CBEIH - Relatório de Publicações - 2013 by Canoa Docs

2013

Relatório de publicações GT343 Controle do Mexilhão-dourado: Bioengenharia e novos materiais para aplicações em ecossistemas e usinas hidrelétricas.

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RELATÓRIO DE PUBLICAÇÕES Este documento tem por objetivo apresentar parte dos resultados obtidos pelo Centro de Bioengenharia de Espécies Invasoras de Hidrelétricas no ano de 2013. Constam neste relatório os resultados já apresentados em congressos, conferências e workshops e artigos submetidos para publicação em revistas e periódicos nacionais e internacionais. Os referidos trabalhos são oriundos das linhas de pesquisa do CBEIH, abrangendo Bioengenharia, Modelagem e Simulação e Monitoramento Ambiental.

BELO HORIZONTE, 07 DE FEVEREIRO DE 2014

2013

Relatório de publicações

1. Micrografia de células crescendo em amostra preparada com concha de Limnoperna fortunei

9º Relatório Parcial projeto GT 343 “Controle do mexilhão dourado: bioengenharia e novos materiais para aplicações em ecossistemas e usinas hidrelétricas”. Antonio Valadão Cardoso - Fundação Centro Tecnológico de MG-CETEC Janeiro-2014

Equipe do Projeto: 1- Antonio Valadão Cardoso, Dr – Coordenador, Dr em Eng. de Materiais, PósDout. em Bioreologia , Pesquisador Pleno do CETEC; 2- Mônica de Cassia S. Campos, Dr em Geomorfologia, Pesquisadora Plena do CETEC; 3- Arnaldo Nakamura Filho, Doutorando em Eng. De Materiais REDEMAT UFOP-CETEC-UEMG, Bolsista Fund. Gorceix; 4- Gabriela Rabelo Andrade, Mestranda em Design-UEMG, Bolsista CapesCnpq; 5- Arthur Corrêa de Almeida, Mestrando em Eng. De Materiais REDEMAT UFOP-CETEC-UEMG, Bolsista Capes-Cnpq; 5- Hernán Roberto Espinoza Riera, Mestrando em Eng. De Materiais REDEMAT UFOP-CETEC-UEMG, Bolsista Capes-Cnpq; 6- Fabiano Alcisio e Silva, Doutorando em Ciências Biológicas UFMG; 7- João Locke Ferreira de Araújo, graduando em Ciências Biológicas UFMG, Bolsista de Iniciação Científica CBEIH; 8- Frederico Magalhães Vieira,, graduando em Engenharia de Controle e Automação UFMG, Bolsista de Iniciação Científica CBEIH; 9- Anna Carolina Paganini Guañabens, graduando em Ciências Biológicas UFMG, Bolsista de Iniciação Científica CBEIH.

APRESENTAÇÃO O CBEIH foi criado em parceria entre a CEMIG e CETEC a fim de estabelecer um marco sólido no combate e controle de espécies invasoras, principalmente aquelas de interesse ecológico e econômico que infestam os reservatórios das usinas hidrelétricas. Em atividade desde o início de 2011, o CBEIH conta, em seus quadros, com equipe multidisciplinar capacitada, com mais de dez anos de experiência. As três grandes áreas que norteiam o trabalho do CBEIH – Monitoramento, Bioengenharia e Modelamento – receberam impulso renovado em 2013, através de parcerias internacionais, e o CBEIH se destacou por meio de uma proposta inovadora, que fundiu Monitoramento e Bioengenharia visando a implantação de um protocolo de DRRI: Detecção Rápida & Resposta Imediata, um sistema dinâmico e preciso de destecção e controle de espécies invasoras.

MONITORAMENTO O Monitoramento consiste em um conjunto de atividades organizadas para acompanhar dispersão do organismo no meio ambiente, onde equipes treinadas visitam periodicamente locais infestados e não infestados, obtendo dados ambientais e ecológicos que auxiliam na compreensão das relações entre o organismo invasor e o meio ambiente. Em 2013, o Monitoramento do CBEIH ganhou novo fôlego com o início da implementação de uma parceria internacional para Early Detection, juntamente com o Bureau of Reclamation. • Early detection Em 2013, o CBEIH avançou na criação do primeiro laboratório de Early Detection no Brasil, estabelecendo um protocolo capaz de nivelar, de acordo com os mais altos padrões internacionais, as atividades do monitoramento terceirizado nas grandes represas. A implementação do protocolo em questão é prevista para 2014, terminado o período de testes e refinamento. O Early Detection é um processo moderno e eficiente, fruto de metodologias combinadas, implementado com sucesso em grandes centros de pesquisa fora do Brasil, tendo como principal referência o Bureau of Reclamation (EUA). O processo se apóia em tripé tecnológico, composto de Análise Visual Automatizada de Microfluido, Reação em Cadeia Polimerase (PCR) e Contagem de Larvas por Microscopia Ótica de Luz Polarizada, adaptado pelo CBEIH no Brasil e em processo de aprimoramento. • Inovação Com o desenvolvimento de tecnologias nacionais de Early Detection, existem diversas perspectivas de requisição de propriedade intelectual, principalmente em relação a patentes envolvendo processos e produtos. Estão prevsitas patentes referentes a: • Suite de Softwares (Java, C e MATLAB) para geração de matrizes celulares e modelagem dinâmica em cenários geoespaciais delimitados (concluído); • Dispositivo autônomo remoto para visualização e medição de parâmetros diversos (em desenvolvimento); • Tintas e revestimentos (coatings) antiaderentes hidrofóbicos e superhidrofóbicos (em desenvolvimento).

BIOENGENHARIA No último ano a Bioengenharia do CBEIH avançou na compreensão de vários processos relacionados à construção da concha e à adesão do mexilhão dourado, principalmente aqueles envolvidos na produção do bisso; avançou ainda no desenvolvimento de coatings superhidrofóbicos e no manejo de resíduos oriundos da limpeza de incrustações para o desenvolvimento de produtos de interesse clínico.

MODELAGEM Muitos dos projetos em andamento no grupo de Modelagem do CBEIH se encerraram em 2013. Como saldo o CBEIH conta agora com um banco robusto de simulações sobre a dispersão do mexilhão dourado, não restrito ao território nacional.

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UNIDADE I

Publicações e Apresentações em

Congressos e Eventos

XII Encontro da SBPMat- Campos de JordĂŁo

The Effect of Hydroxyurea (HU) in the Phase Transitions of Collagen Gels

The effect of hydroxyurea (HU) in the phase transitions of collagen gels Alves, E. D. L. 1 , Cardoso, A. V.1,2 1

REDEMAT-Rede Temática em Engenharia de Materiais UFOP-UEMG-CETEC, Belo Horizonte, MG, Brasil e-mail: ellen.denise@redemat.em.ufop.br 2

Centro de Tecnologia SENAI CETEC, Belo Horizonte, MG, Brasil email: avcardoso2007@gmail.com

The hydroxyurea (HU) is considered the main drug for sickle cell anemia (SCA); SCA is a haemoglobinopathy with strong incidence in Africa and the Americas. The polymerization of the mutant hemoglobin (HbS) – in its deoxygenated state – generates nanometric fibers which causes the gelification of the hemoglobin-serum suspension, a phenomenon called sickling of the red blood cell (RBC)1. HU is an unstable compound and presents autocatalytic mechanism in aqueous solution2. In SCA, HU action has been explained in terms of inducing the production of fetal hemoglobin (HbF), which inhibits the HbS polymerization. Our hypothesis is that HU has an anti-gelling effect, dissolving the HbS gel, and decreasing the vascular occlusion risk. To investigate the anti-gelling action of HU We used bovine collagen type I as the gelling agent and modulated DSC technique (Step Scan®) to analyze the effect of HU addition on the phase transitions of the collagen gel, in the interval 10-60 oC. Experimental results are discussed and our approach to test anti-gelling substances with potential of use on SCA treatment are reviewed critically. Acknowledgments: This work was supported by CAPES. References: [1] Finch, J.T., Perutz, J. F., Bertles, J.F., Dobler, J. Structure of Sickled Erythrocytes and of Sickle-Cell Hemoglogin Fibers. Proc. Nat. Acad. Sci, 1973. 3:718-722. [2] Lunghi A, Aloni C, Gigante L, Mazzei N, Cardillo P. Hydroxyurea explosion: a thermoanalytical and calorimetric study. Journal of Loss Prevention in the Process Industries 2002;15:489–495.

REDEMAT REDE TEMÁTICA

E NGENHARIA

M ATERIAIS

UFOP – CETEC – UEMG UFOP - CETEC - UEMG

The effect of hydroxyurea (HU) in the phase transitions of collagen gels Alves, E. D. L.1 , Cardoso, A. V.1,2 1REDEMAT-Rede Temática em Engenharia de Materiais UFOP-UEMG-CETEC, Belo Horizonte, MG, Brasil 2 Centro de Tecnologia SENAI CETEC, Belo Horizonte, MG, Brasil PALAVRAS CHAVES: Hydroxyurea, collagen, SSDSC

INTRODUCTION Sickle cell anemia (SCA) is an inherited blood disorder that affects red blood cells (RBC). The sickle cell gene causes the body to produce abnormal hemoglobin (HbS) which polymerizes – in its deoxygenated state – generating nanometric fibers which cause the gelification, consequently red blood cells develop a sickle form1. These sickled red blood cells can block blood vessels resulting in vasoocclusion, tissue and severe organ damage. The drug that reduces the severity of sickle cell disease is hydroxyurea (HU)2,3. Our hypothesis is that HU has an anti-gelling effect, dissolving the HbS gel, and decreasing the vascular occlusion risk. To investigate the anti-gelling action of HU we used bovine collagen type I as the gelling agent, the thermal analysis technique of modulated Step Scan DSC (SSDSC) to analyze the effect of HU addition on the phase transitions of the collagen gel and scanning electron microscope (SEM) to reveal the differences between gel-morphologies.

RESULTS AND DISCUSSION

Figura' 5:' Nacre' Layer' composta' por' agregação' de' cristais' de' aragonite'em'format'de'lajotas.'

Figura' 6:' Imagem' detalhada' das' estruturas'em'formato'de'lajota'presente' na'Nacre'Layer.'

Figure 2 - SSDSC scan of collagen gels with and without HU in the interval 0oC to 40 oC.

Figure' 7:' Imagem' de' MET' mostrando' as' franjas' claroC escuro'que'evidenciam'os'cristais'de'aragonita.'

OBJECTIVE

F i g u r e ' 8 : ' R e s u l t a d o ' d a' Transformada' Rápida' de' Fourier,' método' usado' para' idenKﬁcar' os' cristais'de'aragonita.'

To investigate the anti gelling effect of HU on type I collagen gels using differential scanning calorimetric (DSC) and scanning electron microscopy(SEM). MATERIALS AND METHOD

Figure 3 – SEM 2D images of collagen gels alone(images, A,B and C) and with addition of hydroxyurea (images D,E,F). Magnifications of top and bottom images are de same (A=D, B=E and C=F)

Figure 4 – SEM 3D images of collagen gels alone (G) and with addition of hydroxyurea (H). Magnification 1000x.

Figure 1 – Diagram of sample preparation

Gels of type I collagen from bovine tendon were solubilized in a solution of acetic acid 0,02M at least 1 hour at 60oC. The mixture was centrifuged at 2500 rpm for 15 minutes and the supernatant was collected. The solution pH was adjusted for 7.4. In such experiments, four parts of collagen solution was mixed with one part of hydroxyurea. Step Scan DSC experiments were carried out with temperature step 3oC, heating rate in the temperature step 2oC min-1, basic isotherm duration of 60s with equilibrium criterion (± 0.05µW). Samples of gels were fixed, dehydrated and dried using a protocol suggested by Glauert, 19754.

The figure 2 displays the distinct behavior of gels with and without HU as temperature increases. The collagen gel with hydroxyurea holds more water inside his structure therefore presenting a higher specific heat. The collagen gel without HU addition is much weaker on holding water and therefore presents lower cp. In figures 3 and 4, the SEM images 2D and 3D show the differences of microstructure between gels with and without HU. The collagen gel without HU presents a three-dimensional network top images with random array of fibers allowing the entrapping of a large volume of water solvent, therefore presenting a high Water Holding Capacity (WHC). The structure of collagen gels with HU a looser network structure compared to other gel presents less blanks and resulting in reduced capacity to retain the solvent.

REFERENCES 1.  2.  3.  4.

Finch, J.T., Perutz, J. F., Bertles, J.F., Dobler, J. Structure of Sickled Erythrocytes and of Sickle-Cell Hemoglobin Fibers. Proc. Nat. Acad. Sci, 1973. 3:718-722. Lunghi A, Aloni C, Gigante L, Mazzei N, Cardillo P. Hydroxyurea explosion: a thermoanalytical and calorimetric study. Journal of Loss Prevention in the Process Industries 2002;15:489–495. Charache, S., Terrain, M. L., Moore, R. D., Dover, G. J., Barton, F. B., Eckert, S. V., McMahon, R.P., Bonds, D.R. Effect of hydroxyurea on the frequency of painful crises in sickle cell anemia. Investigators of the Multicenter Study of Hydroxyurea in Sickle Cell Anemia. N Engl J Med. 1995;332(20):1317-22. Glauert, A.M. Fixation, Dehydration and Embedding of Biological Specimens. North- Holland Publishing Company, 1975. 3:45-46.

ACKNOWLEGMENTS We would like to thank the Center of Microscopy in Federal University of Minas Gerais and Bioengineering Center of Invasive Species for technical assistance with the SEM experiments and valuable suggestions. For CAPES and FAPEMIG for finalcial support and NovaProm Food Ingredients Ltda. by to provide some raw materials for this work.

Obtaining Biogenic Aragonite as Raw Material for Osteogenic Bone Implants

Obtaining biogenic aragonite as raw material for osteogenic bone implants Almeida C. A.1, Teodoro E. N. A., Nakamura A. F.1 , Mota H.1, David M.2, Cardoso A. V.1 1

Centro de Bioengenharia de Espécies Invasoras, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil 2 CEMIG – Companhia Energética de Minas Gerais, Brazil e-mail: arth.correa@gmail.com

Aragonite is a metastable polymorph of calcium carbonate (CaCO3) found in the shell of molluscs. It is displayed in lamellae and prismatic columns and features osteogenic properties, demonstrably stimulating bone growth in in vivo experiments, including human subjects. The purpose of this research was to obtain and characterize biogenic aragonite from the shells of invasive mussel Limnoperna fortunei. The shells were taken from euthanized mussels from aquariums cultivation, and underwent a manual cleaning to remove the organic debris. The cleaned shells were dryed in air, and the milling of the shells was done using agate mortar and pestle. The heat treatment was conducted in 2-hours multiple isothermal steps in electric muffle. Each set of samples was isothermally heat-treated in the interval 200 °C to 800 °C, in order to track changes in the samples. The first observable difference is on the powder coloring, which changed after some thermal treatment steps. Above 400 °C it is possible to separate the layers that compose the shell, indicating the degradation of the organic matrix, which acts as a "glue" between the mineral layers. Each fraction of the heat-treated powder, after cooling down, was manually shieved into different particle sizes. The 400 mesh particle size (approx. 30 µm) was considered ideal for the XRD analysis. The XRD showed similar patterns for all tests with the most significant changes in the temperature interval 400 °C-500 °C. The transformation rate of aragonite to calcite increases above 300 °C, and continues until 700 °C, from which only calcite peaks was detected. It can be concluded that the most suitable temperature to extract the greatest amount of aragonite from the samples is above 400 °C. This temperature allows eliminating almost every proteins trace and may ensure that the sample is mostly aragonite. References: [1] C.C. Lin; L.G. Liu. High pressure phase transformations in aragonite-type carbonates. Phys Chem Minerals, v.24, 149–157, 1997 [2] M. R. R. Hamester; P. S. Balzer; D. Becker. Characterization of calcium carbonate obtained from oyster and mussel shells and incorporation in polypropylene. Materials. Research, v. 15, n. 2, 2012 [3]$ K.$ Vecchio,$ X.$ Zhang,$ J.$ Massie,$ M.$ Wang,$ C.$ Kim$ 9$ Conversion$ of$ Bulk$ Seashells$ to$ Biocompatible$Hydroxyapatite$for$Bone$Implants.$Acta%Biomaterialia$3,$910–918,$2007$ [4]$ H.$ Liao,$ H.$ Mutvei,$ M.$ Strokm,$ L.$ Hammarstrokm,$ J.$ Li.$ Tissue$ Responses$ to$ Natural$ Aragonite$(Margaritifera$shell)$Implants$in%vivo.$Biomaterials$21,$4579$468,$2000$ $

(APRESENTAÇÃO ORAL)

Characterization of Biological Surfaces with Waterrepellency and Self-cleaning Properties

Characterization of biological surfaces with waterrepellency and self-cleaning properties Riera H. E.1, Mota H.1,3, David M.3, Cardoso A.V. 1,2 1

Centro de Bioengenharia de Espécies Invasoras de Hidrelétricas, Belo Horizonte, BRASIL 2 Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais, Belo Horizonte, BRASIL 3 Companhia Energética de Minas Gerais , Belo Horizonte, BRASIL e-mail: espinozahernan9@gmail.com

Shapes and structures of biological materials have been studied since the beginning of the twentieth century. D’Arcy Thompson (1917) conducted studies of the geometry and growth mechanics of living organisms and has proposed mathematical models to explain how physics plays an important role in biological structures [1]. The study of biological surfaces becomes attractive for researchers from different areas, due to the versatility of forms and mechanisms that depend on each species and the environment in which they had developed. The bestknown case is that of the Lotus flower which has a nano topography covered with wax crystals that provide high levels of hydrophobicity and allows a water droplet “roll off” and carrying dirt out of the leaf, providing a self-cleaning characteristics. [2] The aim of this work is to characterize the surface of the leaf aquatic plant Salvinia Molesta that has natural mechanisms for water-repellency and self-cleaning. To characterize the leaf surface we have used contact angle technique (water droplets) and scanning electron microscopy (SEM) for morphological visualization. Results have shown that the plant has several piliforms structures eggbeater-shaped, which allow water droplets to fix on the top of each structure ensuring that the plant surface remains dry. These structures are fully covered with crystallised wax except the top of each trichome that has hydrophilic properties (Figure 1). This fact was demonstrated quantitatively by measuring the contact angle (∼140 o). (a)

(b)

Figure 1: The surface microstructure of the leaf plant Salvinia Molesta (a) piliforms structures eggbeater-shaped (b) Hydrophobic and hydrophilic interface References: [1] Thompson, D. On Growth and Form. Cambridge University Press. Abridged edition (1992). [2] Barthlott W. et al. Superhydrophobicity in perfection: the outstanding properties of the lotus leaf, Beilstein Journal of Nanotechnology, v.2, (2011), p.152, New York.

(APRESENTAÇÃO ORAL) 10

UNIDADE II

Artigos submetidos em revistas ou periรณdicos

Observação: todos os códigos de programação estão disponíveis, caso solicitados, por meio do endereço contato@cbeih.org.

Cell

Elsevier Editorial System(tm) for Tissue and Manuscript Draft

Manuscript Number: Title: Microanatomy and ultrastructure of the foot of the invasive bivalve Limnoperna fortunei (Dunker, 1957) (Bivalvia: Mytilidae) Article Type: Full Length Article Keywords: Foot - Microanatomy - Limnoperna fortunei - Mucous Secretions Channel - Cilia Corresponding Author: Mr. João Ferreira de Araújo Locke, Corresponding Author's Institution: CBEIH First Author: João Ferreira de Araújo Locke Order of Authors: João Ferreira de Araújo Locke; Gabriela R Andrade; Arnaldo F Nakamura; Marcela D Carvalho; Antônio V Cardoso, Ph. D Abstract: In this study, the morphology and ultrastructure of the foot of the mollusc Limnoperna fortunei were compared to other bivalve from different habitats. The foot is flat-shaped with multiple projections on the surface and covered with ciliary tufts over its whole extension. The epithelial layer is simple and formed by ciliated columnar epithelium and mucous cells. The mucous cells are well developed both in the epithelial tissue, where they are found in greater concentration, and in the connective tissue, containing principally carboxylic acids and mucous substances. Using TEM observation, the secreting cells were classified into three types, in accordance with the secretion produced. The bundles of muscular fibers are composed mainly of smooth muscle fibres, and striated muscle fibres were also found. It was found that the microfilaments present on the bivalve foot surface are true cilia, due to the presence of axonemes, found in the epithelial layer, which are fundamental structures of cilia and flagella. It could also be confirmed the relationship between the channel on the ventral portion of the foot and the function of migrating protein secretion to the formation of byssus.

Cover Letter

Bioengineering Centre of Invasive Species - CBEIh Av. José Cândido da Silveira, 2000 - 31035-536 - Minas Gerais - Brazil 2013, July 24

Dear Editor,

This study presents the microanatomy and ultrastructure of the foot of the golden mussel (Limnoperna fortunei), a bivalve invasive specie of the Brazilian freshwaters, which has been causing major ecological and economic damage in our country. Since the foot of the golden mussel is the first structure used to explore the environment and to attach to various types of surfaces, this study is crucial for further development on methods for controlling adhesion with minimized environmental impacts. It was found that the microfilaments present on the bivalve foot surface are true cilia, due to the presence of axonemes found in the epithelial layer, which are fundamental structures of cilia and flagella. It could also be confirmed the relationship between the channel on the ventral portion of the foot and the function of protein secretion to the formation of byssus. The mussel produces substances with high adhesive power whose study may lead to the development of bioinspired materials such as adhesives for medical applications and dry bonding solutions for general use. The study was carried out using optical and electron microscopy (TEM and SEM) in order to describe tissues and cells that compose the foot of L. fortunei. Sincerely,

Antonio Valadão Cardoso, PhD, senior researcher, Technology Centre SENAI CETEC antonio.cardoso@fiemg.com.br 55 31 34892293 Av. José Cândido da Silveira, 2000 - Horto - 31035-536 Minas Gerais - Brazil

*Manuscript Click here to view linked References

Microanatomy and ultrastructure of the foot of the invasive bivalve Limnoperna fortunei (Dunker, 1957) (Bivalvia: Mytilidae) João Locke Ferreira de Araújoa; Gabriela Rabelo Andrade a; Arnaldo Nakamura Filhoa; Marcela David de Carvalhoc; Antonio Valadão Cardosoa,b a

Bioengineering Centre of Invasive Species - CBEIH, Brazil

Av. José Cândido da Silveira, 2000 - Horto - Belo Horizonte - Minas Gerais, 31035-536 – Brazil B

Technology Centre SENAI CETEC, Brazil Av. José Cândido da Silveira, 2000 - Horto - Belo Horizonte - Minas Gerais, 31035-536 – Brazil c

Companhia Energetica de Minas Gerais - Cemig, Brazil

Av. Barbacena, 1200, Santo Agostinho - Belo Horizonte - MG, 30190-131 - Brazil joaolocke.bio@gmail.com gabriela@cbeih.org nakamura@cbeih.org marcela.david@cemig.com.br antonio.cardoso@fiemg.com.br keywords: Foot - Microanatomy - Limnoperna fortunei - Mucous Secretions - Channel - Cilia

Abstract In this study, the morphology and ultrastructure of the foot of the mollusc Limnoperna fortunei were compared to other bivalve from different habitats. The foot is flat-shaped with multiple projections on the surface and covered with ciliary tufts over its whole extension. The epithelial layer is simple and formed by ciliated columnar epithelium and mucous cells. The mucous cells are well developed both in the epithelial tissue, where they are found in greater concentration, and in the connective tissue, containing principally carboxylic acids and mucous substances. Using TEM observation, the secreting cells were classified into three types, in accordance with the secretion produced. The bundles of muscular fibers are composed mainly of smooth muscle fibres, and striated muscle fibres were also found. It was found that the microfilaments present on the bivalve foot surface are true cilia, due to the presence of axonemes, found in the

epithelial layer, which are fundamental structures of cilia and flagella. It could also be confirmed the relationship between the channel on the ventral portion of the foot and the function of migrating protein secretion to the formation of byssus.

1 â&#x20AC;&#x201C; INTRODUCTION The freshwater bivalve Limnoperna fortunei (Dunker, 1857), known as the golden mussel, belongs to the family (Mytilidae) of marine mussels, order Mytiloida and subclass Pteriomorpha. Their original geographical distribution was restricted to Southeast Asia, mainly China, being common also in South Korea, Taiwan and Thailand. The mollusc was found as an invasive species for the first time in 1966, in Hong Kong, and in 1991 in Japan and South America ( Pastorino et al, 1993). It is thought that its invasion occurred through the ballast water of cargo vessels, and since then it has proliferated and caused grave environmental damage and economic impact (Santos et al., 2005; Ferreira et al., 2004). The golden mussel is an invasive species capable of producing substantial alterations in the natural or artificial water systems that it invades, above all because of its remarkable reproductive power and by the absence of natural enemies in Brazil. The economic impact caused by the species are also notable, since it frequently blocks water impoundment pipelines, grids and cooling systems associated with hydropower plants and network tanks in fish farms. These factors arise out of the gregarious behaviour of the animal, intensified by the high adhesive capacity of the byssus-plate adhesive produced by the species (Brugnoli et al., 2005; Collyer et al., 2007). Studies of other species of attaching bivalves such as the mussels Mytilus edulis (Brown et al., 1952), Perna viridis (Jiang et al., 2012), Septifer virgatus (Seed and Richardson, 1999) and Tegillarca granosa (LEE et al., 2012) and the gastropod Haliotis rufescens (LIN et al., 2009) demonstrate that the foot of these animals possesses marked importance in the process of attachment, being present from the larval phase as their

first structure of adherence to substrates. Several research also demonstrates the function of the glands present in the foot in the formation of highly adhesive proteins involved in the production of the byssus (Lee et al., 2012; Punt et al., 1998 ; Lu et al., 2012; Lane et al., 1975; Passos et al., 2004). The present study sought to characterize the microanatomy and ultrastructure foot mussel L. fortunei using the techniques of light microscopy and electron microscopy (scanning and transmission), with the aim of understanding the structure of this organ of great importance for the species considering their significant participation in the production of byssus.

2. MATERIALS AND METHODS 2.1 – Specimens

The specimens of L. fortunei were collected in the River Paranaíba, downstream of the confluence with the Barreiro river (navigation buoy 30 – Paranaíba river basin - Latitude: 19.655833˚ S / Longitude: 51.083889˚ W) near the Municipality of Parnaíba (MS). The animals were removed from navigation buoys with the help of spatulas. Subsequently they were transported to the laboratory, where they were dissected and the feet were packed at a temperature of 10˚C until performing the experiment. The specimens were prepared for foot examination under light microscopy (0.5 cm 3), scanning electron microscopy (0.5 cm3) and transmission electron microscopy (2 mm 3), and the preparation conditions specific to each process.

2.2 - Light microscopy

The preparation of Samples for light microscopy (LM) was performed according to the basic methodology of preparation suitable for this procedure. The specimens were fixed in Bouin aqueous solution and rinsed under running water, then dehydrated through graded ethanol series (70-100%). Then, they were diaphanized in xylene for three times in sequence and infiltrated in paraffin by sequentially twice, followed by embedding in paraffin and cut into the form of blocks. After this procedure, the samples have been cut with a microtome in the thickness 4-6μm using an RM2235 microtome (Leica). The specimens were stained with hematoxylin and 0.5% eosin (HE) solution of periodic acidSchiff (PAS) and alcian blue at pH 2.5 (AB-PAS).

2.3 - Electron microscopy

The sample preparation for electron microscopy was performed according to the traditional method of dehydration. The specimens were fixed in modified Karnovsky solution (2.5% glutaraldehyde and 2% paraformaldehyde) and 0.1 M phosphate buffer, pH 7.3 for 48 h at 4 ° C. Experiments and analyses involving electron microscopy were performed in the Centre of Microscopy at the Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, Brazil (http://www.microscopia.ufmg.br)

2.3.1 Scanning electron microscopy (SEM)

The samples for SEM were dehydrated with a Bal-Tec critical point dryer, RES101 Model (Leica) and the outside surface was coated with gold ion particles (10nm thickness) in a Bal-Tec metalizer, Model MD20 (Leica). Visualization of the samples occurred in two models of scanning electron microscope: FEG - Quanta 200 FEI and JEOL JSM - 6360LV. With the purpose of obtaining images in transverse and longitudinal sections, some samples were submitted to cryofracture. The method follows the traditional protocol for the preparation of samples for SEM, but before submitting the specimens to critical point drying with CO2, the cells were frozen to the temperature of liquid nitrogen (-196Â°C) and fractured with a scalpel blade.

2.3.2 Transmission electron microscopy (MET)

The samples for MET were embedded in Epon/Acetone resin (1:2) between 1h and 2h, in a closed flask and examined utilizing the Transmission Electron Microscope Tecnai G2-20 - SuperTwin FEI - 200 kV.

2.4 - Analyses of the images

SEM images were analysed in the software ImageJ (software in the public domain developed in the National Institutes of Health, USA) for measurements of the diameter, average length of the cilia and diameter and average length of the distal portion (extremity) of the cilia. To verify the average results, various measurements were made on similar structures from different images (22 diameters; 12 total lengths; 13 diameters

and 13 lengths of the distal portion) and the arithmetic mean was calculated from them (Fig. 1).

FIGURE 1

3. RESULTS

3.1. Morphology and structure of the foot observed by light microscopy

The foot of the L. fortunei was characterized as flattened and fused with the visceral mass (Fig. 2). FIGURE 2

The epithelial layer can be formed by simple or ciliated columnar epithelium, containing or not mucous cells. The form of the epithelium is different depending on the region where it is found; being composed of ciliated columnar tissue along the whole extension of the foot and simple columnar in the portions nearer the visceral mass of the animal. In the centre of the ventral region of the foot a groove was found, which has been called “channel” (Fig. 3A), delimited by ciliary epithelial tissue. Glandular secretions were found over the extension of this channel, which confirms the function of the channet in the migration of the adhesive secretions for the formation of the byssus threads and the adhesive plate (Coté, 1994; Waite et al., 1998; Eble et al., 2001). The standardization of the effect of HE, AB-PAS and PAS stains demonstrated the different compositions of the mucous secretion produced by the foot. The secretions of protein origin were observed by the colouring of HE. The secretions of saccharide origin appeared with the purple-magenta colour (Fig. 3).

The mucous cells are distributed primarily in the epithelial layer and can also be observed between the connective tissue and the muscular layers. The mucous cells appear in the vacuolar form in the colouring of HE, but reacted with PAS in pH 2.5 (Fig. 3D). The connective tissue layers occupy a greater area in the marginal zone than in the intermediate zone. The connective tissue layer and the mucosa extend from the epithelial layer (Fig. 3C).

FIGURE 3

3.2. Structure of the foot in electron microscopy

The foot of the L. fortunei is composed of epithelial, connective and muscular tissue layers, presenting a channel in the ventral portion which measures around 60% of the length of the foot, and a duct in its base, from where the byssus threads issue (Fig. 4). FIGURE 4

3.2.1. Epithelial tissue

Various saliences were found on the surface of the foot measuring, on average, 6.8Âľm in length and 0.2Âľm in diameter. The presence of axonemas (structures composed of nine pairs of microtubules in a circle, with a central pair) in the ciliary epithelium of L. fortunei made it possible to identify the microstructures that cover the surface as true cilia (Fig. 5). FIGURE 5

FIGURE 6

3.2.3. Channel

Through the SEM images it was possible to observe a depression in the ventral part of the foot, denominated in the literature as a groove. This structure is related to the mussel attachment process to the substrate, being involved in the production of secretions that will give form to the byssus and was already observed in another species of attaching mussel, M. edulis (Brown et al., 1953; Tamarin et al., 1972). Some images produced of the ventral region of the foot showed the existence of cilia also covering the inside of this channel (Fig. 7D) FIGURE 7

3.2.4. Glandular tissue

The secreting cells were classified into three types (A, B and C), in accordance with the cellular form and density of the secretion beads. Type A: the most common type among the three types of secretory cells and more present in the epithelial layer. The secretion granules have lower density among the three types of secretory cells, indicated by lighter shades of gray (Fig. 8A). Type B: the cells of this tissue are oval-shaped and were mainly observed in the connective tissue layer. The secretory granule has a rounded shape with a mean diameter of 0.8μm. Electron density in the membrane was higher than in A, but was lower than in C (Fig. 8B). Type C: the cells in the tissue have an elliptical shape and exhibit a reduced amount of granules. The secretory granules are circular shaped with a mean diameter of 0.92μm. The electron density of the membrane of these granules was the highest among the three, exhibiting a darker shade of gray (Fig. 8C).

FIGURE 8

4. DISCUSSION

The foot of attaching bivalves is rudimentary and generally lends itself to multiple functions (Gosling, 2003). As described in Mytilus edulis (Brown et al., 1952), the foot of Limnoperna fortunei is flattened and muscular, containing ciliary tufts over its whole extension (Fig. 4). Based on the images produced by electron microscopy, we observed the presence of microstructures at the foot of L. fortunei very similar to those found in the dorsal portion of the foot of the mussel M. edulis (Lane et al., 1975) and in the epithelial tissue of the bivalve Tegillarca granosa (Lee et al., 2012). This last species also has microvilli, ciliary tufts and mucous cells in the epithelial layer, however, belongs to the group of burrowing bivalves, whose foot is wedge-shaped (Eble, 2001; Park et al., 2011). The presence of ciliary structures is reported in the literature as facilitator of transportation of aquatic animals (such as in Daphnia sp.) in view of the increased viscosity of the fluid due to the scale of these aquatic species (Vogel, 2003). These structures can also contribute to facilitate movement of substances and particles entering the mantle cavity as well as to carry mucous substances out of the cavity of the mantle (Lee et al., 2012; Beninger and Veniot, 1999). The presence of cilia covering the foot of molluscs can also act as highly specialized structure for underwater adhesion through short-range forces, or van der Waals forces, as showed in the study of the gastropod red abalone, Haliotis rufescens (Lin et al, 2009). The mean mesures of cilia lenght (6.8µm) and diameter (0.2µm) were compatible to those found on the surface of red abalone foot (measuring approximately 0.2μm in diameter, which were named nanofibrilas). Also drawn attention a peculiarity in the form of these cilia, which are different from those already found for other molluscs (Brown et al., 1952, Lane et al., 1975, Lee et al., 2012). The distal portion of each cilium is narrower compared to the

rest of the diameter (130nm and 220nm, respectively) and ends in a rounded tip. This form and size can further facilitate adhesion by van der Waals (Arzt, 2006; Gao and Yao, 2004). Through the technique of cryofracture has been possible to obtain images of fragments that allowed us to visualize the foot L. fortunei in cross section and observe the communication between the structures and tissues of the interior and exterior of the foot and especially the ciliated epithelium of the communication with the other tissues. Were also found on the epithelium of the foot a massive presence of axonemas (Fig. 5) that provide the movement of cilia and flagella. The presence of these structures confirms that these are true cilia. This finding is also reinforced by the presence of mitochondria distributed along this tissue in the apical cytoplasm (Fig. 8D). The channel of the foot (Fig. 7) is delimited by a ciliary epithelial tissue and frequently presents mucous secretions within its whole of its extension (Fig. 9). A similar structure was found in another species also pertaining to the family Mytilidae, the Mytilus edulis (Brown et al., 1953; Coyne and Waite, 2000) which is related to the locomotion and attachment of the animal to the substrate transporting the secretions to the base of the foot to form the byssus threads (CotĂŠ, 1994; Waite et al., 1998; Eble et al., 2001). Both in attaching as in burrowing bivalves, there is the presence of secreting glands, which perform functions adapted to the habitat of each group. In the case of burrowing bivalves, they are used primarily for the fixing of sediments and formation of pseudofaeces (Norenburg and Ferrari, 1990; Cranfield et al., 1974). In the attaching bivalves on the other hand, such as M. edulis (Lane et al., 1975) and L. fortunei, they seem to be associated with the formation of the fixing device (Zuccarello, 1981; N.I. Selin et al 2003), known as byssus (Tamarin et al., 1972; Kathryn et al., 2000; Xiao-Xia et al., 1998 ; Sobieszek et al., 1973).

FIGURE 9

In the TEM images secreting cells along the epithelial tissue of the foot were identified and differentiated based on their morphology and the product secreted by them. The presence of rough endoplasmic reticulum (Fig. 10) is an indicator of the production of proteins. The mucous glands present in the foot of this animal are probably related to the production of substances involved in the formation of the byssus (Lee et al., 2012; Punt et al., 1998; Lu et al., 2012; Lane et al., 1975).

FIGURE 10

The mucous cells contained abundant acid material, in addition to mucopolysaccharides, identified by AB-PAS (pH 2.5) and PAS stain. The secretions of protein origin were manifested by the colouring of HE. The standardization of the effect of the colourings in HE, AB-PAS and PAS demonstrated the presence of different compositions in the mucous tissues of the foot, showing also that this structures are involved in the production of multiple secretions, which are connected to the origin of the byssus (Brown et al, 1953; Tamarin et al 1972). Although the mucous cells are distributed primarily in the epithelial layer, these can also be observed between the connective tissue and the muscular layers. The mucous cells of a epithelial layer appear in a vacuolar form in the colouring with HE, as shown in the results, and reacted to the ABPAS in pH 2.5 (Fig. 3E and 3F). It could be confirmed the significant importance of the foot of the golden mussel, L. fortunei, in the processes of locomotion in the aquatic medium and provisional attachment to substrates through intermolecular interactions of van der Waals and in the production, secretion, and migration of substances for the formation of byssus.

ACKNOWLEDGMENTS

The authors would like to acknowledge CEMIG GT for the financial support and the Center

Microscopy

the

Universidade

Federal

Minas

Gerais

(http://www.microscopia.ufmg.br) for providing the equipment and technical support for experiments involving electron microscopy.

REFERENCES Arzt, E., 2006. Biological and artificial attachment devices: Lessons for materials scientists from flies and geckos. Materials Science and Engineering: C 26, 1245–1250. Bairati, A., Comazzi, M., Gioria, M., 2000. An ultrastructural study of connective tissue in mollusc integument: I. Bivalvia. Tissue and Cell 32, 425–436. Beninger, P.G., St-Jean, S., Poussart, Y., Ward, J.E., 1993. Gill function and mucocyte distribution in Placopecten magellanicus and Mytilus edulis (Mollusca: Bivalvia): the role of mucus in particle transport. Mar. Ecol. Prog. Ser. 98, 275–282. Beninger, P., Veniot, A., 1999. The oyster proves the rule: mechanisms of pseudofeces transport and rejection on the mantle of Crassostrea virginica and C. gigas. Marine Ecology Progress Series 190, 179–188. Brown, C.H., 1952. Some structural proteins of Mytilus edulis. Quarterly Journal of Microscopical Science 3, 487–502. Brugnoli, E., Clemente, J., Boccardi, L., Borthagaray, A., Scarabino, F., 2005. Golden mussel Limnoperna fortunei (Bivalvia: Mytilidae) distribution in the main hydrographical basins of Uruguay: update and predictions. Anais da Academia Brasileira de Ciências 77, 235–44. Collyer, W., Jurídica, C., 2007. Ballast Water, Bioinvasion and international reply (protuguese). Revista juridica 9, 145–160. Coyne, K.J.K., Waite, J.H.J., 2000. In search of molecular dovetails in mussel byssus: from the threads to the stem. Journal of Experimental Biology 203, 1425–1431. Cranfield, H.J., 1974. Observations on the function of the glands of the foot of the pediveliger of Ostrea edulis during settlement. Mar. Biol. 22, 211–223.

Darrigran, G., 2001. The golden mussel, a new-found enconomic and environmental problem to mercosul (spanish). Pesquisa Naval 209–220. Eble, A.F., 2001. Anatomy and histology of Mercenaria mercenaria. In: Kraeuter, J.N., Castagna, M. (Eds.), Biology of the Hard Clam. Elsevier, New York, pp. 117–220. Ferreira C. E. L., Gonçalves J. E. A., Coutinho R., 2004. Ship hulls and platforms as vectors in the introduction of exotic species (portuguese). In: Silva, J.S.V. and Souza, R.C.C.L. (Eds.), Ballast Water and bioinvasion. Interciência, Rio de Janeiro, pp. 143-155. Gao, H.H., Yao, H.H., 2004. Shape insensitive optimal adhesion of nanoscale fibrillar structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 7851–7856. Glauert, A.M., 1980. Fixation, dehydration and embedding of biological specimens. North-Holland Pub. Co. ; American Elsevier Pub. Co., Amsterdam : New York. Gosling, E.M., 2003. Bivalve molluscs : biology, ecology, and culture. Oxford ; Malden, MA : Fishing News Books. Hayat, M.A., 2000. Principles and Techniques of Electron Microscopy. Cambridge University Press. Côté, I.M., 1995. Effects of predatory crab effluent on byssus production in mussels. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 188, 233–241. Coyne, K.J., Waite, J.H., 2000. In search of molecular dovetails in mussel byssus: from the threads to the stem. Journal of Experimental Biology 203, 1425–1431. Jiang, Z., Du, L., Ding, X., Xu, H., Yu, Y., Sun, Y., Zhang, Q., 2012. A novel recombinant bioadhesive designed from the non-repeating region of Perna viridis foot protein-1. Materials Science and Engineering: C 32, 1280–1287. Kamino, K., 2008. Underwater Adhesive of Marine Organisms as the Vital Link Between Biological Science and Material Science. Mar Biotechnol 10, 111–121. Lane, D.J.W., Nott, J.A., 1975. A study of the morphology, fine structure and histochemistry of the foot of the pediveliger of Mytilus edulis L. J. Mar. Biol. Ass. 55, 477–495. Lee, J.S., Lee, Y.G., Park, J.J., Shin, Y.K., 2012. Microanatomy and ultrastructure of the foot of the infaunal bivalve Tegillarca granosa (Bivalvia: Arcidae). Tissue and Cell 44, 316–324.

Lin, A.Y.M., Brunner, R., Chen, P.Y., Talke, F.E., Meyers, M.A., 2009. Underwater adhesion of abalone: The role of van der Waals and capillary forces. Acta Materialia 57, 4178–4185. Lu, Q., Hwang, D.S., Liu, Y., Zeng, H., 2012. Molecular interactions of mussel protective coating protein, mcfp-1, from Mytilus californianus. Biomaterials 33, 1903–1911. Mansur, M.C.D., Santos, C.P. dos, Pereira, D., 2012. Freshwater invasive molluscs in Brazil: biology, prevention and control (portuguese). Redes Editora, Porto Alegre. Netto, O.S.M., 2011. Control of incrustation of invasive organisms in materials and cooling systems of hydroelectric plants (portuguese). Universidade Federal do Paraná, Curitiba. Nishida, A., Ohkawa, K., Ueda, I., Yamamoto, H., 2003. Green mussel Perna viridis L.: attachment behaviour and preparation of antifouling surfaces. Biomolecular Engineering 20, 381–387. Norenburg, J.L., Ferraris, J.D., 1990. Cytomorphology of the pedal aperture glands of Mya arenaria L. (Mollusca, Bivalvia). Can. J. Zool. 68, 1137–1144. Park, J.J., Kim, J.W., Shin, H.C., Lee, Y.G., Lee, J.S., 2011. Microanatomy and ultrastructure of foot of the equilateral venus, Gomphina veneriformis (Bivalvia: Veneridae). In: 2011 Meeting of the Korean Fisheries Societies, Busan, Korea, pp. 194– 195 [abstracts]. Passos, F.D., Domaneschi, O., Sartori, A.F., 2004. Biology and functional morphology of the pallial organs of the Antarctic bivalve Mysella charcoti (Lamy, 1906) (Galeommatoidea: Lasaeidae). Polar Biol 28, 372–380. Punt, A.G., Millward, G.E., Jones, M.B., 1998. Uptake and depuration of 63 Ni by Mytilus edulis. Science of the total environment 214, 71–78. Santos, C.P., Würdig, N.L., Mansur, M.C.D., 2005. Larval stages of the golden mussel Limnoperna fortunei (Dunker, 1957) (Mollusca, Bivalvia, Mytilidae) in the basin of Guaiba, Rio Grande do Sul, Brazil (portuguese). Brazilian Journal of Zoology 22 (3), 702–708. Seed, R., Richardson, C.A., 1999. Evolutionary Traits in Perna viridis (Linnaeus) and Septifer virgatus (Wiegmann) (Bivalvia: Mytilidae). Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 273–287.

Selin, N.I., Vekhova, E.E., 2003. Morphological Adaptations of the Mussel Crenomitilus grayanus (Bivalvia) to Attached Life. Russian Journal of Marine Biology/Biologiya Morya 29, 230–235. Sobieszek, A., 1973. The fine structure of the contractile apparatus of the anterior byssus retractor muscle of Mytilus edulis. J. Ultrastruct. Res. 43, 313–413. Tamarin, A., Keller, P.J., 1972. An ultrastructutal study of the byssal thread forming system in Mytilus. Journal of ultrastructure research 40, 401–416. Vogel, S., 2003. Comparative biomechanics: life's physical world. Princeton University Press. Waite, J.H., Qin, X.-X., Coyne, K.J., 1998. The peculiar collagens of mussel byssus. Matrix Biology 17, 93–106. Qin, X.X., Waite, J.H., 1998. A potential mediator of collagenous block copolymer gradients in mussel byssal threads. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95, 10517–10522. Zuccarello, L.V., 1981. Ultrastructural and cytochemical study on the enzyme gland of the foot of a mollusc. Tissue Cell 13, 701–713

FIGURE CAPTIONS Figure 1 - Length of the cilia of the foot of the mussel L. fortunei measured on ImageJ (public domain software). Figure 2 - Photograph of an individual of the species Limnoperna fortunei, where the foot (F), gills (G) and byssus threads (Bt) can be observed. Figure 3 - Light microscopy of the foot of L. fortunei (A) Sagittal section showing the ciliary epithelial layer (EL) connective tissue layer (CTL) and striated muscular layer (STM), in HE; (B) Detail showing the whole extension of the tissue around the foot channel (FC); the central portion presents secretions (FS) within the channel, delimited by the ciliary epithelial tissue with nuclei coloured purple, in HE. (C) Detail of the tissue at the edge of the foot presenting folds and ciliary epithelium (EL), in HE. (D) Sagittal section showing the ciliary epithelial layer (EL) connective tissue layer (CTL), striated muscle layer (STM) and smooth muscle layer (SMM), in PAS. (E) Detail showing the whole extension of the tissue around the foot channel (FC); the central portion presents secretions (FS) within the channel, delimited by the epithelial tissue and with nuclei coloured purple, in PAS. (F) Detail of the tissue at the edge of the foot presenting folds and ciliary epithelium (EL), in PAS. (G) Sagittal section showing the epithelial layer (EL) connective tissue layer (CTL), in AB-PAS. (H) Detail showing the whole extension of the tissue around the foot channel (FC); the central portion presents secretions (FS) within the channel, in AB-PAS. (I) Detail of the tissue at the edge of the foot presenting folds and ciliary epithelial layer (EL) and smooth muscle bundles (SMM), in AB-PAS. Figure 4 - SEM images of the surface of the foot with gradual zoom increases, showing (A) a panoramic image of the foot of L. fortunei with a channel in the ventral region; (B) Foot surface with multiple projections and ciliary tufts; (C) detail of the surface covered with cilia; (D) details of the cilium (Ci) whose distal portion presents a smaller diameter than the rest of the stem. Figure 5 - Transmission microscopy image showing a massive presence of axoneme (An), the basic composition of cilia and flagella. (A) epithelial tissue of the foot, detailing the composition of the structure and the presence of axonemes (An) and mitochondria (Mt) throughout the tissue. (B) Detail of the composition of the axoneme, (An) formed by 9 pairs of microtubules around a central pair. Figure 6 â&#x20AC;&#x201C; Average dimensions of the cilia obtained utilizing the Software imageJ.

Figure 7 - SEM image showing the existence of a channel throughout the length of the foot. (A) Panoramic image showing the filaments of the byssus (BT) and the foot channel (FC). (B) Increased zoom on the ventral portion of the foot showing the edged of the channel (FC); (C) Detail of the interior of the channel (FC) covered with cilia. (D) Detail of the interior of the channel with secretions (Se) deposited on the surface of the cilia. Figure 8 - Transmission electron microscopy (TEM) of the secreting cells on the foot of L. fortunei. (A) secreting cells of the type A in the epithelial layer; the secretion beads (Gl A) present low electron density, exhibiting ligh shades of gray. (B) secreting cells of the type B in the layer of connective tissue; the secretion beads (Gl B) present higher electron density than in A, but lower than in C, exhibiting medium shades of gray. (C) secreting cells of the type C; the secretion beads (Gl C) presented high electron

density, exhibiting darker shades of gray. (D) Detail of the presence of a large number of mitochondria (Mt) and secretion beads of the type A (Gl A), the most abundant in the whole tissue. Figure 9 â&#x20AC;&#x201C; Light microscopy of the foot of L. fortunei. (A) sagittal section of the tissue around the channel of the foot revealing the presence of byssal secretions (BS) within the channel. (B) Detail of the secretion (FS) within the foot channel, delimited by ciliary epithelial tissue (EL).

Figure 10 â&#x20AC;&#x201C; Transmission electron microscopy (TEM) of the foot of the L. fortunei, delimiting the cells of the epithelial tissue. The nuclei (Nc) of these are quite evident, as well as the rough endoplasmic reticulum (RER).

Figure 1 Click here to download high resolution image

Figure 2 Click here to download high resolution image

Figure 3 Click here to download high resolution image

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Figure 6

EDGE DIAMETER MEAN:

0.1 µm EDGE LENGTH MEAN:

0.6 µm

LENGTH MEAN:

6.8 µm CILIA DIAMETER MEAN:

0.2 µm

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Figure 10 Click here to download high resolution image

UNIDADE III

Trabalhos de

Iniciação

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO TECNOLÓGICA E INOVAÇÃO - PIBIC

Ministério da Ciência e Tecnologia / CNPq - Edital 2012 / 2013 Programa Institucional de Iniciação Científica – Fundação CETEC

GT343 – Controle do Mexilhão Dourado: Bioengenharia e novos materiais para aplicações em ecossistemas e usinas hidrelétricas Letalidade do mexilhão dourado Limnoperna fortunei (Dunker) à cianotoxinas em condições experimentais RF-PIBIC GT343 / CNPq / Agosto/ 2013

Vinicius Sergio Rodrigues Diniz Autor Dra Mônica de Cássia Souza Campos Orientadora Dra Patrícia Faleiro Pimentel Co-orientadora

______________________________________________________________________ UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais ______________________________________________________________________

Centro Tecnológico SENAI CETEC _____________________________________________________________________ GERENTE DE INOVAÇÃO E TECNOLOGIA José Eustáquio Drumond

Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais - CETEC PRESIDENTE Marcílio César de Andrade Av. José Cândido da Silveira, 2000 - Horto Florestal - Belo Horizonte - MG – 31035-536 Telefone: (31) 3489-2000 / Fax: (31) 3489-2200 – Portal: www.cetec.br - E-mail: faleconosco@cetec.br

Centro Tecnológico SENAI CETEC Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais / CETEC Projeto concernido – GT343

Orientadora: Dra Mônica de cássia campos.

Autores: Vinicius Sergio Rodrigues Diniz, estudante do curso de ciências biológicas, UFMG Dra Mônica de Cássia Souza Campos, Pesquisadora CETEC SENAI

Sumário( 1 INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 1! 2 OBJETIVOS ................................................................................................................... 2! 3 PROBLEMA(S) .............................................................................................................. 3! 4 MATERIAIS e MÉTODOS .............................................................................................. 3! 4.1 EXPERIMENTOS de SOBREVIVÊNCIA de LARVAS em DIFERENTES CONCENTRAÇÕES de CIANOTOXINAS ...................................................................... 3! 4.1.1 CIANOBACTÉRIAS UTILIZADAS (MANUTENÇÃO ) ...................................... 4! 4.1.2 CONCENTRAÇÂO de CIANOTOXINAS NAS AMOSTRAS................................... 4! 4.1.3 COLETA e OBTENÇÃO de LARVAS. ................................................................ 5! 4.1.4 CONTAGEM das LARVAS de MEXILHÃO DOURADO ..................................... 5! 4.1.5 DESENHO EXPERIMENTAL ............................................................................ 5! 4.2 EXPERIMENTOS COM MEXILHÕES ADULTOS .................................................... 6! 4.2.1 EXPERIMENTO 1 : AVALIAÇÃO da TAXA de FILTRAÇÃO do MOLUSCO PARA DIFERENTES GRUPOS de CIANOBACTÉRIAS (TÓXICAS e NÃO TÓXICAS) 6! 4.2.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ................................................................. 6! 4.2.3 CÁLCULO da TAXA de FILTRAÇÃO dos BIVALVES ....................................... 7! 4.2.4 MÉTODOS de CONTAGEM da DENSIDADE de CÉLULAS ............................... 7! 4.3 EXPERIMENTO 2: MORTALIDADE de ADULTOS na PRESENÇA de EXTRATO de MICROCYSTIS AERUGINOSA ..................................................................................... 8! 4.3.1 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ................................................................. 9! 4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA ......................................................................................... 9! 5.1 SOBREVIVÊNCIA de LARVAS em DIFERENTES CONCENTRAÇÕES de CIANOTOXINAS .......................................................................................................... 9! 5.2 EXPERIMENTOS COM ADULTOS ........................................................................ 10! 6 CONCLUSÕES............................................................................................................. 14! 7 REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 14!

Letalidade do mexilhão dourado Limnoperna fortunei (Dunker) à cianotoxinas em condições experimentais 1 INTRODUÇÃO Limnoperna fortunei é um molusco Bivalve da família Mytilidae, conhecido vulgarmente como Mexilhão Dourado. Sua distribuição geográfica restringia-se ao sudeste asiático, contudo, foi reportado como uma espécie invasora em Hong Kong e, em 1991, no Japão e na América do Sul. O tempo curto de geração do molusco, a plasticidade fenotípica, aliados a um comportamento gregário (animais que vivem em grupos), uma grande abundância em seu habitat natural, uma ampla tolerância ambiental e associação a atividades humanas, são causas da rápida dispersão do animal entre diferentes tipos de ambientes aquáticos (Ruckert & Campos, 2004).

As cianobactérias são organismos que, por meio da fotossíntese, obtêm energia para crescer e se reproduzir. O aumento em abundância desses organismos é prejudicial à qualidade das águas em reservatórios, devido ao seu risco potencial de toxicidade RESENDE (2007). Em nível da qualidade da água, os grandes problemas surgem devido ao esgotamento de nutrientes, sobressaturação de oxigênio durante o dia e depleção do mesmo durante a noite, formação de tapetes sobre a superfície da água, alteração da viscosidade do meio, e alteração de odor e sabor da água (Vasconcelos, 1995, Fernandes, 2008). Quando o ecossistema não suporta mais crescimento, dá-se o colapso de parte da massa de cianobactérias, que entra em decomposição, podendo levar à depleção do oxigênio na água e à produção de ácido sulfídrico, amônia e hidroxilamina (Vasconcelos, 1995). Este fenômeno pode conduzir à mortandade das populações animais e produzir odores indesejáveis. Ao nível humano, os principais problemas estão relacionados à produção de metabólitos secundários que são acumulados no ambiente ou bioacumulados: as cianotoxinas, causadoras de uma gama de problemas (Fernandes, 2008). As cianotoxinas são compostos produzidos pelas cianobactérias que podem afetar a biota aquática, resultando em efeitos tóxicos assim como em ambientes terrestres (Sivonen & Jones, 1999), ainda não é clatra a razão de sua produção, embora acredita-se que possam auxiliar na competição e na redução da predação (Cybis, et al., 2006). Em termos de estrutura química, as cianotoxinas são divididas em peptídeos cíclicos, alcaloides e lipopolissacarídeos. Quanto aos mecanismos da toxicidade, são muito diversos e variam de efeitos hepatotóxicos, neurotóxicos e dermatotóxicos até a inibição geral de síntese proteica (Sivonen & Jones, 1999). Dentre as cianotoxinas testadas nesse trabalho incluem-se a microcistina: heptapeptídeos cíclicos que têm efeito na inibição de fosfatases, atuando como potentes produtores de tumores (CETESB, 2013 & Cybis, et

al., 2009). As microcistinas apresentam diferentes

variações na estrutura molecular e possivelmente as diferentes formas causem diferentes efeitos em moluscos, alem da possibilidade de outros metabólitos produzidos pelas cianobactérias afetarem o mexilhão como ocorrem em larvas de peixes, microcustáceos, entre outros (FUNASA, 2003). Além desta cianotoxina, foi testada a influência da saxitoxina: alcalóides carbamatos, que produzem efeitos neurotóxicos, por inibição da transmissão nervosa através de bloqueio dos canais de sódio nas células. Essa cianotoxina pode ser produzida principalmente dos gêneros Microcystis, Anabaena, Nodularia, Oscillatoria, Nostoc e Cylindrospermopsis (Carmichael, 1994).

L. fortunei é um molusco filtrador capaz de ingerir partículas em suspensão (Borges, 1985 apud Amorim, 1987) e assim como outros filtradores, pode ingerir cianobactérias e cianotoxinas, sendo um potencial bioacumulador (Amorim & Vasconcelos, 1999). AMORIM (1997) mostrou a capacidade de depuração do Mytilus galloprovincialis após a ingestão de Microcystis aeruginosa, sendo que o filtrador reduziu a quantidade de microcistina presente na água, porém essa cianotoxina retornava ao ambiente por meio das fezes. Dessa forma o molusco pode ingerir toxinas e metabolizá-las sem prejudicá-lo.

GAZULHA, et al.(2012a) testaram a influência da forma das cianobactérias na taxa de filtração de mexilhões adultos os quais demostraram uma preferência por formas unicelulares à formas coloniais e filamentosas. Resultados semelhantes, levando em conta o formato da célula foram relatados em CATALDO, et al. (2012). Os autores também discutiram a influência da microcistina nas taxas de filtração, sendo encontrada uma diferença significativa de filtração para as cepas de Microcystis não produtoras de toxinas. Por outro lado, GAZULHA, et al. (2012b) e RUCKERT et al. (2004) evidenciaram que L. fortunei na presença de toxinas pode apresentar taxa de filtração semelhante para cepas não toxicas, mostrando que a forma pode ser um aspecto mais relevante para o sucesso alimentar. Esta divergência de resultados, pode ter ocorrido devido à ausência de medição da concentração da toxina nos experimentos. Tal avaliação foi realizada por CATALDO, et al, (2012) que evidenciaram ausência de redução da taxa de filtração em concentrações de até 2µg.L-1 de cianotoxinas, porém, em concentrações acima de 8 µg.L-1, uma taxa de mortalidade significativa de mexilhões foi observada. Ainda não há estudos que testem o efeito da saxitoxina, conhecida por causar paralisia em moluscos (Oliveira, et al. 2010), na taxa de filtração e mortalidade desses organismos.

2 OBJETIVOS

•

Avaliar o efeito de cianobactérias produtoras e não produtoras de toxina sobre o L.fortunei.

•

Expor o mexilhão a diferentes concentrações de cianobactérias produtoras de microcistina e saxitoxina, avaliando o efeito na taxa de filtração e mortalidade.

3 PROBLEMA(S) O mexilhão dourado e as cianobactérias são causadores de impactos ambientais e podem agir em conjunto ou isoladamente, gerando problemas de cunho econômico e ambiental. Os impactos causados por L. fortunei, relatados em DARRIGRAN & PASTORINO, (1995) e RUCKERT & CAMPOS (2004) são resultantes principalmente, da obstrução de tubulações pelo crescimento descontrolado do molusco em sistemas de captação de água bruta, dificultando o funcionamento de hidrelétricas, por exemplo. A obstrução causa uma perda da área e aumento da rugosidade da tubulação, implicando em um aumento da vazão para manter a pressão (Resende, 2007). Impactos na estrutura das comunidades aquáticas foram explicitados por RICCIARDI (1997) entre outros, cujos estudos mostraram que a presença do molusco em substratos artificiais é capaz de modificar a comunidade de macroinvertebrados tanto na sua densidade quanto na diversidade. L. fortunei é um molusco filtrador. Estudos realizados em laboratório apontam divergências na taxa de filtração do mexilhão dourado na presença de cianobactérias tóxicas GAZULHA, et al.(2012), GAZULHA, et al.(2012b), CATALDO, et al. (2012) RUCKERT et al. (2004) Tendo em vista a contradição nos estudos científicos, este estudo procurou avaliar a interação entre esses dois grupos em laboratório, testando-se a influência da concentração de cianotoxinas na sobrevivência e comportamento alimentar do bivalve.

4 MATERIAIS e MÉTODOS 4.1 EXPERIMENTOS de SOBREVIVÊNCIA de LARVAS em DIFERENTES CONCENTRAÇÕES de CIANOTOXINAS Para estudos com larvas buscou-se avaliar a taxa de sobrevivência dos estágios larvais planctônicos em diferentes concentrações de cianotoxinas. O intuito foi avaliar os efeitos de cianobactérias produtoras de cianotoxinas ou não tóxicas para a mortalidade de estágios larvais e quantificar em quais concentrações isso ocorreria. Para utilizar as cianobactérias utilizou-se o método de Kuroda, et al, (2000) para romper as células e expor as larvas somente aos metabólitos produzidos pelas cianobactérias.

4.1.1 CIANOBACTÉRIAS UTILIZADAS (MANUTENÇÃO ) . Pra a realização dos experimentos, utilizou-se uma cepa de Microcystis aeruginosa (FIGURA 2A) produtora de microcistina, obtida por coleta direta na lagoa da Pampulha e isolada em laboratório segundo o método descrito por KUGRENS et al. (2000). Foi utilizada também uma cepa de Cylindrospermopsis raciborskii (FIGURA 2B) produtora de saxitoxina cedida pelo pesquisador Dr Fernando Antônio Jardim pelo Setor de Hidrobiologia do laboratório central da COPASA (Companhia de Saneamento de Minas Gerais).

Outra cianobactéria

utilizada foi Sphaerocavum sp. (FIGURA 2C) obtida em uma coleta no município de Confins (MG) e isolada em laboratório segundo KUGRENS et al. (2000).A utilização de Sphaerocavum sp. testou a possível influência de outros metabólitos, visto que ela não produzia microcistina bem como saxitoxina. A manutenção das cianobactérias é feita em meio ASM 1.

A Fonte, SANT’ANNA et al, 2007 B fonte : http://greenwaterlab.com/algal-id. C fonte: http://www.nhm.ac.uk/natureonline/species-of-the-day/scientific-advances/disease/microcystis-aeruginosa/

FIGURA 2-A Microcystis aeruginosa; B Sphaerocavum sp; C Cylindrospermopsis raciborskii

4.1.2 CONCENTRAÇÂO de CIANOTOXINAS NAS AMOSTRAS Para a análise quantitativa da concentração de cianotoxinas presentes na água, as amostras foram congeladas e descongeladas no total de três vezes (Kuroda et al, 2000), homogeneizadas e analisadas pelo método de imunoensaio

do tipo placas de ELISA, da

marca BEACON. Para a quantificação de cianotoxinas foi necessário filtrar as amostras com filtro de membrana com o diâmetro de poro (retenção) de 0,2 µm (Jardim, 2008). Antes da análise de microcistina foram adicionados a cada tubo 100 µL de EDTA 0,1 M para complexar o ferro presente nas amostras, propiciando assim uma menor interferência desse metal durante a análise imunoenzimática (Magalhães & Azevedo, 2004) e para saxitoxina 4 ml de ácido acético 50mM (Carneiro et al (2009).

4.1.3 COLETA e OBTENÇÃO de LARVAS. Foi realizada uma coleta na tomada de água da piscicultura do reservatório de Volta Grande MG por meio de redes de plâncton 35µm. Desta forma foram coletadas amostras do plâncton contendo larvas de mexilhão (Figura 1A). A coleta foi realizada neste ponto frente à grande densidade de adultos encontrados no local (Figura1B). Após coletadas, as amostras foram levadas imediatamente para o laboratório próximo ao local de coleta para identificação, contagem e a realização do experimento.

FIGURA 1: A (Acima) Filtração das larvas com rede de plâncton; B (Abaixo) nível de infestação de adultos de mexilhão dourado.

4.1.4 CONTAGEM das LARVAS de MEXILHÃO DOURADO As larvas foram separadas da amostra por meio de uma pipeta de Pasteur de vidro. O número de larvas foi contabilizado e identificado após a sedimentação do material em câmara reticulada de Pexiglass e exame em microscópio invertido Zeiss (aumento 100X).

4.1.5 DESENHO EXPERIMENTAL Após a coleta e contagem das larvas, as mesmas deveriam ser distribuídas em poços de uma placa multicanal onde estavam amostras de cianotoxinas em diferentes concentrações (FIGURA 3). Nas linhas B-G (FIGURA 3) seriam distribuídos 5 larvas de mexilhões em cada poço. O experimento teria a duração de 3 horas com averiguação a cada 15 minutos e a mortalidade das larvas seria constatada por meio da interrupção do batimento ciliar. Foram

utilizados todos os compostos ao mesmo tempo visto que o tempo de vida das larvas fora do ambiente natural é curto.

FIGURA 3 Esquema da placa: Na primeira linha “A” poços contendo somente os “extratos” de cianobactérias sem a presença do mexilhão, nas linhas B a F poços com as cianotoxinas distribuídas respectivamente nas seguintes concentrações: 100%, 80%, 60%, 40% e 20%. A coluna G corresponde ao controle contendo somente larvas sem a presença de extratos de cianobactérias

4.2 EXPERIMENTOS COM MEXILHÕES ADULTOS 4.2.1 EXPERIMENTO 1 : AVALIAÇÃO da TAXA de FILTRAÇÃO do MOLUSCO PARA DIFERENTES GRUPOS de CIANOBACTÉRIAS (TÓXICAS e NÃO TÓXICAS) O experimento avaliou a possível influência entre a presença de cianotoxinas e a taxa de filtração do L. fortunei. Para isso foram utilizadas duas cepas de Microcystis aeruginosa (produtora e não produtora de microcistina) e duas cepas de Cylindrospermopsis raciborskii produtora e não produtora de saxitoxina além de uma Spherocavun que não produzia nenhuma cianotoxina testada. O experimento consistiu na avaliação da taxa de filtração do mexilhão conforme descrito por Gazulha, et al. (2012) levando em conta três variáveis presentes em cianobactérias: sua forma, a presença de toxina e o tipo de toxina.

4.2.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL O experimento foi realizado em cinco etapas, uma com cada cepa de cianobactéria. Cada etapa possuía treze béqueres contendo 120 ml de solução com cianobactérias. O grupo

controle possuía três béqueres contendo somente as cianobactérias testadas e os outros dez béqueres continham um mexilhão em cada e a solução de cianobactérias para efetuar o calculo da taxa de filtração por recipiente. Uma alíquota do meio foi removida no início do experimento e congelada para medir a quantidade de cianotoxinas. A duração do experimento foi de uma hora e trinta minutos à partir do momento que o mexilhão abriu o sifão e ao término desse período a solução contendo as cianobactérias foi recolhida e fixada com lugol para realizar a contagem de células e posteriormente efetuar o cálculo da taxa de filtração. Os mexilhões usados apresentavam entre 15 a 20 milímetros de comprimento, sendo que todos passaram por um período de inanição de 24 horas antes início do experimento para a eliminação de resíduos do trato digestivo.

4.2.3 CÁLCULO da TAXA de FILTRAÇÃO dos BIVALVES Para fazer o cálculo da taxa de filtração é preciso contabilizar a quantidade de células que são selecionadas pelo mexilhão e não são levadas ao trato digestivo. Portanto algumas cianobactérias são filtradas, mas não são assimiladas, desta maneira ficam retidas em muco e expelidas do corpo: as pseudofezes. Por conseguinte, é de vital importância contabilizar o numero de células nas pseudofezes para efetuar o cálculo da taxa de filtração. O método descrito por Grazulha, et al, 2012a para efetuar o cálculo é baseado na captura das pseudofezes para posteriormente separar as cianobactérias do muco. A taxa de filtração é grosseiramente calculada pela concentração inicial de células no béquer, subtraída pela concentração final, menos a concentração obtida nas pseudofezes. Porém o método é inviável, pois não é possível capturar as pseudofezes sem remover uma alíquota de água e de células do meio, desta maneira a quantidade pode ser superestimada. Para esse trabalho mantivemos as pseudofezes no meio e ao término do experimento fixamos com lugol. Para efetuar a contagem das células acrescentou-se NaOH 1M na proporção de 2:1 (1 mL da cultura : 0,5

mL de NaOH) mantendo-se em banho-maria a 60ºC durante 10 min até a liberação das células do muco e posteriormente efetuar-se a contagem total de células em solução. .

4.2.4 MÉTODOS de CONTAGEM da DENSIDADE de CÉLULAS As culturas de cianobactérias que apresentavam formato esférico (Microcustis e Sphaerocavum) foram contadas após a homogeneização, da amostra fixada com lugol para análise em câmara de Neubauer (figura 4). A escolha da área de contagem foi feita segundo a densidade de células presentes na amostra. Se a densidade era alta, a contagem era feita nos círculos vermelhos (figura 4) quando a densidade celular fosse baixa, a contagem era feita nos círculos azuis. Cada quadrado grande possui área de 1,0mm² e com uma coluna de 0,1mm, portanto possui o volume de 0,1mm³ (Honda 2005).

Fonte: http://medical.tpub.com/14295/css/14295_279.htm FIGURA 4 – Esquema da câmara de Neubauer

Para a contagem de Cylindrospermopsis racirsbokii foi usada a câmara de Sedgwick Rafter segundo recomendado por (CETESB, 2005) visto que as colônias são filamentosas e torna inviável a contagem pelo método de Neubauer. A contagem de células pelo método de Sedgewick Rafter é amplamente utilizada na análise da água, inspeção de cultura e de qualquer outro líquido, onde as partículas por unidade de volume devem ser determinadas.

4.3 EXPERIMENTO 2: MORTALIDADE de ADULTOS na PRESENÇA de EXTRATO de MICROCYSTIS AERUGINOSA !

Avaliou-se a provável interferência de outros metabólitos, que não a cianotoxina

conhecida, na mortalidade do mexilhão dourado e no comportamento do mesmo. Para isso induziu-se a lise celular de uma Microcystis aeruginosa, não produtora de microcistina pelo método de KUDORA, 2005 para expor os bivalves somente aos metabólitos isolados dos

resíduos da lise das células. Para ter uma concentração maior de metabólitos, as culturas eram congeladas após atingirem uma concentração de 106 células/mL para a posterior lise.

4.3.1 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL Para realizar os experimentos foram selecionados 120 mexilhões com tamanho variando entre 15 a 20 mm . Os mexilhões passaram por um período de inanição de 24 horas para limpeza do trato intestinal antes do início do experimento. Após conseguir o extrato das cianobactérias, foram feitas diluições de 100% 80%, 60%, 40% e 20% e distribuídas em duas réplicas por tratamento em béqueres de 500 ml. Além disso, existiam dois controles com 10 mexilhões em cada béquer apenas com água. Para realizar o experimento, os béqueres, contendo 10 mexilhões cada um, foram mantidos em câmara de geminação a uma temperatura de 24 0C e fotoperíodo (12/12) constantes e com aeração e sem reposição do volume inicial do liquido. Foi feito diariamente o registro do número de mexilhões mortos, bissados e em atividade de filtração. O experimento durou até que todos os mexilhões estivessem mortos devido à evaporação da água dos béqueres.

4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA Nas análises estatísticas e na representação gráfica dos resultados foi utilizado o programa STATISTICA versão 8.0. As análises estatísticas fundamentaram-se em TRIOLA (1999) e incluíram: •

Estatísticas descritivas: de caráter exploratório; tiveram o intuito de resumir e descrever atributos, estes representados pelos valores da média aritmética e da dispersão dos dados (desvio padrão, mediana, valor máximo e valor mínimo), que foram tabulados ou representados em diagramas de caixas (boxplots).

•

A anova não paramétrica de Kruskal-Wallis foi utilizada para detectar diferenças significativas entre os parâmetros “taxa de filtração” e “categoria taxonômica de cianobactéria avaliada” visto que não foi constatada a homogeneidade de variâncias testadas. Foi rejeitada a hipótese nula com níveis usuais de probabilidade (0,05).

5 DESENVOLVIMENTO E ANÁLISE DE RESULTADOS 5.1 SOBREVIVÊNCIA de LARVAS em DIFERENTES CONCENTRAÇÕES de CIANOTOXINAS Para o experimento com larva era necessário que encontrássemos um numero mínimo (n= 5 por tratamento) de larvas para preencher os poços da microplaca. Porém durante a contagem das amostras obtidas em campo foi constado que não existia o número necessário, desta maneira o experimento não pode ser realizado.

5.2 EXPERIMENTOS COM ADULTOS 5.2.1 EXPERIMENTO 1 : AVALIAÇÃO da TAXA de FILTRAÇÃO do MOLUSCO PARA DIFERENTES GRUPOS de CIANOBACTÉRIAS (TÓXICAS e NÃO TÓXICAS) Os experimentos com as diferentes espécies de cianobactérias foram realizados em dias diferentes, porém em condições semelhantes entre 14 e 17 horas e com temperatura entre 19 e 22 °C. No experimento com a cepa tóxica de Cylindrospermopsis raciborskii o mexilhão apresentou taxas de filtração com média 17.51 mL/mexilhão.h com valores mínimos e máximos de 0 e 58.11 mL/mexilhão.h respectivamente. O tamanho médio dos mexilhões foi de 17.62 milímetros e peso médio de 0.09 g (Tabela 1). TABELA 1 Estatísticas descritivas (Filtração Cylindrospermopsis raciborskii (T)) Variável

Média (DP)

Taxa de filtração

17.51 (18.58)

11.33

58.11

Peso

0.09 (0.02)

0.08

0.05

0.14

Tamanho do molusco

17.62

15.51

19.94

17.62 (1.4)

Mediana Mínimo

Máximo

DP – Desvio Padrão; CV – Coeficiente de variação;T-x toxica

No experimento com a cepa não tóxica de Cylindrospermopsis raciborskii o mexilhão apresentou taxas de filtração com média 29.11 mL/mexilhão.h com valores mínimos e máximos de 0 e 85.30 mL/mexilhão.h respectivamente. O tamanho médio dos mexilhões foi de 17.16 milímetros e peso médio de 0.09 g (Tabela 2). TABELA 2 Estatísticas descritivas (Filtração Cylindrospermopsis raciborskii (NT)) Variável

Média (DP)

Taxa de filtração

29.11 (36.71)

10.92

85.30

Peso

0.09 (0.02)

0.09

0.05

0.14

Tamanho do molusco

17.96

15.91

19.61

17.16 (1.0)

Mediana Mínimo

Máximo

DP – Desvio Padrão; CV – Coeficiente de variação;NT- Não toxica

No experimento com gênero Spherocavum sp. o mexilhão apresentou taxas de filtração com média 17.25 mL/mexilhão.h com valores mínimos e máximos de 0 e 44.70 mL/mexilhão.h respectivamente. O tamanho médio dos mexilhões foi de 17.16 milímetros e peso médio de 0.06 g (Tabela 3). TABELA 3 Estatísticas descritivas (Filtração com gênero Spherocavum sp (NT)) Variável

Média (DP)

Mediana Mínimo

Máximo

Taxa de filtração

17.25 (16.56)

19.29

44.70

Peso

0.06 (0.02)

0.06

0.01

0.09

Tamanho do molusco

17.01

15.16

19.75

17.16 (1.0)

DP – Desvio Padrão;NT- Não toxica

No experimento com a cepa não tóxica de Microcystis aeruginosa o mexilhão apresentou taxas de filtração com média 31.39 mL/mexilhão.h com valores mínimos e máximos de 0 e 85.30 mL/mexilhão.h respectivamente. O tamanho médio dos mexilhões foi de 17.82 milímetros e peso médio de 0.06 g (Tabela 4). TABELA 4 Estatísticas descritivas (Filtração Microcystis aeruginosa (NT)) Variável

Média (DP)

Mediana Mínimo

Máximo

Taxa de filtração

31.39 (20.07)

11.33

85.30

Peso

0.08 (0.03)

0.09

0.05

0.14

Tamanho do molusco

17.82 (1.35)

17.62

15.51

19.94

DP – Desvio Padrão ;NT- Não toxica

A dispersão dos dados de filtração para as diferentes cianobactérias pode ser visualizada na FIGURA 5. Os resultados para as taxas de filtração foram significativamente diferentes segundo a cepa de cianobactéria usada (Tabela 5) sendo nula para Microcistis aeruginosa produtora de microcistina e semelhante para os demais grupos. A Tabela 5 mostra que as taxas de filtração são semelhantes para os demais grupos de cianobactérias ao se excluir a cepa tóxica de M. aeruginosa mesmo incluídas as outras cepas tóxicas como as do gênero de C. raciborskii. Todos os resultados mostram que as taxas de filtração foram baixas, se comparados a taxas de filtração estabelecidas em outros trabalhos como Cataldo et al, 2012; Ruckert & Campos, 2004 Um baixa taxa de filtração mesmo em presença de cianobactérias não tóxicas como ocorreu para Spherocavum sp parecem indicar portanto a existência de um outro fator ou substância que inibiria a atividade de alimentação do molusco. Isso provavelmente acontece pela produção de outros metabólitos de cianobactérias não testados e ou detectáveis pelo método utilizado e que poderiam afetar outros seres vivos (CHRISTOFFERSEN K.,1996). Os testes foram realizados em concentrações acima de 104 células/ml ,portanto a concentração de metabolitos no meio é alta. Esse resultado mostra que a interação entre as cianobactérias e mexilhão dourado é mais complexa que o inicialmente proposto e envolve não somente a forma e a presença de cianotoxinas, bem como outros metabólitos que precisam ser estudados. TABELA 5 - Teste Kruskal Wallis para a taxa de filtração de adultos expostos a diferentes cianobactérias Variável

Espécies de

cianobactérias Taxa de filtração Taxa de filtração

23,44

0,001

3,43

0,32

Ao se comparar as taxas de filtração entre duas cepas tóxicas, porém com formas diferentes,

M aeruginosa colonial,

Tf = 0

e C. raciborski, filamentosa Tf = 17.51

mL/mexilhão.h verificou-se que houve filtração apenas para a exposição à segunda espécie. Provavelmente isso se deu por uma diferença no grau de toxicidade da cianotoxina testada e não devido à forma das colônias já que, avaliando-se apenas o fator forma das cianobactérias verificamos que as taxas de filtração entre as formas coloniais e filamentosas de cepas não tóxicas foi indistinta estatisticamente ( teste t = 0,64

e p =0,47 n= 30) confirmando os

resultados de CATALDO et al., ( 2012) e os resultados obtidos no relatório precedente (Diniz, & Campos, 2012). Boxplot Taxa de Filtração (mL/mexilhão . h) 90 80 70

T. Filtração

60 50 40 30 20 10 0 -10 C. raciborskii (NT)

M. aeruginosa (Nt) Spherocavun

C. raciborskii (T)

Mediana 25%-75% Min-Max

Espécie FIGURA 5 Taxas de filtração de Limnoperna fortunei exposto a cepas tóxicas de Microcystis e Cylindrospermopsis. (p<0,05)

Um outro aspecto que poderia interferir seria uma alta densidade de células no meio que poderia inibir a filtração (Vasconcelos 2008). Todavia, alguns estudos indicam o contrário

para o molusco Mytilus galloprovincialis que realizou a filtração em 105 células/ml segundo Fernandez (2008) ou mesmo o próprio L. fortunei como mostram os resultados deste estudo que indicaram que o bivalve que foi capaz de filtrar em concentrações parecidas de M. aeruginosa não tóxica. Portanto acredita-se que o principal fator para este resultado distinto na filtração das duas cepas tóxicas se deva à elevada concentração de cianotoxinas no meio (3.61 ppb), sobretudo para o experimento com Microcistis, o que possivelmente pôde ser detectado pelo molusco. O mexilhão, portanto, não tolera concentrações elevadas de cianotoxinas, e desta maneira teve sua taxa de filtração afetada, como relatado também em CATALDO, et al (2012). Acredita-se portanto que baixas concentrações de cianotoxinas no meio podem provocar respostas distintas, já que alguns estudos mostram que o mexilhão não é afetado pela microcistina (GAZULHA ,et al, 2012 e RUCKERT, et al, 2004 ) ou seja, nesse caso o mexilhão pode não sofrer influência na sua taxa de filtração.

A presença da saxitoxina reduziu inicialmente a taxa de filtração do molusco. A concha da maioria dos bivalves manteve-se aberta durante o experimento com C. raciboskii produtora de saxitoxina, porém a taxa de filtração foi baixa. Como relatado por OLIVEIRA, et al, 2010 a saxitoxina pode causar paralisia em moluscos, por conseguinte os mexilhões mantiveram-se com a concha aberta porém não conseguiram realizar a filtração depois de um certo tempo de exposição. Como a quantificação das concentrações de cianotoxina não foi possível neste caso, os resultados não permitem afirmar se a filtração manteve-se por um tempo porque a concentração não era tão elevada ou se apesar de em alta concentração ocorreu um tempo para que o efeito de paralisação do sifão inalante se manifestasse.

5.2.2 EXPERIMENTO 2: MORTALIDADE de ADULTOS na PRESENÇA DE EXTRATO de MICROCYSTIS AERUGINOSA O experimento 2 demonstrou que a sobrevivência dos mexilhões em presença de concentrações mais altas de extratos celulares de M. aeruginosa é menor (figura 6). Na concentração de 100% a curva foi a primeira a chegar ao valor de “0” sobreviventes. Nas outras curvas a tendência para concentrações maiores relacionadas ao menor número de sobreviventes não foi bem estabelecida. Em um dos tratamentos de 40%, ocorreu uma mortandade muito grande nos dias 4 e 5, fenômeno que foi causado por um problema não identificado. Por tratar-se de um experimento preliminar não é possível fazer inferências estatísticas e embasamentos fortes para os fenômenos, porém foi possível observar que concentrações elevadas de metabólitos de cianobactérias não toxicas causam efeitos negativos no L.fortunei.

Portanto é preciso realizar novos experimentos e estudar outros metabólitos de cianobactérias e seus efeitos no mexilhão.

Número'de'sobreviventes'

25! 20! 100%! 15!

80%! 60%!

10!

40%!

20%! Controle!

0! 1! 2! 3! 4! 5! 6! 7! 8! 9! 10! 11! 12! 13! 14! Dias'

FIGURA 6 Curva de sobreviventes em diferentes concentrações de extratos de cianobactérias

6 CONCLUSÕES Os resultados gerados neste estudo mostraram que as taxas de filtração do bivalve adulto são reduzidas ou inibidas na presença de altas concentrações de toxina . Acima de 3ppbs de microscitina, o mexilhão não abre o sifão e não filtra. Por outro lado os dados sugerem que podem existir níveis toleráveis de cianotoxinas nos quais o mexilhão consegue manter sua atividade de filtração. Concluímos que somente em concentrações menores que 3 ppb, L. fortunei é bioacumulador de microcistina e acima destes níveis sua atividade disiológica é limitada. Nos testes com saxitoxina, foi registrada a abertura do sifão porém com baixas taxas de filtração. Isso ocorre porque a toxina exerceu um efeito paralisante sobre os mesmos, contudo é preciso ainda avaliar em estudos posteriores em quais concentrações na água ela exerce esse efeito. Além das cianotoxinas, outros metabólitos produzidos pelas cianobactérias podem causar efeitos nocivos em moluscos, como indicam os resultados preliminares com a exposição a extratos celulares após a lise celular.

7 REFERÊNCIAS AMORIM, A., “Acumulação e depuração de microcistinas por Mytilus galloprovincialis Lamarck”.Tese de Mestrado em Ecologia Aplicada. Faculdade de ciências da Universidade do Porto, 1997. AMORIM, A & VASCONCELOS, V.M.(1999). Dynamics of microcystins in the mussel Mytilis Galloprovinciallis. Toxicon 37: 1041-1052

BORGES, M. T. M., 1985. Sobre a nutrição de moluscos bivalves em cultura controlada, com especial referência aos aspectos qualitativos. Trabalho de síntese apresentado para efeito do disposto no n° 2 do artigo 58° do decreto de lei n° 448/79 de 13 de Novembro. Porto: pp. 88; apud AMORIM, A., 1997. “Acumulação e depuração de microcistinas por Mytilus galloprovincialis Lamarck”. Tese de Mestrado em Ecologia Aplicada. Faculdade de ciências da Universidade do Porto. CARMICHAEL, W.W.; Beasley, V.R.; Bunner, D.L.; Eloff, J.N.; Falconer, I.R., Gorham, P.R.; Harada, K.-I.; Yu, M.-J.; Krishnamurthy, T.; Moore, R.E.; Rinehart, K.L.; Runnegar, M.T.C.; Skulberg, O.M. e Watanabe, M. (1988). “Naming of cyclic heptapeptide toxins of cyanobacteria (blue-green algae).” Toxicon., 26, pp. 971-973. CATALDO, D. ; O'FARRELL, I.; PAOLUCCI, E.; SYLVESTER, F.; BOLTOVSKOY, D. The introduced bivalve Limnoperna fortunei boosts Microcystis growth in Salto Grande reservoir (Argentina): evidence from mesocosm experiments. vol. 7 p. 91 – 91, 2012 CARMICHAEL, W. W., 2001. Health effects of toxin-producing cyanobacteria: “The CyanoHabs”. Human and Ecological Risk Assessement 7: 1393-1407. Apud Fernandes S., Biodiversidade de Cianotoxinas em Bivalves. Tese submetida à Faculdade de Ciências da Universidade do Porto para obtenção do grau de Mestre em Ecologia Aplicada, 43pp, 2008. CARNEIRO, R.L.; SANTOS, M.E.V.; PACHECO, A. B. F.; AZEVEDO, S. M.F. O. Effects of light intensity and light quality on growth and circadian rhythm of saxitoxins production in Cylindrospermopsis raciborskii (Cyanobacteria). Journal of Plankton Research, v. 31, p.481–488 , 2009. CETESB, NT 06: L5. 025. Teste para avaliação de toxicidade aguda de cianobactérias método de ensaio. São Paulo, 1993. CETESB- Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental, Identificação e contagem de algas fitoplanctônicas com ênfase em cianobactérias ( algas azuis ). Noções básicas. São Paulo, 2005. CHRISTOFFERSEN K. (1996) Ecological implications of cyanobacterial toxins in aquatic food webs. Phycologia, 35, 42–50. DARRIGRAN, G. & G. PASTORINO. The recent introduction of a freshwater asiatic bivalve Limnoperna fortunei (Mytilidae) into South America. The Veliger 32 (2): 171-175, 1995. FERNANDES S., Biodiversidade de Cianotoxinas em Bivalves. Tese submetida à Faculdade de Ciências da Universidade do Porto para obtenção do grau de Mestre em Ecologia Aplicada, 43pp, 2008. GAZULHA, V; MANSUR, MCD; CYBIS, LF and AZEVEDO, SMFO. Grazing impacts of the invasive bivalve Limnoperna fortunei (Dunker, 1857) on single-celled, colonial and filamentous cyanobacteria. Braz. J. Biol. [online]., vol.72, n.1 [cited 2012-08-21], pp. 3339.2012a GAZULHA, V; MANSUR, MCD; CYBIS, LF e AZEVEDO, SMFO. Feeding behavior of the invasive bivalve Limnoperna fortunei (Dunker, 1857) under exposure to toxic cyanobacteria Microcystis aeruginosa. Braz. J. Biol. [online]. vol.72, n.1,2012 b, HONDA, R.Y. 2005. Estudos taxonômicos e de desenvolvimento in vitro de Microcystis spp. (Cyanobacteria) isoladas de corpos d’água do estado de São Paulo. Dissertação de Mestrado Instituto de Botânica, São Paulo. JARDIM, F. A. & AZEVEDO, S. M. F. O. 2006. Cianobactérias em Águas para abastecimento público e o cumprimento da legislação brasileira. Boletim da Sociedade Brasileira de Limnologia, 35(3):86-91. ISSN: 1980-8976. KUGRENS, P.; CLAY, B.L.; AGUIAR, R. Ultrastructure of Lobocharacium coloradoense, gen. et sp. nov. (Chlrophyta, Characiosiphonaceae), an unusual coenocyte from Colorado. J. Phycol. 36:p.421-432. 2000 KURODA, E.K. et al. Caracterização e escolha do tipo de carvão ativado a ser empregado no tratamento de águas contendo microcistinas. In: 23º CONGRESSO BRASILEIRO DE ENGENHARIA SANITÁRIA E AMBIENTAL, Anais..., Campo Grande: Associação Brasileira de Engenharia Sanitária e Ambiental - ABES, 2005. MAGALHÃES V F ; AZEVEDO, S. M. F. O. . Interference of Fe+3 in microcystins analysis: considerations on the water treatment for hemodialysis. In: VI International Conference on Toxic Cyanobacteria (ICTC), 2004, Bergen - Noruega. Anais do VI International Conference on Toxic Cyanobacteria (ICTC), 2004. p. 74.

OLIVEIRA, M.D.; CALHEIROS; D.F., JACOBI, C.M.; HAMILTON, S.K.,. Abiotic factors controlling the establishment and abundance of the invasive golden mussel Limnoperna fortunei. Biological Invasions, DOI 10.1007/s10530-010-9862-0, 2010. RICCIARDI, A.; WHORISKEY, F. G. and RASMUSSEN,J. B. The role of species interactions in invasion success. Canadian Aquatic Invasive Species Network, Annual General Meeting, Banff, Alberta,J. fish.aquat.sci, Canada, v 54, 12 p, 1997 RESENDE, M. R. Variação das características hidráulicas em condutos forçados devido a infestação pelo Limnoperna fortunei. 2007. 102 f. Dissertação (Mestrado em saneamento, Meio ambiente e recursos hídricos) - Escola de engenharia, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 2007 RUCKERT, G., CAMPOS, MCS. and ROLLA, ME., Alimentação de Limnoperna fortunei (Dunker 1857): taxas de filtração com ênfase ao uso de Cyanobacteria. Acta Sci. Biol. Sci., vol. 26, no. 4, p. 421-429, 2004.. TRIOLA, M. F. Introdução à estatística. Editora LTC Rio de Janeiro. 1999, 410 p. VASCONCELOS V.M.O. Toxicologia de Cianobactérias, Distribuição de Cianobactérias Tóxicas e Suas Toxinas em Águas Doces Portuguesas. Bioacumulação em Bivalves. Tese de doutorado. Universidade,1995.

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS PARA GRADUANDOS CETEC PROGRAMA INSTITUCIONAL DE INICIAÇÃO TECNOLÓGICA E INOVAÇÃO – PIBITI / CNPq 2012-2013

Ministério da Ciência e Tecnologia / CNPq - Edital no / Ano / Programa Institucional de Iniciação Científica – Fundação CETEC

Projeto GT 343: controle do mexilhão dourado: bioengenharia e novos materiais para a aplicação em ecossistemas e usinas hidrelétricas.

DESENVOLVIMENTO*DE*NOVA*TÉCNICA*DE* BIOCOMPATIBILIDADE*DE*BIOCERÂMICAS*EM*MEIO* ACELULAR RF-PIBIT GT / CNPq / 12 /08 / 2013

Autor: Marina Coimbra Martins Braga Orientador: Arthur Corrêa de Almeida Co- Orientador: Doutor Antônio Valadão Cardoso

Universidade Federal de Minas Gerais Centro de Bioengenharia de Espécies Invasoras de Hidrelétricas - CBEIH

Centro Tecnológico SENAI CETEC GERENTE DE INOVAÇÃO E TECNOLOGIA José Eustáquio Drumond

Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais - CETEC PRESIDENTE Marcílio César de Andrade

Av. José Cândido da Silveira, 2000 - Horto - Belo Horizonte - MG – 31170-000 Telefone: (31) 3489-2000 / Fax: (31) 3489-2200 – Site: www.cetec.br - E-mail: faleconosco@cetec.br

Ministério da Ciência e Tecnologia / CNPq - Edital no / 2012 / Programa Institucional de Iniciação Científica – Fundação CETEC Projeto GT 343: controle do mexilhão dourado: bioengenharia e novos materiais para a aplicação em ecossistemas e usinas hidrelétricas.

Desenvolvimento de nova técnica para testes de Biocompatibilidade de Biocerâmicas em meio acelular CNPq/ agosto /2013

Nome do Orientador: Arthur Corrêa de Almeida Pesquisador Pleno, Orientador: Doutor Antônio Valadão Cardoso

Belo Horizonte Agosto/2013

Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais / CETEC Centro Tecnológico SENAI CETEC Centro de Bioengenharia de Espécies Invasoras de Hidrelétricas

Desenvolvimento de Nova Técnica Para Testes de Biocompatibilidade de Biocerâmicas em Meio Acelular

Orientador: Arthur Corrêa de Almeida, Mestrando em Engenharia de Materiais UFOP.

Autores: Marina Coimbra Martins Braga, Minas Gerais, Ciências biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais – UFMG. Arthur Corrêa de Almeida, Mestrando em Engenharia de Materiais – Universidade Federal de Ouro Preto – UFOP. Antônio Valadão Cardoso, Doutorado em Materials Engineering pela University of Sheffield, Inglaterra (1992).

AGRADECIMENTO Agradeรงo o meu orientador, Arthur, pelo apoio e pela confianรงa em meu trabalho, a todos do CBEIh, ao financiamento do CNPq, ao Centro Tecnolรณgico SENAI CETEC, a empresa NovaProm por ter cedido gentilmente o colรกgeno Novapro utilizado nos experimentos e ao setor de Mineralogia do CETEC pelo moinho cedido.

RESUMO EXPANDIDO A necessidade de materiais biocompatíveis para uso clínico tornou-se uma preocupação crescente, foco de muitas das pesquisas biomédicas recentes. Utilizados atualmente em próteses e implantes, os materiais biocompatíveis permitem imaginar máquinas biointegradas que possibilitem o tratamento pontual de doenças sem danificar tecidos adjacentes, a correção de deficiências teciduais ou genéticas e a melhoria das capacidades, físicas e mentais. Além da biocompatibilidade e bioatividade, esses materiais precisam apresentar resistência ao desgaste (físico e químico, impostos pelo ambiente fisiológico) e ciclo de vida equivalente ao do organismo receptor. Várias metodologias são empregadas para verificar a biocompatibilidade e bioatividade dos materiais, e merece destaque o SBF (Simulated Body Fluid) criado na década de 1990. Esta solução mimetiza as concentrações iônicas (dissociadas ou não) do plasma sanguíneo, oferecendo um meio acelular acessível para testes de bioatividade. Por observação da deposição de cristais de apatita (fosfato de cálcio) na superfície de uma amostra imersa em SBF e da medição das concentrações iônicas na solução após a retirada da amostra, podem-se obter os primeiros dados de atividade biológica de um material. A biomineralização é um processo extremamente bem sucedido, presente em praticamente todos os grupos de seres vivos. Ela pode ser observada na construção dos ossos e dentes, nas carapaças dos crustáceos e na folha das gramíneas, em bactérias ferromagnéticas e na concha das diatomáceas e dos moluscos. A aragonita é um polimorfo do carbonato de cálcio (CaCO3) encontrada nas conchas de moluscos. Aparece em lamelas e colunas prismáticas, cimentada em uma matriz protéica formando o nácar. Em comparação com a calcita (o polimorfo estável do CaCO3), a aragonita se mostra uma cerâmica muito biocompatível, estimulando no corpo humano o crescimento do tecido ósseo. A matriz orgânica constituinte do nácar também apresentaria propriedades osteogênicas consideráveis. O Limnoperna fortunei, conhecido popularmente como mexilhão dourado, é um bivalve de água doce da família Mytilidae. O mexilhão-dourado, como espécie invasora, gera impactos tanto ambientais como econômicos. Os impactos ambientais estão

relacionados, principalmente, com o crescimento descontrolado das populações, alterando o equilíbrio ecológico. Os danos econômicos estão relacionados com a enorme capacidade de fixação do mexilhão, levando ao entupimento do sistema de resfriamento de usinas hidroelétricas. Os espécimes retirados na limpeza desse sistema não são aproveitados para fins econômicos e seu descarte em aterros pode provocar impactos ambientais como contaminação dos lençóis freáticos. No presente trabalho, pretende-se desenvolver uma técnica (na forma de protocolo) para solucionar o problema relativo à verificação e comparação da bioatividade da aragonita biomineralizada a partir de mexilhão-dourado, com matéria orgânica (nácar) e sem a mesma. Os mexilhões do Laboratório de cultivo de mexilhões-dourados do CETEC foram coletados nas proximidades da Usina Hidrelétrica de São Simão. Os espécimes foram eutanasiados e seus tecidos moles e bisso foram removidos mecanicamente. As conchas foram moídas em moinho de bola e, posteriormente, triturados com gral e pistilo para refino do pó. O mesmo foi dividido em duas partes iguais e uma delas foi levada em forno a 400ºC por uma 1h para eliminação total da matéria orgânica. Foram separados porções do pó em diversos mesh e feito uma mistura de 10% de pó de 150 mesh (105 µm) e 90% de 250 mesh (63 µm). Foi feito pastilhas com pastilhador manual utilizado 1g de pó e, depois de testes de Encharcamento, as pastilhas apresentaram perda da integridade, apesar da pastilha que continha matéria orgânica apresentar maior estabilidade durante a manipulação. Para melhorar a mesma, foi utilizado colágeno a 8% como aglutinante e levadas ao forno a 180º C para completa desnaturação do colágeno. Além disso, foi feito testes de cobertura para manter apenas uma superfície da pastilha em contato com o meio a fim de se manter sua integridade. A cera de carnaúba se mostrou uma boa opção para exercer a função. Foram feitas análises dos pós, tratados termicamente ou não e das pastilhas em Microscópico Eletrônico de Varredura e observou-se que o pó não tratado termicamente, apesar de terem sido levados ao forno a 180ºC, mantinha a matéria orgânica, apresentando maior coesão das partículas e a manutenção dos prismas de aragonita, estes mais resistentes que as lajotas. Foi observado ainda que, apesar de termicamente tratado a 400ºC, o pó mantinha os cristais de aragonita e partículas mais livres. Devido a dificuldades inesperadas durante a preparação das amostras, tempo para execução do projeto não foi suficiente para obtermos resultados que permitam uma conclusão. Faz-se necessária a continuação dos testes.

RESUMO Várias metodologias são empregadas para verificar a biocompatibilidade e bioatividade dos materiais, e merece destaque o SBF (Simulated Body Fluid). Esta solução mimetiza as concentrações iônicas do plasma sanguíneo, oferecendo um meio acelular para testes de bioatividade. Por observação da deposição de cristais de apatita (fosfato de cálcio) na superfície de uma amostra imersa em SBF, pode-se obter os primeiros dados de atividade biológica de um material. A aragonita é um polimorfo do carbonato de cálcio (CaCO3) encontrada nas conchas de moluscos juntamente com matéria orgânica formando o nácar. A matriz orgânica do nácar também apresentaria propriedades osteogênicas consideráveis. O Limnoperna fortunei, conhecido popularmente como mexilhão dourado, é um bivalve de água doce da família Mytilidae. O mexilhão-dourado, como espécie invasora, gera impactos tanto ambientais como econômicos. No presente trabalho, pretende-se desenvolver uma técnica (na forma de protocolo) para solucionar o problema relativo à verificação e comparação da bioatividade da aragonita biomineralizada a partir de mexilhão-dourado, com matéria orgânica (nácar) e sem a mesma. Os mexilhões foram coletados do laboratório de cultivo do CBEIH CETEC. Os espécimes foram eutanasiados, e posteriormente foi realizada lavagem em água e retirada mecânica dos tecidos moles e bisso. As conchas foram trituras em moinho de bola e parte do pó obtido foi levada em forno à 400ºC para eliminação da matéria orgânica. Foi utilizado colágeno a 8% como aglutinante para a fabricação das pastilhas. As mesmas foram cobertas com cera de carnaúba para melhorar as propriedades mecânicas. O pó e as pastilhas foram analisados em Microscópio Eletrônico de Varredura. Os testes em SBF encontram-se em andamento.

SUMÁRIO * 1.*Introdução*..............................................................................................................................*1! 2.Objetivos**................................................................................................................................*4! 2.1.!Objetivos!Geral!!.......................................................................................................................!4! 2.2.!Objetivos!específicos!!..............................................................................................................!4! 3.*Materiais*e*Métodos**..............................................................................................................*5! 3.1.!Coleta!e!Limpeza!dos!Mexilhões!!............................................................................................!5! 3.2.!Moagem!e!Granulometria!!......................................................................................................!6! 3.2.1.!Testes!de!Moagem!...........................................................................................................!6! 3.2.2.!Testes!de!Granulometria!!.................................................................................................!7! 3.3.!Tratamento!Térmico!!...............................................................................................................!8! 3.4.!Análise!em!MEV!!......................................................................................................................!8! 3.5.!Pastilhamento!!........................................................................................................................!8! 3.5.1.!Testes!de!Pastilhamento!e!Encharcamento!!....................................................................!9! 3.5.2.!Testes!de!Cobertura!e!Encharcamento!!.........................................................................!10! 3.5.3.!Análise!em!MEV!...............................................................................................................!6! 4.*Resultados*e*Discussão**........................................................................................................*11! 4.1.!Moagem!................................................................................................................................!11! 4.1.1.!Moagem!!........................................................................................................................!11! 4.1.2.!Granulometria!!...............................................................................................................!11! 4.1.3.!Tratamento!térmico!!......................................................................................................!11! 4.1.4.!Análise!em!MEV!!............................................................................................................!12! 4.2.!Pastilhamento!.......................................................................................................................!13! 4.2.1.!Pastilhamento!!...............................................................................................................!13! 4.2.2.!Teste!com!Aglutinante!!..................................................................................................!14! 4.2.3.!Teste!de!Cobertura!!........................................................................................................!15! 4.2.4.!Análise!em!MEV!!............................................................................................................!16! 5.*Conclusão*e*Próximos*Passos**...............................................................................................*18* 5.1.!Testes!de!Pastilhamento!!......................................................................................................!18! 5.2.!Testes!em!SBF!!.......................................................................................................................!18! 5.3.!Análise!em!MEV!....................................................................................................................!18! 5.4.!Análise!de!Composição!Química!!..........................................................................................!18! Referências*Bibliográficas**........................................................................................................*19* !

*LISTA

de FIGURAS

Figura 1: Mexilhões sendo retirado da boia de navegação 30 com o auxílio de uma espátula ..........................................................................................................................................5 Figura 2: Concha de mexilhão-dourado sem tecidos moles........................................5 Figura 3: Moinhos e bolas usados na trituração das conchas..........................................6 Figura

4: Bolas de tamanhos variados usadas para moagem

das conchas de

mexilhão...........................................................................................................................6 Figura 5: Gral e pistilo de ágata usados para refinamento do pó obtido por meio de moinho..............................................................................................................................7 Figura 6: Peneiras usadas para separação granulométrica..............................................7 Figura 7: Pastilhador manual usado para preparação das amostras................................8 Figura 8: Pastilhas revestidas com cera de carnaúba......................................................9 Figura 9: Pastilhas revestidas com colágeno. Nota-se o ressecamento dos anéis de colágeno indicados pelas setas..........................................................................................10 Figura 10: Testes de Encharcamento........................................................................10 Figura 11: Pós de diversas granulometrias obtidos pela moagem e maceração em almofariz...........................................................................................................................11 Figura 12: Pó com e sem tratamento térmico à 400ºC.....................................................12 Figura 13: Pó sem tratamento térmico (nácar)......................................................................12 Figura 14: Cristal de aragonita em pó tratado termicamente. No centro vê-se um cristal de aragonita..............................................................................................................13 Figura 15: Pastilhas obtidas pela mistura dos mesh de 250 e 150 com e sem tratamento térmico..............................................................................................................................14 Figura 16: Pastilhas obtidas pela mistura dos pós tratados ou não termicamente com colágeno a 8% cozidos em forno a 180ºC por 1h..............................................................14 Figura 17: Pastilhas de colágeno a 10% usada como controle.........................................15 Figura 18: Resultados dos testes de Encharcamento..................................................15 Figura 19: Pastilha sem tratamento térmico. No detalhe um prisma ainda intacto................16 Figura 20: Pastilha sem tratamento térmico em maior aumento. É possível observar os prismas e partes das lajotas...................................................................................................................17 Figura 21: Pastilha sem tratamento. No detalhe parte do perióstraco....................................17

1. INTRODUÇÃO A necessidade de materiais biocompatíveis para uso clínico tornou-se uma preocupação crescente, foco de muitas das pesquisas biomédicas recentes (KARAGEORGIOU e KAPLAN, 2005; GARRETA et al. 2007, VALLET-REGI, 2008; SAIZ e BOSE, 2012). Utilizados atualmente em próteses e implantes, os materiais biocompatíveis permitem imaginar máquinas biointegradas que possibilitem o tratamento pontual de doenças sem danificar tecidos adjacentes, a correção de deficiências teciduais ou genéticas e a melhoria das capacidades, físicas e mentais. O principal objetivo da Engenharia de Tecidos – ramo das ciências que une Engenharia de Materiais e Biomedicina – é a produção, em laboratório, de materiais capazes de substituir e/ou induzir processos regenerativos avançados em tecidos orgânicos danificados. São considerados aspectos mecânicos, industriais e obviamente os aspectos biológicos e clínicos, como biocompatibilidade, bioatividade, capacidade de recrutamento e indução da diferenciação celular. Esses materiais não podem avançar para testes in vivo antes de uma bateria de testes in vitro (COMBESA et al., 2006), dentre os quais se destacam testes de imersão em fluído corporal simulado. A criação de protocolos de testes flexíveis e confiáveis permite a redução de custos (e de tempo) na aplicação destes, auxiliando na otimização desta etapa crucial na conversão do protótipo em produto. Além da biocompatibilidade e bioatividade, esses materiais precisam apresentar resistência ao desgaste físico e químico (impostos pelo ambiente fisiológico) e ciclo de vida equivalente ao do organismo receptor. Mas os custos atuais de desenvolvimento e produção destes materiais tornam inviáveis o seu emprego em situações cotidianas, relegando à maioria absoluta da população, intervenções bruscas, pouco diferentes daquelas empregadas em séculos anteriores. A busca por soluções segue caminhos distintos, e não por acaso, a natureza nos fornece incessantemente exemplos de materiais que possam, em maior ou menor grau, cumprir essa tarefa. Várias metodologias são empregadas para verificar a biocompatibilidade e bioatividade dos materiais, e merece destaque o SBF (Simulated Body Fluid) criado e aperfeiçoado por Tadashi Kokubo (TANAHASHI et al., 1996) na década de 1990. Esta solução mimetiza as concentrações iônicas, dissociadas ou não, do plasma sanguíneo, oferecendo um meio acelular acessível para testes de bioatividade. Por observação da deposição de cristais de apatita (fosfato de cálcio) na superfície de uma amostra imersa em SBF e da medição das

concentrações iônicas na solução após a retirada da amostra, podem-se obter os primeiros dados de atividade biológica de um material. A biomineralização é um processo extremamente bem sucedido, presente em praticamente todos os grupos de seres vivos, e consiste na produção, em ambiente intra e/ou extra celular, de compostos minerais que cumprem funções estruturais e de armazenamento iônico (LOWENSTAM et al. 1989, KELTON et al. 2010). Ela pode ser observada na construção dos ossos e dentes, nas carapaças dos crustáceos, na folha das gramíneas, em bactérias ferromagnéticas e na concha das diatomáceas e dos moluscos. As cerâmicas obtidas por esse processo possuem características variadas, e polimorfos metaestáveis são amplamente empregados pelos organismos, além de fases amorfas temporárias (WEISS et al. 2002). A aragonita (ortorrômbica, com densidade de 2,93g/cm3, metaestável à temperatura ambiente) é um polimorfo do carbonato de cálcio (CaCO3) encontrado em depósitos geológicos na Espanha, na Eslováquia e nos EUA, e aparece em depósitos arenosos no leito oceânico das Bahamas. É encontrado ainda nas conchas de moluscos, onde exerce função primariamente estrutural (KOBAYASHI, 2006). Aparece em lamelas e colunas prismáticas, cimentada em uma matriz protéica. Em comparação com a calcita (o polimorfo estável do CaCO3), a aragonita se mostra uma cerâmica muito biocompatível, estimulando no corpo humano o crescimento do tecido ósseo (ATLAN et al., 1997; LIAO et al., 2000). Na concha dos moluscos, a aragonita (fase mineral) e a matriz protéica (fase orgânica) formam um material compósito (cerâmica + polímero) chamado nácar. De acordo com LAMGHARI (2008), a matriz orgânica constituinte do nácar também apresentaria propriedades osteogênicas consideráveis. O Limnoperna fortunei (DUNKER, 1857), conhecido popularmente como mexilhão dourado, é um bivalve de água doce da família Mytilidae. Sua distribuição geográfica original restringia-se ao sudeste asiático, principalmente China. Foi encontrado como espécie invasora pela primeira vez em 1966 em Hong Kong, e em 1991 no Japão e na América do Sul (PASTORINO et al.,1993). Em 1991, foi registrado pela primeira vez na América do Sul no rio da Prata (Argentina), provavelmente introduzido via água de lastro de navios (PASTORINO

al.,1993). Atualmente é encontrado em vários sistemas lóticos como o Rio da Prata, Rio Paraná, Rio Uruguai e Rio Paraguai (BRUGNOLI et al., 2005) e em vários ambientes lacustres como o Lago Guaíba e a Lagoa dos Patos (DARRIGRAN, 2001).

O mexilhão-dourado, como espécie invasora, gera impactos tanto ambientais como econômicos. Os impactos ambientais estão relacionados, principalmente, com o crescimento descontrolado das populações (GAZULHA, 2010), alterando o equilíbrio ecológico. Os danos econômicos estão relacionados com a enorme capacidade de fixação do mexilhão, levando ao entupimento do sistema de resfriamento de usinas hidroelétricas (SIMEÃO, 2011), o que obriga as concessionárias a promover grandes limpezas desses dutos, interferindo na produção de energia. Os espécimes retirados nessa limpeza não são aproveitados para fins econômicos e seu descarte em aterros pode provocar impactos ambientais como contaminação dos lençóis freáticos. No presente trabalho, pretende-se desenvolver uma técnica (na forma de protocolo) para solucionar o problema relativo à verificação e comparação da bioatividade da aragonita biomineralizada a partir de concha de mexilhão-dourado, com matriz orgânica (nácar) e sem a mesma.

2. OBJETIVOS 2.1 . OBJETIVO GERAL !

Comparar a bioatividade da aragonita biomineralizada com a do nácar (aragonita +

matriz orgânica)

2.2 . OBJETIVOS ESPECÍFICOS !

Obter nácar a partir da concha de Limnoperna fortunei;

Separar a matriz orgânica da inorgânica (aragonita) de parte do nácar obtido;

Caracterizar o CaCO3 obtido a fim de conferir o grau de pureza da aragonita;

Obter os corpos de prova;

Produzir SBF;

Obter os corpos de prova para realização, posterior, de diferentes tempos de imersão

das amostras em SBF.

3. MATERIAIS e MÉTODOS Para a realização dos testes foi necessária uma coleta preliminar dos organismos e a manutenção dos mesmos em um laboratório de cultivo.

3.1. COLETA e LIMPEZA dos MEXILHÕES Os mexilhões do Laboratório de cultivo de mexilhões-dourados do CETEC foram coletados nas proximidades da Usina Hidrelétrica de São Simão, à jusante da confluência do rio Barreiro, boia de navegação 30 (Latitude 19,655833; Longitude 51,083889). Os indivíduos foram coletados manualmente, retirando o bisso sem comprometer as estruturas vitais e garantindo o máximo da integridade do animal, conforme mostra a figura 1. Os organismos foram transportados em sacos plásticos e em transportadores de isca viva aerados diretamente para o laboratório de cultivo.

Figura 1: Mexilhões sendo retirado da boia de navegação 30 com o auxílio de uma espátula

Os indivíduos foram eutanasiados e mantidos em geladeira, aproximadamente. 5 o C. Logo depois tiveram seus tecidos moles e bisso retirados mecanicamente. As conchas foram lavadas em água corrente para retirar o restante das impurezas. Após o procedimento as conchas foram secas por 72h em temperatura ambiente.

Figura 2: Concha de mexilhão-dourado sem tecidos moles.

3.2. MOAGEM e GRANULOMETRIA 3.2.1. Teste de Moagem As conchas obtidas foram submetidas a alguns testes em moinho de bolas para verificar qual seria a melhor proporção de bolas/carga e tempo de moagem para se obter o particulado mais fino possível, ideal para o pastilhamento. As bolas eram de 2 tamanhos: grande, com ± 2,0 cm de diâmetro e pequeno, com ± 1,0 cm de diâmetro

Figura 3: Moinhos e bolas usados na trituração das conchas.

Figura 4: Bolas de diferentes tamanhos usadas para moagem das conchas de mexilhão.

Para refinar ainda mais o pó obtido por meio de moagem foi usado almofariz e pistilo de ágata. Uma opção a ser considerada seria usar um moinho planetário para a refinação do pó. Nesse caso, será preciso testes para verificar a viabilidade.

Figura 5: Gral e pistilo de ágata usados para refinamento do pó obtido por meio de moinho. Notase em seu interior o pó de concha de mexilhão em processo de maceração.

3.2.2. Testes de Granulometria O pó obtido foi submetido peneiração em malhas de diversos mesh, a saber: 150 mesh (106 µm), 250 mesh (63 µm), 400 mesh (37 µm), com auxilio de um agitador eletromagnético para peneiras Bertel. As amostras de 400 mesh, ou 37 µm, foram analisadas em microscópio eletrônico de varredura (MEV).

Figura 6: Peneiras usadas para separação granulométrica.

3.3. TRATAMENTO TÉRMICO Do macerado obtido, metade passou por tratamento térmico para a retirada total de matéria orgânica, em forno à 400ºC por 1h. A outra metade, com matéria orgânica (nácar) foi armazenada em temperatura ambiente.

3.4. ANÁLISE EM MEV Foi realizada análise dos pós (tratado termicamente e sem tratamento) em Microscópio Eletrônico de Varredura (Tescan Vega 3 LMU, 10.00 kV, utilizando alto vácuo) a fim de comprovar a manutenção ou ausência de matéria orgânica e observar quaisquer possíveis alterações da morfologia dos cristais aragonita.

3.5. PASTILHAMENTO 3.5.1. Testes de Pastilhamento e Encharcamento Nos testes de pastilhamento foram verificadas qual proporção dos pós obtidos, nas diferentes granulometrias, seria a ideal para realizar o pastilhamento e que forneceria a melhor pastilha para imersão em SBF. As pastilhas foram feitas com 1g do pó, tanto com tratamento térmico quanto sem (nácar) em pastilhador manual.

Figura 7: Pastilhador manual usado para preparação das amostras

Foram realizados testes mecânicos (dureza e impacto) e de encharcamento para verificar a manutenção da integridade da pastilha. Após alguns testes foi necessária a adição de um aglutinante para melhorar as propriedades mecânicas da pastilha. Depois de levantamento bibliográfico (MEYERS, 2008) o aglutinante escolhido foi colágeno bovino, por já ser empregado nessa função e ser bioativo e biocompatível. Foram, então, realizados testes com várias concentrações de colágeno, a saber, 12%, 9%, 8% 7% e 6%, para verificar o melhor resultado. O colágeno foi obtido adicionando o colágeno bovino em pó com ácido acético (CH3COH) 0,02M e levado em banho-maria a 60ºC por 1h, para que as fibras do colágeno sofressem desnaturação parcial. Foi então feita neutralização do ácido com NaOH 0,5M até atingir o pH 7 para que o pH não interferisse na solução de SBF nem reagisse com o CaCO3 das pastilhas. Pela desnaturação do colágeno por ácido acético e banho-maria ser temporária, as pastilhas com aglutinante, foram cozidas em forno a 180ºC por 1h para que a desnaturação fosse completa e definitiva.

3.5.2. Testes de Cobertura e encharcamento Foram realizados testes para cobertura das pastilhas a fim de manter a coesão das partículas durante o encharcamento da pastilha. Foi usado colágeno em uma concentração de 8% como opção de cobertura e cera de carnaúba aquecida em banho-maria a 80ºC, mantendo uma superfície da pastilha livre para ter contato com o meio como mostram as figuras 8 e 9. Na figura 10 temos o teste de encharcamento sendo realizado.

! Figura 8: Pastilhas revestidas com cera de carnaúba.

! Figura 9: Pastilhas revestidas com colágeno. Nota-se o ressecamento dos anéis de colágeno indicados pelas setas.

Figura 10: Testes de encharcamento: em 1- Pastilha com tratamento térmico sem cobertura. 2- Pastilha sem tratamento térmico sem cobertura. 3- Pastilhas de colágeno. 4Pastilhas com tratamento térmico e cobertura de colágeno. 5- Pastilhas sem tratamento térmico e cobertura de colágeno. 6- Pastilhas sem tratamento térmico e cobertura de cera de carnaúba. 7- Pastilhas com tratamento térmico e cobertura de cera de carnaúba.

3.5.3. Análise em MEV As pastilhas foram analisadas em Microscópico Eletrônico de Varredura ((Tescan Vega 3 LMU, 10.00 kV, utilizando alto vácuo) para verificar a agregação das partículas, resíduos de matéria orgânica e manutenção da morfologia dos cristais de aragonita.

4. RESULTADOS e DISCUSSÃO 4.1. MOAGEM 4.1.1. Moagem Nos testes de moagem a melhor proporção foi de 65% de bolas (com 50% de bolas grandes e 50% de bolas pequenas) para 25% de carga, aproximadamente 225g de concha. O melhor tempo x rpm para conseguir o pó mais fino possível foi de 7h a 70rpm.

4.1.2. Granulometria Foram obtidos, após moagem e maceração em gral e pistilo, pós de >150, 150 (106 µm), 250 (63 µm) e 400 (37 µm) mesh em proporções desiguais.

Figura 11: Pós de diversas granulometrias obtidos pela moagem e maceração em almofariz.

4.1.3. Tratamento térmico O pó obtido apresentou uma coloração rosa-lilás e tendeu a ficar mais rosado quanto menor for as partículas que o compõe como mostra a figura 11. O tratamento térmico alterou as propriedades ópticas do material e o pó passou a ter coloração escura, marrom acinzentado como mostra a figura 12.

Figura 12: Pó com e sem tratamento térmico à 400ºC.

4.1.4. Análise em MEV No pó sem tratamento térmico é possível observar que as partículas, com tamanho entre 0,2 e 8 µm, permanecem mais unidas devido à presença de matéria orgânica. Na figura 13 nota-se a manutenção dos prismas que, se comparado às lajotas de aragonita, possui mais resistência à moagem.

Figura 13: Pó sem tratamento térmico (nácar).

O pó tratado transformou-se de nácar em aragonita devido à alta temperatura. Não foi visto nenhum resíduo de matéria orgânica na amostra. É possível verificar na figura 14 a presença de cristais de aragonita e pequenos cristais de pó de aragonita a 400 mesh (106

µm).

Figura 14: Cristal de aragonita em pó tratado termicamente. No centro vê-se um cristal de aragonita.

4.2. PASTILHAMENTO 4.2.1. Pastilhamento Para maior aproveitamento de todo pó obtido foi feita a proporção de meshs possíveis. A proporção de 90% de pó de 250 mesh (63 µm) com 10% de pó com 150 mesh (106 µm ) foi a que apresentou melhor resultado para pastilhamento em pastilhador manual.

Figura 15: Pastilhas obtidas pela mistura dos mesh de 250 e 150 com e sem tratamento térmico.

4.2.2. Teste com Aglutinante O uso de colágeno a 8% se mostrou ideal para aglutinar as partículas e melhorar o pastilhamento. De acordo com a literatura, o colágeno apresenta propriedades de biocompatibilidade e bioatividade que podem influenciar nos resultados de imersão no SBF. Para que os efeitos do colágeno não sejam considerados nos resultados, será estabelecido um grupo controle composto por pastilhas de colágeno em uma concentração de 10% como mostrado na figura 17.

Figura 16: Pastilhas obtidas pela mistura dos pós tratados ou não termicamente com colágeno a 8% cozidos em forno a 180ºC por 1h.

Figura 17: Pastilhas de colágeno a 10% usada como controle

4.2.3. Teste de Cobertura A pastilha sem tratamento térmico se manteve mais integra do que a pastilha com tratamento, provavelmente porque a matéria orgânica presente na pastilha sem tratamento mantém a coesão das partículas. Apesar disso com a manipulação sua integridade foi alterada. O colágeno não se mostrou interessante para a cobertura por absorver muita água do meio como mostra a foto 15 (em 3, 4 e 5), formando uma gelatina e não mantendo a integridade das pastilhas. Enquanto que a cera de carnaúba é inerte e mantém a coesão das partículas e por isso se mostrou ideal para fazer a cobertura.

Figura 18: Resultados dos testes de encharcamento: em 1- Pastilha com tratamento térmico sem cobertura. 2- Pastilha sem tratamento térmico sem cobertura. 3- Pastilhas de colágeno. 4- Pastilhas com tratamento térmico e cobertura de colágeno. 5- Pastilhas sem tratamento térmico e cobertura de colágeno. 6- Pastilhas sem tratamento térmico e cobertura de cera de carnaúba. 7- Pastilhas com tratamento térmico e cobertura de cera de carnaúba.

4.2.4. Análise em MEV Pela superfície da pastilha foi possível notar que o aglutinante utilizado permitiu melhor coesão das partículas, aumentando a resistência ao encharcamento. Também é nítida a presença de maior número de prismas do que de lajotas, justamente por serem, estas últimas, menos resistentes à moagem. Não houve sinterização das partículas, devido à baixa temperatura que foi submetida à amostra.

! Figura 19: Pastilha sem tratamento térmico. No detalhe um prisma ainda intacto

Figura 20: Pastilha sem tratamento térmico em maior aumento. É possível observar os prismas e partes das lajotas.

Figura 21: Pastilha sem tratamento. No detalhe parte do perióstraco

5. CONCLUSÃO E PRÓXIMOS PASSOS Devido a dificuldades inesperadas durante a preparação das amostras o tempo para execução do projeto não foi suficiente para obtermos resultados que permitam uma conclusão. Faz-se necessária a continuação dos testes.

5.1. TESTES DE PASTILHAMENTO Serão realizados testes de pastilhamento em prensa hidráulica para aumentar a qualidade da pastilha, diminuindo sua friabilidade e possível retirada da cobertura para testes em SBF.

5.2. TESTES EM SBF Será produzido m-SBF de acordo com protocolo de Kokubo, em 1990, e modificado por Oyane et al, em 2002. Após produção, serão realizados testes de imersão em SBF para diferentes tempos, a saber: 1º, 5º, 10º, 17º, 24º e 31º dias, havendo troca do meio de 48h em 48h.

5.3. ANÁLISE EM MEV As amostras de nácar e aragonita imersas em SBF serão retiradas em diferentes tempos e analisadas no MEV para verificar a deposição de apatita na superfície de cada amostra e as diferenças, ou não, entre elas.

5.4. ANÁLISE DE COMPOSIÇÃO QUÍMICA Será realizada análise de composição química do SBF após os testes de imersão por Espectrometria de Emissão Atômica por Plasma Acoplado Indutivamente para verificar os íons presentes nas amostras.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ATLAN G., BALMAIN, N., BERLAND, S., VIDAL, B., LÓPEZ, E. - Reconstruction of human maxillary defects with nacre powder: histológical evidence of bone regeneration. C.R. Acad. Sci. Paris/Life Sci 320 (1997) 253-258. BOSE, S., ROY, M., BANDYOPADHYAY, A., - Recent advances in bone tissue engineering scaffolds. Trends in Biotechnology October 2012, vOL. 30, No. 10 BRUGNOLI,

distribution

the

al.

Golden

main

mussel

Limnoperna

hydrographical

basins

fortunei Uruguay:

(Bivalvia: update

Mytilidae) and

predictions. Anais da Academia Brasileira de Ciências, v. 77, n. 2, p.235-244, 2005.

COMBESA, C., MIAO, B., BAREILLE, R., REY, C. - Preparation, physical–chemical caracterisation and cytocompatibility of calcium carbonate cements. Biomaterials 27 (2006) 1945–1954 DARRIGRAN, G.. El mejillón dorado, un novedoso problema económico/ambiental para el Mercosur. Pesquisa Naval, 2001.

GARRETA, E. GASSET D., GEMINO, C., BORRÓS, S. - Fabrication of a three-dimensional nanostructured biomaterial for tissue engineering of bone Biomolecular Engineering 24 (2007) 75–80 GAZULHA,Vanessa. O mexilhão dourado Limnoperna fortunei (Dunker, 1857) na presença de cianobactérias: taxa de filtração, comportamento alimentar e sobrevivência. Porto Alegre, 2010. KELTON, K. F., GREER, A. L –Biomineralization. Nucleation in Condensed Matter (2010), 640651 KARAGEORGIOU, V. KAPLAN D. - Porosity of 3d biomaterial scaffolds and osteogenesis Biomaterials 26 (2005) 5474–5491 KOBAYASHI I, SAMATA, T., - Bivalve shell structure and organic matrix. Materials Science and Engineering c 26 (2006) 692–698. LIAO, H., MUTVEI, H., STROKM, M. S., HAMMARSTROKM, L., Li, J. - Tissue responses to natural aragonite (Margaritifera shell) implants in vivo. Biomaterials 21 (2000) 457- 468 LOWENSTAM, H. A., WEINER, S. - On Biomineralization, 1989, Oxford University Press

MEYERS, A. M., et al - Biological materials: Structure and mechanical properties. Science Direct 53 (2008) 1-206 PASTORINO, G. et al.Limnoperna fortunei (Dunker, 1857) (Mytilidae), nuevo bivalvo invasor em águas del Rio de la Plata. Neotrópica, vol. 39, p.101-102, 1993.

SAIZ, E., ZIMMERMANN, E.. A., lEE, J. S., WEGST, U. G. K., TOMSI, A. P. - Perspectives on the role of nanotechnology in bone tissue engineering. Dental Materials 29, No. 1, (2013) 103–115 SIMEÃO, C. M. G., Influência da variação de velocidade e pressão sobre Limnoperna fortunei Dunker 1857 (bivalvia, mytilidae) e verificação dos efeitos da toxicidade do látex

Euphorbia splendens var hislopii N.E.B (Euphobiaceae) para esta espécie. Belo Horizonte 2011.

TANAHASHI, M. KOKUBO, T., NAKAMURA, T., KATSURA, Y., NAGANO, M., - Mltrastructural study of an apatite layer formed by a biomimetic process and its bonding to bone. Biomaterials 17 (1996) 47-51 VALLET-REGÍ, M., ARCOS, D. – Biomimetic Nanoceramics in Clinical Use: From Materials to Applications (2008) WEISS I. M., TUROSS, N., ADDADI, L., WEINER, S. - Mollusc larval shell formation: amorphous calcium carbonate is a precursor phase for aragonite. Journal Of Experimental Zoology 293:478–491 (2002)

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS PARA GRADUANDOS - CETEC PROGRAMA INSTITUCIONAL DE INICIAÇÃO TECNOLÓGICA E INOVAÇÃO – PIBITI / CNPq

Cultura Celular para testes de Biocompatibilidade e Bioatividade CNPq/ agosto /2013 1"

Universidade Federal de Minas Gerais

Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais - CETEC Diretoria de Desenvolvimento e Serviços Tecnológicos Centro de Bioengenharia de Espécies Invasoras de Hidrelétricas - CBEIH PRESIDENTE Marcílio César de Andrade VICE PRESIDENTE Eduardo Prates Octaviani Bernis DIRETOR DE DESENVOLVIMENTO E SERVIÇOS TECNOLÓGICOS DIRETOR DE PLANEJAMENTO GESTÃO E FINANÇAS Ivan Amorim Barbosa

Av. José Cândido da Silveira, 2000 - Horto - Belo Horizonte - MG – 31170-000 Telefone: (31) 3489-2000 / Fax: (31) 3489-2200 – Site: www.cetec.br - E-mail: faleconosco@cetec.br

Cultura Celular para testes de Biocompatibilidade e Bioatividade CNPq/ agosto / 2013

Nome do Orientador: Arthur Corrêa de Almeida Pesquisador Pleno, Orientador: Doutor Antônio Valadão Cardoso

Belo Horizonte agosto/2013

Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais / CETEC Diretoria de Desenvolvimento e Serviços Tecnológicos Centro de Bioengenharia de Espécies Invasoras de Hidrelétricas Cultura Celular para testes de Biocompatibilidade e Bioatividade

Orientador: Arthur Corrêa de Almeida, Mestrando em Engenharia de Materiais - UFOP.

Autores: Ana Cristina Fausto Gomes, Graduanda em Ciências biológicas, Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerias – PUC Minas. Arthur Corrêa de Almeida, Mestrando em Engenharia de Materiais – Universidade Federal de Ouro Preto – UFOP. Antônio Valadão Cardoso, Doutorado em Materials Engineering pela University of Sheffield, Inglaterra (1992).

RESUMO Limnoperna fortunei, um mexilhão de água doce da família Mytilidae é razão deste e de outros estudos no Brasil, por ser uma espécie invasora bem adaptada que vem causando danos à industrias e usinas hidrelétricas. Sua capacidade de fixação em substratos variados causa obstrução de tubulações de captação de água, de filtros e sistemas de resfriamento em industrias, hidrelétricas e sistemas de drenagem de águas pluviais, além de graves alterações nos ecossistemas aquáticos. Existem, atualmente, processos químicos e mecânicos de remoção dos mexilhões que se encontram obstruindo tubulações e turbinas nas hidrelétricas; o que não existe ainda é um modo de descarte apropriado para os residuos de moluscos derivados do processo de remoção. Conhecido popularmente como mexilhão dourado esta espécie é nativa do sudeste asiático e foi introduzida em várias regiões do mundo como Japão, Coréia Tailândia e Taiwan, via água de lastro. No Brasil, obteve seu primeiro registo no Lago Guaíba, RS, no final de 1998. Em poucos anos ocupou os rios da bacia do Rio Paraná, Paraguai e Uruguai. Este projeto destaca a presença de aragonita (polimorfo metaestável do carbonato de cálcio – CaCO3) que exerce função primeiramente estrutural na concha do mexilhão. A aragonita aparece em lamelas e colunas prismáticas, cimentada em uma matriz proteica (com o qual forma o nácar) e apresenta propriedades osteogênicas, (ATLAN et al, 1997) estimulando no corpo humano o crescimento do tecido ósseo, compósito de polímeros (células, água e proteínas como o colágeno) e cerâmica (hidroxiapatita - fosfato de cálcio). Materiais biocompatíveis são inseridos ou incorporados, como próteses e implantes, em um sistema vivo com o intuito de restaurar ou substituir tecidos danificados, ou estimular os processos naturais de recuperação destes. Os materiais

biocompatíveis

permitem

imaginar

máquinas

biointegradas

que

possibilitem o tratamento pontual de doenças sem danificar tecidos adjacentes, a correção de deficiências teciduais ou genéticas e a melhoria das capacidades, físicas e mentais, levando o homem a um novo patamar, humano e social. Devido à importância de suas propriedades osteogênicas, este estudo pretende, em sua proxima etapa, comparar a biocompatibilidade da aragonita biomineralizada com e sem a matriz orgânica por meio do protocolo de teste de 1"

contato com células VERO. Para obtenção das amostras de conchas, exemplares foram coletados e moados no laboratório de cultivo do CBEIH (CETEC – MG). Parte desta amostra foi tratada termicamente, afim de se eliminar a matriz orgânica. Deste pó foram feitas pastilhas, para serem submetidas aos testes. Espera-se, imediatamente a este estudo, verificar a biocompatibilidade da aragonita em comparação com o nácar, analisando a morfologia das células VERO nos testes de contato.

INDICE DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 Conchas depois de limpas, secando à temperatura ambiente ........................... 7 Figura 2 Moínho de Bola utilizado para moagem as conchas do mexilhão. ..................... 8 Figura 3 Grão e Pistilo utilizados para moagem do pó...................................................... 9 Figura 4 Peneiras para separação granulométrica de 150 e 250 mesh............................ 9 Figura 5 Produto da moagem: Comparação dos diferentes tamanhos de pó obtidos. ..... 9 Figura 6 Imagem de tubo falcon com colágeno tipo I bovino pronto. .............................. 10 Figura 7 Imagem de uma placa de petri com: na esquerda, pastilha feita com pó tratado termicamente, sem matéria orgânica. Na direita nácar, com matéria orgânica. ............. 11 Figura 8 Em (A), pastilhas cobertas por colágeno.(B) pastilhas cobertas por Cera com uma face livre. ................................................................................................................. 11 Figura 9 Capela de Fluxo Laminar utilizada para repique das células VERO................. 12 Figura 10 Primeiro teste de contato do meio de cultura de células com amostras de vários tipos. ..................................................................................................................... 12 Figura 11 Imagem de varredura de Cristal de aragonita. ................................................ 14 Figura 12 Imagem de MEV das pastilhas de aragonita................................................... 15

Contents' " " 1."

INTRODUÇÃO"......................................................................................................................"1"

2."

OBJETIVOS"..........................................................................................................................."4" 2.1"

OBJETIVO GERAL"......................................................................................................."4"

2.2"

Objetivos específicos"......................................................................................................."4"

3."

PROBLEMA"..........................................................................................................................."5"

4."

MATERIAS e MÉTODOS"....................................................................................................."6" 4.1"

LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO"........................................................................"6"

4.2"

OBTENÇÃO das AMOSTRAS"......................................................................................"7"

4.3"

PREPARO das AMOSTRAS".........................................................................................."7"

4.4"

PREPARO da CULTURA CELULAR"........................................................................."11"

5."

RESULTADO e DISCUSSÃO"..........................................................................................."14"

6."

CONCLUSÃO"......................................................................................................................"16"

7."

RECOMENDAÇÕES"..........................................................................................................."17"

8."

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS".................................................................................."18"

9."

ANEXOS".............................................................................................................................."20"

" " " " " " " " " " "

INTRODUÇÃO A necessidade de materiais biocompatíveis para uso clínico tornou-se uma

preocupação

crescente,

foco

muitas

das

pesquisas

biomédicas

recentes

(KARAGEORGIOU e KAPLAN, 2005; GARRETA et al. 2007, VALLET-REGI 2008, SAIZ e BOSE 2012). Atualmente utilizados em próteses e implantes, os materiais biocompatíveis permitem imaginar máquinas biointegradas que possibilitem o tratamento pontual de doenças sem danificar tecidos adjacentes, a correção de deficiências teciduais ou genéticas e a melhoria das capacidades, físicas e mentais. O principal objetivo da Engenharia de Tecidos – ramo das ciências que une Engenharia de Materiais e Biomedicina – é a produção, em laboratório, de materiais capazes de substituir e/ou induzir processos regenerativos avançados em tecidos orgânicos danificados. São considerados aspectos mecânicos, industriais e obviamente os aspectos biológicos e clínicos, como biocompatibilidade, bioatividade, capacidade de recrutamento e indução da diferenciação celular. Esses materiais não podem avançar para testes in vivo antes de uma bateria de testes in vitro (COMBESA, 2006), dentre os quais se destacam testes de imersão e testes com culturas celulares. A criação de protocolos de testes flexíveis e confiáveis permite a redução de custos (e de tempo) na aplicação destes, auxiliando na otimização desta etapa crucial na conversão do protótipo em produto. Várias metodologias são empregadas para verificar a biocompatibilidade e bioatividade dos materiais, dentre elas os testes envolvendo a cultura in vitro de células, utilizando a amostra como substrato (DAVIS 2002, VUNJAK-NOVAKOVIC 2006, FRESHNEY 2010). Cultivando linhagens celulares específicas (HUANG, 2009) e utilizando a amostra como substrato, pode-se obter informações a respeito da biocompatibilidade da amostra, verificada pela “qualidade” da relação entre as células e o substrato, observando características como a morfologia das células após determinado período de cultivo, adesão destas ao substrato, degradação do substrato, etc. O teste de contato VERO se mostra adequado aos parâmetros em questão pois estas células apresentam características de crescimento em cultura bastante definidas, tais como morfologia e propriedades de crescimento, facilitando a observação de pequenas alterações em função de tratamentos físico-químicos (LIAO, 2010). 1"

A biomineralização é um processo extremamente bem sucedido, presente em praticamente todos os grupos de seres vivos, e consiste na produção, em ambiente intra e/ou extra celular, de compostos minerais que cumprem funções estruturais e de armazenamento iônico (LOWENSTAM, 1989; KELTON, 2010). Ela pode ser observada na construção dos ossos e dentes, nas carapaças dos crustáceos e na folha das gramíneas, em bactérias ferromagnéticas e na concha das diatomáceas e dos moluscos. As cerâmicas obtidas por esse processo possuem características variadas, e polimorfos metaestáveis são amplamente empregados pelos organismos, além de fases amorfas temporárias (WEISS, 2002). A aragonita (ortorrômbica, com densidade de 2,93g/cm3, metaestável à temperatura ambiente) é um polimorfo do carbonato de cálcio (CaCO3) encontrado em depósitos geológicos na Espanha, na Eslováquia e nos EUA, e aparece em depósitos arenosos no leito oceânico das Bahamas. É encontrado ainda nas conchas de moluscos, onde exerce função primariamente estrutural (KOBAYASHI, 2006). Aparece em lamelas e colunas prismáticas, cimentada em uma matriz proteica. Em comparação com a calcita (o polimorfo estável do CaCO3), a aragonita se mostra uma cerâmica muito biocompatível, estimulando no corpo humano o crescimento do tecido ósseo (ATLAN et al., 1997; LIAO et al., 2000). Na concha dos moluscos, a aragonita (fase mineral) e a matriz proteica (fase orgânica) formam um material compósito (cerâmica + polímero) chamado nácar. De acordo com LAMGHARI (2008), a matriz orgânica constituinte do nácar também apresentaria propriedades osteogênicas consideráveis. O Limnoperna fortunei (DUNKER, 1857), conhecido popularmente como mexilhão dourado, é um bivalve de água doce da família Mytilidae. Sua distribuição geográfica original restringia-se ao sudeste asiático, principalmente China. Foi encontrado como espécie invasora pela primeira vez em 1966 em Hong Kong, e em 1991 foi encontrado no Japão e na América do Sul (PASTORINO et al.,1993). Em 1991, foi registrado pela primeira vez na América do Sul no rio da Prata (Argentina), (PASTORINO

provavelmente

introduzido

via

água

lastro

navios

et al.,1993). Atualmente é encontrado em vários sistemas lóticos

como o Rio da Prata, Rio Paraná, Rio Uruguai e Rio Paraguai (BRUGNOLI et AL., 2005) e em vários ambientes lacustres como o Lago Guaíba e a Lagoa dos Patos (DARRIGRAN, 2001). 2"

O mexilhão-dourado, como espécie invasora, gera impactos tanto ambientais como econômicos. Os impactos ambientais estão relacionados, principalmente, com o crescimento descontrolado das populações (GAZULHA, 2010). Já um dos danos econômicos está relacionado com a enorme capacidade de fixação do mexilhão, levando ao entupimento do sistema de resfriamento de usinas hidroelétricas (SIMEÃO, 2011), o que obriga as concessionárias a promover grandes limpezas desses dutos, interferindo na produção de energia. Os espécimes retirados nessa limpeza ainda não são aproveitados para fins econômicos e seu descarte em aterros pode provocar impactos ambientais como contaminação dos lençóis freáticos. No presente trabalho pretende-se comparar a biocompatibilidade da aragonita biomineralizada com e sem a matriz orgânica. Para isto será utilizado o protocolo de teste de contato com células VERO.

OBJETIVOS

2.1

OBJETIVO GERAL

Comparar a biocompatibilidade da aragonita biomineralizada com e sem a matriz

orgânica.

2.2

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Obter nácar a partir da concha de Limnoperna fortunei;

Separar a matriz orgânica da inorgânica (aragonita) de parte do nácar obtido;

Caracterizar o CaCO3 obtido a fim de conferir o grau de pureza da aragonita;

Obter os corpos de prova para realização posterior de testes de Contato com

células VERO a fim de se comparar a biocompatibilidade do nácar e da aragonita.

PROBLEMA O mexilhão-dourado, como espécie invasora, gera impactos tanto ambientais

como econômicos. Os impactos ambientais estão relacionados, principalmente, com o crescimento descontrolado das populações (GAZULHA, 2010). Já um dos danos econômicos está relacionado com a enorme capacidade de fixação do mexilhão, levando ao entupimento do sistema de resfriamento de usinas hidroelétricas (SIMEÃO, 2011), o que obriga as concessionárias a promover grandes limpezas desses dutos, interferindo na produção de energia. Os espécimes retirados nessa limpeza ainda não são aproveitados para fins econômicos e seu descarte em aterros pode provocar impactos ambientais como contaminação dos lençóis freáticos.

MATERIAS e MÉTODOS Para a realização dos testes foi necessária uma coleta preliminar dos

organismos e a manutenção dos mesmos em um laboratório de cultivo (CBEIH – CETEC).

4.1

LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO

" A cultura de tecidos celulares teve início juntamente com o séc. XX, quando Ross Harisson demonstrou que tecido nervoso extraído de sapos gera fibras quando selado em uma câmara com linfa de sapo. Posteriormente, sêmen de mamíferos foi congelado e preservado por longos períodos, sendo recuperado a um estado viável para inseminação artificial. Na década de 1940, Earle e colaboradores desenvolveram a primeira linhagem contínua de células, estocadas em nitrogênio líquido, e em 1970, Sato e colaboradores publicaram uma série de artigos sobre as necessidades específicas de diferentes tipos celulares, em relação aos fatores proteicos de crescimento. Assim, a cultura de tecidos aparece não só como um vasto campo de pesquisa, mas também como uma ferramenta tecnológica no campo recém estabelecido da Biologia Molecular (DAVIS, 2002). Como ferramenta, a cultura de tecidos permitiu a substituição de cobaias animais em muitos experimentos, originando a farmatoxicologia in vitro. De acordo com Davis (2002) espera-se, no campo biomédico, que a tecnologia de cultura de células contribua em escala crescente com os tratamentos clínicos: culturas de células epiteliais já são empregadas em enxertos de pele em úlceras e queimaduras. Em um futuro próximo, células transplantadas contendo material genético alterado poderão ser utilizadas para corrigir defeitos em pacientes diabéticos, com fibrose cística, hemofilia, ou síndromes enzimáticas raras. Nakamura e colaboradores estabeleceram, em 1962, a linhagem VERO, aprovada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) para a produção de vacinas (MOLINARO, 2010).

Células Vero apresentam características de crescimento em

cultura bastante definidas, tais como morfologia e propriedades de crescimento, facilitando a observação de pequenas alterações em função de tratamentos físicoquímicos (LIAO, 2010). Por isso essa linhagem é, atualmente, bastante indicada para testes de biocompatibilidade. 6"

4.2

OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS Os indivíduos foram obtidos do Laboratório de Cultivo do CBEIH e foram

coletados nas proximidades da Usina Hidrelétrica de São Simão, à jusante da confluência do rio Barreiro, boia de navegação 30 (Latitude 19,655833; Longitude 51,083889).

Após a obtenção dos exemplares foram seguidos os seguintes tópicos: !

Os mexilhões foram eutanasiados;

As conchas foram mantidas em geladeira, a fim de evitar dessecação da matriz

orgânica; !

Foram lavadas e os tecidos moles foram retirados mecanicamente;

As conchas secaram a temperatura ambiente; (Figura 1)

Figura'1'Conchas'depois'de'limpas,'secando'à'temperatura'ambiente'

4.3

PREPARO DAS AMOSTRAS A primeira moagem foi realizada em Moínho de Bola de alumina (CEBEIH –

CETEC). Foram realizados testes para verificar a quantidade ideal de pó e bola/cargas a serem utilizados no moínho: Primeiro teste •

Velocidade definida: 70 rpm

•

20% do volume de bolas de cerâmica (50% pequenas e 50% grandes)

•

30% do volume de conchas

•

Tempo: 10 min

Foi obtido um particulado grosseiro (+/- 0,6 cm) Segundo teste 7"

•

Velocidade 70 rpm

•

45% do volume de bolas

•

50% do volume de conchas (+/- 150g)

•

Tempo: 30 min

Foi obtido um particulado de 1cm, com presença de particulado a 250 mesh Terceiro teste •

Velocidade 70 rpm

•

65% do volume de bolas

•

25% do volume de carga (+/- 250g)

•

Tempo: 7 horas

Foi obtido um particulado fino, entre 400 e 140 mesh. O melhor resultado obtido foi 25% de carga (aproximadamente 250g) para 65% de bolas, 70 rpm por 7 horas. Foi obtido desta etapa um particulado fino entre 140 e 400 mesh, em proporção desigual. (Figura 2).

Figura'2'Moínho'de'Bola'utilizado'para'moagem'as'conchas'do'mexilhão.'

Foram feitos testes de pastilhamento manual com os diferentes tamanhos de pó obtidos, para constatar qual seria o tamanho ideal para melhor firmeza das pastilhas: O melhor resultado obtido foi com pó de tamanho 250 mesh. A segunda moagem foi realizada então manualmente com auxílio de grão e pistilo, para padronizar o tamanho das partículas em 250 mesh. (Figura 3). Porém devido à dificuldade de moagem a medida em que o pó diminui o tamanho, foi estabelecido que as pastilhas seriam compostas de 90% de pó de tamanho 250 mesh e 10% de pó a 140 mesh.

Figura'3'Grão'e'Pistilo'utilizados'para'moagem'do'pó.

O pó foi separado por tamanho com auxílio de peneiras de 150 e 250 mesh. (Figuras 4 e 5).

Figura'4'Peneiras'para'separação'granulométrica'de'150'e'250'mesh.'

Figura'5'Produto'da'moagem:'Comparação'dos'diferentes'tamanhos'de'pó'obtidos.

Metade do pó obtido foi levado ao forno e tratado termicamente à 400°C para que se eliminasse a matéria orgânica. A intenção deste procedimento era obter um pó de aragonita e outro de nácar (não tratado termicamente), para comparar a influência da matéria orgânica nos experimentos.

Foram realizados testes de encharcamento das pastilhas prontas para verificar a resistência da mesma quando encharcada com meio. O resultado dos testes mostrou que as amostras não resistiam satisfatoriamente ao encharcamento, apresentando elevada friabilidade. Para obter melhor manuseabilidade foi adicionado ao pó um ligante: o colágeno tipo I bovino. O aglutinante permitiu melhor aderência das partículas. Procedimento: -

Foi utilizado 1,5g de colágeno tipo I bovino diluído em 25 ml de ácido acético (0,02 normal). O ácido acético adicionado colabora, juntamente com o banho maria, no processo de desnaturação parcial das fibras de colágeno. Porém posteriormente este ácido deve ser neutralizado para que não aja sobre a aragonita (CaCO3) degradando sua fase mineral.

A mistura foi levada a banho maria 60°c durante 60 min.

O ácido acético foi então neutralizado com NaOH (0,05M) até alcançar pH 7.

Figura'6'Imagem'de'tubo'falcon'com'colágeno'tipo'I'bovino'pronto.'

As pastilhas foram preparadas na proporção de 1g de pó para 150µL da mistura. A seguir foram separadas em dois grupos: Aragonita – cujo pó com qual foi feita havia sido tratado termicamente no forno a 400°c afim de eliminar a matéria orgânica (Figura 7) e Nácar – cujo pó não foi tratado termicamente antes da preparação das pastilhas (Figura 7). Depois de prontas, todas as pastilhas foram tratadas em mufla elétrica a 180°c por 50 min.

10"

Figura'7'Imagem'de'uma'placa'de'petri'com:'na'esquerda,'pastilha'feita'com'pó'tratado'termicamente,' sem'matéria'orgânica.'Na'direita'nácar,'com'matéria'orgânica.'

Porém aos serem submetidas a novos testes as pastilhas feitas com pó termicamente tratado continuaram sem manuseabilidade quando encharcadas. Diante disso a solução para o problema foi cobri-las com uma camada protetora que mantivesse sua integridade. Foram testadas camadas de cera e colágeno. A amostra foi coberta, restando apenas uma face de contato com o meio.

Figura'8'Em'(A),'pastilhas'cobertas'por'colágeno.(B)'pastilhas'cobertas'por'Cera'com'uma'face'livre.'

4.4

PREPARO DA CULTURA CELULAR

O meio de cultura celular utilizado nos testes foi emprestado do Laboratório de Virologia Básica e Aplicada (LVBA) UFMG. Todo procedimento de criação e repique do meio foi realizado no local. Para cultivo e repique das células VERO seguiu-se um protocolo pré-estabelecido. (Anexo A)

11"

" Figura'9'Capela'de'Fluxo'Laminar'utilizada'para'repique'das'células'VERO.'

Depois de pronta a cultura, foi realizado o primeiro teste de contato do meio de cultura de células com as amostras. Para este teste foram utilizadas: (Figura 10).

•

Poço A1: Pastilha de nácar, pura (sem cobertura de colágeno);

•

Poço B1: Pastilha de aragonita, pura;

•

Poços A2/ B2/ A3/ B3: Pastilhas de colágeno puro (grupo controle);

•

Poços A4/ B4: Pastilhas de aragonita com cobertura de colágeno;

•

Poços A5/ B5: Pastilhas de nácar com cobertura de colágeno;

•

Poço A6: Pastilha de aragonita com cobertura de cera;

•

Poço B6: Pastilha de nácar com cobertura de cera;

" Figura'10'Primeiro'teste'de'contato'do'meio'de'cultura'de'células'com'amostras'de'vários'tipos.'

12"

Nota-se, na figura 10, que as pastilhas termicamente tratadas (somente aragonita) não resistiram ao encharcamento e se desmancharam, porém as que estavam envoltas com a camada de cera não perderam sua forma. As pastilhas de nácar resistiram bem ao encharcamento, mesmo as que não possuíam cobertura. Este comportamento pode estar associado à materia orgânca ainda contida em sua costituição. Os testes que seguiram foram realizados com as pastilhas envoltas em cera.

13"

RESULTADO e DISCUSSÃO

Após obtenção das amostras e moagem das conchas, metade do pó obtido foi levado ao forno à 400°c para eliminar a matéria orgânica contida no nácar e trasformá-lo em pó de aragonita. O resultado visto a olho nú foi uma nítida mudança na coloração da amostra. O pó foi análisado também em MEV (Microscópio Eletrônico de Varredura). (CBEIH – CETEC). (Figura 13).

Figura'11'Imagem'de'varredura'de'Cristal'de'aragonita.'

O pó tratado transformou-se de nácar em aragonita devido à alta temperatura. Não foi observado resido de matéria orgânica na amostra. É possivel verificar na figura 11 a presença de cristais de aragonita e pequenos cristais de pó de aragonita à 400 mesh. O formato prismático, quando comparado às lajotas de aragonita, possui maior resistência à moagem. Nos testes de pastilhamento o melhor resultado obtido foi com pó de tamanho 250 mesh. Porém devido a dificuldade de moagem a medida que as partículas diminuem de tamanho, foi estabelecido que as pastilhas seriam compostas de 90% de pó de tamanho 250 mesh e 10% de pó a 140 mesh. Depois de prontas as pastilhas foram levadas ao MEV. (Figura 12).

14"

" Figura'12'Imagem'de'MEV'das'pastilhas'de'aragonita'

" Pela superfície da pastilha foi possível notar que o aglutinante utilizado permitiu melhor coesão das partículas, aumentando a resistência ao encharcamento. Também é nítida a presença de maior número de prismas do que de lajotas, justamente por serem, estas ultimas, menos resistêntes à moagem. Não houve sinterização das partículas, devido à baixa temperatura que foi submetida a amostra. Nos testes de encharcamento as pastilhas termicamente tratadas (somente aragonita) não resistiram e se desmancharam, porém as que estavam envoltas com a camada de cera não perderam sua forma. As pastilhas de nácar resistiram bem ao encharcamento, mesmo as que não possuíam envolto. Esta reação pode estar associada à materia orgânca ainda contida em sua costituição. (Figura 12). Nos primeiros testes de contato houve a formação de uma monocamada de células nos poços da placa de teste. Observando esta monocamada em microscópio óptico viu-se uma alteração morfologica destas, que passaram do formato circular (células não aderidas) para um formato fusiforme.

15"

CONCLUSÃO Foram realizados somente os testes preliminares, mas pode-se reafirmar que as

amostras de aragonita e nácar são, de fato, biocompativeis. Observando em microscópio óptico, a monocamada formada na superfície dos poços da placa de testes, vê-se a alteração morfológica das células VERO, que se tornam fusiformes, indicativo de aderência ao substrato.

16"

RECOMENDAÇÕES Necessita-se comparar a biocompatibilidade entre as amostras de aragonita e

nácar. Para isto será realizado o ensaio de MTT, um teste que mede a taxa metabólica das células. Este teste é mais quantitativo e permitirá uma comparação mais precisa entre os diferentes substratos.

" " " " " " " 17"

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Atlan g, balmain n, berland s, vidal b, lópez e - reconstruction of human maxillary defects with nacre powder: histológical evidence of Bone regeneration. C.r. acad. Sci. Paris/life sci 320 (1997) 253-258. Bose s, roy m, bandyopadhyay a - recent advances in bone tissue engineering scaffolds trends in biotechnology october 2012, vol. 30, no. 10 Brugnoli, e. Et al. Golden mussel limnoperna fortunei (bivalvia: mytilidae) distribution in the main hydrographical basins of uruguay: update and predictions. Anais da academia brasileira de ciências, v. 77, n. 2, p.235-244, 2005. Combesa c, miao b, bareille r, rey c - preparation, physical–chemical caracterisation and cytocompatibility of calcium carbonate cements. Biomaterials 27 (2006) 1945–1954 Darrigran, g.. El mejillón dorado, un novedoso problema económico/ambiental para el mercosur. Pesquisa naval, 2001. Davis, j.m – basic cell culture - second edition, 2002, oxford university press Freshney, i. R – culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. Wiley-blackwell, 2010 Garreta e, gasset d, semino c, borrós s - fabrication of a three-dimensional nanostructured biomaterial for tissue engineering of bone biomolecular engineering 24 (2007) 75–80 Gazulha,vanessa. O mexilhão dourado limnoperna fortunei (dunker, 1857) na presença de cianobactérias: taxa de filtração, comportamento alimentar e sobrevivência. Porto alegre, 2010. Huang z, li x - nanoscale structural and mechanical characterization of heat treated nacre, materials science and engineering c 29 (2009) 1803–1807 Karageorgiou v, kaplan d -porosity of 3d biomaterial scaffolds and osteogenesis biomaterials26 (2005) 5474–5491 18"

Kelton k. F, greer a. L – biomineralization. Nucleation in condensed matter (2010), 640651 Kobayashi i, samata t - bivalve shell structure and organic matrix. Materials science and engineering c 26 (2006) 692–698. Lamghari m, almeida m. J, berland s, huet h, laurent a, milet c, lopez e - estimulation of bone marrow cells and bone formation by nacre: in vivo and in vitro studies bone vol. 25, no. 2, supplement august 1999:91s–94s Liao h, mutvei h, strokm m. S, hammarstrokm l, li j - tissue responses to natural aragonite (margaritifera shell) implants in vivo biomaterials 21 (2000) 457- 468 Lowenstam h. A, weiner s - on biomineralization, 1989, oxford university press Molinaro e. M - conceitos e métodos para a formação de profissionais em laboratórios de saúde: volume 2 epsjv; ioc (2010) 215-253. P.101-102, 1993. Pastorino, g. Et al. !Limnoperna fortunei (dunker, 1857) (mytilidae), nuevo bivalvo invasor em águas del rio de la plata!. Neotrópica, v. 39, Saiz e, zimmermann e. A, lee j. S, wegst u. G. K, tomsi a. P - perspectives on the role of nanotechnology in bone tissue engineering dental materials 29, no. 1, (2013) 103–115 Simeão, c. M. G., influência da variação de velocidade e pressão sobre limnoperna fortunei dunker 1857 (bivalvia, mytilidae) e verificação dos efeitos da toxicidade do látex de euphorbia splendens var hislopii n.e.b (euphobiaceae) para esta espécie. Belo horizonte 2011. Vallet-regí m, arcos d – biomimetic nanoceramics in clinical use: from materials to applications (2008) Vunjak-novakovic g, freshney i. R – culture of cells for tissue engineering. Wiley, 2006 Weiss i. M, tuross n, addadi l, weiner s - mollusc larval shell formation: amorphous calcium carbonate is a precursor phase for aragonite journal of experimental zoology 293:478–491 (2002)

19"

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO TECNOLÓGICA E INOVAÇÃO - PIBIC

Ministério da Ciência e Tecnologia / CNPq - Edital 2012 / 2013 Programa Institucional de Iniciação Científica – Fundação CETEC Projeto GT 343 – Controle do mexilhão dourado: bioengenharia e novos materiais para aplicações em ecossistemas e usinas hidrelétricas

ARQUITETURA E TECNOLOGIA: LABORATÓRIOS INTELIGENTES PARA PRESERVAÇÃO DE ESPÉCIES BIOLÓGICAS GT 343 / CNPq 12/Agosto/2013 Autor: Fernanda Cristina de Souza Fiuza Orientador: Hernan Roberto Espinoza Riera

______________________________________________________________________ Universidade Federal de Minas Gerais ______________________________________________________________________

Centro Tecnológico SENAI CETEC ______________________________________________________________________ GERENTE DE INOVAÇÃO E TECNOLOGIA José Eustáquio Drumond

Centro Tecnológico SENAI CETEC Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais / CETEC Projeto GT 343 – Controle do mexilhão dourado: bioengenharia e novos materiais para aplicações em ecossistemas e usinas hidrelétricas Orientador: Hernan Roberto Espinoza Riera

Autores: Fernanda Cristina de Souza Fiuza, Arquitetura e Urbanismo, Universidade Federal de Minas Gerais. Hernan Roberto Espinoza Riera, Mestrando em Engenharia de Materiais.

Relatório Final

ARQUITETURA E TECNOLOGIA: LABORATÓRIOS INTELIGENTES PARA PRESERVAÇÃO DE ESPÉCIES BIOLÓGICAS 1. INTRODUÇÃO 1.1 Caracterização da invasão do mexilhão dourado O Limnoperna fortunei (Dunker, 1857), conhecido como mexilhão dourado é um molusco bivalve de água doce pertencente à família Mytilidae. Este bivalve, filtrador, apresenta grande capacidade reprodutiva, comportamento gregário, grande capacidade de adesão e alta tolerância a ambientes hostis. Pode se adaptar a diversas condições ambientais desfavoráveis, como águas poluídas ou contaminadas. Também possui resistência à variação de pH, temperatura e outros parâmetros. Em sua fase adulta, a espécie produz um filamento proteico secretado por uma glândula próxima a seu pé que permite ao animal uma forte fixação em superfícies rígidas. É originário do sudeste da Ásia e foi introduzido na América do Sul na década de 1980, trazido na água de lastro de navios. Em 1990 ocorreu seu primeiro registro na América, no Rio da Prata, na Argentina (Pastorino et al., 1993), atingindo em seguida o Uruguai, Paraguai, Bolívia e Brasil (Cataldo & Boltovskoy, 2000). Registros recentes indicam a presença do mexilhão dourado em Volta Grande – MG, localizado na bacia do rio Grande, um reservatório importante no processo de geração de energia elétrica pela Cemig (Companhia Energética de Minas Gerais S.A.). O sucesso do estabelecimento de espécies invasoras em um determinado ambiente depende, dentre outros fatores, da baixa eficiência ou ausência de predadores na área invadida (WILLIAMSON & FITTER, 1996). Diversas espécies de peixes têm sido descritas na América do Sul como predadoras do mexilhão dourado (MONTALDO et al. 1999), entretanto pouco ainda se sabe acerca dos reais impactos destas ações nas comunidades de L. fortunei.

1.2 Influencia da eficiência dos laboratórios de cultivo – MELHORAR A invasão do mexilhão dourado não só alterou a dinâmica dos ecossistemas nos quais foi inserido, como também causou grande impacto econômico para o setor hidrelétrico devido ao entupimento de tubulações. O Limnoperna fortunei tem sido estudado em diversos laboratórios afim de se determinar um modo de impedir que o mesmo cause tantos prejuízos e estudar suas propriedades de adesão para a criação de materiais bioinspirados.

Nesse contexto, é de suma importância que os laboratórios atendam as demandas da espécie. Ambientes projetados para um fim específico colaboram com a melhoria da produtividade e facilitam as atividades ali desenvolvidas, dinamizando os processos e agilizando os resultados. Atualmente, a criação de ambientes flexíveis para diversos usos tem sido muito discutida entre os profissionais do meio arquitetônico. O desafio é obter projetos de espaços eficientes para o usuário que compatibilizem as demais instalações com projetos complementares e atendam às normas e certificações e, além disso, que sejam passíveis de futuras alterações e implementação de novas tecnologias automatizadas. O trabalho descrito neste relatório foi desenvolvido de acordo com as necessidades do laboratório de cultivo do mexilhão dourado da Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais (CETEC MG), vinculado à pesquisa que objetiva o desenvolvimento de medidas mitigadoras para a ação do bivalve nas instalações da CEMIG, adotando uma política de novas técnicas não-poluentes e prevenção da ação invasora, bem como o aprimoramento na pesquisa dos processos químicos e físicos ocorrentes no procedimento de adesão do mexilhão.

2. OBJETIVOS A bolsa vigente objetiva o estudo e criação de soluções arquitetônicas e automatizadas para a melhoria do laboratório de cultivo do mexilhão dourado, localizado no CETEC MG, e o desenvolvimento de novos métodos de cultivo automatizados que aumentem a eficiência dos processos e experimentos desenvolvidos nas instalações laboratoriais, utilizando para tal, pesquisa em área tecnológica com auxílio de demais profissionais e pesquisadores da área.

3. PROBLEMAS 3.1 AS INSTALAÇÕES ATUAIS DO CETEC As instalações do CETEC MG foram construídas na década de 1970 e projetadas de maneira razoavelmente flexível e não tão passíveis de incrementação de tecnologias da construção quanto desejado. Apesar das instalações serem antigas, alguns setores conseguiram adaptar seus laboratórios e dessa forma têm sua demanda atendida. Mesmo assim essas instalações necessitam de melhorias, pois encontram-se desatualizadas. Para tal, são necessárias intervenções arquitetônicas na atual situação e readequação dos laboratórios com abertura para futuras mudanças. Especificamente, o laboratório de cultivo do mexilhão dourado exige adequação às normas de biossegurança, por se tratar de uma espécie de fácil adaptação e que pode, acidentalmente, ser inserida em tubulações de esgoto e proliferar.

4. METODOLOGIA Inicialmente foi destinado um período para levantamento bibliográfico do assunto. Nesse processo, ficou constatado que não há literatura específica sobre o tema, e sim diversas referências em artigos mais amplos. Durante a pesquisa bibliográfica, uma obra análoga em especial foi mais profundamente estudada, devido a um exemplo acessível nas próprias instalações do CETEC MG: os Clean Rooms ou Salas Limpas. Após a revisão bibliográfica, houve um levantamento de dados a respeito do laboratório de cultivo do mexilhão dourado, como a rotina de trabalho, as condições físicas do espaço, os processos e experimentos realizados, e posteriormente a elaboração de projetos e novos layouts que englobariam sugestões de novos métodos de cultivo da espécie.

5. DESENVOLVIMENTO E ANÁLISE DOS RESULTADOS Durante o levantamento bibliográfico, surgiu a necessidade de estudo de um tipo específico de laboratório como exemplo de aplicação de automação e demais tecnologias. A obra análoga estudada foi a Sala Limpa, visto que, além da inovação aplicada nos projetos, havia um exemplo acessível nas próprias instalações do CETEC MG. No que se diz respeito à arquitetura tecnológica ligada a construção de laboratórios altamente automatizados, tem-se como pioneiras as Salas Limpas. São laboratórios que exigem um rigorosa proteção e controle das partículas presentes dentro das salas. Esse ambiente é mantido por artifícios da automação e pela cooperação dos usuários. Os mesmos são instruídos a seguir o impreterivelmente o protocolo de segurança. Todo esse cuidado é imprescindível para o bom funcionamento da Sala Limpa, pois qualquer contaminação por partículas externas pode comprometer o

processo produtivo e, consequentemente, a

confiabilidade das análises e demais serviços executados no laboratório. Nos Clean Rooms são desenvolvidas atividades que atendem a diversos setores como indústrias, biotecnologia, áreas hospitalares, fármacos e até cosméticos. Durante a elaboração do projeto é importante considerar o fluxo de trabalho e a facilidade de manutenção. Isso está intimamente relacionado ao tipo de mobiliário utilizado no projeto. Esses móveis devem possuir o mínimo de cantos vivos, aberturas, fendas ou saliências, com acabamentos monolíticos e resistentes aos desgastes. Atualmente existem empresas especializadas em projetos de móveis para Salas Limpas. Mesmo com todos esses cuidados na escolha dos equipamentos que integram a sala, a maior fonte de contaminação da área são os próprios operadores. Até mesmo uma movimentação excessiva pode gerar agito de partículas que, em geral, são trazidas do ambiente externo no corpo dos operadores. Por isso, é importante que todos os que frequentem a Sala Limpa usem roupas especiais que minimizem a chance de contaminação e

estejam cientes das regras específicas de uso. Os operadores devem ser selecionados baseados em critérios de disciplina e controle psicológico para atuar de forma a não comprometer a limpeza da sala. A elaboração do projeto exige que o profissional tenha conhecimentos não só arquitetônicos, como também de técnicas de ar condicionado e filtragem de ar, materiais e equipamentos, métodos sanitários, esterilização e iluminação.

Figura 1: Exemplo de esquema de ventilação de uma Sala Limpa

Figura 2: Imagem externa de uma sala limpa

Figura 3: Imagem interna de uma Sala Limpa

Figura 4: Vestimenta exigida para a atuação em Salas Limpas

Figura 5: Sala Limpa do CETEC MG

O nível de biossegurança requerido para as Salas Limpas, bem como a automação do ambiente de trabalho é muito superior ao do laboratório de cultivo do mexilhão dourado. “Os

procedimentos

biossegurança

Brasil

são

regulamentados pela Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio), (http://www.biosseguranca.com/home.htm) através da Lei de Biossegurança - N.11.105 de 24 de Março de 2005. O foco de atenção dessa Lei, no entanto, são os riscos relativos às técnicas de manipulação de organismos geneticamente modificados e questões relativas a pesquisas científicas com células-tronco embrionárias, não havendo ainda

qualquer

procedimento

norma

estabelecidos

para

manipulação de espécies invasoras. Da mesma forma, os manuais de técnicas laboratoriais de biossegurança levam em conta apenas os riscos inerentes à contaminação e disseminação de vetores de doenças, sem menção aos procedimentos básicos de segurança para a manutenção de espécies invasoras. “ – COLOCAR REFERENCIA O atual laboratório de cultivo do Limnoperna fortunei, funciona em uma instalação improvisada e imprópria para sua função, localizada no Setor de Análises Químicas (STQ) do CETEC MG. A área total é de aproximadamente 32m² dividida em duas salas, conforme representado abaixo:

Sala 2

Sala 1

Figura 6: Modelo 3d do atual laboratório do mexilhão dourado As janelas da sala 2 foram encobertas por uma película isofilme. As portas internas são vedantes. A temperatura é mantida em torno de 20°C por um aparelho de Ar Condicionado e a luminosidade diária não é controlada. Por se tratar de uma espécie com risco de dispersão por meio aquático, as saídas hidráulicas foram lacradas com uma camada de areia para evitar a inserção de larvas na rede de esgoto.

Figura 7: Situação atual do laboratório de cultivo do mexilhão dourado

Figura 8: Bancada de experimentos atendendo ao uso do computador e depósito de objetos, sem espaço suficiente para a realização das análises.

Partindo para o levantamento de dados do cotidiano atual do laboratório de cultivo, alguns quesitos precisam ser pontuados: •

Duas pessoas trabalham com frequência no laboratório: o profissional responsável e a técnica.

•

Cerca de cinco bolsistas e/ou pesquisadores frequentam o laboratório não periodicamente para a realização de experimentos com o mexilhão.

•

São mantidos, em média, 7 aquários com o organismo.

O procedimento de obtenção do mexilhão se baseia em coletas do molusco a cada 3 meses no leito dos rios em Volta Grande. No local, eles são raspados com espátula e armazenados em caixas com aeradores contendo água dos próprios rios. Essas caixas são transportadas ao laboratório em isopores com gelo. Chegando ao laboratório, os indivíduos passam por um processo de lavagem para retirada da matéria orgânica agregada e repousam por dois dias. Devido a baixa resistência do bivalve a altos índices de cloro, a água que abastece os aquários vem da rede, passa por uma caixa de descloração e em seguida preenche os aquários. Ocorre também a medição de temperatura, pH e oxigênio dissolvido da água. Esse processo ocorre duas vezes por semana. O mexilhão é alimentado com ração de peixe e solução com algas. A ração, rica em proteínas, fermenta durante 7 dias, em galão com aerador. Já as algas, da espécie Pseudokirchneriella subcapitata, são cultivadas durante 7 dias em soluções com nutrientes e aerador. Ambas as soluções são armazenadas no freezer e todos os dias são depositados 100mL de cada nos aquários. A preparação é feita pela técnica do laboratório no mesmo setor. Todo efluente resultante dos processos ocorridos no laboratório são encaminhados para um sistema de tratamento no qual há despejo de cloro para eliminar os organismos ainda vivos. Após 24 horas, os resíduos líquidos são despejados na terra, sem contato algum com a rede de coleta de esgoto da COPASA. Está prevista a transferência de setor do ambiente de cultivo do mexilhão dourado, entretanto ainda não está definido exatamente a localização do novo laboratório. Diante da impossibilidade de elaboração de um projeto formal, adotou-se a alternativa de trabalhar com módulos que, devido a sua flexibilidade, podem se encaixar e conformar o espaço da nova instalação.

Figura 9: Módulo de cultivo: transferência das caixas d’água para outro cômodo e transporte da água por meio de mangueiras, quando acionado o sensor de nível, passando por medidores de pH e cloro.

Figura 10: Módulo da bancada de experimentos: separação das funções (experimento + computadores), ergonomicamente projetada.

Figura 11: Módulo para uso do computador Além dos módulos mostrados, outros elementos componentes do laboratório podem ser encaixados, como a câmara de germinação, os armários e as caixas de cloração. Vai depender da situação do espaço de destino. Ainda sim, é importante enumerar medidas arquitetônicas de precaução para o futuro laboratório. As janelas das salas de contato direto com o mexilhão devem ser vedadas com borracha, assim como todas as portas internas devem ser vedantes e de material termicamente isolante e resistente a agua. A climatização da sala deve ser controlável: a temperatura e a iluminação devem ser manejáveis independentemente. As bancadas e cubas de pia devem ser confeccionadas de material impermeável não poroso e

resistente a produtos químicos e choques mecânicos. Para evitar a disseminação por meio aquático, a pintura das paredes deve ser feita com tinta epóxi com fundo selante e os pisos e rodapés devem ser feitos com material monolítico, sem emendas e com formato desfavorável a acumulação de líquido e sujeira. Vale ressaltar que qualquer outro material deve atender as normas de biossegurança adequadas ao caso. Quanto a elaboração de novos métodos de cultivo, um experimento realizado pela pesquisadora do CBEIH Gabriela Rabelo, inspirou ideias sobre mudanças na forma de cultivo atual do mexilhão. Durante esse experimento, um aquário foi retirado do laboratório e exposto a ação do vento, temperatura e luminosidade ambientes. A alga, alimento do mexilhão, foi depositada no aquário apenas uma vez durante o experimento, pois o contato com a luz solar possibilitou a realização da fotossíntese e a reprodução da espécie, o que facilitou o trabalho da pesquisadora no cultivo do mexilhão. A exposição ao ambiente externo também trouxe como consequência a alteração visível do aspecto da concha do molusco. Quando cultivado em ambiente laboratorial, a concha do bivalve se torna mais acinzentada e perde algumas listras características do animal quando encontrado na natureza. A concha dos organismos cultivados neste experimento eram mais parecidas com o aspecto comum do mexilhão. O experimento durou cerca de 3 meses, pois foi realizado durante o verão e as altas temperaturas culminaram na morte dos organismos cultivados. Com esse experimento, concluise que a exposição a luz solar e a condições mais parecidas as naturais do mexilhão facilita o cultivo e talvez possibilite a reprodução do mexilhão nesse ambiente. Se adequarmos este experimento e prevenirmos contra possíveis agentes que prejudiquem a continuidade do procedimento, será possível um estudo mais próximo da realidade do mexilhão em seu ambiente e também facilitará os cuidados no cultivo. Direcionando para a criação de um novo método de cultivo laboratorial que reproduza condições físicas mais parecidas com o ambiente natural do mexilhão e possibilite ao pesquisador o controle dos principais aspectos influentes nos experimentos com o mexilhão, foi criado um esquema que atenderia, mesmo que em primeiro momento, as demandas solicitadas. [FOTO DO NOVO METODO] De acordo com o esquema representado, os aquários ficam expostos a luz solar que entra pela esquadria. Para garantir a temperatura ideal para o mexilhão, pode ser utilizado um microcontrolador Arduino, ligado a um sensor de temperatura que, quando atingir uma temperatura definida, ativa a placa de Peltier e resfria o aquário até abaixar a temperatura e chegar a uma mínima também definida pelo pesquisador e desativa o sistema. Dessa forma, o mexilhão terá contato com a luz solar e não correrá o risco de morrer devido a altas temperaturas, como no primeiro experimento. Além disso, os aquários são interligados por tubulações que permitem a circulação da água, facilitando o estudo de adesão do mexilhão a

tubulações. A Circulação da água é garantida por uma bomba ligada ao aquário que também é controlável pelo pesquisador.

Figura 13: Arduino: placa microcontroladora de prototipagem eletrônica que utiliza uma linguagem baseada em C/C++.

Figura 14: Placa de Peltier: Pastilhas que utilizam o Efeito Peltier (produção ou absorção de calor) para resfriar uma de suas superfícies e aquecer a outra.

6. CONCLUSÕES Devido a fatores limitantes, não foi possível a elaboração do projeto formal arquitetônico e automatizado do laboratório do mexilhão dourado. Entretanto, a alternativa de divisão em módulos pode contribuir para a continuação do trabalho quando houver a definição do espaço do novo laboratório. O estudo da rotina de trabalho, dos profissionais atuantes e das condições físicas resulta em um programa com diretrizes que levam a um projeto eficiente. Neste plano, surge juntamente com os estudos específicos, sugestões de novos métodos de trabalho, como aconteceu no decorrer da bolsa. Realizando a construção do método de cultivo elaborado e o teste da sua eficiência, será possível a realização de novos experimentos, de forma mais automatizada que facilita o trabalho dos pesquisadores.

7. RECOMENDAÇÕES Como continuação do trabalho já iniciado, ainda resta o desenvolvimento e detalhamento dos processos automatizados com auxílio de um profissional da área. Algoritmos como o da aplicação do circuito com Arduíno e Pastilha de Peltier não foram desenvolvidos até o presente momento. Cabe ainda trabalhar em novos métodos de cultivo que atendam a demais testes que possam vir a ser necessários para os pesquisadores. A partir disto, será possível a construção de novos métodos de cultivo e a realização de possíveis ajustes quando necessário. Essas mudanças são aplicáveis mesmo no laboratório atual e podem ser melhoradas após a mudança de espaço. Quando definido o local de destino do laboratório de cultivo do mexilhão dourado, as recomendações arquitetônicas sugeridas por este relatório podem ser seguidas e adaptadas para a aplicação real, bem como a conformação do espaço por meio dos módulos gerados.

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO TECNOLÓGICA E INOVAÇÃO - PIBIC ! ! ! Ministério da Ciência e Tecnologia / CNPq - 2013 Programa Institucional de Iniciação Científica – Fundação CETEC

Projeto GT 343 – Controle do Mexilhão Dourado: Bioengenharia e novos materiais para aplicações em ecossistemas e usinas hidrelétricas

Desenvolvimento de Protocolo de Modernização do Monitoramento do Mexilhão Dourado (Limnoperna fortunei)

GT 343 / CNPq / 2013

Autor Brunno Mark Mascarenhas Costa Orientador Mônica de Cássia Souza Campos Co-orientador Fabiano Alcísio e Silva

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______________________________________________________________________! Universidade!Federal!de!Minas!Gerais!0!UFMG! ______________________________________________________________________!

Centro Tecnológico SENAI CETEC _____________________________________________________________________! GERENTE&DE&INOVAÇÃO&E&TECNOLOGIA& José!Eustáquio!Drumond!

FUNDAÇÃO CENTRO TECNOLÓGICO DE MINAS GERAIS - CETEC PRESIDENTE Marcílio!César!de!Andrade! Av.!José!Cândido!da!Silveira,!2000!0!Horto!Florestal!0!Belo!Horizonte!0!MG!–!310350536! Telefone:!(31)!348902000!/!Fax:!(31)!348902200!–!Portal:!www.cetec.br!0!E0mail:!faleconosco@cetec.br!

CENTRO TECNOLÓGICO SENAI CETEC FUNDAÇÃO CENTRO TECNOLÓGICO DE MINAS GERAIS / CETEC ! !

Projeto GT 343 – Controle do Mexilhão Dourado: Bioengenharia e Novos Materiais para Aplicações em Ecossistemas e Usinas Hidrelétricas

Orientador: Mônica de Cássia Souza Campos, Doutora em Geologia Ambiental e Recursos Naturais Co-orientador: Fabiano Alcísio e Silva, Mestre

Autores: Brunno Mark Mascarenhas Costa; Engenharia de Controle e Automação, Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG. Mônica de Cássia Souza Campos, Doutora Fabiano Alcísio e Silva, Mestre

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SUMÁRIO 1.&INTRODUÇÃO&...................................................................................................................................&7& 2.&OBJETIVOS&........................................................................................................................................&8& 3.&PROBLEMAS&.....................................................................................................................................&8& 4.&METODOLOGIA&.................................................................................................................................&8& 4.1. REVISÃO DAS TÉCNICAS TRADICIONAIS .................................................................................. 8 4.2. DESENVOLVIMENTO DO SOFTWARE ......................................................................................... 8 4.3. TESTES DO PROGRAMA ................................................................................................................. 9 4.4. ANÁLISE DOS RESULTADOS ......................................................................................................... 9 5.&DESENVOLVIMENTO&E&ANÁLISE&DE&RESULTADOS&..............................................................................&9& 5.1. REVISÃO DAS TÉCNICAS TRADICIONAIS .................................................................................. 9 5.1.2. PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) ................................................................................ 9 5.1.3. MICROSCOPIA e UTILIZAÇÃO da POLARIZAÇÃO CRUZADA da LUZ ............................. 10 5.1.4. CITOMETRIA de FLUXO BASEADA em IMAGEM ................................................................. 10 5.2. DESENVOLVIMENTO DO SOFTWARE ........................................................................................ 12 5.2.1. ESTRUTURA do SOFTWARE ................................................................................................... 13 5.2.1.1. FUNÇÃO de DETECÇÃO .................................................................................................................................... 13 5.2.1.2. INTERFACE GRÁFICA ........................................................................................................................................ 13 5.2.1.3. EXIBIÇÃO dos RESULTADOS ............................................................................................................................. 13

5.2.2. CORRELAÇÃO CRUZADA NORMALIZADA .......................................................................... 14 5.2.3. SOFTWARE de RECONHECIMENTO de PADRÃO de IMAGENS ......................................... 15 5.3. TESTES DO PROGRAMA ............................................................................................................... 16 5.4. ANÁLISE DOS RESULTADOS ....................................................................................................... 17 5.4.1 ANÁLISE GRÁFICA dos RESULTADOS ................................................................................... 20 5.4.2. PARALELO ENTRE FLOWCAM e SOFTWARE DESENVOLVIDO ....................................... 26 6.&CONCLUSÕES&..................................................................................................................................&27& 7.&RECOMENDAÇÕES&..........................................................................................................................&28& 8.&REFERÊNCIAS&..................................................................................................................................&29& ANEXO&1&–&IMAGENS&E&HISTOGRAMAS&DOS&RESULTADOS&GERADOS&PELO&PROGRAMA&NOS& DIFERENTES&TESTES&EXECUTADOS.&.....................................................................................................&32&

Atualizar !!!!!!!!!!!!!!!!! ! !

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LISTA de FIGURAS Figura 1: FlowCAM .................................................................................................................................... 11 Figura 2: Esquema de captura de imagens ponderado por polarizadores ................................................... 11 Figura 3: Detecção de amostras birrefringentes .......................................................................................... 12 Figura 4: Esquema de funcionamento do FlowCAM .................................................................................. 12 Figura 5: interface gráfica do software desenvolvido ................................................................................. 13 Figura 6: Exemplo de resultado das amostras identificadas pelo software ................................................. 14 Figura 7: Conjunto de imagens correlacionadas utilizado nos testes .......................................................... 17 Figura 8: Imagens de referência utilizadas nos testes. O teste 1 usa a imagem à esquerda, enquanto que o teste 2 à direita. O teste 3 contempla os testes 1 e 2 combinados ....................................................... 19 Figura 9: Avaliações estatísticas de variância em função da variação do respectivo teste avaliado, para Sensibilidade em 60%. a) Variação do número de Acertos. b) Variação do número de Subestimações. c) Variação do número de Sobrestimações ................................................................ 21 Figura 10: Avaliações estatísticas de variância em função da variação do respectivo teste avaliado, para Sensibilidade em 70%. a) Variação do número de Acertos. b) Variação do número de Subestimações. c) Variação do número de Sobrestimações ................................................................ 22 Figura 11: Avaliações estatísticas da distribuição de probabilidade t de Student em função da variação da Sensibilidade do programa. a) Variação do percentual de Acertos (p-valor = 0,000221). b) Variação do percentual de Subestimações (p-valor = 0,000280). c) Variação do percentual de Sobrestimações (p-valor = 0,001175) ............................................................................................................................ 23 Figura 12: Eficiência do programa para o fator de sensibilidade de 60% e ângulo de passo 45. a) fator de escala 2. b) fator de escala 3 ................................................................................................................ 23 Figura 13: Eficiência do programa para o fator de sensibilidade de 70% e ângulo de passo de 45. a) fator de escala 2. b) fator de escala 3 ........................................................................................................... 24 Figura 14: Eficiência do programa para o fator de escala 2 e ângulo de passo 45. a) fator de sensibilidade 60%. b) fator de sensibilidade 70% ..................................................................................................... 25 Figura 15: Eficiência do programa para o fator de escala 3 e ângulo de passo 45. a) fator de sensibilidade 60%. b) fator de sensibilidade 70% ..................................................................................................... 25 Figura 16: Mostra de imagens detectadas pelo FlowCAM ......................................................................... 26 ! !

Figura 17: interface e mostra de imagens detectadas pelo software desenvolvido ..................................... 26

LISTA de TABELAS Tabela 1: Resultados absolutos e relativos dos percentuais de Acerto, Subestimação e Sobrestimação, e seus respectivos erros para ângulo de passo 360 ................................................................................. 18 Tabela 2: Resultados absolutos e relativos dos percentuais de Acerto, Subestimação e Sobrestimação, e seus respectivos erros para ângulo de passo 180 ................................................................................. 18 Tabela 3: Resultados absolutos e relativos dos percentuais de Acerto, Subestimação e Sobrestimação, e seus respectivos erros para ângulo de passo 90 ................................................................................... 18 Tabela 4: Resultados absolutos e relativos dos percentuais de Acerto, Subestimação e Sobrestimação, e seus respectivos erros para ângulo de passo 45 ................................................................................... 19 Tabela 5: Comparação entre FlowCAM e software desenvolvido .............................................................. 26

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________________________________ Relatório Final !

DESENVOLVIMENTO de PROTOCOLO de MODERNIZAÇÃO do MONITORAMENTO do MEXILHÃO DOURADO (Limnoperna fortunei) 1

Campos, M. C. S.;2Costa, B. M. M.;3Silva, F. A.

1. INTRODUÇÃO O Limnoperna fortunei (Dunker, 1857), popularmente conhecido como mexilhão dourado, é um molusco bivalve da Família Mytilidae que habita rios e lagos de água doce. O mexilhão é originário da China (Karatayev, A. Y; et al., 2010), se espalhou por Hong Kong, Taiwan e Japão, e posteriormente para a Argentina (Pastorino, et al., 1993). Em meados do século XXI a espécie chegou ao Brasil, mostrando-se nociva aos diversos ecossistemas invadidos como o Rio da Prata, Rio Paraná, Rio Paraguai (Brugnoli, et al., 2005), o Lago Guaíba e a Lagoa dos Patos (Darrigran, 2001). O mexilhão dourado é considerado nocivo aos ambientes que invade já que causa diversos impactos econômicos e ecológicos, com prejuízos sobre a biodiversidade local e causando incrustações e entupimento de tubulações de hidrelétricas, que, consequentemente, o tornaram alvo de diversas pesquisas a respeito de seu potencial invasivo.

O monitoramento é essencial no que tange à importância do estudo da dinâmica populacional de espécies invasoras, sobretudo aquelas que trazem algum tipo de prejuízo, seja de âmbito ambiental e/ou econômico. A identificação precoce de uma espécie invasora permite ao gestor estabelecer programas que visem a erradicação da espécie ou ainda a contaminação de novos locais.

O desenvolvimento de novas técnicas de modernização do monitoramento populacional da espécie invasora Limnoperna fortunei, é de grande importância para evitar que a espécie continue se alastrando pelas diversas redes pluviais do Brasil, causando desequilíbrio ecológico, e econômico às empresas que utilizam água bruta de rios contaminados como é o caso das barragens de usinas hidrelétricas.

Atualmente, os métodos de monitoramento do mexilhão dourado são voltados para inspeção visual e coleta de amostras da região com suspeita de invasão, metodologia que pode ser ineficiente, já que tal trabalho é periódico e, portanto, sujeito à grande variabilidade no que diz respeito à dinâmica populacional da espécie invasora (Mackie, G. L.; Claudi, R., 2010). Além disso, as técnicas tradicionais de monitoramento são de custo relativamente alto, já que demandam constantes deslocamentos até as regiões contaminadas e também diversas horas de especialistas para análises das amostras sob estereomicroscopia.

O programa MATLAB® tem sido utilizado como ferramenta para desenvolvimento de estudos de análises de imagens para modelagem computacional e automação de processos. A estrutura do programa permite a introdução de linguagem matemática e, assim, para o 7!! !

desenvolvimento de inteligência artificial remota. O desenvolvimento de uma linguagem matemática, acoplada ao programa MATLAB®, poderia auxiliar nos processos de identificação de imagens de larvas de mexilhão de modo a amenizar os custos oriundos do monitoramento da espécie, assim como melhorar a aquisição de informações. Desta forma, o desenvolvimento de um sistema de monitoramento remoto capaz de capturar dados relevantes ao estudo poderiam otimizar o processo em questão e ainda reduzir os custos finais.

2. OBJETIVOS Desenvolvimento de metodologias para análise quantitativa e qualitativa do mexilhão dourado por meio de uma ferramenta capaz de identificar, contabilizar e classificar, sobretudo, a fase larval do organismo. A ferramenta deverá funcionar através de um software de reconhecimento de padrão de imagens desenvolvido no programa MATLAB®, com intuito de otimizar as técnicas vigentes de monitoramento e propiciar meios para o monitoramento remoto, contínuo ou em um menor intervalo de tempo.

3. PROBLEMAS A detecção rápida da chegada de um invasor é a melhor forma de combate a uma espécie invasora e fundamental, pois permite ao gestor ambiental o controle de subpopulações enquanto elas ainda estão pequenas o suficiente para serem erradicadas (FICMNEW, 2003), além de evitarem a contaminação de novos locais. As atuais técnicas de monitoramento são custosas, fazendo com que sejam executadas poucas vezes ao ano e, consequentemente, diminuem a eficiência da detecção imediata da invasão e desenvolvimento de programas de manejo. Diante da relevância do monitoramento e identificação precoce da invasão do mexilhão dourado, a automação do processo é determinante para a proteção dos ambientes e diminuição do avanço da espécie. A otimização do monitoramento requer que as análises e obtenção de dados sejam feitas de maneira predominantemente remota, visando obter uma caracterização mais fiel no que tange ao crescimento e avanço populacional da espécie.

4. METODOLOGIA 4.1. REVISÃO das TÉCNICAS TRADICIONAIS Inicialmente, foi realizada pesquisa direcionada às técnicas de monitoramento mais utilizadas para a identificação e contagem da fase larval do mexilhão Dourado, evidenciando as peculiaridades de cada uma.

4.2. DESENVOLVIMENTO do SOFTWARE 8!! !

Foi desenvolvido um software de reconhecimento de padrão de imagens capaz de auxiliar na identificação e contabilização das larvas do mexilhão utilizando a linguagem de programação textual MATLAB (MATrix LABoratory) proprietária de programa homônimo, contando com diversos recursos de processamento de imagens, bem como para desenvolvimento de interface gráfica.

4.3. TESTES do PROGRAMA Foram realizados vários de testes envolvendo imagens modelo juntamente com imagens de referência previamente escolhidas, com o objetivo de avaliar o grau de semelhança entre elas, com base em três parâmetros principais que fazem parte dos recursos programáticos do software: Fator de Escala, Ângulo de Passo e Fator de Sensibilidade.

4.4. ANÁLISE dos RESULTADOS Com base nos testes realizados com a execução do software, analisamos os acertos e falhas na identificação das amostras, além de apresentar possíveis motivos para a ocorrência de tais falhas, apontando os fatores preponderantes que aumentam e diminuem a eficiência do programa de acordo com as escolhas feitas com respeito ao conjunto de imagens de amostras e referências e também aos recursos programáticos peculiares que auxiliam nas decisões de uma solução de compromisso.

5. DESENVOLVIMENTO e ANÁLISE de RESULTADOS 5.1. REVISÃO das TÉCNICAS TRADICIONAIS As principais técnicas utilizadas na detecção e caracterização do mexilhão revisadas estão descritas a seguir:

5.1.2. PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) Método de amplificação do DNA através do uso da enzima polimerase, que catalisa a reação de polimerização de ácidos nucléicos permitindo a detecção do aumento do DNA multiplicado. A técnica utiliza o isolamento seletivo do DNA que permite isolamento de fragmentos de DNA do genoma, amplificando seletivamente uma região específica.

Dentre as vantagens desta técnica destaca-se que devido ao fato da amplificação do DNA, o PCR pode ser usado em análise de amostras extremamente pequenas, permitindo uma estimativa da quantidade de dada sequência presente numa amostra. Além disso por se tratar de uma técnica bastante específica, a legitimidade e confiança dos resultados positivos são grandes. 9!! !

No entanto, observa-se que a técnica ainda é bastante nova e com resultados ainda inconsistentes. Apenas alguns grupos em universidades vêm aplicando a técnica no Brasil e, portanto, ainda não é uma análise de rotina que possa ser indicada à monitoramento de empresas já que ainda é aplicada apenas em pesquisas. !

5.1.3. MICROSCOPIA e UTILIZAÇÃO da POLARIZAÇÃO CRUZADA da LUZ A Microscopia é largamente usada em aplicações geológicas, como no estudo de minerais e em seções finas de rocha, mas também atende a outras áreas, incluindo Geologia, Biologia, Medicina, etc.; podendo ser usada tanto quantitativa quanto qualitativamente. A microscopia e estereomicroscopia são atualmente as técnicas mais usadas e consolidadas para análise de larvas do mexilhão dourado. Os mesmos procedimentos para análises de plâncton são empregados para avaliar a presença e quantificar as larvas de mexilhão em uma amostra. Atualmente o CETEC tenta empregar a utilização da luz polarizada para otimizar o processo das análises microscópicas.

A luz polarizada é criada pela passagem de luz através de um filtro de polarização, permitindo a passagem de luz em apenas uma direção, seja ela vertical, horizontal ou diagonal. O microscópio de polarização é constituído de dois filtros, um acima e outro abaixo da amostra; o polarizador e o analisador. O modo com que as substâncias, principalmente as sólidas, interagem com a luz polarizada é preponderante para sua identificação, dependendo de suas propriedades ópticas.

5.1.4. CITOMETRIA de FLUXO BASEADA em IMAGEM Método de contagem, análise e classificação de partículas microscópicas suspensas em meio líquido em fluxo. Um feixe de luz de um único comprimento de onda é direcionado a esse meio líquido. Vários detectores são apontados ao local onde o fluxo passa através do feixe de luz, sendo um paralelo e vários perpendiculares a esse, além de detectores fluorescentes.

Esta tecnologia tem inúmeras aplicações, que vão desde a biologia molecular à biologia marinha, devido às suas propriedades autofluorescentes, que podem ser exploradas para a caracterização de comunidades planctônicas, como a fase larval do mexilhão dourado. Apesar de já ser utilizada em diversos trabalhos para análises de plâncton em geral, ainda não é empregada para análise de larvas do mexilhão dourado e, portanto, requer pesquisas para aprimoramento. Além disso, destaca-se o alto preço do equipamento, que custa em torno de duzentos mil dólares, tornando todo o processo bastante custoso e dificultando, inclusive, o desenvolvimento da técnica em pesquisas.

Dentre os equipamentos de citometria de fluxo disponíveis no mercado, destaca-se o FlowCAM, que é mais amplamente utilizado para análises de plânctons, e único já com artigos publicados para esse tema. O FLOWCAM® (figura 1) é uma analisador de partículas microscópicas que combina tecnologias óptica, eletrônica e de fluidos, bem como citômetro de fluxo e identificador de imagens utilizando luz polarizada, aliado a um programa de contagem e reconhecimento de padrão de imagens. ! 10! !

! Figura 1: FlowCAM

O princípio de funcionamento do FlowCAM se atem à utilização de uma bomba de sucção de fluidos; levando a amostra a uma célula de fluxo, que é ortogonal ao caminho óptico de um feixe de laser acoplado. O sistema óptico é semelhante a um microscópio, sendo utilizado para capturar imagens em tempo real à medida em que as partículas passam através da célula de fluxo. A possibilidade que o FlowCAM oferece de trabalhar com luz polarizada pode ser bastante útil na identificação do mexilhão dourado, devido às características birrefringentes de sua concha calcária, permitindo um discernimento mais seletivo no tocante à eficiência de detecção do molusco. A figura 2 mostra o esquema de funcionamento do polarizador e a figura 3 imagens de larvas de mexilhão dourado geradas pelo equipamento durante um teste desenvolvido pelo fabricante do FlowCAM.

! Figura 2: Esquema de captura de imagens ponderado por polarizadores

! 11! !

! Figura 3: Detecção de amostras birrefringentes

! Figura 4: Esquema de funcionamento do FlowCAM

É importante salientar que todas as técnicas supracitadas são realizadas em laboratórios específicos e, geralmente, carecem de pessoal qualificado para a operação dos equipamentos, que são peculiares a cada método. Além disso, nenhuma das técnicas funciona de forma autômata ou remota, o que impossibilita monitoramento contínuo e aumenta os custos de análises frequentes.

5.2. DESENVOLVIMENTO do SOFTWARE & Para o desenvolvimento da ferramenta de software, fez-se necessário buscar referências a respeito da linguagem especifica do MATLAB, bem como na forma de utilização dos recursos disponibilizados para tratamento de imagens. Em seguida foi desenvolvida a estrutura de implementação do código textual que pode ser subdividida em três partes principais: Função de Detecção, Interface Gráfica e Exibição dos Resultados; e serão detalhadas separadamente a seguir. ! 12! !

5.2.1. ESTRUTURA do SOFTWARE 5.2.1.1. FUNÇÃO de DETECÇÃO Corresponde ao cerne do software de detecção. Utiliza métodos matemáticos para encontrar padrões com base em uma imagem de referência previamente selecionada. A função é intrínseca à linguagem MATLAB, sob o nome de normxcorr2, e implementa internamente a operação de correlação cruzada normalizada, que realiza cálculos pixel a pixel entre as imagens de referência e a amostra, produzindo valores que variam entre 0 e 1 para cada pixel correlacionado, cuja propriedade é utilizada para avaliar o grau de semelhança entre elas. Tal função será detalhada no desenvolvimento do trabalho.

5.2.1.2. INTERFACE GRÁFICA Conhecida sob o nome de GUIDE no ambiente do MATLAB, essa ferramenta de desenvolvimento de interfaces gráficas possibilita uma interação mais amistosa com o usuário do software, além de oferecer recursos que auxiliam na análise dos dados. Como o MATLAB oferece formas de interação com o GUIDE de maneira simples, ele não será detalhado no escopo deste trabalho, uma vez que sua utilização apenas tem caráter visual e não interfere na lógica programática do software desenvolvido. A figura 5 mostra a interface desenvolvida com o auxílio da ferramenta GUIDE.

! Figura 5: interface gráfica do software desenvolvido

5.2.1.3. EXIBIÇÃO dos RESULTADOS Apesar de ser um recurso de interface gráfica, é relevante destacar que as técnicas utilizadas para uma melhor interação entre o programa e o usuário foram desenvolvidas sem o auxílio direto do GUIDE. Apenas apresentam os recursos diretamente disponíveis ao usuário por meio da interface. São eles a exibição das imagens identificadas, a geração de histograma do percentual de identificação e a possibilidade de salvamento das imagens identificadas à medida em que o programa executa. A figura 6 mostra um exemplo de resultado obtido na execução do software. ! 13! !

! Figura 6: Exemplo de resultado das amostras identificadas pelo software

5.2.2. CORRELAÇÃO CRUZADA NORMALIZADA A base de desenvolvimento da ferramenta de software, utilizando a linguagem técnica do MATLAB, se sustenta na utilização da função matemática de correlação cruzada normalizada, que será detalhada a seguir. Em aplicações de processamento de imagens, sobretudo aquelas em que os modelos de imagens sofrem variações de luminosidade e diferentes condições de exposição, é conveniente tratar de modelos matemáticos normalizados, que possuem significância prática ao se avaliar o grau de correlação entre duas imagens. Tal método é efetuado a cada passo iterativo subtraindo a respectiva média e dividindo pelo desvio padrão de cada imagem. A função de correlação cruzada normalizada relaciona imagens mapeadas em matrizes bidimensionais equivalentes, quando se utiliza escala em cinza, em função da densidade de pixels, matiz, saturação e luminosidade de um determinado modelo amostra !

avaliado em relação a uma

, cuja expressão matemática é dada por:!

! em que

é o número total de pixels de ambas as imagens.

é a média da amostra mapeada

e seu desvio padrão, seguindo da mesma forma para o modelo . Tal tratamento também pode ser interpretado como o produto escalar de dois vetores normalizados, cuja notação é apresentada abaixo:

! 14! !

Do ponto de vista vetorial, a correlação cruzada normalizada é equivalente ao cosseno do ângulo entre os vetores unitários F e T, sendo, portanto, igual a 1 quando tais vetores são múltiplos escalares entre si, i.e., quando são paralelos.

Com base nas descrições supracitadas, é possível fazer uso do referente modelo na determinação de correspondência ou semelhança entre duas imagens, embora o método não leve em conta fatores como geometria presente nas imagens, que aperfeiçoariam as técnicas de identificação; visto que a precisão é suficiente para a requerida seletividade do diagnóstico qualitativo, em detrimento da menor relevância quantitativa. ! No MATLAB, a função de correlação cruzada normalizada é implementada da forma como se segue sob o nome de normxcorr2: ! normxcorr2 usa o seguinte procedimento genérico: ! Calcula a correlação cruzada no domínio do espaço ou da frequência, dependendo do tamanho das imagens; ! Calcula somas locais e somas precomputadas; ! Usa somas locais para normalizar a correlação cruzada a fim de obter os coeficientes de correlação. A implementação segue o escopo da fórmula apresentada abaixo:

Onde é a imagem, sob o modelo.

é a média da imagem modelo e

é a média de

na região

5.2.3. SOFTWARE de RECONHECIMENTO de PADRÃO de IMAGENS O software desenvolvido tem como base a implementação da função de correlação cruzada normalizada apresentada anteriormente, levando em conta a correlação entre duas imagens, e avaliando o grau de semelhança entre ambas.

Os diversos recursos programáticos utilizados no desenvolvimento do programa auxiliam na determinação e aperfeiçoamento da identificação do presente software, merecendo destaque os seguintes:

! 15! !

! Fator de Sensibilidade: valor real ajustável que determina o grau de sensibilidade da correlação entre as imagens - variando entre 0, representando nenhuma semelhança, e 1, para semelhança pura (igualdade entre as imagens), bem como valores intermediários; ! Fator de Escala: valor inteiro ajustável, com menor valor admitido igual a 2, que determina as quantidades de correlações entre as imagens de referência e a amostra. É bastante relevante seu uso em amostras cujas escalas sejam menores que às das referências, de modo que a função de correlação tenha maior significado. Contudo pode incorrer em erros se usado de forma desproporcional. A cada unidade adicionada ao fator de escala, o software computa novamente a função de correlação para uma escala da imagem da amostra 50% maior que sua escala original; ! Ângulo de Passo: valor inteiro ajustável, representado em graus, que determina o números de rotações da imagem de amostra no sentido anti-horário, até o máximo de 360º. O número de correlações distintas realizadas devido ao ângulo de passo cresce à medida em que o ângulo de passo diminui – tendo mínimo valor 1 e máximo 360.

Há de se salientar que os valores ajustáveis são parâmetros intrínsecos ao programador e não ao usuário.

No que tange à interface gráfica com o usuário, existem alguns recursos disponíveis que auxiliam na identificação das imagens e merecem ser citados. São eles:

! Possibilidade para correlações com até 5 imagens de referência simultaneamente; ! Dimensionamento da apresentação das amostras identificadas conforme a conveniência; ! Possibilidade de salvamento das amostras identificadas em local distinto; ! Suporte para 3 extensões de imagens: JPG, BMP e PNG; ! Histograma que registra o percentual de identificação do número de amostras em função do número total de imagens correlacionadas.

5.3. TESTES do PROGRAMA Os presentes testes têm objetivo de qualificar e identificar a eficiência do software desenvolvido, contando com séries de imagens modelo para o devido fim. Tais testes se baseiam em avaliar a corretude das amostras identificadas com o auxílio de uma imagem de referência teste escolhida, comparando com a inspeção visual das mesmas, contrastando possíveis erros e acertos provenientes da variação de três parâmetros importantes que afetam diretamente o desempenho do programa, já discutidos anteriormente: Ângulo de Passo, Fator de Escala e Fator de Sensibilidade.

É relevante salientar que o tempo de execução do software aumenta consideravelmente à medida que se diminui o ângulo de passo e aumenta o fator de escala, além do aumento do número e dimensão das imagens de referência escolhidas e também das imagens correlacionadas. ! 16! !

Foram utilizados 110 imagens, sendo que 71 delas representavam larvas do mexilhão dourado, 19 eram imagens de moluscos com larvas parecidas às do mexilhão dourado, e 20 eram outros plânctons em geral. A figura 7 mostra as imagens utilizadas nos testes.

! Figura 7: Conjunto de imagens correlacionadas utilizado nos testes

Foram realizados três diferentes testes para avaliar as 110 imagens apresentadas ao programa. O primeiro teste foi utilizada uma imagem como referência ao programa, no segundo uma outra imagem da larva, e o terceiro teste utilizou as duas imagens. Em cada teste foram avaliados a eficiência do programa em função do fator de sensibilidade (0,60 e 0,70), o fator de escala (2 e 3), e os ângulos de rotação da imagem de referência, chamado de ângulo de passo (360º, 180º, 90º e 45º).

Nos resultados o programa exibe as imagens detectadas pelo software (janela à esquerda), e também os respectivos histogramas de percentual de imagens detectadas (janela à direita). O resultado apresentado em cada variação do teste compõe o anexo 1.

5.4. ANÁLISE dos RESULTADOS Para avaliar o desempenho do software em função dos diferentes testes e variáveis aplicadas, os dados foram dispostos em gráficos demonstrando a relação entre os percentuais de Acertos (proporção do número de mexilhões dourados identificados e o total de amostras), Subestimações (razão entre o número de mexilhões dourados não identificados e o total de amostras) e Sobrestimações (relação da quantidade de imagens identificadas como falsas positivas, ou seja, não correspondentes ao mexilhão dourado, em função do total de amostras). ! 17! !

Ângulo'de'passo'360

Escala Acerto 60% Acerto 70% Moluscos 60% Moluscos 70% Acerto total (60% ) Acerto (60% ) % Erro Subestimação 60% Subestimação (60% ) % Erro Sobrestimação 60% Sobrestimação (60% ) % Acerto total (70% ) Acerto (70% ) % Erro Subestimação 70% Subestimação (70% ) % Erro Sobrestimação 70% Sobrestimação (70% ) %

Teste 1 2 30 15 31 15 66 60 41 37,27 3 2,73 53 48,18 56 50,91 1 0,91

Teste 2 2 54 5 60 5 75 68,18 17 15,45 18 16,36 43 39,09 66 60 1 0,91

Teste 3 2 59 19 65 19 79 71,82 12 10,91 19 17,27 56 50,91 52 47,27 2 1,82

Teste 1 3 33 16 35 16 66 60 38 34,55 6 5,45 53 48,18 55 50 2 1,82

Teste 2 3 54 5 60 5 75 68,18 17 15,45 18 16,36 43 39,09 66 60 1 0,91

Teste 3 3 59 19 65 19 78 70,91 12 10,91 20 18,18 55 50 52 47,27 3 2,73

Tabela 1: Resultados absolutos e relativos dos percentuais de Acerto, Subestimação e Sobrestimação, e seus respectivos erros para ângulo de passo 360 Ângulo'de'passo'180

Teste 1 2 31 15 33 15 66 60 40 36,36 4 3,64 53 48,18 56 50,91 1 0,91

Teste 2 2 58 6 64 7 78 70,91 13 11,82 19 17,27 43 39,09 65 59,09 2 1,82

Teste 3 2 63 20 70 21 81 73,64 8 7,27 21 19,09 56 50,91 51 46,36 3 2,73

Teste 1 3 36 16 39 16 68 61,82 35 31,82 7 6,36 53 48,18 55 50 2 1,82

Teste 2 3 58 6 64 7 78 70,91 13 11,82 19 17,27 43 39,09 65 59,09 2 1,82

Teste 3 3 63 20 70 21 80 72,73 8 7,27 22 20 56 50,91 51 46,36 3 2,73

Tabela 2: Resultados absolutos e relativos dos percentuais de Acerto, Subestimação e Sobrestimação, e seus respectivos erros para ângulo de passo 180

Ângulo'de'passo'90

Teste 1 2 35 20 38 20 68 61,82 36 32,73 6 5,45 58 52,73 51 46,36 1 0,91

Teste 2 2 60 8 67 9 78 70,91 11 10 21 19,09 44 40 63 57,27 3 2,73

Teste 3 2 64 24 72 25 80 72,73 7 6,36 23 20,91 59 53,64 47 42,73 4 3,64

Teste 1 3 39 23 44 23 69 62,73 32 29,09 9 8,18 60 54,55 48 43,64 2 1,82

Teste 2 3 60 8 67 9 78 70,91 11 10 21 19,09 44 40 63 57,27 3 2,73

Teste 3 3 64 25 73 26 79 71,82 7 6,36 24 21,82 59 53,64 46 41,82 5 4,55

Tabela 3: Resultados absolutos e relativos dos percentuais de Acerto, Subestimação e Sobrestimação, e seus respectivos erros para ângulo de passo 90 ! 18! !

Ângulo'de'passo'45

Teste 1 2 35 21 38 21 68 61,82 36 32,73 6 5,45 59 53,64 50 45,45 1 0,91

Teste 2 2 61 12 67 13 80 72,73 10 9,09 20 18,18 48 43,64 59 53,64 3 2,73

Teste 3 2 65 27 72 28 82 74,55 6 5,45 22 20 62 56,36 44 40 4 3,64

Teste 1 3 41 24 46 24 71 64,55 30 27,27 9 8,18 60 54,55 47 42,73 3 2,73

Teste 2 3 61 18 67 19 80 72,73 10 9,09 20 18,18 54 49,09 53 48,18 3 2,73

Teste 3 3 65 30 72 31 81 73,64 6 5,45 23 20,91 64 58,18 41 37,27 5 4,55

Tabela 4: Resultados absolutos e relativos dos percentuais de Acerto, Subestimação e Sobrestimação, e seus respectivos erros para ângulo de passo 45

Os resultados obtidos nos testes 1, 2 e 3 podem ser observados nas tabelas 1 a 4 mostradas acima, com respeito a cada ângulo de passo utilizado. As imagens de referência utilizadas nos testes são apresentadas na figura 8.

! Figura 8: Imagens de referência utilizadas nos testes. O teste 1 usa a imagem à esquerda, enquanto que o teste 2 à direita. O teste 3 contempla os testes 1 e 2 combinados

O teste 1 mostra que o aumento do fator de escala contribuiu de forma efetiva no número de imagens identificadas pelo programa. Observa-se que o fator de escala pode ser útil na detecção de imagens com dimensões desproporcionais em relação à referência, no entanto, verificou-se também que houve detecção de falsos positivos que ocorreram provavelmente em função do aumento desta escala.

Sob a óptica qualitativa, os resultados do teste 2 são bastante parecidos aos observados no teste 1, principalmente em relação aos dados obtidos para ângulos de passo menores, verificando padrões parecidos. ! 19! !

Análises semelhantes são obtidas para fator de sensibilidade 0,70 do ponto de vista qualitativo, diferindo apenas no que diz respeito ao número de amostras identificadas, sendo mais seletivo na identificação dos padrões, diminuindo a possibilidade de ocorrência de casos falsos positivos; porém aumentando a probabilidade de falhas de identificação de amostras efetivas do mexilhão dourado.

O teste 3 apenas contempla os resultados obtidos para os testes 1 e 2 de forma unificada, ficando sujeito às mesmas análises aplicadas a eles de forma combinada. Análises mais instrutivas a respeito dos testes apresentados, com auxílio de gráficos, serão discutidas a seguir.

5.4.1 ANÁLISE GRÁFICA dos RESULTADOS ! Os gráficos apresentados nesta seção fazem referência a avaliações estatísticas entre os três testes realizados no trabalho, fixando o ângulo de passo em 45, pois obteve maiores resultados quantitativos, para os fatores sensibilidade utilizados nos mesmos. A variação do fator de escala não produziu significância estatística e não é apresentado. Os testes estatísticos foram realizados utilizando o software Statistic versão 7.0 e para execução dos testes foram seguidos todos os pressupostos necessários.

Sob o ponto de vista do número de acertos, para fator de sensibilidade em 60%, constatou-se que houve variação significativa da eficiência do programa, ou seja, variação quantitativa de acertos e erros em função dos testes realizados, com as imagens 1, 2 e usando as duas simultaneamente (figura 8). A análise de variância mostrou que os acertos são significativamente menores no teste 1 quando usamos apenas uma imagem da larva oriunda da literatura (figura 9 a). Os testes estatísticos também indicam que os erros de subestimação são significativamente maiores no teste 1 (figura 9 b) e significativamente menores os erros de sobrestimação (figura 9 c), ou seja, ao aumentarmos a quantidade das imagens de referência, os erros de subestimação diminuem significativamente, em contrapartida do aumento dos erros de sobrestimação.

! a)

! 20! !

! b)

c)&

Figura 9: Avaliações estatísticas de variância em função da variação do respectivo teste avaliado, para Sensibilidade em 60%. a) Variação do número de Acertos. b) Variação do número de Subestimações. c) Variação do número de Sobrestimações ! Igualmente à análise anterior, a mesma tendência é observada quando aumentamos o fator de sensibilidade para 70%. No entanto, neste caso, observou-se que os acertos foram significativamente menores no teste 2 quando utilizamos a imagem do banco de dados do CBEIH como referência (figura 10 a)). O teste 2 também apresentou maiores erros por subestimação (figura 10 b)). Nos dois testes, observa-se que, ao utilizarmos duas imagens como referência, os acertos são significativamente maiores e os erros por subestimações menores. Todavia, aumentam os erros por sobrestimação (figura 10 c)), ou seja, o programa seleciona imagens que não se referem ao mexilhão dourado, e deverão ser excluídas manualmente pelo analista. Salienta-se que este é um erro bastante comum observado nas análises do FlowCAM, e indicam que devemos utilizar um número maior de imagens de referência, mas também calibrar esse número para que não haja excessivos erros de sobrestimação.

! a)

! 21! !

! b)

Figura 10: Avaliações estatísticas de variância em função da variação do respectivo teste avaliado, para Sensibilidade em 70%. a) Variação do número de Acertos. b) Variação do número de Subestimações. c) Variação do número de Sobrestimações

A figura 11 a), b) e c) indicam testes de distribuição de probabilidade t de Student, comparando a eficiência do programa quando variamos o fator de sensibilidade (60 e 70%). Os testes indicaram que os acertos são significativamente maiores na sensibilidade 60% (figura 11 a)). Isso ocorre fundamentalmente pelos altos erros de subestimação ao utilizarmos a sensibilidade 70% (figura 11 b)). Observa-se que os erros de sobrestimação são bem maiores na sensibilidade de 60% (figura 11 c)). Entretanto, como os erros de subestimação ocorrem em números muito maiores do que os de sobrestimação, a eficiência do software é melhor na sensibilidade de 60%. Esta tendência ocorre, provavelmente, devido ao fato de a imagem de uma larva nunca ser exatamente igual à imagem de referência. Ao aumentarmos o fator de sensibilidade dos testes, o programa não reconhece diversas imagens de larvas do mexilhão dourado, o que aumenta os erros por subestimação. No entanto, a sobrestimação é diminuída já que imagens diferentes quase nunca serão selecionadas, indicando que o valor de sensibilidade ótimo deve ser encontrado ao calibrar os erros por subestimação e sobrestimação.!! !

! a)

! 22! !

! !

Figura 11: Avaliações estatísticas da distribuição de probabilidade t de Student em função da variação da Sensibilidade do programa. a) Variação do percentual de Acertos (p-valor = 0,000221). b) Variação do percentual de Subestimações (p-valor = 0,000280). c) Variação do percentual de Sobrestimações (p-valor = 0,001175)

Os gráficos a seguir contemplam comparações entre os três testes do tópico anterior, fixando o ângulo de passo também em 45. Apesar de não representarem avaliações estatísticas, tais comparações reforçam o exposto anteriormente.

80!

60!

Acerto!%!

40!

Subescmação!%!

20!

Sobrescmação!%!

60!

Acerto!%!

40!

Subescmação!%!

20!

Sobrescmação!%!

0! Teste!1! Teste!2! Teste!3!

Teste!1! Teste!2! Teste!3!

Figura 12: Eficiência do programa para o fator de sensibilidade de 60% e ângulo de passo 45. a) fator de escala 2. b) fator de escala 3

Os gráficos da figura 12 indicam que o número de acertos do programa superam os erros de subestimação e sobrestimação, o que mostra uma boa eficiência do software. Em relação ao número de acertos observados, verifica-se que houve pouca variabilidade entre as escalas 2 e 3, dado que a variação do fator de escala não afetou muito o resultado. A respeito dos percentuais de subestimação e sobrestimação, observa-se, a diminuição das subestimações e ligeiro aumento das sobrestimações nos testes dois e três comparados ao teste um. Isto pode estar relacionado ao fato de que ao aumentarmos o número de imagens como referência o programa é capaz de identificar um maior número de imagens parecidas com a larva, o que diminui a sub estimação (falso negativo), mas pode aumentar a sobre estimação (falso positivo). Os falsos negativos se mostraram como os erros mais consideráveis, e foi maior no teste 1. ! 23! !

É importante destacar que a imagem utilizada no teste 2 foi adquirida na coleção do CBEIH enquanto a imagem do teste 1 vem de um artigo publicado. Isto significa que a qualidade da imagem utilizada no teste 2 é melhor e, portanto, refletiu nos resultados.

A figura 13 mostra os mesmos testes, contudo, para fator de sensibilidade de 70%.

80!

60!

Acerto!%!

40!

Subescmação!%!

20!

Subescmação!%!

20!

Sobrescmação!%!

Acerto!%!

Sobrescmação!%!

0! Teste!1! Teste!2! Teste!3!

Teste!1! Teste!2! Teste!3!

Figura 13: Eficiência do programa para o fator de sensibilidade de 70% e ângulo de passo de 45. a) fator de escala 2. b) fator de escala 3

Ao aumentarmos o fator de sensibilidade verificou-se que a porcentagem dos acertos reduzem drasticamente. Chama-se a atenção ao percentual de erros por subestimação que é notadamente o parâmetro que mais sofre variação entre os testes, chegando em um dos casos ser maior que a porcentagem de acertos. Verifica-se que a escala 3 apresentou resultados melhores que a escala 2, que pode indicar uma melhor escala de trabalho para o software.

É importante salientar que a melhor qualidade da imagem de referência 2, que se mostrou variável importante para o fator de sensibilidade de 60% não foi preponderante quando a sensibilidade passou a 70%. No entanto, assim como nos resultados de sensibilidade de 60%, os melhores são obtidos quando fornecidos um maior número de imagens de referência ao software, a exemplo do que ocorre no teste 3.

As figuras 14 e 15 mostram os testes realizados para fatores de escala fixados em 2 e 3 respectivamente:

! 24! !

80!

60!

Acerto!%!

40!

Subescmação!%!

20!

Sobrescmação!%!

60!

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40!

Subescmação!%!

20!

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0! Teste!1! Teste!2! Teste!3!

Teste!1! Teste!2! Teste!3!

Figura 14: Eficiência do programa para o fator de escala 2 e ângulo de passo 45. a) fator de sensibilidade 60%. b) fator de sensibilidade 70%

80!

60!

Acerto!%!

40!

Subescmação!%!

20!

Sobrescmação!%!

60!

Acerto!%!

40!

Subescmação!%!

20!

Sobrescmação!%!

0! Teste!1! Teste!2! Teste!3!

Teste!1! Teste!2! Teste!3!

Figura 15: Eficiência do programa para o fator de escala 3 e ângulo de passo 45. a) fator de sensibilidade 60%. b) fator de sensibilidade 70%

Podemos ainda comparar o efeito da variação do fator de sensibilidade entre os gráficos presentes nas figuras 14 e 15. Com respeito aos gráficos a) e b) da figura 14, para fator de escala 2, observamos que a variação do fator de sensibilidade de 0,60 para 0,70 diminui consideravelmente o percentual de acertos e, consequentemente, aumenta o percentual de subestimações. Nota-se que, devido ao fato de o fator de sensibilidade maior ser mais seletivo, o percentual de sobrestimação diminui bastante, mostrando que há menos casos de identificação de falsos positivos. Já para os gráficos a) e b) da figura 15, análise análoga é prontamente determinada, obtendo os mesmos paradigmas que a análise realizada para a figura 14.

É notável a diferença quantitativa observada entre testes similares com fatores de sensibilidade diferentes. É sem dúvida o recurso que mais afeta a precisão de identificação do software desenvolvido, devendo ser devidamente adequado de modo a não incorrer nem em muitas falhas de identificação nem em excessos de falsos positivos.

! 25! !

5.4.2. PARALELO ENTRE FLOWCAM e SOFTWARE DESENVOLVIDO A comparação entre o software desenvolvido e o FlowCAM, tanto do ponto de vista da funcionalidade quanto da interface com o usuário são importantes para verificar a importância da continuidade dos estudos. Alguns pontos que merecem maior destaque são explicitados abaixo sob a óptica de suas vantagens e desvantagens.

Característica Custo

Complexidade Utilidade

& &

FlowCAM Alto custo

Mais complexo

Software desenvolvido Baixo custo

& Mais simples&

Completo (possui mecanismos de captura e identificação de imagens)

Limitado (possui apenas mecanismo de identificação de imagens)

Tabela 5: Comparação entre FlowCAM e software desenvolvido

É válido evidenciar que as comparações supracitadas têm caráter demonstrativo e não tem nenhum valor científico, pois não houveram comparações reais entres os sistemas, mas sim especulações de suas características com o auxílio de referências obtidas do FlowCAM. Abaixo, algumas imagens peculiares aos dois sistemas.

Figura 16: Mostra de imagens detectadas pelo FlowCAM

Figura 17: interface e mostra de imagens detectadas pelo software desenvolvido

& &

! ! 26! !

6. CONCLUSÕES A técnica de detecção utilizada no desenvolvimento do software é bastante promissora, tendo em vista os experimentos desenvolvidos e as análises realizadas com base nos parâmetros de desempenho a ele intrínsecos. A função de correlação cruzada é bastante eficiente no tocante ao propósito do trabalho, oferecendo recursos capazes de lidar com uma gama variada de imagens de diferentes padrões.

A utilização do programa MATLAB® teve papel fundamental no desenvolvimento do projeto, contando com recursos essenciais, como a plataforma de desenvolvimento de interfaces gráficas (GUIDE), além de diversos outros que possibilitaram uma melhor proximidade entre o software e o usuário.

Os testes e análises apresentados no desenvolvimento do trabalho demonstram a capacidade de o software ser utilizado de maneira científica, sobretudo na identificação de larvas do mexilhão dourado, que, acoplado a um sistema remoto de captura de imagens, torna-se um boa alternativa para tal fim. É importante enfatizar que, além dos problemas da detecção de falsos positivos, há também a questão dos erros de subestimação das amostras que, de fato, são corretas do ponto de vista da seleção do conjunto de imagens correlacionadas. Tais problemas são intrínsecos às características das amostras de referência escolhidas, bem como de fatores externos ao âmbito do software, como a uniformidade tanto dimensional quanto de padronização do conjunto de imagens selecionado, além dos fatores de sensibilidade, de escala e o ângulo de passo. Portanto, a eficiência da execução do programa é totalmente dependente desses parâmetros fazendo com que seja necessário estabelecer uma solução de compromisso entre eles de modo a obter um desempenho satisfatório, tanto sob a óptica quantitativa/qualitativa, quanto a computacional.

! 27! !

7. RECOMENDAÇÕES A técnica de reconhecimento de padrão de imagens empregada no desenvolvimento do software é bastante eficiente quando trata imagens de referência retiradas diretamente de imagens de amostra, mas mostra sinais de falha quando tais referências não têm relação direta com tais amostras, que é o propósito principal de identificação de padrão de imagens. Todavia, a essência matemática empregada na função de correlação cruzada é promissora o suficiente para que hajam outras pesquisas a respeito do seu uso com ênfase na detecção de imagens.

A respeito da utilização do software proposto, é importante ter ciência dos eventuais problemas que podem ocorrer com seu uso e também de sua utilidade na detecção de imagens, embora sua eficiência seja dependente de fatores intrínsecos e extrínsecos, estabelecendo um equilíbrio entre a eficiência computacional e a eficiência de detecção, buscando auxiliar na escolha das referências e conjunto de amostras, bem como evitar a utilização de imagens de alta resolução devido ao grande overhead de tempo na execução do programa.

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8. REFERÊNCIAS &

MACKIE, G. L.; CLAUDI, R. Monitoring and Control of Macrofouling Mollusks in Fresh Water Systems. 2.ed. Boca Raton, et al.: CRC Press, 2010. 516 p. CULVER, C. S.; DRILL, S. L.; MYERS, M. R.; BOREL, V. T. Early Detection Monitoring Manual for Quagga and Zebra Mussels. San Diego: California Sea Grant College Program, 2009. 40 p. FRISCHER, M. E.; NIERZWICKI-BAUER, S. A.; KELLY, K. L. Reliability of Early Detection of Dreissena spp. Larvae by Cross Polarized Light Microscopy, Image Flow Cytometry, and Polymerase Chain Reaction Assays. Denver: U.S Department of the Interior Bureau of Reclamation Policy and Administration, 2011. 38 p. DIVITTORIO, J.; GRODOWITZ, M.; SNOW, J.; MANROSS, T. Inspection and Cleaning Manual for Equipment and Vehicles to Prevent the Spread of Invasive Species. Denver: U.S Department of the Interior Bureau of Reclamation Policy and Administration, 2012. 224 p. HOSLER, M. D. Early Detection of dreissenid species: Zebra/Quagga mussels in water systems. 2.ed., vol. 6 Denver: Aquatic Invasions, 2011. 6 p. WIKIPÉDIA. Desenvolvido pela Wikimedia Foundation. Polymerase Chain Reaction. Disponível em: <http://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction>. Acesso em: 07 jun. 2013. WIKIPÉDIA. Desenvolvido pela Wikimedia Foundation. Citometria de Fluxo. Disponível em: <http://en.wikipedia.org/wiki/Flow_cytometry>. Acesso em: 26 jun. 2013. WIKIPÉDIA. Desenvolvido pela Wikimedia Foundation. Polarização cruzada da luz. Disponível em: <http://en.wikipedia.org/wiki/Polarized_light_microscopy>. Acesso em: 26 jun. 2013. WIKIPÉDIA. Desenvolvido pela Wikimedia Foundation. Microscópio de luz polarizada. Disponível em: <http://pt.wikipedia.org/wiki/Microsc%C3%B3pio_petrogr%C3%A1fico>. Acesso em: 26 jun. 2013. WIKIPÉDIA. Desenvolvido pela Wikimedia Foundation. Informações sobre o MATLAB. Disponível em: <http://pt.wikipedia.org/wiki/MATLAB>. Acesso em: 26 jun. 2013. Nikon. Pesquisa tecnologia de luz polarizada. Disponível em: <http://www.nikoninstruments.com/pr_BR/Information-Center/Polarizing>. Acesso em: 26 jun. 2013. Uso do método de polarização cruzada da luz para detecção de larvas. Disponível em: <http://el.erdc.usace.army.mil/zebra/zmis/zmishelp/use_of_cross_polarized_light_for_veliger_d etection.htm>. Acesso em: 26 jun. 2013. Fluid Imaging. Pesquisa analisador de partículas FlowCAM. Disponível em: <http://www.fluidimaging.com/products-particle-imaging-analyzer.htm>. Acesso em: 26 jun. 2013. Imagem do sistema FlowCAM. Disponível <http://www.fluidimaging.com/Collateral/Images/English-S/FlowCamPortable_242H.jpg>. Acesso em: 26 jun. 2013.

em:

Imagem detectada pelo FlowCAM, após sofrer o método de polarização cruzada da luz. Disponível em: <http://www.fluidimaging.com/Collateral/Images/EnglishUS/3_Zebras_Biref_sm.jpg>. Acesso em: 26 jun. 2013. ! 29! !

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO TECNOLÓGICA E INOVAÇÃO - PIBIC

Ministério da Ciência e Tecnologia / CNPq - Edital 2012 / 2013 Programa Institucional de Iniciação Científica – Fundação CETEC Projeto GT 343 - Controle do mexilhão-dourado : Bioengenharia e novos materiais para aplicações em ecossistemas e usinas hidrelétricas DESENVOLVIMENTO DE SISTEMA AUTONOMO DE CONTROLE DE TEMPERATURA PARA LABORATORIO DE CULTIVO GT 343 / CNPq

Victor Lamounier Bittencourt Antônio Valadão Cardoso

JULHO/2013

______________________________________________________________________

Universidade Federal de Minas Gerais ______________________________________________________________________

Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais – CETEC Diretoria de Desenvolvimento e Serviços Tecnológicos Setor de Análises Químicas – STQ _____________________________________________________________________ GERENTE DE INOVAÇÃO E TECNOLOGIA José Eustáquio Drumond PRESIDENTE Marcílio César de Andrade Av. José Cândido da Silveira, 2000 - Horto Florestal - Belo Horizonte - MG – 31035-536 Telefone: (31) 3489-2000 / Fax: (31) 3489-2200 – Portal: www.cetec.br - E-mail: faleconosco@cetec.br

Ministério da ciência e Tecnologia/CNPq Programa institucional de Iniciação Científica – Fundação CETEC

Projeto GT 343 – Controle do mexilhão dourado : bioengenharia e novos materiais para aplicações em ecossistemas e usinas hidrelétricas

DESENVOLVIMENTO DE SISTEMA DE CONTROLE DE TEMPERATURA PARA EXPERIMENTOS LABORATORIAIS GT 343 / CNPq

Nome do Orientador Pesquisador Pleno, Antônio Valadão Cardoso

Belo Horizonte Julho/ 2013

Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais / CETEC Diretoria de Desenvolvimento e Serviços Tecnológicos Setor de Análises Químicas – STQ Projeto GT 343 – Controle do mexilhão dourado : bioengenharia e novos materiais para aplicações em ecossistemas e usinas hidrelétricas

Orientador : Antônio Valadão Cardoso, Doutor Co-Orientador :

Autores : Victor Lamounier Bittencourt, Engenharia de Controle e Automação, Universidade Federal de Minas Gerais – UFMG. Antônio Valadão Cardoso, Doutor.

DESENVOLVIMENTO de SISTEMA de CONTROLE de TEMPERATURA para EXPERIMENTOS LABORATORIAIS 1.INTRODUÇÃO A confiabilidade de resultados obtidos em experimentos laboratoriais depende, de forma direta, da qualidade dos métodos utilizados para obtenção de dados. Desenvolver equipamentos confiáveis, sobre os quais se possa ter controle e previsão apurada de comportamento frente às diversas situações às quais serão submetidos, é um problema enfrentado diariamente pela engenharia. Processos laboratoriais dependem de condições físicas específicas. Definir a Constante de Elasticidade de uma mola requer um controle apurado da Força sobre ela aplicada. Assim como no caso da Constante de Elasticidade, definir características físicas de substâncias e materiais requer um controle das condições às quais estão submetidos, seja da Força, Temperatura ou pH. O mesmo ocorre em se tratando de cultivos biológicos, substâncias em processo de reação, etc. Em contraponto à Fábrica de Softwares, para que a realização de um experimento ou processo se dê de forma mais confiável, é necessário um estudo para que se possa criar um método de controle específico para o problema. No presente trabalho deseja-se definir se o ângulo de contato entre a água e as folhas da Salvinia tem alguma relação com a temperatura. Para tanto, criou-se uma ferramenta utilizando uma Pastilha de Peltier e uma Placa Arduino capaz de regular temperaturas para realização dos testes.

2. OBJETIVOS Criar uma ferramenta capaz de regular a temperatura de amostras para realização de experimentos a fim de determinar se o ângulo de contato entre água e as folhas da salvinia tem alguma relação com a temperatura. O presente trabalho faz parte do Programa de Pesquisa e Desenvolvimento (P&D) GT343 – Controle do mexilhão dourado: bioengenharia e novos materiais para aplicações em ecossistemas e usinas hidrelétricas – em uma parceria do Cetec (Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais) com a Cemig (Companhia Energética de Minas Gerais S.A.).

3. PROBLEMA(S) As características de substâncias, materiais, processos e reações dependem das condições físicas às quais as amostras são submetidas. As dimensões de uma barra metálica dependem de sua temperatura, reações químicas podem ocorrer em velocidades diferentes se submetidas a pressões diferentes. Da mesma maneira, pode haver relação entre a temperatura e o ângulo de contato entre a água e a salvínia. Ângulo de contato Este ângulo é definido como o ângulo que se forma da tangente ao líquido com a superfície do sólido, no ponto de contato entre as três fases: solido-líquido-vapor (CABELLO-RUIZ, J. M., 2009) (Figura 2.8)

Figura 2.8 – Esquema do ângulo de contato e tensões interfaciais. Extraído de SHU-HAU H.; KARRAN W.; WOLFGANG S., 2011)

Para determinar se há ou não relação entre a temperatura e o ângulo de contato entre a água e as folhas da salvínia, faz-se necessária a criação de uma ferramenta capaz de controlar a temperatura das amostras. 4. MÉTODO e METODOLOGIA 4.1.Coleta de amostras: As amostras para caracterização das propriedades de molhabilidade foram coletadas na cidade de Belo Horizonte - Minas Gerais. As espécies de plantas aquáticas Salvinia molesta foi doada pela pesquisadora Dr. Sylvia Meyer do Setor de Medições Ambientais da Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais – CETEC. A espécie Colocasia esculentafoi adquirida no viveiro do Parque Municipal das Mangabeiras.

4.2. Controle de temperatura Foram utilizadas uma Pastilha de Peltier e uma placa Arduino Duemilanove. Através da função PWM(Pulse Width Modulation), a corrente que chega à Pastilha é controlada para manter-se a temperatura desejada.

A placa é ligada ao computador utilizando-se um cabo USB. Os comandos de controle de corrente são digitados e passados para o Arduino, que envia respostas para a tela com as atualizações dos atuais valores para a tela a cada 0,25s. 4.1 MATERIAIS 4.1.1 – ARDUINO Arduino é uma placa microcontroladora de prototipagem eletrônica que utiliza uma linguagem baseada em C/C++. Originária da Itália(2005), a placa possui uma interface simples e intuitiva, possibilitando que programadores com pouca ou muita experiência trabalhem sem problemas, criando projetos que englobam todos os níveis de complexidade. No presente trabalho, utilizou-se a versão Arduino Duemilanove, com placa ATmega 328, contando com 14 pinos Digital I/O (6 deles podem ser usados em função PWM) e um oscilador de cristal de 16MHz. O upload do código e alimentação da placa foram feitos utilizando a entrada USB da mesma.

4.1.2 – PASTILHA de PELTIER O Efeito Termelétrico foi observado pela primeira fez em 1821 pelo físico Thomas Seebeck, caracterizado como a tensão elétrica criada pela junção de dois metais diferentes, sendo que o valor dessa tensão depende dos materiais utilizados e da temperatura a que se encontram. O fenômeno recebeu o nome de Efeito Seebeck. Em 1834, Jean Charles Peltier demonstrou que o Efeito Seebeck era reversível, ou seja, uma junção metálica pode produzir ou absorver calor dependendo da direção da corrente que por ela circula. O gradiente de temperatura depende dos materiais que compõem a junção e do valor da corrente. O fenômeno foi chamado de Efeito Peltier. As Pastilhas de Peltier utilizam esse efeito para resfriar uma de suas superfícies e aquecer a outra. Se o calor gerado pela superfície quente for adequadamente dissipado, a superfície fria pode atingir temperaturas da ordem de 10˚C.As temperaturas das duas superfícies dependem da quantidade de corrente passando pela Pastilha. Utilizando a função PWM do Arduino e um MOSFET N, pode-se regular a corrente e, consequentemente, a temperatura da Pastilha. No presente trabalho foi utilizada uma Pastilha de dimensões 40mmX40mmX3.4mm, corrente máxima 10A, Voltagem máxima 15,4V. A temperatura mínima registrada foi de -8,4˚C, a máxima, de 75˚C. 4.1.3 – COMPONENTES ADICIONAIS Os componentes básicos do projeto são a Placa Arduino Duemilanove e a Pastilha de Peltier, explicitados nos tópicos acima. Além disso, foi utilizado : • PROTOBOARD de 840 FUROS – Interliga os componentes(esquema mostrado abaixo)

• MOSFET CANAL N – Utilizado para controlar a quantidade de corrente que chegará à Pastilha de Peltier • RESISTOR de 10kOhm – Ligado à Protoboard para dissipar corrente e evitar danos a componentes • COOLER Zalman CNPS7500-AlCu – Utilizado para dissipar o calor da superfície quente da Pastilha de Peltier • PASTA TERMICA Thermal Silver – Aplicada entre a Pastilha de Peltier e o Cooler Zalman para beneficiar a dissipação de calor • FIOS JUMPER DIVERSOS Segue o esquema da montagem utilizada :

Figura XX. Retirada de (www.labdegaragem.com)

4.2 – ALGORITMO Segue o algoritmo utilizado para realizar o controle da temperatura foi: int peltier = 3; //A pastilha está conectada ao pino 3 do Arduino

int power = 0; int peltier_level = map(power, 0, 99, 0, 255); //Mapeamento do valor que irá, efetivamente, controlar o MOSFET void setup(){ Serial.begin(9600); pinMode(peltier, OUTPUT); } void loop(){ char option; if(Serial.available() > 0) { option = Serial.read(); if(option == 'a') power += 5; else if(option == 'z') power -= 5; if(power > 99) power = 99; if(power < 0) power = 0; peltier_level = map(power, 0, 99, 0, 255); } Serial.print("Power="); Serial.print(power); Serial.print(" PLevel="); Serial.println(peltier_level); delay(250); analogWrite(peltier, peltier_level); //Envia esse valor à pastilha } O programa recebe comandos de aumentar ou diminuir o valor da corrente na Pastilha de Peltier, que varia de 0% a 99%, utilizando as instruções `a` e `z`, que modificam em +5% e -5%, respectivamente, este valor. As frases após `//` representam comentários da programação, com intenção de facilitar a compreensão do código, e não são consideradas pelo programa.

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS PARA GRADUANDOS CETEC

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE INICIAÇÃO TECNOLÓGICA E INOVAÇÃO PIBITI / CNPq 2012-2013 ! ! ! Ministério da Ciência e Tecnologia / CNPq - 2013 Programa Institucional de Iniciação Científica – Fundação CETEC

Projeto GT 343 – Controle do mexilhão dourado: bioengenharia e novos materiais para aplicações em ecossistemas e usinas hidrelétricas

NOVOS REGISTROS DE INVASÃO PELO MEXILHÃO DOURADO (LIMNOPERNA FORTUNEI) NA BACIA DO ALTO PARANÁ

GT 343 CNPq 2013 Natália Cristina Vieira de Carvalho

Orientador: Arthur Correa de Almeida Co-orientador Fabiano Alcísio e Silva

! ! ! ! ! ! !

______________________________________________________________________! ! Pontifícia!Universidade!Católica!de!Minas!Gerais! Fundação!Centro!Tecnológico!de!Minas!Gerais! ______________________________________________________________________! !

Centro Tecnológico SENAI CETEC _____________________________________________________________________! ! GERENTE&DE&INOVAÇÃO&E&TECNOLOGIA& José!Eustáquio!Drumond!

Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais - CETEC PRESIDENTE Marcílio!César!de!Andrade!

& Av.!José!Cândido!da!Silveira,!2000!K!Horto!Florestal!K!Belo!Horizonte!K!MG!–!31035K536! Telefone:!(31)!3489K2000!/!Fax:!(31)!3489K2200!–!Portal:!www.cetec.br!K!EKmail:!faleconosco@cetec.br!

! Ministério da Ciência e Tecnologia / CNPq - Edital no / ano / Programa Institucional de Iniciação Científica – Fundação CETEC

Projeto: Nome do projeto com a SIGLA

NOVOS REGISTROS DE OCORRÊNCIA DO MEXILHÃO DOURADO (Limnoperna fortunei) NA BACIA DO ALTO RIO PARANÁ

RF-PIBIT SIGLA do projeto / CNPq / 12 / 08 / 2013 !

Nome do Orientador Pesquisador Pleno, Orientador Antônio Valadão Cardoso ! ! ! ! ! ! Belo!Horizonte! JULHO/2013!

1. INTRODUÇÃO

As espécies exóticas invasoras são definidas como aquelas que se encontram fora de seu ambiente de distribuição natural e ameaçam ecossistemas, habitats e/ou espécies nativas (MMA – Espécies Exóticas Invasoras). As invasões biológicas causam graves impactos ecológicos e econômicos aos ecossistemas que estão sujeitos a esse processo. Espécies introduzidas podem alterar a estrutura das populações e comunidades já existentes, promovendo, na maioria dos casos, perda da biodiversidade, que pode ser ainda mais acentuada quando espécies endêmicas são atingidas (Stachowicz et al., 1999; Kado, 2003). Além disso, os prejuízos causados por espécies exóticas para diversas atividades comerciais podem exigir medidas mitigadoras de alto custo (Neves e Rocha, 2001). Limnoperna fortunei (Dunker, 1857), popularmente conhecido como mexilhão dourado, é um exemplo típico de espécie invasora e que tem causado diversos impactos ambientais e econômicos nos locais que invadiu. O mexilhão dourado é um molusco bivalve pertencente à Família Mytilidae, subclasse Pteriomorpha e Ordem Mytiloida. Possui elevada capacidade de reprodução e adaptação nos ambientes em que se instalam, causando mudanças na paisagem e desequilíbrio na fauna e na flora. O mexilhão dourado é capaz de obstruir as tubulações dos sistemas de captação de água, gerando altos custos anuais de operação e manutenção. Essa capacidade de obstruir a passagem de água está relacionada com a produção de fios de bisso, o qual é secretado através de glândulas localizados no pé desses bivalves. O bisso é responsável pela incrustração do mexilhão dourado em diversas superfícies, como rochas, madeiras, plastícos e vidros (Faria et al, 2005). O mexilhão dourado é uma espécie gonocorística, ou seja dióica, com fecundação externa em que os óvulos e espermatozoides são liberados na água (Santos, 2004). Após a fecundação, há o desenvolvimento de uma larva livre, natante e planctônica. A produção de larvas ocorre durante nove meses do ano, cuja densidade pode atingir 20.000 indivíduos/litro. A fase larval possui diferentes estágios, sendo eles: trocófora ciliada, larva D, a qual possui como característica uma charneira reta; véliger, apresentando um “velum” que auxilia na natação e no consumo de nutrientes; e umbonada, apresentando um pé já desenvolvido que é importante na fixação do substrato (Santos, Wurdig & Mansur, 2005). L. Fortunei vive aproximadamente três anos, sendo a maturidade sexual atingida no primeiro ano de vida (Boltovskoy & Cataldo, 1999).

Oriundo do sudeste da Ásia, foi detectado como espécie invasora na América Latina em 1991, na Argentina. No Brasil, foi introduzido na bacia do Lago Guaíba, no Rio Grande Sul na cidade de Porto Alegre (Santos et al, 2005). Acredita-se que essa espécie tenha sido inserida, nas regiões anteriormente citadas, através de água de lastro de navios. O lastro é definido como qualquer material utilizado para manter a estabilidade de um denominado objeto, ou fornecer peso ao mesmo. Um dos materiais que podem ser escolhidos para essa função é a água, uma vez que é mais econômica e eficiente. Sendo assim, os navios ao chegarem ao seu local de destino é descarregado, sendo necessário receber água para manter-se em equilíbrio, e quando o navio é então carregado, a água de lastro é lançada ao mar (Silva, 2006). Atualmente sabe-se que a espécie L. fortunei possui uma extensa distribuição na América do Sul, sendo encontrada no Brasil, Uruguai, Paraguai e Bolívia. No Brasil, há registros da espécie nos estado do Rio Grande do Sul, Minas Gerais, Paraná, Mato Grosso do Sul, São Paulo e Mato Grosso (Fachini, 2011). Recentemente o mexilhão dourado foi detectado no estado de Minas Gerais na bacia do alto rio Paraná, em trechos do rio Grande e Paranaíba. 1.1 Objetivos Inventariar os novos pontos de invasão do mexilhão dourado na Bacia do alto rio Paraná no trecho de encontro dos rios Grande e Paranaíba. 1.2 Problemas A detecção rápida da chegada de um invasor é a melhor forma de combate a uma espécie invasora e fundamental pois permite ao gestor ambiental o controle de subpopulações enquanto elas ainda estão pequenas o suficiente para serem erradicadas (FICMNEW, 2003), além de evitarem a contaminação de novos locais. A região do alto rio Paraná, onde ocorreram os últimos registros do mexilhão dourado no Brasil possui diversas hidrelétricas e locais de grande biodiversidade, portanto inventariar a ocorrência de mexilhões neste trecho da bacia é fundamental para avaliar o avanço da invasão e fornecer informações para manejo e controle da espécie, no intuito de evitar contaminações de novos locais.

2. METODOLOGIA 2.1 Área de Estudo A região do Alto Rio Paraná está localizada no norte-noroeste do Estado do Paraná, no sul-sudeste de Mato Grosso do Sul, no sul de Goiás, no sudoeste de Minas Gerais, na porção ocidental do Estado de São Paulo, e uma estrita área do Paraguai oriental (Neto et al, 2007). O trecho em estudo contempla a região de montante do encontro dos rios Paranaíba e Grande e alguns tributários do rio Paranaíba neste trecho. Os rios amostrados foram: Paranaíba, São Domingos, Barreiro, Corrente e Aporé, Araguari e Grande. Todos os rios são de grande porte sendo a maioria deles utilizados para produção de energia hidroelétrica. 2.2 Coleta Foram realizadas um total de quatro coletas no período entre Julho de 2011 a Abril de 2012. As amostragens foram executadas em estações nos rios e também dentro das máquinas nas estações amostrais onde haviam instalações de usinas hidrelétricas. Em todas as coletas levou-se em consideração os procedimentos de desinfecção dos equipamentos de campo de modo a evitar a disseminação da espécie invasora para sítios ainda não infestados. O roteiro de amostragem iniciou-se partindo dos ambientes com menor risco de invasão para os de maior grau de susceptibilidade, ou já colonizados.

2.2.1

Coleta de parâmetros físico-químicos

Em paralelo às coletas biológicas, foram realizadas análises físico-químicas através de determinações instantâneas de algumas variáveis consideradas de maior relevância para a ocorrência da espécie As análises medidas in sittu foram realizadas através de sonda multi-parâmetros modelo “Proffesional Plus” da marca YSI. Foram feitas medidas instantâneas das variáveis, temperatura, oxigênio dissolvido, pH, condutividade elétrica e nitrato.

2.2.2

Coleta de parâmetros biológicos e análise em laboratório.

A forma larval planctônica de L. fortunei foi coletada através de filtragem em rede de poro 65µ, através de arrastos verticais e horizontais. Esses arrastos ocorreram na sub-superfície da coluna d’água, sendo que os verticais foram realizados na calha central do rio, e os horizontais em uma das margens com duração de 2 minutos. Para a preservação das amostras foi utilizada uma solução de Formol a 4% na proporção de 1:1. As amostras foram devidamente etiquetadas e enviadas ao laboratório para posterior análise. Em laboratório, foi possível fazer a identificação e quantificação das larvas através da microscopia invertida.

3. RESULTADOS As amostragens foram realizadas em 41 estações no total, sendo 2 no rio Aporé, 2 no rio Araguari, 1 no rio Barreiro, 1 no rio Corrente, 23 no rio Grande, 16 no rio Paranaíba e 1 no rio São Domingos. Foram amostradas 23 estações na bacia do rio Grande e 23 estações na bacia do rio Paranaíba. Em 27 estações foram identificadas larvas de mexilhão dourado. Sendo essas estações pertencentes aos rios Aporé, Barreiro, Grande e Paranaíba. Nos rios Araguari, Corrente e São Domingos não houve registro de ocorrência da larva de L. Fortunei.

REFERÊNCIAS Strayer, D.L.; Caraco, N.F.; Cole, J.J.; Findlay, S. & Pace, M.L. Transformation of freshwater ecosystems by bivalves: a case study of zebra mussels in the Hudson River.BioSciencev. 48 n.1.p.19-27. 1999. CATALDO, D.; BOLTOVSKOY, D. D.; MARINI, V.; CORREA, N. (2002) “Limitantes de Limnoperna fortunei em la cuenca del Plata: la predación por peces”, apresentado na “Tercera jornada sobre conservación de la fauna íctica en el rio Uruguay” – Uruguai.

FUNDAÇÃO CENTRO TECNOLÓGICO DE MINAS GERAIS

Programa Institucional de Iniciação Científica – CETEC FAPEMIG Projeto: Modelagem da distribuição potencial da espécie Limnoperna fortunei em escala global RELATÓRIO FINAL

Belo Horizonte Fevereiro/2013

Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais (CETEC) - Diretoria de Desenvolvimento e Serviços Tecnológicos - Setor de Análises Clínicas PRESIDENTE Marcílio César de Andrade VICE-PRESIDENTE Eduardo Bernis DIRETORIA DE DESENVOLVIMENTO E SERVIÇOS TECNOLÓGICOS DIRETORIA DE PLANEJAMENTO GESTÃO E FINANÇAS Ivan Amorim Barbosa Av. José Cândido da Silveira, 2000 - Cidade Nova - CEP 31170-000 – Belo Horizonte – MG telefone: (31) 3489-2000 - fax: (31) 3489-2200 home page: http://www.cetec.br - correio-e: cetec@cetec.br

Universidade Federal de Minas Gerais

FUNDAÇÃO CENTRO TECNOLÓGICO DE MINAS GERAIS

Programa Institucional de Iniciação Científica – CETEC CNPq ou FAPEMIG Projeto: Modelagem da distribuição potencial da espécie Limnoperna fortunei em escala global RELATÓRIO FINAL

Mônica Campos Pesquisador em C&T, Orientador

Belo Horizonte, Fevereiro/2013

FFU UN ND DA AÇ ÇÃ ÃO OC CEEN NTTR RO O TTEEC CN NO OLLÓ ÓG GIIC CO OD DEE M MIIN NA ASS G GEER RA AIISS -- C CEETTEEC C DIRETORIA DE DESENVOLVIMENTO E SERVIÇOS TECNOLÓGICOS SETOR DE ANÁLISES CLÍNICAS Projeto(s) concernido(s): Modelagem da distribuição potencial da espécie Limnoperna fortunei em escala global Centro de Bioengenharia de Espécies Invasoras de Hidrelétricas (CBEIH) Bolsista: Bárbara Gomes Kunzmann,Estudante do curso de Graduação em Ciências Biológicas na Universidade Federal de Minas Gerais Orientador: Mônica de Cássia Souza Campos Outros autores: Fabiano Alcísio de Silva, mestre Agentes financiadores: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG)

Sumário RESUMO..................................................................................................................1 1.INTRODUÇÃO .....................................................................................................2 2.OBJETIVOS .........................................................................................................4 3.MÉTODOS e PROCEDIMENTOS.......................................................................5 3.1Algoritmo................................................................................................................5 3.2Coletas de dados de ocorrência..................................................................................6 3.3 Obtenção de dados ambientais.................................................................................6 3.4 Arcgis....................................................................................................................7 3.5 Estatística...............................................................................................................7 4.RESULTADOS e DISCUSSÃO ...........................................................................8 4.1Análise do desempenho dos modelos gerados pela ROC e AUC....................................8 4.2 Distancia Mahalanobis............................................................................................8 4.2.1 Pontos da Ásia......................................................................................................9 4.2.2 Pontos da América do Sul........................................................................................9 4.2.3 Todos os pontos...................................................................................................10 4.3 Domain................................................................................................................11 4.3. Pontos da Ásia......................................................................................................11 4.3.2 Pontos da América do Sul......................................................................................12 4.3.3 Todos Pontos.......................................................................................................13 4.4 Garp....................................................................................................................14 4.4.1 Pontos da Ásia.....................................................................................................14 4.4.2 Pontos da América do Sul......................................................................................15 4.4.3 Todos os pontos...................................................................................................16 5. CONCLUSÕES ..................................................................................................18 6. REFERÊNCIAS..................................................................................................19

LISTA DE FIGURAS E TABELAS Figura 1......................................................................................................................2 Figura 2......................................................................................................................6 Figura 3......................................................................................................................9 Figura 4....................................................................................................................10 Figura 6....................................................................................................................11 Figura 7....................................................................................................................12 Figura 8....................................................................................................................13 Figura 9....................................................................................................................14 Figura 10..................................................................................................................15 Figura 11..................................................................................................................16 Figura 12..................................................................................................................17

Modelagem da distribuição potencial da espécie Limnoperna fortunei em escala global

RESUMO O avanço tecnológico e a expansão humana levaram à melhoria da qualidade de vida e uma maior distribuição espacial ao longo do globo terrestre, a sede por conhecimento levou o homem a desbravar e descobrir vários locais além de suas fronteiras. Porém, essa grande expansão possui grandes consequências, principalmente para a natureza e, indiretamente, o próprio homem. Algumas dessas consequências são a devastação de biomas, a extinção de espécies e também o aparecimento de espécies invasoras. Essas espécies invasoras, por terem melhor capacidade de se adaptar a uma gama extensa de ambientes, causam grande preocupação, uma vez que chegam em locais que não o seu nativo e se adaptam melhor do que as espécies lá existentes, competindo e podendo levar a extinção das espécies nativas. Por não possuírem um predador natural, podem proliferar sem enfrentar grandes problemas o que pode causar grandes prejuízos tanto para o local invadido quando para o homem. Limnoperna fortunei (Dunker, 1857), conhecido popularmente como mexilhão dourado, é uma espécie invasora, proveniente dos lagos da China, e expandiu sua área através da água de lastro de navios para Hong Kong, Japão, entre outros países do Sudeste asiático, além da invasão de países da América do Sul como o Uruguai, Argentina e o Brasil. O mexilhão dourado representa um problema de suma importância no Brasil, pois obstrui o encanamento de hidrelétricas e outras indústrias que utilizam a água bruta em seus processos, levando a um grande prejuízo econômico. Tendo em vista essa situação, a modelagem da distribuição potencial dessa espécie pode levar a um melhor entendimento sobre a abrangência do seu nicho, possibilitando criar medidas para controlá-la. A predição de possíveis locais invadidos pelo Limnoperna sp contribui para o conhecimento de onde esse animal pode invadir e criar medidas de prevenção evitando-se os prejuízos ambientais e econômicos decorrentes da proliferação desta espécie. O uso dos algoritmos matemáticos Domain, Distância Mahalanobis e Garp With BestSubsets, inseridos na plataforma OpenModeller, é muito comum para a predição de espécies invasoras, sendo esses algoritmos considerados bons preditores. Os resultados dessa iniciação científica a partir da implementação dessas ferramentas de modelagem foram condizentes com o que já era esperado e deram uma excelente ilustração da invasão do mexilhão dourado em escala global mostrando que existem muitas áreas de riscos pelo mundo e priorizando aquelas que merecem maior atenção devido ao seu maior nível de risco à invasão.

PALAVRAS-CHAVE:

Espécie invasora, mexilhão dourado, algoritmos, modelagem de

distribuição espacial.

1.INTRODUÇÃO Espécies invasoras são aquelas que foram introduzidas por meios humanos, sendo voluntária ou involuntariamente, em locais em que antes não existiam, e lá conseguem se estabelecer, reproduzir e expandir sua área de estabelecimento. Pelo fato de serem invasoras, elas possuem Elas possuem ampla tolerância às oscilações do meio, o que as torna muito bem adaptadas à uma grande vairedade de ambientes,suportam uma grande variação de temperatura, ph, entre outros parâmetros que podem contribuir para compor o nicho ecológico de uma espécie. O nicho ecológico de uma população ou espécie pode ser definido pelo agrupamento de condições ambientais e recursos que são necessários para a população ou espécie se manter sem subsídio imigratório (Grinnell 1917). E por isso esses invasores biológicos podem se espalhar amplamente, estabelecendo-se inclusive em locais que não o possuem muita semelhança com os locais de sua origem. Espécies invasoras, são uma preocupação para a conservação, pois elas podem ter um impacto negativo na biodiversidade do local invadido (Lowe et al 2000). Ao invadirem uma região podem alterar o equilíbrio ecológico lá existente, ao competir com espécies nativas, e por não terem um predador natural ainda podem virar pragas, além de causarem outros problemas econômicos. Um organismo invasor que vem sendo sinônimo de preocupação na América do Sul, é o Limnoperna fortunei (Dunker, 1857), popularmente conhecido como mexilhão dourado, que é nativo dos rios e lagos da China, tendo já expandido sua área para Japão, Taiwan, Camboja, Indonésia, Coréia, Laos, Tailândia e Vietnã (Barbosa, 2009). A partir de 1991, iniciou sua invasão na América do Sul pela Argentina, No estuário do Rio da Prata. A figura 1 mostra o seu alastramento pelo continente sul americano.

Figura 1 – Dispersão do Limnoperna fortunei na América do Sul. (Mader Netto, et al.)

Como a questão das espécies invasoras representa um sério risco à biodiversidade mundial, deve se ter consciência de sua importância e buscar-se meios de minimizar os danos causados por elas. Por isso, a utilização de modelos de distribuição potencial se demonstra imprescindível no estudo desses organismos. Tais modelos mostram através de métodos matemáticos, quais são os possíveis locais a serem invadido de acordo com concepções de nicho fundamental e realizado. Modelos de distribuição potencial têm sido muito utilizados em várias situações auxiliando na indicação de áreas prioritárias para conservação da biodiversidade, na avaliação do potencial de invasão de espécies exóticas, no estudo de impactos de mudanças climáticas na biodiversidade, no acompanhamento de vetores de doenças infecciosas, entre outras. O mexilhão dourado possui grande potencial invasor e por ter já causado tantos prejuízos a vários países, torna-se interessante a avaliação de sua expansão não só para o Brasil, mas também para o resto do mundo. Para isso, é necessário o uso de algoritmos capazes de simular sua invasão. Nesse trabalho estão sendo utilizados os algoritmos Distancia Mahalanobis, Domain e Garp With Best Subsets provenientes da plataforma de software livre OpenModeller(http://openmodeller.cria.org.br/ - versão desktop 1.1.0), para modelar a irrupção do L. fortunei nas principais bacias hidrográficas brasileiras e também no mundo.

2.OBJETIVOS Essa bolsa de Iniciação Científica teve como objetivo comparar o desempenho preditivo de três algoritmos de distribuição potencial (Distância Mahalanobis, Domain e GARP) para prever a dispersão em escala global da espécie invasora mexilhão dourado, de modo que se tenha noção da gravidade de seu alastramento e assim possibilitar a tomada de medidas que o contenham e evitar a ocorrência de maiores prejuízos.

3.MÉTODOS e PROCEDIMENTOS 3.1Algoritmo O algoritmo Distância Mahalanobis é estruturado na existência de um ponto ecológico ótimo, definido pela construção de um centroide para todos os pontos de ocorrência em todo o espaço ecológico. A distância entre o valor “ótimo” é o observado para cada célula no grid ambiental com a área geográfica estudada, e o inverso a adequabilidade do ambiente na região. Quanto menor a distância maior a similaridade entre regiões, e uma maior probabilidade da espécie estar presente. O Distância Mahalanobis produz um envelope em forma de elipse em torno do “ótimo” dentro do espaço ecológico. Quando o algoritmo é aplicado a um modelo de distribuição potencial de espécies, as principais condições de um grupo de variáveis do habitat são tipicamente contrastadas, como as descritas para um número de localizações de plantas ou animais com aquelas descritas para localizações de um território. O Domain, diferente do Distância Mahalanobis, nao se baseia em um centroide, faz a distância de Gower, e por isso tem pouca influência no viés amostral. No caso deste algoritmo, são vários envelopes ao redor do ponto. GARP (Genetic Algorithm for Rule Set Production) – Esse é um algoritmo muito usado, se baseia na inteligência artificial e trabalha combinando grupos de regras com o propósito de gerar uma predição mais precisa na região considerada (Stockwell e Noble, 1992). As regras representam um grupo multivariado de relações entre pontos de ocorrência da espécie e de variáveis ambientais. O algoritmo utilizai regras bioclimáticas,atômicas e regressão logística.(Stockwell e Peters, 1999). Os algoritmos utilizados estão inseridos na plataforma Openmodeller Desktop 1.1.0, e para rodar os modelos,manteve-se o padrão de parâmetros existente no sofware: Garp With BestSubsets (DesktopGarp Implementation) 50% dos pontos de ocorrência foram escolhidos aleatoriamente para treino 20 modelos rodados no total Limite de convergência de 0,01 400 é o número máximo de iterações Domain e Distância Mahalanobis Esses dois algoritmos são derivações do Distância Euclidiana do OpenModeller usando métricas diferentes. Distância máxima em relação ao espaço ambiental de referência: 0,1 (acima dele as condições são consideradas inadequadas para a presença da espécie) “Nearest ‘n’ points”: 1 (o que significa que a distância foi medida até o ponto mais próximo, enquanto se fosse 0 a distância ambiental seria medida em relação a média de todos os pontos de ocorrência) Modelos gerados pelo Distância Mahalanobis, Domain e Garp Foram gerados 3 classes de modelos para cada algoritmo segundo a natureza do conjunto de dados de ocorrência utilizados para as simulações,totalizando 9 modelos gerados: Modelos classe I “todos os pontos”: Três modelos usando todos os 319 pontos;; Modelos classe II “pontos da Ásia” Três modelos usando somente os 71 pontos da Ásia; Modelos classe III “pontos da América do Sul” Três modelos usando somente os 249 pontos da América do Sul;

3.2Coletas de dados de ocorrência Os dados de ocorrência de L. fortunei foram retirados da base de dados do CBEIH (Centro de Bioengenharia de espécies invasoras-http://www.cbeih.org/ ), de coletas realizadas e também da literatura. Ao todo, foram utilizados 319 pontos, sendo 71 pontos de ocorrência na Ásia e 248 pontos na América do Sul. Esses pontos estão ilustrados na Figura 2 abaixo.

Figura 2 - Pontos de ocorrência do Limnoperna fortunei.A) América do Sul; B)Ásia

3.3 Obtenção de dados ambientais As camadas climáticas utilizadas para rodar o modelo climático foram retiradas do banco de dados do Worldclim (http://www.worldclim.org/) e foram selecionadas oito no total: • Temperatura Média Anual •

Temperatura Mínima do Mês mais frio

•

Temperatura Média do Trimestre mais frio

•

Temperatura Média do Trimestre mais quente

•

Precipitação do Mês mais chuvoso

•

Precipitação do Mês mais seco

•

Precipitação do Trimestre mais chuvoso

•

Precipitação do Trimestre mais seco

3.4 Arcgis A partir da ferramenta ArcMap, inserida no Software ArcGis 10.0 , foram alteradas as coordenadas de alguns pontos de ocorrência para que eles caíssem dentro de rios, segundo os mapas gerados pelas camadas. Após os modelos serem gerados pelos algoritmos, eles foram transformados em raster no ArcMap para melhor vizualização.

3.5 Estatística As estatísticas usadas para averiguar a qualidade dos modelos foram: Area Under the Curve (AUC) e o Receiver Operation Characteristic (ROC) calculados pelo próprio software OpenModeller. A avaliação de um modelo foca na perfomance de predição e inclui a determinação de um limiar mínimo do valor quantitativo produzido para a presença potencial de uma espécie. A sensibilidade de um modelo é definida como a proporção de presenças verdadeiras em relação ao total de presenças preditas pelo modelo. A especificidade é definida como a proporção de ausências verdadeiras em relação ao total de ausências preditas pelo modelo. Assim, uma curva Receiver Operating Characteristics (ROC) é obtida plotando a sensibilidade contra 1 - especificidade para diferentes valores do limiar de probabilidade, gerando um método de avaliação do limiar independente do modelo(Manel et al., 2001). Além disso, a área abaixo da curva ROC (AUC) é extensivamente usada na modelagem de distribuição de espécies (SDM), caracterizando a performance do modelo, em todos os limiares possíveis, baseando em um valor único que pode ser usado como uma abordagem objetiva ao comparar modelos diferentes (Elith et al., 2006; Phillips et al., 2006). O AUC varia de 0 a 1, onde 1 indica uma alta performance enquanto valores menores que 0.5 indicam uma baixa performance (Luoto et al., 2005; Elith et al., 2006). Apesar de críticas recentes(e.g., Lobo et al., 2008), AUC pode ainda se útil comparando modelos de uma mesma espécie em um espaço geográfico similar

4. RESULTADOS e DISCUSSÃO Os modelos obtidos com os algoritmos se mostraram muito interessantes e de grande valor para o controle do mexilhão. Como já esperado, alguns modelos apresentaram resultados que melhor condizem com a realidade e as suposições tomadas de acordo com o conhecimento disponível sobre a biologia do mexilhão. Os outros modelos podem não ter atingido exatamente o resultado esperado, porém não se deve deixar de levá-los em consideração,pois, ainda assim, mostraram respostas compatíveis com as informações reais sobre o bivalve e seu processo invasivo.

4.1-Análise do desempenho dos modelos gerados pela ROC e AUC Os modelos de todos os algoritmos apresentaram um ótimo desempenho de acordo com o AUC gerado pelo Openmodeller, (AUC > 0.87) segundo os resultados apresentados na Tabela 1. O modelo "Todos os pontos" gerados pelo algoritmo Distância Mahalanobis apresentou o pior desempenho ( AUC = 0,78), enquanto todos os modelos do Domain obtiveram desempenho máximo ( AUC = 1,00). Embora o AUC tenha sido críticado sobre a sua performance, no estudo em questão ele se mostrou condizente, de maneira geral ou em média, com a análise dos mapas gerados, porém, ao se comparar os modelos gerados por cada algoritmo, os resultados foram um pouco incongruentes com a análise feita: O modelo "Todos os pontos" do Distância Mahalanobis foi considerado o melhor entre os três modelos gerados por esse algoritmo, no entando o seu AUC mostra que ele possui a pior performance entre eles. Tabela 1 - Receiver Operating Characteristics ROC e Area Under the Curve AUC para todas as três classes de modelos gerados pelos algoritmos Domain, Garp e Distância Mahalanobis

Algoritmos /classes de modelos

ROC

AUC

Pontos da América do Sul

0,996037

Pontos da Ásia

0,999514

Todos os pontos

0,99524

Pontos da América do Sul

0,968965

0,97

Pontos da Ásia

0,988072

0,99

Todos os pontos

0,940897

0,94

Pontos da América do Sul

0,8709

0,87

Pontos da Ásia

0,91111

0,91

Todos os pontos

0,78038

0,78

Domain:

Garp With BestSubsets:

Distância Mahalanobis:

4.2Distancia Mahalanobis Os produtos gerados pelo algoritmo Distância Mahalanobis ( AUC entre 0,78 a 0,91) apresentaram uma grande flexibilidade prevendo a possível invasão do bivalve em áreas que são pouco prováveis para seu estabelecimento uma vez que a ecologia do local não condiz com as características do animal.

4.2.1 Pontos da Ásia O modelo gerado a partir dos pontos de ocorrência do L.fortunei na Ásia está representado na Figura 3. Como é possivel ver, ele é um bom modelo uma vez que conseguiu prever corretamente os pontos na Ásia, mostrando que é muito provável que ele exista na China que é seu ambiente nativo, além de Japão, Coréia do Sul e Taiwan sabidamente invadidas pelo mexilhão, e ainda previu a invasão na América do Sul, na Bacia do Prata, no Rio Paraná, justamente em pontos onde já existem dados de sua ocorrência. Como já dito, os modelos produzidos pelo Distância Mahalanobis expandiram em muito a área de invasão do mexilhão, e previram que os “HotSpots” da invasão se concentrariam logo acima da linha do Equador, o que faz sentido, se considerarmos que as camadas ambientais utilizadas são climáticas. Lugares como Estados Unidos ( que parte, situar melhor), região mediterrânea da Europa possuem condições climáticas parecidas com o Japão, por exemplo, que é de onde a maioria dos pontos asiáticos foram obtidos. Então, o modelo previu maior risco para aquelas áreas com características climáticas mais próximas dos pontos asiáticos de ocorrência, diminuindo assim a probabilidade de risco na América do Sul .

Figura 3 Modelo com os pontos da Ásia gerados pelo Distância Mahlanobis No mapa colocar coordenadas geográficas, na legenda colocar em portugês e o título_ risco de invasão ( o mesmo para as demais).

4.2.2 Pontos da América do Sul Uma comparação entre os modelos gerados pelo Distância Mahalanobis mostra esse como o modelo (Figura 4) mais flexível de todos os 3. Ele colore o Hemisfério Sul basicamente

de vermelho e laranja o que significa que tem alta probabilidade de invasão pelo mexilhão. Além de uma grande chance de expansão na América do Sul e África, o modelo mostra que ele também poderá ocorrer nas Américas Central e do Norte, principalmente no México e Estados Unidos, também previu exageradamente para Europa, inclusive indicando em amarelo (o que é uma probabilidade mediana) lugares como a Finlândia, Noruega e Inglaterra que, por serem muito frios, não seriam propícios ao estabelecimento da espécie. Esse modelo também não previu uma alta probabilidade de existência do mexilhão em pontos na China, no Japão onde ele atualmente existe.

Figura 4 Modelo com os pontos da América do Sul (AMS) gerado pelo Distância Mahalanobis

4.2.3 Todos os pontos O modelo produzido utilizando todos os pontos de ocorrência presentes na base de dados (Figura 5) se mostrou um intermediário entre os outros dois modelos já explicados. Esse modelo prevê corretamente a existência do mexilhão no Sudeste asiático e também na América do Sul, inclusive traçando uma provável rota para sua expansão até chegar na região amazônica. Apesar de não ser tão exagerado como o modelo com apenas os pontos da América do Sul, ele ainda assim não é o mais adequado para estudos sobre áreas de invasão do mexilhão pois indica um risco de invasão menor de modo geral nas áreas afetadas comparativamente ao primeiro modelo, mas já serve para dar uma ideia sobre a capacidade expansiva de uma espécie invasora e se associado a outros modelos de outros algoritmos é muito útil para modelagem.

Figura 5 Modelo com todos os pontos de ocorrência gerado pelo Distância Mahalanobis

4.3Domain Os modelos gerados pelo Domain são visivelmente melhores que aqueles produzidos pela Distância Mahalanobis. Foram considerados ótimos modelos de estudo da espécie invasora em questão, uma vez que apresentaram AUC = 1 e previram a expansão do Limnoperna fortunei com uma lógica esperada, , tendo como base os pontos de ocorrência por ele utilizados.

4.3.1Pontos da Ásia O modelo gerado pelo Domain utilizando só os pontos de ocorrência da Ásia (Figura 6) foi, de certa forma, mais restritivo, limitando as áreas vermelhas, que são os locais mais prováveis de ocorrência do mexilhão, principalmente à região logo acima da Linha do Equador englobando a Costa Sudeste dos Estados Unidos, o Sul da Europa e o sudeste asiático onde já era esperado que fosse previsto. Ele mostrou de maneira coerente, que o Canadá e o Norte da Ásia são lugares com baixíssimas chances de expansão, ao passo que mostrou corretamente a invasão na América do Sul , embora com poucas regiões em vermelho. Esse modelo foi além, prevendo uma expansão para a Bacia Amazônica, o Centro da África e a Costa Oeste dos EUA.

Figura 6 Modelo com os pontos da Ásia gerado pelo Domain

4.3.2Pontos da América do Sul Esse modelo (figura 7) prevê a invasão principalmente para o Hemisfério Sul, o que é plausível levando em conta os dados climáticos inseridos. Mostrou uma expansão massiva na América do Sul, com a exceção de Chile e Colômbia, o que faz sentindo ao se analisar os pontos de ocorrência e suas características ecológicas. Segundo ele, o mexilhão ainda invadirá o Centro-sul africano, além do México, Sul dos EUA, e a região do Mar Mediterrâneo. Esse modelo pecou ao não prever tão bem para o sudeste asiático.

Figura 7 Modelo com os pontos da América do Sul (AMS) gerado pelo Domain

4.3.3Todos Pontos Assim como o modelo com “todos os pontos” do Distancia Mahalanobis, o modelo (Figura 8) gerado pelo Domain foi um meio termo entre os outros dois gerados por ele, levando em consideração tanto os dados ambientais dos pontos da América do Sul e os dados do Japão, logo ele não se restringiu a um Hemisfério apenas. Esse,então, é considerado o melhor modelo gerado pelo Domain e também o melhor modelo produzido. Também pelos modelos gerados pelo Domain observa-se a grande influência das características ambientais dos pontos de ocorrência sobre os dados de saída dos modelos. Assim os modelos com registros de ocorrência provenientes somente da Ásia aumentam os riscos de invasão para ambientes do Hemisfério Norte e subestimam o risco de invasão para as áreas do Hemisfério Sul e de forma contrária as respostas acontecem ao se utilizarem registros de ocorrência somente da América do Sul.

Figura 8 Modelo com todos os pontos de ocorrência gerado pelo Domain

4.4Garp Os modelos gerados por este algoritmo tenderam a ser mais conservadores, mantendo as áreas com grande potencial de invasão pelo mexilhão próximas aos pontos de ocorrência fornecidos para gerar o modelo.

4.4.1Pontos da Ásia A previsão propiciada por este modelo (Figura 9) se deteve a lugares onde o clima é mais parecido com os pontos fornecidos ( dados de ocorrência), em regiões de clima temperado e de pluviosidade parecida também. Ele foi capaz de prever a região nativa do Limnoperna fortunei, embora tenha sido muito restrito, limitando a área de invasão mesmo no sudeste asiático. Ele previu corretamente a invasão na América do Sul, inclusive em locais que foram invadidos recentemente. Mostrou que o Sudeste do Estados Unidos possui um alto potencial de ser invadido. De um modo geral o modelo fez previsões corretas mas restringiu bastante as áreas de invasão aproximando-as aos pontos de ocorrência

Figura 9 Modelo com os pontos da Ásia gerado pelo Garp With Best Subsets

4.4.2Pontos da América do Sul Nesse modelo utilizando os pontos da América do Sul (Figura 10) houve uma maior expansão da previsão de invasão nos países do hemisfério Sul em relação ao modelo utilizando só os pontos da Ásia do Garp. Porém nos países do Hemisfério Norte a área de invasão diminuiu, em relação à América do Sul. As diferenças de temperatura se demonstram como importantes fatores de predição, demonstrando que o mexilhão se adapta melhor a temperaturas mais quentes, embora tenha uma grande flexibilidade de se adaptar a diversas temperaturas. Nesse modelo mostra a invasão na América do Sul e a predição amplia os prováveis locais que Limnoperna sp. pode se instalar, também prevê a existência no seu território nativo, China, porém não mostra a invasão no Japão.

Figura 10 Modelo com os pontos da América do Sul (AMS) gerado pelo Garp With Best Subsets

4.4.3Todos os pontos A análise desse modelo (Figura 11) e comparação com os outros modelos gerados pelo Garp mostra que ele é o melhor entre os três modelos, gerando um cenário intermediário em relação àqueles produzidos com pontos da Ásia ou com pontos da América do Sul. Ele prevê o conjunto de previsões produzidas pelos outros dois modelos e expande um pouco mais a previsão.

Figura 11 Modelo com todos os pontos de ocorrência gerado pelo Garp With Best Subsets

Analisando os melhores modelos da Distância Mahalanobis, do Garp e do Domain, aqueles gerados a partir do uso de todos os pontos de ocorrência, é possível encontrar algumas semelhanças e também discrepâncias entre as formas de trabalho desses três algoritmos. Todos os algoritmos conseguiram prever muito bem para lugares onde já sabemos a existência do mexilhão, inclusive a sua possível expansão, porém o Domain apresentou mais coerência com as características ambientais da espécie. É sabido que um invasor biológico pode ampliar muito o seu habitat, mas existe sempre um limite que com certeza não foi o limite imposto pelo Distancia Mahalanobis que exagerou na previsão, ou o limite conservador estabelecido pelo Garp, de forma que o melhor desempenho foi o do Domain. Um fato interessante, foi a capacidade de todos os modelos preverem a invasão do Limnoperna fortunei para a porção Sudeste dos Estados Unidos, região em que estão os Grandes Lagos e que foi invadida por um outro bivalve ( mexilhão zebra (Dreissena polymorpha Pallas 1771, ) que possui características ecológicas muito parecidas com o mexilhão desse estudo, embora de famílias distintas, ambos são bivalves de água doce e produtores de bisso . Por ser uma espécie de água doce, a modelagem do nicho ecológico do mexilhão dourado e por conseguinte, de sua distribuição espacial, pode tornar-se mais robusta à medida em que outras variáveis limnológicas forem consideradas pois esses dados vão representar melhor as condições de vida do mexilhão realizando uma predição mais robusta.

5. CONCLUSÕES A partir do que foi produzido foi possível demonstrar o grande potencial invasor que essa espécie tem, com capacidade de se estabelecer basicamente em todos os continentes. Por mais que o potencial invasor seja menor em algumas regiões do que outras, não se deve subestimar a capacidade de expansão de Limnoperna fortunei e com ele as chances de levar prejuízos ambientais (alteração das interações ecológicas, extinção de espécies nativas por competição, diminuição da qualidade de água) e prejuízos econômicos ( doenças, entupimento de encanação de hidrelétricas). Para as áreas de maior risco de invasão propõem-se a intensificação de ações preventivas, e intenso monitoramento. As regiões de menor risco não devem negligenciar a possibilidade de sofrer danos também. E as áreas já invadidas precisam estabelecer medidas de controle do mexilhão a fim de impedir ou minimizar sua expansão. Mesmo considerando modelos bastante genéricos que utilizaram apenas duas variáveis climáticas e em escala global, tais ferramentas se mostraram como bons preditores revelando a eficácia desses algoritmos para a modelagem da de distribuição potencial de espécies invasoras. Uma melhoria de tais respostas é esperada a partir do uso das variáveis limnológicas que representam melhor os requerimentos ecológicos do molusco.

6. REFERÊNCIAS RODDER D., SCHMIDTLEIN S., VEITH M., LOTTERS S. 2009. Alien Invasive Slider Turtle in Unpredicted Habitat: A Matter of Niche Shift or of Predictors Studied? PLoS ONE 4(11): e7843. 2009. Nabout, JC., Soares, TN., Diniz-Filho, JAF., De Marco Júnior, P.,Telles, MPC., Naves, RV. and Chaves, LJ.(2010). Combining multiple models to predict the geographical distribution of the Baru tree (Dipteryx alata Vogel) in the Brazilian Cerrado. Braz. J. Biol., 2010, vol. 70, no. 4, p. 911-919 Grinnell, J. (1917). Field tests of theories concerning distributional control. American Naturalist, 51,115–128. Siqueira, M. F., et al. Something from nothing: Using landscape similarity and ecological niche modeling to ﬁnd rare plant species. Journal for Nature Conservation, (2009), doi:10.1016/j.jnc.2008.11.001 Lowe S, Browne M, Boudjelas S, De Poorter M (2000) 100 of the world’s worst invasive alien species. A selection from the Global Invasive Species Database.Auckland, CA: The IUCN Invasive Species Specialist Group (ISSG). 12 p BARBOSA, F.G. & MELO, A.S. 2009. Modelo preditivo de sobrevivência do Mexilhão Dourado (Limnoperna fortunei) em relação a variações de salinidade na Laguna dos Patos, RS, Brasil. Biota Neotrop. 2009, 9(3): 000-000. DARRIGRAN & DAMBORENEA (Eds.) Bio-invasion del mejillón dorado en el continente americano. Edulp, La Plata, 2006. 220 pág. MÄDER NETTO, O. S. Controle da incrustação de organismos invasores em materiais de sistemas de resfriamento de usinas hidrelétricas. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia - PIPE. 2011. 112 f. : il., grafs., tabs. Darrigran, G.; Ezcurra de Drago, I. 2000. Invasion of Limnoperna fortunei (Dunker, 1857) (Bivalvia: Mytilidae) in America. Nautilus 2:69–74. Cataldo D.H.; Boltovskoy, D. 2000 Yearly reproductive activity of Limnoperna fortunei (Bivalvia) as inferred from the occurrence of its larvae in the plankton of the lower Paraná river and the Río de la Plata estuary (Argentina) Aquatic Ecology 34: 307–317. Elith, J., Graham, C.H., et al. (2006) Novel methods improve prediction of species’ distributions from occurrence data. Ecography 29,129-151 PHILLIPS S. J., ANDERSON R. P., SCHAPIRE R. E., Maximum entropy modeling of species geographic distributions. Ecological Modelling 190 (2006) 231–259. Manel, S., H.C. Williams, and S.J. Ormerod, (2001), Evaluating presence-absence models in ecology: the need to account for prevalence. Journal of Applied Ecology, 38, 921-931. Luoto, m., J. Poyry, r.K. Heikkinen & K. Saarinen. 2005. uncertainty of bioclimate envelope models based on the geographical distribution of species. Global Ecology and Biogeography 14: 575-584. Lobo, J. M., A. Jiménez-Valverde, and R. Real. 2008. AUC: A misleading measure of the performance of predictive distribution models. Global Ecology and Biogeography 17: 145-151. Stockwell, D. R. B., and I. R. Noble. 1992. Induction of sets of rules from animal distribution data: A robust and informative method of analysis. Mathematics and Computers in Simulation 33:385-390. Stockwell, D. R. B., and D. P. Peters. 1999. The GARP modelling system: Problems and solutions to automated spatial prediction. International Journal of Geographic Information Systems 13:143-158. Carpenter G, Gillison AN, Winter J (1993) DOMAIN: A flexible modeling procedure for mapping potential distributions of animals and plants. Biodiversity and Conservation 2: 667-680

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Fundação de Amparo à Pesquisa do Gerais Fundação Centro Tecnológico de Minas

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GT 343 – Controle do Mexilhão Dourado: Bioengenharia e novos materiais para aplicações em ecossistemas e usinas hidrelétricas

Modelo Gravitacional para avaliação do Risco de Invasão de Limnoperna fortunei em reservatórios hidrelétricos

Maio / 2013

______________________________________________________________________ Universidade Federal de Minas Gerais – UFMG ______________________________________________________________________ Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais - CETEC Diretoria de Desenvolvimento e Serviços Tecnológicos Setor de Medições Ambientais - SAM ______________________________________________________________________ PRESIDENTE Marcílio César de Andrade VICE PRESIDENTE Eduardo Prates Octaviani Bernis DIRETOR DE DESENVOLVIMENTO E SERVIÇOS TECNOLÓGICOS

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GT 343 – Controle do Mexilhão Dourado: Bioengenharia e novos materiais para aplicações em ecossistemas e usinas hidrelétricas

Modelo Gravitacional para avaliação do Risco de Invasão de Limnoperna fortunei em reservatórios hidrelétricos

FAPEMIG/ MAIO / 2013

Mônica de Cássia Souza Campos Pesquisador Pleno, Orientador

Belo Horizonte MAIO/2013

Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais / CETEC Diretoria de Desenvolvimento e Serviços Tecnológicos Setor de Medições Ambientais – SAM Setor de Análises Químicas - STQ

GT 343 – Controle do Mexilhão Dourado: Bioengenharia e novos materiais para aplicações em ecossistemas e usinas hidrelétricas

Modelo Gravitacional para avaliação do Risco de Invasão de Limnoperna fortunei em reservatórios hidrelétricos

Autores:

Aluno: Thalisson Scarabelli dos Santos Correia, Engenharia de Controle e Automação, Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG. Orientadora : Mônica de Cássia Souza Campos, Doutora Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais

RESUMO Invasões biológicas demandam uma série de ações de controle e contenção a fim de reduzir os prejuízos econômicos e ambientais causados pelas mesmas. O mexilhão dourado (Limnoperna fortunei) é um bivalve de água doce, que invadiu a América do Sul em 1991 e possui alto poder de adaptação. Contudo, sua forma de dispersão a montante, no sentido contrário do fluxo das correntes, está sempre relacionada a um vetor de dispersão, geralmente associado a atividades antrópicas. Um modelo matemático foi proposto a fim de nos dar informações identificar e quantificar os principais vetores de dispersão desta espécie e definir a área de origem e de destino mais suscetíveis a uma invasão, de forma a se conhecer o risco de invasão de tais ambientes.

Sumário 1

Introdução

Objetivos

Problemas

Metodologia

4.1 Modelo Gravitacional 9 5

Linguagens computacionais utilizadas 9 5.1 Visual Studio 9 5.2 C# (C Sharp)

5.3 Classes 10 6

Resultados

6.1 Desenvolvimento e adaptação da formulação matemática 6.2 Desenvolvimento do Programa 14

6.2.1

Form1 14

6.2.2

Form2 15

6.2.3

Form3 16

6.2.4

Form4 17

6.2.5

Form5 17

6.2.6

Form6 18

6.2.7

Form7 18

6.2.8

Form8 19

6.2.9

Form9 19

6.3 Formato dos dados de entrada 20 6.4 Exemplo de aplicação 21 6.5 Formato dos dados de saída 7

Conclusão

Bibliografia

Lista de Equações Equação 1 - Modelo Gravitacional Geral

Equação 2 - Lei da Gravidade 9 Equação 3 - Modelo Gravitacional de Vetores 13 Equação 4 - Chance Relativa Percentual14 Equação 5 - Chance Relativa Percentual para Múltiplos Vetores 14

Lista de Figuras Figura 1 - Janela representativa da Toolbox do Programa Visual Studio 10 Figura 2 - Exemplo de struct no código 11 Figura 3 - Declaração de Variáveis

Figura 4 - Abertura de Arquivo 11 Figura 5 - Abas 12 Figura 6 - Influência de α Figura 7 - Form1

Figura 8 - Form2

Figura 9 - Form3

Figura 10 - Form4

Figura 11 - Form5

Figura 12 - Form6

Figura 13 - Form7

Figura 14 - Form8

Figura 15 - Form9

Figura 16 - Modelo de Planilha 20 Figura 17 - Formato Reconhecido

Figura 18 - Exemplo de Utilização

1 Introdução O mexilhão dourado (Limnoperna fortunei (Dunker, 1857)) é um bivalve originário do Sudeste Asiático, principalmente China, de água doce da Família Mytilidae. Sua primeira aparição como espécie invasora foi em Hong Kong em 1966. Já em 1991 era encontrado no Japão e América do Sul (CAMPOS et al., 2005). Invadiu o sul da América do Sul sendo registrado pela primeira vez no rio da Prata, Argentina. Provavelmente devido ao transporte em água de lastro de navios vindos da Ásia (Pastorino et al., 1993). Sete anos mais tarde, em 1998, foi encontrado no Lago Guaíba, próximo à cidade de Porto Alegre, sul do Brasil (Mansur et al., 2003) e também na Lagoa dos Patos, também Rio Grande do Sul, Brasil (Darrigran, 2001). Em 2004, registrou-se sua presença no Alto Rio Paraná (CAMPOS et al., 2005). Esta espécie é conhecida por seus impactos econômicos e ambientais. Logo, o conhecimento da dinâmica de sua distribuição é crucial para orientar medidas de prevenção e controle. Muitos modelos de propagação de espécies invasoras dependem de características climáticas e das exigências do organismo (e.g., DAEHLER & STRONG 1996; SUTHERST et al. 1996). Porém esses tipos de modelos descrevem o nicho fundamental do organismo e seu potencial de distribuição, mas não levam em conta a dinâmica da invasão propriamente dita. Alguns habitats em potencial podem estar muito isolados para serem caracterizados como um habitat de risco e recursos gastos na proteção daquele local poderiam estar sendo usados em outros lugares de maior risco (Schneider, Ellis, & Cummings, 1998). Para se avaliar esse risco, modelos de invasão são necessários, pois levam em conta o comportamento dos vetores que carregam a espécie invasora. (Schneider et al., 1998). Quando lidamos com espécies invasoras, principalmente as que acarretam prejuízos ambientais e até mesmo financeiros, o controle se faz necessário e qualquer informação que possa ajudar no sentido de concentrar esforços em poucos pontos de maior risco é crucial. (Carey, 1996).

2 Objetivos Desenvolver um software capaz de apontar áreas de maior risco de invasão levando em consideração não só as características limnológicas e climatológicas do ambiente, mas principalmente os princípios relacionados à invasão, como vetores e as distâncias percorridas por estes. 7

3 Problemas Não podemos considerar como invasão apenas se mover adiante, é necessário analisar a dinâmica do transporte, principalmente para longas distâncias, onde eventos de dispersão tem um papel fundamental. (Hastings, 1996). A dispersão do mexilhão dourado, assim como a do mexilhão zebra, não pode ser avaliada somente com um modelo de difusão, pois estes animais se dispersam por longas distâncias e atravessam nichos heterogêneos e não adequados e, portanto, dependem do transporte por vetores entre essas “ilhas de habitats”. (Schneider et al., 1998). O maior exemplo dessa evidência é o fato de que apesar de originária do sul da Ásia, esta espécie é encontrada como invasor em outro continente (América do Sul) sendo que estes são separados por mar, ambiente cuja salinidade impediria sua sobrevivência. No caso destes bivalves invasores, como os mexilhões zebra e dourado, atividades humanas tais como a pesca, a aquicultura, o transporte hidroviários, pequenas embarcações e outras atividades que envolvem a utilização de água bruta são importantes vetores de disseminação tanto dos estágios larvais planctônicos como das formas adultas bissadas, que podem ser transportadas pela água ou mesmo por via terrestre, aderidas a redes, cascos de embarcações, etc. Dessa forma a informação de como se comportam esse possíveis vetores é fundamental para o prognóstico e controle de qualquer espécie invasora.

4 Metodologia Uma revisão bibliográfica na área foi feita a fim de familiarizar-se com conceitos para escolher o melhor método para a construção do modelo. A área é bem vasta uma vez que não é necessário que o invasor seja aquático, mas que apenas dependa de um vetor. O modelo gravitacional é amplamente adotado para esse tipo de previsão, uma vez que lida com a distância entre origem e destino do invasor como um dificultador de ordem a ser definida.

4.1 Modelo Gravitacional É um modelo matemático baseado numa analogia com a lei da gravidade proposta por Newton e que tem sido usado para estudar eventos do comportamento humano que são relacionados à interação espacial como imigração, turismo (Coelho, Ferreira, & Cavalcanti, 2009; Padilla, Chotkowski, & Buchan, 1996), economia (Azevedo, Portugal, & Neto, 2006; Filipe & Azevedo, 2000) entre outros vários exemplos. A lei da Gravidade, Equação 2, nos diz que a Força Gravitacional que existe entre dois corpos é proporcional à massa de ambos os corpos e inversamente proporcional à distância entre eles ao quadrado, a menos de um fator constante. Seguindo a analogia, o modelo gravitacional prevê que a interação I entre dois lugares i e j, é função de forças repulsivas em i, forças atrativas em j e função inversa da distância D entre as localidades, como mostrado na Equação 1.

Equação 1 - Modelo Gravitacional Geral

Equação 2 - Lei da Gravidade Como pode ser observado na Equação 1, o modelo gravitacional trabalha com vetores e matrizes, pois analisam os locais como em uma rede onde todos os pontos estão interconectados. Por isso para cada i existe uma Interação I cada outro ponto j. Por isso a plataforma usada deve ser capaz de tratar de Vetores e Matrizes com facilidade. Primeiramente, a ideia era trabalhar com a ferramenta MATLAB.

5 Linguagens computacionais utilizadas 5.1 Visual Studio O Visual Studio é uma ferramenta computacional para desenvolvimento criada pela Microsoft® que permite criar executáveis a partir de códigos escritos em diversas linguagens de programação como C, Visual Basic e F#. Como a proposta é desenvolver uma ferramenta 9

capaz de disponibilizar o modelo gravitacional de forma amigável a qualquer usuário a linguagem escolhida foi C#.

5.2 C# (C Sharp) É uma linguagem de programação que permite a criação de janelas de aplicação nos sistemas operacionais Windows permitindo uma interface amigável e conhecida de qualquer usuário comum, além de bastante intuitiva, além disso, C# permite trabalhar com vetores (e listas) e matrizes, mostrando-se adequada às necessidades deste trabalho.

5.3 Classes C# é uma linguagem orientada a objeto. Essa estratégia deixa o código mais limpo e inteligível, além de facilitar o desenvolvimento e reutilização. Um conjunto de classes são implementadas e definem os objetos presentes no software. Cada classe determina como os objetos vão se comportar e quais são seus estados através de atributos e métodos.

Figura 1 - Janela representativa da Toolbox do Programa Visual Studio 10

O Microsoft Visual Studio possui uma Toolbox que auxilia na criação da interface deixando simples a programação de cada botão, caixa de textos ou outros elementos que são tratados como classes.

Figura 2 - Exemplo de struct no código Ainda é possível criar uma coleção de variáveis chamada struct, facilitando, assim, a criação de um banco de dados.

Figura 3 - Declaração de Variáveis As variáveis são declaradas no início do código. Na Figura 3 temos exemplos de variáveis do tipo inteiro (int), ponto flutuante (float), structs criadas (Tipos e Unidade), lista (ArrayList), booleano (bool) e uma matriz de pontos flutuantes (float[,]).

Figura 4 - Abertura de Arquivo 11

Como pode ser visto na Figura 4, é possível abrir arquivos salvos em disco através do código. A linguagem C# tem a peculiaridade de não ser sequencial como outras, ela funciona através de eventos. Determinada rotina é executada quando uma respectiva ação é disparada pelo usuário, como por exemplo, um clique num botão. Cada janela tem um código separado, e elas são chamadas de forms. Pode-se observar que podemos editar tanto o código quanto o visual das janelas, navegando através de abas (Figura 5).

Figura 5 - Abas

6 Resultados 6.1 Desenvolvimento e adaptação da formulação matemática Baseando-se na Equação 1, é necessário definir qual a equação a ser usada. Essa escolha foi feita levando-se em consideração as dinâmicas e tipos de vetores mais presentes na área das represas de São Simão e Volta Grande que são o foco de estudos mais recentes sobre invasão da espécie Limnoperna fortunei. São elas dragas de areia, embarcações comerciais e peixamento. No caso do peixamento, por exemplo, temos diferentes forças atrativas para cada origem, pois uma espécie de peixe que é necessária em uma represa não é cultivada em todas as outras, mas apenas em algumas específicas. Dessa forma faz sentido apenas trabalharmos com conexões individuais entre os locais. Ainda temos uma variável que seria atratividade de

que depende apenas nas características

físico-químicas, limnológicas e climatológicas do lugar de destino. Essa variável foi chamada de Invasibilidade ( ).

Já a função da distância é comumente usada uma potência de , na maioria dos casos 2, como na Lei da Gravidade e ainda outras leis da física. O modelo é dado pela Equação 3.

Equação 3 - Modelo Gravitacional de Vetores Onde

é uma chance relativa; é uma matriz de conexões entre origem e destino devido a tal vetor; é a invasibilidade da origem; é uma matriz de distâncias entre origem e destino; é a potência relativa a viagens longas e curtas;

O ajuste desse modelo pode ser feito através de

que é o único parâmetro que pode ser

escolhido. Esse parâmetro é relacionado com a importância em que a distância tem na equação. Valores altos de

sugerem que a longas distâncias a Interação é pequena entre

, uma vez que quando esse valor é reduzido, a distância tem um papel “menos dificultador”. A Figura 6 é um exemplo de como é a influência da distância para cada valor de

Figura 6 - Influência de α

( ,

Para fins de análise, podemos obter essa chance relativa percentual dividindo cada

por

. Dessa forma teremos um resultado comparativo entre as chances dado pela Equação 4:.

Equação 4 - Chance Relativa Percentual Podemos ainda ter uma chance relativa não só para um vetor apenas, mas para vários. A Equação 5 representa como seria:

Equação 5 - Chance Relativa Percentual para Múltiplos Vetores Onde

é o número de vetores que são considerados; é o peso dado a esse vetor;

Não foi levado em conta que as distâncias percorridas por cada vetor de um ponto i a outro j possa ser diferente. Apesar de provavelmente serem diferentes, acredita-se que essa diferença não seja relevante na avaliação, uma vez que os resultados são qualitativos e não quantitativos.

6.2 Desenvolvimento do Programa Uma vez determinado qual será o modelo usado no programa (Equação 5), iniciou-se o desenvolvimento do software. Como este é composto por janelas, está descrito aqui as funcionalidades de cada uma. Como dito anteriormente, as janelas são chamadas de forms dentro do Visual Studio, e este será o nome adotado a partir daqui.

6.2.1Form1 É o form principal e é nele que é possível importar as informações e dados necessários para o cálculo de risco.

Figura 7 - Form1 Aqui podemos importar uma tabela de informações que contem nome da unidade, cidade e a invasibilidade respectiva, valor entre 0 e 1. Uma tabela com as distâncias também pode ser importada. Os diferentes vetores (Tipo de Invasão) e seu peso

associado. Ao adicionar o tipo

de invasão, pode-se importar a tabela respectiva a esse vetor. É possível ainda conferir as tabelas importadas, ver a equação usada (é mostrada a equação geral dada pela Equação 3) e alterar o valor do parâmetro

, permitindo futuramente que o modelo seja calibrado. Tendo

todas as tabelas de dados importadas com sucesso clica-se em “Calcular”.

6.2.2Form2 Form responsável por mostrar a tabela de informações que foi importada. É ativada quando é pressionado o botão “Ver Tabela de Informações” no Form1.

Figura 8 - Form2

6.2.3Form3 Form responsável por mostrar a tabela de distâncias importada. É mostrada quando o botão “Ver Tabela de Distâncias” é clicado.

Figura 9 - Form3

6.2.4Form4 Da mesma maneira que os forms 2 e 3, também mostra uma tabela mas dos vetores. Como mostra apenas de um vetor por vez, é necessário selecionar no listbox1 o vetor que deseja conferir. Ao pressionar “Ver Tabela de ‘vetor’” no Form1 é mostrada essa janela.

Figura 10 - Form4

6.2.5Form5 É mostrado ao pressionar “Calcular” no Form1. É a janela que mostra os resultados dos cálculos. Todos os resultados estarão em valor relativo percentual. Na tabela da esquerda temos os valores individuais, ou seja, a chance relativa de invasão de um local

por um local .

Já na tabela da direita estão as chances relativas de cada ponto de destino já ranqueadas. É possível obter o resultado individual para cada vetor diferente. É possível exportar os dados das tabelas para um arquivo de extensão txt que ainda pode ser interpretado como uma planilha na ferramenta EXCEL®. Os resultados ainda podem ser melhor interpretados em gráficos.

Figura 11 - Form5

6.2.6Form6 Ao clicar “Mostrar Histograma” no Form5 essa janela é mostrada e nela um gráfico de barras com as chances relativas de cada unidade aparece. Ainda é possível analisar os dados em um gráfico de setor clicando em “Gráfico de Pizza”.

Figura 12 - Form6

6.2.7Form7 No Form1, ao clicar no menu “Sobre” e “CBEIH” essa janela se abre contendo informações sobre o CBEIH aparece.

Figura 13 - Form7

6.2.8Form8 No Form1, ao clicar no menu “Sobre” e “CBEIH.org” essa janela se abre contendo o website cbeih.org.

Figura 14 - Form8

6.2.9Form9 No Form1, ao clicar no menu “Ajuda” e “Guia Rápido” essa janela se abre mostrando um Tutorial para a utilização do software.

Figura 15 - Form9

6.3 Formato dos dados de entrada Os dados necessários para a execução do modelo devem ser importados em arquivos no formato txt. Para facilitar a importação e formatação desse arquivo foi criado um modelo numa planilha EXCEL. Esse modelo mostrado na Figura 16 está na formatação correta aceita pelo programa, basta o usuário salvá-la como texto separado por tabulações como no exemplo da Figura 17.

Figura 16 - Modelo de Planilha 20

Figura 17 - Formato Reconhecido

6.4 Exemplo de aplicação Um exemplo de utilização do programa foi feito com dados fictícios aleatórios gerados pela ferramenta computacional EXCEL a fim de testar e demonstrar o funcionamento devido do software.

Figura 18 - Exemplo de Utilização

6.5 Formato dos dados de saída Os dados de saída não são absolutos, por tanto não se caracteriza uma probabilidade. Os dados devem ser interpretados, pois contem informações para fim de comparação. Os resultados são mostrados em gráficos para facilitar essa avaliação por parte do usuário.

7 Conclusão Apesar do demonstrado funcionamento do programa não há como afirmar que o modelo é fiel à realidade. Na verdade isso não é possível, pois não existe forma de se monitorar cada evento 23

de invasão em particular. Mesmo se fosse possível, a quantidade de dados necessários para se validar esse modelo é muito grande, já que se deve fazer essa avaliação para cada vetor em particular. Contudo, a aplicação desse tipo de modelo gravitacional é muito grande, como já mostrado em na seção 4.1 Modelo Gravitacional. Tendo em vista que a aplicação do programa é uma avaliação de risco e não monitoramento, não existe a preocupação com a exatidão dos dados como data e local de invasão, mas sim saber qual local está sofrendo uma maior pressão de invasão e deve ter maior preocupação com a prevenção.

8 Bibliografia Azevedo, A. F. Z. De, Portugal, M. S., & Neto, P. C. F. De B. (2006). Impactos comerciais da área de livre comércio das américas, 10(2), 237–267. Carey, J. R. (1996). The future of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata invasion of California: A predictive framework. Biological Conservation, 78(1-2), 35–50. Doi:10.1016/0006-3207(96)00016-X Coelho, C., Ferreira, W., & Cavalcanti, J. (2009). Análise estatística multivariada e aplicação do modelo gravitacional aos fluxos turísticos para o Brasil. REUNA, 35–54. Retrieved from http://revistas.una.br/index.php/reuna/article/view/338 Filipe, A., & Azevedo, Z. De. (2000). O Efeito Do Mercosul Sobre O Comércio  : Uma Análise Com O Modelo Gravitacional *, 307–340. Hastings, A. (1996). Models of Spatial Spread: Is the Theory Complete? Ecology, 77(6). Padilla, D., Chotkowski, M., & Buchan, L. (1996). Predicting the spread of zebra mussels (Dreissena polymorpha) to inland waters using boater movement patterns. Global Ecology and …, 5(6), 353–359. Retrieved from http://www.jstor.org/stable/10.2307/2997590 Schneider, D. W., Ellis, C. D., & Cummings, K. S. (1998). A Transportation Model Assessment of the Risk to Native Mussel Communities from Zebra Mussel Spread. Conservation Biology, 12(4), 788–800. Doi:10.1046/j.1523-1739.1998.97042.x Campos M.C.S., Rolla Me &, Felipe Ga Ocorrência de Limnoperna fortunei (Dunker,1857) em Minas Gerais In: Proceedings X Congresso Brasileiro de Limnologia, Ilhéus, BA, julho, 24 -29, 2005, Sociedade Brasileira de Limnologia, number 998 794, 2005. Darrigan, g. Distribuição espacial e temporal do "mexilhão dourado" (limnoperna fortunei) na bacia de la plata. Http: //www.malacologia.com.ar. Disponivel em: <http://www.malacologia.com.ar/malacologia/portugues/histi.htm>. 24

Pastorino, g. Et al. Limnoperna fortunei (dunker, 1857) (mytilidae), nuevo bivalvo invasor em รกguas del rio de la plata. Neotrรณpica, v. 39, p.101-102, 1993.

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS PARA GRADUANDOS CETEC PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO TECNOLÓGICA E INOVAÇÃO - PIBIC Ministério da Ciência e Tecnologia / CNPq Programa Institucional de Iniciação Científica – Fundação CETEC

Projeto GT 343 – Controle do mexilhão dourado: bioengenharia e novos materiais para aplicações em ecossistemas e usinas hidrelétricas

MODELAGEM DA DISTRIBUIÇÃO POTENCIAL DO MEXILHÃO DOURADO ATRAVÉS DO USO DE SISTEMAS DE INFORMAÇÃO GEOGRÁFICA GT 343 / CNPq Lucas Pires Augsten Capanema

Mônica de Cássia Souza Campos

Belo Horizonte Agosto / 2013

______________________________________________________________________ Universidade Federal de Minas Gerais ______________________________________________________________________

Centro Tecnológico SENAI CETEC _____________________________________________________________________ GERENTE DE INOVAÇÃO E TECNOLOGIA José Eustáquio Drumond

Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais - CETEC PRESIDENTE Marcílio César de Andrade

Av. José Cândido da Silveira, 2000 - Horto Florestal - Belo Horizonte - MG – 31035-536 Telefone: (31) 3489-2000 / Fax: (31) 3489-2200 – Portal: www.cetec.br - E-mail: faleconosco@cetec.br

Centro Tecnológico SENAI CETEC Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais / CETEC

Projeto GT 343 – Controle do mexilhão dourado: bioengenharia e novos materiais para aplicações em ecossistemas e usinas hidrelétricas

Orientador: Mônica de Cássia Souza Campos.

Autores: Lucas Pires, Est. Geografia, Universidade Federal de Minas Gerais.

Mônica de Cássia Souza Campos, PhD.

MODELAGEM DA DISTRIBUIÇÃO POTENCIAL DO MEXILHÃO DOURADO ATRAVÉS DO USO DE SISTEMAS DE INFORMAÇÃO GEOGRÁFICA

INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 01 OBJETIVOS .......................................................................................................... 01 PROBLEMA ......................................................................................................... 01 MÉTODOS ............................................................................................................ 01 DESENVOLVIMENTO E ANÁLISE DE RESULTADOS ................................. 01 CONCLUSÕES ..................................................................................................... 01 RECOMENDAÇÕES …………………………………………………………… 01 REFERÊNCIAS ………………………………………………………………… 01 Ayres, R. U. Thermodynamics and Process Analysis for the Future Economic Scenarios. INSEAD. Working Paper Series. Fontainebleau. France. 1995. 24 p. Faucheux, S. & Noël, J-F. ÉCONOMIE DES RESSOURCES NATURELLES ET DE L’ENVIRONMENT. Paris: Armand Collin. 1995. 370 p.

1. INTRODUÇÃO: As constantes alterações ambientais provocadas pela dispersão humana acarretam uma série de modificações na composição das populações originais. Diversas espécies têm sido, cada vez mais, introduzidas e disseminadas pelo homem. Muitas destas espécies se tornam invasoras, multiplicando-se a tal ponto de causarem grandes transtornos ambientais, econômicos ou até mesmo sociais (Pestana et al., 2010). As invasões biológicas constituem uma grave ameaça para a biodiversidade mundial, sendo que geralmente afetam a estrutura das comunidades e o próprio funcionamento do ecossistema (Williamsom & Fitter, apud, Barbsoa, 2009). Espécies invasoras geralmente são capazes de se reproduzir de maneira rápida, apresentam crescimento acelerado e elevada adaptação aos diferentes ambientes aquáticos que colonizam (Darrigran, 1997). De acordo com a união Internacional para a Conservação da Natureza e dos Recursos Naturais (IUCN), atualmente as invasões de espécies exóticas são a segunda maior causa da perda de biodiversidade no planeta (Barbosa, 2008). Os modelos de distribuição de espécie (ou em inglês Species Distribution Modeling- SDM) objetivam a caracterização do nicho ecológico de uma espécie e de sua projeção no espaço geográfico. O resultado é um mapa de distribuição potencial, que pode ser útil na predição da capacidade de invasão de determinada espécie exótica (Rodder , 2009). Elith & Leathwick (2009) destacam como principais etapas da boa prática de modelagem: o recolhimento de dados relevantes; avaliação da sua adequação (precisão e abrangência dos dados das espécies, a relevância e a abrangência dos preditores); decisão de como lidar com variáveis preditoras correlatas; seleção de um algoritmo de modelagem apropriado, ajuste do modelo aos dados de treinamento, avaliação do modelo incluindo o realismo de funções de resposta embutidos, ajuste do modelo aos dados e desempenho preditivo em dados de testes; mapeamento das previsões para o espaço geográfico; e, enfim, a repetição dos procedimentos para melhorar o modelo à luz dos conhecimentos adquiridos ao longo do processo. Modelos de distribuição potencial baseados no nicho ecológico têm sido amplamente utilizados para prever o avanço de espécies invasoras (Drake and Bossenbroek 2004; Bossendreol et al. 2007; Kluza and McNyset 2005,

apud, Oliveira 2010), impactos da mudança climática

(Pearson et al., 2002), e padrões espaciais na diversidade de espécies (Graham & Hijmans, 2006). Esses modelos se desenvolveram e se aprimoraram de maneira exponencial nos últimos anos em decorrência da disponibilidade de dados climatológicos e ecológicos em largas escalas espaciais em conjunto com a facilidade de acesso aos Sistemas de Informação

Geográfica, programas de otimização e maior poder computacional (Tôrres, 2012). Os ambientes SIG são imprescindíveis para estudo de ecologia e é impensável não se recorrer a essas ferramentas na construção de modelos de sistemas ambientais, não só por sua capacidade gráfica, mas também pelas potencialidades analíticas e geoestatísticas (Segurado & Jesus, 1999). Para a construção de modelos realísticos e para a validação dos mesmos, é fundamental possuir dados ambientais confiáveis, além de conhecimento científico da biologia da espécie (Oliveira, 2010). Para tanto, o objeto de estudo desta pesquisa é o bivalve de água doce Limnoperna fortunei, o Mexilhão Dourado, que é um molusco natural do Sudeste Asiático, principalmente da China. Esse molusco foi primeiramente encontrado como espécie invasora em Hong Kong, em 1965 (Morton, 1973, apud, Barbosa, 2008). A espécie foi detectada primeiramente na América do Sul, em 1991, nas águas salobras do estuário do Rio da Prata, Balneário de Bagliardi, próximo a Buenos Aires, (Pastorino et.al, 1993). Segundo Darrigran & Pastorino (1995), o aparecimento da espécie, no continente Americano, coincidiu com o aumento do intercâmbio comercial entre a Argentina e a China, existindo uma

Figura 1: Dispersão do Limnoperna fortunei na América do Sul FONTE: Mader Netto, et al, 2011

grande relação entre a dispersão do mexilhão e a água de lastro de navios. Desde então o Mexilhão Dourado vem espalhando-se pela bacia do Rio da Prata e do Rio Paraná (Darrigran, 2000). Sendo que, no ano de 1999, o Mexilhão encontrava-se em cinco países sul-americanos: Argentina, Brasil, Bolívia, Paraguai e Uruguai (Barbosa, 2008). No Brasil a ocorrência da espécie limita-se às Bacias do Rio Paraná, Paraguai e Lago Guaíba – RS, e em Minas Gerais, a primeira ocorrência registrada do Limnoperna fortunei foi à montante da usina hidrelétrica de Ilha Solteira, em 2004 (Barbosa, 2008).

2. OBJETIVOS: 2.1. OBJETIVO GERAL: O objetivo da pesquisa é utilizar parâmetros limnológicos e hirológicos de sistemas fluviais e lacustres e espacializar tais informações, buscando identificar e mapear áreas com condições ambientais favoráveis à invasão biológica da espécie Limnoperna fortunei, o Mexilhão Dourado.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ! Construção de banco de dados com informações de variáveis limnológicas e hidrológicas; ! explorar as capacidades potenciais de Sistemas de Informação Geográfica para a modelagem de distribuição potencial de espécies invasoras; ! desenvolvimento de mapas de potencial de invasão pela espécie L. fortunei para determinadas bacias hidrográficas do Estado de Minas Gerais; ! identificação de áreas prioritárias para combate e prevenção à invasão da espécie L. fortunei, através do mapeamento de tais áreas; ! contribuir para as tomadas de decisões no controle da invasão do Mexilhão Dourado.

3. PROBLEMATIZAÇÃO: A invasão do mexilhão dourado tem provocado diversos impactos econômicos e ambientais. O Mexilhão interfere na reprodução de espécies nativas e causa prejuízos e desequilíbrio nos ecossistemas onde se instala. Devido a sua capacidade de se aderir a superfícies duras e formar crostas que podem cobrir áreas extensas, esta espécie tem causado grandes prejuízos

à indústrias, hidrelétricas, lavouras e outros segmentos, pois causam obstruções nos canais, filtros, tubulações e sistemas de drenagem. O Mexilhão Dourado consome grande parte dos alimentos de mexilhões nativos contribuindo para a sua extinção. Tal espécie contribui também para a mortandade de peixes que não conseguem digeri-los e também de animais como alguns crustáceos e outros moluscos, já que grudam em suas superfícies e os impedem de se locomover, defender e alimentar. A justificativa de tal trabalho é, portanto, contribuir para as estratégias e ações a serem tomadas tendo em vista a manutenção do equilíbrio dos ecossistemas fluviais e lacustres, para a preservação de espécies naturais da biota dos rios brasileiros, e também no controle dos impactos econômicos causados pela espécie.

4. METODOLOGIA: Os Sistemas de Informação Geográfica fornecem ferramentas que permitem a organização, vizualização e correlação de dados espacializados, e assim, realizam valiosas análises quantitativas e qualitativas (Chakraborti, et al., 2002). A distribuição potencial da espécie Limnoperna fortunei será elaborada a partir de ambiente SIG (Sistemas de Informação Geográfica), utilizando dados físico-químicos da água, que são coletados e medidos pontualmente, e tornando tais informações, que são contínuas, em informações discretas, a partir de pacotes estatísticos oferecidos por ferramentas do software ArcGis da ESRI.

4.1.ESTABELECIMENTO da ÁREA AMOSTRAL: A predição da distribuição potencial do Mexilhão Dourada foi realizada para o território dos Estados Unidos da América. Os modelos foram desenvolvidos utilizando dados limnológicos obtidos a partir do site US Geological Servey no programa NWQA (National Water Quality Assentment). Foram utilizados dados de 241 estações de coletas para a variável temperatura da água, 154 estações para a variável pH e 81 para a variável cálcio. Sendo que foram selecionados os valores referentes ao máximo, minimo e média de cada um desses parâmentros limnológicos. Os dados são referentes aos anos de 2010, 2011 e 2012.

4.2. CONSTRUÇÃO DAS CAMADAS AMBIENTAIS As camadas ambientais foram construídas a partir de variáveis ambientais definidas em função de valores de referência de sobrevivência do Mexilhão Dourado, que foram propostos por Mackie & Claudi, 2010.

Figura 2: Valores de referência para sobrevivência do Limnoperna fortunei. Fonte: Mackie & Claudi, 2010.

As variáveis limnológicas angariadas nos modelos para os Estados Unidos foram temperatura da água, pH, cálcio, clorofila a, turbidez, condutividade, oxigênio dissolvido e alcalinidade. A caracterização abiótica de rios, porém, é realizada de maneira pontual com dados disponíveis em pontos amostrais de água. Portanto, para tornar informações discretas em contínuas, utilizou-se o método de interpolação IDW (Inverse Dintance Weitghed), uma vez que, também intenta-se trabalhar com valores das máximas, mínimas e médias dos parâmetros físicoquímicos obtidos. Tal interpolador não reduz significativamente a amplitude existente nos dados, somente suaviza diferenças abruptas quando existentes, sendo essa uma razão da eventual escolha.

4.3. MÉTODO DE INTERPOLAÇÃO IDW: A interpolação é um processo que permite, a partir de dados de locais de amostragem, estimar valores para o resto de toda superfície. Qualquer valor de uma localização deverá ser estimado com base nos valores dos pontos mais próximos. O processo, assim, é uma ferramenta que estima valores desconhecidos a partir de valores conhecidos (Varella, et al, 2008). O interpolador IDW utiliza o modelo estatístico denominado “Inverso das Distâncias” e implementa literalmente o conceito de auto correlação espacial. Esse processo não considera

determinados padrões existentes nos dados. Caso haja variações abruptas nos dados, ele suaviza essas diferenças. O IDW não faz estimações acima, ou abaixo dos valores existentes na amostra. O modelo consiste em se multiplicar os valores das amostras pelo inverso das suas respectivas distâncias ao ponto de referência para a interpolação dos valores (Varella, et al, 2008).

∑

i =1

∑

i =1

1 zi di 1 di

Em que, z = valores estimados; n = número de amostras; zi = valores conhecidos; di = distâncias entre os valores conhecidos e estimados ( zi e z).

Eaquação 1: Interpolador IDW (Varella, et al,2008).

5. DESENVOLVIMENTO E ANÁLISE DE RESULTADOS Os modelos gerados apontam as regiões com características ambientais compatíveis às necessidades ecológicas da espécie Limnoperna fortunei, indicando o potencial risco de invasão desse bivalve invasor em quatro distintas categorias: Baixo potencial de invasão, potencial moderado, alto potencial de invasão e nenhuma possibilidade de invasão da espécie. Tais modelos resultam em mapas da distribuição potencial da espécie que são referentes aos Estados Unidos da América e Minas Gerais.

5.1. MODELOS para os ESTADOS UNIDOS da AMÉRICA: Inicialmente, foram realizados modelos pontuais, em uma etapa considerada como etapa teste da modelagem do nicho ambiental do Mexilhão Dourado. Para tal foram utilizadas as variáveis: pH, Oxigênio Dissolvido, Cálcio, Clorofila, Temperatura da água, Condutividade e Turbidez. Tais dados foram obtidos através do programa

.Cada variável passou por uma análise

separada e em seguida todas foram somadas através da ferramenta “Raster Calculator” do Spatial Analyst, do ArcGis 10.1. Levando-se em consideração todos os parâmetros limnológicos o modelo apresentou alta susceptibilidade de invasão em todos os pontos amostrais analisados.

Figura 3: Mapa Risco de Potencial de Invasão (todas as variáveis)

Figura 4: Mapa Risco de Potencial de Invasão (Cálcio e Turbidez)

A resposta do modelo para as variáveis Turbidez e Cálcio apresentou 2 estações com baixa probabilidade de invasão. A pequena rede amostral adotada nessa etapa preliminar do projeto enfraquece o resultado do modelo e seu realismo, o fato de se trabalhar com valores médios das variáveis angariadas, em um determinado período de tempo também enfraquece o modelo, uma vez que não vela em consideração sazonalidades que podem ser preponderantes na tolerância dos indivíduos da espécie à determinados fatorem ambientais. Os modelos envolvendo a rede de dados obtida através do programa NWQA (National Water Quality Assentment), representam um importante avanço com relação aos anteriores, pois se trabalhou com uma rede amostral mais ampla, além de terem sido adotados os valores máximos, mínimos e médios. Os dados da qualidade da água, coletados pontualmente, também foram interpolados, através de ferramentas do ambiente de Sistemas de Informação Geográfica. Como resultado foram gerados mapas da potencial distribuição do Limnoperna fortunei, representando as variáveis temperatura da água, pH e cálcio, com os valores médios, mínimos e máximos de cada um desses parâmetros.

Figura 5: Mapa Temperatura máxima Estados Unidos

Figura 6: Mapa Temperatura mĂnima Estados Unidos

Figura 7: Mapa Temperatura mĂŠdia Estados Unidos

Figura 8: Mapa Cálcio máximo Estados Unidos

Figura 9: Mapa Cálcio mínimo Estados Unidos

Figura 10: Mapa Cálcio médio Estados Unidos

Figura 11: Mapa pH máximo Estados Unidos

Figura 12: Mapa pH mĂnimo Estados Unidos

Figura 13: Mapa pH mĂŠdio Estados Unidos

O resultado das camadas ambientais referentes à variável temperatura da água (ºC) demonstra que sazonalmente, este fator pode ser limitador da presença do Limnoperna fortunei em determinadas regiões, principalmente as áreas mais setentrionais. Uma vez que, baixas temperaturas da água (<5ºC) pode ser um fator ambiental de não sobrevivência da espécie. Em geral, o sul e sudoeste dos Estados Unidos correspondem à regiões que apresentam alto e moderado potencial de invasão do Mexilhão Dourado considerando-se a temperatura da água. Devido à elevada resistência da espécie ao Cálcio, tal variável não se põe como um fator limitante à presença do Mexilhão. Em geral, tanto as máximas, quanto as mínimas e médias apresentam alto potencial de invasão em grande parte das áreas. Valores muito altos podem ser restringentes a sobrevivência da espécie. Tal fator pode ser obreservado no mapa Cálcio Max. IDW, em áreas destacadas na cor vermelho, indicando baixo potencial de invasão do bivalve. A variável potencial hidrogeniônico (pH) também se põe como uma condição ambiental que favorece a invasão do Mexilhão Dourado na área de estudo. São poucas as regiões com valores desta variável que condicionam baixo potencial de invasão, grande parte das áreas apresenta alto ou moderado risco da presença da espécie invasora.

6. CONCLUSÕES Apesar de não se tratar de um método usual na modelagem, a utilização dos métodos de interpolação espacial para criar camadas ambientais de diferentes parâmetros limnológicos que indicam áreas de maior adequabilidade ambiental à ecologia da espécie, apresentou resultados satisfatórios e interessantes. Entretanto, o modelo por se se apoiar muito sobre o conhecimento da espécie é essencial que o mesmo seja bem consolidado. Há uma grande lacuna em estudos sobre a tolerância da espécie para algumas variáveis ambientais, os estudos da ecologia da espécie na fase larval ainda é incipiente, a ausência de estudos com larvas ignora uma fase de vida extremamente importante e a principal responsável pela dispersão da espécie. De acordo com os resultados expostos, em termos de condições ambientais compatíveis às necessidades ecológicas do Mexilhão Dourado, os Estados Unidos, em geral, apresentam alto potencial de invasão dessa espécie em grande parte do seu território.

7. RECOMENDAÇÕES Um desenvolvimento posterior do projeto poderá ser realizado tendo como área amostral definida para o estado de Minas Gerais, com dados obtidos através do programa Água de Minas do IGAM. Esse programa é responsável pelo monitoramento da qualidade das águas superficiais e subterrâneas de Minas Gerais desde 1997, e monitora a qualidade das águas a partir de coleta trimestral nas oito principais bacias do Estado. Atualmente a rede básica de monitoramento conta com 448 estações de amostragem distrbuídas nas bacias hidrográficas dos rios São Francisco, Grande, Doce, Paranaíba, Paraíba do Sul, Mucuri, Jequitinhonha, Pardo, Barunhém, Itapemirim, Itabapoana, Itanhém, Itaúnas, Jucuruçu, Peruípe, São Mateus e Piracicaba / Jaguari. Existem tembém mais 172 de redes de amostragem específicas, denominadas redes dirigidas, que são direcionadas para as bacias dos rios Paracatu e da Pampulha e também na bacia do rio das Velhas e Verde Grande (IGAM, pág. 5, 2013).

Figura 14: Mapa Temperatura máxima Estados Unidos

Para se obter modelos mais amplos e realísticos, um tratamento de dados mais profundo deve ser realizado. Para tanto a interpolação de dados, para completar informações ausentes no banco de dados, além da correlação entre diferentes parâmetros a fim de se estabelecer graus de correlação entre eles pode ser realizado. Além disso, outras variáveis ambientais relacionadas à declividade de sistemas fluviais e força de cisalhamento de rios também podem ser cruzadas com variáveis limnológicas através de ambiente SIG.

8. REFERÊNCIAL BIBLIOGRÁFICO

Barbosa F. G. Invasões Biológicas e Limnoperna fortunei. 2008. REB Volume 1 (4): 31-45, 2008. ISSN 1983-7682. Barbosa, F.G. & Melo, A.S. 2009. Modelo preditivo de sobrevivência do Mexilhão Dourado (Limnoperna fortunei) em relação a variações de salinidade na Laguna dos Patos, RS, Brasil. Biota Neotrop. 2009, 9(3): 000-000. Bezerra, D. P.; Campos, M. C. S., 2010. Modelagem da distribuição potencial da espécie invasora Limnoperna fortunei, Mexilhão Dourado. Relatório final de atividades. Programa Institucional de Iniciação Científica - CETEC FAPEMIG. Chakraborti, R. K.; Kaur, J.; De Pinto, J. V., 2002. Analysis of factors affecting Zebra Mussels (Dreissena polymorpha) growth in Saginaw Bay: a Gis-based modeling approach. J. Great Lakes Ressearch. 28(3):396-410. Darrigran, G. A., 2000. Invasive freshwater bivalve of the Neotropical Region.Dreissena. Sea Grant. New York: v.11, 2:7 – 13. Darrigran, G., Pastorino, G., 1995. The recent introduction of Asiatic Bivalve, Limnoperna fortunei (Mytilidae) into SouthAmerica. The Veliger38 (2); 183-187. Darrigran & Damborenea, 2006. (Eds.) Bio-invasion del mejillón dorado en el continente americano. Edulp, La Plata, 2006. 220 pág. Elith J., Leathwick J. R. 1997. Species Distribution Models: Ecological Explanation and rediction Across Space and Time. Annual Review of Ecology, Evolution and Systematics. 2009. 40:677–97.

Etchebehere, M. L. C.; Saad, A. R.; Santoni, G.; Casado, F. C. & Fulfaro, V. J. 2006. Detecção de prováveis deformações neotectônicas no vale do rio do Peixe, Região Ocidental Paulista, mediante aplicação de índices RDE (Relação Declividade-Extensão) em segmentos de drenagem. Revista UNESP – Geociências, v.25, n. 3, p.271-287, 2006. Faria, E. A., Branco, J. R. T., Campos, M. C. S., Oliveira, M. D., Rolla, M. E., 2006. Estudo das características antiincrustantes de materiais. REM: R. Esc. Minas, Ouro Preto, 59(2): 233-238, abr. jun. 2006. Galvão, D. D.; Campos, M. C. S., 2012. Uso do Maxent para a modelagem da distribuição da espécie Limnoperna fortunei. Relatório final de atividades. Programa Institucional de Iniciação Científica - CETEC FAPEMIG. Graham, C. H., & Hijmans, R. J. 2006. A comparison of methods for mapping species ranges and species richness. Global Ecology and Biogeography 15: 578-587. IGAM, 2013. Monitoramento da Qualidade das Águas Superficiais em Minas Gerais em 2012. Resumo

Executivo.

http://www.igam.mg.gov.br/images/stories/qualidade/2013/resumo-

executivo-agua-superficial-2012.pdf Mackie, G. L. and R. Claudi. Monitoring and control of macrofouling mollusks in fresh water systems. CRC Press, Boca Raton, FL. 508 pp, 2010. Mader Netto, O. S., 2011. Controle da incrustação de organismos invasores em materiais de sistemas de resfriamento de usinas hidrelétricas. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia - PIPE. 2011. 112 Oliveira M. D., Calheiros D. F., Jacobi C. M., Hamilton S. K., 2010 Abiotic factors controlling the establishment and abundance of the invasive golden mussel Limnoperna fortunei. Biol Invasions (2011) 13:717–729. Pastorino, G. et al., 1993 !Limnoperna fortunei (Dunker, 1857) (Mytilidae), nuevo bivalvo invasor em águas del Rio de la Plata!. Neotrópica, v. 39, p.101-102, 1993. Pestana, D., Ostrensky, A., Tschá, M.K., Boeger., WA. 2010. Prospecção do molusco invasor Limnoperna fortune (Dunker, 1857) nos principais corpos hídricos do estado do Paraná, Brasil. Papéis Avulsos de Zoologia. Museu de zoologia da Universidade de São Paulo. Volume 50(34): 553-559, 2010.

Pearson, R. G., Dawson, T. P., Berry, P. M., & Harrison, P. A. 2002. SPECIES : A Spatial Evaluation of Climate Impact on the Envelope of Species. Ecological Modelling 154: 289- 300. Rodder. D., Schmidtlein. S., Veith. M., Lotters. S., 2009. Alien Invasive Slider Turtle in Unpredicted Habitat: A Matter of Niche Shift or of Predictors Studied? PLoS ONE 4(11): e7843. 2009. Segurado, P. Jesus, B., 1999. Aplicação de sistemas de informação geogáfica nas diferentes fases de um estudo ecológico Simeão, C. M. G., 2011. Influência da variação de velocidade e pressão sobre Limnoperna fortunei Dunker 1857 (bivalvia, mytilidae) e verificação dos efeitos da toxicidade do látex de Euphorbia splendens var hislopii N.E.B (Euphobiaceae) para esta espécie. Belo Horizonte 2011. Souza, D. V.; Martins, A. N.; Faria, A. L. P., 2011. Aplicação do Índice de Hack (SL) a um trecho do Rio Zêzere, Portugal. Revista Brasileira de Geomorfologia. V.12. Nº1 (2011). Torres, N. M., Vercillo, U. E., 2012. Como ferramentas de modelagem de distribuição de espécies podem subsidiar acções do governo? Natureza e Conservação. 10(2)228-230. December 2012. Varella, C. A. A., Sena Junior, D. G., Estudo do interpolador IDW para utilização em agricultura de precisão. IT190 – Princípios em agricultura de precisão. Seropédica Rio de Janeiro, 2008.

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA E TECNOLÓGICA – PIBIC/PIBIT FUNDAÇÃO CENTRO TECNOLÓGICO DE MINAS GERAIS – CETEC

Modelo dinâmico da dispersão quantitativa do Limnoperma fortunei Relatório Final de Projeto de Iniciação Científica

Bolsista: Gabriel Cardoso Salgado Orientador: Mônica Campos

Número de meses trabalhados pelo bolsista nesta pesquisa: 12 meses

Belo Horizonte, 20 de Fevereiro de 2013.

Resumo A modelagem é uma ferramenta matemática bastante importante com aplicações em diversas áreas da ciência e engenharia. Com ela é possível elaborar modelos de estimação do comportamento de variáveis de interesse em determinados processos. Na aplicação do estudo, o processo é a expansão da distribuição de uma espécie invasora. Então o modelo a ser levantado é do tipo Modelo de Distribuição de Espécies (MDE). A espécie invasora em estudo é chamada Limnoperma fortunei (Dunker, 1857), conhecido como mexilhão-dourado. O L. fortunei é um molusco bivalve de origem na China que tem se espalhado pelo mundo através do fluxo de grandes embarcações. O motivo de essa espécie ser estudada e modelada é que se tornou um problema para a Cemig por causa de seu comportamento natural de se agarrar facilmente em superfícies e consequentemente entupir as tubulações das usinas. Além disso, sabe-se que essa espécie é bastante robusta às condições ambientais, tem rápida maturação sexual e reprodução. Utilizando o framework Qt, está sendo feito um software em C++ para obter um modelo fuzzy dinâmico da população do L. fortunei. Nesse software, o usuário entra com dados das variáveis ambientais, dados de registros da espécie como número de mexilhões adultos e de larvas em determinado ponto de coleta. A saída é um modelo do comportamento da população do L. fortunei tanto adultos como larvas em função das variáveis de entrada, que são as variáveis ambientais. As variáveis de entrada e de saída se referem a um volume de estudo divido em vários espaços denominados células de Von Neumman. Dessa maneira a modelagem é feita em um ambiente amplo com vários espaços na qual o modelo fuzzy é implementado. O software ainda permite executar simulações de previsões da população. PALAVRAS-CHAVE: modelagem, fuzzy, sistemas nebulosos, Limnoperma fortunei, mexilhão dourado, células de Von Neumman.

! !

Sumário 1.!

Introdução ................................................................................................... 6!

2.!

Objetivos ..................................................................................................... 7!

3.!

Modelagem Matemática ............................................................................. 8! 3.1.! Tipos de Modelo ..................................................................................... 8! 3.1.1.! Estático x Dinâmico ......................................................................... 8! 3.1.2.! Linear x Não-Linear ......................................................................... 8! 3.1.3.! Siso x Mimo ..................................................................................... 9! 3.1.4.! Paramétrico x Não-Paramétrico ....................................................... 9! 3.1.5.! Invariantes no Tempo x Variantes no Tempo .................................. 9! 3.1.6.! Em Tempo Contínuo x Em Tempo Discreto ................................. 10! 3.1.7.! A Parâmetros Concentrados x A Parâmetros Distribuídos ............ 10! 3.1.8.! Determinísticos x Estocásticos....................................................... 11! 3.2.! Obtenção de um Modelo ....................................................................... 11! 3.2.1.! Modelagem Fenomenológica ......................................................... 11! 3.2.2.! Modelagem Empírica ..................................................................... 12! 3.3.! Tipo de Modelo e Obtenção Nessa Aplicação ...................................... 12!

4.!

Modelo Nebuloso ..................................................................................... 14! 4.1.! Conjuntos Nebulosos ............................................................................ 14! 4.2.! Operadores Nebulosos .......................................................................... 16! 4.3.! Funções de Pertinência ......................................................................... 19! 4.3.1.! Função Degrau ............................................................................... 19! 4.3.2.! Função Pulso .................................................................................. 19! 4.3.3.! Função Triangular .......................................................................... 20! 4.3.4.! Função Trapezoidal ........................................................................ 21! 4.3.5.! Função Gaussiana .......................................................................... 22! 4.3.6.! Função Seno-Generalizada ............................................................ 22!

4.3.7.! Função Senoidal ............................................................................. 23! 4.4.! Modelos Nebulosos ............................................................................... 24! 4.4.1.! Modelo de Mamdani ...................................................................... 24! 4.4.2.! Modelo de Takagi-Sugeno ............................................................. 25! 5.!

Programação ............................................................................................. 27! 5.1.! Células de Von Neumman .................................................................... 27! 5.2.! Definição das Variáveis ........................................................................ 28! 5.3.! Tempo em Estudo ................................................................................. 29! 5.4.! Entrada de Dados .................................................................................. 29! 5.5.! Definição de Conceitos ......................................................................... 30! 5.6.! Definição de Regras .............................................................................. 32! 5.7.! Treinamento do Modelo ........................................................................ 33! 5.8.! Validação do Modelo ............................................................................ 37! 5.9.! Simulação .............................................................................................. 37!

6.!

Futuras Expectativas ................................................................................. 38!

Referências Bibliográficas .................................................................................. 39!

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Lista de Figuras Figura 4.1: Grau de pertinência em função do valor para o conjunto A – números próximos de 10. Autor: Gabriel Cardoso Salgado .......................................................... 15 Figura 4.2: Grau de pertinência em função do valor para o conjunto B - números distantes de 14. Autor: Gabriel Cardoso Salgado ........................................................... 15 Figura 4.3: Grau de pertinência em função do valor para o conjunto C – números não próximos de 10. Autor: Gabriel Cardoso Salgado ................................................... 16 Figura 4.4: Grau de pertinência em função do valor para o conjunto D – números não distantes de 14. Autor: Gabriel Cardoso Salgado .................................................... 17 Figura 4.5: Grau de pertinência em função do valor para o conjunto E (intercessão entre A e B) – números próximos de 10 e distantes de 14. Autor: Gabriel Cardoso Salgado ............................................................................................................. 17 Figura 4.6: Grau de pertinência em função do valor para o conjunto F (união entre A e B) – números próximos de 10 ou distantes de 14. Autor: Gabriel Cardoso Salgado ........................................................................................................................... 18 Figura 4.7: Grau de pertinência em função do valor para o conjunto A intensificado (muito e pouco) – números próximos de 10, números muito próximos de 10 e números pouco próximos de 10. Autor: Gabriel Cardoso Salgado ........................ 18 Figura 4.8: Função de pertinência em degrau. Autor: Gabriel Cardoso Salgado 19 Figura 4.9: Função de pertinência de pulso. Autor: Gabriel Cardoso Salgado .. 20 Figura 4.10: Função de pertinência triangular. Autor: Gabriel Cardoso Salgado ........................................................................................................................................ 21 Figura 4.11: Função de pertinência trapezoidal. Autor: Gabriel Cardoso Salgado ........................................................................................................................................ 21 Figura 4.12: Função de pertinência gaussiana. Autor: Gabriel Cardoso Salgado ........................................................................................................................................ 22 Figura 4.13: Função de pertinência seno-generalizada. Autor: Gabriel Cardoso Salgado ........................................................................................................................... 23 Figura 4.14: Função de pertinência senoidal. Autor: Gabriel Cardoso Salgado. 23 Figura 5.1: Funções de pertinência dos conjuntos nebulosos da temperatura. Autor: Gabriel Cardoso Salgado..................................................................................... 31 Figura 5.2: Fluxograma do algoritmo do gradiente descendente para treinamento do modelo nebuloso. Autor: Gabriel Cardoso Salgado .................................................. 36

1. Introdução Um modelo de distribuição de espécies serve para obter uma descrição matemática do comportamento da população de uma espécie invasora de um ambiente em função das características do ambiente. Com isso é possível obter uma previsão estatística da capacidade da dispersão e multiplicação da espécie. (Rodder, 2009) Segundo Eykhoff (1974), um modelo matemático é uma representação dos aspectos essenciais de um sistema, que apresenta conhecimento desse sistema em uma forma utilizável. Denn (1986) descreve um modelo matemático como sendo um sistema de equações em que dado um conjunto de dados de entrada, a solução é representativa da resposta do processo. Uma definição mais simples, de Seborg et al (2001) descreve um modelo matemático como sendo nada mais que uma abstração matemática de um processo real. A simulação é a obtenção da série temporal das variáveis de interesse para um dado conjunto de dados de entrada, um modelo formado e condições de contorno das variáveis de saída. (Garcia, 2005)

6! !

2. Objetivos O objetivo deste trabalho é elaborar uma ferramenta computacional para modelagem de população de espécies e usá-la para levantar um modelo da população do Limnoperma fortunei, permitindo a outras pesquisas fazer um estudo mais detalhado de previsões da distribuição da população dessa espécie em determinadas áreas em estudo.

7! !

3. Modelagem Matemática A ferramenta matemática modelagem é apresentada de forma detalhada neste capítulo. Os tipos de modelos e formas de obtenção são revisados e é relatado a escolha do tipo e forma de obtenção para essa aplicação. 3.1. Tipos de Modelo Um modelo matemático pode ser classificado segundo suas características. As classificações mais comuns são: 3.1.1. Estático x Dinâmico Um modelo estático não tem memória e a sua saída permanece inalterada. A entrada para um modelo estático são apenas valores constantes e não séries temporais de variáveis de entrada. Equações algébricas são suficientes para descrever um modelo estático. Um modelo dinâmico tem como entrada séries temporais das variáveis de entrada e a saída são séries temporais influenciadas pelas entradas. Consiste de uma parte transitória das saídas e depois de uma parte em regime permanente após as saídas se estabilizarem. A representação desse tipo de modelo é mais complexa que simples equações algébricas, sendo necessária, por exemplo, equações diferenciais. 3.1.2. Linear x Não-Linear Um modelo é linear se uma variável de saída é função linear de suas derivadas e das outras variáveis, de entrada e de saída, e suas derivadas. Nesse caso, cada variável de saída pode ter seu valor instantâneo expresso como combinação linear dos valores instantâneos das suas derivadas, das outras variáveis de saída e suas derivadas e das variáveis de entrada e suas derivadas. Uma regra básica de uma função linear é o princípio da superposição. Dada uma entrada !! ! resultando em uma saída !! ! , outra entrada !! ! resultando em uma saída !! ! aplicadas a uma condição inicial !! = 0 na saída, a resposta do modelo a uma entrada !! ! = !!! ! + !!! ! será !! ! = !!! ! + !!! ! . 8! !

Um modelo não-linear tem alguma forma diferente de combinação linear na equação que o representa. Então esse tipo de sistema não obedece ao princípio de superposição. Existem diversos tipos de modelos apropriados para representar e obter aproximações mais exatas das não-linearidades de um sistema como, por exemplo, os modelos de Hammerstein e de Wiener, representações NARX, redes neurais artificiais, modelo nebuloso dentre outros. 3.1.3. Siso x Mimo Um modelo Siso (single input single output) é um modelo que representa a influência de apenas uma entrada para apenas uma saída. Se o modelo admitir mais de uma entrada para uma única saída, torna-se do tipo Miso (multiple inputs single output) e se tiver várias entradas influenciando várias saídas então passa a ser do tipo Mimo (multiple inputs multiple outputs). 3.1.4. Paramétrico x Não-Paramétrico Um modelo é dito paramétrico se a saída for obtida a partir das entradas aplicadas a uma função que contém os parâmetros do modelo. Esse tipo de modelo é obtido escolhendo-se a forma das equações e os valores dos parâmetros adequados para obter uma saída razoavelmente próxima da saída do processo para uma determinada entrada. Alguns exemplos de modelos paramétricos são funções de transferência, equações diferenciais e equações de espaço de estados. Por outro lado, um mesmo processo que pode ser representado ou não por modelo paramétrico pode ser representado por um modelo não-paramétrico na forma de tabelas ou gráficos. 3.1.5. Invariantes no Tempo x Variantes no Tempo Um modelo invariante no tempo é uma representação apropriada para sistemas que não têm influência do tempo sobre a saída. A saída seria influenciada apenas pela entrada. Então um modelo paramétrico invariante no tempo tem seus parâmetros constantes.

9! !

Na forma matemática, se um modelo é invariante no tempo e uma entrada !! ! resulta na saída !! ! , então a entrada !! ! = !! ! − ! aplicada a esse modelo resulta em uma saída !! ! = !! ! − ! . Mas se um modelo tiver influência do tempo sobre a saída então é variante no tempo e não obedece a regra da invariância no tempo. Mas uma solução para representar um modelo variante no tempo como um modelo invariante no tempo seria acrescentar uma variável de entrada que é o tempo, ou pelo menos uma determinada função do tempo. 3.1.6. Em Tempo Contínuo x Em Tempo Discreto Um modelo em tempo contínuo pode gerar uma saída de tempo contínuo para as entradas que também podem ser sinais em tempo contínuo. Mas esse tipo de modelo é uma representação puramente matemática. Na prática, com o uso de computadores, um modelo é de tempo discreto. Nesse caso a saída é descrita em pontos discretos no tempo. Esses pontos são assumidos como equidistantes entre si e a distância temporal entre dois pontos consecutivos é o tempo de amostragem. Escolhendo-se um tempo de amostragem adequado, um modelo de tempo discreto pode servir para fazer uma representação próxima do que um modelo de tempo contínuo faria. Basicamente a diferença se refere à representação dos sinais de entrada e saída como sendo em tempo contínuo ou discreto. 3.1.7. A Parâmetros Concentrados x A Parâmetros Distribuídos Um modelo é dito do tipo a parâmetros concentrados se variações no espaço não influenciam na saída. Então variações das propriedades espaciais são desprezadas e o volume de controle é visto como sendo homogêneo. Se a posição de determinado ponto no volume de controle influencia na saída, então a posição influencia também nos parâmetros do modelo paramétrico. Nesse caso o modelo é do tipo a parâmetros distribuídos. Todo sistema real é distribuído. Mas um modelo a parâmetros distribuídos é extremamente complexo, sendo representado por infinitas equações diferenciais. Mas 10! !

um sistema distribuído pode ser aproximado por um número finito de subsistemas representados por modelos a parâmetros concentrados. Cada modelo representaria uma região do sistema em que as variações no espaço teriam efeito desprezível sobre a saída. No entanto vale lembrar que os parâmetros de cada modelo que representa cada região seriam diferentes como se representassem sistemas distintos, mas que podem ser semelhantes. 3.1.8. Determinísticos x Estocásticos Um modelo determinístico pode ter a saída perfeitamente calculada em função das entradas e das condições iniciais sem nenhum processo de geração de número aleatório para influenciar no cálculo. Um modelo estocástico contém a geração de números aleatórios que influenciam na geração do sinal de saída. Normalmente a parte estocástica de um modelo serviria para representar perturbações de entradas ou ruídos na saída para fins de simulação. 3.2. Obtenção de um Modelo Uma vez determinado o tipo apropriado de modelo matemático para representar um sistema, o próximo passo é a obtenção do modelo. Se for um modelo paramétrico, a obtenção do modelo implica na obtenção dos parâmetros. O processo completo de obtenção de um modelo pode ser uma ou combinação das seguintes formas: (Garcia, 2005) 3.2.1. Modelagem Fenomenológica A modelagem fenomenológica consiste em obter os parâmetros do modelo a partir de equações bem definidas pelas “leis da natureza” como, por exemplo, leis da mecânica, termodinâmica, eletromagnetismo, balanços e por equações já determinadas anteriormente por experimentos que são chamadas de relações constitutivas. A importância desse tipo de modelagem é saber como os parâmetros físicos do processo interferem nos parâmetros do modelo. Assim, uma aplicação que envolve projeto e controle de um processo tem influência direta com o resultado desse tipo de modelagem. 11! !

Alguns parâmetros que aparecem nas equações já definidas são obtidos por experiências anteriores, definição de constantes ou cálculos. Mas existem parâmetros que só são obtidos experimentalmente. Então apesar dessa modelagem ser teórica, necessita de experimento prático para ser formulada com números e não apenas escritas algebricamente. Um ponto que falta nessa modelagem é a representação das perturbações, que normalmente não são previstas em leis matemáticas. Mas tais perturbações não deixam de existir, sendo importante a representação dessas no modelo. 3.2.2. Modelagem Empírica A modelagem empírica é chamada de identificação de sistemas. Consiste em identificar um modelo a partir de entradas e saídas obtidas experimentalmente. O modelo resultado dessa análise é válido para a região de operação em que as entradas e saídas foram medidas. Uma vantagem desse modelo é que não é necessário conhecer o sistema a fundo com leis já definidas. Por esse motivo é muito comum se referir a esse tipo de modelagem como modelagem em caixa preta, enquanto a modelagem fenomenológica é referida como modelagem em caixa branca. Além dessa vantagem, outra é que as perturbações estarão presentes nas entradas medidas. Então o modelo resultado da análise incorpora a presença das perturbações. 3.3. Tipo de Modelo e Obtenção Nessa Aplicação Para este estudo do Limnoperma fortunei, foi escolhido um modelo dinâmico, não-linear, mimo, paramétrico, invariante no tempo, em tempo discreto a parâmetros concentrados e determinístico. O tipo de modelo não-linear escolhido foi o modelo nebuloso. O fato de ser um modelo dinâmico significa que a saída do modelo será uma série temporal de saída prevista para um dado conjunto de dados de entrada. O sistema será do tipo mimo porque são várias entradas que interferem na população do L. fortunei e a saída será expressa como a população do mexilhão adulto e das larvas. 12! !

O modelo é paramétrico, sendo então representado por equações com parâmetros a serem determinados. Como se trata de um sistema nebuloso, os parâmetros do modelo são parâmetros de funções de pertinências. Apesar de que as estações do ano influenciam no comportamento da população das espécies, o modelo pode ser perfeitamente obtido como invariante no tempo. As alterações decorrentes das estações do ano se refletem nas variáveis ambientais como, por exemplo, temperatura, e essas são variáveis de entrada no modelo. O modelo será obtido em tempo discreto por motivo simples: não é possível e nem necessário obter um modelo em tempo contínuo para essa aplicação. Um tempo de amostragem adequado para várias pesquisas que usem esse modelo pode variar na ordem de semana, mês ou ano. Sabe-se que o L. fortunei tende a se concentrar nas margens dos rios e nas partes fundas. (Barbosa, 2009) Mas mesmo assim o modelo pode ser tomado como a parâmetros concentrados, porque o volume de controle será divido em áreas, de modo que a saída é simplesmente a população do mexilhão e da larva em toda a área, seja no fundo, na margem, em qualquer estrutura em que se possa agarrar ou até mesmo larvas flutuando ao longo dos rios. O modelo será determinístico, sendo privado de geração de números aleatórios. Mas á claro que uma pesquisa que deseje envolver uma entrada estocástica para uma simulação pode fazê-la gerando um componente aleatório em alguma entrada. A forma de obtenção do modelo envolve tanto a modelagem fenomenológica como a empírica. A parte fenomenológica é obtida com descrições e conclusões de pesquisas e experimentos anteriores sobre o Limnoperma fortunei. Então seriam descrições constitutivas. Não serão necessárias equações constitutivas, porque se trata de um modelo nebuloso. Mas é necessário definir conjuntos nebulosos, que são definições para as variáveis de entrada e de saída do modelo. A parte empírica da obtenção do modelo é feita por computador, consistindo em um algoritmo de otimização dos parâmetros do modelo a partir de entradas e saídas registradas. Essa parte é feita por um programa após o usuário definir a parte empírica da obtenção do modelo. 13! !

4. Modelo Nebuloso Um modelo nebuloso pode ser aplicado para se obter uma aproximação funcional, identificação de sistemas, previsão de séries temporais ou classificação de padrões. (Lemos, 2012) Para entender um modelo nebuloso, é necessário entender conceitos de sistemas nebulosos como conjuntos e operadores nebulosos e função de pertinência. 4.1. Conjuntos Nebulosos Uma função de pertinência é uma forma de indicar se um dado valor pertence ou não a um conjunto e informa o valor de pertinência para o qual o valor pertence ao conjunto. Para um dado conjunto ordinário ! e um dado valor !, a função de pertinência !! ! é igual a zero se o valor ! não pertence ao conjunto !. Mas se ! ∈ !, então o valor de pertinência é igual a um. Isso é descrito na equação 4.1. !! ! =

1, 0,

!∈! !∉!

4.1

Se o conjunto ! é um conjunto nebuloso, então a função de pertinência !! ! pode retornar um valor entre zero e um. O retorno entre zero e um significa que o valor ! pertence ao conjunto ! com o dado grau de pertinência do retorno da função !! ! . Por exemplo, seja um conjunto nebuloso ! descrito como números próximos de 10 e dado analiticamente por: !! ! =

0, 1 − 0,5 10 − ! ,

! < 8!!"!! > 12 8 ≤ ! ≤ 12

4.2

Observa-se que para ! = 10, a função de pertinência !! ! retorna um e para valores mais distantes como ! = 1000, a função retorna zero. A figura 4.1 mostra o gráfico da função de pertinência em função do valor !. Nesse exemplo, o valor ! = 11 pertence ao conjunto ! com grau de pertinência 0,5 e o valor ! = 9,8 pertence ao conjunto ! com grau de pertinência 0,9.

14! !

Figura 4.1: Grau de pertinência em função do valor para o conjunto A – números próximos de 10. Autor: Gabriel Cardoso Salgado

Outro exemplo igualmente simples é dado por outro conjunto nebuloso ! descrito como números distantes de 14 e dado analiticamente por: 1, !! ! = 0,25 14 − ! − 0,25, 0,

! < 9!!"!! > 19 9 ≤ ! ≤ 13!!"!15 ≤ ! ≤ 19 13 < ! < 15

4.3

Nesse exemplo, o grau de pertinência de valores distantes de 14 como, por exemplo, o valor ! = −50 é igual a um e para valores próximos de 14 como, por exemplo, o valor ! = 13,8 é igual à zero. A figura 4.2 mostra o gráfico da função de pertinência em função do valor ! para este exemplo.

Figura 4.2: Grau de pertinência em função do valor para o conjunto B - números distantes de 14. Autor: Gabriel Cardoso Salgado

Conforme pode ser visto na figura, para valores não tão próximos de 14 e não tão distantes de 14 como, por exemplo, o valor ! = 11,5 o grau de pertinência é um número entre zero e um. No caso do valor ! = 11,5 o grau de pertinência é !! 11,5 = 0,375.

15! !

4.2. Operadores Nebulosos Um conjunto nebuloso pode ser descrito por uma regra. Nos exemplos das equações 4.2 e 4.3, as regras que descrevem os conjuntos ! e ! são: números próximos de 10; e números distantes de 14. Para uma mesma variável !, que pode assumir valores numéricos, uma das regras pode ser satisfeita e a outra não. Ainda existe a possibilidade de não satisfazer nenhuma ou satisfazer ambas. Utilizando os exemplos dos conjuntos ! e !, pode ser feito alguns outros exemplos de conjuntos !, !, ! e ! descritos por: •

C – Números que não são próximos de 10;

•

D – Números que não são distantes de 14;

•

E – Números que são próximos de 10 e são distantes de 14;

•

F – Números que são próximos de 10 ou são distantes de 14.

As regras que descrevem os conjuntos ! e ! são apenas contradições das regras dos conjuntos ! e !. Então ! é dito complemento de ! e !, complemento de !. O operador nebuloso de complemento é o que modela a regra de contradição com outra. Alguns exemplos de operadores de complemento são o de Zadeh, de Sugeno e de Yager. Utilizando o complemento de Zadeh, da equação 4.4, as figuras 4.3 e 4.4 mostram os gráficos das funções de pertinência dos conjuntos ! e !. !! ! = 1 − !! !

4.4

Figura 4.3: Grau de pertinência em função do valor para o conjunto C – números não próximos de 10. Autor: Gabriel Cardoso Salgado 16! !

Figura 4.4: Grau de pertinência em função do valor para o conjunto D – números não distantes de 14. Autor: Gabriel Cardoso Salgado

A regra do conjunto !, que é satisfazer ambas as regras dos conjuntos ! e ! é modelada como uma intercessão de conjuntos nebulosos. Alguns exemplos de intercessão nebulosa são mínimo, produto, produto limitado e produto drástico. Utilizando o produto, a figura 4.5 mostra o gráfico da função de pertinência do conjunto !, baseando-se nas funções de pertinência dos conjuntos ! e ! aplicados à equação 4.5. !!∩! ! = !! ! !! !

4.5

Figura 4.5: Grau de pertinência em função do valor para o conjunto E (intercessão entre A e B) – números próximos de 10 e distantes de 14. Autor: Gabriel Cardoso Salgado

A regra do conjunto !, que é satisfazer pelo menos uma das regras dos conjuntos ! e ! é modelada como uma união de conjuntos nebulosos. Alguns exemplos de união nebulosa são máximo, soma probabilística, soma limitada e soma drástica. Utilizando a soma probabilística, na equação 4.6, a figura 4.6 mostra o gráfico da função de pertinência do conjunto !. !!∪! ! = !! ! + !! ! − !! ! !! !

17! !

4.6

Figura 4.6: Grau de pertinência em função do valor para o conjunto F (união entre A e B) – números próximos de 10 ou distantes de 14. Autor: Gabriel Cardoso Salgado

Além dos operadores de complemento, união e intercessão existem também operadores de intensidade que podem ser descritas com as palavras-chaves muito e pouco. Para modelar esses conjuntos, basta elevar a função de pertinência original a uma potência maior que um para o operador muito e menor que um para o operador pouco. A figura 4.7 mostra o resultado de operadores de intensidade dados pelas equações 4.7 e 4.8 aplicados ao conjunto !. !!"#$%

! = !! !

!!"#$"

! =

!! !

4.7 4.8

Figura 4.7: Grau de pertinência em função do valor para o conjunto A intensificado (muito e pouco) – números próximos de 10, números muito próximos de 10 e números pouco próximos de 10. Autor: Gabriel Cardoso Salgado

O efeito de intensificar uma regra é aumentar ou diminuir o grau de pertinência para valores periféricos do conjunto nebuloso. Assim, utilizar o operador muito equivale a fazer com que os valores mais próximos ao “centro” do conjunto nebuloso tenham grau bem maior que os valores periféricos do conjunto. Por outro lado, utilizar o operador pouco consiste em fazer com que os valores periféricos tenham grau de pertinência mais expressivo tanto quanto os valores do “centro” do conjunto. 18! !

4.3. Funções de Pertinência Existem algumas funções de pertinência típicas para modelar algumas regras observadas na natureza, em processos industriais e em diversas outras aplicações. Essas funções são mostradas a seguir. 4.3.1. Função Degrau A função degrau modela um conjunto ordinário. Um conjunto ordinário é um caso particular de conjunto nebuloso em que o grau de pertinência de qualquer valor é retornado absolutamente por zero ou um. A equação que descreve essa função é dada pela equação 4.9. Esse conjunto é ilimitado por um dos lados. !! ! =

1, 0,

!≥! !<!

4.9

Figura 4.8: Função de pertinência em degrau. Autor: Gabriel Cardoso Salgado

Esse tipo de função de pertinência é útil para modelar um comportamento ordinário em relação a uma variável. Por exemplo, se a saída assume determinado valor ou comportamento para alguma entrada maior que um parâmetro !, de forma a não suavizar a saída devido a pequenas variações da entrada na borda do degrau. 4.3.2. Função Pulso A função pulso também modela um conjunto ordinário. A diferença entre essa função e a função degrau é que o conjunto modelado por uma função pulso é limitado por ambos os lados. A equação que descreve essa função é dada por:

19! !

!! ! =

1, 0,

!−! ≤! !−! >!

4.10

Figura 4.9: Função de pertinência de pulso. Autor: Gabriel Cardoso Salgado

A aplicação de uma função de pertinência de pulso é semelhante à de degrau. Por exemplo, alguma função de pertinência para entrada discreta com alguns poucos valores no conjunto universo da entrada como a direção que o fluxo de água dos rios toma em determinado ponto. Então quatro funções de pertinência poderiam modelar as direções ortogonais nos seus dois sentidos de forma que a saída é um espelho da entrada. 4.3.3. Função Triangular A função triangular tem grau de pertinência entre zero e um para valores entre o centro e a periferia do intervalo, ao contrário da função pulso que tem apenas grau zero e um para todos os valores da variável independente !. A equação que descreve a função de pertinência triangular é dada por: 0,

! < ! − !! !!"!! > ! + !! !−! 1+ ,!!!!!!!!!!!!!!!! − !! ≤ ! ≤ ! !! !! ! = !−! 1− ,!!!!!!!!!!!!!!!! < ! ≤ ! + !! !!

4.11

20! !

Figura 4.10: Função de pertinência triangular. Autor: Gabriel Cardoso Salgado

A função triangular é útil para diversas situações de modelagem nebulosa. Uma delas é criar vários conjuntos, tal como o das direções do fluxo de água de forma que dois conjuntos vizinhos compartilhem certa região de entrada com grau de pertinência maior que zero e menor que um. Isso pode modelar melhor direções não ortogonais às direções dos conjuntos, fazendo com que a entrada seja, por exemplo, o ângulo com que o fluxo de água em determinado ponto faz com a direção horizontal de um mapa do ambiente de controle. Esse ângulo tem certo grau de pertinência com o conjunto de fluxo horizontal e certo grau de pertinência com o conjunto de fluxo vertical no mapa. 4.3.4. Função Trapezoidal A função trapezoidal tem um formato que lembra o pulso, mas com as beiras suavizadas em rampa. A equação da função trapezoidal é dada por: 0,!!!! < !! − !! !!"!! > !! + !! ! − !! 1+ ,!!!!! − !! ≤ ! ≤ !! !! !! ! = ! − !! 1− ,!!!!! ≤ ! ≤ !! + !! !! 1,!!!!! < ! < !!

Figura 4.11: Função de pertinência trapezoidal. Autor: Gabriel Cardoso Salgado 21! !

4.12

4.3.5. Função Gaussiana A função gaussiana é a mesma usada em probabilidade para distribuição uniforme, porém sem a necessidade de ter a integral numérica igual a um. A equação da função gaussiana é dada por: !! ! = ! !!,!

!!! ! !

4.13

Figura 4.12: Função de pertinência gaussiana. Autor: Gabriel Cardoso Salgado

Esse tipo de função de pertinência é útil para modelar um conjunto dado por determinada condição. Por exemplo, para modelar uma concentração de cálcio ideal para o bom desenvolvimento da Limnoperma fortunei em determinada região ou para modelar uma determinada concentração de mexilhões adultos que leva ao maior aumento da população no local devido a não ser excessivo e acabar prejudicando com disputas intra-específica, mas também não ser escasso. 4.3.6. Função Seno-Generalizada A função seno generalizada tem um formato que lembra o pulso e o trapézio, dessa vez com as beiras suavizadas em formato semelhante a uma senóide. A equação da função seno-generalizada é dada por: !! ! =

1 !−! 1+ !

4.14

22! !

Figura 4.13: Função de pertinência seno-generalizada. Autor: Gabriel Cardoso Salgado

A função seno-generalizada é uma boa forma de modelar conjuntos dados por determinada condição de entrada mediana. Por exemplo, pode ser útil para modelar, por exemplo, a temperatura amena, pH médio, concentração média de cálcio, salinidade média da água dentre outras condições medianas. 4.3.7. Função Senoidal A função senoidal tem um formato semelhante ao do degrau, mas com borda suavizada em formato semelhante a uma senóide. A função senoidal é dada por: !! ! =

1 1 + ! !!

!!!

4.15

Figura 4.14: Função de pertinência senoidal. Autor: Gabriel Cardoso Salgado

Essa função é útil para modelar extremos das entradas e fazer agrupamentos suavizados. Por exemplo, temperatura quente ou fria, pH ácido ou básico, concentração de cálcio alta ou baixa, salinidade da água alta ou baixa dentre outras condições extremas. 23! !

4.4. Modelos Nebulosos Existem modelos nebulosos típicos como o modelo de Mamdani e o modelo de Takagi-Sugeno, que são baseados em regras. Ambos os modelos são semelhantes e úteis para fazer aproximações de funções, modelagem e estimação de séries temporais. 4.4.1. Modelo de Mamdani O modelo de Mamdani é baseado em regras que regem o processo a ser modelado. Essas regras podem ser descritas de forma linguística como, por exemplo, “se a temperatura é muita quente então a população de larvas é pequena”. Para traduzir essa frase em um modelo matemático, as palavras-chave a serem tomadas são os nomes das variáveis, os termos das condições e os termos das consequências. A variável de entrada temperatura pode ter o grau de pertinência para um dado conjunto nebuloso avaliado. Nesse caso o conjunto nebuloso é a descrição quente intensificado, que pode ser modelado, por exemplo, por uma função de pertinência do tipo senoidal. A variável de saída população de larvas sofre um efeito devido ao fato da temperatura estar muito quente ou não. O conjunto nebuloso pequena, que modela uma faixa de valores que consideram uma população de larvas como sendo baixa é o alvo para o caso da condição ser satisfeita. Então, quanto mais a condição temperatura estar muito quente for satisfeita, mais próximo de pequena será a população de larvas. Em termos matemáticos, generalizando o modelo de Mamdani, para um dado conjunto de ! regras cuja consequência são valores !!,! previstos para cada variável de saída !! , a previsão total para o valor da variável de saída !! no instante de tempo ! é dada pela equação 4.16. !! ! =

! !!! !! ! ! !!! !!

!!,! !

4.16

Nessa equação, a saída prevista depende do grau de pertinência !! ! de que as variáveis de entrada e de saída satisfazem a j-ésima regra. O modelo pondera as consequências de cada regra de acordo com o quão essas regras são satisfeitas. 24! !

4.4.2. Modelo de Takagi-Sugeno O modelo de Takagi-Sugeno é uma extensão do modelo de Mamdani. Nesse modelo, as consequências das regras é a previsão de que a saída seja calculada por uma função linear das variáveis de entrada e de saída. Com esse modelo, pode modelar uma consequência do tipo aumentar ou diminuir como, por exemplo, “se a concentração de microalgas é pequena ou a população de mexilhões adultos é muito grande então a população de mexilhões adultos diminui”. O modelo matemático traduz essa frase considerando-se as palavras-chave. Nesse exemplo, a condição da regra é uma união dos conjuntos nebulosos pequena para a variável concentração de microalgas e grande intensificado para a variável população de mexilhões adultos. A função de pertinência da regra será dada pelo resultado do operador de união (por exemplo, a equação 4.6) aplicado às funções de pertinência dos conjuntos nebulosos envolvidos que podem ser modelados com funções senoidais. A consequência dessa regra é a diminuição da população de mexilhões adultos. Isso pode ser modelado como uma função linear em que o novo valor dessa população é calculado como um valor passado dessa população menos uma constante. Em termos matemáticos, generalizando o modelo de Takagi-Sugeno para um dado conjunto de ! regras, cuja consequência são valores calculados por funções lineares !!,! ! , a previsão total para a variável !! no instante ! é dada por: ! !!! !! ! !!,! ! !!! !! !

!! ! =

4.17

Nessa equação, o termo !! ! tem o mesmo significado que em 4.16, sendo o grau de pertinência de que as variáveis de entrada e de saída satisfazem a j-ésima regra. A diferença surge no termo !!,! ! que é a consequência da j-ésima regra. Esse termo é calculado genericamente por: !!

!!,! ! =

!!!

!!,!,!,! !! ! − ! + !!!

25! !

!!,!,!,! !! ! − ! +

!!,!,!,! !! ! − ! !!!

+ !!

4.18

Nessa equação, o valor previsto para a variável !! no instante ! devido à regra j é função linear das variáveis de entrada !! no instante atual ! e nos instantes atrasados até ! − ! e das variáveis de saída !! nos instantes anteriores até ! − !. No caso particular em que todos os pesos !! e !! são nulos, o modelo de Takagi-Sugeno toma a forma do modelo de Mamdani. No caso do exemplo de regra que envolve a concentração de microalgas e a população de mexilhões adultos, a consequência da regra poderia ser: !!"#$%&',!"#$%& ! = !!"#$%&' ! − 1 − 100 Isso implica que a população de mexilhões adultos tende a diminuir de 100 unidades devido à escassez de microalgas ou ao excesso de indivíduos da mesma espécie implicando em disputa intra-específica por alimentos.

26! !

5. Programação Para obter o modelo e fornecer uma simulação em que se obtém previsões estimadas do comportamento da população e distribuição do Limnoperma fortunei está sendo feito uma solução em C++ que permite obter um modelo nebuloso a partir de dados das variáveis ambientais de entrada e variáveis de saída da população da espécie invasora. A entrada do programa é uma imagem que contém o mapa do volume de controle e dados das variáveis de entrada e de saída registrados em diversos pontos do mapa coletados a uma frequência de amostra suficiente para ter as informações dinâmicas de cada variável durante o tempo de coleta. O conjunto de dados inclui variáveis ambientais de entrada e variáveis de saída. A saída do programa é o modelo propriamente dito, sendo um modelo nebuloso e simulações para obter uma previsão estimada da população e distribuição além do tempo que já tem os dados registrados. 5.1. Células de Von Neumman O método de divisão do problema em pequenos problemas é aplicado conforme o motivo explicado do modelo ser do tipo a parâmetros concentrados. O volume de controle é representado por um mapa em uma imagem e é dividido em pequenas áreas com tamanho igual entre si. Essas áreas são chamadas de células de Von Neumman. As células forma um mosaico que cobre toda a área de interesse na imagem. Como a área de interesse da presença e população do L. fortunei são rios, lagos e mar, espera-se que no mapa de entrada a área de interesse seja a área azul do mapa. Então todas as regiões azuis do mapa serão o volume de controle e células de Von Neumman são construídas de forma a cobrir esse volume. Para a solução ficar mais generalizadas para aplicações semelhantes, o usuário pode definir a cor de interesse na imagem para representar o volume de controle. Assim se o mapa tiver os rios e lagos preenchidos de cor verde, por exemplo, então o usuário pode definir a cor verde como sendo a cor de interesse. Isso permite também a solução ser usada para aplicações de outras espécies além do L. fortunei. 27! !

5.2. Definição das Variáveis A próxima etapa consiste em definir as variáveis de entrada e de saída. O programa permite que o usuário adicione, remova ou altere o conjunto de variáveis segundo o interesse da aplicação. Uma variável é uma definição de uma propriedade que todas as células vão ter para representar numericamente a propriedade física ou informação correspondente no processo real naquela área correspondente. Por exemplo, o usuário define uma variável chamada temperatura para representar a temperatura nas áreas de interesse. Cada célula terá um valor de temperatura associado a cada instante de tempo. Essa série temporal é armazenada como propriedade. As variáveis contêm algumas propriedades, das quais uma é básica e as outras são opcionais, que o usuário pode definir ao criar a variável ou alterar. A propriedade básica que não pode faltar é o nome da variável. As outras propriedades são: domínio da variável; precisão; que é o número de casas decimais a serem mostradas; e unidade de medida. Na aplicação da modelagem do L. fortunei, as variáveis de entrada foram definidas como: Tabela 5.1: Variáveis de entrada do modelo da população e distribuição do L. fortunei.

Nome Temperatura pH Salinidade Concentração de cálcio Concentração de sódio Concentração de poluentes Profundidade da água Concentração de microalgas População de peixes predadores Intensidade do fluxo natural de água Direção do fluxo natural de água Intensidade do fluxo de embarcações Direção do fluxo de embarações

Unidade de medida ℃

! !! ! !! !

Domínio

Precisão

−50,70 0,10 0,1 0,1 0,1 0,1 0, ∞ 0,1 0, ∞ 0, ∞ 0,2! 0, ∞ 0,2!

1 1 2 2 2 2 0 2 0 1 0 1 0

28! !

E as variáveis de saída da modelagem da população do L. fortunei foram definidas como: Tabela 5.2: Variáveis de saída do modelo da população e distribuição do L. fortunei.

Nome

Unidade de medida

População do mexilhão adulto População de larvas

Domínio

Precisão

0, ∞ 0, ∞

0 0

5.3. Tempo em Estudo Uma funcionalidade relacionada ao tempo disponível ao usuário é ajustar o tempo em estudo e o período de amostragem. Como a modelagem é feita assistida por computador, os valores das variáveis são guardados como séries temporais discretas no tempo. A partir disso vem a necessidade de ajustar claramente qual será o período de amostragem. O tempo em estudo é o intervalo total de tempo a ser estudado seja como treinamento do modelo, validação ou simulação. Esse intervalo de tempo pode compreender amostras para uma combinação entre treinamento, validação e simulação. O período de amostragem é o período entre duas amostras consecutivas. Quanto maior for esse período, menor será o nível de detalhamento das informações ao longo de intervalos pequenos de tempo. Mas se esse período for pequeno demais, as informações podem acabar ficando redundantes e apenas aumentar o custo computacional para o treinamento, validação ou simulação. Para a aplicação da modelagem do L. fortunei, o período de amostragem é adequado na ordem de meses, bimestres, trimestres, semestres ou anos. 5.4. Entrada de Dados A entrada de dados pode ser feita com arquivos contendo os dados das variáveis ou manualmente com o usuário preenchendo o valor da variável. No caso do preenchimento manual, o usuário só precisa preencher os valores de algumas células localizadas em pontos escolhidos para terem influência sobre as células vizinhas. 29! !

O programa contém um algoritmo que se encarrega de preencher as outras células baseado nos valores das células influentes preenchidas. Esse algoritmo se baseia no modelo de Mamdani em que o grau de pertinência de proximidade entre cada célula e cada célula influente é o peso para a influência do valor das células influentes. O mesmo algoritmo é usado também para preencher os valores de todas as células ao longo do tempo. Nesse caso, o usuário só precisa preencher os valores das variáveis nas células em alguns instantes de tempo separados e o algoritmo preencherá os valores das variáveis para os demais instantes de tempo usando o modelo de Mamdani também para proximidade de tempo. Para um intervalo de tempo em que se deseja treinar o modelo, ajustando os parâmetros baseado em observações de dados reais de entrada e saída, todas as variáveis de entrada e de saída devem ser preenchidas em todas as células. Um intervalo de tempo que compreende dados para a validação do modelo também tem que ter todas as variáveis de entrada e de saída preenchidas em todas as células. Mas um intervalo de tempo em que se deseja fazer uma simulação de um modelo já pronto só precisa ter as variáveis de entrada preenchidas, além das variáveis de saída nos instantes iniciais de acordo com a ordem do modelo. 5.5. Definição de Conceitos A próxima etapa para a modelagem é a definição de conceitos que serão usados para a definição das regras. A definição de conceitos nada mais é do que a definição de conjuntos nebulosos das variáveis de entrada e de saída. A definição de um conjunto nebuloso envolve a escolha de um tipo de função de pertinência e os parâmetros da função. Durante essa etapa, o usuário observa as funções de pertinência dos conjuntos nebulosos que está criando em gráficos. Para exemplificar, a figura 5.1 mostra o gráfico que contém as funções de pertinência dos conjuntos nebulosos definidos para a variável temperatura. Observe que é necessário que todos os valores do domínio da variável tenham grau de pertinência diferente de zero em pelo menos um dos conjuntos nebulosos, do contrário ocorre uma divisão por zero na equação 4.17, modelo de Takagi-Sugeno.

30! !

Figura 5.1: Funções de pertinência dos conjuntos nebulosos da temperatura. Autor: Gabriel Cardoso Salgado

Seguindo o exemplo da temperatura, foram construídos os conjuntos nebulosos para todas as variáveis definindo-se seus nomes, funções de pertinência e parâmetros adequados. A tabela 5.3 mostra os conjuntos nebulosos para cada variável de entrada. Tabela 5.3: Conjuntos nebulosos das variáveis de entrada.

Conjuntos Nebulosos/Tipo de Função de Pertinência Frio Ameno Quente Senoidal Seno-generalizada Senoidal Básico Equilibrado Ácido Senoidal Seno- generalizada Senoidal Baixa Média Alta Senoidal Seno- generalizada Senoidal Baixa Média Alta Senoidal Seno- generalizada Senoidal Baixa Média Alta Senoidal Seno- generalizada Senoidal Baixa Média Alta Senoidal Seno- generalizada Senoidal Rasa Média Fundo-rio Fundo-lago Alto mar Senoidal Seno-g. Senoidal Senoidal Senoidal Escasso Média Abundante Senoidal Seno-g. Senoidal Ausente Baixa Média Dominante Excessiva Degrau Senoidal Seno-g. Senoidal Senoidal Parada Fraca Média Alta Degrau Trapezoidal Trapezoidal Trapezoidal ~0° ~60° ~120° ~180° ~240° ~300° Triangular Triangular Triangular Triangular Triangular Triangular Parada Fraca Média Alta Degrau Trapezoidal Trapezoidal Trapezoidal ~0° ~60° ~120° ~180° ~240° ~300° Triangular Triangular Triangular Triangular Triangular Triangular

A tabela 5.4 mostra os conjuntos nebulosos para cada variável de saída. Tabela 5.4: Conjuntos nebulosos das variáveis de saída.

Nome População do mexilhão adulto População de larvas

Conjuntos Nebulosos/Tipo de Função de Pertinência Ausente Baixa Média Dominante Excessiva Degrau Senoidal Seno-g. Senoidal Senoidal Ausente Baixa Média Dominante Excessiva Degrau Senoidal Seno-g. Senoidal Senoidal

Vale lembrar que durante o treinamento do modelo, os parâmetros das funções de pertinências são ajustados. Então as funções de pertinências inicialmente construídas não são as funções ótimas do modelo a serem validadas. É apenas um estado inicial do modelo. 5.6. Definição de Regras Após definir os conceitos, se define as regras que vão reger o modelo. As regras usam os conjuntos nebulosos definidos na etapa anterior. A estrutura básica de uma regra é dada por: SE

CONDIÇÕES

ENTÃO

CONSEQUÊNCIAS

As condições envolvem analisar se o valor de alguma(s) variável(s) de entrada ou de saída pertence a um conjunto nebuloso, ou ao resultado de operações nebulosas. Um exemplo de condições esperadas por uma regra é dado por:

concentração de microalgas

escasso

população de mexilhão adulto

excessiva

O primeiro bloco é um teste se a variável concentração de microalgas pertence ao conjunto nebuloso escasso. O segundo bloco é um teste se a variável população de mexilhão adultos pertence ao conjunto nebuloso excessiva. O resultado de cada teste é o grau de pertinência para o qual cada variável satisfaz a condição de pertencer ao respectivo conjunto. 32! !

A palavra “e” entre os blocos é um operador nebuloso de intercessão. Um exemplo desse tipo de operador é a soma probabilística. Então esse operador é aplicado aos graus de pertinência retornados por cada bloco. O resultado dessa operação é o grau de pertinência para o qual as duas variáveis em questão satisfazem as condições totais da regra. O efeito previsto por uma regra é um novo valor para a variável de saída. Esse novo valor por ser uma constante, que é o caso do modelo de Mamdani, ou uma função linear das variáveis de entrada e de saída nos instantes de tempo atual e atrasados, que é o caso do modelo dinâmico de Takagi-Sugeno. As regras só podem ter efeitos sobre as variáveis de saída. Nessa etapa de definir as regras, o usuário ensina os aspectos biológicos básicos para o programa. Essa é a parte de modelagem fenomenológica. É a base para o qual o modelo vai ter regras para reger o comportamento da população do mexilhão adulto e das larvas. A parte empírica tem como meta ajustar os parâmetros das funções de pertinência dos conjuntos nebulosos, os coeficientes das combinações lineares das consequências das regras e a ordem do modelo. 5.7. Treinamento do Modelo Depois de definir as regras, que formam a estrutura básica do modelo, a próxima etapa é o treinamento do modelo com os dados que o usuário entrou na etapa de entrada de dados. Conforme já mencionado, no intervalo de tempo que contém os dados de treinamento, todas as variáveis de entrada e de saída devem estar com seus valores preenchidos. Dessa forma, o algoritmo implica em várias iterações em que as regras são usadas sobre as variáveis de entrada e de saída em instantes !, ! − 1, ! − 2 … para calcular os valores das variáveis de saída no instante ! e comparar essa previsão com os valores reais das variáveis de saída. O resultado da comparação é um erro que é usado para ajustar os parâmetros do modelo de modo que o erro tenda a diminuir. O tipo de algoritmo escolhido para o treinamento do modelo é o gradiente descendente. O critério de avaliação do modelo escolhido é o erro quadrático médio (EQM). O algoritmo gradiente descendente é um algoritmo que minimiza o quadrado do erro seguindo a direção contrária do gradiente da função de erro global. 33! !

A função global de erro é dada por:

!! ! − !! ! ! = 2

5.1

Nessa equação, !! ! é a função global de erro calculada no instante de tempo !. Os valores reais das variáveis reais de saída são !! e !! , representando a população de mexilhão adulto e população de larvas. E os valores calculados pelo modelo das variáveis de saída são !! e !! . O gradiente da função global de erro em relação aos parâmetros do modelo é dado por um vetor com as derivadas parciais dessa função em a cada parâmetro. Essas derivadas parciais são: !! ! − !! ! !! ! − !!,! ! !!! ! = ! !!!,? !!! !! !

!!! ! !!!,?

5.2

!! ! − !! ! !! ! !!! ! = !! ! − ! ! !!!,!,!,! !!! !! !

5.3

!! ! − !! ! !! ! !!! ! = !! ! − ! ! !!!,!,!,! !!! !! !

5.4

!! ! − !! ! !! ! !!! ! = ! !!!,! !!! !! !

5.5

Na equação 5.2, !!,? é um parâmetro de uma função de pertinência !! ! da jésima regra. Na equação 5.3, !!,!,!,! é o coeficiente linear multiplicado pela entrada !! atrasado até o instante ! − ! referente a consequência da j-ésima regra. Esse é o mesmo coeficiente que aparece na equação 4.18. Na equação 5.4, !!,!,!,! é o coeficiente análogo a !!,!,!,! , mas é multiplicado pela saída !! atrasada até o instante ! − !. E na equação 5.5, !!,! é o coeficiente do termo independente da consequência da j-ésima regra. Para cada instante de tempo do intervalo reservado ao treinamento do modelo, o algoritmo ajusta os parâmetros subtraindo cada um desses dos valores correspondentes calculados nas equações 5.2, a 5.5 multiplicados por um fator de incremento. Então a cada iteração, o valor de !!,? é ajustado para !!,? − !

!!! ! !!!,?

. O mesmo raciocínio

descreve a forma como os parâmetros !!,!,!,! , !!,!,!,! e !!,! são ajustados. 34! !

Evidentemente, o modelo deve ser treinado com dados de diversas situações em diversas partes do mundo para se obter um modelo muito bom. Quanto maior a riqueza de informações para treinar o modelo, melhor. Mas o algoritmo deve fazer o ajuste de todos os parâmetros usando todos os dados de treinamento muitas vezes. O número de vezes que todo esse procedimento vai ser feito é o número de épocas, ajustável pelo usuário do programa. Um número grande de épocas permite ao algoritmo absorver bem as informações contidas nos dados de treinamento, ou seja, treinar mais o modelo com os mesmos dados. Mas o número de épocas pode ser demasiadamente grande e já não fazer muita diferença a partir de certa iteração. Então existem outros dois critérios de parada que é verificar se o EQM já não atingiu um valor suficientemente pequeno e verificar se o EQM não diminuiu significativamente. O fluxograma da figura 5.2 mostra de forma esquemática e resumida o algoritmo de treinamento do modelo. O início do algoritmo tem as premissas de que todas as variáveis de entrada e de saída tenham seus valores preenchidos em todas as células em todos os instantes de tempo selecionados para o treinamento do modelo. Outra premissa é de que as todas as regras já estão definidas. O primeiro passo no fluxograma é guardar o conjunto de dados em vetores e sortear a ordem. Isso é uma boa prática de treinamento para não deixar o modelo tendencioso a uma determinada situação do começo do treinamento. Assim, o modelo é ajustado praticamente considerando todas as situações de treinamento de uma vez. Dentro do laço que itera a época tem outro laço que itera o instante de tempo. Dentro deste último, a saída do modelo é calculada pela equação 4.17, modelo de Takagi-Sugeno. O gradiente da função global de erro é calculado pelas equações 5.2 até 5.5. E o ajuste dos parâmetros é feito subtraindo cada parâmetro pela derivada correspondente multiplicada pelo fator de incremento. Depois da iteração nos instantes, o EQM é calculado por:

!"# =

35! !

!! ! − !! ! !!"

5.6

Início: Algoritmo dispõe de dados das variáveis de entrada e de saída em todas as células e em todos os instantes de tempo destinados ao treinamento do modelo e os conjuntos nebulosos e as regras já estão definidas.

Os dados de treinamento são armazenados em um vetor e embaralhados.

Calcula o erro quadrático médio EQM.

!"# ≤ !"#.?

Início do laço de épocas e=0

Não

Início do laço de instantes i=0 Calcula a saída do modelo para o instante.

Sim

∆!"# ≤ ∆!"# ?

Sim

Não

! = !"#$%& ?

Sim

Calcula o gradiente da função global de erro. Ajusta os parâmetros de acordo com o gradiente calculado. Incrementa)o)instante. Não

! = !"#$%& ?

Sim

Figura 5.2: Fluxograma do algoritmo do gradiente descendente para treinamento do modelo nebuloso. Autor: Gabriel Cardoso Salgado

Logo depois de calcular o EQM, três critérios de parada são testados. O primeiro é verificar se o EQM já não é pequeno para poder ser tolerado. A constante tol é a tolerância. O segundo critério é verificar se não houve evolução significativa no modelo. Esse critério compara a diferença entre o EQM da iteração anterior para o atual com a variação mínima para que os dados treinem bem o modelo. Se for menor, é porque o modelo já não responde a situação dos dados de treinamento. O último critério é verificar se já não concluiu o número máximo de épocas. 36! !

5.8. Validação do Modelo Depois que o modelo estiver treinado, pode ser que já esteja pronto. Para saber se está pronto ou não, é necessário validar. O algoritmo de validação escolhido, conforme já foi mencionado, é o EQM. A validação é feita em um conjunto de dados distinto do que foi usado para o treinamento do modelo. Nesse conjunto de dados a saída do modelo é calculada e o índice é obtido pela equação 5.6. Quanto menor for o índice EQM obtido, melhor é o modelo para a situação de tais dados. Uma boa prática de validação é ter um EMQ máximo de tolerância para dados que estejam em situação semelhante a de alguns dados de treinamento e um outro EQM máximo de tolerância para dados que estejam em uma situação nova. Claro que o primeiro EQM de tolerância é menor que o segundo. Isso verifica se o algoritmo de gradiente descendente está trabalhando bem no modelo. Um possível motivo que pode fazer o algoritmo de gradiente descendente não cumprir bem seu papel é um valor grande demais do fator de incremento. A consequência disso seria uma divergência da caminhada do modelo em direção ao mínimo da função global de erro. Por outro lado, se esse fator for pequeno demais, o modelo evolui muito devagar. 5.9. Simulação Depois de se obter um modelo bem validado, esse está pronto para simular a população e distribuição do L. fortunei. O usuário pode preencher os valores das variáveis de entrada conforme condições previstas, registradas ou mesmo desejadas para fins de simulação. Isso pode ser útil para pesquisas que queiram fazer estimativas de como o L. fortunei vai se expandir ao longo do tempo conforme condições previstas das variáveis ambientais, condições normais ou com excitações diferentes. Isso é um modo de elaborar uma estratégia de como lidar com a expansão desse animal. Pode também servir para fazer estimativas de quando o L. fortunei vai chegar a determinados locais, em quanto tempo esse animal alcança uma população excessiva e se torna uma ameaça a determinado ambiente. 37! !

6. Futuras Expectativas A ferramenta que está sendo desenvolvida, além de servir para aplicações com o L. fortunei, pode ser usada para modelar a população e distribuição de outras espécies. Como a etapa de construir células de Von Neumman permite alterar a cor de interesse, a ferramenta pode muito bem ser usada para modelar espécies terrestres também. A referida etapa faz um reconhecimento de cores na imagem. Isso pode ser útil para medir o tamanho do volume de controle em um mapa ou ainda uma quantidade de áreas em uma imagem que satisfaçam condições de cores. Um exemplo de aplicação semelhante que também utiliza o reconhecimento de cores em imagens é o monitoramento de desmatamento das áreas florestais. A principal expectativa, entretanto, é de que a aplicação desta ferramenta levante um bom modelo para a população e distribuição do L. fortunei e que este modelo seja útil para pesquisas que têm esse animal como objeto de estudo.

38! !

Referências Bibliográficas AGUIRRE, L. A. Introdução à Identificação de Sistemas: Técnicas Lineares e NãoLineares Aplicadas a Sistemas Reais, 3. ed. Belo Horizonte, Editora UFMG. 2007. BARBOSA, F.G.; MELO, A.S. Modelo preditivo de sobrevivência do Mexilhão Dourado (Limnoperna fortunei) em relação a variações de salinidade na Laguna dos Patos, RS, Brasil. Biota Neotrop. 2009. DENN, M. M. Process Modeling. Harlow, Longman. 1986. EYKHOFF, P. System Identification: Parameters and State Estimation. London, John Wiley & Sons. 1974. GARCIA, C. Modelagem e Simulação de Processos Industriais e Sistemas Eletromecânicos, 2.ed. São Paulo, Editora da Universidade de São Paulo. 2005. LEMOS, A. P. Sistemas Nebulosos: Conjuntos Nebulosos. Belo Horizonte. 2012. LEMOS, A. P. Sistemas Nebulosos: Aplicações. Belo Horizonte. 2012. SEBORG, D. E.; EDGAR, T. F.; MELLICHAMP, D. A. Process Dynamics and Control, 2.ed. New York. 2001. RODDER D., SCHMIDTLEIN S.; VEITH M.; LOTTERS S. Alien Invasive Slider Turtle in Unpredicted Habitat: A Matter of Niche Shift or of Predictors Studied? plos one. 2009.

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PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO TECNOLÓGICA E INOVAÇÃO - PIBIC

Ministério da Ciência e Tecnologia / CNPq - Edital 2012 / 2013 Programa Institucional de Iniciação Científica – Fundação CETEC Projeto GT 343: Controle do mexilhão dourado: bioengenharia e novos materiais para aplicações em ecossistemas e usinas hidrelétricas

MONITORAMENTO AMBIENTAL AUTOMATIZADO: DESENVOLVIMENTO DE DISPOSITVO DE SENSORIAMENTO AUTÔNOMO E REMOTO PARA AUXÍLIO NO CONTROLE DO INVASOR MEXILHÃO-DOURADO GT 343 / CNPq / 02/08/2013 Frederico Magalhães Vieira Antônio Valadão Cardoso Gabriela Rabelo Andrade

______________________________________________________________________ Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG ______________________________________________________________________

Centro Tecnológico SENAI CETEC _____________________________________________________________________ GERENTE DE INOVAÇÃO E TECNOLOGIA José Eustáquio Drumond

Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais - CETEC PRESIDENTE Marcílio César de Andrade

Av. José Cândido da Silveira, 2000 - Horto Florestal - Belo Horizonte - MG – 31035-536 Telefone: (31) 3489-2000 / Fax: (31) 3489-2200 – Portal: www.cetec.br - E-mail: faleconosco@cetec.br

Centro Tecnológico SENAI CETEC Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais / CETEC Monitoramento ambiental automatizado: desenvolvimento de dispositivo de sensoriamento autônomo e remoto para auxílio no controle do invasor mexilhão-dourado. Projeto - GT 343 Controle do mexilhão dourado: bioengenharia e novos materiais para aplicações em ecossistemas e usinas hidrelétricas Orientador: Antônio Valadão Cardoso, Doutor. Co-orientador: Gabriela Rabelo Andrade.

Autores: Frederico Magalhães Vieira, Graduando em Engenharia de Controle e Automação, Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG. Antônio Valadão Cardoso, Doutor. Gabriela Rabelo Andrade.

INTRODUÇÃO As invasões biológicas estão entre os maiores problemas ecológicos da atualidade (Pivello, 2011) e são, de acordo com a IUCN (International Union for Conservation of Nature), a segunda maior fonte de perda da biodiversidade no planeta. No Brasil, dentre muitas espécies invasoras encontra-se o mexilhão-dourado, Limnoperna fortunei (Dunker, 1857), molusco bivalve de água doce natural do sudeste asiático. Provavelmente introduzido através da água de lastro de navios oriundos da Ásia (Darrigran & Pastorino, 1995), a espécie populou com sucesso rios argentinos por onde alcançou águas brasileiras. De acordo com revisão feita por Netto (2011), a ocupação do mexilhão-dourado no Brasil data de 1998 aos dias atuais, quando sua presença é documentada nos três estados do sul do país, Mato Grosso do Sul e Minas Gerais. Devido à sua capacidade de alterar profundamente os habitats, o molusco ameaça de maneira significativa as espécies nativas e endêmicas, prejudicando seu desenvolvimento. Em função da sua dinâmica de vida, o mexilhão-dourado fixa-se fortemente ao substrato onde então acumulam-se vários indivíduos. Tal comportamento, em especial em sistemas de captação de água para abastecimento e geração de energia elétrica, gera enormes prejuízos decorrentes da obstrução de tubulações e maquinário, demandando manutenções caras e frequentes (Martins, 2008). Com o objetivo de amenizar os prejuízos ocasionados pela presença de espécies invasoras, em foco o mexilhão-dourado, a CEMIG (Companhia de Energia Elétrica de Minas Gerais S.A.) e o CETEC (Fundação Centro Tecnológica de Minas Gerais) criaram o Centro de Bioengenharia de Espécies Invasoras de Hidrelétricas (CBEIH). O CBEIH, organizado em equipes de monitoramento, bioengenharia e modelamento, realiza atividades de estudo e controle, incluindo inspeções regulares de regiões afetadas pelo mexilhão-dourado. Porém, até o presente momento, além de as vistorias e coletas serem realizadas entre intervalos muito grandes, são utilizadas técnicas tradicionais de monitoramento que dispendem de equipe e recursos muito elevados. Assim, o Centro necessita de novas tecnologias para aumentar sua eficiência nas ações de vigilância e predizer com maior qualidade a invasão de um determinado local, tanto quanto as condições daqueles já ocupados. Diante das supracitadas condições, o CBEIH vem desenvolvendo atividades de pesquisa e desenvolvimento para um novo programa de monitoramento ambiental autônomo e remoto, com uso de tecnologias automatizadas na coleta de dados. Pretende-se aliar as práticas atuais à nova abordagem e assim, alcançar uma maior eficiência ao monitorar continuamente diversos pontos e obter, em tempo real, informações valiosas sobre o comportamento do invasor. Considerando o alto potencial dispersivo do mexilhão-dourado, decidiu-se pela adoção da técnica Early Detection, conjunto de técnicas modernas e eficientes implementadas com sucesso em grandes centros de pesquisa fora do Brasil. A técnica baseia-se na prerrogativa de que a detecção precoce da ocorrência de um invasor é uma estratégia mais efetiva por permitir a rápida adoção de planos de manejo para contenção, controle e combate, atenuando os prejuízos e por vezes até eliminando a necessidade da restauração dos locais ocupados (Kirk, 2009; Holcombe & Stohlgren, 2010). Com o propósito de promover a inclusão da Early Detection nas práticas do CBEIH, este trabalho dá início ao desenvolvimento de um dispositivo de monitoramento ambiental autônomo e remoto. Pretende-se através deste, viabilizar o acompanhamento contínuo e sistemático de pontos críticos do monitoramento do mexilhão-dourado, obtendo à distância e em tempo real, informações importantes sobre o comportamento do invasor. Essas informações permitirão realizar ações de controle em tempo mais hábil e logo, mais efetivas. 4

OBJETIVOS Contribuir para o desenvolvimento de protocolos e tecnologias de Early Detection, promovendo sua inserção nas atividades de monitoramento da espécie invasora Limnoperna fortunei pelo Centro de Bioengenharia de Espécies Invasoras de Hidrelétricas (CBEIH). A adoção da técnica acontecerá através do desenvolvimento de um dispositivo de monitoramento ambiental autônomo e remoto, capaz de aferir parâmetros físico-químicos da água, qualitativa e quantitativamente, sensível à alterações indicativas da presença do molusco. Visa-se aumentar a eficiência das práticas de controle e combate associando novas tecnologias às técnicas já consolidadas.

PROBLEMA O CBEIH, focado na pesquisa e controle ambiental do invasor mexilhão-dourado, já realiza vistorias e coletas a fim de acompanhar a dispersão da espécie. No entanto, tendo em vista a alta capacidade reprodutiva do animal, beneficiada pela ausência de seus predadores naturais, as atividades de monitoramento tradicional tornam-se incapazes de acompanhar com a rapidez necessária o avanço da espécie no ambiente. Pelos mesmos motivos, ficam prejudicadas também as ações de contenção do invasor, que demandam respostas rápidas. Em trabalhos atuais de monitoramento, como estudos sobre agricultura de precisão ou sobre deslocamento de cardumes acompanhados por GPS, por exemplo, nota-se a utilização bem sucedida de ferramentas computadorizadas em adição ou em substituição à força de trabalho humano. Muitas vezes tais ferramentas viabilizam a aquisição de informações impossíveis por meio de outras técnicas, além de poupar recursos importantes. Observa-se assim que, em ocasiões adequadas, o uso de máquinas pode ser um ótimo investimento. Nessa ótica, considerando a logística de monitoramento e as necessidades atuais do CBEIH, o desenvolvimento de um dispositivo com funcionamento autônomo e remoto, inserido em uma rede de aquisição de dados, pode ser extremamente útil no acompanhamento do mexilhãodourado, pois subsidiaria eficientemente o Centro com dados sempre atualizados, gerados automaticamente e à distância. O processo de tomada de decisões para o controle do invasor seria assim, substancialmente melhorado.

MÉTODO A construção do dispositivo de monitoramento autônomo foi organizada em duas etapas principais: o hardware - a partir daqui chamado de sonda - que constitui o equipamento para utilização em campo, e o software, que inclui o programa da sonda e a interface de armazenamento e acesso das informações coletadas.

HARDWARE A elaboração da sonda foi iniciada a partir da plataforma Arduino, em razão da simplicidade em trabalhar com a mesma e da grande disponibilidade de componentes robustos e confiáveis como sensores, motores e módulos de rádio, wifi e bluetooth, que são compatíveis com a plataforma e permitem a criação de ferramentas com várias funções, muito úteis e flexíveis. A plataforma Arduino é um projeto open-source de origem Italiana (2005), criado com propósitos educacionais. É muito reconhecida e utilizada em nível mundial, tanto por amadores como por profissionais, para construir desde brinquedos à sistemas de controle e automação 5

residencial (Oxer & Blemings, 2009). É composta por hardware e software. Existem vários modelos de hardware, em sumo, todos são circuitos (placas) eletrônicos com um microcontrolador central, várias entradas e saídas digitais e analógicas, e uma interface de comunicação serial (USB). O software, chamado IDE Arduino (Arduino Integrated Development Enviroment), é o ambiente utilizado para criação dos códigos e pode ser baixado gratuitamente no site oficial da marca (www.arduino.cc). Neste trabalho foi utilizada uma placa Arduino modelo Mega 2560. Este modelo possui um microcontrolador ATmega2560, 54 pinos de entrada e saída digitais e 16 analógicas, e memória flash de 256KB. Pode ser alimentado por entrada externa de 7 a 12 volts ou por meio da entrada serial (USB) utilizada para comunicação com computadores.

SOFTWARE

IDE ARDUINO Para elaboração do código do programa da sonda foi utilizada a IDE Arduino. A linguagem de programação da plataforma é uma mistura das linguagens C e C++. Várias bibliotecas e também a documentação de muitas funções estão disponíveis no site oficial Arduino. Por se tratar de uma plataforma open-source e popular, as referências ao Arduino estão majoritariamente na internet, oficialmente no site da marca, mas também volumosamente em tutoriais e instruções do tipo "faça você mesmo" (do inglês Do It Yourself - DIY) feitas por internautas de todas as partes do mundo em seus próprios sites. Muitas dessas referências foram utilizadas para auxiliar a construção do código e as principais estão listadas em anexo a este relatório.

BANCO de DADOS Para armazenar os dados coletados em campo de forma organizada e centralizada, o projeto envolveu também a construção de um banco de dados. Para tanto, foram utilizados serviços da empresa Google. A escolha desta levou em conta a eficiência, gratuidade e robustez dos serviços providos.

INTERFACE de USUÁRIO Por fim, para que fosse possível acessar e fazer uso de todas as informações armazenadas, foi criado um site, com integração direta ao banco de dados, permitindo acesso aos dados de maneira lógica e organizada pelos pesquisadores do CBEIH.

DESENVOLVIMENTO E ANÁLISE DE RESULTADOS A SONDA Nas coletas e vistorias que realiza atualmente o CBEIH faz uso do equipamento YSI, modelo Professional Plus, capaz de medir temperatura, pH, condutividade elétrica, concentrações de nitrato e oxigênio dissolvido, e potencial oxirredutor de uma amostra d'água. 6

Com base nestes parâmetros já medidos nas rotinas de coleta e nas informações importantes para monitorar possíveis alterações ambientais, fez-se uma busca por periféricos compatíveis à placa Arduino, modelo MEGA 2560 (que o Centro já possuía), de alta qualidade e confiabilidade. Foram escolhidos os sensores da empresa Atlas Scientific, que contêm circuitos dedicados ao Arduino, descritos na tabela a seguir: TABELA1 - Sensores Atlas Scientific. SENSOR

Temperatura pH Oxigênio Dissolvido Condutividade elétrica Luz

Faixa de Medida

-0 - 14 0 - 20 mg/L -0 - 225 RGB | 0 - 3235 lux

Temperatura de operação (oC) -20 – 133 1 – 99 50 (max) 0 – 70 -40 - 85

Foi escolhida também uma placa (Cellular Shield) com módulo GSM/GPRS, modelo SM5100B, para que a sonda pudesse realizar conexões através da Internet e assim funcionar remotamente. Os sensores e módulo GSM citados foram todos comprados fora do Brasil e, ainda que solicitados com antecedência, por motivos de burocracia não chegaram a tempo para conclusão deste trabalho. Desta forma, para que o projeto não fosse interrompido fez-se uso de componentes alternativos, com funções diferentes das selecionadas anteriormente, mas que puderam atender ao propósito de verificar a possibilidade do desenvolvimento de um dispositivo autônomo. Em substituição, foram adotados provisoriamente o módulo Ethernet W5100 e sensores de várias marcas descritos na tabela abaixo. É válido detalhar que dentre os sensores, o probador de pH é igual ao que foi solicitado com a verba do projeto. TABELA 2 - Sensores CBEIH. SENSOR Temperatura/Umidade pH Distância (Ultrassom) Nível d'água Luz

Marca/Modelo DHT11 Atlas Scientific HC-SR04 Water Sensor v2.0 Light Dependent Resistor (LDR)

A conexão física dos sensores com a placa Arduino foi feita com intermédio de uma protoboard, uma Arduino Sensor Shield, e jumpers 22-gauge núcleo sólido, adequados para as necessidades e capacidades da placa e do microcontrolador e que facilitam o encaixe dos fios às portas digitais e analógicas (O'Sullivan & Igoe, 2008). À exceção do probador de pH, que possui um circuito dedicado especial, a interpretação e tratamento dos dados dos sensores é feita diretamente no código da sonda. A foto a seguir mostra o primeiro modelo funcional da sonda.

FIGURA 1 - A Sonda.

Uma representação gráfica do algoritmo do programa da sonda pode ser vista na figura abaixo e seu código implementado está disponível em anexo a este relatório. FIGURA 2 - Ilustração da lógica de funcionamento do dispositivo de monitoramento ambiental.

A lógica da aquisição de dados consiste em iterações contínuas. A cada ciclo a sonda utiliza dos sensores para aferir os parâmetros de uma amostra d'água, registra os valores em um cartão de memória local e em seguida, envia-os para um banco de dados através da Internet. A figura acima representa o fluxo das informações dentro de um único ciclo. Como argumentado anteriormente, pela indisponibilidade dos sensores definitivos, o código escrito considerou a utilização de outros probadores. Estes medem temperatura, umidade, pH, nível d'água, distância e luminosidade. O cartão de memória utilizado foi um microSD de 256MB, da marca NOKIA, que pode ser inserido diretamente no módulo Ethernet.

BANCO de DADOS O banco de dados foi construído utilizando a plataforma Google Drive, da Google. Esta plataforma, cujos serviços são oferecidos na nuvem, isto é, acessíveis através da Internet, provê a utilização de, por exemplo, arquivos de texto, planilhas e formulários, além de scritps pequenos programas - que controlam estes outros serviços citados. Estas ferramentas são gratuitas e permitiram a construção de um sistema automático de armazenamento das informações coletadas pela sonda. Uma representação gráfica de como é estruturado e de como funciona o banco de dados elaborado pode ser vista na figura abaixo e seu código implementado está disponível em anexo a este relatório. FIGURA 3 - Ilustração do funcionamento do banco de dados.

A planilha Dados Mexilhão é a porta de entrada do bando de dados. Todos os dados enviados ao banco chegam por ela e ali são armazenadas durante o intervalo de até um dia. Cada dado que chega à planilha passa por uma rotina de avaliações coordenada pelo script MexilhaoDourado. Caso seus valores estejam fora dos limites preestabelecidos, imediatamente são geradas mensagens de alerta aos destinatários cadastrados. Os limites são alteráveis pelo administrador do banco, assim como os contatos para alerta. Ao final de cada dia, mês e ano, os dados são movidos para outras planilhas, estas nomeadas de acordo com a data de recebimento dos mesmos, e enfim rearranjados em subpastas referenciadas por mês e ano.

INTERFACE de VISUALIZAÇÃO de DADOS A terceira parte do projeto, que constitui a disponibilização e acesso aos dados coletados pela sonda, foi consolidada através da construção do site cujo endereço é www.sites.google.com/site/dadosmexilhao. Para tanto, utilizou-se novamente os serviços da Google, uma vez que ferramentas para criar o portal facilitavam a comunicação com o banco de dados. Nas páginas principais do site ficam exibidos os dados coletados ainda no dia corrente, em planilha e em gráfico, ambos atualizados dinamicamente, assim, pode-se realizar um acompanhamento detalhado em tempo real das variáveis monitoradas. Em uma outra parte do site ficam disponíveis (para visualização) todas as planilhas armazenadas no banco até a presente data, assim como documentos no formato pdf (para download) constituindo assim um histórico dos dados monitorados.

TESTES DETALHAMENTO do PROBLEMA da COMUNICAÇÃO ENTRE ARDUINO e BANCO de DADOS No sistema acima descrito, a conexão entre Arduino e o banco de dados é feita através de um formulário. As respostas à este formulário são diretamente inseridas na planilha Dados Mexilhão, que contém o script de avaliações MexilhaoDourado. Para realizar o envio dos dados, o Arduino preenche os campos de resposta do formulário com os valores recentemente colhidos e, em caso de sucesso, estes aparecem em uma nova linha na planilha. Em termos técnicos, o envio necessita da chave identificadora da planilha e é feito através de uma requisição HTTP do tipo GET, na qual os dados não são criptografados. Este método foi adotado em razão da sua popularidade na Internet e foi suficiente para os objetivos do projetos. No entanto, no primeiro semestre de 2013, a Google alterou internamente a estrutura dos formulários e planilhas de forma que nem a chave de identificação da planilha é acessível mais e nem são possíveis as requisições GET. Como consequência a este projeto, a comunicação entre Arduino e banco de dados parou de funcionar e as duas partes não funcionam conjuntamente mais. O site também ficou comprometido, uma vez que depende diretamente do fluxo de informações no banco. Até a data deste texto, a reelaboração da interface de comunicação do Arduino com o banco de dados, assim como da interface de acesso e download das informações, encontra-se nos primeiros estágios de desenvolvimento e portanto não é detalhada aqui. É importante dizer entretanto que ela utiliza da plataforma Google Cloud, e que o seu novo código é escrito utilizando a ferramenta Google App Engine e demais APIs disponibilizadas pela empresa. As razões desta nova escolha são também a eficiência, gratuidade e robustez dos serviços providos, mas ainda a tentativa de aproveitar o esforço investido na antiga estrutura. À altura em que a comunicação entre Arduino e banco de dados foi interrompida, alguns testes qualitativos do sistema já haviam sido realizados e assim puderam ser apresentados aqui como resultado. Foram testes simples e refletem apenas o funcionamento contínuo do sistema. Abaixo estão algumas figuras que mostram as devidas partes em funcionamento. Os números exibidos nas medidas dos sensores não significam nenhuma informação lógica, são apenas qualitativos.

A figura seguinte demonstra o log de comunicação entre a placa Arduino e o PC ao qual ela está conectada. O texto mostra a rotina de configurações executadas ao ligar a sonda e, em seguida, um ciclo de aferições como ilustrado na figura 2, em que cada sensor realiza uma leitura e então os dados são salvos em cartão de memória e enviados para o 10

banco de dados. É valido notar que a pasta no cartão de memória onde são salvas as informações é nomeada de acordo com a data atual. Esta data é consultada pelo Arduino através da Internet e, nos testes realizados utilizando a rede do CETEC, não foi possível determinar corretamente a referência. Por esse motivo, o horário e data impressas aqui aparecem como "0:00:13 1 1 1970". FIGURA 4 - Log de comunicação serial entre Arduino e Computador.

A próxima figura mostra a aba Dados da planilha Dados Mexilhão. Na aba Limites é possível alterar campos com valores limites para as variáveis sensoriadas. Na aba Contatos é possível cadastrar os e-mails aos quais serão enviadas mensagens de alertas. A aba modelosEmail faz parte do código do Script MexilhaoDourado e não deve ser alterada.

FIGURA 5 - Planilha Dados Mexilhão.

A figura 6 mostra a página do gráfico dinâmico do site mexilhão. Os dados exibidos são apenas qualitativos. FIGURA 6 - Gráfico dinâmico do site mexilhão.

CONCLUSÕES Apesar de não terem sido realizados testes conclusivos sobre a qualidade do dispositivo desenvolvido, esta primeira etapa do trabalho demonstrou que é possível desenvolver um dispositivo autônomo para coleta de dados físico-químicos, e que este poderá ser muito útil ao CBEIH. O problema com a importação dos sensores e módulo GSM mudou bastante o resultado final deste projeto, mas grande parte da estrutura desenvolvida pode e será aproveitada para adaptar o sistema aos propósitos iniciais. Em termos de tecnologia, este trabalho fez uso de soluções de ponta e com garantia de qualidade, como são o Arduino e a Google. Em virtude da boa infraestrutura, o dispositivo pode ser replicado com relativa facilidade, além de ser altamente escalonável, isto é, capaz assumir grandes proporções de utilização, atingindo assim uma rede eficiente de monitoramento. A efetivação dessa nova solução não só corrigiria a carência do CBEIH na vigília do mexilhão dourado, mas proveria uma melhora substancial a todo projeto de monitoramento ambiental, contribuindo significativamente com as técnicas atuais e, por consequência, em vários outros trabalhos científicos.

RECOMENDAÇÕES O sistema desenvolvido precisará passar por uma reformulação considerável para adaptação aos sensores definitivos. Em vista deste problema, a reconstrução, que ainda está em andamento, visa apenas retomar a funcionalidade do sistema. Um próximo passo deve considerar a qualidade e eficiência do código. Como a sonda é uma ferramenta de monitoramento ambiental, ela deve ser resistente às interferências, intempéries, desgastes e demais agressões passíveis de acontecer quando instalada em campo. Assim, como parte futura do desenvolvimento do dispositivo, deve-se estudar e desenvolver um invólucro para a sonda, considerando seu propósito e eficiência. O dispositivo construído é baseado nas plataformas Arduino e Google que constantemente apresentam novos produtos e atualizam seus serviços, assim, é importante conhecer, acompanhar e consultar as tecnologias e soluções disponibilizadas pelos mesmos para realizar a manutenção e melhora do sistema aqui desenvolvido. Muitas pessoas trabalham com Arduino, amadora ou profissionalmente, e com ele desenvolvem vários produtos e serviços. O conhecimento de trabalhos análogos ou semelhantes a este podem ajudar na melhoria do sistema.

REFERÊNCIAS DARRIGRAN, G. & PASTORINO, G. The recent introduction of a freshwater asiatic bivalve, Limnoperna fortunei (Mytilidae) into South América. 1995. The Veliger 38(2): 171-175. HOLCOMBE, T. & STOHLGREN, T. J. Detection and early warning of invasive species. in: CLOUT, Mick N; WILLIAMS, Peter A. Invasive Species Management: A Handbook of Principles and Techniques. Nova Iorque: Oxford University Press, 2009. p. 36-46. KIRK, W. D. & DUSTIN, D. J. 2009. Prevention: A proactive approach to the control of invasive plants in wildlands. In: WILCOX, C. P. & TURPIN, R. B. Invase Species: Detection, Impact and Control. Nova Iorque: Nova Science Publishers, 2009. p. 81-96. MARTINS, M. L. Limnoperna fortunei - Mexilhão Dourado: Atualidade e perspectivas futuras. PCH Notícias & SHP NEWS. v. 47, 2010. p. 26-30. NETTO, O. S. M. Controle da incrustação de organismos invasores em materiais de sistemas de resfriamento de usinas hidrelétricas. 2011. 112 f. Dissertação (Mestrado) Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia - PIPE. Curitiba. 2011. PIVELLO, V. R. 2011. Invasões Biológicas no Cerrado Brasileiro: Efeitos da Introdução de Espécies Exóticas sobre a Biodiversidade. ECOLOGIA.INFO 33 O'SULLIVAN, D. & IGOE,T. Physical computing: Sensing and controlling the physical world with computers. Boston: Couser Technology, 2004. OXER, J. & BLEMINGS, H. Practical Arduino: Cool Projects for open source hardware. Nova Iorque: Springer-Verlag New York, 2009.

CRÉDITOS Centro de Bioengenharia de Espécies

Endereço

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Av. José Cândido da Silveira, 2000 Horto - Belo Horizonte (MG) Telefone: +55 31 3489 2320 Web: www.cbeih.org / contato@cbeih.org

Equipe CBEIH

Coordenador Dr. Antônio Valadão Cardoso Pesquisadores Dr. Antônio Valadão Cardoso Dra. Mônica de Cássia Souza Campos Assistentes de Pesquisa Arnaldo Nakamura Filho Arthur Corrêa de Almeida Fabiano Alcísio e Silva Gabriela Rabelo Andrade Hélen Regina Mota Hernan Roberto Espinoza Riera Estagiários de Iniciação Científica Anna Carolina Paganini Guañabens André Felipe Alves de Andrade Barbara Gomes Kunzmann Danielle Diniz Galvão Frederico Magalhães Vieira Gabriel Cardoso Salgado João Locke Ferreira De Araujo Jônatas Marcos Pinto da Costa Lucas Augsten Pires Capanema Maxwell Fernandes da Silva Martins Newton Gontijo Sampaio Roberto Vidal Coutinho Lopes Thalisson Scarabelli dos Santos Correia Vinícius Rezende Carvalho Vinicius Sergio Rodrigues Diniz Técnico de Laboratório Kelly Carneiro de Souza Lima

Expediente

Design Gráfico: Gabriela Rabelo Andrade Responsável Técnico: Arthur Corrêa de Almeida Data: Fevereiro de 2014

de publicações 2013 Relatório

500 Âľm

Bisso e placa adesivo produzidos pelo mexilhĂŁo-dourado em MEV

Relatório de publicações 2013 +55 31 3489-2320 GT343: Controle do Mexilhão-dourado: Bioengenharia e novos materiais para aplicações em

www.cbeih.org

ecossistemas e usinas hidrelétricas.

contato@cbeih.org

2013

Relatório de publicações GT343 Controle do Mexilhão-dourado: Bioengenharia e novos materiais para aplicações em ecossistemas e usinas hidrelétricas.