LA MICROSCOPIA ELECTRÓNICA Y LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS

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Rev.Col.de MQC de CostaRica(2002)vol. 9 número5 bibliográficoa que nos estemossometiendo. En todo caso,lo más simplees buscar la información en una revista científica.

Usualmenteapareceuna secciónconocida como "Guía para los autores"en la cual se da información detallada.La Revista de CienciasMédicaspublicó Costarricense en el año 2000 un folletito con susindicaciones,que ademásincluye los lineamientos para la presentaciónde manuscritosy que está disponible en la biblioteca BINASSS o bien en la dirección wwwrccm.sa.cr.

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CONCLUSIÓN Debemos ver en el Protocolo esa especie de seguro de éxito, que nos delimita el campo de juego, define 1as reglas y las normas que seguiremosy además,nos organizael tiempo, según las metas que debemos alcanzat en cada periododel estudio.Estoresultaparticularmente importante pues a veces, una vez aprobadoel protocolo no se inicia de inmediatoei trabajoo nosquedamossolo en una determinada etapa sin avanzal; esto es' nos quedamosen uno de los objetivos específicosperdiendode vista la globalidad del proyecto. Por estas razoneses muy importante, plantear adecuadamenteel hacery no protocolode lo quepretendemos solo como un requisito.

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LA MICROSCOPIA

ELECTRÓNICAY LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS Francis co H erruúnilez-Chavarrla Facultadde MicrobiologíaY Centro ile Investigación en Esfiucturas Microscópicas ( CIEMic), Universidad de Costa Rica, SanJosé, Costa Rica, e-mail: hchavarr@cariari.ucr.ac.cr El primer microscopioelectrónico(ME) que se construyó podía aumentarla imagen poco más de l7X. El aumento de los microscopiosactualessobrepasael medio miilón de vecesgraciasa que su resolución es de tan solo 1,4.4.

Los albores dé la historia del ME estuvieron matizados de injusticia. Su creador, Ernst Ruska, era estudiante en el laboratoriode investigaciónen alto voltaje y televisión de la Universidadtécnica de Berlín, cuando diseñó 1o que él llamó un lente elecffomagnético,con el cual se

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Knoll, reconocióel valor de la invención de su alumnoy lo inscribióen un simposio científico que se realizaía el 4 de junio de 1931.Pero Knoll cometió un error: contó los detallesde la invenciónde su alumnoa un amigo,quien a su vez se los comentóa otro amigo. Este último era R. Rudemberg, jefe de ingenieros de la compañía Siemmens,quien con esosdatospatentóel lente electromagnético,el microscopio electrónico y cualquier otro instrumento que se pudiera construir con esos lentes.

Su patente está fechada el 30 de mayo de 1931,tan solo 5 días antesde que Ruska y Knoll presentaran oficialmente su invenciónen el Simposio.

Una vez que Ruska se graduó y ante la falta de empleos en la Alemania de entre guerras, no tuvo más recurso que trabajar en la CompañíaSiemmens,de donde salió el primer prototipo comercial del ME en 1934.Ruska emigró a los EEUU después de la SegundaGue¡ra Mundial y continuó trabajandoen el perfeccionamientodel ME en la compañíaRCA (1). Estahistoriatiene un final feliz pues Ruska recibió el premio Nobel en 1986y el reconocimientooñcial como padre de la microscopia electrónica; aunqueeso ocurrió tan solo dos años antes de su muerte.

Actualmente, el ME se ha consolidado como un instrumento científico aplicable al estudio biomédico y de otros campos tan diversoscomo la flsica, ingeniefa y arqueologla, entre una gran gama de aplicaciones.

Por ejemplo, en arqueología es importante señalar que en Costa Rica la licenciadaPatricia Fem¡ández,del Museo de Oro del Banco Nacional,ha conducido estudios ultraestructurales importantes de piezas precolombinasy sus hallazgos han permitido una mejor interpretación de esos obietos v de las técnicas de

EL MICROSCOPIO ELECTRóNICO COMO HERRAMIENTA DIAGNOSTICA Las primerasobservaciones de virus al ME fueronrealizadasen la décadade 1950, mediantesombreadode los viriones. Esto es, que la preparaciónde virus es sometida a vapores de un metal como platino o cromo, lo que implica el empleo de evaporadores de metales que deben trabajar a alto vacío, consumiendo un tiempo mínimo de 2 a 4 horas por preparación.

Las observacionesposteriores se hicieron mediantela técnicade tinción negativa, que consisteen colocarunagotitade unos5 pl del material donde se buscan los vi¡us en una rejilla para ME y una vez que la preparación se ha secado,se contrastacon un compuestode un metalpesado,como es el ácido fosfotúngstico,lo cual tarda unos 10 a 15 minutos.Esta técnicaes ani4logaa un frotis teñido sobre un portaobjetos y su simplicidad abrió una nueva senda diagnósticaen virología.

El potencial del ME como herramienta diagnóstica en virología comienza a explotarseen la décadade 1960 (2). Para esaépoca,la identificaciónde los virus se rcalizaba mediante cultivo, ya fuese en monocapascelulares,en huevosembrionados o medianteinoculaciónen animales,lo que usualmentetardabamás de 48 horas y el resultadoa vecesno era concluyente, Las primeras aplicacionesde la ME fueron en el diagnóstico diferencial de viruela, frente a otras virosis como sarampión, varicela y en general con cuadros exantemáticos.Obviamente, en una época donde la viruela era endémica en algunas regiones de medio oriente y

Rev.CoL de MQC de CostaRica (2002)vol. 9 número5 occidenteparaevitar brotesepidémicos(2, 3). La ventajadiagnósticaes que el virus de la viruela tiene una morfología caracteística.

También, la ME permitió visualizar el AntígenoAustraliaen la décadade 1960, lo que reforzó más la etiología viral de la hepatitisB en esaépoca,cuandoello era solo una sospecha(4).

ETIOLOGÍA VIRAL DE LAS DIARREASY LA MICROSCOPIA ELECTRONICA Hacia finales de la décadade 1960 se identificaba el agentecausalde las diarreas en aproximadamente an 20Vode los casos, quedandoel resto como casosde etiología desconocida, en los cualessesospechaba la presenciade algún agenteviral, lo cual se habíaplanteadodesde1930.Hubo algunas investigaciones que evidenciaban la prcsencia de virus lo que indirectamenteera confirmado mediante la dianea que sufrían los voluntarios que ingerían filtrados libres de células de las heces dia¡reicas de pacientes(5).

En 1973se publicaronlos dos primeros informes en los cuales se mostrabanlas fotografías tomadasal ME de los rotavirus, lo que desencadenaría una avalanchade publicacionesen todo el mundo, que llevaron a confirmar a este agentecomo la causa principal de dianeas infantiles. El . primero de esosÍabajos correspondióa la doctora aust¡aliana Ruth Bishop, quien inicialmenteenvió una carta a la revista The Lancet informando del primer caso de diarreaen el cual los virionesaparecíanen una biopsia de duodeno.Sin embargo,las políticas editorialesde la revista en esa

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solocaso,por lo cual el trabajofue techazado. Semanasmás tarde enviaron una nueva nota, esta vez con la recopilación de 9 casos,la cual fue publicada(6).

El segundotrabajo correspondióal Dr Flewett. quien descubriólos mismos viriones en las hecesde niños con diarrea.

Este trabajo sería el que motivaría a repetirlo infinidad de veces en todo el mundo pues la metodologíaempleadaera la tinción negativá, lo que permitía el diagnósticodel virus en minutos (7).

En CostaRica, la investigaciónde estos virus al ME llevó a la descripción del primer brote anual en 1977 (8), precedida de algunas otras publicacionescomo se resumenen el artículo "Una visión de la biología tropical a través del microscopio electrónico"(9).

La investigación de las heces dia¡reicas al ME condujo al hallazgo de una pléyade de vi¡us involucradosen la etiología de las diarreas,entte los que sobresalencomo los más importanteslos adenovirus,astrovirus, coronavirus, calicivirus y un grupo heterogéneo de virus cuyo diiámetroes cercano a los 27 nm, por 1o que fueron denominados como 'Agentes de 27 nm" o bien como "Pequeños virus isomórficos". En este grupo se identificó al virus Norwalk como uno de los más ptevalentes;actualmente está clasificadoen la familia Caliciviridae y constituyeuno de los principalesagentes viralesde dia¡reaen adultos(10).

Los primeroshallazgosde Adenovirus en hecesestuvieronmatizadosde incefidumbre anteel dilema dé si realmentese trataba de vitus respiratorioso de un agentecausal de diarrea;esto,por cuantola mayoríade los estudiosse realizabanen hospitalesy se tomaba como controles a pacientes sin dianeainternadospor otrascausas,entrelas quesobresalían las infeccionesrespiratorias. q¡{pnm¡i¡'¡

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por lo que en un principiose respiratorios 'Adenovirusno cultivables". les calificó de Posteriormente se perfeccionaron las técnicaspam su cultivo y se demostróque se trataba de Adenovirus entéricos, ia mayoría de los cuales correspondea dos 40 y 41 (11). serotiposdenominados También, con los coronavirus hubo incertidumbre, pues incluso se ptopuso que podríanser detrituscelularesmás que viriones. Hoy, es consideradouno de los agentescausalesde diarrea que afectan a niños.aunquesu mayor importanciaes en temeros y cerdos. En Costa Rica fueron relacionadoscomo el segundoagente más impofante, luego de los rotavirus, en las diarreasde terneros(12) y también,se han identifrcado como el segundoagente viral involucradocon el brote de diarrea infantil, que sepresentaentre noviembre y enero de cadaaño(13).

Otro agente viral relacionado con diarrea en humanos son los Torovirus, pertenecientea la familia Coronaviridae.El segundolugar en frecuencia, luego de los fot¿virus, lo disputan en este momento los astrovirusy los calicivirus,que al ME son demostradosesporádicamentedebido a que seexcretanen bajacantidady a su pequeño tarÍaño (2'1 nm); sin embargo, las técnicas de inmunoensayos con antlcuerPos monoclonalesy las pruebasde diagnóstico molecular han mostrado que estos virus son más frecuente que los adenovirus, a un cuartolugar en cuanto desplazandolos a prevalenciaen diarreasinfantiles(10).

Como se mencionó previamente,los roiavirus ocupan el primer lugar en cuanto a frecuencia,y presentanun rncremento en la incidencia durante los meses más flos del año,tantoen paísesdesarrollados donde se cuenta con medidas higiénicas como en paísesen desarrollo, adecuadas-.

No obstante,sehanencontradoen aguas y vegetales.En CostaRica fueron detectadosen lechugascompradasen las Feriasdel Agricultor (14).

Actualmente, se han descrito 7 grupos de ¡otavirusdenominadoscon las letrasde A a G, de los cualessolo los A, B y C afecta¡ a humanos;el primero es el de mayor prevalenciamundial, en tanto los otros dos se han relacionadocon brotes esporádicos;de esos, el grupo B fue responsable de una gran epidemia en China en 1982en Ia cual al principiose desconocíael agente, pues las muestras por rotavirusmediantela técnica analizadas de ELISA dabanresultadosnegativos;pero, fueron detectadosal ME, por lo que se les calificó como "Pa¡arotavirus"dado a que no compartíanlos antígenosque permitían el diagnóstico serológicode los rotavirus descritoshastaesaépoca(10).

En general el descubrimiento de los virus de las diarreas se ha realizado al ME, con excepciónde los Picobirnavirus, último agente de esta serie desc¡ito en la décadade 1990.Su descubrimientoocunió por serendipia:Se investigabala presencia de rotavirus medianteelectroforesiscuando se descubrieronunas bandas dobles de ARN que no correspondíana totavirus y que se asocr¿fona un nuevo vrrus, cuyo genoma está integrado por unos 2 o 3 segmentosde ARN de doble banda,por 1o que se denominóPicobirnavirus(15)' Actualmentese han descritoestosvirus en u¡a serieamplia de ve¡tebrados,inclui yencopeces.

SIDAY LAAPARICIÓN DE NUEVOSAGENTES INFECCIOSOS

Rev.CoI. de MQC de CostaRica (2002) vol. 9 número5 muchas entidades infecciosas, algunas causadaspor agentesotrora considerados no virulentos.

Nuevamentela microscopiaelectrónica fue la henamientaque permitió esclarecer muchasrelacionesultraest¡ucturales entre esosagentes.Por ejemplo, se redescubrió el género Cryptosporidium, que emergió comoun agenteimportanteen la causalidad de las diarreas.En un principio se consideró a Cryptosporidium como el único coccidio extracelular; pero el análisis ultraestructural demostróque se trataba de un parásitointraceiular, solo que se localiza inmediatamente bajo la membrana citoplasmática. Aunque los primeros diagnósticos asociaban a este parásito con pacientesinmunosupresos,luego se demostró que también afectabaa personas sin problemas inmunológicos de fondo; solo que en éstosel cuadroera más leve y autolimitado.

En esa misma década se descubrió otro coccidio relacionadocon las diarreas.

Tempranamentese asoció con la diarrea del viajero ya que aparecíaen individuos de países desarrollados que recientemente habían viajado a iáreastropicales, aunque existe un informe previo de su hallazgo en humanos,que data de 1979. Inicialmente eseagentefue consideradouna alga y poste¡iormente se clasificó como Ciclospora cayetanensis, En este caso, se trata de un coccidio que al microscopio de luz se parece a Cryptosporidíum, solo que mide prácticamenteel doble que éste(16).

Adicionalmente,en la décadade 1990 . se redescubrióotro grupo impoÍante de coccidios involucradoscon las diarreas, Estavez, se tratade agentescuyosesporas -única forma capaz de sobrevivir fuera del hospedero-tienen un tamaño que oscila desde 1 pm (Enterocytozoonbieneusi) (Rn¡illi¡lhtm

105 causalesde diasreaE. bieneusi,E. cuniculi y Encephalitozoonintestínalís.Además, otras especies se han asociado con patologías como keratoconujuntivis, cuadros respiratorios, miositis, nefritis, hepatitis, encefalitis e incluso cuadros generalizados desgastantes.

Entre las nuevas especies están Brachiola (Nosema) algerae, Nosema oculatum, Microsporidium ceylonensis, Pleistophora sp., Trachipleistophora hominis, T. Anthropophtera y Vttforma comeae.Actualmentese han descrito 143 géneroscon 1200especies13 de las cuales afectan a humanos (17). No obstante, aparentementeeste agente evolucionó a partir de los hongoszygomicetales(18).

Independientementede su posición filogenética,la microscopiaelectrónicase convirtió en la herramienta diagnóstica inicial para clasificar las especies de microsporidios, pues el número de espiras del filamento polar, una estructuracaracterística de estos parásitos es impofante (19). taxonómicamente El estudioetiológico de las diarreasde los pacientes inmunosupresoscondujo al descubrimiento de otras especies de Campylobacterrelacionadascon diarrea aparte de C. jejuni, como son C. larus, C. fenneliae y C. cinaedi. Las dos últimas fueron reclasificadas posteriormenteen el gércro H elicobacter (20).

SIGLOXXI. LA MICA.OSCOPIA ELECTRONICAYLAS INFECCIOSAS ENFERMEDADES El campo de la bacteriología muestra dos descubrimientosinteresantesen los cuales la microscooiaelectrónicaes una

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106 bacterias cuyo pequeño tamaño (50 y 200 nm) les permite atravesar los filtros otrora considerados"esterilizantes". Por lo tanto, se trata de bacterias visibles solo al microscopio electrónico y que aparentementeestán relacionadas con la etiología de las litiasis renales. Aunque algunoscientíficosdudande su existencia, asociandolos hallazgosmás a precipitaciones químicas de sales de calcio que a agentesbiológicos,la evidenciamicroscópica sugiere que se trata de bacterias bacilares recubiertas de un glicocalix que incorporasalesde calcio (21).

El otro hallazgo trascendentales el descubrimiento de citoesqueleto bacteriano, constituido por un forro proteico locali zadobajo la membranacitoplasmática,con proyecciones que atraviesan el cuerpo de la bacteria, en las cuales se adosan los polisomasbacterianos.

Aunque, esoshallazgos parecensolo de ciencia básica, sus aplicacionesprácticas son muy esperanzadoraspues las evidencias ultraestructurales muestran como la incorporación de fragmentos de ese citoesqueletoprovoca su destabilización y destrucciónde la bacteria. Por lo tanto, su aplicación será una nueva generación de drogasantibacterianas(22).

Centro de Investigación en Estructuras Microscópicasy continúacon supolíticade prestarservicio a la comunidadcientífica nacional e incluso extranjera,vendiendo servicios de análisis ultraestructural en campostan diversoscomo biología,medicina, agronomíay ciencia de materiales.

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CONCLUSION Han transcurrido unos 70 años desde que salió al mercado el primer ME y en este peíodo se ha consolidadocomo un instrumento importante en la investigación en el campo de biomédica,especialmente la virología, en el que sigue siendo un instrumento impofante en los laboratorios de referencia.No obstante,su aplicación en biomedicina es parte de una rutina en muchos laboratoriosde paísesdesar¡ollados.

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