Cultivo de bacteriasmicroaerofílicas:Campylobacter

Rev. Col. de MQC de Costa Rica (2002) vol. 8, número 5

116

Campylobacter

EDUCACION CONTINUA

Cultivo de bacterias microaerofílicas: Campylobacter Dr. Francisco Hernández Chavarría Facultad de Microbiología y Centro de Investigación en Estructuras Microscópicas (CIEMIC), Universidad de Costa Rica.

E-mail: hchavarr@cariari.ucr.ac.cr En la década de 1940 se informó de los primeros aislamientos de una bacteria curva, que fue denominada Vibrio fetus. El nuevo agente se aislaba de hemocultivos de pacientes que indirectamente habían tenido contacto con ganado bovino o caprino (1). Al descubrirse que la nueva bacteria era diferente de los vibrios conocidos, se propuso la creación de un nuevo género denominado Campylobacter, que etimológicamente significa “bacteria curva”. La especie tipo es C. fetus, relacionada con aborto en ganado y con septicemias en humanos. Pero fue hasta la década de 1970 cuando una nueva especie, inicialmente denominada C. fetus subsp jejuni, tomó importancia como uno de los agentes etiológicos más importantes en las diarreas (2).

Se trata de un bacilo, microaerofílico, Gram negativo, de cultivo lento (48 horas), cuya temperatura óptima es de 42°C y se considera un agente de cultivo fastidioso.

Esta bacteria tiene un aspecto curvado, por lo cual frecuentemente adquiere formas de C, S o espirilares, por lo general su diámetro oscila entre 0.2 y 0.5 (m, lo cual significa que es mucho más delgado que la mayoría de las bacterias que aparecen en las heces.

Además, muestra un movimiento muy activo gracias a la presencia de un flagelo polar no envainado en cada extremo.

En la década de 1970 se describió un binomio de especies que usualmente no se diferencian en la rutina de nuestros laboratorios por lo que se informan como C. jejuni/coli; además, se descubrieron otras especies relacionadas con diarrea como C. lari, C. upsaliensis, C. cinnaedi y C. fenneliae; estas dos últimas fueron trasladadas al género Helicobacter.

También, el género incluía a dos especies que eran denominadas Campylobacter atípicos por no ser microaerofílicos y crecer a temperatura ambiente; éstas eran C. nitrofigilis -un fijador de nitrógeno no simbiótico- y C. cryaerophilus.

Ambas, junto con otras dos nuevas especies fueron trasladadas a un nuevo género: Arcobacter; las dos nuevas especies de este género se relacionan con diarrea en humanos y otros animales y son A. butzleri y A. Skirrowii (3).

Cuadro clínico y epidemiología Campylobacter jejuni induce un cuadro de diarrea, que puede caracterizarse por heces líquidas tipo agua de arroz o bien con presencia de sangre y moco como en una disentería.

Se ha descrito prácticamente en todo el

Rev. Col. de MQC de Costa Rica (2002) vol. 8, número 5

117

mundo y en países desarrollados se asocia a brotes epidémicos relacionados con consumo de alimentos contaminados, especialmente pollo. En países en desarrollo su epidemiología le asocia más con contaminación fecal del ambiente al igual que ocurre con el resto de los agentes productores de diarrea.

Es un agente zoonótico que afecta una variedad muy amplia de animales que incluyen desde aves de corral y silvestres hasta ganado bovino y mascotas domésticas. En Costa Rica se ha encontrado una alta prevalencia en pollos muestreados en plantas de procesamiento (4, 5). Además, constituye uno de los agentes más importantes involucrados en las diarreas de niños (6, 7).

C. jejuni se incrimina como posible responsable del Síndrome de Guillain Barré (SGB), un desorden desmielinizante que afecta nervios periféricos causando una parálisis progresiva cuya recuperación tarda de 6 semanas a 2 años; también, puede presentarse una variante, conocida como el Síndrome de Miller-Fisher (oftalmoplejia y ataxia).

Ambos síndromes se relacionan con anticuerpos contra componentes del lipopolisacárido de Campylobacter que reaccionan con los gangliosidos GM1 y GQ1b del tejido nervioso. Se calcula que el SGB se presenta en 1 de cada 1000 pacientes que sufren infecciones por Campylobacter (8, 9).

Su temperatura óptima de crecimiento es de 42ºC. Éstas características dificultan su aislamiento a partir de muestras de heces u otro tipo de espécimen que presente una flora mixta y abundante; pues la mayoría de las bacterias fecales desarrollan colonias en menos de 24 horas, lo que enmascara las posibles colonias de Campylobacter. Por esta razón su aislamiento requiere medios de cultivo selectivos a base de antibióticos para inhibir a otras bacterias.

A las 48 de incubación esta bacteria puede mostrar dos tipos morfológicos de colonias; si se ha inoculado en un medio seco (previamente incubado unas 24 horas a 35ºC) se formarán colonias convexas de aproximadamente 1mm de diámetro e incoloras; pero, si el medio de cultivo es fresco, lo que significa que tiene mucha humedad, las colonias son más grandes, tendiendo a adquirir un aspecto de uso, cuyo eje mayor se orienta en el sentido del rayado, que incluso puede hacer que en las zonas de cultivo más densas de la placa las colonias tiendan a tocarse unas a otras.

Este último morfotipo colonial se debe al movimiento activo de este agente; por lo cual, en un medio fresco las bacterias nadan alejándose del centro de la colonia lo que hace que éstas tengan ese aspecto que algunos autores describen como gotas de agua.

¿Porqué se considera un agente fastidioso?

Los primeros aislamientos correspondieron a hemocultivos, por lo tanto, la muestra inoculada era sangre y posiblemente era el único agente infeccioso presente; por lo tanto no enfrentaba a otras bacterias que compitieran y se podía poner de manifiesto fácilmente. Una situación totalmente opuesta a la que se enfrenta

Campylobacter es considerado de cultivo fastidioso debido a varias características como: a) Es microaerofílico, b) Es de crecimiento lento, por lo cual las placas para el primoaislamiento se deben incubar por lo menos 48 horas, y c)

¿Qué progresos científicos favorecieron el reconocimiento de Campylobacter?

Rev. Col. de MQC de Costa Rica (2002) vol. 8, número 5

118 cuando se pretende hacer el aislamiento a partir de una muestra de heces. Sin embargo, dos de los investigadores que más colaboraron en el reconocimiento de este agente como causa de diarrea hicieron dos aportes metodológicos que propiciaron su aislamiento. Primero, el Dr. Skirrow ideó filtrar las muestras de heces diarreicas a través de membranas de filtro con porosidad de 0.5 (m, lo cual permitía retener a la mayoría de las bacterias presentes en la muestra y solo pasarían las bacterias más delgadas.

Posteriormente, el Dr Bützler ideó la confección de medios selectivos a base de antibióticos que inhibían el crecimiento de otros agentes.

Pronto se conoció la fórmula de cinco antibióticos en un agar sangre cuya base era el medio para Brucella, que fue conocido como Agar de Bütsler y posteriormente también Skirrow ideó otra fórmula más simple con solo tres antibióticos. Actualmente, existe una serie de fórmulas comerciales basadas en estas mezclas de antibióticos, que se conocen como suplementos B y S respectivamente (Cuadro 1).

Cuadro 1 Antibióticos* de los medios para Campylobacter Antibiótico Vancomicina Polimixina B Trimethoprin Cefalotina Anfotericina B

Butzler 10 mg 2500 U 5 mg 12 mg 2 mg

Skirrow 10 mg 2500 U 5 mg No No

* Proporción por litro de medio. El medio base es el agar Brucella o Campylobacter.

Sangre de un 7 a 10% (carnero o caballo), en nuestra experiencia utilizamos sangre humana sin problema.

Condiciones para aislamiento de Campylobacter Se debe utilizar un medio selectivo para este agente, si las muestras clínicas son heces es recomendable las fórmulas con cinco antibióticos pues inhiben más a otros agentes y prácticamente solo se aisla Campylobacter; si por el contrario, se trata de una muestra con una flora menos abundante, como pueden ser las muestras de alimentos, entonces pueden emplearse las fórmulas menos inhibitorias. Las placas deben incubarse en microaerobiosis durante un mínimo de 48 horas a 42ºC. Identificación de Campylobacter En 1983 escribimos una guía detallada donde se indicaba detalladamente la metodología para el aislamiento de esta bacteria (10); sin embargo, sigue siendo uno de los agentes mencionados como posible causa de diarrea que no se buscan rutinariamente en nuestro país y a lo sumo se diagnostica con pruebas que solo son presuntivas. De las colonias sospechosas se debe hacer una tinción de Gram, en la cual el colorante de contraste -safraninadebe cambiarse por fucsina; pues de lo contrario el contraste es muy pobre y es difícil visualizar la bacteria. Si se trata de formas Gram negativas, delgadas y curvas; que además, son oxidasa y catalasa positivas posiblemente se trata de Campylobacter jejuni/coli. Adicionalmente se deben realizar las pruebas biológicas de sensibilidad a ácido nalidíxico y cefalotina. En el sistema API se tiene una serie de pruebas bioquímicas que permiten identificar hasta especie (Cuadro 2).

Rev. Col. de MQC de Costa Rica (2002) vol. 8, número 5

Cuadro 2 Algunas características para la identificación de Campylobacter1 Especie

Hipurato

C. jejuni2

+

C. coli C. lari C. fetus

3

Acido Cefalotinas Nalidíxico S

R

-

S

R

-

R

R

+

R

S

1. Todas las especies son oxidasa y catalasa positivas; además, las indicadas en este cuadro reducen nitratos y no producen H2S. 2. C. jejuni subsp doley es nitratos negativa.

3. De estas especies solo C. fetus crece a temperatura ambiente. El resto lo hacen a 35 y 42°C.

Diagnóstico presuntivo Posiblemente el hecho de que se trate de una bacteria tildada de “fastidiosa” ha hecho que su aislamiento no sea incluido en la rutina bacteriológica de muchos laboratorios clínicos. Lo que ha llevado a incorporar algunos de los métodos de diagnóstico presuntivo como parte de una rutina mal fundamentada, cuando en realidad deberían orientarse los esfuerzos al aislamiento e identificación de una bacteria que posiblemente representa a una de las principales causas de diarrea (6).

Los dos métodos más simples de diagnóstico presuntivo son la tinción de Gram de extendidos de heces en busca de bacterias con morfología similar a Campylobacter; aunque en muchos laboratorios se hace tinción de Giemsa para buscarla junto con Cryptosporidium.

119 El otro método de diagnóstico presuntivo es la observación de preparaciones a fresco -entre lámina y laminilla- ya sea en campo oscuro o campo claro, buscando bacterias con un movimiento muy activo, tipo dardo, capaces de atravesar el campo microscópico en fracciones de segundo (11). Este agente se mueve a 19 (m/seg.

(12).

Microaerobiosis Las formas usuales de generar la atmósfera microaerofílica requerida por Campylobacter incluyen: a. Evacuación con reemplazo: En esta metodología se extrae el aire de una jarra y se reemplaza con la mezcla apropiada (5%O2, 15% CO2 y 80% N2). Esto se hace en una jarra para anaerobiosis cuya tapa debe tener una o dos válvulas para extracción de gases; la extracción del aire se hace con una bomba de rotación (“bomba de vacío” como usualmente se le denomina) y se repone la atmósfera a partir de un cilindro con la mezcla mencionada. Es importante, que el sistema tenga un manómetro para controlar la presión.

Obviamente el sistema es engorroso pero económico. b. Empleo de sobres generadores de microaerobiosis: Al menos la compañía BBL ha desarrollado un sobre generador de CO2 e H2 similar al empleado para anaerobiosis; pero cuya dosificación provee la atmósfera microaerofílica. Este sobre se denomina CampyPak y requiere una jarra y el correspondiente catalizador para que el H2 generado se combine con el O2 y forme el agua. Sin embargo, una de las prácticas más comunes es

120 utilizar el sobre generador para anaerobiosis en una jarra sin catalizador. Obviamente el sistema es caro, pues cada sobre tiene un costo de 1 a 3 dólares; además, el costo se eleva más si se toma en cuenta el precio de la jarra, que oscila alrededor de $500. No obstante, es posible construir jarras a bajo costo empleando tubos de PVC (13). c. Una vela encendida y una AlkaSeltzer®: Uno de los métodos más económicos para generar microaerobiosis es la sustitución de la jarra por un frasco de vidrio de 4 litros con tapa de rosca a la cual se le pone un empaque adicional hecho con un neumático de automóvil. Como generador de microaerobiosis se utiliza una vela, que reduce un poco el oxígeno y aumenta el CO2, que también se incrementa con una AlkaSeltzer.

La tableta efervescente se coloca dentro de un frasquito con unos 15 ml de agua o bien, si hay muchas placas se aprovecha el espacio sustituyendo el frasquito por una bolsita plástica que se pega a la pared del frasco con cinta adhesiva. El resultado final es una atmósfera microaerofílica, que hemos utilizado rutinariamente para el aislamiento de Helicobacter (14). d. Inflando una bolsa plástica: El método más económico consiste en sustituir la jarra por una bolsa plástica con cierre tipo cremallera (tipo Zip-lock) y generar la atmósfera microaerofílica exhalando dentro de ella para inflarla. Al respirar nuestros eritrocitos están utilizando el O2 por lo que exhalamos un aire rico en CO2, que brinda una atmósfera apropiada para Campylobacter; sin embargo, debemos repetir la operación de inflar y

Rev. Col. de MQC de Costa Rica (2002) vol. 8, número 5

desinflar la bolsa unas 4 a 5 veces para cambiar la atmósfera interna, incluyendo el espacio entre las placas. En realidad lo que estamos realizando es la aplicación del método de “evacuación con reemplazo”.

Probamos este método en 138 hisopados de cloaca de pollos, inoculadas por duplicado en agar de Blaser; un juego de placas se incubó en jarras con el sobre CampyPak y el otro en bolsas plásticas, tal como se describió. El resultado fue que aislamos la bacteria en 136 (98%) muestras en la jarra y en el 100% en la bolsa; o sea, hubo dos muestras en las cuales aislamos la bacteria solo en las placas incubadas dentro de la bolsa plástica. Además, las colonias eran de mayor tamaño en ésta que en la jarra; la inoculación de diluciones de una cepa mostró que el recuento de unidades formadoras de colonias no tuvo diferencias significativas en ninguno de los dos casos (15).

Conclusión El aislamiento e identificación de Campylobacter jejuni/coli no es tan difícil o complicado como podría suponerse por el calificativo de “agente de cultivo fastidioso”; además, representa una de las causas más importantes de diarrea en todo el mundo, considerándose uno de los agentes que se involucra frecuentemente en brotes epidémicos asociados con contaminación de agua o alimentos, especialmente pollo. Sin embargo, en Costa Rica su aislamiento no se involucra en la rutina bacteriológica de la mayoría de los laboratorios.

Posiblemente, el coste de la generación de las condiciones de microaerobiosis requeridas constituye el escollo más

Rev. Col. de MQC de Costa Rica (2002) vol. 8, número 5

importante para tal fin, por lo que creemos que la solución sería el empleo del método de evacuación con reemplazo realizado en una bolsa plástica, la cual solo tenemos que inflar soplando en ella a través de una manguera de hule.

Esperamos que esta información sea de utilidad y se aplique rutinariamente en nuestros laboratorios; si se quiere, como un paso adicional a las muestras de heces en las cuales los métodos de diagnóstico presuntivo -frotis teñido o campo oscuro- han sido positivos; aunque, idealmente debería buscarse Campylobacter en todas las muestras de heces diarreicas.

Referencias 1. Middelkamp, J.N., Wolf, H. (1961) An infection due to a “related” vibrio. J Pediatr 59, 318.

2. Dekeiser, D., Gossivin-Detrain, M., et al. (1972) Acute enteritis due to a related vibrio: First positive stool cultures. J Infec Dis 125, 390.

3. Nachamkin, I. (1995) Campylobacter and Arcobacter. En: Manual of Clinical Microbiology, 6th ed. (Murray, P.R., Baron, E.J., Pfaller, M.A., Tenover, F.C., Yolken, R.H., Eds.) p.483-491 ACMP, Washington.

4. Rojas, X., Rojas, Y., Soto, L., Delgado, D., Hernández, F. (1996) Campylobacter en pollos para consumo humano. Rev Cost Cienc Méd 17, 34-39.

5. Pacheco, K., Peña, Y., Gamboa, M.M., Hernández, F. (1999) Prevalence of Campylobacter in chickens in a tropical environment. Rev Bioméd 10, 63-64.

6. Rivera, P., Hernández, F., Rodríguez, R., Herrera, M.L. (1983) Observaciones sobre la epidemiología de Campylobacter fetus spp jejuni. Rev Med Hosp Nal Niños 18, 21-29.

121 7. Mata, L., Simón, A., Padilla, R., Gamboa, M.M., Vargas, G., Hernández, F. et al. (1983) Diarrhea associated with rotaviruses, enterotoxigenic Escherichia coli, Campylobacter, and other agents in Costa Rican Children. Am J Trop Med Hyg 32, 146-153.

8. Tsang, R.S. (2002) The relationship of Campylobacter jejuni infection and the development of Guillain-Barre syndrome. Curr Opin Infect Dis 15, 221-228.

9. Schwerer, B. (2002) Antibodies against gangliosides: a link between preceding infection and immunopathogenesis of Guillain-Barre syndrome. Microbes Infect 4, 373-84 10. Hernández, F., Rivera, P., Herrera, M.L., Rodríguez, R. (1983) Aislamiento y diagnóstico de Campylobacter fetus spp. Jejuni. Rev Med Hosp Nal Niños 18, 1-19.

11. Paisley, J.M., Mirrett, S., et al. (1982) Dark-field microscopy observation of human feces for presumptive diagnosis of Campylobacter fetus subsp. jejuni enteritis. J Clin Microbiol 15. 61.

12. Hernández, F., Vincenti, J., Rivera, P. (1984) Estudio de la movilidad bacteriana empleando televisión en circuito cerrado. Rev Biol Trop 32, 309-312.

13. Obando, S., Barrantes, M., Hernández, F. (1999) Construcción y evaluación de una jarra económica para anaerobiosis.

Rev Cost Cienc Méd 20, 175-181.

14. Hernández, F., Rivera, P. (1991) A low cost method for production of the gaseous environment for isolation of Helicolobacter pylori. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 34, 167-169.

15. Hernández, F. (1996) A simple and inexpensive method to generate a microaerophilic atmosphere for the isolation of Campylobacter sp. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 38, 241-242.