UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS FORESTALES
HIBRIDACIÓN NATURAL ENTRE LAUREL (Laurelia sempervirens [R. ET P.] TUL.) Y TEPA (L. philippiana LOOSER O Laureliopsis philippiana [LOOSER] SCHODDE).
Profesor Guía : Claudio Donoso Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al Título de Ingeniero Forestal
DIEGO ALARCÓN ABARCA VALDIVIA - CHILE 2000
CALIFICACIÓN COMITÉ DE TITULACIÓN
NOTA
PROFESOR PATROCINANTE :
Claudio Donoso Zegers
7,0
PROFESOR INFORMANTE
:
Rodrigo Vengara Lagos 7,0
PROFESOR INFORMANTE
:
Angélica Aguilar Vivar
7,0
El Profesor Patrocinante acredita que el presente trabajo de Titulación cumple con los requisitos de contenido y de forma contemplados en el Reglamento de Titulación de la Escuela. Del mismo modo, acredita que en el presente documento han sido consideradas las sugerencias y modificaciones propuestas por los demás integrantes del Comité de Titulación.
Prof. Claudio Donoso Zegers
A los frutos del esfuerzo y tesón de Lila y Claudio, mis padres. Al comienzo del camino de Paula Sofía y Claudio Andrés.
AGRADECIMIENTOS
El autor desea agradecer a Claudio Donoso, quien con su trabajo, perseverancia y visión señeras, constituye un ejemplo para generaciones de profesionales del bosque, cuyo apoyo hizo posible el desarrollo de cada una de las etapas de esta tesis. Al otro lado de los Andes, a Andrea Premoli y Cinthia Souto, del Laboratorio Ecotono, de la Universidad Nacional del Comahue, en Bariloche, por su vital ayuda en esta tesis en el estudio de variación isoenzimática. A Rolando Martínez, del Laboratorio de Síntesis Orgánica del Instituto de Química de la Universidad Austral de Chile, por su importante apoyo en el análisis de compuestos secundarios foliares. Especiales son los agradecimientos a Héctor Lobos "Lobito", Rodrigo Sagardía y José Felipe Monacci, más que por la importante ayuda brindada en la colecta de muestras, por su amistad a toda prueba y apoyo en los momentos precisos. A Rodrigo Vergara, Moisés Osorio, Sigrid Calderón, Andrea Santana, Jorge Higuera, Marcelo Opazo, Matías Pizzi, Ximena Miranda, Felipe Portales, Paulo Canales, Soledad Celis, Daniela Barrientos, Víctor Limarí, Verónica Fredes, Juan Andrés Benavides, Carolina Alvarez y Alberto Zúñiga, quienes de una u otra forma han brindado valiosa colaboración en distintas fases de esta tesis.
INDICE DE MATERIAS
1.
INTRODUCCIÓN....................................................................................................3
2.
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA .............................................................................5
2.1
Hibridación: características y principios del fenómeno ....................................5
2.2
Consecuencias e importancia de la hibridación ................................................14
2.3
Caracterización de Laurelia sempervirens y L. philippiana.............................17
2.3.1
Clasificación taxonómica ................................................................................ 17
2.3.2
Descripción de las especies............................................................................. 17
2.3.3
Distribución natural de L. sempervirens ........................................................ 19
2.3.4
Distribución natural de L. philippiana ........................................................... 21
2.3.5
Antecedentes sobre la ecología de las especies ............................................. 22
2.3.6
Importancia de L. sempervirens y L. philippiana .......................................... 23
3.
MATERIAL Y MÉTODO ....................................................................................24
3.1
Poblaciones en estudio...........................................................................................24
3.2
Estudio de características morfológicas y anatómicas .....................................26
3.2.1
Análisis mediante Índice de Hibridación ....................................................... 33
3.2.2
Análisis mediante Diagrama de Dispersión ................................................... 33
3.2.3
Dendrograma a partir de análisis de cluster ................................................... 33
3.2.4
Análisis factorial por componentes principales ............................................. 35
3.3
Estudio de compuestos secundarios de las hojas...............................................35
3.4
Estudio de variación isoenzimática .....................................................................39
3.4.1
Extracción y almacenamiento de las muestras............................................... 39
3.4.2
Preparación del gel de almidón....................................................................... 41
3.4.3
Corrida electroforética..................................................................................... 42
3.4.4
Tinción del gel.................................................................................................. 44
3.4.5
Registro e interpretación ................................................................................. 44
4.
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS .........................46
4.1
Estudio de características morfológicas y anatómicas .....................................46
4.1.1
Caracterización según elementos foliares de registro directo....................... 46
4.1.2
Caracterización según coeficientes morfométricos ....................................... 50
4.1.3
Caracterización según rasgos de tipo cualitativo ........................................... 55
4.1.4
Índice de Hibridación de Anderson ................................................................ 57
4.1.5
Diagrama de dispersión de Anderson............................................................. 61
4.1.6
Análisis de Clusters para los coeficientes morfométricos............................. 63
4.1.7
Análisis Factorial por Componentes Principales ........................................... 65
4.2
Estudio de compuestos secundarios de las hojas...............................................68
4.3
Variación isoenzimática en las poblaciones en estudio.....................................71
4.4
Elementos de coherencia con los principios de hibridación............................80
5.
CONCLUSIONES..................................................................................................83
6.
RESUMEN..............................................................................................................85
7.
BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................86 APÉNDICES...........................................................................................................94 Apéndice 1. Coeficientes medios de morfología foliar por individuo ............95 Apéndice 2. Cálculo del Índice de Hibridación ...............................................101 Apéndice 3. Cromatogramas de Flavonoides ..................................................107
INDICE DE CUADROS 1. Comparación de las características de Laurelia sempervirens y L. philippiana ......... 17 2. Individuos incluidos en la muestra, según población y sector ..................................... 26 3. Rasgos cuantitativos de la morfología foliar, y unidades de registro........................... 29 4. Rasgos cualitativos de la morfología foliar, y valores de registro................................ 30 5. Coeficientes de relación morfométrica empleados en el análisis ................................. 32 6. Elementos a registrar a partir de cada mancha en los cromatogramas ........................ 38 7. Sistemas buffer empleados en las corridas electroforéticas.......................................... 42 8. Enzimas de las cuales se analizó su variación y sistema buffer requerido .................. 43 9. Características foliares de registro directo en las poblaciones estudiadas................... 46 10. Presencia de diferencias significativas de los presuntos híbridos, respecto del resto de las poblaciones, para los elementos foliares de registro directo ......................... 49 11. Coeficientes morfométricos en las poblaciones estudiadas........................................ 50 12. Presencia de diferencias significativas de los presuntos híbridos, respecto del resto de las poblaciones, para los coeficientes morfométricos ......................................... 52 13. Rasgos cualitativos observados en las poblaciones estudiadas.................................. 55 14. Características incluidas en el índice de hibridación y sus puntajes.......................... 57 15. Índices de Hibridación calculado para cada individuo ............................................... 59 16. Correlación de cada coeficiente morfométrico foliar con cada factor obtenido por el análisis de componentes principales.......................................................................... 66 17. Compuestos detectados en las poblaciones analizadas por cromatografía................ 68 18. Compuestos detectados en los individuos analizados y valores de Rf (TBA) ......... 69 19. Parámetros de variación genética en las poblaciones en estudio, considerando las frecuencias alélicas de los 18 loci isoenzimáticos.................................................... 72 20.
Matriz de coeficientes de similaridad genética de Rogers (1972) entre las poblaciones en estudio................................................................................................ 75
21. Matriz de valores de identidad genética insesgada según Nei (1978) entre las poblaciones en estudio................................................................................................ 76 22. Representación del número de días observados con presencia de flores maduras en L. philippiana y L. sempervirens, para las temporadas 1996 a 1998....................... 81
INDICE DE FIGURAS 1. Rango latitudinal de distribución de L. sempervirens y L. philippiana ....................... 20 2. Localización de las poblaciones estudiadas................................................................... 25 3. Representación gráfica de los rasgos cuantitativos de la morfología foliar ............... 30 4. Gráfico de dispersión según ángulo del ápice de la lámina (ang a) y número medio de dientes por lámina (as) .............................................................................................. 47 5. Gráfico de dispersión según número medio de nervaduras secundarias por lámina (n) y ángulo de la base de la lámina (ang b) .................................................................. 48 6. Gráfico de dispersión según proporción l/n y proporción l/s ........................................ 51 7. Gráfico de dispersión según proporción l/p, y proporción da/a.................................... 53 8. Gráfico de dispersión según proporción da/p, y proporción l/T.................................... 54 9. Histograma de frecuencia para los valores de Indice de Hibridación en Laurelia sempervirens, L. philippiana e híbridos presuntos ................................................... 60 10. Diagrama de Dispersión de Anderson para los ejemplares estudiados de Laurelia sempervirens, L. philippiana y presuntos híbridos. ................................................. 62 11. Dendrograma del Análisis de Clusters de los individuos, agrupados según vínculo completo y distancias euclidianas entre coeficientes de morfología foliar............. 64 12. Gráfico del análisis factorial por componentes principales según características de morfología foliar ........................................................................................................ 67 13. Dendrograma de grupos de pares insesgados a partir de la distancia genética insesgada modificada de Rogers, según Wright (1978) .......................................... 77 14. Dendrograma de grupos de pares insesgados a partir de los coeficientes de identidad genética insesgada según Nei (1978) ........................................................................ 78
1. INTRODUCCIÓN
La conservación de los bosques nativos depende, entre otros aspectos, de los aportes en información aplicable acerca de las especies que los conforman, en especial respecto de las especies arbóreas que son la base de su estructura. Dentro de esta información, es necesario considerar la variabilidad de las especies forestales a la hora de realizar acciones que permitan su utilización productiva y aseguren la conservación de éstas.
El fenómeno de hibridación entre especies vegetales evolutivamente próximas es frecuente en la naturaleza, constituye una fuente potencial de aumento en la variabilidad del acervo genético de las especies, y es considerada una herramienta que puede determinar el desarrollo o la incorporación de características eventualmente útiles en programas de mejoramiento genético con fines productivos.
Detectar evidencias de procesos de hibridación natural interespecífica, es una labor que requiere un completo conocimiento de las especies involucradas, en cuanto a sus características de morfología, fenología y hábitat. Es así que se han descubierto diversos casos de híbridos en la naturaleza, gracias a una acertada observación por parte de especialistas, quienes han encontrado en terreno, individuos con rasgos intermedios entre dos especies diferentes.
Las especies laurel y tepa son de importancia económica en el ámbito forestal, y su participación en los bosques nativos chilenos es notable en varios tipos forestales. Se trata de especies genéticamente cercanas, consideradas taxonómicamente pertenecientes a una misma familia y pese a que durante mucho tiempo se las trató dentro del mismo género Laurelia, hoy la especie tepa es postulada como el género monoespecífico Laureliopsis.
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Si bien ambas especies comparten una parte importante de sus rangos de distribución geográfica, ellas crecen generalmente en sitios excluyentes, existiendo, sin embargo, áreas de encuentro de estas especies, en las cuales se ha evidenciado la presencia de individuos con aparentes características intermedias, dando origen entonces a la hipótesis de hibridación natural entre éstas, según Donoso (1993).
La existencia de individuos híbridos naturales entre laurel y tepa representaría un hecho de importancia, al abrir expectativas para su empleo, por las ventajas que significa una mayor variabilidad genética eventualmente utilizable en el mejoramiento de alguna o ambas especies, representando a la vez, un elemento de corroboración de su cercanía evolutiva y genética.
El objetivo principal de esta tesis es responder a la hipótesis mencionada, por medio de analizar la identidad de un grupo de individuos presuntamente híbridos debido a que muestran características intermedias entre las especies y coexisten en un área donde se superponen sus rangos de distribución natural. Este análisis considera comparar dichos individuos con poblaciones de cada especie, contiguas a la posible zona de hibridación, incluyéndose además, poblaciones de cada taxa de las cuales se tiene certeza del aislamiento genético entre ambas, producto de su ubicación geográfica.
La comparación entre los grupos mencionados se realiza sobre la base de elementos de anatomía y morfología foliar, presencia de compuestos secundarios en las hojas y variación isoenzimática, todo lo cual permite determinar la relación entre las poblaciones e inferir la identidad del grupo de individuos presumiblemente híbridos.
Dentro de los objetivos específicos de la presente investigación, se cuentan: contribuir al conocimiento de las especies forestales laurel y tepa en relación con la variabilidad que éstas presentan en la zona de estudio, aportar al entendimiento del grado de relación filogenética entre ellas, y contribuir al conocimiento de las características de la anatomía y morfología foliar de las especies en estudio, que favorezcan su identificación. 4
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1
Hibridación: características y principios del fenómeno Se entiende por hibridación el cruzamiento de tipos genéticamente diferentes
(Stebbins, 1950), como por ejemplo distintas poblaciones o razas geográficas dentro de una misma especie, o bien subespecies o especies diferentes (Spurr y Barnes, 1980). Dentro del contexto de las ciencias forestales, el término hibridación generalmente se refiere a la cruza entre distintas especies, o hibridación interespecífica (Wright, 1964a; Zobel y Talbert, 1994).
La hibridación corresponde a un fenómeno frecuente en poblaciones naturales de muchos grupos de plantas leñosas (Spurr y Barnes, 1980). Para su ocurrencia, debe existir compatibilidad genética entre las especies, y además, contigüidad o superposición de sus áreas de distribución, superposición de los períodos de floración de ambas especies y condiciones de sitio adecuadas para la progenie (Stebbins, 1950; Stern y Roche, 1974; Donoso, 1993).
En relación a estos factores, la libre hibridación en poblaciones naturales se ve obstaculizada, dado que especies genéticamente compatibles pese a que puedan superponer sus rangos de distribución, usualmente ocupan distintos nichos ecológicos producto de diferencias en su autoecología y sus requerimientos climáticos y edáficos, determinando entonces que las condiciones favorables para el cruce de ellas y la consecuente generación de híbridos viables, se presenten sólo en ciertas áreas del rango de distribución (Stern y Roche, 1974).
Los híbridos son capaces de sobrevivir sólo en hábitats favorables, y comúnmente donde crecen, también están presentes las especies parentales y demás miembros de la comunidad forestal. De esta forma, muchos híbridos deben competir con otras plantas seleccionadas por el medioambiente y probablemente mejor adaptadas que ellos (Benson, 1962). 5
La hibridación natural sucede con mayor frecuencia en áreas perturbadas, donde ocurren grandes cambios en el ambiente dentro de cortas distancias, permitiendo así la proximidad necesaria de las especies compatibles y el origen de nichos nuevos, favoreciendo el establecimiento de los híbridos formados (Zobel y Talbert, 1994). Estas áreas alteradas pueden constituir un hábitat intermedio o hábitat híbrido, donde las especies parentales no logran adaptarse bien, y la consecuente falta de competencia en esas zonas brinda una buena condición para la sobrevivencia de la progenie híbrida (Benson, 1962; Anderson, 1968; Spurr y Barnes, 1980). Eventualmente, algunos de los híbridos podría presentar una combinación de características mejor adaptada a la nueva mezcla de hábitats producida, que las especies parentales (Heywood, 1968).
Gran parte de los ejemplos de hibridación en el mundo vegetal, se relacionan a hábitats alterados y áreas abiertas por la actividad humana. Un ejemplo de ello lo constituye la hibridación natural entre Nothofagus obliqua y N. alpina, donde alteraciones como incendios, tala de bosques, y abandono de tierras agrícolas o ganaderas, permitieron la formación de renovales mixtos de ambas especies, determinando un mayor contacto entre ellas y favoreciendo así procesos de hibridación natural (Donoso et al., 1990; Donoso, 1993).
Cualquier tipo de alteración ambiental puede dar como resultado un hábitat híbrido potencial (Zobel y Talbert, 1994). Es así como diversas perturbaciones de origen natural, derivan en áreas con características medioambientales propicias para la hibridación, dentro de las cuales se puede incluir deslizamientos de tierra, escoria o nieve, erupciones volcánicas, incendios forestales naturales, solevantamientos o hundimientos de tierras o islas, inundaciones o retiradas de glaciares (Donoso, 1993). Algunos ejemplos para estas últimas situaciones corresponden a los híbridos descritos Sophora macrocarpa x S. microphylla y Myrceugenia exsucca x M. lanceolata, en un área de inundación periódica aledaña a la laguna Amargo, precordillera andina de Linares, en la Región del Maule (Donoso, 1975; Landrum, 1975), o bien los híbridos Nothofagus betuloides x N. nitida, en una zona alterada luego de una avalancha desde el Ventisquero Queulat, en la Región de Aysén (Donoso y Atienza, 1984), y los híbridos 6
entre N. dombeyi y N. nitida, en un área de deslizamiento de tierra y rocas en Anticura, Región de Los Lagos (Donoso y Atienza, 1983).
En términos generales, se puede decir que la frecuencia de hibridación y ocurrencia de procesos de introgresión, es alta en lugares caracterizados por una condición de insularidad, donde la creación de nuevos sitios ecológicos producidos ha determinado en algunos casos la hibridación del hábitat (Anderson, 1968). Esta situación explica en parte la gran cantidad de fenómenos de hibridación ante la señalada condición, destacando en Tasmania el género Eucalyptus y en Nueva Zelandia los híbridos de Nothofagus. La condición de aislamiento ecológico de los bosques de Chile es un elemento que hace más entendible aún la ocurrencia de fenómenos de hibridación entre algunas especies. Se han informado casos para los géneros Nothofagus (Donoso y Landrum, 1979; Donoso y Atienza, 1983; 1984; Donoso et al., 1990; Premoli, 1996), Sophora y Myrceugenia (Donoso, 1975; Landrum, 1975), sin embargo, es probable que acontezca hibridación natural en otros géneros como Baccharis, Berberis, entre Fitzroya cupressoides y Pilgerodendron uviferum, y entre Laurelia sempervirens y L. philippiana, según observaciones en terreno (Donoso, 1993), así mismo en otros casos de la flora nativa chilena.
La posibilidad de cruza entre especies o factibilidad de hibridación es mayor mientras menor sea la diferenciación genética entre las especies afines o próximas. En este ámbito, son numerosos los antecedentes sobre híbridos naturales entre especies forestales de un mismo género, dentro de los que sobresalen los géneros Pinus (Panetsos, 1975; Korol et al., 1995; Edwards-Burke et al., 1997), Abies (Jain, 1976), Picea (Ernst et al., 1990; Krutowski y Bergmann, 1995), Larix (Carlson y Theroux, 1992), Acer, Populus (Whitham, 1989; Zhang et al., 1995), Betula, Quercus (Nason et al., 1992; Rushton, 1993), Aesculus (De Pamphilis y Wyatt, 1990), Castanea, Fraxinus, Ulmus (Machon et al., 1995), Psidium (Landrum et al., 1995), Juglans, Salix (Fritz et al., 1994), Eucalyptus (Ashton y Sandiford, 1988; Whitham et al., 1994) y Nothofagus (Donoso y Landrum 1979, Donoso y Atienza, 1983; Donoso et al., 1990; Premoli, 1996; Gallo et al., 1997). No obstante, también es posible la hibridación natural entre especies 7
de géneros diferentes cercanos, como entre Cupressus y Chamaecyparis, o entre Tsuga y Picea (Wright, 1964b; Zobel y Talbert, 1994). En la naturaleza, sin embargo, existe una serie de mecanismos de aislamiento de especies diferentes, que impiden un efectivo intercambio genético entre ellas. Estos mecanismos pueden clasificarse de la siguiente manera (Stebbins, 1950; Benson, 1962; Bell, 1968; Spurr y Barnes, 1980):
1. Mecanismos de Pre-fertilización o Precigóticos. Integrados por una serie de barreras que impiden la formación del cigoto híbrido, dentro de las cuales se tiene:
a) Aislamiento geográfico: Existencia de las poblaciones de especies o tipos afines en regiones geográficas diferentes (poblaciones alopátricas).
b) Separación ecológica: Las poblaciones viven en la misma región geográfica, constituyendo poblaciones simpátricas, sin embargo ellas ocupan hábitats distintos, con diferentes condiciones climáticas o edáficas. Dentro del rango de distribución común entre las especies, las barreras de incompatibilidad que ocurren en algunas partes del rango, pueden estar ausentes en otras partes (Stern y Roche, 1974).
c) Aislamiento temporal o estacional: Las poblaciones de las especies compatibles se desarrollan en la misma zona o región y pueden ocurrir en los mismos hábitats, pero existen diferencias en los períodos de floración y polinización de las poblaciones. Cuando se presenta esta barrera, puede ocurrir el desarrollo de híbridos naturales entre las poblaciones pese a existir un intervalo de diferencia entre los períodos de floración de las especies. Esto puede deberse a que en determinados años pueden ocurrir fluctuaciones en los períodos de receptividad y época de liberación del polen de ambas especies, debido a condiciones climáticas extraordinarias, o ante ataques de insectos a las estructuras florales causando una maduración temprana o muerte de los tejidos y una posterior regeneración tardía
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de ellos, resultando en una coincidencia parcial de los períodos de floración de las especies (Zobel y Talbert, 1994).
d) Separación etológica indirecta: Ocurre cuando la polinización sólo se hace efectiva mediante agentes muy especializados y específicos, lo que dificulta o imposibilita la llegada de polen de una especie a la flor de la otra especie. Este mecanismo es propio de ciertas especies cuya polinización es mediada por insectos u otros animales.
e) Aislamiento mecánico. Es particularmente efectivo en plantas con elaboradas estructuras florales adaptadas a la polinización por insectos (por ejemplo en especies de las familias Orchidaceae o Asclepiadaceae), ya sea por características del polen, en cuanto a su tamaño o capacidad de agrupación, en relación con las estructuras florales; o bien por una fuerte especialización de los agentes polinizadores a flores con determinadas estructuras específicas.
f) Impedimento en la fertilización: Las barreras actúan en la fase reproductiva de las especies parentales, ya sea por falla o inefectividad del crecimiento del tubo polínico y falla en la fertilización, o diferencia en la velocidad de crecimiento del tubo polínico en el ovario de una especie distinta.
g) Incompatibilidad gamética: La polinización puede ocurrir, pero los gametos son incompatibles antes o en el momento de la fertilización.
2. Mecanismos de Post-Fertilización o Postcigóticos: La fertilización logra ocurrir, formándose los cigotos híbridos, sin embargo ellos son inviables o dan lugar a híbridos débiles o estériles. Si alguno de los mecanismos de aislamiento precigótico resulta no ser efectivo, y llegaran a formarse cigotos híbridos verdaderos, varios otros mecanismos de aislamiento pueden entrar en acción para impedir que el cruce realizado se convierta en un efectivo enlace genético de las dos especies en cuestión (Bell, 1968): 9
a) Inviabilidad: Impedimento en el desarrollo del híbrido F1 luego de la fertilización, por la incapacidad del cigoto híbrido de crecer como embrión normal bajo las condiciones de desarrollo de la semilla; por desajustes entre los juegos de los cromosomas padres, o entre el embrión en desarrollo inicial y el endosperma que lo rodea, haciendo imposible la germinación para el cigoto formado.
b) Debilidad del híbrido: Se impide el crecimiento o reproducción de los híbridos F1, lo cual puede manifestarse en cualquier etapa desde el comienzo del desarrollo del cigoto híbrido, hasta la maduración de los genotipos que constituirán la generación F2. El cigoto formado puede llegar a desarrollarse en una semilla que germina; sin embargo, al establecerse, colapsa antes de formar órganos reproductivos.
c) Esterilidad genética o cromosómica de los híbridos: Incapacidad o falla de los híbridos para producir descendencia, producto de desajustes entre los cromosomas parentales, que actúan en el desarrollo de los gametos o en la meiosis; o un desarrollo anormal de los órganos reproductivos. Algunas causas genéticas para la falla reproductora de los híbridos se pueden deber a diferencias en los complejos genéticos coadaptados de las especies parentales, o esterilidad a consecuencia de una estructura diferente en los cromosomas homólogos (Stern y Roche, 1974). Es obvio que si dos especies difieren ampliamente en la fisiología de sus procesos de desarrollo, muchas recombinaciones de los diferentes factores genéticos que afectan estos procesos no se ajustarán, y producirán individuos no adaptados al ambiente, o significarán deficiencias fatales en el cigoto (Stebbins, 1950).
d) Degeneración de la progenie híbrida: Los híbridos F1 son normales, y fértiles, pero la generación F2, o posteriores a ésta, contienen individuos inviables o estériles.
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Dado que los mecanismos de aislamiento no siempre son eficientes entre las diferentes especies de plantas y árboles, sumado a la longevidad característica de las especies arbóreas y a los eficientes métodos de reproducción sexual que ellos presentan, se hace más fácil la ocurrencia de hibridación entre especies (Donoso, 1993).
Algunas veces la hibridación da lugar sólo a unos pocos tipos intermedios aislados, en cambio en otras, se originan poblaciones conocidas como enjambres de híbridos. Esta diferencia puede producirse debido a oportunidades limitadas para el cruce, posible esterilidad de los híbridos, interviniendo también la intensidad o naturaleza de la presión selectiva (Wright, 1964b). En estos enjambres híbridos se presentan muchas combinaciones, derivadas del cruzamiento de dos especies, seguidas del cruzamiento de los híbridos entre ellos, y con las poblaciones padres (Benson, 1962).
Es necesario considerar que el intercambio genético entre las especies se hace efectivo sólo luego de producirse descendencia posterior al F2 (Stebbins, 1950). En la mayor parte de los casos, la hibridación produce sólo uno o unos pocos árboles F1, mientras que el grupo de híbridos puede subsistir por una generación, desapareciendo posteriormente (Wright, 1964b).
Anderson (1968) denomina hibridación introgresiva o introgresión al proceso de flujo genético a través de una barrera interespecífica incompleta por sobre las barreras de aislamiento de las especies, con una incorporación de genes o complejos genéticos de una especie al acervo genético de la otra, más allá de la ocurrencia ocasional de híbridos espontáneos (Bell, 1968; Stern y Roche, 1974). En este proceso, el flujo limitado de material genético de una especie a otra se produce por hibridación, seguido de retrocruzamiento de los híbridos fértiles y su descendencia con individuos de una o ambas especies progenitoras y posterior selección natural de tipos de cruces mejor adaptados (Stebbins, 1950; Spurr y Barnes, 1980; Zobel y Talbert, 1994). Los híbridos formados frecuentemente son incapaces de producir semillas viables, y en cambio, su polen puede ser viable, siendo capaces de fertilizar individuos de especies parentales (Heywood, 1968). 11
La introgresión puede ocurrir sólo en la parte de la distribución geográfica de la especie en la cual ocurre la superposición geográfica con la distribución natural de especie cercanamente relacionada, y sólo cuando el hábitat provee un nicho ecológico para el establecimiento de tipos introgresivos. Si el patrón de variación de una especie está siendo alterado por hibridación introgresiva, este patrón debería contener más variabilidad en regiones donde los rangos de las especies relacionadas superponen su distribución, que en las regiones donde crecen separadas o aisladas una de otra. Del mismo modo, esta variabilidad debiera ser mayor en áreas recientemente abiertas y hábitats con mucha alteración, que en zonas más antiguas y estables (Stebbins, 1950).
La hibridación introgresiva sigue el principio de correlación entre características diferentes. Si se tienen dos especies A y B, y existe hibridación y posterior introgresión entre ellas, entonces el patrón de variación de la especie A debiera verse aumentada en dirección hacia la especie B, en y cerca de las regiones donde A y B se encuentran juntos, y donde sus hábitats se han alterado en períodos relativamente recientes. Más aún, los individuos introgresantes de la especie A no debieran poseer características diferentes de la especie B recombinadas al azar con aquellas de la especie A. Cada individuo debería variar en la dirección de la especie B en algunas características que distingan las dos especies; aunque obviamente sería expresada en diferentes grados en diferentes individuos (Stebbins, 1950).
Si la hibridación ocurre entre dos especies cercanamente relacionadas, la probabilidad de flujo genético es mayor cuando las especies hayan divergido suficientemente como para tener acervos genéticos bien integrados, pero diferentes. Los genes de una población se incorporan al acervo genético de la otra, si mejoran la armonía bien integrada del acervo genético diferente. Si tienden a romper la armonía, su frecuencia se reducirá; esto es meramente por selección natural (Spurr y Barnes, 1980).
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En general, los procesos de hibridación interespecífica en la naturaleza, están regidos por ciertos principios generales (Stebbins, 1950):
1. A pesar de que los individuos que componen la progenie F1 de un cruce interespecífico son generalmente parecidos entre ellos, la descendencia en el cruce F2 y generaciones posteriores son extremadamente variables, debido a la segregación mendeliana de los factores genéticos responsables de las diferencias interespecíficas.
2. Aunque la segregación en los F2 de un híbrido interespecífico produce un gran número de tipos de recombinación, en ningún caso las características parentales que presenten corresponden a una muestra al azar del total de combinaciones posibles de características fenotípicas de los padres, ya que siempre existe algún grado de correlación entre los grupos de características parentales.
3. Los híbridos interespecíficos naturales tienen más probabilidad de reproducirse a partir del polen de las plantas de las especies parentales por su mayor abundancia, que con el polen escaso y de pobre viabilidad de otro híbrido. Debido a esto, la descendencia de la mayoría de los híbridos es más probable que representen tipos intermedios que F2 verdaderos, situación que tenderá a acentuarse cada vez más debido a la posterior selección natural, dando lugar a la hibridación introgresiva o introgresión.
4. La hibridación depende directamente del ambiente en el cual ocurre. La hibridación que ocurre entre especies bien establecidas y bien adaptadas a un determinado ambiente, no será de trascendencia. En tanto que si la hibridación ocurre bajo condiciones rápidamente cambiantes, o en una región que ofrece nuevos hábitats a la descendencia formada, estos híbridos sobrevivirán y contribuirán en mayor o menor grado al progreso evolutivo del grupo.
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2.2
Consecuencias e importancia de la hibridación Las consecuencias de los procesos de hibridación en la evolución, dependen en
general de las condiciones en las que ocurran. Si dos especies ocupan nichos ecológicos a los cuales están muy adaptadas, entonces se producen nuevas combinaciones genéticas probablemente menos adecuadas al ambiente; en cambio, si la hibridación tiene lugar en hábitats inestables, con un medioambiente cambiante y con gran cantidad de híbridos formados, entonces podrá ocurrir una mejor adaptación de algunos de ellos al ambiente (Donoso, 1993).
La ruptura de los mecanismos interespecíficos de aislamiento, evidenciada por el establecimiento de un puente genético entre especies que presentan la hibridación introgresiva, puede llevar a un aumento de la variación total, y a una disminución de las diferencias interespecíficas (Bell, 1968).
La hibridación puede considerarse de esta manera, como una de las fuentes de variación en las plantas (Stebbins, 1950). La introgresión puede promover fuertes ventajas selectivas a través del suministro de características adaptativas de una especie a otra (Stutz y Thomas, 1964; citado por Donoso, 1993)
Sin embargo, la hibridación entre especies bien adaptadas, y en medioambientes estables, no tendrá mayor significación para las especies, o incluso pudiese ser perjudicial. En algunos casos la hibridación puede provocar alteraciones del desarrollo vegetativo, por existir diferentes complejos genéticos coadaptados en especies arbóreas, llegando a provocar anomalías como clorosis en híbridos, u otros tipos de debilidad híbrida pronunciada. Un ejemplo de la primera situación son los híbridos entre Acacia decurrens y A. molissima (Stern y Roche, 1974).
La hibridación introgresiva modifica y amplifica el patrón de variación de ciertas especies, produciendo convergencias entre especies distintas, por lo que no corresponde a una forma de producir nuevas características morfológicas o fisiológicas, ni con ella se logra un progreso evolutivo. Sin embargo, existe evidencia que en algunos casos la 14
hibridación puede derivar en el origen de tipos de individuos nuevos, que pueden representar varios grados de divergencia o diferencia de sus poblaciones parentales (Stebbins, 1950; Potts y Reid, 1988).
En ciertos casos, a partir de la hibridación entre subespecies preexistentes, pueden surgir razas o nuevas subespecies, dado un nuevo hábitat intermedio disponible para ellos. Otra forma en la cual la hibridación puede derivar en un progreso evolutivo, es a través de una estimulación en la tasa de mutación (Stebbins, 1950).
Dado que la hibridación puede implicar un aumento en los patrones de variación en las poblaciones, puede llegar a dar origen a una superioridad de los híbridos formados por sobre las especies padre, respecto de características de crecimiento en tamaño, generalmente altura, o cualquier propiedad posible de ser medida en términos de, por ejemplo, calidad de la madera, resistencia a temperaturas extremas, o capacidad de resistencia frente a plagas o enfermedades. Esta superioridad se denomina vigor híbrido o heterosis (Zobel y Talbert, 1994).
Se ha evidenciado casos de heterosis, dentro de los más diversos géneros forestales. Algunos ejemplos de importancia corresponden a Larix decidua x leptolepis, con crecimientos notoriamente superiores al de las especies parentales (Wright, 1964a), al igual que Pinus caribaea var. hondurensis x elliotti; Pinus attenuata x radiata, que presenta mayor resistencia a condiciones de bajas temperaturas, o Populus tremuloides x tremula, que presenta mejor resistencia frente al ataque de royas del género Melampsora (Zobel y Talbert, 1994).
Estos individuos pueden ser bastante sobresalientes en algunos aspectos y en ocasiones las cruzas híbridas resultan en individuos raros que presentan características ajenas a la gama de especies progenitoras (Zobel y Talbert, 1994). Estos nuevos caracteres que pueden llegar a ser de utilidad, representan una valiosa fuente de variación eventualmente posible de emplear en programas de mejoramiento genético de especies forestales con diversos fines, tales como el logro de un mayor rendimiento en 15
crecimiento volumétrico, mejor calidad de la madera respecto de ciertas propiedades, resistencia frente a factores abióticos o mejor capacidad de respuesta ante plagas o enfermedades (Györfey, 1960; citado por Zobel y Talbert, 1994).
Otra forma por la cual la hibridación constituye una herramienta útil en el mejoramiento genético, es el hecho que permite la combinación de rasgos favorables o deseados pertenecientes a las especies (Wright, 1964a), o bien la incorporación de caracteres favorables de una especie hacia la otra, a través de la transferencia de uno o varios genes (Hadley y Openshaw, 1980).
Desde la perspectiva del estudio de las relaciones filogenéticas entre las especies arbóreas, sin duda el estudio de la ocurrencia de procesos de hibridación representa un valioso aporte a la taxonomía y clasificación de las mismas (Stern y Roche, 1974; Hadley y Openshaw, 1980). Es así como el descubrimiento de la condición híbrida natural de algunos taxones considerados anteriormente especies, ha contribuido a determinar correctamente su categorización taxonómica, como por ejemplo Nothofagus obliqua x glauca, considerada antes la especie N. leoni (Donoso y Landrum, 1979), Myrceugenia exsucca x lanceolata, anteriormente considerada como M. bridgesii (Landrum, 1975), o Populus tomentosa, que en realidad corresponde al híbrido P. alba x davidiana (Zhang et al., 1995).
Asimismo, la ocurrencia de hibridación permite inferir un alto grado de relación entre las especies que presentan dicho fenómeno, contribuyendo a aclarar su clasificación y taxonomía. En este tema, la posibilidad de una hibridación natural entre Laurelia sempervirens y L. philippiana, contribuiría a reafirmar el grado de relación evolutiva de las especies, significando un aporte a la discusión de la clasificación taxonómica de tepa, especie que ha sido propuesta como género monotípico separado de Laurelia, es decir de L. philippiana Looser a Laureliopsis philippiana (Looser) Schodde (Martínez-Laborde, 1983b).
16
2.3
Caracterización de Laurelia sempervirens y L. philippiana
2.3.1
Clasificación taxonómica Laurelia sempervirens (R. et P.) Tul., conocida comúnmente como Laurel, Tihue
o Trihue y Laurelia philippiana Looser, o Laureliopsis philippiana (Looser) Schodde, cuyos nombres comunes son Tepa, Laurela, Huahuán o Vauván; son dos especies de árboles nativos de importancia forestal en Chile. Estas dos especies pertenecen a la familia Monimiaceae, orden Laurales, subclase Magnoliidae, clase Magnoliopsida o Dicotiledóneas, y división Magnoliophyta o Angiospermas, siguiendo la clasificación taxonómica de Cronquist (Watson y Dallwitz, 1992).
2.3.2
Descripción de las especies L. sempervirens y L. philippiana son árboles siempreverdes de gran similitud en
su aspecto general, sin embargo existen numerosos rasgos específicos que permiten reconocerlas como especie. Estas características se presentan comparativamente en el cuadro 1, según antecedentes de Donoso y Landrum (1973), Muñoz (1980), Donoso (1981a), Martínez-Laborde (1983a), Rodríguez et al (1983), Donoso (1991) y Hoffmann, (1991). CUADRO 1. Comparación de las características de las especies Laurelia sempervirens y L. philippiana (continúa en la página siguiente). Característica Dimensión máxima Ramas
Corteza
L. sempervirens
L. philippiana
Altura
40 m
30 m
D.A.P.
2m
1,4 m
Disposición
Generalmente ascendentes
Espesor
Generalmente gruesa (1,5 cm)
Ramas descendentes en sección inferior de copa Generalmente delgada (0,5 cm)
Color
Claro
Gris claro
Olor
Aromática
Suavemente aromática
Textura
Placas algo circulares con concavidades, que se desprenden (en individuos adultos)
Lisa, no se desprende en forma natural
17
CUADRO 1 (continuación). Comparación de las características de las especies Laurelia sempervirens y L. philippiana (continúa en la siguiente página). Característica
Olor
Coriáceas Lustrosas Borde no revoluto Muy aromáticas
Disposición
Opuestas, decusadas
Opuestas, decusadas
Dimensión
Largo 5 - 10 cm Ancho 2,5 - 5 cm
Forma Color
Largo 4 - 9 cm Ancho 1,5 - 4 cm Oblongas, elípticas a oval-lanceoladas, Elíptico-ovadas, oblongas u oblongo-lanceoladas atenuadas hacia la base Verde brillante, envés más claro Verde oscuro en el haz, envés más claro
Ápice
Dentado a suavemente aserrado hacia los dos tercios superiores Dientes poco notables con glándulas de aceites aromáticos Agudo, redondeado u obtuso a semiobtuso
Aserrado Dientes notorios desiguales en tamaño con glándulas de aceites aromáticos Senos redondeados Agudo a semiobtuso
Base
Cuneada
Cuneada
Borde o Margen
Pubescencia
Pecíolo Tipo
Generalmente glabras Pelos simples en ambas caras Generalmente tercio inferior del nervio medio del envés pubescente Largo 10 mm Pubescentes, aplanados, ligeramente canaliculados Diclinomonoico (flores masculinas y femeninas)
Pelos simples en haz, malpighiáceos en el envés
Largo 5 - 10 mm Andromonoico (flores masculinas y hermafroditas)
Pedúnculo
Inflorescencia en panículas o racimos axilares de Racimos 5 a 20 flores Vellosos Vellosos Largo: 4 a 28 mm Largo: 2 a 3 mm Flor masculina Flor masculina
Corola
4 tépalos
Receptáculo
Asciatiforme, pubescente (pelos simples)
Disposición
Flores
L. philippiana
Coriáceas Lustrosas Borde generalmente revoluto Muy aromáticas
Lámina
Hojas
L. sempervirens
Estambres Anteras
6 - 12 Color rojizo, de 3 mm de largo 2 glándulas nectaríferas basales cada uno Ovoides, de ápice agudo Flor femenina
Perianto campanulado partido en 7 - 9 lóbulos Pubescente (simples al interior, malpighiáceos en el exterior ) 4 de 1 a 1,5 mm de largo 2 glándulas nectaríferas basales cada uno De ápice truncado Flor hermafrodita
Gineceo
Numerosos pistilos con glándulas nectaríferas basales Numerosos carpelos (20-60)
Estambres
Numerosos estaminodios< 2 mm
Receptáculo
Cupuliforme, agranda al fructificar
18
7 a 11 carpelos 4 estambres verdaderos de 2 - 3 mm y abundantes estaminodios Cupuliforme a urceolado, agranda al fructificar
CUADRO 1 (continuación). Comparación de las características de las especies Laurelia sempervirens y L. philippiana. Característica Tipo
Aquenios libres
Tamaño
Contraído en la parte superior Leñoso al madurar Largo: 15 a 20 mm
Contraído en la parte superior Leñoso al madurar Largo: 7 a 9 mm
Receptáculo
Acrescente
Acrescente
Forma
Forma Tamaño
2.3.3
L. philippiana
Aquenios libres
Fruto
Semilla
L. sempervirens
Oval-fusiformes De estilo permanente Cubiertas de pelos (de 5 - 6 mm de largo) desparramados horizontalmente o hacia abajo Largo: 14 a 20 mm
Ovoides Densamente cubiertas de pelos Largo: 9 a 10 mm
Distribución natural de L. sempervirens
Laurel es una especie cuya distribución natural se extiende por la Cordillera de Los Andes, entre las Provincias de Colchagua (34º40' latitud sur) y Llanquihue (41º30' latitud sur), en tanto que por la Cordillera de la Costa se presenta desde la localidad de Tanumé en la Provincia Cardenal Caro (34º10' latitud sur) hacia el sur (Novoa, 1999), siendo más abundante desde el río Itata (36º30' latitud sur) hasta la provincia de Llanquihue, creciendo también en el valle central en el último tramo mencionado (Donoso y Landrum, 1973; Donoso, 1991; Hoffmann, 1991). Ver figura 1.
Hacia 1902 se sostuvo también su presencia en Argentina, desmintiéndose posteriormente por tratarse de un error de identificación (Correa, 1984). Se trata entonces, de una especie endémica de Chile.
Hacia el norte de su distribución, la especie se restringe a sitios cercanos a cursos de agua, en quebradas y áreas húmedas en bosques higrófitos, donde se asocia con roble, coihue, olivillo, canelo, raulí, lingue, avellano, arrayán, mañío de hojas largas y algunas especies esclerófilas, además de diversas especies de arbustos, siempre a altitudes menores a 700 m.s.n.m. (Donoso, 1981a; Donoso, 1981b; Donoso, 1991; Novoa, 1999).
19
FIGURA 1. Rango latitudinal de distribución de Laurelia sempervirens y L. philippiana.
Avanzando hacia el sur en su área de desarrollo, laurel se encuentra en forma natural en suelos húmedos más o menos profundos. Participa de preferencia junto a roble y lingue en el llano central y está acompañado también en ciertos sectores por ulmo, olivillo, coihue, mañío de hojas largas, avellano, raulí y otras especies arbóreas menores y arbustivas en los faldeos de las cordilleras, a altitudes menores a 500 m.s.n.m., llegando incluso al nivel del mar (Donoso y Landrum, 1973; Donoso, 1991).
20
Laurel es una especie que siempre integra bosques mixtos, raras veces se le encuentra formando grupos puros, los cuales son de corta extensión (Hoffmann, 1991).
2.3.4
Distribución natural de L. philippiana
La distribución natural de tepa por la Cordillera de Los Andes, abarca territorio chileno entre las Provincias de Bío-Bío (37º30' latitud sur) hasta la Provincia Capitán Prat (47º30' latitud sur) y una porción en sector argentino entre las provincias de Neuquén (40º15' latitud sur) y Chubut (42º40' latitud sur), mientras que por la Cordillera de la Costa, crece hacia el sur a partir de los faldeos de la Cordillera de Nahuelbuta, a los 38º de latitud sur (Donoso y Landrum 1973; Correa, 1984; Hoffmann, 1991, Donoso, 1993). Ver figura 1.
Tepa se desarrolla de preferencia en sectores de altitudes medias de la Cordillera de Los Andes. Se presenta entre 650 y 1000 m.s.n.m. en el área de Laguna del Laja y hacia el sur desciende levemente en altitud. Es así que en la Provincia de Valdivia crece en forma natural entre los 500 y 900 m.s.n.m, con un óptimo ecológico entre 600 y 700 m.s.n.m. No obstante, en el área costera de este tramo, su presencia desciende hasta altitudes menores a 300 m.s.n.m., e incluso en la vertiente occidental de la Cordillera de la Costa llega a menos de 60 m.s.n.m. (Donoso, 1993).
Hacia la mitad meridional de su área de distribución, tepa desciende progresivamente en altitud, creciendo entre los 200 y 500 m.s.n.m. en la Provincia de Palena, mientras que en el extremo sur de su área de presencia natural, se encuentra en sectores costeros de escasa altitud, en la zona litoral de la Región de Aysén, donde llega a formar bosques puros de la especie (Innes, 1991; citado por Donoso, 1993).
El amplio rango latitudinal que abarca tepa, con diez grados de latitud, en relación con la variación de los factores climáticos y edáficos, determinan que ésta se asocie con diversas especies, de manera que hacia el norte participa principalmente junto a coihue común y raulí conformando el Tipo Forestal Coihue-Raulí-Tepa acompañado 21
en ciertos sectores por trevo, tineo, mañío hembra, olivillo; mientras que hacia el sur, en los bosques del Tipo Forestal Siempreverde comparte el sitio con una amplia gama de especies como coihue común, ulmo, mañío de hojas punzantes, mañío hembra, trevo, canelo, luma, melí, arrayán y lingue, en tanto que hacia el extremo sur del Tipo Forestal Siempreverde, coexiste con coihue común, coihue de Chiloé, canelo y mañío de hojas punzantes (Donoso, 1981b).
2.3.5
Antecedentes sobre la ecología de las especies Con relación al gradiente de tolerancia a la sombra, y ligado a ello, los
requerimientos de humedad, tepa y laurel son especies tolerantes a la sombra. Tepa se caracteriza por su marcada tolerancia, mientras que laurel es semitolerante o de tolerancia intermedia (Donoso, 1981a).
Ambas especies poseen plántulas de germinación epígea (Donoso, 1981a). Laurel y tepa son especies cuya polinización se produce por medio de entomofilia, dado que en sus estructuras florales están equipadas con nectarios (Donoso, 1981a). La floración generalmente se produce durante septiembre en tepa, mientras que laurel florece entre octubre y noviembre (Donoso, 1991).
Además de la reproducción sexual, ambas se reproducen asexualmente mediante rebrotes de raíz y tocón. La dispersión de las semillas de las dos especies ocurre por anemocoría, gracias al vilano piloso que poseen sus frutos (Donoso, 1993).
Las dos especies presentan una tendencia a regenerar aprovechando claros de extensión pequeña, ante los cuales reaccionan con relativa rapidez (Veblen et al., 1979; citado por Donoso, 1993). Dentro de las diferentes situaciones de desarrollo de cada especie, ambas son capaces de penetrar de manera gradual en los doseles superiores, los que van ocupando a medida que los árboles de esos doseles caen, producto de mortalidad o alteraciones exógenas naturales.
22
La cantidad de luz o sombra constituye en ambas especies un importante factor para la sobrevivencia en rodales naturales. La acción del ganado doméstico actualmente constituye un elemento importante en la mortalidad de la regeneración (Donoso, 1993). 2.3.6
Importancia de L. sempervirens y L. philippiana Las especies en estudio corresponden a componentes importantes de los bosques
nativos de Chile, que a través de sus amplias distribuciones integran diferentes tipos de bosques. Es así que laurel participa en comunidades forestales de los tipos Roble-Hualo, Roble-Raulí-Coihue, y en sectores de baja altitud de bosques del tipo forestal Siempreverde, con una importancia variable tanto en densidad como en área basal. Lo mismo ocurre con tepa, que compone los tipos forestales Roble-Raulí-Coihue, CoihueRaulí-Tepa, y Siempreverde, llegando a ser de gran importancia en estos dos últimos, ya que incluso llega a formar rodales puros de la especie hacia el límite sur de su distribución (Donoso, 1981a).
La madera de ambas especies es de utilidad, siendo ambas muy apreciadas en la carpintería, se les utiliza en revestimientos interiores, puertas interiores, ventanas, cielos, molduras y encofrados. Su principal uso corresponde a la fabricación de tableros contrachapados y chapas. Igualmente es muy apreciada en la construcción de viviendas y fabricación de piezas y juguetes (Díaz-Vaz, 1988a; Díaz-Vaz 1988b).
La madera del laurel ha sido ampliamente explotada desde tiempos pasados, hecho que ha determinado que las existencias de madera de esta especie se vean hoy fuertemente mermadas, prácticamente eliminadas de las zonas del valle central hacia la zona sur de su área de distribución. En el caso de la madera de tepa, ésta presenta muchas veces un falso duramen, asociado a un olor persistente y desagradable producto de colonias de bacterias del genero Pseudomonas (Poblete et al., 1991), principal razón por la cual no se le utilizó en el pasado con igual intensidad que la madera de laurel, pese a que el resto de sus características físicas son similares. No obstante, en la actualidad ésta es utilizada en el mercado nacional y también para exportación, mediante adecuadas técnicas de secado. 23
3. MATERIAL Y MÉTODO
3.1
Poblaciones en estudio Para abordar la hipótesis de hibridación entre L. sempervirens y L. philippiana,
es necesario considerar un área donde se desarrollen poblaciones de ambas especies, ocurra superposición de sus rangos de distribución, y en la cual se encuentren, además, individuos con características aparentemente intermedias entre las dos especies, presumiblemente híbridos.
Las zonas de contacto de poblaciones de laurel y tepa ocurren en sectores relativamente puntuales, como en ciertos sectores de faldeos cordilleranos de los Andes cercanos a riberas de lagos en la Provincia de Valdivia, Región de los Lagos; mientras que en la Cordillera de la Costa, en algunas zonas de altitud cercana a los 300 m.s.n.m., en áreas de transición entre bosques del tipo forestal Roble-Raulí-Coihue y bosques del tipo forestal Siempreverde.
Las poblaciones en estudio corresponden a un área dentro de esta última situación, a 10 km al sureste de la ciudad de Valdivia en el Sector Llancahue (ver figura 2), comprendiendo los predios Llancahue y Senderos del Bosque. En este sector, se individualizó en terreno, 29 individuos que presentan rasgos de la morfología foliar aparentemente intermedios entre las especies, conformando el conjunto de presuntos híbridos. En el mismo sector, además, se identificó una población de L. sempervirens en un área de menor altitud en el predio Senderos del Bosque y una población de L. philippiana en una de mayor altitud, en el predio Llancahue (ver cuadro 2).
Como patrón de comparación de las poblaciones puras de cada especie, y ante la posibilidad de compatibilidad reproductiva de las especies y que los eventuales procesos de hibridación introgresiva pudiesen afectar la naturaleza de las poblaciones puras, se hizo necesario considerar un parámetro comparativo de dichas poblaciones. A raíz de esto, se incluyó en este estudio, una población pura de cada especie. El calificativo de 24
pura, se refiere a que cada población está conformada por individuos cuya autenticidad de especie es segura, dado el aislamiento geográfico con la otra, y por encontrarse en sitios de crecimiento natural exclusivo para cada una, permitiendo suponer entonces, un aislamiento genético de cada población respecto de la otra especie.
73º
A
40º B
C
FIGURA 2. Localización de las poblaciones estudiadas. A corresponde al sector Llancahue (comuna de Valdivia); B indica el predio Santa Isabel (comuna de Paillaco), mientras que C muestra el sector Aguas Calientes (Parque Nacional Puyehue). La población de L. sempervirens pura se ubica en el predio Santa Isabel, a 7 km al oeste de Paillaco, Comuna de Paillaco, Provincia de Valdivia (ver figura 2), a una 25
altitud aproximada de 100 m.s.n.m, en el valle central. Corresponde a una población de laurel que participa en un renoval de roble, del tipo forestal Roble-Raulí-Coihue. La población pura de L. philippiana, en tanto, está incluida en un bosque del tipo forestal Siempreverde, de la Cordillera de los Andes, a una altitud aproximada de 600 m.s.n.m. en el sector Aguas Calientes del Parque Nacional Puyehue, en la Comuna de Puyehue, Provincia de Osorno (figura 2). En esta situación, tepa se encuentra junto a coihue común, tineo, ulmo, y mirtáceas como arrayán. CUADRO 2. Número de individuos incluidos en la muestra, según población y sector, incluyendo los códigos empleados en la identificación. Sector
Llancahue (Valdivia)
Paillaco Aguas Calientes
Predio (código)
Población (código)
Número de Individuos
Presuntos híbridos (N)
29
Los senderos del bosque
(1)
Llancahue
(2)
Los senderos del bosque
(1)
L. sempervirens
(S)
31
Llancahue
(2)
L. philippiana
(P)
29
Santa Isabel
(5)
L. sempervirens
(S)
31
Parque Nacional Puyehue
(6)
L. philippiana
(P)
31
Cada individuo fue etiquetado mediante una banda naranja con una identificación que incluye el código del sector, el código de la población según especie (según los indicados en el cuadro 2) y un número correlativo.
3.2
Estudio de características morfológicas y anatómicas Para determinar si una población natural es de origen híbrido, es necesario
primero conocer completamente las características morfológicas y anatómicas presentes en el fenotipo de cada especie parental, así como los límites de la variación de las mismas (Zobel y Talbert, 1994). En los estudios para detectar procesos de hibridación,
26
por lo tanto, se requiere un completo espectro de los caracteres de cada individuo, según la representación del número de individuos o poblaciones (Benson, 1962).
En la selección de los caracteres o rasgos a emplear, éstos deben ser atributos manifiestos, susceptibles de ser evaluados en un organismo, y que presenten diferencias entre las poblaciones (Bell, 1968). La comparación entre las poblaciones con la finalidad de detectar híbridos puede ser hecha según alguna propiedad o rasgo distintivo referido a alguna estructura, fisiología o comportamiento del organismo que se pueda contar, medir o catalogar, comprendiendo datos de índole bioquímica, fisiológica, citológica y morfológica tradicional. Una característica será útil cuando no esté sujeta a gran variación por la acción de algún factor ambiental, y proceda de una base genética tal, que haga improbable que cambie fácilmente (Heywood, 1968).
La hibridación se manifiesta según el reconocimiento de intermediación morfológica (Rushton, 1993), dentro del cual, la morfología floral es de importancia ya que no es alterada por factores del medioambiente, siendo importante también la morfología del fruto y semilla. Las características vegetativas, referidas a las hojas, tales como la forma, distribución, duración y venación de las hojas son también elementos de valor al estudiar procesos de hibridación, al igual que la forma, textura, y modo de fijación de las hojas. Asimismo, son útiles ciertas características relacionadas con el ápice, margen y base de la hoja. La proporción de los tamaños, correlacionado a la forma, resulta de más valor que los tamaños absolutos que pueden sufrir influencias por el medio. En el caso de especies que carecen de pautas distintivas de variación floral, o ausencia de ellas, las hojas a menudo brindan los principales medios de identificación (Bell, 1968).
Las forma de las células, en general no es influida de manera apreciable por los cambios del medio, siendo relativamente uniformes, a pesar de modificaciones superficiales provocadas por el medio en tamaño, espesor de las paredes o espacio intracelular. Los estomas presentan diversas variaciones que pueden ser usadas con fines taxonómicos, tales como las formas de distribución de las células estomáticas y anexas. 27
Características epidérmicas como la forma de las células y pautas en el grosor de la cutícula, pueden ser lo suficientemente distintivas como para contribuir en evaluaciones taxonómicas (Bell, 1968).
Por otro lado, el tipo de pubescencia también representa una característica posible de registrar, empleada en análisis de híbridos, y es un elemento que no estaría influenciado por el ambiente (Bell, 1968).
L. sempervirens y L. philippiana son especies que poseen similitud en aspecto general, con caracteres exteriores tan semejantes, que hacen difícil su diferenciación (Urban, 1934). Sin embargo, existen caracteres distintivos con relación a la morfología floral principalmente, y también en cuanto a la morfología foliar de ambas.
En una etapa preliminar de este estudio, se consideró la amplia gama de elementos que distinguen las especies, con el fin de precisar algún patrón de intermediación en los caracteres morfológicos para definir la población presuntamente híbrida. El grupo de individuos detectados como posibles híbridos se definió en función de caracteres morfológicos foliares. Los aspectos de la morfología floral, en tanto, no se consideran en el presente estudio, debido a que ninguno de los individuos identificados como híbridos presuntos, en función de las características foliares, ha florecido en las temporadas 1997 y 1998.
Luego de la observación preliminar de las poblaciones incluidas en el estudio se procedió a definir el conjunto de características útiles en la distinción de las especies. Dentro del conjunto de rasgos considerados, algunos son medibles cuantitativamente, mientras que otras características son de apreciación cualitativa. La nómina de características cuantitativas a registrar a partir de las hojas, se muestra en el cuadro 3, mientras que en la figura 3 se ilustra el detalle de caracteres de la morfología foliar.
28
CUADRO 3. Rasgos cuantitativos de la morfología foliar, y unidades de registro. Rasgo
Notación
Unidad
a)
Largo total de la hoja.
T
mm
b)
Largo de la lámina.
l
mm
c)
Ancho de hoja en el punto medio de la lámina.
a
mm
d)
Ancho de hoja en el punto medio de la primera mitad de la lámina.
a'
mm
e)
Ancho de hoja en el punto medio de la segunda mitad de la lámina.
a''
mm
f)
Número de dientes a cada costado de la lámina.
s', s''
unidad
g)
Número de nervaduras secundarias principales(1) a cada costado.
n', n''
unidad
h)
Distancia desde el comienzo superior de la lámina hasta el primer par de dientes.
da
mm
i)
Distancia desde el comienzo inferior de la lámina hasta el último par de dientes.
db
mm
j)
Ángulo del ápice. Formado por el primer diente del costado izquierdo, el ápice de la hoja y el primer diente del costado derecho.
αa
grados
k)
Ángulo de la base. Formado por el último diente del costado izquierdo, el ápice de la hoja y el último diente del costado derecho.
αb
grados
Los rasgos cualitativos se registraron a través de observación directa, estableciendo categorías apuntadas por medio de puntajes, cuyos valores se presentan en el cuadro 4.
(1)
Se entenderá como nervadura secundaria principal a toda nervadura que derive del nervio medio, sea visible a simple vista y cruce la línea imaginaria que divide en partes iguales la superficie entre el nervio medio y el costado de la lámina.
29
FIGURA 3. Representación gráfica de los rasgos cuantitativos de la morfología foliar, según el cuadro 3.
CUADRO 4. Rasgos cualitativos de la morfología foliar, y valores según categorías de registro. Rasgo
Cualidades § § § §
Qas
Qep
Forma del diente del borde de la lámina, con relación a la posición de la glándula en § el diente. §
Forma del borde de las células epidérmicas del envés de la hoja, a través de corte tangencial de la lámina bajo microscopio.
§ § § §
Qtp Tipo de pilosidad Nivel de pilosidad en las Qpy yemas foliares.
§ § § §
Curvo y poco agudo, aserrado suave. Con la glándula próxima al seno del diente. Aserrado algo marcado Con la glándula a veces hacia fuera de la lámina, otras próxima al seno del diente. Pronunciado y agudo. Con la glándula hacia fuera de la lámina, alejada del seno redondeado del diente, y situada en la punta del diente. Borde recto a poco sinuoso, generalmente sin lóbulos, o de un número menor a 5. Borde algo sinuoso, con número de lóbulos entre 5 y 8. Borde muy sinuoso, con número de lóbulos mayor de 8. Sólo pelos simples en haz y envés de la hoja. Pelos simples en haz y pelos simples y/o pelos malpighiáceos en el envés de la hoja. Yemas glabras a escasamente pubescentes. Yemas algo pubescentes a pubescentes. Yemas muy pubescentes.
30
Valor 0 0.5 1 0 0.5 1 0 1 0 0.5 1
El proceso de registro de los rasgos morfológicos de las estructuras vegetativas incluyó la extracción de ramillas, conservando su individualización de acuerdo a cada etiqueta en terreno. Con el objeto de minimizar el efecto que pudieran eventualmente ejercer las variables ambientales en los aspectos en estudio, se consideró extraer las ramillas a partir del tercio inferior de la copa de cada árbol, cuidando que este follaje correspondiera a una sección de la copa orientada hacia el oeste o hacia el este, evitando aquellas expuestas hacia el norte o hacia el sur. Las ramas de cada individuo luego de ser extraídas, fueron etiquetadas y almacenadas en bolsas plásticas individuales, para su posterior herborizado.
Para cada individuo, se capturó la variabilidad individual de sus características a considerar en el estudio, mediante la extracción de ramillas que sumaran al menos 16 hojas sanas y completamente desarrolladas, por cada individuo. Esta cantidad de hojas a incluir por individuo, surgió a partir de un pre-muestreo realizado para la relación largoancho de la lámina y número de dientes por hoja, para un 5% de error, con un 95% de confianza. Además, de cada individuo se conservó algunas hojas en un compuesto fijador de tejido vegetal F.A.A., para la posterior visualización de sus caracteres microscópicos considerados. A partir de las características morfológicas registradas, la comparación del grupo de individuos presuntamente híbridos con aquellos de las poblaciones puras de las especies, se hizo en función de la relación existente entre las características observadas en una misma hoja, a través de coeficientes de relaciones morfométricas y no según valores absolutos de tamaño, ya que estos últimos podrían estar sujetos a variación por efectos ambientales. Los coeficientes que representan cada ejemplar, listados en el cuadro 5, se obtuvieron a partir del promedio de los valores de las 16 hojas registradas por cada uno.
31
CUADRO 5. Coeficientes de relación morfométrica empleados en el análisis de características de la morfología foliar. Coeficiente
Notación
Fórmula
1) Ángulo del ápice de la lámina.
ang a
αa
2) Ángulo de la base de la lámina.
ang b
αb
3) Número de dientes en el margen de la lámina.
as
∑(s', s'')
4) Número de nervaduras secundarias en la lámina.
n
∑(n', n'')
5) Relación entre ancho medio de lámina y largo total de hoja.
a/T
(a/T)
6) Relación entre largo de la lámina y largo total de la hoja.
l/T
(l/T)
7) Relación entre el largo de la lámina y longitud del peciolo.
l/p
(l/(T-l))
8) Relación entre el largo de la lámina y número de nervaduras secundarias principales.
l/n
(l/(∑ ∑(n', n''))
9) Relación entre el largo de la lámina y número de dientes en margen.
l/s
(l/(∑ ∑(s', s''))
10) Relación entre distancia da y longitud del peciolo.
da/p
(da/(T-l))
11) Relación entre distancia db y longitud del peciolo.
db/p
(db/(T-l))
12) Relación entre distancia da y largo de la lámina.
da/l
(da/l)
13) Relación entre distancia db y largo de la lámina.
db/l
(db/l)
14) Relación entre distancia da y el ancho medio de la lámina.
da/a
(da/a)
15) Relación entre distancia db y el ancho medio de la lámina.
db/a
(db/a)
16) Relación entre el número de dientes en el margen y número nervaduras secundarias en la lámina.
Ss/Sn
∑(s',s'')/∑ ∑(n',n'')
17) Coeficiente de forma de lámina.
ka
(a-∑ ∑(a', a''))/a
18) Tipo de aserrado.
Qas
-
19) Forma de células de la epidermis inferior.
Qep
-
20) Tipo de pilosidad foliar
Qtp
-
21) Nivel de pilosidad en yemas foliares.
Qpy
-
32
3.2.1
Análisis mediante Índice de Hibridación Una vez generada la matriz de datos de coeficientes de morfología foliar, se
consideraron los coeficientes que más contrastan entre las especies puras, en la confección del Índice de Identidad de Especies o Índice de Hibridación (IH), según Anderson (1968).
Se asignó un puntaje con valor 0 para cada característica dentro del rango representativo de L. sempervirens, mientras que se otorgó un puntaje con valor 1 para cada característica que ajustó a L. philippiana. La sumatoria de los valores determinó el valor del IH de cada individuo, con un valor 0 ó cercano a 0, para laurel y un valor cercano a m para tepa (siendo m el número de variables a examinar en la confección del IH). Siguiendo a Anderson (1968), el conjunto de individuos que posea valores de IH intermedios entre 0 y m, pueden ser considerados híbridos.
3.2.2
Análisis mediante Diagrama de Dispersión Otra forma de detección de los híbridos, empleada en este estudio, corresponde al
Diagrama de Dispersión de Anderson (1968). Para su confección fue necesario graficar la dispersión del total de individuos en función del par de variables cuantitativas que acentuaran de mejor forma las diferencias entre las especies típicas. Además, los individuos representados como puntos, rombos o círculos en el gráfico, se ilustraron mediante símbolos, líneas o apéndices, destacando así los eventuales híbridos incluidos en la muestra.
3.2.3
Dendrograma a partir de análisis de cluster El estudio también consideró un análisis de conglomerados o clusters, el cual
corresponde a un análisis multivariado, que permite identificar entidades o grupos de acuerdo con las características que estos posean (Hair et al., 1992). 33
El análisis de clusters permite identificar y clasificar objetos de manera de identificar elementos muy similares entre ellos en cada grupo, lo que se representa en un dendrograma, en el cual cada rama reúne individuos, en este caso según la similaridad de sus coeficientes morfométricos. Este tipo de análisis, ampliamente utilizado en estudios taxonómicos, permite establecer grupos homogéneos dentro de cada rama y a la vez heterogéneos entre las ramas resultantes del análisis, para un nivel o criterio determinado (Hair et al., 1992).
Este análisis se efectuó a partir de la matriz de coeficientes morfométricos relativizados a escalas de 0 a 100, para los rangos de mínimo y máximo de cada coeficiente. La matriz resultante del procedimiento descrito, se procesó mediante el software STATISTICA.
El procedimiento de agrupación jerárquica empleado fue por Vinculo Completo, ante el supuesto que existían grupos diferentes dentro de la matriz de coeficientes morfométricos relativizados (Dillon y Matthew, 1984), entre los cuales el programa computacional midiera las distancias más lejanas entre los clusters formados por los individuos similares según los coeficientes.
La unidad escogida de medición de las distancias entre conglomerados de individuos formados fue la Distancia Euclidiana, unidad estándar de distancia entre clusters. La elección se debe a que este tipo de distancias no requiere supuestos respecto del nivel de correlación entre las variables empleadas, o coeficientes morfométricos en este caso. Debido a las múltiples opciones de correlación interna entre los coeficientes morfométricos, y a la incapacidad de determinar ponderaciones de pesos relativos para cada coeficiente, es que se optó por esta, la medida más conservadora.
En el dendrograma resultante, en tanto, se esperó una división gráfica entre las poblaciones de L. sempervirens y las de L. philippiana según la morfología foliar, eventualmente haciendo posible la detección de individuos híbridos o grupos de ellos, según el criterio de intermediación morfológica, los cuales han de mostrarse en un nivel 34
medio de división, luego de la segregación en el dendrograma, de las poblaciones de especies puras.
3.2.4
Análisis factorial por componentes principales El conjunto de coeficientes morfométricos relativizados se estudió mediante un
Análisis Factorial del tipo por Componentes Principales (PCA). La ventaja de este análisis es que permite reducir y sintetizar las variables de estudio, en este caso los 21 coeficientes de morfología foliar considerados, con el objeto de observar el grado de relación entre los individuos, según los coeficientes condensados en factores, que determinan el grado de acercamiento de los individuos investigados frente al conjunto de coeficientes.
A partir de los factores que explicaron mejor el grado de relación de los individuos en función de su morfología foliar, se determinó cuales variables presentaron mayor correlación con cada factor, es decir, se identificaron los coeficientes que relacionan o segregan los individuos y por ende las poblaciones en estudio.
El análisis señalado se efectuó con la ayuda del software STATISTICA. Se esperó que destacaran los grupos más disímiles de individuos según los coeficientes, es decir los individuos de L. sempervirens en un extremo, y de L. philippiana en el otro, mientras que de los eventuales individuos con características morfológicas intermedias, se esperó su representación en el espacio gráfico entre los grupos más disímiles.
3.3
Estudio de compuestos secundarios de las hojas
Una técnica que ha demostrado ser de gran utilidad en la detección de híbridos vegetales, es el estudio de caracteres químicos como la presencia de compuestos secundarios en las hojas. Estos compuestos poseen un valor taxonómico notable, y a través de ellos es posible realizar una distinción entre poblaciones. Esta técnica es especialmente útil cuando es difícil interpretar las diferencias entre los caracteres 35
morfológicos de las especies involucradas y presuntos híbridos, llegando a ser de mayor eficacia en los casos en que los híbridos tienen un parecido estrecho con alguna de las especies parentales o cuando existe un elevado grado de retrocruzamiento, lo que determina una mayor dificultad en la diferenciación de las poblaciones (Heywood, 1968).
Los compuestos químicos se pueden estudiar mediante técnicas de cromatografía que separan los constituyentes de ciertos metabolitos vegetales, dentro de los cuales se pueden considerar ciertos compuestos secundarios de bajo peso molecular, subproductos de los principales procesos metabólicos, como por ejemplo los flavonoides (Heywood, 1968).
Los flavonoides son un gran grupo de pigmentos vegetales, generalmente dentro de la gama del amarillo, de gran difusión en el reino vegetal, se encuentran en todos los órganos de las plantas superiores, especialmente en las hojas y botones florales (Taiz y Zeiger, 1991; Montes et al., 1992). Estos compuestos poseen carácter específico, de tal forma que de las muestras extraídas de las plantas, es posible obtener un perfil cromatográfico típico o cromatograma que caracterizará a cada población o especie.
Esta especificidad le brinda a estos compuestos un elevado valor taxonómico para el análisis de híbridos si se obtienen desarrollos cromatográficos claramente diferenciados para cada especie. Cada compuesto en particular tendrá una posición característica en la serie de puntos o manchas coloreadas del cromatograma. Para realizar la distinción, no es necesario averiguar cuáles son en particular los compuestos que participan (Bell, 1968).
La técnica para la detección de los compuestos mencionados se denomina cromatografía bidimensional en capa fina de celulosa y para su empleo en el presente estudio, se consideró los siguientes pasos, según Domínguez (1975) y comunicación personal de Rolando Martínez(2). (2)
Rolando Martínez, Instituto de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Austral de Chile, Valdivia.
36
a) Extracción: Se extrajo una cantidad aproximada de 10 a 15 hojas por individuo, de la misma sección del follaje de la cual se tomaron las ramillas para el estudio de características morfológicas, guardándolas en sobres de papel para su posterior secado, evitando así su descomposición. Para cada individuo se tomó la mencionada cantidad estándar de biomasa de hojas y se realizó un extracto en metanol de acuerdo a Heywood (1968), por un período de 48 horas dentro de un Erlenmeyer, para disolver los compuestos de las hojas.
b) Concentrado: El extracto resultante de los compuestos vegetales, se trató en un rotavapor al vacío hasta lograr un concentrado.
c) Sembrado de placas: Se depositó el concentrado en una cromatoplaca de capa fina de celulosa de 20 por 20 cm, identificada con el código del individuo. La siembra se realizó a una distancia de 2 a 3 cm desde el vértice inferior izquierdo de cada placa.
d) Corrida en TBA: La placa sembrada se expuso al primer solvente (TBA, o solución de n-butanol, ácido acético glacial y agua destilada, en una relación en volumen de 3:1:1) al embeberla desde su arista inferior, dentro de una cámara cromatográfica. El solvente al ascender por capilaridad disolvió arrastrando los compuestos del concentrado sembrado. Debido a que cada compuesto fenólico se desplaza a diferentes velocidades por el papel, los diversos compuestos quedan separados entre sí en varios puntos a lo largo del eje en movimiento. Cuando la línea de saturación del solvente llegó al borde superior de la placa, ésta se retiró de la cámara con la solución y se puso a secar (Bell, 1968).
e) Corrida en HoAc: La placa se expone al segundo solvente (HoAc, o ácido acético glacial al 15%) de igual forma dentro de la cámara cromatográfica, pero a diferencia del paso anterior, esta vez se hizo correr en sentido perpendicular a la corrida con el primer solvente, desde su arista izquierda, para favorecer una mayor separación de los compuestos en dos dimensiones en la capa fina de celulosa, con un mayor grado 37
de subdivisión de manchas, según Bell (1968). Al igual que en el paso anterior, una vez que el solvente ascendió totalmente, se extrajo la placa de la cámara, dejando luego que el solvente evaporara por completo.
f) Detección de flavonoides: Los compuestos separados por el proceso se identificaron bajo luz ultravioleta y con exposición de la placa a vapores amoniacales que acentuasen la presencia de las manchas, permitiendo así diferenciar los compuestos que pudiesen tener ubicación cercana (Bell, 1968).
De cada placa analizada se registró la información presente en el cuadro 6, y a partir de los valores de distancia de migración del solvente y de migración de cada compuesto, se obtuvo el valor de la relación de flujo (Rf) para cada mancha en cada sistema de solvente, a través de la fórmula [1]. Esta relación posee la particularidad de ser reproducible para cada compuesto (Domínguez, 1975). CUADRO 6. Elementos a registrar a partir de cada mancha en los cromatogramas. Elemento
Unidad de registro
1) Presencia del compuesto.
Letra correlativa
2) Color de cada mancha.
Notación de color
3) Migración del solvente.
dms (mm)
4) Migración de cada compuesto según solvente.
ds (mm)
Rf ( m, s ) = dms ds
Rf ( m, s ) dms ds
[1]
= Relación de flujo del compuesto m con el solvente s = Distancia recorrida por el soluto m con el solvente s (mm) = Distancia recorrida por el solvente s (mm)
Una vez detectados las Rf de los compuestos en cada individuo, fue posible suponer la presencia de diferentes flavonoides según individuo, esperando compuestos 38
comunes para ambas especies, dada la cercanía filogenética entre ellas, y además esperando la detección de compuestos específicos de cada especie. Son estos últimos los que permiten la detección de los posibles híbridos, ya que debiesen incluir en su contenido los compuestos comunes de ambas especies, y además, los compuestos específicos de una y de otra especie, siendo ésta la prueba de su intermediación en cuanto al contenido de estos químicos. Como resultado de la eventual interacción de ambos acervos genéticos, y de la mayor variabilidad en los híbridos, se consideró posible también la presencia de compuestos diferentes, o manchas híbridas, específicos de los híbridos.
3.4
Estudio de variación isoenzimática El transporte de ciertas partículas a través de un solvente, por acción de un
campo eléctrico, que permite la separación de mezclas heterogéneas de proteínas, hidratos de carbono y ácidos nucleicos, se denomina electroforesis (Freifelder, 1982). Esta técnica, aplicada exitosamente en muchas disciplinas botánicas, ha permitido estudiar la variación hereditaria en disciplinas como genética, sistemática y biología de poblaciones.
El procedimiento utilizado en el presente estudio para extraer y movilizar enzimas a través de electroforesis, para su detección a través de tinciones histoquímicas es el que a continuación se presenta, basado en Conkle et al (1982), Kephart (1990), y comunicación personal de Andrea Premoli(3).
3.4.1
Extracción y almacenamiento de las muestras Consta de la extracción de las enzimas presentes en los tejidos vegetales, proceso
que requiere gran atención al ambiente, el cual debe ser frío y en un buffer de extracción.
(3)
Andrea Premoli, Laboratorio Ecotono, Departamento de Biología, Universidad Nacional del Comahue, Bariloche, Argentina.
39
La homogeneización del tejido se realizó mediante mortero, rompiendo la compartimentalización celular, para liberar las proteínas. Para evitar la interacción entre las proteínas y compuestos secundarios (fenoles, terpenos, pectinas, resinas, cumarinas, o pigmentos carotenoides) y la formación de compuestos insolubles, fue necesario utilizar aditivos en los buffers de extracción, como la Polivinilpirrolidona (PVP-40), para así favorecer la detección de una mayor actividad enzimática.
Como material para los estudios electroforéticos relacionados con actividad enzimática, se debe emplear tejido fresco y vivo, siendo posible utilizar cualquier porción de la planta: brotes, yemas, flores, anteras, polen, semillas, hojas o raíces. En este caso, se ocupó una porción de hojas nuevas de cada individuo, a partir de ramas de unos 30 cm. La colecta de dichas ramillas se llevó a cabo cuidando de su mantención en ambiente fresco, húmedo y refrigerado para favorecer la conservación de la actividad enzimática. Se utilizó tejido joven, preferible por brindar una mayor actividad enzimática, debido a su bajo contenido en compuestos fenólicos.
Luego de la homogeneización por extracción mecánica del tejido mediante mortero de porcelana en frío, se mezcló con el buffer de extracción. Las muestras extraídas debieron colocarse en placas con microtubos, mantenidas en frío, ordenadamente etiquetadas y cuidando de que no haya contaminación entre las muestras.
Debió minimizarse el tiempo transcurrido entre el homogeneizado y la electroforesis, empleando ultracongelación para evitar la degradación de las enzimas. Por esto, los extractos se almacenaron en un congelador de ultrafrío a una temperatura entre -70º y -80ºC. Antes de congelarlos se incluyeron mechas de papel filtrador o secante dentro de los microtubos, para que éstas se impregnaran del extracto de cada muestra.
40
3.4.2
Preparación del gel de almidón El gel de almidón constituye una muy buena matriz de soporte para la migración
de los extractos de proteínas vegetales a través de la corrida electroforética. Sus principales ventajas son que constituye una matriz no tóxica, con poros similares en tamaño a las proteínas, creando así un filtro de moléculas que incrementa la resolución de separación de las enzimas.
El gel debió elaborarse la tarde anterior a cada día de la corrida electroforética, para favorecer una estructura adecuada y facilitar el rebanado horizontal para el replicado de los geles y su tinción para diferentes enzimas a partir de un solo gel. Su elaboración se realizó en la siguiente forma:
a) Se pesó 36 gramos de almidón de papa SIGMA, y se mezcló con 300 ml del buffer de gel a temperatura ambiente en un Erlenmeyer, revolviéndose al aplicar movimientos arremolinados vigorosos, hasta la disolución del almidón. b) El Erlenmeyer se puso a calentar, aplicando siempre movimientos por algunos minutos, hasta la aparición de burbujas en su base. El almidón tras este proceso se volvió más delgado y se comenzó a formar un coloide, el cual se tornó menos viscoso, al comenzar a hervir. c) Se retiró del fuego y se dejó en un horno microondas por 4 minutos, revolviendo vigorosamente a cada minuto, para soltar burbujas. d) Se desgasificó usando una bomba de vacío por presión de agua, tras lo cual el gel se tornó cristalino. e) La solución se vertió en un molde horizontalmente nivelado, llenándolo hasta las esquinas. f) Cada gel se cubrió con una película plástica 20 minutos después, para evitar el desecamiento de su superficie.
41
3.4.3
Corrida electroforética Se empleó un sistema buffer en la preparación del gel y además un electrobuffer,
el cual corresponde a una solución ionizada que permite la conducción de la corriente aplicada durante la corrida electroforética. Dado que las proteínas llevan carga eléctrica, sean estas positivas producto de grupos amino ionizados, o negativas producto de grupos carboxilo ionizados, éstos migran en un sentido determinado al aplicar la corriente eléctrica.
Con relación a los sistemas buffer, se requiere de experiencia y pruebas previas para conocer el comportamiento de las corridas y cuales sistemas buffer emplear en cada enzima a estudiar de cada especie, al igual que la batería de tinciones a utilizar. Para el caso del presente estudio, esta prueba fue realizada por la Dra. Andrea Premoli en el Laboratorio Ecotono, de la Universidad Nacional del Comahue, Argentina, con muestras de L. philippiana.
La preparación de los sistemas buffer debió realizarse de manera regulada con un pH-ímetro. En el cuadro 7 aparecen los pH según sistema buffer, y en el cuadro 8 se muestran las enzimas a estudiar. CUADRO 7. Sistemas buffer empleados en las corridas electroforéticas. Sistema Buffer
pH gel
pH electrobuffer
16
8.5
8.1
18
7.0
7.0
MC
7.5
7.5
Para el sembrado de los geles, éstos debieron cortarse luego de enfriarlos por 30 minutos antes del montaje, despegándolos de los bordes por medio de cortes rectos, y se procedió a montar las mechas con un corte limpio y recto, hecho a unos 3 a 4 cm paralelo a una arista y perpendicular a la base del gel. La siembra de las mechas 42
embebidas en los extractos se realizó con una separación de 2 a 3 mm entre mechas, siguiendo el orden de las mechas para conservar su identificación. Para indicar la velocidad de la corrida, se sembró también una mecha con Azul de Bromofenol.
El gel sembrado se posicionó encima y entre las bandejas llenas cada una con 350 ml del electrobuffer, cargadas con el ánodo (carga negativa) en el inicio de la corrida, y el cátodo (positiva) hacia el final de la corrida. Se utilizó esponjas de celulosa como puentes para la transmisión de la corriente eléctrica a través del electrobuffer embebido en las esponjas desde las bandejas. Sobre las esponjas y para sostenerlas al gel, se ubicó un vidrio sobre ellas, y dado que el proceso debe realizarse en condiciones de frío, se depositó hielo seco sobre el vidrio. Se procedió finalmente a aplicar la corriente eléctrica a partir de la fuente de poder, de 50 miliamperes por gel. CUADRO 8. Enzimas de las cuales se analizó su variación mediante electroforesis y sistema buffer requerido. Enzima
Abreviación
Sistema Buffer
1) Ácido fosfatasa
ACPH
MC
2) Alcohol deshidrogenasa
ADH
16
3) Aldolasa
ALD
MC
4) Glutamato oxalacetato transaminasa
GOT
16
5) Isocitrato deshidrogenasa
IDH
MC
6) Malato deshidrogenasa
MDH
18
7) Enzima málica
ME
MC
8) Peroxidasa
PER
16
9) Fosfoglucoisomerasa
PGI
MC
10) Fosfoglucomutasa
PGM
18
11) Shikimato deshidrogenasa
SDH
18
6-PGD
18
12) 6-fosfoglutamato deshidrogenasa
43
3.4.4
Tinción del gel Luego de la corrida electroforética, se rebanó cada gel con un hilo fino tenso,
obteniendo secciones para el uso de diversas tinciones sobre el mismo gel con las mismas muestras. Cada rebanada se depositó sobre una bandeja etiquetada, y luego se aplicó la tinción específica para cada enzima a estudiar.
Posterior a la tinción, los geles se incubaron a 37º C en un horno, tras lo cual apareció el patrón de migrado de las enzimas por efecto de la electroforesis.
3.4.5
Registro e interpretación El registro del patrón de migración de las enzimas se realizó para cada zona de
actividad o locus de cada enzima empleada. Por ejemplo, en el caso de la enzima ACPH, ésta posee un solo locus o zona de actividad, dentro del cual, en las especies en estudio pueden aparecer como una banda arriba solamente, con una banda abajo solamente, o con ambas. Si aparece sólo una banda arriba o sólo una banda abajo, es indicio de un homocigoto 2-2 ó 3-3, respectivamente, mientras que si aparecen ambas, esto quiere decir que se trata de un heterocigoto, registrándose como 2-3.
Este sistema de registro constituye la matriz de datos requeridos por el software BIOSYS. Este programa permite obtener la información requerida para el análisis y comparación de la variación isoenzimática entre las poblaciones en estudio, obteniendo los siguientes parámetros que brindan una importante ayuda para interpretar la relación genética entre las poblaciones:
a) Frecuencias alélicas para cada población, según locus y total. b) Porcentaje de loci polimórficos (según criterio del 95%) en cada población. c) Número medio de alelos por locus en cada población. d) Grado medio de heterocigocis observada en cada población. e) Grado medio de heterocigocis esperada, según equilibrio de Hardy-Weinberg, para cada población. 44
f) Valores de identidad genética insesgada según Nei (1978) entre poblaciones. g) Valores de distancia genética modificada de Rogers entre las poblaciones, según el método de Wright (1978), citado por De Pamphilis y Wyatt (1990).
A partir de los valores de identidad genética y distancia genética, se generaron dendrogramas del tipo de pares de grupos insesgados (UPGMA), empleando la distancia euclidiana. La utilidad de estos dendrogramas es la explicación gráfica de la similaridad genética entre las poblaciones, segregándolas según parecido en variación alélica.
45
4. PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS
4.1
Estudio de características morfológicas y anatómicas Se presenta a continuación, la morfología foliar observada en las poblaciones
estudiadas a través de coeficientes morfométricos que permiten caracterizar los rasgos de las hojas, de acuerdo a tres categorías: la primera referida a elementos foliares de registro directo y relativamente invariables en el desarrollo foliar, otra conformada por coeficientes de relación de forma de la hoja, originados a partir de dimensiones de ciertas secciones de la hoja, pero que convertidos en proporciones de forma, pierde importancia las dimensiones absolutas, permitiendo comparar los individuos y poblaciones con un riesgo menor de incorporar el efecto ambiental en el fenotipo observado. Finalmente, una tercera categoría integra rasgos de apreciación cualitativa, pero transferidas a escala numérica para su comparación.
4.1.1
Caracterización según elementos foliares de registro directo Al observar la forma del ápice y la base de la hoja, mediante los ángulos
registrados, se muestra que L. sempervirens posee ápices de forma obtusa, con ángulos de ápice (ang a) superiores a 100º, en cambio L. philippiana muestra ángulos inferiores de 65º o agudos, en sus dos poblaciones, como se puede apreciar en el cuadro 9, corroborando lo señalado en la literatura respecto de la forma del ápice de la lámina foliar (Muñoz, 1980; Rodríguez et al., 1983; Donoso, 1991). CUADRO 9. Características foliares de registro directo en las poblaciones estudiadas. Las cifras entre paréntesis corresponden a desviación estándar. Característica foliar
ang a (º)
L. sempervirens (Paillaco)
L. sempervirens (Llancahue)
109.32 (22.3) 118.06 (18.8)
L. philippiana x sempervirens (Llancahue)
L. philippiana (Llancahue)
L. philippiana (Puyehue)
82.52 (15.97) 63.95 (9.60)
62.18 (9.27)
ang b (º)
71.49 (11.9)
69.96 (11.4)
67.95 (7.27)
64.00 (9.24
57.76 (7.50)
as (número)
21.16 (2.13)
21.24 (3.62)
27.40 (4.24)
38.85 (4.41)
35.89 (5.79)
n (número)
13.99 (1.69)
13.24 (1.69)
17.83 (2.36)
23.88 (2.06)
21.56 (1.91)
46
Los individuos que integran el grupo de presuntos híbridos, en tanto, exhiben una intermediación respecto del rasgo mencionado, con ápices de ángulo medio de 82.5º. Esta intermediación se aprecia también para la forma de la base de la hoja, en el cual L. sempervirens registra ángulos de base de lámina (ang b) superiores a los de L. philippiana, mientras que en los presuntos híbridos, esta característica se presenta intermedia entre los valores de ang b de ambas especies (ver cuadro 9).
50
as (número por lámina)
45
40
35
30
25
20
15 40
60
80
100
120
140
160
ang a (grados) L. philippiana [Puyehue]
L. sempervirens [Paillaco]
L. philippiana [Llancahue]
L. sempervirens [Llancahue]
Presuntos híbridos [Llancahue]
FIGURA 4. Gráfico de dispersión según ángulo del ápice de la lámina (ang a) y número medio de dientes por lámina (as), para los 151 individuos de las poblaciones en estudio. Al observar la dispersión de los datos registrados en los gráficos de las figuras 4 y 5, se aprecia que ang a es un carácter de gran utilidad en segregar ambas especies, y 47
permite positivamente destacar el carácter intermedio descubierto en los híbridos putativos, de mejor manera que ang b, mostrando una variabilidad mayor entre las especies que este último rasgo. De hecho, el grupo de los presuntos híbridos presenta diferencias significativas en base a ang a con todas las otras poblaciones de ambas especies, soportado por el análisis de varianza realizado con una confianza de 95%, según Weinberg y Goldberg (1990). En tanto que según ang b, el grupo de presuntos híbridos, pese a diferir significativamente con L. philippiana de Puyehue, no es estadísticamente diferente de las poblaciones de L. sempervirens, ni de L. philippiana de Llancahue, según se señala en el cuadro 10.
110
100
ang b (grados)
90
80
70
60
50
40 10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
n (número por lámina) L. philippiana [Puyehue]
L. sempervirens [Paillaco]
L. philippiana [Llancahue]
L. sempervirens [Llancahue]
Presuntos híbridos [Llancahue]
FIGURA 5. Gráfico de dispersión simple según número medio de nervaduras secundarias por lámina (n) y ángulo de la base de la lámina (ang b), para los 151 individuos de las 5 poblaciones en estudio. 48
La cuenta de dientes en las hojas (as), así como el número de nervaduras secundarias observadas (n), también corresponden a características que permiten diferenciar las especies, donde L. philippiana muestra números superiores de ambos elementos foliares, con entre 35 y 39 dientes en promedio para las dos poblaciones, mientras que L. sempervirens presenta alrededor de 21 dientes. Los presuntos híbridos mostraron alrededor de 27 dientes por lámina, señalando de igual forma intermediación para este elemento de caracterización foliar. Para el número medio de nervaduras secundarias, L. sempervirens mostró entre 23 y 21, y alrededor de 13 en L. philippiana. El registro de un número de n cercano a 18 en los presuntos híbridos, hace que este rasgo también destaque la intermediación que presentan estos últimos, entre las especies parentales. Los valores registrados de cada coeficiente de morfología para cada individuo se adjuntan en el apéndice 1.
CUADRO 10. Presencia de diferencias significativas que presenta la población de presuntos híbridos, respecto del resto de las poblaciones, para los elementos foliares de registro directo, según análisis de varianza, para un 95% de confianza. Coeficiente morfométrico
L. sempervirens (Paillaco)
L. sempervirens (Llancahue)
L. philippiana (Llancahue)
L. philippiana (Puyehue)
ang a ang b as n
Si No Si Si
Si No Si Si
Si No Si Si
Si Si Si Si
Las características foliares as y n, sin duda reflejan de mejor manera la intermediación de los rasgos en los híbridos respecto de L. sempervirens y L. philippiana, al tiempo que permiten diferenciar de mejor forma ambas taxa, como es posible de ver en las figuras 4 y 5, donde se aprecia la dispersión de los individuos analizados en función de estos elementos foliares. El análisis de varianza efectuado a los datos a nivel de individuos, corrobora el comportamiento de los presuntos híbridos como grupo homogéneo que difiere de manera estadísticamente significativa (P <0.05) de las poblaciones de ambas especies para las características señaladas, según se observa en el cuadro 10. 49
4.1.2
Caracterización según coeficientes morfométricos Los coeficientes morfométricos analizados, que reflejan la proporción en que
ocurren las dimensiones de las características de ancho de la hoja (a), longitud de lámina (l), longitud de hoja (T), longitud de pecíolo (p), distancias da y db, y número de dientes (s) y nervaduras secundarias (n) en las hojas; generan los coeficientes morfométricos de a/T, l/T, l/p, l/n, l/s, da/p, db/p, da/l, db/l, da/a, db/a, Ss/Sn y ka, que se muestran en el cuadro 11, para los valores medios de cada población. CUADRO 11. Coeficientes morfométricos en las poblaciones estudiadas. Las cifras entre paréntesis corresponden a desviación estándar. Coeficiente morfométrico
L. sempervirens (Paillaco)
L. sempervirens (Llancahue)
L. philippiana x sempervirens (Llancahue)
L. philippiana (Llancahue)
L. philippiana (Puyehue)
a/T
0.41 (0.05)
0.41 (0.04)
0.44 (0.04)
0.39 (0.04)
0.37 (0.04)
l/T
0.91 (0.01)
0.90 (0.02)
0.92 (0.01)
0.94 (0.00)
0.93 (0.01)
l/p
11.24 (1.93)
9.83 (1.88)
12.91 (2.22)
16.59 (1.60)
14.30 (2.30)
l/n
5.12 (0.76)
5.35 (0.53)
4.60 (0.55)
4.16 (0.40)
4.06 (0.50)
l/s
3.38 (0.52)
3.38 (0.56)
3.00 (0.36)
2.57 (0.31)
2.46 (0.29)
da/p
0.60 (0.18)
0.45 (0.11)
0.89 (0.21)
1.36 (0.24)
1.23 (0.21)
db/p
3.30 (0.50)
3.33 (0.70)
4.08 (0.61)
4.63 (0.66)
4.08 (0.69)
da/l
0.05 (0.01)
0.05 (0.01)
0.07 (0.01)
0.08 (0.01)
0.09 (0.01)
db/l
0.30 (0.03)
0.34 (0.04)
0.32 (0.04)
0.28 (0.04)
0.29 (0.05)
da/a
0.12 (0.03)
0.11 (0.02)
0.15 (0.03)
0.20 (0.03)
0.23 (0.05)
db/a
0.67 (0.11)
0.77 (0.15)
0.69 (0.12)
0.68 (0.10)
0.75 (0.16)
Ss/Sn
1.54 (0.18)
1.63 (0.26)
1.58 (0.28)
1.64 (0.17)
1.68 (0.26)
ka
0.19 (0.03)
0.19 (0.02)
0.22 (0.02)
0.18 (0.02)
0.16 (0.02)
A partir de los valores medios señalados en el cuadro 11, y de la información graficada en las figuras 6, 7 y 8, que ilustran la dispersión de estos coeficientes para la totalidad de los individuos analizados, se desprende que para algunos de estas proporciones de forma estudiadas, los individuos que incluyen el grupo de posibles híbridos presentan en efecto, un carácter intermedio entre los valores obtenidos en las 50
poblaciones de L. sempervirens y L. philippiana, tanto para las poblaciones cercanas en Llancahue como para aquellas de carácter puro en Paillaco y Llancahue, respectivamente. La situación mencionada se aprecia para los coeficientes l/T, l/p, l/n, l/s, da/p, da/l y da/a, a través de los cuales es posible discriminar las poblaciones de L. sempervirens de las de L. philippiana, y los valores medios de dichos coeficientes que muestran los individuos híbridos presuntos, los ubican entre los de las especies parentales, y a la vez se presentan como un grupo significativamente diferente de las poblaciones de ambas especies (P <0.05), como se extrae del cuadro 12.
4.8
4.3
Coeficiente l/s
3.8
3.3
2.8
2.3
1.8 2.9
3.4
3.9
4.4
4.9
5.4
5.9
6.4
6.9
Coeficiente l/n L. philippiana [Puyehue]
L. sempervirens [Paillaco]
L. philippiana [Llancahue]
L. sempervirens [Llancahue]
Presuntos híbridos [Llancahue]
FIGURA 6. Gráfico de dispersión simple según proporción entre longitud de la lámina y número de nervaduras secundarias (l/n) y según proporción entre longitud de la lámina y número de dientes (l/s), para los 151 individuos de las 5 poblaciones en estudio.
51
CUADRO 12. Presencia de diferencias significativas que presenta la población de presuntos híbridos, respecto del resto de las poblaciones, para los coeficientes morfométricos estudiados, según análisis de varianza, para un 95% de confianza. Coeficiente morfométrico
L. sempervirens (Paillaco)
L. sempervirens (Llancahue)
L. philippiana (Llancahue)
L. philippiana (Puyehue)
a/T l/T l/p l/n l/s da/p db/p da/l db/l da/a db/a Ss/Sn ka
Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si No No Si
Si Si Si Si Si Si Si Si No Si Si No Si
Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si No No Si
Si Si Si Si Si Si No Si Si Si No No Si
Dos de los coeficientes estudiados, db/l y Ss/Sn, pese a separar las especies a través de sus valores medios obtenidos en las poblaciones, ubican a los individuos posibles híbridos, dentro del rango propio de L. sempervirens, haciendo denotar una mayor similitud del grupo de híbridos hacia esta especie. En efecto, el grupo de híbridos no presenta diferencias significativas (P <0.05) con L. sempervirens de Llancahue según db/l. Por otro lado, de acuerdo al coeficiente Ss/Sn, el grupo de presuntos híbridos no es significativamente diferente a las poblaciones de ambas especies, por lo que la tendencia observada de similitud hacia L. sempervirens no es suficientemente importante en este último coeficiente como para ser considerada, a diferencia de db/l, el cual sí manifiesta cercanía de los híbridos hacia L. sempervirens.
La proporción db/p, es igualmente capaz de segregar ambas especies, pero según este coeficiente, los individuos híbridos putativos presentan mayor similitud hacia L. philippiana, quedando incluidos dentro del rango de variabilidad de ésta. En este contexto, los valores de db/p en los híbridos no presentan diferencias significativas con los de la población de L. philippiana de Puyehue (P <0.05), como señala el cuadro 12.
52
0.35
0.3
Coeficiente da/a
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05 6
8
10
12
14
16
18
20
Coeficiente l/p L. philippiana [Puyehue]
L. sempervirens [Paillaco]
L. philippiana [Llancahue]
L. sempervirens [Llancahue]
Presuntos híbridos [Llancahue]
FIGURA 7. Gráfico de dispersión simple según proporción entre longitud de la lámina y longitud del pecíolo (l/p), y según proporción entre la distancia desde el ápice hasta el primer diente del margen, y ancho de la hoja (da/a), para los 151 individuos de las 5 poblaciones en estudio.
Por su parte, los coeficientes de forma a/T y ka permiten positivamente discriminar las especies. Sin embargo, los individuos presuntos híbridos muestran coeficientes que difieren y superan significativamente los rangos de ambas especies para estos parámetros, poniendo en evidencia que un cierto grado de variabilidad ampliada en los híbridos, que no es propia de las poblaciones de las especies puras.
53
Respecto del coeficiente db/a, es necesario apuntar que no permite segregar las especies, en consecuencia tampoco permite catalogar a los presuntos híbridos en su carácter de intermedio o más afín a alguna de las taxa, aunque se puede señalar que sí se encuentra dentro del rango de variabilidad observada en ambas especies. De hecho, el análisis de varianza corrobora que no hay diferencias significativas (P <0.05) en base a este parámetro en los posibles híbridos con las poblaciones puras de L. sempervirens en Paillaco ni con las de L. philippiana en Puyehue o en Llancahue.
0.95 0.94 0.93
Coeficiente l/T
0.92 0.91 0.9 0.89 0.88 0.87 0.86 0.25
0.45
0.65
0.85
1.05
1.25
1.45
1.65
1.85
Coeficiente da/p L. philippiana [Puyehue]
L. sempervirens [Paillaco]
L. philippiana [Llancahue]
L. sempervirens [Llancahue]
Presuntos híbridos [Llancahue]
FIGURA 8. Gráfico de dispersión simple según proporción entre la distancia desde el ápice hasta el primer diente del margen, y longitud del pecíolo (da/p), y según proporción entre longitud de la lámina y longitud de la hoja (l/T), para los 151 individuos de las 5 poblaciones en estudio.
54
4.1.3
Caracterización según rasgos de tipo cualitativo Los rasgos de carácter cualitativo incluidos en el estudio muestran diferencias
discretas entre L. sempervirens y L. philippiana, permitiendo segregarlas en la asignación de puntajes que representan estas características según el cuadro 13.
Para la forma del diente del borde de la lámina, observando la posición de la glándula respecto del diente (Qas), L. sempervirens presenta el valor 0, que indica dientes curvos a poco agudos, con aserrado suave y ubicación de glándula próxima al seno del diente, en tanto que L. philippiana posee hojas con dientes pronunciados y agudos y glándula preferentemente alejada del seno, orientado hacia fuera de la lámina, según su valor 1, como se infiere del cuadro 13.
El grupo de presuntos híbridos mostró valor 0.5, es decir se trata de individuos con aserrado algo marcado y glándulas de ubicación diversa en relación al seno, incluyendo glándulas hacia fuera y otras veces próxima al seno del diente, que las catalogan como intermedias para el rasgo morfológico Qas.
CUADRO 13. Rasgos cualitativos observados en las poblaciones estudiadas. Los valores señalan la transcripción numérica de los rasgos, según en cuadro 4. La cifra entre paréntesis corresponde a desviación estándar. Características L. sempervirens cualitativas (Paillaco)
L. sempervirens (Llancahue)
L. philippiana x sempervirens L. philippiana L. philippiana (Llancahue) (Puyehue) (Llancahue)
Qas
0
0
0.5
1
1
Qep
0
0
0.5
1
1
Qtp
0
0
0
1
1
Qpy
0
0
0.45 (0.15)
1
1
55
La forma de las células epidérmicas del envés de las láminas (Qep), también aparece como un rasgo que diferencia L. sempervirens de L. philippiana. En esta primera especie la totalidad de los individuos en sus dos poblaciones observadas, muestran células epidérmicas del envés de la hoja con bordes relativamente rectos y en general carentes de lóbulos evidentes, con un puntaje 0. En contraste se observa los individuos de L. philippiana con células de epidermis del envés foliar con bordes de manifiesta sinuosidad, caracterizadas por un número elevado de lóbulos, muy superior a ocho, correspondiendo al valor 1.
La intermediación de este rasgo relativo a la forma de las unidades del tejido epidérmico inferior, es sorprendentemente notorio en los individuos híbridos, cuyas células son claramente intermedias respecto de L. sempervirens y L. philippiana, con bordes sinuosos, y un número de lóbulos por lo general entre 5 y 8, indicando un valor de Qep de 0.5.
El tipo de pilosidad observado (Qtp), muestra que los híbridos putativos presentan sólo pelos simples en ambas caras de las hojas, al igual que L. sempervirens, por esto su valor es 0 en ellos. Opuesta es la situación detectada en L. philippiana, con valor de puntaje 1, lo que implica presencia de pelos simples en el haz y pelos simples y malpighiáceos en el envés de la hoja, tal como describe Martínez-Laborde (1983a).
El nivel de pilosidad en yemas foliares según apreciación visual (Qpy), cataloga con valor 0 a los individuos estudiados de L. sempervirens, al observarse en ellos yemas foliares glabras a escasamente pubescentes, en tanto que L. philippiana presenta yemas muy pubescentes, con valor 0. El conjunto de individuos híbridos presuntos exhibió en su gran mayoría un valor 0.5, es decir un nivel intermedio de abundancia de pelos en las yemas foliares, no obstante en algunos de ellos se presenció yemas glabras, similares a las de L. sempervirens.
56
4.1.4
Índice de Hibridación de Anderson Se consideraron los diez rasgos que mejor reflejaran las diferencias entre las
especies L. philippiana y L. sempervirens, para la confección del índice de identidad de especies, o Indice de Hibridación de Anderson. La selección se hizo en función de los rasgos en los cuales efectivamente ocurre un rango de variabilidad definido para las especies, ya que del resto de las otras características, si bien se observó una clara tendencia de su utilidad en separar las poblaciones de las especies típicas, ellas presentan un grado de sobreposición en la dispersión de su variabilidad en ambas especies.
Se usaron entonces las características que permitieran dar rangos inherentes a cada especie, los que se muestran en el cuadro 14. Luego de la suma de los puntajes obtenidos para dichas características (puntajes que se adjuntan en el apéndice 2), se llegó a un valor de IH para cada individuo. Estos valores se muestran en el cuadro 15. CUADRO 14. Características incluidas en el índice de hibridación y los puntajes según rango. Puntaje Rasgo
ang a as n l/T da/p da/a Qas Qep Qtp Qpy
0 (rango propios de L. sempervirens) > 83º < 28 < 17 < 0.924 < 0.9 < 0.15
0.5
1 (rango propios de L. philippiana)
17-19
Según cuadro 4
57
≤ 83º ≥ 28 > 19 ≥ 0.924 ≥ 0.9 ≥ 0.15
Al examinar el gráfico de frecuencias de individuos según cada rango de puntaje de IH, en la figura 9, se observa que los individuos de L. sempervirens presentaron puntajes 0, o cercanos a este valor, mientras que en el extremo opuesto, los individuos identificados como L. philippiana, arrojaron puntajes de IH de valor 10, o cercanos a 10.
En tanto, los individuos híbridos presuntos se presentan con puntajes intermedios en su mayoría entre 2 y 7, destacando como intermedios entre las especies. Se observa una mayor frecuencia de los individuos híbridos según su IH, con valores más cercanos a L. sempervirens, que a L. philippiana (ver figura 9).
58
CUADRO 15. Índices de Hibridación (IH) calculado para cada individuo analizado de las cinco poblaciones en estudio. L. sempervirens (Paillaco)
L. sempervirens (Llancahue)
L. philippiana x sempervirens (Llancahue)
L. philippiana (Llancahue)
L. philippiana (Puyehue)
Árbol
IH
Árbol
IH
Árbol
IH
Árbol
IH
Árbol
IH
5S03 5S04 5S05
0 0 0
1S03 1S04 1S05
0 0 0
1N01 1N04 1N05
3.5 5.5 3.5
2P01 2P02 2P03
10 10 10
6P03 6P04 6P05
9 9 10
5S06 5S07
0 0
1S06 1S07
0 0
1N06 1N07
1.5 2.5
2P04 2P05
10 10
6P06 6P07
10 10
5S08 5S09 5S10
0 1 0
1S08 1S09 1S10
0 1 0
1N08 2N01 2N02
5.5 2.5 4.5
2P06 2P07 2P08
10 10 10
6P08 6P09 6P10
9.5 10 9
5S11 5S12 5S13
0.5 0 2
1S11 1S12 1S13
0 0 0
2N03 2N04 2N05
5 7 6.5
2P10 2P11 2P12
10 10 10
6P11 6P12 6P13
10 10 10
5S14 5S15
0 1
1S14 1S15
0 0
2N06 2N07
2.5 4.5
2P13 2P14
10 10
6P14 6P15
10 10
5S16 5S17 5S18
0 0 0
1S16 1S17 1S18
0 0 0
2N08 2N09 2N10
2.5 3 3
2P15 2P16 2P17
10 10 10
6P16 6P17 6P18
10 10 10
5S19 5S20 5S21
0 0 2
1S19 1S20 1S21
0 0 0
2N11 2N12 2N13
4.5 5.5 6
2P18 2P19 2P20
8 10 10
6P19 6P20 6P21
10 10 10
5S22 5S23
0 0
1S22 1S23
0 0
2N14 2N15
7 6.5
2P21 2P22
10 10
6P22 6P23
9 8
5S24 5S25 5S26
0 0 0
1S24 1S25 1S26
0 0 0
2N16 2N17 2N18
3 4.5 2
2P23 2P24 2P25
9 10 10
6P24 6P25 6P26
10 9 9
5S27 5S28 5S29
1 2 0
1S27 1S28 1S29
0 0 1
3N01 3N02 3N03
4.5 6.5 6.5
2P26 2P27 2P28
10 10 10
6P27 6P28 6P29
10 10 10
5S30 5S31
0 1
1S30 3S01
0 0
3N05 3N06
4.5 2.5
2P29 2P30
10 10
6P30 6P31
9 9
5S32 5S33
1 0
3S02 3S03
0 0
6P32 6P33
7 10
59
30 25
NUMERO NUMERODE DE INDIVIDUOS INDIVIDUOS
20 15 10
L p - Puyehue ______ _ _ _ _ _________ __ _ __ __ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ L p - Llancahue Presuntos híbridos _______________________________________ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ L s - Llancahue
5 _
L s - Pa illaco
0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
INDICE HIBRIDACIÓN INDICE DEDEHIBRIDACIÓN FIGURA 9. Histograma de frecuencia para los valores de Indice de Hibridación en Laurelia sempervirens (Ls), L. philippiana (Lp) e híbridos presuntos
4.1.5
Diagrama de dispersión de Anderson El diagrama de dispersión confeccionado según el método de Anderson (1968),
se presenta el la figura 10. Se empleó para su construcción el par de coeficientes que permitieron diferenciar de mejor forma las poblaciones de L. sempervirens de las de L. philippiana; estas fueron el número de dientes en la hoja (as) y el número de nervaduras secundarias en la lámina (n).
Se complementó este diagrama con las características de tipo de aserrado (Qas), borde de células del epidermis inferior (Qep), tipo de pilosidad (Qtp) y ángulo del ápice de la hoja (ang a), ilustrados mediante apéndices a cada extremo superior, derecho, izquierdo e inferior, respectivamente, de cada punto que representó cada individuo, como se aprecia en el recuadro al interior del diagrama.
La mayoría de los individuos que componen el grupo de los presuntos híbridos, aparece en el espacio ubicado entre las poblaciones de L. sempervirens de Paillaco y Llancahue, y de L. philippiana de Puyehue y Llancahue, y presentan las cualidades intermedias según los apéndices dibujados, destacando gracias a este diagrama su condición de intermedios entre ambas especies, respecto de las características estudiadas.
Pese a que algunos individuos del grupo de híbridos supuestos, se muestran dentro del rango de L. sempervirens, y otros dentro del de L. philippiana, para el resto de las características incluidas en el diagrama, presentan los rasgos intermedios de todas formas, pudiendo por lo tanto considerarse como intermedios.
61
DIENTES EN MARGEN EN HOJA (Unidades)
Aserrado margen lámina
Muy Pronunciado, diente agudo con glándula hacia fuera de seno
Marcado, diente curvo con glándula hacia seno de diente o hacia fuera
Suave, diente curvo con glándula hacia interior seno
Borde de células epidérmicas de envés
Muy sinuoso Más de 8 de lóbulos
Algo sinuoso Entre 5 y 8 lóbulos
Recto a poco sinuoso Entre 0 y 5 lóbulos
Pilosidad en yemas foliares
Muy pubescentes
Algo pubescentes a pubescentes
Glabras a escasamente pubescentes
Ápice hoja
Recto a obtuso (83º-158º)
Agudo (45º-83º)
Población
Localidad
L. sempervirens
Paillaco
L. sempervirens
Llancahue
L. philippiana x sempervirens
Llancahue
L. philippiana
Llancahue
L. philippiana
Puyehue
NERVADURAS SECUNDARIAS EN HOJA (Unidades)
FIGURA 10. Diagrama de dispersión de Anderson (1968), de los ejemplares estudiados de Laurelia sempervirens, L. philippiana y presuntos híbridos.
4.1.6
Análisis de Clusters para los coeficientes morfométricos El dendrograma derivado del análisis de clusters, se presenta en la figura 11. Al
tomar en cuenta que esta determinación de conglomerados considera como base los 21 coeficientes de morfometría foliar, se infiere que la máxima diferenciación entre grupos ocurre entre los individuos de L. philippiana y el conjunto de individuos de L. sempervirens unidos a los presuntos híbridos; sin embargo, al considerar un 74% de la relación de máxima diferenciación entre conglomerados existentes, se identificaron tres grupos principales, correspondientes a una segregación de los individuos de L. philippiana, de L. sempervirens y los presuntos híbridos L. philippiana x sempervirens, los cuales aparecen como grupo intermedio.
Lo anterior implica que al considerar el nivel de 74% de la máxima distancia euclidiana observada entre clusters, el total de los 151 individuos de la muestra se segregan entonces en tres grupos de homogeneidad interna, pero heterogéneos en relación con los otros clusters, correspondiendo a un primer grupo con individuos de L. sempervirens, un segundo que incluye los individuos presuntos L. philippiana x sempervirens, y un tercer grupo formado por los individuos de L. philippiana.
El conjunto de individuos presuntos híbridos, se observa entonces, como un grupo homogéneo frente a los coeficientes morfológicos foliares registrados, y presenta como conjunto, una mayor cercanía frente al conglomerado compuesto por los individuos de L. sempervirens.
Al interior de los clusters de cada especie típica, se puede señalar en general, que no se presentan separaciones internas que respondan a diferencias entre la población de Llancahue y la población pura, tanto para L. philippiana como para L. sempervirens, y los diversos clusters más pequeños de cada especie integran individuos tanto de las poblaciones puras como de las de Llancahue, para ambas especies.
63
Relación del vínculo frente a la máxima distancia entre clusters (%) 0
20
40
60
80
100
5S03 1S04 5S09 5S23 1S18 1S07 1S15 1S09 1S05 1S13 1S19 5S21 5S28 5S04 1S20 5S12 5S20 5S24 5S06 1S12 1S16 5S07 1S21 5S16 5S18 3S03 5S17 3S02 1S10 1S17 5S33 1S26 1S27 1S28 1S11 1S23 1S24 1S22 5S05 1S03
L. sempervirens
1S25 1S14 1S29 5S08 1S30 5S14 5S11 5S30 5S31 1S08 5S27 5S32 5S22 5S25 5S26 5S10 5S13 5S15 1N01 2N04 2N05 1N04 3N02 3N03 1N08 2N01 2N15 2N14 2N07 3N05 2N13 2N09 2N16 2N11 3N01 2N17 2N03 2N08 3N06 2N06 2N10 2N18 1N05 1N06 1N07 2N12 2P01
L. philippiana x sempervirens
2P08 2P28 2P25 2P21 2P30 6P16 2P15 2P20 2P22 2P23 2P26 2P03 6P13 2P04 2P05 2P27 6P17 2P06 6P33 2P11 2P24 6P19 2P10 2P13 6P29 2P16 2P19 6P06 6P11 6P09 6P08 6P24 6P21 2P02 2P12 6P07 6P14 2P14 6P12 6P15 2P29 6P18 6P27 6P28 6P23 6P04 2P17 6P05
L. philippiana
6P25 6P20 6P26 6P22 6P32 6P30 6P31
FIGURA 11. Dendrograma del Análisis de Clusters para los 151 individuos de la muestra, agrupados según vínculo completo y distancias euclidianas entre los coeficientes de morfología foliar relativizados.
4.1.7
Análisis Factorial por Componentes Principales
El gráfico bidimensional compuesto por los factores arrojados en el análisis factorial por componentes principales, se entrega en la figura 12.
Al examinar el gráfico aludido, y dado que a cada extremo alejado del cero de cada factor, se ubican los individuos con la mayor diferenciación según los 21 coeficientes morfológicos foliares, se observa que el factor 1 segrega claramente las poblaciones de L. philippiana de las de L. sempervirens, mientras que se destaca en la zona intermedia entre los grupos de especies parentales, a los individuos del grupo de presuntos híbridos.
Lo anterior quiere decir que el conjunto de coeficientes de la morfología foliar de correlación significativa con el factor 1, de Qas, Qep, Qpy, da/p, Qtp, n, as, ang a, da/a, l/p, l/T, da/l, l/n, l/s y db/p, según importancia decreciente, explican con propiedad las diferencias entre ambas especies, a la vez que resaltan el carácter intermedio de los híbridos. Los valores absolutos de las correlaciones de las variables con cada factor, aparecen en el cuadro 16.
Al considerar el factor 2, se observa que éste reúne características de menos utilidad en la segregación de las especies parentales. Sin embargo, este factor permitió identificar los coeficientes morfométricos para los cuales los individuos híbridos muestran un comportamiento diferente, fuera del rango de variabilidad típica de las especies padre, y que representan el conjunto de variabilidad propia de gran parte de los híbridos. Estos coeficientes son db/a, db/l, ang b y Ss/Sn, nombrados en orden de importancia decreciente respecto de la correlación observada con el factor 2, como se muestra en el cuadro 16.
65
CUADRO 16. Correlación de cada coeficiente morfométrico foliar con cada factor obtenido por el análisis de componentes principales. La presencia de asterisco señala al coeficiente como estadísticamente significativo (P <0.01), según Feese (1984). Coeficiente morfométrico
ang a ang b as n a/T l/T l/p l/n l/s da/p db/p da/l db/l da/a db/a Ss/Sn ka Qas Qep Qtp Qpy
Correlación con Factor 1
Correlación con Factor 2
* 0.832 0.430 * 0.860 * 0.896 0.329 * 0.792 * 0.793 * 0.695 * 0.691 * 0.909 * 0.600 * 0.792 0.423 * 0.816 0.065 0.137 0.317 * 0.950 * 0.950 * 0.898 * 0.947
0.153 * 0.613 0.326 0.063 * 0.587 0.225 0.226 0.033 0.384 0.001 0.245 0.197 * 0.702 0.342 * 0.929 * 0.563 0.119 0.039 0.039 0.071 0.033
66
1
N302 N303 N108 N204 N211 N217 N301
N208
0.8
N203 N201
N214
FACTOR 2 [db/a; db/l; ang b; a/T; s/n]
N207
N202
N216
N104
N215
N209 N306
N205
N210
N213
0.6 N206 N101
N305
N105 N218
0.4
L. philippiana [Llancahue]
L. philippiana x sempervirens [Llancahue]
P215
N106
L. sempervirens [Paillaco]
N212
S518 S511 S108 S514 N107
S520 S507
0.2
S509 S510
S512
S503 S508 S504 S106 S506S524 S112 S116
S526
L. philippiana [Puyehue]
S505 S118 S103 S104 S107 S126
0
S114
P201 P221 P223 P208P219 P206 P616 P612 P225 P213 P203 P205 P210 P611 P608 P202 P607 P604 P609 P217 P211 P605 P614 P603 P620 P622
L. sempervirens [Llancahue]
S522 S122 S105
-0.2 S111
-0.4 -1
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
FACTOR 1 [Qas; Qep; Qpy; da/p; Qtp; n; as; ang a; da/a; l/p; l/T; da/l; l/n; l/s; db/p]
FIGURA 12. Gráfico resultante del análisis factorial por componentes principales según morfología foliar. Se señalan los coeficientes de correlación significativa con cada factor.
4.2
Estudio de compuestos secundarios de las hojas
Tras revelar las placas luego de la corrida cromatográfica, se detectaron ocho compuestos fenólicos mostrando distintos colores a la luz UV, que se presentan en el cuadro 17. La separación de los compuestos para su diferenciación se realizó a través del solvente TBA, mientras que la migración de los flavonoides en el solvente HoAc no fue significativa. CUADRO 17. Compuestos detectados en las poblaciones analizadas por cromatografía Compuesto
Color
Rango Rf (TBA)
A
Amarillo opaco
0.980 - 0.993
B
Púrpura
0.938 - 0.972
C
Púrpura
0.887 - 0.932
D
Amarillo opaco
0.848 - 0.894
E
Amarillo a pardo
0.787 - 0.883
F
Amarillo a pardo
0.770 - 0.772
G
Amarillo brillante
0.709 - 0.725
H
Pardo
0.523
Luego de examinar los cromatogramas resultantes, los cuales se incluyen en el apéndice 3), se constató la existencia de flavonoides comunes para L. sempervirens y L. philippiana como era predecible producto de la cercanía filogenética entre las especies. Aquellos compuestos presentes en ambas, como se aprecia en el cuadro 18, son A, B y D, de los cuales el primero se encuentra en todos los individuos de ambas especies y también en los presuntos híbridos. Para el segundo compuesto en tanto, se detectó su presencia sólo en algunos árboles de las poblaciones ubicadas en Llancahue, de L. sempervirens, L. philippiana e híbridos.
Los cromatogramas también revelaron compuestos característicos de cada especie, como C, que se halla sólo en L. philippiana y en algunos híbridos; mientras que hay 68
otros compuestos presentes de manera exclusiva en L. sempervirens y algunos híbridos, estando ausentes en L. philippiana (compuestos E, F y G). Además se detectó un compuesto peculiar (H) en uno de los híbridos analizados (ver cuadro 18). CUADRO 18. Compuestos detectados en los individuos analizados por cromatografía y sus valores de Rf (TBA).
Población
L. sempervirens (Llancahue) L. sempervirens (Paillaco) L. philippiana (Llancahue) L. philippiana (Puyehue)
L. philippiana x sempervirens (Llancahue)
Árbol
Valor de Rf (TBA) según compuesto A
B
1S06 1S07
0.980 0.986
0.941 0.972
1S21 5S04
0.980 0.980
0.947
5S16 5S29
0.987 0.980
2P04 2P12
0.986 0.987
0.953
2P24 6P08
0.993 0.980
0.951
6P25 6P27
0.987 0.986
2N07 2N09
0.987 0.986
2N10 2N11
0.980 0.986
2N12 2N13 2N14 2N15
C
D
E
0.855
0.822
F
G
0.770
0.709
0.772
0.725
H
0.833
0.867 0.919 0.907 0.914 0.898
0.860 0.857
0.787 0.823
0.938
0.890
0.863
0.812 0.829
0.987 0.993
0.848
0.815
0.957
0.887 0.929
0.987 0.986
0.947 0.959
0.921 0.932
0.894
0.801
0.523
De lo anterior se desprende que las poblaciones de L. sempervirens y L. philippiana analizadas poseen composición fenólica similar respecto de algunos compuestos (A, B, D). Resulta lógico producto de su parentesco, que compartan tipos de compuestos químicos. Sin embargo, cada una posee compuestos específicos que la 69
diferencian de la otra, como C que es característico de L. philippiana, mientras que E, F y G son propios de L. sempervirens, y que al parecer corresponderían a químicos con el carácter de "marcador" de cada especie.
Los presuntos híbridos mostraron las manchas comunes a ambas especies, pero además se presenta una combinación en la composición de la mayoría de ellos, respecto de los flavonoides exclusivos de cada una de las especies parentales. Es así que los híbridos 2N09, 2N11, 2N12 y 2N14 incluyen en su composición la mancha C típica de la población pura de L. philippiana, y el flavonoide E, único de la población pura de L. sempervirens. Por otra parte, el híbrido 2N10 mostró el compuesto H diferente, que no se observó en ningún árbol de las poblaciones parentales.
Se hace patente la intermediación de los híbridos a juzgar por su composición fenólica, a la vez que ellos presentan un grado de variabilidad mayor al de las poblaciones puras de L. sempervirens y L. philippiana, al contener rasgos químicos de ambas, e incluso eventualmente generar compuestos diferentes.
La situación observada es posible de explicar producto de la recombinación de los caracteres de ambas especies mediante la hibridación, de la misma manera como se ha manifestado en experiencias de hibridación natural entre otras especies, en las que los híbridos presentan componentes de una y de otra especie parental, y además, componentes específicos de los híbridos o manchas híbridas.
Si bien es cierto, en este caso no se logró observar gran cantidad de manchas que favorecieran una mayor diferenciación de las especies padre, como ha ocurrido en los estudios de Nothofagus alpina x obliqua (Morales, 1987; Donoso et al., 1990) o Nothofagus betuloides x dombeyi (Atienza, 1982; Donoso y Atienza, 1983) que ayuden a documentar el fenómeno de hibridación, se debe mencionar que las especies de Laurelia de este estudio poseen numerosos flavonoides, según lo detectado en una prueba inicial realizada con muestras de follaje tomadas en otoño, de algunos individuos. Lamentablemente en la cromatografía final, cuyas muestras fueron tomadas 70
al iniciar la primavera, los individuos mostraron concentraciones menores de la mayoría de los compuestos, producto de un aparente cambio estacional no esperado.
Lo anterior se reflejó en un menor número de componentes fenólicos detectados que permitieran discriminar en mejor forma las especies L. sempervirens y L. philippiana y por cierto destacar el carácter intermedio en la composición de este tipo de compuestos fenólicos en los híbridos. No obstante, y pese a la situación mencionada, se logró registrar un número de fenoles mínimo necesario para la identificación y discriminación de las especies. La presencia de flavonoides específicos de los híbridos, o manchas híbridas, al parecer no es un fenómeno generalizado en los individuos analizados (compuesto H en el híbrido 2N10), como ha ocurrido en otros fenómenos de hibridación estudiados mediante esta técnica. Sin embargo, la cromatografía ha sido útil, ya que ha destacado un mínimo de rasgos propios de cada especie, y en los individuos presuntos híbridos ha dado prueba de la combinación en la composición de estos químicos, revelando así su carácter intermedio entre las especies estudiadas, apoyando la hipótesis de ocurrencia de individuos híbridos naturales entre L. sempervirens y L. philippiana.
4.3
Variación isoenzimática en las poblaciones en estudio
Los parámetros genéticos calculados a partir de las frecuencias alélicas de los 18 loci analizados para las poblaciones estudiadas, se presentan en el cuadro 19. El número medio de alelos por locus (A) alcanzó un valor de 1,3 en la población pura de L. sempervirens de Paillaco, mientras que este valor en la población de Llancahue de la misma especie es similar, con un valor de 1,2. Las poblaciones de L. philippiana mostraron poseer valores de número medio de alelos por locus de 1,7 para la población pura de Puyehue y 1,5 en la población de esta especie en Llancahue.
El grupo de individuos presuntos híbridos L. philippiana x sempervirens, en tanto, presentó un valor estimado del mencionado parámetro genético de 1,4; intermedio 71
entre las poblaciones cercanas de la misma zona de Llancahue, e igualmente intermedio entre las poblaciones de L. sempervirens y L. philippiana puras. Esta situación se ha presentado en otros casos de hibridación natural en plantas, como el estudio de Gallagher et al. (1997) en híbridos del género Carpobrotus, y la situación es explicable producto de la combinación de los acervos genéticos de ambas especies, que haría posible la presencia de alelos de ambas especies en los híbridos, traduciéndose en un número medio de ellos en ciertos locus.
Respecto del parámetro P% o porcentaje de loci polimórfico según el criterio de frecuencia de alelo más común menor a 95%, ambas poblaciones de L. sempervirens (pura y cercana a la zona de hibridación) presentaron 11.1% de loci polimórfico. Superiores fueron los valores registrados para las poblaciones de L. philippiana, tanto la pura de Puyehue, como la de Llancahue, alcanzando valores para P% de 22.2%, como se muestra en el cuadro 19. CUADRO 19. Parámetros de variación genética en las poblaciones en estudio, considerando las frecuencias alélicas de los 18 loci isoenzimáticos. Los valores entre paréntesis corresponden a errores estándar.
Población (Localidad)
Tamaño medio de la muestra por locus
Número medio de alelos por locus (A)
Porcentaje de loci polimórficos (P%)
Directa (Hd)
Esperada (He)
L. sempervirens (Paillaco)
30.6 (0.3)
1.3 (0.2)
11.1
0.022 (0.017)
0.038 (0.026)
L. sempervirens (Llancahue)
27.7 (1.7)
1.2 (0.1)
11.1
0.020 (0.013)
0.034 (0.024)
L. philippiana x sempervirens (Llancahue)
25.1 (1.4)
1.4 (0.1)
27.8
0.048 (0.026)
0.089 (0.038)
L. philippiana (Llancahue)
26.0 (1.6)
1.5 (0.2)
22.2
0.062 (0.036)
0.117 (0.059)
L. philippiana (Puyehue)
30.3 (0.4)
1.7 (0.2)
22.2
0.104 (0.045)
0.137 (0.055)
72
Heterocigocis Media
La población de presuntos L. philippiana x sempervirens, por su parte, mostró un valor para este parámetro de 27.8%, significativamente superior a las poblaciones de las especies parentales, lo que se interpreta como una variabilidad mayor en su acervo genético.
La heterocigocis media calculada directamente a partir de las frecuencias alélicas de los 18 loci en estudio (Hd), arrojaron valores de 0.022 y 0.020 para L. sempervirens en Paillaco y Llancahue respectivamente, mientras que los valores calculados para L. philippiana fueron 0.062 en Llancahue y 0.104 para la población de Puyehue. El grupo de individuos presuntos híbridos, mostraron un valor de Hd de 0.048, intermedio tanto entre las poblaciones cercanas (Llancahue), como entre las poblaciones de carácter puro (L. sempervirens en Paillaco y L. philippiana en Puyehue).
Coherente con los valores registrados para Hd, el parámetro de estimación insesgada como es la heterocigocis media esperada según el equilibrio poblacional de Hardy-Weinberg (He), mostró ser de 0.038 y 0.034 en las poblaciones de L. sempervirens pura y cercana respectivamente, en tanto que para las muestras de L. philippiana se obtuvieron valores de He de 0.117 para la población cercana y 0.137 para la pura de esta especie; para luego observar que el conjunto de híbridos putativos mostró un valor de He de 0.089, intermedio para los pares de grupos de especies parentales. Las diferencias entre la heterocigocis media esperada y la observada pueden deberse a las restricciones del tamaño de la muestra empleada en el estudio, la que tal vez es insuficiente para representar el equilibrio de Hardy-Weinberg.
Pese a que los valores de heterocigocis media Hd y He presentan desviaciones estándares considerables y que el valor de la heterocigocis es el reflejo de la variabilidad genética de las poblaciones, era esperable para la población híbrida valores de He superiores al de las especies padre, sin embargo, los resultados señalan valores intermedios entre las especies para el parámetro mencionado, probablemente por la ocurrencia de procesos de hibridación introgresiva pasados que atenuarían la gama potencial de variabilidad mayor de los híbridos. No obstante lo anterior, lo importante es 73
notar la naturaleza intermedia de la población híbrida respecto de la variabilidad genética registrada en las especies de L. sempervirens y L. philippiana. Al igual que en otros eventos de hibridación descritos en especies vegetales, como el de Gallagher et al (1997), ocurre en este caso un comportamiento intermedio en los valores de heterocigocis media en el grupo de híbridos probables.
El parámetro P% destaca la mayor variabilidad genética presente en el conjunto de híbridos, en tanto que A y los valores de Hd y He, señalan una clara tendencia a la intermediación de estos parámetros descritos de variabilidad genética a escala poblacional.
Los coeficientes de similaridad genética de Rogers (1972) obtenidos para los pares de poblaciones en estudio se entregan en el cuadro 20, y junto con el dendrograma resultante de grupos de pares insesgados (UPGMA) en base a la distancia genética insesgada modificada de Rogers, según Wright (1978) entre las poblaciones estudiadas, que se aprecia en la figura 13, destacaron la alta similaridad entre las poblaciones de L. sempervirens según su componente genético considerando las frecuencias alélicas para los loci estudiados, con un coeficiente de similaridad genética de 0.977, presentándose la misma situación entre las poblaciones de L. philippiana, con un coeficiente de 0.917.
La población presunta híbrida mostró una similaridad genética alta con las poblaciones de L. sempervirens, a través de los coeficientes 0.938 con la población pura de Paillaco y 0.937 con aquella de Llancahue, en tanto que al compararla con las poblaciones de L. philippiana mostró menor similaridad genética hacia ellas, mediante coeficientes de 0.442 frente a la población de Llancahue, y 0.475 con la población pura de Puyehue de esta última especie, todo lo cual se refleja en el dendrograma de la figura 13, el cual exhibe la señalada similaridad genética mayor del grupo de híbridos presuntos, con las poblaciones de L. sempervirens.
74
L. sempervirens (Llancahue)
0.977
1.000
L. philippiana x sempervirens (Llancahue)
0.938
0.937
1.000
L. philippiana (Llancahue)
0.393
0.394
0.442
1.000
L. philippiana (Puyehue)
0.425
0.429
0.475
0.917
L. philippiana (Puyehue)
1.000
L. philippiana (Llancahue)
L. sempervirens (Paillaco)
L. philippiana x sempervirens (Llancahue)
L. sempervirens (Llancahue)
Población (Localidad)
L. sempervirens (Paillaco)
CUADRO 20. Matriz de coeficientes de similaridad genética de Rogers (1972) entre las poblaciones en estudio.
1.000
Igual patrón se percibe al observar los valores de identidad genética insesgada según el método de cálculo de Nei (1978), presentados en el cuadro 21, y el dendrograma de la figura 14, que deriva de estos coeficientes de identidad genética. Se aprecia que las poblaciones de L. philippiana se hallan cercanamente asociadas entre sí como era posible de esperar, al igual que entre las de L. sempervirens, con valores de identidad de 0.969 y 0.997, respectivamente. Los presuntos híbridos mostraron nuevamente un notorio acercamiento hacia las poblaciones de L. sempervirens, con valores de identidad de 0.973 para la población pura de Paillaco y 0.974 al compararla con la población cercana de esta especie, en Llancahue.
75
L. sempervirens (Llancahue)
0.997
1.000
L. philippiana x sempervirens (Llancahue)
0.973
0.974
1.000
L. philippiana (Llancahue)
0.396
0.404
0.461
1.000
L. philippiana (Puyehue)
0.430
0.433
0.490
0.969
L. philippiana (Puyehue)
1.000
L. philippiana (Llancahue)
L. sempervirens (Paillaco)
L. philippiana x sempervirens (Llancahue)
L. sempervirens (Llancahue)
Población
L. sempervirens (Paillaco)
CUADRO 21. Matriz de valores de identidad genética insesgada según Nei (1978) entre las poblaciones en estudio.
1.000
La información generada a partir de los coeficientes calculados de identidad y similaridad genética entre las poblaciones, permitiría aventurar que el conjunto de presuntos híbridos podría tratarse de una población de L. sempervirens. Si esto fuese así, entonces lo lógico habría sido encontrar que el grupo de posibles híbridos presentara una identidad y similaridad genética mayores con la población cercana de esta especie en Llancahue, producto de su proximidad geográfica y ecológica. Sin embargo, es interesante observar que la población de L. sempervirens de Llancahue es más símil con aquella de carácter puro del valle central en Paillaco, que frente al grupo de probables híbridos.
76
Distancia genética modificada de Rogers (Wright, 1978)
L. sempervirens (Paillaco) L. sempervirens (Llancahue) L. philippiana x sempervirens (Llancahue) L. philippiana (Llancahue)
L. philippiana (Puyehue)
FIGURA 13. Dendrograma de grupos de pares insesgados (UPGMA), generado a partir de la distancia genética modificada de Rogers, según Wright (1978), entre las poblaciones estudiadas.
Índice de Similaridad Genética
L. sempervirens (Paillaco) L. sempervirens (Llancahue) L. philippiana x sempervirens (Llancahue) L. philippiana (Llancahue) L. philippiana (Puyehue)
FIGURA 14. Dendrograma de grupos de pares insesgados (UPGMA), generado a partir de los coeficientes de identidad genética insesgada según Nei (1978), entre las poblaciones estudiadas.
Al mismo tiempo, la diferencia que este grupo de posibles híbridos muestra respecto de las poblaciones de L. sempervirens, se traduce en una proximidad genética hacia L. philippiana. Las poblaciones de esta última presenta mayor similaridad genética con la población de presuntos híbridos, que con ambas poblaciones de L. sempervirens, repitiéndose la tendencia si se considera los coeficientes de identidad genética insesgada, según Nei (1978).
El conjunto de resultados del análisis de variación isoenzimática, a partir del cual se infiere su información genética, indican que la población compuesta por los individuos postulados como híbridos, presenta valores intermedios respecto de los parámetros de variación genética estudiados (A, Hd, He) y una mayor variabilidad genética deducible de un porcentaje mayor de loci polimórfico en relación con las poblaciones de L. sempervirens y L. philippiana. Todo lo anterior apoya la hipótesis de hibridación natural entre las especies, ya que concuerda el principio de intermediación de los caracteres. Sin embargo, este grupo de supuesta naturaleza híbrida posee una marcada similaridad genética con las poblaciones de L. sempervirens, superior a la observada con las poblaciones de L. philippiana, evidenciando así un posible proceso de introgresión hacia L. sempervirens, dada la mayor cercanía genética hacia esta especie y teniendo presente que la diferencia del grupo de híbridos frente a las poblaciones de L. sempervirens, es en dirección hacia L. philippiana. Todo apunta hacia el hecho que este conjunto de individuos se trataría efectivamente de híbridos naturales L philippiana x sempervirens, sin embargo, no corresponderían a híbridos de primera generación F1, sino más bien a un grupo de individuos introgresantes hacia L. sempervirens, al poseer un acervo genético más similar a ésta.
79
4.4
Elementos de coherencia con los principios de hibridación. A razón de las abundantes evidencias de la condición de intermedios entre L.
sempervirens y L. philippiana, que manifiestan los individuos presuntos híbridos, se deduce que el grupo en cuestión estaría comprobando la hipótesis de hibridación entre las especies, ya que el principio de intermediación se cumple a cabalidad en la mayoría de los individuos para los análisis de morfología foliar, mediante los métodos gráficos (pares de coeficientes, diagramas de dispersión), métodos numéricos (índice de hibridación), métodos de análisis estadístico (de clusters y factorial por componentes principales). Asimismo, el estudio de compuestos químicos secundarios foliares, detecta la misma tendencia en términos de intermediación de los híbridos. Por último, respecto de los parámetros de variación genética calculados, los valores de heterocigocis no hacen otra cosa que corroborar la condición intermedia del grupo de híbridos y corroboran el mayor grado de variabilidad que éstos presentan, probablemente producto de la interacción de los acervos genéticos de ambas especies.
Pese al cúmulo de pruebas de intermediación en estos híbridos, es necesario recordar algunos de los requisitos necesarios para la ocurrencia de la hibridación. Se observa que este grupo correspondería a un ejemplo de quiebre en los mecanismos de aislamiento precigóticos entre las especies en cuestión, ya que, como se ha mencionado, ellas comparten un área importante de sus distribuciones geográficas, sin embargo, ocurren en forma natural en sitios generalmente disyuntos. El área de Llancahue sería un ejemplo en el cual confluyen o se encuentran los requerimientos altitudinales de ambas especies, al conformar una situación de altitudes medias de la Cordillera de la Costa en la Provincia de Valdivia, lo cual implica que el aislamiento geográfico y ecológico entre ambas especies se vería vulnerado, favoreciendo el contacto.
Respecto de las eventuales barreras producto de diferencias en los agentes polinizadores, y ante la inexistencia de mayores antecedentes al respecto, es posible aventurar que ambas especies poseen un grupo común de agentes polinizadores buscadores de néctar, ya que las glándulas que sustentan dicho recurso se hallan presentes en las dos especies. 80
Por otro lado, la separación o aislamiento temporal que habría entre las especies, dado por diferencias en los períodos de floración es relativo, según observaciones del autor al respecto, presentadas en el cuadro 22. Mientras que durante el año 1997 no se registró una sincronía conspicua en los períodos de floración, ésta si se logró observar en las temporadas 1996 y 1998. El suficiente número de días en los cuales se presentaron flores de ambas especies en sus diferentes estados de madurez en 1998, hace suponer que esta barrera de aislamiento precigótico no es absoluta, y probablemente se dé como respuesta a una conjugación de factores climáticos inusuales, determinando que en algunas temporadas exista un suficiente número de días hábiles para la ocurrencia de una polinización entre las especies en cuestión.
CUADRO 22. Representación del número de días observados con presencia de flores maduras en L. philippiana (en gris oscuro) y L. sempervirens (en gris claro), para las temporadas 1996 a 1998 en el área de Valdivia. Año 1996
1997
1998
Agosto
Septiembre
Octubre
21
Días Noviembre comunes
3 23 3
8
29
11
0
6 7
25 8
18
Los requerimientos de sitio para la progenie híbrida, en el área de estudio, pudieron verse favorecidos por los diversos niveles de alteración del área, ya existiendo antecedentes de uso con perturbación de las comunidades forestales del área, probablemente desde los primeros años de la ciudad de Valdivia, en consideración a la cercanía del área en cuestión con este centro urbano. Actualmente la zona se presenta como un verdadero mosaico vegetacional en diferentes estados de desarrollo, hecho que demuestra alteraciones en el pasado. 81
Todos estos antecedentes indicados, en conjunto con las evidencias de intermediación morfológica presentadas en este estudio, apuntan al hecho de que el conjunto de individuos con características intermedias entre L. sempervirens y L. philippiana, representa efectivamente híbridos naturales entre las especies, es decir, L. philippiana x sempervirens.
En ellos se pone de manifiesto una mayor variabilidad morfológica, química y genética según el conjunto de resultados, advirtiéndose, además, ocurrencia de cierta variación diferente, propia de los híbridos para ciertas características analizadas de morfología y composición química foliares.
Todo indica que la naturaleza de estos híbridos no correspondería a un grupo de individuos de primera generación, o F1, sino más bien las evidencias apuntan a que se trataría de un grupo resultante tras hibridación introgresiva hacia L. sempervirens, como señalan las múltiples pruebas de una mayor cercanía relativa hacia esta especie.
82
5. CONCLUSIONES
Existen características que permiten diferenciar las especies L. sempervirens y L. philippiana, en función de la morfología foliar, composición química y variación isoenzimática.
En consideración a las características presentadas por las especies en Llancahue, las poblaciones de L. sempervirens y L. philippiana de esta área no presentan diferencias substanciales con respecto a las poblaciones de ambas especies en las áreas de crecimiento exclusivo de cada una en Paillaco y Puyehue, respectivamente.
Existe un grupo de individuos con características de morfología foliar, químicos y variación genética que los indican como intermedios entre L. sempervirens y L. philippiana.
Las características foliares de mayor utilidad en la segregación de las especies estudiadas, y que a la vez permiten detectar individuos con características intermedias son la forma del aserrado, la forma de las células de la epidermis inferior de las hojas, la pilosidad de las yemas foliares, el número de nervaduras secundarias de la lámina, el número de dientes del margen de la lámina y la forma del ápice de la hoja.
Los individuos de características morfológicas intermedias presentaron una variabilidad genética mayor al de las especies padre, a juzgar por el porcentaje de loci polimórficos observado, en tanto que mostraron intermediación en los parámetros de variación genética de número medio de alelos por locus y grado medio de heterocigocis, al compararlos con los valores de las poblaciones de especies puras a nivel poblacional.
El grupo de individuos intermedios corresponden a híbridos entre las especies estudiadas, en función de las evidencias morfológicas, químicas y genéticas, y las condiciones ecológicas del área donde ellas se desarrollan, comprobándose la hipótesis de la presente tesis. 83
El conjunto de hĂbridos L. philippiana x sempervirens, a la luz de los antecedentes arrojados por el estudio, estarĂa conformado por individuos resultantes de un proceso de hibridaciĂłn introgresiva hacia L. sempervirens.
84
6. RESUMEN Con el objeto de investigar la hipótesis de hibridación natural entre las especies arbóreas nativas laurel (Laurelia sempervirens [R.
ET
P.] TUL.) y tepa (L. philippiana
LOOSER o Laureliopsis philippiana [LOOSER] SCHODDE), se estudió una población de individuos presumiblemente híbridos, una población de laurel y otra de tepa, las tres ubicadas contiguamente en un área al sureste de la ciudad de Valdivia. Se incluyó en el estudio una población natural aislada de laurel, ubicada en la comuna de Paillaco y otra de tepa, en el Parque Nacional Puyehue. Para cada población, conformada en promedio por 30 individuos, se analizó la variación isoenzimática mediante electroforesis de gel de almidón, considerando 18 loci isoenzimáticos; la variación de compuestos secundarios de las hojas mediante cromatografía en placa fina de celulosa, y la variación de 21 características foliares anatómicas y morfológicas estudiadas a partir de observación directa. Los resultados concluyen en la ocurrencia de hibridación natural entre estas especies, probablemente con procesos de introgresión hacia L. sempervirens.
SUMMARY An assessment for hypothesis of natural hybridization between Chilean native tree species laurel (Laurelia sempervirens [R.
ET
P.] TUL.) and tepa (L. philippiana
LOOSER or Laureliopsis philippiana [LOOSER ] SCHODDE) was carried out through a
research of natural populations of laurel, tepa and a supposedly hybrid one, located close to each other, in an area at southeast from Valdivia city. It also was included a genetically isolated natural population of laurel species at Paillaco, and other one from tepa species, at Puyehue National Park. For each population, constituted by 30 individuals as average, its isozyme variation was analyzed by means of starch gel electrophoresis considering 18 isozyme loci. Its leaf secondary compounds were investigated through thin-layer cellulose chromatography and the leaf morphology variation was studied from 21 leaf anatomy and morphological traits. Results concludes in the occurrence of natural hybridization between studied species, probably with introgressive processes towards L. sempervirens.
85
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APÉNDICES
APÉNDICE 1 COEFICIENTES MEDIOS DE MORFOLOGÍA FOLIAR POR INDIVIDUO
1) Coeficientes medios de morfología foliar en población de L. sempervirens de Llancahue. Árbol 1S03 1S04 1S05 1S06 1S07 1S08 1S09 1S10 1S11 1S12 1S13 1S14 1S15 1S16 1S17 1S18 1S19 1S20 1S21 1S22 1S23 1S24 1S25 1S26 1S27 1S28 1S29 1S30 3S01 3S02 3S03
ang a ang b 127.50 80.94 110.31 61.25 101.88 58.13 123.75 91.25 136.25 65.31 106.88 82.50 118.75 61.25 111.88 70.31 127.81 66.88 110.63 70.63 101.88 59.38 143.13 71.88 127.50 65.00 128.13 71.00 99.06 59.06 124.38 52.50 100.63 56.25 126.25 71.88 129.38 78.75 126.56 68.44 104.38 60.63 116.88 66.88 123.75 91.25 93.75 75.00 93.75 62.19 130.63 66.88 157.50 96.25 152.50 72.81 123.13 76.88 85.63 69.38 95.63 68.13
as 23.06 24.31 16.75 19.13 20.94 20.75 22.06 21.50 16.19 20.25 16.75 27.63 23.69 18.81 21.25 21.19 20.06 23.75 19.25 15.19 18.00 19.13 19.13 25.94 24.94 23.81 29.31 23.13 21.94 17.88 22.81
n 12.13 11.81 12.50 10.81 13.50 14.38 14.75 13.63 11.38 12.44 12.50 12.38 15.13 11.88 12.81 10.50 13.44 13.69 12.63 12.06 13.25 13.88 10.81 16.06 13.56 13.50 14.94 14.31 16.75 12.63 16.31
a/T 0.41 0.39 0.33 0.46 0.39 0.43 0.41 0.40 0.39 0.43 0.33 0.38 0.40 0.43 0.38 0.39 0.37 0.42 0.46 0.37 0.40 0.42 0.46 0.39 0.38 0.44 0.45 0.44 0.44 0.37 0.42
l/T 0.90 0.90 0.89 0.90 0.91 0.92 0.93 0.91 0.87 0.91 0.90 0.90 0.92 0.91 0.90 0.92 0.92 0.91 0.90 0.90 0.88 0.87 0.90 0.88 0.89 0.87 0.89 0.89 0.91 0.91 0.92
l/p 8.83 9.80 8.94 9.34 10.69 13.06 14.30 9.96 6.73 10.71 9.28 10.02 12.62 10.38 9.95 11.78 11.37 10.49 9.48 9.20 7.91 7.24 9.34 8.14 8.50 7.10 8.93 8.62 10.35 10.55 11.25
l/n 5.18 6.37 6.20 5.19 5.42 4.82 5.07 5.33 5.04 5.92 6.26 5.73 5.35 5.72 5.72 6.07 6.30 5.32 5.25 5.09 4.93 4.82 5.19 5.00 5.22 5.09 5.23 4.56 4.77 4.89 4.82
l/s 2.73 3.11 4.64 2.92 3.52 3.33 3.41 3.41 3.53 3.67 4.68 2.57 3.42 3.60 3.45 3.00 4.23 3.03 3.43 4.01 3.62 3.48 2.92 3.10 2.84 2.88 2.66 2.84 3.63 3.51 3.50
da/p 0.40 0.30 0.40 0.48 0.38 0.68 0.64 0.49 0.41 0.54 0.41 0.29 0.37 0.45 0.50 0.51 0.43 0.70 0.47 0.50 0.42 0.41 0.48 0.36 0.44 0.37 0.29 0.41 0.45 0.62 0.48
db/p 2.82 3.37 3.52 3.28 3.83 3.99 4.99 3.73 2.60 3.69 3.61 2.68 3.88 3.61 3.53 4.47 4.14 2.88 3.36 3.57 2.87 2.78 3.28 2.61 2.74 2.36 2.21 2.49 3.29 3.59 3.57
da/l 0.04 0.03 0.04 0.05 0.04 0.05 0.05 0.05 0.06 0.05 0.04 0.03 0.03 0.04 0.05 0.04 0.04 0.06 0.05 0.05 0.05 0.06 0.05 0.04 0.05 0.05 0.03 0.05 0.04 0.06 0.04
db/l 0.32 0.35 0.39 0.34 0.36 0.31 0.35 0.38 0.38 0.35 0.39 0.27 0.31 0.35 0.36 0.39 0.36 0.28 0.35 0.40 0.37 0.38 0.34 0.32 0.32 0.33 0.25 0.29 0.32 0.34 0.32
da/a 0.10 0.07 0.12 0.10 0.09 0.11 0.10 0.11 0.14 0.11 0.12 0.07 0.07 0.10 0.12 0.11 0.10 0.13 0.10 0.13 0.12 0.12 0.10 0.10 0.12 0.11 0.06 0.10 0.09 0.14 0.09
db/a Ss/Sn 0.71 1.93 0.80 2.07 1.08 1.35 0.67 1.79 0.85 1.57 0.67 1.45 0.80 1.51 0.86 1.58 0.87 1.44 0.75 1.63 1.08 1.35 0.65 2.24 0.71 1.58 0.75 1.61 0.85 1.67 0.95 2.04 0.91 1.50 0.60 1.76 0.69 1.55 0.96 1.27 0.83 1.37 0.80 1.40 0.67 1.79 0.72 1.62 0.75 1.85 0.66 1.78 0.50 1.97 0.59 1.62 0.66 1.32 0.82 1.43 0.70 1.40
ka Qas Qep Qtp Qpy 0.20 0 0 0 0 0.21 0 0 0 0 0.20 0 0 0 0 0.21 0 0 0 0 0.18 0 0 0 0 0.18 0 0 0 0 0.21 0 0 0 0 0.17 0 0 0 0 0.14 0 0 0 0 0.17 0 0 0 0 0.20 0 0 0 0 0.19 0 0 0 0 0.22 0 0 0 0 0.19 0 0 0 0 0.19 0 0 0 0 0.22 0 0 0 0 0.21 0 0 0 0 0.18 0 0 0 0 0.18 0 0 0 0 0.17 0 0 0 0 0.20 0 0 0 0 0.18 0 0 0 0 0.21 0 0 0 0 0.18 0 0 0 0 0.22 0 0 0 0 0.18 0 0 0 0 0.14 0 0 0 0 0.18 0 0 0 0 0.15 0 0 0 0 0.16 0 0 0 0 0.18 0 0 0 0
2) Coeficientes medios de morfología foliar en población de L. sempervirens de Paillaco. Árbol 5S03 5S04 5S05 5S06 5S07 5S08 5S09 5S10 5S11 5S12 5S13 5S14 5S15 5S16 5S17 5S18 5S19 5S20 5S21 5S22 5S23 5S24 5S25 5S26 5S27 5S28 5S29 5S30 5S31 5S32 5S33
ang a ang b 96.88 63.13 123.44 79.38 104.38 107.50 109.69 75.31 120.63 83.44 133.75 74.38 74.06 63.13 106.25 74.38 123.13 68.75 114.69 67.50 86.25 87.50 143.75 83.13 98.13 80.31 123.13 76.88 83.13 69.38 95.63 68.13 83.13 67.50 111.25 70.94 81.25 60.00 125.63 63.75 141.88 57.81 128.44 58.44 131.25 65.31 141.25 76.56 85.31 67.19 82.81 58.13 146.88 60.00 111.88 71.88 99.69 74.06 83.44 72.19 98.13 70.31
as 20.50 21.75 22.44 20.25 20.38 23.19 23.19 16.50 22.56 23.06 20.00 22.69 24.44 21.94 17.88 22.81 19.50 20.63 19.00 18.44 21.38 23.00 19.19 23.69 22.88 18.38 22.19 19.56 22.88 22.00 19.56
n 12.00 13.69 12.00 10.88 13.75 14.75 13.00 13.13 17.13 13.75 15.00 15.44 15.25 16.75 12.50 16.31 13.44 13.56 12.69 11.56 12.63 14.19 12.31 15.38 15.31 14.56 15.69 15.25 14.81 14.69 12.38
a/T 0.43 0.43 0.38 0.45 0.44 0.45 0.39 0.44 0.41 0.42 0.44 0.51 0.49 0.44 0.37 0.42 0.36 0.42 0.31 0.35 0.40 0.39 0.36 0.37 0.39 0.36 0.37 0.43 0.42 0.40 0.40
l/T 0.90 0.90 0.92 0.90 0.91 0.90 0.92 0.92 0.92 0.90 0.94 0.90 0.93 0.91 0.91 0.92 0.90 0.91 0.89 0.91 0.90 0.91 0.92 0.92 0.92 0.91 0.92 0.92 0.93 0.93 0.91
l/p 9.17 9.69 11.94 9.59 11.63 9.41 11.13 12.59 11.99 9.88 16.01 9.46 15.29 10.35 10.55 11.25 8.99 10.48 8.78 10.18 9.99 9.92 11.01 11.98 12.58 10.92 11.62 12.45 13.96 13.43 12.19
l/n 5.93 5.07 5.52 5.89 4.74 4.98 7.07 5.98 4.83 5.13 5.08 4.52 5.31 4.77 4.95 4.82 6.38 4.39 5.23 5.53 4.48 4.69 5.14 4.71 4.42 5.20 3.78 4.74 4.52 5.06 5.82
l/s 3.46 3.19 2.97 3.16 3.18 3.19 3.97 4.68 3.65 3.04 3.83 3.06 3.30 3.63 3.51 3.50 4.36 2.83 3.50 3.52 2.63 2.90 3.35 3.01 2.97 4.09 2.66 3.65 2.93 3.38 3.70
da/p 0.32 0.51 0.46 0.44 0.52 0.44 0.50 0.87 0.55 0.52 1.02 0.50 0.57 0.45 0.62 0.48 0.40 0.60 0.52 0.54 0.56 0.51 0.65 0.60 0.81 0.71 0.62 0.85 0.76 0.86 0.74
db/p 2.88 2.75 3.40 3.18 3.42 2.40 3.03 3.57 3.20 3.15 4.09 2.66 4.34 3.29 3.59 3.57 3.01 3.32 2.82 3.03 3.51 2.91 3.01 2.75 3.07 3.80 3.42 3.63 3.97 3.43 4.07
da/l 0.03 0.05 0.04 0.05 0.05 0.05 0.05 0.07 0.05 0.05 0.06 0.05 0.04 0.04 0.06 0.04 0.04 0.06 0.06 0.05 0.06 0.05 0.06 0.05 0.06 0.06 0.05 0.07 0.05 0.06 0.06
db/l 0.31 0.29 0.28 0.34 0.30 0.26 0.27 0.29 0.26 0.32 0.26 0.28 0.29 0.32 0.34 0.32 0.33 0.31 0.32 0.29 0.34 0.29 0.27 0.23 0.24 0.34 0.29 0.29 0.29 0.25 0.34
da/a 0.07 0.11 0.09 0.09 0.10 0.09 0.11 0.15 0.10 0.12 0.14 0.09 0.07 0.09 0.14 0.09 0.11 0.13 0.17 0.14 0.13 0.12 0.15 0.12 0.15 0.16 0.13 0.15 0.12 0.15 0.14
db/a Ss/Sn 0.66 1.73 0.61 1.60 0.69 1.89 0.68 1.87 0.63 1.51 0.52 1.59 0.64 1.83 0.60 1.29 0.59 1.34 0.68 1.69 0.54 1.34 0.50 1.48 0.55 1.63 0.66 1.32 0.82 1.44 0.70 1.40 0.84 1.48 0.68 1.55 0.94 1.50 0.77 1.61 0.77 1.74 0.68 1.63 0.69 1.57 0.57 1.58 0.58 1.50 0.87 1.27 0.73 1.43 0.62 1.31 0.63 1.55 0.59 1.51 0.77 1.60
ka Qas Qep Qtp Qpy 0.21 0 0 0 0 0.19 0 0 0 0 0.17 0 0 0 0 0.18 0 0 0 0 0.18 0 0 0 0 0.18 0 0 0 0 0.24 0 0 0 0 0.20 0 0 0 0 0.20 0 0 0 0 0.22 0 0 0 0 0.18 0 0 0 0 0.21 0 0 0 0 0.21 0 0 0 0 0.15 0 0 0 0 0.16 0 0 0 0 0.18 0 0 0 0 0.17 0 0 0 0 0.19 0 0 0 0 0.18 0 0 0 0 0.17 0 0 0 0 0.23 0 0 0 0 0.18 0 0 0 0 0.14 0 0 0 0 0.18 0 0 0 0 0.16 0 0 0 0 0.22 0 0 0 0 0.15 0 0 0 0 0.22 0 0 0 0 0.17 0 0 0 0 0.16 0 0 0 0 0.22 0 0 0 0
3) Coeficientes medios de morfología foliar en población de L. philippiana de Llancahue. Árbol 2P01 2P02 2P03 2P04 2P05 2P06 2P07 2P08 2P10 2P11 2P12 2P13 2P14 2P15 2P16 2P17 2P18 2P19 2P20 2P21 2P22 2P23 2P24 2P25 2P26 2P27 2P28 2P29 2P30
ang a ang b 66.56 66.88 45.31 47.19 69.06 66.25 73.44 61.56 79.38 61.88 64.69 45.00 66.56 66.88 59.06 66.88 57.19 64.69 58.75 49.69 45.31 47.19 65.94 74.06 58.13 69.69 62.19 68.13 57.81 65.63 51.25 55.31 88.75 78.75 59.06 57.19 66.25 70.00 53.75 62.50 69.38 75.00 63.13 82.50 65.31 56.56 67.50 59.38 72.81 75.00 76.88 62.50 55.94 67.50 62.50 67.19 72.81 65.00
as 40.00 45.31 31.69 39.44 35.19 28.75 40.00 42.75 36.81 33.00 45.31 35.19 47.50 41.25 34.81 36.50 36.25 37.13 42.50 37.50 41.50 44.56 36.06 42.69 43.19 36.38 40.81 38.44 36.25
n 25.56 22.56 24.50 24.13 24.69 20.69 25.56 25.75 24.63 19.63 22.56 25.31 24.88 26.38 20.25 26.00 22.25 23.56 24.69 21.88 25.31 26.63 22.88 25.63 26.75 23.88 24.56 20.88 20.69
a/T 0.42 0.30 0.41 0.39 0.37 0.38 0.42 0.39 0.38 0.34 0.30 0.43 0.41 0.43 0.40 0.35 0.47 0.37 0.41 0.39 0.40 0.40 0.37 0.38 0.46 0.40 0.39 0.36 0.43
l/T 0.95 0.94 0.93 0.94 0.94 0.94 0.95 0.95 0.94 0.93 0.94 0.94 0.94 0.94 0.94 0.94 0.93 0.94 0.94 0.95 0.94 0.94 0.94 0.94 0.94 0.94 0.94 0.94 0.95
l/p 20.62 16.96 14.24 15.85 16.38 18.52 20.62 18.88 16.78 15.20 16.96 15.27 15.40 16.00 15.38 15.07 14.80 16.09 14.74 17.75 15.29 16.60 16.74 17.14 16.81 15.73 17.75 15.75 17.80
l/n 3.95 4.18 4.20 4.47 3.77 4.20 3.95 4.46 4.62 4.89 4.18 3.77 4.20 3.90 3.87 3.81 3.80 3.34 4.17 4.60 3.62 3.72 4.60 4.47 3.84 4.12 4.43 4.91 4.69
l/s 2.48 2.06 3.24 2.76 2.64 3.00 2.48 2.69 3.07 2.91 2.06 2.72 2.18 2.51 2.23 2.71 2.36 2.14 2.42 2.71 2.23 2.21 2.91 2.68 2.40 2.72 2.69 2.66 2.68
da/p 1.81 1.24 1.23 1.01 1.13 1.65 1.81 1.45 1.81 1.28 1.24 1.80 1.17 1.24 1.72 1.40 1.08 1.38 1.14 1.40 1.23 1.01 1.28 1.39 1.33 1.18 1.37 1.14 1.47
db/p 4.94 3.11 4.67 4.63 5.10 6.28 4.94 5.29 4.93 4.86 3.11 4.53 4.14 4.44 4.56 4.84 4.94 4.55 3.80 5.21 4.25 4.06 5.64 4.83 3.95 4.98 4.67 4.16 5.00
da/l 0.09 0.07 0.09 0.06 0.07 0.09 0.09 0.08 0.11 0.09 0.07 0.12 0.08 0.08 0.11 0.09 0.07 0.08 0.08 0.08 0.08 0.06 0.08 0.08 0.08 0.07 0.08 0.07 0.08
db/l 0.25 0.19 0.33 0.29 0.32 0.33 0.25 0.28 0.30 0.32 0.19 0.30 0.27 0.29 0.30 0.32 0.34 0.28 0.26 0.29 0.28 0.25 0.34 0.28 0.23 0.32 0.27 0.27 0.28
da/a 0.20 0.23 0.20 0.16 0.18 0.22 0.20 0.19 0.27 0.24 0.23 0.26 0.18 0.17 0.27 0.25 0.14 0.21 0.18 0.19 0.19 0.15 0.20 0.21 0.16 0.17 0.19 0.19 0.18
db/a Ss/Sn 0.56 1.60 0.59 2.03 0.74 1.30 0.71 1.63 0.80 1.44 0.84 1.42 0.56 1.60 0.70 1.67 0.73 1.51 0.88 1.69 0.59 2.03 0.66 1.39 0.62 1.95 0.62 1.57 0.71 1.73 0.88 1.41 0.66 1.63 0.72 1.59 0.59 1.73 0.70 1.72 0.66 1.66 0.58 1.68 0.88 1.58 0.70 1.67 0.48 1.62 0.75 1.53 0.65 1.66 0.69 1.85 0.63 1.75
ka Qas Qep Qtp Qpy 0.17 1 1 1 1 0.19 1 1 1 1 0.14 1 1 1 1 0.14 1 1 1 1 0.15 1 1 1 1 0.23 1 1 1 1 0.17 1 1 1 1 0.17 1 1 1 1 0.18 1 1 1 1 0.20 1 1 1 1 0.19 1 1 1 1 0.16 1 1 1 1 0.20 1 1 1 1 0.20 1 1 1 1 0.17 1 1 1 1 0.16 1 1 1 1 0.16 1 1 1 1 0.20 1 1 1 1 0.17 1 1 1 1 0.20 1 1 1 1 0.17 1 1 1 1 0.17 1 1 1 1 0.19 1 1 1 1 0.17 1 1 1 1 0.19 1 1 1 1 0.14 1 1 1 1 0.18 1 1 1 1 0.16 1 1 1 1 0.20 1 1 1 1
4) Coeficientes medios de morfología foliar en población de L. philippiana de Puyehue. Árbol 6P03 6P04 6P05 6P06 6P07 6P08 6P09 6P10 6P11 6P12 6P13 6P14 6P15 6P16 6P17 6P18 6P19 6P20 6P21 6P22 6P23 6P24 6P25 6P26 6P27 6P28 6P29 6P30 6P31 6P32 6P33
ang a ang b 47.50 50.63 70.94 73.13 57.50 52.50 55.31 58.75 60.63 53.13 61.25 61.56 62.50 54.38 66.25 57.19 55.63 58.44 64.38 63.75 72.50 61.56 44.69 53.44 64.38 63.75 57.19 54.69 82.50 68.75 61.25 62.19 55.00 44.69 62.81 61.88 52.50 52.19 74.06 58.75 69.69 57.19 61.88 61.56 61.88 53.75 48.13 46.88 65.31 68.75 61.25 66.56 54.69 71.56 71.88 52.19 69.06 49.06 83.13 53.75 51.88 44.06
as 35.38 38.44 35.56 34.56 44.75 30.81 33.69 36.75 34.81 47.81 33.13 39.25 47.81 39.50 29.81 37.00 35.19 31.19 34.25 30.44 40.69 34.44 29.13 36.56 44.19 47.19 35.56 28.56 27.56 29.94 28.69
n 26.19 24.31 24.25 22.06 25.25 18.63 21.19 20.63 22.06 22.19 22.81 21.94 22.19 20.56 19.88 20.38 20.44 20.81 19.88 20.19 22.88 19.44 23.56 22.19 19.50 21.38 24.25 20.25 19.56 19.31 20.25
a/T 0.31 0.40 0.36 0.39 0.33 0.40 0.34 0.39 0.36 0.40 0.41 0.32 0.40 0.38 0.46 0.36 0.32 0.36 0.35 0.34 0.36 0.40 0.34 0.30 0.39 0.40 0.37 0.32 0.34 0.38 0.37
l/T 0.92 0.91 0.93 0.94 0.94 0.93 0.93 0.92 0.93 0.94 0.94 0.93 0.94 0.95 0.93 0.93 0.95 0.93 0.93 0.92 0.94 0.93 0.92 0.91 0.94 0.93 0.93 0.92 0.93 0.91 0.94
l/p 12.89 11.42 13.15 15.54 16.17 13.67 13.19 12.60 14.29 17.61 15.98 14.39 17.61 18.67 13.06 13.75 18.49 12.76 14.12 11.74 16.61 13.05 11.85 11.03 16.41 14.81 14.86 12.15 13.03 10.33 18.20
l/n 3.84 2.94 3.52 3.88 3.64 3.91 3.87 3.74 3.74 4.67 3.57 4.17 4.67 4.42 4.05 4.61 4.65 4.60 4.08 4.13 4.09 4.31 3.60 3.98 4.71 5.42 4.15 3.34 3.63 3.65 4.24
l/s 2.83 1.85 2.39 2.48 2.06 2.37 2.44 2.09 2.34 2.17 2.49 2.35 2.17 2.30 2.72 2.55 2.70 3.11 2.44 2.75 2.30 2.45 2.89 2.41 2.08 2.46 2.85 2.38 2.60 2.38 2.98
da/p 1.18 1.01 1.44 1.26 1.19 1.34 1.04 1.20 1.31 1.36 1.33 1.26 1.36 1.50 1.13 1.14 1.36 1.52 1.40 0.93 0.75 1.37 1.05 1.16 1.24 1.20 1.75 1.05 1.14 0.84 1.38
db/p 3.86 2.57 4.23 3.95 4.18 3.96 4.11 3.63 3.73 4.33 4.41 3.62 4.33 4.66 4.34 3.40 5.23 4.00 3.81 3.80 4.43 3.82 3.70 3.05 3.33 3.57 4.08 4.84 5.24 3.91 6.28
da/l 0.09 0.09 0.11 0.08 0.07 0.10 0.08 0.10 0.09 0.08 0.08 0.09 0.08 0.07 0.09 0.08 0.07 0.12 0.10 0.08 0.04 0.10 0.09 0.11 0.08 0.08 0.12 0.09 0.09 0.08 0.07
db/l 0.31 0.23 0.32 0.25 0.26 0.29 0.32 0.29 0.26 0.25 0.28 0.25 0.25 0.24 0.33 0.25 0.29 0.32 0.27 0.32 0.27 0.30 0.31 0.28 0.20 0.24 0.28 0.40 0.40 0.38 0.34
da/a 0.28 0.20 0.29 0.20 0.21 0.23 0.21 0.23 0.24 0.19 0.19 0.26 0.19 0.19 0.18 0.22 0.22 0.31 0.27 0.22 0.12 0.24 0.25 0.33 0.18 0.19 0.30 0.26 0.24 0.20 0.19
db/a Ss/Sn 0.92 1.37 0.52 1.62 0.85 1.47 0.61 1.57 0.74 1.78 0.68 1.66 0.85 1.59 0.69 1.80 0.69 1.59 0.59 2.18 0.62 1.46 0.76 1.79 0.59 2.18 0.60 1.94 0.68 1.50 0.65 1.82 0.83 1.73 0.81 1.50 0.74 1.73 0.89 1.53 0.71 1.78 0.69 1.77 0.85 1.26 0.87 1.66 0.49 2.27 0.57 2.22 0.70 1.47 1.16 1.42 1.11 1.42 0.93 1.56 0.88 1.43
ka Qas Qep Qtp Qpy 0.16 1 1 1 1 0.14 1 1 1 1 0.17 1 1 1 1 0.18 1 1 1 1 0.16 1 1 1 1 0.16 1 1 1 1 0.19 1 1 1 1 0.18 1 1 1 1 0.18 1 1 1 1 0.17 1 1 1 1 0.14 1 1 1 1 0.16 1 1 1 1 0.17 1 1 1 1 0.17 1 1 1 1 0.15 1 1 1 1 0.17 1 1 1 1 0.16 1 1 1 1 0.14 1 1 1 1 0.20 1 1 1 1 0.14 1 1 1 1 0.14 1 1 1 1 0.16 1 1 1 1 0.14 1 1 1 1 0.14 1 1 1 1 0.15 1 1 1 1 0.16 1 1 1 1 0.17 1 1 1 1 0.14 1 1 1 1 0.14 1 1 1 1 0.12 1 1 1 1 0.16 1 1 1 1
5) Coeficientes medios de morfologĂa foliar en grupo de L. philippiana x sempervirens de Llancahue. Ă rbol 1N01 1N04 1N05 1N06 1N07 1N08 2N01 2N02 2N03 2N04 2N05 2N06 2N07 2N08 2N09 2N10 2N11 2N12 2N13 2N14 2N15 2N16 2N17 2N18 3N01 3N02 3N03 3N05 3N06
ang a ang b 112.19 77.19 55.63 69.69 91.25 74.06 107.19 58.13 89.38 55.63 85.63 73.13 100.31 73.44 105.94 71.88 69.38 77.50 69.38 68.75 69.38 77.81 79.69 67.19 90.00 68.44 80.00 65.63 110.63 70.94 78.13 70.00 82.19 74.69 60.00 60.63 50.31 52.50 65.63 71.25 81.56 72.50 103.13 72.81 85.31 69.38 83.75 52.19 80.94 72.81 69.69 65.63 74.06 61.88 77.50 57.19 85.00 67.81
as 37.69 29.19 18.44 21.25 19.88 26.81 26.94 28.13 32.25 28.75 34.06 23.31 27.88 26.38 28.13 26.75 30.88 23.25 25.81 28.31 21.06 28.88 30.63 24.00 28.94 30.88 25.75 30.44 30.00
n 16.38 22.50 14.13 15.75 13.38 19.63 20.44 19.63 18.31 18.63 15.63 17.25 15.44 16.63 17.38 16.63 19.50 19.38 17.31 18.06 19.13 17.13 19.44 14.38 21.50 22.19 19.63 16.06 15.75
a/T 0.48 0.39 0.47 0.43 0.39 0.45 0.47 0.44 0.45 0.50 0.50 0.43 0.43 0.47 0.46 0.44 0.47 0.37 0.39 0.42 0.47 0.46 0.43 0.36 0.43 0.43 0.42 0.41 0.45
l/T 0.93 0.92 0.90 0.90 0.89 0.93 0.92 0.93 0.93 0.94 0.93 0.92 0.94 0.92 0.91 0.92 0.92 0.91 0.94 0.94 0.94 0.92 0.92 0.93 0.92 0.93 0.93 0.94 0.92
l/p 13.39 11.97 9.54 9.54 8.02 14.62 12.02 13.13 12.88 15.07 13.53 11.73 17.71 12.40 11.04 12.68 12.74 10.73 16.50 15.47 15.16 11.44 11.23 13.87 11.58 14.37 13.46 16.56 12.06
l/n 4.82 4.29 4.65 4.25 4.69 4.13 3.92 4.60 5.27 4.02 5.17 4.81 5.01 4.77 4.81 4.98 3.85 3.73 4.97 4.38 4.15 4.84 4.44 5.32 3.65 4.49 4.04 5.93 5.39
l/s 2.08 3.30 3.52 3.15 3.13 3.01 3.02 3.18 2.99 2.60 2.34 3.53 2.79 3.00 2.98 3.09 2.38 3.15 3.33 2.82 3.78 2.86 2.79 3.15 2.71 3.16 3.10 3.16 2.85
da/p 0.65 0.85 0.92 0.66 0.56 1.17 0.89 0.59 0.88 1.22 1.13 0.82 1.25 0.82 0.73 0.78 0.79 1.12 1.19 1.21 1.27 0.60 0.89 0.76 0.71 0.95 0.94 0.83 0.74
db/p 3.86 3.93 3.48 4.20 3.28 4.43 4.04 4.01 3.60 3.88 3.40 4.01 5.07 3.81 3.17 4.21 4.21 4.26 5.69 3.94 5.12 3.72 3.31 4.39 3.55 4.22 4.21 5.38 4.05
da/l 0.05 0.07 0.10 0.07 0.07 0.08 0.07 0.05 0.07 0.08 0.08 0.07 0.07 0.07 0.07 0.06 0.06 0.10 0.07 0.08 0.09 0.05 0.08 0.05 0.06 0.07 0.07 0.05 0.06
db/l 0.29 0.33 0.36 0.44 0.41 0.31 0.34 0.31 0.28 0.26 0.25 0.34 0.29 0.31 0.29 0.34 0.33 0.39 0.35 0.25 0.34 0.33 0.29 0.31 0.31 0.30 0.32 0.32 0.34
da/a 0.10 0.17 0.19 0.15 0.16 0.17 0.15 0.10 0.14 0.16 0.16 0.15 0.15 0.13 0.14 0.13 0.12 0.26 0.17 0.17 0.17 0.11 0.17 0.14 0.13 0.15 0.15 0.12 0.13
db/a Ss/Sn 0.57 2.34 0.78 1.32 0.70 1.32 0.93 1.37 0.92 1.51 0.64 1.38 0.67 1.37 0.65 1.46 0.58 1.79 0.50 1.56 0.47 2.20 0.72 1.38 0.64 1.84 0.62 1.61 0.59 1.63 0.71 1.63 0.65 1.62 0.97 1.21 0.84 1.50 0.57 1.58 0.68 1.11 0.65 1.70 0.63 1.62 0.81 1.70 0.66 1.36 0.67 1.44 0.70 1.32 0.75 1.90 0.70 1.98
ka Qas Qep Qtp Qpy 0.22 0.5 0.5 0 0.5 0.25 0.5 0.5 0 0.5 0.23 0.5 0.5 0 0.5 0.25 0.5 0.5 0 0.5 0.23 0.5 0.5 0 0.5 0.22 0.5 0.5 0 0.5 0.23 0.5 0.5 0 0.5 0.19 0.5 0.5 0 0.5 0.23 0.5 0.5 0 0.5 0.27 0.5 0.5 0 0.5 0.25 0.5 0.5 0 0.5 0.25 0.5 0.5 0 0 0.23 0.5 0.5 0 0.5 0.24 0.5 0.5 0 0.5 0.20 0.5 0.5 0 0.5 0.22 0.5 0.5 0 0.0 0.20 0.5 0.5 0 0.5 0.22 0.5 0.5 0 0.5 0.24 0.5 0.5 0 0.5 0.17 0.5 0.5 0 0.5 0.22 0.5 0.5 0 0.5 0.22 0.5 0.5 0 0.5 0.20 0.5 0.5 0 0.5 0.21 0.5 0.5 0 0 0.19 0.5 0.5 0 0.5 0.25 0.5 0.5 0 0.5 0.22 0.5 0.5 0 0.5 0.19 0.5 0.5 0 0.5 0.23 0.5 0.5 0 0.5
APÉNDICE 2 CÁLCULO DEL ÍNDICE DE HIBRIDACIÓN
1) Puntajes de Índice de Hibridación en población de L. sempervirens de Llancahue. Árbol
ang a
as
n
l/T
da/p
da/a
Qas
Qep
Qtp
IH
1S03 1S04 1S05 1S06 1S07 1S08 1S09 1S10 1S11 1S12 1S13 1S14 1S15 1S16 1S17 1S18 1S19 1S20 1S21 1S22 1S23 1S24 1S25 1S26 1S27 1S28 1S29 1S30 3S01 3S02 3S03
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0
2) Puntajes de Índice de Hibridación en población de L. sempervirens de Paillaco. Árbol
ang a
as
n
l/T
da/p
da/a
Qas
Qep
Qtp
IH
5S03 5S04 5S05 5S06 5S07 5S08 5S09 5S10 5S11 5S12 5S13 5S14 5S15 5S16 5S17 5S18 5S19 5S20 5S21 5S22 5S23 5S24 5S25 5S26 5S27 5S28 5S29 5S30 5S31 5S32 5S33
0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 2 0 1 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 1 2 0 0 1 1 0
3) Puntajes de Índice de Hibridación en población de L. philippiana de Llancahue. Árbol
ang a
as
n
l/T
da/p
da/a
Qas
Qep
Qtp
IH
2P01 2P02 2P03 2P04 2P05 2P06 2P07 2P08 2P10 2P11 2P12 2P13 2P14 2P15 2P16 2P17 2P18 2P19 2P20 2P21 2P22 2P23 2P24 2P25 2P26 2P27 2P28 2P29 2P30
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 8 10 10 10 10 9 10 10 10 10 10 10 10
4) Puntajes de Índice de Hibridación en población de L. philippiana de Puyehue. Árbol
ang a
as
n
l/T
da/p
da/a
Qas
Qep
Qtp
IH
6P03 6P04 6P05 6P06 6P07 6P08 6P09 6P10 6P11 6P12 6P13 6P14 6P15 6P16 6P17 6P18 6P19 6P20 6P21 6P22 6P23 6P24 6P25 6P26 6P27 6P28 6P29 6P30 6P31 6P32 6P33
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 0 1 0 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
9 9 10 10 10 10 10 9 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 9 8 10 9 9 10 10 10 9 9 7 10
5) Puntajes de Índice de Hibridación en grupo de híbridos L. philippiana x sempervirens de Llancahue. Árbol
ang a
as
n
l/T
da/p
da/a
Qas
Qep
Qtp
IH
1N01 1N04 1N05 1N06 1N07 1N08 2N01 2N02 2N03 2N04 2N05 2N06 2N07 2N08 2N09 2N10 2N11 2N12 2N13 2N14 2N15 2N16 2N17 2N18 3N01 3N02 3N03 3N05 3N06
0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0
1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1
0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0
1 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0
0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0
0 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
4 6 4 2 3 6 3 5 5 7 7 3 5 3 3 3 5 6 6 7 7 3 5 2 5 7 7 5 3
APÉNDICE 3 CROMATOGRAMAS DE FLAVONOIDES
1) Cromatogramas de L. sempervirens de Llancahue.
a) 1S06
c) 1S21
b) 1S07
2) Cromatogramas de L. sempervirens de Paillaco.
a) 5S04
c) 5S29
b) 5S16
3) Cromatogramas de L. philippiana de Llancahue.
a) 2P04
c) 2P24
b) 2P12
4) Cromatogramas de L. philippiana de Puyehue.
a) 6P08
c) 6P27
b) 6P25
5) Cromatogramas de los presuntos hĂbridos L. philippiana x sempervirens (continĂşa).
a) 2N07
b) 2N09
c) 2N10
d) 2N11
5) Cromatogramas de los presuntos h铆bridos L. philippiana x sempervirens (continuaci贸n)
e) 2N12
f) 2N13
g) 2N14
h) 2N15