Laboratorio Clínico e Investigación by ConalacPma

Revi st a Panameña del

Labor at or i o Cl í ni co

eI nvest i gaci ón

R e v i sRta e v RiPa setvani a m e ñ

s Pt a a d e l L a b Loar abL to oa rbr i o a nPaam e e Ien evI enIs atotroartCiool í nnCai cmñoae ñd e l vnevisg a cr i oi ól ínn i a etsi g a C l c o d e l t i g c i óí n i c a n o

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Sucesos Históricos para la creación de CONALAC Luis R. Lozano U. Dirección Nacional de Laboratorio Clínico, Caja Seguro Social

La profesión de Laboratorista Clínico se inicia en el año 1550 A.C.; donde aparecieron escritos que certifica la descripción por observación de parásitos intestinales. Otros, señalan los escritos de la profesión al viejo continente europeo (año 1306) en ciudad de Boloña, Italia; donde la joven Alexandra Giliani quien realizaba dicho trabajo.

Otros científicos contribuyeron a la creación de los Laboratorios Clínicos como lo son: Louis Pasteur y Robert Koch con sus avances en bacteriología (1857 y 1876), Rudolf Virchow quien se especializó en Fisiología Celular y es el fundador de los archivos de patología en Berlín (1847). El primer Laboratorio de Química asociada a la Medicina en Estados Unidos, fue fundado en la Universidad de Michigan (1844).

En la época Renacentista (siglo XV y XVI) al Médico Suizo Theospharatus Bombast Von Honenheim (Paracelso), se le atribuye las primeras bases de la profesión al describir la Tuberculosis en Salzburgo (1493-1541).

En 1928 se construye un moderno Laboratorio Clínico en el Hospital Panamá, con el Dr. Lawrence Getz, como director.

También hay escritores que atribuyen fechas posteriores al año 1600 el inicio de los Laboratorios.

En 1935 se crea la Escuela de Laboratorio Clínico del Hospital, Carlos J. Finlay, del Santo Tomas.

Marcelo Malpighi (1628-1694) es señalado como fundador de la Patología y como el iniciador de trabajos con el microscopio en embriología y anatomía.

En enero de 1938 se inicia el Servicio Nacional de los Laboratorios Clínicos de Salud Pública. Ese año se procesaron 33,000 exámenes de laboratorio.

La fundación de los laboratorios de manera científica se inicia con los trabajos de Antoj Van Leewhooek´s (1677) donde describe células rojas y posteriormente protozoos y bacterias.

El 27 de abril de 1943 se autoriza el Servicio de Laboratorios Clínicos para Asegurados, y da inicio la prestación del servicio en 1946 con la apertura de la Policlínica José A. Remón Cantera.

El 23 de agosto de 1944 durante la segunda guerra mundial se funda el Banco de Sangre del Hospital Santo Tomás; el gestor de esta creación fue el Dr. Rolando Chanis con el apoyo del Licdo. Manuel F. Zárate. De esta manera se inicia la Medicina Transfusional en Panamá. El 6 de diciembre de 1947 se publica en Gaceta Oficial No. 10,467 la Ley No. 66 del 10 de noviembre de 1947 que rige el Código de Salud, actualmente vigente que regula y norma la posesión de instalaciones para la práctica de exámenes de Laboratorio. En 1948 el Licenciado Víctor Charles es nombrado como Director Técnico de Banco de Sangre del Hospital Santo Tomás y permanece hasta 1990 en esta posición pasando luego a ser asesor de la Dirección. La primera Laboratorista del Banco de Sangre del HST fue la Licda. Micaela Mendizábal. En 1953 se da inicio a la organización de los Laboratorios Locales y Regionales. Se adiestra al personal con cursos de Laboratorios Básico, de Refrescamiento y Especialidades con el apoyo y colaboración de la UNICEF. En 1954 se crea la primera Asociación de Técnicos de Laboratorio, Radiología y Patología. Situaciones de la época influyeron para la desaparición de la misma. Cuatro años después se crea la Asociación de Microbiología la cual desaparece de igual forma. En 1959 se inicia la inscripción de personal para el primer curso de Laboratorio para la formación de Laboratoristas en la CSS. Los requisitos de ingreso eran demostrar 2 años de estudio o conocimientos en el área científica. En enero de 1962 se elige la Junta Directiva para la Asociación Nacional de Laboratoristas de Panamá, en la Provincia de Veraguas. El Ier. Congreso de Laboratoristas se realizó el 29 de abril de 1962 en la Provincia de Chiriquí. Durante este Congreso se aprobó un anteproyecto de Ley que regulaba la profesión. En ese mismo año se establecen las categorías de Laboratorio: a) Nacional, b) Regional, c) de área o locales. El 4 de febrero de 1963 se aprueba la Ley No. 67 la cual reglamenta la Profesión de Laboratorista. Esta Ley No. 67 conjuntamente con la Ley No. 4 del 13 de enero de 1961, vienen a regular el salario de los profesionales del Laboratorio. En 1965 se crea en la Universidad Nacional de Panamá, en la Facultad de Ciencias Naturales y Farmacia en la Escuela de Biología el Departamento de Tecnología Médica. En 1969 se realiza la primera graduación de Tecnólogos Médicos con un Total de 12 egresados y se crea la Asociación de Tecnólogos Médicos de Panamá.

En octubre de ese mismo año sale a la luz pública el Ier. Boletín informativo de la Asociación Nacional de Laboratorista de Panamá. Entre 1972 y 1977 la Asociación Nacional de Laboratorista y la Asociación de Tecnólogos Médicos de Panamá se reúnen para crear un solo gremio. En el mes de noviembre de 1974 un grupo de estudiantes solicita el cierre de la matrícula de primer ingreso. El 5 septiembre de 1977 con el aval de COLABIOCLI se suscribe un documento conjunto entre la ANL y ATMP donde ambas Asociaciones se desprenden de todos sus bienes y patrimonios para crear una sola sociedad de Laboratoristas. El 3 de mayo de 1978, en Asamblea General, se crea el Colegio Nacional de Laboratoristas Clínicos de Panamá. Este gremio viene a ser confirmado como la máxima entidad de todos los Laboratoristas del país al aprobarse la Ley No. 74 del 19 de septiembre de 1978, la cual regula la profesión y le da Estabilidad en el cargo a todo aquel la ejerce. El 9 de octubre de 1978 por Decreto Presidencial se aprueba el Decreto No. 259 de Escalafón el cual viene hacer justicia y así unifica los salarios de todos los Laboratoristas Clínicos del País (MINSA, CSS, Patronatos, algunas empresas privadas que se acogen a la primera. Categoría). A través de esta reseña histórica hacemos énfasis en la importancia que nuestra profesión ha tenido, tiene y tendrá para beneficio de la humanidad. las generaciones actuales y que están por llegar reciben una profesión que les proporciona orgullo y satisfacción. Los Laboratorios Clínicos del presente cuentan con los mayores requisitos de calidad por el constante trabajo en equipo, con eficacia y ante las metas propuestas por la alta exigencia de los tiempos y las necesidades de la población.

Verificación del Protocolo para la detección del C. difficile Toxinas en heces del C.H.M.Dr.A.A.M. Panamá A Solis1, B Yañez2, R Rodríguez2, C Herrera3 1Departamento de Microbiología, CHMDrAAM, 2Escuela de Tecnología Médica, Facultad de Medicina UP, 3R Rodríguez

Resumen Clostridium difficile (C. difficile) puede ser una infección fatal adquirida en el hospital y su prevalencia ha aumentado. El diagnóstico preciso de C. difficile es esencial para el manejo del paciente, control de infecciones, y para definir su epidemiología. Hicimos una revisión sistemática de ensayos comerciales a nuestro alcance para la detección de C. difficile toxina (CDT) A y B en muestras de heces. Comparación de la detección de CDT en cultivo agar C. difficile sin cultivo selectivo para la detección de dicho microorganismo, fue agregado a algunas muestras como parte de un estudio en paralelo. La revisión de la sensibilidad media y especificidad (IQR) según la información de fábrica son como sigue: bioMérieux VIDAS sensibilidad: 88.3% y especificidad 99.6% (comparado contra ensayo EIA manual disponible en el mercado y Ensayo de Citotoxicidad en un total de 1011 muestras), GeneXpert System CEPHEID fue comparado en fábrica con cultivo directo para la tipificación de cepas por REA, el Xpert C. difficile/Epi Assay mostró una sensibilidad para el C. difficile toxinógeno del 98,72% y una especificidad del 90,86%. El Xpert C. difficile/Epi Assay también demostró una concordancia positiva del 98,55% y una concordancia negativa del 97,65% para C. difficile toxinógeno / 027/NAP1/BI. Si la prevalencia de CDT A y B en muestras de heces es relativamente baja (<10%), el valor predictivo positivo de estos ensayos es inaceptablemente baja (por ejemplo, <50% en algunos casos) y pueden variar dependiendo en el ensayo y el número de muestras analizadas. Este bajo valor predictivo positivo incide en la gestión clínica, brotes, y hace que los datos epidemiológicos fiables.

Abstract

C. difficile can be a fatal hospital-acquired infection and its prevalence has increased. Accurate diagnosis of C. difficile is essential for patient management, infection control, and for defining its epidemiology. We did a systematic review of commonly used commercial assays for detection of C. difficile toxin (CDT) A and B in stool samples. By comparison of detection of CDT in cell culture without selective culture for C difficile was done. The review of the mean sensitivity and specificity (IQR) factory reportedly are as follows: bioMérieux VIDAS sensitivity: 88.3% and specificity 99.6% (compared with manually EIA assay commercially available and cytotoxicity assay by a total of 1011 samples ), GeneXpert System CEPHEID factory was compared with direct culture for strain typing by REA, the Xpert C. difficile / Epi Assay showed a sensitivity for C. difficile toxigenic of 98.72% and a specificity of 90.86%. The Xpert C. difficile / Epi Assay also demonstrated a positive agreement (sensibility) 98.55% and (specificity) 97.65% negative agreement for C. difficile toxigenic / 027/NAP1/BI. If the prevalence of CDT A and B in stool samples is relatively low (<10%), the positive predictive value of these assays is unacceptably low (eg, <50% in some circumstances) and will vary depending on the assay and number of samples tested. This low positive predictive value impinges on clinical management, outbreaks, and makes epidemiological data unreliable. To improve diagnosis, we suggest a two-stage testing strategy for C difficile toxin with an initial highly sensitive rapid screening test to identify positive samples that are then confirmed by a reference method. Palabras Claves: Toxina C. difficile (inglés: C difficile toxin CDT), Colitis, EIA Assay: Ensayo ELISA, Infección por C. difficile (CDI)), Enfermedades Asociadas a Cuidado del Paciente (EAAS), Caja del Seguro Social (CSS), Valor predictivo positivo (PPV), Intervalo de confianza (IC)

Introducción Infección por C. difficile es una de las principales causas de diarrea debido a EAAS en los hospitales del mundo (Ortiz A. Camacho, 2009). En condiciones normales, C. difficile forma parte de la flora normal intestinal del ser humano. En adultos sanos de un 3 al 5% (hasta en el 15% en Japón), del 16-45% de los adultos hospitalizados con una terapia de antibióticos, en un 50% de los infantes y niños y en un 15-80% de los neonatos. En estos individuos no parece originar ninguna patología. Por tanto la presencia de este microorganismo en una muestra de heces no tiene por qué indicar que el paciente sufra una infección por C. difficile (Alderete P. Alba, 2011) (Esclapadez Berandeu, 1992).

El estado de portador asintomático se debe a la presencia de anticuerpos séricos Ig G contra la toxina A del C. difficile, que protege de la diarrea y de la colitis (Bujanda Leis, 2008). La colonización en adultos hospitalizados durante una semana o más, es del 20% al 50% para ingresos de 4 o más semanas (Esclapadez Berandeu, 1992). La colonización se lleva a cabo durante la primera semana en el 20% de los casos, y después de la cuarta en el 50%. Solamente el 30% de los pacientes que han sido colonizados de nuevo desarrollan Diarrea Asociada a C. difficile (Bujanda Leis, 2008). Actualmente se ha producido un incremento considerable del número de casos y de su gravedad en ciertas zonas geográficas (Canadá, Estados Unidos y oeste de Europa) atribuible a la aparición de una cepa hipervirulenta (NAP1/BI/027) (Bujanda Leis, 2008). Esta nueva cepa presenta características genéticas distintivas como: Ausencia del gen tcdC, cuya función es la regulación en la producción de toxinas, Producción de toxinas A, B y binaria y la resistencia a fluoroquinolonas. (Ortiz A. Camacho, 2009). La cepa NAP1/BI/027 produce 15–20 veces más cantidad de toxinas que las cepas comunes. Además, esta cepa libera una tercera toxina, llamada binaria, que es similar a la toxina de Clostridium perfringens, lo que incrementa notablemente su virulencia. (Bujanda Leis, 2008). La resistencia a las fluoroquinolonas durante la última década favoreció la virulencia de una cepa de C. difficile. Su nombre se debe a la caracterización por diferentes técnicas moleculares; la PFGE tipo 1 que la identificó como toxina tipo III Norteamérica (NAP-1), el análisis de restricción enzimática la identifica como tipo BI y por ultimo una técnica de PCR la clasifica como ribotipo 027. De ahí surge la clasificación NAP1/BI/027 (Bujanda Leis, 2008).

El mecanismo posible de la producción en exceso de toxinas por NAP1/BI/027serıa una delección parcial en el gen tcdC, que codifica como un regulador de la expresión de las toxinas A y B. (Bujanda Leis, 2008) Las autoridades de la Caja de Seguro Social de Panamá confirmaron la existencia de una nueva cepa de nombre "NAP 027" de la bacteria C. difficile, por lo que han incrementado las medidas sanitarias en el hospital regional Rafael Hernández, ubicado en la provincia de Chiriquí. Erick Miranda, director institucional de la Caja de Seguro Social de Chiriquí, manifestó que desde el año 2003 en diferentes países del mundo apareció la nueva cepa NAP 027 de la bacteria C. difficile, la cual es muy virulenta y a raíz que la provincia de Chiriquí es un punto del libre tránsito y la aparición para el año 2008 en el hermano país de Costa Rica cuando se presentó su primer caso, no se descarta que sea esta la forma que haya llegado esta nueva cepa a Panamá. Ante la preocupación de la población de los casos de la bacteria C. difficile, las autoridades afirmaron que hasta el momento el reporte es de 46 casos, de ellos 17 con la cepa NAP1 027, 6 fallecidos, en edades de 39 a 81 años, el mayor incremento de casos apareció en el mes de octubre de este año con 18 personas infectadas. De los casos que han aparecido 11 se mantienen recluidos en el Hospital Regional, de los cuales 5 de ellos esperaban ser dados de alta próximamente. (La Prensa-Panamá, Noviembre 2012). Nuestro estudio se plantea la necesidad de verificar el protocolo de diagnóstico de laboratorio, corriendo muestras en simultáneo que cumplan con los criterios de inclusión y con el protocolo de Flujo de muestra de Heces para Prueba de C. difficile, además de estandarizar la detección de las cepas C. difficile en Agar Selectivo y su posterior caracterización por métodos bioquímicos Vitek. Las muestras que se procesaron en este estudio cumplen con criterios de inclusión validos según las características sintomáticas de los pacientes y apoyadas en la clínica realizada por los médicos de nuestra institución. Nuestro principal objetivo es verificar nuestro

protocolo, calculando datos de sensibilidad y especificidad a manera de corroborar la información proporcionada por las casas comerciales que venden estas pruebas, y aprovechar los datos para validar y estandarizar la metodología convencional de cultivo en Agar de C. difficile.

METODOLOGÍA Y RESULTADOS.

En este estudio se evaluaron muestras diarreicas de pacientes sintomáticos del Complejo Hospitalario Metropolitano Dr. Arnulfo Arias Madrid durante los meses de Agosto a Octubre del 2012, en la Sección de Microbiología del Complejo Hospitalario Metropolitano Dr. Arnulfo Arias Madrid. Tipo de estudio:Descriptivo- Retrospectivo. Se analizaron muestras diarreicas de pacientes sintomáticos del Complejo Hospitalario Metropolitano Dr. Arnulfo Arias Madrid y hospitales de la red de la caja de CSS que enviaran muestras con solicitud. Las cuales fueron escogidas al azar un total 333 muestras de pacientes con sintomatología de diferentes salas del Complejo Hospitalario Metropolitano Dr. Arnulfo Arias Madrid y hospitales de la red de la CSS. Criterios para la Toma de Muestras Criterios de Inclusión: Se incluyen todas las solicitudes de examen de heces por C. difficile de los pacientes de las diferentes salas del Complejo Hospitalario Metropolitano Dr. Arnulfo Arias Madrid y de la red de la CSS. Criterios de exclusión: Se excluyen aquellas solicitudes que no sean referidas por el médico tratante y las muestras que no se presenten en condiciones adecuadas, ni debidamente identificadas. METODOLOGÍA Se recibieron las muestras diarreicas que llegaron en envases limpios de boca ancha, con suficiente cantidad de muestra, rotuladas con: nombre y cédula del paciente. La solicitud médica presentó los siguientes datos: fecha de recolección de la muestra, nombre, cédula y edad del paciente, lugar de procedencia, nombre y firma del médico tratante. Luego se introdujeron los datos al sistema informático de

recolección de datos (Copérnico) y se anotaron en nuestro formulario de recolección de datos. Detección de las toxinas A/B de C. difficile por el método ELFA. La prueba de ELFA (Elisa Linked Fluorescent Assay) es un método práctico que detecta la presencia de ambas toxinas, esta metodología combina el método inmunoenzimático tipo sandwich (ELISA) con una detección final por fluorescencia, la cual es proporcional a la cantidad de toxina presente en la muestra. En el control de calidad se incluyen dos controles positivos y un control negativo en el equipo de VIDAS C. difficile toxin A&B, los cuales se analizan con cada calibración. Dichos controles se procesan igual que las muestras de los pacientes. El equipo solo analiza los valores de control del kit que estén identificados como C1, C2. No se pueden validar los resultados de las muestras si los valores de control se desvían de los valores esperados. La calibración se realiza cuando se abre un nuevo lote, después de haber introducido las especificaciones del lote patrón. Se efectúa una recalibración cada 14 días. Esta operación le permitirá al sistema ajustar los datos de la curva de calibración a las posibles variaciones menores en la señal de la prueba a lo largo de la vida útil del equipo. Se analiza por duplicado el estándar, que es identificado por S1. El valor del estándar está comprendido en los límites de RFV (relative fluorescence value) fijados por el equipo. Si no fuera el caso se repite la calibración. Procedimiento: Ver el Flujograma de Detección de Toxinas de C. difficile Interpretación de los Resultados: se realizó considerando el valor del test para cada muestra que es interpretado por el sistema de la siguiente manera: Valor del test: RFV paciente/ calibrador RFV Dicho valor del test así como su interpretación aparecen en la hoja de resultados: Valor de test i n t e r p r e t a c i ó n < 0.13 N e g a t i v o ≥ 0,13 a < 0, 37 D u d o s o ≥ 0,37 P o s i t i v o

Xpert C. difficile EPI El Cepheid Xpert® C. difficile/Epi Assay es una prueba cualitativa de diagnóstico in vitro para la detección rápida de secuencias del gen regulador de la toxina B y la identificación presuntiva de cepas 027/NAP1/BI de C. difficile toxinógeno de muestras de heces informes (líquidas o blandas) recogidas de pacientes con sospecha de infección por C. difficile (ICD). La identificación presuntiva de cepas 027/NAP1/BI de C. difficile se lleva a cabo mediante la detección de secuencias del gen regulador de la toxina binaria (CDT) y la eliminación de un solo par de bases en el nucleótido 117 del gen tcdC. El gen tcdC codifica para un regulador negativo en la producción de toxinas de C. difficile. La prueba se realiza en el Cepheid GeneXpert Dx System y utiliza la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real automatizada para detectar secuencias de genes de toxinas asociadas a C. difficile productor de toxinas.

Principios del procedimiento

El GeneXpert Dx System automatiza e integra la purificación de muestras, la amplificación de ácidos nucleicos y la detección de la secuencia diana en muestras simples o complejas mediante ensayos de PCR en tiempo real y PCRtranscriptasa inversa en tiempo real (q-PCR). (La RT-PCR en tiempo real se utiliza para ensayos que detectan ARN; el Xpert C. difficile/Epi Assay utiliza la PCR en tiempo real para detectar ADN.) El sistema está formado por un instrumento, ordenador personal y software precargado para realizar las pruebas y ver los resultados. El sistema requiere el uso de cartuchos desechables de un solo uso que contengan los reactivos para la PCR y alojen el proceso de la PCR. Al tratarse de cartuchos autónomos, se elimina la contaminación cruzada entre muestras. Xpert C. difficile/Epi Assay es una prueba de diagnóstico in vitro automatizada y rápida para la detección cualitativa de C. difficile productor de toxinas directamente a partir de muestras fecales informes (liquido o blandas) de pacientes con sospecha de infección por C. difficile (ICD). El ensayo detecta el gen de la toxina B (tcdB), el gen de la toxina binaria (CDT), y la eliminación de un solo par de bases en el

nucleotido 117 del gen que codifica para un regulador negativo de la producción de toxinas (tcdC ƒ´117).

La presencia combinada de los genes que codifican la toxina B y la toxina binaria y la eliminación del tcdC ƒ´117 se han asociado con una cepa hipervirulenta de C. difficile conocida como 027/NAP1/BI, que se ha relacionado con brotes patógenos graves en centros sanitarios de todo el mundo. Cada prueba incluye un control de procesamiento de muestras (CPM) y un control de comprobación de sondas (CCS). Control de procesamiento de muestras (CPM) — Garantiza que la muestra se procesó correctamente. El CPM contiene esporas de Bacillus globigii en forma de una masa de esporas secas que se incluye en cada cartucho para verificar el procesamiento adecuado de las bacterias de la muestra. El CPM confirma que se ha producido la lisis de las bacterias y esporas de C. difficile, si los microorganismos están presentes, y verifica que el procesamiento de la muestra es adecuado. Aparte de lo anterior, este control detecta la inhibición asociada a la muestra del ensayo de PCR en tiempo real. El CPM deberá ser positivo en una muestra negativa, y puede ser negativo o positivo en una muestra positiva. El CPM pasa si cumple los criterios de aceptación validados. Control de comprobación de sondas (CCS) — Antes de iniciar la reacción PCR, el GeneXpert Dx System mide la señal de fluorescencia de las sondas para monitorizar la rehidratación de las microesferas, el llenado del tubo de reacción, la integridad de las sondas y la estabilidad de los colorantes. La comprobación de sondas pasa si cumple los criterios de aceptación asignados. Controles externos —Se pueden utilizar controles externos de acuerdo con las organizaciones de acreditación locales, estatales y nacionales, según corresponda.

Interpretación de los resultados: A partir de las señales fluorescentes medidas y de los algoritmos de cálculo incorporados, y los muestra en la ventana View Results (Ver resultados). Los resultados posibles se resumen en la Tabla 1.

Resultados

tabla 2. Prevalencia observada de C. diﬃcile toxigénico por grupo de edad * Grupo de Edad

Prevalencia de C. diﬃcile toxinógeno(incluye 027/NAP1/BI)

Prevalencia de 027/NAP1/BI

mas de 90 años 31-40 años 51-60 años 0-20 años 21-30 años 71-80 años sin edad en la boleta 61-70 años 81-90 años 41-50 años

7 20 29 9 21 34 104 49 34 25

28.6% 25.0% 13.8% 11.1% 9.5% 8.8% 8.7% 8.2% 5.9% 4.0%

14.3% 5.0% 6.9% 11.1% 4.8% 8.8% 8.7% 12.2% 8.8% 8.0%

total 332 * Prevalencia basada en los resultados de Protocolo de Muestras

Tabla 4. DATOS DE IMPORTANCIA RECAUDADOS DURANTE EL ANALISIS DE LOS DATOS. AGOSTO-OCTUBRE 2012 CHMDAAM Pacientes repetidos metodo ELFA

TOTAL 39

Numero de pruebas ELFA gastadas en repeticiones

Dudosos

Positivos 027/NAP1/BI

Resultados 027/NAP1/BI METODO PCR GENEXPERT CEPHEID

Muestras corridas por ambas metodos

N 58

Dudosos repetidos Positivos repetidos Negativos repetidos 4 6 29 79 Toxina B positiva. 027 negativo Negativos

Muestras positivas por ELFA y positivas por GeneXpert

Muestras positivas Por Elfa y Negativas por GeneXpert

Discusión Según los datos procesados en esta revisión del Protocolo seguido en nuestro laboratorio para procesar las muestras enviadas con solicitud del médico tratante con sospecha de CDI se han llegados a los siguientes resultados: 1. La prevalencia resultante en el periodo de tiempo analizado Agosto-Octubre 2012 CHMDAAM, muestra que nuestra población más colonizada y con CDI está en el grupo de edad de más de 90 años con un 28.6% y en esta misma población se ubica la mayor prevalencia de la cepa B1/NAP1/027 (resultados GeneXpert) con un 14.3%. Lo cual concuerda con estudios como Prospective study of Clostridium difficile infections in Europe with phenotypic and genotypic characterisation of the isolates F. Barbut1, P. Mastrantonio2, M. Delme´e3, J. Brazier4, E. Kuijper5 and I. Poxton6, on behalf of the European Study Group on Clostridium difficile (ESGCD)* 2. Debido a que la prevalencia encontrada por grupos de edad supera el 10% en varios grupos de nuestro estudio, se puede afirmar que se encontraba un brote de CDI en las muestras analizadas, por lo que el método de screening y el Protocolo de detección de C. difficile en muestras de heces fue efectivo para captar los pacientes con CDI. Estudios más profundos serán necesarios para verificar el protocolo mencionado en épocas en donde la prevalencia de CDI es menor a 10%. Ver Tabla 2 3. Otro hallazgo encontrado fue la prevalencia por procedencia, en donde el mayor número de pacientes positivos para CDI estaban en las salas CIM/CIN, CICCV, Pie Diabético, Pol Especializada, Medicina 6 y 6to KPC, ginecología, Transición, Neurocirugía, Hidratación, Urología, Sin procedencia, Medicina 5, geriatría, Urgencia, las cuales son solo 14 de las 40 salas estudiadas, lo cual indica claramente que el control de CDI por sala se ha dado efectivamente en el 65% de las salas. También cabe citar que en Hospitales como el Rafael Hernández la prevalencia alcanzo un 71.43% para la 027/NAP1/BI METODO PCR GENEXPERT CEPHEID. 4. Algunos ajustes serán necesarios en nuestro protocolo de detección, para disminuir el número de repeticiones de resultados NEGATIVOS de nuestro método de Screening, o bien buscar un método que aporte mejor sensibilidad y PPV para mayor IC de nuestro protocolo. 5. Las muestras con resultados 027/NAP1/BI METODO PCR GENEXPERT CEPHEID serán protocolizadas en un estudio posterior donde se realizarán las técnicas de confirmación molecular para la cepa en mención.

¿Conóces la Hemoglobina Fetal? Y Montenegro Departamento de Hematología Especial, Hospital del Niño

Durante nuestro desarrollo embrionario

tenemos la aparición de tres tipos de hemoglobina: Gowers (las cuales existen dos tipos), hemoglobina Portland y la Hemoglobina Fetal.

Pasada la quinta semana de gestación, las cadenas de hemoglobina Gowers constituyen entre el 24 y 42% de la hemoglobina total, el resto está constituido por la hemoglobina Fetal. Es importante destacar que aunque son hemoglobinas embrionarias, ya están formadas por cadenas específicas que van a permitir el buen transporte de oxígeno al resto del sistema circulatorio. Llegando a la décima semana de gestación, la hemoglobina Fetal constituye el más alto porcentaje de la hemoglobina sintetizada. Al momento de nacer, teniendo las cadenas de hemoglobinas normales, el ser humano tiene alrededor de 15% de hemoglobina A y el resto es hemoglobina Fetal, a medida que el bebé va desarrollándose tenemos la aparición de otro tipo de hemoglobina, llamada hemoglobina A2. De modo, que al momento de llegar a una etapa adulta, la situación en cuanto a la distribución normal de cada uno de los tipos de hemoglobinas que tenemos en las personas; son tres: • Hemoglobina A: 95%

• •

Hemoglobina Fetal: menos de 1% Hemoglobina A2: 2.5%

Esto constituye la biosíntesis normal de las cadenas de hemoglobina, que en condiciones normales todos tenemos; sin embargo cuando tenemos el aumento de algunas de estas cadenas podemos tener estados patológicos involucrados específicamente con la síntesis de cada una de estas cadenas (específicamente la hemoglobina fetal y A2). Por ejemplo: la correcta cuantificación de la Hemoglobina A2 y Fetal son de vital importancia en el diagnóstico de las Talasemias, así como en el pesquizaje de las personas que tienen persistencia de la hemoglobina Fetal. Es importante tener siempre en cuenta que dependiendo de los meses de nacido que tenga el bebé, así mismo esperaremos valores diferentes de la Hemoglobina Fetal; esto va a ser imperativo al momento de que el Hematólogo evalúe la condición del paciente. Tanto la Hemoglobina Fetal como la Hemoglobina A2 pueden ser cuantificadas por diferentes métodos que incluyen desde determinaciones manuales hasta automatizadas, ejemplo Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC: High Performance liquid).

A Icaza1, N Moreno2 1Laboratorio Clínico, Hospital de Especialidades Pediátricas O.T.H., 2 Facultad de Medicina, Universidad de Panamá

RESUMEN Rhodococcus rhodnii es considerado por varios investigadores como un simbionte obligatorio de Rhodnius prolixus, cuya distribución se encuentra en Norte América; ya que las ninfas no pueden llevar a cabo su desarrollo sexual sin las vitaminas que le confiere su relación simbiótica con Rhodococcus rhodnii. Rhodnius prolixus adquiere simbiontes a través de la coprofagia de las heces de los adultos para poder pasar de un estadío a otro. Sin embargo, se ha encontrado en este estudio que Rhodnius pallescens, alberga otros simbiontes comensales, además del género Rhodococcus, como Gordonia spp., Dietzia maris ó Corynebacterium spp., los que posiblemente le estén confiriendo algún factor necesario para su desarrollo. La detección y caracterización de estos simbiontes se realizó mediante la elaboración de un medio de cultivo estandarizado por nosotros, denominado, medio “Rhodococcus”, lo que le permitió a la bacteria desarrollar una coloración y morfología de colonia que facilita su recuperación e identificación. Mediante la técnica de PCR-RFLP se establecieron patrones de restricción característicos que conllevaron a la diferenciación de subespecies de Rhodococcus rhodnii y otros simbiontes detectados, ya que su identificación fenotípica no permite diferenciarlas entre si. La importancia clínica de estos simbiontes radica en que pueden ser utilizados como control biológico para evitar la transmisión de Trypanosoma cruzi, el cual se desarrolla en el intestino medio, siendo la presencia de estos simbiontes vital para completar su ciclo de desarrollo. Los estudios con Rhodococus spp. son de gran interés debido a la posibilidad de diseñar

estrategias transgénicas; y es por ello que se requieren desarrollar técnicas para su identificación y además, establecer su prevalencia en nuestro medio. INTRODUCCION La relación simbiótica entre microorganismos e insectos es muy conocida, éstos pueden encontrarse en los intestinos o en otras partes del cuerpo, como tejidos y la hemolinfa, ovarios y otros órganos sexuales. (Hypsa y Dale, 1997). Los microorganismos encontrados en insectos son usualmente intracelulares y muchas veces es difícil cultivarlos en medios artificiales. No es el caso de Rhodococcus rhodnii, el cual puede crecer en medios simples. Su relación simbiótica con los triatominos es de vital importancia en el desarrollo sexual de Rhodnius prolixus, ya que le confiere vitaminas necesarias para el crecimiento, como vitamina B. (Baines, 1956). El Rhodococcus está presente normalmente en el suelo y en las excretas de muchos animales. Rhodococcus rhodnii es adquirido por los triatominos a través de la coprofagia que las ninfas realizan al emerger para poder pasar al siguiente estado de maduración. Esta necesidad obligatoria ha sido objeto de estudios ya que por muchos años se ha intentado controlar al triatomino para evitar la transmisión de los tripanosomas. (Beard, 1998) Es por ello que actualmente se están explorando otras vías para el control de estos insectos, y se ha pensado en Rhodococcus rhodnii, el cual es un elemento obligatorio para el desarrollo de Rhodnius prolixus. Los simbiontes pueden ser modificados genéticamente y utilizarse como antiparasíticos, dentro del intestino medio, que es donde se desarrollan los tripanosomas. (Doston, 2003).

En este estudio se aisló el simbionte Rhodococcus rhodnii de Rhodnius pallescens, el cual se ha encontrado en una extensión desde Colombia hasta Nicaragua y se desarrolló un medio para su aislamiento, de manera que nos permitió observar la morfología y coloración de la colonia característica, para luego identificar la especie mediante la prueba de PCR-RFLP, a través de 5 diferentes enzimas de restricción con lo que creamos un patrón diferencial único de Rhodococcus rhodnii. Importante también fue determinar el porcentaje de infestación del Trypanosoma cruzi con respecto a la presencia de Rhodococcus rhodnii, por lo que se realizó una placa directa de heces del Rhodnius pallescens. Obtuvimos información sobre la prevalencia de Rhodococcus rhodnii en Rhodnius pallescens y se espera que este simbionte u otros simbiontes recuperados puedan utilizarse para el control del vector en Panamá, ya que hasta el momento su presencia sólo se había encontrado en Rhodnius prolixus. MATERIALES Y METODOS Colecta, almacenaje y alimentación de Rhodnius pallescens: Una vez identificada la palma, se procedió a la disección del microhabitat, que consiste en su tala y el corte de pencas en busca de los triatominos. Los triatominos que se capturaron se colocaron en frascos de vidrio rotulados con el área de colecta, fecha y nombre del colector. Dentro del frasco se colocó una hoja de papel plegado en su interior, para favorecer el desplazamiento. Se tapó con tapa de rosca con pequeños agujeros para su posterior alimentación. Antes de almacenarlos se le hizo un directo a las heces para determinar su positividad a Trypanosoma spp. Los triatominos fueron conservados en un cuarto oscuro a una temperatura entre 24-26°C, que es la ideal para su desarrollo. Una vez colectados los triatominos, se procedió a clasificarlos, escogiendo solamente a Rhodnius pallescens. Se alimentaron de forma semanal con sangre de gallina, a través de una gaza. Este proceso duraba aproximadamente de 15 a 20 minutos. La señal de que se habían alimentado era su

abdomen abultado. (Instituto Conmemorativo Gorgas, 2007). Disección de Rhodnius pallescens: Se tomaron con una pinza los triatominos a disectar del frasco de almacenaje y se sumergieron en yodo por 5 minutos. Se transfirieron a alcohol al 70% por otros 5 minutos, donde fueron colocados en un plato de vidrio sobre la base del estereoscopio. Dentro del mismo, el triatomino se colocó sobre el dorso para su disección. Las pinzas de disección fueron esterilizadas en el mechero y enfriadas en agua destilada estéril, previo a su utilización. Se procedió entonces a separar el tórax del cuerpo y se extrajo el sistema digestivo, rápidamente se hizo un frotis directo y se sembró en agar Sangre, agar Rhodococcus y BHI (Brain Heart Infusion). Una vez terminado el procedimiento, se esterilizaron las pinzas en el mechero y se sumergieron en etanol al 70% para continuar con el siguiente ejemplar. (Espino, 2007) A los triatominos mantenidos en cautiverio por más de tres generaciones se les realizó una tinción de Gram, mientras que a los colectados de campo, una placa directa en heces (5 días después de su colección), en busca de Trypanosomas cruzi. Cultivo de Rhodococcus rhodnii del sistema digestivo de Rhodnius pallescens: El sistema digestivo fue macerado y luego sembrado directamente en agar sangre, agar Rhodococcus y caldo BHI e incubado a 37°C. La aparición de colonias no hemolíticas, redondas, frecuentemente mucosas con un pigmento rosado-salmón que se desarrolla dentro de 4 a 7 días de incubación en agar Rhodococcus es indicativo de Rhodococcus spp. Agar Rhodococcus: Los ingredientes de este medio son eficaces para la recuperación de organismos de crecimiento lento, cuyo desarrollo es fastidioso. La preparación del gel de agarosa es de suma importancia para la obtención de morfología y pigmentos deseados. Debe agregarse agarosa al 2% para que el medio gelifique. El extracto de levadura es muy importante para el ciclo de la morfología de la bacteria: cocos-(cocobacilos)-cocos. Al servir el medio en el plato, debe servirse 25 ml, un poco más del estándar (20 ml) para que no se seque antes de que la colonia alcance la madurez.

Las especies de Rhodococcus se desarrollan bien en este medio, sin embargo el pase a agar sangre o agar para Rhodococcus debe realizarse durante las 24 horas para evitar el sobrecrecimiento de otras bacterias no deseadas que se encuentren en la muestra.

La mezcla de reacción utilizada es la siguiente: 15 μl H2O Mili-Q, 2.5 μl Buffer 10X, 1.5 μl de MgCl2, 2.5 μl dNTP´S, Taq Polymerasa 1.0 μl. Los primers reverse y forward: Primer F 0.5 μl 16F (5’-GCTTAACACATGCAAG-3’), Primer R 0.5 μl 16R(5’-ACGGGCAGTGTGTACAAGACC-3’).

Análisis molécular de Rhodococcus rhodnii: Extracción de ADN: Centrifugamos 100 μl de BHI líquido con una cepa pura por 15 minutos a 100,000 rpm. Se resuspendió con 200 μl del botón bacteriano en TE 1X (Tris 10mM, pH 8.0, EDTA 1 mM) y luego dos lavadas más con la misma solución. Luego, añadimos 200 μl de TE 1X tratado con 100 μl de lisozima (2 mg/ml) e incubado a 37°C por 30 minutos. Adicionamos 100 μl de dodecil sulfato sódico (SDS) 1% y 100 ul de Proteinasa K (100 μg/ml) e incubamos a 65°C por 4 horas. Seguidamente, adicionamos 84 μl de NaCl 5M y 60 μl de CTAB e incubamos las muestras a 65°C por 20 minutos. Finalmente, se añade 200 μl de isopropanol y 200 μl de cloroformo alcohol isomílico (24:1) y se inviertieron los tubo 20 veces seguido por una centrifugación por 1 minuto.

PCR-RFLP: Los productos de amplificación obtenidos con cada una de las bacterias fueron sometidos a digestión con diferentes endonucleasas: Pst I, Hind III, Bam HI, Eco RI y Kpnl. Los perfiles de restricción obtenidos se observaron mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa al 1% y coloreadas con bromuro de etidio. Se analizaron los perfiles de restricción comparando los resultados con los algoritmos de diferenciación para Rhodococcus rhodnii . La identificación final de estos simbiontes fue confirmada mediante secuenciación en el Instituto de Biotecnología de la Universidad de Granada, España.

La fase acuosa se descartó. Se realizaron extracciones hasta que la fase acuosa y la interfase estuvieron claras. En esta última extracción se añadió 200 μl de isopropanol y el ADN se dejó precipitar a -20°C por 24 horas, se colectó por centrifugación a 4°C por 30 minutos. La madeja de ADN obtenida se lavó con etanol al 70%, se secó a temperatura ambiente y se resuspendió en TE (10mM Tris, 1 mM EDTA) 1X. (Pavía, 2005). La concentración de ADN se midió a través de una corrida con estándares en gel de agarosa. PCR: El Master mix de las reacciones individuales debe tener un volumen final de 28ul. Seguido de una desnaturalización a 94°C por 5 minutos. Luego 30 ciclos de desnaturalización a 94°C por 1 minuto, alineamiento a 55°C por 1 minuto y extensión a 72°C por 1 minuto. 10 minutos más de extensión para mayor acoplamiento de los productos a 72°C por 1 minuto. Finalmente visualizamos 5 μl del producto de amplificación mediante electroforesis horizontal en gel de agarosa TAE (Tris-acetato-EDTA) 1% a 100v por 30 minutos. (Hypsa y Dale, 1997).

RESULTADOS La colecta de R. pallescens se realizó en diferentes sectores de la Provincia de Panamá durante el año 2008, siendo colectados los siguientes ejemplares en cada lugar estudiado: La Chorrera (15), Arraiján (20), Pacora (18) y Chilibre (16). En el cuadro No. 1 se muestra que el número de simbiontes aislados de R. pallescens, es independiente del número de triatominos colectados. CUADRO Nº 1

COLECTA DE RHODNIUS PALLESCENS Y SIMBIONTES POSITIVOS

AISLADOS EN DISTINTAS AREAS DE LA PROVINCIA DE PANAMA, AÑO 2008

Áreas de colecta

# de palmas derribadas

# Rhodnius pallescens

colectados

# Simbiontes aislados de

Rhodnius

Pallescens

Chorrera

Arraiján

Pacora

Chilibre

Burunga

Carriazo

St. Rosa

TOTAL

El Espino

*(CHO)

*(BUR)

*(CAR)

*(CHI)

En el caso de Dietzia maris, su patrón de restricción diferencial se presenta muy similar al de R. rhodnii, solamente la enzima Pst I lo diferencia con la aparición de bandas con 1000 pb y 450 pb. Observar figura 6.

500

450

600

1200

Kpn I Eco RI

1000

650

600

500

450

Gordonia spp.

450 Bam HI

Kpn I

Hind III Eco RI

Dietzia maris

Pst I

Bam HI

1510

Hind III 1510

1500

Eco RI

Para los Corynebacterium spp., se observan dos especies diferentes por su variación en las enzimas Pst I y Hind III. Las enzimas Bam HI, Eco RI y Kpn I se mantuvieron estables entre las dos especies de Corynebacterium spp. recuperadas.

1000 VIII

650

Kpn I

Fig. 7 Patrones de restricción diferencial para Gordonia spp.

MARKER

Las enzimas Pst I, Hind III y Bam HI varían entre las diferentes especies de Gordonia spp. Las enzimas Eco RI y Kpn I se mantuvieron estables en este grupo.

Gordonia spp.

VIII MAR KER

Fig. 6 Patrón de restricción diferencial para Dietzia maris.

Pst I

Bam HI

600

1 Kb ladder

Hind III 750

Pst I

VIII MARKER

Bam HI

1500

VIII MAR KER

Pst I Bam HI Kpn I Hind III 1500 1000 Eco RI 750 650 1000

Pst I

450

150 0

Gordonia rubripertinctus Pst I 1500

Bam HI 1500

Eco RI

Kpn I

750

1510

100 0 600

Hind III 1510

1500

Hind III

Corynebacterium spp.

Kpn I

Eco RI

1000

450

MARKER

600

VIII

650

VIII MAR KER

Pst I

Gordonia spp.

750

Bam HI

1500

Hind III

1510

Eco RI

750

Kpn I

750

Corynebacterium spp.

Fig. 8 Patrones de restricción diferencial para Corynebacterium spp.

DISCUSION Diferentes regiones dentro de la Provincia de Panamá están colonizadas por Rhodnius pallescens, siendo todas positivas en el examen directo en heces por Trypanosoma cruzi; sin embargo cada grupo dentro de su región posee un simbionte característico. Por lo tanto, la presencia de uno u otro simbionte parece obedecer la característica de una región determinada. Este factor no ha sido reportado anteriormente. En esta investigación se desarrolló un medio de cultivo más apropiado para la recuperación de Rhodococcus spp.; ya que el agar sangre y caldo BHI sugeridos por Sellon, 2000 no son tan efectivos como el medio propuesto en este trabajo; en el cual no se utiliza sangre sino extracto de malta, extracto de levadura, sales carbonatadas y glucosa. El color salmón desarrollado por las colonias de Rhodococcus y el naranja intenso de Gordonia rubripertinctus fueron clave para la identificación presuntiva. Cabe señalar que el medio indicado es además efectivo para el aislamiento de Actinomycetes, ya que es fácil de preparar y no se descompone fácilmente. R. rhodnii no es el único simbionte encontrado en R. pallescens. A través de esta investigación se detectó además, la presencia de Corynebacterium spp; Gordonia spp y Dietzia maris como simbiontes y cuya función en R. pallescens está por descubrirse a través de futuros estudios. Hay que recalcar que en la actualidad solamente se han reportado 13 aislamientos de D. maris, según Rainey,1995 y en este estudio se han reportado 3 como simbiontes de R. pallescens. Pavía, 2005 y Rodríguez, 2004 encontraron simbiontes como Serratia marscecens, Pseudomona aeruginosa y Corynebacterium spp, además de R. rhodnii, pero en Rhodnius prolixus. Cabe destacar que la técnica PCR-RFLP logra distinguir patrones de subespecie de Rhodococcus rhodnii. Estas variaciones son determinadas por la enzima de restricción Kpn I de la cual se obtiene bandas como 1000pb en una subespecie y 1000 pb y 450 pb en la otra. La enzima de restricción PstI determina la especie dentro de los Actinomycetes. En el género Rhodococcus las enzimas de restricción Hind

III, BAM HI y Eco RI se mantienen constantes en su patrón diferencial. Maier, (2000) y Ronald, (1993) han sugerido que el efecto de factores ambientales ha dado como resultado una leve mutación, un cambio de una base, una inserción, delección ó substitución, produciendo variaciones en los sitios de restricción. Existen otras bacterias que no pertenecen a la familia de los Actimomycetes que también ejercen un papel de simbionte dentro de Rhodnius pallescens, por lo que Rhodococcus rhodnii no es un simbionte obligatorio del mismo, pero es altamente definido dentro de los especimenes de colonia y es transmitido eficazmente por medio de la coprofagia de forma vertical, en contraste con los hallazgos de Baines, (1956); en los que Rhodococcus rhodnii se encuentra en forma constante y obligatoria, pero en Rhodnius prolixus. Es interesante observar que se detectaron 4 diferentes patrones de restricción diferencial para Gordonia spp. De acuerdo con la morfología de la colonia y pigmentos desarrollados, se marcan diferencias bien establecidas. Por ejemplo, una presenta un color mostaza y contextura mucosa; mientras que las otras presentan un color rosa vieja y su contextura es sumamente mucosa. Falta por investigar el papel de este conjunto de Gordonias spp. dentro de Rhodnius pallescens. Cabe destacar que la mayoría de las Gordonias spp. fueron aisladas de triatominos que habitan la región de Pacora, solamente dos se encontraron en Chorrera. Se puede apreciar el hallazgo de dos patrones de restricción diferencial del genero Corynebacterium spp. Se aislaron 9 Corynebacterium spp. entre las regiones de Chorrera y Burunga. Cabe señalar que los Corynebacterium spp. de Chorrera tienen un patrón diferente a los de Burunga. Sin embargo, dentro de los que se encontraban en cautiverio se observan ambos patrones. Este hallazgo parece confirmar la hipótesis de que los simbiontes son regionales. Para finalizar en este trabajo se elaboró un nuevo medio de cultivo para el crecimiento de

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Instituto Oncológico Nacional

Movilización y Procesamiento

de Células Madres Hematopoyéticas J González2, A Rodríguez1, k Abrego1, E Fanilla1, Y Olmedo1 1 Servicio de Hematología, Instituto Oncológico Nacional 2Banco de Sangre, HSF (actualmente)"

RESUMEN

Las Células Madres Hematopoyéticas (CMH), que están en el espacio de la Médula Ósea son estimuladas a pasar al torrente sanguíneo y movilizadas desde la sangre, se obtienen mediante aféresis, proceso en el cual se le extrae la sangre a la persona y se realiza la separación de los componentes celulares; con el fin de realizar una posterior devolución de las partes restantes al donante. Al finalizar, las células son procesadas y criopreservadas para su uso en el futuro. El tiempo de conservación del producto depende del estado del paciente, el cual puede ser de días, meses o años. Trabajos recientes han demostrado la viabilidad de los productos de CMH después de haber sido almacenadas a temperaturas criogénicas por más de 19 años. Para el proceso de Criopreservación de la bolsa colectada de CMH se utiliza una curva de congelamiento, disminuyendo la temperatura de manera progresiva y controlada mediante sistemas computarizados y nitrógeno líquido. Una vez que se han alcanzados los – 90º C, se transfiere la unidad congelada a la ubicación definitiva dentro del termo de almacenamiento en nitrógeno líquido, donde debe mantenerse sumergida permanentemente a una temperatura de –196º C. Palabras clave: células madre hematopoyéticas, movilización, criopreservación, viabilidad, células CD34.

ABSTRACT The Hematopoietic Stem Cells (HSC) who are in the space of the Bone Marrow are stimulated to going on to the peripheral blood and mobilized from the blood, are obtained by means of aphaeresis, process in that involves removing whole blood from a person and separating the blood into individual components so that one particular component can be removed. The remaining blood components then are re-introduced back into the bloodstream of the person. Finally, the cells are processed and cryopreserved for his use in the future. The time of conservation of the product depends on the condition of the patient, which can be of days, months or years. Recent works have demonstrated the viability of HSC's products after having being stored to cryogenic temperatures for more than 19 years1. For Criopreserved of the HSC bag use a curve of freezing, decreasing the temperature gradually and controlled by computer systems and liquid nitrogen. once they have reached -90 °C, there is transferred the unit frozen to the definitive location inside the thermos of storage in liquid nitrogen, where she must be kept plunged permanently to a temperature.

INTRODUCCIÓN La célula madre hematopoyética (CMH) es una célula aislada de la sangre periférica o de la médula ósea que puede renovarse a sí misma, puede diferenciarse en una variedad de células especializadas, y puede movilizarse fuera de la médula ósea a la sangre periférica. Las fuentes de CMH pueden ser halladas en la médula ósea, en la sangre periférica y en la sangre del cordón umbilical.2 El objetivo de esta revisión es dar a conocer ciertos parámetros inherentes al proceso de manipulación y Criopreservación de las Células Progenitoras Hematopoyéticas y la importancia de conocer ciertas características de la célula que pueden incidir con la viabilidad del producto congelado para lograr la técnica adecuada. Para alcanzar este propósito, nos basamos en el conocimiento de las propiedades físicas y químicas de la célula; pues este proceso es afectado por diferentes variables como permeabilidad celular, volumen osmóticamente inactivo y relación superficie /área de la célula. La estructura y composición de las membranas plasmáticas determinan los principales eventos celulares que tienen lugar durante los procesos de Criopreservación. Las bajas temperaturas afectan la difusión y ósmosis a través de las membranas y cada célula maneja su propio pérfil biofísico el cual interactúa con diferentes criopreservantes celulares.

Movilización de CMH La hematopoyesis se produce fundamentalmente en la médula ósea contenida en la pelvis, el esternón, la columna vertebral y el cráneo.3, 4 La producción de células sanguíneas maduras ocurre de manera específica en el microambiente de la médula ósea. Figura 1. La exposición de las células progenitoras a las citocinas puede iniciar la cascada de maduración para producir componentes celulares sanguíneos maduros comprometidos. Estas citocinas son endógenas, aunque durante el proceso de extracción de las células madre, algunas suelen administrarse de manera exógena a los pacientes en un esfuerzo por potenciar la producción de células madre en poco tiempo.5-8 Ejemplos de estas citocinas exógenas son el filgrastim (factor estimulante de colonias de granulocitos glucosilado [G-CSF]) y el lenograstim (G-CSF no glucosilado). Las quimiocinas intervienen en el movimiento celular. Las células madre expresan el receptor de quimiocinas CXCR4, responsable del anclaje de las células madre al microambiente de la médula ósea. Cuando se unen el CXCR4 y el SDF-1α, también se producen interacciones entre las integrinas y las moléculas de adhesión celular. El anclaje de las células madre dentro del microambiente de la médula ósea tiene lugar mediante la producción continua del Factor derivado de células madres ( SDF-1α) por las células del estroma, interviniendo en la proliferación y migración de éstas células. Lo que favorece la liberación de las células madre en la circulación periférica es la pérdida de unión a las células del estroma, junto con la pérdida de actividad SDF-1α,. El bloqueo de este receptor con un antagonista de quimiocinas (como el plerixafor) ha elevado las células madre hematopoyéticas circulantes y ayudado a la recogida de células madre en pacientes con mieloma múltiple y linfoma.9-14

Figura 1 Microambiente de la Médula Ósea

Fu S, Liesveld J. Mobilization of hematopoietic stem cells. Blood Rev. 2000;14(4):205-218.

Las células madre hematopoyéticas expresan el antígeno marcador de superficie celular CD34, el cual es utilizado para determinar la extensión y la eficacia de las extracciones de células madre de sangre periférica. Aunque no constituye una medida completa de la cantidad y la calidad de las células recogidas, se ensayan muestras de sangre de las extracciones para determinar el número de células CD34+ presentes. La cinética generalizada del CD34 y los leucocitos post administración de Citocinas muestra el descenso de los leucocitos posterior a la administración del régimen de quimioterapia, seguido de un aumento de los mismo por la inducción del GM-CSF, se puede observar el valor del nadir cercano a los 10 días +/- 3 de la movilización. El monitoreo de las células CD34 inicia desde el día 7 de movilización para indicar el momento adecuado de inicio de la recolección de las células madres en sangre periférica. Figura 2. Una vez extraída la cantidad específicas células deseadas, se completan las extracciones y se conservan para su uso futuro. Las concentraciones deseadas habituales pueden variar de unos centros de tratamiento a otros y el objetivo específico para un paciente está relacionado con la enfermedad subyacente, el origen de las células madre y el tipo de trasplante que se vaya a realizar. En general, para un trasplante autólogo se considera mínima una concentración de 2 x 106 de células CD34+/kg de peso corporal; y se consideran óptimas las concentraciones de ≥ 5 x 106 de células CD34+/kg para un trasplante único y de ≥ 6 x 106 de células CD34+/kg para un trasplante en tándem. 15-20

La membrana plasmática de la célula eucariota en su estructura organizada según el modelo de mosaico fluido, compuestas básicamente de lípidos anfipáticos, proteínas y un pequeño porcentaje de carbohidratos que es variable de acuerdo al tipo y especie celular. Por ejemplo, la membrana plasmática de los eritrocitos está compuesta de proteínas en 9%, un 43% de lípidos y un 8% de carbohidratos. El tamaño de partícula, la polaridad y la carga iónica determinan el paso a través de las membranas y de esa forma, pequeñas moléculas como las de agua (peso molecular PM: 18), etanol (PM: 46), glicerol (PM: 92) y oxígeno pasan a través de la membrana mientras que la glucosa (PM: 180) no lo hace. Cuanto menos polar es una molécula más rápido puede pasar la membrana. Los lípidos (colesterol y ácidos grasos) como componentes más abundantes determinan la fluidez y resistencia de la membrana plasmática durante los procesos de criopreservación. El empaquetamiento y la posición de estas moléculas en las bícapas determinarán la rigidez de las membranas y por tanto el transporte de moléculas. Este transporte a través de las membranas es el punto crítico para la súpervivencia celular post-descongelación. En las bícapas, los ácidos grasos de los fosfolípidos se encuentran en paralelo los unos a los otros mientras que el colesterol se intercala entre ellos. Este empaquetamiento de las cadenas hidrofóbicas hace que interaccionen entre ellas y se estabilicen por fuerzas de van der Waals. Cuanto más difícil sea este empaquetamiento más fluida será la membrana. Al ser más larga la cadena del ácido graso, más fácilmente se forman estas uniones y más rígida es la membrana, la existencia de dobles enlaces en las cadenas hidrofóbicas de los fosfolípidos de la membrana introduce cambios de orientación en las cadenas y hace que estas moléculas no interaccionen tan fácilmente entre sí y por tanto que la membrana sea más fluida.

La presencia de moléculas de colesterol en la bícapa le proporciona rigidez a temperaturas fisiológicas por la unión de sus anillos a las cadenas de ácidos grasos (impide su libre movimiento y por tanto disminuye la fluidez) pero impide, por razones estéricas, que las cadenas de ácidos grasos se empaqueten libremente (cristalicen) al disminuir la temperatura aumentando, en ese momento, la fluidez de las membranas. Las membranas celulares son las estructuras que sufren mayor daño en los procesos de congelación en general debido a la pérdida de fluidez de sus componentes lipídicos, la transición de lípidos fluidos a sólidos se da a una temperatura de 10°C-16°C alterando de esta manera las funciones de la membrana y dándole un alto grado de fragilidad, durante la deshidratación celular que tiene lugar en el proceso de congelación se puede presentar una pérdida de lípidos lo cual afectaría la integridad de la membrana plasmática por pérdida de su capacidad de expansión durante la rehidratación al volver a condiciones isotónicas. Figura 2. Cinética generalizada de la movilización de leucocitos y de células CD34+ en sangre periférica después de quimioterapia y administración de G-CSF.

Movilización y aféresis de CMH, EBMT

Recolección de CMH Se inicia cuando las células CD34+ son el 0.1% de las células nucleadas en Sangre periférica, es decir cuando tenemos mayor o igual de 25 células CD34+/ml de sangre periférica. La obtención por aféresis de 60 ml/min por 4 horas aproximadamente, realizado por el personal del Banco de Sangre de nuestra institución y se prepara en 2 a 3 días con un mínimo de 2 millones de células CD34+/kg de peso.

Procesamiento de CMH Una vez que la bolsa de Recolección de CMH ingresa al laboratorio de Criopreservación, es pesada para determinar el volumen de sangre recolectado; luego se toma una muestra en una cabina de flujo laminar para realizar recuento celular total, cálculo de la viabilidad, recuento leucocitario con diferencial, valor del hematocrito y plaquetas. La enumeración de CD34+ la realizamos usando la plataforma ISAGHE mediante el Citómetro de Flujo FACS ARIA II. Criopreservación La criopreservación tiene como objetivo mantener la viabilidad y funcionabilidad de las células a bajas temperaturas bajas. Este efecto sobre los sistemas celulares, es determinado por las reacciones bioquímicas. Sin embargo, este no es un proceso exento de problemas ya que puede inducir variaciones extremas en las propiedades químicas, térmicas y eléctricas las cuales pueden alterar las membranas celulares, los organelos y la delicada interacción célulacélula inherente en las células y tejidos a criopreservar. Las células nucleares (FIGURA 3) se obtienen por centrifugación diferencial en un sistema de circulación cerrado para disminuir contaminantes. El crioprotector habitual es el Dimetilsulfóxido (DMSO), el cual previene la deshidratación y disminuyendo la cantidad de agua absorbida por los cristales de hielo. Es ligeramente tóxico, por lo que debe ser utilizado en frío y debe ser agregado al concentrado celular lentamente.

Realizamos una sustancia crioprotectora; en la cual el 50% corresponde a las CMP; 20% de plasma autológo y 20% de Medio de Cultivo, RPMI y 10% DMSO para el almacenamiento a largo tiempo. Las proteínas proporcionadas por el plasma autológo aumentan la supervivencia de las células, modifican la viscosidad y la temperatura de la transición hialina de la solución crioprotectora. El RPMI proporciona los electrolitos. Esta sustancia crioprotectora: crioprotector y concentrado celular, es colocada en la bolsa de Criopreservación (FIGURA 4) y luego en un estuche metálico adecuado al tamaño de la misma.

Fig 4: La bolsa de Criopreservación es colocada en placas metálicas para iniciar el procedimiento de congelación programada.

Se utiliza un sistema de congelamiento programada (FIGURA 5), disminuyendo gradualmente 1ºC por minuto a hasta llegar a 4ºC; primero se agrega la solución crioprotectora de manera gradual para lograr el equilibrio osmótico ( 5 minutos).

Fig. 5: Sistema de congelamiento programada: incluye una cámara de congelación el cual desciende gradualmente 1ºC/min hasta llegar a -10ºC y posteriormente hasta -80ºC para luego ser almacenadas en la fase liquida del Nitrógeno Líquido (-196ºC). Fig. 3: Las células nucleares (FIGURA 3) se obtienen por centrifugación diferencial en un sistema de circulación cerrado para disminuir contaminantes

Después, desciende gradualmente 1ºC por minuto hasta llegar a -10ºC, se induce el proceso de nucleación disminuyendo abruptamente a -60ºC posteriormente es llevado a -20ºC y disminuye gradualmente hasta -80ºC una vez alcanzada dicha temperatura las células son guardadas en almacenadores de nitrógeno líquido en la fase liquida (-196ºC) para su posterior aplicación. Para mantener un nivel adecuado del mismo, los termos que se utilizan generalmente están provistos de sensores y de un mecanismo automático que regula el ingreso de nitrógeno, desde un tanque de transferencia que se encuentra adyacente al termo de almacenamiento, y conectado al mismo por un sistema de mangueras que permitan la transferencia del nitrógeno líquido, en cantidad suficiente como para reponer el que se haya evaporado. Además se preservan viales con células remanentes y plasma para eventuales exámenes y análisis futuros. El control de calidad de la Criopreservación se realiza con valoraciones in vitro: Conteo (Citometría) (tasas de recuperación de células mononucleares, CD34+, eritrocitos y PMN), prueba de viabilidad (Citometría de Flujo) y Cultivo de CFU-GM. RESULTADOS En Septiembre de 2000 se inauguró en Panamá el primer Laboratorio de Criopreservación de Células Hematopoyéticas usando congelación programada en el Instituto Oncológico Nacional, brindado este servicio a los pacientes del Programa de Trasplante de Médula ósea de la institución. Hasta el 31 de diciembre de 2012 se han realizados 401 procedimientos de Criopreservación de Células Madres Hematopoyéticas en Sangre Periférica, Medula ósea y cordón umbilical; De los cuales el 98 % provienen de Sangre periférica, 1.5 % son de Medula Ósea y 0.5, de Cordón Umbilical. Con un total de 162 pacientes.

La celularidad total recibida fue de 1.178 millones de células (28,0–4.876) y la viabilidad fue de 90% (80–100). Hubo 5,0% de contaminación bacteriana de las muestras, las cuales no fueron descartadas por la posibilidad de decontaminarlas previamente a su uso en caso de ser necesitadas. La cantidad total de células mononucleares criopreservadas fue en promedio de 20000 millones de células, de las cuales entre el 0,1% y 4.0 % fueron CD34+, es decir células con características de Células Madre. El promedio de células CD34+ criopreservadas fue de 4.0 millones. CONCLUSIONES La estructura y composición de las membranas plasmáticas determinan los principales eventos celulares que tienen lugar durante los procesos de criopreservación, su comportamiento durante la congelación y descongelación definirá los índices de supervivencia de la célula congelada. Los periodos críticos para la sobrevida celular durante la criopreservación son la fase inicial del congelamiento y el periodo de retorno a condiciones fisiológicas; para su posterior aplicación terapéutica (trasplantes) llegando a crear verdaderos archivos biológicos. Entre los problemas más habituales del procesamiento de las CMH está la destrucción de células diferenciadas (eritrocitos, granulocitos, etc), la criopreservación imperfecta por la presencia de células maduras y la toxicidad en la infusión por citocinas y componentes intracelulares. Las causas de daño celular por congelación se deben a daño mecánico por formación de hielo intra y extracelular, por expansión térmica, hiperosmolaridad extracelular y deshidratación, Cambios en el pH y desnaturalización de proteínas. Las características de cada producto varía dependiendo del peso corporal del donante y/o receptor. Estos valores ayudan a una mejor criopreservación del productos: Hematocrito: 1-5%, Concentración de Células Mononucleares: 50- 99% del total de leucocitos. Células CD34+: entre 0.1-10% del número total de células mononucleares.

¡¡¡Felicidades para todos los Laboratoristas Clínicos que día a día trabajan junto a un equipo multidisciplinario de profesionales para el beneficio de una mejor calidad de salud para todos!!!

Gotas de Sabiduría!

Importancia de la Proteína en la Coagulación Sanguínea Y Montenegro Departamento de Hematología Especial, Hospital del Niño

Por muchos años, la coagulación ha constituido una de las partes fundamentales en cuanto a investigación clínica, en la medida de obtener los mejores tratamientos para las diferentes enfermedades hemorrágicas que son de vital importancia en el buen funcionamiento hemodinámico de nuestro organismo. Muchos han sido los descubrimientos en cuanto a la secuencia de reacciones que intervienen en la activación de los diversos factores de la coagulación, activación que conlleva a la formación del coágulo de fibrina estable para su posterior lisis; a través de mecanismos naturales de inhibición que asegura la hemostasia eficaz. Es así como tenemos el mecanismo natural de las proteínas plasmáticas, proteína C, S y Antitrombina III, que permiten que esta regulación se lleve a cabo en conjunto con la plasmina. Sin embargo desde hace algunos años, se ha estado estudiando la actividad de otra proteína plasmática la Proteína Z (PZ), la cual es considerada una proteína vitamina K dependiente. El mecanismo de acción es directamente hacia su unión con la trombina, su vida media en el plasma es de siete días y a nivel estructural es similar a la de los factores II, VII, IX, y X, así como a las de las proteínas S, C y Antitrombina III. Otra de sus funciones más importantes es que interviene en la inhibición del factor X, y la encontramos presente en las lesiones arteroescleróticas. Así como la plasmina nos ayuda a destruir los restos de fibrina durante el proceso de recuperar el mecanismo hemodinámico, el sistema reticuloendotelial permite destruir el exceso de factores activados de la coagulación durante la lesión vascular; y las proteínas S, C y Antitrombina III actúan específicamente en la inhibición de algunos de los factores de la coagulación

como el V y el X; la PZ es estudiada en la actualidad con una función similar a la de los factores vitamina k dependiente (II, VII, IX y X), y su homología con la proteína S y C, nos hace reflexionar en el rol tan importante dentro de la hemostasia. Se han realizado diversos estudios relacionados con la importancia de esta proteína en los pacientes con anticuerpos antifosfolípidos, encontrándose que esta proteína Z se encuentra disminuída sin ser relacionada con su especificidad antigénica. Dicha alteración puede deberse a una acelerada depuración de la proteína, inhibición de su síntesis o a la presencia de anticuerpos específicos anti-PZ. La actividad de esta proteína, así como la interacción de esta en los pacientes con anticuerpos antifosfolipídicos aún continúa en estudio para dilucidar las diversas hipótesis propuestas. Sin embargo, es importante se tenga el conocimiento de que esta proteína existe sobre todo al momento de analizar las diversas causas de estados hemorrágicos en donde no se encuentra por parte del laboratorio una respuesta que pueda ayudar al clínico a dilucidar la patología hemorrágica que en algún momento tengamos en un paciente.

real (PCR-RT) para la detección de la DNAemia (CMV-DNA), en el año 2007. La carga viral de este virus es usada como marcador predictor de la enfermedad por CMV.

PALABRAS

CLAVES:

Citomegalovirus, antigenemia, Reacción en cadena de la Polimerasa en tiempo real; carga viral, terapia preventiva, DNAemia.

A Rodríguez1, K Abrego1, E Fanilla1, Y Olmedo1 1 Servicio de Hematología, Instituto Oncológico Nacional

RESUMEN El tratamiento preventivo basado en la detección sensible de Ácido Desoxiribonucleico (ADN) del Citomegalovirus Humano (HCMV) ha ayudado a reducir la mortalidad relacionada con este virus post trasplante alogénico de células madre hematopoyética (CMH). El hallazgo de la replicación viral activa podría ayudar a predecir mejor la enfermedad de HCMV y permite ser usado como marcador predictor de la enfermedad por CMV después de Trasplante de CMH alogénico. Se realizó el monitoreo para la infección activa por HCMV inicialmente por la amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA), y posteriormente, mediante la reacción en cadena de la polimerasa en Tiempo Real. El tratamiento preventivo guiado por técnicas moleculares reduce la carga viral y la frecuencia de la enfermedad. En nuestra institución se inicia el monitoreo de CMV, a finales del año 2000 con la técnica de NASBA para determinar antigenemia, la cual es reemplazada por la de técnica de la Reacción en cadena de la Polimerasa en tiempo

ABSTRAC The preventive treatment based on the sensitive detection of Desoxirribonucleic Acid(DNA) of the Human Cytomegalovirus (HCMV) has helped to reduce the mortality related to this virus post allogenic transplant of the Hematopoietic Stem Cells (HSC). The finding of the viral active replication might help to predict better HCMV’s diseases and it allows to be used as biomarker predictor of the diseases by CMV after allogenic transplant of HSC. We realize monitoring for the active infection for HCMV initially for the amplification based on the sequence of acid nucleic (NASBA), and later, by means of the chain reaction of the real time polymerase. The preventive treatment guided by molecular technologies reduces the viral load. In our institution CMV’s monitoring begins at the end of the year 2000 with NASBA’s technology to determine antigenemia, which is replaced the polymerase chain reaction real time technology (PCR-RT) for the detection of the DNAemia (CMV-DNA), in the year 2007. The viral load of the virus is used as scoreboard predictor of the disease by CMV.

INTRODUCCIÓN

El Citomegalovirus (CMV) es el principal causante de morbi-mortalidad en los pacientes trasplantados, causando Enfermedad Injerto contra huésped (EICH) y en otros pacientes inmunocompetentes es el causante de infecciones asintomáticas1. En Trasplante alogénico, se ha descrito que aproximadamente el 35% de los receptores pueden presentar infección activa por CMV 2. Los métodos serológicos son tardíos, así como el cultivo de fibroblastos. La antigenemia es la medición de proteínas virales en sangre expresadas durante la infección; la cual es consi-derada como el método de referencia para detectar diseminación o viremia en cuadros agudos. Sin embargo, en los últimos años existen numerosas evidencias clínicas sobre la utilidad de los métodos moleculares en el monitoreo de CMV. Diversas estrategias moleculares se han utilizado para este propósito, como Southern Blot, Hibridación in situ y en la última década se han desarrollado técnicas que han optimizado la detección de CMV en sangre de pacientes en riesgo de

Determinación de DNAemia Extracción de ADN: se utilizaron 200ul de plasma de muestra en tubos de EDTA; con ayuda del kit de extracción (QIAgen). La extracción se realizó de acuerdo a las instrucciones dadas por el fabricante y el ADN extraído se resuspendió en un volumen final de 180 ul de Agua. RCP-RT: la detección del ADN de CMV se realizó utilizando el kit Artus CMV TM PCR QIAgen, para la cuantificación del ADN de CMV se utilizó 20 ul del ADN extraído y los resultados se expresaron como copias de ADN viral por militros de sangre (copias/ml). La curva estándar para la cuantificación del ADN de CMV se realizó utilizando cuatro diluciones con concentraciones conocidas del ADN de CMV para determinar la carga patógena. Para el análisis se consideró positiva muestras con valores mayores a 1 copias de ADN de CMV/ml de sangre. Cuadro 2

Cuadro 2. Gráfica Delta Rn contra Número de Ciclos de la amplificación. Las Cuatro primeras líneas corresponden a los estándares de cuantificación y las siguientes al

del seguimiento

molecular de muestra de pacientes con trasplante alogénico sin detección temprana del virus.

RESULTADOS Los resultados de la determinación de antigenemia solo permitían reportar presencia o ausencia; en cambio los obtenidos para la determinación de la DNAemia nos permite cuantificar el número de copias y conocer con exactitud la cantidad de amplicones que posee el paciente en el seguimiento temprano activo del virus. En esta revisión se buscó la presencia de CMV mediante antigenemia y DNAemia por medio de la RCP-TR en muestras de sangre, provenientes de pacientes con trasplante alogénico de CMH. De las 163 muestras analizadas por CMVpp67 inicialmente, fueron positivas el 11% de ellas para la antigenemia y de las 208 muestras analizadas para DNAemia; el 19% presentaron transcriptos detectables para CMV-DNA. Esto ayudo a detectar tempranamente la activación de HCMV. Y de esta manera, existe mayor control en los pacientes que recibieron un tratamiento antiviral con ganciclovir y monitoreo bajo las técnicas moleculares.

CONCLUSIÓN Durante la reactivación, el virus se encuentra en estado latente, no se detecta ARNm viral y se inicia un nuevo ciclo de replicación con producción de virus, aunque no necesariamente con sintomatología. Las técnica moleculares para la detección de CMV han demostrado su valor predictivo en la infección temprana activa por HCMV y en su monitorización en pacientes inmunosuprimidos, así como también para evaluar la eficacia de la terapia antiviral en pacientes de alto riesgo después de trasplante alogénico de CMH.

Referencias 1. Madi N, Al-Nakib W, Mustafa AS, Saeed T, Paesa A, Nampoory MR. Detection and monitoring of cytomegalovirus infection in renal transplant patients by quantitative real-time PCR. Med Princ Pract 2007; 16: 268-73 2. Leraez-Ville M, Ouachee M, Delaure R, Sauget AS, Blanche S, Buzin A, et al. Monitoring cytomegalovirus infection in adult and pediatric bone marrow transplant recipients by a real-time PCR assay performed with blood plasma. J Clin Microbiol 2003; 41: 2040-6. 3. Caliendo AM, Kirsten St. George, Allega J, Bullota AC, Gilbane L., Rinaldo CR. Distinguishing Cytomegalovirus (CMV) Infection and Disease with CMV Nucleic Acid Assays. J Clin Microbiol. 2002;40:1591-86. 4. Blank B S, Meenhorst P L, Mulder J W, Weverling G J, Putter H, Pauw W, et al. Value of different assays for detection of human cytomegalovirus (HCMV) in predicting the development of HCMV disease in human immunodeficiency virus-infected patients. J Clin Microbiol 2000; 38: 563-9. 5. Schmidt GM, Hoak DA, Niland JC, Duncan SR, Forman SJ, Zaia JA. A randomized, controlled trial of prophylactic ganciclovir for cytomegalovirus pulmonary infection in recipients of allogenic bone marrow transplants. The City of Hope-Stanford-Syntex CMV Study Group. N Engl J Med. 1991;324: 1005-111 6.- Caliendo A M, Schuurman R, Yen-Lieberman B, Spector S A, Andersen J, Manjiry R, et al. Comparison of quantitative and qualitative PCR assays for cytomegalovirus DNA in plasma. J Clin Microbiol 2001; 39: 1334-8. 7.- Ikewaki J, Ohtsuka E, Satou T, Kawano R, Ogata M, Kikuchi H, et al. Real-time PCR assays based on distinct genomie regions for cytomegalovirus rcactivation following hematopoietic stem cell transplantation. Bone Marrow Transplant 2005; 35: 403-10. 8. Liesnard C, De Wit L, Motte S, Brancart F, Content J. Rapid diagnosis of cytomegalovirus lung infection by DNA amplification in bronchoalveolar lavages. Mol Cell Probes 1994;8:273-83. 9. Li H, Dummer J S, Estes W R, Meng S, Wright P F, Tang Y W. Measurement of human cytomegalovirus loads by quantitative real-time PCR for monitoring clinical intervention in transplant recipients. J Clin Microbiol 2003; 41: 187-91.

Donaciones de canastillas en el Hospital Santo Tomás y CHMAAM-CSS, a las madres de los niños nacidos el 10 de febrero en el marco de la conmemoración del día del laboratorista clínico.

Gira de asistencia social con el fin de educar a la población en temas médicos, entrega de regalos a los ahijados y compartir momentos de alegría con los niños de la comunidad.

Realizamos donaciones a la Fundación Amigos del Niño con Leucemia y Cáncer (FANLYC)

Opinión Opinión asintomáticas y un gran número no son comunicadas a las autoridades. En cuanto a la hepatitis C, se ha establecido que es la causante entre el 80-90% de las hepatitis postransfusio-nales.

Z de Castillo1, V Moscoso2 1Laboratorio NAT, CSS, 2Departamento de Ciencias de Laboratorio, Facultad de Medicina, UP

En el siglo XXI, la sangre sigue siendo patrimonio del ser humano y, en muchos aspectos, el cuidado de la salud requiere de este recurso. La sangre es considerada un bien escaso, e irremplazable artificialmente, en tanto, que nada puede sustituir completamente sus funciones. Estas funciones conllevan el transporte de oxígeno y nutrientes, factores de coagulación y elementos para la inmunidad, todas indispensables para el sostenimiento de la vida. De allí que, muchos tratamientos médicos requieran transfusiones de componentes sanguíneos, haciéndolos una parte clave del cuidado de salud moderno, mejorando el desenlace del paciente. El beneficio que puedan ofrecer las transfusiones de componentes sanguíneos está condicionado a la seguridad de las mismas, determinada ésta por una serie de procesos que se inician con la selección del donante y terminan con el acto transfusional en el paciente. En el contexto de lo expuesto la legislación vigente en Panamá, en materia transfusional, dispone que se realicen exámenes de laboratorio a los donantes antes de emplear los componentes. Entre las pruebas que se realizan cabe destacar las que evalúan la presencia de agentes infecciosos potencialmente transmisibles por transfusión, como: HBV, HCV y HIV. Cada año se registran en el mundo más de 200 millones de infecciones por hepatitis B, número que podría ser mayor si consideramos que entre un 75% y un 90% de estas hepatitis son

Los costos sociales y económicos que surgen como consecuencia de estas enfermedades revelan lo trascendente del problema. En la actualidad, muchas de estas complicaciones son evitables en la medida en que los bancos de sangre tengan acceso al desarrollo tecnológico con el que se cuenta. Desde 1999, la prueba de amplificación de ácido nucléico (NAT, por sus siglas en inglés) se ha constituido en la principal, a nivel mundial, para el tamizaje de los virus de las Hepatitis B, Hepatitis C y el de la inmunodeficiencia humana. La técnica amplifica una porción de los segmentos de ácido nucléico del genoma viral (ADN o ARN) en más de un millón de copias para detectar el virus.

En el año 2007, las autoridades de la Caja de Seguro Social de Panamá toman la decisión de incorporar esta metodología con la intención de acortar el período de ventana y así ofrecer mayor seguridad en la transfusión, al disminuir el riesgo de transmisión de estos agentes infecciosos. Además, los pacientes evaluados en los diferentes servicios clínicos podrían tener resultados más confiables sobre su posibilidad de infección, con respecto a estos virus. Para la institución, la medida significaría disminuir la posibilidad de que se infecten pacientes a través de componentes sanguíneos, quienes verían afectada sensiblemente su calidad de vida y a los que habría que ofrecer tratamientos costosos que afectarían sensiblemente el presupuesto.

Si consideramos las estadísticas nacionales anuales los donantes que acuden a las instalaciones de la Caja de Seguro Social, representan un poco más del 60% del total de donantes del país, los cuales son evaluados por metodología NAT. Estos hallazgos nos llevan a concluir que requerimos de un sistema nacional de evaluación, selección y validación de los ensayos de sangre, buscando lograr una sensibilidad y especificidad no menor de 99.5%. Es un hecho que, mientras existan pacientes con cirugías de urgencia o de alta complejidad y pacientes con enfermedades hemorrágicas hereditarias, la donación de sangre es imprescindible. Siendo así, debemos fortalecer el Programa Nacional de Sangre, donde se elaboren proyectos para conseguir fondos que permitan el desarrollo de una campaña masiva y sostenida que promueva la donación voluntaria. En ese sentido, habría que extender el uso de la metodología NAT a nivel nacional, estandarizar metodologías a través de la centralización por regiones, lo que facilitaría establecer sistemas de gestión de calidad que nos conducirían a reforzar la hemovigilancia y el uso adecuado de la sangre.

En contraste, microorganismos como: Corynebacterium spp, Bacillus spp (Excepto B.anthracis) y Propionibacterium acnés que raramente representan bacteriemia verdadera. El objetivo de este estudio fue determinar la frecuencia de microorganismos aislados en Hemocultivos de pacientes del Hospital del Niño, Republica de Panamá.

en el sistema automatizado Vitek 2 y por el método de difusión según normas del CLSI 2011 y 2012. Los mecanismos de resistencia fueron confirmados usando método de tabletas Neosensitabs con los Kits KPC-MBL, AmpC confirmatorio y AmpC-ESBL screen (Rosco Diagnostica, Dinamarca). La data analizada fue obtenida del sistema de informática MODULAB (ISAZA, España).

MATERIALES Y MÉTODO

RESULTADOS

Desde agosto de 2011 hasta agosto de 2012 se recibieron un total de 9,837 muestras de hemocultivos correspondientes a pacientes hospitalizados del Hospital del Niño con sospecha de bacteriemia.

Se procesaron un total de 9,837 muestras de hemocultivos de las cuales 1,619 (16.5%) fueron positivas y 8,218 (83.5%) fueron negativas. Del total de hemocultivos positivos 69.2% correspondió a cocos Gram Positivos, mientras que 18.9% y 8.1% correspondió a bacilos Gram negativos y Candida spp respectivamente. En medio de los cocos Gram positivos el agente más frecuente fueron las especies de Staphylococcus coagulasa negativa (SCN) (55.3%), Staphylococcus aureus (5.6%), Streptococcus spp (5.6%) y Enterococcus spp con 2.7% de todos los aislamientos. Los bacilos Gram negativos más frecuente fueron las Enterobacterias con un 14.1%, seguido de los Bacilos Gram

Las muestras fueron recolectadas en botellas pediátricas Bact-ALERT SA e incubadas durante 5 días en el sistema automatizado de Hemocultivos Bact-ALERT (Biomerieux, Francia). Las botellas detectadas por el sistema como positivas fueron removidas, se les realizó coloración de Gram y subcultivos en medios de agar sangre, agar Mac Ckonkey, Agar sabouraux, agar chocolate de acuerdo a la reacción de Gram. De las colonias aisladas se completó la identificación fenotípica utilizando los esquemas de identificación como: bioquímica manual, sistema automatiGrafico No.1: Distribución de microorganismos de hemocultivos positivos, Hospital de Niño. 2011-12. zado Vitek 2 y API NE negativos no fermentadores (BGNNF) con un (Biomerieux, Francia). Las pruebas de suscep4.8%, ver grafico No.1. tibilidad a los antimicrobianos fueron realizdas

Después de los SCN las Enterobacterias fueron los agentes más aislados incluyendo Klebsiella pnuemoniae (41.9%), Escherichia coli (23.7%), Enterobacter spp (12.6%), Serratia spp (9.6%) y 11.1% de otras especies de Enterobacterias (Salmonella enteritidis, Shigella flexnerii, Proteus mirabilis, Pantoea agglomerans, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Morganella morgagnii). Los mecanismos de resistencia detectados en medio de las Enterobacterias fueron betalactamasas de espectro extendido (BLEE), Cefalosporinasas AmpC cromosómicas y plasmidicas, e impermeabilidad a los carbapenemicos mediada por porinas. La especies de Candida representaron el 8.1% de todos los aislamientos. El 50.9% de los aislamientos fueron por miembros del Complejo Candida parapsilosis, 36.3% por Candida albicans, 5.3% por Candida guilliermondii y 7.1% de especies de Candida que no pudieron ser identificadas. Se detecto resistencia anfotericina B, caspofungina y los azoles con excepción de posaconazol en medio de los aislados de Candida spp. Las especies de Streptococcus más aislados fueron Streptococcus agalactiae 41.8%, Streptococcus viridans 20.2%, Streptococcus pneumoniae 19.0%, Streptococcus pyogenes 12.7% y otras especies de Streptococcus 6.3%. Staphylococcus aureus fue aislado en 5.6% de los casos incluyendo cepas meticilino resistentes y con resistencia inducible a clindamicina. Un 2.7% de los aislamientos de cocos Gram positivos fue Enterococcus spp, siendo el agente más aislado Enterococcus faecalis con 71.1%, seguido de Enterococcus faecium con 21.1% y otras Enterococcus spp 7.8%. Nosotros no encontramos resistencia de alto nivel a los aminoglicósidos, ni resistencia a vancomicina en medios de los aislados de Enterococcus, con excepción de las especies aisladas que presentan resistencia natural a vancomicina (E.raffinosus, E.gallinarum). El 4.8% de los aislamiento fueron BGNNF incluyendo principalmente Pseudomonas aeruginosa (39.8%), Complejo Acinetobacter baumannii (29.4%), y 30.9% de otros BGNNF (Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas Burkholderia cepacia, Brevinvomonas vesicularis, Flavobacterium spp).

Los mecanismos de resistencia encontrados en medio de los BGNNF fueron: metalobetalactamasas (MBL), oxacilinasas (OXA), cefalosporinasas AmpC cromosómica, BLEE, impermeabilidad a los carbapenemicos. Otros microorganismos que fueron aislados con menos frecuencia fueron Aeromonas hydrophila, Bacteroides fragilis, Haemophilus influenzae, Bacillus spp, Kocuria rocea, Corynebacterium spp, Leclercia adecarbosylata, Leuconostoc spp, Kocuria sedentarium, Micrococcus luteus. DISCUSION Para la correcta detección de infecciones del torrente sanguíneo se recomienda la toma de dos series de hemocultivos, de punciones dife/rentes por serie dependiendo del peso del paciente (Gonsalves et al, 2009). En este trabajo sólo se recolecto una botella de hemocultivo por paciente, este factor pudo haber influido en la baja frecuencia de aislamiento que obtuvimos si los comparamos con otros estudios similares donde se obtuvieron porcentajes de positividad más altos (Zarate et al, 2005, Sanchez et al, 2010). El número de cultivos de sangre positivos, especialmente cuando se mide en función del total de cultivos obtenidos es útil para interpretar la significancia clínica de los cultivos de sangre positivos. No consideramos la tasa de contaminación, ni la significancia clínica de los aislamientos al evaluar nuestros resultados. Considerando que en otros trabajos el 67% de los aislados de SCN son considerados contaminantes (Gonsalves et al, 2009). Otros estudios ha determinado que el 70% de los cultivos de sangre positivos por SCN son contaminantes (Panaiguia et al, 1987).podemos deducir que en nuestro caso gran parte de nuestros aislamientos se deben a contaminación al momento de la toma de la muestra. Los SCN son el más común contaminante de los cultivos de sangre, pero ahora son patógenos frecuentes y determinar la significancia clínica de este grupo de microorganismos en sangre es especialmente problemático (Weinstein, 2003). Basados en nuestros resultados las Enterobacterias, Candida spp, Staphylococcus aureus, Streptococcus spp y BGNNF son la principal causa de infecciones del torrente sanguíneo en nuestro Hospital.