IMPLICAÇÕES ECOTOXICOLÓGICAS DO CONTROLE QUÍMICO DE Limnoperna fortunei (Dunker, 1857) (Bivalvia: My

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS PROGRAMA DE PÓS -GRADUAÇÃO EM SANEAMENTO, M EIO AMBIENTE E RECURSOS HÍDRICOS

IMPLICAÇÕES ECOTOXICOLÓGICAS DO CONTROLE QUÍMICO DE Limnoperna fortunei (Dunker, 1857) (Bivalvia: Mytilidae)

Lângia Colli M ontresor

Belo Horizonte 2014

Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos

Lângia Colli M ontresor

IMPLICAÇÕES ECOTOXICOLÓGICAS DO CONTROLE QUÍMICO DE Limnoperna fortunei (Dunker, 1857) (Bivalvia: Mytilidae)

T ese apresentada ao P rograma de P ós-graduação em Saneamento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Saneamento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos.

Área de concentração: Meio Ambiente

Linha de pesquisa: Avaliação de Impact os e Riscos Ambientais

Orientador: Carlos Barreira Mart inez Co-orientadores: Teofânia H.D.A. Vidigal; Kleber Miranda-Filho

Escola de Engenharia da UFM G Belo Horizonte 2014

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AGRADECIMENTOS Aos meus orientadores Teofânia Vidigal e Carlos Barreira M artinez, por terem acreditado nesta parceria da biologia e engenharia, a partir da qual surgiu, entre outras coisas, esta tese. Ap rendi muito com vocês nestes anos de agradável e produtivo convívio! Vocês me deram o sup orte necessário para realizar as diversas etapas deste trabalho e me apoiaram dentro e fora do laboratório. Trabalhar com vocês foi uma parceria que deu e continuará dando certo! À equipe do Lelf (Laboratório de Estudos em Limnoperna fortunei), que está por trás de cada resultado deste trabalho. Uma equipe coesa e dedicada que comemorou e sofreu junta a cada alegria e tristeza nos nossos experimentos. E foram muitas... A Dalva Luz, sempre parceira, desde os primeiros passos do laboratório (e meus também), para o que der e vier. A Nelmara Inês Cordeiro, que conheci de forma tão conturbada, no meio de tanta estatística, e que para nossa felicidade veio se somar à equipe. Nossa amizade sobreviveu à calibração do eletrodo de amônia! Juliano M ichel Araújo, Luciana Gerhard, Cynthia Andrade, Paulo Ricardo Coelho que ajudaram tanto em tantas etapas importantes deste trabalho. Ao Paulo Roberto de Souza, que foi fundamental durante a construção do laboratório e que está sempre por perto quando precisamos de socorro! Mesmo que seja em um final de semana...

A parceria com o Laboratório de Aquacultura da Escola de Veterinária da UFM G foi fundamental ao desenvolvimento deste trabalho. O professor Kleber M iranda-Filho, que é co-orientador desta tese, sempre foi muito receptivo ao trabalho em parceria e investiu nesta colaboração e seu aluno de doutorado M arcio José Silva. Ao amigo e funcionário da Escola de Veterinária, André Almeida Fernandes, p ela disp onibilidade, apoio e amizade.

A Domingo Rodriguez Fernandez (Itaipu Binacional) por todo o apoio que nos foi oferecido nos trabalho de campo executados em Itaipu.

A Jairo Pinheiro, professor do Departamento de Biofísica da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, pela parceria nos trabalhos com fisiologia de moluscos, e aos seus ex-alunos Victor Tunholi Alves e Vinícius Tunholi Alves, que ajudaram nos experimentos.

A Adriano Paglia, professor do Departamento de Biologia Geral (ICB/ UFM G), por tudo que tem me ensinado sobre estatística nos nossos trabalhos em parceria.

A Bruno Rezende de Souza, professor do Departamento de Fisiologia e Biofísica, pela parceria nos estudos com o peixe zebra. M arco Aurelio Romano-Silva, do Laboratório de Neurociências, Faculdade de M edicina, UFM G por possibilitar a utilização da infraestrutura do biotério de peixe zebra de seu laboratório, Daniela Valadão, responsável pelo biotério, e a estudante de mestrado Erika Kelmer Sacramento, que nos ajudou e ensinou sobre o manejo do peixe zebra... mesmo aos finais de semana!

A Alfredo H. Wieloch, professor do Departamento de Zoologia, pela parceria nos experimentos com os p rotistas. Às amigas e estudantes de pós-graduação do Laboratório de M alacologia (IOC/ Fiocruz) Patrícia Cantanhede e Aline Schilitz, que identificaram as espécies de Physa e Pomacea utilizadas neste estudo.

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A todos os integrantes da Rede de Estudos em Limnoperna fortunei, com os quais tenho aprendido a olhar para o mexilhão dourado sob diferentes perspectivas.

A Iara Melo e Ingrid Coura, da secretaria do PPG-SM ARH, com quem sempre podemos contar.

Ao suporte financeiro Fapemig-Vale (CRA - RDP-00097-10), CNPq e Capes.

E a biodiversidade se resumirá àquelas espécies mais resistentes... mesmo que comecemos a mudar de atitude agora.

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RES UMO O presente trabalho investigou, a partir de uma abordagem ecotoxicológica, o controle químico de Limnoperna fortunei, o mexilhão dourado. Foram selecionados para serem testados compostos: (1) que são usados para o controle do mexilhão dourado (M XD-100), (2) considerados eficientes por outros estudos (NaOH) ou (3) conhecidos por sua ação tóxica para macroinvertebrados límnicos -

-

(amônia: N-NH 3, nitrito: N-NO 2 , nitrato: N-NO 3 , cloreto de sódio: NaCl). A toxicidade a diferentes estádios de vida de L. fortunei (larva, recruta e adulto) foi verificada através da concentração letal mediana (CL50). A resposta comportamental (abertura das valvas) dos adultos também foi avaliada.

Em outra etapa, foi feita uma análise comparativa de dois destes compostos químicos (amônia e M XD-100) em testes crônicos (21 dias) com recrutas e adultos de L. fortunei, além de testes agudos em organismos não alvo, incluindo o protista Paramecium caudatum, os moluscos Physa acuta, Omalonyx matheroni e Pomacea dolioides e os peixes Oreochromis niloticus e Danio rerio.

Esforços devem ser concentrados em busca de alternativas de menor impacto ambiental para o controle da bioincrustação.

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ABS TRACT The present research aimed to investigate ecotoxicological aspects of the chemical control of Limnoperna fortunei, the golden mussel. Among the chemicals chosen to the tests, some are used in the control of the golden mussel (M XD-100) or were considered effective by other studies (sodium hydroxide: NaOH), while others are known to have toxic effects on freshwater macroinvertebrates -

-

(ammonia: NH 3-N, nitrite: NO 2 -N, nitrate: NO 3 -N, sodium chloride: NaCl). Their toxicity to different life stages of the golden mussel (larvae, juveniles and adults) was tested and the resp ective LC´s50 were estimated. Behavioral responses (shell gapping) of adult mussels were also evaluated.

Afterwards, two chemicals were selected (ammonia and M XD-100) to a comparative analysis, including chronic tests (21 days) with juveniles and adults of golden mussel and acute tests with non-target organisms of different taxa: one protist (Paramecium caudatum), mollusks (Omalonyx matheroni, Physa acuta and Pomacea dolioides) and fishes (Oreochromis niloticus and Danio rerio). Efforts should be made in the search for alternatives with lower environmental impacts in order to control the macrofouling.

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S UMÁRIO

LISTA DE FIGURAS.................................................................................................................8 LISTA DE TABELAS ................................................................................................................9 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍM BOLOS ........................................................10 1

INTRODUÇÃO ................................................................................................................12

1.1 Bioinvasão.................................................................................................................12 1.2 Impactos ecológicos do mexilhão-dourado...............................................................13 1.3 Distribuição geográfica do mexilhão dourado na América do Sul ..........................16 1.4 O controle químico e seus impactos ambientais .......................................................22 2 OBJETIVOS .....................................................................................................................22 2.1 Objetivo geral............................................................................................................22 2.2 Objetivos específicos ................................................................................................23 3 REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................................24 3.1 3.2 3.3 3.4

Biologia do mexilhão dourado .................................................................................24 O p rocesso de invasão: características ambientais e plasticidade fisiológica ...........25 Estudos ecotoxicológicos e proteção ambiental........................................................28 Sensibilidade do mexilhão dourado a compostos químicos......................................30 3.4.1 Sensibilidade do mexilhão dourado ao nitro gênio inorgânico..................................32 3.4.2 Sensibilidade a valores elevados de pH e o uso de NaOH no controle químico do mexilhão dourado...............................................................................................................34 3.4.3 Sensibilidade do mexilhão dourado a um biocida composto de amônia quaternária e taninos ..............................................................................................................................34 3.4.4 Sensibilidade do mexilhão dourado ao sal ...............................................................35 3.5 Avaliação das respostas fisiológica em moluscos .............................................................36 3.6 Sobre os outros organismos que foram testados .................................................................37 3.6.1 Ciliados .....................................................................................................................37 3.6.1.1 Paramecium caudatum (Protoctista: Peniculida: Parameciidae) ..................37 3.6.2 M oluscos gastrópodes de diferentes espécies ..........................................................38 3.6.2.1 Physa acuta (Gastropoda: Pulmonata: Phy sidae) .........................................38 3.6.2.2 Pomacea dolioides (Gastropoda: Caenogastropoda: Ampullariidae) ...........39 3.6.2.3 Omalonyx matheroni (Gastropoda: Pulmonata: Succineidae) .....................39 3.6.3 Larvas de peixe ......................................................................................................40 3.6.3.1 Oreochromis niloticus (Linnaeus, 1758) (Perciformes: Cichlidae) ..............40 3.6.3.2 Danio rerio (Hamilton, 1822) (Cyp riniformes:Cyprinidae) .........................41 4 M ETODOLOGIA .............................................................................................................41 4.1 Testes de toxicidade ...........................................................................................................41 4.1.1 Testes com larvas de Limnoperna fortunei ...............................................................43 4.1.2 Testes com recrutas e adultos de Limnoperna fortunei.............................................44 4.1.3 Testes de toxicidade aguda: cálculo da CL50 e estimativa dos limites seguros para exposição crônica ..............................................................................................................46 4.1.4 Testes de toxicidade aguda: Análise do comportamento evasivo de mexilhão dourado ..............................................................................................................................46 4.1.5 Testes de toxicidade crônica: Exposição crônica do mexilhão dourado às concentrações de segurança para a amônia e o MXD-100 e análise do conteúdo de carboidratos (ênfase glicogênio) .......................................................................................46 6

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4.1.6 Testes de toxicidade aguda com outros organismos .................................................48 4.1.6.1 Testes com protista ciliado Paramecium caudatum...............................................49 4.1.6.2 Testes com juvenis de moluscos gastrópodes (Physa acuta, Pomacea dolioides) 50 4.1.6.3 Testes com desova de molusco gastrópode (Omalonyx matheroni) ......................50 4.1.6.4 Testes com larvas de peixe zebra (Danio rerio) ....................................................51 4.1.6.5 Testes com larvas de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus)...............................52 RESULTADOS.................................................................................................................54

5.1 Ensaios toxicológicos com Limnoperna fortunei...............................................................58 5.2 Exposição crônica do mexilhão dourado às concentrações de segurança para a amônia e o MXD-100..................................................................................................................................60 5.3 Toxicidade da amônia (N-NH 3) e do MXD-100 a organismos aquáticos ..........................61 6 DISCUSSÃO .....................................................................................................................61 6.1 Toxicidade de diferentes compostos químicos ao mexilhão dourado.................................62 6.2. Resposta comportamental de adultos do mexilhão dourado .............................................69 6.3. Toxicidade da amônia e do M XD-100 a outros organismos aquáticos .............................70 7 8 9

CONCLUSÕES .................................................................................................................61 PERSPECTIVAS ...............................................................................................................61 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................................74 APÊNDICE 01: Artigo em preparação: Invasion history of the golden mussel Limnoperna fortunei in Brazil inferred from mitochondrial and nuclear DNA (Sari et al. 2014) ................83 APÊNDICE 02: Short-term toxicity of ammonia, sodium Hydroxide and a commercial biocide to golden mussel Limnoperna fortunei (M ontresor et al. 2013) .............................................124 APÊNDICE 03: M anutenção de Populações Viáveis de Mexilhão Dourado em Laboratório Visando Estudos de Impacto em Usinas Hidrelétricas (M ontresor et al. 2011) ....................130 APÊNDICE 04: Resultado do cálculo da CL50 do hidróxido de sódio (NaOH) para o mexilhão dourado (Limnoperna fortunei) .............................................................................................139 APÊNDICE 05: Resultado do cálculo da CL50 do cloreto de sódio (NaCl) para o mexilhão dourado (Limnoperna fortunei) ..............................................................................................141 APÊNDICE 06: Resultado do cálculo da CL50 do nitrito (N-NO 2-) para o mexilhão dourado (Limnoperna fortunei) ............................................................................................................143 APÊNDICE 07: Resultado do cálculo da CL50 do nitrato (N-NO 3-) para o mexilhão dourado (Limnoperna fortunei)............................................................................................................ 146 APÊNDICE 08: Resultado do cálculo da CL50 da Amônia não ionizada (N-NH 3) para o mexilhão dourado (Limnoperna fortunei) e esp écies não-alvo ..............................................149 APÊNDICE 09: Resultado do cálculo da CL50 do (MXD-100) para o mexilhão dourado (Limnoperna fortunei) e para espécies não-alvo ....................................................................155

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LIS TA DE FIGURAS Figura 1. M apa mostrando a cronologia de ocorrência de Limnoperna fortunei no Brasil a partir do primeiro registro na América do Sul, as p opulações consolidadas e as não consolidadas. As cores no mapa do Brasil representam as bacias hidrográficas. Fonte: SANTOS et al. (2012) com modificações.

Ilustração: Daniel Coscarelli 18 Figura 2. M apa mostrando a distribuição das usinas hidrelétricas (UHEs) e a potência das mesmas.

A área destacada em amarelo representa a região de ocorrência do mexilhão dourado. Fonte: Atlas de Energia elétrica do Brasil 3ª EDIÇÃO com modificações. www.aneel.gov.br/arquivos/pdf/atlas_p ar2_cap3.pdf M odificado de Aneel, 2008.

20 Figura 3. Porcentagem (IC 95%) de Limnoperna fortunei apresentando as valvas abertas após serem expostos p or 24 horas a diferentes concentrações de NaOH. 59 Figura 4. Porcentagem (IC 95%) de Limnoperna fortunei apresentando as valvas abertas após serem expostos p or 24 horas a diferentes concentrações de NaCl. 59 Figura 5. Porcentagem (IC 95%) de Limnoperna fortunei apresentando as valvas abertas após serem expostos por 24 horas a diferentes concentrações de N-NO2-.

59 Figura 6. Porcentagem (IC 95%) de Limnoperna fortunei apresentando as valvas abertas após serem expostos por 24 horas a diferentes concentrações de N-NO3 .

59 Figura 7. Porcentagem (IC 95%) de Limnoperna fortunei apresentando as valvas abertas após serem expostos p or 24 horas a diferentes concentrações de N-NH 3.

60 Figura 8. Porcentagem (IC 95%) de Limnoperna fortunei apresentando as valvas abertas após serem expostos p or 24 horas a diferentes concentrações de M XD-100.

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LIS TA DE TABELAS Tabela 1. As dez maiores usinas em operação no Brasil, região e potência segundo dados da ANEEL 2008 e a dados sobre a presença do mexilhão dourado. ............................................21 Tabela 2. Limites de tolerância ambiental de Limnoperna fortunei ........................................26 Tabela 3. Características gerais dos testes toxicológicos realizados: organismos testados, número amostral, duração dos experimentos (h), compostos químicos avaliados e as respectivas concentrações das soluções-teste ..............................................................................................52 Tabela 4. Concentração letal mediana (CL50) e o intervalo de confiança de 95 % do hidróxido de sódio (NaOH) para diferentes estádios de vida de Limnoperna fortunei..................................54 Tabela 5. Concentração letal mediana (CL50) e o intervalo de confiança de 95% do cloreto de sódio (NaCl) para diferentes estádios de vida de Limnoperna fortunei .............................................54 Tabela 6. Concentração letal mediana (CL50) e o intervalo de confiança de 95% do nitrito (N-NO 2-) para diferentes estádios de vida de Limnoperna fortunei ........................................................55 Tabela 7. Concentração letal mediana (CL50) e o intervalo de confiança de 95 % do nitrato (N-NO 3) para diferentes estádios de vida de Limnoperna fortunei .......................................................55 Tabela 8. Concentração letal mediana (CL50) e o intervalo de confiança de 95% de amônia tóxica (N-NH3) para diferentes estádios de vida de Limnoperna fortunei e para organismos de outros táxons ...................................................................................................................................56 Tabela 9. Concentração letal mediana (CL50) e o intervalo de confiança de 95 % de um produto comercial a base de taninos (M XD-100) para diferentes estádios de vida de Limnoperna fortunei e para organismos de outros táxons .............................................................................................57 Tabela 10. M edia ± desvio padrão da concentração de carboidratos no tecido de adultos de Limnoperna fortunei expostos a 0,025 mg/L N-NH 3 e M XD-100 e no tratamento controle. n=número amostral ..................................................................................................................61

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LIS TA DE ABREVIATURAS , S IGLAS E S ÍMBOLOS % °C

µL µm ‰ ABNT AES ANOVA Ca(OH)2 2+ Ca CaCO3 CE50 cel/mL CEMA CESP CL50 CL50-24h – CL50-48h CL50-72h CL50-96h cm CO2 CONAM A COPAM COPEL DNS dpf EPA EUA Fisp q Furnas g g.L-¹

g/L h HCl 1M .

IBAM A ind./m2 Itaipu

Porcentagem, partes por cem Grau Celsius M icrolitros M icrômetro Permilagem, partes por mil Associação Brasileira de Normas Técnicas Organização internacional que atua no setor elétrico brasileiro com empresas de geração, comercialização e distribuição de energia Análise de variância Hidróxido de cálcio ou Cal Íons de Cálcio Carbonato de Cálcio Concentração efetiva mediana Células por mililitro Conselho Estadual do M eio Ambiente Companhia energética de São Paulo Concentração Letal M ediana Concentração Letal M édia em 24 horas Concentração Letal M édia em 48 horas Concentração Letal M édia em 72 horas Concentração Letal M édia em 96 horas Centímetros Dióxido de carbono ou gás carbônico Conselho Nacional de Meio Ambiente Conselho Estadual de Política Ambiental Companhia Paraense de energia Ácido dinitrosalicilato Dia após a fertilização Agência de proteção ambiental – Environmental Protection Agency Estados Unidos da América Ficha de informações de segurança de produtos químicos Usina Hidrelétrica Gramas Gramas p or Litro Gramas p or Litro Horas Ácido Clorídrico a um molar Instituto Brasileiro do M eio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis Número de indivíduos por metro quadrado Usina Hidrelétrica binacional 10

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L LELf m m.s-¹ 3

m MG mg/L M in mL mm MW M XD-100 N n NaCl NaOH NAT + NH 4 NH 4Cl nm N-NH 3 N-NO 2 N-NO 3Nº NO 2 NO 3O PB pH PR rpm S SM A TCA UV UHE

Leste Laboratório de Estudos de Limnoperna fortunei Centro de Pesquisas Hidráulicas M etros M etros por segundo M etro cúbico M inas Gerais M iligramas por Litro M inutos M ililitro M ilímetros M egawatt Nome comercial do Protetor anti-incrustante Norte Número amostral Cloreto de Sódio Hidróxido de Sódio Nitrogênio Amoniacal Total Íon amônio ou amônia ionizada Cloreto de amônio Nanômetro Nitrogênio na forma de amônia Nitrogênio na forma de nitrito Nitrogênio na forma de nitrato Número Íon nitrito Íon nitrato Oeste Proteína bruta Potencial hidrogeniônico Paraná Rotações por minuto Sul Secretaria do M eio Ambiente Ácido tricloroacético Radiação Ultravioleta Usina Hidrelétrica

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1. INTRODUÇÃO

1.1.

Bioinvasão

A biodiversidade vem sofrendo severas alterações devido às atividades humanas que influenciam diretamente o ambiente - ex. alteração na concentração de CO2 na atmosfera, deposição de nitrogênio, chuva ácida e outros (SALA et al. 2000). A dispersão de espécies invasoras é um dos grandes problemas contemporâneos já que estas podem provocar a extinção de espécies nativas, promover a destruição de habitats, causar danos à saúde humana e animal e comprometer várias atividades econômicas como a pesca, a agricultura irrigada, os setores elétricos e de abastecimento de água (M cNEELY 2001, DARRIGRAN & M ANSUR 2009). A bioinvasão gera custos ambientais e financeiros elevados (SILVA et al. 2004, DARRIGRAN & MANSUR 2009, SOUZA et al. 2009, DARRIGRAN 2010).

No ambiente aquático, em face ao crescimento do intercâmbio comercial global, considera-se a descarga de água de lastro a mais importante via de introdução de espécies exóticas em todo o mundo e uma das grandes ameaças ao equilíbrio ambiental (FERNANDES & LEAL NETO 2006).

SOUZA et al. (2009) ao traçarem um histórico da bioinvasão aquática no Brasil ressaltam pontos importantes: 1) o aumento no número de eventos de bioinvasão no Brasil nos últimos anos pode ser resultado do agravamento do problema, ou do aumento das pesquisas sobre o assunto; 2) os dados existentes para o Brasil não são contínuos e estão mais restritos a determinadas regiões e a determinadas espécies; 3) embora haja esforços na tentativa de se obter informações sobre as bioinvasões em águas brasileiras, a maioria das informações sobre bioinvasão são relativas à América do Norte e a Europa, enquanto outras regiões, como África e América Latina, são pouco estudadas (SARI et al. 2014 em preparação – APÊNDICE 1). JUNQUEIRA et al. (2009) fizeram uma revisão sobre a bioinvasão no ambiente marinho no Brasil, levantaram as publicações desde a década de 80 e indicaram a importância da gestão de espécies invasoras (prevenção, manejo, detecção precoce, controle e erradicação das espécies já estabelecidas). Estes autores traçaram diretrizes para a próxima década, como por exemplo: determinação dos efeitos de ordem econômica, ecológica, social e ambiental relativos à presença de espécies invasoras e estudos sobre as rotas de invasão. De fato, após o estabelecimento de espécies invasoras em determinado ambiente, diversos procedimentos de curto, médio e longo prazo, de caráter multidisciplinar, devem 12

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ser realizados para minimizar os danos causados pela bioinvasão. A complexidade do sistema “bioinvasão, ambiente e atividade humana” exige uma abordagem científica e tecnológica também complexa (JUNQUEIRA et al. 2009).

Entre os diferentes grupos de organismos invasores que causam impactos econômicos e ambientais estão os bivalves de água doce. As recentes invasões de ambientes aquáticos dulcícolas pelos bivalves Dreissena polymorpha (Pallas, 1835) (Bivalvia: Dreissenidae) conhecido como mexilhãozebra e pelo mexilhão dourado Limnoperna fortunei (Dunker, 1857) (Bivalvia: M ytilidae) colocam os bivalves entre os invasores que mais causam impactos ecológicos e econômicos (KARATAYEV et al. 2010). Esforços em diferentes áreas têm sido feitos para entender e controlar estas invasões.

Neste contexto, tem-se enfatizado a conservação dos bivalves nativos (AUGSPURGER et al. 2003, USEPA 2008) e o controle dos bivalves invasores (M ACKIE & CLAUDI 2010).

1.2. Impactos ecológicos e econômicos do mexilhão-dourado

Limnoperna fortunei é um bivalve de água doce da família M ytilidae, cuja maioria dos representantes habita o ambiente marinho. Esta espécie, nativa dos rios e estuários do sudeste da Ásia, invadiu com sucesso a América do Sul, e hoje está distribuída em cinco países: Argentina, Paraguai, Brasil, Uruguai e Bolívia. Devido à origem marinha da família M ytilidae, L. fortunei apresenta características reprodutivas (ex. estádios larvais planctônicos) peculiares aos bivalves marinhos. As larvas são muito pequenas, variando de 80 a 350 µm o que facilita sua dispersão e transporte (BELZ, et al. 2012). Nas instalações industriais, ainda durante os primeiros estádios de desenvolvimento, as larvas se fixam, utilizando o filamento de bisso, em praticamente todo tipo de substrato duro, como rocha, conchas, metal, plástico, vidro, cimento e madeira (SANTOS et al.

2005, DARRIGRAN & M ANSUR 2006, 2009, DARRIGRAN & DAM BORENEA 2011).

A bioincrustação pode ocorrer em diferentes substratos, em decorrência da incrustação de organismos, que podem pertencer a diversos táxons. O assentamento e crescimento de organismo de mais de 50 micrômetros de tamanho, sobre qualquer substrato submerso, natural ou artificial é denominado macrofouling, e pode gerar obstrução de canais e tubulações (DARRIGRAN & PEREYRA 2011). Em decorrência deste processo, o intervalo de parada de sistemas industriais para limpeza e para trocas de equipamentos tem diminuído, enquanto a perda de carga nestes sistemas

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tem aumentado. As usinas hidrelétricas (UHEs) têm sofrido diversos prejuízos, o que tem sido motivo de preocupação, uma vez que estas são as principais geradoras de energia no Brasil.

Devido à sua alta taxa de reprodução, comportamento gregário e capacidade de fixação em, praticamente, qualquer tipo de substrato ainda quando larva, L. fortunei tem obstruído condutos forçados (nos quais a pressão é diferente da pressão atmosférica) e livres. Em ambientes naturais 2

(DARRIGRAN, et al., 2005) já foram encontrados em densidades de cerca de 150.000 ind./m e, em ambientes artificiais, foram encontradas populações com densidades ainda maiores, chegando a 2

aproximadamente 243.000 ind./m (DARRIGRAN et al. 2007).

Entre os problemas relacionados à incrustação por L. fortunei em UHEs pode-se citar a obstrução de tubulações, filtros, bombas, condensadores e turbinas. Em sistema de abastecimento de água, a presença de altas densidades do mexilhão dourado confere sabor e odor desagradáveis à água (RESENDE et al. 2007, DARRIGRAN 2010, SIM EÃO et al. 2011). Em plantas industriais que utilizam água bruta no sistema de resfriamento, a incrustação de L. fortunei dificulta a troca de energia térmica, resultando em sup eraquecimento de máquinas. As tubulações de água utilizadas no resfriamento de máquinas são menores e necessitam constantemente de limpeza. Custos operacionais, originalmente não previstos, estão entre as consequências geradas pela invasão.

O impacto sobre a fauna local e a alteração das cadeias alimentares também estão entre os problemas causados por L. fortunei. Os ecossistemas invadidos pelo mexilhão dourado sofrem diversas modificações físico-químicas e biológicas causadas pela alta taxa de filtração de L. fortunei, associada à elevada densidade populacional (M ANSUR et al. 2003, DARRIGRAN 2005, DARRIGRAN & DAM BORENEA 2011). Alterações na composição de espécies têm sido observadas e incluem o desaparecimento de algumas espécies e o favorecimento de outras. A alimentação por filtração gera a retirada de partículas da coluna de água e a subsequente deposição no sedimento em forma de fezes e pseudofezes. A redução da turbidez aumenta a penetração de luz na coluna de água, causando alterações no plâncton (BOLTOVSKOY et al. 2009). O impacto do mexilhão dourado na comunidade planctônica, decorrente do hábito filtrador, foi discutido em FACHINI et al. (2012). Por outro lado, a deposição de matéria orgânica no sedimento favorece a infauna e prejudica a epifauna endêmica (DARRIGRAN & DAM BORENEA 2011).

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Densas populações de L. fortunei têm causado grande impacto em comunidades de macroinvertebrados. Estudos em diferentes regiões têm mostrado um aumento da riqueza de macroinvertebrados, especialmente oligoquetos, hirudíneos e nematódeos. As espécies associadas a L. fortunei são mais abundantes e, enquanto ocorre um aumento das populações de alguns táxons, outros táxons claramente declinam (DARRIGRAN & DAM BORENEA 2011). Em um balneário do Rio do Prata, na Argentina, foi detectado o deslocamento de pelo menos duas espécies de gastrópodes nativos: Chilina fluminea (M aton, 1809) e Gundlachia concentrica (d’Orbigny, 1835) (DARRIGRAN, et al. 1998). O mexilhão dourado pode se fixar à concha de outros moluscos, exercendo assim efeitos deletérios sobre, por exemplo, o gastrópode Pomacea canaliculata (Lamarck, 1822) e até o bivalve invasor Corbicula fluminea (DARRIGRAN et al. 2000, SANTOS et al. 2012). Em uma ocasião, foram contabilizados 172 indivíduos de L. fortunei sobre um único exemplar do bivalve invasor C. fluminea (M ANSUR et al. 2003). A incrustação de L. fortunei sobre bivalves dificulta a movimentação das valvas e consequentemente a respiração e a alimentação, levando os organismos incrustados à morte (DARRIGRAN 2005, 2010). A conservação dos bivalves nativos da América do Sul tem sido motivo de preocupação e diversas espécies estão ameaçadas (PEREIRA et al. 2014). Os impactos da introdução de L. fortunei e de outros bivalves invasores no continente é mais um fator que coloca em risco os bivalves nativos (SANTOS et al.

2012, PEREIRA et al. 2014).

Os impactos do mexilhão dourado sobre a ictiofauna também têm sido descritos na literatura.

Devido à ocorrência desta espécie em grandes quantidades em rios e reservatórios, peixes onívoros têm alterado seus hábitos alimentares passando a se alimentar quase que exclusivamente do mexilhão dourado (PENCHASZADEH, et al. 2000), o que resulta em modificação de toda a cadeia trófica destes ecossistemas (DARRIGRAN & DAM BORENEA 2011). No alto do rio Paraguai, o mexilhão passou a ser utilizado como alimento por peixes pertencentes às famílias Characidae (Pacu - Piaratus mesopotamicus), Anostomidae (Piau-três-pintas - Leporinus friderici), Pimelodidae (M andi -Pimelodus maculatus) e Doradidae (Armau - Oxidororas kneri e Armado Ptedoras granulosus), representando de 12% (P. maculatus) até 100% (P. mesopotamicus e L. friderici) da dieta das espécies estudadas (OLIVEIRA 2003). No reservatório de Itaipu (Rio Paraná) nos anos de 2005 e 2006, das 36 espécies de peixes analisadas 24 consumiam L. fortunei, ressaltando o papel dos peixes no controle deste molusco invasor (OLIVEIRA et al. 2010). No caso da Bacia do Prata, a partir de registros da literatura, foi constatado que 17 esp écies de peixe predam L. fortunei (DARRIGRAN & DAM BORENEA 2011). Devido à abundância do mexilhão dourado nos ecossistemas, aqueles peixes que passaram a se alimentar desta espécie, puderam alocar a 15

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energia que era utilizada para buscar alimento, em outras atividades, como o crescimento e a reprodução. De fato, a invasão de L. fortunei foi associada ao aumento do estoque de espécies de importância comercial (BOLTOVSKOY et al. 2006). Além da predação de mexilhões adultos, as larvas deste molusco também são uma importante fonte de alimento para larvas de 18 espécies de peixe (BOLTOVSKOY et al. 2014). A presença de mexilhões vivos na porção terminal do sistema digestório de L. fortunei demonstrou a importância do transporte de peixes vivos, relacionada à aquicultura, na disp ersão desta esp écie (BELZ 2006; BELZ, et al. 2012).

1.3.

Considerações sobre a distribuição geográfica do mexilhão dourado na América do S ul

A invasão de L. fortunei na América do Sul já foi intensamente discutida (DARRIGRAN & M ANSUR 2006, 2009; DARRIGRAN 2010). De forma resumida, os principais acontecimentos foram listados cronologicamente, proporcionando assim uma visão panorâmica deste processo: 1) a presença da espécie foi detectada pela primeira vez na América do Sul na Argentina, no Rio da Prata, em 1991 (Balneário Bagliardi, Buenos Aires); 2) a partir daí a espécie invadiu quatro importantes rios da Bacia do Prata na Argentina; 3) entre 1995-1996 invadiu os rios Paraná e Paraguai; 4) o primeiro caso de bioincrustação para água doce na América do Sul foi registrado no final de 1994 na Argentina, sendo sucedido de outros casos em anos seguintes; 5) em 1994 o mexilhão foi localizado no Rio da Prata em território do Uruguai; 6) em 1996 foi registrado no Porto de Assunção, no Paraguai; 7) em 1998 na represa de Yacyretá, da usina hidrelétrica (UHE) binacional, que foi construída no Rio Paraná entre a Argentina e o Paraguai; 8) em 2001 foi detectado na UHE de Itaipu, que também é uma usina binacional (Brasil-Paraguai) no Rio Paraná; 9) em 2005

foi registrado na UHE binacional de Salto Grande, localizada no Rio Uruguai

(Argentina-Uruguai) e, posteriormente, ainda no mesmo ano, em outras localidades do Uruguai; 10) em 2002, o mexilhão se dispersou no oeste da Argentina e chegou a plantas nucleares deste país. De fato, o mexilhão dourado ao final de aproximadamente 10 anos de invasão da América do Sul já havia alcançado 5 países na seguinte ordem: Argentina (1991), Uruguai (1994), Paraguai (1997), Brasil (1998) e Bolívia (1998).

No Brasil (Figura 1), considera-se que duas introduções ocorreram praticamente ao mesmo tempo, uma no M ato Grosso do Sul (Corumbá), devido à intensa navegação fluvial, e outra via água de lastro, no Rio Grande do Sul (Porto Alegre, no Rio Guaíba) (DARRIGRAN & M ANSUR 2009). A 16

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figura 1 mostra uma cronologia da invasão na América do Sul, incluindo o Brasil. Até o momento, a ocorrência de L. fortunei no Brasil está descrita para as bacias dos rios Paraná, Paraguai, Uruguai, Grande e Lago Guaíba (DARRIGRAN & M ANSUR 2009, SANTOS et al. 2012, AGUDOPADRON 2012). O primeiro registro de L. fortunei no Pantanal ocorreu em 1998 sendo que vários registros posteriores foram reportados para esta região. A colonização de L. fortunei atingiu o sistema de bacias hidrográficas Paraná-Uruguai, e atualmente segue expandindo e já se encontra, por exemplo, na bacia do rio Tietê (São Paulo), na bacia do rio Paranaíba, que faz a divisa dos Estados de M inas Gerais e Goiás (DARRIGRAN & M ANSUR 2009, SANTOS et al. 2012, AGUDO-PADRON 2012). Além de afetar várias usinas hidrelétricas (ex. Itaipu e Porto Primavera), também foram invadidas pelo referido molusco as captações de água do Estado do Rio Grande do Sul (COLARES et al. 2002, SANTOS et al. 2012). Em algumas usinas instaladas em trechos do Rio Grande, em M inas Gerais, a presença de L. fortunei também foi documentada (ex. UHE de Volta Grande). De fato, foram registradas ocorrências em grande parte do Rio Grande, incluindo os reservatórios das usinas hidrelétricas de Porto Colômbia, M ascarenhas de M oraes e M arimbondo, na divisa dos estados de M inas Gerais e São Paulo (SANTOS et al. 2012). Em algumas localidades do país, o mexilhão foi detectado, porém as populações não se estabeleceram (Figura 1) (SANTOS et al. 2012). Ainda em 2012, a presença de L. fortunei foi notificada no estado de Santa Catarina, no reservatório entre as UHEs de M achadinho e Barra Grande na Bacia Hidrográfica do Alto do Rio Uruguai (AGUDO-PADRON 2012). Um ano após o primeiro registro, o mexilhão dourado já apresenta populações consolidadas nesta localidade, causando problemas nos setores de refrigeração da UHE de M achadinho, além de continuar avançando na Bacia do Alto do Rio Uruguai (AGUDO-PADRON

et al. 2012, AGUDO-PADRON &PORTO FILHO 2013,

DARRIGRAN et al. 2012). http://pt.wikipedia.org/wiki/Rio_Parana%C3%ADba#mediaviewer/Ficheiro:Riodelaplatabasinmap. png

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Figura 1: M apa mostrando a cronologia de ocorrência de L. fortunei no Brasil a partir do primeiro registro na América do Sul, as populações consolidadas e não consolidadas. As cores no mapa do Brasil representam as bacias hidrográficas. Fonte: SANTOS et al. (2012) com modificações e notificação de AGUDO-PADRON et al. (2012). Ilustração: Daniel Coscarelli.

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No Sul do Brasil foram identificados quatro potenciais vetores de dispersão do mexilhão dourado (BELZ et al. 2012): 1) o transporte de areia; 2) o deslocamento de embarcações de pesca com mexilhões incrustados para áreas livres de mexilhão, 3) o transporte de água em barcos de pesca; 4) em peixes vivos - ex. mexilhões vivos na porção final do intestino de Pterodoras granulosus (Valenciennes, 1821) (Siluroidei: Doradidae), nome vulgar: abotoado. A intensa navegação fluvial, o comércio de alevinos e as possibilidades anteriormente citadas, são reportados como as principais vias de dispersão do mexilhão dourado (FERNANDES et al. 2012). Diante dos p rejuízos causados por L. fortunei, empresas, principalmente do setor elétrico, tem financiado estudos sobre este invasor (ex. ITAIPU Binacional, CEMIG, FURNAS, VALE). As modificações ambientais causadas por uma usina podem favorecer alguns organismos em detrimento de outros. Um ambiente lótico é transformado em um reservatório, o qual passa a ter múltiplos usos. O avanço do mexilhão dourado no Brasil coincide com a existência de grandes UHEs. Alguns fatores podem estar relacionados a esta coincidência:

a) Os reservatórios de UHEs normalmente têm múltiplos usos como, por exemplo, a recreação e a implantação de ancoradouros para pequenas embarcações. Estas embarcações podem ser oriundas de diversos locais e através de seu deslocamento, incluindo transporte terrestre, podem carregar os mexilhões por grandes distâncias. Desta forma o mexilhão dourado pode se estabelecer em novos ambientes.

b) A formação de reservatórios permite a instalação de um conjunto de eclusas, as quais podem facilitar o processo de invasão biológica. O mexilhão pode aderir-se ao casco de cargueiros e de chatas de transporte, os quais têm constituído um importante vetor de transporte na região sudeste do Brasil. Isso favorece a dispersão do mexilhão dourado ao longo das bacias hidrográficas.

c) O aumento descontrolado do fluxo de pessoas e de materiais de pesca também pode ser um vetor de entrada de mexilhão nos reservatórios. De fato, existe uma sobreposição da distribuição da ocorrência de L. fortunei no Brasil (Figura 1) e a existência de grandes UHEs (Figura 2). Pela análise da Figura 2, pode-se observar no canto sup erior esquerdo, a concentração de UHEs no Brasil, que tem seu ponto máximo na região compreendida entre os Estados de M inas Gerais, Goiás, M ato grosso do Sul e São Paulo. Na porção central da Figura 2 (ANEEL 2008), observa-se a incidência de UHEs com potência instalada sup erior a 4.000 M W. Essas UHEs possuem grandes 19

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reservatórios, os quais são utilizados em múltiplas atividades. Entre estas, a atividade de recreação é bastante importante para a movimentação da economia do entorno dos reservatórios.

Figura 2: M apa mostrando a distribuição das UHEs e a potência das mesmas. A área destacada em amarelo representa a região de ocorrência do mexilhão dourado (SANTOS et al. 2012, AGUDOPADRON & PORTO FILHO 2013). Fonte: Atlas de Energia elétrica do Brasil - 3ª EDIÇÃO com modificações. www.aneel.gov.br/arquivos/pdf/atlas_p ar2_cap3.pdf - Aneel, 2008.

Considerando que existe uma distribuição coincidente do mexilhão dourado e as UHEs, é importante enfatizar que o setor energético no Brasil é bastante relevante. No país existem, em operação, aproximadamente 230 Centrais Geradoras Hidrelétricas (CGHs - com até 1 M W de potência instalada, com potência total de 120 M W); aproximadamente 320 Pequenas Centrais Hidrelétricas (PCHs - entre 1,1 M W e 30 M W de potência instalada, totalizando 2,4 mil M W de potência instalada); e 159 Usinas Hidrelétrica de Energia (UHEs, com mais de 30 M W, com uma capacidade total instalada de 74, 632 mil M W). A tabela 1 mostra as 10 das maiores UHEs em operação no Brasil e a situação atual frente ao mexilhão dourado. Até o final de 2008 as UHEs, independentemente de seu porte, respondiam, por 75,68% da potência total instalada no país 20

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(ANEEL 2008). O Brasil é o país com maior potencial hidrelétrico do mundo: um total de 260 mil M W dos quais pouco mais de 30% resultaram em UHEs construídas ou outorgadas. Considerando dados relacionados ao Plano Nacional de Energia 2030 (ANEEL 2008), o potencial elétrico que pode ser aproveitado no país é de cerca de 126.000 MW. Desse total, mais de 70% estão associados às bacias do Amazonas e do Tocantins/Araguaia.

Tabela 1. As dez maiores usinas em operação no Brasil, região e potência segundo dados da ANEEL 2008 e dados sobre a presença do mexilhão dourado.

Nome

Potência (kW)

Região

Norte

Ano de notificação da presença de L. fortunei _

Situação atual da presença de L. fortunei Livre

Tucuruí I e II

8.370.000

Itaipu (parte brasileira)

6.300.000

Sul

2001

Invadida

Ilha Solteira

3.444.000

Sudeste

2004

Invadida

Xingó

3.162.000

Nordeste

_

Livre

Paulo Afonso IV

2.462.400

Nordeste

_

Livre

Itumbiara

2.082.000

Sudeste

_

Sob ameaça iminente

São Simão

1.710.000

Sudeste

2003

Invadida

Governador Bento M unhoz da Rocha Neto (Foz do Areia)

1.676.000

Sudeste

_

Sob ameaça iminente

Jup iá (Eng. Souza Dias)

1.551.200

2004

Invadida

Sudeste

Porto Primavera 1.540.000 Sudeste 2002 Invadida (Eng. Sérgio M otta) Fonte: Tabela retirada de ANEEL (2008) com modificações. Dados referentes à presença de L. fortunei retirados de SANTOS et al. (2012).

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1.4. O controle químico e seus impactos ambientais

A prevenção e o controle de espécies invasoras têm sido um desafio. Diversas alternativas se mostraram ineficazes ou muito laboriosas e, quando eficientes, com frequência geram impactos negativos no ecossistema aquático e na biodiversidade local. As metodologias e recursos utilizados no controle de espécies invasoras em plantas industriais dependentes da captação de água para o seu funcionamento, quase sempre geram resíduos químicos, os quais, além de serem lançados no ambiente, ainda podem acelerar a corrosão diminuindo o tempo de vida de equipamentos, bombas e tubulações. Uma importante revisão sobre métodos de controle dos mexilhões invasores enfatiza que atualmente o controle químico tem sido utilizado com mais frequência (M ACKIE & CLAUDI 2010). No entanto, estes autores pontuam que, a aplicação destes produtos deve ser cautelosa, pois pode causar danos aos sistemas hídricos, como por exemplo, a alteração dos padrões de qualidade de água e a extinção de espécies nativas e, portanto, têm sua utilização ainda muito restrita e em caráter experimental.

Com a introdução de L. fortunei no Brasil, diversos métodos químicos de controle têm sido utilizados. Resultados promissores foram alcançados com tratamentos de longo prazo em sistemas de arrefecimento com hidróxido de sódio (NaOH) e um produto comercial a base de taninos e amônia quaternária produzido no Brasil (M XD-100 - M axclean Ambiental e Química S.A, Brasil) (ROLLA & M OTTA 2010, CALAZANS et al. 2012). Neste contexto, a toxicidade do efluente do sistema de arrefecimento deve ser rotineiramente monitorada, de forma que os padrões exigidos para efluentes industriais sejam atendidos. No entanto, as implicações ecotoxicológicas do controle químico do mexilhão dourado no Brasil não têm sido exploradas (M ONTRESOR et al. 2013 – APÊNDICE 2). A expansão desta espécie no país, bem como em outras áreas da América do Sul e a consequente expansão do uso de métodos químicos de controle, devem ser cuidadosamente estudadas, visando à mitigação dos impactos ambientais.

2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo Geral Investigar os efeitos ecotoxicológicos do controle químico de L. fortunei através da análise comparativa da toxicidade de diferentes compostos ao mexilhão dourado e a organismos não alvo, 22

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visando à mitigação dos impactos ambientais associados ao controle químico desta espécie invasora.

2.2. Objetivos específicos

Avaliar a toxicidade aguda de alguns compostos químicos (amônia, nitrito, nitrato, hidróxido de sódio, M XD-100 e cloreto de sódio) ao mexilhão dourado por meio da estimativa da concentração letal mediana (CL50) para diferentes estádios de vida, em testes com duração de 24 a 96 horas.

Verificar a ocorrência de alterações comportamentais (fechamento de valvas) em adultos de L. fortunei expostos a diferentes compostos químicos (amônia, nitrito, nitrato, hidróxido de sódio, M XD-100 e cloreto de sódio).

Análisar comparativamente a sensibilidade de diferentes estádios de vida de L. fortunei aos químicos testados e avaliar possíveis implicações em estratégias de controle, visando à redução do impacto ambiental.

Ampliar o conhecimento sobre os limites de segurança de L. fortunei (estimados a partir da CL50 96h) a variáveis físico-químicas da água, visando fornecer subsídios que auxiliem (1) o desenvolvimento de metodologias de controle, (2) a elaboração de modelos preditivos de expansão da espécie e (3) o aprimoramento da metodologia de manutenção de L. fortunei em laboratório através do monitoramento destes parâmetros físico-químicos.

Usar dois químicos selecionados nos testes de toxicidade aguda (M XD-100 e amônia) para testar possíveis impactos do controle químico do mexilhão dourado em espécies não alvo de diferentes táxons (o protista ciliado Paramecium caudatum, os moluscos gastrópodes Omalonyx matheroni, Physa acuta, Pomacea dolioides e os peixes tilápia, Oreochromis niloticus, e peixe zebra, Danio rerio) a partir de uma abordagem ecotoxicológica comparativa.

Testar os valores de segurança do M XD-100 e da amônia (obtidos na etapa anterior) para L. fortunei (adultos e jovens) em exposição crônica de 21 dias utilizando como parâmetro a mortalidade e o conteúdo de carboidratos nos tecidos (dando ênfase aos níveis de glicogênio).

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3. REVIS ÃO DA LITERATURA

3.1. Biologia do mexilhão dourado

Limnoperna fortunei é um bivalve pequeno (2 a 4 cm) que apresenta a concha com o mesmo formato dos mexilhões marinhos (família M ytilidae). A coloração da concha pode variar de amarelada até marrom escuro. O formato achatado das valvas e a presença dos filamentos de bisso favorecem a fixação dos mexilhões e a colonização de substratos duros, com consequente formação de populações de alta densidade. Estes bivalves epifaunais são dióicos, com machos e fêmeas na maioria das vezes presentes em proporções bastante semelhantes, no entanto, casos isolados de hermafroditismo foram reportados (DAM BORENEA & PENCHASZADEH 2006). Os indivíduos adultos medem aproximadamente 4 cm e vivem cerca de dois a três anos. No primeiro ano de vida alcançam a maturidade sexual. O comprimento da concha de um animal no primeiro ano de vida é de aproximadamente 5 mm.

O ciclo de vida do mexilhão inclui um estádio juvenil/adulto bentônico e um estádio larval planctônico. SANTOS et al. (2005) descrevem as fases do ciclo larval do mexilhão e resumidamente, os seguintes estádios são reconhecidos: trocófora (comprimento 80-125 µm), véliger (150-220 µm), pedivéliger (220 a 250 µm) e a pós-larva ou plantígrada (aproximadamente 300 µm), onde a larva inicia a produção dos filamentos de bisso. Ap ós este último estádio larval, os indivíduos abaixo de 5 mm são denominados recrutas (SANTOS et al. 2008). A fecundação desta espécie ocorre externamente através de um processo de eliminação de gametas na água (DARRIGRAN & DAM BORENEA 2006, DAM BORENEA & PENCHASZADEH 2006). A proximidade de indivíduos machos e fêmeas dentro das rosetas (aglomerados de mexilhões comportamento gregário) facilita o sucesso de fecundação externa. O ciclo de liberação dos gametas do mexilhão é influenciado pelas condições climáticas e ambientais. A maturação dos gametas sofre influência de fatores sazonais (DARRIGRAN et al. 1999, DARRIGRAN & DAM BORENEA 2006, DAM BORENEA & PENCHASZADEH 2006, SANTOS et al. 2012). Desta forma, períodos contínuos de reprodução são alternados com períodos de repouso. Em localidades diferentes, de acordo com o clima e com as condições físico-químicas do ambiente, os ciclos reprodutivos do mexilhão dourado apresentam padrões regionais. De fato, em diferentes localidades estudadas os ciclos de liberação de gametas e o repouso se alternam de forma característica em cada uma delas (DARRIGRAN & DAM BORENEA 2006, DAM BORENEA & PENCHASZADEH 2006). O 24

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estádio larval é o período de maior dispersão e, de acordo com as condições ambientais, principalmente a temperatura, sua duração pode variar de 30 a 70 dias (DARRIGRAN & DAM BORENEA 2006, DAM BORENEA & PENCHASZADEH 2006, M ACKIE & CLAUDI 2010). A presença e abundância de larvas em determinado local está associada à densidade das populações e também as condições químicas (ex. pH, níveis de cálcio), físicas (ex. velocidade da corrente de água, temperatura) e biológicas (produtividade primária) do ambiente (DARRIGRAN & DAM BORENEA 2006).

3.2. O processo de invasão: características ambientais e plasticidade fisiológica

O sucesso de uma invasão depende de diversos fatores, alguns deles relacionados ao organismo (invasiveness), como a plasticidade fisiológica, que confere a algumas espécies a capacidade de tolerar uma faixa maior de flutuações ambientais. Outros fatores são inerentes ao ambiente a ser colonizado (invasibility) (DARRIGRAN et al. 2011). No início do processo de invasão do continente americano, o mexilhão-dourado colonizou regiões temperadas, na foz do Rio da Prata e posteriormente se expandiu até áreas subtropicais com invernos mais curtos. O mexilhão dourado pode ser encontrado em águas salinas, com concentrações de sal de até 3‰ (g/L). Os limites de tolerância da espécie, e as características físico-químicas do ambiente, foram utilizados para (1) verificar a possibilidade de invasão em tributários Andinos da Bacia do Rio da Prata (DARRIGRAN et al. 2011), (2) compreender o processo de invasão e as possibilidades de dispersão em algumas localidades no Rio Uruguai e seus afluentes em uma área de planície de inundação (Esteros del Iberá) na Argentina (DARRIGRAN et al. 2012), (3) estimar o potencial de dispersão da espécie na Bacia do Rio Paraguai, onde já ocorre em algumas localidades, para outras bacias hidrográficas do Brasil e em três grandes bacias norte americanas (OLIVEIRA et al. 2010 b, c, d).

As principais variáveis ambientais que influenciam no estabelecimento de bivalves em ecossistemas de água-doce são a concentração de cálcio, alcalinidade, pH, oxigênio dissolvido, dureza total, temperatura, turbidez, condutividade e clorofila a (M ACKIE & CLAUDI 2010). Recentemente, foi feito um trabalho de revisão sobre os limites de tolerância de L. fortunei (DARRIGRAN et al.

2011), os quais se encontram listados na Tabela 2. No entanto, estes limites foram estabelecidos com base em observações realizadas em campo. Ensaios em laboratório podem ajudar a melhor compreender a tolerância ambiental e a sensibilidade do mexilhão dourado a compostos químicos.

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Tabela 2. Limites de tolerância de Limnoperna fortunei Parâmetros Salinidade sup erior

Temperatura mais baixa

Temperatura mais alta

Valor ≤ 3 g.L-¹ < 5 g.L-¹ 0ºC 5ºC 12°C 31,8°C 33°C 35°C

pH mais elevado

7,22 7,8

pH mais baixo

6,0 6,2 6,3

Cálcio mais elevado

11,60 mg/L

Cálcio mais baixo

1 mg/L 3,96 mg/L

Oxigênio mais baixo

0,2 mg/L

Oxigênio mais elevado

11,33 mg/L

M enor concentração de sólidos em suspensão

0,0001 g/L

M aior concentração de sólidos em suspensão

0,214 g/L

Exposição ao ar (ambiente com umidade elevada)

168 h 72-276 h

Profundidade

40 m

M enor transparência

0,1 m 0,156 m

Velocidade da água sup erior

1,1 m.s-¹

Nota: Dados extraídos de DARRIGRAN et al. (2011).

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Um dos mais importantes parâmetros que limitam a invasão de moluscos é a concentração de cálcio. Na maioria dos ecossistemas de água-doce as concentrações de Ca2+ são baixas, no entanto, o cálcio é de grande importância para a formação da concha dos moluscos. O íon cálcio é ainda necessário em uma série de funções fisiológicas dos moluscos, incluindo a sinalização celular, regulação ácido-base e contração muscular (BRUSCA & BRUSCA 2003). M oluscos de água-doce apresentam sofisticados mecanismos de captação, transporte e metabolização do cálcio (M ACHADO & LOPES-LIMA 2011). Um índice foi criado para indicar a tendência ao equilíbrio termodinâmico relacionado ao carbonato de cálcio (CaCO3) em uma escala logarítmica na base dez, considerando a temperatura da água, pH, condutividade, alcalinidade total (GRAN 1952) e cálcio dissolvido (APHA 2005). Este é denominado índice de saturação da calcita (SIcalcite = calcite saturation index). Assim, um valor positivo indica um ambiente sup ersaturado e um valor negativo insaturado (OLIVEIRA et al. 2010 c, d). O p adrão espacial da concentração de cálcio e do potencial de calcificação foi utilizado por OLIVEIRA et al. (2010c) para construir modelos de nicho ecológico.

No Brasil, diversos locais apresentam condições favoráveis à colonização por L. fortunei, incluindo áreas do estuário do Amazonas, e alguns de seus tributários mais ao Sul (Tapajós, Teles Pires, Araguaia), além da bacia do São Francisco e parte da Bacia do Paraná (Rio Paranaíba) (OLIVEIRA et al. 2010c). Condições desfavoráveis para o estabelecimento de populações de L. fortunei incluem, por exemplo, extremos de pH ou temperatura, baixa dureza, alta turbidez, variações físicoquímicas sazonais de grande amplitude, entre outros. Em tributários Andinos da Bacia do Rio da Prata, as principais barreiras à expansão do mexilhão dourado, segundo DARRIGRAN et al.

(2011), são a salinidade, os sedimentos e as barreiras hidrológicas. Os mesmos fatores citados acima, além do pH da água, foram utilizados para uma análise de ocorrência e de possibilidade de dispersão de L. fortunei em tributários dos rios Uruguai e Paraná em uma região de planície de inundação, na Argentina (DARRIGRAN et al. 2012). O mexilhão dourado apresenta uma amplitude de tolerância ambiental ainda maior que a do mexilhão-zebra (D. polymorpha), tolerando águas mais ácidas, de baixa dureza e com altos níveis de poluição (KARATAYEV et al. 2007, 2010).

M odelos preditivos indicam a possibilidade de colonização por L. fortunei nas regiões ao sul e no centro da América do Norte (KARATAYEV et al. 2007, OLIVEIRA et al. 2010a, DARRIGRAN et al. 2011), o que causaria perdas econômicas e ecológicas muito maiores do que aquelas já causadas pelos bivalves invasores D. polymorpha e Corbicula sp . Considerando os impactos econômicos e ecológicos que podem ser gerados pela expansão da distribuição de L. fortunei, investimentos em políticas de controle e pesquisa básica e aplicada são bem justificados e urgentes.

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3.3. Estudos ecotoxicológicos e proteção ambiental A ecotoxicologia estuda diversos aspectos da contaminação ambiental por poluentes naturais ou artificiais e seus efeitos sobre os organismos vivos (LEBLANC 2004, M AGALHÃES & FERRÃO FILHO 2008). As pesquisas em ecotoxicologia incluem bioensaios ou testes de toxicidade, nos quais são avaliadas as respostas, algum dano ou a morte dos organismos testados (M ING-HO 2005). Testes ecotoxicológicos enfocam a relação de causa e efeito entre a concentração de determinado poluente (ou mistura de poluentes) e os danos a diferentes espécies. Nos testes, os organismos são expostos a diferentes concentrações de um poluente (químico ou físico) por um determinado tempo e os efeitos sobre a mortalidade, comportamento, reprodução, crescimento, morfologia, aspectos fisiológicos e bioquímicos são observados (JAM ES at al. 2000). A mortalidade e o comportamento são frequentemente utilizados na avaliação da toxicidade de um composto químico a uma espécie (M AROÑAS & DAM BORENEA 2006; USEPA 2008; SOARES et al. 2009). Em um cenário global de crescente impacto ambiental, a ecotoxicologia tem se destacado como um importante campo de estudo, não só para a ampliação do conhecimento científico, como também para o estabelecimento de medidas regulatórias.

Estudos ecotoxicológicos são essenciais no estabelecimento e no aprimoramento de medidas preventivas e na determinação dos limites legais para a emissão de efluentes (M ING-HO 2005).

Quanto maior a diversidade de táxons e o número de espécies testadas, melhor o entendimento sobre os danos causados pelo poluente. Uma vez que organismos distintos apresentam diferentes níveis de sensibilidade aos compostos químicos, a correta avaliação de risco ambiental resulta do conhecimento sobre o nível de segurança para diferentes espécies. A escolha, nos testes de toxicidade, de espécies representativas do ambiente em questão e sensíveis ao poluente testado assegura que os limites terão efeito protetivo para toda aquela comunidade de organismos (DOM INGUES & BERTOLETTI, 2006). Para que os testes de toxicidade sejam reprodutíveis e confiáveis, os métodos para a execução destes devem ser padronizados (ADAM S & ROWLAND 2003, APHA 2005, BERTOLETTI 2009).

A partir de 1970, muitas metodologias foram padronizadas e utilizadas como referência em vários países. No Brasil, o primeiro procedimento padronizado para execução de testes ecotoxicológicos com organismos aquáticos foi publicado em 1987, pela Associação Brasileira de Normas Técnicas ABNT (M ARTINS & BIANCHINI 2011). No entanto, até o presente momento, a maior parte dos testes de toxicidade utiliza os padrões internacionais e, portanto, empregam espécies não nativas. A 28

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padronização internacional possibilita a comparação de resultados, mas por outro lado, pode gerar resultados que impliquem em critérios de qualidade de água não protetivos para os organismos e ecossistemas do Brasil (M ARTINS & BIANCHINI 2011). Entre os organismos utilizados com maior frequência nos ensaios ecotoxicológicos com efluentes industriais, pode-se citar a bactéria Vibrio fischeri, as algas Chlorella vulgaris, Scenedesmus subspicatus e Pseudokirchneriella subcaptata, os microcrustáceos Daphnia similis, Daphnia magna, Ceriodaphnia dubia e Ceriodaphnia silvestrii, os p eixes Danio rerio e Pimephales promelas (COSTA et al. 2008).

Os limites nacionais para a emissão de efluentes são estabelecidos pela Resolução Nº357/2005 do Conselho Nacional de M eio Ambiente - CONAM A (BRASIL, 2005). Os testes de toxicidade são abordados na Resolução Nº 430/2011 (BRASIL, 2011), a qual dispõe sobre as condições e padrões de lançamento de efluentes; e complementa e altera a Resolução Nº357/2005. Critérios mais restritivos podem ser adotados nos estados, o que, de fato, ocorre em alguns casos, como, por exemplo, em São Paulo (Resolução da Secretaria do M eio Ambiente: SM A 03/2000) (SÃO PAULO, 2000); Paraná (Conselho Estadual do M eio Ambiente: CEMA Resolução N° 081/2010) (PARANÁ, 2010) e M inas Gerais (Conselho Estadual de Política Ambiental: COPAM Deliberação Normativa Conjunta Nº01/2008) (M inas Gerais, 2008).

Em relação ao tempo de duração, os ensaios podem ser considerados agudos ou crônicos. Nos testes de toxicidade aguda, os organismos são expostos por um curto período de tempo (até 96 horas) a, no mínimo, cinco concentrações da substância tóxica, incluindo concentrações que resultam em 0 a 100% de mortalidade (ADAM S & ROWLAND 2003). Este tipo de teste gera respostas em um curto intervalo de tempo mediante estimativas do efeito tóxico. Na estimativa da concentração efetiva mediana (CE50), o valor se refere à concentração capaz de causar alteração comportamental (usualmente a imobilidade) em 50% dos indivíduos testados. A concentração letal mediana (CL50) é aquela que causa a mortalidade de 50% dos indivíduos testados. As principais vantagens destes testes são o curto tempo de duração, o baixo custo e a existência de protocolos amplamente aceitos e de execução relativamente simples. Por estes motivos estes testes são amplamente difundidos e fornecem informações que compõem um importante banco de dados ecotoxicológicos.

Em testes de toxicidade crônica, o enfoque é o efeito em longo prazo de concentrações subletais das substâncias tóxicas investigadas. Nestes casos, busca-se verificar efeitos não letais, os quais são mais sutis, como alterações na reprodução, no crescimento, no comportamento, em parâmetros fisiológicos, entre outros (M ING-HO 2005). Testes crônicos abrangendo o ciclo de vida completo 29

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do organismo são mais complexos e onerosos. Desta forma, são mais difundidos ensaios abrangendo parte do ciclo de vida ou os estádios iniciais do organismo-teste como embriões, larvas e juvenis (M cKIM , 1977). Testes de toxicidade crônica de 7 a 21 dias de duração com microcrustáceos dos gêneros Daphnia e Ceriodaphnia são rotineiramente utilizados na avaliação de amostras ambientais e para testes de produtos químicos (ARAGÃO & ARAUJO 2006).

3.4. S ensibilidade do mexilhão dourado a compostos químicos e ensaios em laboratório

Ap esar dos impactos causados pelo mexilhão dourado, poucos estudos avaliaram em laboratório a sensibilidade desta espécie a compostos químicos. O conhecimento sobre a toxicidade de compostos químicos a esta espécie tem implicações para o controle químico. Devido a sua semelhança com o mexilhão zebra (D. polymorpha), muitas das alternativas empregadas na tentativa de solucionar os problemas causados pelo mexilhão dourado, são baseadas nas soluções aplicadas no combate ao mexilhão zebra. Entretanto, verificou-se que L. fortunei é mais tolerante a produtos e tratamentos que D. polymorpha (KARATAYEV et al. 2007, M ACKIE & CLAUDI 2010, DARRIGRAN et al. 2011). Com a expansão do mexilhão dourado, é cada vez mais importante que se conheça sua sensibilidade a compostos químicos que possam ser empregados em planos de controle. Estes dados podem auxiliar na prevenção da expansão desta espécie e a traçar estratégias de controle (DARRIGRAN et al. 2011, 2012)

Os testes de toxicidade são uma importante ferramenta na seleção de biocidas. Em principio, testes toxicológicos podem ser realizados com qualquer espécie aquática, desde que apresente determinadas características (ex. fácil cultivo e adaptação a condições de laboratório) e que asp ectos de sua biologia e comportamento sejam conhecidos (COSTA et al. 2008). Experimentos com bivalves apresentam algumas peculiaridades. Quando ocorre mortalidade não se pode observar imediatamente uma vez que os animais se fecham dentro das valvas. Em relação ao comportamento, o repertório dos bivalves é bastante restrito. Recentemente, PEREIRA et al. (2012) fizeram considerações sobre os procedimentos necessários para os ensaios ecotoxicológicos com bivalves (especificamente L. fortunei). Estes autores trataram dos critérios de letalidade e de comportamento que devem ser observados durante os experimentos (como a extensão do sifão e a abertura ou fechamento das valvas). Critérios para a seleção dos animais que irão compor os grupos experimentais também foram reportados e validados por diversos autores (COSTELLO et al. 2009, PEREYRA et al. 2011, 2012, Di FIORI et al. 2012, PEREIRA et al. 2012). Os critérios variam um 30

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pouco, entretanto, todos visam selecionar exemplares que demonstram estar em boas condições (como sifão exposto e fixação pelo bisso). Animais que não apresentem sifão exposto, resposta rápida a estímulo mecânico e que não tenham secretado o bisso, não devem ser utilizados nos experimentos (COSTELLO et al. 2009, PEREYRA et al. 2011, 2012, PEREIRA et al. 2012).

Os critérios de letalidade variam entre os trabalhos (COSTELLO et al. 2009, PEREYRA et al.

2011). Diante do fechamento total das valvas, para verificar se o animal está morto ou vivo, este deve ser dissecado. A avaliação da anatomia interna permite verificar o batimento dos filamentos branquiais (PEREIRA et al. 2012). O critério de letalidade para larvas considera a ausência total de natação e de atividade interna (verificada por transparência) (PEREYRA et al. 2011,2012). Além dos critérios de letalidade, o comportamento do mexilhão frente ao componente tóxico é um fator extremamente importante. O fechamento das valvas na presença de um composto químico foi denominado de “comportamento evasivo” ( Di FIORI et al. 2012), e visa minimizar o contato do mexilhão com o toxicante. O comportamento evasivo de L. fortunei frente ao glifosato foi recentemente avaliado por Di FIORI et al. (2012). Estes autores, no entanto, não detectaram diferenças significativas entre o comportamento dos animais expostos ao químico e o grupo controle. Devido ao comportamento evasivo, aplicações intermitentes em baixas concentrações são geralmente eficientes na prevenção da incrustação de organismos ou bioincrustação, e resultam na aplicação de menores quantidades de produtos químicos.

No caso de ensaios com larvas de mexilhão, estas devem ser selecionadas de acordo com o estádio de desenvolvimento em que se encontram. Além disso, deve-se observar se estas apresentam alguma alteração morfológica ou comportamental (PEREIRA et al. 2012). Estudos sobre o controle de bivalves invasores indicam que as estratégias de controle voltadas para os estádios larvares resultam no uso de menores quantidades de biocidas (VERWEEN et al. 2009). Geralmente, os estádios mais jovens de um organismo são mais sensíveis à toxicidade de compostos químicos. No caso dos bivalves, indivíduos adultos são relativamente tolerantes a solventes orgânicos e a pesticidas, e os estádios larvais são muito sensíveis a compostos químicos inorgânicos como cloro, metais e amônia (AUGSPURGER et al. 2003). Devido à dificuldade de manter estes animais em laboratório, faltam estudos visando à padronização de testes de toxicidade para os estádios iniciais de vida de bivalves de água doce.

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A correta manutenção de bivalves em laboratório é um grande desafio técnico. No caso dos ensaios toxicológicos com mexilhão dourado, para que a confiabilidade dos experimentos seja garantida, várias medidas tornam-se necessárias, começando pelo constante monitoramento e controle da qualidade da água até aos cuidados com a produção de alimento (algas unicelulares) e com a frequência e a quantidade com que este é ofertado durante o período de aclimatação. Assim, a manutenção em laboratório de populações em boas condições fisiológicas e sanitárias dependerá de uma série de fatores, que começa pela coleta e transporte dos espécimes até o local de estudo e envolvem toda uma rotina diária de alimentação e monitoramento da qualidade da água (M ONTRESOR et al. 2011 – APÊNDICE 03).

Além disso, para que se possa manter uma espécie em cativeiro é essencial que sejam conhecidos seus limites fisiológicos, de forma que se possa adequar o ambiente do cativeiro para a espécie estudada. No caso de organismos aquáticos, é essencial que sejam conhecidos os parâmetros ideais para a manutenção da espécie (ex: pH, temperatura, oxigênio dissolvido, dureza, salinidade, concentração de amônia, nitrito, nitrato etc.). Ap esar da crescente importância dos estudos em laboratório com L. fortunei, diversos asp ectos importantes p ara a correta manutenção em laboratório ainda são desconhecidos.

Os ensaios ecotoxicológicos em laboratório geram resultados que auxiliam também na compreensão dos limites de tolerância de uma espécie (BERTOLETTI 2009, M ARTINS & BIANCHINI 2011).

No caso de compostos que ocorrem usualmente na água, informações sobre sua toxicidade ao mexilhão dourado podem auxiliar no desenvolvimento de modelos preditivos da expansão da espécie e para a padronização e validação de testes de toxicidade. Aspectos físico-químicos afetam a distribuição desta espécie (ex: temperatura, salinidade, alcalinidade, dureza, pH etc.) e conhecer a sua faixa de tolerância nos diferentes estádios de vida a compostos químicos auxilia na elaboração de modelos de predição.

3.4.1. S ensibilidade do mexilhão dourado ao nitrogênio inorgânico

O nitrogênio é um dos elementos químicos mais abundantes do planeta e é um componente essencial das principais biomoléculas. Nos ecossistemas aquáticos, as formas mais comuns de nitrogênio inorgânico são os íons NH 4+ , NO 2- e NO3- (amônia ionizada ou amônio, nitrito e nitrato).

A amônia tende a ser oxidada a nitrito e posteriormente a nitrato em um processo oxidante de duas 32

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etapas (principalmente por bactérias quimioautotróficas) (SHARM A & AHLERT 1977). Nas últimas décadas, a poluição antrop ogênica tem alterado substancialmente o ciclo do nitrogênio e resultado em um grande aumento da poluição por nitrogênio orgânico e inorgânico. Os animais aquáticos são geralmente sensíveis ao nitrogênio inorgânico. Assim, as altas concentrações de amônia decorrentes das atividades humanas causam impactos ecotoxicológicos diretos e indiretos sobre os organismos aquáticos (AUGSPURGER et al. 2003; CAM ARGO & ALONSO 2006)

A amônia é uma substância extremamente tóxica para peixes e outros organismos aquáticos (THURSTON & RUSSO 1981, CAM ARGO & ALONSO 2006). O pH e a temperatura são os +

principais parâmetros que determinam o equilíbrio químico entre a forma ionizada (NH 4 ) e a não ionizada (NH 3). Quanto maior o valor destes, maior tendência à formação de NH 3, a qual é mais solúvel em lipídios e facilmente se difunde pelas membranas celulares, causando efeitos tóxicos mesmo em baixas concentrações (THURSTON & RUSSO 1981). A toxicidade da amônia varia amplamente entre os táxons de invertebrados. Estudos de toxicidade à amônia têm revelado que os bivalves de água doce são particularmente sensíveis a este composto químico (USEPA 2008).

Os efeitos tóxicos de amônia para bivalves de água doce e marinhos têm sido relatados e incluem: 1) redução da quantidade de tempo que as valvas são mantidas abertas para a respiração e alimentação; 2) secreção prejudicada do fio de bisso e 3) diminuição da ação ciliar e alteração do metabolismo (REDDY & M ENON 1979, M UMMERT et al. 2003). Além disso, os estádios iniciais de mexilhões são mais sensíveis do que os adultos ao NH 3, e eles também podem ser mais sensíveis quando comparados com outros invertebrados e com algumas espécies de peixes (M UM M ERT et al. 2003, BOARDM AN et al. 2004, CHERRY et al. 2005).

M uitos estudos investigaram os efeitos tóxicos da amônia em espécies de água doce, no entanto, são relativamente escassos os trabalhos sobre as outras formas comuns de nitrogênio inorgânico, o nitrito e o nitrato (SOUCEK & DICKNSON 2012). Em ecossistemas de água doce as concentrações de nitrito e nitrato estão aumentando, em consequência das fontes antrop ogênicas de aporte de nitrogênio na água. Em locais poluídos, a concentração de nitrito pode exceder 73 mg/L N-NO 2(ALONSO & CAM ARGO 2006), no entanto, a concentração letal mediana (CL50) para diversas espécies é menor que este valor (SOUCEK & DICKNSON 2012). A partir de dados de toxicidade aguda foram estabelecidos critérios de qualidade de água adequados à proteção de espécies sensíveis (ao menos para exposições em curto prazo), segundo os quais, o limite máximo deve estar 33

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entre 0,08 e 0,35 mg/L N-NO 2- (ALONSO & CAM ARGO 2006). O nitrato é menos tóxico que o nitrito e que a amônia, assim, seu efeito tóxico é geralmente desconsiderado. No entanto, estudos -

em laboratório têm mostrado que concentrações de nitrato de 10 mg/L N-NO 3 podem afetar negativamente espécies sensíveis em exposições crônicas. A partir de estudos com diferentes -

táxons, o limite máximo recomendado varia entre 2,0 e 3,6 mg/L N-NO 3 (ALONSO & CAM ARGO 2006).

3.4.2. S ensibilidade a valores elevados de pH e o uso de NaOH no controle químico do mexilhão dourado

De acordo com DARRIGRAN et al. (2011), L. fortunei ocorre em ambiente com pH entre 6,0 e 7,8.

Valores acima ou abaixo do limite de tolerância podem prevenir o assentamento das larvas (M ACKIE & CLAUDI 2010). O hidróxido de sódio está sendo considerado como uma ótima opção para controle do mexilhão dourado em tubulações de sistemas de resfriamento de água. Em relação a outros métodos de controle químico, o NaOH mostrou-se economicamente mais vantajoso, tendo demonstrando ainda eficiência na diminuição da bioencrustação causada por outros organismos e na redução da corrosão química e biológica (LACTEC 2004, M ADER NETTO 2011). A injeção de NaOH (pH de 8 a 8,5) faz com que os grupos carboxílicos dos ácidos húmicos e compostos orgânicos sejam ionizados, minimizando a bioincrustação nos sistemas de resfriamento (LACTEC 2004). Em estudos realizados na Usina Hidrelétrica de Salto Caxias, localizada no Estado do Paraná, M ÄDER NETTO (2011) menciona o controle de 99% da bioincrustação, em 12 meses de experimento, adicionando ininterruptamente NaOH na tubulação, de forma a manter o pH 9. A alteração de pH tem sido considerada uma importante estratégia no controle de D. polymorpha e no tratamento da água de lastro (TENEYEK 2009).

3.4.3. S ensibilidade do mexilhão dourado a um biocida composto de amônia quaternária e taninos

Alguns compostos a base de taninos têm mostrado uma boa atividade biocida, e baixa toxicidade ambiental. O M XD-100 é composto por amônia quaternária e taninos e tem sido utilizado no Brasil para o controle do mexilhão dourado. Os componentes a base de amônia quaternária não são detectados pelos animais como compostos nocivos. Desta forma, mesmo na presença destes compostos químicos, os mexilhões continuam com a sua atividade filtradora (sifão exposto) 34

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(M ACKIE & CLAUDI 2010). O M XD-100 é considerado um biocida biodegradável, não corrosivo a metais, de baixa toxicidade a seres humanos e à biota aquática (M ÄDER NETTO 2011). Os resultados do uso do M XD-100 têm sido satisfatórios. Entre os locais onde este biocida foi testado pode-se citar CESP, Ibitinga da AES Tietê, Governador José Richa da COPEL, Manso de FURNAS e Itaipu. No entanto, não foi realizada uma avaliação detalhada sobre a eficiência e ou comparação com outras metodologias (M ÄDER NETTO 2011). Em um estudo comparativo entre o MXD-100 e o NaOH, este último se mostrou mais eficiente no controle da bioincrustação, além de apresentar um menor custo, sendo uma boa alternativa de controle químico (M ÄDER NETTO 2011).

Segundo M ÄDER NETTO (2011), é possível manter os sistemas de resfriamento tratados tanto com M XD-100 quanto com NaOH, operando normalmente em ambientes aquáticos com a presença de L. fortunei. Em ambos os tratamentos não se observa a redução da vazão do sistema de resfriamento e nem os aumentos de temperaturas resultantes da bioincrustação pelo mexilhão dourado. No entanto, o autor ressalta que o uso do NaOH tem um custo menor. A continuidade de pesquisas avaliando os prós e contras de diferentes estratégias de controle químico irão contribuir para uma melhor adequação das metodologias de controle em relação aos aspectos econômicos e ambientais.

3.4.4. S ensibilidade do mexilhão dourado ao sal Ap esar de ser considerada uma espécie de água doce, o mexilhão dourado ocorre em áreas de estuário. Estudos em laboratório demonstraram que L. fortunei tem alta tolerância a variações de salinidade, o que favorece a invasão de novas áreas a partir de água de lastro e a invasão de áreas de estuário (SYLVESTER et al. 2013). A tolerância a variações de salinidade para vários invertebrados de água doce tem sido investigada e os níveis de salinidade entre 5 a 8‰ (g/L) têm sido considerados como o limite sup erior sup ortado por estas espécies, apesar da escassez de estudos com estes animais (BEREZINA 2003).

Estudos realizados em campo indicam que a sobrevivência e a manutenção do mexilhão dourado são ameaçadas em salinidades sup eriores a 3‰ (CAPITOLI et al. 2008). Em recente revisão sobre a tolerância ambiental do mexilhão dourado, foi relatado que para este bivalve, o limite de tolerância à salinidade foi menor ou igual a 3‰ (DARRIGRAN et al. 2011). Estudos em laboratório indicam que L. fortunei não consegue sobreviver por mais de quatro dias em salinidades sup eriores a 4‰ (ANGONESI et al. 2008), no entanto, outras variáveis que não foram controladas podem ter 35

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interferido neste resultado. A capacidade de L. fortunei de sobreviver em ambientes salobros pode ser evidenciada, por exemplo, pela presença de indivíduos em regiões de água salobra no Rio da Prata e na Lagoa dos Patos/RS (ANGONESI et al. 2008, SYLVESTER et al. 2013). Em um trabalho recente, ANGONESI et al. (2008) reforçaram a importância de se estudar a influência da salinidade na viabilidade de embriões e larvas de L. fortunei.

3.5. Avaliação das respostas fisiológica em moluscos A avaliação de parâmetros fisiológicos tem sido considerada uma importante ferramenta na investigação das respostas metabólicas frente ao estresse, inclusive em estudos com moluscos. De fato, estes organismos apresentam respostas metabólicas mensuráveis quando expostos a condições estressantes. Dentre as condições de estresse mais estudadas em moluscos, estão as respostas metabólicas frente a componentes tóxicos como metais traço e compostos naturais (PINHEIRO 2011). Além destas, outras condições de estresse também têm sido avaliadas em bivalves e gastrópodes, como por exemplo, o parasitismo, jejum severo e alterações na alimentação, no fotoperíodo e na densidade populacional (PATTERSON et al. 1999, PINHEIRO 2011).

As principais reservas de carboidratos encontradas nos moluscos são o glicogênio e o galactogênio.

As reservas de glicogênio são encontradas nos tecidos moles (musculatura, manto e glândula digestiva) e sendo as reservas de galactogênio restritas a glândula de albúmen. Como os bivalves não apresentam glândula de albúmen, em um estudo comparando diferentes dietas, foi mensurado o conteúdo de glicogênio dos tecidos de L. fortunei (HUDSON 2014). A variação nos níveis de glicogênio estocado no tecido dos moluscos é um dos parâmetros metabólicos utilizados para mensurar o estresse nestes animais. Em bivalves, o glicogênio é considerado a fonte primária de estocagem energética e a quantidade relativa de glicogênio disponível nos tecidos tem sido considerada um bom indicador da condição do animal (body condition) (PATTERSON et al. 1999).

Como fonte energética, o glicogênio é rapidamente usado quando o organismo é submetido a uma condição estressante (PINHEIRO 2011). Assim, variações nos níveis de glicogênio têm sido consideradas um parâmetro que reflete de forma adequada o status energético e de reserva de um organismo, ou seja, um biomarcador de estresse. Em duas espécies de bivalves de água doce, os níveis de glicogênio nos tecidos do manto refletiram as alterações metabólicas decorrentes de uma condição de estivação e de controle alimentar (PATTERSON et al. 1999). Em mexilhões marinhos (Mytilus edulis) (Bivalvia: M ytilidae), a dosagem de glicogênio em diferentes tecidos foi utilizada para avaliar as condições fisiológicas em populações deste bivalve, em diferentes condições 36

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ambientais durante 14 meses (ZWAAN & ZANDEE, 1972). A modificação nos níveis de glicogênio em diferentes tecidos de Biomphalaria glabrata (Gastropoda: Planorbidae) submetidos ao estresse químico foi usada com sucesso, validando o uso do glicogênio como biomarcador em moluscos (ANSALDO et al. 2006).

3.6. S obre os outros organismos que foram testados Além do mexilhão dourado, espécies pertencentes a outros táxons foram utilizadas como modelo experimental no presente trabalho. Segue uma descrição sucinta destes táxons e das espécies utilizadas: 3.6.1. Protistas ciliados Os ciliados apresentam um importante papel nos ecossistemas, podendo servir de indicador de mudanças ambientais, além de realizarem funções chave no fluxo de energia e na ciclagem de elementos (AM ANCHI 2010). Os ciliados, particularmente os paramécios, têm sido utilizados como modelo há mais de cem anos (M ORANGE 2006). M uitos ciliados planctônicos apresentam alta taxa reprodutiva, principalmente por reprodução assexuada, são de fácil cultivo e manipulação em laboratório, características que favorecem sua utilização como organismo teste (WEISSE 2006).

Os ciliados são considerados bons indicadores ou biosensores de poluição ambiental, principalmente pelo fato de não apresentarem parede celular e de seu genoma ser mais semelhante ao genoma humano do que outros micro-organismos eucariotos (GUTIERREZ et al. 2003, 2009).

Na ecotoxicologia, ciliados do gênero Paramecium são empregados no estudo dos efeitos da poluição da água, podendo-se utilizar como parâmetro, o comportamento locomotor, a taxa reprodutiva, alterações morfológicas e a mortalidade (M IYOSHI et al., 2003; VENKATESWARA et al. 2006).

3.6.1.1. Paramecium caudatum O.F.Müller, 1786 (Protoctista: Peniculida: Parameciidae) É uma espécie ubíqua (DRAGESCO & DRAGESCO-KERNÉIS, 1986), de hábito alimentar bacterívora e algívora, com tolerância à salinidade variando de oligo a meso-eurihalina. Ocorre em águas estagnadas, correntes e estações de tratamento de esgotos, apresentando boa tolerância a ambientes eutrofizados, que podem ser alfamesosapróbicos ou polissapróbicos (FOISSNER & BERGER, 1996). Esta espécie tem sido utilizada em experimentos de toxicologia com solventes

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orgânicos, herbicidas, inseticidas, fungicidas, antibióticos e metais (M IYOSHI et al. 2003; VENKATESWARA et al. 2006, 2007).

3.6.2. Moluscos gastrópodes de diferentes espécies Atualmente, moluscos são amplamente utilizados em testes de toxicidade com sedimentos marinhos (TRAUNSPURGER & DREWS 1996). No entanto, apesar de sua importância ecológica nos ecossistemas límnicos, poucas espécies são utilizadas em testes de toxicidade (DUCROT et al.

2006). Pesquisas em banco de dados apontam que as esp écies límnicas mais utilizadas em testes são o gastrópode Lymnaea sp . e o bivalve Dreissena sp . (DUCROT et al. 2006). A relativa simplicidade dos procedimentos de coleta, transporte e manutenção de gastrópodes, faz com que estes organismos sejam adequados para estudos em laboratório (MARTINS & BIANCHINI 2011). Além disso, os moluscos são usualmente abundantes em ecossistemas aquáticos, inclusive no Brasil, o que reflete sua importância no funcionamento dos ecossistemas. Em um trabalho que avaliou a tolerância fisiológica relativa a compostos orgânicos e metais a diferentes ordens de macroinvertebrados, verificou-se que moluscos das classes Bivalvia e Gastropoda estavam entre os macroinvertebrados mais tolerantes a compostos orgânicos e os menos tolerantes a metais (WOGRAM & LIEISS 2001).

3.6.2.1. Physa acuta Draparnaud, 1805 (Gastropoda: Pulmonata: Physidae) Esta espécie de molusco de água doce foi descrita a partir de espécimes coletados na França, mas é provável que seja originária da América do Norte (DILLON et al. 2002). Acredita-se que as principais vias de dispersão desta espécie sejam a aquariofilia e a piscicultura. A distribuição geográfica desta espécie é ampla, podendo ser encontrada em diversos ambientes de água doce, eutrofizados ou não, em vários continentes como a Europa, Ásia, África, Austrália, América do Norte, América Central e América do Sul (SANTOS et al. 2012). No Brasil, já foram registradas ocorrência de P. acuta nas bacias hidrográficas do Atlântico Leste e Sudeste e também do Tocantins-Araguaia. Estes moluscos toleram ambientes poluídos e existem registros na literatura de populações em densidades acima de 3000 indivíduos/m2 (APPLETON, 1996; FRANÇA et al.

2007).

3.6.2.2. Pomacea dolioides (Reeve, 1856) (Gastropoda: Caenogastropoda: Ampullariidae)

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Pomacea dolioides (Reeve, 1856) ocorre principalmente mais ao norte do Brasil, sendo encontrada na bacia do Amazonas, inclusive na Venezuela (HAYES et al. 2009). Esta é uma espécie de molusco de água doce nativa da América do Sul. A família Ampullariidae, a qual pertence, inclui espécies que são amplamente distribuídas no continente Sul-Americano, onde constituem a maior parte da malacofauna límnica. Estes gastrópodes são operculados, e apresentam hábito anfíbio, uma vez que podem passar parte do tempo fora da água respirando ar atmosférico. A capacidade de respirar tanto dentro, como fora da água, contribui para o sucesso adaptativo destes moluscos. A presença do opérculo favorece a estivação deste molusco em condições ambientais desfavoráveis. O gênero Pomacea distribui-se por toda a região Neotropical, geralmente em grandes densidades populacionais, habitando coleções hídricas lênticas e estagnadas (THIENGO et al. 2011). Neste gênero, encontram-se os maiores moluscos de água doce (podem alcançar até 170 mm), os quais são dioicos, ovíparos e apresentam ovos calcários, que são depositados em cachos fora da água.

Além disso, apresentam ampla tolerância à poluição orgânica, a temperaturas baixas, a dessecação e a salinidade. As pomáceas são utilizadas como animais ornamentais em aquários, o que favorece sua dispersão através da aquariofilia. Em algumas partes do mundo, algumas espécies pertencentes a este gênero se estabeleceram como invasoras devido a sua alta capacidade reprodutiva e voracidade alimentar (COWIE 2002, THIENGO et al. 2011). Em algumas culturas, estes animais são utilizados na alimentação e podem atuar na transmissão de nematódeos de importância médica (YANG et al. 2013).

3.6.2.3. Omalonyx matheroni (Pontiez & Michaud, 1835) (Gastropoda: Pulmonata: S uccineidae) O gênero pode ser encontrado em diversos ambientes de água doce, eutrofizados ou não, associados à margem ou vegetação emergente destes sistemas e ocorrendo, inclusive, em ambientes poluídos.

A distribuição geográfica de Omalonyx é a América do Sul, a leste dos Andes e ilhas das Baixas Antilhas, no Caribe. No Brasil, encontra-se em todas as regiões do país (TILLIER 1981, COSCARELLI et al. em preparação). Ap enas em uma, das nove bacias hidrográficas brasileiras, este gênero não foi ainda registrado: a bacia do rio Uruguai, na região sul. No entanto, a presença de Omalonyx nesta bacia foi registrada fora do Brasil, perto de Salto, Uruguai (OLAZARRI 1979). No Brasil, O. matheroni apresenta uma área de ocorrência ampla incluindo toda a Amazônia (região norte), sudeste e nordeste do país e, recentemente, a região Sul (ARRUDA et al. 2009). Esta espécie de molusco foi descrita a partir de exemplares coletados na ilha de Guadalupe, nas Baixas Antilhas, Caribe. São animais hermafroditas que apresentam desova gelatinosa e transp arente, permitindo que 39

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se visualize o embrião em desenvolvimento no interior do ovo. Uma desova de O. matheroni pode conter em média 6 a 16 ovos, sendo que os ovos medem aproximadamente 2 mm de diâmetro e levam de 13 a 20 dias para completar o desenvolvimento (M ONTRESOR et al. 2012).

3.6.3. Larvas de peixe Os peixes são vertebrados aquáticos frequentemente utilizados como indicadores ambientais.

Ensaios com peixes auxiliam na compreensão sobre os efeitos dos tóxicos sobre vertebrados.

Devido a sua importância econômica e ecológica, existem muitos estudos sobre estes animais. Além disso, se conhece bem o comportamento e as técnicas de manutenção em laboratório destes animais.

Os testes de toxicidade aguda com peixes são bem difundidos e algumas espécies como “fathead minnow” Pimephales promelas, paulistinha ou peixe zebra Danio rerio e lebiste ou “guppy” Poecilia reticulata são utilizadas com frequência. As larvas são normalmente mais sensíveis que os adultos, desta forma, os testes com larvas têm sido escolhidos ao invés dos testes com adultos.

3.6.3.1. Oreochromis niloticus (Linnaeus, 1758) (Perciformes: Labroidei: Cichlidae) Esta espécie é conhecida popularmente como tilápia, uma espécie invasora, originária da bacia do rio Nilo, no Leste da África, que se encontra amplamente disseminada nas regiões tropicais e subtropicais no Sudeste Asiático, e no Continente Americano (USA, M éxico, Panamá e toda a América do Sul). No Brasil, foi introduzida em açudes da região Nordeste, difundindo-se para todo o país. É uma espécie tropical cuja temperatura ideal para seu desenvolvimento varia entre 25 e 30°C. A tilápia é um dos peixes com maior potencial para a aquicultura por apresentar rápido crescimento e possuir elevado valor comercial, principalmente nos países desenvolvidos. Além disso, alimenta-se dos itens básicos da cadeia trófica, aceita grande variedade de alimentos, responde com a mesma eficiência a ingestão de proteínas de origem vegetal e animal, possui plasticidade fisiológica e é tolerante a doenças. Estas características fazem com que a tilápia seja capaz de se adaptar a diferentes ambientes e sistemas de produção (AYROSA 2009).

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3.6.3.2. Danio rerio (Hamilton, 1822) (Cypriniformes:Cyprinoidea:Cyprinidae) O peixe zebra é um peixe pequeno, que habita rios tropicais, sendo nativo dos rios da Índia e sul da Ásia. É um organismo muito popular como modelo de estudos de desenvolvimento genético, biomedicina, neurofisiologia e ecotoxicologia. De fato, os embriões de peixe zebra são utilizados em testes de diferentes químicos. Este peixe tem muitas características que facilitam seu uso como modelo de estudo, mesmo quando comparados com outros modelos clássicos como os camundongos e os ratos. Estes atributos são: pequeno tamanho, robustez, apresentam ovos e larvas transparentes que facilitam a visualização e o acompanhamento do desenvolvimento, sem que haja a necessidade do uso de equipamentos sofisticados. A fertilização é externa, os embriões são facilmente manipulados e as alterações no desenvolvimento, facilmente observadas ao microscópio óptico. A fecundidade é alta e o crescimento é rápido; a organogênese ocorre em 36 horas e as larvas são bem móveis com 2-3 dias pós-eclosão (SPENCE et al. 2008; SCHOLZ et al. 2008).

Atualmente existem disponíveis muitas informações genômicas e fisiológicas sobre esse animal.

4. METODOLOGIA

4.1. Testes de toxicidade

Foram selecionados alguns compostos químicos para a realização dos testes de toxicidade aguda.

Foram realizados testes semi-estáticos com renovação total da solução a cada 24 horas. A duração dos testes variou de 24 a 96 horas, dependendo das características do organismo e/ ou do estádio de desenvolvimento deste. As concentrações testadas, em triplicata, no experimento definitivo (Tabela 3) foram selecionadas com base em experimentos-piloto. Inicialmente, os testes foram realizados em diferentes estádio de vida de L. fortunei. Em uma segunda etapa, os compostos com potencial aplicação no controle do mexilhão dourado foram testados em organismos não alvo de outros táxons, visando uma melhor compreensão dos efeitos ecotoxicológicos associados ao controle químico. Os critérios para a triagem dos compostos foram os seguintes: (1) compostos que estão sendo ou que já foram usados para o controle do mexilhão dourado, como é o caso do M XD-100 e do hidróxido de sódio (NaOH); (2) compostos sabidamente tóxicos a organismos aquáticos límnicos, que podem apresentar potencial aplicação no controle químico do mexilhão dourado, mas que ainda não foram utilizados e nem testados com esta finalidade. Seria o caso da amônia não 41

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ionizada (N-NH 3), do nitrito (N-NO 2-), do nitrato (N-NO 3-) e do cloreto de sódio (NaCl). Estes compostos geralmente são monitorados durante a rotina de manutenção de animais aquáticos. No entanto, no caso do mexilhão dourado, os níveis de segurança e a concentração letal mediana (CL50) -

eram desconhecidos tanto para a amônia não ionizada (N-NH 3), quanto para o nitrito (N-NO 2 ), o -

nitrato (N-NO 3 ) e o cloreto de sódio (NaCl).

Os reagentes utilizados no p reparo das soluções-teste foram os seguintes:

- Hidróxido de sódio (NaOH) (Cromoline, Brasil, 99.0% de pureza)

- Cloreto de sódio (NaCl) (Red Sea, França, 99.2% de pureza)

- Nitrito de sódio (NaNO 2) (Sigma-Aldrich, Japão, 99.0% de pureza)

- Nitrato de sódio (NaNO 3) (Sigma-Aldrich, Japão, 99.0% de pureza)

- Cloreto de amônio (NH 4Cl) (M erck, Alemanha, 99.8% de pureza)

- M XD-100 (Biocida comercial composto por taninos e amônia quaternária) (M axclean Ambiental e Química S.A, Brasil).

Os critérios para a seleção dos organismos a se testar foram os seguintes: (1) organismos representantes de diversos táxons (com ênfase nos moluscos que, neste caso, são o alvo do controle químico); (2) de fácil manutenção em laboratório; (3) viabilidade de aquisição; (4) incluir representantes da fauna nativa e exótica (5) organismos que possam ser individualizados, para possibilitar que seja feito o mesmo delineamento utilizado nos experimentos com larvas e recrutas de mexilhão dourado, permitindo assim a comparação dos resultados do mexilhão dourado com os de outras esp écies. Foram realizados testes com os seguintes organismos: - Protista ciliado: P. caudatum O.F.M üller, 1786 (Peniculia: Peniculida: Parameciidae)

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- M oluscos: desovas de O. matheroni (Gastropoda: Succineidae); juvenis de P. acuta; (Gastropoda: Phy sidae); juvenis de P. dolioides (Caenogastropoda: Ampullariidae).

- Larvas de peixes: O. niloticus Linnaeus, 1758 (Perciformes: Cichlidae) e D. rerio Hamilton, 1822 (Cyprinoidea: Cyprinidae).

Foram feitas tentativas de realizar testes com espécies nativas de peixes Leporinus obtusidens Valenciennes, 1837 (Characiformes: Anostomidae) (Piau), Prochilodus lineatus Valenciennes, 1837

(Characiformes: Curimatidae)

(Corimba) e Astyanax sp p.

Baird & Girard, 1854

(Characiformes: Characidae) (Lambari), mas devido a problemas de logística e as questões inerentes à reprodução dos mesmos, as larvas não puderam ser obtidas na ocasião de realização dos experimentos. Tentamos ainda obter microcrustáceos da espécie nativa Ceriodaphnia silvestrii Daday, 1902 (Cladocera: Daphnidae), mas não foi possível adquiri-los na ocasião.

Foram realizados testes com desovas de Biomphalaria glabrata (Gastropoda: Planorbidae), mas devido ao tamanho diminuto e a impossibilidade de individualização dos ovos, a desova desta espécie não foi utilizada nos testes definitivos. Os juvenis de O. matheroni e de B. glabrata também não foram selecionados para os testes definitivos uma vez que, por serem muito pequenos, apresentaram o comportamento de sair da solução testes durante os experimentos piloto. Devido ao tamanho reduzido e a movimentação rápida, não foi possível manipular com agilidade os rotíferos Philodina sp . Ehrenberg, 1830 (Bdelloidea: Philodinida: Philodinidae), o que dificultou a realização dos testes. Desta forma, estes organismos não foram utilizados nos testes definitivos.

Os parâmetros físico-químicos das soluções utilizadas nos testes foram monitorados diariamente, como descrito abaixo. As soluções estoque foram preparadas com água destilada. Água de abastecimento, desclorada com tiossulfato de sódio, foi utilizada para o preparo das soluções de uso, cujas concentrações encontram-se listadas na Tabela 3.

M onitoramento dos parâmetros físico-químicos: Foram monitorados a temperatura, o pH, o oxigênio dissolvido e a amônia não ionizada. Os equipamentos utilizados foram um oxímetro (ProODO; YSI), e um medidor de bancada para pH/ ISE (HI 3221; Hanna) ao qual foi acoplado o pHmetro (HI 1131B; Hanna) e o eletrodo seletivo para amônia (HI 4101; Hanna). A concentração de amônia não ionizada foi calculada de acordo com a metodologia descrita por EMERSON et al.

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(1975), considerando a concentração mensurada de amônia total e os valores de pH e temperatura da água.

4.1.1. Testes de toxicidade aguda: larvas de Limnoperna fortunei

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As larvas de L. fortunei foram obtidas através da filtragem de um volume de 3 a 5 m em uma rede de plâncton de 80 µm na Usina Hidrelétrica de Itaipu Binacional (Rio Paraná). No laboratório localizado dentro da usina, o material foi triado e larvas no estádio de véliger (150 a 220µm) (SANTOS et al. 2005) foram selecionadas em microscópio estereoscópico. Nesse estádio larval valvado, os animais se movimentam ativamente e apresentam um véu bastante desenvolvido.

As larvas de mexilhão dourado foram submetidas a uma primeira triagem, sendo transferidas para placas de cultura celular (6 poços por placa, 10mL de água desclorada por poço). Foram colocadas no máximo 20 larvas por poço de modo a facilitar a transferência das mesmas para as placas teste.

Para os experimentos de toxicidade, as larvas foram novamente selecionadas e transferidas para placas de cultura celular de 24 poços (cada poço com a capacidade de 3 mL), contendo as soluções teste. Os químicos testados, número amostral e duração dos experimentos encontram-se listados na Tabela 3.

4.1.2. Testes de toxicidade aguda: recrutas e adultos de Limnoperna fortunei

Os animais foram coletados manualmente no lago da Usina Hidrelétrica de Itaipu, nas proximidades do laboratório do Portinho, localizado no Refúgio Biológico Bela Vista, em Foz do Iguaçu/PR (25º 26’ 48,9” S; 54° 32’ 58,1” W) de acordo com metodologia descrita por M ONTRESOR et al.

(2011). O processo de transporte até o LELf (Laboratório de Estudos de Limnoperna fortunei no Centro de Pesquisas Hidráulicas – UFM G) durou cerca de 8 horas. Antes do início dos experimentos, os mexilhões foram aclimatados, durante 15 dias, em quatro aquários de 200L, com aeração constante e a temperatura de 18°C e fotoperíodo de 12 horas. Água de abastecimento, desclorada com tiossulfato de sódio, foi utilizada para manutenção dos animais nos aquários. Os parâmetros físico-químicos foram monitorados diariamente como descrito no item 4.1. A água dos aquários foi mantida em pH 7,8 aproximadamente, oxigênio dissolvido sup erior a 8 mg/L, com saturação acima de 90% e a amônia total em valores inferiores a 0,6 mg/L.

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Os mexilhões foram alimentados uma vez ao dia com microalgas cultivadas em laboratório, Scenedesmus sp ., Selenastrum sp . ou Ankistrodesmus sp . O volume de cultura oferecido aos mexilhões diariamente foi calculado de acordo com a concentração encontrada em cada cultivo no dia de sua utilização e com o número de animais a se alimentar, de acordo com a equação 1 (M ANSUR et al. 2008).

V

B *C (1) A

V = volume (mL) da suspensão algácea a ser adicionada na cultura - B = número de mexilhões em cada aquário - C = 3,2 x 106 (número de células por indivíduo) - A = número de células/mL da suspensão algácea (obtido através da contagem das algas).

Dois dias antes de cada experimento, 200 mexilhões de tamanho inferior a 5 mm (recrutas) foram selecionados e mantidos em incubadora a 25 ± 2°C, fotoperíodo de 12 horas e aeração constante. Os espécimes que não se fixaram a parede do recipiente após 24 horas e que não apresentavam o sifão estendido foram excluídos do experimento. Grup os de 18 indivíduos foram aleatoriamente disp ostos individualmente em placas de 6 poços (cada poço com capacidade de 10 mL) contendo 10 mL de água desclorada. Foram selecionadas para os testes, as placas nas quais todos os espécimes se fixaram na parede do recipiente e apresentavam sifão exposto.

Para os testes com os animais adultos, 1.000 mexilhões (21-27 mm) foram selecionados e mantidos em uma incubadora a 25 ± 2°C, fotoperíodo de 12 horas e aeração constante, dois dias antes dos experimentos. Da mesma forma que descrito anteriormente, os espécimes que não se fixaram a parede do recipiente após 24 horas e que não apresentavam o sifão estendido foram excluídos do experimento. Foram aleatoriamente dispostos 11 indivíduos em frascos de vidro (500 mL) contendo 300 mL de água desclorada e aeração constante. Para os testes, foram selecionados os recipientes em que todos os espécimes estavam fixados às p aredes.

Foram realizados testes semi-estaticos (com troca total das soluções a cada 24 horas) de toxicidade aguda (24-96 h) independentes. As concentrações testadas, em triplicata, no experimento definitivo (Tabela 3) foram selecionadas com base em experimentos-piloto. Nos testes com mexilhões adultos, além da mortalidade, o comportamento dos animais (valvas abertas ou fechadas) também foi 45

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monitorado. Os químicos testados, número amostral e duração dos experimentos encontram-se listados na Tabela 3. Antes da renovação diária das soluções, os parâmetros físico-químicos da água foram monitorados como descrito anteriormente.

A mortalidade foi monitorada em intervalos de 24 h. Os animais mortos foram removidos dos recipientes duas vezes ao dia para prevenir a deterioração da água. No último dia de experimento, os animais que estavam fechados foram dissecados e aqueles que apresentavam batimento na ciliatura das brânquias foram considerados vivos.

Um experimento adicional foi realizado para observar o comportamento de L. fortunei exposto a CL50 96h de cada um dos compostos químicos. Os indivíduos foram selecionados e aclimatados como descrito acima. M exilhões (30 por teste) foram individualmente colocados em poços contendo 10 mL da solução a ser testada (0,25 mg/L N-NH 3, 11,10 mg/L M XD-100, 88,51 mg/L NaOH e controle). Durante duas horas os indivíduos com as valvas abertas foram contabilizados em intervalos de dez minutos.

4.1.3 Testes de toxicidade aguda: cálculo da CL50 e estimativa do nível de segurança

O cálculo da CL50 foi feito utilizando-se o programa “Trimmed Spearman-Karber” modificado (HAM ILTON et al. 1977). A concentração segura de exposição aos químicos, ou nível de segurança, foi calculada por inferência, considerando-se o valor de 10% da CL50-96h (SLAUGHTER et al. 2007). Para comparar a toxicidade dos compostos químicos testados, foram considerados o maior e o menor valor de CL50 para cada um deles. Estes valores e seus respectivos intervalos de confiança foram comparados. Foram considerados diferentes aqueles valores em que não houve sobreposição do intervalo de confiança.

4.1.4. Testes de toxicidade aguda: Análise do comportamento evasivo de mexilhão dourado Os efeitos das diferentes concentrações dos químicos NaOH, NaCl, N-NO 2-, N-NO 3-, N-NH3, M XD100, na proporção de indivíduos adultos com as valvas abertas/ fechadas, nas primeiras 24 horas de exposição, foram testados com análise de variância simples ANOVA (ZAR, 2009). Comparações "a posteriori" foram feitas por inferência utilizando o intervalo de confiança de 95%.

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No outro experimento, em que foram testadas as concentrações referentes à CL50-96h (para o M XD-100, N-NH 3, e NaOH), as proporções de adultos de L. fortunei apresentando as valvas abertas foram comparadas com o teste do qui-quadrado.

4.1.5. Testes de toxicidade crônica: Exposição crônica do mexilhão dourado às concentrações de segurança para a amônia e o MXD-100 e análise do conteúdo de carboidratos (ênfase glicogênio)

Com o intuito de testar o nível de segurança previamente estimado para a amônia e para o M XD100, recrutas e adultos de mexilhão dourado foram expostos p or 21 dias a estes dois compostos, na concentração de 1 mg/L M XD-100 e 0,025 mg/L N-NH 3. O grupo controle foi mantido na água desclorada utilizada para o preparo das soluções, as quais foram trocadas diariamente. Foram utilizados 25 indivíduos por tratamento (5 frascos com 5 indivíduos cada), os quais foram mantidos em câmara incubadora com aeração constante, temperatura de 25 ± 2°C, pH~7,8 e fotoperíodo de 12 horas.

Os indivíduos adultos foram selecionados como descrito anteriormente e aleatoriamente distribuídos em recipientes plásticos com capacidade de 4 L, contendo 2 L de solução teste. Os recrutas foram acondicionados em frascos de 400 mL contendo 200 mL de solução. No momento da troca diária de solução, os parâmetros físico-químicos da água foram mensurados como reportado no item 4.1. Para alimentação, foi oferecida uma mistura de microalgas contendo aproximadamente 6

1,5x 10 cel./mL (Scenedesmus sp ., Ankistrodesmus sp . e Chlamydomonas sp .) 3 vezes p or semana, 3 horas antes da troca de solução, volume de 10 mL para os adultos e 1 mL para os recrutas. Os aquários foram monitorados diariamente.

Ap ós os 21 dias de teste, os tecidos dos adultos foram separados das conchas com auxílio de pinças oftalmológicas e tesouras de ponta fina. Ap roximadamente 1 g de tecido foi acondicionado separadamente em tubos de criogênio 1,5 mL. Os tubos foram mantidos no gelo durante o processo de coleta do tecido e, em seguida, foram armazenados em freezer (- 20ºC) até o processamento da amostra. A análise do conteúdo de glicogênio foi realizada de acordo com protocolo descrito por PINHEIRO & GOM ES (1994). Assim, as amostras foram descongeladas, pesadas e homogeneizadas com um homogeneizador de tecido (Ten Broeck Py rex, Corning, NY, USA) em TCA 10% (ácido tricloroacético) na proporção de 10 mL de TCA para 1 g de tecido.

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Posteriormente, as amostras foram centrifugadas por 5 minutos a 4000 rpm e o volume obtido foi filtrado, aquecido por 5 min. a 45ºC. Foi adicionado metade do volume da amostra de etanol absoluto. As amostras foram transferidas para um banho de gelo por 15 min. e centrifugadas a 18.000 G p or 10 min. Posteriormente, o precipitado foi ressusp endido em 5 mL de água destilada. A 2 ml desta amostra, foram adicionados 2 mL de HCL 1M , e, após 30 min a banho-maria a 100ºC (água fervente), foi acrescentado 1 mL de NaOH 3M . Este material foi homogeneizado e transferido para tubos Falcon de 15 mL, e ao mesmo foram adicionados 1 mL de 3,5 DNS (ácido dinitro salicilato). As amostras foram analisadas em espectrofotômetro a 535 nm. Os valores de absorbância foram anotados e comparados com o padrão. Para verificar os efeitos crônicos da exposição a baixas doses de M XD-100 e amônia sobre a quantidade de glicogênio no tecido de L. fortunei foi utilizada uma análise de variância simples ANOVA (ZAR, 2009).

4.1.6. Testes de toxicidade aguda com outros organismos

Testes de toxicidade utilizando organismos de outros táxons foram realizados com o intuito de comparar os níveis de toxicidade do M XD-100 e da amônia para organismos não alvo. Foram testados o protista P. caudatum, os moluscos P. acuta (jovem), O. matheroni (desova), P. dolioides (jovem) e os peixes D. rerio (larva) e O. niloticus (larva). Para a comparação foram utilizados os valores de CL50 calculados a partir dos testes de toxicidade aguda. Para favorecer as comparações, os aspectos relativos à metodologia foram padronizados para minimizar a influência de diferenças metodológicas nos resultados. No entanto, em alguns casos, foram necessários ajustes para adaptar a metodologia a peculiaridades de cada espécie.

As soluções-estoque foram preparadas com água destilada e os respectivos compostos químicos. As soluções de uso foram preparadas a partir da diluição da solução estoque com água de abastecimento desclorada com tiossulfato de sódio. A concentração de amônia real foi mensurada com o uso de um eletrodo seletivo para a amônia (APHA, 1995). A concentração de amônia não ionizada foi calculada de acordo com a metodologia descrita por EMERSON et al. (1975), considerando os valores de pH e temperatura da água e as concentrações conhecidas de amônia total.

Foram realizados testes semi-estáticos independentes de toxicidade aguda aos químicos M XD-100 e amônia. Para cada químico e cada organismos testado, foram utilizadas de 5 a 8 concentrações 48

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(Tabela 3) e um grupo controle, em triplicata, simultaneamente. As concentrações foram previamente definidas com base em experimentos-piloto. Todos os testes foram realizados em câmara incubadora a 27°C ± 1°C e fotoperíodo de 14 horas (exceto para tilápia temperatura 23ºC ± 2°C, fotoperíodo de 12 horas). A mortalidade foi monitorada após 24, 48, 72 e 96 horas de teste para P. acuta, P. dolioides, O. matheroni e O. niloticus. Devido ao ciclo de vida curto de P. caudatum, a mortalidade foi monitorada após 1 hora, 2 horas e 24 horas de exposição. Os testes com D. rerio tiveram 48 horas de duração. A duração do experimento foi mais curta uma vez que foram selecionados animais que não estivessem protegidos pelo córion (3 dias pós fertilizaçãoDPF), para evitar que a proteção do córion influenciasse nos resultados de toxicidade. No entanto, após o 5º DPF, a reserva de alimento das larvas já seesgota e estas precisam ser alimentadas, o que inviabilizaria a continuidade dos testes. No momento das trocas diárias de solução e ao fim dos experimentos, os parâmetros físico-químicos da água foram mensurados (conforme descrito no item 4.1.2). Ao final do experimento as soluções foram substituídas por água desclorada e a mortalidade foi monitorada por mais 24 horas.

Para as espécies P. caudatum P. acuta, P. dolioides, O. matheroni e D. rerio, os experimentos foram realizados em placas de 24 poços, nas quais foram testados grupos de 6 indivíduos, em triplicata (n=18). A cada poço, contendo 1 indivíduo, foram adicionados 2,5 mL de solução teste. A mortalidade foi monitorada diariamente com o auxílio de microscópio estereoscópio.

As larvas de O. niloticus por serem maiores, mais ativas, e necessitarem de mais espaço que os outros organismos testados, foram acondicionadas em frascos, e não em placas. O número de larvas por frasco foi estabelecido respeitando o limite de densidade de 1 grama de larva/L. Para cada concentração foram testados grupos de 9 indivíduos, em triplicata (n=27). Os frascos contendo 500 mL de solução foram mantidos em câmara incubadora com aeração artificial.

4.1.6.1 Testes com protista ciliado Paramecium caudatum

Exemplares de P. caudatum foram isolados a partir de amostras de água coletadas na Lagoa da Pampulha, Belo Horizonte, M G, Brasil, (Coordenadas: 19o55’09” S, 43o56’47” O). Estas amostras foram mantidas em placas de Petri às quais se adicionaram sementes de arroz com casca. A fim de obter um grande número de indivíduos de P. caudatum para isolamento, a cultura foi monitorada diariamente para se observar o crescimento do número de indivíduos desta espécie. Para o preparo 49

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do meio de cultura, água filtrada foi fervida e deixada esfriar em temperatura ambiente. Em uma placa de Petri, sementes de arroz com casca foram submetidas à irradiação por luz ultravioleta durante trinta minutos, tomando-se o cuidado de agitar a placa três vezes para expor toda a sup erfície à incidência dos raios UV. A água filtrada foi colocada em oito tubos de ensaio 15x200 mm, aos quais foram adicionadas seis sementes de arroz com casca. Os tubos contendo a água filtrada e as sementes de arroz com casca foram mantidas em descanso por, no mínimo, 24 horas.

Logo após, indivíduos de P. caudatum foram isolados das amostras de água da Lagoa da Pampulha e mantidos em cultura nas p lacas de Petri, utilizando-se para isso micropipetas e microscópio óptico de campo claro. Entre 10 e 15 indivíduos de P. caudatum foram inoculados em cada um dos oito tubos de ensaio contendo água filtrada e sementes de arroz com casca. As culturas foram mantidas em condições estéreis e em incubadora com temperatura de 23ºC e fotop eríodo de zero horas de luz, até atingirem a fase logarítmica, que se deu após sete dias de cultura.

Para a realização dos testes, uma alíquota de 500 µL da cultura de P. caudatum foi colocada no último poço de uma placa de cultura celular de 24 poços (cada poço com a capacidade de 3 mL).

Exemplares nadando ativamente foram individualmente selecionados com o auxílio de uma micropipeta (1-5 µL) sob microscópio estereoscópio. Cada um destes exemplares foi transferido para um poço e para cada concentração testada foi utilizada uma placa contendo 18 exemplares.

Cada fileira destas placas, contendo 6 indivíduos cada, constituiu uma amostra. Os testes foram realizados em triplicata (n=18). A cada poço, contendo 1 indivíduo, foi adicionado 1 mL de solução teste. Os animais foram mantidos em uma incubadora a 27 ± 1°C, fotoperíodo 0 horas de luz.

4.1.6.2. Testes com juvenis de moluscos gastrópodes (Physa acuta e Pomacea dolioides)

Os juvenis de P. acuta foram obtidos em laboratório, a partir de parentais coletados nas proximidades do laboratório do Portinho, localizado no Refúgio Biológico Bela Vista, em Foz do Iguaçu/PR. Estes animais foram encontrados sobre asrosetas do mexilhão dourado, as quais serviam de substrato para P acuta. Os animais foram criados nas mesmas condições descritas no item 4.1.2. para o mexilhão dourado e alimentados diariamente com alface. Exemplares jovens medindo entre 5-7 mm aproximadamente foram selecionados para o teste.

Desovas de P. dolioides foram obtidas nas margens da Lagoa da Pampulha, Belo Horizonte, M G. Para que os ovos se desenvolvessem, as desovas foram colocadas individualmente no centro de uma 50

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placa de isopor de 5x5cm, em um aquário de vidro de (40x30x20cm) contendo água desclorada.

Este aquário foi observado diariamente e os jovens recém-eclodidos foram transferidos para outro aquário, contendo aeração artificial e alimento. Diariamente, foi oferecida alface fresca como alimento. Foram selecionados para os experimentos esp écimes com tamanho entre 5-7 mm.

Para ambas as espécies (P. acuta e P. dolioides) foram selecionados para os testes, exemplares com movimentação ativa, os quais foram individualmente acondicionados em poços de uma placa de cultura celular de 24 poços (cada poço com a capacidade de 3 mL).

4.1.6.3. Testes com desova de molusco gastrópode (Omalonyx matheroni)

Desovas de O. matheroni foram obtidas a partir de parentais coletados nas margens da Lagoa da Pampulha, Belo Horizonte, M G, criados de acordo com metodologia descrita previamente (M ONTRESOR et al. 2012). A criação foi observada diariamente para retirada das desovas recémpostas, as quais foram mantidas em câmara incubadora a 27 ± 1°C, fotoperíodo de 14 horas antes e durante a realização dos experimentos. As desovas foram acondicionadas em placas de Petri com tampa, contendo uma fina camada de água desclorada, a qual foi trocada diariamente.

A desova deste molusco é uma massa gelatinosa transparente em forma ovalada onde cada ovo é envolvido por três membranas sendo que os ovos são relativamente grandes (~2 mm de diâmetro).

Isto permitiu que os embriões fossem selecionados para o teste sem danos. Os ovos foram individualizados, permitindo que se colocasse um embrião por poço. Foram selecionados, sob microscópio estereoscópio ovos contendo embriões na fase final do desenvolvimento (acima de 10 dias), os quais apresentavam as seguintes características: região cefálica bem desenvolvida com os dois pares de tentáculos proeminentes e com a forma mais arredondada. Par de tentáculos posterior com pigmentação do ocelo bem visível. A boca é vista como uma abertura única. Concha bem formada é evidente no centro do manto que, por transparência, permite a observação dos batimentos cardíacos. A região podal apresenta-se bem desenvolvida como o pé mais alongado, apresentando a extremidade posterior mais afinada. Nota-se o embrião com suave movimentação.

4.1.6.4. Testes com larvas de peixe zebra (Danio rerio)

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Os adultos de peixe zebra (Danio rerio) utilizados na obtenção das desovas p ara este estudo, foram mantidos a 28°C, fotoperíodo de 14 h luz em um sistema automático de recirculação (Aquaneering) no Laboratório de Neurociência da Faculdade de M edicina da Universidade Federal de M inas Gerais (SOUZA et al. 2011). M achos e fêmeas de D. rerio (maduros sexualmente), mantidos em laboratório de acordo com metodologia previamente descrita (SOUZA et al. 2011), foram colocados, no final da tarde, em um mesmo aquário (3 casais por aquário) para obtenção de formas larvares. No dia seguinte, pela manhã, as larvas foram retiradas do aquário e colocadas em uma placa de Petri com meio de cultura contendo os sais necessários e o pH (7,2) adequado para seu desenvolvimento (LAWRENCE 2007). As larvas foram mantidas em câmara incubadora a 27 ± 1°C, fotoperíodo de 14 horas até o final dos experimentos. Até o 3° dia após a fertilização (DPF), foi realizada a troca diária do meio de cultura. No 3º DPF, larvas livres, com movimentação ativa e sem alterações morfológicas aparentes foram selecionadas, sob microscópio estereoscópio e individualmente acondicionados em placas de cultura celular de 24 poços (cada poço com a capacidade de 3 mL).

4.1.6.5. Testes com larvas de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus)

Larvas de O. niloticus adquiridas de uma piscicultura localizada no município de Guapé/M G, foram recebidas com 4 dias de vida e aclimatadas p ara as condições de laboratório por 15 dias. No período de aclimatação foram mantidas em um aquário de 180 litros, a 23°C, e receberam alimento (ração ®

farelada, 55% PB, Laguna, Socil ) 4 vezes ao dia até a saciedade aparente. As larvas selecionadas para os experimentos apresentavam morfologia e comportamento normais, comprimento total 14,5 ± 1 mm e peso 50 ± 7 mg.

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Tabela 3. Características gerais dos testes toxicológicos realizados: organismos testados, número amostral, duração dos experimentos (h), compostos químicos avaliados e as respectivas concentrações das soluções-teste*.

Organismo teste/ estádio de desenvolvimento Limnoperna fortunei/ Larva

n (por grupo)

réplicas

n (por concentração)

Tempo (horas)

6

3

18

24

n (por ensaio) Limnoperna fortunei Recruta

n (por ensaio)

6

3

18

96

NaOH (mg/L)

NaCl (‰)

N-NO2 (mg/L)

N-NO3(mg/L)

N-NH3 (mg/L)

MXD-100 (mg/L)

20 40 80 160 320 800

6 9 12 18 21 24

0,5 3 12 50 200 800

5 60 200 600 2000

0,02 0,09 0,15 0,17 0,32 0,35 0,70 1,40

0,05 0,5 1 4 7 10 100 500

126

126

126

108

162

162

50 100 200 400 800

2 6 12 24 36

200 400 800 2000 4000 6000

0,002 0,009 0,01 0,02 0,04 0,08 0,17 0,35

0,05 0,5 1 10 100 500

108

108

126

162

126

10 50 150 300 800

108

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Continuação Organismo teste/ estádio de desenvolvimento Limnoperna fortunei Adulto

n (por grupo)

réplicas

n (por concentração)

Tempo (horas)

11

3

33

96

n (por ensaio) Paramecium caudatum

n (por ensaio)

6

3

18

24

NaOH (mg/L)

N-NO2 (mg/L)

NaCl (‰)

40 80 160 240 320 400 800

2 6 12 24 36

264

198

35 50 65 80 95 175 400 800

26 4

N-NO3(mg/L)

N-NH3 (mg/L)

MXD-100 (mg/L)

200 400 800 1750 3500 7000

0.14 0.21 0.31 0.50 0.72

0,05 0,5 1 10 100 500 2000 5000 10000

231

198

330

0,19 1,94 5,84 9,74 19,49 29,24 38,99 58,48

5 7,5 10 15 30 40

216

168

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Continuação Organismo teste/ estádio de desenvolvimento Physa acuta Juvenis

n (por grupo)

réplicas

n (por concentração)

Tempo (horas)

6

3

18

96

n (por ensaio)

Pomacea dolioides Juvenis

n (por ensaio)

NaOH (mg/L)

NaCl (‰)

N-NO2 (mg/L)

N-NO3(mg/L)

N-NH3 (mg/L)

MXD-100 (mg/L)

0,09 0,19 0,97 1,94 3,89 5,84 7,79 9,74

0,5 1 5 10 50

162

6

3

18

96

0,09 0,19 0,97 1,94 3,89 5,84 7,792 9,74

162

0,5 1 5 10 20 30 40 50

162

162

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Organismo teste/ estádio de desenvolvimento Omalonyx matheroni Desova

n (por grupo)

réplicas

n (por concentração)

Tempo (horas)

6

3

18

96

n (por ensaio)

Oreochromis niloticus (tilápia) Larva

9

3

27

NaOH (mg/L)

NaCl (‰)

N-NO2 (mg/L)

N-NO3(mg/L)

N-NH3 (mg/L)

MXD-100 (mg/L)

0,19 1,94 9,74 19,49 29,24 38,99 58,48

10 50 100 200 300 500 1000

144

144

96

0,1 1 10 100 1000

n (por ensaio)

Danio rerio (peixe-zebra) Larva

162

6

3

18

48

n (por ensaio)

0,58 1,94 3,31 4,48 5,84

108

4 10 20 40 70 100 300 144

n= número amostral por concentração testada. Para obter o número amostral total o n deve ser multiplicado pelo número de concentrações testadas por experimento.

Os dados utilizados para montar a tabela podem ser verificados nos Apêndices de 4 a 9. * Cada ensaio incluiu as concentrações listadas nesta tabela e ainda um grupo controle.

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5. RES ULTADOS Os resultados dos testes de toxicidade estão apresentados nas tabelas a seguir (Tabela 4 a 9). Cada tabela exibe os resultados para um dos compostos químicos testados. Alguns destes compostos foram testados somente nos diferentes estádios de vida do mexilhão dourado, sendo este o caso do -

-

NaOH (Tabela 4), NaCl (Tabela 5), N-NO 2 (Tabela 6) e N-NO 3 (Tabela 7). Nos testes com amônia (Tabela 8) e M XD-100 (Tabela 9) foram utilizados, além do mexilhão dourado, outros organismos.

A mortalidade dos animais testados aumentou de acordo com o aumento da concentração dos compostos químicos e com o tempo de exposição. Não houve mortalidade igual ou sup erior a 10% nos grupos controle para os diferentes testes realizados.

6. DISCUSS ÃO

Biocidas são utilizados para o tratamento de água, tratamento de esgoto, tratamento de água de lastro e como agente anti-incrustante em tubulações industriais. M étodos químicos também são utilizados na prevenção e controle de espécies invasoras. No entanto, os biocidas apresentam um largo espectro de ação, o que resulta em danos a espécies não alvo. Em uma revisão da literatura, foram identificados 32 biocidas, os quais foram classificados em dois grupos, oxidantes (halogenados e não halogenados) e não oxidantes (ácidos, aldeídos, aminas, cetonas, metais) (CHATTOPADHYAY et al. 2004). M uitos destes têm sido utilizados com frequência no tratamento de água potável e de esgoto, e para prevenir incrustações em sistemas de resfriamento em indústrias de diversos segmentos. Estratégias para minimizar estes danos incluem a busca por biocidas que sejam ambientalmente menos agressivos e também a realização de estudos sobre a concentração efetiva e tempo de aplicação, visando à otimização dos métodos utilizados. Dependendo do composto químico utilizado, pode ser necessário um tratamento, ou neutralização do efluente antes do seu descarte, evitando assim danos a organismos não alvo (CHATTOPADHYAY et al. 2004).

Com o aumento da dispersão do mexilhão dourado, diversos componentes químicos vêm sendo testados e utilizados com o objetivo de controlar as populações e minimizar os impactos econômicos causados por este bivalve (M ACKIE & CLAUDI 2010, DARRIGRAN & DAM BORENEA 2011). No entanto, considerando os problemas ambientais que são desencadeados pelo uso de produtos químicos na água (M ACKIE & CLAUDI 2010), esforços devem ser concentrados na busca por biocidas menos agressivos ao ambiente e por estratégias de uso que 57

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minimizem os impactos ambientais. Neste contexto, é importante que se conheça a sensibilidade do mexilhão dourado a diferentes compostos químicos, bem como os impactos em organismos nãoalvo. Ensaios em laboratório fornecem informações importantes à avaliação do risco ambiental associado ao uso de compostos químicos no controle de espécies invasoras. Estas informações também são importantes para o estabelecimento de medidas regulatórias.

6.2. Resposta comportamental de adultos do mexilhão dourado

Os bivalves apresentam um limitado repertório comportamental e a abertura e fechamento das valvas é um dos comportamentos mais importantes, além de ser facilmente mensurado (FRANK et al. 2007; HÉGARET et al. 2007; DI FIORI et al. 2012). O comportamento de abrir e fechar as valvas foi avaliado em um trabalho com L. fortunei exposto ao glifosato (DI FIORI et al. 2012). No presente trabalho, após 24 horas, foram observadas alterações no comportamento somente nas maiores concentrações testadas: 160 mg/L de NaOH, 12 g/L NaCl; 400 mg/L NO 2-; 800 mg/L NO 3-; 0,31 mg/L de N-NH 3 e 100 mg/L de M XD-100 (Figuras 3-8). Estas concentrações, no entanto, estão bem acima da faixa utilizada no controle de L. fortunei em plantas industriais. O presente estudo mostrou que, assim como outros bivalves, L. fortunei é extremamente sensível a N-NH 3 (CL50 96-h = 0,25 mg/L). Entretanto, a exposição por 24 horas a este componente químico na concentração da CL50 96-h não desencadeou alterações comportamentais (N-NH 3=96,7%, controle=93,3% valvas abertas), reforçando o potencial da amônia no controle de L. fortunei. As respostas comportamentais devem ser avaliadas ao se escolher uma estratégia de controle (tratamento contínuo ou intermitente) (CALAZANS et al. 2012, M AROÑAS E DAM BORENEA 2006, ROLLA & M OTA 2010). Trabalhos sobre a tolerância de L. fortunei a métodos físicos e químicos de controle devem considerar este comportamento. O presente estudo contribui para o entendimento da relação entre a toxicidade e efeitos comportamentais em L. fortunei.

Os resultados do presente estudo contribuem para as discussões sobre o controle químico de espécies invasoras. O desenvolvimento de estratégias ambientalmente seguras visa reduzir o impacto ambiental decorrente das atividades humanas. A ampla e crescente utilização de biocidas nos ecossistemas límnicos implica na necessidade de uma maior atenção à regulamentação do uso destes.

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9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Adams WJ & Rowland CD. 2003. Aquatic Toxicology Test M ethods. CHAPTER2 In: Hoffman DJ, Rattner BA, Burton GA Jr, Cairns J Jr (eds). Handbook of ecotoxicology. Lewis, Boca Raton, Flórida pp. 19-46.

ANEEL (Agência nacional de energia elétrica) Brasil. 2008. Capitulo 3. Energia Hidráulica. In: Atlas de energia elétrica do Brasil. 3. ed. Brasília: pp. 51-61 Alonso, A., & Camargo, J. A. 2003. Short-term toxicity of ammonia, nitrite, and nitrate to the aquatic snail Potamopyrgus antipodarum (Hy drobiidae, M ollusca). Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 70(5), 1006-1012.

Alonso, A., Camargo, J. A. 2006. Toxicity of nitrite to three sp ecies of freshwater invertebrates.

Environmental toxicology, 21(1), 90-94.

Alonso, Á., & Camargo, J. A. 2009. Long-term effects of ammonia on the behavioral activity of the aquatic snail Potamopyrgus antipodarum (Hy drobiidae, M ollusca). Archives of environmental contamination and toxicology, 56(4), 796-802.

Amanchi, N. R. 2010. A low cost microbiotest for screening behavioural and ecotoxicological responses of Paramecium caudatum and Oxytricha fallax to azadirachtin. Adv. Ap pl. Sci. Res, v. 1, n. 2, 124-131.

Angonesi, L. G.; Rosa, N. G. Bemvenuti, C. E. 2008. Tolerance to salinities shocks of the invasive mussel Limnoperna fortunei under experimental conditions. Iheingia Sér. Zool., n. 98, 66-99.

Ansaldo, M .; Nahabedian, D.E.; Holmes-Brown, E.; Agote, M .; Ansary, C. V.; Guerrero, N.R. e Wider, E.A.2006. Potential use of glycogen level as biomarker of chemical stress in Biomphalaria glabrata. Toxicology, 224 (1-2), 119-27 [APHA] American Public Health Association. 2005. Standard M ethods for the Examination of Water and Wastewater. 19th ed. APHA-AWWA-WPCF, Washington, DC. Ap pleton, C.C. 1996. Freshwater mollusks of Southern Africa. University of Natal Press, Pietermaritzburg. 64 p.

Aragão, M . A. & Araújo, R.P.A. 2006. M étodos de ensaios de toxicidade com organismos aquáticos. Cap. 6. In: Zagato, P.A. e Bertoletti, E. 2006. Ecotoxicologia aquática – princípios e aplicações. ZAGATTO e BERTOLETTI (org.) São Carlos: Rima; p: 117 – 152.

Agudo-Padrón, A.I.; Porto Filho, É. & Saalfeld, K. 2012. First confirmed record of Limnoperna fortunei (Dunker, 1857) in Santa Catarina State, Southern Brazil. Rio de Janeiro, RJ: Abstract Book "XI International Congress on Medical and Applied Malacology - XI ICMAM", September 25-29 2012, p.

125.

Available online at: http://www.icmam2012.com.br/docs/abstracts_book_xi_icmam2012.pdf Agudo-Padrón, A.I. & Porto Filho, É. 2013. The asiatic golden mussel, Limnoperna fortunei (Dunker, 1857), in the Up per Uruguay River Basin, Southern Brazil: current situation to one year of its regional discovery. FMCS Newsletter Ellipsaria, Illinois, 15(2): 33-35. online at: http://molluskconservation.org/EVENTS/ELLIPSARIA/EllipsariaJune2013 Arruda, J.O., D. Pereira, P.E.A. Bergonci, C.P. Santos and M .C.D. M ansur. 2009. Novos registros de Omalonyx matheroni (Pontiez&Michaud, 1835) (M ollusca, Gastropoda, Succineidae) para os Estados de São Paulo e Paraná, Brasil. Biotemas 22(2): 187-190.

Augsp urger, T., Keller, A.E., Black, M .C., Cope, W.G., Dwyer, F.J. 2003. Water quality guidance for protection of freshwater mussels (Unionidae) from ammonia exposure. Environ. Toxicol.

Chem. 22, 2569-2575.

Ay roza, L. M . 2009. Criação de Tilápia-do-Nilo, Oreochromis niloticus, em Tanques-rede, na Usina Hidrelétrica de Chavantes, Rio Paranapanema, SP/PR. Jaboticabal, xiii, 92 f. ; Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Centro de Aquicultura 59

Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos

Belz CE. 2006. Analise de risco de bioinvasão por Limnoperna fortunei (Dunker, 1857): um modelo para a Bacia do Rio Iguaçu, Paraná. Tese do grau de Doutor em Ciências.

Universidade Federal do Paraná. 102 pp.

Belz CE, Darrigran G, Netto OSM, Boeger, WA, Ribeiro Jr PJ. 2012. Analysis of four dispersion vectors in inland waters: the case of the invading bivalves in South America. J Shellfish Res 31: 777–784.

Berenzen, N., Schulz, R., & Liess, M . 2001. Effects of chronic ammonium and nitrite contamination on the macroinvertebrate community in running water microcosms. Water Research, 35(14), 3478-3482.

Berezina N.A. 2003. Tolerance of freshwater invertebrates to changes in water salinity . Russian Journal Ecology, 34, 262-266.

Bertoletti E. 2009. Sensibilidade de algumas espécies de peixes de água doce utilizadas no Brasil.

J. Braz. Soc. Ecotoxicol., 4. 9-13 Boardman, G.D., Starbuck, S.M ., Hudgins, D.B., Li, X.Y., Kuhn, D.D. 2004. Toxicity of ammonia to three marine fish and three marine invertebrates. Environ. Toxicol. 19, 134-142.

Boltovskoy, D., Correa, N., Cataldo, D., & Sylvester, F. (2006). Disp ersion and ecological impact of the invasive freshwater bivalve Limnoperna fortunei in the Río de la Plata watershed and beyond. Biological Invasions, 8(4), 947-963.

Boltovskoy , D., Karatayev, A., Burlakova, L., Cataldo, D., Karatayev, V., Sylvester, F., M arinelarena, A. 2009. Significant ecosy stem-wide effects of the swiftly sp reading invasive freshwater bivalve Limnoperna fortunei. Hy drobiologia, 636(1), 271-284.

Boltovskoy D., & Correa N. 2014. Ecosy stem impacts of the invasive bivalve Limnoperna fortunei (golden mussel) in South America. Hy drobiologia, 1-15.

Brasil, 2005. Resolução nº. 357. Conselho Nacional do M eio Ambiente - CONAM A. Brasília, Diário Oficial da União, 17 de março de 2005.

Brasil. 2011. Conselho Nacional do M eio Ambiente. Resolução n° 430, Diário Oficial da União, de 16 de maio de 2011.

Brusca RC, Brusca GJ 2003. Invertebrates. 2nd ed., Sinauer Associates, M assachusetts, Inc., Publishers, xxii + 936 pp.

Cadmus Group. 2004. Chippewa River, M innesota Technical Support for Un‐ionized Ammonia TM DL: Prepared for: U.S. EPA Region 5M innesota Pollution Control Agency.

Calazans, S.H., Fernandes, L.V., Fernandes, F.C. 2012. Outros compostos. In: M ansur M C et al. (eds) M oluscos límnicos invasores no Brasil: biologia, prevenção e controle. Redes Editora, Porto Alegre-RS, Brasil, pp 311-315.

Camargo, J.A. & Alonso, A. 2006. Ecological and toxicological effects of inorganic nitrogen pollution in aquatic ecosy stems: A global assessment. Environ. Internat. 32: 831–849.

Capítoli, R. R.; Colling, L. A., Bemvenuti C. E. 2008. Cenários de distribuição do mexilhão dourado Limnoperna fortunei (M ollusca – Bivalvia) sob distintas condições de salinidade no complexo lagunar Patos-M irim, RS – Brasil. Atlântica, n. 30, p. 35-44.

Chattopadhyay, S., C. Hunt, P. Rodgers, A. Swiecichowski, C. Wisneski. 2004. Evaluation of biocidesfor potential treatment of ballast water. United States Coast Guard Research and Development Center, Groton, CT. Cherry, D.S.; Scheller, J.L.; Cooper, N.L.; Bidwell, J.R. 2005. Potential effects of asian clam (Corbicula fluminea) die-offs on native freshwater mussels (Unionidae) I: Water-column ammonia levels and ammonia toxicity . J. N. Am. Benthol. Soc. 24(2): 369-380.

Clearwater, S.J., Hickey, C.W., M artin, M .L. 2008. Overview of potential piscicides and molluscicides for controlling aquatic pest sp ecies in New Zealand. Science for conservation 283. New Zealand Department of Conservation, Wellington.

60

Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos

Coutteau, P., & Sorgeloos, P. 1992. The use of algal substitutes and the requirement for live algae in the hatchery and nursery rearing of bivalve molluscs: an international survey. Journal of Shellfish Research, 11, 467-467.

Coscarelli D. M ontresor, Vidigal THDA Taxonomy and geographic distribution of Omalonyx (Gastropoda: Succineidae) sp ecies from southern South America – em preparação Costa, C. R., Olivi, P., Botta, C. M . R., Espindola E. L. G. 2008. A toxicidade em ambientes aquáticos: discussão e métodos de avaliação. Química Nova, 31. 1820-1830.

Costello D. M ., Brown L. M ., Lamberti G. A. 2009. Acute toxic effects of ionic liquids on zebra mussel (Dreissena polymorpha) survival and feeding. Green Chem 11: 548–553.

Cowie, RH. 2002. Ap ple snails as agricultural pests: their biology, Impacts, and management. pp.145–192, In: G. M . BARKER, ed., Molluscs as crop pests. CABI Pub, Cambridge, New York, 450 pp.

Damborenea M .C & Penchaszadeh P. 2006. Biologia reproductiva de Limnoperna fortunei. In: Darrigran G & Damborenea C (eds) Bio-invasión del mejillón dorado em el continente americano. Edulp, La Plata, pp 71-83.

DARRIGRAN, G., S.M . M ARTIN, B. GULLO & L. ARM ENDARIZ. 1998. M acroinvertebrados associated with Limnoperna fortunei (Dunker, 1857) (Pelecipoda, M ytilidae) in Río de la Plata, Argentina. Hydrobiologia, 367:223-230. Belgica.

DARRIGRAN, G.; Damborenea, C. & Greco, N. 2007. Freshwater invasive bivalves in man-made environments: A case study of larvae biology of Limnoperna fortunei in a Hy droelectric Power Plant in South America. AMBIO, 36(7):575-579 Darrigran, G. Prevención y control de bivalves de água dulce – caso “M ejillón Dorado” em la Región Neotropical 2005. In: Noguerita, M . G.; Henry, R.; Jorcin, A. Ecologia de reservatórios:impactos potenciais, ações de manejo e sistemas em cascata. São Carlos: RiMa, Cap. 9.

Darrigran, G. 2010. Summary of the distribution and impact of the golden mussel in Argentina and Neighboring countries. In: M ackie GL, Claudi R (eds) M onitoring and control of macrofouling mollusks in freshwater systems, 2nd edn. CRC Press, Boca Raton, p p 389-396.

Darrigran G, Penchaszadeh P, Damborenea M C. 2000. An invasion tale: Limnoperna fortunei (Dunker, 1857) (M ytilidae) in the neotrop ics. In: Proceedings of the 10th International Aquatic Nuisance Species and Zebra-M ussels Conference,Toronto, Canada, pp 219–224.

Darrigran, G.; M ansur C.D. 2006. Distribución, abundancia y dispersión: In: Bio-invasión Del mejillón dorado en el continente americano Darrigran G & Damborenea C. Ed. Universidad de La Plata. pp 94 -112.

Darrigran G, M ansur M CD. 2009. Introdução e disp ersão do Limnoperna fortunei. In “Introdução a Biologia das Invasões. O M exilhão Dourado na América do Sul: biologia, dispersão, impacto, prevenção e controle” Ed by G Darrigran, C Damborenea, Cubo Editora, São Carlos, pp 89– 110.

Darrigran G & Damborenea C. 2011 Ecosy stem Engineering Impact of Limnoperna fortunei in South America. Zoological Science, 28 (1):1-7.

Darrigran, G & Pereyra JP. 2011. Estandarizacion de métodos de control para Limnoperna fortunei (mejillon dourado) em centales Hidroelétricas , pp 350-361. In: Tópicos em M alacologia.

Orgs. Fernandez M . A, Santos S. B., Pimenta A, Thiengo S.C. Ecos do XIX EBRAM – Editora Sociedade Brasileira de M alacologia Technical Books Editora Organizadores 468p.

Darrigran, G., Damborenea, C., Drago, E.C., Ezcurra de Drago, I., Paira, A. 2011. A environmental factors restrict the invasion process of Limnoperna fortunei (M ytilidae) in the Neotropical region: A case study from the Andean tributaries. Int. J. Limnol. 47, 221-229.

Darrigran, G, Damborenea C.; Drago E., I.E. Drago, Paira A. Archuby F. 2012. Invasion process of Limnoperna fortunei (Bivalvia: M ytilidae): The case of Uruguay River and emissaries of the Esteros del Iberá Wetland, Argentina, Zoologia, 29 (6), 531–539.

61

Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos

Deaton Le, Derby J,. Subhedar N, Greenberg M . 1989. Osmoregulation and salinity tolerance in two sp ecies of bivalve mollusc: Limnoperna fortunei and Mytilopsis leucophaeta. Journal of Experimental M arine Biology and Ecology 14 67–79.

Di Fiori, E., Pizarro, H., Santos Afonso, M ., Cataldo, D. 2012. Impact of the invasive mussel Limnoperna fortunei on glyphosate concentration in water. Ecotoxicol. Environ. Saf. 81, 106113.

Dillon, R.T. Jr.; Wethington, A.R.; Rhett, J.M .; Smith, T.P. 2002. Pop ulations of the European freshwater pulmonate Physa acuta are not reproductively isolated from American Physa heterostropha or Physa integra. Invertebrate Biology 121: 226−234.

Ducrot, V., Cognat, C., M ons, R., M outhon, J., Garric, J. 2006. Development of rearing and testing protocols for a new freshwater sediment test sp ecies: The gastropod Valvata piscinalis.

Chemosp here, 62(8), 1272-1281.

Emerson, K., Russo, R.C., Lund, R.E., Thurston, R.V. 1975. Aqueous ammonia equilibrium calculation: Effect of p H and temperature. J. Fish. Res. Board Can. 32, 2379-2383.

Fachini A, Gazulha V. Pedroso C. S. 2012. Os impactos do mexilhão-dourado sobre a comunidade planctônica CAPÍTULO 23 In: M ANSUR, M .C.; SANTOS, C.P.; PEREIRA, D.; PAZ, I.C.; ZURITA, M .L.; RODRIGUEZ, M .T.; NEHRKE, M .V.; BERGONCI, P.E. (Org.). M oluscos Límnicos Invasores No Brasil: Biologia, Prevenção E Controle. Porto Alegre: Redes Editora, 2012. p. 255-261 Fernandes, F.C. & Leal Neto, A. C. 2006. Água de lastre como vía de introducción de especies a nivel global. In: Bio-invasión Del mejillón dorado en el continente americano Dararigran G & Damborenea C. Ed. Universidad de La Plata pp 43-50.

Fernandes F. C., M ansur M .C.D, Pereira D., Fernandes, L. V. G, Campos S.C, Danelon O. M .

2012. CAPÍTULO 1. Abordagem conceitual dos moluscos invasores nos ecossistemas límnicos brasileiros. In: M oluscos límnicos invasores no Brasil: biologia, prevenção e controle. Porto Alegre: Redes Editora, p. 19-24.

Fispq M XD-100. Ficha de informações de segurança de produto químico - M XD-100. M axclean ambiental e química S.A 2011 Nome do Produto: M XD 100, Número FISPQ: 001, Páginas: 06, Elaboração: 10/05/2011, Revisão: 00/00/0000.

França, R.S., Suriani, A.L.; Rocha, O. 2007. Composição das espécies de moluscos bentônicos nos reservatórios do baixo Rio Tietê (São Paulo, Brasil) com uma avaliação do impacto causado pelas esp écies exóticas invasoras. Revista Brasileira de Zoologia 24(1):41-51.

Goudreau, S. E., Neves, R. J., & Sheehan, R. J. 1993. Effects of wastewater treatment plant effluents on freshwater mollusks in the upper Clinch River, Virginia, USA. Hy drobiologia, 252(3), 211-230.

Gutiérrez, J. C., M artín-González, A., Díaz, S., & Ortega, R. 2003. Ciliates as a potential source of cellular and molecular biomarkers/biosensors for heavy metal pollution. European journal of protistology,39(4), 461-467.

Gutiérrez, J. C.; Amaro, F. ; M artín-González, A. 2009. From heavy metal binders to biosensors: Ciliate metallothioneins discussed. BioEssays, v. 31, n. 7, p. 805-816.

Gran, G. 1952. Determination of the equivalence point in potentiometric titrations. Part II. Analyst 77:661-671.

Hamilton, M .A., Russo, R.C., Thurston, R.V. 1977. Trimmed sp earman-karber method for estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays. Environ. Sci. Technol. 11, 714719.

Hayes KA., Cowie RH., Thiengo SC. 2009. A global phylogeny of apple snails: Gondwanan origin, generic relationships, and the influence of outgroup choice (Caenogastropoda: Ampullariidae). Biological Journal of the Linnean Society , 98: 61–76.

62

Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos

Hua, D., Neves, R. J., Jiao, Y. 2013. Effects of algal density , water flow and substrate type on culturing juveniles of the rainbow mussel (Villosa iris) (Bivalvia: Unionidae) in a laboratory recirculating sy stem. Aquaculture,416, 367-373.

Huang, Z., Jones, J., Gu, J., Hallerman, E., Lane, T., Song, X., Wan, R. 2013. Performance of a Recirculating Aquaculture System Utilizing an Algal Turf Scrubber for Scaled-Up Captive Rearing of Freshwater M ussels (Bivalvia: Unionidae). North American Journal of Aquaculture, 75(4), 543-547.

James RC., Roberts SM ., Williams PL. 2000. General Principles of Toxicology. CAPÍTULO 1 In: Principles of Toxicology: Environmental and Industrial Applications. 2ªed Nova Iorque : John Wiley & Sons. p p. 3–34.

Junqueira, A. O. R.; Julio, L. M .; Ferreira-Silva, M . A. C.; Campos, S. H. C.; Fernandes, F. C. & Lopes, R. M . 2009. Bioinvasão no ambiente marinho. In: Rocha, R. M . & Borger W. A. (Ed.) Estado da arte e perspectivas p ara a Zoologia no Brasil. Curutiba, UFPR, Brasil, pp. 273-284.

Karatayev, A.Y.; Boltovskoy, D.; Padilla, D.K., Burlakova, L.E. 2007. The invasive bivalves Dreissena polymorpha and Limnoperna fortunei: Parallels, contrasts, potential sp read and invasion impacts. Journal of Shellfish Research, 26(1):205-213.

Karatayev A. Y., L. E. Burlakova, V. A. Karatayev, D. Boltovskoy. 2010. Limnoperna fortunei Versus Dreissena polymorpha: Population Densities and Benthic Community Impacts of Two Invasive Freshwater Bivalves,” Journal of Shellfish Research, 29:975-984.

Komala, Z. 1995. Notes on the use of invertebrates, especially ciliates, in studies on p ollution and toxicity . Folia Biol. 43 (1995) 25–27.

Lactec 2004 – Instituto de Tecnologia para o Desenvolvimento. 2004. In: Estudos p ara controle da deposição de lama ferruginosa (“fouling”) nos sistemas de resfriamento das usinas de Nova Ponte e Emborcação da Companhia Energética de M inas Gerais - CEMIG. Relatório Final.

Curitiba, Paraná.

Lawrence, C. 2007. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): A review. Aquaculture, 269(1), 1-20.

Leblanc GA. 2004. Basics of Environmental Toxicology. CAPITULO 26 In: Hodgson E. A text book of modern toxicology. 3ª ed. John Wiley & Sons, New Jersey, pp. 463-478.

M achado J. , Lopes-Lima M . 2011. Calcification mechanism in freshwater mussels: potential targets. Toxicological & Environmental Chemistry, volume 93, number 9, 1778–1787.

M ackie, G.L., Claudi, R. 2010. M onitoring and control of macrofouling mollusks in fresh water sy stems. CRC Press, Boca Raton.

M acM illan, R. J., Cawthorn, R. J., Whyte, S. K., & Lyon, P. R. 1994. Design and maintenance of a closed artificial seawater sy stem for long-term holding of bivalve shellfish. Aquacultural engineering, 13(4), 241-250.

M äder Netto, O.S. 2011. Controle da incrustação de organismos invasores em materiais de sistemas de resfriamento de usinas hidrelétricas Dissertação de M estrado, Pós-Graduação em Engenharia, Universidade Federal do Paraná, Brasil, 112p.

M agalhães, D. P.; Ferrão Filho, A. S. 2008. A ecotoxicologia como ferramenta no biomonitoramento de ecossistemas aquáticos. Oecologia Brasiliensis. 12, 355-381.

M ansur, M . C. D.; Santos, C. P.; Darrigran, G.; Heydrich, I.; Callil, C. T.; Cardoso, F. R. 2003.

Primeiros dados quali-quantitativos do mexilhão-dourado, Limnoperna fortunei (Dunker, 1857), no Delta do Jacuí, no Lago Guaíba e na Laguna dos Patos, Rio Grande do Sul, Brasil e alguns aspectos de sua invasão no novo ambiente. Revista Brasileira de Biologia, v. 20, n. 1, p. 75 – 84.

M ansur, M . C. D.; Fernandes, F. C.; Coutinho, R.; Larsen, K. T. S.; Rebello, M. F. 2008. Programa de Pesquisa para controle do mexilhão dourado (Limnoperna fortunei) na águas jurisdicionais brasileiras. IEAPM : CNPq,. 381 p . Relatório Ténico.

63

Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos

M artins, S. E., Bianchini, A. 2011. Toxicity tests aiming to protect Brazilian aquatic sy stems: current status and implications for management.Journal of Environmental M onitoring, 13(7), 1866-1875.

M aronãs, M .E., Damborenea, C., 2006. Efecto de biocidas y tolerancia a la exposicion al aire. In: Darrigran G & Damborenea C (eds) Bio-invasión del mejillón dorado em el continente americano. Edulp, La Plata, pp 167-173.

M cneely, J. 2001. Invasive sp ecies: a costly catastrophe for native biodiversity . Land use and water resources research, v. 1, n. 2, p. 1 – 10.

M ing-Ho Y. 2005. Introduction. CAPÍTULO 1 In: Environmental Toxicology: Biological and Health Effects of Pollutants. 2ª ed. Boca Raton, Florida: CRC Press LLC, pp. 1-10.

M iyoshi, N., Kawano, T., Tanaka, M ., Kadono, T., Kosaka, T., Kunimoto, M ., Hosoya, H. 2003.

Use of Paramecium Species in Bioassays for Environmental Risk M anagement: Determination of IC~ 5~ 0 Values for Water Pollutants. Journal of Health Science-Tokyo-, 49(6), 429-435.

M ontresor, L. C.; Vidigal, T. H. D. A.; Simeão, C. M . G.; Coscarelli, D.; Luz, D. M . R.; Gerhard, L.; M artinez, C. B. 2011. M anutenção de Pop ulações Viáveis de M exilhão Dourado em Laboratório Visando Estudos de Impacto em Usinas Hidrelétricas. The 9th Latin-american congress on electricity generation and transmission – clagtee.

M ontresor, L., Teixeira, A., Paglia, A., Vidigal, T. 2012. Reproduction of Omalonyx matheroni (Gastropoda: Succineidae) under laboratory conditions.Revista de biologia tropical, 60(2), 553-566.

M ontresor LC, M iranda-Filho K.C, Paglia A., Luz DM .R., Araújo J.M ., Silva M J S., Gerhard L., M artinez, C. B. E, Vidigal T. H.D.A. 2013. Short-term toxicity of ammonia, sodium Hy droxide and a commercial biocide to golden mussel Limnoperna fortunei (Dunker,1857).

Ecotoxicology and Environmental Safety 92: 150-154.

M ook, W. T., Chakrabarti, M . H., Aroua, M . K., Khan, G. M . A., Ali, B. S., Islam, M . S., Abu Hassan, M . A. 2012. Removal of total ammonia nitrogen (TAN), nitrate and total organic carbon (TOC) from aquaculture wastewater using electrochemical technology: A review.

Desalination, 285, 1-13.

M orange, M . (2006). What history tells us IV. Ciliates as models... of what?. Journal Of Biosciences-Bangalore, 31(1), 27.

M ummert AK, Neves RJ, Newcomb TJ, Cherry DS. 2003. Sensitivity of juvenile freshwater mussels (Lampsilis fasciola, Villosa iris) to total and un-ionized ammonia. Environmental Toxicology And Chemistry, Vol. 22, No. 11, 2545–2553.

Olazarri, J. 1979. Los moluscos plaga de los cultivos de "berro" en Salto, Uruguay. Comunicaciones de la Sociedad Malacológica del Uruguay, 5(36): 63-69.

Oliveira CRC, Fugi R., Brancalhão KP, Agostinho AA. 2010. Fish as potential controllers of invasive molluscs in a neotrop ical reservoir. Natureza & Conservação, 8(2), 140-144.

Oliveira M D. 2003. Ocorrência e impactos do mexilhão-dourado (Limnoperna fortunei) (Dunker, 1857) no Pantanal Mato-Grossense. Circular Técnica 38 – Embrapa.

Oliveira M D, Hamilton SK, Calheiros DF, Jacobi CM . 2010a. Oxygen depletion events control the invasive golden mussel (Limnoperna fortunei) in a tropical floodplain wetland, 30: 705-716.

Oliveira M D, Hamilton S K, Jacobi CM . 2010b. Predicting potential sp read of the Asian golden mussel (L. fortunei) in North America based on observations of its environmental tolerance in south America. IN: M ackie GL, Claudi R. M onitoring and control of macrofouling mollusks in fresh water sy stems. CRC Press, Boca Raton, p p 165- 169.

Oliveira, M . D., Hamilton, S. K., Calheiros, D. F., Jacobi, C. M ., & Latini, R. O. 2010c. M odeling the potential distribution of the invasive golden mussel Limnoperna fortunei in the Up per Paraguay River sy stem using limnological variables. Brazilian Journal of Biology, 70(3), 831840.

64

Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos

Oliveira, M .D., Hamilton, S.K., Jacobi, C.M ., 2010d. Forecasting the expansion of the invasive golden mussel Limnoperna fortunei in Brazilian and North American rivers based on its occurrence in the Paraguay River and Pantanal wetland of Brazil. Aquat. Invasions. 5, 59-73.

Patterson CM 1971. Taxonomic studies of the land snail family Succineidae. M alacol Rev 4: 131202.

Patterson M .A., Parker B.C. & Neves R.J. 1999. Glycogen concentration in the mantle tissue of freshwater mussels (Bivalvia: Unionidae) during starvation and controlled feeding. American M alalogical Bulletin, 15, 47-50.

PENCHASZADEH, P., G. DARRIGRAN, C. ANGULO, A. AVERBUJ, N. BRIGNOCCOLI, M .

BRÖGGER, A. DOGLIOTTI y N. PÍREZ. 2000. Predation on the invasive freshwater mussel Limnoperna fortunei (Dunker, 1857) (M ytilidae) by the fish Leporinus obtusidens Valenciennes, 1846 (Anostomidae) in the Río de la Plata, Argentina. Journal Shellfish Research, 19(1):229-231.

Pereira D, Calazans S. H. C, Fernandes L. V. G, Padula I. C, Dos Santos C. P., Fernandes F. C., Rodriguez M . T. R., Arenzon A., M ansur, M . C. D. 2012. Planejamento experimental para a seleção de métodos de controle populacional de moluscos invasores. CAPITULO 26 In: Espécies de moluscos límnicos invasores no Brasil M oluscos: Biologia, Prevenção e Controle. Porto Alegre: Redes Editora,.pp. 279 – 293.

Pereira, D., M ansur, M . C. D., Duarte, L. D., de Oliveira, A. S., Pimpão, D. M ., Callil, C. T., Ituarte C., Parada E., Peredon S., Darrigran G., Scarabino F., Clavijo C., Lara G., M iyahira IC., Rodriguez M TR., Lasso, C. 2014. Bivalve distribution in hydrographic regions in South America: historical overview and conservation. Hy drobiologia, 735(1), 15-44.

Pereyra, J. P., Rossini, G. B., Darrigran, G. 2011. Toxicity of three commercial tannins to the nuisance invasive sp ecies Limnoperna fortunei (Dunker, 1857): implications for control.

Fresenius Environ. Bull. 20, 1432-1437.

Pereyra, P. J. Rossini G. B., Darrigran, G. 2012. Toxicity of neem's oil, a potential biocide against the invasive mussel Limnoperna fortunei (Dunker 1857), 2012. An. Acad. Bras. Ciênc. 84 (4), 1065-1071.

Pinheiro J. 2011. Resposta fisológica de moluscos em condições de estresse. pp. 161-168. In: Tópicos em M alacologia. Orgs. Fernandez M . A, Santos S. B., Pimenta A, Thiengo S.C. Ecos do XIX EBRAM – Editora Sociedade Brasileira de M alacologia Technical Books Editora Organizadores 468p.

Pinheiro, J.; Gomes, E. M . 1994. A method for glycogen determination in molluscs. Arq. Bras.

Biol. Tecnol. v.37 p.569- 576.

Reddy, N. A., M enon, N. R. 1979. Effects of ammonia and ammonium on tolerance and byssogenesis in Pema viridis. M ar. Ecol. Prog. Ser. 1: 315-321.

Resende, M . R. 2007.Variação das características hidráulicas em condutos forçados devido à infestação pelo Limnoperna fortunei. Dissertação (M estrado em Saneamento, M eio Ambiente e Recursos Hídricos) – Escola de Engenharia, Universidade Federal de M inas Gerais, Belo Horizonte.

Rolla, M .E., M ota, H.R. 2010. Response of a major Brazilian utility to the golden mussel invasion.

In: M ackie GL and Claudi R (eds), M onitoring and control of macrofouling mollusks in freshwater systems. CRC Press, Boca Raton, pp 396-403.

Sala, O. E.; Chapin, F. S.; Armesto, J. J.; Berlow, E.; Bloomfield, J.; Dirzo, R.;, Huber-Sanwald, E.; Huenneke, L F.; Jackson, R.B.; Kinzig, A.; Leemans, R., Lodge, D M .; M ooney, H. A.; Oesterheld, M ; Poff, N..L., Sykes, M . T..; Walker B. M .; Wall, D. H. 2000. Global Biodiversity Scenarios for the Year 2100. SCIENCE: 287: 1770 – 1774.

Santos, C.P.; Wurdig, N.L.; M ansur, M .C.D. 2005. Fases larvais do mexilhão dourado Limnoperna fortunei (Dunker) (M ollusca, Bivalvia, M ytilidae) na Bacia do Guaíba, Rio Grande do Sul, Brasil. Revista Brasileira de Zoologia 22(3):702-708.

65

Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos

Santos S. B., Thiengo S. C., Ammon M . F., M iyahira I. C., M ansur M . C., Pereira D. 2012.

CAPÍTULO 2 Espécies de moluscos límnicos invasores no Brasil In: M oluscos Límnicos Invasores No Brasil: Biologia, Prevenção e Controle. Porto Alegre: Redes Editora. P. 24 – 49 Scholz S, Fischer S, Gündel U, Küster E., Luckenbach T., Voelker D. 2008. The zebrafish embryo model in environmental risk assessment applications beyond acute toxicity testing Environ Sci Pollut Res 15:394404 Sharma, B., Ahlert, R. C. 1977. Nitrification and nitrogen removal. Water Research, 11(10), 897925.

Silva, J.S.V.; Fernandes, F.C.; Souza, R.C.C.L.; Larsen, K.T.S. Danelon, O.M . 2004. Água de Lastro e Bioinvasão.Pp 1-10. In: J.S.V. Silva & R.C.C.L. Souza (eds.). Água de Lastro e Bioinvasão. Interciência, Rio de Janeiro, RJ. 224p .

Simeão, C. M . G. 2011. Influência da variação de velocidade e pressão sobre Limnoperna fortunei (Dunker,1857) (Bivalvia, M ytilidae) e verificação dos efeitos da toxicidade do látex de Euphorbia splendens var. Hislopii n. E. B.(Euphorbiaceae) para esta espécie, Tese (Doutorado Programa de PósGraduação em Saneamento, M eio Ambiente e Recursos Hídricos) – Universidade Federal.

Slaughter, A.R., Palmer, C.G., M uller, W.J. 2007. An assessment of two-step linear regression and multifactor probit analysis as alternatives to acute to chronic ratios in the estimation of chronic response from acute toxicity data to derive water quality guidelines. Integr Environ.

Assess. M anag. 3, 193-202.

Soares, M .F., Pereira, D., Santos, C.P., M ansur, M .C., Pires, M ., Breintenbach, J.O., Grespan, C., 2009. Toxicidade do Sulfato de Cobre ao M exilhão Dourado, Limnoperna fortunei (Dunker, 1857) em Água Bruta. J. Braz. Soc. Ecotoxicol. 4, 37-48.

Soucek, D. J., Dickinson, A. 2012. Acute toxicity of nitrate and nitrite to sensitive freshwater insects, mollusks, and a crustacean. Archives of environmental contamination and toxicology, 62(2), 233-242.

Souza, R. C. C. L. ; Calanzas, S. & Silva, E. P. 2009. Impacto das espécies invasoras no ambiente aquático. Ciência e Cultura (SBPC), 61: p. 35-41.

Sousa B. R. Romano Silva M . A, V. Topepe. 2011. Dop amine D2Receptor Activity M odulates Akt Signaling and Alters GABAergic Neuron Development and M otor Behavior in Zebrafish Larvae. The Journal of Neuroscience, 6, 31:5512–5525 Spence R, Gerlach G. , Lawrence C and Smith C. 2008. The behaviour and ecology of the zebrafish Danio rerio. Biol Rev. 83: 13-34 Sylvester, F., Cataldo, D. H., Notaro, C., Boltovskoy, D. 2013. Fluctuating salinity improves survival of the invasive freshwater golden mussel at high salinity : implications for the introduction of aquatic species through estuarine ports. Biological Invasions, 1-12.

TenEyek, M . 2009. Sodium hydroxide (NaOH). Great ships initiative bench-scale test findings, technical report – public GSI/BS/5.

Thurston, R.V., Russo, R.C. 1981. Ammonia toxicity to fishes. Effect of pH on the toxicity of the un-ionized ammonia sp ecies. Environ. Sci. Technol. 15, 837-840.

Tillier, S. 1981. South American and Juan Fernandez succineid slugs (Pulmonata). Journal of Molluscan Studies 47: 125-146.

Traunspurger, W., & Drews, C. 1996. Toxicity analysis of freshwater and marine sediments with meio- and macro- benthic organisms: a review. Hy drobiology, 328, 215-261.

USEPA (United States Environmental Protection Agency). 2008. An introduction to freshwater mussels as biological indicators. Office of Environmental Information - Office of Information Analysis and Access. Washington, DC. USEPA 2009. United States Environmental Protection Agency. 2009. Draft 2009 update of aquatic life ambient water quality criteria for ammonia—freshwater. EPA-822-D-09-001. USEPA, Office of Water, Office of Science and Technology, Washington, DC 66

Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos

USEPA 2013. United States Environmental Protection Agency. 2013. Aquatic life ambient water quality criteria for ammonia—freshwater. EPA-822-R-13-001. USEPA, Office of Water, Office of Science and Technology, Washington, DC Venkateswara Rao, J., Srikanth, K., Arepalli, S. K., Gunda, V. G. 2006. Toxic effects of acephate on Paramecium caudatum with sp ecial emphasis on morphology, behaviour, and generation time. Pesticide biochemistry and physiology, 86(3), 131-137.

Venkateswara Rao, J., Gunda, V. G., Srikanth, K., Arepalli, S. K. 2007. Acute toxicity bioassay using Paramecium caudatum, a key member to study the effects of monocrotophos on swimming behaviour, morphology and reproduction. Toxicological & Environmental Chemistry, 89(2), 307-317.

Verween A., Vincx M ., Degraer S. 2009. Comparative toxicity of chlorine and peracetic acid in the biofouling control of Mytilopsis leucophaeata and Dreissena polymorpha embryos (M ollusca, Bivalvia), International Biodeterioration & Biodegradation, Volume 63, Issue 4, 523-528 Wassnig, M ., & Southgate, P. C. 2012. Effects of settlement cues on behaviour and substrate attachment of hatchery reared winged pearl oyster (Pteria penguin) larvae. Aquaculture, 344, 216-222.

Watton, A. J., & Hawkes, H. A. 1984. The acute toxicity of ammonia and copper to the gastropod Potamopyrgus jenkinsi (Smith). Environmental Pollution Series A, Ecological and Biological, 36(1), 17-29.

Weisse, T. 2006. Freshwater ciliates as ecophysiological model organisms lessons from Daphnia, major achievements, and future perspectives. Archiv für Hy drobiologie, 167, v. 1, n. 4, p.

371-402.

Wiessner, A., Kappelmeyer, U., Kaestner, M ., Schultze-Nobre, L., Kuschk, P. 2013. Response of ammonium removal to growth and transpiration of Juncus effusus during the treatment of artificial sewage in laboratory-scale wetlands. Water research, 47(13), 4265-4273.

Wogram, J.; Liess, M . 2001. Rank ordering of macroinvertebrate sp ecies sensitivityto toxic compounds by comparison with that of Daphnia magna. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, v. 67, n. 3, p. 0360-0367.

Wright, D. A., Setzler-Hamilton, E. M ., M agee, J. A., Kennedy, V. S., M cIninch, S. P.. 1996. Effect of salinity and temperature on survival and development of young zebra (Dreissena polymorpha) and quagga (Dreissena bugensis) mussels Estuaries, 3: 19, 619-628.

Yang TB., Wu ZD., & Lun ZR. 2013. The apple snail Pomacea canaliculata, a novel vector of the rat lungworm, Angiostrongylus cantonensis: its introduction, sp read, and control in China.

Hawai'i Journal of Medicine & Public Health, 72(6 Suppl 2), 23.

Zwaan, A. De & D. I. Zandee, 1972. Body distribution and seasonal changes in the glycogen content of the common sea mussel Mytilus edulis. Comp. Biochem. Phy siol., 43 (A), 53-58.

67