Apostila 3

TROMBOFILIA O termo trombofilia refere-se a tendĂŞncia de desenvolver trombose conseqĂźente a fatores predisponentes geneticamente determinados e/ ou adquiridos.

Trombofilia Anormalidades do mecanismo hemostático com desequilíbrio da interação plaquetas, parede vascular e proteínas da coagulação que podem levar a trombose venosa ou arterial.

Tríade de Virchow - fatores predisponentes a trombose: - lesão endotelial * - hipercoagulabilidade do sangue - alterações do fluxo sanguíneo

Trombofilia • Trombofilia Hereditaria (Primária): manifestação clínica

geralmente precose; • Trombofilia Adquirida (Secundária):tem como causa grupo

Heterogêneo de doenças.

Fatores GenĂŠticos Fatores Adquiridos Estilo de Vida

Fatores de risco hereditários para trombose Redução de proteínas antitrombóticas • Deficiência de AT • Deficiência de Proteína C • Deficiência de Proteína S Aumento de proteínas pró-trombóticas • APC (fator V resistente à PC ativada) • Mutação do gene da Protrombina 20210 • Hiperhomocisteinemia • Elevação do FVIII ou FXI • Disfibrinogenemia

Quando pesquisar trombofilia (?)

• • • • • • • • •

Evento trombótico abaixo de 45 anos Trombose espontânea Eventos trombóticos recorrentes História de trombose venosa na família do paciente Localização rara da trombose (veia porta, mesentérica, cerebral) Resistência a heparina (def. AT) Púrpura fulminante neonatal (PC/PS) Necrose de pele induzida por cumarínicos (def. PC/PS) Uso de contraceptivo oral em família com trombofilia

Investigação laboratorial da Trombofilia

• Exclusão de doenças adquiridas • Distante do episódio trombótico agudo (6 meses) • Ausência de anticoagulantes orais (PC e PS)

• Ausência de heparina (AT)

Testes recomendados para pesquisa de trombofilia • • • • • •

Determinação da Antitrombina Determinação da Proteína C Determinação da Proteína S APC Resistance /FV Leiden Mutação do gene Protrombina 20210 Homocisteína

• Fator VIII/ AL /ACL

Deficiência da Antitrombina • Primeira a ser reportada (1965) • Relativamente incomum(~1% TVP) • Deficiência adquiridas (heparina, síndrome nefrótica, Lasparaginase)

Métodos de determinação de AT • COAGULOMÉTRICO • IMUNOLÓGICO /IMUNOELETROFORESE

• COLORIMÉTRICO/CROMOGÊNICO

Determinação da AT substrato cromogênico

Excesso trombina Tampão com heparina

pNA AA AA AA AA

pNA

AA AA AA AA

pNA

Plasma AT

pNA TR TR AT He

AT

TR

TR TR TR AT He Trombina - AT - Heparina

Deficiência de PC e PS

 8-12-vezes risco trombótico

 idade (15-30 anos)  Deficiência adquirida: anticoagulante oral e gravidez (PS)

Proteína C C4BBinding Protein

Proteína S

Inativa

Ativa

FVa FVIIIa

FV(i) FVIII(i)

Proteína S

Proteína C

APC Trombina Trombomodulina

Célula Endotelial

Determinação Proteína C e S  Proteína C

 funcional (atividade) – coagulométrico colorimétrico  não-funcional (antígeno)  Proteína S  funcional (atividade)

 não-funcional (antígeno)  Formas livre e total da Proteína S

Atividade da Proteína C- COAGULOMÉTRICO

Agkistroden c. contortrix

FXII

FXI Proteína C

FIX Proteína C Ativada

Método baseado na atividade anticoagulante da PC. Limitações: Vleiden; VIII; ACL

FVIII

TTPA

FX FV

FII Fibrinogênio

PROTEÍNA C -MÉTODO COLORIMÉTRICO (CROMOGÊNICO)

H

D Lys

Agkistroden c. contortrix

Pro Arg

Proteína C

Proteína C ativada pNA pNA

Interferentes: icterícia; hemólise; lipidemia

Atividade da Proteína S- Coagulométrico

Plasma deficiente PS + Proteína C Ativada + Plasma PS

FXII FXI FIX FVIII FV FX

TTPA

FII Fibrinogênio

DETERMINAÇÃO DA PS

Y

ELISA

= Anticorpo secundário ligado à peroxidase = proteína S plasmática

Y

PS LIVRE PS TOTAL

Y= Anticorpo anti-PS livre ou total

DETERMINAÇÃO DA PS

COR AMARELA PROPORCIONAL À QUANTIDADE DE PS

Y

Proteína C e S •Proteína C baixa Fator VII Meia vida similar – ambos baixos sugere insuficiência hepática ou antagonismo da vitamina K •Proteína

S baixa Fator VIII FVIII aumentado em respostas inflamatórias

Fator V • FV circula no plasma como cofator não ativado • FV é ativado pela trombina e atua como cofator na conversão da protrombina em trombina • FVa é inativado pela PCa e ordenado 306 Segunda quebra

306

506

679

Primeira quebra

506

PCa

679

(Códons do Fator V)

Terceira quebra

APC resistência • 1992 – pacientes com tromboembolismo venoso inexplicável , plasma com baixa resposta à PCa no TTPa

Proteína C (5%)

1994 – Dalback (posição 1691A)

Proteína S (7%)

1996 – Bertina VLeiden

AT (3%) Desconhecido (70%)

LA (5%)

Outros (10%)

Base Molecular do APCR Fator V Normal

ARG

Fator V Inativo (para coagulação)

Proteína C ativada GLN Fator V Leiden (Arginina506  Glutamina)

Não inativação (trombose)

Fator V Leiden 

Causa mais comum de trombose venosa



~5% da população „normal‟



Risco aumentado com a idade



Frequentemente combinado com outros fatores de risco, genéticos ou adquiridos

APC RESISTÊNCIA – método coagulométrico • TTPa do plasma do paciente/pool N com PCa • TTPa do plasma do paciente/pool N

Relação = TTPa PCa (amostra/poolN) TTPa (amostra/pool N) Relação Normatizada = Relação da amostra Relação do pool N 

Confirmação por PCR

Protrombina Mutante • Precursor da trombina ; dependente de vitamina K • Foi identificada 1996 (transição de guanina a adenina) no nucleotídeo 20210 • Portadores heterozigóticos têm níveis de PT 30% acima em relação a indivíduos normais • PTM (20210) – risco de trombose 2 a 5 vezes • Detecção somente por PCR

HIPERHOMOCISTEINEMIA

Homocisteína: aa formado durante a conversão de metionina em cisteína Genetico

Adquirida

Homozigotos Polimosrfism o

Def. Vitamina Falência Renal Farmacos

Determinação por HPLC, ELISA, Imunoturbidimetria

CISTATIONA SINTETASE

Hiperhomocisteinemia



Nível plasmático >15 mol/l



Fator de risco para doença cardiovascular e trombose venosa



Fácil tratamento (ácido fólico, Vit B6, B12)

Efeitos da hiperhomocisteinemia Inibe trombomodulina Inibe AT ligada a heparan sulfato Inibe ADPase Bloqueia ligação t-PA Estimula expressão TF por CE e monoc

Inibe inativação do FVa por APC

Inibe ativação da PC Aumenta trombogenicidade da superfície das CE Aumenta a interação das plaquetas e parede do vaso Inibe fibrinólise

Pró-trombótico

Aumenta a geração de trombina

Determinação de Homocisteína 

HPLC



Enzima imunoensaioimmuno



Partículas de Látex

Frequência dos fatores de risco para trombose venosa



Deficiência de PC

5%



Deficiência de PS

8%



Gene do FII Aumento FVIII Aumento FXI Homocisteína



Dysfibrinogenemia <1%



APA



FV Leiden



Deficiência de AT

1%

  

6% 16% 11% 10% 10%

20%

Aproximadamente 75-80% dos pacientes com trombose venosa têm um ou mais fatores de risco

Fatores de risco ď ľ

A maioria dos fatores de risco hereditĂĄrios e adquiridos tem um efeito individual relativamente pequeno, mas . . . .

ď ľ

O risco aumenta quando dois ou mais fatores se combinam

Sinergismo entre fatores de risco de origem congĂŞnita FV Leiden (hetero) 0 + 0 0 + + 0 +

MTHFR (homo) 0 0 + 0 + 0 + +

FII 20210 (hetero) 0 0 0 + 0 + + +

Risco 1.0 2.8 1.8 2.4 16.5 22.8 19.6 56.4

VITÓRIA - ES

TROMBOFILIA ADQUIRIDA

Estados de Hipercoagulabilidade Adquirido 1.

Gravidez 2.

Imobilização 3.

Trauma 4.

Estado pós-operatório 5.

Idade avançada 6.

Tratamento com estrógeno contraceptivo 7.

Hiperhomocisteinemia 8.

Quimioterapia 9.

Síndrome nefrótica 10. Doenças malígnas 11. Síndrome antifosfolipídica *****

ANTICORPOS ANTIFOSFOLÍPIDES

SÍNDROME DO ANTIFOSFOLÍPIDE DEFINIÇÃO

A Síndrome do Antifosfolípide (SAF) é uma doença

auto-imune

associação trombose

de e/ou

caracterizada

sintomas perda

clínicos

gestacional

presença de anticorpos antifosfolípides.

pela como e

a

SÍNDROME DO ANTIFOSFOLÍPIDE DEFINIÇÃO Anticorpos antifosfolípides são uma família de auto-anticorpos heterogêneos , incluindo anticorpos anticardiolipina (ACA), anti-

2-glicoproteína 1, anti-protrombina e anticoagulante lúpico.

Dirigidos contra proteínas plasmáticas ligadas a superfícies aniônicas(não necessariamente fosfolípides) : β-glicoproteína I,

protrombina, proteína C ativada, Proteína S, anexina V, cininogênio de alto peso molecular, ativador tecidual do plasminogênio (t-PA), fator XII, fator VII e VII ativado,

trombomodulina, heparan sulphate.

SAF - CLASSIFICAÇÃO

PRIMÁRIA (SAFP) - Quando não está associada a outras patologias.

SECUNDÁRIA (SAFS) - Quando está associada a outras patologias auto-imunes, principalmente o LES, neoplásicas ou infecciosas.

Asherson RA, Cervera R. “Primary”, “secondary” and other variants of the antiphospholipid syndrome. Lupus. 1994;3:293-8

Prevalência da Síndrome Antifosfolípide 35% de SAF em indivíduos com LES.

AVC em indivíduos com idade inferior a 50 anos, a frequência de ACA varia de 18-46%.

A frequência de ACA em mulheres com perdas fetais recorrentes varia de 12-15%. É mais comum em mulheres (5:1) caucasianas (8590% dos casos).

Se não anticoagulado, há risco de desenvolver trombose em 50% dos indivíduos com SAF no período de dois anos.

SAF - CRITÉRIOS DIAGNÓSTICOS CLÍNICOS 1 ou + episódios de trombose vascular Morbidade gestacional 3 ou + abortamentos espontâneos consecutivos (<10 sem.)

1 ou + mortes inexplicadas de fetos morfologicamente normais (>10 sem.)

1 ou + nascimentos prematuros de crianças morfologicamente normais (<34 sem.) devido pré-eclêmpsia grave, eclâmpsia ou insufuciência placentária

Wilson et al. International consensus statement on preliminary classification criteria for definite antiphospholipid syndrome. Arthritis Rheum 1999;42(7):1309-1311.

SAF - CRITÉRIOS DIAGNÓSTICOS LABORATORIAIS Anticorpo anticardiolipina, IgG ou IgM, em títulos moderados ou altos, em 2 ou mais ocasiões, com intervalos de 6 ou + semanas e pesquisados por um ELISA padronizado para anticorpos anticardiolipina dependente de 2-GP1.

Inibidor Lúpico presente no plasma em 2 ou + ocasiões, com intervalos de 6 ou + semanas, detectados conforme as diretrizes da Sociedade Internacional em Trombose e Hemostasia,

Subcomitê em Inibidor Lúpico/Antifosfolípides.

WILSON et al., 1999

SAF - CRITÉRIOS DIAGNÓSTICOS

A presença de 1 critério clínico e 1 critério laboratorial confirma o diagnóstico de SAF.

WILSON et al., 1999

DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE ANTICORPO ANTIFOSFOLÍPIDE

ANTICOAGULANTE LÚPICO Anticorpos heterogêneos IgG/IgM : imunoglobulinas hexagonais • Promovem prolongamento do tempo de coagulação dos testes dependentes de fosfolípides • Porém, não estão associados com sangramento e sim com trombose arterial e/ou venosa • Mecanismos (?)

Fisiopatologia dos anticorpos anti-fosfolípides • Ativação das células endoteliais • Inibição de PGI2 das células endoteliais • Aumento da adesão de leucócitos às CE • Diminuição da expressão da TM • Hiperatividade das plaquetas -

TXA2

Anticorpos anti-lúpico e proteínas ligantes • • • • • •

β2 glicoproteína I Protrombina Anexina V PC PS Cininogênio de alto peso molecular

Critérios estabelecidos pelo International Society of Thrombosis and Haemostasis (ISTH) 1995/2009: • 1º) Prolongamento dos testes de coagulação dependentes de fosfolípides (testes de triagem): TTPa Tempo de coagulação com caulim (TCC ou KCT) Teste com veneno da víbora de Russell diluído (TVVRd) Teste de inibição da tromboplastina (TTI) • Para evitar falsos resultados negativos, devem ser utilizados no mínimo dois testes de triagem baseados em princípios diferentes.

Além disso, o plasma teste e os plasmas controles devem ser submetidos à dupla centrifugação para a retirada das plaquetas (contagem de plaquetas no plasma abaixo de 10 x 109/L ).

2º) Demonstração da presença do inibidor realizada

através do estudo das misturas (1 parte do plasma do paciente e 1 parte do plasma normal). A presença de AL impede a correção dos tempos de coagulação do teste,

após a mistura. Em paralelo, deve-se excluir a presença de heparina na amostra através do tempo de trombina (TT) que também impede a correção do teste no estudo das misturas.

3º) Prova confirmatória : demonstração do inibidor ser dependente de fosfolípide.

A prova confirmatória é a demonstração da correção do efeito inibitório do AL por adição de alta concentração de fosfolípide,

diferenciando

de

coagulação cujo prolongamento

outros

inibidores

da

Interferentes - Presença de fibrina - fatores pré-ativados.

- Hematócritos acima de 55% - excesso de citrato de sódio TP e TTPa prolongados.

C = 1.85 x 10-3 (100 - Hto) x V >55%

< 30%

• Falso positivo : Presença de Heparina (sensibilidade TT- 0.05 U/ml).

• Falso-negativo: relacionados a plasma não suficientemente pobre em plaquetas, e ACL fraco.

Anticoagulante Lúpico - Melhor correlação com trombose, morbidade gestacional e trombose em pacientes com LES - Baixa concordância inter-laboratorial: - Realização de 2 ou mais testes, nenhum teste é 100% sensível - Em pacientes sob anticoagulação oral:

adiar o exame  teste a 50% (se INR < 3,5)  se INR > 3,5, não realizar a pesquisa Miyakis S et al. J Thromb Haemost 2006; 4:295-306

PESQUISA DE ANTICOAGULANTE LÚPICO - TTPa CAPM Pré-calicreína

calicreína XII Fosfolípide Fosfolípide VIIIa

Xa

X II

IXa

XIIa XIa IX

Fosfolípide Va

IIa

Fibrinogênio

Fibrina estável

CAPM

XI

PESQUISA DE ACL –VIA TTPa

•

Teste de triagem mais comum (VIII e Fibrinogênio altos)  Fosfolípides (variam quanto à sensibilidade)

•

Mistura 1:1 e 4:1 - Prolongado (LA) - Correção (deficiência de fator)

•

Confirmatório - Prova de neutralização com plaquetas - Fosfolípide de fase Hexagonal absorve o AL, TTPA normal

PESQUISA DE ACL– via TVVRd

Mais específico que o TTPa; • Não sofre interferência de inibidor de VIII:C ou deficiência; • Misturas com plasma normal exclui deficiências de FII, FV e X; • Mais sensível ao AL direcionado contra Beta 2 Glicoproteína I; • Sofre interferência da heparina (falso positivo).

Confirmatório - Excesso de fosfolípides / lisado de plaquetas/ plaquetas ativadas com ionóforo de cálcio

Fluxograma para o diagnóstico de Anticoagulante Lúpico ISTH

Teste 1 (TTPa) normal

Teste 2 (dRVVT) normal

Parar a avaliação para AL

anormal

Teste de Mistura (PN+PP) corrige

não corrige

Documentação da dependência de fosfolípides

Se negativo

Teste de Mistura Incubado

positivo

AL confirmado

Dosagem de fatores corrige Deficiência específica de fator ou inibidor específco

Brandt JT et al. Thromb Haemost 1995; 74:1185-1190

Se

ANTICORPOS ANTICARDIOLIPINA (ACL)

• anticorpos direcionados à cardiolipina, presente em altas concentrações na membrana mitocondrial (componente da maioria das células humanas)

Anticorpo Anti- 2 Glicoproteína I • A maioria dos Ac anti-fosfolípides requerem um cofator 2GPI sérico para melhor ligação Fosfolip

Y

2GPI

Neoepitopo

Apolipoproteína H anticoagulante natural fraco, ávido por fosfolípides carregado negativamente : inibe agregação plaquetária e coagulação

ACL - ELISA IgG C+ N1 N2 N3 N4 N5 Pac 1 Pac 2

IgM

ACL - ELISA

IgG

Y

Cardiolipina

IgM

Y

ACL - ELISA Cálculos IgG e IgM Densidade óptica N1; N2; N3; N4; N5 Média

3 SD > POSITIVO

Média

5 SD > FORTEMENTE POSITIVO

IgG > 40 GPL ; IgM > 40 MPL

Anticorpos Anticardiolipina • Baixa concordância inter-laboratorial • ACL IgM tende a dar falso-positivo, particularmente quando baixos títulos, presença de fator reumatóide ou crioglobulinas

Miyakis S et al. J Thromb Haemost 2006; 4:295-306

Tratamento da SAF AAS, 100mg/dia – objetiva aumentar os níveis de prostaciclina sérica.

Anticoagulação Oral com antagonistas da Vitamina K (marevan ou marcoumar), mantendo o INR entre 2,5 – 4,0.

Heparina s.c., 5.000 UI/12 em 12 horas, nos casos em que a ACO não foi possível.

Hidroxi-Cloroquina – 400 mg/dia – inibição da agregação e da ativação plaquetária.

Corticosteróides e Imunossupressores são inefetivos na prevenção de novos episódios de trombose

MARCADORES DA ATIVAÇÃO DA COAGULAÇÃO

UBATUBA -SP

Marcadores da Ativação da coagulação

TAT Protrombina F1+2

Trombina

Fibrinogênio

+

Antitrombina

Fibrina

Fibrina polimerizada

PDF

Plasmina

D-Dímero ; PDF

Marcadores da Ativação da coagulação

D-Dímero - (fibrina) - detecção ou exclusão de TVP; EP; carcinoma ovariano, CIVD PDF - (fibrina e fibrinogênio)- detecção de estado de hiperfibrinólise, trombose, CIVD F1+2 - (protrombina) - detecção ou exclusão de CIVD; TVP; EP; monitoração de terapia anticoagulante

DÍMERO - D • Métodos - Aglutinação com partículas de látex - ELISA - Mini-vidas (ELISA rápido) - ELISA convencional

PRODUTOS DE DEGRADAÇÃO DE FIBRINA E FIBRINOGÊNIO (PDF)

• Métodos - Aglutinação com partículas de látex (plasma ou soro) - ELISA

FRAGMENTO 1+2 • Método - ELISA