho. 6. Agitar e invertir el butirómetro hasta que su contenido esté perfectamente mezclados y los coágulos de caseína se hayan disuelto, lo cual se comprobará por ausencia de partículas blancas. 7. Se coloca el butirómetro en un baño de agua a 65ºC entre 10 y 15 minutos con el tapón hacia abajo y manteniendo la columna de grasa totalmente sumergida. 8. Inmediatamente después se coloca el butirómetro en la centrífuga con el tapón colocado hacia afuera a una velocidad de funcionamiento de 1200 r. p. m. durante 5 minutos .
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9. Retirar el butirómetro de la centrífuga y colocarlo en el baño de agua durante 3 minutos como mínimo y 10 minutos como máximo. El nivel del agua debe estar por encima de la parte superior de la escala. 10. Retirar el butirómetro del baño de agua y ajustar cuidadosamente el tapón para leer directamente en la escala el porcentaje de materia grasa. En el butirómetro para leche cada una de las divisiones grandes representa 1 g% de materia grasa, y las divisiones pequeñas 0,1 g% de materia grasa. B. DETERMINACIÓN DE MATERIA GRASA POR UN MÉTODO INSTRUMENTAL MILKO-TESTER MINOR Introducción: El siguiente procedimiento para la determinación del porcentaje de materia grasa en leche, utiliza un analizador Milko-Tester Minor, el cual mide la dispersión de la luz en la leche, que es proporcional a la cantidad de glóbulos de grasa presentes. Este procedimiento describe un método rápido para la determinación de materia grasa en leche. Principio: Se diluye la muestra en una solución de EDTA para eliminar la interferencia que producen las micelas de caseína y se homogeneiza la mezcla par uniformar el tamaño del glóbulo graso. Se mide luego la dispersión de la luz provocada por el pasaje de la misma a través de la muestra. EL PORCENTAJE DE MATERIA GRASA PUEDE VARIAR POR: A) CAUSAS NORMALES:
Con un animal bien alimentado y sano. Con los distintos ordeñes: mayor porcentaje a la tarde que a la mañana. Con la cantidad de leche producida. Con el mes de lactación. Con el cambio de régimen alimenticio. Con las estaciones: mínimo en primavera y comienzos del verano y máximo en el invierno. Con el calor: desciende la cantidad de leche y el % de grasa. Con el tiempo transcurrido entre ordeñes. Con las partes del ordeñe: en el ordeñe de 5 minutos el 1º minutos tendrá menor riqueza que el último.
B) POR ADULTERACIONES:
Aguado ó agregado de soluciones: rebajan todos los componentes de la leche. Desnatado.
DETERMINACIÓN DE SÓLIDOS TOTALES EN LECHE FLUIDA Objeto:
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Esta norma tiene por objeto establecer el método para determinar los sólidos totales y libres de materia grasa en leche. Terminología: Sólidos totales de la leche es el residuo comprendido principalmente por compuestos nitrogenados, materia grasa, hidratos de carbono y sales minerales. Expresado en por ciento ponderal obtenido después del proceso de desecación según el método que se describe a continuación: Fundamento del método: Una cantidad conocida de la muestra se deseca mediante evaporación en estufa, utilizando arena hasta constancia de masa. Procedimiento: 1. Colocar una varilla corta de vidrio y la cantidad de arena suficiente (20 g aproximadamente ) en una cápsula. 2. Secar el conjunto en estufa a 102 ± 1ºC hasta que dos pesadas sucesivas no difieran entre sí en más de 0, 1 mg. 3. Se pesan aproximadamente 10 g de muestra con una exactitud de 0,5 mg en la cápsula, se homogeneiza con la arena, utilizando para ello la varilla de vidrio. 4. Se coloca la cápsula a Baño María a ebullición durante el tiempo necesario para que la muestra se seque parcialmente, lo cual insume aproximadamente 20 minutos. 5. Se coloca la cápsula en la estufa a 102 ± 1ºC y se calienta durante 90 minutos. 6. Dejar enfriar la cápsula (con los sólidos totales) en el desecador y pesar con aproximación de 0,1 mg. 7. repetir el calentamiento por períodos de 30 minutos, enfriando y pesando hasta que dos pesadas sucesivas no difieran entre sí en más de 1 mg, o bien hasta que se observe un aumento de masas en cuyo caso debe tenerse en cuenta en valor anterior. Cálculo: El contenido de sólidos totales se calcula de la siguiente forma: S
m1 m 100 m2 m
Siendo: S= contenido de sólidos totales en % de masa. m= masa de la cápsula vacía en g. m2= masa de la muestra antes de la desecación en g. m1= masa de la muestra luego de la desecación, en g. El contenido de sólidos libre de materia grasa, se calcula con la siguiente fórmula: SNG ST MG
SNG= sólidos no grasos, en % en masa. ST= contenido de sólidos totales, en % en masa. MG= contenido de materia grasa determinado por el método butirométrico, en % en masa.
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Observaciones generales:
Es importante que las cápsulas tanto vacías como con muestra están perfectamente frías antes de proceder a su peso, para evitar cometer así errores de pesada. No debe quedar líquido sobrenadante al colocar la muestra en la cápsula. La temperatura del B. M. debe ser superior a 92ºC porque la lactosa puede cristalizar a una temperatura inferior como lactosa hidratada ocluyendo agua de difícil evaporación. Durante esta etapa debe evitarse la formación de nata ó coágulos que puedan retener humedad. El control de la temperatura y del tiempo de permanencia de la muestra en la estufa, son de suma importancia en el desarrollo correcto de este análisis.
Valor normal = 8, 5 a 9 g %. Las variaciones del extracto seco se deben a: 1) Causas normales: Por alimentación del animal. Enfermedades de los animales, normalmente las vacas enfermas dan siempre valores mínimos. Si la leche es muy rica en grasa puede parecer aguada por su ESD ya que éste es muy bajo. 2) Adulteraciones: El aguado lo rebaja. El agregado de soluciones preparadas. El desnatado lo rebaja.
Valor normal /esperado: Sólidos no grasos: 8,5 -9 g%
Valor normal /esperado: Sólidos totales: 11,5 -12 g%
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES Definición Se entiende por contenido de proteínas totales, al resultante de multiplicar el porciento de nitrógeno determinado por el procedimiento que se describe a continuación por el factor 6,38. Principio La determinación se efectúa por el método Kjeldhal. Se mineraliza la muestra con ácido sulfúrico y un catalizador, para transformar el nitrógeno de la misma, en nitrógeno amoniacal. El amoniaco es posteriormente liberado en medio alcalino (con hidróxido de sodio) y valorado.
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Ámbito de aplicación Este método de referencia, es de aplicación en leche y productos lácteos, que no contengan más sustancias nitrogenadas, que aquellas presentes normalmente en la leche.