Revista Panameña de Laboratorio Clínico e Investigación by ConalacPma

ISSN2309-2955 Volumen 4 Número 2 Agosto 2013

Panamá

Bendiciones Colegas y Lectores: Nos complace presentarles este volumen de la “Revista Panameña de Laboratorio Clínico e Investigación” del Colegio Nacional de Laboratoristas Clínicos de Panamá. Teniendo en cuenta que, los profesionales del siglo XXI enfrentan un mundo muy diferente al de otras generaciones y que los procesos como la globalización y el desarrollo de la tecnología, han ejercido influencias en ámbitos como la investigación e impactos sobre la educación nace este volumen, el cual no solo apunta esencialmente a publicar novedades; sino que también busca dar a conocer dentro del mundo académico los resultados de las investigaciones en curso y a aquellos profesionales innovadores, que son la base fundamental del progreso de las ciencias. En consecuencia de esto, el estilo de nuestro escrito es altamente técnico reconociendo el liderazgo de esta labor en el interminable proceso de la docencia continua. Con una intención muy respetuosa y sin deshonrar de forma alguna los conocimientos que cada autor quiere trasmitir en su publicación, el material publicado fue sometido a evaluaciones por el comité editorial y el grupo de pares revisores, especialistas en cada área, con el fin de cumplir los requisitos internacionales para registrarnos internacionalmente. A partir de esta edición obtenemos con mucho orgullo, esfuerzo y dedicación para ésta, TÚ REVISTA el código numérico ISSN (International Standard Serial Number). En el mundo cambiante de hoy, todas las investigaciones son necesarias y es fundamental darlas a conocer mediante algún instrumento. Esta Revista es una herramienta accesible y funcional para divulgar tus esfuerzos dentro de la comunidad académica y profesional de nuestro país. Es por eso que les exhortamos a que se animen a publicar sus aportes a la profesión y permitirnos dentro del gremio mantenernos en constante actualización. Insistir en la necesidad de la calidad para aumentar la cantidad de artículos, revisiones y proyectos de investigación nos atañe, para continuar brindando una revista de calidad científica, técnica y profesional. Por último, agradecemos: a los autores por su aceptación a las modificaciones que se realizaron durante el proceso de edición, a nuestro diseñador por su apoyo y a todos los que colaboraron indirectamente en la creación de este volumen. Esperamos que disfrutes esta selección, que sea de tu interés y pueda aplicarse a tu labor en reconocimiento del esfuerzo y dedicación del comité editorial en contribuir a la profesión. ¡BIENVENIDOS! Comité Editorial

ISSN2309-2955 Volumen 4 Número 2 Agosto 2013

Visión Nuestra visión es hacer que ésta publicación transcienda las fronteras de nuestro Colegio; mediante un reconocimiento a nivel Nacional e Internacional; estimulándolos a todos los profesionales de nuestro país a mostrar sus propias realidades, avances científicos y proyectos de investigación para así brindar artículos de calidad y carácter original.

Misión Difundir artículos de alta calidad científica y tecnológica elaborados por nuestros profesionales, contribuyendo al conocimiento y desarrollo del país; mediante investigaciones, artículos de revisión, desarrollos tecnológicos, actualizaciones científicas u otros trabajos.

Padre; Nosotros los laboratoristas clínicos te damos gracias por el privilegio que nos das al contribuir con nuestros conocimientos en la salud de nuestros semejantes. -Te pedimos por aquel que yace en una cama o tiene alguna dolencia. -Disposición por dar más de nosotros, por quien sólo confía en ti y ciegamente se pone en nuestras manos. -Integridad por la vida y el derecho ajeno. -Pasión por nuestro trabajo y ánimo de superación. -Respeto a nuestros colegas, compañeros de milicia y a todo el equipo de salud. -Humildad para reconocer nuestros errores, aprender de ellos y mucho más de ti, llegando a ser mejores profesionales. -Fe para creer que por encima de cualquier diagnóstico o padecimiento, que tus milagros aun existen. -Espacio para nuestras familias y compartir con ellos los tesoros de la vida. Padre, en tus manos no somos más que seres humanos dando lo mejor de nosotros en beneficio de otros, como un día lo hiciste Tú. Danos la fortaleza para seguir adelante y nunca desmayar. Lic. Juan Carlos Pinto

Agradecemos a nuestros Pares Revisores por brindar sus conocimentos y capacidades en la edición de este volumen de la Revista. Esperando contar con su colaboración de su amplia experiencia dentro del área científica que maneja en cada laboratorio; así con sus aportaciones de criterios y observaciones para poder elevar la calidad de nuestras publicaciones, optimizar los procesos editoriales y ofrecer una más ágil publicación. Dios les Bendiga: Maura Ballesteros, TM. Banco de Sangre, Hospital Santo Tomás. Irene Espinosa, TM. Microbiología, Instituto Oncológico Nacional.

¹Kerube Cerceño, ¹Lilian Jara, ²Patricio Gonzàlez-Hormazàbal. ¹Escuela de medicina,Universidad de Chile. Santiago, Chile. Recibido, 30 de julio de 2013 Publicado, agosto de 2013 Palabras clave: Cáncer de mama; SNP; FGFR2; MAP3K1 Abstract:

Breast cancer (BC) is one of the major health problems of woman worldwide. Risk factors attributable to the development of disease include: age, ethnicity, hormonal exposure and genetic factors, being the latter the most important. Current model proposed to explain genetic susceptibility to BC is the polygenic one, and includes the involvement of high, moderate and low-penetrance genes. Low- penetrance genes FGFR2 and MAP3K1 presented the highest associations with increased risk of BC. FGFR2 gene encodes growth factor receptor and MAP3K1 gene encodes serine/ threonine kinase, member of mitogen activated kinases (MAPK). The event downstream of FGFR2 activation pathway includes the MAPK pathway. In addition of their individual effect, is postulated that the interaction between both genes may increase the risk of BC. Recently, many studies have been conducted in women from European, Asian and African origin in which differences in risk estimates to BC could be attributable to differences in genetic structure. Currently in Chile and other South American populations, there are not studies analyzing low-penetrance BC genes with increase risk of familial BC. The completion of these studies could help to understand the genetic basis of susceptibility of BC in this population. This study show the association with BC risk of low-penetrance variants rs1219648, rs2981582 and rs2420946 (FGFR2 gene) and rs889312 (MAP3K1 gene), and the interaction between both genes. A case- control study was performed in 307 cases of familial BC BRCA1/2 negative and 614 healthy controls without familial BC history. Genotyping was performed using 5'Exonuclease Taqman® assay. The results showed that the risk allele frequencies of FGFR2 variants were higher in cases (values between 0.48 and 0.49 for the three SNPs of FGFR2 gene) compared to controls (value of 0.40 for the three SNPs). The FGFR2 gene variants were associated with increased risk of BC in homozygous for the risk allele (rs1219648 GG OR= 1.83[CI 95% 1.2 – 2.8]; rs2981582 TT OR= 1.91[CI95% 1.3 – 2.9]; rs2420946 TT OR= 2.03[CI95% 1.3 – 3.1]) for the complete sample. After stratification by family history, the highest associations were for the risk homozygous of SNP's rs1219648 and rs2420946 (OR= 2.15 [CI95% 1.1 – 4.1] and OR= 2.27 [CI95% 1.2 – 4.2], respectively) in BC cases without family history diagnosed at age ≤50 years. For SNP rs889312 (MAP3K1 gene), results showed that risk allele was higher in cases (0.45) compared with controls (0.36) of entire sample. Also, after stratification by family history, the highest association was for the risk homozygote CC (OR= 2.40 [CI95% 1.3 – 4.4]) in BC cases without family history diagnosed at age ≤50 years. Currently in Panamanian population, there's not any study in FGFR2 and MAP3K1 genes related to BC.

Resumen

El cáncer de mama (CM) constituye uno de los mayores problemas para la salud de la mujer actual. Los factores de riesgo atribuibles al desarrollo de la enfermedad incluyen: edad, etnia, exposición hormonal y factores genéticos siendo este último el más importante.

El modelo actualmente propuesto para explicar la susceptibilidad genética al CM es poligénico e incluye la participación de genes de alta, moderada y baja penetrancia. De los genes de baja penetrancia FGFR2 y MAP3K1 han presentado las mayores asociaciones con el aumento del riesgo a CM. El gen FGFR2 codifica para un receptor de factor de crecimiento y el gen MAP3K1, codifica para una serina /treonina quinasa, integrante del grupo de quinasas activadoras de mitógenos (MAPK). La cascada de eventos río abajo de la vía de activación del FGFR2 incluye a la vía de las MAPK. Además de su efecto individual, se postula que la interacción entre estos genes podría aumentar el riesgo a CM. A la fecha, los estudios de susceptibilidad que vinculan a FGFR2 y MAP3K1 con CM, se han realizado en mujeres de origen europeo, asiático y afroamericano en las cuales las diferencias en las estimaciones de riesgo a CM podrían ser atribuibles a diferencias en la estructura genética de cada población. Actualmente, en Chile y en otras poblaciones Sudamericanas no existen estudios que relacionen los loci de susceptibilidad de baja penetrancia con aumento del riesgo a CM familiar. La realización de estos estudios ayudaría a comprender las bases genéticas de la susceptibilidad al CM en esta población. En este trabajo se estudió las variantes de los genes de baja penetrancia rs1219648, rs2981582 y rs2420946 del gen FGFR2 y rs889312 del gen MAP3K1 y su asociación con el riesgo para CM y la interacción entre ambos genes con la susceptibilidad a la enfermedad. El estudio caso control de las variantes se realizó en un total de 307 casos de CM familiar BRCA1/2 negativo y 614 controles sanos sin antecedentes de CM mediante el ensayo 5'Exonucleasa (Taqman®). Los resultados indicaron que las frecuencias del alelo de riesgo de las variantes del gen FGFR2 fueron mayores en los casos (valores entre 0,48 y 0,49 para los tres SNPs), en comparación con los controles (valor de 0,40 para los tres SNPs). Las variantes del gen FGFR2 se asociaron con el aumento del riesgo para CM en los individuos homocigotos para el alelo de riesgo (rs1219648 GG OR= 1,83[IC95% 1,2 – 2,8]; rs2981582 TT OR= 1,91[IC95% 1,3 – 2,9]; rs2420946 TT OR= 2,03[IC95% 1,3 – 3,1]) en la muestra completa. En la estratificación por historia familiar, las mayores asociaciones fueron para los homocigotos de riesgo de los SNPs rs1219648 y rs2420946 (OR= 2,15[IC95% 1,1 – 4,1] y OR= 2,27[IC95% 1,2 – 4,2], respectivamente) en los casos de CM sin historia familiar de CM y diagnosticados a edad ≤ 50 años. Para la variante rs889312 del gen MAP3K1, los resultados indicaron que el alelo de riesgo fue mayor en los casos (0,45) en comparación con los controles (0,36) en la muestra completa. Igualmente en la estratificación por historia familiar, la mayor asociación la presentó el homocigoto de riesgo CC (OR= 2,40[IC95% 1,3 – 4,4]) en los casos de CM sin historia familiar diagnosticados a edad ≤ 50 años. Actualmente en la población panameña, no se han hecho estudios de los genes FGFR2 y MAP3K1, en relación a cáncer de mama.

Métodos Introducción

El cáncer de mama (CM) constituye uno de los mayores problemas para la salud de la mujer actual. En Chile, presenta la primera tasa de mortalidad por cáncer en mujeres (15,8/100,000 mujeres) desplazando al cáncer de vesícula y vía biliares (15,3 /100.000 mujeres) que hace algunos años atrás ocupaba el primer lugar (1). Se ha estimado que 5-15% de todos los CM presentan agregación familiar (2, 3). En los años 90' se identificaron dos genes de susceptibilidad para cáncer de mama: BRCA1 y BRCA2 (4, 5, 6). Los genes BRCA1/2 son de alta penetrancia e inicialmente fueron considerados los más importantes en la susceptibilidad genética al CM familiar. Sin embargo, la literatura ha informado que las mutaciones germinales en BRCA1/2 sólo explican aproximadamente el 20% del CM familiar y la frecuencia de mutaciones de estos genes es muy baja en la población general (7). Actualmente, la literatura plantea que el modelo poligénico es el que mejor explica el riesgo de CM en los casos con agregación familiar de la enfermedad (8). Este modelo plantea que la susceptibilidad genética al CM se explica por mutaciones en BRCA1/2 y por un número mucho mayor de mutaciones en genes de moderada y baja penetrancia. Los genes de moderada y baja penetrancia se asocian con aumentos moderados o bajos del riesgo y frecuencia poblacional es alta (> 0.05) (9). En los últimos años, los Estudios de Asociación del Genoma Completo (GWAS, de sus siglas en inglés Genome Wide Association Studies) han identificado alelos de baja penetrancia asociados al CM. En un GWAS, el grupo de Easton et al., (10) identificó 5 loci de susceptibilidad asociados con aumento del riesgo para CM en los genes FGFR2, TNRC9 /TOX3, MAP3K1 y LSP1. El Receptor del Factor de Crecimiento Fibroblástico 2 (FGFR2) es un receptor con actividad tirosina quinasa intrínseca (11). El FGFR2 aumenta su expresión en las líneas celulares de CM y se encuentra amplificado y sobreexpresado en tumores mamarios (12,13). El gen FGFR2 en humanos, se encuentra localizado en la región cromosómica 10q26 y tiene 21 exones (14). Las variantes rs2981582, rs2420946, rs1219648, rs2981579 y rs11200014 (localizados también en el intrón 2 del gen FGFR2) han sido objeto de estudio por diversos autores (10, 15, 16, 17, 18). El gen MAP3K1 se ubica en la región cromosómica 5q11.2 y codifica para la proteína MAP3K1 (proteína activadora de mitógenos quinasa 1). Esta quinasa inicia la vía de señalización de las proteínas quinasa activadoras de mitógenos (MAPK) que incluye Ras, Raf, Mek, y Erk, responsable de regular la transcripción de genes importantes en el cáncer. La relación del gen MAP3K1 se ha descrito en dos GWAS, específicamente la variante polimórfica rs889312 (10, 15). Algunos autores han descrito la asociación entre el SNP rs889312 y el riesgo para CM (19, 20). En su mayoría, los estudios relacionados con las variantes del gen FGFR2 y MAP3K1, se han realizado en poblaciones de diversas etnias. Sin embargo, es desconocida la contribución de estas variantes al CM en mujeres suramericano. Por otro lado, muchos estudios incluyen casos de CM de inicio temprano sin historia familiar para CM (21). En población chilena, 18% de los casos de CM BRCA1/2 tienen historia familiar para CM o cáncer de ovario (22); hay un importante porcentaje de los casos de CM negativos para BRCA1/2 sin historia familiar. Por lo tanto, en el presente estudio se evaluó la asociación de las variantes de los genes FGFR2 y MA3K1 con el riesgo para CM en casos de CM con historia familiar y casos de inicio temprano sin historia familiar para CM.

Se seleccionaron 307 casos de CM de familias con alto riesgo para CM y/o ovario. Todos los casos fueron analizados para mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 y se seleccionaron sólo los casos BRCA1/2 negativos. El grupo de los controles incluyó 604 mujeres sanas sin historia personal ni familiar de CM. El grupo muestral fue seleccionado de los archivos del Servicio de Salud del Area Metropolitana de Santiago, Corporación Nacional del Cáncer (CONAC) y otros servicios privados del área metropolitana de Santiago. Los casos incluidos en este estudio presentan muestras de ancestros chilenos de varias generaciones atrás, dato que se obtuvo luego de la entrevista. Los participantes en el estudio firmaron un consentimiento informado. Este estudio contó con la aprobación del Comité de Ética de la Facultad de Medicina, Universidad de Chile y se encuentra en el marco de ejecución del proyecto FONDECYT 1110081 (23). Genotipificación Se extrajo el DNA genómico total de muestras de sangre periférica a los 307 casos y 604 controles utilizando la técnica de Chomczynski et al (24). La genotipificación de los SNP rs2420946 (c.109+1899A>G), rs1219648 (g. 123346190A>G), rs2981582 (c.109+906T>C) del gen FGFR2 y rs889312 (g.6626243C>A) del gen MAP3K1, se llevó a cabo utilizando el ensayo 5' Exonucleasa (Taqman®). La técnica consistió en la elaboración de una mezcla de reacción que incluyó DNA, Universal Master Mix 2x de TaqMan® (Applied Biosystems®), Taqman® SNP Genotyping Assay (Applied Biosystems®) y agua libre de DNasa. Los cuatro ensayos se encuentran disponibles como pruebas prediseñados por Applied Biosystems®. La reacción se realizó en un Equipo de PCR en tiempo Real Step One (Applied Biosystems®). La discriminación alélica se realizó en el software Step one V2.1 (Applied Biosystems®).

Análisis estadístico aplicado al estudio

Se calcularon las frecuencias alélicas y genotípicas para casoscontroles y se determinó si estaban en Equilibrio de HardyWeinberg usando un test de bondad de ajuste (x2) a través del programa STATA versión 8.2. Se utilizó el test exacto de Fisher de una cola para comparar frecuencias alelicas y genotípicas con signiﬁcancia (p < 0,05). La fuerza de asociación se estimó utilizando la razón de posibilidades (OR, Odds ratio) con su intervalo de conﬁanza al 95% con STATA 8.2.

Resultados

La tabla 1 presenta la distribución alélica y genotípica de las variantes rs1219648, rs2981582 y rs2420946 del gen FGFR2 y rs889312 del gen MAP3K1 en la muestra completa (n= 307) y en los subgrupos por historia familiar de CM(n=198) y sin historia familiar de CM < 50 años (n=109). La distribución de genotipos en los controles presentó valores de p mayor a 0,05. La frecuencias genotípicas y alélicas de los genes FGFR2 y MAP3K1 difirieron significativamente en los tres grupos y en comparación con los controles. En la muestra completa, las variantes del gen FGFR2 y del MAP3K1, se asociaron significativamente con el aumento del riesgo para CM. En este mismo grupo, los homocigotos para el alelo de menor frecuencia se asociaron con el aumento de riesgo para CM (rs1219648, GG OR: 1,83[1,2 – 2,8], p=<0,01), rs2981582 (TT OR: 1,91[1,3 – 2,9],p=<0,01), rs2420946 (TT OR: 2,03[1,3 – 3,1], p= <0,01) y rs889312( CC OR: 2,10(1,4 – 3,1), p= 0,01). También se observó asociación con el aumento del riesgo para CM en los portadores del alelo de menor frecuencia (Tabla 1). Con respecto a estratificación por historia de CM familiar e inicio temprano de la enfermedad, se observó que la condición homocigótica para el alelo de riesgo de los tres SNPs del gen FGFR2 (rs1219648 GG, rs2981582 TT y rs2420946 TT) y

Genotipo/ alelo

Controles (%)n=614

FGFR2 rs1219648 AA AG GG Alelo A Alelo G

rs2981582

222 (36%) 289 (47%) 103(17%) 733(0,60) 495(0,40)

Casos de CM en la muestra completa (n= 307)

Casos de CM con historia familiar de CM (n=198)

Casos de CM ≤50 sin historia familiar de CM (n=109)

Casos (%)

OR (IC 95%)

Casos (%)

OR (IC 95%)

Casos

OR (IC 95%)

81(27%) 157(51%) 69(22%) 319(0,52) 295(0,48)

1,00(referencia) 1,49(1,1 – 2,1) 1,83(1,2 – 2,8) 1,00(referencia) 1,37(1,1 – 1,7)

0,01 <0,01 <0,01

55(28%) 100(50%) 43(22%) 210(0,53) 186(0,47)

1,00(referencia) 1,39(0,9 - 2,1) 1,68(1,0 – 2,7) 1,00(referencia) 1,31(1,0 – 1,6)

0,05 0,02 0,01

26(24%) 57(52%) 26(24%) 109(0,50) 109(0,50)

1,00(referencia) 1,68(1,0 – 3,0) 2,15(1,1 – 4,1) 1,00(referencia) 1,48(1,1 – 2,0)

0,02 0,01 0,01

1,00(referencia) 1,40(1,0 – 1,9) 1,91(1,3 – 2,9) 1,00(referencia) 1,40(1,1 – 1,7)

1,00(referencia) 1,24(0,8-1,8) 1,87(1,2-3,0) 1,00(referencia) 1,38(1,1-1,7)

0,14 <0,01 <0,01

27 (25%) 58 (53%) 24 (22%) 112 (0,51) 106 (0,49)

1,00(referencia) 1,75(1,0-3,0) 2,00(1,0-3,8) 1,00(referencia) 1,44(1,1-1,9)

0,01 0,02

<0,01

59 (30%) 90(45%) 49 (25%) 208 (0,53) 188 (0,47)

CC CT TT C T

230 (37%) 282 (46%) 102 (16%) 742 (0,60) 486 (0,40)

86 (28%) 148 (48%) 73 (24%) 320 (0,52) 294 (0,48)

CC CT TT C T

222(36%) 291(47%) 101(17%) 735(0,60) 493(0,40)

82(27%) 149(49%) 76(24%) 313(0,51) 301(0,49)

1,00(referencia) 1,39(1,0 – 1,9) 2,03(1,3 – 3,1) 1,00(referencia) 1,43(1,2 -1,7)

0,02 <0,01 <0,01

55(28%) 95(48%) 48(24%) 205(0,52) 191(0,48)

1,00(referencia) 1,32(0,9 – 1,9) 1,91(1,2- 3,1) 1,00(referencia) 1,39(1,1 – 1,7)

0,08 <0,01 <0,01

27(25%) 54(50%) 28(25%) 108(0,50) 110(0,50)

1,00(referencia) 1,52(0,9 – 2,6) 2,27(1,2 – 4,2) 1,00(referencia) 1,52(1,1 – 2,0)

0,06 <0,01 <0,01

AA AC CC A C

256(42%) 274(44%) 84(14%) 786(0,64) 442(0,36)

100(33%) 138(45%) 69(22%) 338(0,55) 276(0,45)

1,00(referencia) 1,29(0,9 – 1,8) 2,10(1,4 – 3,1) 1,00(referencia) 1,45(1,2 – 1,8)

0,06 <0,01 <0,01

67(34%) 88(44%) 43(22%) 222(0,56) 174(0,44)

1,00(referencia) 1,22(0,8 – 1,8) 1,95(1,2 – 3,1) 1,00(referencia) 1,39(1,1 – 1,8)

0,15 <0,01 <0,01

33(30%) 50(46%) 26(24%) 116(0,53) 102(0,47)

1,00(referencia) 1,41(0,9 – 2,3) 2,40(1,3 – 4,4) 1,00(referencia) 1,56(1,2 – 2,1)

0,09 <0,01 <0,01

rs2420946

MAP3K1 rs889312

0,02 <0,01

0,01

OR: Odds ratio; CM: cáncer de mama: IC: Intervalo de confianza. Slattery et al (30) publicaron un estudio caso-control en donde Discusión En la actualidad existen gran cantidad de trabajos cuya finalidad ha sido la identificación de los genes que dan cuenta del porcentaje remanente de casos de CM negativo para mutaciones en los genes BRCA1/2 (10, 25,26). Gracias a los avances en los estudios se ha logrado conocer parte de la predisposición genética subyacente en los casos de CM familiares y esporádicos BRCA1/2 negativo. Sin embargo, poco se conoce en población suramericana. En este estudio caso-control, evaluamos el impacto de los polimorfismos de los genes FGFR2 y MAP3K1 en casos negativos para BRCA1/2 en población chilena. El gen FGFR2 es un gen supresor de tumores que puede sobreexpresarse y amplificarse en células de tumores mamarios. En sus trabajos, Meyer et al (27) sugieren como mecanismo para explicar el origen de la carcinogénes, que las variantes de secuencia en el intrón 2 entre ellas las variantes rs1219648, rs2420946 y rs2981582, están muy próximas a los sitios de unión para factores de transcripción como Oct-1/Runx2 y a sitios putativos de unión del receptor de estrógenos (RE) (10), lo cual condicionaría la sobreexpresión del gen FGFR2 en el CM. En este estudio, se realizó una estratificación de la historia familiar de CM e inicio temprano de la enfermedad, para observar la exposición de los diferentes grupos al factor de riesgo genético e identificar el grupo de mayor riesgo. Se observó que los casos sin historia familiar de CM y diagnosticados a edad ≤ 50 años, presentaron las mayores asociaciones con el aumento del riesgo para CM. A la fecha, son varios los estudios que han descrito la asociación de las variantes del intrón 2 del gen FGFR2 con el riesgo para CM (16). Otros estudios incluyen casos de origen afroamericano, japonés, y europeo que llegaron a las misma conclusiones (21, 28,29). Como se ha mencionado, muchos son los autores que han logrado presentar diferencias en cuanto al riesgo para el CM en individuos de diversas etnias.

incluyeron mujeres con CM esporádico tanto de origen hispánico como no hispánico procedentes del Suroeste de Estados Unidos. en sus observaciones las mujeres de origen hispánico presentaron mayor riesgo para CM. Probablemente las mujeres hispánicas fueron en su mayoría mexicanas residentes en Estados Unidos, en las que es conocido el importante componente genético amerindio-español. Lo anterior, podría explicar las observaciones en mujeres chilenas que presentan un componente genético amerindio-español importante. La población chilena es el resultado de la mezcla entre población amerindia y europea, en su mayoría españoles con un grado de mezcla que se ha estimado en un 40% amerindio y 60% europeo (31,32). En relación al efecto biológico de la variante rs889312 en la carcinogénesis mamaria, esta variante se encuentra en un bloque de desequilibrio de ligamiento de 280 kb en donde se encuentra el gen MAP3K1. Por lo tanto, se podría sugerir que la asociación con el riesgo para CM está relacionada con la vía de señalización en donde participa la proteína MAP3K. Existen varios estudios que han llegado a las mismas conclusiones de este trabajo (16,19). La literatura ha planteado supuestos con el propósito de explicar el origen de las enfermedades de origen multifactorial, como el CM. Uno de estos supuestos sugiere que las variantes de genes que se encuentran comúnmente en la población con una frecuencia superior al 5% (33) son la causa; a diferencia de las enfermedades mendelianas que presentan fuerte agregación familiar y son causadas por alelos de alta penetrancia de origen monogénico. Los alelos de riesgo de los cuatro SNPs analizados en esta tesis son de baja penetrancia y presentan una frecuencia alélica alta. Lo anterior, podría explicar las observaciones de los grupos con y sin historia familiar a CM.

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Daniel Hidalgo A, Farmacéutico de Hospital, Angélica Pedrouzo, Tecnóloga Médico y Marieta C. de Jiménez, Farmacéutica, Hospital Aquilino Tejeira, Ciudad de Penonomé, Provincia de Coclé, República de Panamá. Recibido, 30 de julio de 2013 Publicado, agosto de 2013

RESUMEN

La aparición de cepas bacterianas resistentes a los antimicrobianos en una comunidad ambulatoria u hospitalaria de cualquier parte del mundo genera un impacto negativo en lo económico, médico, social e incluso legal. Este es un tema que debiera de preocupar tanto a las autoridades de salud así como a los profesionales sanitarios que nos desenvolvemos cada día en tareas que involucran el uso de antimicrobianos. Los estudios de utilización de medicamentos (EUM) son los que permiten a las autoridades y profesionales de la salud enrumbar las políticas de antibióticos en favor de disminuir la resistencia bacteriana, los costos y muchos otros beneficios. Se cuantificaron y analizaron los antimicrobianos utilizados durante dos(2) años en un hospital general de segundo nivel según el sistema de clasificación de medicamentos reconocida internacionalmente: Anatomical Therapeutic Chemical Classification (Clasificación ATC) de la Organización Mundial de la Salud y su unidad de medida: la Dosis Diaria Definida (DDD) y se correlacionaron los resultados con los cultivos de bacterias que resultaron positivas resistentes utilizando el sistema automatizado VITEK 32; resultando que Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomona aeruginosa, Enterobacter cloacae, Proteus sp, Acinetobacter baumannii y Shigella sp fueron las bacterias que desarrollaron mas resistencia a los antimicrobianos Ampicilina, Cefalotina, Ciprofloxacina, Ceftazidina, y Clindamicina principalmente. Se impone que las autoridades de salud adopten medidas regulatorias sobre el uso de antimicrobianos especialmente en los factores asociados a la utilización de los mismos y se evidencia el respaldo necesario a este tipo de estudios a nivel de todos los hospitales del país como herramienta para definir la política de utilización de antibióticos. Palabras clave: Antimicrobianos, parenterales, resistencia, dosis diaria definida, estudios de utilización de medicamentos.

INTRODUCCIÓN

El gran impacto negativo en lo económico, médico y social que tienen la aparición de cepas bacterianas resistentes a los antimicrobianos en una comunidad ambulatoria u hospitalaria de cualquier parte del mundo lo es igual para nuestro hospital. Este es un tema que debiera de preocupar tanto a las autoridades de salud así como a los profesionales sanitarios que nos desenvolvemos cada día en tareas que involucran el uso de antimicrobianos. Según la OMS los estudios de utilización de medicamentos (EUM) son los que tienen como objetivo de análisis: “la comercialización, distribución, prescripción y uso de medicamentos en una sociedad, con acento especial, sobre las consecuencias médicas, sociales y económicas resultantes”. La Organización Mundial de la Salud considera que “el uso abusivo de los antibióticos es una de las principales causas del incremento de la resistencia bacteriana, uno de los mayores problemas de salud pública. La prescripción no adecuada y abusiva de los antibióticos, la prolongación de los planes más allá de lo necesario, la aplicación de dosis no óptimas, la irregularidad en la toma de las drogas, son los principales factores que han llevado a que hoy la tasa de resistencia antimicrobiana sea elevada. A pesar de que en otros países este tipo de estudios están tomando cada vez más fuerza permitiendo a las autoridades y profesionales de la salud enrumbar su política de antibióticos en favor de disminuir la resistencia bacteriana, los costos y mucho otros beneﬁcios, en nuestro país, los estudios de este tipo no han tomado el auge requerido. Para esto es necesario que todos, tanto autoridades como profesionales, asumamos un compromiso social, profesional e institucional en el desarrollo de este tipo de actividades; esto es así, puesto que la génesis del problema de inducción de la resistencia bacteriana está estrechamente ligada a la forma en que manejamos los antimicrobianos; y es en este punto donde tenemos que actuar principalmente para evitar los estragos posteriores que se originan.

OBJETIVOS

Los autores desarrollaron el presente estudio retrospectivo de consumo y análisis cuantitativo de antimicrobianos intravenosos

en este nosocomio durante dos(2) años para conocer nuestros hábitos de prescripción , estimar la población expuesta, conocer las medidas educativas, informativas regulatorias y otras referentes a su utilización, sugerir áreas para posteriores investigaciones, y ﬁnalmente se presenta un minucioso análisis microbiológico para mostrar la susceptibilidad antimicrobiana y comparar estos datos con los descritos en la literatura, con el ﬁn de poder desarrollar políticas tanto para el uso racional de antimicrobianos como para enfrentar el problema del incremento de la resistencia bacteriana a estos medicamentos y alertar a los médicos prescriptores sobre la posible asociación de estos factores con la aparición de resistencia antimicrobiana.

METODOLOGÍA

Este tipo de investigación científica requiere de una clasificación de los antimicrobianos y unos parámetros de medidas cuantitativas adecuados, por lo que se utilizó el sistema de clasificación de medicamentos reconocida internacionalmente: Anatomical Therapeutic Chemical Classification (Clasificación ATC) de la Organización Mundial de la Salud y su unidad de medida: la Dosis Diaria Definida (DDD). Este sistema asigna un código a cada principio activo (o asociación de ellos) y establece un valor de DDD para cada uno, que permite medir el consumo de los diferentes medicamentos de una manera racional y realizar comparaciones entre distintos ámbitos. (1). Se rechaza el costo por unidad de medida porque el precio de las especialidades farmacéuticas, aún con la misma composición, puede ser distinto y variar en el tiempo. Tampoco es útil la expresión por cantidades consumidas (envases, unidades, gramos, litros, etc.) ya que para una misma entidad patológica se puede emplear gramos de una sustancia, o miligramos de otra, dependiendo de su actividad.(1) -162 La DDD es: “ La dosis promedio diaria de un medicamento, empleado en su indicación principal , en una determinada forma farmacéutica y en el adulto .” El sistema de clasificación Anatómico Terapéutico Químico (ATC) y la dosis diaria definida (DDD) como unidad de medida se han convertido en el estándar de oro para la investigación internacional de la utilización de medicamentos. El hospital donde se realiza el estudio, está ubicado en la Ciudad

las unidades y 6.12% en el año 2011, pero no se incluyen en el estudio ya que no se contabilizan los días camas. Los resultados de utilización de antimicrobianos incluyen solamente a los servicios de Medicina Interna, Cirugía General, Cirugía Reconstructiva, Ortopedia y Traumatología, Ginecología, Obstetricia, Neumología, Oftalmología y Psiquiatría. Por grupo anatomoterapéutico, los antimicrobianos mayormente utilizados fueron la penicilinas betalactámicas, principalmente las penicilinas resistentes a las betalactamasas, seguidas de las penicilinas de amplio espectro sin actividad antiseudomónicas; en tercer nivel se registraron otros antimicrobianos betalactámicos como lo son las cefalosporinas de primera y de tercera generación, luego las ﬂuoroquinolonas, los aminoglicósidos, lincosamidas, derivados imidazólicos y glicopéptidos en última instancia. Los detalles se aprecian en el cuadro N° 1.

CUADRO N°1

CLASIFICACION ANATOMICA-TERAPEUTICA -QUIMICA OMS

DDD/100 Días Camas HOSPITAL AQUILINO TEJEIRA-PENONOMÉ UTILIZACION DE ANTIMICROBIANOS SEGÚN LA CLASIFICACION ATC Año 2010 Año 2011 J01 ANTIMICROBIANOS SISTEMICOS 96.5 106.5

J01C Penicilinas Betalactámicas J01CA Penicilinas con Amplio Espectro(PAE) PAE sin actividad antiseudomónica

44.9

37.7

10.9

10.5

10.9

10.5

J01CE Penicilinas Sensibles a Bectalactamasas

2.2

2.1

J01CF Penicilinas Resistentes a betalactamasas

29.9

23.6

J01CR Combinación de Penicilinas (Incl. Inh. de betalactamasas)

1.9

1.5

1.9

1.5

J01D Otros Antimicrobianos betalactámicos

19.5

25.7

Cefalosporinas JO1DB, J01DC,J01DD yJ01DE

18.9

24.5

J01DB Cefalosporinas de Primera Generación

0.4

5.9

J01DC Cefalosporinas de Segunda Generación

0.1

J01DD Cefalosporinas de tercera Generación

17.7

18.2

J01DE Cefalosporinas de Cuarta Generación

0.7

0.3

J01DH Carbapenems

0.6

1.3

7.4

13.8

PAE con actividad antiseudomónica +betalactamasa

J01F Macrólidos, Lincosamidas y Estreptograminas J01FF Lincosaminas

J01G Aminoglocósidos J01GB Otros Aminoglicósido

J01MQuinolonas

7.4

13.8

8.9

10.7

8.9

10.7

10.1

12.7

J01MA Fluoroquinolonas

10.1

12.7

J01X Otros Antimicrobianos

5.8

5.9

J01XA Glicopéptidos

0.6

0.5

J01XB Derivados Imidazólicos

5.2

5.4

RESULTADOS:

De un total de 145 camas disponibles que tiene el hospital se excluyeron 25 camas de los servicios de Pediatría y Neonatología, restando 120 camas con un porcentaje de ocupación de 71% durante un periodo de doce meses (365 días). La cefalotina y metronidazol mostraron consumos importantes. Otros antimicrobianos mostraron consumos mínimos según se puede apreciar en el cuadro N° 2. El análisis de los resultados de la utilización de antimicrobianos intravenosos durante el período de estudio señaló el uso de siete ntibióticos principalmente: Oxacilina fue el mas utilizado durante los años 2010 y 2011, seguida de ceftriaxona, luego la clindamicina en el año 2011, la ampicilina en ambos años, y la gentamicina en ambos períodos.

CUADRO N°4

CUADRO N°2 HOSPITAL AQUILINO TEJEIRA-PENONOME UTILIZACION DE ANTIMICROBIANOS INTRAVENOSOS EN DDD/DIAS-CAMAS CODIGO ATC

HOSPITAL AQUILINO TEJEIRA-PENONOME ANTIMICROBIANOS AFECTADOS POR RESISTENCIA BACTERIANA

DDD

Año

Año 2011

(OMS 2006)

2010

Amikacina

J01GB06

0.606

1.317

Ampicilina

J01CA01

10.931

10.489

Penicilia Sódica

J01CE01

3.6

2.254

2.060

Cefalotina Sódica

J01DB03

0.448

5.867

ANTIMICROBIANO

Cefepime

J01DE01

0.667

0.330

Cefotaxima

J01DD01

3.264

1.045

Cefoxitina

J01DC01

0.060

0.018

Ceftazidina

J01DD02

0.177

0.021

Ceftriaxona

J01DD04

14.365

16.505

Ciprofloxacina

J01MA02

0.5

8.150

9.448

Clindamicina

J01FF01

1.8

7.412

13.833

Gentamicina

J01GB03

0.24

8.374

9.418

Imipenem/Cilastatina

J01DH51

0.595

1.282

Levofloxacina

J01MA12

0.5

1.965

3.26

Metronidazol

J01XD01

1.5

5.278

5.368

Oxacilina o Cloxacilina

J01CE04

30.074

23.642

Pip/Taz

J01CR05

1.871

1.472

Vancomicina

J01XA01

0.588

0.500

En cuanto a la utilización de antimicrobianos por servicios, destacan los que fueron afectados por el desarrollo de resistencia bacteriana principalmente: Ampicilina, Cefalotina, Ciprofloxacina, Cefepime, Ceftazidina, Clindamicina, Levofloxaxino, Ciprofloxacina, Oxacilina, Imipenem/Cilastatina y TMP/SMX (Ambulatorio) como se presentan el cuadro N° 3.

CUADRO N°3 HOSPITAL AQUILINO TEJEIRA-PENONOME UTILIZACION DE ANTIMICROBIANOS PARENTERALES EN DDD/100 DIAS-CAMAS POR SERVICIOS CIRUGIA MEDICINA GINECOLOGIA OBSTETRICIA 42 C, IO=62.8% 49 C, IO=47

ANTIMICROBIANO Amikacina Ampicilina Penicina Sódica Cefalotina Cefepime Cefotaxima Cefoxitina Ceftazidina Ceftriaxona Ciprofloxacina Clindamicina Gentamicina Imipenem/Cilastatina Levofloxacina Metronidazol Oxacilina Pip/Taz Vancomicina

2010 1.630 3.285 5.309 15.983 0.167 1.783 0.035 1.367 12.573 10.900 20.929 19.725 2.517 1.458 4.359 40.260 1.184 0.659

2011 1.834 0.037 5.976 17.933 0.188 2.007 0.039 1.538 14.154 12.270 23.561 22.260 1.931 1.641 4.908 45.322 1.333 0.741

45C, IO=71.3% 46C,IO=66.3% 5C,IO=30.5%

2010 0.417 1.699 0.704 0.277 1.716 6.225 0.155 0.456 24.523 10.153 9.333 0.318 1.531 6.974 6.974 26.997 3.888 1.433

2011 0.521 6.055 0.945 0.047 0.804 1.047 0.013 0.559 28.140 15.160 12.141 0.147 2.172 7.519 9.852 28.702 3.201 0.856

2010 0.449 36.649 0 0.898 0 2.919 0 0 25.331 3.377 88.629 141.029 0 0 9.402 14.372 0 0

5C,IO=48%

2011 14.587 157.028 0.771 17.252 0 1.178 0 0.248 18.678 0 74.519 70.277 0 0 4.931 13.099 0 0

20C,IO=68.2% 20C,IO=79.3%

2010 0 6.829 0.057 0.025 0 0.075 0 0 0.07 0 0.355 0.234 0 0 0 0.271 0 0

2011 0.173 4.448 0.014 0.661 0 0.026 0.017 0 0.138 0 0.432 0.495 0 0 0 0.060 0 0

Estos antimicrobianos afectados por el desarrollo de resistencia bacteriana se muestran según el grado de utilización que recibieron durante el periodo de estudio (Ver Cuadro N°4).

ANTIMICROBIANO

Utilización

Oxacilina Cefalotina Ampicilina Cefepime Ceftazidina Ciprofocaxina Levoﬂoxacina Imipenem/Cilastatina

1° 2° 3° 1° 2° 3° 1° 2° 3° 1° 2° 3° 1° 2° 3° 1° 2° 3° 1° 2° 3° 1° 2° 3°

Año 2010 Cirugía Medicina Ginecología Cirugía Ginecología Obtetricia Ginecología Obtetricia Medicina Medicina Cirugía

Año 2011 Cirugía Medicina Ginecología Cirugía Ginecología Obtetricia Ginecología Medicina Obtetricia Medicina Cirugía

Cirugía Medicina

Cirugía Medicina Ginecología Medicina Cirugía

Medicina Cirugía Medicina Cirugía

Cirugía Medicina

Medicina Cirugía

Durante el año 2010 y 2011, las bacterias que desarrollaron mas resistencia fueron: Klebsiella pneumoniae, Enterobacter sp, Acinetobacter baumannii, Proteus sp E. coli, Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus aureus y Shigella según se muestra en la tabla N°5.

TABLA N°5 Microorganismo

2010

2011

Klebsiella pneumoniae

Enterobacter sp

Acinectobacter baumannii

Proteus sp

E. coli

182

Pseudomona aeruginosa

Staphylococcus aureus

Shiguella sp

197 (15%)

377(18%)

TOTAL **1276/2108

El análisis de los resultados de correlación se hizo en base a ocho bacterias encontradas como resistentes frente a diez y ocho antibacterianos intravenosos descritos y durante los años 2010 y 2011 e incluyen muestras de pacientes ambulatorios y hospitalizados. Los resultados del cuadro anterior no incluyen datos de gentamicina y Pip/Taz, con Ceftriaxona solo para K. pneumoniae y E. coli, con la Levoﬂoxacina solo para Shigella sp y con vancomicina solo para S.aureus por falta de tarjetas de sensibilidad en la institución. Los factores asociados al consumo de antimicrobianos afectaron los rangos de consumo de cada uno de los compuestos estudiados. Los principales factores analizados en este estudio se enuncian en el cuadro N° 7.

solicitudes adecuadas de antibiogramas al laboratorio de microbiología, son factores que inciden directamente en las prescripciones empíricas que fomentan el desarrollo de resistencia bacteriana. A pesar de las limitaciones que tuvo este trabajo, el mismo puede ser utilizado de base para impulsar otros del mismo tipo que tengan una cobertura más amplia, incluyendo otros nosocomios del país y establecer políticas nacionales para el uso de antimicrobianos a través de los estudios de utilización de medicamentos.

CUADRO N°7

Hospital Aquilino Tejeira-Penonomé MEDIDAS REGULATORIAS SOBRE EL USO DE ANTIMICROBIANOS Años 2010 y 2011 Parámetro SI NO √ Existe un Comité de Farmacia y Terapéutica √ Existe un Comité de Infeciocciones Nosocomiales √ Existe un Arsenal de antimicrobianos deﬁnidos √ Existe listado registringidos de antimicrobianos *√ Existe un suministro adecuado de antimicrobianos Los antimicrobianos tienen limitaciones de uso según la infección

Se solicitan adecuadamente los antibiogramas √ Laboratorio informa de arsenal de reactivos √ Laboratorio informa sobre la susceptibilidad *= 93% de demanda satisfecha de antimicrobianos intravenosos DISCUSIÓN:

√ √

El consumo de antimicrobianos parenterales y su correlación con la aparición de cepas resistentes no se evalúan sistemáticamente en nuestros hospitales. La utilización de la metodología de DDD por 100 días-camas permitió conocer la magnitud de nuestro consumo y la población expuesta a los mismos, y las bacterias que desarrollaron resistencias, así como las medidas regulatorias del uso de antimicrobianos que las autoridades de salud pueden modificar. Es de interés mencionar que algunas bacterias aisladas y que presentaron resistencia antimicrobiana tales como Staphylococcus sp. E.coli, K.pneumoniae productores de beta-lactamasas de espectro extendido (BLEE o ESBL) Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii son motivos de vigilancia nosocomial. En el presente estudio pudimos demostrar que antimicrobianos como Ampicilina y Cefalotina, que mostraron los mayores índices de afectación por resistencia bacteriana, se utilizan significativamente en este hospital. Igualmente llama la atención la resistencia emergente de Ciprofloxacina , Cefepime y otros antimicrobianos. Como estos resultados no incluyen todos los antimicrobianos estudiados por falta de tarjetas de sensibilidad, es de esperar que los mismos sean de mayor relevancia epidemiológica al contar con este recurso microbiológico. Es de vital importancia considerar que al no estar conformado un Comité de Farmacia, Terapéutica y la consecuente inexistencia de regulaciones para el uso de antimicrobianos y la falta de

REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA: 1.Bonal de Falgás,J; Castro Celis I; Manual de Formación para Farmacéuticos Clínicos, España 1989Ed. Díaz de Santos, S.A.Madrid. 2.Fica Alberto, Cabello M A, Juliet L C, Prado D P, y Bavestrello F L; Consumo de Antimicrobianos parenterales en diferentes hospitales de chile durante el año 2005. 3.WHO Collaborating Centre for Drug Statistics and Methodology (Centro colaborador de la OMS que define las dosis diarias definidas, clasificación ATC/DDD) 4.www.escmid.org/research_projects/study_groups/esgap/abc_calc 5.Arnau JM, Vallarino A . Estudio de Utilización de medicamentos. Servicio de farmacología Clínica, Departamento de Farmacología y Terapéutica. Universidad Autónoma de Barcelona. 6.Blanco Doris, López Julián. Uso de antibióticos parenterales en el servicio de medicina interna de un hospital de tercer nivel de la ciudad de Bogotá. Rev. colomb. cienc. quim. farm. [serial on the Internet]. 2009 June [cited 2012 June 07] ; 38(2): 142-155. Available from: http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0034-74182 009000200002&lng=en 7.Sáenz Campos Desirée. EUM: revisión comparativa de los perfiles de consumo de antibióticos entre hospitales nacionales. Rev. costarric. salud pública [revista en la Internet]. 1999 Jul [citado 2012 Jun 07] ; 8(14): 32-36. Disponible en: http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1409-142919 99000100005&lng=es 8.Álvarez Barranco, Luis Carlos. Urinary tract infections in the Hospital Universidad del Norte. Salud Uninorte. Barranquilla (Col).2007; 23 (1):9-18. 9.Boza-Cordero,Ricardo et. Resistencia bacteriana a antibióticos en el Hospital San Juan de Dios 1995-1999. AMC, julio-septiembre 2001, vol 43(3). Pp.119-127. 10.Salas Bogantes, Roy et. Resistencia bacteriana a los antibióticos en infecciones del tracto urinario bajo, en pacientes de consulta externa en el área de salud Palmares. Fármacos 2004,17:1-2. 11.Normas CLSI 2011. 12.Gilbert N David, Moellering Robert C,Eliopolus, George M, Chambers,Henry F, Saag, Michael S; The Sanford Guide to Antimicrobial Therapy 2011.

Mgtr. Evelyn Navarro Kreitz. TM, GSS. RC – Laboratorio Clínico, Hospital Nacional Recibido, 30 de julio de 2013 Publicado, agosto de 2013 Resumen: La Norma ISO 15189 es especíﬁca para los laboratorios de análisis clínico. Para lograr su implementación es tan importante el compromiso de la dirección como el del personal que a diario debe hacer cumplir las políticas que se han establecido para mantener el sistema de gestión de calidad establecido y la mejora continua del mismo. Abstract: The Rule ISO 15189 is speciﬁc for clinical analysis laboratories. To achieve its implementation is important the commitment from management as well as the personal that day by day enforce the policies established to keep the quality manage system and the constant improvement of it.

l Hospital Nacional es un hospital de carácter privado ubicado en la ciudad de Panamá.

de Gestión de Calidad (SGC) basado en la Norma ISO 15189 y se nombra al Representante de Gestión de Calidad.

El mismo es producto de la evolución de la Clínica Nacional que abrió sus puertas en 1973 con 10 camas, atendiendo especialidades de ginecología y obstetricia por lo que pronto se le conoció como la Clínica de la Mujer. En 1980 se traslada a una nueva sede con 25 camas. En 1994 se abre el Centro Médico Nacional que dispone de 80 consultorios para la atención de diversas especialidades. Finalmente, en agosto de 1998 abre sus puertas el que es hoy Hospital Nacional, como respuesta a la demanda de sus servicios y con capacidad de 80 camas, 3 quirófanos para cirugía de alta complejidad, 2 salas de parto, 20 bacinetes para recién nacidos, cuidados intensivos, etc. Este año, se han ampliado las instalaciones en todos los niveles del hospital, lo que ha permitido abrir una nueva sala de urgencias con mayor capacidad de atención de pacientes y así mismo se han distribuido los espacios para la ampliación de los departamentos y salas de hospita-lización.

Desde entonces se da inicio a una ardua labor, la mayor de ellas lograr que el personal comprenda la importancia de la incorporación de la norma estandarizando los métodos de trabajo.

Como parte de este importante hospital, se encuentra el Departamento de Laboratorio Clínico, este cuenta con secciones de Urinálisis, Parasitología, Química General y Especial, Hematología General y Especial, Inmunología, Microbiología y Banco de Sangre. La idea de incorporar las Normas ISO, como parte de la rutina de trabajo del Laboratorio Clínico era una visión del gestor del hospital, Dr. Juan Medrano (Q.E.P.D.), la misma es apoyada por la dirección del laboratorio, Licda. Eva Ríos de González. Ésta visión comienza a cristalizarse cuando en el año 2005 se solicita a una empresa local la evaluación del Laboratorio Clínico para la implementación del Sistema

Se da inicio al levantamiento de la documentación requerida por la norma, el uso de formularios y adecuado almacenamiento, la participación en programas de control de calidad internos y externos, la identificación de los equipos con un registro exhaustivo de sus mantenimientos preventivos y correctivos. Esta tarea no fue fácil, hubo momentos de mucho entusiasmo y otros de menos. Uno de los inconvenientes principales fue el cambio constante del personal. A través de la administración del hospital se logra establecer mecanismos de motivación para que el personal permanezca laborando en la empresa en lugar de migrar a otras instituciones. Otro inconveniente estuvo relacionado a los proveedores, ya que no acostumbraban a entregar los listados de verificación de la instalación de los equipos, como tampoco los certificados de trazabilidad de los controles, en algunos casos hubo que recurrir al directamente al fabricante para obtener la información. Durante el período de implementación se realizaron varias auditorias para determinar el grado de avance de la misma, hasta considerar que estábamos en condición de solicitar la acredi-tación al organismo acreditador.

Solicitamos la acreditación al Consejo Nacional de Acreditación de Panamá. En ese momento ellos no contaban con personal capacitado en la Norma ISO 15189, por lo que, como miembros del Foro Centroamericano de Acreditación (FOCA) nos informaron sobre los países que estaban en condición de acreditar bajo esta Norma. Así, contactamos a la Oficina Guatemalteca de Acreditación (OGA), quienes nos dieron las directrices de la oficina para iniciar el proceso de acreditación con ellos. Formalizamos la solicitud, misma que fue aceptada. Se envió la documentación para que realizaran la evaluación de la misma. En noviembre de 2009 nos visitaron los auditores para la evaluación in situ, como era de esperarse levantaron no conformidades que resolvimos en el directo y Coombs Directo de Recién Nacidos . tiempo determinado para una visita de verificación. Finalmente, la resolución de Acreditación fue aprobada en fecha “Guatemala, 27 de octubre de 2010” bajo la resolución “OGA-LE-032-09”, en esta consta la acreditación de las pruebas siguientes: Hemograma, Glucosa, Creatinina, Nitrógeno de Urea, Ácido Úrico, Colesterol, Triglicéridos, Albúmina, Proteína, AST. A la fecha nos han realizado dos auditorías de seguimiento en las cuales demostramos mantener el SGC implementado, para la última visita además solicitamos la ampliación de la acreditación a otras pruebas de química tales como: Amilasa, Bilirrubina total y directa, Calcio, Cloruro, Colesterol, HDL-colesterol, fosfato, ALT, Magnesio, Potasio y Sodio; y para el Banco de Sangre, las Pruebas Serológicas de Donantes y Pacientes, Tipaje Directo e Inverso para donantes y pacientes, Coombs Indirecto, Tipaje Tipaje directo y Coombs Directo de Recién Nacidos. La implementación del SGC y su mejora continua, a través de la Política de Calidad del Laboratorio Clínico, han permitido lograr: •Apoyo de la administración en la capacitación del personal. •Asignación de mayor espacio en la infraestructura del laboratorio. •Colaboración de los proveedores en los programas de mantenimiento de los equipos, en facilitar información de certificaciones de controles y reactivos.

•Participación activa del personal en la mejora de los procesos. •Implementación de un SGC en otros departamentos del hospital. •Certificación del Departamento de Radiología e Imagen bajo la Norma ISO 9001.

CONCLUSIÓN: Implementar un SGC no es fácil. Se requiere de la colaboración de todos los involucrados en los procesos. El compromiso de la alta dirección es un factor esencial para llevar a cabo esta tarea. Como un sistema de mejora continua esto ha contribuido a incluir en los programas de control de calidad externo a otros analitos adicionales a los acreditados, lo que a su vez permite a los clientes, médicos y pacientes, una confianza plena en los resultados emitidos por el laboratorio.

Dia Del Laboratorista Clínico 2013 Conmemoración de los 35 años de CONALAC

INAUGURACIÓN DE LA ACTIVIDAD POR PARTE DE LA PRESIDENTA

LANZAMIENTO DE LA REVISTA PANAMEÑA DE LABORATORIO CLÍNICO E INVESTIGACIÓN

Entrega de Reconocimiento a los Colegas Jubilados

Colegas Participantes de la Celebración en Conmemoración a los 35 años de CONALAC

Premiación a los Colegas, Celebración en Conmemoración a los 35 años de CONALAC

Abril 2013

Palabras por la Presidenta

Junio 2013

Concurso Premiaci贸n

Presentaci贸n

Cena

Mgtr. Evelyn Navarro Kreitz. TM, GSS. Banco de Sangre, C.H.M.Dr.A.A.M. Recibido, 30 de julio de 2013 Publicado, agosto de 2013

Resumen: Es de suma importancia determinar la presencia de bacterias en los componentes plaquetarios debido a que se ha demostrado que son el hemocomponente con mayor riesgo de trasfusión de bacterias. La detección de bacteremia por transfusión es poco detectada, se requiere de la pericia del médico, ya que en la mayoría de los casos los signos y síntomas de su presencia son confundidos con los propios de la patología del paciente. Actualmente existen diversos métodos de detección de bacterias en lo hemocomponentes, de ellos se recomienda el cultivo aunque puede ocurrir que las plaquetas sean liberadas antes de obtener un resultado ﬁnal, pero la continuación de su cultivo después de la transfusión permite informar al médico la detección de un crecimiento de bacterias para que tome las medidas pertinentes en el paciente. Abstract: It is extremely important to determine presence of bacteria in platelet components since it has been proved that they are the riskiest hemocomponent to bacterial transfusion. Detection of bacteremia by transfusions is low, and it is required medical expertise, since in most of the cases signals of its presence are confounded with the pathology of the patient itself. Nowadays there are varied methods to detect bacteria in hemocomponents. It is recommended a culture, eventhough platelets could be released before to obtain a ﬁnal result. But continuation of its culture after blood transfusion allows informing the doctor about detection of bacterial growing to take pertinent measures in the patient.

Palabras claves: plaquetas, bacterias, transfusión.

a literatura sobre contaminación de hemocomponentes ha establecido que el mayor riesgo de contaminación bacteriana se encuentra en los concentrados plaquetarios, sean estos obtenidos mediante la separación de sangre total o por aféresis. Esto es así, debido a la condición de almacenamiento propia de este hemocomponente, temperatura de 20°C a 24°C, donde la reproducción de las bacterias ocurre con mayor facilidad. (1) En nuestro país no se tiene un registro de la infección por bacterias causada por la transfusión de plaquetas; sin embargo, en la literatura internacional podemos encontrar reportes que reﬂejan la incidencia de sepsis por transfusión de plaquetoféresis contaminadas con bacterias de 1:13,000 a 1:31,000 y con tasa de mortalidad de 1:70,000 a 1: 140,000. También expresan que estos valores pueden ser mayores cuando las plaquetas son obtenidas a partir de sangre total. (2) El riesgo de sepsis aumenta, de 6 a 10 veces más, cuando se trata de pooles de plaquetas. (7) La causa más común de infección transmisible por transfusión es la contaminación bacteriana, esto se relaciona con lo reportes hechos a la Food and Drug Administration (FDA) y otros sistemas de vigilancia, que establecen que del 14% al 24% de las muertes están asociadas a transfusión. (4) Entre los microorganismos asociados a la sepsis por transfusión de plaquetas se encuentran bacterias de la ﬂora normal de la piel y otros como por ejemplo: Staphylococcuss sp. (42%), Streptococcus SP. (12%), Corynebacterium sp., Pseudomonas sp., E. coli (9%), Salmonella sp (9%), Bacillus sp. (9%), Serratia sp. (8%),

Enterobacter sp. (7%).G. (6, 7) El riesgo de contaminación bacteriana por transfusión supera el riesgo de transmisión de virus como los de hepatitis B y C, y el de Inmunodeficiencia Humana (VIH); por lo que se ha considerado que la contaminación bacteriana por transfusión representa un riesgo catastrófico para el receptor, que puede tener consecuencias legales. (4,7) El riesgo de contraer sepsis es tres veces mayor al transfundir plaquetas que al transfundir eritrocitos; éste riesgo aumenta considerablemente cuando la transfusión se realiza en pooles de plaquetas frente a las obtenidas por aféresis. (4) Varios investigadores coinciden en que la dificultad para confirmar la sospecha de contaminación bacteriana se debe a que la población que recibe la mayor cantidad de transfusión de plaquetas, está compuesta por pacientes hematooncológicos, cuya condición implica frecuentes estados febriles, inmunosupresión, neutropenia, terapia de antibióticos de amplio espectro, canalización de accesos vasculares, mismos que enmascaran el comportamiento clínico producido por la infección bacteriana. (4) En la búsqueda de disminuir el riesgo de infección bacteriana por transfusión de plaquetas países como Estados Unidos, Holanda, Bélgica y Noruega, entre otros, han implementado el uso de metodologías de detección de crecimiento bacteriano en componentes plaquetarios. Como ventaja adicional, la implementación de métodos de detección de crecimiento bacteriano en plaquetas, permite extender el tiempo de almacenamiento de las misma hasta 7 días, esto incluyendo el uso de bolsas que permitan la adecuada permeabilidad de los gases, lo que a su vez contribuye directamente a mejorar el inventario de plaquetas y con ello la recuperación de costos. Sin embargo, si esta detección se hace muy temprano, la carga bacteriana puede ser muy baja para ser detectada o si se hace muy cercana al momento de la liberación de las plaquetas, los resultados podrían no estar disponibles para evitar la transfusión. Armando Cortés y sus colaboradores, encontraron a través de diversa literatura disponible que “las reacciones sépticas asociadas con plaquetas contaminadas generalmente se presentan con una unidad que ha sido almacenada al menos durante tres días” y que “con plaquetas almacenadas por cinco días, la tasa de sepsis asociada a transfusión es cinco veces mayor que la de las plaquetas almacenadas durante cuatro días o menos”, esto llevó a la FDA a regresar nuevamente el almacenamiento de plaquetas hasta cinco días. (4)

Entre los posibles orígenes de la contaminación bacteriana podemos mencionar: la piel del donante, bacteremia del donante, contaminación del equipo colector, el ambiente en que se realiza la separación de los hemocomponentes. (5) Ante estas, se han sugerido métodos de prevención como: •Limpieza adecuada del área de la punción. •Descarte de la primera porción de sangre luego de la venopunción, debido a que en las capas más profundas pueden haber bacterias que pasan a la bolsa cuando al entrar la aguja corta la piel que pasa hacia la bolsa en donde encontrarán el medio de cultivo perfecto para su crecimiento. Entre mayor sea el volumen de sangre inicial descartado menor será la probabilidad de crecimiento de las bacterias. •Reducción de patógenos •Estudios para detección de crecimiento bacteriano. (7) Otras opciones para contribuir a la prevención de la contaminación bacteriana, propuesto por Rivera-López MR y cols. en su investigación sobre Contaminación bacteriana de hemocomponentes, son: cuidar la técnica del muestreo de la bolsa, las condiciones de limpieza de las superﬁcies trabajo, el control de temperaturas de las áreas y la limpieza de los sistemas de aire acondicionado. Debido a la importancia de la detección de la contaminación bacteriana, se han establecido varios métodos para su identiﬁcación, entre ellos: (3) •Detección mediante la reducción del pH: Este es un método indirecto, de rápida determinación; sin embargo, solo se pueden detectar bacterias cuando éstas superan las 10 unidades formadoras de colonias/mL. En estudios realizados con éste método se encontró que todos los resultados positivos eran falsos. Adicionalmente, no pudo detectar cinco unidades contaminadas. (4) •Tinción bacteriana: tinciones como la de Gram y Naranja de acridina, tienen la desventaja de presentar baja sensibilidad debido a que, al igual que la medición del pH, detectan cantidades mayores a las 10 UFC/mL, sin mencionar su laboriosidad. •Cultivo microbiológico: este debe ser un método rápido, sensible y que utilice un pequeño volumen de muestra para la inoculación. Es el método de preferencia.

e incuba por un mínimo de 24 horas a 35°C. Luego de este tiempo, el contenido de la bolsita es analizada por consumo de oxígeno comparándolo con la cantidad de oxígeno en el ambiente. Al encontrar que la concentración de oxígeno dentro de la bolsa es menor que la concentración de oxígeno del ambiente exterior, se deduce que hay bacterias en la muestra de plaquetas que han consumido el oxígeno presente en la bolsa. En ambos casos las plaquetas deben haber permanecido en incubación y agitación por 24 horas antes de la inoculación. Aunque estos parecen ser los mejores métodos, hay que tener presente cantidades muy bajas de plaquetas pueden no ser detectables, pero ellas podrían proliferarse hasta llegar a ser un inóculo importante al momento de la transfusión. •Con el propósito de evitar falsos positivos al utilizar estos métodos, se deben tener los siguientes cuidados: (3) -Manipular las muestras en un cámara de flujo laminar o en lugar que garantice la esterilidad. -Utilizar un sistema de conexión cerrado. -Asegurar la asepsia del medio de cultivo antes y durante la inoculación. -Mantener condiciones de almacenamiento adecuadas para el medio de cultivo utilizado. •Métodos inactivadores de patógenos: se trata de una sustancia química añadida al producto sanguíneo, la cual es activada por exposición a la luz o por cambios en el pH causando así la destrucción del microoganismo. Este método tiene la ventaja de inactivar una amplia gamma de bacterias poco tiempo después de su obtención; sin embargo, aún hay incertidumbre en cuanto a su acción sobre las bacterias formadoras de esporas y alguna pérdida de plaquetas durante el proceso. En el caso de las plaquetas puede utilizarse la Rivoflabina, ésta se disuelve en el plasma de las plaquetas, se expone a luz UV. La fotoexposición produce una unión entre la Riboflavina y e DNA o RNA rompiendo las bases y modificando las bases. Este método ha sido efectivo en la destrucción de VIH, Virus del Nilo, algunas bacterias y protozoos. (5)

Estos pueden ser manuales o automatizados. Sin embargo, en los Bancos de sangre se prefieren los sistemas automatizados por su fácil manejo y rapidez en los resultados. Aunque permiten la detección de bacterias no es posible identificar el microorganismo específico que ha crecido en ellos.

Otro inactivador de patógenos que puede ser utilizado con las plaquetas es el Amotosaleno (S-59), quien también es mezclado con el concentrado de plaquetas y expuesto a la luz UV, adicionalmente tiene la ventaja de degradarse a subproductos toxicológicamente seguros. (5)

Los métodos automatizados que podemos encontrar en el mercado se basan en la detección de CO2 o en la determinación del consumo de O2. -Monitoreo de la producción de CO2: En este caso una muestra de las plaquetas (5-10mL) es inoculada en una botella con medio de cultivo a temperatura controlada. Al crecer el microorganismo, se aumenta la concentración de CO2 dentro de la botella produciéndose un cambio de color del indicador que se encuentra en el fondo de la botella, este cambio es detectado por un foto sensor que transmite la señal a la computadora, esta mediante un software analiza el resultado. El resultado negativo ﬁnal es reportado luego de 5 días de incubación.

En los Estados Unidos de América, a través de la AABB, en sus estándares para los Bancos de Sangre ha propuesto “5.1.5.1 El Banco de Sangre o Servicio de Transfusión tendrá métodos para limitar y detectar la contaminación bacteriana en todos los componentes de plaquetas.” Este estándar se implementó a partir del 1 de marzo de 2004, con el propósito de mitigar la contaminación bacteriana en las plaquetas.

-Determinación del consumo de O2: En este método se conecta una bolsita con el medio de cultivo, por medio de un sistema que mantenga la esterilidad, se deja pasar la muestra de plaquetas (3mL) a la bolsita, se separa

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Resistencia a Rifampicina

Recibido 8 de Agosto de 2013 Publicado Agosto 2013 Por: Fedora Lanzas, TM Instituto Conmemorativo Gorgas de Estudios de la Salud.

Las mutaciones más comunes en el gen rpoB son responsables de casi el 100% de resistencia a la rifampicina (RIF) en las muestras de TB-MDR analizadas en el estudio. Siendo la mutación en rpoB531 responsable de la resistencia a RIF en un 79% de los casos de TB-MDR, sugiriendo probable resistencia cruzada con todas las rifamicinas.

Resistencia a Isoniacida

La gran mayoría de la resistencia a isoniacida (INH) en Panamá se debe a mutaciones en el gen katG y en el promotor de inhA. La mutación en KatG315 fue responsable en un 70% de resistencia a INH. Y la mutación c-15t en el promotor de inhA fue responsable de un 19% de resistencia, sugiriendo probable resistencia cruzada con Etionamida. Un 16% de los aislados TB-MDR en estudio fueron resistentes a INH por el método de las proporciones múltiples (gold estándar) pero no presentaron en su genoma ninguna de las mutaciones hasta ahora identiﬁcadas a nivel mundial responsables de resistencia, por lo que esto requerirá de estudios posteriores.

En la tarde del 24 de Marzo de 1882, Robert Koch médico y científico alemán presentó su descubrimiento del Mycobacterium tuberculosis (MTB), bacteria responsable de causar la enfermedad conocida como tuberculosis (TB). Koch comenzó recordando a la audiencia de las estadísticas aterradoras: ¨Si la importancia de una enfermedad para la humanidad se mide por el número de muertes que provoca, a continuación, la TB debe ser considerada mucho más importante que las enfermedades infecciosas más temidas, la peste, el cólera y similares. Uno de cada siete de todos los seres humanos muere de TB, si sólo se tiene en cuenta a los grupos de mediana edad productiva, la tuberculosis abarca un tercio y más de la población¨. Robert Koch fue un gran visionario, a pesar que ha transcurrido un poco más de un siglo y que en 1882 no se hablaba aún de HIV, las estadísticas actuales de la Organización Mundial de la Salud (OMS) no se alejan de las presentadas por Koch durante la conferencia ante la sociedad fisiológica en Berlín. En el siglo XIX actualmente, la OMS establece que la TB sigue siendo una causa importante de muerte de origen infeccioso. En el 2011, fueron reportadas, aproximadamente 1,4 millones de muertes de las cuales medio millón eran del sexo femenino, fueron las cifras reportadas. A través de los años la TB ha desarrollado resistencia a los antifímicos y se ha clasificado en base a su sensibilidad: la TB sensible a los antifímicos, la TB multidrogo resistente (TB-MDR), la TB extremadamente drogo resistente (TB-XDR) y la TB totalmente drogo resistente (TB-TDR). En el mundo para el 2011 había unos 630,000 casos de TB-MDR y aproximadamente el 9% de ellos tenían TB-XDR.

De la colección de aislados MDR en estudio, un 33% presentaron mutaciones en el gen embB. Correspondiendo estos resultados de secuenciación con sólo 15 de los aislados reportados resistentes a etambutol (EMB ) por el método de las proporciones múltiple de Canetti. Esto es debido a la falta de reproducibilidad del método convencional para determinar resistencia a EMB.

En Panamá en los últimos años, los casos nuevos de TB oscilan entre 1,400 a 1,600 casos por año. Y desde el 2001 al 2010 se han registrado un poco menos de 100 casos TB-MDR.

Caracterización molecular de cepas TB-MDR

Investigaciones de TB en Panamá

Un grupo de investigadores integrado por personal del Instituto Conmemorativo Gorgas de Estudios de la Salud, Laboratorio Central de Referencia de Salud Pública, el Programa Nacional contra la TB, y la valiosa colaboración internacional de los doctores: Petros Karakousis de la Universidad de Johns Hopkins y Thomas Ioerger de la Universidad de Texas A&M nos ha permitido identiﬁcar y determinar la frecuencia de las mutaciones que conﬁeren resistencia a los antifímicos en una colección de aislados TB-MDR y caracterizar a nivel molecular las cepas TB-MDR que circularon en nuestro país en la pasada década. Frecuencia de mutaciones en aislados de cepas TB-MDR que circularon en nuestro país en la pasada década:

Resistencia a Etambutol

Resistencia a Estreptomicina y otros Animoglucósidos

Un 73% presentó la mutación c517t en el gen rrs y sólo 4 aislados (6%) en el gen rpsL en los codones 43 y 88 conﬁriendo estas mutaciones resistencia a estreptomicina. Solamente dos aislados (3%) tenían mutaciones en el gen rrs en la posición 1401 conﬁriendo resistencia muy probablemente a kanamicina, amikacina y capreomicina.

Resistencia a Fluoroquinolonas

Afortunadamente, luego de analizar a través de secuenciación el gen gyrA, sólo 6 (9%) aislados TB-MDR presentaron mutaciones en los codones 90 y 94.

Latin American Mediterranean (LAM) es un linaje prevalente en países de América Latina. En Panamá el linaje LAM es particularmente mayoritario entre los aislados MDR, ya que 78.8% de los aislados clínicos MDR (52/66) son LAM. Análisis de SNP (single nucleotide polymorphisms) del genoma completo de cada uno de los aislados se utilizó para construir un árbol filogenético con la finalidad de elucidar las relaciones entre los aislados. Los aislados MDR del linaje LAM pueden ser subdivididos en 4 cluster: el cluster más grande, al que hemos llamado LAM9-c1 con 29 aislados; cluster c2 con nueve; cluster c3 con siete y el cluster c4 con 4 aislados. Y el resto de los aislados pertenecían en menor cantidad a PGG-1, Haarlem, X clade y T clade. El análisis del árbol filogenético muestra que un poco menos de la mitad de los aislados (29 de 66) son variantes de una única cepa

LAM9-C1 con una combinación de mutaciones características de resistencia para isoniacida (katG:S315T), rifampicina (rpoB:S531L) y estreptomicina (rrs:c517t) sugiriendo una transmisión continua (resistencia primaria). Sin embargo, algunos aislados individuales miembros de este cluster adquirieron mutaciones adicionales de resistencia a otras drogas. En el dendograma la cepa de referencia KZN_4207 está estrechamente asociada a LAM9-c1 implicando que la cepa panameña LAM9-c1 es una variante de la cepa KZN MDR/XDR identificada en KwaZulu-Natal, Sudáfrica. La cepa KZN pertenece al linaje LAM4 y tiene espoligotipo 777777607760731, muy similar a LAM9. Los datos genéticos corroboran la relación entre estas dos cepas. Por ejemplo, ambas cepas KZN y LAM9-c1 tienen una deleción de 2606pb que abarca Rv0376-Rv0378. Por el contrario LAM-c2, LAM-c3 y LAM-c4 no tienen este marcador. Los aislados que conforman el cluster LAM9-c1 fueron obtenidos entre los años 2002 a 2010. Un 66% de estos casos provenían de Colón y 21% de Panamá Metro. Esta cepa MDR fue prevalente entre individuos de edad productiva y fue asociado a hombres ≥ 35 años (odds ratio=9.28, estadísticamente significante por Fisher´s exact test, p<0.044). La mitad de los pacientes infectados con esta cepa murieron (15/29, 52%) aunque la diferencia no fue estadísticamente significante al comparar la frecuencia total de muertes entre los casos MDR. Los aislados del cluster LAM9-c2 no son resistentes a estreptomicina. LAM-c3 tiene espoligotipo LAM3. LAM-c4 puede ser identificado con la cepa RDRio que fue identificada como una de las mayores causantes de tuberculosis en Brazil, los aislados en este cluster tienen la característica de una deleción de 26kb de Rv3347-Rv3354. El análisis de los clusters en el dendograma provee una fuerte evidencia de resistencia primaria principalmente en el cluster LAM9-c1. Pero no hay evidencia directa de que esta cepa es más virulenta que el resto, por lo que se requiere realizar estudios posteriores para dilucidar este aspecto. Árbol filogenético de los aislados MDR basado en el análisis de 6,890 SNP del genoma completo. Beijing Haarlem

X clade LAM-c4

LAM-c2

LAM9-c1

LAM-c3

T clade

LAM

INVERSIONES SAGRAV,S.A., brindando desde 1995 soluciones de calidad en todas las áreas del laboratorio clínico , felicita a los tecnólogos médicos por su dedicación e invaluable aporte a la salud de los panameños.

Recibido 2 de Agosto de 2013 Publicado Agosto 2013

Icaza, Ana María, TM. Hospital de Especialidades Pediátricas Omar Torrijos Herrera

INTRODUCCIÓN:

Las metalobetalactamasas, son enzimas que pertenecen a la clase B de Ambler y al grupo 3 según la clasiﬁcación funcional de Bush-Jacoby- Medeiros. Característicamente, estas enzimas son inhibidas por agentes quelantes de zinc, como el EDTA (ácido etilenodiamino tetra acético) y el SMA (mercaptoacetato de sodio). Han sido aisladas y reportadas en numerosos países. Los genes que las codiﬁcan pueden estar localizados a nivel cromosó-mico o plasmídico. Estas enzimas hidrolizan una gran variedad de antibióticos β-lactámicos, incluyendo penicilinas, cefalosporinas (1ª, 2ª, 3ª y 4ª generación) y carbapenemas. No actúan, in vitro, sobre aztreonam. El hecho de actuar sobre carbapenemas hace que su importancia clínica sea aún mayor, ya que estos antibióticos, debido a su amplio espectro de acción y a su estabilidad frente a la acción de enzimas β-lactamasas de espectro extendido (BLEE), son utilizados como último recurso para el tratamiento de infecciones causadas por bacilos Gram negativos resistentes a otros antibióticos β-lactámicos. Además, se han publicado diversos trabajos documentando la diseminación de este tipo de enzimas en el ámbito hospitalario, resaltando su importancia epidemiológica. Esto conduce a que la detección de enzimas metalo B-lactamasas sea determinante para dirigir el tratamiento óptimo de los pacientes y para controlar la diseminación de la resistencia.(Díaz, 2008). Las primeras carbapenemasas de origen plasmídico se describieron en Japón en el año 1991 en Pseudomonas aeruginosa y con posterioridad en diversas especies de enterobacterias, entre ellas S. marcescens, Pseudomonas putida y Achromobacter xyloxoxidans. La enzima caracterizada correspondía con una metalobetalactamasa a la que denominó IMP-1. El gen responsable se encontraba localizado en un integrón incluido en plásmidos transferibles. En la actualidad se conocen hasta 29 variantes en el grupo de las enzimas IMP y se han descrito con más frecuencia en P. aeruginosa que en las enterobacterias. Así mismo, en el año 1997 se detectó en Italia, también en Pseudomonas aeruginosa, una enzima de carácter transferible que recibió el nombre de VIM-1 y cuyo gen se asocia a integrones de clase 1. Hasta la fecha se han descrito 27 variantes, siendo VIM-2 una de las más difundidas. (Poirel L, 2000). Las Pseudomonas spp, también pueden presentar otras beta-lactamasas además de las metalo-betalactamasas, como las tipo GES. No existen recomendaciones para la búsqueda de

BLEE en Pseudomonas aeruginosa en la estandarización de las pruebas de sensibilidad (CLSI, EUCAST); sin embargo el Servicio Antimicrobiano de Argentina estandarizó una metodología fenotípica simple y de alto desempeño para la detección de enzimas tipo GES. La sinergia imipenem-ceftazidima es altamente predictiva en enzimas de la familia GES. Otras BLEE podrían ser detectadas con este simple ensayo puesto que también presentan la característica de inhibición por imipenem (PER, VEB, entre otras). Asociaciones entre VIM y BLEE no es común; sin embargo se ha reportado solamente para VIM-2 con PER-1 ó GES. En el 2002 se reporta en Argentina el primer caso de P. aeruginosa que produce VIM y GES al mismo tiempo. (Pasteran, 2005) La familia de B-lactmasas de tipo GES (Guyana ExtendedSpectrum) incluye en la actualidad 15 miembros (variantes alélicas). Esta familia de enzimas posee capacidad hidrolítica sobre penicilinas y cefalosporinas, especialmente ceftazidima. Algunas variantes alélicas son también capaces de hidrolizar el imipenem (no meropenem) como GES-2, GES-4 a GES-6 (variantes de GES con actividad carbapenemasa). La primera descripción de este grupo de enzimas se debate entre los hallazgos casi simultáneos en el año 2000 de una K. pneumoniae productora de GES-1 recuperada de un paciente de Guyana y un Enterobacter cloacae productor de IBC-1 de Grecia. Como los aislamientos resultaron contemporáneos cada grupo de investigadores les dio origen con una nomenclatura distinta. En la actualidad, las enzimas tipo IBC (Integron Borned Carbapenemase) han sido renombradas como variantes de la familia GES. ( Walsh. T.R., 2005). En esta investigación se colectaron 20 Pseudomonas spp. con perﬁl altamente resistente por espacio de 1 año en el Hospital de Especialidades Pediátricas Omar Torrijos Herrera con el ﬁn de detectar diferentes mecanismos de resistencia en Pseudomonas spp., tales como frecuencia de metalo-betalactamasas, presencia de BLEE tipo GES y otros tipo de BLEE, que en la rutina normal de trabajo no son detectados con el objeto de implementar su búsqueda en los Laboratorios de Microbiología de la C.S.S.

METODOLOGÍA

La metodología utilizada para determinar los mecanismos de resistencia en Pseudomonas spp fue la de aproximación de discos. Se colectaron 20 Pseudomonas spp, con un perﬁl alto de resistencia en el Hospital de Especialidades Pediátricas Omar Torrijos Herrera, durante Junio 2011 a Junio 2012. Las 20 Pseudomonas spp. fueron sometidas para la búsqueda de Metalobetalactamasas, BLEE tipo AmpC, GES y otros tipo de BLEE. Para determinar el tipo de metalo-betalactamasa, se realizó una PCR convencional.

Los procedimientos de describen a continuación: 1-Detección de AmpC en Pseudomonas spp. por el método de aproximación de discos: a.Preparar un inóculo de la Pseudomonas spp. a probar a una densidad 0.5 Mc Farland. b.Estriar un agar Müeller- Hinton según la metodología de Kirby-Bauer. c.Colocar un disco de ceftazidima (30 µg) a 20 mm de distancia del borde de un disco de ácido clavulánico y un disco de cefotaxime a 20 mm del borde del disco de ácido clavulánico. d.Incubar a 37°C por 24 horas. Interpretación: Se forma un achatamiento en forma de D en los discos de ceftazidime y cefotaxime, indicativo de presencia de AmpC. 2-Detección de metalo-betalactamasas en Pseudomonas spp. por el método de aproximación de discos: a.Preparar un inóculo de la Pseudomonas spp. a probar a una densidad 0.5 Mc Farland . b.Estriar un agar Müeller- Hinton según la metodología de Kirby-Bauer. c.Colocar un disco de imipenem (30 µg) a 15 mm de distancia de un disco de EDTA y un disco de meropenem (30 µg) a 15 mm del disco de EDTA. d.Incubar a 37°C por 24 horas. Interpretación: Observar la formación de un o dos abanicos entre el disco de imipenem o meropenem y el disco de EDTA. 3-Detección de metalo-betalactamasas en Pseudomonas spp. mediante el método de concentración inhibitoria mínima E-test. a.Preparar un inóculo de la Pseudomonas spp. a probar a una densidad 0.5 Mc Farland . b.Estriar un agar Müeller- Hinton según la metodología de Kirby-Bauer. c.Colocar una tira de E-test MBL en el centro del plato de agar Müeller-Hinton. d.Incubar a 37°C por 24 horas. Interpretación: Formación de una ﬂecha en el lado de la tira donde se encuentra el imipenem. Aplicar la siguiente fórmula:

Si el cálculo resulta ser una concentración inhibitoria mínima igual o mayor a 8, se considera una metalo-betalactamasa. 4-Detección de metalo-betalactamasas en Pseudomonas spp. mediante una PCR convencional: a.Extracción de ADN para Pseudomonas spp.: i.Añadir 25 µl de agua libre de DNA a un tubo de 1.0 ml. ii.Añadir 25 µl de NaOH 0.1 N iii.Vortex iv.Calentar entre 95 a 99°C por 10 minutos. v.Enfriar de 3 a 5 minutos en hielo. vi.Añadir 18 µl de TRIS-HCl 0.5 N pH 8. vii.Añadir 400 µl de agua destilada fría. viii.Vortex ix.Centrifugar 18,000 rpm por 18 minutos. x.Añadir 400 µl de DNA extraido a un microtubo. b.Elaboración del Master mix: El master mix y el control positivo están a una concentración de 10X y hay que llevarlos a 1X. i.Volumen total del master mix: 25 µl. ii.9 µl de agua destilada. iii.13 µl dNTP iv.1 µl de primers (especíﬁcos para VIM-2) v.2 µl de ADN por probar. c.Programa del termociclador: i.94°C por 5 minutos. ii.94°C por 30 segundos. iii.95°C por 30 segundos. iv.72°C por 30 segundos. v.72°C por 5 minutos. vi.4°C por 5 minutos. 5-Detección de betalactamasa tipo GES en Pseudomonas spp, asi como de otras betalactamasas por el método de aproximación de discos: a.Preparar un inóculo de la Pseudomonas spp. a probar a una densidad 0.5 Mc Farland . b.Estriar un agar Müeller- Hinton según la metodología de Kirby-Bauer.

c.Colocar un disco de ceftazidima (30 µg) a 20 mm de distancia del borde de un disco de imipenem (30 µg) y un disco de amoxicilina + ácido clavulánico a 20 mm del borde del disco de imipenem. d.Incubar 24 horas a 37°C. Interpretación: Se forma una inhibición por imipenem sobre ceftazidima “efecto huevo” en el antibiograma por difusión.

C+

RESULTADOS

Se analizaron 20 Pseudomonas spp. con un perﬁl de alta resistencia en un periodo comprendido entre junio 2011 y junio 2012; en busca de los posibles mecanismos de resistencia que estuvieran presentes en cada una de ellas; obteniendo los siguientes resultados: a.Análisis de la detección de AmpC en Pseudomonas spp. por el método de aproximación de discos: Las 20 Pseudomonas spp. analizadas por AmpC poseían este mecanismo de resistencia.

261 pb

Figura 3. Detección de 3 metalo-betalactamasas por una PCR convencional para metalo-betalactamasas tipo VIM en Pseudomonas aeruginosa. Cepas aisladas del H.E.P.O.T.H., año 2012. d.Análisis de la detección de metalo-betalactamasas en Pseudomonas spp. mediante el método de concentración inhibitoria mínima (E-test) con la tira E-test MBL: De las 20 Pseudomonas spp. analizadas, 3 fueron positivas mediante este método, mostrando la ﬂecha característica en el lado del imipenem.

Figura 1. Mecanismo de resistencia AmpC en Pseudomonas spp. por el método de aproximación de discos. Cepa aislada en H.E.P.O.T.H., año 2012. b.Análisis de la detección de metalo-betalactamasas en Pseudomonas spp. por el método de aproximación de discos: De las 20 Pseudomonas spp. analizadas, 3 Pseudomonas aeruginosas presentaron metalobetalactamasas.

Figura 4. Formación de la ﬂecha en el lado del imipenem en Pseudomonas aeruginosa metalo-betalactamasas. e.Análisis de la detección de betalactamasa del tipo GES en Pseudomonas spp. mediante el método de aproximación de discos: De las 20 Pseudomonas spp. analizadas en busca de betalactamasas tipo GES, 18 Pseudomonas spp. fueron positivas de este mecanismo de resistencia. Solo 2 resultaron ser positivas por otras betalactamasas que no corresponden al tipo GES.

CAZ

AMC

Figura 2. Formación de un abanico entre el disco de imipenem y EDTA, indicativo de la presencia de metalo-betalactamasas, por el método de aproximación de discos. Cepa aislada en el H.E.P.O.T.H, año 2012.

c.Análisis de la detección de metalo-betalactamasas en Pseudomonas spp. por una PCR convencional: De las 3 Pseudomonas aeruginosas. positivas por el método de aproximación de discos para detección de metalo-betalactamasas, las 3 Pseudomonas aeruginosas presentaron bandas correspondientes a metalo-betalactamasas.

Figura 5. Formación del “efecto huevo” entre el disco de amoxicilina + ácido clavulánico y el ceftazidima, indicativo de la presencia de la betalactamasa GES en Pseudomonas spp. Cepa aislada del H.E.P.O.T.H. año 2012.

Se observaron 2 Pseudomonas aeruginosa que poseían otros tipos de betalactamasas distintas al tipo GES, entre ellas: la tipo VEB y tipo PER

cuando la cepa presenta alta resistencia. Otro método, el de concentración inhibitoria mínima (E-test) con la tira MBL también es bastante conﬁable y sencillo de realizar. Es interesante destacar que al hacer una PCR convencional con primers especíﬁcos para la metalo-betalactamasa tipo VIM, se descubre que existen diferentes variaciones de metalobetalactamasas tipo VIM en nuestro medio, ya que la cepa marca el patrón de banda fuerte a 261 pb, mas no marca la segunda banda como el control positivo para VIM-2.

TIPO VEB

IPM MM

CAZ

AMC

Utilizando el ensayo propuesto por el Servicio Antimicrobiano de Argentina para la detección de betalactamasas tipo GES, se pudo determinar que estas se encuentran en un 80% en nuestro medio y en un 20% otro tipo de betalactamasas (PER, VER etc.). En Argentina se reporta en el 2002 el primer caso de concordancia de metalo-betalactamasa VIM-2 con betalactamasa tipo GES. En Panamá, se descubre esta concordancia también en el 2012, Hospital de Especialidades Pediátricas Omar Torrijos Herrera (H.E.P.O.T.H) Se recomienda buscar todos los mecanismos de resistencia expuestos en este trabajo en Pseudomonas spp. que tengan un perﬁl de alta resistencia e inclusive reportarlos en los informes de epidemiología para así poder seguir una vigilancia activa de estos importantes mecanismos de resistencia.

TIPO PER

IPM MM

CAZ

BIBLIOGRAFÍA AMC

Figura 6. Betalactamasas tipo VEB y PER, encontradas en Pseudomonas spp. Cepas aisladas en el H.E.P.O.T.H., año 2012.

CONCLUSIÓN

Todas las Pseudomonas spp. poseen de forma intrínseca el mecanismo de resistencia AmpC, por lo tanto es natural encontrarlo en ellas. Las Pseudomonas spp. con metalo-betalactamasas no son muy frecuentes; pero hay que mantener una vigilancia activa y conﬁrmar con el método de aproximación de discos su presencia

Díaz, Jose Alberto. 2008. “Detección de metalobetalactamasas (MBLs) en Pseudomonas resistentes a los carbapenemas en un Hospital Nacional, en los meses de enero a octubre del año 2008. Tesis para optar por el grado de Magister en Microbiología. Pasteran, Fernando; Faccone, Diego; Petroni, Alejandro; Rapoport, Melina; Galas, Marcelo; Vázquez, Miryam; Procopio, Adriana. 2005. “Novel variant (VIM-11) of the metallo-betalactamase VIM family in a GES-1 extended spectrum Metalobeta-lactamase producing Pseudomonas aeruginosa clinical isolate in Argentina”. Antimicrob. Agent and Chemother. 49(1):474-5. Poirel,L; Naas, Thierry and Nordman Patrice. 2000. “Characterization of VIM-2, a carbapenem-hydrolizing Metallo-b-lactamase and its plasmid and integron-borne Gene from Pseudomonas aeruginosa clinical isolate in France. Antimicrob. Agent and Chemoter. 44(4):891-897. Walsh, T.R.; Toleman, M.A.; Poirel, L.; Nordman, P. 2005. “Metallo-beta-lactamase: the quiet before the storm?. Clinical Microb. Rev. April;18(2): 306-25.

Domínguez, Omara, Lam, José, Rodríguez, Darwin Banco de Sangre. CHMDrAAM.

RESUMEN: Los Bancos de Sangre deben incorporar en sus metodologías controles de calidad internos que aseguren el control del proceso durante la fase analítica para disminuir al mínimo la posibilidad de obtener resultados falsos negativos, cuyas consecuencias en el paciente, sus familiares y la comunidad son de tipo sanitarias, psicológicas y socioeconómicas. En este sentido, el Banco de Sangre de Referencia para la Caja de Seguro Social (C.H.M.Dr.A.A.M.) buscando la mejora continua de los procesos y procedimientos que ejecuta, ha adquirido los virotroles como suero control interno. El objetivo principal de este estudio fue determinar si los controles antes mencionados pueden ser utilizados como una alternativa para controlar la fase analítica del tamizaje serológico de las pruebas infecciosas que se realizan a las bolsas de sangre. Después de ejecutar la metodología de trabajo, según lo planteado en la literatura, se llega a la conclusión de que el uso de los virotroles contribuye a minimizar el riesgo de transfundir componentes sanguíneos con resultados falsos negativos. ABSTRACT Blood banks should incorporate into their internal quality control methodologies to ensure control the process during the analytical phase to reduce to a minimun the possibility of false negative consequences on the patient, family and community are of health, psychological and socioeconomic. In this sense, the reference blood bank for Caja de Seguro Social (C.H.M.Dr.A.A.M.) seeking continuous improvement of processes and procedures to run has acquiered the virotroles as internal control serum. The main objective of this study was to determine whether these controls can be used as an of infectious tests performed on blood bags. After executing the method of work according to what was stated in the literature, the conclusion is reached that the use of virotroles helps minimize the risk of transfusing blood components with false negative results. PALABRAS CLAVES: Control de calidad interno, falso negativo, media, desviación estándar, coeﬁciente de variación. INTRODUCCIÓN La Organización Mundial de la salud (OMS) considera como uno de los pilares fundamentales en la disminución de las infecciones transmitidas por transfusión de hemocomponentes (ITT), contar en los Bancos de sangre con metodologías aprobadas que cumplan con altos estándares de calidad en el tamizaje serológico de las muestras de los donantes. En Panamá, una fortaleza que se tiene en los Bancos de Sangre, es que sus insumos y reactivos, antes de ser comercializados en el país, tienen que cumplir con requisitos que exige el Laboratorio Central de Referencia en Salud Pública ( LCRSP), deben obtener un criterio técnico,

contar con registro sanitario y una ficha técnica. El Banco de Sangre del Complejo Hospitalario Metropolitano de la Caja de seguro Social y el del Hospital Santo Tomás a solicitud del LCRSP, participan en la verificación de la reactividad de estos insumos según lo estipulado por el fabricante. En lo que respecta a reactivos para el tamizaje de enfermedades infecciosas de transfusión por hemocomponentes, los Bancos de Sangre, deben garantizar la pezquiza de unidades reactivas bajas o en zona gris para evitar resultados falsos negativos. En este contexto, se deben introducir medidas de control que mejoren la calidad de los componentes sanguíneos. De allí la importancia del establecimiento de un control de calidad interno en el que se utilicen controles de tercera opinión. Este es justamente el objetivo de este artículo, evaluar si los virotroles pueden utilizarse como control de calidad interno en el monitoreo de la fase analítica durante la realización de pruebas de tamizaje serológico de las muestras de los donantes de sangre. Hasta hace poco tiempo, no contábamos en el país con material comercial para el control interno en pruebas infecciosas. El LCRSP distribuía sueros reactivos y no reactivos como control externo y los Bancos de Sangre participaban en programas de control de calidad externo como el College of American Pathologists (CAP) y MLE (Medial Laboratory Evaluation). En el año 2005, al instalarse en Panamá el Laboratorio Regional de Referencia para VIH/SIDA éste se encargaba de la preparación y distribución de sueros de reactividad conocida para que fueran usados en los Bancos de Sangre y Laboratorios Regionales de Referencia de Centroamérica y Panamá como controles de calidad interno. El Programa duró muy poco dada la dificultad de obtener Bronidox L-5 o ácida sódica para mantener los sueros límpidos y estables. En el año 2010 se presenta la posibilidad de utilizar en el país los virotroles para pruebas infecciosas (HIV, HBsAg, HTLV I/II, HCV, Hbcore, Sifilis) excepto Chagas. La utilización de estos controles se sustentó reconociendo los beneficios que se obtienen al identificar evidencias de las imperfecciones ocultas en los diferentes procesos y la magnitud de las consecuencias sanitarias, psicológicas, familiares y socio económicas. Para efectos de estas evaluaciones, se hace necesario el cálculo de la media de las corridas de estos controles, su desviación estándar, así como el índice resultante entre el valor de la muestra y el cut off. (DO/CO). Estos resultados nos permiten hacer el cálculo del coeficiente de variación y excluír los valores extremos aplicando el método de Grubbs en el que se utiliza la siguiente fórmula: Z= (Valor – Media) / Desviación Estándar. El valor de esta ecuación no debe ser mayor que el estipulado en la gráfica de Grubbs para el número de datos calculados (n).

Con los valores que se obtengan se debe hacer la construcción de la gráfica de Levey-Jeanning y aplicar las reglas de Westgard. Hay que advertir que, según la literatura consultada, los valores el coeficiente de variación (CV) hasta 12% pueden ser considerados excelentes, entre 12.1% y 22%, aceptables y superiores al 22% alto. MATERIALES Y MÉTODOS A fin de implementar el uso de los controles internos en el Banco de Sangre del C.H.M.Dr.A.A.M, se utilizaron sueros control interno (SCI) comerciales para validar los ensayos realizados. Inmediatamente, se procedió a establecer rangos de referencia de control según lo sugiriera el fabricante, ya que los virotroles pueden aplicarse a distintas metodologías. Con el Virotrol F y C se evaluaron las pruebas de HIV; HTLV I/II, HCV, Hbcore, HbsAg, y con el Virotrol Sífilis, la prueba de Sífilis, junto con ellos se utilizó el Viroclear que es no reactivo para las pruebas antes mencionadas. Se debe advertir que estos virotroles se utilizan en metodologías de quimioluminiscencia que es la que se realiza en este Banco de Sangre. La literatura especifica que los sueros controles internos reactivos deben poseer valores entre 2.0 a 4.8 veces por encima del cut off y el suero control interno (SCI) no reactivo debe ser menor de 0.8; con esta referencia procedimos a realizar las pruebas, obteniéndose los siguientes valores: -Virotrol C: HIV (2.78); HCV (2.96) -Virotrol F. HbsAg ( 3.37); HTLV I/II ( 2.15), Hbcore (2.41) -Virotrol Sífilis: Sífilis (13.4). Al no ajustarse a los criterios previamente establecidos, esta prueba se excluyó para efectos de este estudio. -Viroclear: No reactivo para los siete marcadores. Evaluado los Virotroles, se realizaron 20 determinaciones para cada una de las pruebas usadas en el tamizaje de los donantes. Estas determinaciones se realizaron durante 5 días consecutivos (4 determinaciones por día del mismo SCI, para cada prueba). Cumplida esta etapa, se siguió con el cálculo de la media, desviación estándar y el índice DO/CO. Los sueros controles internos no reactivos fueron trabajados bajo los mismos criterios. Con los resultados obtenidos de la media, y la desviación estándar de cada prueba se calculó el coeficiente de variación, excluyéndose los valores extremos (outlier) usando el método de Grubbs. Según se desprende de la tabla N°1 que presentamos a continuación: TABLA N°1 Método de Grubbs para detección de outliers (valores a ser excluídos). Z= (valor – media)/Desviación Estándar. N

Z crítico

2.29

2.73

2.34

2.76

2.41

2.78

2.46

2.80

2.51

2.82

2.55

2.84

2.59

2.86

2.62

2.88

2.65

2.89

2.68

2.91

2.71

2.92

Fuente: Registros del Banco de Sangre C.H.M.Dr.A.A.M.

RESULTADOS: La evaluación de las 20 determinaciones durante los cinco días según lo descrito anteriormente, nos condujo a los siguientes resultados: Cuadro N°1 Valores de la media, desviación estándar y coeﬁciente de variación para las pruebas de HCV, HBcore y HIV. MEDIA

2.96262295

MEDIA

2.41327586

MEDIA

2.78885246

0.11363541

0.13194082

0.17232816

5.78997641

5.46729105

9.63344733

1DS

2.07625836

1DS

2.54521668

1DS

1.96118062

2DS

2.18989376

2DS

2.67715749

2DS

2.13350878

3DS

2.30352917

3DS

2.80909831

3DS

2.30583694

MENOS 1DS

1.84898754 MENOS 1DS

2.28133505

MENOS 1DS

1.6165243

MENOS 2DS

1.73535214 MENOS 2DS

2.14939423

MENOS 2DS

1.44419614

MENOS 3DS

1.62171673 MENOS 3DS

2.01745342

MENOS 3DS

1.27186798

HCV

HBCORE

HIV

Fuente: Registro del Banco de Sangre CHMDrAAM. Cuadro N°2 Valores de la media, desviación estándar y coeﬁciente de variación para las pruebas de HBsAg y HTLV I/II. MEDIA

3.371245327

MEDIA

2.15180328

0.096101608

0.13685162

2.854567325

6.35985651

1DS

3.4709854323

1DS

2.28865488

2DS

3.5698704322

2DS

2.42550648

3DS

3.6609871234

3DS

2.56235808

MENOS 1DS 3.2809753216 MENOS 1DS

2.01495168

MENOS 2DS 3.1860984323 MENOS 2DS

1.87810008

MENOS 3DS 3.0809743267 MENOS 3DS

1.74124848

HBSAG

HTLV I/II

Fuente: Registro del Banco de Sangre CHMDrAAM. En ambos cuadros podemos observar que los resultados del coeﬁciente de variación de las pruebas en estudio, cumplen con lo señalado en la literatura, y todas se encuentran en menos de 12%, lo que se considera excelente. Con los valores obtenidos, se construyeron en papel milimetrado, las gráﬁcas de Levey – Jennings para cada una de las pruebas. El monitoreo de la aceptación o no de la corrida, se realizan utilizando las reglas de Westgard.

A continuación presentamos como ejemplo, la gráfica para la prueba de HIV. Gráfica N°1 Gráfica de Levey-Jennings para la prueba de HIV

2.30 2.13 1.96 2.78 1.61 1.44 1.27 Gráﬁca N°2 Gráﬁca de Levey-Jennings para la prueba de HIV

Media + 3DE (2.30) Media + 2DE (2.13) Media + 1DE (1.96) Media ( 2.78) Media - 1DE (1.61) Media - 2DE (1.44) Media - 3DE (1.27)

+3 +2 +1 0 -1 -2 -3

DISCUSIÓN Como habíamos señalado, la determinación de la reactividad de los virotroles siguiendo los criterios expresados por Grubbs al llevarlo a una tabla Z, permite reconocer la validez de estos controles en la ejecución de las pruebas. Apoyándonos en las gráficas de Levey-Jennigs podemos monitorear estos valores y concluir si los resultados de las pruebas pueden o no ser aceptados. Los resultados encontrados en este estudio, nos permitieron concluir que los virotroles utilizados para el control de calidad interno en el tamizaje de las muestras de los donantes de sangre, nos ofrecen garantizar la validez de las pruebas y la tranquilidad de que en la fase analítica estamos aplicando los controles que nos ayudan a minimizar los resultados falsos negativos. BIBLIOGRAFÍA Ley N° 17 del 31 de Julio de 1,986 por la que se reglamentan reglamentan los Bancos de Sangre y transfusiones Sanguíneas y se dictan otras medidas. Resolución N° 7 del 17 de Abril de 2,013: “Por la cual se aprueban las normas técnicas y administrativas que regulan los Bancos de Sangre y servicios de Medicina Transfusional para su aplicación en todas las instalaciones públicas y privadas donde se presten estos servicios de salud.” BRASIL. Agencia nacional de vigilancia sanitaria. Resolução da Diretoria Colegiada – RDC nº 153 de 14 de junio de 2004. Diario Oficial da União. Brasília. BRASIL. Agência nacional de vigilância sanitária. Resolução da Diretoria Colegiada – RDC nº 302 de 13 de octubre de 2005. Diário Oficial da União. Brasília. Cura E. & Wendel S. Manual de procedimientos de Control de Calidad para los laboratorios de serología y de los bancos de sangre. PAHO/HPC/HCT/94.21. 1994. Multirule and “Westgard Rules”. Disponível em: http://www.westgard.com/multirule.htl#howmrl Grubb’s test for detecting outiliers. Disponível em: http://www.graphpad.com/quickcalcs/GrubbsHowTo.cfm Levey S. and Jennings ER. The use of control charts in clinical laboratories. Am. J. Clin. Pathol. 20: 1059 – 1066, 1950. Programa de Controle de Qualidade http://www.panel.com.Br/ser_pcqis_1.html

Interno

– CQI

–

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uso.

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E N E L B A N C O DE S A N G R E DE L C O MP L E J O H OS P ITAL AR IO ME T R OP OL ITAN O E S T A MO S PA R A S E R V I R L E !!!

AGRADECIMIENTOS: A todo el personal del Banco de Sangre del Complejo Hospitalario Metropolitano por su compromiso y alto sentido de responsabilidad para con los pacientes y donantes. Al Lic. Virgilio Moscoso por su asesoría en la redacción y edición del presente documento.

Por: Yudiana Y. Montenegro C. – Tecnóloga Médica LAHE-HDN

Resumen: La Enfermedad de von Willebrand es una anomalía de la coagulación de carácter hereditario, aunque también puede ser adquirida, es la más común en los seres humanos. Se caracteriza por la deficiencia cualitativa y cuantitativa del factor de von Willebrand. Es una enfermedad que hombres y mujeres pueden padecer, en donde la diversidad de manifestaciones clínicas es evidente, en las que podemos mencionar sangrados en nariz, oídos, encías, o bien hematomas (sin dolor) que aparecen y desaparecen por sí solos, encontrando uno o varios de los síntomas descritos en cada paciente. Existen tres tipos de la enfermedad: Leve: Deficiencia cuantitativa. Moderada: Deficiencia cualitativa (alteración de la proteína de von Willebrand). Severa: Deficiencia cuantitativa. El tipo más común es la forma Leve, y está documentado que la forma severa de esta enfermedad clínicamente es similar a los estados severos de la Hemofilia, por lo que la enfermedad de von Willebrand es considerada PRIMAHERMANA DE LA HEMOFILIA, por lo que es importante que a nivel de laboratorio podamos tipificar y documentar la misma a fin de mejorar el diagnóstico, control y seguimiento. Para el buen diagnóstico desde el punto de vista de laboratorio se debe controlar cada una de las fases del control de Calidad, solo así podemos obtener resultados confiables y veraces, que serán de gran utilidad al médico para el diagnóstico, monitoreo y profilaxis adecuada del paciente, la cual va a depender de su severidad. Hoy día se conocen ciertas condiciones relacionadas con la toma de la muestra que antes eran desconocidas, las mismas involucran: horario de toma y tipificación del tipo de sangre del paciente en estudio lo que permite complementar la información y así poder eliminar el sesgo que nos pudiera dar una falsa elevación de esta proteína. En los años 80, la Enfermedad de von Willebrand en nuestro país, era totalmente desconocida para nuestra población; con el correr de los años hemos ido aprendiendo a conocerla y a ser capaces de diagnosticarla,

de tal manera que en la actualidad podemos hablar con propiedad tanto en clínica como en análisis de laboratorio; de la que sin duda es la Coagulopatía Congénita más común en nuestro país. La literatura señala que fue descubierta en 1926 por Erick von Willebrand, en cual publicó un trabajo que hacía mención a una enfermedad hemorrágica padecida por toda una familia sueca; observándose tanto en varones como en mujeres (hasta entonces se le llamó Pseudohemofilia). Ya para 1960, estudios realizados por Zimmerman en conejos, indicó la presencia de un anticuerpo contra el factor VIII de la coagulación sanguínea (lo que hoy conocemos como anticuerpos anti-factor de von Willebrand). En este sentido, nuestros especialistas (Hematólogos) y equipo de diagnóstico de laboratorio (Tecnólogos Médicos), tanto de la Caja de Seguro Social (CSS) como del Ministerio de Salud y Patronatos; han logrado grandes avances en diagnóstico, tratamiento y profilaxis de estos pacientes. Es importante que nuestra población conozca un poco sobre la Enfermedad de von Willebrand, los probables síntomas y signos que se pueden presentar, las diferentes hemorragias que en su mayoría son de mucosas, gingival (inclusive al cepillarse los dientes), en las mujeres que menstrúan se observan sangrados por arriba de los 10 días. Todos estos síntomas nos pueden indicar clínicamente que estamos ante la presencia de una persona con la Enfermedad de von Willebrand. El factor de von Willebrand propiamente dicho, es sintetizado por las células endoteliales y megacariocitos (responsables de la producción de plaquetas), a nivel genético se encuentra ubicado en el cromosoma 12 y se encuentra constituido por una serie de proteínas de diferentes tamaños llamados Multímeros, que utilizando un sistema electroforético especial, nos permite determinar cada uno de los tamaños de estas proteínas, importantes para determinar uno de los tipos de esta enfermedad (tipo 2). A nivel bioquímico, debemos recordar que todas las coagulopatías congénitas se deben a deficiencia de uno de los factores de la coagulación, no olvidando que la activación de los mismos (según el Nuevo Modelo Celular- descrito por Hoffman), se da por activación del factor Tisular extravascular posterior a la lesión del vaso sanguíneo,

lo que permite que los diferentes complejos de activación puedan formarse y continuar con la activación de los factores y plaquetas hasta producir el coágulo de fibrina estable. De manera que al activar el factor VIII de la coagulación, se produce un enlace muy fuerte con el factor de von Willebrand, de esta forma es el factor de von Willebrand el que da estabilidad y viabilidad al factor VIII. Si tenemos en una persona poca producción del factor von Willebrand, al momento de necesitar que estabilice y mantenga viable al Factor VIII, habrá un déficit de factor von Willebrand y van a verse los síntomas que dan origen a la enfermedad. A diferencia de las otras coagulopatías congénitas, que pueden ser diagnosticadas incluso por sus proteínas, en el laboratorio, esta enfermedad tiene un comportamiento diferente de acuerdo al grado de severidad; de aquí su clasificación: •Tipo 1: Deficiencia cuantitativa del factor de von Willebrand •Tipo 2: Deficiencia cualitativa del factor de von Willebrand •Tipo 3: Ausencia cuantitativa del factor de von Willebrand La tipo 1 es aquella en donde encontramos deficiencia del factor von Willebrand y del factor VIII, no hay anormalidades funcionales del factor de von Willebrand. La tipo 2 es aquella en donde encontramos el factor von Willebrand bajo y los multímeros del factor ausente, mientras que la tipo 3 es aquella donde tenemos ausencia total del factor von Willebrand y niveles muy bajos del factor VIII. Una vez el paciente es evaluado clínicamente, se remite a los laboratorios de hematología especializada y se les realizan las pruebas para determinar la presencia de la enfermedad, dichas pruebas incluyen: •Tiempo de sangría: nos permite evaluar mediante una pequeña incisión (a un tamaño y profundidad estandarizada) en el antebrazo el tiempo que demora la persona en formar el cóagulo (esto es producto de la unión simultánea de miles de plaquetas). •Adhesividad plaquetaria: evalúa la funcionabilidad de las plaquetas al momento de formar el coágulo primario. •BHC (biometría hemática completa): para determinar el número total de plaquetas. •TTPa (tiempo de tromboplastina parcial activado): evalúa el factor VIII de la coagulación entre otros, y es con esta simple prueba que nos podemos orientar ante la probable presencia de esta enfermedad puesto que podemos encontrar este tiempo prolongado o normal en caso del tipo 1 de la enfermedad. •Cofactor de Ristocetina: evalúa la actividad funcional del factor von Willebrand. •Factor von Willebrand Antigénico: determinamos la cantidad del factor de von Willebrand presente.

•Niveles circulantes de factor VIII: importante evaluar para determinar la fuerza estabilizadora que tendrá el complejo formado con el factor de von Willebrand. •Agregabilidad plaquetaria con Ristocetina: prueba que nos permite evaluar la capacidad que tienen los receptores ubicados en las plaquetas para agregarse entre sí, fuerza que es inducida por el agregante Ristocetina. Esta Enfermedad tiene varias particularidades, que son importantes destacar desde el punto de vista clínicolaboratorio: •La forma leve (Tipo 1) es la más frecuente dado que en su comportamiento podemos encontrar TTPa normales, pero con clínica evidente, es por ello que este tipo de coagulopatía congénita es estudiada hasta por un año, realizando hasta tres determinaciones de la misma triada (F.VIII, Cofactor de Ristocetina, FvWAg), antes de poder descartar a un paciente por esta enfermedad. •Es importante tomar esta muestra en horas de la mañana puesto que se conoce que el factor von Willebrand hace una elevación (pico) en horas vespertinas lo cual nos daría valores errados de esta proteína. •Hoy día se incluye el tipo de sangre en todos los pacientes que se estudia por esta coagulopatía, ya que se tiene documentado que la personas con tipo de sangre A tienen mayor cantidad de la proteína sobre los demás tipos de sangre y este patrón sigue siendo motivo de estudio en la actualidad. En nuestro país estamos capacitados para responder a las necesidades diagnósticas en cuanto a técnicas y equipos de laboratorio, capaces de realizar el diagnóstico de la enfermedad de von Willebrand tipo 1 y 3, siendo que la tipo 2 se realiza por técnicas que involucran un alto costo. Estadísticamente nuestra población con enfermedad de von Willebrand asciende a un aproximado de 380 personas, siendo la que ocupa el mayor índice de incidencia la enfermedad de von Willebrand tipo 1. Dependerá de nosotros los que trabajamos con esta enfermedad brindar la docencia adecuada, en primera al personal de salud, seguido por la población susceptible (mujeres en edad reproductiva y personas con síntomas que nos puedan orientar a esta enfermedad).