кейс финала технической секции Трансдермальность на службе фармакологии
Оглавление
Введение
Использование свойств кожи в медицине
Кожа и её функции
Кожная абсорбция
Энхансеры и их влияние на сорбционные свойства кожи
Методы тестирования проницаемости кожи и обработка данных
Команда Changellenge» подготовила данный кейс исключительно для использования в образовательных целях. Авторы не намереваются иллюстрировать как эффективное, так и неэффективное решение управленческой проблемы. Некоторые имена в данном кейсе, а также другая информация могли быть изменены с целью соблюдения конфиденциальности. Данные, представленные в кейсе, не обязательно являются верными или актуальными и также могли быть изменены с целью соблюдения коммерческой тайны. «Changellenge» ограничивает любую неправомерную форму воспроизведения, хранения или передачи кейса без письменного разрешения. Для того чтобы заказать копию или получить разрешение на распространение, пожалуйста, свяжитесь с нами по адресу: info@changellenge.com
Введение
Введение/ 4
Введение
Два сорок пять по полудню. Самолёт, вылетевший из Цюриха 3 часа 15 минут назад, благополучно приземлился в Северной столице. Кира, технический директор российского стартапа, возвращалась с переговоров с иностранными инвесторами, уставшая, но почти уверенная в том, что вот-вот её команда сможет получить тот долгожданный раунд инвестиций, необходимый для вывода исследований на качественно новый уровень. В текущей экономической ситуации возможность получить финансирование для небольшой компании вообще можно было бы считать чудом. Однако если бы последние несколько месяцев Кира и её коллеги не проводили бы в лаборатории многие и многие часы, то этой поездки и этой встречи с потенциальными инвесторами не случилось бы вовсе. Сочетание оригинальной идеи и огромное количество усилий, вложенных в проект, в конце концов приносили свои плоды. Кроме того, это означало, что совсем скоро (несмотря на то, что переговоры
длились уже почти полгода) она и её команда даже смогут начать тестовое производство готового продукта! Кира спешила в лабораторию, желая поделиться последними новостями и воодушевить команду на последний рывок (который означал еще неделю-другую в режиме 16-часового рабочего дня без выходных и почти без перерывов на ланч). Кроме того, ей самой не терпелось продолжить свою часть исследования. Всё время, проведенное в Цюрихе, она мечтала вернуться обратно в лабораторию, так как была убеждена, что именно там, в окружении оборудования и образцов материалов, её место. Она и её команда разрабатывали более эффективный способ доставки лекарственных средств — через кожу — и сейчас пытались выяснить, какие химические вещества (молекулы-проводники или энхансеры) способны ускорить время проникновения активных компонентов через кожу и доставить их в кровь. Технология обещала
быть перспективной и заманчивой с коммерческой точки зрения. Однако, как технический директор проекта с опытом привлечения финансирования, она лучше других в команде могла преподнести их идею и промежуточные результаты целой коллегии инвесторов. В конце концов, кто-то же должен был найти финансирование на их общую мечту, не так ли? А пока, главным результатом последних переговоров стало решение о том, что Кире и её команде необходимо в кратчайшие сроки провести тестирование материалов. Очевидно, что намного проще получить деньги, имея козырь в рукаве. Исследования, а не написанные на бумаге перспективы и возможности проекта, и были тем самым козырем. Задача команды Киры — проведение серии экспериментов с использованием молекул-проводников (энхансеров), анализ протекающих процессов, в том числе скорости проникновения препарата через кожу, для того чтобы заложить базу для разработки
Введение/ 5
конечного продукта, а также наглядно продемонстрировать инвестиционному фонду собственные возможности.
лежать в основе дальнейшей разработки готового продукта. Работу по подготовке к презентации Кира разделила на три части.
Итак, Кире необходимо подготовить убедительную презентацию для потенциального инвестора. На планирование процесса как с технической, так и с финансовой стороны, выбор и подготовку необходимых для тестирования образцов у Киры и её команды около недели, после чего им необходимо будет провести собственно эксперимент и заняться обработкой данных, которые в итоге и будут
Во-первых, Кире и её команде требуется определить оборудование и спланировать процедуру и весь процесс проведения опытов, необходимых для исследования скорости проникновения препарата с энхансером через кожу. Во-вторых, им необходимо выявить, какие людские и финансовые ресурсы им понадобятся для проведения исследований: воз-
можно ли осуществление всех исследований внутри компании без использования сторонних людских ресурсов, или необходимы специалисты в своей области и дополнительное дорогостоящее оборудования. В-третьих, им нужно подготовиться к проведению эксперимента в кратчайшие сроки, обработке данных, которые они смогут получить в ходе исследований, и описанию процессов, происходящих при взаимодействии препарата и кожи.
Использование свойств кожи в медицине
Использование свойств кожи в медицине/ 7
Использование свойств кожи в медицине
Среди различных систем доставки лекарственных веществ (ЛВ) — пероральных, парентеральных (наночастицы и нанокапсулы), субкутальных (имплантанты), внутриполостных, буккальных и т.д. — наибольшее распространение и коммерческий успех получили трансдермальные терапевтические системы (ТТС). Они предназначены для непрерывной подачи содержащихся в них вещества через неповрежденную кожу в системное кровообращение в течение длительного (ограниченного только медицинскими показаниями) времени с заранее заданной скоростью. ТТС принадлежит к новому поколению лекарственных форм, в которых используется технология контролируемого высвобождения лекарственного вещества. Она основана на том, что вещество непрерывно подается в организм со скоростью, создающей в кровотоке постоянный уровень концентрации вещества, близкий к минимальному терапевтическому уровню. В отличие от этого уровень концентрации ЛВ при использовании традиционных лекарственных форм имеет
пики, которые могут достигать токсического уровня, когда проявляются побочные эффекты. Каким образом можно доставить активные компоненты в дерму? Основных способа три: 1. Можно разрушить барьер, то есть нарушить целостность липидных слоев. Разрушителями разной степени агрессивности являются ПАВ, растворители (спирты) и оксикислоты (фруктовые кислоты). Следует отметить, что и ПАВ и спирты - разрешенные ингредиенты в косметике. Они прекрасно себя зарекомендовали, но в косметических составах короткого времени действия: шампунях, пенках, лосьонах, то есть очищающих продуктах. В то же время присутствие этих ингредиентов в кремах, гелях, сыворотках, иными словами - в косметике длительного времени действия, неуместно, поскольку они способны либо образовывать бреши в липидных пластах, либо встраиваться в оболочки живых клеток и частично или полностью разрушать эпидермальный барьер. На восстановле-
ние нормально функционирующего слоя кожи потребуются силы и время. Чем взрослее кожа, тем труднее она восстанавливается. 2. Можно размягчить липидный слой, то есть сделать пласты более жидкими и текучими. Текучесть увеличивается при введении в косметический состав натуральных масел, содержащих мононенасыщенную олеиновую кислоту. Тогда в некоторых местах образуются зазоры и возможна ограниченная миграция водорастворимых веществ во внутренние слои кожи. Эффективность данного способа доставки активных ингредиентов очень мала, зато восстановление липидного слоя протекает быстро и без нарушений. Этот принцип лежит в основе применения питательных масок. 3. Можно использовать специальные транспортирующие вещества, так называемые трансдермальные переносчики, которые легко прокладывают себе дорогу через эпидермальный барьер, не разрушая последний. Чаще всего роль энхансеров (трансдермальных пере-
Использование свойств кожи в медицине/ 8
носчиков) играют различные липосомы. Сегодня липосомальный транспорт - самый популярный в косметологии. Однако проблема эффективности косметики продолжает волновать умы ученых. Постоянно растет количество активных ингредиентов, способствующих обновлению кожного покрова, и вопрос транспорта становится все более актуальным. Молекулы многих лекарственных веществ, обладающие соответствующими физико-химическими свойствами, могут диффундировать из лекарственного средства в поверхность кожи, проникать сквозь роговой слой и достигать эпидермиса и дермы, а затем васкулярная сеть переносит их в органы и ткани. Трансдермальная (ТД) доставка препарата в кровоток с последующим получением системного эффекта получила на-
звание «трансдермальная терапевтическая система» (ТТС). ТТС в форме пластырей или плёнок замедленно высвобождает используемое лекарственное средство. Трансдермальная форма удобна тем, что пластырь (или плёнка) наклеивается на кожу, и лекарство через верхние слои кожи быстро проникает в кровь (кровеносные сосуды). Самая простая ТТС состоит из следующих компонентов: • основная мембрана, предотвращающая высвобождение препарата в окружающую среду и попадание влаги извне; • лекарственный резервуар для растворения, хранения и высвобождения препарата; • мембрана, обеспечивающая скорость высвобождения действующего вещества; • клей, предназначенный для
обеспечения плотного контакта системы с кожей; • защитная пленка для хранения системы. В современных ТТС, так называемых матриксных системах (matrix systems), клейкий слой одновременно выполняет все функции — прилипание, хранение, высвобождение и контроль за высвобождением препарата. Преимущества ТТС: удобство применения, лекарство быстро попадает в кровь, возможность регулировать скорость высвобождения лекарства, возможность использовать гидрофильные и липофильные вещества. Это сравнительно новая лекарственная форма, из самых известных примеров — ТТС с нитроглицерином (Тринитролонг) и ТТС с женскими гормонами (Евра).
Использование свойств кожи в медицине/ 9
Трансдермальные терапевтические системы
Кожа и её функции
Кожа и её функции/ 11
Кожа и её функции
1
http://www.golkom.ru/book/48_4.html
Кожа — сложный орган человеческого организма. Кожа защищает тело от широкого спектра внешних воздействий, участвует в дыхании, терморегуляции, обменных и многих других процессах. Кроме того, кожа представляет массивное рецептивное поле различных видов поверхностной чувствительности (боли, давления, температуры и т. д.). Кожа является самым большим по площади органом. Площадь кожи у взрослого человека достигает 1,5—2,3 м², масса 4-6 %, а вместе с гиподермой 16-17 % от общей массы тела. Кожа состоит из эпидермиса, дермы и подкожно-жировой клетчатки (гиподермы). Эпидермис включает в себя пять слоев эпидермальных клеток и определяет примерно 5% общей толщины кожного покрова. Общая площадь эпидермиса у взрослого человека тождественна площади поверхности тела и составляет обычно 1,5-2 м2. Масса соответствует 0,5 кг при толщине на большей поверхности тела около 130-150 мкм. В свою очередь эпидермис состоит из пяти слоев,
плавно переходящих друг в друга. Самый нижний слой — базальный — располагается на базальной мембране и представляет собой 1 ряд призматического эпителия. Сразу над ним лежит шиповатый слой (3-8 рядов клеток с цитоплазматическими выростами), затем следует зернистый слой (1-5 рядов уплощенных клеток), блестящий (2-4 ряда безъядерных клеток, различим на ладонях и стопах) и роговой слой, состоящий из многослойного ороговевающего эпителия. Эпидермис также содержит меланин, который окрашивает кожу и вызывает эффект загара. Структурной единицей верхнего кератинового слоя является чешуйка, имеющая длину до 10 мкм и толщину от 0,07 до 1 мкм. Каждая чешуйка окружена однослойной липидной оболочкой (12-15 нм), заполнена кератиновыми фибриллами диаметром 7-8 нм и аморфным материалом. Фибриллы в основном ориентированы по длине чешуйки. Чем ниже в роговом слое расположена чешуйка, тем более аморфным (менее упорядоченным) является ее содержимое.1
Чешуйки блестящего слоя между пучками нерегулярно расположенных фибрилл содержат фрагменты митохондрий. Это позволяет предположить, что фрагменты блестящего слоя по своей структуре являются промежуточными между чешуйками рогового слоя и клетками зернистого слоя. Чешуйки рогового и блестящего слоев организованы в достаточно компактное образование за счет слипания наружных липидных мембран и взаимопроникновения ороговевших десмосом (фрагментов). На рисунке представлена схематическая организация рогового слоя эпидермиса. Особый интерес представляют микроканалы (микроотверстия), образованные за счет неплотного и нерегулярного слипания чешуек. Они могут быть как сквозными, обеспечивая реализацию одного из механизмов проницаемости кожи, так и тупикового характера, теряющиеся в толще чешуек рогового и блестящего слоев. Именно сквозные микроканалы в основном определяют защитные функ-
Кожа и её функции/ 12
ции и проницаемость кожи. Пограничная зона между эпидермисом и дермой. Через эту зону осуществляются обменные процессы между эпидермисом, не имеющим кровоснабжения, и ниже лежащей дермой. На участках тела с тонким слоем эпидермиса (кожа груди, спины и т.д.) граница между эпидермисом и дермой почти ровная. С увеличением толщины эпидермиса возрастает неровность пограничной зоны. В пограничной зоне располагается свет-
лый бесструктурный промежуток и базальная мембрана, сплетенная из пучков коллагеновых волокон, предшественники которых синтезированы фибробластами дермы, а также сплетение ретикулярных волокон, являющихся частью дермы. Размеры базальной мембраны и светлого промежутка сопоставимы по толщине 40-50 и 30-40 нм, соответственно.
— сосочкового слоя, на котором располагаются многочисленные выросты, содержащие в себе петли капилляров и нервные окончания, и сетчатого слоя, содержащего кровеносные и лимфатические сосуды, нервные окончания, фолликулы волос, железы, а также эластические, коллагеновые и гладкомышечные волокна, придающие коже прочность и эластичность.
Дерма, или собственно кожа, представляет собой соединительную ткань и состоит из 2-х слоев
Подкожно-жировая клетчатка состоит из пучков соединительной ткани и жировых скоплений,
Структура кожи
Кожа и её функции/ 13
Схема организации рогового слоя эпидермиса
пронизанных кровеносными сосудами и нервными волокнами. Физиологическая функция жировой ткани заключается в накоплении и хранении питательных веществ. Кроме того, она служит для терморегуляции и дополнительной защиты внутренних органов. Помимо самой кожи в организме имеются её анатомические производные — образования, которые получают развитие из кожи и её зачатков. Различные выделения желёз, расположенных в коже, также являются частью наружного покрова организма. Основные функции кожи: • Защитная. Защищает организм от действия механических и химических факторов, ультрафиолетового излучения, проникновения микробов, потери и попадания извне воды. Кожа также реагирует на воздействие механических сил (проявляя при этом свойства эластичности и амортизации). • Терморегуляторная функция выполняется за счет излучения
тепла и испарения пота. • Участие в водно-солевом обмене (связано с потоотделением). • Экскреторная (выведение с потом продуктов обмена, солей, лекарств). • Депонирование крови (в сосудах кожи может находиться до 1 л крови). • Эндокринная и метаболическая (синтез и накопление витамина D и некоторых гормонов) • Рецепторная (благодаря наличию многочисленных нервных окончаний). • Иммунная (захват, процессинг и транспорт антигенов с последующим развитием иммунной реакции). Различают: • толстую кожу (на ладонях и подошвах) — образована толстым (400—600 мкм) эпидермисом, нет волос и сальных желёз; • тонкую кожу (на остальных частях тела) — состоит из тонкого (70-140 мкм) эпидермиса; есть волосы и кожные железы.
Кожная абсорбция
Кожная абсорбция/ 15
Виды кожной абсорбции
Кожная (трансдермальная, чрескожная) абсорбция представляет собой процесс переноса химических веществ с внешней поверхности кожи в системный кровоток. Ее можно разделить на следующие стадии: • попадание вещества, соединения на верхний слой эпителия; • проникновение вещества во второй слой кожи, который функционально и конструктивно отличается от первого слоя;
2
http://www.medline.ru/public/monografy/ toxicology/p4-toxicokinetics/p2.phtml
•
резорбция — проникновения и поглощение вещества через лимфо- и кровоток. Проникновение веществ через кожу осуществляется тремя путями: через эпидермис (A, B), через волосяные фолликулы (C), через сальные и потовые железы (D). Для хорошо проникающих через кожу низкомолекулярных и липофильных соединений основным является трансэпидермальный путь, поскольку относительная суммарная площадь поверхности
двух других путей мала и составляет менее 1% от общей площади поверхности кожи. Для веществ, медленно всасывающихся через кожные покровы, трансфолликулярный (C) и трансгландулярный (D) пути могут иметь существенное значение.2 При трансэпидермальном проникновении веществ возможно как прохождение их непосредственно через клетки, так и через межклеточные пространства.
Кожная абсорбция/ 16
Факторы, влияющие на показатель кожной абсорбции
Объект исследования Сорбционные свойства кожи человека и кожи животных, чаще всего используемых в лабораториях, значительно различаются. По отношению к большинству химических веществ, кожа животных более проницаема по отношению к человеческой. Это связано с различиями в содержании липидов в коже, её структурой и толщиной рогового слоя. Кроме того, кожа лабораторных животных часто имеет большее количество потовых желез и фолликул на единицу площади, что может определять большую важность транградулярного и трансфолликулярного способов доставки веществ. Наиболее схожими с человеческой кожей характеристиками обладают кожа свиней и человекоподобных обезьян.
желез, что приводит к уменьшению количества липидного слоя на поверхности кожи, 3) уплощение поверхностно-сосудистого сплетения и 4) атрофия кожной каппилярной сети, в результате которой ослабляется кровоснабжение жизнеспособных клеток эпидермиса. В целом, независимо от условий окружающей среды, пола и этнической принадлежности, барьерные свойства кожи остаются достаточно схожими. Так, при тестировании всасываемости бензойной кислоты, кофеина и ацетилсалициловой кислоты не было найдено существенных различий во всасываемости для разных этнических групп. Тем не менее следует отметить, что все исследованные соединения были гидрофильными.
Возраст, пол и раса Изменения, которые происходят в процессе старения кожи включают в себя: 1) увеличение сухости рогового слоя, 2) снижение активности сальных
Место расположения кожи на теле Как показано на рисунке, существуют значительные различия в толщине кожи на разных участках тела, что не может не влиять на сорбционные свойства того или
иного участка. Например, толщина кожи век составляет примерно 0,05 см, а толщина кожи ладоней и подошв ног — около 0,4 см. Состояние кожи может иметь существенное влияние на показатели проницаемости химических веществ, в частности тогда, когда барьерная функция кожи нарушается. Проницаемость кожи может быть увеличена путем влияния физических (например, погода, воздействие солнечного света, окклюзии), химических (например, растворители, моющие средства, кислоты, щелочи), и патологических факторов (например, механическое повреждение, болезненное состояние). При некоторых наиболее распространенных заболеваний кожи, таких как псориаз и атопическая экзема, кожный покров характеризуются практически полным отсутствием зернистого слоя в жизнеспособной части эпидермиса. При поражениях кожи степень эффективности барьерной функции кож может изменяться
Кожная абсорбция/ 17
в широких пределах и зависит от конкретного патологического состояния рогового слоя. Температура и скорость циркуляции крови Температура кожи может оказать влияние на скорость проникновения химических веществ в двумя путями. Во-первых, повышение температуры кожи напрямую увеличивает степень проницаемости кожи. Кроме того, температура может также воздействовать на структуру рогового слоя, в частности, на кристаллическую структуру липидных бислоев, что ведет, опять же, к повышению проницаемости. Во-вторых, температура может влиять на приток крови к коже. В этом случае увеличение скорости абсорбции будет наблюдаться, в основном, для веществ, которые быстро проникают в кожу, но медленно абсорбируются в кровь. Физическое состояние вещества (форма препарата). Термодинамически, чистые по-
рошки и насыщенные жидкие растворы одних и тех же соединений обладают одинаковой движущей силой для поглощения кожей, и поглощение веществ из сухих частиц может происходить даже без увлажнения поверхности. Тем не менее, кожная абсорбция химических веществ в растворах может быть более быстрой, чем абсорбция из сухого вещества. Размер и масса молекулы вещества При обычных условиях трансдермальным способом могут проникать только маленькие молекулы, чей молекулярный вес ниже 500 Da. Тем не менее, транспортное вещество, несущее активные ингридиенты, также может способствовать их прохождению через роговой слой. Транспортные вещества могут вступать в различные взаимодействия с липидами и протеинами рогового слоя, изменяя его проницаемость и улучшая доставку веществ в кожу. Химические связи. Скорость пенетрации через рого-
вой слой может быть медленнее ожидаемой для некоторых ионов металлов (в частности, Ag +, Cd2 +, Ве2 + и Hg2 +), акрилатов, четвертичных аммониевых ионов, гетероциклических ионов аммония и солей сульфония. Ионизация вещества Ионизированные вещества хуже проникают в кожу, для них коэффициенты проницаемости в роговой слой кожи на 1-2 порядка ниже аналогичных, но неионизированных соединений. Концепция finite dose и infinite dose В случае с infinite dose, при тестировании препарата поддерживается постоянный максимальный уровень проницаемости вещества (т.е. наружная концентрация вводимого вещества постоянна и не уменьшается), поэтому в данном случае количество используемого препарата на единицу площади должно быть достаточно велико. В случае с finite dose, максимальный уровень абсорбции в ходе эксперимента может быть
Кожная абсорбция/ 18
как достигнут, так и не достигнут. Так обычно происходит при введении препарата in vivo в обычных условиях, когда потери вещества могут происходить частично изза их испарения. Эксперименты с finite dose позволяют опреде-
лить максимальный и общий уровень абсорбции исследуемого препарата. В примере использовано соединение с показателем растворимости в воде 25 мкг/мл и коэффициентом распределения роговой слой/вода равный 200.
Различие показателей кожной абсорбции в зависимости от места наложения препарата
Соединение растворяют в воде, который используется в качестве переносчика средства. Полная группировка факторов, влияющих на показатели проницаемости кожи приведены в таблице.
Изменение показателей кожной проницаемости с течением времени в зависимости от дозировки.
Кожная абсорбция/ 19
Группа факторов
Примеры факторов Физическое состояние вещества
Тестируемый препарат
Размер молекулы Коэффициент липофильности Ионизация Вид животного
Кожа
Место расположения кожи на теле Температура Показатели метаболизма Заболевания кожи Десквамация Повреждения рогового слоя Степень гидратации рогового слоя эпидермиса Циркуляция лимфы и крови Растворимость
Соединение-переносчик
Летучесть Распределение в роговом слое кожи Наличие вспомогательных веществ Эффект, оказываемый на роговой слой Коэффициент pH Концентрация препарата
Дозировка препарата
Виды дозировки: finite dose — доза с учетом потерь на диффузию и испарение infinite dose — доза без запаса на возможные потери, но со средством-проводником, облегчающим абсорбцию Общая площадь кожного покрова в сравнении с vehicle Продолжительность воздействия препарата
Энхансеры и их влияние на сорбционные свойства кожи
Энхансеры и их влияние на сорбционные свойства кожи/ 21
Понятие энхансера
Тема эффективной доставки активных веществ вглубь кожи активно разрабатывается в лабораториях и присутствует на страницах научных журналов с конца 70-х годов. С тех пор информация о способах и механизмах проникновения веществ в кожу стремительно нарастает. Чтобы разобраться в том, как именно воздействует на кожу тот или иной современный лекарственный препарат или косметический продукт, нужен уже немалый объем информации. Небольшие молекулы могут проникать вглубь эпидермиса через межклеточные пространства, поры, волосяные фолликулы, но все же оставаясь близко к поверхности кожи. Возникла потреб-
3 http://vitazone.ru/forum/showthread. php?t=485
ность в специальных системах доставки активных ингредиентов вглубь кожи, при этом активные вещества должны попасть к клеткам в неизменном виде. Работы в этом направлении связаны с поиском специальных молекул-переносчиков, энхансеров, иначе называемых системами доставки и способных удовлетворять нескольким требованиям: • безопасность для организма (нетоксичность и гипоаллергенность); • биосовместимость с клетками кожи; • способность проникать на ту или иную глубину в эпидермис; • способность связывать активную молекулу, не нарушая ее фи-
зико-химических характеристик и биологической активности, образуя своеобразный комплекс; • способность освобождать активную молекулу, доставив ее до места, к намеченной мишени3 • в идеале, они должны быстро действовать, степень и длительность их активности должна быть предсказуемой и управляемой (вновь воспроизводимой); • энхансеры должны работать однонаправленно, т.е. должны осуществлять доставку веществ в организм и препятствовать потере веществ из организма; • после удаления энхансера с поверхности кожи, её защитные свойства должны вернуться в первоначальное состояние быстро и в полном объеме.
Энхансеры и их влияние на сорбционные свойства кожи/ 22
В качестве энхансера могут служить различные химические соединения, в том числе:
• • • • •
Спирты Амиды Сложные эфиры Гликоли — пропиленгликоль
Диэтиленгликоля моноэтиловый эфир (этилкарбитол, карбитол)
Однако не все из них способны удовлетворить требованиям, приведенным выше, необходимым для возможности использования в качестве компонента лекар-
• • • • •
Жирные кислоты Пирролидоны Сульфоксиды ПАВ (сурфактанты) Терпены
ственного или косметического препарата. Кроме того, разные химические соединения неодинаково влияют на процесс диффузии (усиливают проницаемость кожи
в меньшей или большей степени) и не всегда сочетаются с физиологически активным агентом.
Энхансеры и их влияние на сорбционные свойства кожи/ 23
Проницаемость кожи как физический процесс
Вообще, с физической точки зрения, диффузия — основной механизм пассивного транспорта веществ, обусловленный наличием концентрационного градиента. Различают несколько видов диффузции: • простая диффузия, когда диффундирующее вещество движется по градиенту через мембрану, не образуя комплекса или проникая через канал; • облегченная диффузия, осуществляемая с помощью так называемых переносчиков — белков или молекулярных комплексов, обладающих специфическим сродством к определенным веществам; • ограниченная диффузия, когда ион, проходящий через мембрану, подвергается воздействию заряженных групп белков, находящихся в канале и ограничивающих скорость поступления вещества в клетку. Простая диффузия — это самопроизвольный физический процесс проникновения вещества
из области высокой в область меньшей его концентрации в результате броуновского движения. Математическое обоснование процесса диффузии впервые дал А. Фик. Согласно первому закону Фика поток диффузии прямо пропорционален градиенту концентрации dC/dx:
где J — количество молей вещества, перенесенного за единицу ; D — ковремени, ; эффициент диффузии, С — концентрация; x — координата. Таким образом, поток вещества при диффузии — это количество вещества, диффундирующего за единицу времени через данную площадь. Градиент концентрации — изменение концентрации вещества на единицу длины в направлении диффузии. Знак минус в правой части уравнения означает, что диффузия происходит из области большей концентрации вещества в область меньшей. Коэффициент диффузии зависит от
природы вещества, температуры и характеризует его способность к диффузии. Обычно при исследовании проницаемости клеточной мембраны концентрационный градиент определить трудно, поэтому для описания диффузии вещества через нее используют простую формулу:
где ∆C — разность концентрации вещества по разные стороны мембраны; h — толщина мембраны; Р — коэффициент проницаемости, аналогичный коэффициенту диффузии, но зависящий не только от природы вещества и температуры, но и от свойств мембраны. В общем случае нестационарной диффузии концентрация вещества в любой точке может меняться со временем (второй закон Фика):
Энхансеры и их влияние на сорбционные свойства кожи/ 24
Облегченная диффузия происходит при участии молекул-переносчиков, скорость проникновения которых не имеет линейной зависимости от их концентрации. Причем при определенных концентрациях скорость их проникновения значительно выше, чем при простой диффузии. В этом случае вещество самостоятельно диффундирует через мембрану, но скорость диффузии намного возрастает, если молекулы этого вещества (А) образуют комплекс с молекулами переносчика (Х), который хорошо растворяется в липидах. На поверхности мембраны молекулы А соединяются с молекулами Х и в виде комплекса АХ проникают в клетку. Далее молекулы А освобождаются, а молекулы переносчика диффун-
4
http://pskgu.ru/ebooks/revinbio/ revinbio_3_31.pdf 5 http://pskgu.ru/ebooks/antbio/antbio_06. pdf
дируют к наружной поверхности мембраны и связываются с новыми молекулами А. Диффузия с участием переносчика, как и простая диффузия, происходит до тех пор, пока концентрация по обе стороны мембраны не станет одинаковой. Если количества вещества в среде повысить так, что при этом израсходуются все молекулы вещества Х, то скорость диффузии при дальнейшем повышении вещества А увеличиваться не будет. В общем случае кинетика облегченной диффузии подчиняется
уравнению Михаэлиса-Ментэна:4 где — максимальный поток;
— наружная концентрация — переносимого вещества; константа Михаэлиса-Ментэна. На рисунке показана зависимость плотности потока от Jm веществ через биологическую мембрану в клетку в зависимости от концентраций этих веществ во внеклеточной среде при простой (1) и облегченной (2) диффузии (считается, что концентрация внутри клетки меняется незначительно).5
Методы тестирования проницаемости кожи и обработка данных
Методы тестирования проницаемости кожи и обработка данных/ 26
Методы тестирования проницаемости кожи и обработка данных
Эффекты и механизмы действия химических энхансеров можно исследовать при помощи различных методов. Методы включают в себя исследования диффузии, дифференциальную сканирующую калориметрию (DSC), инфракрасную спектроскопию, рентгеновскую дифрактометрию и спектроскопию электронного парамагнитного резонанса (ЭПР).
Исследования диффузии Свойства и эффекты химических энхансеров могут быть исследованы in vitro или in vivo. Первый способ подразумевает исследование образцов кожи в диффузионных камерах (диффузионная ячейка), в то время как второй способ подразумевает использование живых животных или людей in situ (на месте). В случае с исследованиями in vitro,
анализы могут производиться в камерах, изготовленных из стекла или нержавеющей стали. Диффузионная ячейка состоит из донорской камеры и приемной камеры, между которыми помещается кожа (пример типичного устройства приведен на рисунке).
А - Фильтр из активированного угля (для летучих исследуемых веществ) Б - Донорская камера ячейки В - Кожная оболочка (2,54 см2) Г - Поддерживающая сетка Д - Стеклянная диффузионная ячейка Е - Магнитный вращающийся стержень Ж - Приемная камера / раствор с температурой 32 ± 10С. поддерживаемой с помощью водяной бани З - Автоматический пробоотборник, запрограммированный для отбора проб в определенное время; пипетка / шприц для отбора проб в люминесцентные или ВЭЖХ сосуды; объем, поддерживаемый путем добавления свежего приемного раствора. Пример типичного устройства статической диффузионной ячейки для проведения исследований перкутанной абсорбции in vitro
Методы тестирования проницаемости кожи и обработка данных/ 27
Ячейка должна обеспечивать герметичность вокруг кожи, способствовать легкому приготовлению образцов и хорошему перемешиванию приемного раствора в контакте с обратной стороной кожи, оптимальный температурный контроль ячейки и ее содержимого. Для проведения эксперимента подходят как статические, так и проточные диффузионные 6 ячейки. Донорские ячейки оставляют открытыми во время экспозиции определенной дозой экспериментальной пробы. Для неопределенных доз или при конкретных программах для определенных доз, ячейки могут быть закрыты.
6
http://www.vnicsmv.ru/services/standart/ pdf-tk-339/deya/1.5.339-2.005.11.pdf
Подготовка кожи. В эксперименте может использоваться кожа человека или животных. Предпочтительно использовать жизнеспособную кожу, нежизнеспособная кожа также может использоваться при условии, что подтверждена ее целостность. Пригодными для применения являются как эпидермальные оболочки (разделенные
обработкой энзимами, теплом или химическим способом), так и расщепленные кожные образцы (обычно 200 — 400 мкм толщиной), подготовленные с дерматом. Может использоваться кожа обычной толщины, но избыточной толщины кожи (приблизительно > 1 мм) следует избегать, если только это не является специальным требованием для определения вещества в слоях кожи. Подбор видов, анатомическое место и техника препарирования должны быть обоснованы. Необходимо получение достоверных данных, как минимум, четырех воспроизведений для каждой экспериментальной пробы. Целостность кожного образца. Результатом неправильной подготовки может явиться повреждение роговой оболочки, поэтому целостность подготовленной кожи должна быть проверена. При исследовании кожного метаболизма свежесрезанная кожа должна быть использована как можно быстрее при условиях, поддерживающих метаболическую активность. Све-
жесрезанная кожа должна быть использована в течение 24 часов, но приемлемый период хранения кожи может изменяться в зависимости от системы энзимов, вовлеченных в метаболизм, и температур хранения. Когда пробы кожи хранятся до использования, необходимо убедиться, что барьерная функция поддерживается. Нанесение вещества на кожу. Нанесение вещества, имитирующее экспозицию человека, составляет 1 — 5 мг/см2 кожи для твердых веществ и до 10 мкл/см2 для жидкостей. Количество должно быть обосновано ожидаемыми условиями проведения испытания, целями исследования и физическими характеристиками пробы. Например, нанесения на кожу могут быть неопределенными, в больших объемах на единицу поверхности. Температура. На пассивную диффузию веществ (и, соответственно, на кожно-резорбтивное действие) влияет температура. Для диффузионной камеры и кожи
Методы тестирования проницаемости кожи и обработка данных/ 28
должна поддерживаться постоянная температура, близкая к нормальной температуре кожи 32 ± 10С. Различные конструкции ячеек требуют применения различных водяных бань и нагреваемых температурных блоков для поддержания физиологической нормы для кожи и приемного раствора. Влажность должна быть в пределе от 30 до 70%.
7
http://www.eapatis.com/ruSearch/ ms.exeData/EAPO/eapo2007/PDF/009024. pdf 8
http://www.sciencedirect.com/science/ article/pii/S0378517313001841#
DSC (Дифференциальная сканирующая калориметрия) DSC используют для определения изменений в физико-химических свойствах соединений в комбинации с агентом, способствующим проникновению в кожу после испарения летучей жидкости. Метод дает возможность определить оптимальное соотношение лекарственного препарата7 и способствующего агента, которое приводит к образованию измененной аморфной формы для усиления трандермальной пенетрации всасывания (т.е. повышает уровень пенетрации лекарственного препарата). Методика DSC может быть использована для
изучения взаимодействий между эпидермисом и энхансерами. С помощью неё можно получить исчерпывающую информацию о зависимости теплоемкости липидов или мембран в суспензии от температуры (т.е. построить кривую теплоемкости).8 Взаимодействия между энхансерами и кожей могут быть исследованы с помощью измерения тепловых переходов в присутствии и без энхансера. Фурье-спектроскопия (Fourier transform infrared spectroscopy) Фурье-спектроскопия может быть полезна для исследования взаимодействия между энхансером и роговым слоем кожи. Активность липидов и белков эпидермиса отражается на результатах спектроскопии в разных спектральных зонах. Прибором для ФС служит фурье-спектрометр, основная часть которого — интерферометр Майкельсона (изобретен А. Майкельсоном в 1880). Интерферометр
содержит два взаимно перпендикулярных зеркала - неподвижное 1 и подвижное 2 и полупрозрачную светоделительную пластину 3, расположенную в месте пересечения падающих пучков излучения и пучков, отраженных от обоих зеркал. Пучок излучения от источника 4, попадая на пластину 3, разделяется на два пучка. Один из них направляется на неподвижное зеркало 1, второй — на подвижное зеркало 2; затем оба пучка, отразившись от зеркал, выходят через светоделитель из интерферометра в одном и том же направлении. Далее излучение фокусируется на образце 5 и поступает на детектор излучения 6. Два пучка отличаются друг от друга оптической разностью хода, величина которой меняется в зависимости от положения подвижного зеркала. В результате интерференции пучков интенсивность результирующего потока I(х)периодически меняется (модулируется). Частота модуляции зависит от частоты падающего излучения v и смещения подвижного зеркала х. В результирующей интерферограмме
Методы тестирования проницаемости кожи и обработка данных/ 29
выделяется т. наз. точка нулевой разности хода, или точка белого света. В этой точке для всех частот наблюдается максимум; от нее ведут отсчет смещения подвижного зеркала. Для градуировки перемещений последнего часто используют интерферограмму монохроматического излучения от лазера (обычно на основе Нe - Ne), введенного в фурье-спектрометр.9 При поглощении образцом излучения с какой-либо частотой наблюдается уменьшение интенсивности интерферограммы, соответствующей этой частоте. После проведения фурье-преобразования в полученном спектре наблюдается полоса поглощения
9 http://www.xumuk.ru/encyklopedia/2/4981. html
образца. Преобразование Фурье осуществляют на ЭВМ.
Быстрое развитие и широкое применение ФС обусловлены рядом преимуществ фурье-спектрометра по сравнению с дисперсионными приборами. Tак называемый выигрыш Фелжета, или мультиплекс-фактор, связан с тем, что любая точка интерферограммы содержит информацию о всей исследуемой спектральной области. На детектор в каждый момент поступают сигналы, соответствующие всем частотам. За одно сканирование (за время t1) регистрируется спектр с таким же
отношением сигнал/шум (S/N)t1, как и для дисперсионного спектрометра (но за время t2 на несколько порядков большее, чем t1). Если для получения спектра на фурье-спектрометре затратить время t2, то отношение сигнал/ шум возрастает во много раз в соответствии с уравнением
Другое важное преимущество фурье-спектрометра — выигрыш Жакино, или геом. фактор, определяется отсутствием в нем щелей (задерживающих в дисперсионных спектрометрах до 99,9% излучения), что дает значит. выигрыш в светосиле (~ в 100-200 раз).
Оптическая схема фурье-спектрометра: 1 - неподвижное зеркало интерферометра; 2 - подвижное зеркало; 3 - светоделительная пластина; 4 - источник излучения; 5 - исследуемый образец; 6 - детектор излучения.
Методы тестирования проницаемости кожи и обработка данных/ 30
Это позволяет уменьшить время регистрации спектров и отношение сигнал/шум, повысить разрешение и уменьшить габариты прибора. Вследствие того, что интерферометр модулирует каждую частоту излучения различным образом, отсутствует влияние рассеянного излучения, это обеспечивает высокую точность измерений даже высокой оптической плотности. Любое излучение, исходящее из образца, не модулируется и не детектируется, так что в спектре отсутствуют ложные сигналы.
Чувствительность аналитических определений на фурье-спектрометре обычно в 100-1000 раз выше, производительность в сотни раз больше, погрешности измерений на порядок меньше, чем в случае использования дисперсионных приборов. Пределы обнаружения ряда веществ достигают долей нанограмм, а использование микроскопа позволяет анализировать включения в образцах размерами 1Ox 10 мкм2. С помощью ФС можно изучать кинетику реакций, протекающих за время около 1 мс.
Имеются фурье-спектрометры для получения спектров в различных областях - от нескольких см-1 до десятков тыс. см-1, в т.ч. спектров комбинац. рассеяния. На ИК фурье-спектрометрах достигнуто разрешение до 1,3·10-4 см-1, точность определения волнового числа до 10-4 см-1. Созданы приборы для видимой и УФ областей, на которых получают, в частности, эмиссионные спектры ряда элементов (U, Np, Pd, Но и др.) с воспроизводимостью волновых чисел b2·10-6см-1 при (S/N)>103.
Компьютерная обработка данных После получения результатов лабораторных исследований, наиболее важным этапом оказывается их правильная обработка и понятное представление для внешних пользователей. Так, для моделирования процессов (в том числе диффузии), построения графиков функций можно использовать различное программное обеспечение. Одно из популярных решений в данной области — Mathcad. Mathcad - программное средство, среда для выполнения на ком-
пьютере разнообразных математических и технических расчетов, снабженная графическим интерфейсом, которая предоставляет пользователю инструменты для работы с формулами, числами, графиками и текстами. Mathcad содержит сотни операторов и встроенных функций для решения различных технических задач. Программа позволяет выполнять численные и символьные вычисления, производить операции со скалярными величинами, векторами и матрицами, автоматически переводить одни единицы измерения в другие. Среди возможностей Mathcad можно выделить: • Решение дифференциальных уравнений, в том числе и численными методами • Построение двумерных и трёхмерных графиков функций (в разных системах координат, контурные, векторные и т. д.) • Использование греческого алфавита как в уравнениях, так и в тексте
Методы тестирования проницаемости кожи и обработка данных/ 31
• Выполнение вычислений в сим-
вольном режиме Выполнение операций с векторами и матрицами • Символьное решение систем уравнений • Аппроксимация кривых • Выполнение подпрограмм • Поиск корней многочленов и функций
• Проведение статистических
расчётов и работа с распределением вероятностей • Поиск собственных чисел и векторов • Вычисления с единицами измерения • Интеграция с САПР-системами, использование результатов вычислений в качестве управляю-
щих параметров С помощью Mathcad можно документировать все вычисления в процессе их проведения.