Fvb173p

UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS

INSTITUTO DE PATOLOGIA ANIMAL

PESQUISA DE LESIONES COMPATIBLES CON LA “INFLAMACIÓN DEL MÚSCULO ESQUELÉTICO Y CARDÍACO (HSMI)” EN BASE A HISTOLOGÍA Y RT-PCR EN SALMONES DEL ATLÁNTICO (SALMO SALAR) EN CUATRO CENTROS DE CULTIVO DEL SUR DE CHILE.

Memoria de Título presentada como parte de los requisitos para optar al TÍTULO DE MÉDICO VETERINARIO

CRISTOBAL ALBERTO BALBOA GONZALEZ

VALDIVIA – CHILE

2012

PROFESOR PATROCINANTE

PROFESORES CALIFICADORES

_______________________________________ Dra. María José Navarrete Talloni

_______________________________________ Dra. María Angélica Hidalgo Gómez

_______________________________________ Dr. Alex Patricio Romero Zuñiga

FECHA DE APROBACIÓN: 31 de agosto de 2012

ÍNDICE

Capítulos

Páginas

RESUMEN

1

SUMMARY

2

INTRODUCCIÓN

3

MATERIAL Y MÉTODOS

11

RESULTADOS

15

DISCUSIÓN

21

REFERENCIAS

24

ANEXOS

26

32

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

AGRADECIMIENTOS

1

1. RESUMEN

La inflamación del músculo esquelético y cardiaco (HSMI) es una nueva enfermedad en el salmón del Atlántico (Salmo salar), descrita en la salmonicultura noruega. Esta enfermedad fue diagnosticada por primera vez en el año 1999 y desde la fecha ha incrementado anualmente el número de brotes, convirtiéndose en un problema creciente para la industria de cultivo de salmón del Atlántico en Noruega. Hasta el año 2010 el agente era desconocido pero en estudios recientes se ha logrado asociar a un nuevo virus denominado Piscine Reovirus (PRV), el cual solo recientemente ha logrado ser aislado. Esta enfermedad se caracteriza por ser altamente contagiosa, transmitiéndose por cohabitación afectando a peces entre los 5 a 9 meses después de la liberación en el agua salada, con un peso de entre 0,4 y 1 kg.

La mortalidad en las jaulas es generalmente inferior al 10%, pero puede ser cercana al 20% siendo su morbilidad muy alta, casi al 100%. Actualmente, se ha determinado la presencia del virus en Chile mediante RT-PCR, el cual presentó una alta homología al PRV noruego. El signo más predominante de la enfermedad en las jaulas marinas es anorexia y comportamiento natatorio anormal, además de la presencia de peces moribundos y con piel oscura. La patogenia de esta enfermedad es en gran parte desconocida y aún no se han establecido métodos de control, actualmente la sugerencia es manejar el estrés en los periodos críticos, realizar sacrificio sanitario y suplementar con ácido tetradeciltioacético (antioxidante).

El objetivo de este estudio fue describir los hallazgos histopatológicos en salmón del Atlántico (Salmo salar) provenientes de cuatro centros de cultivo del país que fueron detectados positivos a PRV por RT-PCR con Ct menores a 31 para determinar la presencia de lesiones características de la enfermedad. Las muestras de peces Salmo salar recolectadas provenían del Proyecto SERNAPESCA-UACh, a las cuales se identificaron y analizaron en forma individual, por pez y centro de cultivo, para ser segregadas por Ct y sometidas a las técnicas de procesamiento y análisis histológico. Las muestras finalmente analizadas fueron tejidos de músculo cardiaco y esquelético para pesquisar lesiones compatibles con HSMI.

Los principales hallazgos histopatológicos en músculo cardiaco observados en 54 peces fueron epicarditis leve 46.30% (25/54) y miocarditis leve 31.48% (17/54). Las lesiones más comunes en músculo esquelético observadas en 53 peces fueron infiltración macrofágica moderada 32.08% (17/53) y degeneración leve 45.28% (24/53). Los análisis estadísticos (Chi-cuadrado) revelaron que no existe una asociación directa entre positividad a RT-PCR y grados de severidad de las lesiones histológicas. No fue posible establecer una asociación directa entre valores mayores y menores a la mediana del Ct y presencia/ausencia de lesión. Al segregar los centros por media, mediana y moda del Ct se pudo encontrar mayor cantidad de lesiones severas en el centro con el menor Ct y menor cantidad de lesiones en el centro con mayor valor de Ct. Finalmente, los resultados obtenidos no permiten asociar en forma directa las lesiones encontradas a nivel histológico con PRV, ya que no corresponden a las lesiones de tipo inflamatorias características de la enfermedad. Sin embargo, PRV se encuentra presente en las aguas de las zonas de cultivo marinas de nuestro país.

Palabras clave: HSMI, Salmo salar, histopatología, RT-PCR, Ct, SERNAPESCA.

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2. SUMMARY

STUDY OF PATHOLOGIC LESIONS COMPATIBLE WITH “HEART AND SKELETAL MUSCLE INFLAMMATION (HSMI)” BASED ON HISTOLOGY AND RT-PCR IN ATLANTIC SALMON (SALMO SALAR) IN FOUR FISH FARMS OF SOUTHERN CHILE Heart and skeletal muscle inflammation (HSMI) is a novel disease of farmed Atlantic salmon (Salmo salar) described in Norway. The disease was diagnosed for the first time in1999, since then outbreaks have increased annually, becoming a rising problem for the salmon farming industry in Norway. Until 2010 the etiological agent was unknown, but recent studies have associated the disease to a new virus, Piscine Reovirus (PRV), that has been recently isolated. This disease is characterized for being highly contagious, transmitted by cohabitation, affecting fish from 5 to 9 months, weighing between 0.4 and 1 kg after release in salt water.

The mortality rate at the cages is generally less than 10%, but it might get close to 20% being morbidity rates almost 100%. Currently, the presence of the virus has been have detected in Chile, showing high homology to the Norwegian PRV. The most prevalent sign of disease in sea cages is anorexia, abnormal swimming and behavior, besides the presence dying fish and dark skin. The pathogenesis of HSMI is largely unknown and control methods have not yet been established; it is suggested to manage stress at critical periods, perform stamping out and supplementation with tetradecylthioacetic acid (antioxidant).

The objective of the present study was to describe the pathological findings in Atlantic salmon (Salmo salar) from four farms of the south part of Chile, that were tested positive for PRV by RT-PCR presenting a Ct less than 31, to determine the presence of the disease’s distinctive lesions. The samples from Salmo salar were collected from a National Fisheries Service (SERNAPESCA) and Universidad Austral de Chile project, and were individually identified and analyzed by fish and origin, and then separated by Ct, and therefore histologically processed and analyzed. Finally, the analyzed samples were skeletal muscle and cardiac muscle tissues to determine compatible lesions with HSMI.

The main histopathological findings in cardiac muscle in 54 cases were mild epicarditis 46.30% (25/54) and mild myocarditis 31.48% (17/54). The most common lesions in skeletal muscle from 53 cases were moderate macrophagical infiltration 32.08% (17/53) and mild degeneration 45.28% (24/53). Statistical analyses (Chi-square) revealed that there is no direct association between positive RT-PCR and severity of the histopathological lesions. It was not possible to establish a direct association between higher and lower values to the median Ct and presence/absence of lesions. By segregating cases by Ct’s mean, median and mode there were more severe lesions in cases with lower Ct and less lesions in cases with higher Ct values.

Finally, these results showed that there is no direct association between PRV and the histopathological lesions observed, which do not correspond to the classical HSMI findings, even though PRV is still present in the seawater of marine cultures in Chile.

Keywords: HSMI, Salmo salar, histopathology, RT-PCR, Ct, SERNAPESCA.

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3. INTRODUCCIÓN

3.1.

ANTECEDENTES GENERALES

La acuicultura es la industria de producción de alimentos con mayor crecimiento en el mundo. Sin embargo, el aumento de la producción está siendo acompañado por la emergencia de enfermedades infecciosas (Finstad y col 2012), una de ellas es la inflamación del músculo esquelético y cardiaco (HSMI) que es una nueva enfermedad en el salmón del Atlántico (Salmo salar) descrita en la salmonicultura noruega. Esta enfermedad fue diagnosticada por primera vez en el año 1999 y desde la fecha ha incrementado anualmente el número de brotes (Kongtorp y col 2004A, Kongtorp y col 2004B, Ferguson y col 2005, Watanabe y col 2006, Kongtorp y col 2009), convirtiéndose en un problema creciente para la industria de cultivo de salmón del Atlántico en Noruega (Kongtorp y Taksdal 2009). En el año 2006, la enfermedad fue diagnosticada en 94 ocasiones, en el 2007 el número de centros de cultivos afectados fue 162 y un total de 417 granjas fueron reportadas el año 2010 en Noruega (Palacios y col 2010).

Con referencia a las pérdidas económicas, éstas se producen por la baja del apetito, mortalidad y cronicidad del cuadro (Alne y col 2009).

Esta enfermedad es altamente infecciosa y su agente causal no había sido aislado en cultivo celular (Palacios y col 2010, Finstad y col 2012). La identificación había sido en extremo dificultosa, existiendo una única asociación con un nuevo Reovirus, Piscine Reovirus (PRV) (Palacios y col 2010) pero Mikalsen y colaboradores (2012) logró aislarlo en líneas GF-1, determinando a PRV como agente causal de HSMI.

Esta enfermedad se ha asociado con epidemias de enfermedades infecciosas que amenazan no sólo la producción local, sino también a los peces silvestres que se aproximan a las jaulas marinas y de peces que escapan de ellas (Palacios y col 2010). Wiik-Nielsen y colaboradores (2012) describen cuatro especies de peces silvestres que fueron positivos a ensayos de RT-PCR para PRV. Se ha pensando que la enfermedad estaba circunscrita a Noruega pero se ha detectado un caso sospechoso de HSMI en Escocia de etiología incierta (Ferguson y col 2005) siendo la primera vez que se reporta fuera de Noruega, además de otros países como Chile (Bustos y col 2011, Yousaf y col 2012).

La inflamación del músculo esquelético y cardiaco ha sido inducida experimentalmente en el salmón del Atlántico mediante la inoculación con extractos de corazón y riñón de peces con HSMI o mediante la cohabitación con peces enfermos. En la actualidad no existen sistemas de diagnóstico certeros aunque se están validando la técnica recientemente lograda, por lo que HSMI se diagnostica con histopatología básica (Kongtorp y col 2004B) y se confirma con RT-PCR para Piscine Reovirus (PRV), el cual sería el agente involucrado (Palacios y col 2010).

Con respecto a los signos clínicos, esta enfermedad se caracteriza por nado errático, en contra de la corriente del agua, típicamente posicionado contra las paredes de las jaulas, color oscuro de la piel y letargia. Los hallazgos histopatológicos característicos son epi-, endo- y

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miocarditis, necrosis del miocardio, así como también miositis y necrosis del músculo esquelético rojo (Kongtorp y col 2009, Palacios y col 2010).

3.2.

DESCRIPCION DEL AGENTE

En estudios de patogenia de la enfermedad (Kongtorp y Taksdal 2009) y de su transmisión (Kongtorp y col 2004A) HSMI se describe como una enfermedad infecciosa (Kongtorp y col 2004B, Palacios y col 2010) debido a que se ha observado que la mortalidad puede comenzar en una jaula y extenderse a las próximas (Watanabe y col 2006).

La etiología viral había sido durante mucho tiempo sospechosa y la caracterización de un virus causal se ha logrado (Mikalsen y col 2012). No había sido posible encontrar parásitos o bacterias que expliquen HSMI y ningún virus conocido, como por ejemplo el virus de la anemia infecciosa del salmón (ISAv) producido por un Orthomyxoviridae, o el virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNv) el cual es un Birnavirus, había podido ser identificado (Watanabe y col 2006). La microscopía electrónica ha revelado varias partículas de tipo viral (VLP) (Watanabe y col 2006, Palacios y col 2010), pero una asociación concluyente de cualquiera de éstas a HSMI no se logró establecer (Kongtorp y col 2009). Kongtorp y Taksdal (2009), reportan infección a través del uso experimental de inóculos de peces muertos infectados, los cuales fueron tratados con antibióticos para excluir posibles infecciones bacterianas. Además, se señala que a pesar de tratar un inóculo con cloroformo resultó igualmente infeccioso, lo que indica que el agente no tiene una capa lipídica externa sensible al cloroformo.

En uno de los últimos estudios realizados por Palacios y colaboradores (2010) para determinar la etiología de HSMI, se vinculó la enfermedad con la presencia de un nuevo virus denominado Piscine Reovirus (PRV), un nuevo Reovirus identificado por piro secuenciación de alto rendimiento de muestras positivas a HSMI mediante histología. Los Reovirus son virus icosaédricos, sin envoltura, con ARN de doble cadena que comprende desde 10 hasta 12 segmentos. Existe una divergencia en la secuencia de PRV con respecto a otros Reovirus, como Orthoreovirus y Aquareovirus (Palacios y col 2010). Se relacionó formalmente PRV a HSMI ya que Mikalsen y colaboradores lograron aislar en cultivo celular con líneas GF-1, obteniendo efecto citopático posterior al cuarto pasaje (Mikalsen y col 2012).

PRV se ha detectado en peces de cultivo que no han presentado signos clínicos de HSMI, esto podría deberse a que puede causar un gran rango de manifestaciones desde inaparentes hasta letal (Løvoll y col 2010). Además puede ser encontrado tanto en peces saludables como enfermos (Løvoll y col 2010, Finstad y col 2012). PRV ha sido detectado también en pequeñas cantidades en las poblaciones silvestres de salmón del Atlántico (WiikNielsen y col 2012, Finstad y col 2012) estando el virus ampliamente distribuido en el agua de mar (Finstad y col 2012).

Dentro de las investigaciones se ha determinado que la distribución en el tejido y la carga de PRV se correlacionan con las lesiones características de la enfermedad en el salmón de forma natural y experimentalmente (Mikalsen y col 2012).

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3.3.

EPIDEMIOLOGÍA

Los brotes de la enfermedad comienzan de 5 a 9 meses después de la liberación en el agua salada del salmón del Atlántico con un peso de entre 0,4 y 1,0 kg. Sin embargo, en 2004 la enfermedad se observó a las 2 semanas después de la liberación en algunas granjas marinas en el oeste de Noruega (Kongtorp y col 2004B, Watanabe y col 2006). La morbilidad puede ser tan alta como 100% (Kongtorp y col 2006), mientras que la mortalidad en las jaulas es generalmente inferior al 10%, pero puede ser cercana al 20% (Yousaf y col 2012) de los peces que muestran cambios en el corazón y los tejidos somáticos musculares (Watanabe y col 2006, Kongtorp y col 2009). Una mortalidad significativa a menudo se asocia con episodios de estrés adicional durante la fase clínica de la enfermedad (Kongtorp y col 2004B). Los animales en acuicultura están limitados a altas densidades generándose las condiciones propicias para la transmisión de agentes infecciosos y la reducción a la resistencia a las enfermedades mediante la inducción de estrés (Palacios y col 2010). Con respecto a este punto, factores como la ocurrencia de otras enfermedades podrían contribuir al desarrollo de HSMI. La condición ubiquitaria de PRV junto con los brotes reportados estaría provocando una presión de selección en cuanto a la eficacia de diseminación y posiblemente en la virulencia (Finstad y col 2012). Se sospecha que el agente se presenta en el medio, por tanto, es probable que algunos brotes en centros de cultivos en la fase de agua de mar puedan pasar desapercibidos al contener peces con lesiones graves en concordancia con HSMI, pero sin ningún problema aparente de enfermedad (Kongtorp y col 2009, Mikalsen y col 2012).

HSMI es transmisible experimentalmente al Salmón del Atlántico sano por vía intraperitoneal con inyecciones de variados tejidos de animales enfermos y por la convivencia con peces infectados (Kongtorp y col 2004A, Kongtorp y col 2009, Mikalsen y col 2012).

La transmisión exitosa de HSMI por la inyección de plasma de la sangre sugiere que el agente causal puede estar presente en la sangre periférica durante el brote clínico. Tesis que fue reafirmada por Mikalsen y colaboradores (2012), ya que fue posible determinar dispersión de virus mediante pequeños vasos en el tejido cardiaco. Es de importancia tener en cuenta las rutas más probables de infección natural y contaminación a través del epitelio branquial, como el intestino o la epidermis. Esto puede tener implicaciones para la dispersión del virus, al menos desde los peces muertos y en descomposición (Kongtorp y Taksdal 2009).

Hasta el año 2004 la enfermedad solo se había reportado en Noruega, pero en el año 2005 se documentó un brote de la enfermedad por Ferguson y colaboradores (2005) en que las lesiones fueron similares a las previamente descritas para HSMI. De haber sido HSMI el agente causal de este brote, hubiese representado la primera vez que la condición se hubiese descrito fuera de Noruega. Actualmente, se ha determinado la presencia del virus en Chile y Escocia (Yousaf y col 2012). Con respecto a nuestro país, el PRV identificado presentó una alta homología al virus noruego (Bustos y col 2011). La industria salmonera puede llegar a ser muy susceptible a enfermedades foráneas, de esta manera se debe considerar la rápida dispersión de la enfermedad ya que es de vital importancia conocer los países afectados por HSMI para extremar las medidas de vigilancia epidemiológicas y bioseguridad.

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3.4.

PATOGENIA

La patogenia de la HSMI es en gran parte desconocida (Kongtorp y col 2009).

Actualmente, se está estudiando la participación de linfocitos T citotóxicos CD3, CD 4 y CD8 en la patogenia. Se sostiene que los linfocitos CD8 causarían las lesiones características (Mikalsen, y col 2012). Poco se sabe sobre la introducción de HSMI en el medio, los factores de la patogénesis y el riesgo de brotes de la enfermedad clínica (Kongtorp y Taksdal 2009). Un reciente estudio longitudinal de la evolución de la enfermedad indicó que HSMI puede comenzar como una infección subclínica, seguido por una fase aguda clínica en el curso de unas pocas semanas, y posteriormente una fase de recuperación que puede durar varios meses (Ferguson y col 2005, Kongtorp y col 2009). Este mismo estudio mostró que los cambios cardíacos pueden ser observados varios meses antes y después de un brote clínico, lo que sugiere un desarrollo lento y prolongado de la enfermedad.

El signo más predominante de la enfermedad en las jaulas marinas es anorexia y comportamiento natatorio anormal (Kongtorp y col 2004B), además de la presencia de peces moribundos y de piel oscura (Kongtorp y col 2009). Durante el primer brote de la enfermedad en 1999, hubo un descenso inicial del apetito y mortalidad aproximado a 15.5%. Peces con comportamiento natatorio anormal presentaban piel oscura y letargia, típicamente posicionados cerca de las paredes de las jaulas nadando en contra de la corriente. Los peces tenían un balance normal, pero no respondían a la alimentación u otro estimulo (Kongtorp y col 2004B, Watanabe y col 2006).

Se describe una fase pre-clínica y una fase clínica del brote. La fase pre-clínica es el período definido entre la transferencia del mar hasta la fase de brote clínico. Esta fase se inicia con un aumento de la mortalidad y de peces moribundos debido a HSMI. La fase clínica del brote es descrita como el período de aumento de la mortalidad debido a HSMI. En este período, el número de peces moribundos y muertos fue significativamente superior a la normal en todos los sitios donde se recogieron las muestras para el estudio realizado por Kongtorp y colaboradores (2009).

Recientemente se ha especulado en relación al poder patógeno de PRV, ya que se ha observado un rol fundamentalmente oportunista del virus frente a otra enfermedad cardiaca de los salmónidos (síndrome cardiomiopático o CMS) presente en Noruega, lo cual aumenta las dudas sobre la acción patógena y patogenia de PRV.

3.5. ANTECEDENTES GENERALES DE LA HISTOLOGÍA DEL MÚSCULO CARDIACO Y ESQUELETICO

Las lesiones características encontradas en peces afectados por HSMI ocurren principalmente en la musculatura cardiaca y esquelética. A continuación se describirá la histología normal.

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3.5.1. EPICARDIO Y ENDOCARDIO

Una capa delgada de tejido conectivo cubre el miocardio subepicardialmente y subendocardicalmente. El epicardio es la capa visceral del pericardio. Se compone principalmente por una monocapa de células epiteliales, pero algunas áreas también contienen células hematopoyéticas y adiposas (Fig. 1A). El endocardio contiene una monocapa de células endoteliales, que son equivalentes a las células sanguíneas de revestimiento (Kongtorp 2009).

3.5.2. MIOCARDIO

Ambas capas musculares del corazón, las capas compacta y esponjosa, consisten en un entramado de tejido muscular cardíaco (Fig. 1B). En los peces, los cardiomiocitos crecen hiperplásicamente, en lugar de hipertrofia. Los miocitos presentes en el miocardio compacto son generalmente más pequeños que los miocitos en la capa esponjosa. Ambos tipos de células son considerablemente más pequeñas que los cardiomiocitos mamíferos. El núcleo está ubicado en posición central dentro de la célula, y toma un color azulado pálido mediante tinción con hematoxilina y eosina (HE). Los componentes importantes de los miocitos son las miofibrillas contráctiles, que están situadas en la porción citoplasmática de las células (sarcoplasma). En los peces, hay un menor número de miofibrillas en miocitos auriculares, en comparación con los miocitos ventriculares. Las miofibrillas consisten en filamentos delgados compuestos por actina, tropomiosina y la troponina, además de filamentos gruesos que contienen miosina. Estas estructuras están organizadas en un patrón repetitivo de las bandas llamadas sarcómeros, creando un patrón de estriación cruzada. La naturaleza acidófila de las miofibrillas contribuye a un color rosado del citoplasma al teñir con HE. En el músculo cardíaco, las células individuales están ramificadas e interconectadas con las células vecinas a través de discos intercalados (Kongtorp 2009).

3.5.3. MÚSCULO ESQUELETICO

El tejido del músculo esquelético en el salmón se compone principalmente de fibras de color rojo y color blanco, siendo estas últimas, las fibras musculares más abundantes, y constituyen la mayor parte de los músculos del cuerpo. Éstas están ancladas al esqueleto y la piel por una capa de tejido conectivo, disponiendo el músculo en cuatro unidades. El tejido se divide en haces de músculo estriado esquelético por capas de tejido conectivo (Kongtorp 2009).

La función del músculo blanco es generar gran cantidad de energía permitiendo movimientos rápidos. Esto es debido al metabolismo anaeróbico de la glucosa, que se almacena en forma de glucógeno en el tejido muscular. El músculo rojo está situado paralelo al eje del cuerpo a lo largo de la línea lateral de los peces. Se compone de pequeños haces de fibras musculares estriadas (Fig. 1E) y contiene más mioglobina en el sarcoplasma que el tejido del músculo blanco. El tejido muscular es de color rojo, muy vascularizado. Recibe la mayor parte de su energía de la fosforilación oxidativa de los ácidos grasos y está implicado en los movimientos de mantención en los peces (Kongtorp 2009).

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Figura 1. Salmo salar. Micrografías de tejidos de peces control negativo para HSMI (H&E), las muestras A, B y corresponden a músculo cardiaco, mientras que las muestras D y E corresponden a muestras de músculo esquelético rojo. (A)Se observa epicardio con infiltrado de células adiposas (flecha), estrato compacto y esponjoso (delimitadas por flechas), 20X. (B)Zona de transición entre estrato compacto (flecha) y esponjoso (circulo), se observa el entrelazado de fibra musculares (estrella), 20X. (C)Estrato compacto normal (flecha), 20X. (D)Sección de músculo rojo cortado en forma transversal, se observa las fibras musculares en estado normal a 20X. (E)Paquetes de fibras musculares rojas normales, 40X. Muestras provenientes del centro 21B del proyecto SERNAPESCA-UACh.

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3.6.

HISTOPATOLOGÍA

El diagnóstico de HSMI se basa en el examen histológico (Kongtorp y col 2004B, Kongtorp y col 2009), por esta razón es importante considerar lesiones características para el diagnóstico de esta enfermedad. Histológicamente, se reconoce por la inflamación y necrosis en el corazón y músculo esquelético rojo (Kongtorp y col 2009). Esta enfermedad es reconocida por una extensa panmiocarditis, siendo característica una severa epicarditis con una infiltración masiva de células mononucleares. A nivel ventricular es posible observar infiltrados de linfocitos, macrófagos y células plasmáticas, más evidentes en la capa compacta, pero encontrándose también en la capa esponjosa del miocardio. Las células inflamatorias se ubican sobre y alrededor de los cardiomiocitos. Las células afectadas muestran signos de degeneración, eosinofilia, perdida de las estriaciones, vacuolización y núcleo central. Las células necróticas es posible verlas asociadas a los infiltrados inflamatorios (Kongtorp y col 2004A, Kongtorp y col 2006).

Kongtorp y colaboradores (2004B) sostenían que el agente que causa HSMI debería estar presente en el miocardio en algún momento en la patogénesis, lo que induce una intensa respuesta inmune que genera las extensas lesiones observadas, situación que es corroborada al detectar linfocitos CD8 mediante inmunohistoquímica (Mikalsen y col 2012). A nivel de los miocitos de la musculatura roja es posible observar hipercelularidad e infiltrado inflamatorio sobre y entre las fibras musculares, pérdida de estriaciones, necrosis, degeneración, vacuolización y eosinofilia (Kongtorp y col 2006), también producto de la acción citotóxica de linfocitos CD8 (Mikalsen y col 2012). Con respecto al músculo blanco, es posible observar degeneración sin infiltrado inflamatorio (Kongtorp y col 2004A).

3.7.

CONTROL

No se han descrito técnicas directas en cuanto a bioseguridad ni de control para esta enfermedad, tampoco se conocen los factores de riesgo y las causas de introducción de HSMI a las zonas de cultivo, pero ha sido demostrado que el movimiento de peces en las fases de agua de mar dispersa el virus a causa del estrés producido (Rimstad 2011). Un método indirecto fue estudiado por Alne y colaboradores (2009) el cual consistía en incluir ácido tetradeciltioacético (antioxidante) en la dieta de los peces expuestos a brotes naturales de HSMI. Los resultados fueron prometedores, ya que al promover factores antinflamatorios y antioxidantes aumenta la sobrevida en un 45%, aumenta el coeficiente de crecimiento térmico (sin aumento significativo de la tasa de conversión alimentaria), disminuye la concentración de urea en sangre y aumenta la expresión de genes relevantes para la oxidación de ácidos grasos en el corazón por medio del aumento de la cantidad y tamaño de peroxisomas.

Según lo descrito por Ferguson y colaboradores (2005) la eliminación inmediata de los peces involucrados sería un método de control, siendo este la única sugerencia descrita en la literatura. Debido a que HSMI se ha extendido en toda la industria salmonera noruega, no sería significativo el control de bioseguridad ya que el agente se transmite por cohabitación (Kongtorp y col 2004A) y se encontraría ampliamente distribuido en el agua de mar (Finstad y col 2012). Según Kongtorp y colaboradores (2004B) el estrés producido por manejos aumenta la mortalidad y la extensión de los brotes observados, por esta razón sería importante realizar

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manejos acotados para evitar estrés innecesario en los peces. Teniendo en cuenta la notable propagación en Noruega (Palacios y col 2010) hay una clara necesidad de seguir trabajando para comprender el agente de HSMI y el papel que desempeña en el impacto de la industria (Ferguson y col 2005), ya que las pérdidas se producen por la baja del apetito, mortalidad y cronicidad del cuadro (Alne y col 2009).

Actualmente se encuentra en desarrollo una vacuna contra PRV (*), pero teniendo en cuenta la naturaleza ubiquitaria y la persistencia de PRV, no es probable que la vacunación por sí sola pueda erradicar el virus de la industria acuícola. Sin embargo, junto con otras medidas profilácticas, la vacunación puede contribuir a reducir el número y/o severidad de los brotes de HSMI. La disminución en la carga viral observadas en los peces listos para cosecha puede indicar que los peces son capaces de montar una cierta respuesta inmunológica contra PRV. La producción de líneas genéticas resistentes es una estrategia adicional para la lucha contra HSMI (Løvoll y col 2012).

3.8.

OBJETIVOS

3.8.1. OBJETIVO GENERAL

Realizar examen histopatológico de corazón y músculo esquelético en salmón del Atlántico (S. salar), provenientes de cuatro centros de cultivo del sur de Chile para pesquisar lesiones compatibles con la “Inflamación del músculo esquelético y cardíaco (HSMI)” en base a histología y RT-PCR.

3.8.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• •

Describir los hallazgos histopatológicos en corazón y músculo esquelético en salmón del Atlántico positivo a HSMI mediante RT-PCR. Asociar los hallazgos histopatológicos en salmón del Atlántico con “Inflamación del músculo esquelético y cardíaco (HSMI)” en peces positivos a Piscine Reovirus por RT-PCR con Ct menor a 31.

_________________________________________________________________________ * http://www.vetinst.no/Forskning/Forskningsprosjekter/Andre-forskningsprosjekter/Developmentof-a-Piscine-Reovirus-PRV-vaccine Consultado el 19 de junio de 2012 a las 20:33h

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4. MATERIAL Y MÉTODOS

4.1.

MATERIAL BIOLÓGICO

En base a un estudio previo realizado en Chile, el cual demostró la presencia del virus en el país, la presente investigación analizó tejidos de músculo esquelético y cardiaco en busca de lesiones concordantes con HSMI, formando parte del proyecto del Servicio Nacional de Pesca (SERNAPESCA) y el Instituto de Patología Animal de la Universidad Austral de Chile denominado “Estudio prospectivo para determinar la presencia del agente viral Piscine Reovirus (PRV) en centros de cultivo de salmonideos de las X, XI y XII regiones”.

El total de muestras recolectadas pera el proyecto SERNAPESCA-UAChfue de 395 peces, pero para la realización de este estudio se analizaron 54 ejemplares de salmón del Atlántico positivos a RT-PCR con Ct menor a 31, obtenidos a través del proyecto del Servicio Nacional de Pesca (SERNAPESCA) y el Instituto de Patología Animal de la Universidad Austral de Chile denominado “Estudio prospectivo para determinar la presencia del agente viral Piscine Reovirus (PRV) en centros de cultivo de salmonideos de las X, XI y XII regiones”, que contempló la obtención de muestras de peces y sus tejidos desde centros de cultivo localizados en las Regiones de Los Lagos (X región), Aysén del General Carlos Ibáñez del Campo (XI región) y Magallanes y de la Antártica Chilena (XII región).

4.2.

TOMA DE MUESTRAS

La toma de muestras fue realizada por personal capacitado de SERNAPESCA. Se obtuvieron muestras de corazón, músculo esquelético, páncreas y riñón medio, las cuales fueron remitidas al Laboratorio de Anatomía Patológica UACh, en frascos debidamente identificados e individualizados, en formalina tamponada al 10%, según protocolos estandarizados. Para efectos de este estudio se consideró el análisis de muestras de corazón y músculo esquelético.

4.3.

MUESTRAS

Se utilizaron 54 peces de un total de 395 correspondientes a los muestreados para el proyecto SERNAPESCA-UACh. Los peces provienen de cuatro centros de cultivo donde cada centro de cultivo esta compuesto de 15 peces divididos en cinco pooles de tres peces. Los centros de cultivos seleccionados provienen de distintas zonas y regiones del sur del país, los cuales resultaron positivos al ensayo de RT-PCR para PRV y que presentaron un Ct menor a 31 (entre 20.9 y 30.7) (Cuadro 1). El centro 29A, proveniente de Punta Arenas (Región de Magallanes y de la Antártida Chilena) constaba de cinco pooles, catorce muestras para músculo esquelético y quince para músculo cardiaco, esto debido a que no fue muestreada una muestra de músculo esquelético. El centro 26A, proveniente de Puerto Montt (Región de los Lagos), constaba de cinco pooles, quince muestras tanto para músculo esquelético como para músculo cardiaco. El centro 6B, procedente de Aysén (Región de Aysén del General Carlos Ibáñez del Campo), contaba 5 pooles, quince muestras para músculo esquelético y cardiaco. Finalmente,

12

el centro 23, procedente de Castro (Región de los Lagos), constaba de 3 pooles, nueve muestras para músculo esquelético y cardiaco. Además, se consideró un centro control negativo (21B) confirmado por RT-PCR, constituido por 2 pooles, seis muestras para corazón y músculo esquelético (Salmo salar) provenientes de Puerto Montt. En el Anexo 8.2 se puede observar los hallazgos histológicos del control negativo, mientras que en el Anexo 8.5 se detalla el diseño del muestreo y el método para recolectar las muestras.

Cuadro 1. Resumen de la procedencia de los centros, cantidad de muestras para el análisis histopatológico (músculo esquelético y corazón), cantidad de pooles y resultados (rango) de RT-PCR. Procedencia Centro de cultivo Puerto Aysen Castro Punta Arenas Puerto Montt Puerto Montt

6B 23 29A 26A 21B

Músculo esquelético 15 9 14 15 6

4.4.

Corazón

Pooles

Ct

15 9 15 15 6

5 3 5 5 2

23,7 - 30,3 23,5 - 26,9 20,9 - 27 27,3 - 30,7 Control Negativo

PROTOCOLOS

Una vez recepcionadas las muestras por el Laboratorio de Biotecnología y Patología Acuática se realizó la prueba de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) para los tejidos de corazón y músculo esquelético, la cual entrega el valor de la prueba denominado Ciclo umbral o Cycle threshold (Ct). Este se trata de un valor matemático calculado que indica en forma inversamente proporcional la cantidad de ADN o ARN que se encuentra en forma inicial en la muestra a analizar. De esta forma, mientras más ácidos nucleicos existan menor será el valor del Ct. Se estipula que valores de Ct mayores a 32 se consideran negativos.

En forma simultánea al análisis de RT-PCR se destinan muestras para su registro, procesamiento histológico, observación anatomopatológica y diagnóstico. Estos procedimientos se realizan bajo los protocolos establecidos dentro del proyecto SERNAPESCA-UACh y aquellos que rigen en los laboratorios del Instituto de Patología Animal.

4.4.1. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS

El proceso para el análisis histopatológico de las muestras de tejido se realizó de acuerdo a la metodología histológica de rutina de deshidratación e inclusión en parafina sólida (Luna 1968). Brevemente, los tejidos fueron fijados en formalina tamponada al 10%, para luego ser laminados y procesados automáticamente (Autotécnico Histokinette), donde se realizó la deshidratación. Luego, se impregnaron con parafina. Posteriormente, se realizó la inclusión, para después realizar los cortes en micrótomo de rotación a 5 micras. Finalmente, las muestras se tiñeron en una batería de hematoxilina (núcleo azul) y eosina (citoplasma rojo) y fueron montadas en sus portaobjetos.

13

4.4.2. CLASIFICACIÓN DE LAS LESIONES EN MÚSCULO CARDIACO Y ESQUELETICO

Los peces diagnosticados como positivos a través de RT-PCR, presentando Ct menores de 31, fueron analizados a nivel histológico para determinar lesiones características para HSMI. Kongtorp y colaboradores (2004B) establecieron las lesiones características para músculo cardiaco y esquelético (Fig. 2).

•

Músculo cardiaco: Severa epicarditis, caracterizada por una severa infiltración mononuclear (Fig. 2A). Infiltración del estrato esponjoso y compacto del ventrículo, caracterizado por infiltración mononuclear junto a macrófagos, linfocitos y células plasmáticas (Fig. 2B y 2C). Los miocitos afectados presentan signos de degeneración y las células necróticas se encuentran asociadas a células inflamatorias.

•

Músculo esquelético : Infiltrado mononuclear entre y en las fibras musculares, perdida de estriación, vacuolización y necrosis (Fig. 2D y 2E).

Kongtorp y colaboradores (2006) establecieron la graduación de las lesiones de la siguiente forma: Focos inflamatorios dispersos indicaría lesiones leves. Lesiones multifocales o difusas evidentemente separadas de tejido sano corresponden a lesiones moderadas. Mayoría del tejido infiltrado en forma difusa es característico de lesiones severas.

En base a lo descrito por Kongtorp y colaboradores (2004B, 2006) se establecieron los criterios para graduar las lesiones provenientes de los grupos de peces en el presente estudio.

En un examen preliminar de las muestras histológicas se determinó caracterizar las lesiones principales, por lo que se modificó el método antes descrito, pesquisando las siguientes lesiones: Músculo cardiaco: Epicarditis y Miocarditis, Músculo esquelético: Degeneración e Infiltración macrofágica.

La graduación fue la siguiente: Ausente: Sin alteraciones. Leve: Lesiones correspondientes a menos 30% del tejido en forma focal. Moderado: Lesiones entre 30 y 60% en forma focal o difusa. Severo: Lesiones sobre el 60% en forma difusa. Para efectos de la graduación, la simbología esta detallada en el Cuadro 2:

Cuadro 2. Categorías de graduación de las lesiones utilizadas en este estudio.

Simbología Ausencia Leve Moderado Severo

4.5.

0 1 2 3

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los datos obtenidos fueron analizados mediante el uso de estadística descriptiva, siendo segregados mediante cuartiles y medianas. Además, se utilizó la prueba estadística de Chi cuadrado.

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Figura 2. Salmo salar. Músculo cardiaco y esquelético en muestras control positivo para HSMI (H&E).

Las muestras A, B y C corresponden a muestras de músculo cardiaco, mientras que las muestras D y E corresponden a músculo esquelético rojo. (A)Corte transversal, severa epicarditis e infiltrado inflamatorio severo (flechas A). En estrato compacto (flechas B), zona de transición (flechas C) y estrato esponjoso (flechas D) se observa severamente afectada por infiltrado inflamatorio, 10X. (B)Infiltrado inflamatorio severo del estrato compacto (flechas indican linfocitos), 20X. (C)Severa miocarditis del estrato esponjoso (flechas indican linfocitos), 20X. (D)Corte transversal, miositis severa. Se observa degeneración (flecha A), necrosis (flecha B), infiltración macrofágica difusa (letra C) y pérdida de la arquitectura normal, comparar con Fig.1E (letra D), 20X. (E)Corte transversal, músculo rojo severamente afectado por infiltrado inflamatorio difuso (flechas A), y músculo blanco normal (letra B), 4X. (Muestras donadas por el Instituto de Veterinario de Noruega, Oslo; Dra. Torunn Taksdal).

15

5. RESULTADOS

Se analizaron cuatro centros de peces Salmo salar provenientes de las regiones de Los Lagos, de Aysén del General Carlos Ibáñez del Campo y la Región de Magallanes y de la Antártida chilena. En el caso de lesiones observadas en músculo esquelético, las lesiones diagnósticas determinadas fueron degeneración muscular e infiltración macrofágica. Para músculo cardiaco, las lesiones diagnosticadas fueron epicarditis y miocarditis, según la modificación del método de Kongtorp (2006).

5.1.

CARACTERIZACIÓN DE LAS LESIONES HISTOPATOLÓGICAS

A continuación se describen las lesiones observadas en los cortes de músculo esquelético y cardiaco.

Músculo cardiaco: 3.7% (2/54) de las muestras presentaron epicarditis de carácter severo (Fig. 3A) y un 1.85% (1/54) miocarditis severa. Acorde al método modificado, se clasificaron como severas debido al carácter difuso que comprometían más del 60% del tejido. Cabe mencionar, que los tipos celulares observados fueron linfocitos. No se evidenciaron signos de degeneración ni necrosis. Las lesiones de carácter moderado observadas presentaron un 18.52% (10/54) para epicarditis (Fig. 3B) y un 20.37% (11/54) para miocarditis. La mayoría de las lesiones observadas fueron de carácter leve o no presentaron ninguna lesión (Fig. 3C). No se observó endocarditis.

Músculo esquelético: Se observó severa infiltración macrofágica en un 5.66% (3/53) de las muestras (Fig. 3E). La degeneración leve se presentó en un 45.28% (24/53) de las muestras y en 32.08% (17/53) de las muestras se observó infiltración macrofágica moderada (Fig. 3F). La mayoría de las lesiones observadas fueron de carácter leve o sin lesión. El resumen de la suma y porcentaje de las lesiones observadas se presentan en el Cuadro 3.

5.1.1. HALLAZGOS HISTOPATOLÓGICOS EN MÚSCULO ESQUELÉTICO

En todos los centros, las lesiones más comunes en músculo esquelético fueron: infiltración macrofágica moderada con un 32.08% (17/53) y degeneración leve con un 45.28% (24/53) del total (n=53) (Cuadro 3). Destaca la degeneración de carácter leve con un 42.9% (6/14) para el centro 29A, degeneración leve con un 73.3% (11/15) para el centro 26A, infiltración macrofágica moderada con un 20.0% (3/15) para el centro 6B y degeneración leve e infiltración macrofágica moderada, ambas con un 55.6% (5/9) para el centro 23. El resumen de frecuencias y porcentajes se detalla en el Anexo 8.1.

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Figura 3. Salmo salar. Tejidos de peces positivos a HSMI por medio de RT-PCR (Ct entre 20.9 a 30.7) (H&E). A, B, C y D corresponden a músculo cardiaco, mientras que las muestras E y F corresponden a muestras de músculo esquelético rojo. (A)Epicarditis con infiltrado inflamatorio severo (flechas), se observa como se introduce en el estrato compacto, 20X. (B)Epicarditis leve (flechas), 20X. (C)Miocarditis leve focal en estrato compacto (flechas indican linfocitos), 10X. (D)Infiltrado inflamatorio focal en estrato esponjoso (estrella), 10X. (E)Corte longitudinal, infiltración macrofágica moderada (flechas indican macrófagos) y degeneración de las fibras musculares (letras A, B y C), 20X. (F)Lesión característica de degeneración muscular, con células macrofágicas (flechas) entre y sobre células musculares, fagocitando haces musculares (estrella), 40X. Muestras provenientes de los centros 23, 6B, 29A y 26A del proyecto SERNAPESCA-UACh.

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Cuadro 3. Frecuencias totales y porcentajes para las muestras de músculo esquelético y cardíaco.

Tejido

Ausencia Leve Moderado Severo Total

Músculo esquelético Infiltración Degeneración Macrofágica nº % nº 21 39,62 19 24 45,28 14 8 15,09 17 0 0 3 53 100 53

Corazón Epicarditis % 35,85 26,42 32,08 5,66 100

nº 17 25 10 2 54

Miocarditis % 31,48 46,3 10,52 3,7 100

nº 25 17 11 1 54

% 46,3 31,48 20,37 1,85 100

5.1.2. HALLAZGOS HISTOPATOLÓGICOS EN MÚSCULO CARDIACO

Para la totalidad de las muestras (n=54), las lesiones que se presentaron con mayor frecuencia en músculo cardiaco fueron epicarditis leve con un 46.30% (25/54) y miocarditis leve con un 31.48% (17/54) (Cuadro 3). Destacan la epicarditis y miocarditis moderada con un 40.0% (6/15) cada una para el centro 29A, epicarditis leve con un 73.3% (11/15) para el centro 26A, epicarditis leve con un 33.3% (5/15) para el centro 6B, y epicarditis y miocarditis leve, ambas con un 55.6% (5/9) para el centro 23. El resumen de frecuencias y porcentajes se detalla en el Anexo 8.1.

5.2.

ESTRATIFICACIÓN DE LA POBLACIÓN EN CUARTILES

Con el objetivo de obtener una mayor cantidad de datos se estratificó a la población en base a cuartiles tomando como referencia el Ct., los datos se resumen en el Cuadro 4:

Cuadro 4. Cuartiles obtenidos en la estratificación de los datos según el valor de Ct.

Q Ct 1 23,975 (20,9-23,9) 2 27,15 (24,2-27) 3 28,3 (27,3-28) 4 (28,3-30,7) Total Casos

n 14 13 12 15 54

% 26 24 22 28 100

Cuartil 1 (Q1): Las lesiones observadas más comunes en músculo esquelético (n=13) fueron: degeneración en un 30.8% (4/13). Destaca miocarditis con un 35.7% (5/14) para las lesiones en corazón (n=14). Cabe mencionar que sólo en Q1 se encontraron lesiones de carácter severo. Un 23.1% (3/13) correspondió a infiltración macrofágica severa, 14.3% (2/14) para epicarditis y un 7.1% (1/14) para miocarditis. En Q1 se observó la mayor frecuencia de lesiones de carácter moderado 27.8% (15/54).

18

Cuartil2 (Q2): Tanto para degeneración en músculo esquelético y miocarditis en músculo cardiaco se observaron un 53.8% de lesiones de carácter leve (7/13). En este cuartil se observa la mayor frecuencia de lesiones de carácter leve 48.1% (25/52).

Cuartil 3 (Q3): Se observó degeneración leve en músculo esquelético y leve epicarditis en un 60% (9/12) y 33.3% (5/12) de las muestras respectivamente. Del total de las muestras para este cuartil (n=48), la lesiones de carácter leve fueron las más frecuentes, con un 47.9% (23/48) de las muestras.

Cuartil 4 (Q4): Infiltración macrofágica moderada en músculo esquelético es la lesión que destaca con un 33.3% (5/15), mientras que para músculo cardiaco fue epicarditis leve con un 73.3% (11/15). Para este cuartil no se observaron lesiones en un 50% (30/60) de las muestras.

Se realizó un análisis con uso de filtro de datos según el nivel de lesión en asociación a los distintos cuartiles, segregando por la mediana obtenida de cada cuartil. Las lesiones más severas estuvieron asociadas al Q1, mientras que la ausencia de lesiones se observó asociada al Q4. Para los cuartiles Q2 y Q3 se establece una relación inespecífica entre el grado de lesión y el Ct. Datos expresados en Cuadro 5. En el Anexo 8.3 se detalla la frecuencia y porcentajes para cada cuartil y lesión.

Cuadro 5. Lesiones por pez asociada a la mediana del Ct correspondiente a los distintos cuartiles.

Degeneración Inf Macrofágica Epicarditis 2 3 2 2 3 2 1 2 1 1 1 1 0 0 2 0 0 0 0 0 1 0 0 2 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 2 0 1 2 0 2 2 0 1 2 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Miocarditis 2 2 1 1 2 0 1 1 2 1 1 0 0 0 0 0 0 0

CT 23,5 23,5 23,5 26,1 26,1 26,1 26,1 26,1 26,1 27,4 27,4 27,4 27,6 27,6 27,6 29 29 29

Q 1

2

3

4

19

5.3.

CONCORDANCIAS MEDIANTE CHI CUADRADO

Para el análisis de los datos se estableció la mediana en base al Ct, de manera de poder establecer concordancias según distintos criterios:

1) Concordancia entre el nivel de Ct y presencia/ausencia de lesión: Se realizó el análisis para las cuatro lesiones y se detallan las frecuencias en Cuadro 6.

Sólo para miocarditis fue posible rechazar la hipótesis nula (H:0), mientras que para degeneración, infiltración macrofágica y epicarditis no fue posible establecer una asociación significativa (Cuadro 6).

2) Concordancia entre el nivel de Ct y grado de lesión: Para la realización de esta prueba fue necesario agrupar el grado de lesión en “Severa” más “Moderada” y “Leve” más “Sin lesión”. Los detalles se observan en Cuadro 7. Se realizó la prueba para las cuatro lesiones, pero no fue posible calcular el para el criterio de degeneración de músculo esquelético, mientras que para infiltración macrofágica no fue posible rechazar la hipótesis nula. Para los criterios de epicarditis y miocarditis fue posible rechazar la hipótesis nula,estableciendo una asociación entre el nivel del Ct y el grado de lesión (Cuadro 7).

5.4.

MEDIA, MEDIANA Y MODA

En base a estos resultados estadísticos, se seleccionaron los centros 23 y 26A debido a que tienden a ser simétricos (Cuadro 8).

Para el centro 23 es posible observar que el Ct promedio es de 24.8, lo que se relaciona con lesiones de grado severo a moderado, mientras que el centro 26A tiene un promedio de Ct de 28.3 lo que corresponde con lesiones de carácter leve y ausentes. En el Anexo 8.4 se detalla el total de los peces con su respectivo valor de Ct y grado de lesiones.

Cuadro 6. Frecuencias observadas según la asociación establecida entre la mediana del Ct de todas las muestras y la presencia/ausencia de lesiones para los distintos tejidos, sin diferenciar entre distintos grados de lesión.

Ct

Ct >27,15 <27,15 21 16 6 11 (p > 0.1429) Ct >27,15 Miocarditis <27,15 Con lesión 21 8 Sin lesión 6 19 (p < 0.0004)

>27,15 <27,15 15 17 11 10 (p > 0.6949) Ct >27,15 Inf Macrofagica <27,15 Con lesión 15 19 Sin lesión 11 8 (p > 0.3360)

Epicarditis Con lesión Sin lesión

Degeneración Con lesión Sin lesión

20

Cuadro 7. Frecuencias observadas según la asociación establecida entre la mediana del Ct de todos los peces y el grado de lesión para los distintos tejidos.

Ct

Ct >27,15 <27,15 12 0 9 27 (p < 0.0001) Ct >27,15 Miocarditis <27,15 Sev + Mod 11 1 Lev + Sin 16 26 (p < 0.0011)

>27,15 Degeneración <27,15 Sev + Mod 4 4 Lev + Sin 22 23 (p no se puede calcular) Ct >27,15 Inf Macrofagica <27,15 Sev + Mod 9 11 Lev + Sin 17 16 (p > 0.6456)

Epicarditis Sev + Mod Lev + Sin

Cuadro 8. Media, mediana y moda observada para los 2 centros seleccionados según su simetría.

Centro 26A Media Mediana Moda

Centro 23 28,3 Media 27,6 Mediana 27,3 Moda

24,8 23,9 23,5

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6. DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos en este estudio dan a conocer la naturaleza inespecífica de las lesiones observadas. Si bien es cierto que HSMI produce cuadros de epi-, mio- y endocarditis severas en los peces con signología (Kongtorp 2004B) y Ct bajos, no es una regla general ya que se ha determinado que cargas virales en disminución mantienen lesiones histológicas severas (Mikalsen y col 2012).

Según la dispersión existente en los tipos y grados de lesiones histopatológicas halladas en este estudio, es cuestionable que PRV sea el agente causal de lo observado ya que no se condice según lo expuesto por Kongtorp y cololaboradores (2006) en un estudio longitudinal de HSMI. Con respecto a los resultados descritos por Kongtorp y cololaboradores (2006), se observan lesiones de carácter severo en relación 1 a 1 entre epicarditis y los estratos compacto y esponjoso a nivel de corazón. Además, en ese estudio, aproximadamente un 50% de los peces muestreados presentaron lesiones de carácter severo a moderado. Esta situación no se presenta en este proyecto, ya que el 77.78% (42/54) presentó lesiones de carácter leve o sin lesión. Con relación a este punto, según lo expuesto por Kongtorp (2009) fue posible observar que las lesiones documentadas a nivel de epicardio, miocardio y endocardio se relacionan en 99%, 97% y 95% respectivamente, a su vez la presencia de lesiones degenerativas y de miositis en músculo rojo y blanco se prestan de esta manera: 91%, 85%, 36% y 2% respectivamente, datos para peces saludables con un n=404. Adicionalmente, según Kongtorp y colaboradores (2006) y Kongtorp (2009), el músculo esquelético rojo debería verse afectado en forma severa en peces con lesiones cardiacas, lo cual no se observó en el presente estudio.

A través de los análisis estadísticos, en la presente investigación se trató de establecer una relación entre la presencia y ausencia de lesiones de carácter severo y moderado en corazón y las lesiones a nivel de músculo esquelético. No fue posible realizar la prueba de Chi cuadrado (Χ2) para este criterio, ya que el 50% de los resultados esperados fueron menores de 5. Al establecer concordancias mediante Χ2 para el criterio “entre el nivel de Ct y presencia/ausencia de lesión” fue posible asociar las lesiones al grado de Ct pero solo para miocarditis. Al utilizar el criterio “entre el nivel de Ct y grado de lesión” se pudo establecer una relación sólo para epicarditis y miocarditis con respecto al Ct y severidad de lesión.

Conociendo el comportamiento de las lesiones características para HSMI, los hallazgos observados no son característicos y por ende los resultados no pueden ser asociados directamente con la enfermedad. Posiblemente ésto se debe a que el valor muestral de 54 no es suficiente para pesquisar las lesiones previamente descritas en la literatura. Otro escenario para este caso podría ser que la acción patógena no sea lo suficientemente severa como para producir las lesiones características de la enfermedad. Løvoll y colaboradores (2012) mencionan el efecto sinérgico, mientras que Mikalsen y colaboradores (2012) plantean un rol oportunista de PRV frente a casos de coinfección con la enfermedad del síndrome cardiomiopático (CMS), otra enfermedad cardiaca de los salmónidos la cual no se encuentra en Chile. Por otra parte, cabe la posibilidad que el estado inmune de los peces en la industria nacional impida la expresión completa de la enfermedad, haciéndola pasar sólo por un cuadro subclínico o como un agente secundario. Se describe que los tejidos afectados por este agente

22

tienen la capacidad de regeneración completa a parcial (Ferguson 2005, Kongtorp y col 2006, Yousaf y col 2012), pudiendo ser éste otro motivo por el cual no se observan lesiones mayores.

No es discutible la presencia del PRV en base a la positividad a la prueba de RT-PCR, pero sí su acción patógena. No fue posible encontrar lo esperado según lo descrito por Palacios y colaboradores (2010), quienes señalan que la carga del virus se relaciona con la enfermedad, y por ende con lesiones histológicas características para HSMI, pero sí queda espacio para conjeturas, ya que sería posible obtener lesiones severas con baja carga viral (Mikalsen y col 2012). Considerando que peces muestreados con y sin signología en brotes normales presentan el mismo grado de lesiones histopatológicas, tanto en corazón como en músculo esquelético (Kongtorp y col 2004B, 2006), sería esperable encontrar una mayor cantidad de lesiones atribuibles a HSMI que las pesquisadas en el presente estudio. Según el estudio base (SERNAPESCA-UACh) y el método de muestreo aleatorio es esperable obtener resultados que den cuenta de esta enfermedad, si es que existiera una acción directa de PRV sobre la población. Según esta prueba diagnóstica (RT-PCR), se puede decir que PRV está presente en las aguas de nuestro país, pero hasta la fecha no hay reportes de brotes clínicos como los documentados en Noruega, por lo cual es aventurado asignar a PRV como causante de mortalidades notorias en la industria o si es que está causando algún impacto real. Para confirmar si PRV es el causante de las lesiones es imperativo complementar con diagnósticos como inmunohistoquímica y/o hibridación in situ, como lo realizado por Palacios y colaboradores (2010), Finstad y colaboradores (2012), Yousaf y colaboradores (2012), ya que estas técnicas permiten relacionar las lesiones directamente con la presencia del agente.

Adicionalmente a ésto, se debe considerar la técnica del cultivo celular porque en estudios recientes se pudo demostrar su efectividad (Mikalsen y col 2012).

Dentro de las observaciones realizadas en músculo cardiaco no fue posible identificar lesiones concordantes con endocarditis, y con respecto a músculo esquelético, se observaron lesiones a nivel del músculo blanco, donde se presentaron lesiones degenerativas y con infiltrado inflamatorio, situación contraria con lo descrito por Kongtorp y colaboradores (2004A), donde sólo fue posible observar degeneración sin infiltrado. Para definir las lesiones clásicas es necesario que éstas sean lesiones de carácter severo y en estados crónicos (Kongtorp y col 2006), situación que no se observó en el actual trabajo, debido a que sólo un 5.66% (3/53) de las lesiones se presentaron con severa infiltración macrofágica, sin observarse degeneración. Se debe considerar que el muestreo realizado fue dirigido a los pesos donde ocurren los brotes clínicos de la enfermedad según el estudio de Bustos y colaboradores (2011) y no a estadíos posteriores.

Según la estratificación por cuartiles se puede observar que los cuartiles 1 y 4 corresponden a lo esperado biológicamente. Siendo Q1 el 25% superior de los Ct positivos (ordenados de menor a mayor) donde se observó que existen las lesiones más severas en 3 peces. Consecuentemente, Q4 no presenta ningún tipo de lesión en 3 peces. Sería esperable no encontrar lesiones aún en peces positivos a RT-PCR según lo descrito por Mikalsen y colaboradores (2012). Considerando estos datos, los Ct contenidos en Q4 resultarán negativos a histología mientras que Q1 son positivos. En los peces pertenecientes a Q2 y Q3 se devela la ambivalencia de los hallazgos histopatológicos.

23

Al analizar los centros en forma individual, se utilizó media, mediana y moda para caracterizar según el Ct. Al respecto, los centros que presentaron una simetría mayor fueron considerados. Para el centro 23, el Ct promedio fue de 24.7; este centro posee la mayoría de las lesiones más severas. A su vez, el centro 26A presentó un promedio de 28.2, el cual posee las lesiones más leves y ausentes. Estos resultados se condicen con lo observado al estratificar la población en cuartiles.

Considerando los actuales problemas de la industria como por ejemplo el copépodo Caligus rogercresseyi y la rickettsia Piscirickettsia salmonis, además del último evento producido por ISAv es de carácter imprescindible continuar la investigación para poder desarrollar planes de contingencia para enfermedades emergentes como es HSMI. PRV se encontraría en la sangre por lo cual C. rogercresseyi podría ser un vector a considerar. Afortunadamente para nuestra realidad se sospecha que PRV por si solo no es capaz de producir enfermedad y que el agente causal de CMS no se encuentra en nuestras zonas de cultivo, lo que resulta como la razón más probable por la cual no se han registrado brotes de HSMI. El salmón del Atlántico es la única especie en producción afectada por PRV, adicionalmente P. salmonis es el patógeno principal en el cultivo de S. salar por su gran impacto, su carácter inmunosupresor y porque se han detectado nuevas variantes, situación que debería considerarse por las características de HSMI. Siendo esta la primera investigación oficial y de carácter preliminar en cuanto a la caracterización de las lesiones producidas por HSMI y el comportamiento de estás en el salmón del Atlántico nacional es necesario para la industria promover el conocimiento de este agente, patogenia y como podría relacionarse con las enfermedades de importancia. Como ya se ha mencionado PRV estaría actuando en forma secundaría, por esta razón pensar en un posible impacto económico/productivo resultaría impreciso con los datos existentes en nuestro país, aun así las pérdidas se producen por mortalidad y baja del rendimiento productivo.

Para futuros estudios se recomienda estandarizar la metodología y procedimientos para una correcta ejecución y manejo de las muestras, además es de vital importancia capacitar en forma adecuada al personal encargado de la recolección de muestras debido a que ese factor favorece la realización de la técnica histológica y la observación microscópica para un diagnóstico más certero. La implementación de técnicas diagnósticas adicionales, tales como hibridación in situ, inmunohistoquímica y/o cultivo celular son fundamentales para poder recabar información y determinar si las lesiones pesquisadas a nivel histopatológico son producto de PRV y si se corresponde la presencia del virus con la lesión observada por histopatología, como lo han realizado los autores aquí citados. Además, sería importante evaluar hay un impacto real de esta enfermedad en la salmonicultura nacional o si podría un escenario desfavorable para la industria.

6.1.

CONCLUSIONES

Las muestras observadas y analizadas de corazón y músculo esquelético mediante histológica no presentaron las lesiones características de HSMI.

En este estudio no existe asociación directa con PRV y las lesiones encontradas, según el nivel del Ct.

24

7. REFERENCIAS

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26

8. ANEXOS

Anexo 8.1

Total de muestras analizadas y hallazgos histopatológicos en tejidos de músculo esquelético y cardiaco de los distintos centros, según procedencia. Se indica la frecuencia de las lesiones observadas con su respectivo porcentaje.

Lugar de Procedencia Tejidos

: Punta Arenas : Músculo esquelético Infiltración Centro 29A Degeneración Macrofágica nº % nº % Ausencia 8 57,14 8 57,14 Leve 6 42,87 5 35,71 Moderado 0 0 1 7,14 Severo 0 0 0 0 Total 14 100 14 100 Lugar de Procedencia : Puerto Montt Tejidos : Músculo esquelético Infiltración Centro 26A Degeneración Macrofágica nº % nº % Ausencia 2 13,33 1 6,66 Leve 11 73,33 6 40 Moderado 2 13,33 8 53,33 Severo 0 0 0 0 Total 15 100 15 100 Lugar de Procedencia : Aysen Tejidos : Músculo esquelético Infiltración Centro 6B Degeneración Macrofágica nº % nº % Ausencia 11 73,33 10 66,66 Leve 2 13,33 2 13,33 Moderado 2 13,33 3 20 Severo 0 0 0 0 Total 15 100 15 100 Lugar de Procedencia : Castro Tejidos : Músculo esquelético Infiltración Centro 23 Degeneración Macrofágica nº % nº % Ausencia 0 0 0 0 Leve 5 55,55 1 11,11 Moderado 4 44,44 5 55,55 Severo 0 0 3 33,33 Total 9 100 9 100

Corazón Epicarditis nº 3 4 6 2 15

Miocarditis % 20 26,66 40 13,33 100

nº 3 5 6 1 15

% 20 33,33 40 6,66 100

Corazón Epicarditis nº 4 11 0 0 15

Miocarditis % 26,66 73,33 0 0 100

nº 8 6 1 0 15

% 53,33 40 6,66 0 100

Corazón Epicarditis nº 10 5 0 0 15

Miocarditis % 66,66 33,33 0 0 100

nº 14 1 0 0 15

% 93,33 6,66 0 0 100

Corazón Epicarditis nº 0 5 4 0 9

Miocarditis % 0 55,55 44,44 0 100

nº 0 5 4 0 9

% 0 55,55 44,44 0 100

27

Anexo 8.2

Total de muestras analizadas para los tejidos de músculo esquelético y cardiaco como control negativo. Se indica la frecuencia de las lesiones observadas con su respectivo porcentaje y lugar de procedencia.

Lugar de Procedencia : Puerto Montt Tejidos : Músculo esquelético Infiltración Centro 21B Degeneración Macrofágica nº % nº Ausencia 6 100 6 Leve 0 0 0 Moderado 0 0 0 Severo 0 0 0 Total 6 100 6

Corazón Epicarditis % 100 0 0 0 100

nº 6 0 0 0 6

Miocarditis % 100 0 0 0 100

nº 6 0 0 0 6

% 100 0 0 0 100

28

Anexo 8.3

Total de muestras analizadas para los tejidos de músculo esquelético y cardiaco correspondiente a los distintos cuartiles. Se indica la frecuencia y grado de severidad de las lesiones observadas con su respectivo porcentaje Q1 Tejidos

Músculo esquelético Infiltración Ct 20,9-23,9 Degeneración Macrofágica nº % nº Ausencia 6 46,15 6 Leve 4 30,76 1 Moderado 3 23,07 3 Severo 0 0 3 Total 13 100 13 Tejidos Ct 24,2-27 Ausencia Leve Moderado Severo Total

Músculo esquelético Infiltración Degeneración Macrofágica nº % nº 5 38,46 5 7 53,84 5 1 7,69 3 0 0 0 13 100 13

Corazón Epicarditis % 46,15 7,69 23,07 23,07 100 Q2

nº 5 3 4 2 14

Miocarditis % 35,2 21,4 28,6 14,3 100

nº 5 3 5 1 14

Total % 35,74 21,42 35,71 7,14 100

nº 22 11 15 6 54

% 40,74 20,37 27,77 11,11 100

Corazón Epicarditis % 38,46 38,46 23,07 0 100 Q3

nº 1 6 6 0 13

Miocarditis % 7,69 46,2 46,2 0 100

nº 1 7 5 0 13

Total % 7,69 5384 38,46 0 100

nº 12 25 15 0 52

% 23,07 48,07 28,84 0 100

Tejidos

Músculo esquelético Corazón Infiltración Ct 27,3-28 Degeneración Epicarditis Miocarditis Total Macrofágica nº % nº % nº % nº % nº % Ausencia 2 13,33 1 6,66 7 46,7 8 53,33 18 37,5 Leve 9 60 5 33,33 5 33,3 4 26,66 23 47,91 Moderado 1 6,66 6 40 0 0 0 0 7 14,58 Severo 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Total 12 100 12 100 12 100 12 100 48 100 Q4 Tejidos Músculo esquelético Corazón Infiltración Ct 28,3-30,7 Degeneración Epicarditis Miocarditis Total Macrofágica nº % nº % nº % nº % nº % Ausencia 8 53,33 7 46,66 4 26,7 11 73,33 30 50 Leve 4 26,66 3 20 11 73,3 3 20 21 35 Moderado 3 20 5 33,33 0 0 1 6,66 9 15 Severo 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Total 15 100 15 100 15 100 15 100 60 100

29

Anexo 8.4

Centros 23 y 26A seleccionados según la simetría del valor del Ct.

Nº Pez 1268-12-E 1269-12-E 1270-12-E 1271-12-E 1272-12-E 1273-12-E 1274-12-E 1275-12-E 1276-12-E 1311-12-E 1312-12-E 1313-12-E 1314-12-E 1315-12-E 1316-12-E 1317-12-E 1318-12-E 1319-12-E 1320-12-E 1321-12-E 1322-12-E 1323-12-E 1324-12-E 1325-12-E

Degeneración 2 2 1 1 1 2 1 1 2 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 2 1 2 1 1

Inf Macrofagica Epicarditis 3 2 3 2 2 1 2 1 1 1 2 1 2 1 2 2 3 2 2 0 1 1 1 1 1 1 2 1 0 1 1 1 1 1 2 0 2 0 2 0 2 1 2 1 1 1 2 1

Miocarditis 2 2 1 1 1 1 1 2 2 0 1 1 1 2 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0

CT 23,5 23,5 23,5 26,9 26,9 26,9 23,9 23,9 23,9 27,3 27,3 27,3 28,3 28,3 28,3 27,4 27,4 27,4 27,6 27,6 27,6 30,7 30,7 30,7

30

Anexo 8.5

Información proveniente del proyecto SERNAPESCA-UACh concerniente al diseño del muestreo y elección de centros de cultivo y cantidad de peces recolectados.

8.5.1

DISEÑO DEL MUESTREO

El muestreo fue diseñado de manera aleatoria, de tipo transversal y posteriormente estratificado por regiones.

8.5.2

POBLACIÓN

La población del estudio fueron peces de la especie Salmo salar con pesos desde 800g hasta 2100g. De un universo de 155 centros acuícolas en la etapa productiva de engorda y de reproductores y con información de sus pesos, se seleccionaron aquellos centros de peces que presentan pesos entre 800 y 2100g. Los centros que presentaron este rango de pesos fueron 28, distribuidos entre las regiones de Los Lagos, Aysén y Magallanes (Cuadro 1), de los cuales se obtuvieron las muestras.

Cuadro 1. Cantidad de centros con pesos diferentes para Salmo salar con su respectiva proporción.

Regiones Los Lagos Aysén Magallanes Total

Pesos 50-6000g nº % 48 31 97 63 10 6 155 100

8.5.3

>800-2100g nº % 7 25 19 68 2 7 28 100

DISTRIBUCIÓN DEL TAMAÑO DE LA MUESTRA

De un estudio anterior se determinaron altos porcentajes del virus HSMI en los centros acuícolas del sur de Chile (Bustos y col 2011). Gracias a estos antecedentes, y para la determinación del tamaño de la muestra del proyecto SERNAPESCA-UACh, se utilizó una prevalencia esperada de un 50% y un error de 5% considerando una población infinita y un 95% de confianza. Bajo estos supuestos se determinó un tamaño de la muestra (n) de 385 peces, y adicionalmente se consideró incorporar 10 peces por supuestas pérdidas, resultando en un total de 395 peces.

31

8.5.4

MÉTODO DE OBTENCIÓN DE LA MUESTRA

Considerando que existen regiones con una carga productiva mayor que otras, se estratificó por región y se determinó proporcionalmente el número de muestras, acorde a lo presentado en el Cuadro 2.

Cuadro 2. Número de Centros y peces muestreados según la proporción de producción para las distintas regiones.

Nº Nº muestras peces Centros por regiones Regiones nº nº % Los Lagos 7 96 25 Aysén 19 262 68 Magallanes 2 27 7 Total 28 385 100

Nº muestras por centro + pérdidas nº 14 14 15

Como se observa en el Cuadro 3, de cada uno de los 28 centros se obtuvieron entre 14 y 15 peces para la toma de muestras, de existir riesgo de pérdida de muestras por condiciones adversas se solicitó aumentar el número de peces obtenidos en caso de remplazo. Los peces fueron obtenidos de forma aleatoria y el muestreo no fue dirigido a peces muertos o moribundos.

32

9. AGRADECIMIENTOS

Deseo dedicar esta investigación a mi Dios y familia: Gracias Señor Jesús porque “Así que no depende del que quiere, ni del que corre, sino de Dios que tiene misericordia”.

Romanos 9:16 Gracias Loreto, esposa mía y mi pequeña hija Sofía por estar siempre a mi lado y ser mi gran aliciente en este último paso, las amo mucho.

También quisiera agradecer a todas las personas e instituciones que hicieron posible el término de mi carrera y la culminación de mi Memoria de Título: Dr. Paredes y Dra. Navarrete del Instituto de Patología Animal por acogerme y guiarme en el transcurso de esta Memoria. También agradezco el fuerzo del personal técnico que hizo posible el procesamiento de las muestras histológicas Dr. Ricardo Enríquez y Dr. Alex Romero del Laboratorio de Biotecnología y Patología Acuática, por formar mis conocimientos, por su disposición y ayuda. Mis agradecimientos a todo el personal del laboratorio que aportó su disposición y trabajo para el desarrollo de esta memoria.

Servicio Nacional de Pesca, por facilitar los datos recabados en el proyecto que es marco de esta investigación.

Dra. Torunn Taksdal, por las muestras donadas mediante el Instituto Veterinario de Noruega, Oslo.

Fundación Dael, por premiar mi esfuerzo y sustentar mis estudios.

A mis padres y amigos, por su amor, incondicionalidad, compañerismo, apoyo y cariño.