NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT CAPSAICIN TỪ ỚT
vectorstock.com/27117080
Ths Nguyễn Thanh Tú eBook Collection
BÁO CÁO NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT CAPSAICIN TỪ ỚT (Capsicum frutescens (L.) Bail) ĐỂ PHÁT TRIỂN THỰC PHẨM CHỨC NĂNG WORD VERSION | 2021 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL.COM
Tài liệu chuẩn tham khảo Phát triển kênh bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật : Nguyen Thanh Tu Group Hỗ trợ trực tuyến Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon Mobi/Zalo 0905779594
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM ---o0o---
BÁO CÁO NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT CAPSAICIN TỪ ỚT (Capsicum frutescens (L.) Bail) ĐỂ PHÁT TRIỂN THỰC PHẨM CHỨC NĂNG Mã số: 184.TP14 TS. NGUYỄN NGỌC TUẤN
GVHD: Chủ nhiệm:
Lê Thị Thảo My Võ Duy Khánh
TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 5 NĂM 2019
LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện và hoàn thành bài nghiên cứu này bên cạnh sự nỗ lực của nhóm còn có sự giúp đỡ từ rất nhiều phía. Trước tiên, chúng tôi xin gửi lời cám ơn tới trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất cũng như điều kiện cho việc học tập và nghiên cứu, các thầy cô giáo trong Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho chúng tôi những kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian qua. Đặc biệt, chúng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Ngọc Tuấn đã tận tình giúp đỡ, trực tiếp chỉ bảo, hướng dẫn chúng tôi trong suốt quá trình làm đồ án tốt nghiệp. Đồng thời, chúng tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô bên viện nghiên cứu đã tạo điều kiện thuận lợi nhất về phòng thí nghiệm cũng như các dụng cụ, hóa chất và thiết bị để chúng tôi có thể hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp. Mặc dù đã cố gắng nhưng với trình độ lý luận cũng như kinh nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót, chúng tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp của quý thầy cô. Chúng tôi chân thành cám ơn. Tp HCM, ngày 27 tháng 5 năm 2019 Nhóm thực hiện đề tài
i
TÓM TẮT Mục đích: tách chiết, phân lập các hợp chất phenolic từ quả ớt (Capsicum frutescens (L.) Bail). Được thu hái ở huyện Thanh Bình, tỉnh Đồng Tháp. Ngày 18 tháng 6 năm 2018. Được định danh bởi Tiến sĩ Đỗ Ngọc Đài-Trường ĐH Kinh tế Nghệ An Tp. Vinh. Tách chiết, phân lập được hai hợp chất Capsaicin và Acid Cinnamic từ quả ớt (Capsicum frutescens (L.) Bail) bằng các phương pháp sắc kí cột, sắc kí bản mỏng và xác định cấu trúc của các hợp chất trên bằng các phương pháp vật lí như UV, IR, NMR, MS.
ii
MỤC LỤC NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ............................. Error! Bookmark not defined. LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................... i TÓM TẮT ĐỒ ÁN ..........................................................................................................ii MỤC LỤC ..................................................................................................................... iii DANH MỤC BẢNG ....................................................................................................... v DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................... vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ...................................................................................... viii ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................ ix CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ........................................................................................... 1 1.
Tổng quan ớt.......................................................................................................... 1 1.1. Giới thiệu.............................................................................................................. 1 1.2. Định danh dược liệu ............................................................................................. 1 1.3. Mô tả hình thái và phân bố sinh thái .................................................................... 1 1.4. Thành phần hóa học ............................................................................................ 3 1.5. Hoạt tính sinh học của ớt...................................................................................... 4 1.6. Tổng quan về capsaicin ........................................................................................ 5 1.6.1. Nguồn gốc về Capsaicin ............................................................................... 5 1.6.2. Định nghĩa về Capsaicin ............................................................................... 5 1.6.3. Công dụng của Capsaicin ............................................................................. 6 1.6.4. Tác dụng phụ của Capsaicin ......................................................................... 8
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ................................. 9 2. Vật liệu nghiên cứu: ..................................................................................................... 9 2.1. Thời gian và địa điểm: ......................................................................................... 9 2.2. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị: ........................................................................ 9 2.2.1. Nguyên liệu: .................................................................................................. 9 2.2.2. Hóa chất và thiết bị ....................................................................................... 9 2.3. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 11 2.3.1. Phương pháp lấy mẫu ................................................................................. 11 2.3.2. Phương pháp chiết tách, phân lập ............................................................... 11 2.3.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất .............................................. 11 iii
2.4. Nghiên cứu các hợp chất từ ớt ........................................................................... 11 2.4.1. Quy trình nghiên cứu .................................................................................. 11 2.4.2. Phương pháp lấy mẫu ................................................................................. 12 2.4.3. Quy trình xử lí mẫu ..................................................................................... 13 2.4.4. Phương pháp sắc ký cột và phương pháp sắc ký bản mỏng: ..................... 15 2.5 Phương pháp xác định cấu tạo hợp chất:............................................................. 17 2.6.Các thông số vật lý thu được:.............................................................................. 21 2.6.1. Capsaicin ..................................................................................................... 21 2.6.2. Cinnamic acid ............................................................................................. 21 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................................... 22 3. Các hợp chất: ............................................................................................................. 22 3.1. Hợp chất 1: ......................................................................................................... 22 3.2. Hợp chất 2: ......................................................................................................... 38 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 44 4.1. Kết luận .............................................................................................................. 44 4.2. Kiến nghị ............................................................................................................ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 45 PHỤ LỤC ........................................................................................................................ a Phụ lục 1: Thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu .................................................. a Phụ lục 2: Hình ảnh chấm bảng mỏng............................................................................. b
iv
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các hợp chất chính của capsaicin Bảng 3.1. Kết quả 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất 1 Bảng 3.2: Kết quả phổ của hợp chất 2
v
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cây ớt Hình 2.1. Nguyên liệu ớt đang nghiên cứu Hình 2.2. Quy trình nghiên cứu phân lập các hợp chất từ quả ớt (Capsicum frutescens (L.) Bail) Hình 2.3. Quy trình thu mẫu ớt (Capsicum frutescens (L.) Bail) Hình 2.4. Quy trình xử lí mẫu ớt (Capsicum frutescens (L.) Bail)
Hình 2.5. Phân lập các hợp chất từ ớt (Capsicum frutescens (L.) Bail) Hình 3.1. Phổ HMBC của hợp chất 1 Hình 3.2. Capsaicin 3D Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của CAP005 Hình 3.4. Phổ giản thể 1H-NMR của CAP005 Hình 3.5. Phổ giản thể 1H-NMR của CAP005 Hình 3.6. Phổ 13C-NMR của CAP005 Hình 3.7. Phổ giản thể 13C-NMR của CAP005 Hình 3.8. Phổ HMBC của CAP005 Hình 3.9. Phổ HMBC giản thể của CAP005 Hình 3.10. Phổ HMBC giản thể của CAP005 Hình 3.11. Phổ HMBC giản thể của CAP005 Hình 3.12. Phổ HMBC giản thể của CAP005 Hình 3.13. Phổ HMQC của CAP005 Hình 3.14. Phổ HMQC giản thể của CAP005 Hình 3.15. Phổ HMQC giản thể của CAP005 Hình 3.16. Phổ khối lượng của hợp chất 2 Hình 3.17. Phổ 1H-NMR của hợp chất 2 vi
Hình 3.18. Phổ 1H-NMR của hợp chất 2 Hình 3.19. Phổ 13C-NMR của hợp chất 2 Hình 3.20. Phổ 13C-NMR của hợp chất 2 Hình 3.21. Phổ DEPT của hợp chất 2 Hình 3.22. Phổ DEPT của hợp chất 2
vii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT UltraViolet Visible (UV-Vis): Quang phổ tử ngoại khả kiến Ultraviolet (UV): Tia tử ngoại hoặc tia cực tím Infrared radiation (IR): Quang phổ hồng ngoại Nuclear Magnetic Resonance (NMR): Cộng hưởng từ hạt nhân Mass Spectroscopy (MS): Phương pháp khối phổ Thin Layer Chromatography (TLC): Sắc ký lớp mỏng Distortionless Enhancement by Polarization Transfer (DEPT): Xác định cấu trúc bằng cách chuyển giao phân cực Heteronuclear Multiple Bond Correlation (HMBC): Tương quan hạt nhân đa liên kết Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC): Kết hợp lượng tử đơn hạt nhân
viii
ĐẶT VẤN ĐỀ Các nhà khoa học xác định chất capsaicin trong ớt cay có khả năng giết chết tế bào ung thư và nhiều lợi ích cho sức khỏe, tuy nhiên điều đó chỉ có được khi sử dụng capsaicin đúng cách. Ớt là loại cây phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới, được sử dụng rộng rãi làm chất tạo hương vị trong thực phẩm, chất tạo màu, … Do có hương vị đặc trưng nên ớt được sử dụng làm gia vị trong bữa ăn hàng ngày. Bên cạnh đó, ớt còn là một vị thuốc quý trong y học cổ truyền có thể chữa được nhiều bệnh rất hữu hiệu. Ớt là vị thuốc giúp tiêu hóa tốt, giúp ăn ngon chóng tiêu. Ớt còn được dùng ngoài như một vị thuốc gây đỏ, kích thích tại chỗ với những trường hợp đau nhức do phong thấp, đau khớp, đau lưng [4]. Gần đây, một số tỉnh vùng đồng bằng sông Hồng đã bắt đầu trồng ớt với diện tích lớn nhằm cung cấp nguồn nguyên liệu cho các nhà máy sản xuất mặt hàng thực phẩm. Các sản phẩm này được đưa ra thị trường tiêu thụ hoặc xuất khẩu mang lại lợi nhuận cao. Trong ớt có những chất chủ yếu như: capsaicin (C18H27NO3) là một alcaloid chiếm khoảng 0,05 – 2%, phần lớn tập trung ở biểu bì và giá noãn; vitamin C chiếm tỉ lệ khoảng 0,8 – 1% trong ớt Việt Nam; ngoài ra trong ớt còn có chất khác như capsanthin, vitamin B1, B2, citric axit, malic axit [5]. Ngoài ra Capsaicinoid, đặc biệt là capsaicin đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm [5] [6]. Capsaicin được sử dụng điều trị hen suyển, ho, đau họng, giảm đau răng, viêm thấp khớp [7]. Capsaicin còn là chất kháng oxi hóa, thúc đẩy quá trình chuyển hóa năng lượng, ngăn chặn sự tích tụ chất béo và là chất chống viêm [8]. Hàm lượng capsaicin khác nhau tùy theo mỗi loại ớt khác nhau. Nhiều nghiên cứu được thực hiện nhằm so sánh, đánh giá hàm lượng capsaicin trong mỗi loại ớt. Năm 2010, Nwokem và cộng sự [9] trích ly năm loại ớt khác nhau ở Nigeria, hàm lượng capsaicin được xác định bằng phương pháp phân tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS). Năm 2012, Ida Musfiroh và cộng sự [10] đánh giá hàm lượng capsaicin trong 12 loại ớt khác nhau ở Indonesia. Trong năm 2012, XiangYuan Deng và cộng sự [11] tối ưu hóa quá trình trích ly capsaicinoid với sự hỗ trợ của siêu âm chỉ ra tỉ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp là10 mg/g. Trích ly với sự hỗ trợ của vi sóng là một phương pháp được sử dụng trích ly capsaicinoid. Năm 2003, Opal và cộng sư [12] trích ly capsaicinoid với tỉ lệ nguyên liệu 10 ml/g cho thấy phương pháp này trích được 95% capsaicinoid. Ngoài ra, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu được Barbero và cộng sự ix
[13] khảo sát từ 15 – 50 ml/g. Nghiên cứu này chỉ ra rằng capsaicinoid được trích bằng phương pháp hỗ trợ vi sóng nhanh hơn phương pháp cổ điển. Từ đó nhóm chúng tôi quyết định “Chiết xuất và phân lập hợp chất phenolid từ cây Ớt (Capsicum frutescens (L.) Bail)”
x
CHƯƠNG 1: Tổng Quan
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.
Tổng quan ớt
1.1.
Giới thiệu Ớt, là một loại quả thuộc các cây thuộc chi Capsicum của họ Cà (Solanaceae),
phân họ cà solanoideae, tông ớt capsicease, chi ớt capsicum L. Là một loại quả gia vị phổ biển trên thế giới. 1.2.
Định danh dược liệu Tên khoa học: Capsicum frutescens (L.) Bail Tên thường gọi: Ớt Tên khác: Lạt tiêu, Lạt tử, Ngưu giác tiêu, Hải tiêu Họ: Cà (Solanaceae)
1.3.
Mô tả hình thái và phân bố sinh thái Mô tả hình thái: Cây ớt thuộc loại thân thảo, mọc hàng năm ở các nước ôn đới, sống lâu năm và
thân phía dưới hóa gỗ ở các nước nhiệt đới. Cây có nhiều cành, nhẵn. Lá mọc so le, mềm, hình thuôn dài, đầu nhọn, phiến lá dài 2-4 cm, rộng 1,5 – 2cm. Hoa màu trắng, mọc đơn mộc ở kẽ lá, mùa hoa gần như quanh năm nhưng nhiều nhất vào tháng 5-6. Quả mọc rủ xuống hay quay lên trời (chỉ thiên), hình dáng quả thay đổi, có loại tròn, có loại dài, khi chín có màu đỏ, vàng hay tím. Trong chứa nhiều hạt dẹt màu trắng.
Hình 1.1 Cây ớt
1
CHƯƠNG 1: Tổng Quan Phân bố sinh thái: Ớt có nguồn gốc từ châu Mỹ; ngày nay nó được trồng khắp nơi trên thế giới và được sử dụng làm gia vị, rau, và thuốc. Ở Việt Nam: Quỳnh Phụ (Thái Bình) với diện tích 1200 ha, Đại Lộc (Quảng Nam), Phù Mỹ, Phù Cát (Bình Định), Bố Trạch (Quảng Bình), Châu Đốc (An Giang), Thanh Bình (Đồng Tháp), Tiền Giang, Long An, Lâm Đồng, Vĩnh Phúc, Thái Bình, Nam Định và một số tỉnh thành khác... [22]
Hình 1.2 Bản đồ phân bố vùng trồng ớt ở Việt Nam Hiện nay, ớt được trồng ở khắp nước ta, có nơi trồng rất rộng rãi khắp thôn xóm. Gieo hạt cây ớt trong vườn ươm rồi lấy cây con đi trồng để nhân giống. Khi quả chín già, hái quả về tách lấy hạt, phơi khô và bảo quản trong lọ kín. Hạt ớt rất dễ này mầm ở nhiệt độ 20oC nhưng ở nhiệt độ thấp hơn, thời gian nảy mầm có thể kéo dài đến 10 – 12 ngày. Ớt được gieo trồng quanh năm nhưng thường có ba thời vụ chủ yếu. Mỗi mùa vụ từ khi trồng đến khi thu hoạch khoảng 110 – 120 ngày. Quả chín tới đâu
2
CHƯƠNG 1: Tổng Quan hái ngay tới đó. Năng suất trung bình đạt từ 7 đến 12 tấn quả tươi/ha, tùy theo giống cây. 1.4.
Thành phần hóa học [1] Capsaicin là một alkaloid chiếm tỉ lệ khoảng 0,05-2%. Cấu trúc hóa học được
xác định là acid isodexenic vanilylamit có đặc điểm bốc hơi ở nhiệt độ cao, gây hắt hơi mạnh Capsaicin là hoạt chất gây đỏ, nóng, chỉ xuất hiện khi quả ớt chin, chiếm tỉ lệ từ 0,01-0,1%. Các hợp chất chính có trong cây ớt chủ yếu là các dẫn xuất của capsaicin bao gồm: STT
Hợp chất
Hàm lượng
Tài liệu tham khảo
1
Capsaicin (8-Methyl-N-vanillyl- 65-70%
[1]
trans-6-nonenamide) (1) 2
Dihydrocapsaicin
(N-(4- 19-25%
[1]
Hydroxy-3-methoxybenzyl)-8methylnonanamide) (2) 3
Nordihydrocapsaicin
(N-(4- 5-8%
[1]
Hydroxy-3-methoxybenzyl)-7methyloctanamide) (3) 4
Homodihydrocapsaicin ( N-(4-
0.4-1.2%
[1]
0.2-0.8%
[1]
Hydroxy-3-methoxybenzyl)-9methyldecanamide) (4) 5
Homocapsaicin ( (3E)-N-(4Hydroxy-3-methoxybenzyl)-9methyldec-7enamide) (5)
Bảng 1.1 Các hợp chất chính của capsaicin
3
CHƯƠNG 1: Tổng Quan
(1) Capsaicin
(2) Dihydrocapsaicin
(3) Nordihydrocapsaicin
(4) Homodihydrocapsaicin
(5) Homocapsaicin Trong quả ớt chứa nhiều loại vitamin như vitamin A, E, K, C, B1, B2, B3, B5, B6, beta carotene, Canxi, sắt, magie, photpho, kali, natri, kẽm, đồng… Ngoài ra còn có các acid hữu cơ như acid citric, acid malic… 1.5.
Hoạt tính sinh học của ớt So với cam, ớt có nhiều hơn hẳn các loại Vitamin C, chất sắt, canxi, phốt pho
và vitamin nhóm B. Mỗi 100 g ớt cay tươi có chứa tới 144 mg vitamin C, đứng đầu trong các loại rau tươi. Lượng vitamin C phong phú có thể khống chế bệnh tim mạch, xơ cứng động mạch và giảm cholesterol, beta carôtin trong ớt cay có tới 1390 mg, là một trong những nguồn tốt nhất cung cấp carotin, diệp hoàng tố, các chất này đều là một trong những chất chống oxy hoá và có tác dụng chống cảm mạo, phong hàn. [1] Khi cắn một miếng ớt, vị cay kích thích mạnh sẽ làm cho não bộ bài tiết chất hoá học làm giảm bớt đau đớn và sinh ra một chút khoái cảm. Gần đây, đã có người
4
CHƯƠNG 1: Tổng Quan thử dùng ớt cay để chữa trị chứng bệnh đau đầu nghiêm trọng mang tính thần kinh và hiệu quả rất tốt. Ớt cay không những hữu dụng đối với người bị phong hàn mà trong việc điều chỉnh mỡ máu cũng rất có tác dụng. Các nghiên cứu của nước ngoài đã cho thấy chuột sau khi ăn đồ ăn có ớt, lượng cholesterol trong máu giảm rõ rệt. Trong ớt cay có những loại chất đặc biệt có thể đẩy nhanh sự trao đổi chất để đạt được hiệu quả đốt chất béo trong cơ thể nên có tác dụng trong việc giảm béo. Chất này còn có thể thúc đẩy bài tiết hormone nên cũng có tác dụng làm đẹp da. Trong ớt cay có rất nhiều vitamin C, nhưng do vitamin C không chịu nhiệt, dễ bị phá vỡ nên khi nấu nướng, phần lớn vitamin C đều hoà tan vào trong thức ăn hoặc bị phân tách. 1.6.
Tổng quan về capsaicin
1.6.1. Nguồn gốc về Capsaicin Capsaicin được bắt đầu nghiên cứu vào thế kỉ 19. Năm 1816, Bucholtz là người đầu tiên khám phá ra chất cay chủ yếu trong trái ớt bằng cách dằm vỏ trong một dung môi hữu cơ. Đến năm 1846, Thresh cho rằng chất cay có thể tách chiết dưới dạng tinh thể và nó được ông đặt tên là capsaicin. Năm 1878, một dược sĩ người Hungary, Edre Hogyes đã chiết được capsaicin và sau đó ông gọi tên là capsicol và khám phá ra rằng capsaicin kích thích lên màng nhầy khoang miệng và dạ dày làm tăng sự bài tiết. Tuy nhiên, đến năm 1898, Karl Micko mới là người đầu tiên phân lập được capsaicin ở dạng tinh khiết. Năm 1919, thành phần hóa học của capsaicin cũng được xác định bởi Nelson và sau đó chính nhà khoa học này đã xác định được cấu trúc hóa học cụ thể của capsaicin. Capsaicin được tổng hợp lần đầu tiên vào năm 1930 bởi Spath và Darling. 1.6.2. Định nghĩa về Capsaicin Có công thức phân tử:
5
CHƯƠNG 1: Tổng Quan Khối lượng phân tử 305,1991g/mol, nóng chảy ở 62 - 65°C. Capsaicin là hoạt chất gây cay nóng trong các thực vật thuộc giống ớt (giống Capsicum). Capsaicin là một alkaloid tương đối ổn định, hầu như không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ cao hoặc thấp của môi trường xung quanh. Mặc dù không màu, không mùi nhưng capsaicin là hợp chất cay nhất được biết. Capsaicin không tan trong nước nhưng tan nhiều trong alcohol, chất béo và dầu. Vì thế trong trường hợp ăn bị cay quá, dùng nước chỉ giảm được độ cay phần nào, những thức ăn có sữa sẽ giúp ta nhiều hơn. Ớt càng cay, chất Capsaicin (độc tố) càng nhiều: dùng trên 3 g/ngày gây hại. Capsaicin trong y khoa được liệt kê vào loại độc dược. Đây là một hóa chất có tác dụng khiến cho ớt có vị cay nóng, thế nhưng, khi ở dạng tinh khiết, hóa chất này có thể giết chết bất cứ ai thử nuốt nó. Capsaicin gây nóng và bỏng rát khi tiếp xúc với da người. Tuy nhiên bắt đầu từ lượng nào đó, nó mới tác hại đến cơ thể. Những phủ tạng như ruột, bao tử, hệ hô hấp, da và da nhờn trong khoang miệng mũi sẽ bị thiệt hại, nếu ăn cay quá độ. Dùng ớt quá độ và trong một thời gian dài có thể làm hệ thần kinh chết dần. Những hệ thần kinh bị ảnh hưởng: vị giác, cơ quai hàm, và do đó sự cảm nhận về độ cay cũng giảm đi. Có người ăn cả trái ớt vẫn không có phản ứng gì tức thời, nhưng có người chỉ cần cắn một miếng thôi là nước mắt mũi giàn giụa, mồ hôi toát ra, tim đập nhanh, máu dồn, đầu bưng bưng, tai nhức ù... [2] Khi ăn cay trong người sẽ tiết ra chất Endorphine (có tác dụng gần giống như thuốc phiện), chất này được phỏng đoán là lý do làm cho nghiện. 1.6.3. Công dụng của Capsaicin Capsaicin được áp dụng tại chỗ rất hữu ích trong việc làm giảm đau liên quan đến bệnh thần kinh tiểu đường và đau cơ xương mãn tính. Có được sử dụng để làm tăng khả năng bàng quang và giảm sự không kiểm soát được ở bệnh nhân bị bàng quang quá hiếu động. Capsaicin có thể làm giảm buồn nôn và nôn sau mổ khi áp dụng tại các điểm bấm huyệt. Nó có thể được sử dụng để điều trị bệnh viêm thận kết hợp với suy thận và bảo vệ dạ dày chống lại viêm dạ dày không gây viêm không steroid. 6
CHƯƠNG 1: Tổng Quan Ngoài ra, Capsaicin còn thúc đẩy quá trình đốt cháy mỡ. [3] Tác dụng chống ung thư: Nhiều nghiên cứu cho thấy khi sử dụng capsaicin liều thấp mà cơ thể cho phép thì hoạt chất này thể hiện hoạt tính chống ung thư [14] [15]. Capsaicin gây ra các cơ chế làm chết tế bào một cách mạnh mẽ trên nhiều loại tế bào ung thư ở người, kết quả này thể hiện cả ở trong các nghiên cứu thử nghiệm trong phòng thí nghiệm và trên chuột. Các nghiên cứu gần đây chủ yếu tập trung vào capsaicin như một loại thuốc tiềm năng chống ung thư có thể áp dụng trong điều trị ung thư tế bào nhỏ ở người như: ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt và ung thư ruột kết. Trong nghiên cứu của Lau JK và cộng sự năm 2014, cho thấy capsaicin liều lượng thấp được dung nạp tốt ở chuột với trọng lượng, lượng thức ăn và lượng nước uống giống nhau giữa những con chuột được điều trị thường và những con chuột được điều trị bằng capsaicin [15] [16]. Capsaicin có khả năng kích hoạt hoạt tính gây chết tế bào ung thư dạ dày ở người và làm giảm độc tính ở thận do cisplatin gây ra ở chuột nhắt [17] [18]. Tuy nhiên, khi sử dụng capsaicin liều cao trên 100 mg capsaicin/kg trọng lượng cơ thể trong một thời gian dài sẽ gây loét dạ dày, đẩy nhanh sự phát triển của tuyến tiền liệt, dạ dày, tá tràng, ung thư gan và tăng cường di căn ung thư vú [19]. Tác dụng trong điều trị bệnh vảy nến: Ngoài tác dụng giảm đau, capsaicin còn được biết đến bởi khả năng điều trị các bệnh ngoài da khác nhau: da khô, vẩy nến. Chất dẫn truyền thần kinh (chất P) là chất điều trị hiểu quả cho các bệnh ngoài da trên. Nhiều nghiên cứu gần đây đã áp dụng vai trò của capsaicin để sản xuất kem capsaicin hỗ trợ điều trị bệnh vảy nến, kết quả thu được cho thấy kem capsacin làm giảm đáng kể sự phát triển vẩy nến trên da. Tuy nhiên, các bệnh nhân tình nguyện thử cho biết ban đầu kem capsaicin tác dụng lên một số nốt nhỏ, ngứa và gây nhức sau đó ức chế sự phát triển của nó [21]. Tác dụng trong phòng ngừa và điều trị bệnh tiểu đường: Capsaicin trong ớt được coi là hoạt chất có lợi trong việc phòng ngừa và điều trị bệnh tiểu đường. Việc thường xuyên sử dụng ớt như là một loại thực phẩm giàu chất dinh dưỡng đã được chứng minh là có khả năng cải thiện lượng đường trong máu và 7
CHƯƠNG 1: Tổng Quan phản ứng insulin ở cả nam giới và nữ giới [20]. Ngoài ra, các tình trạng đau đớn liên quán đến bệnh tiểu đường, đái tháo đường cũng có thể điều trị bằng kem capsaicin để làm giảm phản ứng đau tức thì [16]. Tác dụng trong hỗ trợ giảm cân: Capsaicin trong ớt được chứng minh là có vai trò giảm cân và giảm chất béo cho cơ thể do chất này có khả năng oxy hóa chất béo, tăng cường trao đổi chất trong cơ thể giúp đốt chát chất béo và ngăn chặn dự thèm ăn [16]. 1.6.4. Tác dụng phụ của Capsaicin Capsaicin gây kích ứng da và gây ra các vấn đề như: đỏ và sưng, đau đớn, khô, đốt và ngứa, đau đớn. Điều này đôi khi trở nên tồi tệ hơn trong thời tiết nóng và ẩm ướt, khi bạn tắm trong nước ấm, và khi bạn đổ mồ hôi. Thường kéo dài vài ngày nhưng có thể kéo dài từ 2 đến 4 tuần. Capsaicin cũng có thể làm cho da của bạn nhạy cảm hơn với ánh nắng mặt trời và sức nóng, vì vậy hãy sử dụng kem chống nắng mỗi khi bạn đi ra ngoài. Giống như bất kỳ loại thuốc nào, nó có thể gây phản ứng dị ứng ở một số người. Gọi bác sĩ nếu bạn bị ngứa, phát ban, sưng cổ họng, ngực và khó thở.
8
CHƯƠNG 2: Vật Liệu Và Phương Pháp Nghiên Cứu
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 2. Vật liệu nghiên cứu: 2.1.
Thời gian và địa điểm: Quá trình nghiên cứu và hoàn thành đồ án được tiến hành từ ngày 10 tháng 6
năm 2018 đến ngày 13 tháng 5 năm 2019 tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 1A Thạnh Lộc 29, Thạnh Lộc, Quận 12, TP. Hồ Chí Minh. 2.2.
Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị:
2.2.1. Nguyên liệu: Quả ớt (Capsicum frutescens (L.) Bail) được thu hái ở huyện Thanh Bình, tỉnh Đồng Tháp ngày 18 tháng 6 năm 2018. Được định danh bởi Tiến sĩ Đỗ Ngọc ĐàiTrường ĐH Kinh tế Nghệ An Tp.Vinh.
Hình 2.1. Nguyên liệu quả ớt (Capsicum frutescens (L.) Bail) 2.2.2. Hóa chất và thiết bị Hoá chất: Các dung môi để ngâm chiết mẫu ớt đều dùng loại tinh khiết kĩ thuật, khi dùng cho các loại sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột nhanh sử dụng loại tinh khiết phân tích.
9
CHƯƠNG 2: Vật Liệu Và Phương Pháp Nghiên Cứu Thiết bị: Sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc ký lớp mỏng phân tích được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 105715), độ dày 0,2 mm; RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 368 nm; dùng hơi Iot (I2) hiện màu những chất có trên bản mỏng hoặc dùng dung dịch axit sunfuric đặc (H2SO4) phun lên bản mỏng rồi hơ nóng trên bếp điện từ đến khi hiện màu. Sắc ký cột (CC) Sắc ký cột được thực hiện với chất hấp thụ silica gel pha thường, pha đảo có cỡ hạt 70-230 mesh; 230-400 mesh (Merck). Phổ tử ngoại (UV) Phổ tử ngoại được ghi trên máy Agilent UV-Vis tại khoa Hóa học, trường Đại học Vinh, Nghệ An. Phổ hồng ngoại (FT-IR) Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên máy Bruker Optics VERTEX 80 tại khoa Hoá học, trường Đại học Vinh, Nghệ An. Phổ khối lượng (MS) Phổ khối lượng (ESI-MS) được đo trên máy micrOTOF-QII 10187 trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR đo trên máy Bruker 500MHz, phổ
13
C-
NMR, DEPT, HMBC, HSQC, COSY đo trên máy Bruker 125 MHz (Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) với chất chuẩn là TMS.
10
CHƯƠNG 2: Vật Liệu Và Phương Pháp Nghiên Cứu 2.3.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu Mẫu ớt (Capsicum frutescens (L.) Bail) được thu hái vào thời điểm thích hợp trong năm. Mẫu tươi sau khi lấy về được rửa sạch, để nơi thoáng mát, tiến hành chiết tách và phân lập, bảo quản ở điều kiện thích hợp dùng để thí nghiệm. 2.3.2. Phương pháp chiết tách, phân lập Để phân tích và phân tách cũng như phân lập các hợp chất, sẽ sử dụng các phương pháp sắc ký như: sắc ký lớp mỏng (TLC); sắc ký cột thường (CC); sắc ký cột nhanh (FC); phương pháp kết tinh. 2.3.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất Cấu trúc các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ: phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (IR); phổ khối lượng (EI-MS), (ESI-MS), (HR-ESI-MS); phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR; phổ cộng hưởng từ hạt nhân
13
C-NMR; phổ
cộng hưởng từ hạt nhân DEPT, HMBC, HSQC; cấu trúc lập thể tương của các hợp chất này được xác định các phương pháp phổ NMR. 2.4. Nghiên cứu các hợp chất từ ớt 2.4.1. Quy trình nghiên cứu Thu thập mẫu Nội dung quy trình Định loại
-
Cao chiết
-
Phương pháp lẫy mẫu Xử lí mẫu Phương pháp sắc ký cột và phương pháp sắc ký bản mỏng Phương pháp xác định cấu tạo hợp chất
Phân tích thành phần hóa học
Hình 2.2. Quy trình nghiên cứu phân lập các hợp chất từ quả ớt (Capsicum frutescens (L.) Bail)
11
CHƯƠNG 2: Vật Liệu Và Phương Pháp Nghiên Cứu 2.4.2. Phương pháp lấy mẫu Mẫu ớt được thu thập vào ở huyện Thanh Bình, tỉnh Đồng Tháp ngày 18 tháng 6 năm 2018. Được định danh bởi Tiến sĩ Đỗ Ngọc Đài-Trường ĐH Kinh tế Nghệ An Tp. Vinh Thu thập: Quả ớt (Capsicum frutescens (L.) Bail)
Định loại: Đặc điểm hình thái của mẫu Chụp ảnh mẫu ớt Bảo quản và lưu mẫu
Hình 2.3. Quy trình thu mẫu ớt (Capsicum frutescens (L.) Bail)
12
CHƯƠNG 2: Vật Liệu Và Phương Pháp Nghiên Cứu 2.4.3. Quy trình xử lí mẫu Nguyên liệu (ớt hiểm)
Xử lý
Cắt t=50-55C
Sấy
t= 24 giờ Xay t= 45C Tỷ lệ ớt: ethanol 95% 1:10
Ngâm
Siêu âm
Tỷ lệ ớt: ethanol 95% 1:10
Ngâm 16 tiếng Khuấy 3000 vòng, t=20’
t= 40’
Đồng nhất
Lọc
t= 60C
Cô quay
Cao Ethanol
Hình 2.4. Quy trình xử lí mẫu ớt (Capsicum frutescens (L.) Bail)
13
CHƯƠNG 2: Vật Liệu Và Phương Pháp Nghiên Cứu Thuyết minh quy trình xử lý mẫu: Nguyên liệu Sử dụng ớt (ớt hiểm) được thu hái ở huyện Thanh Bình, tỉnh Đồng Tháp. Có khối lượng là 5 kg. Xử lý và cắt: Ớt sau khi mua đem rửa với nước và để ráo. Sau khi ráo, cắt nhỏ ớt với kích thước nhỏ 1-2mm. Mục đích: Xử lý nguyên liệu để chuẩn bị cho các công đoạn sau. Cắt ớt với kích thước nhỏ để diện tích tiếp xúc của nguyên liệu khi sấy sẽ lớn hơn, khi đó sấy nguyên liệu sẽ nhanh khô hơn. Sấy: Nguyên liệu sau xử lý đem sấy lạnh ở nhiệt độ 50-55C trong 24 giờ. Mục đích: Giảm khối lượng của nguyên liệu, tăng độ bền và tăng thời gian bảo quản. Với nhiệt độ sấy thường ở nhiệt độ từ 10-65C, sấy lạnh giúp giữ được các chất, vitamin, màu sắc, hoạt chất có trong ớt, tránh việc phân hủy các hoạt chất trong ớt ở nhiệt độ cao. Xay: Ớt sau sấy được xay nhuyễn thành bột. Mục đích: Xay nhỏ ớt thành bột, tạo kích thước nhỏ giúp ớt dễ hòa tan với dung môi ở công đoạn sau. Thí nghiệm 1: mẫu ngâm Ngâm: Ớt sau khi xay được ngâm trong dung môi etanol 95%. Tỷ lệ ngâm ớt: etanol 95% là 1:10, trong 16 tiếng. Mục đích: hòa tan các chất có hoạt tính sinh học trong ớt. Đồng nhất: Mẫu ngâm được đồng nhất bằng máy đồng hóa mẫu Silverson với tốc độ khuấy 3000 vòng/phút trong thời gian là 20 phút. 14
CHƯƠNG 2: Vật Liệu Và Phương Pháp Nghiên Cứu Mục đích: để đồng hóa mẫu Lọc: Sau khi đồng nhất mẫu được lọc với thiết bị lọc chân không. Mục đích: thu dịch lọc. Ở thí nghiệm này, các công đoạn từ ngâm, đồng nhất, lọc, sẽ được lặp đi lặp lại đến khi dịch lọc mất màu. Cô quay: Cô quay dịch lọc ở 60C Mục đích: thu hồi dung môi, lấy cao tổng. Thí nghiệm 2: mẫu siêu âm Siêu âm: Với nhiệt độ chiết là 45C, thời gian chiết là 40 phút và chiết một lần Mục đích: hòa tan các hợp chất sinh học. Cô quay: Hỗn hợp sau chiết được đem đi cô quay ở nhiệt độ 60C Mục đích: thu hồi dung môi, lấy cao tổng (cao ethanol). 2.4.4. Phương pháp sắc ký cột và phương pháp sắc ký bản mỏng: Phương pháp sắc ký cột Trong sắc ký cột người ta dùng cột thủy tinh để nhồi pha tĩnh. Vật liệu nhồi Silica gel (silicagel pha thuận có Si có đính nhóm OH- thường dùng và silica gel pha nghịch có Si đính dây alkan R - ít dùng) thường có 3 loại là mịn (15-40 µm), loại vừa (40-63 µm) và loại thô (60-200 µm). Kích cỡ của cột lớn, vừa, nhỏ tùy vào mục đích sử dụng. Tỉ lệ mẫu/ pha tĩnh thông thường có thể là 1/30, 1/100 hay nhiều hơn. [15] Cột được chạy bằng dung môi thích hợp. Dung môi các chất được tách ra khỏi cột và được hứng thành từng phân đoạn, bằng tay hay bộ phận hứng phân đoạn. Các
15
CHƯƠNG 2: Vật Liệu Và Phương Pháp Nghiên Cứu phân đoạn được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, những phân đoạn giống nhau được gộp chung loại dung môi để thu được chất tinh khiết mong muốn. Có hai kỹ thuật hay sử dụng đó là sắc ký cột nhanh (flash chromatography- áp suất dương thấp trên đầu cột), và sắc ký cột chân không (vacuum liquid chromatography - áp suất dương thấp dưới cột), đặc điểm là sử dụng cột ngắn, đường kính to để tăng tốc độ và mẫu. [15] Phương pháp sắc ký bản mỏng: Bình khai triển là bình thủy tinh hình trụ cao 25 cm đường kính miệng 10 cm, có nắp đậy kín. Bão hòa hơi dung môi trong bình bằng cách lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình, rồi rót một lượng vừa đủ dung môi vào bình, lắc rồi để giấy lọc thấm đều dung môi. Lượng dung môi sử dụng sao cho sau khi thấm đều giấy lọc còn lại một lớp dày khoảng 5 mm đến 10 mm ở đáy bình. Ðậy kín nắp bình và để yên 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sử dụng bản mỏng TLC silicagel 60 F254 của hãng Merck được cắt bằng kéo thành bản hình chữ nhật có kích thước 3,5 cm x 12 cm và bản tự chế tạo từ tinh bột sắn dây kích thước 4 cm x 12 cm. Sử dụng ống thuỷ tinh mao quản hoặc micropipet để đưa mẫu lên bản mỏng. Thể tích dung dịch từ 0,001ml đến 0,005 ml đối với trường hợp đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng điểm và từ 0,l - 0,2 ml khi đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng vạch. Ðường xuất phát phải cách mép dưới của bản mỏng 1,5 cm – 2 cm và cách bề mặt dung môi từ 0,8 - 1 cm. Các vết chấm phải nhỏ, có đường kính 2 – 6 mm và cách nhau 15 mm. Các vết ở bìa phải cách bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm để tránh hiệu ứng bờ. Ðặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển. Ðậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi. Khi dung môi đã triển khai trên bản mỏng được một đoạn, lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng rồi chụp ảnh, đo khoảng di chuyển của dung môi và các chất cần tách. Tính hệ số Rf. Với tách chất màu thực vật trong lá xanh làm với các hệ dung môi khác nhau, trong mỗi hệ dung môi khảo sát ở nhiều tỉ lệ để tìm ra tỉ lệ tối ưu. Đối với tách các ion kim loại cần khảo sát bằng chấm các mẫu riêng trước khi sử dụng mẫu hỗn hợp. [16]
16
CHƯƠNG 2: Vật Liệu Và Phương Pháp Nghiên Cứu 2.5 Phương pháp xác định cấu tạo hợp chất: Phương pháp khối phổ (MS) Phương pháp khối phổ (MS) là một kỹ thuật phân tích hóa học giúp xác định hàm lượng và loại chất hóa học có trong một mẫu bằng cách đo tỷ lệ khối lượng trên điện tích và số lượng của các ion pha khí. Nguyên lý của khối phổ: Khối phổ là kỹ thuật phân tích đo phổ về khối lượng của các phân tử tích điện khi chúng di chuyển trong điện trường. Mẫu được ion hóa trở thành các phân tử tích điện khác nhau và được phân tách dựa vào sự sai khác về giá trị m/z. Dữ liệu phổ khối được tự động ghi lại và sử dụng để nhận dạng protein bằng các công cụ tin sinh học. Phương pháp IR: Vùng bức xạ hồng ngoại (IR) là một vùng phổ bức xạ điện từ rộng nằm giữa vùng trông thấy và vùng vi ba; vùng này có thể chia thành 3 vùng nhỏ: - Near-IR 400-10 cm-1 (1000- 25 μm) - Mid-IR 4000 - 400 cm-1 (25- 2,5 μm) - Far-IR 14000- 4000 cm-1 (2,5 – 0,8 μm) Phương pháp phân tích phổ hồng ngoại nói ở đây là vùng phổ nằm trong vùng có số sóng 4000 - 400 cm-1. Vùng này cung cấp cho ta những thông tin quan trọng về các dao động của các phân tử do đó là các thông tin về cấu trúc của các phân tử Phương pháp UV-VIS: Phương pháp đo quang phổ hấp thụ nguyên tử UV-VIS dựa vào hiệu ứng hấp thụ xảy ra khi phân tử vật chất tương tác với bức xạ điện từ. Bước sóng được sử dụng từ 200 đến 800 nm. Hiện tượng bức xạ điện từ tuân theo định luật Lamber. Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên sự tạo phức mầu của các ion với thuốc thử. Nồng độ của các ion trong phức thay đổi sẽ tạo ra màu khác nhau, dẫn đến độ hấp
17
CHƯƠNG 2: Vật Liệu Và Phương Pháp Nghiên Cứu thụ quang khác nhau. Độ hấp thụ quang được xác định theo định luật Lamber-Beer theo phương trình: A = Ɛ.l.C Trong đó: Ɛ: Hệ số hấp thụ phụ thuộc vào bản chất màu và bước sóng của ánh sáng tới. l: Chiều dày cu vet. C: Nồng độ chất phân tích. Khi l và Ɛ không đổi, độ hấp thụ quang phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ. Vì vậy, khi xây dựng được đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa độ hấp thụ và nồng độ C trong từng trường hợp cụ thể sẽ dễ dàng xác định được nồng độ chưa biết của một chất thông qua độ hấp thụ quang. Giới han phát hiện của phương pháp cỡ 10-5M – 106M.-Bee. Phương pháp NMR: NMR: Là phương pháp xác định cấu trúc phân tử hợp chất hữu cơ dựa vào đồ thị ghi lại năng lượng hấp thụ và bức xạ khi cộng hưởng của nguyên tử theo thời gian Điều kiện thí nghiệm: Khi đặt một chất có hật nhân có số spin (I) lẻ (1H, 13C...) được đặt trong một từ trường ngoài (B0), các spin hạt nhân sẽ được sắp xếp lại theo hai hướng: thuận và ngược chiều với từ trường và đạt tới trạng thái cân bằng giữa hai trạng thái này với một tỉ lệ xác định của 2 trạng thái. Nếu dùng một bức xạ điện từ có tần số thích hợp chiếu xạ lên chất đó, các spin sẽ hấp thu năng lượng (cộng hưởng) và chuyển lên mức năng lượng cao (sắp xếp ngược chiều với từ trường). Khi ngưng chiếu xa, các spin hạt nhân sẽ giải phóng năng lượng để trở về trạng thái cân bằng. Xác định năng lượng mà các hạt nhân cùng một loại nguyên tố trong phân tử hấp thu (hay giải phóng) sẽ thu được phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các chất đó. 2.5.
Phân lập Capsaicin từ Capsaicinoids:
Cao ethanol đươc hòa tan trong nước, chiết phân bố với dung môi clorofom, cất thu hồi dung môi thu được cao clorofom (78 g) và dịch nước (270 g). 18
CHƯƠNG 2: Vật Liệu Và Phương Pháp Nghiên Cứu Cao clorofom (CAP) được sắc ký cột (dcộtx Lcột = 8x80 cm) silica gel 230-400 mesh với hệ dung môi rửa giải hexane:acetone (100:0, 25:1, 15:1, 10:1, 7:1, 5:1) và hệ dung môi rửa giải CHCl3-MeOH (10:1, 6:1, 3:1, 2:1, 1:1) mỗi hệ dùng 1 lít dung môi, thu được 5 phân đoạn (CAP1- CAP5). Phân đoạn CAP3 (1,2 g) được tiến hành sắc ký cột (dcộtx Lcột = 5x40 cm) silica gel 230-400 mesh, dung môi rửa giải CHCl3:MeOH (100:0, 50:1, 10:1, 2:1, 1:1), mỗi hệ dung môi 250 ml thu được 3 phân đoạn. Phân đoạn CAP32 tiếp tục được phân bố trên cột (dcộtx Lcột = 3x60 cm) silica gel 230-400 mesh, dung môi rửa giải CHCl3:MeOH (30:1) thu được hợp chất CAP-003 (38 mg). Phân đoạn CAP5 (1,8 g) được tiến hành sắc ký cột (dcộtx Lcột = 5x40 cm) silica gel 230-400 mesh, dung môi rửa giải CHCl3:MeOH (100:0, 50:1, 10:1, 2:1, 1:1), mỗi hệ dung môi 250 ml thu được 3 phân đoạn. Phân đoạn CAP51 tiến hành sắc ký cột cột (dcộtx Lcột = 5x40 cm) silica gel với hệ dung môi ethyl acetate : hexane (7:3) thu được hợp chất CAP-005 (6,4 mg).
19
CHƯƠNG 2: Vật Liệu Và Phương Pháp Nghiên Cứu
Cao ethanol (480 g) Cloroform, nước Cô quay loại bỏ dung môi
Cao dịch nước (270 g)
Cao Cloroform (78 g) CC, Silica gel Hexane:acetone (100:0, 25:1, 15:1, 10:1, 7:1, 5:1) CHCl3-MeOH (10:1, 6:1, 3:1, 2:1, 1:1)
CAP1 (3,6 g) (g)
CAP2 (5,4 g)
CAP3 (25,2 g)
CAP4 (11,4 g)
CAP5 (21,8 g)
CC, Silica gel CHCl3:MeOH (100:0, 50:1, 10:1, 2:1, 1:1)
CAP33
CAP32
CAP34
CC, Silica gel CHCl3:MeOH (100:0, 50:1, 10:1, 2:1,1:1 1:1)
CAP51
CC, Silica gel CHCl3:MeOH (30:1)
CAP52
CC, Silica gel Hexane:aceton e (7:3)
CAP003 (38 mg)
CAP005 (6,4 mg)
Hình 2.4. Phân lập các hợp chất từ ớt (Capsicum frutescens (L.) Bail) 20
CAP53
CHƯƠNG 2: Vật Liệu Và Phương Pháp Nghiên Cứu 2.6.
Các thông số vật lý thu được: 2.6.1. Capsaicnin
13
C-NMR (125MHz, CDCl3) ppm: 172,8 (C-1), 146,7 (C-3’), 145,2 (C-4’), 138,1
(C-7), 130,4 (C-1’),126,5 (C-6), 120,8 (C-6’), 114,3 (C-5’), 110,7 (C-2’), 43,6 (C-1’’), 36,8 (C-2), 32,2 (C-5), 30,9 (C-8), 29,3 (C-4), 25,3 (C-3), 22,7 (C-9). 22,7 (8-CH3). 1
H-NMR (500MHz, CDCl3) ppm: 6,85 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5’), 6,80 (1H, d, J =
1,5 Hz, H-2’), 6,75 (1H, dd, J = 8,0 1,5 Hz, H-6’), 5,39 (1H, bs, H-NH), 5,38 (1H, s, H-OH), 5,34 (1H, m, H-7), 5,32 (1H, m, H-6), 4,34 (2H, d, J = 5,5 Hz, H-1”), 3,88 (3H, s, OCH3-3’), 2,21 (2H, t, J = 6,0 Hz, H-2), 2,21 (1H, m, H-8), 1,97 (2H, q, J = 7,0 Hz, H-5), 1,65 (2H, p, J = 8,0 Hz, H-3), 1,38 (2H, p, J = 7,5 Hz, H-4), 0,94 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-9).
2.6.2. Cinnamic acid 13
C-NMR (125MHz, CDCl3) ppm: 171,8 (C-1), 147,1 (C-2), 134,1 (C-1’),
130,7 (C-4’), 129,0 (C-3’),129,0 (C-5’),128,4 (C-2’), 128,4 (C-6’), 117,2 (C-3). 1
H-NMR (500MHz, CDCl3) ppm: 7,79 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-2), 7,56 (2H, t,
H-2’, H-5’), 7,41 (2H, d, H-2’, H-6’), 7,40 (1H, s, H-4’), 6,46 (1H, d, J=16, H-3).
21
CHƯƠNG 3. Kết Quả Và Bàn Luận
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3. Các hợp chất: 3.1. Hợp chất 1: Cấu trúc của hợp chất 1 được xác định dựa trên các thông số thu được từ các phương pháp phổ. Phổ khối lượng (MS) của hợp chất 1 cho thấy tín hiệu của pic ion giả phân tử m/z 306,2048 [M+H]+ tương ứng với công thức phân tử là C18H27NO3Na (theo tính toán là m/z 306,2064 [M+H]+). Phổ UV của hợp chất 1 xuất hiện các tín hiệu hấp phụ tại 204,239 nm. Ngoài ra, trong phổ 1H-NMR của hợp chất 1 xuất hiện các tín hiệu proton tương ứng của hai nhóm methyl (CH3) tại δH 0,94 (6H, d, J = 6,5 Hz, H-9, 8-CH3); proton của năm nhóm methylene (CH2) tại δH 4,34 (2H, d, J = 5,5 Hz, H-1”), 2,21 (2H, t, J = 6,0 Hz, H-2), 1,97 (2H, q, J = 7,0 Hz, H-5), 1,65 (2H, p, J = 8,0 Hz, H-3), 1,38 (2H, p, J = 7,5 Hz, H-4); proton của một nhóm methin (CH) tại δH 2,21 (1H, m, H-8); proton của một nhóm methoxy (OCH3) tại δH 3,88 (3H, s, OCH3-3’); proton olefin của hai nhóm methin (CH=) tại δH 5,34 (1H, m, H-7), 5,32 (1H, m, H-6); ba proton của nhân thơm tại δH 6,85 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5’), 6,80 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-2’), 6,75 (1H, dd, J = 8,0 1,5 Hz, H-6’); một nhóm amide (NH) tại δH 5,39 (1H, bs, H-NH); một proton của nhóm hidroxyl (OH) tại δH 5,38 (1H, s, H-OH) Phổ 13C-NMR của hợp chất 1 xuất hiện các tín hiệu cacbon tương ứng của hai nhóm methyl (CH3) tại δC 22,7 (8-CH3 , C-9); cacbon của năm nhóm methylen (CH2) tại δC 43,6 (C-1”), 36,8 (C-2), 32,2 (C-5), 29,3 (C-4), 25,3 (C-3); cacbon của một nhóm methin (CH) tại δC 30,9 (C-8); cacbon olefin của hai nhóm methin (CH=) tại δC 138,1 (C-7), 126,5 (C-6); sáu cacbon của nhân thơm tại δC 146,7 (C-3’),145,2 (C-4’), 130,4 (C-1’), 114,2 (C-5’), 120,8 (C-6’), 110,7 (C-2’); một nhóm cacbon cacbonyl (C=O) tại δC 172,8 (C-1); một nhóm cacbonxyl (OCH3) tại δC 55,9 (3’-OCH3); Trong phổ HSQC của hợp chất 1 đính kèm trực tiếp giữa cacbon và proton được thể hiện trong bảng 3.1. 22
CHƯƠNG 3. Kết Quả Và Bàn Luận
Phổ HMBC của hợp chất 1 này cho thấy 1H tương quan với 13C tại: NH tương quan với C-1, OH tương quan với C-3’, C-4’, C-5’; OCH3 tương quan với C-3’; H-2’ tương quan C-3’, C-4’,C-6’,C -1”; H-5’ tương quan với C-1’, C-3’, C-4’; H-6’ tương quan với C-2’, C -3’ , C-4’, C-1” , H-2 tương quan với C-1, C-3, C-4, H-3 tương quan với C-1, C-2, C-4, C-5, H-4 tương quan với C-2, C-3, C-5, C-6, H-5 tương quan với C-3, C-4, C-6, C-7, H-6 tương quan với C-4, C-5, C-8, H-7 tương quan với C-9, 8CH3, H-8 tương quan với C-6, C-7, H-9 và 8-CH3 tương quan với C-7, H-1” tương quan với C-1, C-1’, C-2’, C-6’.
Hình 3.1. Phổ HMBC của hợp chất 1
Bảng 3.1. Kết quả 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất 1 13
STT
13
1
C-NMR 1
C*-NMR 13
H-NMR
H*-NMR 1
C-NMR
[23]
H-NMR
[23]
1
172,81(s)
172,8
2
36,65(t)
36,8
2,19(t, 8,0)
2,21 (2H, t, 6,0)
3
25,26(t)
25,3
1,64(p, 8,0)
1,65 (2H, p, 8,0)
4
29,24(t)
29,3
1,37(p, 8,0)
1,38 (2H, p, 7,5 )
5
32,19(t)
32,2
1,97(q, 7,0)
1,97 (2H, q, 7,0)
6
126,39(d)
126,5
5,32(m)
5,32 (1H, m)
23
CHƯƠNG 3. Kết Quả Và Bàn Luận
7
137,98(d)
138,1
5,35(m)
5,34 (1H, m)
8
30,92(d)
30,9
2,21(m)
2,21 (1H, m)
9
22,62(q)
22,7
0,94(d, 7,0)
0,94 (3H, d, 6,5)
8-
22,62(q)
22,7
0,94(d, 7,0)
0,94 (3H, d, 6,5)
1”
43,47(t)
43,6
4,33(d, 5,5)
4,34 (2H, d, 5,5)
1’
130,23(s)
130,4
2’
110,61(d)
110,7
6,79(d, 2,0)
6,80 (1H, d, 1,5)
3’
146,65(s)
146,7
4’
145,03(s)
145,2
5’
114,32(d)
114,4
6,85(d, 8,0)
6,85 (1H, d, 8,0)
6’
120,66(d)
120,8
6,74(dd, 8.0, 2.0)
6,75 (1H, dd, 8,0, 1,5)
55,9
3,85(s)
3,88 (3H, s)
NH
5,84(bs)
5,39 (1H, bs)
OH
5,87(s)
5,38 (1H, s)
CH3
OCH3 55,86(q)
Kết hợp phổ MS, 1H-NMR, 13 C-NMR và so sánh với tài liệu tham khảo [23] cho phép xác định cấu trúc của hợp chất 1 là CAPSAICIN.
Capsaicin (1) 24
CHƯƠNG 3. Kết Quả Và Bàn Luận
Hình 3.2. Capsaicin 3D
Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của CAP005
25
CHƯƠNG 3. Kết Quả Và Bàn Luận
Hình 3.4. Phổ giản thể 1H-NMR của CAP005
26
CHƯƠNG 3. Kết Quả Và Bàn Luận
Hình 3.5. Phổ giản thể 1H-NMR của CAP005
27
CHƯƠNG 3. Kết Quả Và Bàn Luận
28
CHƯƠNG 3. Kết Quả Và Bàn Luận
Hình 3.6. Phổ 13C-NMR của CAP005
29
CHƯƠNG 3. Kết Quả Và Bàn Luận
Hình 3.7. Phổ giản thể 13C-NMR của CAP005
Hình 3.8. Phổ HMBC của CAP005 30
CHƯƠNG 3. Kết Quả Và Bàn Luận
Hình 3.9. Phổ HMBC giản thể của CAP005
31
CHƯƠNG 3. Kết Quả Và Bàn Luận
Hình 3.10. Phổ HMBC giản thể của CAP005
32
CHƯƠNG 3. Kết Quả Và Bàn Luận
Hình 3.11. Phổ HMBC giản thể của CAP005
33
CHƯƠNG 3. Kết Quả Và Bàn Luận
Hình 3.12. Phổ HMBC giản thể của CAP005
34
CHƯƠNG 3. Kết Quả Và Bàn Luận
Hình 3.13. Phổ HMQC của CAP005
35
CHƯƠNG 3. Kết Quả Và Bàn Luận
Hình 3.14. Phổ HMQC giản thể của CAP005
36
CHƯƠNG 3. Kết Quả Và Bàn Luận
Hình 3.15. Phổ HMQC giản thể của CAP005
37
CHƯƠNG 3. Kết Quả Và Bàn Luận
3.2. Hợp chất 2: Hợp chất 2 có dạng tinh thể màu trắng không mùi, nhiệt độ nóng chảy 132133°C. Phổ khối lượng HRMS: m/z 148,566 [M]+ ứng với công thức phân tử C9H7O2: 148,1586. Phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu proton của nhóm benzyl H-2’, 6’(7,41), H3’,5’(7,56) và H-4’(7,40). Ngoài ra còn có hai tín hiệu proton trans olefin (δH 6,46, 7,79) (Bảng 3.2). Phổ
13
C-NMR kết hợp với phổ DEPT (Bảng 3.2), cho thấy tín hiệu của 9
nguyên tử cacbon: một cacbon cacbonyl C-1 (δC 171,8); sáu cacbon thơm (δC 128,4, 129,0, 130,7, 134,1), hai carbon olefin (δC 117,2, 147,1). Kết hợp phổ MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT và so sánh với tài liệu tham khảo [24] cho phép xác định cấu trúc của hợp chất 2 là axit cinnamic.
Axit cnnamic Bảng 3.2: Kết quả phổ của hợp chất 2
Cacbon
DEPT
13C-NMR
1
C=O
171,8
2
CH
147,1
7,79(1h, d, J=15,5)
3
CH
117,2
6,46 (1H, d, J=16)
C-1’
C
134,1
C-4’
CH
130,7
7,40 (1H, s)
C3’-5’
CH
129,0
7,56 (2H, t,)
C2’-6’
CH
128,4
7,41 (2H, d,)
38
1H-NMR
CHƯƠNG 3. Kết Quả Và Bàn Luận
Hình 3.16. Phổ khối lượng của hợp chất 2 CAP003-CDCL3-1H
Hình 3.17. Phổ 1H-NMR của hợp chất 2 39
CHƯƠNG 3. Kết Quả Và Bàn Luận
CAP003-CDCl3-1H
Hình 3.18. Phổ 1H-NMR của hợp chất 2
40
CHƯƠNG 3. Kết Quả Và Bàn Luận
CAP003-CDCl3-C13CPD CAP003-CDCl3-Cl3CPD
Hình 3.19. Phổ 13C-NMR của hợp chất 2
41
CHƯƠNG 3. Kết Quả Và Bàn Luận
CAP003-CDCl3-Cl3CPD
Hình 3.20. Phổ 13C-NMR của hợp chất 2
42
CHƯƠNG 3. Kết Quả Và Bàn Luận
CAP003-CDCl3-Cl3CPD&DEPT
Hình 3.21. Phổ DEPT của hợp chất 2 CAP003-CDCl3-Cl3CPD&DEPT
Hình 3.22. Phổ DEPT của hợp chất 2 43
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Mẫu ớt ((Capsicum frutescens (L.) Bail), 5kg) thu hái ở huyện Thanh Bình, tỉnh Đồng Tháp, được ngâm chiết với dung môi ethanol, sau đó tiến hành thu hồi dung môi bằng áp suất thấp được 480 g cao màu nâu. Tiến hành chiết phân đoạn với dung môi cloroform và bỏ dung môi thu được 78 g cao. Tiếp tục tiến hành các phương pháp sắc ký cột phân tách được 5 phân đoạn (CAP1 3,6 g; CAP2 5,4 g; CAP3 25,2 g; CAP4 11,4 g; CAP5 21,8 g). Phân đoạn CAP3 và CAP5 sử dụng phương pháp sắc kí cột phân tách mỗi phân đoạn tách được 3 phân đoạn khác (CAP32, CAP33, CAP34, CAP51, CAP52, CAP53). Phân đoạn CAP32 và CAP51 bằng phương pháp sắc ký cột thu được hai chất là CAP003 38 mg (ở phân đoạn CAP32) với hệ dung môi rửa giải là CHCL3:MeOH tỉ lệ 30:1 và CAP005 6,4 mg (ở phân đoạn CAP51 với hệ dung môi rửa giải là Hexan:Aceton tỉ lệ 7:3. Bằng các phương pháp phổ MS, IR, NMR đã xác định được cấu trúc của các hợp chất CAP003 là Acid Cinnamic và CAP005 là Capsaicin. 4.2. Kiến nghị Nghiên cứu tách chiết và phân lập capsaicin đã có từ lâu trên thế giới và cả Việt Nam. Tuy nhiên chúng tôi đã thực hiện lại, với điều kiện phòng thí nghiệm, quy mô nhỏ và thời gian còn hạn chế. Nên chúng tôi có vài kiến nghị sau: -
Khối lượng capsaicin thu được rất là lớn, nên có thể lấy làm chất chuẩn để định lượng, kiểm định, các loại thực phẩm có hàm lượng capsaicin.
-
Có thể dùng capsaicin thu được để điều chế ra các loại thực phẩm chức năng hỗ trợ trong việc giảm cân, phòng chống ung thư…
44
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] http://kkhtn.duytan.edu.vn/Home/ArticleDetail/vn/94/1668/tac-dung-cua-ot [2] “Life Science Research” (PDF). Truy cập 29 tháng 9 năm 2015 [3] https://tuoitre.vn/chat-capsaicin-trong-ot-co-the-giup-ngan-chan-nguy-co-tangcan-1175835.htm [4]. Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. 2004: p. 382 – 384 [5]. Xiaofeng Xu, Y.Z., Shiqiang Yan*, Optimization of Soxhlet extraction of capsaicinoids using orthogonal experiment [6]. Xiang-Yuan Deng*, K.G., Xin Huang and John Liu, Optimization of ultrasonicassisted extraction procedure of capsaicinoids from Chili peppers using orthogonal array experimental design. African Journal of Biotechnology, 21 August, 2012. Vol. 11: p. 13153-13161 [7]. Enkelejda Goci1*, E.H., Kliton Vide2, Ledjan Malaj3Application And Comparison Of Three Different Extraction Methods Of Capsaicin From Capsicum Fruits. Albanian Journal of Pharmaceutical Sciences, 2013. Vol. 1: p. 16-19 [8]. Gerardo F. Barbero, M.P., * and Carmelo G. Barroso, Pressurized Liquid Extraction of Capsaicinoids from Peppers. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 04/04/2006. Vol. 54: p. 3231 – 3236 [9]. C.O. Nwokem*, E.B.A., 2J.A. Kagbu, 2E.J. Ekanem, Determination of Capsaicin Content and Pungency Level of Five Different Peppers Grown in Nigeria. New York Science Journal, 2010. Vol. 3: p. 17 – 21 [10]. Ida Musfiroh*, M.M., Treesye Angelina, Muchtaridi Muchtaridi, Capsaicin Level of Various Capsicum Fruits. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 29 Nov 2012. Vol. 5: p. 248 – 251 [11]. Xiang-Yuan Deng, Kun Gao, Xin Huang and John Liu - Optimization of ultrasonicassisted extraction procedure of capsaicinoids from Chili peppers using
45
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ orthogonal array experimental design, African Journal of Biotechnology, 21/08/2012. Vol. 11: p. 13153-13161 [12]. Opal J. Williams, G.S. Vdaya Raghavan, Valerie Orsat' Jianming Dai Microwave assisted Extraction Of Capsaicinoids From Capsicum Fruit, Journal of Food Biochemistry, 24/06/2003. Vol. 28, p. 113 – 122 [13]. Gerardo F. Barbero, Miguel Palma, Carmelo G. Barroso - Determination of capsaicinoids in peppers by microwave-assisted extraction–high-performance liquid chromatography with fluorescence detection, Analytica Chimica Acta, 04/06/2006. Vol. 578, p. 227–233 [14]
Aggarwal BB, Kunnumakkara AB, Harikumar KB, Tharakan ST, Sung B,
Anand P, Potential of spice-derived phytochemicals for cancer prevention, vol. 74(13), pp. 1560-1569, 2008. [15]
https://www.sbc-vietnam.com/san-pham/sac-ky/sac-ky-cot.aspx
[16] Verlag chemie Academic pess (1966), N.Y. Thin Layer Chromatography. [18]
Valentovic MA, Ball JG, Brown JM, Terneus MV, McQuade E, Van Meter S,
Hedrick HM, Roy AA, William T, Resveratrol attenuates cisplatin renal cortical cytotoxicity by modifying oxidative stress, vol. 28(2), pp. 248-257, 2014. [19]
Bley K, Boorman G, Mohammad B, McKenzie D, Babbar S, A comprehensive
review of the carcinogenic and anticarcinogenic potential of capsaicin, vol. 40(6), pp. 847-873, 2012. [20]
Yuan LJ, Qin Y, Wang L, Zeng Y, Chang H, Wang J, Wang B, Wan J, Chen SH,
Zhang QY, Zhu JD, Zhou Y, Mi MT, Capsaicin-containing chili improved postprandial hyperglycemia, hyperinsulinemia, and fasting lipid disorders in women with gestational diabetes mellitus and lowered the incidence of large-for-gestationalage newborns, vol. 35(2), pp. 398-393, 2016. [21]
Ellis CN, Berberian B, Sulica Vl, Dodd WA, Jarratt MT, Katz HI, Prawer S,
Krueger G, Rex IH Jr, Wolf JE, A double-blind evaluation of topical capsaicin in pruritic psoriasis, vol. 29(3), pp. 438-442, 1993.
46
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ [22] https://www.syngenta.com.vn/cay-ot [23] Natural Product Letters , Volume 3, 1993 - Issue 1 [24] T. Fukuyama, M. Arai, H. Matsubara and I. Ryu, J. Org. Chem., 2004, 69, 81058107
47
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu
Hình 1.1. Thiết bị cô quay
Hình 1.2. Cân kĩ thuật
Hình 1.3. Bể siêu âm
Hình 1.4. Máy sấy
a
Phụ lục 2: Hình ảnh chấm bảng mỏng
Hình 2.1. TLC của Capsaicin
Hình 2.2. Bảng mỏng phân đoạn
Hình 2.3. Bảng mỏng chiếu đèn UV
b
Hình 2.4. TLC của Acid Cinnamic
c