GIÁO TRÌNH PHÂN TÍCH THỰC PHẨM - CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM - IUH - ĐH CÔNG NGHIỆP TPHCM (WORD DOC)

GIÁO TRÌNH PHÂN TÍCH THỰC PHẨM

vectorstock.com/26473796

Ths Nguyễn Thanh Tú eBook Collection

GIÁO TRÌNH PHÂN TÍCH THỰC PHẨM CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM - IUH - ĐH CÔNG NGHIỆP TPHCM (WORD DOC) WORD VERSION | 2021 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL.COM

Tài liệu chuẩn tham khảo Phát triển kênh bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật : Nguyen Thanh Tu Group Hỗ trợ trực tuyến Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon Mobi/Zalo 0905779594

CHƯƠNG 1: CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM 7 1.1 VAI TRÒ PHÂN TÍCH THỰC PHẨM ............................................... 7 1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG PHÂN TÍCH THựC PHẩM ............................................................................................................ 8 1.2.1

Phương pháp hóa học .................................................................. 8

1.2.2

Phương pháp hóa lý..................................................................... 9

1.3 PHƯƠNG PHÁP QUANG PHổ ........................................................ 10

GIÁO TRÌNH PHÂN TÍCH

1.3.1

Phương pháp quang phổ UV – Vis ........................................... 14

1.3.2

Cấu tạo thiết bị quang phổ UV – Vis ........................................ 15

1.3.3

Ứng dụng phương pháp quang phổ trong định lượng .............. 15

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM

THỰC PHẨM- CÔNG NGHỆ

..................................................................................................... 17

2.1 MỤC ĐÍCH CỦA LẤY MẪU PHÂN TÍCH ..................................... 17 2.1.1

THỰC PHẨM - IUH- ĐH CÔNG NGHIỆP TPHCM

Mục đích.................................................................................... 17

2.1.2

Một số khái niệm trong lấy mẫu ............................................... 17

2.1.3

Lấy mẫu và gửi mẫu.................................................................. 18

2.2 Phương pháp lấy mẫu ......................................................................... 26 2.2.1

Phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên ............................................. 26

2.2.2

Phương pháp lấy mẫu phi ngẫu nhiên ....................................... 27

CHƯƠNG 3: CÁC KỸ THUẬT CHUẨN BỊ MẪU TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM ..................................................................................................... 28 3.1 YÊU CẦU CHUNG CỦA CÁC KỸ THUẬT XỬ LÝ MẪU PHÂN TÍCH............................................................................................................ 28 3.1.1

Giới thiệu xử lý mẫu ................................................................. 28

3.1.2

Tại sao phải xử lý mẫu phân tích .............................................. 28

3.2 KỸ THUẬT VÔ CƠ HÓA ƯỚT (XỬ LÝ ƯỚT).............................. 30 1

2

3.2.1

Vô cơ hóa ướt bằng axit mạnh đặc nóng .................................. 30

CHƯƠNG 5: CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN

3.2.2

Kỹ thuật vô cơ hóa ướt bằng dung dịch kiềm mạnh đặc nóng . 36

TRONG THỰC PHẨM ........................................................................................ 92

3.3 KỸ VÔ CƠ HÓA KHÔ ...................................................................... 40

5.1 GIỚI THIỆU CHUNG ....................................................................... 92

3.3.1

Nguyên tắc và các quá trình xảy ra khi vô cơ hóa mẫu ............ 40

5.1.1

Protein trong thực phẩm ............................................................ 92

3.3.2

Thiết bị và dụng cụ để xử lý khô .............................................. 44

5.1.2

Vai trò của việc phân tích protein ............................................. 94

3.3.3

Vô cơ hoá khô không có phụ gia và chất bảo vệ ...................... 45

3.3.4

Vô cơ hoá khô có phụ gia và chất bảo vệ ................................. 46

5.2.1

Xác định protein tổng theo phương pháp Kjeldahn .................. 95

3.3.5

Ưu nhược điểm.......................................................................... 48

5.2.2

Xác định protein tổng theo phương pháp Dusma ..................... 97

3.4 KỸ THUẬT VÔ CƠ HOÁ KHÔ - ƯỚT KẾT HỢP ......................... 48

5.2.3

Phương pháp Biuret ................................................................ 102

5.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH PROTEIN ................................ 95

3.4.1

Nguyên tắc chung...................................................................... 48

5.2.4

Phương pháp Lowry ................................................................ 103

3.4.2

Phương pháp tiến hành và một số ví dụ .................................... 49

5.2.5

Phương pháp nhuộm màu Bradford ........................................ 107

3.4.3

Ưu nhược điểm.......................................................................... 51

5.2.6

Phương pháp Bicinchoninic Acid (BCA) ............................... 109

3.5 KỸ THUẬT TRÍCH LY THƯỜNG SỬ DỤNG KHI XỬ LÝ MẪU 51

5.2.7

Phương pháp hấp thụ tử ngoại ................................................ 111 Xác định hàm lượng lượng axit amin trong thực phẩm bằng

3.5.1

Cơ sở, nguyên tắc và điều kiện trích ly..................................... 51

5.2.8

3.5.2

Một số kỹ thuật trích ly thường dùng trong xử lý mẫu phân tích .

phương pháp folmadehyl ...................................................................... 112

................................................................................................... 53 CHƯƠNG 4: CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯƠNG NƯỚC

CHƯƠNG 6: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH GLUXIT TRONG THỰC PHẨM

................................................................................................... 115

TRONG THỰC PHẨM ....................................................................................... 77

6.1 GIỚI THIỆU CHUNG ..................................................................... 115

4.1 GIỚI THIỆU CHUNG ....................................................................... 77

6.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP....................................... 116

4.2 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NƯỚC ..... 79

6.3 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP BERTRAND ............................................................................................. 119

4.2.1

Phương pháp khối lượng ........................................................... 79

4.2.2

Phương pháp chuẩn độ KarlFischer .......................................... 80

6.3.1

Cơ sở của phương pháp........................................................... 119

4.3 PHƯƠNG PHÁP NỘI SUY GIÁN TIẾP ĐỂ ƯỚC TÍNH LƯỢNG

6.3.2

Chuẩn bị mẫu .......................................................................... 120

6.3.3

Xác định hàm lượng đường .................................................... 121

6.3.4

Tính toán kết quả..................................................................... 122

O

NƯỚC BẰNG CÁCH ĐO BRIX ............................................................. 82 4.3.1

Ước lượng nồng độ bằng khúc xạ kế ........................................ 82

4.3.2

Ước lượng nồng độ bằng tỷ trọng kế ........................................ 87

6.4 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP

4.3.3

Xác định tỷ trọng bằng bình đo tỷ trọng ................................... 90

DNS .......................................................................................................... 125

3

4

6.4.1

Nguyên tắc .............................................................................. 125

7.3.11 Xác định hàm lượng tro cuả sản phẩm dầu............................. 151

6.4.2

Xử lý mẫu ................................................................................ 125

7.3.12 Xác định hàm lượng tạp chất của sản phẩm dầu mỡ thực phẩm ..

6.4.3

Tiến hành:................................................................................ 126

................................................................................................. 153

6.5 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG SACCAROZA .................... 128

7.3.13 Xác định hàm lượng nước và các chất dễ bay hơi trong sản phẩm

6.6 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG TỔNG BẰNG PHƯƠNG

dầu mỡ ................................................................................................. 154

PHÁP BERTRAN ..................................................................................... 129

7.3.14 Xác định hàm lượng acid béo tự do có trong dầu, mỡ thực phẩm

6.7 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TINH BỘT ......................................... 129

................................................................................................. 155

6.8 XÁCĐỊNH ĐỘ POL CỦA ĐƯỜNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO GÓC QUAY CỰC .................................................................................... 129 6.8.1

Cơ sở lý thuyết ........................................................................ 129

CHƯƠNG 7: CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH LIPID ............................. 130 7.1 GIỚI THIỆU ..................................................................................... 130 7.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH LIPID ..................................... 131 7.2.1

Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp Soxhlet ........... 131

7.2.2

Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp Adam – Rose –

Gottlieb ................................................................................................. 134 7.3 Phân tích một số chỉ tiêu đánh giá chất lượng dầu mỡ .................... 134 7.3.1

Xác đinh tỷ khối của dầu hay chất béo dạng lỏng .................. 134

7.3.2

Xác định điểm đục của dầu mỡ thưc phẩm............................. 135

7.3.3

Xác đinh điểm mềm (điểm nóng chảy ống hở) của dầu mỡ ... 137

7.3.4

Xác định chỉ số Peroxide trong dầu mỡ .................................. 138

7.3.5

Xác định chỉ số xà phòng hoá của dầu mỡ thực phẩm ........... 140

7.3.6

Xác định chỉ số iod (Phương pháp Wijs) ................................ 142

7.3.7

Xác định chỉ số acid trong dầu mỡ ......................................... 144

7.3.8

Xác định chỉ số hydroxyl trong dầu mỡ................................. 146

7.3.9

Xác định hàm lượng chất không xà phòng hoá trong dầu mỡ 148

7.3.10 Xác định hàm lượng xà phòng trong dầu................................ 150 5

6

CHƯƠNG 1.

CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM

1.1.

1.2.

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG PHÂN TÍCH THựC PHẩM

Phân tích thực phẩm phải xuất phát từ việc lựa chọn phương pháp phân tích. Vì thế, lựa chọn phương pháp là mắt xích đầu tiên trong quy trình phân

VAI TRÒ PHÂN TÍCH THỰC PHẨM − Việc kiểm nghiệm chất lượng thực phẩm nói riêng và và sản phẩm nói chungphục vụ cho rất nhiều mục đích, như là:

tích, nó có ý nghĩa quan trọng.

Hiện nay, các phương pháp định lượng được sử dụng trong phân tích được

+ Đối với công tác kiểm tra, cấp giấy chứng nhận chất lượng thì việc kiểm

chia thành hai nhóm phương pháp đó là nhóm các phương pháp hóa học (gọi

nghiệm chất lượng để đưa đến quyết định chấp nhận lô hàng hoặc từ chối

tắt là phương pháp hóa học) và nhóm các phương pháp hóa lý (gọi tắt là

cấp chứng nhận cho lô hàng.

phương pháp hóa lý).

− Trong sản xuất, quản lý chất lượng, nghiên cứu phát triển sản phẩm: đánh

Những tiêu chí được sử dụng để lựa chọn phương pháp phân tích bao gồm:

giá chất lượng sản phẩm là để nhận biết mức chất lượng của sản phẩm đạt

Độ đúng của phương pháp

được so với tiêu chuẩn qui định (về cảm quan, thành phẩm dinh dưỡng và vi

Độ chính xác của phương pháp

sinh) nhằm điều chỉnh những sai xót, tìm hiểu nguyên nhân gây ra, để có

Tính chuyên biệt của phương pháp

biện pháp chấn chỉnh kịp thời đảm bảo chất lượng sản phẩm.

Kích cỡ mẫu

Kiểm nghiệm còn nhằm xác định chính xác chất lượng sản phẩm, trên cơ sở đó phân loại, xếp hạng sản phẩm đúng yêu cầu của từng mặt hàng.

Cung cấp số liệu về chất lượng thực phẩm phục vụ cho công tác quản lý nhà nước.

Trang thiết bị Tính kinh tế Tính an toàn và độ độc hại Tốc độ và tính cấp thiết của công việc 1.2.1. Phương pháp hóa học

Người ta đã đưa ra nhiều phương pháp để đánh giá các khía cạnh khác

Phương pháp hóa học còn được gọi là phương pháp cổ điển không chỉ vì

nhau về chất lượng sản phẩm. Một số phương pháp chỉ thích hợp cho

nó là phương pháp dựa trên phản ứng hóa học để định lượng cấu tử mà đó còn

mục đích này mà không thích hợp cho mục đích khác.

là nhóm những phương pháp được sử dụng sớm hơn so với những phương

Tùy theo yêu cầu kiểm tra mà người ta chọn phương pháp thích hợp

pháp hóa lý.

để đạt được độ tin cậy cao nhất. Các phương pháp kiểm nghiệm đã

Phương pháp hóa học lại được chia thành hai phương pháp nhỏ đó là

được áp dụng bao gồm: phương pháp cảm quan, phương pháp hoá học,

phương pháp khối lượng và phương pháp thể tích thông qua việc cân hay đo

phương pháp vi sinh vật.

chính xác khối lượng hay thể tích cấu tử hay thuốc thử cần xác định. Phương pháp hoá học được sử dùng để phân tích xác định hàm lượng lớn (đa lượng) của các chất, thông thường lớn hơn 0.05% 7

8

Phương pháp phân tích khối lượng: dựa vào việc cân sản phẩm tạo thành

Phương pháp hóa lý được phân chia dựa trên tính chất được sử dụng để xác

sau quá trình thực hiện phản ứng tạo kết tủa từ đó xác định hàm lượng cấu tử

định cấu tử đó là: phương pháp quang phổ, phương pháp điện, và phương

cần phân tích như:

pháp sắc ký.

Phương pháp bay hơi

Trong giáo trình này, chúng tôi chỉ đề cập đến phương pháp quang phổ UV

Phương pháp kết tủa

– Vis trong phân tích định lượng.

Phương pháp phân tích thể tích: Dựa vào việc đo chính xác thể tích dung

1.3.

PHƯƠNG PHÁP QUANG PHổ

Phương pháp quang phổ là phương pháp hóa lý, dựa trên sự tương tác giữa

dịch thuốc thử có nồng độ chính xác để tính hàm lượng cấu tử cần phân tích

bức xạ điện từ và vật chất (nguyên tử, phân tử). Khi có sự tương tác với vật

bao gồm: Phương pháp chuẩn độ axit – bazo

chất, bức xạ điện từ sẽ hấp thụ hoặc phát xạ mà bức xạ được ứng dụng trong

Phương pháp chuẩn độoxy hóa – khử

thiết bị quang phổ hấp thụ hay quang phổ bức xạ tương ứng.

Bức xạ điện từ bao gồm một dải các sóng điện từ có bước sóng dao động

Phương pháp chuẩn độ kết tủa

trong một khoảng rộng từ bước sóng rất nhỏ như tia gamma (λ = 10-16 – 10-

Phương pháp chuẩn độ phức chất

8

Cơ sở chung của phương pháp phân tích thể tích:

m) đến bước sóng rất dài như sóng radio (λ = 100 – 108m). Bức xạ điện từ là

Dựa vào bản chất của phản ứng để xây dựng phương pháp

tổ hợp dao động của điện trường và từ trường vuông góc nhau, lan truyền

Sử dụng những lý thuyết liên quan để xây dựng phương pháp

trong không gian như sóng ngang. Do vậy mà bức xạ điện từ vừa có bản chất

Dùng định luật đương lượng làm cơ sở việc tính toán

của sóng, lại vừa mang bản chất của hạt.

Dùng chất chỉ thị màu để nhận biết điểm cuối Các quá trình trong phương pháp thể tích chủ yếu là thao tác bằng tay và sự quan sát bằng mắt của người thực hiện nên sự mất mát xảy ra là tương đối lớn vì vậy để tránh sai số thì lượng phân tích thường lớn. Để xác định điểm tương đương người ta dùng chất chỉ thị màu cho vào vì vậy, độ nhạy của phương pháp không cao.

Hình 1.1. Bước sóng dải bức xạ điện từ

1.2.2. Phương pháp hóa lý

Phương pháp hóa lý còn được gọi là phương pháp hiện đại. Phương pháp này được sử dụng khi cần yêu cầu độ chính xác cao, yêu cầu tốc độ phân tích nhanh chống hoặc khi hàm lượng cấu tử cần phân tích nhỏ. Cơ sở của phương

Năng lượng phân tử hay nguyên tử là tổng các dạngnăng lượng: E = Eđt+Edđ+ Eq

pháp dựa trên tính chất hóa lý của cấu tử để xác định chúng.

9

10

Eđt: Năng lượng điện tử của phân tử

Sự chuyển vị của electron trong liên kết σ của các hợp chấthữu cơ từ

Edđ: Năng lượng do những dao động gây bởi tươngtác giữa các nguyên tử trong phân tử.

orbital liên kết σ lên phản liên kết σ*.Sự chuyển vị này đòi hỏi năng lượng khá lớn, vìvậy quá trình chuyển vị nằm trong vùng tử ngoại xa. Đó là vùng có

Eq: Năng lượng do sự quay của các phân tử chungquay trong trục nào

bước sóng ngắn, năng lượng lớn.

Chuyển mức n → σ*

đó của nó. Ở điều kiện bình thường, các phân tử tồn tại ở trạng thái bền vững, có mức

Sự chuyển vị của các điện tử từ obital n lên cácorbital σ* trong các nguyên

năng lượng thấp – trạng thái cơ bản Eo. Khi chiếu chùm bức xạ điện từ vào

tử như O, N, S. Chuyển mức này xảy ra ở vùng phổ tử ngoại gần có năng

môi trường vật chất sẽ xảy ra hiện tượng hấp thu hoặc bức xạ năng lượng. Khi

lượng khônglớn. Sự dịch chuyển này dao động ở 180nm với alcol còn vớidẫn

đó điện tử sẽ dịch chuyển lên trạng thái có năng lượng lớn hơn gọi là trạng

xuất halogen của nó là 190nm. Đối với các aminlà 220nm. Cụ thể: Ete có

thái kích thích.

λmax= 190nm (ε =2000), Metanol có λmax= 183nm (ε =50), Etylamin có λmax=

Như vậy khi xảy ra tương tác, năng lượng của phân tử sẽ thay đổi (∆E≠0,

210 nm (ε =800).

với ∆E=E2-E1).Nếu năng lượng phân tử thay đổi thì phân tử hấp thu (nếu

Chuyển mức n→ π*

∆E>0) hoặc bức xạ năng lượng (nếu ∆E<0). Mỗi phân tử chỉ hấp thu hay phát

Điện tử từ orbital không liên kết n lên orbital phản liênkết π*.Đây là quá

xạ chọn lọc các bức xạ điện từ có tần số hay bước sóng nhất định. Là đây

trình thường xảy ra trong phân tử có một nguyêntử chứa điện tử không liên kết

chính là cơ sở của phương pháp quang phổ nói chung.

như ở những phân tử chứanhóm chức cacbonyl (C=O) và bước sóng hấp thu

Các dạng chuyển dịch điện tử:

,

,

270nm- 295nm. Bản chất của các dung môi có ảnh hưởng đến bước sónghấp

,

thu vì nó tác động đến liên kết trong phân tử.

Chuyển mức π→π* Các hợp chất đồng phân với etylen chứa liên kết đôi trongphân tử có khả năng hấp thu mạnh trong vùng bướcsóng 170nm. Vị trí hấp thu phụ thuộc vào sự hiện diện của nhóm thế vídụ etylen có λmax= 165nm (ε =16000). Những hợp chất không màu thường có phổ hấp thu trongvùng cận tử ngoại. Khi chúng hấp thu bức xạ thì chúng sẽchuyển tới trạng thái thông qua cơ chế chonhận điện tử.Lúc này điện tử từ orbital cho điện tử sẽ chuyển lênorbital nhận điện tử Hình 1.2 Các dạng chuyển mức điện tử

tạo thành những ion hay có sự phâncực trong phân tử.

Chuyển mứcd→d

Chuyển mức 11

12

Sự chuyển mức xảy ra ở các orbital d, nhất là ở các kimloại vùng chuyển

1.3.1. Phương pháp quang phổ UV – Vis

tiếp. Các phối tử có cặp điện tử tự do tham gia lai hóa vớinhững orbital này

Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis hay còn gọi là phương

chuyển điện tử vào các orbital này gâyra sự chuyển mức.Màu tạo ra của các

pháp trắc quang – so màu. Đây là phương pháp dựa trên hiện tượng hấp thụ

phức làm cho phức có khả năng hấpthu những bước sóng ở vùng khả kiến.

bức xạ UV-Vis của các phân tử.

Những yếu tố ảnh hưởng đến sự chuyển mức: sự liên hợp, dung môi, pH...

Sự hấp thụ năng lượng điện tử trong vùng sóng ánh sáng tử ngoại gần (190-400nm) và khả kiến (400-780nm) của các chất gây ra sự chuyển dịch của

Ảnh hưởng của dung môi Bước sóng hấp thu và cường độ hấp thu của các hợpchất chịu ảnh hưởng

các điện tử từ trạng thái cơ bản sang trạng thái kích thích. Biểu đồ biển diễn sự

của dung môi.Sự tác động của những dung môi khác nhau lên cácphân tử làm

tương quan giữa cường độ hấp thu theo bước sóng của một chất được gọi là

thay đổi mức năng lượng giửa các trạng tháikích thích và cơ bản.Sự tác động

phổ UV-Vis của chất ấy trong điều liện xác định.

của dung môi lên phân tử làm sinh rachuyển dịch xanh và chuyển dịch đỏ.

Chuyển dịch xanh

Là hiện tượng hấp thu bức xạ của các hợp chấthữu cơ có bước sóng ngắn hơn trong những dungmôi có tính phân cực cao. Hiện tượng này được tìm thấy ở quá trình chuyển dịch n→π* của nhóm cacbonyl.Nguyên nhân là do sự làm bền trạng thái n củadung môi.

Chuyển dịch đỏ

Là hiện tượng các hợp chất hữu cơ có xu hướnghấp thu những bức xạ có bước sóng dài hơntrong những dung môi có độ phân cực cao hơn. Hiện tượng được tìm thấy ở các phân tử hữu cơmà trong cấu trúc phân tử của nó có sự liên hợp.Nguyên nhân của hiện tượng này là do: o

Định lượng cấu tử bằng phương pháp quang phổ UV – Vis được dựa trên cơ sở định luật Lambert – Beer.

Khi chiếu bức xạ đơn sắc có cường độ ban đầu I0vào môi trường vật chất thì cường độ tia sáng giảm còn lại I. Khi đó: I< I0do

Khi mạch C càng dài thì hiệu ứng liên hợp càng tăng, dẫn tới độ lệch năng lượng giữa hai trạng thái giảm.

o

Hình 1.3 Sự hấp thu ánh sáng trong vùng khả kiến

Trong phân tử hữu cơ có hiệu ứng liên hợp càng dài thì bước sóng hấp thu càng giảm.

Bị hấp thubởi môi trường vật chất IA Bị phản xạ ở bề mặt cuvet IR Do vậy, I0= I + IA+ IR= I + IA IR ≈0 khi bề mặt cuvet nhẵn

13

14

Cường độ hấp thu được biểu diễn thông qua A hoặc T. A, T phụ thuộc

Bước đầu tiên, cần chuẩn bị dung dịch mẫu Cx và một loạt dung dịch

vào bản chất của chất hòa tan, chiều dày d và nồng độ C của dung dịch.

chuẩn có nồng độ tăng dần (thông thường là 5 nồng độ chuẩn: C1, C2,

Với A = lg(Io/I) : độ hấp thu

C3, C4, C5). Loạt dung dịch chuẩn này phải nằm trong vùng tuyến tính

T = I/Io: độ truyền suốt

giữa độ hấp thu và nồng độ.

A = - lgT

Bước thứ 2, tạo phức màu và đo độ hấp thu của mẫu và dãy chuẩn trong

Độ hấp thu A = εdC phụ thuộc vào ε: độ hấp thu của chất hấp thu, d: đường kính cuvet, C: nồng độ chất hấp thu

cùng điều kiệnAx và A1, A2, A3, A4, A5.

Bước thứ 3, Xây dựng đường chuẩn của độ hấp thu theo nồng độ dung

Khi đo ở λ xác định, εd = hằng số, A phụ thuộc vào C. Khi đó, quan hệ

dịch chuẩn. Và cuối cùng, từ phương trình đường chuẩn và độ hấp thu của mẫu ta sẽ tính toán được nồng độ cấu tử (Cx) cần tìm trong mẫu.

giữa A và C tuyến tính: đây chính là cơ sở lý thuyết của phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis.

Lưu ý

1.3.2. Cấu tạo thiết bị quang phổ UV – Vis

Độ hấp thụ có tính cộng, tức là:

Bao gồm các bộ phận sau đây:

A123...n = A1 + A2 + A3 +... + An

Đèn nguồn

Nghĩa là, độ hấp thu của dung dịch bao gồm tổng độ hấp thu của chất

Bộ phận tạo ánh sáng đơn sắc

hấp thu và độ hấp thu của chất nền. Do đó, trước khi đo độ hấp thụ của

Cuvet và ngăn chứa cuvet

một dung dịch (ADD) thường dùng dung dịch nền (dung dịch có thành

Detector

phần giống dung dịch cần đo nhưng nồng độ cấu tử cần xác định bằng

Bộ khuếch đại tín hiệu

không) để hiệu chỉnh máy sao cho độ hấp thu của dung dịch nền (ADD

Bộ ghi nhận tín hiệu

nền)

bằng không.

1.3.3. Ứng dụng phương pháp quang phổ trong định lượng

Để sử dụng phương pháp quang phổ trong định lượng cấu tử cần chuyển cấu tử cần phân tích về dạng hợp chất có khả năng hấp thu bức xạ điện từ vùng UV-Vis. Lưu ý rằng hợp chất này phải nằm ở dạng hòa tan trong dung dịch. Sau đó, tiến hành đo sự hấp thu bức xạ điện từ của hợp chất tạo thành để tính toán hàm lượng chất cần xác định thông qua các phương pháp: phương pháp trực tiếp, phương pháp so sánh, phương pháp đường chuẩn, phương pháp thêm chuẩn. Sau đây chúng tôi xin giới thiệu phương pháp đường chuẩn trong định lượng cấu tử.

15

16

CHƯƠNG 2.

PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM

được xác nhận cùng một lần.

MỤC ĐÍCH CỦA LẤY MẪU PHÂN TÍCH

2.1.

thuận người có hàng và người kiểm nghiệm), do cùng một cơ sở sản xuất và Đơn vị chỉ định lấy mẫu: đơn vị chứa trong lô hàng đồng nhất mà ta tiến

2.1.1. Mục đích

hành lấy mẫu ở đó.

Lấy mẫu sản phẩm nhằm mục đích thực hiện quá trình kiểm nghiệm thực phẩm. Việc lấy mẫu đúng qui cách sẽ góp phần làm cho kết quả kiểm nghiệm

Mẫu ban đầu: mẫu lấy ra từ một đơn vị chỉ định lấy mẫu, nó đại diện cho sản phẩm trong đơn vị chứa đó.

và xử lý kết quả sau này đúng đắn. Vì thực tế, chỉ một lượng mẫu rất nhỏ để

Mẫu chung: tập hợp các mẫu ban đầu của lô hàng đồng nhất.

kiểm nghiệm mà kết quả lại được dùng để đánh giá một cách khách quan chất

Mẫu thử trung bình: mẫu lấy ra từ một phần của mẫu chung sau khi đã trộn

lượng sản phẩm có khối lượng rất lớn.Vì lý do lấy mẫu đóng một vai trò rất quan trọng nhất trong đánh giá chất lượng lô sản phẩmnên mẫu phải phản ánh chính xác mọi đặc điểm chất lượng và phải đặc trưng cho thành phần trung bình của lô sản phẩm.

đều. Mẫu này đại diện cho sản phẩm của lô hàng đồng nhất, nó được dùng để kiểm nghiệm tất cả các chỉ tiêu chất lượng lô hàng.

Mẫu thử hoá học:mẫu lấy ra từ một phần của mẫu thử trung bình để tiến hành kiểm nghiệm các chỉ tiêu hóa học của sản phẩm.

Tùy thuộc vào đặc tính riêng biệt của lô sản phẩm mà có những quy định cho việc lấy mẫu khác nhau. Không thể đưa ra những quy tắc cụ thể cố định cho mọi tình huống mọi sản phẩm.

Mẫu thử cảm quan: mẫu lấy ra từ một phần của mẫu thử trung bình để tiến hành kiểm nghiệm các chỉ tiêu cảm quan của sản phẩm.

2.1.3. Lấy mẫu và gửi mẫu

Việc áp dụng kỹ thuật lấy mẫu trong quá trình phân tích phản ảnh đúng hay sai về thực tế chất lượng của sản phẩm mà mẫu đó đại diện, từ đó đưa ra những quyết định ảnh hưởng đến quyền lợi của nhà cung cấp, doanh nghiệp hoặc người tiêu dùng cũng như sức khỏe của cộng đồng.

Những yêu cầu khi lấy mẫu cần phải thực hiện một số qui định sau đây: Mẫu thực phẩm phải có đủ tính chất đại diện cho cả lô hàng thực phẩm đồng nhất.

Trước khi lấy mẫu cần kiểm tra tính đồng nhất của lô hàng, xem xét các

Căn cứ để lập phương án kiển tra là chuẩn mực chấp nhận (cỡ mẫu, các

giấy tờ kèm theo, đối chiếu nhãn trên bao bì, để riêng các sản phẩm có

thông tin khác). Để xác định cỡ mẫu ta căn cứ vào: cỡ lô, mức độ phức tạp và

bao bì không còn nguyên vẹn (rách, thủng, vỡ, mất nhãn...) phân chia số

nguồn kinh phí, tầm quan trọng của sản phẩm, các thông tin khác và bậc kiểm

còn lại thành lô hàng đồng nhất.

tra.

Số đơn vị chỉ định lấy mẫu của từng lô hàng đồng nhất được qui định

2.1.2. Một số khái niệm trong lấy mẫu

như sau:

Lô hàng đồng nhất: lô hàng bao gồm những sản phẩm cùng tên gọi, cùng loại về chất lượng, cùng khối lượng đựng trong bao bì cùng kiểu, được sản

Nếu lô hàng đồng nhất từ 1 đến 3 đơn vị chứa: số đơn vị chỉ định lấy mẫu là tất cả các đơn vị chứa trong lô hàng.

xuất cùng một công nghệ, sản xuất trong cùng một thời gian (tuỳ theo sự thỏa 17

18

Nếu lô hàng đồng nhất từ 4 đơn vị chứa mẫu trở lên: số đơn vị chỉ định lấy mẫu được tính theo công thức:

Khi lấy mẫu ở thể rắn đựng trong toa xe, thùng xe (thùng có dạng hình hộp chữ nhật) hay đổ thành đống hình nón, ta chia điểm lấy mẫu như hình sau:

C=K n Trong đó: C là số đơn vị chỉ định lấy mẫu n: số đơn vị chứa của lô hàng.

K: hệ số phụ thuộc vào dạng sản phẩm và đơn vị chứa trong lô hàng (K ≤ 1) K = 1 khi số đôn vị chứa trong lô hàng không quá lớn K < 1 khi số đơn vị chứa trong lô hàng lớn.

Nếu số dư của phép khai căn lớn hơn phần khai căn thì C = K*n, + 1 (n, là

Hình 2.1Những điểm lấy mẫu rắn khi mẫu ở dạng đống hay trên thùng

phần nguyên đã được khai căn) Khối lượng mẫu chung của các mặt hàng được qui định cụ thể theo từng loại sản phẩm nhưng không được ít hơn mẫu thử trung bình qui định

Đối với sản phẩm ở thể lỏng Nếu sản phẩm được chứa trong thùng, bể thì cầnphải khuấy đều, dùng ống cao su sạch khô, cắm vào các điểm đã chia để hút lấy mẫu

như phần dưới đây.

Khối lượng mẫu ban đầu bằng khối lượng mẫu chung chia cho số đơn vị chỉ lấy mẫu.

Khi lấy mẫu ban đầu cần chú ý đến trạng thái, tính chất của sản phẩm. Phải lấy ở nhiều vị trí khác nhau trong đơn vị chứa và trong lô hàng. Cụ thể như sau: Đối với sản phẩm ở thể rắn Cần chú ý sự không đồng đều về kích thước sản phẩm, cần phải lấy cả sản phẩm có kích thước lớn và kích thước bé. Thường ta tiến hành chia điểm để lấy mẫu tuỳ theo hình dạng của đơn vị chứa sản

Hình 2.2Những điểm lấy mẫu khi mẫu ở dạng lỏng Chia điểm khi lấy mẫu chất lỏng: Nếu lấy mẫu trên đường vận chuyển, thì thường ta lấy ở vòi chảy ra:

phẩm.

mở vòi cho chất lỏng chảy ra 5 phút rồi mới hứng để lấy mẫu. Khi lấy củng phải lấy ở nhiều thời gian khác nhau.

19

20

Hai phần mẫu được gởi ngay đến phòng thí nghiệm, kèm theo phiếu ghi nội dung sau:

Hình 2.3Mô tả lấy mẫu trên đường ống Đối với sản phẩm vừa ở thể rắn vừa ở thể lỏng không đồng nhất thì khi lấy mẫu, lấy ở các vị trí khác nhau nhưng phải lấy cả phần rắn, cả phần lỏng theo đúng tỷ lệ của chúng trong sản phẩm. Đối với sản phẩm sệt đồng nhất, khuấy kỹ và lấy mẫu đều ở các vị trí khác nhau. Đối với sản phẩm được đóng trong hộp, chai, lọ hoặc bao gói trong túi... thì lấy mẫu ở trong bao gói.

Tập trung mẫu ban đầu lấy được từ các đơn vị chỉ định lấy mẫu cho vào dụng cụ sạch, khô, trộn đều thành mẫu chung.

Mẫu thử trung bình được lấy tư mẫu chung. Khối lượng mẫu thử trung bình được qui định riêng cho từng sản phẩm, nhưng phải đủ để tiến hành phân tích các chỉ tiêu cần xác định (mỗi chỉ tiêu riêng biệt cần tiến hành 3 lần song song) và mẫu lưu theo qui định phần dưới đây. Sau khi đã lấy xong mẫu trung bình, lượng mẫu chung còn lại phải được trả lại lô hàng.

Chia mẫu thử trung bình làm 3 phần, tiến hành bao gói, bảo quản theo qui định của từng loại sản phẩm, không được làm cho tính chất chỉ tiêu cần xác định bị thay đổi. Trong đó:

21

Tên cơ quan chủ quản của đơn vị sản xuất

Tên cơ sở sản xuất

Tên và loại sản phẩm

Số hiệu và khối lượng lô hàng

Khối lượng mẫu gởi đến kiểm tra

Ngày, tháng, năm lấy mẫu

Lý do lấy mẫu

Yêu cầu kiểm tra các chỉ tiêu gì

Họ tên chức vụ người lấy mẫu

Trong hai phần mẫu gởi tới kiểm nghiểm thì một phần dùng để kiểm nghiệm còn một phần lưu lại phòng thí nghiệm.

Phần mẫu thử còn lại được giữ tại cơ sở làm đối chứng khi có khiếu nại.

Thời gian lưu mẫu không được quá thời gian bảo hành qui định cho từng loại sản phẩm.

Khi tiến hành lấy mẫu cần lưu ý: Dụng cụ đựng mẫu thử có thể là bao bì ban đầu của sản phẩm, hoặc được đóng gói trong những dụng cụ không làm ảnh hưởng đến sản phẩm, tốt nhất là trong những chai, lọ thuỷ tinh sạch có nút nhám.

Trường hợp mẫu phải gởi đi xa để kiểm nghiệm hoặc có nghi vấn, tranh chấp, phải đóng gói cẩn thận, phía ngoài dán niêm phong có đóng dấu, hoặc kẹp dấu xi cẩn thẩn tránh trường hợp mẫu bị đánh tráo.

Thực phẩm dể bị hư hỏng phải gởi mẫu gấp nhanh đến nơi kiểm nghiệm trong thời gian thực phẩm còn tốt.

22

gam thì tiến hành cắt thành từng khía ngang thân có chiều dài 2 tới 4

2.1.3.1. Nhận mẫu

Mẫu trung bình khi gởi tới phòng kiểm nghiệm cần tiến hành trình tự những công việc sau:

cm và cứ lấy một khúc loại bỏ một khúc Mẫu là các loại mắm:

Kiểm tra xem bao bì có hợp lệ không.

Đối với mắm loại sệt có phần nước và phần cái đồng nhất (mắm

Kiểm tra lại phiếu gửi kiểm nghiệm, biên bản lấy mẫu, nhãn dán, xác định loại thực phẩm...

tôm, mắm ruốt, mắm chua) trước khi lấy mẫu phân tích hoá học phải khuấy đều.

Xác định yêu cầu thực nghiệm.

Đối với các loại mắm mà phần cái và phần nước không đồng nhất

Ghi sổ nhận mẫu với những lời chỉ dẫn cần thiết.

như cá muối phải lọc qua màng vải tách riêng cái và nước rồi xử

Tiến hành kiểm nghiệm. Trường hợp có nhiều mẫu hàng chưa kiểm

lý như sau:

nghiệm được ngay một lúc thì phải bảo đảm điều kiện bảo quản để thực phẩm không bị thay đổi cho đến khi nghiểm kiểm.

o Phần nước: lọc kỹ qua giấy lọc vào bình tam giác có dung tích 250 ml sạch và khô, dùng ống hút lấy chính xác 10 ml dịch đã

Nếu mẫu không phù hợp phải lấy giấy tờ kèm theo hoặc bị mất dấu niêm phong, mất bì... thì không được nhận mẫu để phân tích

lọc và chuyển vào bình định mức 250 ml, thêm nước cất đến vạch mức, lắc đều: dung dịch dùng để phân tích những chỉ

Chuẩn bị mẫu thử hóa học

tiêu hoá học và chỉ được sử dụng trong thời gian 4 giờ kể từ

Mẫu thử là các hải sản tươi, khô, ướp màu tối phải loại bỏ các phần

khi pha loãng.

không ăn được: đầu, vẩy, da, vỏ, nội tạng, xương, nhưng không rữa.

o Phần cái: nếu là phần cái của các sản phẩm muối mặn, xử lý

Sản phẩm ướp đông phải làm tan băng trong không khí ở nhiệt độ

như sản phẩm là hải sản tươi, khô, ướp muối như đã nói ở

0

trong phòng đến khi nhiệt độ của sản phẩm đạt 5 C. Tuỳ theo kích thước (khối lượng) của sản phẩm để tiến hành xử lý mẫu như sau:

trên. o Nếu phần cái là các dạng mắm khác: nghiền nhuyễn, trộn đều

Sản phẩm có khối lượng nhỏ hơn 30 gam: xay nguyên con. Riêng tôm phải bóc vỏ, bỏ đầu mới xay nguyên con.

và chia làm hai phần: một phần để xác định các chỉ tiêu hóa học, phần còn lại dùng nước cất trích ly ra hai lần: lần 1 tỷ lệ

Sản phẩm có khối lượng từ 30 đến 500 gam, chỉ lấy phần thịt không có xương, da.

nước cất và cái tỷ lệ 1:1 (theo khối lượng), lần 2 tỷ lệ 0,5: 1.

Sau đó tập trung dịch lọc hai lần lại, đo thể tích rồi tiến hành

Sản phẩm có khối lượng trên 500 gam: sau khi mổ, loại bỏ nội tạng, tách da, tách xương, chỉ lấy phần thịt một bên (bên phải hoặc bên trái). Trong trường hợp phần thịt một bên có khối lượng lớn hơn 500

xác định thành phần hoá học của phần cái hoà tan trong nước. Đối với các loại mắm chế biến từ nguyên liệu thuỷ sản xử lý như phần lỏng ở trên. Đối với đồ hộp thủy sản:

23

24

Đối với đồ hộp có phần cái và nước riêng biệt: kiểm nghiệm phần

đi xác định ngay. Dụng cụ để lấy mẫu và nghiền mẫu không được làm

cái riêng, phần nước riêng.Phần cái được xử lý như ở phần

thay đổi tính chất hóa học của mẫu.

trước.Phần nước dùng để xác định hàm lượng những chất có khả năng trao đổi và hoà tan trong chất lỏng (xác định độ axit, kim

Ngoài ra, có thể tham khảo các cách lấy mẫu cho từng sản phẩm thực phẩm cụ thể sau :

loại hòa tan, H2S...) nhưng thời gian xác định không được sớm

Lấy mẫu kẹo (theo TCVN 4067 :1985).

hơn 15 ngày kể từ ngày xuất xưởng.

Lấy mẫu đường (theo TCVN 4837 :1989).

Đối với các loại đồ hộp đặc, ướp đông (có ít nước). Có thể gạn

Lấy mẫu khoai tây (theo TCVN 4999 :1989).

phần nước (thường là rất ít) vào chén sứ. Phần cái được xử lý như

Lấy mẫu rau quả tươi (theo TCVN 5102 : 1990).

phần ở trên, sau đó lại cho phần nước vào và trộn đều cho đến khi

Lấy mẫu rau quả chế biến (theo TCVN 5072 : 1990).

tất cả thành một khối đồng nhất.

Lấy mẫu gia vị (theo TCVN 4886 :1989; 4889 :1989).

Các mẫu thử được chuẩn bị theo những phương pháp xử lý ở

Lấy mẫu cà phê nhân (theo TCVN 5702 :1993).

trên, nhanh chóng được xay nhỏ hai lần qua máy xay thịt có sàng

Lấy mẫu sản phẩm sữa (theo TCVN 5531 : 1991; 6266 : 1997;

với đường kính lỗ sàng từ 2 đến 3 mm. Trộn đều và lấy từ 150

6267 :1997; 6400 :1998).

đến 200 g cho vào lọ thủy tinh miệng rộng có nút mài.Có thể dùng dao, kéo cắt mẫu thử và nghiền nhỏ trong cối sứ hoặc thủy

Lấy mẫu thịt và các sản phẩm thịt (theo TCVN 2833-1 :2002).

2.2.

Phương pháp lấy mẫu

2.2.1. Phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên

tinh.

Mẫu thử sau khi chuẩn bị xong, trong điều kiện bình thường phải

Thường sử dụng khi lô hàng có số lượng nhỏ, được phân bố trong một

tiến hành phân tích ngay trong vòng 4 giờ kể từ khi chuẩn bị mẫu

phạm vi hẹp như nhà kho. Mẫu được lấy ở những vị trí bất kỳ. Mỗi cá thể

thử.

trong lô hàng được chọn vào mẫu với cùng một xác suất bằng nhau.Nếu như tổng số cá thể trong lô hàng là N, kích thước thước mẫu là n thì xác suất đó sẽ

Chú ý: Nếu không kiểm nghiệm ngay được thì phải bảo quản mẫu ở nhiệt độ

bằng tỷ số giữa tổng số cá thể và kích thước mẫu. Để thực hiện lấy mẫu bằng

thấp hoặc có sấy mẫu hoặc đun nóng khoảng một giờ để bảo quản (chỉ

phương pháp này cần mã hóa các cá thể trong lô hàng bằng dãy số ngẫu nhiên.

áp dụng việc sấy mẫu hoặc đun nóng trong trường hợp xác định các

Khi đó, cá thể được chọn theo sự ngẫu nhiên của con số.

thành phần hóa học dưới tác dụng của nhiệt độ không làm thay đổi các

Ưu điểm của phương pháp này là không cần nhiều thông tin về lô hàng, có thể tính được sai số do chọn mẫuvà dễ dàng thực hiện các phương pháp thống

thành phần đó).

Khi xác định độ ẩm của thực phẩm nếu nghiền mẫu quá nhiều thì

kê, kiểm định giả.

nước sẻ mất vì vậy khi thao tác phải thật nhanh, nghiền xong phải đem 25

26

2.2.2. Phương pháp lấy mẫu phi ngẫu nhiên

CHƯƠNG 3.

CÁC KỸ THUẬT CHUẨN BỊ MẪU TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM

Phương pháp chọn mẫu phi ngẫu nhiên hay còn gọi là chọn mẫu phi xác suất (non-probability sampling methods). Với phương pháp này các đơn vị

Xử lý mẫu trong phân tích thực phẩm là khâu hết sức quan trọng, một

trong lô hàng không có khả năng bằng nhau để được chọn vào mẫu nghiên

trong những yếu tố ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả phân tích.Tuỳ đối

cứu.

tượng mẫu, tuỳ từng chỉ tiêu phân tích mà phải có cách xử lý khác nhau.

Phương pháp này được sử dụng khi đó, mỗi cá thể được lựa chọn vào một theo một cách thuận tiên, sẵn có và dễ tiếp cận do nhanh và chi phí thấp. Được sử dụng trong nghiên cứu khám phá, để xác định ý nghĩa thực tiễn hoặc để

3.1.

YÊU CẦU CHUNG CỦA CÁC KỸ THUẬT XỬ LÝ MẪU PHÂN TÍCH

3.1.1. Giới thiệu xử lý mẫu

Xử lý mẫu là quá trình hoà tan (dissolution) và phân huỷ (digestion), phá huỷ cấu trúc mẫu ban đầu lấy từ đối tượng cần phân tích, để giải phóng và

khảo sát sơ bộ.

chuyển các chất cần xác định về một dạng đồng thể phù hợp (ví dụ dạng dung dịch) cho một phép đo đã chọn để xác định hàm lượng của chất mà chúng ta mong muốn.

Ví dụ: Hòa tan mẫu hợp kim Al trong axit HNO3 45% để được dung dịch xác định Al và các tạp kim loại trong hợp kim Al. Xử lý mẫu có hai quá trình xảy ra đồng thời là: Pháhuỷ cấu trúc ban đầu của chất mẫu (digestion of sample Matrix).

Hòa tan giải phóng chất cần xác định về dạng dung dịch đồng thể.

Quá trình xử lý thường được tiến hành tại phòng thí nghiệm trước khi thực hiện kiểm nghiệm. Tuy nhiên, trong một số trườnghợp mẫu cần phải được xử lý sơ bộ ngay trước khi mang mẫu về phòng thí nghiệm vì những mẫu này rất dễ bị biến đổi khi lấy chúng ra khỏi lô hàng.

3.1.2. Tại sao phải xử lý mẫu phân tích

Để đưa các chất cần xác định về một trạng thái thích hợp với phép đo, theo phương pháp phân tích đã chọn.

Các kết quả phân tích phải phản ánh và đại diện đúng cho đối tượng cần nghiên cứu, theo dõi.

27

28

Với bất kỳ một phương pháp xác định, mỗi chất phân tích chỉ có thể được

Các chất cần xác định tồn tại ở trạng thái liên kết hoá học khác nhau, trong

xác định chính xác khi nó tồn tại ở một trạng thái nhất định và đồng nhất phù

các hợp chất vô cơ, hữu cơ khác nhau, có khi rất bền vững, lượng chất ở mỗi

hợp với kỹ thuật phân tích.

vị trí trong mẫu cũng không đồng đều, nên không thể xác định đúng hàm

Ví dụ: Để xác định các kim loại (ví dụ: Fe, Cu, Mn...) trong mẫu thịt, chúng ta không thể bỏ ngay mẫu thịt vào máy quang phổ hấp thụ nguyên tử để

lượng của nó trong một tổ hợp phức tạp, bền vững và bị các nguyên tố, các chất liên kết khác cản trở.

đo mà cần phải đưa các kim loại tồn tại trong mẫu về trạng thái ion hay hợp

Vì vậy muốn phân tích một đối tượng nào, chúng ta phải lấy mẫu, xử lý

chất tan được trong dung dịch nước, sau đó mới xác định được chúng trong

phù hợp để có được một trạng thái hay một dung dịch mẫu phân tích xác định

dung dịch này.

các chất mong muốn.

Mẫu phân tích có nhiều chủng loại, rất đa dạng, từ loại có thành phần đơn

Việc xử lý mẫu theo cách nào, là tuỳ thuộc vào:

giản đến loại có thành phần phức tạp. Chúng có thể tồn tại ở các trạng thái

Đối tượng mẫu, matrix của mẫu.

khác nhau như rắn từng cục, từng mảnh, hay lỏng, khí, huyền phù nên không

Bản chất, tính chất của các chất cần phân tích.

thể cho nguyên mẫu như thế vào thiết bị phân tích để xác định được.

Trạng thái tồn tại, cấu trúc vật lý, hoá học của các chất trong mẫu.

Phương pháp phân tích được lựa chọn để xác định chúng.

Hàm lượng của chất cần xác định ở mức nào trong mẫu.

Trên cơ sở các yếu tố đó, chúng ta sẽ lựa chọn được biện pháp xử lý phù hợp cho chất phân tích. Các kỹ thuật xử lý mẫu phân tích đã và đang được sử dụng phổ biến hiện nay đó là: Kỹ thuật vô cơ hoá khô (xử lý khô), Kỹ thuật vô cơ hoá ướt (xử lý ướt), Kỹ thuật vô cơ hoá khô- ướt kết hợp, Các kỹ thuật trích ly (trích ly lỏng-lỏng, trích ly rắn-lỏng, trích ly rắn – khí...)

3.2.

KỸ THUẬT VÔ CƠ HÓA ƯỚT (XỬ LÝ ƯỚT)

3.2.1. Vô cơ hóa ướt bằng axit mạnh đặc nóng 3.2.1.1. Nguyên tắc và bản chất

Nguyên tắc chung

29

30

Dùng axit mạnh đặc và nóng (ví dụ HCl, H2SO4), hay axit mạnh, đặc và

Nhiệt độ sôi của hỗn hợp mẫu khi xử lý mẫu phụ thuộc vào nhiệt độ sôi

nóng có tính oxy hoá mạnh (HNO3, HClO4), hoặc hỗn hợp 2 axit (HNO3 +

của dung dịch axit dùng để phân huỷ mẫu. Khi cần nhiệt độ sôi cao thì phải

H2SO4), hay 3 axit (HNO3 + H2SO4 + HClO4), hoặc là 1 axit đặc và một chất oxy hoá mạnh (H2SO4 + KMnO4), v.v. để phân huỷ mẫu trong điều kiện đun nóng trong bình Kendan, trong ống nghiệm, trong cốc hay trong lò vi sóng.

dùng dung dịch axit có nhiệt độ sôi cao (bảng 2.1). Trong hệ kín áp suất cao sẽ tạo ra nhiệt độ sôi cao, tuỳ thuộc vào loại axit dùng để phân huỷ mẫu.

Tất nhiên khi dùng hỗn hợp, thì nhiệt độ sôi của dung dịch axit hỗn hợp sẽ phụ thuộc vào thành phần của hỗn hợp axit ta dùng và nhiệt độ sôi của dung

Lượng axit cần dùng để phân huỷ mẫu thường gấp 10 - 15 lần lượng mẫu, tuỳ thuộc mỗi loại mẫu và cấu trúc vật lý hoá học của nó.

dịch phân huỷ sẽ nằm giữa nhiệt độ sôi của hai axit được trộn với nhau. Vì thế với các chất mẫu khó phân huỷ (khó xử lý) chúng ta phải dùng các axit và hỗn

Thời gian phân huỷ mẫu (xử lý) trong các hệ hở, bình Kendan, ống

hợp axit có nhiệt độ sôi cao và tính oxy hoá mạnh.

nghiệm, cốc... thường từ vài giờ đến hàng chục giờ, cũng tuỳ loại mẫu, bản chất của các chất. Còn nếu trong lò vi sóng hệ kín thì chỉ cần 50 - 90 phút.

Các dung dịch axit dùng để hoà tan và xử lý mẫu

Bảng 3.1Nhiệt độ sôi của các dung dịch axit đặc

Khi xử lý ướt, người ta thường dùng các loại dung dịch axit đặc và có tính oxy hoá mạnh, song tất nhiên chọn loại axit nào là tuỳ thuộc vào bản chất của chất nền (matrix) của mẫu và chất phân tích tồn tại trong mẫu đó. Chẳng hạn như:

Với axit đơn Axit

HCl

HNO3

H2SO4

H3PO4

HClO4

HF

Nồng độ(%)

36

65

98

78

72

40

110

121

280

213

203

120

o

T(sôi) C

Dùng 1 axit đặc: HCl, HF, H3PO4, H2SO4,

Với hỗn hợp axit

Dùng 1 axit có tính oxy hoá: HNO3, H2SO4, HClO4, Hỗn

hợp

2

axit:

Cường

thuỷ,

(HCl+HNO3),(HNO3+H2SO4),(HF+H2SO4)

Loại hỗn hợp của

Thành phần (V/V)

o

Nhiệt độ sôi C

Hỗn hợp 3 axit: (HCl + HNO3 + H2SO4), ( HNO3 + H2SO4 + HClO4)

(HCl + HNO3)

3/1

116-118

Hỗn hợp 1 axit và chất oxy hoá: (H2SO4+ KMnO4), (HNO3+H2O2)

(HNO3+ H2SO4)

4/1

130-135

Hỗn hợp 2 axit và 1 chất oxy hoá mạnh: (HNO3+ H2SO4+ KMnO4)

(HNO3+ H2SO4 )

3/2

150-155

Dung dịch muối có pH nhất định: (KCl 1M, pH=5, NH4Ac 1M,

(HNO3+ H2SO4 + HclO4 )

4/2/2

137-140

2/1

130-150

2/1/1

120-130

pH=6)

(HF+ H2SO4 )

Nhiệt độ dung dịch phân huỷ mẫu

(HNO3+ H2SO4 + HF) 31

32

Sự khuếch tán đối lưu, chuyển động nhiệt và va chạm của các hạt

3.2.1.2. Các kỹ thuật vô cơ hóa ướt

Việc xử lý mẫu theo phương pháp ướt, có thể được thực hiện trong các

mẫu với nhau làm chúng bị bào mòn dần.

Các tác nhân này tấn công và bào mòn dần các hạt mẫu từ ngoài vào, làm

thiết bị và dụng cụ khác nhau.

cho các hạt mẫu bị mòn dần dần, bé dần rồi tan mất hết, khi chúng ta đun mẫu

a. Trong điều kiện thường Xử lý trong cốc thuỷ tinh, khi đun nóng trên bếp điện hay nồi cách

trong bình Kendan hay trong cốc trong một thời gian nhất định.

Trong lò vi sóng:

thuỷ.

Ngoài các tác nhân phân huỷ như trên, trong lò vi sóng còn có sự phá vỡ từ

Xử lý trong bình Kendan thường khi đun nóng

trong lòng hạt mẫu ra ngoài, do các phân tử nước hấp thụ (>90%) năng lượng

Xử lý trong bình Kendan có ống sinh hàn hồi lưu dung môi, v.v. b. Trong hộp kín: Mẫu để trong hộp kín, thêm dung dịch axit để phân huỷ

vi sóng và nó có động năng rất lớn, nên chúng có chuyển động nhiệt rất mạnh, làm căng và xé các hạt mẫu từ trong ra. Thêm vào đó lại là hệ kín, nên có áp

mẫu, đậy kín, sau đó thực hiện phân huỷ bằng cách: Sấy trong tủ sấy, trên bếp cát, hoặc trong lò nung ở nhiệt độ thích

suất cao và sẽ làm nhiệt độ sôi lại cao hơn và đây là tác nhân phân huỷ mạnh nhất, do đó thúc đẩy quá trình phân huỷ mẫu rất nhanh từ trong ra và từ ngoài

hợp.

Ngâm hay luộc hộp mẫu trong nồi nước sôi, hay trong dầu sôi, v.v.

vào. Vì thế nên việc xử lý mẫu trong lò vi sóng chỉ cần thời gian ngắn (30 - 70

c. Xử lý mẫu trong lò vi sóng (trong hệ kín và hở)

phút) mà lại triệt để.

Trong các hệ lò vi sóng đơn giản và điều khiển bằng tay:

Các quá trình xảy ra khi phân huỷ mẫu Dưới tác dụng của axit đặc và năng lượng nhiệt (nhiệt độ), cả năng lượng

Hệ bình mẫu hở,

vi sóng, các quá trình vật lý và hoá học sau đây sẽ xảy ra:

Hệ bình mẫu đóng kín (có áp suất cao),

Sự phá vỡ mạng lưới cấu trúc của hạt chất mẫu, giải phóng các chất

Trong các hệ nhiều bình và hoạt động theo chương trình lập trình:

phân tích, để đưa chúng vào dung dịch dưới dạng các muối tan.

Hệ bình mẫu hở có khống chế nhiệt độ.

Hệ bình mẫu đóng kín (áp suất cao), có khống chế nhiệt độ, áp suất...

Quá trình oxy hoá khử làm thay đổi hoá trị, chuyển đổi dạng, làm tan

Hiện nay kỹ thuật xử lý ướt với axit đặc có tính oxy hoá mạnh trong bình

vỡ các hạt vật chất mẫu, để giải phóng chất phân tích về dạng muối tan.

kendan và trong lò vi sóng hệ kín đang được dùng nhiều nhất.

Nếu xử lý mẫu hữu cơ phân tích kim loại, thì có sự đốt cháy, phá

3.2.1.3. Cơ chế và các tác nhân phân huỷ mẫu

huỷ các hợp chất hữu cơ và mùn tạo ra khí CO2 và nước, để giải

Cơ chế của sự phân huỷ mẫu

phóng các kim loại trong chất mẫu hữu cơ về dạng muối vô cơ tan

Trong điều kiện thường hệ hở, thì tác nhân phân huỷ mẫu là:

trong dung dịch.

Tác dụng phá huỷ và hoà tan mẫu của axit, Tác nhân năng lượng nhiệt, làm tan rã các hạt mẫu cùng với axit, 33

34

Tạo ra hợp chất dễ bay hơi, làm mất đi các anion trong phân tử chất

muối vô cơ tan trong dung dịch nước theo phương trình tổng quát

mẫu, làm mẫu bị phân huỷ tạo ra các hợp chất tan trong dung dịch.

như sau: (Mẫu) + HNO3 + H2O2 → Men(NO3)m + H2O + CO2+ NO2

Sự tạo thành các hợp chất hay muối phức tan trong dung dịch.

Có thể tách chất phân tích ra khỏi mẫu ban đầu ở dạng kết tủa không

(muối tan của kim loại )

tan và nhờ đó người ta tách được các chất phân tích và làm giàu

3.2.1.4. Ưu nhược điểm và ứng dụng

chúng.

Ưu và nhược điểm:

Như vậy, trong quá trình xử lý mẫu ở đây cũng có thể có các phản ứng hoá

Hầu như không bị tổn thất các chất phân tích, nhất là trong lò vi

học xảy ra như phản ứng oxy hoá khử, phản ứng thuỷ phân, phản ứng tạo

sóng,

phức, phản ứng hoà tan, phản ứng kết tủa, v.v. của các phần tử chất mẫu với

Nhưng thời gian phân huỷ mẫu rất dài khi xử lýở điều kiện thường –

các axit dùng để phân huỷ mẫu và các chất có trong mẫu với nhau. Trong đó

hệ hở,

quá trình nào là chính hay phụ là do thành phần, chất nền, bản chất của chất

Tốn nhiều axit đặc tinh khiết cao, nhất là trong các hệ hở,

mẫu và các loại axit dùng để phân huỷ và hoà tan mẫu quyết định.

Dễ bị nhiễm bẩn khi xử lý trong hệ hở, do môi trường hay axit dùng,

Ví dụ về kỹ thuật xử lý ướt

Phải đuổi axit dư khi kết thúc quá trình xử lý nên dễ làm nhiễm bẩn, bụi vào mẫu, v.v.

Xử lý mẫu rau quả bằng hỗn hợp 2 axit (HNO3 + H2O2 trong bình Kendanđể xác định hàm lượng các kim loại nặng (Cd, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb,

Ứng dụng: Ứng dụng chủ yếu của kỹ thuật xử lý ướt này là để xử lý mẫu xác định các

Zn). Quá trình được thực hiện như sau:

-

Lấy 5.00 g mẫu đã nghiền mịn và trộn đều vào bình Kendan

-

-

3-

2-

kim loại và một số phi kim hay anion vô cơ, như Cl . Br , I , AsO4 , SO4 ,

Bổ sung thêm 60 mL HNO3 65%, 5 mL H2O2 30%

3-

Cắm phễu nhỏ vào bình kendan, lắc đều và đun sôi nhẹ cho mẫu phân huỷ, đến khi được dung dịch trong không màu (6-8 giờ tuỳ loại mẫu).

Chuyển mẫu sang cốc 250 mL, làm bay hơi hết axit bằng đèn IR đến còn muối ẩm, để nguội, định mức bằng dung dịch HCl 2% thành 25 mL.

2

PO4 , SiO3 … trong các mẫu sinh học, mẫu hữu cơ, mẫu vô cơ, mẫu môi trường, mẫu đất, mẫu nước, mẫu bụi không khí, mẫu kim loại, hợp kim, rau quả và thực phẩm, v.v.

3.2.2. Kỹ thuật vô cơ hóa ướt bằng dung dịch kiềm mạnh đặc nóng 3.2.2.1. Nguyên tắc chung

Trong kỹ thuật này này, người ta thường dùng các dung dịch kiềm mạnh, đặc nóng (như NaOH, KOH 15 - 20%), hay hỗn hợp của kiềm mạnh và muối

Trong quá trình xử lý, các nguyên tố kim loại ở dạng các hợp chất cơ kim của mẫu rau quả, sẽ bị axit đặc oxy hoá đưa các kim loại về các 35

kim loại kiềm (như NaOH + NaHCO3), hay một kiềm mạnh và peroxit (như KOH + Na2O2), nồng độ lớn (10 - 20%), để phân huỷ mẫu phân tích trong 36

điều kiện đun nóng trong bình Kendan hay trong hộp kín, hoặc trong lò vi

Hỗn hợp kiềm, muối và peroxit (KOH + NaHCO3+ H2O2),

sóng.

Hỗn hợp kiềm, muối và peroxit kiềm (KOH + NaHCO3+ Na2O2)…

Những thông số của quá trình: Lượng dung dịch: cần lượng lớn từ 8-15 lần lượng mẫu.

Thời gian phân huỷ: từ 4 - 10 giờ trong hệ hở.

Còn trong hệ lò vi sóng kín chỉ cần thời gian 1 - 2 giờ.

Nhiệt độ phân huỷ: nhiệt độ sôi của dung dịch kiềm. Nó thường trong vùng 150 – 2000C. Các quá trình xảy ra khi phân huỷ mẫu Dưới tác dụng của kiềm và nhiệt độ, cả năng lượng vi sóng, có thể xảy ra các quá trình sau: Phá vỡ cấu trúc của chất mẫu, chuyển các chất của mẫu vào dung dịch Các chất của mẫu tương tác với kiềm tạo ra các sản phẩm tan được Có thể sinh ra các khí bay ra, giúp sự tan của mẫu tốt hơn Có thể tạo ra các hợp chất bền ít phân li và tan trong dung dịch Tạo ra các sản phẩm kết tủa muối khác của chất phân tích để tách nó ra khỏi mẫu ban đầu.

Các cách hoà tan và dung dịch hoà tan Chất phân huỷ: Theo kỹ thuật xử lý ướt này chúng ta có thể dùng các dung dịch của các chất sau đây để xử lý mẫu: Dung dịch kiềm đặc (20 - 25 % NaOH, hay KOH), Dung dịch kiềm đặc nóng có chất oxy hoá mạnh (NaOH + Na2O2), Hỗn hợp kiềm đặc nóng có chất khử (KOH + NaHSO3), Hỗn hợp kiềm mạnh và muối (NaOH + NaHCO3), (KOH + Na2CO3), 37

38

Quá trình phân huỷ

Kỹ thuật xử lý ướt bằng dung dịch kiềm đặc nóng cũng có ưu điểm là hầu

Quá trình phân huỷ được thực hiện khi đun sôi dung dịch mẫu, trong một thời gian nhất định trong bình Kendan hay trong ống nghiệm,

như không làm mất các chất phân tích, nhất là các nguyên tố có hợp chất dễ bay hơi và các nguyên tố và các matrix của mẫu dễ tan trong kiềm.

thường là từ 6 -10 giờ trong bình kenđan hở, trong lò vi sóng hệ kín (có áp suất cao) thì chỉ mất khoảng 40 - 70 phút, tuỳ loại mẫu.

Nhưng kỹ thuật này có một nhược điểm lớn là tốn rất nhiều kiềm tinh khiết cao, thường phải dùng gấp từ 10 – 15 lượng mẫu, khả năng gây nhiễm bẩn dễ

Cơ chế phá vỡ (phân huỷ) mẫu theo cách này cũng tương tự như

xảy ra. Lượng kiềm dư nhiều, sau khi xử lý xong thường phải loại hết, nhưng

trong trường hợp dùng các axit ở trên, trong hệ hở hay hệ kín, nhưng

rất khó, chỉ bằng cách trung hoà bằng axit, song lại làm loãng mẫu và dễ dàng

ở đây tác nhân phân huỷ là dung dịch kiềm mạnh nóng.

nhiễm bẩn, mất thời gian cô đặc mẫu. Đây là một công việc rất khó khăn và

Nhiệt độ phân huỷ

mất nhiều thì giờ và cũng hay làm nhiễm bẩn mẫu. Vì thế kỹ thuật này chỉ

Nhiệt độ sôi của các dung dịch kiềm là tuỳ thuộc vào thành phần và nồng

được dùng cho một số trường hợp, mà cách xử lý bằng axit không đem lại

độ của dung dịch kiềm ta sử dụng để xử lý mẫu. Nói chung trong vùng từ 115

hiệu quả.

o

– 230 C, tuỳ thuộc nồng độ của kiềm và muối có trong dung dịch phân huỷ

Ví dụ phân huỷ mẫu xác định một số anion vô cơ, phi kim hay á kim, như

mẫu và đây là một yếu tố thúc đẩy sự phân huỷ xảy ra nhanh hơn. Nghĩa là tác

các chất: Cl , Br , NO3 , SO4 , PO4 … trong các đối tượng mẫu sinh học và

nhân phân huỷ mẫu ở đây là kiềm và nhiệt độ (năng lượng nhiệt) và năng

một số mẫu thực phẩm không xử lý được bằng phương pháp axit.

1-

lượng vi sóng, nếu dùng lò vi sóng.

1-

1-

2-

3-

Phạm vi áp dụng: Kỹ thuậtnày thích hợp cho:

Ví dụ ứng dụng kỹ thuật vô cơ hóa ướt bằng kiềm đặc nóng: Hoà tan oxit

Các hợp chất hay các mẫu tan tốt trong kiềm.

nhôm bằng dung dịch NaOH 10% nóng: Lấy 0,5g mẫu dạng bột vào bình

Phân huỷ các chất hữu cơ để lấy các phi kim.

Kendan, tẩm ướt bằng vài giọt nước cất, thêm 10 mL NaOH 10%, đun sôi để hoà tan mẫu.

3.3.

KỸ VÔ CƠ HÓA KHÔ

3.3.1. Nguyên tắc và các quá trình xảy ra khi vô cơ hóa mẫu

Cơ chế ở đây là chuyển trạng thái tinh thể rắn oxit sang ion tan trong dung

3.3.1.1. Nguyên tắc

Kỹ thuật xử lý khô (vô cơ hóa khô) là kỹ thuật nung để xử lý mẫu trong lò

dịch là muối NaAlO2 và khí hydro theo phản ứng:

o

nung ở một nhiệt độ thích hợp (450 - 750 C), song thực chất đây chỉ là bước

Al2O3 + NaOH → H2 + NaAlO2 + H2O

đầu tiên của quá trình xử lý mẫu. Vì sau khi nung, mẫu bã còn lại phải được

3.2.2.2. Ưu nhược điểm và phạm vi ứng dụng

hoà tan (xử lý tiếp) bằng dung dịch muối hay dung dịch axit phù hợp, thì mới

Ưu nhược điểm

chuyển được các chất cần phân tích trong tro mẫu vào dạng dung dịch, để sau

39

40

đó xác định nó theo một phương pháp đã chọn. Khi nung các chất hữu cơ của mẫu sẽ bị đốt cháy thành các hợp chất vô cơ.

Các loại chất phụ trợ (phụ gia) Kỹ thuật tro hoá khô thường được dùng cho các mẫu hữu cơ, xử lý để xác

Nhiệt độ nung

định các kim loại, và các mẫu quặng vô cơ có cấu trúc bền vững rất khó tan o

Nhiệt độ nung xử lý mẫu thường trong vùng 450 - 750 C, tuỳ thuộc vào

trong các axit mạnh. Việc tro hoá cũng có thể được thực hiện khi có thêm chất

mẫu (chất nền và cấu trúc của nó) và các chất cần phân tích và đó là yếu tố

phụ gia, chất bảo vệ hay chất chảy. Các chất bảo vệ và chất chảy thường hay

quyết định. Nhưng phải đảm bảo đốt cháy được hết các chất hữu cơ và không

được dùng là:

làm mất chất phân tích. Ví dụ khi nung xử lý các mẫu rau quả và thực phẩm ở o

Các axit: HNO3, H2SO4, H3PO4,

nhiệt độ từ 500 – 550 C, để xác định các kim loại nặng, các kim loại kiềm và

Một số muối: KNO3, Ca(NO3)2, Mg(NO3)2, LiBO2, Na2B4O7,

kiềm thổ. Song nếu không có chất phụ gia bảo vệ thì thường các nguyên tố

Hỗn hợp axit và muối: (Mg(NO3)2+ HNO3), (HNO3 + H2SO4),

Cd, Pb, Zn... có thể bị mất từ 10 - 15% mà chúng ta không khống chế được.

Hỗn hợp kiềm và muối: (KOH + NaHCO3), (KOH + Na2SO4),

Nhiệt độ nung thường phụ thuộc vào:

Hỗn hợp muối và peroxit: (KHCO3 + Na2O2), (NaHCO3 +

Bản chất của chất mẫu và chất phân tích,

Na2O2),

Cấu trúc, dạng liên kết, loại hợp của các chất trong mẫu,

Hỗn hợp kiềm mạnh và peroxit: (NaOH + Na2O2), (KOH +

Thời gian nung: Có thể từ 5 – 12 giờ, tuỳ thuộc vào:

Na2O2).

Mỗi loại chất mẫu Mỗi chất phân tích

Hỗn hợp kiềm, muối và chất oxyhóa (KOH + NaHCO3+ Na2O2).

Cấu trúc, dạng liên kết, loại hợp của các chất trong mẫu

Hỗn hợp kiềm và muối pyrosnphat (KOH + Na2S4O7), v.v.

Các chất phụ gia này có hai tác dụng: Bảo vệ các chất phân tích không bị mất Góp phần làm cho mẫu được phân huỷ nhanh và triệt để hơn 3.3.1.2. Những quá trình xảy ra khi xử lý

Trong quá trình nung xử lý mẫu có thể có nhiều quá trình vật lý và hoá học xảy ra, tuỳ theo bản chất, thành phần của mỗi loại mẫu và chất phụ gia được thêm vào, đó là các quá trình: Trước tiên làm bay hơi mất nước hấp thụ và nước kết tính trong chất mẫu, 41

42

3.3.2. Thiết bị và dụng cụ để xử lý khô

Sự tro hoá, đốt cháy các chất mùn và các chất hữu cơ của mẫu,

Các thiết bị để xử lý mẫu theo phương pháp khô thường không có nhiều.

Phá vỡ cấu trúc ban đầu của chất mẫu, Chuyển dạng các hợp chất phức tạp của chất mẫu về dạng đơn giản

Thông thường mẫu được cho vào chén hay bát nung (thạch anh, sứ, Ni, Fe, hay Pt, hoặc Au, hay W,..) có dung tích khác nhau (từ 30 - 200 mL). Sau đó

hơn, Quá trình oxy hoá khử thay đổi hoá trị của nguyên tố trong các chất

được nung tại nhiệt độ phù hợp trong lò nung.

Dụng cụ chứa đựng mẫu để nung:

mẫu, Giải phóng ra một số khí, như CO, CO2, SO2,..

Các loại chén nung thạch anh, sứ, graphit, platin, vàng, zirconi, v.v.

Có một số tương tác hoá học của các chất với nhau, tương tác với

Các loại bát nung thạch anh, sứ, kim loại (platin, vàng, zirconi), v.v.

Các loại chén và bát Teflon chịu nhiệt.

chất phụ gia thêm vào tạo ra các chất lúc đầu không có.

Tất cả các quá trình đó đều góp phần làm tan vỡ cấu trúc ban đầu của các

Thiết bị để nung mẫu có hai loại chính:

hạt mẫu tạo ra tro bã mẫu, để sau đó hoà tan chất phân tích vào dung dịch axit.

Thiết bị thông thường: Tủ sấy và lò nung các loại.

Đó là những quá trình có thể xảy ra, tất nhiên là đa dạng và phức tạp, nó xảy

Thiết bị hiện đại: Các loại lò vi sóng và lò cao tần, v.v.

ra như thế nào là tuỳ thuộc vào các yếu tố sau đây: Thành phần, chất nền và trạng thái liên kết của chất mẫu và chất phân tích, Các chất phụ gia, chất chẩy và chất bảo vệ thêm vào mẫu, Bảng 3.2 Các quá trình trong xử lý khô trong lò nung

Các điều kiện nung, trong đó nhiệt độ là yếu tố chính, sau đó là môi trường nung là không khí, hay trong khí trơ (Ar, N2, He,..).

43

Phụ gia

Nhiệt độ

Sản phẩm sau khi nung

Đất sét

KOH+Na2O2

550-650

Na2SiO3+K2SiO3+H2O

Quặng Silicat

KOH+Na2O2

500-600

Na2SiO3+K2SiO3+H2O+MeX

Quặng Ferrit

550-600

FeO+Fe2O3+SO2+H2O

Quặng CuS

550-600

CuO+SO2+H2O + MenXm

Dolomit

550-650

CaO+MgO+H2O+CO2+ MenXm

LnCO3FxH2O

550-650

Ln2O3+CO2+HF+H2O +MenXm

Nhựa đường

550-650

MexOy+CO2+SO2+H2O+MenX m

Loại mẫu

44

Thực phẩm

KNO3+HNO3

500-550

MexOy+CO2+H2O+ KxXy+NO

Rau quả

KNO3+HNO3

500-550

MexOy+CO2+H2O+ KxXy+NO

Rau quả

500-550

MexOy+CO2+H2O+MenXm

Chất hữu cơ

500-600

MexOy + CO2 + H2O + (NOx)

Chẳng hạn: Tro hoá khô mẫu rau quả để xác định các kim loại (Na, K, Ca, Mg, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb, Zn).

Cân lấy 5 g, mẫu đã nghiền mịn vào trong chén thạch anh, đem sấy từ từ o

cho đến khi mẫu khô đen, rồi đem nung 3 giờ đầu ở nhiệt độ 450 C, sau đó o

nâng lên 550 C, cho đến khi mẫu hết than đen, sẽ được tro mẫu trắng. Hoà tan

3.3.3. Vô cơ hoá khô không có phụ gia và chất bảo vệ

Nung để xử lý mẫu không có phụ gia và chất bảo vệ là quá trình xử lý mẫu

tro thu được trong 12 - 15 mL dung dịch HCl 18% và 0.5 mL HNO3 65%, đun

sơ bộ nhờ tác dụng của năng lượng nhiệt thích hợp trong một thời gian nhất

nhẹ cho tan hết, đuổi hết axit dư đến còn muối ẩm và định mức thành 25 mL

định, để phá vỡ cấu trúc tinh thể dạng ban đầu của mẫu phân tích, đốt cháy

bằng dung dịch HCl 2%. Các nguyên tố Cd, Cu, Pb, Zn sẽ bị mất một ít (10 -

chất hữu cơ, chuyển nó sang dạng các hợp chất khác đơn giản, dễ hoà tan tiếp

15%) khi nung. Phương pháp này thích hợp để xác định các kim loại nhóm I,

bằng dung dịch axit hay bằng dung dịch kiềm nhằm đưa chất phân tích vào

II và Fe, Mn, Ni.

dung dịch, sau đó có thể xác định được chúng theo một phương pháp nhất định.

Theo cách này, thông thường một số nguyên tố trong mẫu sẽ có thể bị mất khi nung, như Cd (10 - 15%), Cu (7 - 12%), Pb (15 - 20%)... Và hàm lượng bị mất đi này lại không kiểm soát và không khống chế được trong quá trình nung. Sự mất này càng nhiều khi nung mẫu ở nhiệt độ càng cao, hay thời gian o

nung càng lâu. Như ví dụ 1 ở trên, nếu nung mẫu ở nhiệt độ 550 C, Cd, và Pb o

sẽ mất từ 2 - 10%, khi ở 600 C, thì Cd và Pb sẽ mất đến 18 - 20%... Đó là vấn đề cần phải chú ý.

3.3.4. Vô cơ hoá khô có phụ gia và chất bảo vệ

Tro hoá khô có phụ gia và chất bảo vệ cũng là quá trình xử lý mẫu sơ bộ o

nhờ tác dụng của nhiệt độ thích hợp (500 - 600 C ), có thêm tương tác hỗ trợ của chất phụ gia để hạn chế sự mất một số nguyên tố như cách nung không phụ gia ở trên. Các chất phụ gia thường là các chất chảy, muối kiềm, axit đặc để phá vỡ cấu trúc tinh thể dạng ban đầu của mẫu phân tích, để chuyển nó sang một dạng khác dễ hoà tan tiếp bằng axit.

Khi có chất chảy và chất phụ gia nhiệt độ nung thường thấp hơn khi không có chất chảy, thời gian ngắn hơn, song lại triệt để hơn, mà lại không mất chất 45

46

phân tích. Nhất là các mẫu có cấu trúc bền, chịu nhiệt, hay mẫu matrix hữu cơ,

Ứng dụng tro hoá mẫu sữa để xác định các kim loại (Na, K, Ca, Mg,

thì tác dụng của chất bảo vệ là rất quan trọng. Như hai ví dụ trên, nhưng khi

Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb, Zn) như sau:

xử lý có chất bảo vệ, thì không bị mất một số nguyên tố phân tích đã nêu.

Lấy 5 gam mẫu vào chén thạch anh, thêm chất phụ gia (8 mL H2SO4 45% và 2g KNO3 (hay 2 g LiBO3), trộn đều, sấy khô cẩn thận cho mẫu khô và o

thành than đen, sau đó đem nung 3 giờ đầu ở nhiệt độ 400 - 450 C, rồi sau đó o

ở 550 C, đến khi hết than đen, được tro mẫu trắng. Sau đó hoà tan tro thu được trong 15 mL dung dịch HCl 18% và 1 mL HNO3 65%, đun nhẹ cho mẫu tan hết, đun nhẹ làm bay hơi axit đến còn muối ẩm, định mức thành 25 mL bằng dung dịch axit HCl 2%. Đó là dung dịch để xác định các nguyên tố kim loại nói trên.

3.3.5. Ưu nhược điểm

Thao tác và cách làm đơn giản, Không phải dùng nhiều axit đặc tinh khiết cao đắt tiền Xử lý được triệt để, nhất là các mẫu nền hữu cơ. Đốt cháy hết các chất hữu cơ, vì thế làm dung dịch mẫu thu được sạch Nhưng có nhược điểm là có thể mất một số chất dễ bay hơi, ví dụ như Cd, Pb, Zn, Sn, Sb, v.v. nếu không có chất phụ gia và chất bảo vệ.

3.4.

KỸ THUẬT VÔ CƠ HOÁ KHÔ - ƯỚT KẾT HỢP

3.4.1. Nguyên tắc chung

Nguyên tắc của kỹ thuật này là mẫu được phân huỷ trong chén hay cốc nung. Trước tiên người ta thực hiện xử lý ướt bằng một lượng nhỏ axit, và chất phụ gia, để phá vỡ sơ bộ cấu trúc ban đầu của các hợp chất mẫu và tạo điều kiện giữ một số nguyên tố có thể bay hơi khi nung. Sau đó mới nung ở nhiệt độ thích hợp. Vì thế lượng axit dùng để xử lý thường chỉ bằng 1/4 hay 1/5 lượng cần dùng cho xử lý ướt. Sau đó nung sẽ nhanh hơn và quá trình xử lý sẽ triệt để hơn xử lý ướt, đồng thời lại hạn chế được sự mất của một số kim 47

48

loại khi nung. Do đó đã tận dụng được ưu điểm của cả hai kỹ thuật xử lý ướt

HCl 2% thành 25 mL. Đây là dung dịch để xác định các nguyên tố đã nói trên

và xử lý khô, nhất là giảm bớt được các hoá chất (axit hay kiềm tinh khiết cao)

(Na, K, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb, Zn).

khi xử lý ướt, sau đó hoà tan tro mẫu sẽ thu được dung dịch mẫu trong, vì

Ví dụ 2: Xử lý mẫu sữa để xác định các kim loại (Na, K, Ca, Mg, Cd,

không còn chất hữu cơ và sạch hơn tro hoá ướt bình thường.

Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb, Zn)

Các quá trình vật lý và hoá học xảy ra khi xử lí là tương tự như trong xử lí

Lấy 5.000 g mẫu vào chén nung, thêm 5 mL HNO3 45%, 2 mL H2SO4 98%

ướt và khô đã nêu ở trên, song ở đây là sự kết hợp cả hai kế tiếp nhau. Trong

và 5 mL Mg(NO3)2 5% (hay KNO3), trộn đều, để xử lý ướt sơ bộ sấy mẫu trên

đó xử lý ướt ban đầu là để bảo vệ một số nguyên tố cho xử lí khô tiếp theo không bị mất. Kỹ thuật này thích hợp với các mẫu có nền (matrix) là chất hữu cơ, như rau quả, thực phẩm... xử lí để xác định các kim loại và một số phi kim.

Những phòng thí nghiệm không có thiết bị lò vi sóng, thì đây là một cách tốt cho việc xử lý mẫu xác định các kim loại nặng trong các đối tượng mẫu sinh

bếp điện hay trong tủ sấy cho đến khi khô và thành than đen dòn. Sau đó nung o

o

ở 400 - 450 C trong 3 giờ, tiếp đó ở 550 C cho mẫu tro hoá đến khi thấy bã không còn đen. Hoà tan tro thu được trong 18 mL HCl 1/1và có thêm 1.0 mL HNO3 65%, đun nóng cho mẫu tan hoàn toàn, đuổi hết axit dư đến còn muối ẩm, và định mức thành 25 mL bằng axit HCl 2%. Đây là dung dịch mẫu để

học, mẫu môi trường và quặng đất đá.

xác định các kim loại bằng các phương pháp UV-VIS, hay AAS, hay ICP-

3.4.2. Phương pháp tiến hành và một số ví dụ

Để sử dụng phương pháp này, trước tiên xử lý ướt sơ bộ, sau đó mới nung, nên tính chất và sự diễn biến của nó cũng tương tự như trong hai kỹ thuật đã

OES, hoặc ICP-MS. Ví dụ 3: Xử lý mẫu tôm, cua, cá... để xác định các kim loại (Na, K, Ca,

nói ở trên. Chỉ có khác là sau khi xử lý mẫu không phải đuổi lượng axit dư

Mg, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb, Zn).

quá nhiều như trong xử lý ướt. Sau đây là vài ví dụ.

Lấy 5.00 gam mẫu vào chén thạch anh, thêm 8 mL H2SO4 75% và 3 mL

Ví dụ 1: Xử lý mẫu rau quả để xác định các kim loại (Na, K, Ca, Cd,

Mg(NO3)2 5% , trộn đều, để xử lý ướt sơ bộ, ta sấy hay đun trên bếp điện cho

Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb, Zn)

mẫu sôi nhẹ và đun từ từ cho đến khô và thành than đen. Sau đó đem nung 3

Lấy 5.000 g mẫu đã nghiền mịn vào chén nung, thêm 5 mL HNO3 45% và

giờ đầu ở 400 - 450 C, và nung tiếp ở 550 C cho mẫu tro hoá đến được bã

5 mL Mg(NO3)2 5%, trộn đều, rồi sấy, hay đun nhẹ trên bếp điện cho mẫu sôi

không còn đen. Hoà tan tro thu được trong 18 mL HCl 1/1 và có thêm 1 mL

o

và đến khi khô thành than đen dòn. Sau đó đem nung lúc đầu ở 400 - 450 C

o

o

HNO3 65%, đun nóng cho mẫu tan hết, làm bay hơi hết axit dư đến còn muối

trong 3 giờ, rồi nâng lên 550 C, đến hết than đen. Hoà tan tro thu được trong

ẩm, định mức thành 25 mL bằng HCl 2%. Đây là dung dịch mẫu để xác định

20 mL dung dịch HCl 1/1 và có thêm 1 mL HNO3 65%, đun nóng cho tan

các kim loại nói trên bằng các phương pháp phổ UV-VIS, hay phổ AES, AAS

o

hoàn toàn, làm bay hơi hết axit dư đến còn muối ẩm, định mức bằng dung dịch

49

hoặc ICP-OES.

50

K= CS(A)/ CS(B)

3.4.3. Ưu nhược điểm

Các ưu của kỹ thuật này là tận dụng được các ưu điểm của kỹ thuật xử lý ướt và cả xử lý khô, cụ thể là:

CS(A) là nồng độ chất X trong pha A (dung môi A, pha Benzen);

Hạn chế được sự mất của một số chất phân tích dễ bay hơi Sự tro hoá triệt để, sau khi hoà tan tro còn lại có dung dịch mẫu trong

và tách chúng ra khỏi chất nền (matrix) của mẫu ban đầu, chuyển chất cần

Không phải đuổi axit dư lâu, nên hạn chế được sự nhiễm bẩn

phân tích vào dung môi trích ly. Sau đó, tiến hành xác định chúng trong dung

Phù hợp cho nhiều loại mẫu khác nhau để xác định kim loại, ...

Kỹ thuật này được ứng dụng chủ yếu để xử lý mẫu cho phân tích các -

-

nguyên tố kim loại và một số anion vô cơ, như Cl . Br , SO4 , PO4 ,.. trong các loại mẫu sinh học, mẫu môi trường, mẫu hữu cơ và vô cơ. Không dùng được cho xử lý mẫu để xác định các chất hữu cơ. Trong các phòng thí nghiệm bình thường, không có trang bị lò vi sóng, thì cách xử lý này vẫn là một phương pháp thích hợp, đơn giản, mà vẫn đảm bảo có được kết quả tốt.

3.5.

nước) hết vào pha A. Đó là một điều kiện của quá trình trích ly để lấy chất phân tích

Thời gian xử lý nhanh hơn tro hoá ướt

-

Còn CS(B) là nồng độ của chất X trong pha B (dung môi B, pha Như vậy nếu như hệ số phân bố K> 99/1, thì coi như chất X đã chuyển gần

Không phải dùng nhiều axit tinh khiết cao tốn kém

-

Trong đó:

môi này. Thông thường người ta trích ly chất phân tích từ pha nước vào pha hữu cơ không tan vào nước. Hai pha này tạo thành hệ trích ly (hệ pha), ví dụ hệ pha: (Benzen / H2O), (CCl4 / H2O), (CHCl3 / H2O), (MIBK / H2O), v.v.

3.5.1.2. Nguyên tắc và cơ sở của quá trình trích ly

Bản chất của quá trình trích ly là dựa trên cơ sở sự phân bố (hay hoà tan) khác nhau của chất phân tích vào trong hai pha (2 dung môi) không trộn lẫn vào nhau. Tức là các chất phân tích tan tốt trong dung môi này, nhưng lại

KỸ THUẬT TRÍCH LY THƯỜNG SỬ DỤNG KHI XỬ LÝ MẪU

không tan tốt trong dung môi kia. Nghĩa là sự phân bố của một chất trong hai

3.5.1. Cơ sở, nguyên tắc và điều kiện trích ly

dung môi (2 pha) là rất khác nhau. Nhờ đó mà chúng ta lấy được chất cần

3.5.1.1. Hệ số phân bố của chất

Hệ số phân bố của chất tan (chất phân tích) trong 2 pha không tan vào nhau là một hằng số hoá lý (hằng số nhiệt động) và nó đặc trưng cho sự phân bố của mỗi chất. Nó cho ta biết sự phân bố (hay sự hoà tan) của chất phân tích vào hai pha (2 dung môi) không trộn lẫn vào nhau theo tỷ lệ nhất định. Nếu giá trị hằng số này càng lớn, thì sự phân bố đó càng khác nhau nhiều và càng thuận lợi cho quá trình trích lytách chất phân bố từ pha này sang pha kia.

Chất tan S phân bố vào hệ pha gồm 2 dung môi A và B (ví dụ Benzen và nước) không trộn vào nhau theo định luật phân bố Nersnt: 51

phân tích ra khỏi pha mẫu ban đầu, chuyển nó vào pha thứ 2 (dung môi) mà chúng ta mong muốn. Sau đó xác định nó trong dung môi trích ly. Như thế yếu tố quyết định sự tách và xử lý mẫu ở đây là hệ số phân bố của chất trong 2 pha(dung môi), và các điều kiện thực hiện trích ly. Khi hệ số Klớn sẽ có hiệu suất trích ly cao.

3.5.1.3. Điều kiện của quá trìnhtrích ly

Để có được hiệu quảtrích ly tốt, quá trình trích ly phải có các điều kiện và đảm bảo được các yêu cầu nhất định sau đây: 52

Dung môi trích ly phải có độ tinh khiết cao để không làm nhiễm bẩn thêm các chất lạ vào mẫu.

hoặc cho một pha chuyển động còn một pha đứng yên. Dụng cụ được sử dụng trong chiết lỏng – lỏng: perforator, còn trong chiết rắn

Dung môi trích ly phải hoà tan tốt các chất phân tích, nhưng không được hoà tan tốt với các chất khác có trong mẫu.

– lỏng: soxhlet.

3.5.2.1. Kỹ thuật trích ly tĩnh

Hệ số phân bố của hệ trích ly phải lớn, để cho quá trình trích ly được triệt

Kỹ thuật trích ly này khá đơn giản, không cần thiết bị phức tạp, mà chỉ cần một số phễu trích ly (dung tích 100, 250, 500 mL) là có thể tiến hành được ở

để.

Cân bằng trích ly nhanh đạt được và thuận nghịch, để giải trích ly được

mọi phòng thí nghiệm. Việc lắc trích ly có thể thực hiện bằng tay, hay bằng máy lắc nhỏ. Hiện nay, người ta đã cung cấp các hệ trích ly đơn giản có 6, 9

tốt.

Sự phân lớp khi trích ly phải rõ ràng, nhanh và dễ tách ra riêng biệt các

hay 12 phễu với máy lắc nhỏ, nên việc thực hiện trích ly cũng dễ dàng và dễ đồng nhất điều kiện.

pha.

Phải thực hiện trong nhiệt độ phù hợp và giữ không đổi trong cả quá

Kỹ thuật trích ly tĩnh đơn giản, dễ thực hiện nên nó được ứng dụng phổ biến và rất có hiệu quả trong lĩnh vực tách trích ly phân tích hay làm giàu các

trình.

Phải lắc hay trộn đều mạnh để quá trình trích ly xảy ra được tốt.

chất phân tích phục vụ cho việc xác định hàm lượng vết. Nhất là tách và làm

3.5.2. Một số kỹ thuậttrích ly thường dùng trong xử lý mẫu phân tích

giàu các kim loại, các chất hữu cơ, HCBVTV độc hại trong các mẫu nước,

Dựa theo bản chất của pha:

nước thải, nước biển, v.v.

Chiết lỏng – lỏng: chất phân bố từ pha lỏng ban đầu được chiết bởi

3.5.2.2. Kỹ thuật trích ly dòng chảy liên tục

Trong kỹ thuật này, khi thực hiện trích ly, hai pha lỏng không trộn được

pha dung môi lỏng Chiết rắn – lỏng: chất phân bố ban đầu ở pha rắn được chiết bởi pha

vào nhau (hai dung môi, có một dung môi có chứa chất phân tích) được bơm liên tục và đi ngược chiều nhau với tốc độ nhất định trong hệ trích ly, như

dung môi lỏng Chiết lỏng – rắn (chiết pha rắn): chất phân bố ban đầu ở pha lỏng

phễu trích ly, hay bình trích ly liên hoàn đóng kín để chúng tiếp xúc với nhau.

Hoặc cũng có thể chỉ một dung môi chuyển động, còn một pha đứng yên trong

được chiết bởi pha rắn

bình. Khi đó, chất phân tích sẽ được phân bố vào hai dung môi theo tính chất

Dựa theo kỹ thuật chiết: Chiết gián đoạn: lượng dung môi được chia thành làm nhiều phần,

của chúng, để đạt đến trạng thái cân bằng. Trích ly theo kỹ thuật này hiệu suất

để tiến hành chiết nhiều lần nhằm tăng hiệu suất chiết. Trong kỹ

cao hơn so với kỹ thuật trích ly tĩnh. Đây là phương pháp trích ly được ứng

thuật này dụng cụ được sử dụng là phễu chiết

dụng trong trích ly sản xuất công nghệ.

Chiết liên tục: pha dung môi và pha chứa chất tách tiếp xúc liên tục

Để thực hiện kỹ thuật trích ly này, phải có hệ thống máy trích ly, cột trích

với nhau bằng cách là cho 2 pha di chuyển liên tục ngược chiều nhau

ly hay bình trích ly, bơm để bơm các chất theo dòng chảy ngược chiều nhau

53

54

với tốc độ nhất định thích hợp, hoặc chỉ một chất, hay cả 2 chất chuyển động ngược chiều nhau, và phải có bộ tách pha, để tách các chất ngay trong quá

Nếu tiếp tục trích ly lần thứ 2, q2 là % số mol chất tan S còn lại ở pha 1 sau lần trích ly thứ hai thì

trình trích ly, để thu chất được trích ly ra liên tục, hay theo từng thời điểm

Tiếp tục như vậy, % số mol chất tan S còn lại ở pha 1 sau lần trích ly thứ n

(chu kỳ) nhất định, mà cân bằng trích ly đạt được. là

3.5.2.3. Kỹ thuật trích ly lỏng - lỏng

Nguyên tắc của kỹ thuật trích ly này là dựa trên cơ sở sự phân bố của chất

Do qn < qn-1 <. ..< q1 < 1, nếu n đủ lớn thì qn ≈ 0. Quá trình trích ly được

phân tích vào hai pha lỏng (2 dung môi) không trộn lẫn được vào nhau (trong

xem như hoàn toàn.

hai dung môi này, có thể một dung môi có chứa chất phân tích) được để trong

Ảnh hưởng của pH đối với chất phân bố là acid hữu cơ

một dụng cụ trích ly, như phễu trích ly, bình trích ly. Vì thế hệ số phân bố

Trong môi trường nước, acid hữu cơ (HA) phân ly theo phương trình:

nhiệt động Kcủa cân bằng trích ly là một yếu tố quyết định hiệu quả của sự

HA ↔ H+ + A-

trích ly. Kếđến là sự ảnh hưởng của nhiệt độ, pH của môi trường trích ly.

Trích ly theo kỹ thuật này có hai loại là trích ly tĩnh và trích ly theo dòng chảy

Hay

liên tục. Trong phân tích, kỹ thuật trích ly tĩnh được ứng dụng nhiều hơn, vì sự

Khi đó nồng độ axit HA trong pha 1 là

đơn giản của nó.

Khi đó,

Cân bằng khi trích ly chất phân bố S từ pha thứ nhất sang pha thứ hai Trong quá trình trích ly, chất tan S phân bố giữa 2 pha. Khi đạt trạng thái cân bằng: S1 ↔ S2

Ảnh hưởng của pH đối với chất phân bố là bazo hữu cơ Trong môi trường nước, bazo hữu cơ (HA) phân ly theo phương trình:

Theo định luật phân bố ta có

B + H+↔ BH+

Gọi: + pha ban đầu và pha trích ly tương ứng là 1 và 2 + n là số mol chất S có trong pha 1

Hay

+ V1, V2 là thể tích pha 1 và pha 2

Khi đó nồng độ axit HA trong pha 1 là

+ q1 là % số mol chất tan S còn lại ở pha 1 sau lần trích ly thứ nhất Khi đó,

Và

;

;

Khi đó, Và 3.5.2.4. Kỹ thuật trích ly rắn - lỏng

Do đó, ta được:

Vào năm 1879, Franz Soxhlet đã giới thiệu thiết bị trích ly mà sau này được 55

56

đặt tên của ông dùng để tách chất béo từ thực phẩm. Kỹ thuật này nhận được

Kỹ thuật trích ly này có ưu điểm là trích ly triệt để, song các điều kiện trích

nhiều sự quan tâm vì sự trích ly kéo dài được thực hiện mà không cần giám sát.

ly phải nghiêm ngặt và thời gian trích ly cũng dài, thì mới có kết quả trích ly

Từ đó, việc trích ly các hợp chất hóa học được chú trọng vào dung môi hữu cơ

tốt. Vì thế hệ thống vận hành tự động (auto-Soxlet) cho kết quả tốt hơn. Nó

thích hợp là một trong các phương pháp phổ biến nhất trong phân tích thực

thích hợp cho việc trích ly lượng vết các chất hữu cơ, nhất là các chất độc hại

phẩm vì không cần quá trình lọc, nhiệt độ trích ly cao hơn nhiệt độ phòng, mẫu

từ các đối tượng mẫu khác nhau, chất phân tích có trong mẫu ở trạng thái rắn,

sẽ liên tục đi vào dung môi mới và có thể sử dụng cả dung môi phân cực lẫn

bột, vật mẫu xốp khô (lá cây), v.v. Kỹ thuật trích ly này được ứng dụng chủ

không phân cực. Bất lợi của kỹ thuật này là đòi hỏi một lượng lớn dung môi

yếu để trích ly các HCBVTB từ các mẫu cây, lá, rau quả, thực phẩm, mẫu đất.

(300 – 500 ml), dung môi cần phải bay hơi để giúp quá trình loại bỏ dung môi

Ngày nay, kỹ thuật được cải tiến bằng cách sử dụng kỹ thuật siêu âm để hỗ

được dễ và quá trình thực hiện kéo dài nhiều giờ hay nhiều ngày mới có thể

trợ. Đó là kỹ thuật trích ly siêu âm. Nguyên tắc chung chung của kỹ thuật này

hoàn tất.

cũng vẫn dựa trên cơ sở chung của kỹ thuậttrích ly là sự phân bố của chất vào

Trích ly Soxhlet là một kỹ thuật trích ly bán liên tục với pha mẫu là ở trạng

hai pha không trộn lẫn vào nhau, chỉ có khác là ở đây được thực hiện trong

thái rắn: bột, hạt dạng mảnh, dạng lá. Còn dung môi trích ly (chất hữu cơ) là ở

môi trường có thêm tác dụng của năng lượng sóng siêu âm. Pha chứa mẫu

dạng lỏng. Ví dụ như trích ly lấy dầu melton từ lá cây bạc hà bằng dung môi

phân tích cần trích ly là pha nước và pha lỏng để trích ly chất phân tích là

hữu cơ n-hexan, hay benzen. Trích ly các thuốc trừ sâu hay hợp chất bảo vệ

dung môi hữu cơ (pha thứ hai) đều được cho vào bình trích ly, sau đó được đặt

thực vật trong mẫu rau quả, mẫu đất bằng n-hexan.

vào trong hộp trích ly của hệ trích lydưới tác dụng của sóng siêu âm thích hợp

Vì thế đây là kỹ thuật trích ly của hệ dị thểmà chất phân tích ở trong mẫu

trong một thời gian nhất định (1,5 - 2 giờ). Kỹ thuật trích ly này có thể được

rắn, bột, lá, sợi, v.v mà các kỹ thuật trích ly đã nêu ở trên không làm được tốt,

thực hiện ở hai trạng thái mẫu đồng thể và dị thể.

đặc biệt là trích ly các chất hữu cơ trong các mẫu không ở dạng lỏng (hệ trích

3.5.2.5. Kỹthuật trích ly lỏng có áp lực (PFE)

Kỹ thuật này sử dụng dung môi được tăng tốc gần tới vùng chảy tới hạn,

ly dị thể) nên kỹ thuật này có tên gọi là kỹ thuật trích ly rắn – lỏng.

khi đó khả năng trích ly tốt hơn. Ở nhiệt độ cao, tốc độ trích ly tăng do độ nhớt

Thiết bị :

và sức căng bề mặt của dung môi giảm trong khi tính hòa tan và tốc độ

Thiết bị của kỹ thuật trích ly này có hai loại là: Các hệ trích ly Soxhlet thường và đơn giản.

khuyếch tán của nó vào mẫu tăng lên. Áp suất giữ cho dung môi nằm ở dưới

Các hệ trích ly Soxhlet tự động (Auto-Soxhlet).

điểm sôi và khiến nó xâm nhập qua các lỗ nhỏ trên bề mặt mẫu. Sự kết hợp

Kỹ thuật trích ly theo hệ loại 1 là đơn giản, vận hành bằng tay, còn kỹ

giữa nhiệt độ cao và áp suất đem lại hiệu quả trích ly cao hơn, do đó sẽ tối

thuậttrích ly theo hệ máy loại 2 là vận hành một cách tự động theo

thiểu hóa lượng dung môi sử dụng và giúp trích ly triệt để hơn. Thời gian cần

chương trình.

trích ly trên thực tế có sự độc lập với khối lượng mẫu và hiệu quả trích ly chủ yếu phụ thuộc vào nhiệt độ. Hình 2 là một mô hình thiết bị PFE.

Ưu nhược điểm và phạm vi ứng dụng 57

58

Mẫu được cho vào ngăn trích ly bằng thép không rỉ mà tại đó dung môi

Trích ly lỏng có áp lực được ứng dụng chủ yếu trong kiểm soát các thông số

được bơm vào và đưa lên nhiệt độ và áp suất xác định. Thông thường nhiệt độ

ô nhiễm và gần đây là tiền xử lý thực phẩm. Bảng 6 giới thiệu một vài ứng

được giữ trong khoảng từ 80ºC đến 200ºC và áp suất trong khoảng từ 10 đến

dụng của nó.

20 MPa. Các điều kiện này được giữ nguyên trong vài phút để tạo sự dịch

Bảng 3.3 Trích ly lỏng có áp lực trong phân tích thực phẩm

chuyển ổn định chất phân tích từ mẫu vào dung môi. Dịch trích ly được đẩy

Thực phẩm

vào ống thu nhận bởi một lượng dung môi thứ 2 và lượng dung môi thứ 2 này cũng được đẩy vào ống đó bởi một dòng khí trơ. Toàn bộ quá trình diễn ra trong 15 – 20 phút.

Khi thao tác với mẫu ẩm, để tránh hiện tượng vón cục, có thể sử dụng

Rau quả, bột Rau quả, nước ép

Thuốc trừ sâu, thuốc

Hexane+10%

diệt cỏ

acetone, acetonitrile

Thuốc trừ sâu chứa

t (0C) / p (MPa) 125/10 100/10,4

n -Methylcarbamate

Acetonitrile

100/13,8

Trái cây

Polyphenol

Methanol

40/6,9

Dược phẩm

Vitamin K1 Acetonitrile

80/13,8

trái cây, bột

11,7% Al2O3, gần 3% Fe2O3 và vết CaO, MgO, Na2O và K2O.

Rau quả, trái cây

giống như trích ly bằng Soxhlet

Dung môi

Ethyl acetate

điatomit (kizegua). Điatomit khi tro hóa có chứa khoảng 65 – 87% SiO2, 2,3 – Phương pháp thực hiện thường cho kết quả trung thực vì các điều kiện gần

Chất phân tích

Photpho hữu cơ

Chlorpyrifos, Thức ăn trẻ em

malathion, 4.4’-DDE, 4,4’–DDT

Thịt xông khói

Hydrocarbon chứa

Methylene chloride

vòng thơm

+ 10% acetonitrile

80/10

Chất béo, Cá

polychlorinated

Hexane

125/10

biphenyls Arsenobetaine, Cá

arsenocholine, dimethylarsenic acid

Hình 3.1 Mô hình thiết bị PFE (a) Bình chứa dung môi, (b) Bơm, (c) Van lọc, (d) Ngăn trích ly, (e) Lò nung, (f) Van cố định, (g) Ống thu nhận, (h) Lỗ thông khí, (i) Bình khí trơ 59

Cá

Hợp chất có mùi

Methanol + 50% H2O Hexane-ethyl acetate

80/10

60

Thịt Bột ngũ cốc, thịt gà, trứng

Chất béo

Hexane

125/10

quá trình tiền xử lý mẫu có thể thực hiện với dòng siêu chảy không bị nhiễm

Isopropyl alcohol + Axit béo

hexane-methanol +

120/0,8

Chất béo

+ chloride +

trong trích ly bằng Soxhlet.

80/10,4

bột sữa, thức ăn gia súc

chóng, làm giảm thời gian trích ly. Công đoạn hoàn tất diễn ra dưới 20 phút

Polychlorinated

Hexane

biphenyls

100/10,3

chất béo và dầu

chọn dòng siêu chảy với nhiệt độ tới hạn thấp.

Chất béo

Ether dầu hỏa

100/13,8

Một trong tính chất thú vị nhất của các dòng chảy này là mối liên quan trực tiếp giữa nồng độ dung môi với tỷ trọng. Do tỷ trọng của dòng chảy là một hàm của nhiệt độ và áp suất nên điều chỉnh chính xác các thông số này sẽ cho

thực vật.

Malt

thay vì nhiều giờ đồng hồ như trong trích ly lỏng – rắn truyền thống. Kỹ thuật này cũng được sử dụng đối với các chất phân tích không ổn định nhiệt khi

Sản phẩm từ sữa, thịt, bột ngũ cốc,

Tốc độ thấm nhanh của dòng siêu chảy vào thực phẩm, ngay cả khi độ xốp thấp, cho phép sự thẩm thấu ngược các chất cần phân tích một cách nhanh

methanol Dầu gan cá tuyết,

bẩn, không gây ngộ độc, chẳng hạn như CO2, là sự lựa chọn hoàn hảo so với việc phải chấp nhận những nguy cơ tiềm tàng và sử dụng dung môi đắt tiền

chloroform Hexane + methylene

Bột sữa

tích ở pha lỏng, để tốc độ trích ly tăng và ít bị tổn thất nhiệt. Ngoài ra, nhiều

Proanthocyanidins

Acetone + 20% H2O

60/100

phép sử dụng được một dung môi có khoảng nồng độ hòa tan thấp. Từ đó cho phép thay thế nhiều loại dung môi truyền thống với một dòng siêu chảy duy

So sánh giữa trích ly lỏng có áp lực với phương pháp Soxhlet, ưu điểm của

nhất. Ví dụ như CO2 siêu chảy ở 7,515 Mpa và 80ºC (d = 0,15 g/ml) được xem

nó là giảm lượng dung môi sử dụng và thời gian trích ly nhưng nhược điểm là

như một dung môi có độ hòa tan cao như những chất khí như pentan, trong khi

sử dụng thiết bị dụng cụ chuyên dụng rất đắt tiền nhằm đảm bảo sự an toàn

ở 38,265 Mpa và 40ºC (d = 0,95 g/ml) độ hòa tan của nó gần giống như các

tránh mối nguy do dung môi bị quá nhiệt và dụng cụ chịu áp suất cao.

chất lỏng chẳng hạn như metylen clorua, cacbon tetraclorua, toluen hay

3.5.2.6. Kỹ thuật trích dòng siêu chảy (SFE)

benzen. Khi chọn áp suất trích ly, cần lưu ý là khi tăng áp suất, hợp chất có

Trích ly bằng dòng siêu chảy với thực phẩm được giới thiệu nhiều năm

khối lượng phân tử cao hơn sẽ trở thành chất tan, trong khi giảm áp suất dòng

trước đây trên quy mô công nghiệp nhưng nó chỉ được ứng dụng vào công

siêu chảy sẽ mất đi một vài phần khả năng hòa tan của nó. Nếu giảm áp suất

đoạn chuẩn bị mẫu phân tích vào thời gian gần đây.

đến áp suất khí quyển, dòng chảy sẽ mất gần như toàn bộ khả năng hòa tan và

Dung môi sử dụng là một dòng siêu chảy, là một chất nằm ở trạng thái có

những hợp chất đã trích ly sẽ tách ra khỏi dung dịch.

nhiệt độ và áp suất tới hạn, tạo nên những tính chất kết hợp đặc biệt. Dòng siêu

Nước là một lựa chọn kém với kỹ thuật này vì nhiệt độ và áp suất tới hạn

chảy khuếch tán qua chất rắn cũng như chất khí nhưng có thể hòa tan chất phân

cao của nó. Dòng siêu chảy được sử dụng phổ biến là CO2 với giá trị tới hạn

61

62

thấp và độ hoạt động hóa học thấp. CO2 dễ thu nhận được ở dạng siêu tinh khiết với giá thành hợp lý, nó là chất thân thiện với môi trường và có thể tách trích ly ra khỏi các chất phân tích thu nhận được dễ dàng không có trở ngại gì cũng như không gây tổn thất đáng kể.

Nitơ oxyt cũng là dòng siêu chảy tốt nhưng nó rất dễ cháy nổ. Amoniac là chất phân cực với độ hòa tan tốt nhưng nó dễ tương tác hóa học và gây ăn mòn.

Hydrocacbon cũng thường có khả năng cháy nổ và cũng không dùng được với kỹ thuật phân tích SFE. Một phương pháp thực hiện thông thường trong trích ly bằng dòng siêu chảy được đề cập trong mối liên quan với tính chất hóa lý của dòng siêu chảy đó là việc sử dụng các chất hỗ trợ (đồng dung môi). Đó là những hợp chất được thêm vào dòng chảy nguyên thủy để tăng hiệu suất trích ly. Ví dụ như thêm vài phần trăm (1 – 10%) dung môi metylic vào cacbon dioxyt sẽ mở rộng khoảng trích ly với những chất phân tích có độ phân cực cao hơn.

Kỹ thuật trích ly với dòng siêu chảy ứng dụng trong thiết bị đơn giản được giới thiệu trong Hình 3.

Hình 3.2 Sơ đồ thiết bị SFE (a) Nguồn chất hỗ trợ, (b) Bơm, (c) Ngăn trích ly, (d) Lò nung, (e) Thu hồi, (f) Bộ phận hãm dòng, (g) Nguồn dòng chảy, (h) Bộ lọc (i) Bơm pittong cao áp tác dụng kép Mẫu được đưa vào ngăn trích ly bên trong, mà dòng chảy được bơm vào đó ở một áp suất trên điểm tới hạn. Nhiệt độ của ngăn tăng trên giá trị tới hạn của dòng chảy. Lượng thực phẩm cần khoảng 1 – 3 g trong mỗi ngăn. Trong trường hợp thực phẩm rắn cần đồng nhất mẫu, còn thực phẩm lỏng thì cần hấp thụ lên một chất trơ và có lỗ xốp để tránh trở ngại trong việc điều chỉnh 2 pha khi có áp suất. Thành phần nước trong mẫu phải được điều chỉnh kỹ lưỡng vì nước, được coi là một đồng dung môi mạnh, có thể làm thay đổi khả năng trích ly của dòng siêu chảy và đồng thời nó bị đóng băng khi dòng chảy bay hơi gây tắc nghẽn các van và bộ phận hãm dòng.

Sự trích ly có thể thực hiện ở chế độ tĩnh hay động, hoặc chế độ tuần hoàn.

Khi thực hiện trích ly chế độ tĩnh, ngăn trích ly được lấp đầy bởi dòng siêu chảy, được tăng áp và giữ yên cân bằng. Ở chế độ động, dòng siêu chảy liên tục chảy qua ngăn trích ly. Ở chế độ tuần hoàn, dòng chảy được bơm tuần hoàn

63

64

qua mẫu và sau khi đạt được số lần tuần hoàn yêu cầu, nó được bơm về bộ

chất cần phân tích và điểm hấp phụ trên thực phẩm vẫn còn hạn chế.

phận thu hồi.

Bảng 3.4 Trích ly bằng dòng siêu chảy trong phân tích thực phẩm

Trong suốt quá trình trích ly, chất phân tích hòa tan được phân tách từ mẫu vào dòng siêu chảy đã bị giảm áp, không bị tổn thất, đi qua 1 bộ phận thay đổi

Thực phẩm

tốc độ dòng, về ống thu nhận. Ống thu nhận này có thể rỗng hay có chứa chất

Thịt heo

hấp phụ thích hợp hay những chất chuẩn cần thiết của phân tích theo yêu cầu

Thịt heo sấy

của việc chuẩn độ sau đó. Trong phân tích thực phẩm, chất béo và dầu thường được thu nhận trong 1 ống rỗng hay trong một dung môi. Tương tự như vậy, thuốc trừ sâu và các vitamin tan trong béo cũng đươc thu nhận trong 1 dung môi hay hấp thụ lên bề mặt chất triết ở pha rắn, trong khi đó mùi và hương được thu nhận trong một ống đông lạnh.

Mỡ heo Nạc bò Thịt, trứng

Bản chất dòng siêu chảy, nhiệt độ và áp suất, thời gian trích ly, hình dạng ngăn trích ly, cỡ mẫu và loại hợp chất dùng trong thu nhận chất phân tích là những yếu tố chung ảnh hưởng đến sự trích ly.

Ngay từ ban đầu, kỹ thuật trích ly này được sử dụng rộng rãi để phân chia

Trứng

t(ºC)/

Chất phân tích

Dòng chảy + chất hỗ trợ

Chất béo

CO2+(CH3)2CHOH

120/62

Cholesterol

CO2

50/34

p(MPa)

Polychlorinated biphenyl 40/10,3 và

Hương quá nhiệt

CO2

Nicarbazin dư

CO2+C2H5OH

85/27,6

CO2

50/69

Atrazine và thuốc diệt cỏ chứa triazine khác

30

Trứng

Chloramphenicol

CO2

80/69

Trứng

Thuốc trừ sâu gốc clo

CO2

40/0,72

Vitamin A

CO2+5% C2H5OH

60/26

các thành phần hữu cơ trong phân tích thực phẩm, đặc biệt là trích ly chất béo

Sản phẩm từ

và dầu. Theo thời gian, ứng dụng của kỹ thuật SFE trong thực phẩm được

sữa, thịt

củng cố nhiều và vì vậy bảng 7 chỉ tổng hợp một vài cách phân chia gần đây

Bột sữa

Vitamins A và E

CO2+5% CH3OH

80/37

trong thực phẩm, hương thơm và gia vị.

Dầu cám

Ferulate-phytosterol

CO2

80/69

ester

CO2+5% CH3OH

40/34,5

Các dòng siêu chảy góp phần tiến bộ đáng kể về dung môi trích ly trong

bắp

phân tích thực phẩm. Các chất trích ly sạch hơn so với các dung môi hữu cơ và giảm sựu tổn thất nhiệt. Không cần phải cô đặc trước khi phân tích hóa học.

Dầu hạt ngũ

Mặc dù những ưu việt đã được chứng minh và ứng dụng đáng kể của nó vào

cốc,

việc phân chia trong lĩnh vực công nghiệp, kỹ thuật này vẫn bị thất bại trong

margarin

việc trở thành công cụ phân chia chính vì yêu cầu lựa chọn dòng siêu chảy và chất hỗ trợ đòi hỏi nhiều kinh nghiệm, trong khi có rất ít thông tin về dung môi

80/55,2 Phytosterol

CO2

80/13,8,

CO2+10% (CH3)3COCH3

27,6 và 41,4

Chất béo và

Thuốc trừ sâu gốc clo

dầu

hữu cơ và photpho hữu

CO2+3% CH3CN

60/27,6

phân tích và thêm vào đó sự hiểu biết về sự tương tác giữa dòng siêu chảy, các 65

66

cơ Táo

Fenpyroximate

Nho

Glycoside

Nho Ớt bột Gia vị Cám gạo Lúa mì, ngô Mầm ngũ cốc Thức ăn ăn kiêng Thức ăn trẻ em

5-Hydroxymethyl-2-

tocopherol, γCO2 CO2+10% CH3OH hay CO2

90/20

35/38,5

CO2

40/13,8 và

Hương thơm

CO2

40/12

Chất béo và γ-oryzanol

CO2

50/69

Dầu ớt bột, β-carotene, các carotenoid đỏ

Thuốc trừ sâu gốc photpho hữu cơ

CO2

70/24,5

Cà chua

a. Nguyên tắc và điều kiện Nguyên tắc chung Một kỹ thuật trích ly theo cơ chế hấp phụ phổ biến là kỹ thuật trích ly trên pha rắn (SPE) trong đó người ta dùng những ống cartridge thích hợp để hấp phụ chất phân tích và tách chúng ra khỏi hỗn hợp. Khi dung dịch mẫu đi qua

CO2

80/25

trong khi những thành phần khác của mẫu lại đi qua (hay ngược lại, trong trường hợp làm sạch tạp chất). Sự cân bằng giữa chất phân tích và chất hấp phụ

Tocopherol

β- cryptoxanthin và

CO2+15% C2H5OH

75/35

nhựa trao đổi cũng được dùng rất phổ biến và các nghiên cứu gần đây, cho

Atrazine, carbofuran, CO2+10% CH3CN

70/17,3

metolachlor Vitamin E 30 VOC Lycopene, β-carotene, α- carotene, α-

thương mại hóa nhưng vật liệu phổ biến nhất là silic dioxyt vì nó dể dàng tái hoạt hóa bề mặt để sử nhiều lần và phạm vi sử dụng rộng rãi. Chất hấp phụ là

zeaxanthin chlorpyrifos,

nhanh chóng đạt được do bề mặt hấp phụ lớn.

Nhiều loại chất hấp phụ như nhôm, magiê silicat và than hoạt tính đã được

Carotenoid, β-carotene,

CO2

45/27,5– 34,5

Cá

3.5.2.7. Kỹ thuật trích ly pha rắn (SPE)

vùng chất hấp phụ đã được hoạt hóa, chất xác định bị hấp phụ trên bề mặt rắn

40– Mầm lúa mì

tocopherol

40/69

CO2+20% CH3OH

furaldehyde

tocopherol, δ-

CO2

45/10

CO2

thấy các phân tử của chúngcó thể dùng làm vật liệu trong kỹ thuật trích ly SPE trong thực phẩm.

Thông thường, kích thước của hạt hấp phụ trong khoảng từ 10 đến 60 µm.

Bản chất vật liệu sử dụng giống như trong sắc ký lỏng (chỉ khác về kích cỡ).

Chất hấp phụ gồm 3 loại cơ bản: không phân cực, phân cực và trao đổi ion. Độ hoạt động của chúng phụ thuộc vào bản chất của pha liên kết, nồng độ pha liên kết. Việc lựa chọn chất hấp phụ phụ thuộc vào cấu trúc thực phẩm, bản chất chất cần tách vì nó liên quan tới sự tương tác của những chất này với bề mặt pha. Quá trình trích ly thực hiện qua 4 bước: thiết lập (các nhóm chức của nền

67

68

hấp phụ được solvat hóa để dễ tương tác với mẫu hay là sự hoạt hóa bề mặt),

lỏng – lỏng và cho phép loại bỏ đồng thời những tạp chất nhiễu và cô đặc chất

củng cố (các chất cần phân tích được gắn vào bề mặt khung), rửa giải (những

cần phân tích.

chất không mong muốn bị loại bỏ) và giải hấp (các chất cần phân tích được giải hấp phụ và thu nhận để tiến hành phân tích). Quá trình rữa giãi phải chú ý

Nhiều loại thực phẩm được làm sạch bằng kỹ thuật trích ly trên pha rắn rất thành công cho việc xác định nhiều chất hợp chất.

là rất dể sự rữa giãi sẽ làm mất đi pha liên kết, sau này sẽ không tái sử dụng được hay làm giảm tuổi tho của vật liệu.

Phương pháp SPE được phát triển hoàn thiện thông qua những nghiên cứu về pH, lực ion, sự phân cực, tốc độ dòng chảy của dung môi và bản chất hóa lý của nền hấp phụ.

Trong lãnh vực sắc ký hệ thống này được ghép với cột sắt ký để tách và định lượng. Ban đầu mẫu được hòa tan và cho vào bộ phận nạp mẫu tự động,

Hình 3.3 Quy trình hoạt động của thiết bị SPE gắn nối tiếp với hệ thống sắc ký ion.

rồi từ đó được bơm vào ống cartridge của hệ thống SPE, lúc này cột sắc ký

(A) Mẫu được chuyển từ bộ phận nạp mẫu tự động (s) vào ống cartridge (SPE); cột IC

được giữ cho dòng ra của sắc ký đồ ổn định theo một chế độ chạy phù hợp

được giữ cho dòng ra ổn định (e) từ bơm p2

được cài đặt. Những tạp chất nhiễu được rửa giải ra khỏi ống cartridge của hệ

(B) Tạp chất nhiễu được rửa giải ra khỏi ống cartridge (SPE) đi vào thùng chứa tạp chất

thống SPE bằng dung môi thích hợp, ở bước thứ 4 ống chứa các chất xác định

(w) bằng dung môi thích hợp (sw) được bơm từ bơm p3; cột IC vẫn giữ trạng thái như

được nối với cột sắc ký và các chất cần phân tích được rửa giải bằng một dung

ở bước A

môi thích hợp. Có thể xem như đây là một quá trình tiền xử lý mẫu trước khi

(C) Chất cần phân tích được tháo ra khỏi ống cartridge (SPE) bằng bộ phận tháo mẫu (e) và

cho vào cột sắc ký. Kỹ thuật này có nhiều cải tiến hơn phương pháp trích ly 69

70

ống (l) được lắp đầy; cột IC vẫn giữ trạng thái như ở bước A và B.

Các chất trích ly và dung môi rửa giải phải có độ sạch cao theo yêu

(D) Ống (l) được nối với cột IC và các chất cần phân tích được tháo ra bằng bộ phận tháo mẫu (e) và cùng lúc đó ống cartridge (SPE) mới được gắn vào cho quá trình tiền xử lý mẫu tiếp theo.

cầu của cấp hàm lượng phân tích.

Hệ số phân bố nhiệt động Kfb của cân bằng trích ly phải lớn, để có được hiệu suất trích ly cao.

Phân loại kỹ thuậttrích ly pha rắn

Quá trình trích ly phải xảy ra nhanh và nhanh đạt cân bằng, nhưng

Theo đặc điểm và bản chất của kỹ thuật trích ly, các chất trích ly pha rắn được chế tạo và phân chia theo các loại chất:

không có tương tác phản ứng hoá học làm mất hay hỏng pha rắn và chất phân tích.

• Loại hấp phụ pha thường. Đó là các Silica trung tính và ôxit nhôm,

Quá trình trích ly phải có tính thuận nghịch, để quá trình rửa giải

• Hấp phụ pha ngược. Đó là các Silica thường được alkyl hoá nhóm-

được tốt giúp lấy chất phân tích ra khỏi pha trích ly bằng một pha

OH,

động phù hợp.

• Loại chất trao đổi ion (để tách Cation và Anion),

Không làm nhiễm bẩn thêm chất phân tích trong quá trình trích ly

• Chất rây hay sàng lọc phân tử theo độ lớn, kích thước của phân tử chất,

bởi bất kỳ từ nguồn nào.

Quá trìnhtrích ly phải được thực hiện trong điều kiện nhất định phù

• Loại chất hấp phụ khí (purge and trap Extraction), để hấp thụ chất

hợp, phải lặp lại được tốt và tất nhiên là càng đơn giản dễ thực hiện

khí.

thì càng tốt.

b. Điều kiện của trích ly pha rắn

c. Các kỹ thuật trích ly pha rắn và cơ chế trích ly

Quá trình trích ly ở đây thực chất cũng là sự phân bố của chất phân tích

Trích ly theo cơ chế hấp phụ pha thường

giữa 2 pha, pha rắn (chất trích ly) và pha lỏng (dung dịch chứa chất phân tích)

Trong kỹ thuật này, chất trích ly (pha tĩnh) là các Silica trung tính, có bề

không trộn lẫn vào nhau trong những điều kiện nhất định, như pH, dung môi,

mặt xốp phân cực. Nó tác dụng tốt với các chất mẫu không phân cực và ít

nhiệt độ, tốc độ chảy của mẫu qua cột trích ly. Trong đó hệ số phân bố nhiệt

phân cực. Đó là sự tương tác hấp phụ. Tuỳ theo bản chất và cấu trúc phân tử

động Kb của chất phân tích giữa hai pha (rắn và lỏng chứa mẫu) cũng là một

của mỗi nhóm chất phân tích, bản chất hấp phụ của Silica trung tính và các

yếu tố quyết định hiệu quả của sự trích ly. Nó cũng tương tự như trong hệ sắc

điều kiện thực hiện trích ly, mà nhóm chất phân tích nào bị pha tĩnh hấp phụ

ký cột lỏng-rắn (của các hệ HPLC).

và giữ lại trên cột trích ly và hoàn toàn tương tự như sự tương tác hấp phụ

Vì thế muốn thực hiện trích ly pha rắn tốt phải có các điều kiện sau đây

trong cột sắc ký NP-HPLC.

Pha rắn hay chất trích ly (dạng cột trích ly hay đĩa trích ly) phải có

Dung môi để giải trích ly chất phân tích trong loại này thường là các dung môi

tính chất hấp thụ hay trao đổi chọn lọc với một chất, hay một nhóm

hữu cơ không phân cực hay ít phân cực và kị nước (không tan vào nước), hay

chất phân tích nhất định, tức là tính chọn lọc của pha tĩnh trích ly.

hỗn hợp của chúng với nhau theo tỷ lệ thích hợp. Ví dụ n-Hexane, n-Heptane, 71

72

CCl4, CHCl3, Benzen, Diclo-Etan, Ethyaxetat, v.v. Các dung môi này được

Trao đổi Cation axit mạnh (R-SO3Na) và axit yếu (R-COONa).

gọi là pha động (MP) và nó phải hoà tan tốt chất phân tích, để lấy được các

Trao đổi Anion Bazơ mạnh (R-N (-OH)), bazơ yếu (R-NH2OH).

chất phân tích ra khỏi pha tĩnh (chất trích ly rắn).

+

Cơ chế của sự trao đổi ion

Trích ly theo cơ chế hấp phụ pha ngược Trong kỹ thuật này, chất trích ly (pha tĩnh) là các Silica pha ngược, có bề

Loại trao đổi Cation theo phương trình tổng quát quá trình trao đổi Cation:

mặt hầu như không phân cực. Nó tác dụng tốt với các chất mẫu không phân

nMat-SO3Na + Me

cực và phân cực. Đó là sự tương tác hấp phụ của pha tĩnh (chất trích ly). Tuỳ

trên cột tách trích ly.

→ (Mat-SO3)n-Me + nNa

+

(Chất trích ly) (Chất phân tích)

theo bản chất và cấu trúc phân tử mỗi nhóm chất phân tích và các điều kiện thực hiện trích ly, mà nhóm chất phân tích nào bị pha tĩnh hấp phụ và giữ lại

n+

Trong đó: Mat: Mạng rắn của chất trao đổi ion; n+

Cơ chế trích ly ở đây là sự tương tác hoàn toàn tương tự như sự tương tác

Me : Cation của chất phân tích. +

hấp phụ trong cột sắc ký lỏng hiệu năng cao hấp thụ pha ngược (RP-HPLC ).

Na : Cation trao đổi của chất trích ly.

Kỹ thuật này dễ thực hiện, đơn giản và được ứng dụng nhiềudo tính tiện lợi

-SO3Na: Nhóm chức trao đổi ion.

của hệ dung môi rửa giải tan trong nước, dung môi chứa chất phân tích.

Chúng ta có thể minh hoạ sự tương tác này như mô hình sau:

Loại trao đổi Anion: theo phương trình tổng quát quá trình trao đổi Anion

Trích ly theo cơ chế trao đổi ion

n-

nMat-OH + X → (Mat)n-X + nOH

Nguyên tắc

n-

(Chất trích ly) (Chất phân tích)

trao đổi) của chất trích ly (pha tĩnh trao đổi ion) để hấp thu (giữ) chất phân Trong đó:

hợp để rửa giải chất phân tích vào dung môi đó và sau đó tiến hành xác định

Mat: Là mạng rắn của chất trao đổi ion;

nó theo một phương pháp phân tích thích hợp đã chọn. Dung môi rửa giải ở

X : Anion của chất phân tích.

đây là dung dịch nước của các muối tan của kim loại kiềm, amoni có pH phù

OH và Cl là anion trao đổi.

hợp, hay dung dịch axit loãng và có thể có thêm chất tạo phức.

-

hay nMat-Cl + X →(Mat)n-X + nCl

Dựa trên cơ sở của quá trình trao đổi ion của chất phân tích với ion đối (ion tích lại trên pha tĩnh (cột trích ly). Sau đó dùng một pha động (dung dịch) phù

-

n-

-

-

Trong quá trình trao đổi ion, tuỳ thuộc vào mỗi loại chất phân tích và chất

Chất trao đổi ion

pha tĩnh (chủ yếu là nhóm chức trao đổi ion thuộc loại axit yếu hay mạnh,

Chất trao đổi ion của kỹ thuật này có thể là hai loại sau đã và đang được sử

hoặc bazơ mạnh hay yếu), mà quá trình có thể được thực hiện tốt trong một

dụng phổ biến, đó là: 73

74

o

vùng pH (môi trường axit) nhất định. Vì thế,trích ly theo cơ chế này cần phải

độ bay hơi thấp (dưới 150 C) và dễ bay hơi. Kỹ thuật này rất thích hợp cho

được thực hiện trong môi trường pH (hay axit) phù hợp.

trích lycác chất hữu cơ trong môi trường khí, hay các mẫu rắn, mẫu bột, hay

Trích lytheo cơ chế trao đổi cặp ion

mẫu bùn và mẫu nhão. Tất nhiên, việc trước tiên là phải nhũ hoá các mẫu này

Cùng với sự trao đổi cation và anion, trong trích ly pha rắn còn có cơ chế

bằng một dung môi thích hợp, như nước hay dung môi hữu cơ có nhiệt độ sôi

trích ly theo kiểu cặp ion. Đây cũng là bản chất trao đổi của ion của chất phân

cao. Còn chất hấp phụ ở đây là các hạt silica rắn xốp được nhồi vào cột trích

tích thông qua chất trung gian- chất tạo cặp ion, nó cho ion trao đổi với chất

ly đóng kín. Nó cũng thường là các silica trung tính xốp hay silica đã được thế

phân tích. Nó cũng hoàn toàn tương tự như sắc ký cặp ion của hệ pha ngược

hoá (alkyl hoá), tương tự như trong hệ trích ly NP-HPLC và RP-HPLC.

hấp phụ (hệ RP-HPLC). Chất trích ly ở đây thường là chất hấp phụ pha ngược.Ví dụ Silica LiChrosorb RP-8, RP- 18 hay là Hypersil ODS. Và ở đây cũng có hai kiểu trao đổi cặp ion.

Kỹ thuật này rất thích hợp cho việc xử lý các loại mẫu để xác định các o

chất hữu cơ có nhiệt độ sôi thấp (dưới 150 C) và dễ bay hơi trong các loại mẫu rắn, mẫu bùn, các mẫu bã thải và các mẫu khí. Nó có ưu điểm là chọn lọc

3.5.2.8. Kỹ thuật trích ly hấp phụ pha khí (rắn-khí)

cao, thích hợp cho các phương pháp phân tích HPLC, GC, hay GC-MS, để xác

Nguyên tắc chung Kỹ thuật này dựa trên cơ sở là ở một nhiệt độ nhất định thích hợp, khi thổi một dòng khí trơ nóng (argon hay hêli) dẫn mẫu ở dạng khí vào cột trích ly, thì một nhóm các chất phân tích bị pha tĩnh rắn trong cột hấp phụ giữ lại, còn các chất khác thì đi qua. Vì thế về bản chất nó cũng là quá trìnhtrích ly giữa hai pha khí và rắn (pha trích lylà rắn, chất phân tích được trích lyở dạng khí) không tan vào nhau. Ở đây, trích lytheo cơ chế hấp phụ. Sau đó có thể:

định lượng nhỏ các chất hữu cơ, một số hợp chất cơ kim và một số chất vô cơ, như H2S, HCN, v.v.

Thiết bị và một số ví dụ Thiết bị gồm có hai loại là các hệ đơn giản và hệ hoàn chỉnh tự động theo chương trình. Khí mang trơ ở đây là khí argon, hêli hay nitơ tính khiết (> 99,9%). Cụ thể thiết bị là gồm các bộ phận: + Hệ cột trích lykín và buồng cột trích lycó gia nhiệt được,

Người ta lại làm nóng cột hấp phụ và cũng dùng dòng khí trơ nóng để giải hấp các chất phân tích đưa trực tiếp chúng vào hệ cột của

+ Khí trơ mang mẫu, cũng như để rửa giải chất phân tích (Ar, N2, hay

máy GC hay cho chúng tan vào một dung môi hữu cơ phù hợp để

He).

xác định bằng cách khác, như HPLC hay phổ UV-VIS.

+ Hệ máy bơm khí và nén khí mẫu vào cột trích ly.

Hay cũng có thể giải trích ly chất phân tích ra khỏi cột trích ly bằng

♦ Ví dụ: Trích ly lấy một số hợp chất pesticide dễ bay hơi trong các loại nước hay mẫu rắn, bùn (Method 502.2b. EPA).

một dung môi hữu cơ thích hợp hoà tan tốt chất và xác định chúng

Cột hấp phụ là chất trích ly pha rắn loại LC2-25x1 cm. Mẫu được giữ ở

bằng HPLC hay IR.

o

Phương pháp trích lynày được ứng dụng cho cả mẫu rắn và lỏng, hay bùn,

150 C và dòng khí trơ Argon thổi qua bình mẫu với tốc độ 0,8-1,0 mL/phút để

hay bã thải, nhưng chỉ cho các chất phân tích là các hợp chất hữu cơ có nhiệt

đưa chất phân tích vào cột hấp phụ. Các chất phân tích sẽ được hấp phụ vào

75

76

cột này. Sau đó cũng giải hấp các chất trong cột hấp phụ bằng dòng khí trơ đó

Thực phẩm có hàm lượng nước thấp: những thực phẩm có hàm lượng

o

nước nhỏ hơn 10%.

nhưng ở 200 C, để dẫn vào máy GC/MS để tách và xác định các chất.

Trong các sản phẩm thực phẩm, nước tồn tại ở hai dạng là nước tự do và nước liên kết: Nước ở dạng tự do: nước vẫn giữ được tính chất của nước nguyên chất.

Nước ở dạng liên kết được chia thành ba dạng tùy thuộc vào mức độ liên kết.

Nước liên kết hóa học: nước liên kết rất chặt chẽ với các thành phần trong thực phẩm và rất khó để tách chúng ra khỏi tương tác CHƯƠNG 4.

hóa học này.

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯƠNG NƯỚC

Nước liên kết hấp thụ: độ bền liên kết kém hơn trong liên kết hóa

TRONG THỰC PHẨM 4.1.

học và được hình thành do tương tác lưỡng cực của nước với các

GIỚI THIỆU CHUNG

Nước là thành phần vốn có ở hầu hết cơ thể sinh vật và chiếm khoảng 90%

thành phần phân cực trong thực phẩm.

khối lượng tươi của một số nguyên liệu thực vật. Do đó, nước giữ vai trò quan

Nước liên kết mao quản: nước được hấp thụ bởi các phần tử ở bề

trọng đối với sự sống nói chung và ngành công nghiệp thực phẩm nói riêng.

mặt mao quản rồi di chuyển vào bên trong các mao quản.

Hàm lượng nước trong thực phẩm dao động khá rộng từ rất nhỏ trong các loại

Nước liên kết là nước tham gia liên kết với các phân tử khác bằng lực

hạt ngũ cốc khô đến rất lớn ở các loại nguyên liệu tươi sống như rau, quả tươi.

Vanderwal, liên kết hydro, liên kết ion… Khi nước ở dạng liên kết thì nước

Dù không cung cấp năng lượng nhưng nước lại giữ vai trò ổn định cấu trúc

không còn những tính chất như nước tự do. Cụ thể, nước liên kết không còn

đặc trưng cho mỗi sản phẩm thực phẩm. Nước vừa có thể đóng vai trò là môi

khả năng là dung môi hòa tan các chất khác, không đóng băng và khó bốc hơi

trường phản ứng mà cũng vừa có thể là chất tham gia phản ứng xảy ra trong

hơn nước tự do.

thực phẩm.

Xác định chính xác lượng nước có trong thực phẩm là điều quan trọng vì

Nước không chỉ là một nguyên liệu quan trọng không thể thiếu của công nghiệp thực phẩm mà nước còn là yếu tố ảnh hưởng lớn đến tính chất của nguyên liệu và sản phẩm thực phẩm. Dựa vào hàm lượng nước có trong thực phẩm mà người ta chia thực phẩm thành 3 nhóm:

nó ảnh hưởng quyết định đến hiệu quả chế biến, bảo quản những sản phẩm này.

Hàm lượng nước được đánh giá thông qua độ ẩm hoặc hoạt độ nước. Có nhiều phương pháp xác định hàm lượng nước trong thực phẩm, dưới đây là

Thực phẩm có hàm lượng nước cao: hàm lượng nước chiếm hơn 40%.

một số phương pháp tiêu biểu:

Thực phẩm có hàm lượng nước trung bình: hàm lượng nước từ 10 – 40% 77

Xác định độ ẩm 78

Phương pháp khối lượng

hơi khi nhiệt độ tăng. Mặc dù vậy, phương pháp khối lượng vẫn được lựa

Phương pháp chuẩn độ Karl Fischer

chọn là phương pháp chuẩn để xác định hàm ẩm. o

Phương pháp xác định gián tiếp thông qua Brix

Phương pháp này chỉ cần một lượng mẫu nhỏ đã được đồng nhất và có thể

Xác định hoạt độ nước

4.2.

xác định chính xác độ ẩm trong khoảng từ 0,01% đến 99,99%. Sau đây,

Phương pháp điểm sương

chúng tôi sẽ trình bày cách tiến hành xác định độ ẩm bằng thiết bị sấy đối lưu.

Phương pháp đường đẳng áp

4.2.2. Phương pháp chuẩn độ KarlFischer

Không giống như phương pháp khối lượng khi giả sử tất cả các chất bay

MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NƯỚC

4.2.1. Phương pháp khối lượng

hơi được loại ra dẫn đến sự giảm khối lượng mẫu là nước, phương pháp chuẩn

Độ ẩm trong mẫu được xác định bằng cách xác định sự chênh lệch khối

độ Karl Fischer là phương pháp trực tiếp xác định hàm lượng nước. Phương

lượng mẫu trước và sau khi sấy trong thiết bị sấy thích hợp (tủ sấy đối lưu, sấy

pháp này đặc biệt thích hợp với mẫu có độ ẩm thấp (nhỏ hơn 1%) và có thể

chân không hoặc microwave) và trong một thời gian sấy nhất định để hóa hơi

xác định hàm lượng ẩm ở mức 0,01%. Phương pháp Karl Fischer cũng thích

hoàn toàn nước có trong mẫu.

hợp khi xác định hàm lượng nước của những mẫu có hàm lượng đường hay

Phương pháp khối lượng được sử dụng đế xác định độ ẩm còn được gọi là phương pháp sấy đến khối lượng không đổi. Bởi phương pháp này sử dụng sự

protein cao, mà không cần phải lo lắng về khả năng các chất này có thể phân hủy khi xác định hàm lượng nước như ở phương pháp khối lượng.

chênh lệch khối lượng của mẫu trước và sau khi sấy đến khối lượng không đổi

Bản chất của phương pháp là dựa vào sự chuẩn độ nước bằng dung dịch

để tính toán giá trị độ ẩm. Chính vì sự chênh lệch khối lượng của mẫu được sử

methanol khan có chứa iod, SO2 và một lượng dư pyridine. Chuẩn độ dựa trên

dụng để tính toán độ ẩm mà phương pháp này được đánh giá là phương pháp

phản ứng giữa iod với SO2, phản ứng này chỉ xảy ra khi có sự hiện diện của

không phản ánh chính xác lượng nước có trong mẫu. Điều này được lý giải

nước theo phương trình:

như sau: thứ nhất là, không phải tất cả nước có mặt trong thực phẩm đều có

I2-Pyr + SO2-Pyr + Pyr + H2O SO3-Pyr + 2PyrH+I-(Pyr được ký hiệu cho

thể bay hơi một cách dễ dàng khi tiến hành sấy mẫu mà chỉ có một phần nước

pyridine)

tồn tại trong mẫu không bị bay hơi khi sấy. Chẳng hạn, nước liên kết khó có thể bay hơi hoàn toàn khỏi mẫu. Lý do thứ hai đó là tốc độ của quá trình bay hơi nước sẽ tăng nhanh khi nhiệt độ sấy tăng. Tuy nhiên, thực phẩm là một tổ

Sản phẩm SO3-Pyr tiếp tục phản ứng với methanol tạo thành

anion

methylsulfate: SO3-Pyr + CH3OH PryH+CH3SO4-

hợp của rất nhiều thành phần nhạy cảm với nhiệt độ cao. Khi nhiệt độ sấy tăng

Từ các phản ứng trên có thể thấy rằng mỗi một mol nước cần một mol I2.

lên đến hoặc cao hơn 100°C thì những hợpc chất này có thể bị biến đổi thành

Điểm tương đương của quá trình chuẩn độ đạt được khi chuẩn độ mẫu với

những hợp chất khác nhau. Lý do cuối cùng đó là không chỉ có nước mới bị

thuốc thử Karl Fischer cho đến khi màu iod bền (điều này cho thấy tất cả nước

hóa hơi khi bị xử lý nhiệt mà còn có một số những thành phần khác cũng hóa

đã phản ứng hết). Trong quá trình thực hiện phản ứng, màu của dung dịch

79

80

thường thay đổi từ màu vàng sang màu nâu, điều này gây khó khăn cho quá

Với phương pháp này có thể xác định độ ẩm nhỏ hơn 0.01%. Thời gian

trình phát hiện điểm tương đương bằng trực quan khi chuẩn độ thể tích. Ngoài

phân tích mất từ 20-45 phút (tùy thuộc vào mẫu) bao gồm: hiệu chuẩn, đo

ra, điểm tương đương có thể dễ dàng được nhận biết khi thực hiện bằng

blank, trích ly mẫu trong dung môi Karl Fischer và kiểm tra.

phương pháp chuẩn độ điện thế.

4.3.

Phần này, chúng tôi sẽ giới thiệu phương pháp chuẩn độ thể tích Karl Fischer với mẫu sử dụng ở dạng rắn và có độ ẩm thấp.

PHƯƠNG PHÁP NỘI SUY GIÁN TIẾP ĐỂ ƯỚC TÍNH LƯỢNG NƯỚC BẰNG CÁCH ĐO OBRIX Phương pháp gián tiếp xác định hàm lượng nước có thể chia thành 2 nhóm:

Chuẩn độ Karl Fischer có thể phân làm 2 loại: chuẩn độ điện dẫn và chuẩn

nhóm phương pháp khối lượng, tức là xác định khối lượng mẫu trước và sau

độ thể tích. Trong chuẩn độ Karl Fischer màu, một trong những biện pháp xác

khi sấy và nhóm phương pháp xác định nồng độ chất tan trong mẫu từ đó suy

định lượng nước phản ứng tại điện cực bằng cách đo lượng điện (Culông) cần

ra nồng độ nước. Khi xác định hàm lượng nước dựa trên việc xác định nồng

thiết để thực hiện phản ứng hoàn toàn giữa nước và thuốc thử Karl Fischer.

độ chất tan trong mẫu có hai giả định cần được thực hiện. Giả định đầu tiên là

Ưu điểm của phương pháp là không cần chất chuẩn nhưng độ nhạy rất cao (có

đặc tính của phép đo phải có một độ lặp dựa trên nồng độ chất tan. Giả định

thể xác định đến 10µg nước) và rất hữu ích cho xác định ở dạng vết. Đối với

thứ hai là nồng độ nàycó thể được chuyển đổi chính xác sang hàm ẩm.

chuẩn độ Karl Fischer thể tích dựa trên chất chuẩn (đó là thuốc thử Karl

Những phương pháp gián tiếp dựa vào việc ước lượng nồng độ chất tan

Fischer) khi nó được thêm vào để phản ứng với nước hiện diện trong mẫu. Từ

thường sử dụng đường cong hiệu chỉnh để biểu diễn mối quan hệ giữa đặc tính

thể tích thuốc thử có nồng độ chính xác tiêu tốn tại điểm tương đương có thể

được đo với nồng độ chất tan, từ đó suy ra hàm lượng nước. Hai phương pháp

xác định nồng độ nước nên vấn đề chuẩn hóa thuốc thử rất quang trọng.

cổ điển dành cho việc ước lượng hàm lượng chất tan là dựa vào khối lượng

Phương pháp này có thể xác định lượng ẩm từ 10 ppm đến 100%.. Mặc dù

riêng và chỉ số khúc xạ của dung dịch vì khối lượng riêng (hay chỉ số khúc xạ)

không nhạy với những mẫu có lượng ẩm rất nhỏ so với phương pháp chuẩn độ

sẽ thay đổi khi nồng độ chất tan của dung dịch thay đổi.

Karl Fischer màu nhưng chuẩn độ Karl Fischer thể tích cho phép đo trong một

4.3.1. Ước lượng nồng độ bằng khúc xạ kế

khoảng dao động lớn.

4.3.1.1. Nguyên tắc

Thuốc thử Karl Fischer không ổn định do đó phải được chuẩn hoá thường

Chỉ số khúc xạ là một hệ quả của sự thay đổi tốc độ ánh sáng trong các môi trường khác nhau, được xác định bằng tỷ số giữa vận tốc ánh sáng trong chân

xuyên. Có thể sử dụng thuốc thử thương mại vì nó ổn định hơn.

Việc nhiễu có thể xảy ra đối với các mẫu có chứa những thành phần làm

không với vận tốc ánh sáng trong môi trường. Nếu ánh sáng trong chân không

giảm lượng iod. Mẫu chứa hàm lượng ketone hoặc aldehyde cao, đặc biệt khi

là tia tới theo đường biên bề mặt phẳng với môi trường, thì chỉ số khúc xạ

đo ở độ ẩm thấp, có thể có vấn đề vì những chất này có thể tạo ra nước.

cũng là tỷ số của sin góc tới của tia ánh sáng trong chân không và sin của góc khúc xạ trong môi trường.

81

82

Chỉ số khúc xạ của một chất so với không khí là tỷ lệ giữa sin góc tới và

khúc xạ tự động khác không yêu cầu mẫu được đặt vào giữa hai lăng kính.

sin góc khúc xạ của chùm tia sáng truyền từ không khí vào chất đó. Trong

Thiết bị loại này yêu cầu mẫu được đặt trên bề mặt thủy tinh và sự phát hiện

thực tế thường được sử dụng không khí là môi trường tham khảo chứ không

dựa vào phản xạ tới hạn bên trong đến thủy tinh. Trong thiết bị này sử dụng

phải là chân không. Chỉ số khúc xạ của không khí ở 1 atm, 25°C là 1.00027,

đầu dò điện tử và chế độ bù trừ nhiệt có thể được lập trình khi vận hành.

giá trị này có thể được sử dụng như một hằng số để xác định chỉ số khúc xạ

4.3.1.2. Cách tiến hành

thực của hệ thống.

a. Dụng cụ, hóa chất

Chỉ số khúc xạ là một đặc tính vật lý của môi trường, nó phụ thuộc vào

Khúc xạ kế Abbe (UPF-22 hoặc UPF-23 hoặc tương đương)

bước sóng ánh sáng và nhiệt độ đo. Nó có thể được xác định bằng cách nhận

Máy điều nhiệt

dạng góc phản xạ tới hạn, đó là góc tới, góc giới hạn giữa bề mặt ranh giới của

Nhiệt kế chuẩn xác ( loại 4 E.2 )

o

một tia ánh sáng trong môi trường mà tại đó góc khúc xạ bằng 90 . Bất kỳ tia

Rượu etanola tinh khiết hoặc các dung môi tinh khiết khác.

ánh sáng bên trong môi trường đến bề mặt với một góc tới lớn hơn góc giới hạn sẽ bị phản xạ nội toàn phần.

Trong thực tế, góc phản xạ tới hạn được đo tại biên của chất lỏng bằng lăng kính thủy tinh có chỉ số khúc xạ đã biết, chứ không phải tại biên của chất lỏng với khí. Một thiết bị thông dụng là khúc xạ kế Abbe có sử dụng lăng kính bù trừ (lăng kính Amici) cho phép sử dụng ánh sáng trắng để xác định chỉ số khúc xạ ánh sáng của bước sóng của dòng sodium D (kết quả đọc tương ứng với vạch D của đèn natri). Điều này là một lợi thế vì nguồn ánh sáng trắng có sẵn hơn nguồn sodium D và do đó việc sử dụng khúc xạ kế cầm tay rất khả thi.

(a)

(b)

Hình 4.1: (a) Brix kế cầm tay, (b) Brix kế để bàn b. Chuẩn bị xác định − Trước khi xác định, phải rửa bề mặt lăng kính của khúc xạ kế bằng vài

Yêu cầu đầu tiên là mẫu phải ở dạng dung dịch. Trong một vài thiết bị, dung dịch được đặt giữa hai lăng kính và hình ảnh của đường biên tia giới hạn được điều chỉnh để gặp mốc tham khảo. Sự điều chỉnh này để chỉ số khúc xạ và đương lượng oBrix có thể được đọc từ một thang đo. Nhiệt độ mẫu phải

giọt rượu hay dung môi khác, lau sạch và thấm khô bằng giấy lọc hoặc vải lụa sạch, mềm và không bị xơ bông. − Nối máy điều nhiệt với vỏ lăng kính của khúc xạ kế và cho nước có nhiệt độ 20oC đi qua vỏ trong 15 đến 20 phút.

được xác định, hoặc thiết bị phải có chế độ bù trừ nhiệt. Một số khúc xạ kế kỹ

− Trước khi bắt đầu thí nghiệm, phải kiểm tra lại độ chính xác của thiết bị

thuật số tự động sử dụng phương pháp trình bày mẫu tương tự nhưng chúng có

với nước cất hai lần, độ khúc xạ của nước cất này ở 20oC bằng 1,3330

thể tự động ghép đôi biên giới hạn tới mốc tham khảo. Một số loại thiết bị đo 83

84

hoặc theo chất lỏng mẫu kèm theo khúc xạ kế. Việc tiến hành kiểm tra dựa theo bản hướng dẫn kèm theo máy.

− Lấy giá trị trung bình số học của hai lần xác định song song làm kết quả thí nghiệm, đồng thời chênh lệch giữa kết quả hai lần đo không được

− Nếu khúc xạ kế không theo đúng chỉ số khúc xạ của nước hoặc mẫu nói trên, phải dùng núm hiệu chỉnh số 0 để hiệu chỉnh về độ chia cần thiết. c. Tiến hành xác định

vượt quá 0.0003. − Sau khi kết thúc, phải rửa cẩn thận bề mặt lăng kính bằng rượu hoặc bằng các dung môi tinh khiết khác (điều này phụ thuộc vào độ hoà tan

− Dùng pipet nhỏ một đến hai giọt mẫu lỏng lên bề mặt của lăng kính (bề mặt này đã được rửa sạch và làm khô từ trước), nhưng không được chạm pipet vào lăng kính, sau đó nhanh chóng kết hợp hai lăng kính và

của chất nghiên cứu) và làm khô lăng kính như trước khi bắt đầu xác định.

4.3.1.3. Một số lưu ý

− Để xác định chỉ số khúc xạ ở các nhiệt độ cao hơn 20oC cũng phải làm

ép chúng lại.

Với những chất lỏng dễ bay hơi phải nhỏ qua lỗ vào khe giữa hai lăng

tương tự nghĩa là cho nước có nhiệt độ cần thiết qua vỏ lăng kính của

kính. Nhẹ nhàng đặt ống nhìn ở vị trí nằm nghiêng.

khúc xạ kế.

− Điều chỉnh gương tương ứng với nguồn sáng tự nhiên hoặc nhân tạo sao

− Trong trường hợp nhiệt độ phòng cao hơn nhiệt độ cần xác định chỉ số

cho có được sự chiếu ánh sáng mạnh nhất trường quan sát về xuất hiện

khúc xạ thì phải làm theo một trong các phương pháp sau đây:

ranh giới sáng tối (đen trắng).

Tiến hành xác định trong các phòng có máy điều hoà nhiệt độ.

Nếu ranh giới sáng tối có chút màu, thì phải quay lăng kính bù trừ để

Đặt một chậu nước có làm lạnh bằng đá xuống dưới 20oC ngay cạnh

triệt tiêu màu. Nếu hai vùng sáng tối không thật rõ rệt thì cần rửa cẩn

máy điều nhiệt. Nước hồi lưu cho chảy qua một ống xoắn bằng kim loại

thận lăng kính ở chỗ tia sáng đi vào.

đặt trong chậu rồi mới chảy về máy điều nhiệt. Phải chờ cho nhiệt độ vỏ

Sau đó từ từ quay núm quay gắn với thang chia độ hình cung cho đến

lăng kính xuống 20oC (hoặc nhiệt độ cần thiết khác) rồi mới tiến hành

khi ranh giới sáng tối cắt giao điểm hai vạch đen một cách chính xác và

xác định.

cân đối.

Nếu chất lỏng xác định có chỉ số khúc xạ tỷ lệ tuyến tính với nhiệt độ

− Việc tính toán chỉ số khúc xạ được tiến hành nhờ một kính lúp ở thang chia độ hình cung theo vạch chia tương ứng với đường ngầm của thang.

Ghi lại kết quả thu được và lặp lại năm lần (lần lượt từ trên xuống và từ

thì có thể xác định chỉ số khúc xạ ở hai nhiệt độ khác nhau rồi ngoại suy về nhiệt độ cần thiết. − Trong trường hợp độ ẩm không khí lớn hơn nước thường đọng ở lăng

dưới lên) sau đó lấy giá trị trung bình của năm lần đo, coi đó là kết quả

kính khúc xạ kế làm mờ đi, ảnh hưởng đến độ chính xác của phép đo.

xác định.

Phải dùng giấy lọc hay vải sạch thấm khô lăng kính ở phần đi vào và đi ra của ánh sáng.

85

86

− Với những chất có nhiệt độ sôi quá thấp bay hơi rất nhanh, không nên

trọng kế khác nhau có sự khác nhau trong tỷ lệ của thể tích bầu chính với thể

mở lăng kính mà phải nhỏ chất lỏng nghiên cứu qua khe hở giữa hai

tích thân đo. Ngoài ra, chúng còn có sự khác nhau về khối lượng, do đó mức

lăng kính của khúc xạ kế.

bị nhúng chìm dưới nước là khác nhau. Độ nhạy của tỷ trọng tăng khi độ

4.3.2. Ước lượng nồng độ bằng tỷ trọng kế

mỏng của thân giảm, nhưng điều này lại làm giảm giới hạn đo của tỷ trọng.

4.3.2.1. Nguyên tắc

Khi sử dụng, để xác định tỷ trọng của dung dịch một cách chính xác, đầu tiên

Tỷ trọng kế được sử dụng để xác định khối lượng riêng hoặc trọng lượng

người ta sử dụng tỷ trọng có giới hạn đo lớn để ước lượng giá trị đo, sau đó

riêng của một chất lỏng sử dụng nguyên lý của lực đẩy Archimedes. Những

dùng một tỷ trọng tinh có giới hạn đo phù hợp để xác định chính xác giá trị tỷ

kết quả lực đẩy Archimedes từ áp lực từ dưới lên trên bất kỳ đối tượng bị

trọng.

nhúng chìm hoặc bị nhúng một phần trong chất lỏng. Áp lực từ dưới lên được

4.3.2.2. Cách tiến hành

tạo ra như một hệ quả của khối lượng chất lỏng bị thế chỗ. Tại điểm của phần

a. Dụng cụ, hóa chất

bị nhúng chìm khi áp lực từ dưới lên vừa bằng khối lượng của tỷ trọng kế, thì

Tỷ trọng kế có độ chia phù hợp. Nếu không biết độ chia phù hợp có thể

tỷ trọng kế sẽ nổi. Mực chất lỏng có thể được đo dựa theo thang đo đã khắc

lựa chọn tỷ trọng có giới hạn đo lớn. Sau khi đo có thể ước lượng được

trên tỷ trọng kế. Một cách đơn giản, khối lượng riêng là khối lượng của tỷ

giá trị đo, trên cơ sở đó lựa chọn tỷ trọng có giới hạn đo phù hợp để thu

trọng kế chia cho thể tích chất lỏng bị chiếm chỗ khi tỷ trọng kế nổi.

kết quả chính xác.

Tỷ trọng kế được thiết kế với phần chân đế có bầu rộng và phần đỉnh hình

Nhiệt kế

ống hẹp. Giả sử rằng mức chất lỏng bên trong phần ống, thể tích chất lỏng thế

Bộ điều nhiệt

chỗ là thể tích của bầu cộng với phần tương đương vị trí của chất lỏng trong

Bình hình trụ bằng thuỷ tinh không màu có đường kính tối thiểu phải

phần thân tỷ trọng kế. Khi thể tích bầu lớn trái ngược với thân, một sự thay đổi nhỏ về tỷ trọng sẽ gây kết quả biến động lớn trên vạch của thân tỷ trọng.

Những vạch tương ứng với những thể tích thay thế khác nhau được khắc trên thân tỷ trọng. Những vạch này có thể được đặt nhãn như những giá trị tỷ trọng o

lớn hơn đường kính lớn nhất của tỷ trọng kế 25 mm. b. Tiến hành xác định Trước khi xác định, phải rửa tỷ trọng với nước cất và lau sạch và thấm khô bằng giấy lọc hoặc vải lụa sạch, mềm và không bị xơ bông.

hoặc như những nồng độ dung dịch đường tương đương ( Brix). Kích thước

Cho dung dịch mẫu vào bình hình trụ sạch và khô sao cho mức chất

của bầu và thân tỷ trọng xác định phạm vi tỷ trọng hoặc khối lượng riêng của

lỏng cách miệng bình 4 cm. Đưa bình hình trụ có chất lỏng vào bể điều

tỷ trọng kế.

nhịêt và giữ 20 phút ở nhiệt độ 20±0.1oC, sau đó dùng nhiệt kế vừa

Tỷ trọng kế đã được hiệu chỉnh trước bởi nhà sản xuất, những phép hiệu

khuấy vừa đo nhiệt độ của chất lỏng . Khi nhiệt độ của chất lỏng đạt

chỉnh này chỉ có giá trị ở một nhiệt độ xác định. Do đó trước khi sử dụng cần

20±0.1oC cẩn thận thả tỷ trọng kế khô vào bình hình trụ sao cho tỷ trọng

hiệu chỉnh lại bằng cách sử dụng những dung dịch đường đã biết nồng độ. Tỷ

kế không chạm vào đáy và thành bình hình trụ. Sau 3-4 phút đọc trực

87

88

tiếp mật độ của chất lỏng. Khoảng cách đáy dưới của tỷ trọng kế đến

nhiên sai số này không đáng kể). Do đó nhiệt độ của chất lỏng phải tương ứng

đáy hình trụ không được nhỏ hơn 3 cm.

với nhiệt độ ghi trên tỷ trọng kế (thường là 20oC). Trong trường hợp phải đo

Sau khi đo kiểm tra lại nhiệt độ của chất lỏng, nếu sự thay đổi nhiệt độ o

tỷ trọng của dung dịch có nhiệt độ cao hơn nhiệt độ ghi trên tỷ trọng kế, cần

lớn hơn 2 C, cần phải đo lại. Hoặc có thể sử dụng phương pháp hiệu

lập bảng hiệu chỉnh, đồng thời dựa vào bảng này để xác định sai số trong quá

chỉnh nhiệt độ tương ứng.

trình đo.

Tỷ trọng của chất lỏng ứng với độ chia của tỷ trọng kế theo điểm dưới của mặt cầu lõm đối với chất lỏng trong suốt và sáng màu và giới hạn trên của mặt cầu lõm đối với chất lỏng hơi đục và tối màu.

Khi đọc chỉ số, tỷ trọng kế phải đứng yên, không chạm vào đáy và thành bình.

Ngoài việc dùng tỷ trọng kế, còn rất nhiều phương pháp khác xác định tỷ

Sau khi sử dụng xong, tỷ trọng kế được rửa sạch, lau khô và đặt vào hộp.

trọng của dung dịch. Một phương pháp nữa rất thường hay xác định tỷ trọng của dung dịch đó là sử dụng bình đo tỷ trọng.

4.3.3. Xác định tỷ trọng bằng bình đo tỷ trọng

c. Tính kết quả Kết quả đo trung bình của hai lần đo liên tiếp.

4.3.3.1. Nguyên tắc

Tỷ trọng của mẫu thử được xác định bằng cách so sánh khối lượng mẫu thử Giá trị đo

và nước trong cùng 1 bình tỷ trọng ở 20oC. 4.3.3.2. Dụng cụ, hóa chất

Dung dịch mẫu

Bình tỷ trọng có kích thước và kiểu dáng thích hợp với chất lỏng cần đo Bể điều hoá nhiệt có thể điều chỉnh được nhiệt độ ở 20oC ± 0.1oC.

Tỷ trọng kế

Nhiệt kế

Hình 4.2 Xác định nồng độ bằng tỷ trọng kế Một số lưu ý

Tỷ trọng kế được nhà sản xuất thiết kế với nhiệt độ đo chuẩn là ở 20oC. Nếu nhiệt độ đo lớn hơn hay nhỏ hơn ở 20oC, cần phải hiệu chỉnh. Vì nếu nhiệt độ thay đổi, dẫn đến sự thay đổi sức căng bề mặt gây ra sai số (sai số đáng kể). Mặc khác, nhiệt độ cao, thủy tinh giản nở gây ra sai số khi đo (tuy 89

Hình 4.3 Bình đo tỷ trọng 90

4.3.3.3. Tiến hành

Cân bình tỷ trọng sạch và khô (cả nút) với độ chính xác đến 0.0001g Cho nước cất đã đun sôi và để nguội vào bình, xác định khối lượng nước chứa trong bình một cách chính xác sau khi đã để trong bể điều hoà nhiệt có nhiệt độ 20oC ± 0.1oC. Ghi khối lượng của nước cất trong bình (m2) .

Cho mẫu vào cùng bình tỷ trọng đã rửa sạch sấy khô xác định chính xác khối lượng của mẫu chứa trong bình ở 20oC ghi khối lượng (m1). Đối với chất lỏng để bay hơi cần phải thao tác hết sức cẩn thận để tránh mất mát do bị bay hơi.

4.3.3.4. Tính kết quả

Kết quả có thể biến đổi với các điều kiện áp suất nhưng thông thường CHƯƠNG 5.

sự biến đổi này không đáng kể và ta có thể bỏ qua được.

Khối lượng riêng của mẫu ở 20oC tính bằng g/ml được tính theo công thức sau:

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN TRONG THỰC PHẨM

5.1.

GIỚI THIỆU CHUNG

5.1.1. Protein trong thực phẩm

Protein là thành phần có nhiều ở trong tất cả các tế bào. Trừ một số loại protein dự trữ, hầu hết protein đều có chức năng sinh học quan trọng hoặc có

Trong đó: o

m1: khối lượng chính xác của mẫu thử cho vào bình ở 20 C tính

vai trò tạo cấu trúc cho tế bào. Protein là đại phân tử được cấu tạo từ các axit amin. Trong phân tử, các axit amin liên kết với nhau bằng liên kết peptit tạo

bằng g m2: khối lượng chính xác của nước cất cho vào bình ở 20oC tính

thành chuỗi peptit. Phân tử protein có thể chứa một hay nhiều chuỗi peptit.

Các nguyên tố hóa học tham gia vào cấu tạo của protein gồm hydro, carbon,

bằng g dnước: khối lượng riêng của nước ở 20oC bằng 0.9982g/ml

nitơ, oxy, lưu huỳnh, có thể có photpho và một số nguyên tố khác. Khối lượng

A: số hiệu chỉnh được tính bằng A = Pa.m2 (Pa là khối lượng

phân tử của protein tương đối lớn và dao động trong một khoảng rộng từ 5000 đến hơn 1,000,000 đơn vị dalton. Một điều đặc biệt khi nghiên cứu hàm lượng

riêng của không khí bằng 0.001g/ml)

các nguyên tố có mặt trong phân tử protein thì người ta nhận thấy rằng nitơ là nguyên tố có hàm lượng thay đổi nhất trong số các nguyên tố có mặt trong 91

92

protein. Hàm lượng nitơ thay đổi từ 13,4% đến 19,1% do sự khác nhau về

urea và các ion amonium. Do đó, phụ thuộc vào phương pháp phân tích, các

thành phần axit amin có trong protein. Nói chung, những loại protein giàu axit

thành phần khác của thực phẩm có thể ảnh hưởng đến kết quả phân tích

amin kiềm tính chứa nitơ nhiều hơn.

protein ở mức độ khác nhau. Thông thường để khảo sát hàm lượng protein thì

Protein có thể được phân loại theo thành phần, cấu trúc, chức năng sinh học hoặc tính tan. Ví dụ, protein đơn giản chỉ chứa các axit amin, tuy nhiên protein phức tạp còn chứa thêm các thành phần khác không có bản chất protein.

cần phải tiến hành bước tinh sạch bằng các phương pháp như : kết tủa thuận nghịch, sắc ký ái lực…

Nhiều phương pháp xác định hàm lượng protein đã được phát triển.

Nguyên tắc chung của các phương pháp này dựa trên việc xác định hàm lượng

Chính vì kích thước phân tử lớn làm cho protein tạo thành dịch keo khi hòa tan. Và các phân tử keo này không thể đi qua màng bán thấm nên có thể tiến

nitơ nguyên tố, liên kết peptit, axit amin thơm, khả năng nhuộm màu, độ hấp thụ tử ngoại của protein và tính chất khuếch tán ánh sáng.

hành tinh sạch protein ra khỏi những thành phần có kích thước nhỏ. Độ bền

Những yếu tố cần được xem xét khi lựa chọn phương pháp phân tích đó là

của dịch keo phụ thuộc vào pH, nhiệt độ và mức độ hydrat hóa. Khi loại bỏ

độ nhạy, độ đúng, độ chính xác, thời gian và chí phí phân tích, các đặc điểm

các yếu tố giúp bền hệ keo thì các phân tử protein sẽ kết tụ lại với nhau. Đặc

của vật liệu phân tích.

tính này cũng được lợi dụng để tinh sạch protein hay để sản xuất những sản

5.1.2. Vai trò của việc phân tích protein

Phân tích protein có vai trò quan trọng vì các mục đích sau:

phẩm giàu protein như đậu hủ, phô mai…

Hiện tượng protein chuyển từ trạng thái keo trong dung dịch thành dạng

Khai báo giá trị dinh dưỡng trên nhãn

kết tụ còn được gọi là hiện tượng kết tủa protein hay biến tính protein. Sự biến

Khảo sát các tính chất chức năng. Protein trong nhiều loại thực phẩm có

tính protein được chia thành hai loại: loại thứ nhất là biến tính thuận nghịch,

các tính chất chức năng đặc biệt: ví dụ, gliadin và glutenin của bột mì

khi loại bỏ tác nhân gây biến tính thì phân tử protein trở về trạng thái ban đầu

để làm bánh mì, cazein trong sữa để đông tụ trong sản xuất pho mai và

và loại thứ hai là biến tính không thuận nghịch là khi loại bỏ tác nhân gây biến

albumin trứng để tạo bọt.

tính mà protein vẫn không thể trở về trạng thái ban đầu được. Khi bị biến tính

Xác định hoạt tính sinh học. Một số protein, như enzym và chất ức chế

thì tính tan, cấu trúc không gian cũng như tính chất chức năng của protein có

enzym là đối tượng nghiên cứu của khoa học thực phẩm và dinh dưỡng

thể bị thay đổi.

học. Ví dụ, các enzym protease để làm mềm thịt, pectinase trong quá

Phân tích protein là một quy trình phức tạp do khả năng gây nhiễu của một số thành phần thực phẩm khác có những tính chất hóa lý tương tự như protein.

Hay khi phân tích hàm lượng nito trong prtein cũng sẽ gặp một vấn đề đó là nitơ không chỉ có nguồn gốc từ protein mà còn từ các axit amin tự do, peptit

trình chín của quả và chất ức chế trypsin trong hạt họ đậu đều có bản chất protein.

Ngoài ra, phân tích hàm lượng protein để nhà sản xuất đánh giá sự đồng đều của các lô hàng trong sản xuất.

nhỏ, axit nucleic, phospholipit, porphyrin và một số vitamin, alcaloit, axit uric, 93

94

5.2.

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH PROTEIN

Dùng Se sẽ làm cho tốc độ phản ứng nhanh hơn so khi dùng CuSO4 nhưng

5.2.1. Xác định protein tổng theo phương pháp Kjeldahn

lại xảy ra tiêu hao một số đạm vì các phản ứng sau đây:

Nguyên tắc của phương pháp này là vô cơ hóa mẫu thực phẩm bằng H2 SO4 đậm đặc với chất xúc tác để hình thành (NH4)2 SO4. Khi đó, kiềm mạnh (NaOH hoặc KOH) sẽ đẩy NH3 từ muối (NH4 )2SO4 . Hệ thống ngưng tụ sẽ giúp ngưng tụ NH3 vào bình hứng có chứa sẵn một lượng dư H2SO4 .

(NH4)2SO4

+ H2SeO3 → (NH4)2SeO3 + H2SO4

(NH4)2SeO3 → 3H2O + 2/3NH3 + Se + 2/3N2 Xúc tác thủy ngân: 2HgO → Hg2O + O

Định phân lượng H2 SO4 dư bằng dung dịch NaOH, từ đó xác định được

Hg2O → Hg + HgO

lượng H 2SO4 đã phản ứng và tính được hàm lượng nitơ tổng có trong mẫu.

Hg + H2SO4→ HgO + SO2 + H2O

Các Phương trình phản ứng xảy ra:

Dùng xúc tác thủy ngân cũng làm hao hư một số đạm. Đó là (NH2Hg)2SO4.

Quá trình vô cơ hóa mẫu:

Để loại trừ hợp chất này người ta dùng bột kẽm và chất kiềm để tạo ra H+, H+

Xúc tác, to

này sẽ khử hợp chất này trở lại (NH4)2SO4. Thủy ngân củng cố tốc độ phản

RCH(NH2)COOH + H2SO4 đđ → CO2 + SO2 + NH3 + H2O

ứng rõ rệt nhưng có nhiều phiền phức, tốn kém và độc hại. Còn K2SO4 được

NH3 + H2SO4đđ → (NH4)2SO4

dùng để tăng nhiệt độ sôi của dung dịch lên gần 300 - 4000C.

Quá trình chưng cất:

Hàm lượng protein thô theo % (X) được tính bằng công thức:

Dùng dung dịch NaOH đuổi NH3 ra khỏi dung dịch.

NaOH + (NH4)2SO4→

Na2SO4 + NH3 + H2O

X1 =

[(V B − V S ) × N × 0,014 × 100 × K ] M

,%

NH3 bay sang bình hứng có chứa dung dịch H2SO4(đã biết trước nồng độ, thể tích).

X 2 = X 1 × 6.25, %

2NH3 + H2SO4→ (NH4)2SO4

Trong đó:

Cơ chế tác dụng của chất xúc tác:

N: Nồng độ dung dịch chuẩn NaOH, N

Xúc tác CuSO4:

VB: Thể tích dung dịch NaOH chuẩn mẫu trắng, mL

2CuSO4 → Cu2SO4 + SO2 +2O

Vs: Thể tích dung dịch NaOH chuẩn mẫu thử, mL

Cu2SO4 + H2SO4 → CuSO4 + SO2 + 2H2O

M: Khối lượng mẫu thử, g

Xúc tác Selenium: Se + H2SO4 →

K: Hệ số chuyển đổi nitơ sang đạm tương ứng (theo bảng4.1)

H2SeO3 + 2SO2 + 2H2O

H2SeO3

→ SeO2 + H2O

SeO2

→ Se + 2O

X1:Hàm lượng nitơ, % X2: Hàm lượng protein thô, %

95

96

Bảng 5.1Hệ số chuyển đổi nitơ protein của nhiều loại thực phẩm Thực phẩm

lại khí nitơ thoát ra. Đo lượng khí nitơ thoát ra bằng nitơ kế sẽ tính toán được hàm lượng protein có trong mẫu

Hệ số chuyển đổi

Trứng, thịt

6.25

Khi dùng phương pháp Dumas cần phải đảm bảo các oxit nitơ chuyển hoàn

Sản phẩm chế biến từ sữa

6.38

toàn thành nitơ, còn những khí không bị hấp thụ bởi dung dịch kiềm (ví dụ khí

Lúa mì

5.70

oxy và cacbon oxit) phải được loại hoàn toàn trước khi đi vào bình thu chứa

Các loại ngũ cốc khác, hạt có dầu

6.25

dung dịch kiềm. Khí nitơ sẽ được đẩy vào bình thu khí bằng khí CO2 được nén

Hạnh nhân

5.18

sẵn hoặc được tạo ra bởi dung dịch có tên là bình kip. Bình kip tạo ra CO2

Đậu phụng, đậu Braxin

5.46

bằng cách cho axít HCl đậm đặc vào đá vôi. Khí CO2 đẩy khí N2 vào nitơ kế

Các loại đậu khác, dừa

5.30

và sau đó CO2 bị hấp thụ bởi dung dịch kiềm KOH (nồng độ khoảng 50%).

Sau khi khí N2 đi vào khí áp kế, để cho nhiệt độ cân bằng khoảng 15 phút, sau

Phương pháp này được áp dụng với mọi trạng thái khác nhau của thực phẩm từ rắn, lỏng, sệt... với chi phí thấp, là phương pháp chính thức xác định

đó đo lần lượt nhiệt độ, áp suất và thể tích khí của khí áp kế và từ đó tính ra hàm lượng nitơ.

Lg %N = lgV + lga + (1 – lg(lượng cân))

protein thô, có thể đo lượng microgram protein bằng phương pháp cải tiến (phương pháp micro Kjedahl). Nhưng cần lưu ý rằng phương pháp này xác định hàm lượng nitơ tổng chứ không riêng gì hàm lượng nitơ từ protein, thời

Trong đó: V: thể tích khí ở điều kiện đã cho a: trọng lượng của 1 mL nitơ ở nhiệt độ và áp suất ghi trên khí áp kế

gian phân tích khá dài, và hóa chất có tính ăn mòn

Quy trình xác định hàm lượng protein theo phương pháp Dumas 5.2.2. Xác định protein tổng theo phương pháp Dusma

Nguyên tắc chung của phương pháp đó là mẫu được đốt cháy hoàn toàn bằng khí oxi tinh khiết ở nhiệt độ khoảng 950oC. Hỗn hợp khí sau quá trình đốt cháy chủ yếu là CO2, H2O, O2, NOx và N2. Ngoài ra,có thể có halogen, hiđro halogenua, các đioxit và trioxit của lưu huỳnh. Hỗn hợp khí được cho qua đồng kim loại và đồng oxit nóng đỏ. Các oxit của nitơ bị đồng phân huỷ thành nitơ và oxy, đồng thời oxy này cùng với oxy nằm trong các khí đốt tạo với đồng kim loại thành đồng oxit. Hợp chất cacbon oxit khi gặp đồng oxit sẽ bị oxy hoá thành cacbondioxit trước khi hấp phụ vào dung dịch kiềm chỉ còn 97

98

Hệ thống khí (Khí mang, khí oxy) Cho mẫu vào lò đốt (Cho mẫu rắn hoặc lỏng đã cân vào ống đựng hoặc giấy thiếc, tiêm mẫu lỏng Lò đốt hoạt động ở nhiệt ở nhiệt độ từ 850oC đến 1200oC (Nguồn oxy cung cấp cho lò đốt ở dạng điều chỉnh hoặc tự động) Chất hấp thụ (Dùng chất hấp thụ SO2/SO3, halogen tùy thuộc vào nhà sản xuất thiết bị) Loại nước bằng cách ngưng tụ, sử dụng bộ làm lạnh bằng điện Khử NOx thành N2 và loại oxy sinh ra bằng đồng Loại ẩm và CO2 bằng cách sử dụng các hóa chất khô Mg(ClO4)2 cho nước, NaOH cho CO2 Detector dẫn nhiệt (Dòng khí dùng cho xác định: khí mang và N2, dòng khí bù trừ: khí mang) Bộ xử lý tín hiệu

99

100

5.2.3. Phương pháp Biuret 5.2.3.1. Nguyên tắc

Trong môi trường kiềm, ion đồng (II) có khả năng tạo phức với các liên kết peptid sẽ tạo phức có màu tím hồng. Độ hấp thu của phức tạo thành được đo ở bước sóng 540 nm. Từ độ hấp thu đo được người ta có thể xác định hàm lượng protein có trong mẫu bằng phương pháp đường chuẩn. Đây là phương pháp phổ biến được sử để xác định hàm lượng protein vì phản ứng này là phản ứng đặc trưng của liên kết peptit.

Hình 5.1 Phản ứng xảy ra trong phương pháp Biuret.

5.2.3.2. Quy trình phân tích

Hoà 5 ml dung dịch cơ chất phản ứng biuret với 1 ml dung dịch protein (1-10 mg protein/ml). Dung dịch cơ chất phản ứng biuret gồm CuSO4, NaOH và tartrat kali natri (để ổn định ion đồng trong môi trường kiềm).

Sau khi hòa dung dịch phản ứng, để ở nhiệt độ phòng 15 phút hoặc 30 phút và đo mật độ quang của mẫu ở bước sóng 540 nm.

Nếu dung dịch phản ứng không trong suốt cần lọc hoặc ly tâm.

101

Xây dựng đường chuẩn với albumin của serum bò (BSA: Bovine Serum Albumin).

102

các gốc tyrosine và tryptophan của phân tử protein. Phức màu xanh da trời

5.2.3.3. Áp dụng

Phương pháp biuret được dùng để xác định hàm lượng protein có trong

tạo ra được đo ở bước song 750 nm. Từ quy trình ban đầu Miller và Hartree

ngũ cốc, thịt, đậu nành cũng như để đánh giá chất lượng thức ăn chăn nuôi

đã có những cải tiến để cải thiện độ tuyến tính của quan hệ giữa mật độ

(AOAC Method 935.11).

quang với nồng độ protein.

5.2.3.4. Ưu điểm

Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein

Là phương pháp phân tích protein đơn giản nhất.

trong một phạm vi nhất định. Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của

So với phương pháp Kjeldahl ít tốn kém hơn; nhanh hơn (có thể

protein chuẩn, ta có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên

hoàn thành nhanh hơn 30 phút).

cứu.

Ít có sự chênh lệch về màu sắc hơn so với các phương pháp Lowry, phương pháp đo hấp thụ UV hoặc đo độ đục.

Rất ít các hợp chất khác có trong thực phẩm gây nhiễu đến phản ứng biuret.

Giá trị đo được không tính nitơ từ các nguồn không phải từ peptid hoặc protein.

5.2.3.5. Nhược điểm

Không nhạy như phương pháp Lowry, đòi hỏi lượng protein tối thiểu

Hình 5.2 Phản ứng xảy ra trong phương pháp Lowry 5.2.4.2. Quy trình

cho phân tích 2-4 mg.

Mật độ quang đo được có thể bị tăng lên do sự có mặt của các sắc

Quy trình sau dựa trên những cải tiến của Hartree: Hòa tan mẫu protein cần phân tích đến hàm lượng thích hợp (20-100

màu khác.

Nồng độ muối amon cao ảnh hưởng đến phản ứng.

µg) Sau khi làm nguội, bổ sung dung dịch Tartrat Kali Natri - Na2CO3

Màu sắc khác nhau tùy loại protein: gelatin cho màu hồng tím.

Dung dịch trước khi đo có thể bị đục nếu có mặt lipit và carbohydrat

và ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút.

Cho thêm dung dịch CuSO4 – KNaC4H4O6 (Tartrat Kali Natri) –

ở nồng độ cao.

Không phải là phương pháp tuyệt đối: cần phải xây dựng đường

NaOH sau khi để nguội và ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút.

Bổ sung tiếp dung dịch phản ứng Folin mới được chuẩn bị, khuấy

chuẩn hoặc đối chiếu với phương pháp Kjeldahl.

đều và ủ ở 50oC trong 10 phút.

5.2.4. Phương pháp Lowry 5.2.4.1. Nguyên tắc

Đo mật độ quang ở 750 nm.

Phương pháp Lowry kết hợp phản ứng biuret với phản ứng khử của dung dịch Folin-Ciocalteau (phosphomolybdic/ phosphotungstic acid) với 103

Xây dựng đường chuẩn cẩn thận bằng albumin của serum bò (BSA: Bovine Serum Albumin) để xác định nồng độ protein của mẫu.

104

Dung dịch C: Hỗn hợp của hai dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1 (pha

5.2.4.3. Áp dụng

Do tính đơn giản và độ nhạy cao, phương pháp Lowry được sử dụng rộng rãi trong phân tích hóa sinh. Tuy nhiên, đây không phải là phương pháp được dùng rộng rãi để xác định protein trong thực phẩm nếu chưa chiết tách protein ra khỏi sản phẩm.

trước khi dùng).

Thuốc thử folin, trước khi dùng pha loãng hai lần sao cho độ axit bằng 1N. Albumin huyết thanh bò 1mg/ml.

5.2.4.4. Ưu điểm

Cách tiến hành:

Rất nhạy:

Mẫu thí nghiệm

50-100 lần nhạy hơn so với phương pháp biuret

Lấy chính xác 0,5ml dịch chứa protein với hàm lượng thích hợp cho vào

10-20 lần nhạy hơn so với phương pháp hấp thụ UV ở 280 nm.

ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C, lắc đều để yên trong 10 phút.

Độ nhạy tương đương với phương pháp Nessler hóa, tuy nhiên

Sau đó thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25ml folin đã pha loãng 2

tiện lợi hơn

lần, lắc đều và để yên trong 30 phút, mầu vàng của hỗn hợp chuyển sang

Ít bị ảnh hưởng bởi độ đục của mẫu.

mầu xanh da trời và đạt đến cường độ mầu cực đại. Đem so màu của hỗn

Có tính đặc hiệu cao hơn so với các phương pháp khác

hợp trên máy so màu quang điện ở bước sóng 750nm. Xác định được trị số

Tương đối đơn giản; có thể thực hiện trong vòng 1-1,5h.

mật độ quang học của dung dịch nghiên cứu. Đo trên máy 3 lần lặp lại và

5.2.4.5. Nhược điểm

lấy trị số trung bình.

Vì một số lý do sau, quy trình Lowry đòi hỏi phải xây dựng đường chuẩn cẩn thận cho từng áp dụng:

Mẫu đối chứng: Cho 0,5ml đệm cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C và

Màu sắc thay đổi tùy loại protein rõ hơn so với phương pháp biuret.

bước tiếp theo được tiến hành như mẫu thí nghiệm.

Cường độ màu không tỷ lệ thuận nghiêm ngặt theo nồng độ protein.

Xây dựng đường đồ thị chuẩn:

Phản ứng bị ảnh hưởng ở mức độ khác nhau bởi đường sacaroza, lipit, đệm phosphat, monosacarit và hexoamin.

Hàm lượng protein tan trong dung dịch được xác định theo phương pháp Lowry, dùng albumin huyết thanh bò (BSA) làm chất chuẩn.

Đường khử, sulfat amon và các hợp chất có nhóm SH- với nồng độ cao ảnh hưởng đến phản ứng.

Cân 0,01g (10mg – albumin huyết thanh bò) hoà tan trong 10ml nước, ta được dung dịch gốc có nồng độ là 1mg/ml. Sau đó pha

5.2.4.6. Tiến hành

loãng dung dịch gốc bằng nước cất với các nồng độ 20, 40, 60, 80,

Hoá chất cần dùng:

100, 120 g/ml để tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn.

Dung dịch A: 4g NaOH (0,1M) và 20g Na2CO3 (2%) pha trong 1000ml nước cất.

Mẫu thí nghiệm: lấy chính xác 0,5ml dung dịch BSA ở nồng độ pha loãng như trên cho vào ống nghiệm, thêm vào mỗi ống

Dung dịch B: 0,5g CuSO4.5H2O (0,5%) pha trong dung dịch Natri

2ml dung dịch C để ở nhiệt độ phòng 10 phút, sau đó cho

citrat (1%) hoặc trong dung dịch Natri Kali Tactơrat 1%.

105

106

0,25ml thuốc thử folin (1N) đem so màu với bước sóng 660nm.

Mẫu đối chứng: lấy 0,5 ml nước cất cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C và các bước tiếp theo được tiến hành như mẫu thí nghiệm.

Qua 3 lần lặp lại thí nghiệm có thể xây dựng đường hồi quy. Kết quả được xử lý theo phương pháp thống kê thông thường.

5.2.5. Phương pháp nhuộm màu Bradford 5.2.5.1. Nguyên tắc

Khi thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue G-250 liên kết với protein, màu thuốc đổi từ đỏ nhạt đến xanh nhạt và bước sóng hấp thụ cực đại của màu nhuộm dịch từ 465nm đến 595nm. Sự thay đổi mật độ quang ở bước sóng 595nm tỷ lệ thuận với nồng độ protein có trong mẫu. Cũng giống như các phương pháp nhuộm màu khác, phương pháp Bradford dựa vào bản chất lưỡng tính của protein. Khi dung dịch có chứa protein được axit hóa đến pH nhỏ hơn điểm đẳng điện của protein, thuốc nhuộm sẽ bám vào protein bằng tương tác tĩnh điện. Hiệu quả nhuộm màu tăng lên do tương tác kỵ nước giữa phân tử phẩm nhuộm với bộ khung polypeptit kề bên các gốc tích điện dương của protein. Trong trường hợp của phương pháp Bradford, phẩm nhuộm sau khi bám vào protein sẽ thay đổi phổ hấp thụ so với lúc chưa liên kết.

Hình 5.3 Phản ứng xảy ra trong phương pháp Bradford 5.2.5.2. Quy trình

Hòa tan phẩm màu Coomassie Brilliant Blue G-250 trong etanol 95% và axit hóa bằng axit phosphoric 85%.

Hòa trộn mẫu protein (1-100 µg/ml) và dung dịch chuẩn BSA (Bovine Serum Albumin) với dung dịch Bradford. Đo mật độ quang ở 595 nm đối chiếu với mẫu trắng.

Nồng độ protein có trong mẫu được tính từ đường chuẩn BSA. 5.2.5.3. Áp dụng, ưu và nhược điểm:

Phương pháp Bradford sử dụng Coomassie Brilliant Blue G-250 là phương pháp nhanh và nhạy. Phương pháp này đã thay thế hầu hết các phương pháp nhuộm màu sử dụng các phẩm nhuộm tích điện âm với gốc axit sulfonic, như acid orange 12, Orange G và Amido Black. Phương pháp Bradford đã được ứng dụng thành công khi xác định protein của cháo, bia thành phẩm trong sản xuất bia. Quy trình này cũng được cải tiến để định lượng protein ở hàm lượng µg. Do phép đo nhanh, nhạy và ít bị nhiễu hơn so với phương pháp Lowry, nó đã được sử dụng rộng rãi trong phân tích các loại protein tinh sạch.

107

108

Ưu điểm của phương pháp:

5.2.6.2. Quy trình

Thời gian tiến hành nhanh, phản ứng có thể hoàn thành trong 2 phút.

Hòa cùng lúc dung dịch protein với các dung dịch cơ chất phản ứng

Độ lặp lại tốt

BCA, gồm muối BCA natri, carbonat natri, NaOH, sulfat đồng pH

Nhạy gấp nhiều lần so với phương pháp Lowry

11.25.

Không bị nhiễu bởi sulfat amon, polyphenol, carbohydrat như đường

Ủ ở nhiệt độ 37 oC thời gian 30 phút hoặc ở nhiệt độ phòng với thời gian 2 h, hoặc ở 60 oC trong 30 phút. Việc lựa chọn nhiệt độ phụ

sacaroza hoặc các cation như K+, Na+ và Mg2+ Đo protein và các peptit có phân tử xấp xỉ hoặc lớn hơn 4000 Da.

thuộc vào độ nhạy mong muốn. Nhiệt độ cao hơn cho tín hiệu màu

Nhược điểm

lớn hơn.

Bị nhiễu bởi các chất tẩy rửa ion hoặc phi ion như Triton X-100 và sodium dodecyl sulfat. Tuy nhiên, đây là các sai số nhỏ (0.1%) có thể

Đo màu dung dịch ở 562 nm đối chiếu với mẫu trắng.

Xây dựng đường chuẩn sử dụng BSA 5.2.6.3. Áp dụng, ưu và nhược điểm:

hiệu chỉnh được bằng các mẫu kiểm tra phù hợp.

Phức protein-phẩm màu có thể bám dính vào cuvet thạch anh. Phân

Phương pháp BCA được dùng cho protein đã được tách và tinh sạch.

Chưa có báo cáo nào cho thấy có thể áp dụng phương pháp này để xác định

tích cần phải thực hiện với cuvet thủy tinh hoặc nhựa.

Màu sắc thay đổi tùy loại protein; Phải lựa chọn cẩn thận protein

protein trong thực phẩm. Ưu điểm

chuẩn.

Độ nhạy có thể so sánh được với phương pháp Lowry; độ nhạy của

5.2.6. Phương pháp Bicinchoninic Acid (BCA)

phương pháp micro BCA (0.5-1.0 µg) tốt hơn so với phương pháp

5.2.6.1. Nguyên tắc

Protein khử ion đồng (II) thành ion đồng (I) trong môi trường kiềm.

Phức tạo ra giữa ion đồng (I) và dung dịch cơ chất BCA màu xanh táo sẽ có màu hồng nhạt. Cường độ màu tạo ra sẽ tỷ lệ thuận với nồng độ protein.

Lowry.

Việc hòa trộn các dung dịch phản ứng 1 lần thực hiện dễ dàng hơn so với phương pháp Lowry.

Các dung dịch cơ chất phản ứng bền hơn so với ở phương pháp Lowry.

Không bị nhiễu bởi các chất tẩy rửa phi ion và các muối đệm.

Các tác nhân gây biến tính protein ở nồng độ vừa phải (guanidineHCl 4M hoặc ure 3M) không gây nhiễu.

Nhược điểm Màu sắc không bền theo thời gian. Người phân tích cần chú ý cẩn thận đến thời gian đọc kết quả đo mật độ quang.

Hình 5.4 Phản ứng xảy ra trong phương pháp BCA. 109

110

Bất kỳ hợp chất nào có khả năng khử Cu2+ thành Cu+ đều góp phần làm tăng cường độ màu.

dụng rộng rãi đối với các loại thực phẩm khác. Nó được áp dụng tốt hơn đối với các hệ protein đã được tinh sạch hoặc protein được trích

Đường khử gây nhiễu ở mức độ nhiều hơn so với ở phương pháp Lowry. Sulfat amon ở nồng độ cao cũng gây nhiễu.

ly tách nhờ kiềm hoặc các tác nhân gây biến tính như ure 8 M. Mặc dù các liên kết peptit có trong protein hấp thụ UV ở 190-220 nm

Sự khác biệt màu sắc giữa các protein cũng tương tự như ở phương pháp Lowry.

mạnh hơn so với ở 280 nm, tuy nhiên đo UV ở vùng bước sóng ngắn như vậy khó khăn hơn.

5.2.7. Phương pháp hấp thụ tử ngoại

Ưu điểm:

5.2.7.1. Nguyên tắc

Nhanh và tương đối nhạy (ở 280 nm cần 100 µg protein hoặc hơn để

Protein hấp thụ bức xạ UV mạnh ở bước sóng 280 nm, chủ yếu do các

phân tích; nhạy hơn phương pháp biuret nhiều lần).

gốc tryptophan và tyrosine của phân tử protein. Vì hàm lượng của

Không bị nhiễu bởi sulfat amon và các muối đệm khác.

tryptophan và tyrosine trong phân tử protein của mỗi loại thực phẩm khá ổn

Mẫu không bị phân hủy; có thể dùng cho các phân tích khác sau khi

định, độ hấp thụ UV ở 280 nm có thể dùng để tính nồng độ protein dựa vào

phân tích xong protein; được áp dụng rộng rãi để xác định protein

định luật Lambert Beer. Vì mỗi protein có thành phần axit amin có chứa số

chạy qua cột sắc ký.

vòng thơm khác nhau nên cần xác định độ hấp thụ phân tử (molar absorptivity hay extinction coeficient) cho từng loại protein.

Nhược điểm: Axit nucleic cũng hấp thụ UV ở 280 nm. Tỷ số giữa độ hấp thụ ở

5.2.7.2. Quy trình

280 nm và 260 nm của protein tinh sạch và axit nucleic tương ứng là

Protein được hòa tan trong dung dịch đệm hoặc kiềm.

1,75 và 0,5. Do đó có thể hiệu chỉnh phần hấp thụ của axit nucleic ở

Đo độ hấp thụ của dung dịch protein ở 280 nm đối chiếu với mẫu

280 nm nếu biết các tỷ số này. Có thể hiệu chỉnh độ hấp thụ của axit

trắng.

nucleic dựa vào sự chênh lệch độ hấp thụ ở 235 và 280 nm.

Nồng độ protein được tính theo công thức:

Có sự chênh lệch đáng kể về hàm lượng các axit amin thơm trong

A = abc Trong đó,

thành phần cấu tạo của protein từ các nguồn khác nhau.

A: mật độ quang

Dung dịch đo cần phải trong suốt và không màu. Độ đục do các hạt

a: độ hấp thụ phân tử

có trong dung dịch sẽ làm sai lệch kết quả đo mật độ quang.

b: chiều dày cuvet

Đòi hòi hệ protein cần xác định phải tương đối tinh sạch.

c: nồng độ

5.2.8. Xác định hàm lượng lượng axit amin trong thực phẩm bằng phương

5.2.7.3. Áp dụng, ưu và nhược điểm:

pháp folmadehyl

Áp dụng:

5.2.8.1. Lý thuyết

Phương pháp hấp thụ UV được dùng để xác định protein có trong

Khi thêm một lượng dư formol trung tính vào dung dịch axit amin, lúc

sữa và các sản phẩm thịt. Đây không phải là phương pháp có ứng

này formol sẽ đẩy H+ ra khỏi – NH3+ và phản ứng với nhóm – NH2 tạo

111

112

thành dẫn xuất methyl hóa. Dẫn đến, axit amin mất đi tính bazo và chỉ còn tính axit do chỉ còn lại nhóm – COOH tự do.

Dung dịch nghiên cứu có màu đậm phải pha thật loãng vì nếu màu đậm thì khó nhận biết sự thay đổi màu khi chuẩn độ Phương pháp này chỉ cho kết quả thật đúng đối với trường hợp của acid monoamino monocacboxylic. Để kết quả đúng với mọi trường hợp (khi trong dung dịch ngoài các acid monoamino monocacboxylic

ra còn có

chứa các

acid

monoamino

dicacboxylic và diamino monocacboxylic) cần phải trung hòa Định lượng các nhóm cacboxyl của chúng bằng dung dịch kiềm tiêu chuẩn. Từ đó tính được lượng nito amin của các axit amin có trong dung

dung dịch pH = 7 trước khi phân tích.

5.2.8.2. Dụng cụ và thiết bị

Máy lắc

3 erlen 100mL

Máy khuấy từ, cá từ

1 burette 25mL

Máy đo pH

2 becher 100mL

monoacid và phản ứng trung hòa tiến hành hoàn toàn, nghĩa là

Bình định mức 100mL

Ống nhỏ giọt

cần có dư một ít dung dịch formaldehyd vào phản ứng trung hòa

1 pipet 1mL

hoàn toàn các nhóm cacboxyl được thực hiện khi pH môi trường

1 pipet 20mL

dịch.

Khi dùng phương pháp này cần chú ý những điểm sau: Phải tuân thủ những điều kiện để cho phản ứng tạo thành metylen

5.2.8.3. Hóa chất

đạt tới 9,2 – 9,5.

Arginin và ure không phản ứng với formaldehyd cho nên không tính khi chuẩn bằng kiềm Tirosin cho kết quả cao hơn vì ngoài nhóm cacboxyl, nhóm phenol cũng một phần được định phân bởi kiềm. Một số acid

Na2HPO4 0,1N

Formol trung tính 20%

NaOH 0.05N

Phenolphtalein 1%

Ba(OH)2

bão

hòa

trong

CH3OH 5.2.8.4. Tiến hành

amin cho kết quả ít hơn như prolin Nếu trong dung dịch có chứa nhiều NH3, nhất là trong các dịch

Lấy 1mL nước mắm cho vào bình định mức 100mL, dùng nước

thủy phân protein thì phải loại trừ NH3 trừ trong chân không ở

cất tráng, rửa và chuyển vào bình định mức sao cho khoảng

nhiệt độ 400C.

50mL, đậy lắp và lắc trong 10 phút

Các muối amon như NH4Cl, (NH4)2SO4 cũng tác dụng với

Thêm 3 giọt chỉ thị PP; cho từng giọt Ba(OH)2 bão hòa cho đến

formaldehyde tạo thành hexamethylen tetramin và acid. Acid này

khi dung dịch có màu hồng. Cho dư 3mL Ba(OH)2 bão hòa, đun

sau đó được trung hòa bởi kiềm gây ra sai số

sôi 1 phút rồi tiến hành lọc, rữa kết tủa bằng nước nóng. Thể tích

2(NH4)2SO4 + 6CH2O → (CH2)6N4 + 2H2SO4 + 6H2O

dung dịch sau khi lọc khoảng 70mL.

4NH4Cl + 6CH2O → (CH2)6N4 + 4HCl + 6H2O 113

114

Trung hòa dung dịch lọc bằng HCl 0,1N cho đến không màu.

hoặc xeton (-CO) tự do như glucoza, fructoza… hoặc một hay nhiều nhóm

Dung NaOH 0,01N thêm từng giọt cho tới hồng nhạt, rồi dùng

aldehyde hay ketone kết hợp với các nhóm chức khác như saccaroza, tinh

HCl 0,01N thêm từng giọt lắc đều cho đến không màu. Định mức

bột… Ngoài ra, trong phân tử gluxit tỉ lệ mol của nguyên tố oxy và hydro

dung dịch bằng nước cất trung tính đến 100mL

là 1:2 giống phân tử nước nên gluxit còn có tên gọi là hydratcacbon.

Lấy 25mL dịch lọc cho vào becker 250mL, thêm vào 20mL dung dịch focmon trung tính, 50mL nước cất; 2 giọt PP lắc đều trong 5 phút

Nhóm oza gồm các loại đường khử trực tiếp khử oxy do có nhóm aldehyt hay xeton tự do trong phân tử, như glucoza, fructoza, lactoza...

Chuẩn độ bằng dung dịch chuẩn NaOH 0,05N đến khi dung dịch

Nhóm ozit không trực tiếp khử oxy vì các nhóm aldehyt và xeton ở dưới

có màu hồng nhạt. Ghi thể tích NaOH 0,05N tiêu tốn và tính kết

dạng kết hợp với nhóm chức khác, khi thủy phân cho hai hoặc nhiều oza

quả theo công thức dưới đây.

(các holozit) như tinh bột, saccaroza… hoặc khi thủy phân ngoài các oza

Song song tiến hành làm thí nghiệm kiểm chứng cho mẫu trắng, bằng cách thay dung dịch nghiên cứu bằng nước cất.

dùng làm thuốc chữa bệnh hoặc là chất độc.

Lượng gam Nitơ acid amin có trong 1 lít nước mắm: g/lit N amin

Đường khử là các đường chứa nhóm aldehyt (-CHO) hoặc xeton (-CO)

V 1000 = 0,014 × (Vth − Vtr ) NNaOH dm × Vxd Vbd

như glucoza, fructoza, arabinoza, maltoza, lactoza; trong khi đó saccaroza, trehaloza không phải đường khử.

Trong đó:

Đa số các phương pháp chuẩn độ đường đều dựa trên khả năng khử của

Vth và Vtr: Số mL NaOH dùng chuẩn độ cho mẫu thực và mẫu trắng.

đường, do đó để xác định thành phần các đường không khử, người ta thường dùng phương pháp thủy phân đường không khử thành đường khử và

N: Nồng độ dung dịch NaOH dung để chuẩn độ

chuẩn độ tổng lượng đường khử bao gồm lượng đường khử ban đầu trong

Vbd : Thể tích mẫu cho vào bình định mức (1mL)

mẫu và đường khử tạo ra do thủy phân đường không khử (thường là các di,

0,014: Khối lượng của 1mdlg N.

tri hay polysaccarit). Sau đó lượng đường không khử được tính bằng công

Vdm : Thể tích bình định mức (100mL)

thức:

Vxd: Thể tích mẫu đem đi phân tích (25mL) CHƯƠNG 6.

còn cho các chất không phải oza (các heterozit), thí dụ như glucozit. Những glucozit không có giá trị về dinh dưỡng mà những chất có tính chất dược lý

5.2.8.5. Tính toán kết quả

Đường không khử = (đường tổng – đường khử) * hệ số k

PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH GLUXIT TRONG THỰC PHẨM

6.1.

Về phương diện hóa học, glucid có thể chia làm 2 nhóm:

Hệ số k phụ thuộc vào đường không khử, k = 0,95 với saccaroza và k = 0,9 với tinh bột.

GIỚI THIỆU CHUNG

Glucid là những hợp chất hữu cơ trong phân tử có chứa C, H, O kết hợp với nhau, trong đó có nhiều nhóm hydroxyt và một nhóm aldehyt (-CHO) 115

6.2.

ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP

Hầu hết các phương pháp xác định hàm lượng gluxit bằng phương pháp hóa học đều dựa vào tính chất khử của nhóm andehyt và ceton tự do trong 116

phân tử. Do đó, các phương pháp này chỉ xác định các loại đường khử

thủy sôi trong 3 giờ. Sau khi thủy phân cần làm lạnh ngay dưới

(glucoza, fuctoza…). Để xác định hàm lượng các loại đường đôi, ba, hay

vòi nước.

polysaccarit (đường không khử) phải thủy phân các loại đường này thành

Trung hòa (bằng dung dịch NaOH) để đưa dung dịch về môi

các loại đường khử đơn giản.

trường trung tính hay bazơ yếu. Vì ở môi trường này thuận lợi

Các hợp chất như lipit, protit, các kim loại… cũng ảnh hưởng lớn đến

cho việc khử tạp và tủa đồng.

kết quả xác định. Do đó trước khi xác định gluxit cần loại bỏ các loại hợp

Phương pháp khử tạp:

chất này.

Tuỳ theo từng nguyên liệu, từng loại thực phẩm mà sử dụng những

Có rất nhiều phương pháp xác định gluxit (đường khử, đường tổng, tinh bột). Song để có một kết quả chính xác, phải đặc biệt chú ý đến hai khâu

phương pháp khử tạp khác nhau. Sau đây là một số dung dịch dùng để khử tạp.

quan trọng trong khi chuẩn bị mẫu: Phương pháp thủy phân và phương

Dung dịch chì axetat 30%

pháp khử tạp. Ngoài ra, độ tinh khiết hóa chất, thao tác kỹ thuật cũng góp

Dung dịch kaliferocianua 15%, dung dịch kẽm sungfat 30%

phần tạo nên một kết quả chính xác

Dung dịch patanh: HNO3(d=1.39) 160mL + Chì oxit đỏ 22g +

Phương pháp thủy phân:

NaOH (d= 1.33) 10mL + Nước cất vừa đủ 1000mL

Thông thường khi xác định loại đường không khử trực tiếp oxy hóa như saccaro, tinh bột… người ta thường dùng axid để thủy phân các đường này

Dung dịch kaliiodmercurat: KI 33.2g + HgCl2 13.5g + CH3COOH 200mL + Nước cất 640mL

thành đường khử. Nhưng trong môi trường axid mạnh, nhiệt độ cao thì

Khử tạp bằng nhôm hydroxit

không những các đường này bị thủy phân mà còn một số đường khác như

Dung dịch nhôm clorua 1% (hoặc nhôm sunfat 1%)

levuloza, pentoza… cũng bị thủy phân tạo thành các dẫn xuất của furfurol

NH4OH vừa đủ để kết tủa

làm ảnh hưởng đến quá trình định phân. Do đó, khi tiến hành thủy phân cần

Mục đích của việc sử dụng các dung dịch này làm kết tủa các protid,

xác định nồng độ axit, nhiệt độ và thời gian tối ưu để thủy phân vừa đủ các

lipid và các chất hữu cơ khác, nhằm loại chúng ra khỏi dịch thử, hạn chế sự

loại đường không khử mục tiêu thành đường khử mà không làm ảnh hưởng

ảnh hưởng của chúng đến việc xác định kết quả.

Các phương pháp xác định hàm lượng đường như:

đến những thành phần khác trong mẫu.

Những điều kiện của quá trình thủy phân:

Phương pháp Bertran

Dung dịch mẫu phải có nồng độ từ 4 – 10% tính bằng đường glucoza.

Phương pháp Somogyi Phương pháp Codextan

Môi trường thủy phân là axit HCl 1N.

Phương pháp DNS

Nhiệt độ và thời gian: tuỳ theo từng loại đường mà có các chế độ

Trong các phương pháp trên, phương pháp Bertran là phương pháp

khác nhau: Thủy phân đường saccaro trong nồi cách thủy ở 70 –

thường được sử dụng nhất vì độ chính xác, tính kinh tế và phù hợp với tiêu

0

75 C trong 15 phút. Thủy phân tinh bột, dextrin trong nồi cách 117

chuẩn đo lường của Việt Nam cũng như của thế giới.

118

Trong phương pháp Bertran, để khử tạp người ta sử dụng dung dịch

O CH COONa

RCHO + Cu

kẽm feroxyanua. Ưu điểm của dung dịch này là: kinh tế, không gây độc,

RCOOH + Cu2O +

HO CH COOK

Để định lượng Cu2O có tính khử, trước hết ta oxi hóa nó bằng muối sắt

đảm bảo việc khử tạp tốt ít ảnh hưởng đến quá trình định phân.

6.3.

O CH COOK

HO CH COONa

+ 2H2O

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP

ba (Fe3+) làm cho muôi sắt này chuyển thành muối sắt 2 (Fe2+) ở môi

BERTRAND

trường acid:

6.3.1. Cơ sở của phương pháp

Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2SO4 → 2CuSO4 + H2O + 2FeSO4

Đa số các phương pháp hoá học dùng để xác định đường khử đều dựa trên khả năng khử các hợp chất khác nhau của chúng. Một trong những

FeSO4 được xác định bằng cách cho tác dụng với KMnO4 là chất oxi hóa, do đó dùng KMnO4 để chuẩn độ FeSO4 ở môi trường acid

phương pháp xác định đường khử chính xác. Phổ biến rộng rãi nhất là

10FeSO4 + 8H2SO4 + 2KMnO4 → K2SO4 + 2MnSO4 + 5Fe2(SO4)3

phương pháp Bertran.

+8H2O

Nguyên tắc: Ở môi trường kiềm mạnh, các đường khử (glucose,

Từ số mL KMnO4 0,1N dùng để chuẩn độ FeSO4 hình thành, tra bảng để

fructose, mantose…) có thể dễ dàng khử oxi của Cu(OH)2 tạo kết tủa dạng

có số mg đường glucose, maltose, saccharose, nhân với hệ số pha loãng ta

Cu2O màu đỏ gạch, qua đso tính được lượng đường khử:

có hàm lượng đường trong 100g thực phẩm.

Để định lượng đường khử ta thường dùng thuốc thử feling: thuốc thử này gồm hỗn hợp (1:1) của hai dung dịch: dung dịch sunfat đồng (feling A) và dung dịch kieàm cuûa muoái kali-natri tactrat keùp (feling B).

Cân 10g mận (phần lọc để chuẩn độ sẽ có nồng độ đường biểu thị bằng glucoza vào khoảng 4 – 10%). Nghiền cẩn thận và cho vào 30mL nước cất

Khi trộn hai dung dịch feling A và feling B với nhau thì xảy ra phản ứng giữa chúng theo hai giai đoạn. Đầu tiên tạo thành kết tủa hidroxit đồng

nóng 70-800C để hoà tan mẫu, lấy nước trích ly. Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào erlen 100mL Đun cách thuỷ ở 80oC trong 15 phút. Lắng gạn lấy phần dung dịch cho

xanh da trời.

CuSO4 + 2NaOH → Cu(OH)2 + Na2SO4

vào bình định mức 250. Cho thêm 30mL nước vào becker chứa xác mận

Sau đó Cu(OH)2 tác dụng với muối kali-natri tactrat kép tạo thành muối phức hòa tan và dung dịch có màu xanh thẫm.

O CH COONa Cu HO CH COOK

tiến hành trích ly như trên đến lần thứ 3. Cho toàn bộ dịch trích ly vào erlen 250.

HO CH COONa

Cu(OH)2 +

6.3.2. Chuẩn bị mẫu

O CH COOK

+ 2H2O

Như vậy, muối kép này có tác dụng giữ cho ion Cu2+ trong môi trường kiềm không bị kết tủa dưới dạng Cu(OH)2. Muối phức trên không bền, vì thế các đường có chứa các nhóm andehid hoặc ceton đễ dàng khử Cu2+ thành Cu2+ tạo kết tủa đỏ và bản thân đường bị oxi hoá khi dung dịch đường tác dụng với dung dịch Felling.

Khử tạp chất: Cho vào 1mL kaliferocyanua 15%, lắc đều, để yên trong 2–3 phút. Cho thêm 5mL kẽm acetat 30% vào erlen chứa dịch xác định trên, khuấy mạnh.

Tiến hành lọc kết tủa (tạp) bằng giấy lọc băng vàng, rửa tạp bằng nước nóng cho sạch.

Cho dung dịch vào bình định mức dung tích 250 mL, tráng lại dụng cu chứa dung dịch vài lần với nước cất. Nước tráng cho cả vào bình và không

119

120

được quá 250mL. Trung hòa axit hữu cơ có trong chất thử bằng dung dịch

dùng khoảng 30–50mL Fe2(SO4)3 để hòa tan hoàn toàn kết tủa Cu2O, tráng

NaOH 10% đến khi pH = 7 (kiểm tra bằng giấy chỉ thị màu vạn năng).

bình và rửa phễu.

Định mức bằng nước cất tới 250mL. Đem đi xác định hàm lượng đường

Thêm 5mL H2SO4 20%

6.3.3. Xác định hàm lượng đường

Lấy bình lọc ra và chuẩn độ dung dịch sắt (II) hình thành bằng dung

Lần lượt cho vào erlen 250mL:

dịch KMnO4 cho ñeán khi xuaát hieän maøu hồng nhạt vững bền trong 15

Dung dịch feling A 10 mL;

giây.

Dung dịch feling B 10 mL;

Làm song song với mẫu kiểm chứng thay dung dịch đường bằng nước

Cho 10 ml dịch lọc đã chuẩn bị ở trên và khoảng 20 ml nước cất. Đun

cất.

sôi hỗn hợp đúng 3 phút tính từ khi bột nước xuất hiện đầu tiên. Sau khi

Ghi nhận số mL KMnO4 đã dùng và đem tra ở bảng để có lượng đường

đun sôi, dung dịch vẫn phải có màu xanh biếc đặc trưng. Nếu dung dịch bị

glucose, lactose, maltose hoặc đường nghịch chuyển tùy theo yêu cầu.

mất màu hoàn toàn, màu lục, vàng hoặc nâu chứng tỏ lượng dung dịch

6.3.4. Tính toán kết quả

feling cho vào không đủ để oxi hoá lượng đường trong mẫu. Trường hợp đó cần làm lại thí nghiệm hoặc với lượng thuốc thử nhiều hơn hoặc với

Hàm lượng đường toàn phần biểu thị bằng đường glucose hoặc đường nghịch chuyển (g) trong 100g thực phẩm.

lượng mẫu ít hơn.

Tính bằng công thức: X =

Lấy bình ra và để nghiên cho cặn Cu2O lắng xuống. Dung dịch bên trên

Trong đó:

lớp cặn phải có màu xanh của Cu(OH)2. Khi keát tuûa Cu2O lắng xuống,

X : Hàm lượng đường khử tính theo %

tiến hành lọc phần nước bên trên qua phễu lọc.

a: Số mg đường nghịch chuyển hoặc đường glucose (mg)

Cho nước đã đun sôi vào bình nón và tiếp tục gạn lọc vào phễu cho đến

tương ứng với số mL KMnO4 0,1N, được ghi ở trong bảng

khi nước trong bình nón hết màu xanh.

của mẫu thí nghiệm trừ đi mẫu kiểm chứng.

Trong quá trình gạn lọc chú ý tránh đừng để cho kết tủa rơi vào phễu và

G bd: lượng mẫu cân ban đầu, g.

luôn luôn giữ 1 lớp nước đã đun sôi trên mặt kết tủa trong bình nón và

Vxd: lượng dung dịch thử lấy để làm thí nghiệm (mL)

trong phễu để tránh oxi hoá.

Vdm: thể tích sau khi định mức.

Lần gạn lọc cuối cùng, gạn hết nước và cho ngay vào bình nón 20mL

1000: chuyển từ mg sang g.

dung dịch Fe2(SO4)3 để hòa tan kết tủa Cu2O. Rút hết nước trong phễu, thay bình hút lọc cũ bằng bình mới. Đổ dung dịch Fe2(SO4)3 đã hòa tan hết kết tủa Cu2O trong bình nón, lên trên lớp cặn còn lại trên phễu.

Tráng bình nón và rửa phễu bằng dung dịch Fe2(SO4)3cho đến khi không còn vệt Cu2O trong bình nón và trong phễu. Hút xuống bình lọc và tráng rửa lại bằng nước cất đun sôi, hút cả xuống bình lọc. Chú ý là chỉ 121

a Vdm 100 . .

1000 Vxd Gbd

100: Hệ số chuyển tính thành % Bảng 6.1 Bảng xác định đường glucoza Glucoz

KMnO4

Glucoza KMnO4 0,1N

a (mg)

0,1N (ml)

(mg)

10

3,21

40

Glucoza

KMnO4 0,1N

(ml)

(mg)

(ml)

12,2

70

20,4 122

11

3,52

41

12,5

71

20,7

12

3,82

42

12,8

72

20,9

13

4,14

43

13,0

73

21,2

14

4,45

44

13,3

74

21,4

15

4,75

45

13,6

75

21,7

Đường

16

5,06

46

13,9

76

22,0

nghịch

17

5,38

47

14,2

77

22,2

chuyển (mg)

18

5,69

48

14,4

78

22,5

10

3,24

40

12,2

70

20,3

19

5,99

49

14,7

79

22,7

11

3,55

41

12,5

71

20,6

20

6,31

50

15,0

80

23,0

12

3,87

42

12,8

72

20,8

21

6,60

51

15,3

81

23,2

13

4,17

43

13,1

73

21,1

22

6,90

52

15,6

82

23,5

14

4,48

44

13,3

74

21,3

23

7,20

53

15,8

83

23,7

15

4,80

45

13,6

75

21,6

24

7,50

54

16,1

84

24,0

16

5,11

46

13,9

76

21,8

25

7,80

55

16,4

85

24,2

17

5,42

47

14,2

77

22,1

26

8,10

56

16,6

86

24,5

18

5,72

48

14,5

78

22,4

27

8,40

57

16,9

87

24,7

19

6,04

49

14,7

79

22,6

28

8,73

58

17,2

88

25,0

20

6,35

50

15,0

80

22,9

29

8,99

59

17,5

89

25,2

21

6,65

51

15,3

81

23,1

30

9,29

60

17,7

90

25,5

22

6,95

52

15,5

82

23,4

31

9,58

61

18,0

91

25,7

23

7,25

53

15,8

83

23,6

32

9,87

62

18,3

92

26,0

24

7,55

54

16,1

84

23,8

33

10,2

63

18,5

93

26,2

25

7,83

55

16,4

85

24,1

34

10,5

64

18,8

94

26,5

26

8,13

56

16,6

86

24,3

35

10,7

65

19,1

95

26,7

27

8,43

57

16,9

87

24,6

36

11,0

66

19,3

96

27,0

28

8,73

58

17,2

88

24,8

37

11,3

67

19,6

97

27,2

29

9,03

59

17,4

89

25,1

38

11,6

68

19,9

98

27,5

30

9,32

60

17,7

90

25,3

123

39

11,9

69

20,1

99

27,7

100

28,0

Bảng 6.2 Bảng xác định đường nghịch chuyển KMnO4 0,1N (ml)

Đường nghịch chuyển (mg)

KMnO4 0,1N (ml)

Đường nghịch chuyển (mg)

KMnO4 0,1N (ml)

124

6.4.

tắc chung như sau:

31

9,61

61

18,0

91

25,6

32

9,91

62

18,2

92

25,8

Trường hợp nguyên liệu thí nghiệm không chứa quá nhiều tinh bột hoặc

33

10,2

63

18,5

93

26,1

inulin, có thể trích lyđường từ nguyên liệu bằng nước. Cân và cho vào cối

34

10,5

64

18,7

94

26,3

sứ 1 g nguyên liệu hạt hay các mẫu thí nghiệm thực vật khô như cây, lá

35

10,8

65

19,0

95

26,5

hoặc quả khô... đã được nghiền nhỏ (và sấy khô đến khối lượng không đổi).

36

11,1

66

19,3

96

26,8

Nếu là nguyên liệu tươi (như hoa, quả tươi) thì cân 5 – 10 g. Nghiền cẩn

37

11,4

67

19,5

97

27,0

thận với bột thủy tinh hay cát sạch và 30ml nước cất nóng 70 – 80°C.

38

11,6

68

19,8

98

27,3

Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định mức dung tích 1000 ml. Đun cách

39

11,8

69

20,1

99

27,5

thủy 70 – 80°C trong 35 – 40 phút, kết tủa protein và các tạp chất bằng dung

100

27,8

dịch chì acetate Pb(C2H2O2)2.3H2O hoặc chì nitrate Pb(NO3)2 10%.

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP

Tránh dùng quá dư chì acetate (dùng 2 – 5 ml chì acetate). Sau đó loại bỏ lượng chì acetate dư bằng dung dịch Na2SO4 bão hòa, để yên hỗn hợp 10

DNS

phút. Tiếp đó thêm nước cất tới vạch mức và đem lọc qua giấy lọc vào cốc

6.4.1. Nguyên tắc

Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với

hay bình khô. Nước lọc dùng làm dung dịch thí nghiệm.

thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng

Trường hợp nguyên liệu chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin như

tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. So màu tiến

khoai lang, sắn, khoai tây... cần trích ly đường bằng rượu 70 – 80°C,

hành ở bước sóng 540nm. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucoza tinh

đun hỗn hợp cách thủy trong bình cách thủy có lắp ống làm lạnh

khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu

không khí. Trong trường hợp này không cần kết tủa protein bằng chì

nghiên cứu.

acetate vì lượng protein chuyển vào dung dịch không nhiều.

Trường hợp các nguyên liệu chứa nhiều acid hữu cơ như cà chua,

Phương trình phản ứng tạo màu giữa đường khử và DNS acid:

dứa, chanh, khế... cần chú ý là trong quá trình đun khi trích ly, đường saccharoza có thể bị thủy phân một phần. Do đó cần xác định riêng đường khử và riêng saccharoza. Trước khi đun cách thủy hỗn hợp phải trung hòa acid bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa tới pH 6,4 Hình 6.1(a) Acid dinitrosalicylic, (b) 3-amino, 5- dinitrosalicylic acid 6.4.2. Xử lý mẫu

Tùy vào đối tượng nghiên cứu (hạt, quả...) mà cách chuẩn bị dung dịch nghiên cứu dùng để định lượng đường có khác nhau đôi chút, nhưng nguyên 125

– 7,0.

6.4.3. Tiến hành:

Hóa chất Thuốc thử acid dinitrosalisylic (DNS): cân 1g DNS pha trong 20ml NaOH 2N, thêm vào 50ml nước cất và 30g muối Sodium potassium tartrate, 126

đun cách thủy cho tan rồi định mức tới 100ml.

Dung dịch glucoza chuẩn (500ppm): cân 0.5g D_glucoza pha trong nước cất thành 1lit.

Một số chú ý khi đo Nếu màu là phức đo quá đậm hoặc quá nhạt thì có thể giảm hoặc tăng

thể tích chuẩn cho phù hợp và bổ sung thể tích còn lại bằng nước cất cho đủ

Dung dịch glucoza mẫu (50ppm): hút 10ml dung dịch glucoza chuẩn

10ml hoặc có thể pha chuẩn có nồng độ thấp hơn hoặc cao hơn.

500ppm cho vào bình định mức, thêm nước cất, định mức thành 100ml.

Nếu độ hấp thu của mẫu là nằm ngoài đường chuẩn thì có thể tăng hoặc giảm lượng mẫu sao cho giá trị đo nằm trong đường chuẩn.

Thực hiện 0

Cân khoảng 4 – 6 g nguyên liệu, tiến hành trích ly bằng 40ml cồn 96

Từ số liệu thu được lập đường chuẩn y=ax

bằng cách chưng cách thủy cho sôi khoảng 10 phút trong một becker 250.

Tìm Cx

Chuyển dịch trong suốt của quá trình trích ly qua một becker khác. Cho tiếp

Công thức hàm lượng đường khử được tính như sau:

vào becker trích ly 40ml cồn 960 rồi tiến hành như trên, làm 3 lần để đảm bảo lượng đường được trích ly là hoàn toàn. Song song với quá trình trích ly

Trong đó:

là quá trình cô đặc dịch trích ly bằng phương pháp chưng cách thủy. Khi

- Vđo: là thể tích dung dịch phức đo trong bài là 10ml

dịch cô đặc còn 30ml thì dừng lại, cho vào bình định mức 100ml, lắc đều

- Vxd1,Vxd2: là thể tích đem đi xác định lần 1 và lần 2 trong bài là

định mức 100ml. Hút 10ml dd sau khi định mức cho vào bình định mức

10ml và 2ml

100ml, lắc đều định mức 100ml. Đây là dung dịch chuẩn bị tạo phức để đo

- Vdm1, Vdm2: là thể tích định mức lần 1 và lần 2 trong bài là 100ml

độ hấp thu. (Nếu lượng đường trong mẫu ít có thể định mức 1 lần).

Lập đường chuẩn với các dung dịch glucoza chuẩn có nồng độ 50ppm và tiến hành tạo phức màu cho mẫu theo bảng sau:

Chuẩn glucoza 50ppm

0

1

2

3

4

0

1

2

3

4

Dịch xác định

6.5.

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG SACCAROZA

Để định lượng đường saccaroza, ta tiến hành xác định đường khử theo

Bảng 6.3 Bảng xác định đường chuẩn cuarglucoza với DNS Ống nghiệm

- mbđ: là khối lượng mẫu đem đi xác định.

M1 M2 2

2

Dung dịch DNS

1

1

1

1

1

1

1

Nước cất

9

8

7

6

5

7

7

Chú ý: sau khi cho thuốc thử DNS vào thì tiến hành chưng cách thủy cho sôi 3 phút (chuyển toàn bộ ống nghiệm vào becher 250ml rồi chưng cách thủy) sau đó để nguội rồi thêm nước cất vào cho đủ 10ml như trong bảng.

Tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 530nm 127

phương pháp Bertrand hay Miler, sau đó thủy phân dung dịch ban đầu trong môi trường HCl 1N ở nhiệt độ 68 – 70°C trong thời gian tối đa 7 phút để không bị ảnh hưởng bởi đường lactoza và tinh bột. Sau đó trung hòa hỗn hợp bằng dung dịch NaOH 2N hay dung dịch Na2CO3 bão hòa tới pH = 6,5 – 7 với chỉ thị phenolthalein (không màu sang hồng nhạt). Sau đó chuyển dung dịch đã được trung hòa vào bình định mức 100ml, thêm nước cất tới vạch định mức rồi định lượng đường tổng (tương tự như đường khử, với phương pháp Bertrand sử dụng bảng tra đường nghịch chuyển).

Sau khi xác định đường khử và đường tổng ta có thể tính ra đường saccaroza theo công thức sau: 128

Hàm lượng saccaroza = (hàm lượng đường tổng – hàm lượng đường H+ khử)*0,95

bước sóng của đồng vị thủy ngân 198Hg là 546,2271 nm trong chân không,

Trong đó, 0,95 là hệ số chuyển từ glucose thành saccharose.

này bằng 40,7770 0,0010, khi đo ánh sáng natri màu vàng đã lọc ( bước

6.6.

ở 200C trong ống phân cực 200,000mm. Góc quay cực khi đo ở bước sóng

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG TỔNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP

sóng 589,4400nm trong chân không), 1000Z tương ứng với góc quay

BERTRAN

34,626 0,0010 . Đối với lăng kính thạch anh hoạt động hiệu quả ở bước

Sử dụng dung môi để trích ly hoàn toàn đường tổng trong mẫu vào

sóng 587,000nm thì 1000Z tương ứng với góc quay 34,9340

0,0010

dung dịch. Thủy phân trong môi trường axit, chuyển toàn bộ đường tổng về

Nguyên tắc

dạng đường khử. Khi đó, sử dụng phương pháp xác định đường khử để xác

Sự quay cực là tổng đại số các hiệu ứng chủ yếu của hàm lượng

định hàm lượng đường khử tạo thành. Từ đó, tính toán đường tổng theo

sacaraza có trong dung dịch làm chuyển đổi do sự có mặt các chất hoạt

đường khử

động quang học khác và do quy trình làm sạch.

6.7.

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TINH BỘT

Đây là phép phân tích vật lý bao gồm ba bước cơ bản sau :

Thủy phân mẫu trong môi trường acid HCl chuyển toàn bộ tinh bột về

Chuẩn bị dung dịch chuẩn của đường thô trong nước, kể cả việc

dạng đườn khử glucose. Xác định hàm lượng glucose hình thành bằng

làm trong bằng cách bổ sung dung dịch chì axetat kiềm tính.

phương pháp Bertrand sẽ tính toán được hàm lượng tinh bột 6.8.

Làm sạch dung dịch bằng phương pháp lọc

XÁCĐỊNH ĐỘ POL CỦA ĐƯỜNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO GÓC

Xác định độ pol bằng cách đo góc quay cực của dung dịch đã

QUAY CỰC

được làm sạch.

6.8.1. Cơ sở lý thuyết

Phương pháp này có thể áp dụng cho đường thô, đường trắng, đường đặt biệt là đường có cần làm sạch.Phương pháp đo góc quay cực của dung dịch chuẩn đường thô theo độ Pol được biểu thị bằng thang đo 0Z theo thang đường quốc tế.

Dung dịch đường chuẩn

CHƯƠNG 7.

Dùng 26,0160 gam đường saccaroza tinh kiết được cân trong chân

7.1.

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH LIPID

GIỚI THIỆU

không và hòa tan trong nước tinh kiết ở 20,00 0C đến thể tích không đổi

Lipd hay còn được gọi là chất béo là hợp chất hữu cơ được cấu tạo chủ

100,00ml . Dung dịch này tương ứng với cân 26,000 gam đường trong

yếu từ triglycerit. Là một thành phần quan trọng cấu tạo nên tế bào, làm mô

100mL dung dịch.

đệm… Không những thế, lipid còn là dung môi của những vitamin tan

Cơ sở của điểm 1000 Z

trong dầu, cung cấp và dự trữ năng lượng cho cơ thể. Năng lượng cung cấp

Theo thang đường quốc tế(The basis of the 1000 Z point of international

bởi lipid cao gấp hai lần mức năng lượng được cung cấp từ gluxit hay

sugar scale): sự quay cực của dung dịch đường chuẩn sacroza tinh khiết ở 129

130

protein dù cùng một khối lượng. Ngoài ra, lipid còn góp phần vào giá trị

và tỷ lệ giữa lipid không phân cực (chủ yếu là triacylglycerol) và lipid phân

cảm quan của sản phẩm thực phẩm như giá trị cảm quan, cấu trúc, mùi, vị,

cực (chủ yếu là phospholipid và glycolipid) trong mẫu. Do đó, có thể có vài

Phụ thuộc vào nguồn gốc mà lipid sẽ tồn tại ở trạng thái lỏng đối với

dung môi (một dung môi hay hệ hỗn hợp các dung môi) được chọn phụ

lipd từ thực vật (dầu thực vật), dạng rắn với lipid từ động vật (mỡ động

thuộc vào thành phần và bản chất lipid có trong mẫu. Có thể tách bớt một

vật). Nhưng dù tồn tại ở dạng lỏng hay rắn thì lipid đều có một số đặc tính

phần lipid ra khỏi nguyên liệu bằng cách ép lạnh trước khi trích ly bằng

cơ bản là không tan trong nước và những dung môi phân cực mạnh, tan

dung môi. Dung môi sử dụng cũng thay đổi tùy theo phương pháp. Với

trong dung môi hữu cơ không phân cực hay phân cực nhẹ.

phương pháp Soxhlet (AOAC, 1995) và phương pháp Goldfisch sử dụng

Thành phần cấu tạo lipid chứa trung bình 76 - 79% cacbon và 10 - 12% oxi nên khi đốt cho năng lượng rất lớn: 1g Lipid cho 9,5kCal

dung môi hexane. Phương pháp Folch (Folch et al, 1957) và phương pháp Bligh

Có nhiều phương pháp phân loại lipid, tùy theo cơ sở để phân loạilà

và

Dyer

sử

dụng

dung

môi

chloroform/methanol

hoặc

chloroform/methanol/nước.

thành phần, tính chất, vai trò hay nguồn gốc… Chủ yếulà phân loại theo

Ngoài ra, để giải phóng hoàn toàn lipid ra khỏi nguyên liệu (tinh bột,

thành phần cấu tạo. Căn cứ vào thànhphần cấu tạo người ta phân thành

thức ăn cho cá, sữa) cần phải xử lý mẫu với axit trước khi trích ly. Với mẫu

lipid đơn giản và lipidphức tạp

nguyên liệu sữa thì phải thêm ammonium hydroxide để kết tủa casein trước

Lipid thuần: Là ester của acid cacboxylic và alcol. Trongthành phần cấu

khi trích ly. Khi đó, lipid được giải phóng ra khỏi dạng liên kết với các

tạo chỉ có chứa C,H,O. Thuộc nhóm này cógliceric (dầu thực vật, mỡ động

thành phần trong nguyên liệu. Mặt khác, nguyên liệu cần phải được sấy

vật), sáp và stearic.

khô, giảm kích thước trước khi trích ly cũng là một yếu tốt tăng hiệu suất

Lipid tạp: trong phân tử lipid tạp ngoài thành phần alcolvà acid béo còn có các gốc acid phosphoric, cholin,monosaccharide hoặc oligosaccharide.

Nên về thành phầnnguyên tử ngoài C,H,O còn có N,P,S… 7.2.

trích ly lipid. Định lượng chính xác lipid trong thực phẩm là yêu cầu để ghi nhãn dinh dưỡng, chứng nhận hoặc đánh giá sự đồng nhất cũng như kiểm tra tính chất

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH LIPID

chức năng và giá trị dinh dưỡng của lipid trong thực phẩm.

7.2.1. Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp Soxhlet

Lưu ý: dung môi sử dụng trong quá trình trích ly rất dễ cháy nổ nên các

So với những thành phần khác trong mẫu thực phẩm như protein,

thao tác phải cẩn trọng.

gluxit... lipid không tan trong nước nhưng có thể hòa tan trong các dung

Sử dụng dung môi hexane, diethyl ether, ether dầu hỏa để trích ly lipid

môi hữu cơ không phân cực, hoặc phân cực nhẹ. Dựa vào tính chất này,

trong mẫu thực phẩm. Phương pháp này có thể được sử dụng định lượng

lipid được định bằng cách sử dụng dung môi phù hợp hòa tan lipid, từ đó

lipid trong nguyên liệu ít hay nhiều lipid. Tuy nhiên, dung môi sử dụng

tách lipid ra khỏi các thành phần khác có trong mẫu.

trong phương pháp này chủ yếu chỉ hòa tan được lipid không phân cực mà

Phương pháp được sử dụng để xác định hàm lượng lipid đó là phương

rất ít hòa tan lipid phân cực. Một điều cần lưu ý khi sử dụng phương pháp

pháp Soxhlet. Với phương pháp này, độ hòa tan của lipid là một tiêu chí

này đó là hàm ẩm của mẫu nguyên liệu không được vượt quá 10%. Với các

quan trọng. Độ hòa tan của lipid phụ thuộc rất nhiều vào thành phần lipid

mẫu có độ ẩm cao thì phải tiến hành sấy tách ẩm trước. Khi sấy cần lưu ý

131

132

đến nhiệt độ quá trình sấy bởi nếu nhiệt độ sấy cao sẽ ảnh hưởng tiêu cực

Làm mát hệ thống trước khi lấy mẫu ra

đến trạng thái oxy hóa của lipid. Thông thường, người ta tiến hành sấy ở

Loại bỏ dung môi trong gói mẫu

nhiệt độ thấp và thời gian sấy kéo dài. Cụ thể nếu sấy ở môi trường chân

Tính toán khối lượng lipid trong mẫu.

không 40 - 50°C thì sấy thời gian sấy có thể lên tới 24h hoặc ở 95 - 100°C

7.2.2. Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp Adam – Rose – Gottlieb

trong 5 giờ (AOAC, 1995). Trong trường hợp xác định hàm lượng chất béo

Đối với các loại thực phẩm dạng lỏng từ động vật như sữa bò, sữa dê,

các mẫu thịt theo phương pháp Goldfisch thì phải giảm kích mẫu, tăng diện

sữa cừu, sữa ngựa và dịch lỏng từ thực vật như sữa dừa, các chất béo phân

tích bề mặt trích ly bằng cách nghiền mẫu với cát sạch nhằm giúp quá trình

bố trong dịch sữa dưới dạng các hạt cầu và được bao bọc bởi một lớp màng

trích ly chất béo được hoàn toàn.

lipo-protein. Do đó, để việc xác định chất béo trong dịch sữa đạt độ chính

Trích ly Soxhlet là một quá trình bán liên tục. Thời gian lưu của dung

xác cao thì cần loại bỏ lớp lipo-protein bảo vệ trước khi trích ly chất béo

môi trong trụ trích ly từ 5 đến 20 phút. Dung môi bay hơi sẽ được ngưng tụ

bằng các dung môi hữu cơ.

quay trở lại trụ trích ly. Khi dung môi dâng lên trong trụtrích ly lên đến ống

Nguyên tắc

siphone sẽ chảy xuống bình đun. Quá trình trích ly có thể thực hiện cùng

Chất béo trong mẫu sữa được trích ly bằng cách bổ sung lần lược 4

lúc nhiều mẫu (các mẫu này có cùng hoặc khác nguyên liệu). Hạn chế của

dung môi khác nhau: amoniac, cồn, diethy ether và petroleum ether.

phương pháp này là không thể tách chất béo phân cực và chất béo ở dạng

Cồn và amoniac được dùng để kết tủa và loại protein ra khỏi các hạt

liên kết.

cầu béo. Diethy ether được dùng để trích ly béo và các thành phần tan trong béo. Petroleum ether được bổ sung vào để trích ly béo và

Cách tiến hành phương pháp Soxhlet: Cân 5 – 10g mẫu đã được sấy khô, nghiền nhỏ vào giấy gói

một lượng nhỏ các thành phần tan trong béo do petroleum ether là

Gói kín mẫu và đưa gói mẫu vào trụ trích ly

dung môi trích ly có tính chọn lọc cao hơn so với diethyl ether.

Hỗn hợp sau khi bổ sung dung môi và khuấy đảo tách thành hai pha:

Lắp hệ thống Soxhlet, kiểm tra hệ thống sinh hàn Rót dung môi vào đến nhập trụ trích ly thông qua miệng ống sinh

pha nhẹ nằm ở trên gồm dung môi và béo, pha nặng nằm dưới gồm

hàn. Lưu ý, phải rót dung môi vào trụ chiét cho đến khi dung môi

nước và các chất hòa tan trong nước. Ta thu pha nhẹ gồm dung môi

chảy tràn xuống đến 2/3 bình đun.

và béo, làm bay hơi dung môi ta thu được tổng béo trong mẫu sữa.

7.3.

Dùng bông bịt kín miệng ống sinh hàn tránh dung môi bay hơi

Phân tích một số chỉ tiêu đánh giá chất lượng dầu mỡ

Cấp nước cho hệ thống sinh hàn

7.3.1. Xác đinh tỷ khối của dầu hay chất béo dạng lỏng

Gia nhiệt bình đun

Phạm vi áp dụng: Xác định tỷ khối của dầu hoặc chất béo dạng lỏng.

Điều chỉnh tốc độ ngưng tụ của dung môi từ 2 – 6 giọt/ giây

Tài liệu tham khảo: AOCS Cc 10a-25 (1997)

Tiến hành trích ly từ 6 - 8h, tùy thuộc vào hàm lipid có trong mẫu

Thiết bị, dụng cụ Cân phân tích chính xác đến 0.0001 g

Kiểm tra quá trình trích ly đã hoàn toàn chưa

Nhiệt kế có thể đo được đến 40 0C, vạch chia 0,10C

Kết thúc trích ly 133

134

Nhiệt kế đọc được từ( -10 đến +100) oC có vạch chia 0,1oC .

Bình tỷ trọng dung tích 50 mL đã được sấy khô và cân để biết khối lượng

Bể điều nhiệt: Tuỳ nhiệt độ cần thiết bể sẽ chứa hỗn hợp nước và nước đá hoặc nước, nước đá và muối sao cho nhiệt độ bể phải thấp

Tiến hành: Tiến hành thử nghiệm 2 lần cho mỗi mẫu thử theo các bước sau:

hơn nhiệt độ đông đặc của mẫu cần đo khoảng 5 oC. Bể được khuấy

Xác định khối lượng mẫu ở nhiệt độ cần đo:

đều liên tục để tạo sự đồng nhất nhiệt độ trong bể (Cho phép dùng cốc thủy tinh để làm lạnh thay bể làm lạnh).

Làm chảy mẫu và lọc qua giấy lọc để loại tạp và ẩm.

Làm lạnh mẫu đến nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ qui định khoảng 5 0

C và cho vào bình tỷ trọng đến đầy (chảy tràn), tránh có bọt khí

bên trong bình.

Tiến hành: Tiến hành xác định điểm đục 2 lần cho mỗi mẫu thử theo các bước sau: Cân khoảng (60-75) g mẫu đã được trộn đều vào cốc thủy tinh và gia

Để mẫu tăng nhiệt độ tự nhiên đến đúng nhiệt độ cần đo rồi cân bình tỷ trọng có chứa mẫu, chính xác đến 0,2 mg

nhiệt đến khoảng 130oC cho đến khi mẫu ở dạng lỏng hoàn toàn.

Rót khoảng 45 mL mẫu đã gia nhiệt vào chai đựng mẫu.

Xác định khối lượng nước ở nhiệt độ cần đo:

Đặt chai vào bể làm lạnh .

Tiến hành tương tự như với mẫu thử nhưng thay mẫu thử bằng nước cất

Khi nhiệt độ mẫu cao hơn nhiệt độ điểm đục (dự đoán) khoảng 10

Lưu ý: Xác định khối lượng mẫu và nước trên cùng 1 bình tỷ trọng.

o

Tínhkết quả:

tránh sự quá lạnh và đóng rắn của mẫu tại các mặt tiếp xúc giữa chai

Kết quả được ghi chép và tính toán theo báo cáo thử nghiệm phụ lục 1.

C, bắt đầu khuấy nhanh, đều dung dịch mẫu (theo một chiều) để

đựng mẫu và bể.

Chú ý:

Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 2 kết quả thử song song được làm tròn đến 4 số lẻ

Kể từ lúc này không được lấy nhiệt kế ra khỏi mẫu để tránh bọt khí.

Chai đựng mẫu phải được giữ ở vị trí sao cho mặt thoáng của mẫu

Chênh lệch kết quả giữa 2 lần thử song song không được vượt quá

trong chai ngang với mặt thoáng của nước trong bể làm lạnh.

Thường xuyên lấy chai ra khỏi bể để quan sát.

0,002 đơn vị 7.3.2. Xác định điểm đục của dầu mỡ thưc phẩm

Đọc điểm đục là nhiệt độ tại đó phần nhiệt kế nhúng ngập trong

Điểm đục là nhiệt độ tại đó (trong điều kiện thử nghiệm qui định) mẫu

mẫu sẽ không còn nhìn thấy được theo phương ngang qua chai

trở nên đục do quá trình kết tinh bắt đầu).

và mẫu.

Phạm vi áp dụng: Xác định điểm đục của các sản phẩm dầu, mỡ động vật và thực vật dùng trong thực phẩm.

Báo cáo kết quả: Kết quả được ghi chép và tính toán theo báo cáo thử nghiệm phụ lục

Tài liệu tham khảo: AOCS Cc 6-25 (1997)

1.

Thiết bị, dụng cụ

Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 2 kết quả thử liên tiếp được

Chai đựng mẫu bằng thuỷ tinh dung tích 100 mL .

làm tròn đến số lẻ thứ nhất.

135

136

Chênh lệch kết quả giữa hai lần thử liên tiếp cuả một mẫu không được o

Treo nhiệt kế lên giá và chỉnh sao cho đáy của nhiệt kế ngập sâu

vượt quá 0.5 C

khoảng 30 mm trong nước cất (chứa trong cốc thuỷ tinh dung tích

7.3.3. Xác đinh điểm mềm (điểm nóng chảy ống hở) của dầu mỡ

600 mL ).

Điểm mềm là nhiệt độ tại đó mẫu bắt đầu mềm và bị đẩy trượt đi bên

Lúc bắt đầu đun, nhiệt độ của nước phải thấp hơn điểm mềm (dự

trong ống mao dẫn.

đoán) của mẫu khoảng( 8 - 10) oC. Khuấy nước trong cốc và gia

Phạm vi áp dụng: Xác định điểm mềm của dầu dừa, stearin, các chất béo

nhiệt sao cho nhiệt độ của nước tăng 1oC/ phút và khi gn đến điểm

đã hydrogen hoá và mỡ rắn.

mềm chỉ còn tăng 0,5 oC / phút.

Tài liệu tham khảo: AOCS Cc 3-25 (1997)

Tiếp tục đun nóng cho đến khi mẫu bên trong ống mao dẫn bị đẩy

Thiết bị và dụng cụ:

lên.

Ống mao dẫn thuỷ tinh đường kính trong 1 mm, đường kính ngoài tối đa 3 mm; chiều dài ống (50-80) mm.

Ghi nhiệt độ khi mẫu bắt đầu bị đẩy lên.

Báo cáo kết quả:

Nhiệt kế đọc được (từ -5 đến + 100) oC; vạch chia 0,1oC.

Kết quả được ghi chép và tính toán theo báo cáo thử nghiệm phụ lục

Cốc thuỷ tinh dung tích 600 mL.

1.

Bếp điện điều chỉnh được nhiệt độ.

Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 3 kết quả thử song song được làm tròn đến 0,1 0C.

Tiến hành: Tiến hành thử nghiệm 3 lần cho mỗi mẫu thử theo các bước sau :

Chênh lệch giữa kết quả lớn nhất và nhỏ nhất không được quá 0,5

Cho mẫu đã trộn đều vào cốc thủy tinh và gia nhiệt cho đến khi mẫu nóng chảy hoàn toàn, lọc qua giấy lọc để loại tạp chất và vết ẩm.

Mẫu phải khan nước hoàn toàn.

0

C.

7.3.4. Xác định chỉ số Peroxide trong dầu mỡ

Chỉ số peroxyt (PoV) là lượng chất có trong mẫu thử được tính bằng

Nhúng ống mao dẫn sạch vào dung dịch mẫu đã lọc trên cho đến khi chiều cao mẫu trong ống đạt khoảng 10 mm. Làm lạnh các ống mao dẫn bằng cách áp chặt đầu dưới của ống mao dẫn lên nước đá cho đến khi mẫu đặc lại.

mili đương lượng oxy hoạt tính làm oxi hoá KI trên 1kg mẫu dưới các điều kiện thao tác theo quy định. Chỉ số này phản ánh sự ôi hóa của dầu mỡ.

Nguyên tắc của phương pháp này đó là dựa vào phản ứng của peroxyt với dung dịch KI tạo ra I2 tự do (trong môi trường acid acetic và

Đặt các ống mao dẫn vào bình kín và để trong tủ lạnh ở nhiệt độ (4– o

10) C qua đêm (khoảng 16 h).

cloroform). Sau đó chuẩn độ I2 sinh ra bằng dung dịch chuẩn Na2S2O3 với chỉ thị hồ tinh bột. Điểm tương đương nhận được khi dung dịch chuyển từ

Cột ống mao dẫn vào nhiệt kế sao cho đầu dưới của ông mao dẫn ngang với đáy bầu thuỷ ngân của nhiệt kế.

màu tím đen sang không màu.

Phương trình phản ứng:

137

138

R1 CH CH R2 O

O

R1 CH CH R2

+ 2KI + 2CH3COOH

+ 2CH3COOK

O

I2 + 2 Na2S2O3 = 2 NaI

+

H 2O

Chuẩn độ bằng dung dịch Na2S2O3 0,1 N (chuẩn nhanh, lắc mạnh và

+ I2

đều) cho đến khi mất màu vàng. Thêm 0,5 mL chỉ thị tinh bột. Tiếp tục chuẩn độ cho đến mất màu xanh.

+ Na2S4O6

Lưu ý: Nếu thể tích chuẩn độ nhỏ hơn 0,5 mL Na2S2O3 0,1 N, lặp lại thí Chú ý tiến hành thí nghiệm trong môi trường trung tính hoặc acid yếu.

Nếu tiến hành trong môi trường acid mạnh hoặc kiềm dễ xảy ra phản ứng

nghiệm và dùng dung dịch Na2S2O3 0,002 N để chuẩn độ .

Thực hiện mẫu trắng song song. Thể tích chuẩn mẫu trắng phải nhỏ hơn

oxi hoá của iod với oxi không khí gây sai số lớn.

0,1 mL Na2S2O3 0,1 N .

Phạm vi áp dụng : Xác định chỉ số Peroxide trong dầu mỡ

Tính kết quả:

Tài liệu tham khảo: AOCS Cd 8-53 (1997)

Kết quả được ghi chép và tính toán theo báo cáo thử nghiệm phụ lục 1.

Thiết bị và dụng cụ:

Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 2 kết quả thử song song được làm tròn đến số lẻ thứ nhất

Pipet 1 mL

Chênh lệch kết quả giữa 2 lần thử song song không được quá 0,2

Bình tam giác nút mài dung tích 250 mL.

meq/Kg

Hóa chất : Hóa chất loại tinh khiết phân tích Hỗn hợp dung dịch acetic acid - chloroform gồm 3 phần thể tích

Dầu mỡ thực phẩm– Chỉ s peroxide - AOCS CD 8 – 53 (1997) (VS - VB) x N x 1000

acetic acid băng với 2 phần thể tích chloroform.

Dung dịch KI bão hòa : kiểm tra hằng ngày bằng cách thêm 2 giọt

X=



, meq/kg

W

chỉ thị hồ tinh bột vào dung dịch chứa 0,5 mL KI bão hòa và 30 mL axetic acid - chloroform. Nếu dung dịch có màu xanh thì bỏ đi, pha

N- nồng độ dung dịch Na2S2O3

lại dung dịch KI khác. Nên chuẩn bị dung dịch KI ngay trước khi sử

VB -thể tích dung dịch Na2S2O3 chuẩn mẫu trắng, mL

dụng.

VS -thể tích dung dịch Na2S2O3 chuẩn mẫu thử, mL

Dung dịch chuẩn Na2S2O3 0,1 N.

W- khối lượng mẫu thử, g

Chỉ thị hồ tinh bột 1 %.

X- chỉ số peroxide, meq / kg 7.3.5. Xác định chỉ số xà phòng hoá của dầu mỡ thực phẩm

Tiến hành:

Chỉ số xà phòng hoá là lượng mg KOH cần để xà phòng hoá hoàn toàn

Tiến hành thử nghiệm 2 lần cho mỗi mẫu thử theo các bước sau: Cân (0,05÷ 5,00) g vào bình tam giác nút mài dung tích 250 mL.

1 g mẫu dầu béo.

Thêm 30 mL hỗn hợp acetic acid - chloroform. Lắc nhẹ cho đến khi

Phạm vi áp dụng: Xác định chỉ số xà phòng của các sản phẩm dầu mỡ

mẫu tan hoàn toàn.

thực phẩm thông thường.

Thêm chính xác 0,5 mL KI bão hòa. Để yên đúng 1 phút. Thêm 30

Tài liệu tham khảo: AOCS Cd 3-25 (1997) Thiết bị và dụng cụ :

mL nước cất.

139

140

Bếp cách thuỷ điều chỉnh được nhiệt độ.

Chỉ số xà phòng hoá - AOCS CD 3 – 25 (1997)

Ống sinh hàn có chiều dài tối thiểu 650 mm .

( VB - VS ) x N x 56,1

Bình tam giác dung tích 250 mL.

X = 

Thuốc thử : (loại tinh khiết phân tích).

W

Dung dịch HCl chuẩn 0,5 N.

N - Nồng độ dung dịch HCl

Dung dịch KOH trong cồn: cân khoảng (5 –10) g KOH cho vào bình

VB - thể tích dung dịch HCl chuẩn mẫu trắng , mL

cầu dung tích 2 L chứa sẵn 1,5 L cồn 95o . Đun hoàn lưu trên bêp

VS - thể tích dung dịch HCl chuẩn độ mẫu thử, mL

cách thuỷ 1 h. Chưng cất và thu hồi cồn.

W - khối lượng mẫu thử, g

Hoà tan 40 g KOH trong 1 L cồn đã thu hồi trên (giữ ở nhiệt độ nhỏ o

X - chỉ số xà phòng hoá

hơn 15,5 C trong quá trình hoà tan). Dung dịch nầy phải để qua đêm,

7.3.6. Xác định chỉ số iod (Phương pháp Wijs)

lọc.

Phạm vi áp dụng: Xác định chỉ số iod trong tất cả các loại dầu và mỡ o

Dung dịch chỉ thị phenolphtalein 1 % trong cồn 95 .

thông thường Tài liệu tham khảo: AOCS Cd 1-25(1997)

Tiến hành thử:

Thiết bịvàdụng cụ:

Tiến hành thử nghiệm 2 lần cho mỗi mẫu thử theo các bước sau : Cho mẫu vào cốc thuỷ tinh và gia nhiệt cho đến khi mẫu ở dạng lỏng

Bình iod nút mài dung tích 500 mL

hoàn toàn . Lọc qua giấy lọc để loại bỏ tạp chất và vết ẩm. Mẫu sau

Bình định mức dung tích 1 L

khi lọc phải khan nước hoàn toàn .

Pipet 25 mL

Cân chính xác khoảng (4-5) g mẫu đã chuẩn bị trên vào bình tam giác dung tích 250 mL.

Ống đong 20 mL, 50 mL Cân phân tích chính xác đến 0,0001 g

Thêm 50 mL dung dịch KOH trong cồn.

Khuấy từ

Đun hoàn lưu trên bếp cách thuỷ 1 h.

Giấy lọc

Làm nguội bình đựng mẫu và ống sinh hàn (nhưng không làm đông

Bình tam giác dung tích 50 mL

mẫu trong bình).

Hệ thống tạo khí clo

Rửa bên trong ống sinh hàn bằng một ít nước cất.

Tủ sấy

Lấy bình đựng mẫu ra khỏi ống sinh hàn ; thêm 1 mL chỉ thị

Đồng hồ Hóa chất: (Loại tinh khiết phân tích)

phenolphtalein.

Chuẩn độ mẫu bằng dung dịch HCl 0,5 N cho đến khi mất màu hồng.

Thực hiện mẫu trắng song song với mẫu thử.

Dung dịchWijs: chuẩn bị như sau: Hòa tan 13 g Iod trong 1 L acid acetic băng. Đun nhẹ để hòa tan hoàn toàn, làm nguội. Dùng pipet hút 5 mL dung dịch iod này vào

Tính toán kết quả: 141

142

bình tam giác, thêm 5 mL dung dịch KI 10 %, 30 mL nước cất và

Thêm chính xác 20 mL dung dịch Wijs vào bình ,đậy nút kỹ và lắc

chuẩn độ với Na2S2O3 0,1 N (chỉ thị hồ tinh bột). Ghi thể tích. Lấy

đều.Để yên nơi tối ở nhiệt độ (25oC ± 5) oC trong 1h với mẫu có chỉ

(100÷200) mL dung dịch iod vào bình màu tối, để nơi thoáng mát để

số Iod nhỏ hơn 150 hoặc trong 2h với mẫu có chỉ số Iod lớn hơn

dùng sau. Phần còn lại cho sục khí clo đi qua cho đến khi lượng

hoặc bằng 150

dung dịch Na2S2O3 dùng để chuẩn độ dung dịch gấp đôi lượng dung

Lấy bình ra, thêm lần lượt 20 mL dung dịch KI, 150 mL nước cất.

dịch chuẩn ban đầu. Màu của dung dịch chuyển từ nâu sậm sang màu

Chuẩn độ với dung dịch Na2S2O3 0,1N (khuấy đều và mạnh trong

đỏ. Dung dịch Wijs không nên thừa clo nhưng cần thừa 1 ít iod. Do

quá trình chuẩn độ) đến màu vàng rơm.Thêm 2 mL chỉ thị hồ tinh

đó sau khi thông khí clo, lượng dung dịch Na2S2O3 chuẩn độ bằng

bột.Tiếp tục chuẩn độ cho đến khi mất màu xanh .

hoặc lớn hơn 2 lần lượng dung dịch chuẩn ban đầu thì cần thêm dung dịch iod vào. Dung dịch Wijs phải được giữ trong chai màu nâu, nút o

nhám gắn Paraphin và được bảo quản nơi tối, nhiệt độ dưới 30 C. Tỷ số I/Cl của dung dịch Wijs phải nằm trong khoảng 1,1 ± 0,1 và

Thực hiện đồng thời ít nhất một mẫu trắng trong cùng điều kiện thí nghiệm với mẫu thử Lưu ý: Dung dịch wijs, cacbon tetrachloride, hydro chloride acid, khí chloride acetic acid, sunfunric acid là những chất độc hại đối với mắt và phổi; dễ

được xác định như sau: Hàm lượng iod: Rót 150 mL nước chlorine bão hòa vào bình tam

cháy và hấp thu lên da do đó phải cẩn thận khi sử dụng. Các thao tác này

giác dung tích 500mL ,thêm chính xác 5mL dung dịch Wijs và vài

nên thực hiện trong tủ hút.

viên đá bọt.Lắc và đun sôi. Để sôi đều trong 10 phút, làm nguội,

Tính toán kết quả

thêm 30 mL H2SO4 2% và 15mL dung dịch KI 15%.Trộn đều và

Chỉ số iod (Phương pháp Wijs) - AOCS Cd 1 – 25 (1997)

chuẩn độ ngay bằng dung dịch Na2S2O3 0,1 N với chỉ thị là dung

(VB - VS) x N x 12,69 X=

dịch tinh bột.



Tổng hàm lượng Halogen:Lấy 150 mL nước cất vào bình tam giác

W

dung tích 150mL. Thêm 15mL dung dịch KI 15%.Dùng pipet thêm

N - nồng độ dung dịch chuẩn Na2S2O3

20 mL dung dịch Wijs vào bình lắc đều rồi chuẩn độ bằng Na2S2O3

VB- thể tích dung dịch Na2S2O3 chuẩn mẫu trắng, mL

0,1 N với chỉ thị là dung dịch tinh bột .

VS - thể tích dung dịch Na2S2O3 chuẩn mẫu thử, mL

Tổng hàm lượng Halogen:Lấy 150 mL nước cất vào bình tam giác dung tích 150mL.Thêm 15mL dung dịch KI 15%.Dùng pipet thêm 20 mL dung dịch Wijs vào bình lắc đều rồi chuẩn độ bằng Na2S2O3

W - khối lượng mẫu thử, g X - chỉ số Iod 7.3.7. Xác định chỉ số acid trong dầu mỡ

Chỉ số acid là số mg KOH cần dùng để trung hòa acid béo tự do có

0,1 N với chỉ thị là dung dịch tinh bột.

Thêm vào bình 15 mL cacbon tetrachloride ,lắc kỹ đễ mẫu tan hoàn

trong 1g dầu hoặc mỡ.

Nguyên tắc:

toàn .

143

144

Dùng dung dịch kiềm chuẩn KOH 0,1N để trung hòa hết acid béo tự do

Thêm vài giọt chỉ thị Phenolphtalein.

có trong mẫu thử được hòa tan trong dung môi cồn trung tính với chỉ thị

Chuẩn độ bằng dung dịch KOH chuẩn 0,1 N đến màu hồng bền trong

phenolphtalein.

30 giây.

Điểm tương đương nhận được khi dung dịch từ màu vàng (đặc trưng cho từng loại dầu) chuyển sang màu hồng nhạt và bền trong 30 giây.

Tính kết quả: Kết quả được ghi chép và tính toán theo báo cáo thử nghiệm phụ lục 1.

Phương trình phản ứng: RCOOH + KOH

Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 2 kết quả thử song song RCOOK + H2O

được làm tròn đến 2 chữ số có nghiã

Phạm vi áp dụng: Xác định chỉ số acid trong dầu mỡ động thực vật

Chênh lệch kết quả giữa 2 lần thử song song không được quá 0,22

Tài liệu tham khảo: AOCS Cd 3d-63 (1997)

đối với mẫu có chỉ số acid nhỏ hơn 4 hoặc không quá 0,36 đối với

Thiết bị và dụng cụ :

mẫu có chỉ số acid lớn hơn 4.

Bình tam gíac dung tích 250 mL hoặc 300 mL. Hóa chất: (Loại tinh khiết phân tích) Chỉ số acid - AOCS Cd 3a – 63 (1997)

Dung dịch chuẩn KOH 0,1 N: hòa tan 5,6 g KOH tinh khiết trong 1

V x N x 56,1

lít nước vào bình tam giác 2 lít. Đun sôi và khuấy 10 phút, thêm 2 g

X =  , mg KOH / g

Ba(OH)2, đun thêm( 5 ÷10) phút nữa, làm nguội, đậy nút kỹ và để

W

yên ít nhất 2 giờ trước khi lọc.Chuẩn độ lại bằng acid oxalic với chỉ

N - nồng độ dung dịch KOH

thị Phenolphtalein.

Hỗn hợp dung môi đồng thể tích izopropyl alcohol và toluen.

V - thể tích dung dịch KOH chuẩn mẫu thử, mL

Dung dịch chỉ thị Phenolphtalein 1 % trong izopropyl alcohol.

W - khối lượng mẫu thử, g 7.3.8. Xác định chỉ số hydroxyl trong dầu mỡ

Tiến hành:

Chỉ số hydroxyl là số mg KOH cần thiết để trung hoà lượng acid acetic

Tiến hành thử nghiệm 2 lần cho mỗi mẫu thử theo các bước sau: Thêm dung dịch chỉ thị vào hỗn hợp dung môi theo tỷ lệ (2 mL : 125

có được khi acetyl hoá 1 g mẫu dầu mỡ.

mL) rồi trung hòa bằng dung dịch KOH 0,1 N đến màu hồng bền trong 30

Phạm vi áp dụng: Xác định chỉ số hydroxyltrong dầu mỡ và các chất thay

giây

thế

Cân lượng mẫu (đã được khuấy trộn đến đồng nhất) vào bình tam giác

Tài liệu tham khảo: FAO FNP 5/REV.1 (P.177) - 1983

dung tích 250 mL . Lượng cân mẫu tùy thuộc vào chỉ số acid dự đoán có

Hóa chất: (loại tinh khiết phân tích ) Pyridine tinh khiết (đã được chưng cất lại và thu hồi ở 114oC -

trong mẫu theo bảng sau: Thêm 125 mL hỗn hợp dung môi đã trung hòa . Hòa tan mẫu (nếu

115oC) trước khi sử dụng

cần, làm ấm để hòa tan).

145

146

Anhydride acetic tinh khiết (đã được chưng cất lại và thu hồi ở o

139 C) trước khi sử dụng

Chênh lệch kết quả giưã 2 lần thử song song không được quá 5 đơn vị

Hỗn hợp pyridine - anhydride acetic : Điều chế ngay trước khi sử

7.3.9. Xác định hàm lượng chất không xà phòng hoá trong dầu mỡ

dụng bằng cách trộn 3 thể tích pyridine với 1 thể tích anhydride

Phạm vi áp dụng: Xác định hàm lượng chất không xà phòng hoá trong các

acetic.

loại dầu mỡ thông thường.

Dung dịch KOH 0,5 N trong cồn.

Tài liệu tham khảo: AOCS Ca 6a- 40(1997)

Dung dịch n - butanol đã được trung hoà bằng dung dịch KOH 0,5 N

Thiết bị và dụng cụ: Hệ thống đun hoàn lưu

trong cồn ( với chỉ thị phenolphtalein) đến màu hồng nhạt.

0

Bình lóng dung tích 500 mL

Chỉ thị phenolphtalein 0,2 % trong cồn 60 .

Thuốc thử: (Loại tinh khiết phân tích)

Tiến hành thử: Tiến hành thử nghiệm 2 lần cho mỗi mẫu thử theo các bước sau :

Cồn 950

Cân chính xác đến 0,1 mg lượng mẫu thích hợp cho vào bình tam

Dung dịch KOH 50 %

giác, thêm chính xác lượng tương ứng hỗn hợp pyridine anhydride

Ether petroleum

acetic theo bảng trên. Lắc đều mẫu. Đun hoàn lưu trên bếp cách thuỷ

Dung dịch chuẩn NaOH 0,02 N

1 h. Thêm 10 mL nước cất qua hệ thống hoàn lưu (Nếu dung dịch có

Dung dịch phenolphtalein 1% trong cồn 950

mặt phân cắt, thêm đủ pyridine để có dung dịch đồng nhất) .Tiếp tục đun hoàn lưu thêm 10 phút nữa rồi làm nguội. Dùng 25 mL nbutanol trung tính , một nửa để rửa ống hoàn lưu, 1 nửa để rửa thành bình tam giác. Chuẩn độ bằng KOH 0,5 N , với 1 mL chỉ thị

Tiến hành: Tiến hành thử nghiệm 2 lần cho mỗi mẫu thử theo các bước sau: Cân khoảng 5 g (chính xác đến 0,0001g) mẫu đã trộn kỹ vào bình tam giác nút mài Thêm 30 mL cồn 950 và 5 mL dung dịch KOH 50 %. Đun hoàn lưu

phenolphtalein đến màu hồng nhạt.

Làm mẫu trắng tương tự như trên nhưng không có mẫu thử.

trên bếp cách thủy1giờ hoặc cho đến khi mẫu được xà phòng hoá

Để xác định acid tự do, cân 1 lượng mẫu cho vào bình tam giác khác.

hoàn toàn

Thêm 10 mL pyridine (đã được trung hoà với KOH, chỉ thị

Chuyển toàn bộ mẫu đã xà phòng hoá vào bình lóng. Rửa bình bằng

phenolphtalein).Định phân bằng KOH 0,5 N trong cồn với 1 mL chỉ

cồn 950 đến khi thể tích đạt 40 mL. Tiếp tục rửa bằng nước ấm và

thị phenolphtalein đến hồng nhạt.

sau đó nước lạnh đến khi tổng thể tích đạt 80 mL. Tráng rửa quanh bình tam giác bằng 5 mL ete petrol và cũng thêm vào bình lóng. Làm

Tính kết quả:

nguội đến nhiệt độ phòng rồi thêm 50 mL ete petrol

Kết quả được ghi chép và tính toán theo báo cáo phụ lục 1 Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 2 kết quả thử song song

Đậy nắp, lắc mạnh ít nhất 1 phút, để yên tách lớp Chuyển lớp dưới sang bình lóng khác

được làm tròn đến hàng đơn vị.

147

148

Lặp lại quá trình trích ly ít nhất 6 lần với mỗi lần dùng 50 mL ete petrol. Tất cả dịch trích ly được dồn vào 1 bình lóng

W4 – khối lượng bình và cặn mẫu trắng sau khi trích ly, g VS - thể tích NaOH chuẩn độ mẫu thử,mL

Rửa dịch trích ly 3 lần, mỗi lần 25 mL cồn 10 %. Lắc mạnh và loại bỏ lớp cồn sau mỗi lần trích ly

VB - thể tích NaOH chuẩn độ mẫu trắng, mL X - hàm lượng chất không xà phòng hoá, %

Tiếp tục rửa dịch trích ly bằng cồn 10% cho đến khi dung dịch rửa không cho màu hồng với vài giọt phenolphtalein

W- khối lượng mẫu thử,g 0,0056 là số gam axit oleic tương ứng chuẩn độ với 1ml NaOH 0,02 N

Chuyển dịch trích ly được vào bình tam giác khô sạch đã biết trước khối lượng. Làm bay hơi toàn bộ ete petrol trên bếp cách thủy rồi sấy

trong chuẩn độ trên 7.3.10.Xác định hàm lượng xà phòng trong dầu

đến khối lượng không đổi ở (70 – 80) C. Làm nguội 30 phút trong

Phạm vi áp dụng: Xác định hàm lượng xà phòng trong các sản phẩm dầu

bình hút ẩm rồi cân

thực vật đã tinh chế.

0

0

Hoà tan cặn bằng 50 mL cồn trung tính ở 50 C, thêm 5 giọt

Tài liệu tham khảo: AOCS Cc 17-95 (1997) Thiết bị và dụng cụ:

phenolphtalein.

Chuẩn độ bằng NaOH 0,02 N đến điểm cuối

Bếp cách thuỷ.

Thực hiện mẫu trắng tương tự nhưng thay mẫu bằng nước cất

Bình tam giác có nút mài Microburet 5 mL

Tính kết quả: Kết quả được ghi chép và tính toán theo báo cáo thử nghiệm phụ lục

Dung dịch kiểm tra Aceton chứa 2 % nước: cho 20 mL nước vào 980

1 Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 2 kết quả thử song song

mL aceton nguyên chất rồi chuẩn độ bằng HCl 0,01 N hoặc NaOH 0,01 N với chỉ thị bromophenol xanh cho đến khi dung dịch có màu

được làm tròn đến số lẽ thứ 2.

Chênh lệch kết quả giữa 2 lần thử song song không được quá 0,2%

Chỉ thị bromophenol xanh 1% trong nước.

( W3− W1 ) − [(VS - VB) x 0,0056 x f + (W4 – W2)] 

vàng Dung dịch chuẩn HCl nồng độ 0,01 N.

Hàm lượng chất không xà phòng hóa - AOCS Ca 6a – 40 (1997)

X=

Hóa chất: (Loại tinh khiết phân tích)

x 100 ,

Dung dịch NaOH 0,01N Tiến hành thử:

%

Tiến hành thử nghiệm 2 lần cho mỗi mẫu thử theo các bước sau:

W

Cân khoảng 10 g mẫu (đã trộn đều) chính xác đến 0,0001g vào bình

f- hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH W1 - khối lượng bình mẫu thử ,g

tam giác dung tích 250 mL . Thêm 1 mL nước cất , làm ấm trên bếp

W2 - khối lượng bình mẫu trắng, g

cách thuỷ và lắc mạnh .

W3 - khối lượng bình và cặn mẫu thử sau khi trích ly, g 149

150

Thêm tiếp 50 mL dung dịch kiểm tra, làm ấm rồi lắc kỹ. Để yên cho dung dịch trong bình tách thành hai lớp. Nếu mẫu có xà phòng, lớp

Tài liệu tham khảo: AOCS Ca 11 - 25 (1997) Thiết bị và dụng cụ:

trên sẽ có màu xanh lá mạ đến xanh da trời, tiếp tục thực hiện các

Lò nung điều chỉnh được nhiệt độ đến 600 0C

bước tiếp theo sau đây để xác định hàm lượng xà phòng.

Chén nung dung tích 100 mL

Chuẩn độ mẫu trong bình bằng dung dịch HCl 0,01 N mẫu cho đến khi màu xanh của lớp dung dịch trên chuyển thành màu vàng.

Tiến hành: Tiến hành thử nghiệm 2 lần cho mỗi mẫu thử theo các bước sau:

Tiếp tục làm ấm, lắc và chuẩn độ đến khi lớp trên có màu vàng bền

Trộn mẫu thật đều , nếu cần , làm mềm bằng cách đun nhẹ nhưng

Thực hiện mẫu trắng với mẫu dầu không chứa xà phòng.

không làm chảy mẫu. Đặt chén vào lò nung (550 - 600) oC trong khoảng 30 phút. Làm

Tính kết quả: Kết quả được ghi chép và tính toán theo báo cáo thử nghiệm phụ lục 1

nguội trong bình hút ẩm và cân.

Cân khoảng 50 g mẫu vào chén, đun nhẹ cho đến khi mẫu cháy thành

Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 2 kết quả thử song song

ngọn lửa trên mặt. Giảm kích thước ngọn lửa cho đến khi nhiệt vừa

được làm tròn đến số lẻ thứ nhất

đủ cho mẫu cháy.

Chênh lệch kết quả giữa 2 lần thử song song không được quá 0,01%

Tiếp tục đốt mẫu đến than đen rồi cho chén vào lò nung nhiệt độ (550 - 600) oC trong 1 giờ.

Hàm lượng xà phòng - AOCS Cc 17- 95 (1997)

Lấy chén ra khỏi lò nung , làm nguội 45 phút trong bình hút ẩm ,

(VS -VB) x N x 0,304 ×100

cân.

X =  , %

W

Lặp lại quá trình nung và cân cho đến khi chênh lệch khối lượng giữa 2 lần cân liên tiếp không quá 5 mg

N - nồng độ dung dịch HCl

Tính kết quả:

VS - thể tích HCL chuẩn độ mẫu thử, mL

Kết quả được ghi chép và tính toán theo báo cáo thử nghiệm phụ lục

VB - thể tích HCL chuẩn độ mẫu trắng, mL

1.

W - khối lượng mẫu, g

Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 2 kết quả thử song song

X - hàm lượng xà phòng theo natri oleat, % Lưu ý: Phương pháp này dùng cho mẫu có chứa hàm lượng xà phòng khoảng 0,05 % . Đối với mẫu có hàm lượng xà phòng lớn nên cân khoảng 4

được làm tròn đến 0,1g/Kg Chênh lệch kết quả giữa 2 lần thử song song không được quá 0,1g/Kg Hàm lượng tro - AOCS Ca 11 – 25 (1997)

g mẫu.

(W2 – W) x 1000

7.3.11.Xác định hàm lượng tro cuả sản phẩm dầu

Phạm vi áp dụng: Xác định hàm lượng tro của các sản phẩm dầu mỡ thực phẩm

X =  , g/Kg W1 - W

151

152

Sấy khô chén và cặn đến khối lượng không đổi ở (101 ± 1) 0C, làm

W2 - khối lượng chén và tro, g W1 - khối lượng chén và mẫu, g

nguội 30 phút trong bình hút ẩm, cân

W - khối lượng chén, g

Tính kết quả

X - hàm lượng tro, g/kg

Kết quả được ghi chép và tính toán theo báo cáo thử nghiệm phụ lục

7.3.12.Xác định hàm lượng tạp chất của sản phẩm dầu mỡ thực phẩm

1

Phạm vi áp dụng: Xác định hàm lượng tạp chất không tan của sản phẩm dầu mỡ thực phẩm

Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 2 kết quả thử song song được làm tròn đến 0,01%

Tài liệu tham khảo: AOCS Ca 3a – 46(1997)

Chênh lệch kết quả giữa 2 lần thử song song không được quá 0,01%

Thiết bị và dụng cụ:

Hàm lượng tạp chất - AOCS Ca 3a – 46 (1997)

Tủ sấy điều chỉnh được nhiệt độ ở (101 ± 1) 0C

( W2 - W1 ) x 100

Chén lọc Gooch có lót 2 g amian (đã được sấy khô đến khối lượng

X =  , %

0

không đổi ở (101 ± 1) C . Làm nguội 30 phút trong bình hút ẩm và

W

cân) Thuốc thử: (Loại tinh khiết phân tích)

W2 - khối lượng chén và cặn sau khi sấy , g

Ete petrol

W1 - khối lượng chén , g

Ete etylic

W - khối lượng mẫu , g

X - khối lượng tạp chất , %

Chuẩn bị mẫu

7.3.13.Xác định hàm lượng nước và các chất dễ bay hơi trong sản phẩm dầu

Trộn mẫu thật kỹ bằng dụng cụ thích hợp (có thể làm ấm mẫu nhưng không

mỡ

được đến điểm nóng chảy)

Phạm vi áp dụng: Xác định hàm lượng nước và các chất dễ bay hơi trong

Tiến hành

các sản phẩm dầu mỡ thông thường.

Tiến hành thử nghiệm 2 lần cho mỗi mẫu thử theo các bước sau:

Tài liệu tham khảo: AOCS Ca 2c – 25(1997)

Cân chính xác khoảng 5 g mẫu vào cốc thủy tinh

Thiết bị và dụng cụ :

Thêm 50 mL ete etylic rồi làm ấm trên bếp cách thủy để hoà tan

Tủ sấy điều chỉnh được nhiệt độ đến 1010C ± 10C

Lọc qua chén lọc Gooch

Bếp điện

Rửa 5 lần, mỗi lần với 10 mL ete etylic ấm, để dịch qua lọc hết rồi

Chén ẩm có nắp Bình hút ẩm

mới cho lượng ete tiếp theo

Tiến hành:

Rửa lại cặn bằng 1 ít ete petrol

Tiến hành thử nghiệm 2 lần cho mỗi mẫu thử theo các bước sau: 153

154

Cân chính xác khoảng 5 g (đã được trộn đến đồng nhất)mẫu vào chén ẩm (đã được sấy khô đến không đổi và cân để biết khối lượng)

Thuốc thử: (loại tinh khiết phân tích) Ethyl alcohol 95% đã được kiểm tra độ trung tính bằng cách trung hoà với dung dịch kiềm chuẩn và chỉ thị phenol phtalein.

Đặt chén có mẫu vào tủ sâý ở (101 ± 1)0C trong 30 phút Lấy ra, làm nguội trong bình hút ẩm 30 phút rồi cân

Dung dịch NaOH chuẩn

Lặp lại quá trình sấy và cân cho đến khi chênh lệch giữa 2 lần cân

Dung dịch chỉ thị phenol phtalein 0,1 % trong cồn 95o Thiết bị và dụng cụ:

liên tiếp không quá 5 mg

Tiến hành thử nghiệm 2 lần cho mỗi mẫu thử theo các bước sau:

Tính kết quả: Kết quả được ghi chép và tính toán theo báo cáo thử nghiệm phụ lục

Tuỳ thuộc vào hàm lượng acid béo (dự đoán) có trong mẫu, xác định hàm lượng mẫu, cồn và nồng độ dung dịch NaOH cần thiết để phân tích theo

1 Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 2 kết quả thử song song

bảng sau: Trộn thật đều mẫu và làm chảy mẫu hoàn toàn ở nhiệt độ không quá

được làm tròn đến số lẻ thứ 2 Chênh lệch kết quả giữa 2 lần thử song song không được quá 0,03%

điểm nóng chảy 10oC trước khi cân Cân lượng mẫu tương ứng theo bảng trên và cho vào bình tam giác (lắc mẫu 1 phút trước khi cân nếu mẫu có chứa bọt khí )

Hàm lượng nước và các chất dễ bay hơi - AOCS Ca 2c – 25 (1997)

Thêm lượng cồn tương ứng và 2 mL chỉ thị phenol phatalein. Định phân với dung dịch NaOH chuẩn tương ứng cho đến khi có

(W2 - W1) x 100

màu hồng nhạt bền trong 30 giây.

X =  , %

Hàm lượng acid béo tự do

W2 - W

VxNxK

W2 - khối lượng chén và mẫu trước khi sấy, g

X =  , %

W1 - khối lượng chén và mẫu sau khi sấy, g

W

W - khối lượng chén, g Trong đó :

X - hàm lượng nước và các chất dễ bay hơi,% 7.3.14.Xác định hàm lượng acid béo tự do có trong dầu, mỡ thực phẩm

N

-nồng độ dung dịch NaOH, N

Phạm vi áp dụng: Xác định hàm lượng acid béo tự do có trong dầu thực

V

-thể tích NaOH chuẩn mẫu thử, mL

vật, dầu hải sản, mỡ động vật ở dạng thô hoặc đã tinh chế.

W

-khối lượng mẫu thử, g

Tài liệu tham khảo: AOCS Ca 5a-40 (1997)

K

-hệ số chuyển đổi theo loại acid tương ứng, có giá trị:

Thiết bị và dụng cụ:

K= 28,2 nếu X tính theo acid oleic

Bình tam giác dung tích 250 mL

K= 20,0 nếu X tính theo acid lauric

Dụng cụ định phân (loại đơn giản hoặc tự động)

K= 25,6 nếu X tính theo acid palmitic 155

156

X - hàm lượng acid béo tự do, %

157