CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CỦA CAO LỎNG BỤP GIẤM
vectorstock.com/24597468
Ths Nguyễn Thanh Tú eBook Collection
NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CỦA CAO LỎNG BỤP GIẤM (Hibiscus sabdariffa L.) WORD VERSION | 2022 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL.COM
Tài liệu chuẩn tham khảo Phát triển kênh bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật : Nguyen Thanh Tu Group Hỗ trợ trực tuyến Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon Mobi/Zalo 0905779594
FI
OF
LÊ THỊ HOÀI HƯƠNG
CI
AL
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y
Y
NH
ƠN
NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CỦA CAO LỎNG BỤP GIẤM (Hibiscus sabdariffa L.)
DẠ Y
KÈ
M
QU
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC
HÀ NỘI – 2021
AL
OF
FI
LÊ THỊ HOÀI HƯƠNG
BỘ QUỐC PHÒNG
CI
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HỌC VIỆN QUÂN Y
NH
ƠN
NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CỦA CAO LỎNG BỤP GIẤM (Hibiscus sabdariffa L.)
Cán bộ hướng dẫn: 1. ThS Nguyễn Hồng Hải 2. TS. Nguyễn Công Bàng
DẠ Y
KÈ
M
QU
Y
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC
HÀ NỘI – 2021
QU
Y
NH
ƠN
OF
FI
CI
AL
LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, em đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo tận tình cũng như sự động viên, quan tâm từ các thầy cô, gia đình và bạn bè. Thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc em xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt chặng đường vừa qua. Lời đầu tiên, em xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới: ThS Nguyễn Hồng Hải, người cô đã tận tình, nhiệt huyết chỉ dạy và giúp đỡ em rất nhiều trong thời gian thực hiện khóa luận vừa qua. Em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Công Bàng, thầy đã vô cùng tâm huyết và hướng dẫn, động viên, truyền cho em nhiều kiến thức, kinh nghiệm quý báu và giúp đỡ em rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô giảng viên cùng các cô kỹ thuật viên của bộ môn Hóa dược – Dược lâm sàng đã hỗ trợ và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và làm khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới Ban giám đốc Học viện, Phòng Đào tạo cùng toàn thể cán bộ Giảng viên, Kỹ thuật viên Viện Đào tạo Dược đã giúp đỡ em trong quá trình học tập và nghiên cứu, đã quan tâm dìu dắt và truyền cho em những kiến thức quý giá trong suốt 5 năm theo học tại trường.
DẠ Y
KÈ
M
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ, là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho em hoàn thành khóa luận này. Hà Nội, ngày 05 tháng 07 năm 2021 Học viên Lê Thị Hoài Hương
L
MỤC LỤC
FI CI A
DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC PHỤ LỤC
OF
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN ................................................................................ 2 1.1. TỔNG QUAN VỀ BỤP GIẤM ................................................................... 2
ƠN
1.1.1. Thực vật học .......................................................................................... 2 1.1.2. Thành phần hóa học ............................................................................... 3 1.1.3. Tác dụng dược lý, công dụng .............................................................. 10
NH
1.2. TỔNG QUAN VỀ ACID PROTOCATECHUIC...................................... 12 1.2.1. Công thức cấu tạo và tính chất của acid protocatechuic...................... 12 1.2.2. Tác dụng sinh học ................................................................................ 13
QU Y
1.3. CÁC PHUƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU............................... 15 1.3.1. Phương pháp ngâm .............................................................................. 15 1.3.2. Phương pháp ngấm kiệt ....................................................................... 16 1.3.3. Phương pháp chiết xuất ngược dòng gián đoạn................................... 16
M
1.3.4. Phương pháp chiết nóng ...................................................................... 16
KÈ
1.3.5. Phương pháp chiết siêu âm .................................................................. 16 1.3.6. Phương pháp chiết vi sóng ................................................................... 17 1.3.7. Phương pháp chiết xuất siêu tới hạn .................................................... 17
Y
1.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU GẦN ĐÂY TRONG NƯỚC............................ 17
DẠ
CHƯƠNG 2 – NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 19 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ ............................................................. 19
L
2.1.1. Nguyên liệu .......................................................................................... 19
FI CI A
2.1.2. Thiết bị, hóa chất ................................................................................. 20 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................ 20 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................. 21 2.2.1. Xây dựng phương pháp chiết xuất cao lỏng Bụp giấm ....................... 21 2.2.2. Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng của cao lỏng Bụp giấm ................... 30
OF
2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU .......................................................... 32 CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ....................................................... 33
ƠN
3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU CHẾ CAO LỎNG BỤP GIẤM ................................................................................................................ 33 3.1.1. Kết quả đánh giá chỉ tiêu chất lượng đầu vào dược liệu Bụp giấm..... 33
NH
3.1.2. Kết quả xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid protocatechuic trong dịch chiết Bụp giấm ..................................................... 34 3.1.3. Kết quả xây dựng phương pháp điều chế cao lỏng Bụp giấm ............. 46
QU Y
3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CAO LỎNG BỤP GIẤM ........................................................................................... 48 3.2.1. Hình thức, cảm quan ............................................................................ 48 3.2.2. Độ tan ................................................................................................... 49
M
3.2.3. Tỷ trọng................................................................................................ 49 3.2.4. Định tính flavonoid trong cao lỏng Bụp giấm ..................................... 49
KÈ
3.2.5. Định lượng ........................................................................................... 52
KẾT LUẬN .......................................................................................................... 53
Y
KIẾN NGHỊ ......................................................................................................... 54
DẠ
TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
DẠ
Y
Trang
FI CI A
OF
ƠN
NH
KÈ
1.2 1.3 1.4 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 3.15 3.16 3.17
QU Y
1.1
Tên bảng Một số hợp chất flavonoid và polyphenol có trong dịch chiết Bụp giấm Một số acid hữu cơ trong Bụp giấm Một số hợp chất anthocyanin có trong Bụp giấm Bảng tỷ lệ các giá trị IC50 (Trolox) / IC50(APC) Các thiết bị dùng trong nghiên cứu Các hóa chất dùng trong nghiên cứu Điều kiện gradient của pha động Khảo sát lựa chọn dung môi chiết xuất cao lỏng Bụp giấm Bảng khảo sát tỷ lệ DM/DL chiết xuất cao lỏng Bụp giấm Các thông số khảo sát để lựa chọn phương pháp chiết Kết quả hàm ẩm của dược liệu Bụp giấm Kết quả định tính flavonoid trong dược liệu Bụp giấm Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống Sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ APC Kết quả đánh giá độ lặp lại Kết quả đánh giá độ đúng Kết quả khảo sát LOD, LOQ Kết quả khảo sát lựa chọn phương pháp chiết xuất Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết Kết quả khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ DM/DL Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết Thông số của quy trình chiết xuất Kết quả đánh giá tỷ trọng cao lỏng Bụp giấm Kết quả hàm ẩm cao lỏng Bụp giấm Kết quả định tính APC trong cao lỏng Bụp giấm Kết quả định lượng APC trong cao lỏng Bụp giấm
M
STT
L
DANH MỤC BẢNG
5
7 9 13 20 20 23 28 29 29 33 34 37 39 40 41 42 42 43 44 45 45 46 49 49 50 52
L
DANH MỤC HÌNH
QU Y
NH
ƠN
OF
FI CI A
STT Tên ảnh Trang 1.1 Cây và hoa Bụp giấm 3 Công thức cấu tạo của một số hợp chất flavonoid và polyphenol 1.2 6 trong dịch chiết Bụp giấm 1.3 Công thức cấu tạo của một số acid hữu cơ trong Bụp giấm 8 Công thức cấu tạo của một số hợp chất anthocyanin có trong 1.4 9 Bụp giấm 1.5 Công thức cấu tạo của acid protocatechuic 12 Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L.) thu tại Thành phố 2.1 19 Hồ Chí Minh. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng tại bước sóng 254 nm (A), sau khi hơ 3.1 33 hơi iod (B) 3.2 Sắc ký đồ khảo sát tỷ lệ pha động 1 35 3.3 Sắc ký đồ khảo sát tỷ lệ pha động 2 35 Sắc ký đồ dịch chiết Bụp giấm của chương trình pha động 2, tốc 3.4 36 độ dòng 1,0 ml/phút Sắc ký đồ dịch chiết Bụp giấm của chương trình pha động 2, tốc 3.5 36 độ dòng 0,6 ml/phút 3.6 Sắc ký đồ mẫu trắng 38 3.7 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn APC nồng độ 10 µg/ml 38 3.8 Sắc ký đồ dịch chiết mẫu thử Bụp giấm 38
M
Đồ thị tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ acid protocatechuic
KÈ
3.9
DẠ
Y
3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 3.15
Sơ đồ các giai đoạn điều chế cao lỏng Bụp giấm 1:1 Thành phẩm cao lỏng Bụp giấm 1:1 Phản ứng định tính flavonoid trong cao lỏng Bụp giấm Sắc ký đồ mẫu trắng Sắc ký đồ mẫu chuẩn APC nồng độ 10 µg/ml Sắc ký đồ mẫu thử cao lỏng Bụp giấm
39 47 48 50 51 51 51
L
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DẠ
Y
KÈ
M
QU Y
NH
ƠN
OF
FI CI A
STT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ 1 ACN Acetonitril 2 Alanine/Aspartate aminotransferase ALT/AST Assosiation of Official Analytical Chemists (Hiệp hội 3 AOAC các nhà hóa phân tích chính thức 4 Acid protocatechuic APC 5 CaOx Canxi oxalat 6 DĐVN Dược điển Việt Nam 7 DM/DL Dung môi/Dược liệu 8 DNA Deoxyribonucleic acid 9 EtOH Ethanol 10 High Density Lipoprotein (Lipoprotein Cholesterol HDL tỉ trọng cao) 11 High Performance Liquid Chromatography (Sắc HPLC ký lỏng hiệu năng cao) 12 Inhibitory concentration 50% (Nồng độ ức chế 50% IC50 đối tượng thử nghiệm) 13 International Conference on Harmonisation (Hội đồng ICH hòa hợp quốc tế) 14 iNOS Inducible nitric oxide synthase 15 Low/Very Low - Density Lipoprotein (Lipoprotein LDL/VLDL cholesterol tỷ trọng thấp/rất thấp) 16 LOD Limit of Detection (Giới hạn phát hiện) 17 LOQ Limit of Quantitation (Giới hạn định lượng) 18 LPS Lipopolysaccharide 19 MeOH Methanol 20 PDA Photodiode array (Detector dãy diod quang) 21 RSD Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) 22 SD Standard deviation (Độ lệch chuẩn) 23 SHR Spontaneously hypertensive rat (Chuột tăng huyết áp) 24 TCCS Tiêu chuẩn cơ sở 25 UV-Vis Ultraviolet – Visible (Tử ngoại – khả kiến)
FI CI A
Phiếu giám định tên khoa học
DẠ
Y
KÈ
M
QU Y
NH
ƠN
OF
PHỤ LỤC 1
L
DANH MỤC PHỤ LỤC
AL
ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, xu hướng của thế giới sử dụng thuốc, thực
CI
phẩm bảo vệ sức khỏe có nguồn gốc từ thiên nhiên ngày càng nhiều. Đặc biệt, với những cây chứa các nhóm hợp chất cho tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư lại càng được nghiên cứu phát triển và ứng dụng khá rộng
OF FI
rãi. Trong đó, cây Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L., thuộc họ Bông (Malvaceae))– du nhập vào Việt Nam từ khoảng năm 1992 đến nay đã trở thành cây thuốc trồng phổ biến [1]. Bụp giấm đã được nghiên cứu về thành phần hoá học cũng như tác dụng dược lý. Hoạt chất chính trong Bụp giấm là các
NH ƠN
flavonoid, polyphenol có nhiều tác dụng tiêu biểu như: chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư, chống béo phì, bảo vệ gan, hạ huyết áp... [2]. Đã có nhiều nghiên cứu khác nhau về việc chiết xuất, định tính cũng như định lượng hàm lượng polyphenol từ Bụp giấm. Tuy nhiên, các ứng dụng thường hướng tới ngành thực phẩm giải khát còn trong ngành dược thì chưa được đề cập đến nhiều. Ngoài ra, phần lớn Bụp giấm thường được sử dụng dưới
Y
dạng trà hãm, trà nhúng hoặc ngâm siro…cho hiệu lực tác dụng thấp và không
QU
tiện lợi bằng các chế phẩm dạng cao lỏng, cao khô. Xuất phát từ thực tiễn trên và nhằm tạo tiền đề, làm nguyên liệu cho việc bào chế các chế phẩm hiện đại khác mà đề tài “Nghiên cứu đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của cao lỏng Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L.)” được tiến hành nhằm hai mục tiêu
KÈ M
sau:
1. Xây dựng được quy trình điều chế cao lỏng 1:1 từ dược liệu Bụp giấm. 2. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của cao lỏng 1:1 Bụp giấm đã
DẠ Y
điều chế được.
1
AL
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ BỤP GIẤM
CI
1.1.1. Thực vật học 1.1.1.1. Vị trí phân loại và tên gọi
OF FI
- Tên khoa học: Hibiscus sabdariffa L.
- Tên gọi khác: Actiso đỏ, hoa lạc thần, cây đay nhật, hoa vô thường. - Họ: Bông (Malvaceae).
Theo phân loại thực vật và dựa theo các tài liệu nghiên cứu [1,2], cây Bụp giấm được xếp theo trình tự như sau:
NH ƠN
Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp: Hoa hồng (Rosidae) Bộ: Bông (Malvales) Họ: Bông (Malvaceae)
Y
Chi: Hibiscus
QU
Loài: Sabdariffa
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật
DẠ Y
KÈ M
Bụp giấm là cây thân thảo nhỏ, sống lâu năm, mọc thẳng. Cây cao 1-2m, thân cây màu lục hay đỏ tía, ở gần gốc có phân nhánh, cành cây nhẵn hoặc có lông. Lá cây mọc so le, màu xanh lục với các đường gân đỏ ở trên bề mặt lá. Ở gốc lá nguyên, còn ở phía trên chia thành 3 đến 5 thùy hình chân vịt, mép lá răng cưa. Hoa đơn to, mọc ở lá nách, cuống hoa ngắn, đường kính khoảng 810cm, khi nở xòe to. Cánh hoa có màu vàng hồng hoặc tía đậm đặc trưng, đôi khi màu trắng. Đài phụ gồm 8 đến 12 cánh hẹp, đính liền ở phần dưới, có lông ngắn, đài chính to, lá đài dày, đầu nhọn và mọng nước, cũng có màu đỏ tía. Quả nang, hình trứng, nhọn ở đầu, có phủ lông mịn, quả có hạt nhiều, màu đen [3,4].
2
OF FI
CI
AL
Cây ưa sáng, ưa ẩm và có khả năng chịu hạn. Nhiệt độ phát triển trung bình là khoảng 23-24oC. Mùa hoa quả bắt đầu từ tháng 7 tới tháng 10 [4,5].
Hình 1.1. Cây và hoa Bụp giấm [6]
NH ƠN
1.1.1.3. Phân bố
Cây Bụp giấm có nguồn gốc từ Trung Mỹ, châu Phi và phổ biến ở Ấn Độ với khoảng 40 loài. Ngày nay, loài thực vật này được trồng rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như Trung Quốc, Malaysia, Ả Rập Xê-út, Philippines… [5].
QU
Y
Ở Việt Nam, Bụp giấm được du nhập từ khoảng năm 1992, hiện nay đã có khoảng 23 loài. Cây đã được trồng thử nghiệm ở một số nơi như Hòa Bình, Bắc Giang, Tây Nguyên, Ba Vì, Bà Rịa Vũng Tàu, Đắk Lắk, thành phố Hồ Chí Minh, An Giang, Đồng Tháp.... Tuy nhiên, loài cây này lại phát triển khá tốt ở các tỉnh miền Trung, vùng đồi núi và trung du [4]. 1.1.1.4. Bộ phận dùng
KÈ M
Bộ phận dùng của Bụp giấm là đài hoa, đôi khi còn dùng cả lá và quả.
Hoa sau khi được thu hoạch thì được làm khô theo một trong hai cách là hoa tươi được phơi nắng cho đài hoa khô hẳn hoặc sấy bằng nhiệt đến khô [4]. 1.1.2. Thành phần hóa học
DẠ Y
1.1.2.1. Các Flavonoid và Polyphenol Trong cây Bụp giấm có chứa rất nhiều hợp chất flavonoid và polyphenol là những thành phần quan trọng có tác dụng chống oxy hóa, giảm cholesterol
3
AL
máu, hạ huyết áp, kháng khuẩn, chống viêm, trị đái tháo đường, giảm kích thước sỏi thận và chống ung thư [6].
CI
Năm 2018, Riaz và cộng sự đã nghiên cứu và phân lập các flavonoid sau khi chiết xuất Bụp giấm, một số chất có thể kể đến là: hibiscitrin (1), gossypitrin (2), quercetin (3) và luteolin (4) [6].
OF FI
Ngoài ra, McKay và cộng sự vào năm 2010 cũng công bố trong đề tài nghiên cứu chiết xuất Bụp giấm của họ có chứa các polyphenol. Họ đã phân lập được một số polyphenol điển hình là acid chlorogenic (5), acid protocatechuic (6), eugenol (7) và ergosterol (8) [7].
NH ƠN
Cũng vào năm 2010, Yang cùng các cộng sự đã tiến hành thử nghiệm và định lượng được hàm lượng 5 hoạt chất trong chiết xuất Bụp giấm là: acid protocatechuic (24,24%), catechin (2,67%) (9), gallocatechin (2,44%) (10), acid caffeic (19,85%) (11), gallocatechin gallate (27,98%) (12) [8]. Dịch chiết nước của lá cho thấy có mặt của catechin (4,25%) và acid ellagic (28,20%) (13), kết quả được công bố bởi Lin và cộng sự năm 2012 [9].
DẠ Y
KÈ M
QU
Y
Đến năm 2014, Da-Costa-Rocha cùng các cộng sự cũng đã ghi nhận sự có mặt của hibiscitrin, gossypitrin trong Bụp giấm. Có thể thấy, hibiscitrin và gossypitrin là các flavonoid chiếm hàm lượng lớn trong tổng hàm lượng flavonoid toàn phần của dịch chiết bụp giấm. Ngoài ra, khi chiết xuất Bụp giấm bằng dung môi methanol họ cũng phát hiện trong dịch chiết MeOH có chứa quercetin, luteolin và một lượng ít rutin (2,1 mg/g) (14) cùng với kaempferol (3,2 mg/g) (15) [3].
4
AL
Bảng 1.1. Một số hợp chất flavonoid và polyphenol có trong dịch chiết Bụp giấm Tên hợp chất
Tài liệu tham khảo
1
Hibiscitrin
[3,7]
2
Gossypitrin
3
Quercetin
4
Luteolin
5
Acid chlorogenic
6
Acid protocatechuic
7
Eugenol
8
Ergosterol
9
Catechin
[9]
10
Gallocatechin
[7,9]
11
Acid caffeic
[6,9]
12
Gallocatechin gallate
[9]
13
Acid ellagic
[8]
14
Rutin
[3,9]
15
Kaempferol
[3]
CI
STT
[3]
OF FI
[7,9] [6,7] [7]
[7,9] [7]
KÈ M
QU
Y
NH ƠN
[7]
DẠ Y
Hibiscitrin (1)
Luteolin (4)
Gossypitrin (2)
Acid chlorogenic (5) 5
Quercetin (3)
Acid protocatechuic (6)
AL CI
Catechin (9)
OF FI
Ergosterol (8)
NH ƠN
Eugenol (7)
Acid caffeic (11)
QU
Y
Gallocatechin (10)
Acid ellagic (13)
KÈ M
Gallocatechin gallate (12)
Kaempferol (15)
DẠ Y
Rutin (14)
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của một số hợp chất flavonoid và polyphenol trong dịch chiết Bụp giấm
6
AL
1.1.2.2. Các acid hữu cơ
CI
Acid ascorbic (16) là acid hữu cơ chiếm nồng độ cao trong đài hoa Bụp giấm. Nồng độ acid này khác nhau đáng kể khi ở đài hoa tươi là 6,7-14mg/100g và đài hoa khô là 260-280mg/100g [4].
OF FI
Năm 2003, trong đề tài của Clifford cùng cộng sự đã công bố sự có mặt của acid chlorogenic và acid quinic (17) có trong chiết xuất lá Bụp giấm [10]. Trong nghiên cứu được Alarcon- Alonso thực hiện năm 2012, lượng acid chlorogenic trong chiết xuất Bụp giấm được báo cáo là 2,7mg/g [11].
NH ƠN
Năm 2018, Riaz và cộng sự đã tiến hành chiết xuất Bụp giấm và kết luận rằng trong dịch chiết có chứa một tỷ lệ cao các acid hữu cơ bao gồm: acid malic (18) và acid citric (19) (13% tính theo trọng lượng khô) [6]. Ngoài ra, AbouArab năm 2011 cũng báo cáo rằng chiết xuất đài hoa Bụp giấm chứa acid ascorbic (140,13 mg/100 g). Đồng thời, đề tài cũng kết luận trong dịch chiết đài hoa chứa nồng độ cao các acid hữu cơ như: acid oxalic (20), acid succinic (21), acid tartaric (22) [12]. Gần đây Jabeur đã báo cáo axit oxalic, acid fumaric (23) và acid hibiscus (24) là acid hữu cơ có nồng độ cao nhất trong chiết xuất đài hoa Bụp giấm [13].
Tên acid
Tài liệu tham khảo
Acid ascorbic
[4]
Acid quinic
[11]
18
Acid malic
[6]
19
Acid citric
[6]
20
Acid oxalic
[12]
21
Acid succinic
[12]
22
Acid tartaric
[12]
23
Acid fumaric
[13]
24
Aicd hibiscus
[13]
16
DẠ Y
KÈ M
17
QU
STT
Y
Bảng 1.2. Một số acid hữu cơ trong Bụp giấm
7
AL CI
Acid quinic (17)
Acid oxalic (20)
Acid tartaric (22)
NH ƠN
Acid citric (19)
Acid malic (18)
OF FI
Acid ascorbic (16)
Acid fumaric (23)
Acid succinic (21)
Acid hibiscus (24)
Hình 1.3. Công thức cấu tạo của một số acid hữu cơ trong Bụp giấm
Y
1.1.2.3. Các anthocyanin
QU
Anthocyanin là một nhóm các dẫn xuất flavonoid là các sắc tố tự nhiên có trong hoa khô Bụp giấm và màu của chúng thay đổi theo pH.
KÈ M
Anthocyanin đầu tiên từ đài hoa Bụp giấm được phân lập là hivicin, còn được gọi là hibiscin, về sau đổi tên thành delphinidin-3-sambubioside (25). Sau đó, có thêm các anthocyanin khác được phân lập là cyanidin-3-sambubioside (26), delphinidin-3-glucoside (27) và cyanidin-3-glucoside (28) [14]. Theo nghiên cứu được thực hiện bởi Tsai và cộng sự năm 2002 đã báo cáo rằng 85% anthocyanin là delphinidine-3- sambubioside và là chất đóng vai trò quan trọng trong việc chống oxy hóa của chiết xuất đài hoa Bụp giấm [15].
DẠ Y
Vào năm 2010, Luvonga và cộng sự năm tiến hành nghiên cứu và cho kết quả đài hoa Bụp giấm khô chứa tổng số anthocyanin dưới dạng cyanidin 3glucoside là 622,91 mg/100g [16].
8
CI
AL
Sau đó đến năm 2017, Jabeur và cộng sự trong nghiên cứu của họ đã xác định được delphinedine-3-o-sambubioside (29), delphinidine-3-o glucoside (30) và cyanidine-3-o sambubioside (31) ở hàm lượng (7,03 mg/g), (1,54 mg/g) và (4,40 mg/g) tương ứng [13]. Bảng 1.3. Một số hợp chất anthocyanin có trong Bụp giấm Tên acid
Tài liệu tham khảo
24
Delphinidin-3-sambubioside
25
Cyanidin-3-sambubioside
26
Delphinidin-3-glucoside
27
Cyanidin-3-glucoside
28
Delphinedine-3-o-sambubioside
29
Delphinidine-3-o glucoside
[13]
30
Cyanidine-3-o sambubioside
[13]
[14,15] [14]
[13,14] [14] [13]
QU
Y
NH ƠN
OF FI
STT
DẠ Y
KÈ M
24. R1=OH; R2=OH; R3=Sambubioside Delphinedine-3-sambubioside (28) 25. R1=OH; R2=H; R3= Sambubioside 26. R1=OH; R2=OH; R3=Glucose 27. R1=OH; R2=H; R3=Glucose
Delphinidine-3-o glucoside (29)
Cyanidine-3-o sambubioside (30)
Hình 1.4. Công thức cấu tạo của một số hợp chất anthocyanin có trong Bụp giấm 9
AL
1.1.2.3. Các polysaccharid
OF FI
CI
Polysaccharid là một nhóm hợp chất quan trọng khác và chiếm thành phần đáng kể khoảng 10% trong Bụp giấm. Hàm lượng chất nhầy được xác định trong các đài hoa của các chủng khác nhau là: 24–28% trong các chủng từ Trung Mỹ và Ai Cập nhưng chỉ có 15% trong một chủng Ấn Độ. Pectin chiếm 2-4% trong khi đường đạt tối đa 3–5% trong các chủng này. Chất nhầy và pectin bao gồm 60–80% acid uronic [6]. 1.1.2.4. Các thành phần khác
Các thành phần hóa học khác có trong Bụp giấm là protein, chất béo, carbohydrat, các khoáng chất và chất vô cơ như sắt, calci, kali, phospho, magie.
NH ƠN
Một nghiên cứu trên đài hoa Bụp giấm của Luvonga và cộng sự năm 2010 cho thấy hàm lượng carbohydrate là 68,7%, chiếm tỷ lệ cao nhất, tiếp theo là chất xơ với 14,6% [16]. 1.1.3. Tác dụng dược lý, công dụng
1.1.3.1. Chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan
QU
Y
Bụp giấm chứa flavonoid, các hợp chất phenolic và chúng đều có tác dụng chống oxy hoá mạnh nhờ cấu trúc polyphenol. Cơ chế được cho là do tác dụng lên các gốc tự do có trong cơ thể.
KÈ M
Năm 2003, W-L Lin và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan của APC trong dịch chiết Bụp giấm. Kết quả cho thấy sử dụng APC làm giảm iNOS của gan và tổng nitrit trong huyết thanh do LPS gây ra. Chuột uống APC trước với liều (0,2 và 0,5 mmol/kg) trong 5 ngày làm giảm đáng kể nồng độ trong huyết thanh của các enzym gan ALT và AST [17]. 1.1.3.2. Kháng khuẩn, chống nấm và chống ký sinh trùng.
DẠ Y
Nghiên cứu năm 2008 của Afolabi và cộng sự đã chứng minh chiết xuất Bụp giấm có tác dụng kháng khuẩn, chống lại vi khuẩn Streptococcus mutans gây bệnh ở nồng độ ức chế tối thiểu là 2,5mg/ml [18]. Một nghiên cứu khác của Che-Yi Chao và cộng sự năm 2009 chứng minh tác dụng kháng khuẩn của chiết xuất nước và ethanol của đài hoa Bụp giấm,
10
OF FI
CI
AL
chứa APC giúp chống lại vi khuẩn Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus và Bacillus cereus. Nồng độ ức chế tối thiểu của chiết xuất nước Bụp giấm, dịch chiết ethanol và chiết xuất acid protocatechuic chống lại những vi khuẩn này lần lượt nằm trong khoảng 112-144, 72-96 và 24-44 µg/ml. Hàm lượng acid protocatechuic trong dịch chiết nước và chiết xuất etanol lần lượt là 2,8 ± 0,7 và 11,9 ± 1,2 mg/g [19]. 1.3.3.3. Chống ung thư
Tanaka T và cộng sự năm 2011 đã nghiên cứu về APC trong Bụp giấm và đánh giá là hoạt chất có tiềm năng ngăn ngừa ung thư.
NH ƠN
Cơ chế hoạt động ngăn ngừa ung thư của APC chủ yếu liên quan đến hoạt động chống oxy hóa, bao gồm ức chế sự tạo ra cũng như loại bỏ các gốc tự do và điều chỉnh các enzym chống oxy hóa. Ảnh hưởng tới giai đoạn 1 và 2 của quá trình trao đổi chất của một số chất gây ung thư và được dự đoán là trực tiếp chặn các vị trí liên kết cụ thể của chất gây ung thư cuối cùng với phân tử DNA. Do vậy, Bụp giấm có các đặc tính phòng ngừa ung thư tiềm tàng [20]. 1.1.3.4. Tác dụng bảo vệ thận
Y
Theo Surachet Woottisin và cộng sự vào năm 2011 đã tiến hành đánh giá tác dụng bảo vệ thận của dịch chiết Bụp giấm trên động vật thực nghiệm.
KÈ M
QU
Kết quả nhóm động vật uống chiết xuất Hibiscus sabdariffa L. cho thấy oxalat và glycolat huyết thanh giảm đáng kể, đồng thời bài tiết oxalat qua nước tiểu cao hơn. Kiểm tra mô học cho thấy ít lắng đọng tinh thể CaOx trong thận của những con chuột được điều trị bằng Hibiscus sabdariffa so với những con chuột không được điều trị [21]. 1.1.3.5. Tác dụng lên chuyển hóa lipid
DẠ Y
Nghiên cứu của Gosain và cộng sự đánh giá tác dụng hạ lipid máu của chiết xuất ethanol Bụp giấm trên chuột bị tăng lipid máu ở 2 liều: 200 và 300 mg/kg, đường uống ở chuột Wistar tăng lipid huyết (2 g/kg) gây ra. Sử dụng liều chiết xuất lá Bụp giấm (200 mg/kg và 300 mg/kg) liên tục trong 4 tuần cho thấy mức cholesterol huyết thanh giảm đáng kể lần lượt là 18,5% và 22%; nồng
11
AL
độ triglycerid huyết thanh lần lượt là 15,6% và 20,6%; LDL huyết thanh tương ứng là 24% và 30% và VLDL huyết thanh lần lượt là 15,5% và 20,5% [22]. 1.1.3.6. Tác dụng trên bệnh tăng huyết áp
OF FI
CI
Nghiên cứu của Ibrahim Inuwa và cộng sự đã khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết nước Bụp giấm chứa anthocyanins có tác dụng với chiều dài và diện tích bề mặt mao mạch cơ tim thất trái ở chuột tăng huyết áp tự phát (SHRs).
NH ƠN
Kết quả là nhóm động vật uống dịch chiết Bụp giấm làm giảm đáng kể khối lượng huyết áp tâm thu và huyết áp tâm trương. Đồng thời dịch chiết Bụp giấm làm tăng diện tích bề mặt và mật độ chiều dài của mao mạch cơ tim lên 59%, 65% và 86%, và mật độ chiều dài lần lượt là 57%, 77% và 57%. Các nhà nghiên cứu đã kết luận rằng những tác dụng này có lợi trong việc phục hồi sức khỏe của tế bào bị tổn hại bởi tình trạng phì đại của bệnh tăng huyết áp [23]. 1.1.3.7. Tác dụng trên bệnh tiểu đường
QU
Y
Năm 2011, trong nghiên cứu của Chiung-Huei Peng đã thử nghiệm dịch chiết Bụp giấm với mô hình chuột mắc bệnh tiểu đường type 2 để kiểm tra tác dụng bảo vệ của nó. Kết quả công bố rằng điều trị bằng dịch chiết Bụp giấm làm giảm tình trạng đường huyết cao và tăng insulin máu, đặc biệt ở liều 200mg/kg. Dịch chiết Bụp giấm làm giảm triacylglycerol huyết thanh, cholesterol và tỷ lệ LDL/HDL. Đề tài này kết luận dịch chiết Bụp giấm có tác dụng hạ đường huyết, giảm lipid máu và chống oxy hóa [24]. 1.2. TỔNG QUAN VỀ ACID PROTOCATECHUIC
DẠ Y
KÈ M
1.2.1. Công thức cấu tạo và tính chất của acid protocatechuic
Hình 1.5. Công thức cấu tạo của acid protocatechuic 12
Công thức phân tử: C7H6O4; Phân tử lượng: 154,12g/mol
CI
Nhiệt độ nóng chảy: 221oC; Nhiệt độ sôi: 410oC
AL
Tên IUPAC: 3,4- Dihydroxybenzoic acid
OF FI
Acid protocatechuic tồn tại ở dạng kết tinh rắn màu xám, tan được trong nước với tỷ lệ 1:50, tan trong cồn và ete, có mùi phenol nhẹ, không bị đổi màu trong không khí và là một hợp chất có tính acid yếu [25]. 1.2.2. Tác dụng sinh học 1.2.2.1. Tác dụng chống oxy hóa
NH ƠN
Năm 2011, Li X và cộng sự đã tiến hành chứng minh APC có tác dụng chống oxy hóa thông qua các thử nghiệm khác nhau thể hiện qua bảng 1.2. Bảng 1.4. Bảng tỷ lệ các giá trị IC50 (Trolox) / IC50(APC) Tỷ lệ IC50 (Trolox) / IC50 (APC)
Thử nghiệm tương ứng
2,8
DPPH
2,3
Ion Fe3+ Ion Cu2+
QU
6,1
Y
3,7
ABTS
4,2
Gốc anion superoxide
1,0
Gốc hydroxyl
2,7
Tạo chelat với (Fe2 +)
KÈ M
Chelat hóa ion Cu2
1,5
So với Trolox, APC cho thấy hoạt động chống oxy hóa invitro hiệu quả hơn trong cả môi trường lipid và nước. Do đó, có thể được sử dụng trong dược phẩm hoặc công nghiệp thực phẩm như một chất chống oxy hóa tự nhiên [26].
DẠ Y
1.2.2.2. Tác dụng chống ung thư Trong nghiên cứu của Tanaka T và các cộng sự năm 2011, APC được đánh giá là hoạt chất có tiềm năng ngăn ngừa ung thư vì nó ức chế quá trình sinh ung thư in vitro và tạo ra các tác dụng proapoptotic và chống tăng sinh ở các 13
AL
mô khác nhau. Cơ chế hoạt động ngăn ngừa ung thư của acid protocatechuic chủ yếu liên quan đến hoạt động chống oxy hóa, bao gồm ức chế sự tạo ra cũng như loại bỏ các gốc tự do và điều chỉnh các enzym chống oxy hóa [20].
CI
1.2.2.3. Tác dụng chống đái tháo đường
NH ƠN
OF FI
Theo Scazzocchio B và cộng sự, APC ở mức 1% và 2% khi cho chuột được điều trị bằng d-galactose trong 8 tuần làm giảm nồng độ đường huyết và tăng mức insulin. APC cũng cho tác dụng chống viêm bằng cách giảm giải phóng interleukin (IL) -1 beta, yếu tố hoại tử khối u-anpha và prostaglandin E2 trong não. APC hiệu quả trong việc ngăn chặn hoặc giảm thiểu lão hóa do ngăn ngừa viêm não và tổn thương do glycative. APC ở mức 2% hoặc 4% khi cung cấp cho chuột mắc tiểu đường trong 12 tuần rất hữu ích trong việc ngừa các biến chứng tiểu đường liên quan đến glycation [27]. 1.2.2.4. Tác dụng chống viêm, giảm đau và kháng khuẩn
QU
Y
Qua nghiên cứu của Lende AB và cộng sự năm 2011, APC đã cho thấy hoạt động chống viêm, giảm đau, chống đông máu và chống oxy hóa ở động vật thực nghiệm. Điều trị bằng APC ở mức 2% và 4% làm giảm đáng kể hoạt động của chất ức chế hoạt hóa plasminogen-1 và mức độ fibrinogen; tăng hoạt tính huyết tương của antithrombin-III và protein C; giảm hàm lượng chất béo trung tính trong huyết tương, tim và gan. Vì vậy, APC hiệu quả trong các biến chứng tiểu đường nhờ tác dụng hạ chất béo trung tính, chống đông máu, chống oxy hóa và chống viêm [28]. 1.2.2.5. Tác dụng chống xơ vữa
KÈ M
Theo Borate AR cùng các cộng sự, APC đã được phát hiện có tác dụng chống xơ vữa. APC ức chế sự kết dính của bạch cầu đơn nhân với yếu tố hoại tử khối u- tế bào nội mô động mạch chủ chuột hoạt hóa α (TNF- α).
DẠ Y
Dịch chiết Ethanol của Bụp giấm chứa APC có tác dụng chống oxy hóa và tăng lipid máu đáng kể. Họ đã cho thấy những hiệu quả đối với việc giảm cholesterol toàn phần trong huyết thanh. Do đó APC đóng vai trò như một tác nhân làm tăng chỉ số lipid máu có lợi [29].
14
AL
1.2.2.6. Tác dụng lên tim Một nghiên cứu của Ciftci O và cộng sự đã kết luận việc sử dụng dịch chiết Ethanol Bụp giấm chứa APC có tác dụng hạ huyết áp và bảo vệ tim mạch.
OF FI
CI
2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo- p -dioxin (TCDD) gây độc tính trên tim ở chuột 3-4 tháng tuổi đã và được điều trị bằng acid protocatechuic ở liều 100 mg/kg trong 45 ngày được tìm thấy làm giảm mức độ của các chất phản ứng với acid thiobarbituric, đồng thời làm tăng glutathione, catalase, glutathione peroxidase và superoxide dismutase. Ngoài ra APC còn ngăn ngừa hoại tử và xuất huyết trong mô tim do TCDD gây ra. APC cũng cho thấy tác dụng hữu ích trong nhồi máu cơ tim cấp tính với propranolol ở chó [30].
NH ƠN
1.2.2.7. Tác dụng bảo vệ gan APC trong chiết xuất Bụp giấm được phát hiện có khả năng chống oxy hóa gây ra bởi tert-butylhydroperoxide (t-BHP) trong môi trường nuôi cấy tế bào gan chuột do cơ chế hoạt động chống oxy hóa của nó. APC liều (50 –100 mg / kg) sử dụng trong 5 ngày ức chế quá trình phosphoryl hóa tyrosine do tBHP gây ra ở gan và được phát hiện có hiệu quả chống lại độc tính trên gan do t-BHP gây ra [31].
QU
Y
Ngoài ra, APC còn được chứng minh có tác dụng lên thần kinh, giúp giảm sự tổn thương của tế bào thần kinh và có giá trị trong việc điều trị Parkinson [32]. 1.3. CÁC PHUƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU
KÈ M
1.3.1. Phương pháp ngâm
Phương pháp ngâm là một phương pháp chiết xuất đơn giản với quy trình tiến hành như sau: Dược liệu được chia nhỏ tới độ mịn thích hợp và ngâm trong một loại dung môi thích hợp trong thời gian nhất định, sau đó ép, lắng lọc hoặc thu lấy dịch chiết.
DẠ Y
Tùy theo nhiệt độ chiết xuất mà ngâm được chia nhỏ thành các phương pháp là ngâm lạnh, hầm, hãm, sắc. Phương pháp ngâm được tiến hành một lần với toàn bộ dung môi hoặc ngâm nhiều lần với từng phân đoạn dung môi [33].
15
AL
1.3.2. Phương pháp ngấm kiệt
OF FI
CI
Tên gọi khác của phương pháp này là ngâm nhỏ giọt. Đây là phương pháp cho dung môi chảy rất chậm qua khối dược liệu đựng trong bình ngấm kiệt theo quy định, trong suốt quá trình chiết xuất không có sự khuấy trộn. Sau một khoảng thời gian tùy vào từng loại dược liệu, rút nhỏ giọt dịch chiết ở phía dưới bình, đồng thời bổ sung thêm dung môi ở phía trên bằng cách cho dung môi chảy rất chậm và kiên tục qua lớp dược liệu nằm yên. Lớp dung môi trong bình chiết thường ngập bề mặt dược liệu 3-4cm [33]. 1.3.3. Phương pháp chiết xuất ngược dòng gián đoạn
NH ƠN
Phương pháp này sử dụng hệ thống nhiều bình chiết khác nhau, có thể mắc thành một dãy 4 đến 16 bình chiết nối tiếp nhau. Lúc đầu, dược liệu và dung môi được nạp vào trong tất cả các thiết bị, dược liệu được ngâm vào dung môi trong khoảng thời gian thích hợp. Sau đó dịch chiết được chuyển tuần tự từ thiết bị này sang thiết bị khác.
QU
Y
Hệ thống tổ hợp kín các bình chiết này cho phép đóng ngắt một cách có chu kỳ một trong những thiết bị ra khỏi hệ thống tuần hoàn, cho phép tháo bã dược liệu ở bình đã kiệt rồi nạp dược liệu mới. Sau đó, thiết bị này được đưa trở lại hệ thống tuần hoàn và dịch chiết đậm đặc nhất được dẫn qua. Quá trình chiết bằng phương pháp này xảy ra thoe nguyên tắc “Dung môi mới tiếp xúc dược liệu cũ, dược liệu mới tiếp xúc dung môi cũ” [33]. 1.3.4. Phương pháp chiết nóng
KÈ M
Chiết nóng đun sôi hồi lưu dung môi là một hệ kín. Hỗn hợp dược liệu và dung môi theo tỷ lệ xác định được đun sôi ở nhiệt độ sôi của dung môi. Với những dung môi có nhiệt độ sôi thấp sẽ đun sôi cách thủy. Dung môi bay hơi sẽ ngưng tụ bởi ống sinh hàn, trở lại thiết bị chứa dược liệu tiếp tục quá trình chiết xuất [33].
DẠ Y
1.3.5. Phương pháp chiết siêu âm Phương pháp chiết siêu âm là phương pháp hiện đại, hiệu quả cao và ít tốn kém. Chiết xuất dưới tác động của siêu âm (UAE) là phương pháp ngâm cải tiến với việc sử dụng sóng siêu âm tần số cao làm cho chiết xuất dễ dàng
16
AL
hơn, tần số sóng siêu âm từ 18 kHz đến 100 MHz. Chiết xuất siêu âm cũng có thể làm giảm nhiệt độ nên thuận lợi cho chiết xuất các hợp chất không bền bởi nhiệt độ [33].
CI
1.3.6. Phương pháp chiết vi sóng
NH ƠN
OF FI
Chiết vi sóng (MAE) là sóng cực ngắn hay sóng siêu tần có tần số từ 0,3GHz đến 300 GHz, thường sử dụng bức xạ điện từ ở tần số 2450MHz. Vi sóng có tác dụng làm tăng nhiệt độ của dược liệu một cách đặc biệt, khác với các phương pháp làm nóng khác thì vi sóng là làm nóng đều từ bên trong lõi của vật chất. Nhiệt sinh ra theo 2 cơ chế là dẫn truyền ion và quay lưỡng cực, 2 cơ chế này làm sinh nhiệt trong lòng khối vật chất, làm cho ra nhiệt nhanh và hiệu quả chiết xuất nhanh hơn [33]. 1.3.7. Phương pháp chiết xuất siêu tới hạn
Khi đưa nhiệt độ và áp suất của một chất lên tới giá trị tới hạn, chất đó sẽ tơi vào một vùng trạng thái đặc biệt gọi là trạng thái siêu tới hạn. Phương pháp chiết xuất siêu tới hạn (SFE) là phương pháp sử dụng dung môi ở trạng thái siêu tới hạn, dung môi thường dùng là CO2. Hệ thống hoạt động theo nguyên tắc như sau:
Y
-Dược liệu được nạp vào bình chiết.
QU
-Dòng CO2 lỏng đi qua bộ phận làm lạnh, qua bơm nén rồi qua bộ tăng nhiệt. Khi đạt đến nhiệt độ và áp suất thích hợp, CO2 trở thành dòng diêu tới hạn.
KÈ M
-Dòng này vào bình chiết, hoạt chất sẽ theo dòng CO2 siêu tới hạn qua bộ phận làm lạnh, tại đây CO2 hóa lỏng và được đưa vào bình tách. -Điều chỉnh nhiệt độ và áp suất thích hợp thì CO2 sẽ biết thành dạng khí, sản phẩm thu được lắng xuống. -CO2 dạng khí được đưa qua bộ phận nén lạnh, hóa lỏng và trở lại bình chứa, quá trình chiết lại tiếp tục [33].
DẠ Y
1.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU GẦN ĐÂY TRONG NƯỚC Ở Việt Nam, các năm trước Bụp giấm chủ yếu được nghiên cứu trong ứng dụng trong ngành giải khát, rượu vang. Một số năm gần đây, đã có những
17
AL
nghiên cứu về việc ứng dụng các tác dụng dược lý của Bụp giấm trong bào chế các chế phẩm ngành dược, tiêu biểu là một số đề tài như:
OF FI
CI
- Năm 2017, Vũ Bình Dương, Phạm Văn Hiển và cộng sự đã xây dựng phương pháp định lượng polyhenol toàn phần trong đài Bụp giấm bằng phương pháp UV – VIS và cho kết quả hàm lượng polyphenol toàn phần là 29,35±0,73mg/g tính theo acid gallic. Phương pháp quang phổ UV-VIS đảm bảo độ chọn lọc đặc hiệu, độ đúng cao với tỷ lệ thu hồi 101,63% và độ chính xác cao (RSD<2%) [34].
NH ƠN
- Năm 2014, nhóm tác giả Lê Thị Lan Phương và cs đã tiến hành đánh giá tác dụng bảo vệ gan của bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm trên chuột nhắt tổn thương tế bào gan cấp tính bằng ethanol và cho kết quả: Bột sấy phun đài hoa Bụp giấm có tác dụng bảo vệ gan trên chuột nhắt gây tổn thương tế bào gan cấp tính bằng ethanol 40%, 5 g, 3 lần. Liều 450 mg/kg làm giảm men gan AST 27%, ALT 25% và giảm mức độ viêm, hoại tử tế bào gan [35].
DẠ Y
KÈ M
QU
Y
- Năm 2018, Hội Hóa học Việt Nam đã xây dựng được quy trình chiết xuất phân đoạn giàu hợp chất polyphenol với hàm lượng polyphenol đạt trên 60%. Bằng việc kết hợp các phương pháp sắc ký và phổ hiện đại, nhóm đã nghiên cứu phân lập và xác định được cấu trúc của 05 hợp chất từ đài hoa Bụp giấm gồm: luteolin, quercetin, hisbiscus acid dimethyl ester, β-sitosterol và daucosterol. Đây là các hợp chất đã biết nhưng là lần đầu tiên được phân lập từ cây Bụp giấm ở Việt Nam [36].
18
AL
CHƯƠNG 2 – NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ
CI
2.1.1. Nguyên liệu
QU
Y
NH ƠN
OF FI
- Dược liệu Bụp giấm được thu vào ngày 08/12/2020 tại thành phố Hồ Chí Minh. Mẫu tiêu bản (LTHH-QY001) được lưu tại Phòng Thực vật học, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật (Phụ lục 1). Mẫu được giám định tên khoa học là Hibiscus sabdariffa L., thuộc họ Bông (Malvacaeae).
KÈ M
Hình 2.1. Hoa Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L.) thu tại thành phố Hồ Chí Minh
DẠ Y
Xử lý nguyên liệu: Dược liệu được sấy khô rồi xay nhỏ, đóng gói và bảo quản trong túi nilong kín ở nơi khô ráo, thoáng mát để sử dụng trong nghiên cứu.
19
Thiết bị, hóa chất được trình bày dưới bảng sau:
OF FI
Tên thiết bị Nguồn gốc Cân phân tích độ chính xác 0,0001g Mettler (Thụy Sĩ) Cân kỹ thuật độ chính xác 0,01g ML 3002E-01 (Thụy Sĩ) Tủ sấy Memment (Đức) Máy siêu âm Elmasonic (Mỹ) Máy đo hàm ẩm tự động Sartorius (Đức) Máy cô quay Buchi (Thụy Sĩ) Bộ dụng cụ chiết hồi lưu Việt Nam Máy lọc hút chân không Đức Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Waters – 2695D (Mỹ) Một số dụng cụ khác: pipet, ống đong, cốc Việt Nam có mỏ, bình nón, bình định mức…
NH ƠN
STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
CI
Bảng 2.1. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
AL
2.1.2. Thiết bị, hóa chất
Hóa chất được trình bày trong bảng sau:
Bảng 2.2. Các hóa chất dùng trong nghiên cứu
QU
Y
STT Tên hóa chất 1 APC chuẩn (≥ 98%) 2 Ethanol (50, 70, 90%) Acetonitril
4
MeOH
KÈ M
3
Acid trifluoroacetic
6
Nước cất 2 lần
7 8
n-Hexan Etyl acetat
DẠ Y
5
Nguồn gốc Trung Quốc Việt Nam Merck Trung Quốc Trung Quốc Khoa Dược – BVQY 103 Merck Merck
Tiêu chuẩn Chuẩn đối chiếu TCCS Tiêu chuẩn tinh khiết phân tích HPLC Tiêu chuẩn tinh khiết phân tích HPLC Tiêu chuẩn tinh khiết phân tích HPLC TCCS TCCS TCCS
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện tại: Bộ môn Hóa dược - Dược lâm sàng và bộ môn Kiểm nghiệm – Độc chất, Viện Đào tạo Dược, Học viện Quân y. 20
2.2.1. Xây dựng phương pháp chiết xuất cao lỏng Bụp giấm
AL
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
CI
2.2.1.1. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng đầu vào của dược liệu Bụp giấm a. Hàm ẩm
b. Định tính flavonoid trong dược liệu - Sử dụng phương pháp hóa học:
OF FI
Tiến hành xác định hàm ẩm bằng máy đo hàm ẩm, dùng 1,0 g dược liệu Bụp giấm đã xay nhỏ, thời gian đo khoảng 7 đến 10 phút đến khối lượng không đổi. Hàm ẩm không được quá 10% theo quy định của DĐVN V [37].
NH ƠN
Chuẩn bị mẫu: Cân 1,0 g bột dược liệu Bụp giấm cho vào bình nón, chiết bằng thiết bị chiết siêu âm ở nhiệt độ 80oC, thời gian 30 phút bằng 10 ml EtOH 70%. Lọc lấy phần dịch lọc để sử dụng thực hiện phản ứng (dung dịch A) [38]. * Phản ứng với dung dịch FeCl3
Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 1ml dung dịch A, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%, lắc đều và để yên vài phút.
Y
Yêu cầu: Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu xanh đen.
QU
* Phản ứng Cyanidin
Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 1ml dung dịch A, thêm một lượng nhỏ bột Mg. Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc vào ống nghiệm. Để yên vài phút.
KÈ M
Yêu cầu: Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ. * Phản ứng với dung dịch NaOH
Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 1 ml dung dịch A, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%, lắc đều rồi để yên vài phút.
DẠ Y
Yêu cầu: Phản ứng dương tính khi có xuất hiện tủa vàng. Thêm nước cất vào thì tủa sẽ tan và màu vàng cảu dung dịch sẽ tăng thêm.
21
AL
- Sắc ký lớp mỏng:
CI
Trong nghiên cứu lựa chọn APC là chất chuẩn, do đó tiến hành định tính APC trong dược liệu bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng theo phụ lục 5.4, dược điển Việt Nam V [37].
OF FI
Chuẩn bị bản mỏng: Sử dụng bản mỏng tráng sẵn GF254 của hãng Merck. Kích cỡ bản mỏng là 2,5 x 10cm. Hệ dung môi khai triển: Ethyl acetate : Methanol : Nước với tỷ lệ 8:1:0,1
NH ƠN
Dung dịch thử: Cân 5,0 g dược liệu Bụp giấm cho vào bình nón, chiết với 50ml dung dịch ethanol 70% bằng phương pháp siêu âm, thời gian chiết 1 giờ. Lọc lấy phần dịch chiết, cô đặc đến còn 10ml rồi phân đoạn lần lượt với nhexan, ethyl acetat. Lấy phân đoạn ethyl acetate để tiến hành làm thí nghiệm. Dung dịch chuẩn: Dung dịch chuẩn APC có nồng độ 50 μg/ml. Cách tiến hành:
QU
Y
Chuẩn bị bình khai triển sắc ký: Bão hòa hơi dung môi trong bình bằng cách lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình, rót một lượng vừa đủ dung môi vào bình, lắc rồi để giấy lọc thấm đều dung môi. Lượng dung môi sử dụng sao cho sau khi thấm đều giấy lọc còn lại một lớp dày khoảng 5 mm đến 10 mm ở đáy bình. Đậy kín nắp bình và để yên 1 giờ ở nhiệt độ 20°C đến 25°C.
KÈ M
Dùng mao quản chấm dung dịch thử và dung dịch chuẩn lên bản mỏng đã chuẩn bị sẵn. Sau khi chấm xong dung dịch thử và dung dịch đối chiếu thì đặt bàn mỏng vào bình triển khai. Chú ý lượng dung môi dùng sao cho để các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi. Đậy kín bình và để triển khai ở nhiệt độ từ 20°C đến 25°C và tránh ánh mặt trời. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được khoảng 3/4 bản mỏng, lấy bản mỏng ra khỏi bình. Bản mỏng sau khi lấy ra thì để ngoài cho bay hết dung môi, rồi quan sát các vết chất dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm.
DẠ Y
Thuốc thử hiện màu: Hơ bản mỏng với hơi Iod rắn. Vết trên bản mỏng sẽ có màu vàng nâu.
22
AL
2.2.1.2. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid protocatechuic trong dịch chiết dược liệu Bụp giấm a. Định lượng
OF FI
CI
Acid protocatechuic trong dịch chiết Bụp giấm được định lượng bằng phương pháp HPLC. Hàm lượng acid protocatechuic được tính theo acid protocatechuic chuẩn [39]. *Điều kiện phân tích - Cố định các điều kiện:
+ Cột sắc ký: Phenomenex Gemini C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 μm).
+ Nhiệt độ cột: 30oC + Thể tích tiêm: 10 µl.
NH ƠN
+ Detector: PDA
+ Bước sóng định lượng: 260 nm.
- Khảo sát hệ dung môi pha động: Chọn 2 hệ dung môi + Hệ dung môi (1): A - Acid formic (0,1%); B – ACN
Y
+ Hệ dung môi (2): A - Acid trifluoroacetic (0,1%), B – ACN
QU
+ Điều kiện gradient hai hệ được mô tả ở bảng 2.3. Bảng 2.3. Điều kiện gradient của pha động
DẠ Y
KÈ M
Thời gian (phút) 0 19 20 24 25 29 30 35
A (%) 85 85 80 80 60 60 85 85
23
B (%) 15 15 20 20 40 40 15 15
* Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử:
AL
- Khảo sát tốc độ dòng: Lựa chọn được hệ dung môi pha động, cố định các điều kiện phân tích, tiến hành khảo sát tốc độ dòng: 1ml/phút và 0,6ml/phút.
OF FI
CI
+ Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 5,0 mg acid protocatechuic chuẩn, sau đó hòa tan bằng MeOH trong bình định mức 100 ml, thêm MeOH vừa đủ đến vạch. Lắc đều và thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 50 µg/ml.
NH ƠN
+ Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 2,0 g dược liệu Bụp giấm, cho vào bình nón dung tích 250 ml, thêm 10 ml MeOH, chiết bằng thiết bị chiết siêu âm trong thời gian khoảng 60 phút, số lần chiết là 2 lần. Dịch chiết thu được trong quá trình chiết được lọc qua máy lọc hút chân không, gộp và cho vào bình định mức 50 ml, thêm MeOH đến vạch, lắc đều, lọc dung dịch qua giấy lọc. Sau đó lọc tiếp qua màng lọc cỡ 0,45 µm và được tiêm vào hệ thống phân tích HPLC. * Xây dựng đường chuẩn: Xây dựng phương trình tuyến tính của đường chuẩn rồi từ đó suy ra nồng độ chất trong mẫu thử.
QU
Y
Từ dung dịch chuẩn gốc acid protocatechuic có nồng độ 50 µg/ml, tiến hành pha loãng bằng dung môi MeOH để có được dãy chuẩn với các nồng độ theo thứ tự là: 1,0; 2,5; 5,0; 10,0; 20,0 µg/ml. *Cách tiến hành
KÈ M
+ Tiến hành tiêm dung dịch chuẩn, mỗi nồng độ tiêm 3 lần, ghi lại sắc kì đồ và xác định đáp ứng của pic. + Tiêm mẫu thử, mỗi mẫu thử lặp lại 3 lần, ghi nhận sắc kí đồ và ghi lại đáp ứng với chất cần phân tích. *Tính kết quả
DẠ Y
+ Nồng độ acid protocatechuic chiết được từ dược liệu: Dựa vào đường chuẩn biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic, phương trình S = a × C + b.
24
HL (%) =
AL
+ Hàm lượng APC trong dược liệu được xác định dựa trên công thức: (S−b) × V × n × 100 × 100 a x m ×(100−h) × 1000000
HL: Hàm lượng acid protocatechuic trong dược liệu (%)
CI
Trong đó:
C: Nồng độ acid protocatechuic trong dung dịch thử.
n: Hệ số pha loãng.
OF FI
V: Thể tích dung dịch hòa tan mẫu thử (ml).
m: Khối lượng dược liệu cân để chiết xuất (g). h: Hàm ẩm của dược liệu (%).
NH ƠN
S: Diện tích pic acid protocatechuic (µV*s). a: Hệ số góc của đường chuẩn.
b: Hệ số chắn của đường chuẩn. + Hiệu suất chiết acid protocatechuic từ dược liệu: H (%) =
Trong đó:
HLtt ×100 HLlt
Y
HLtt : Hàm lượng APC có trong dược liệu thực tế chiết được (%). HLlt : Hàm lượng APC có trong dược liệu tính theo lý thuyết (%)
KÈ M
QU
b. Thẩm định phương pháp định lượng Tiến hành thẩm định phương pháp định lượng APC trong dịch chiết dược liệu Bụp giấm theo hướng dẫn của ICH như sau [40]: + Tính tương thích hệ thống Pha dung dịch chuẩn acid protocatechuic có nồng độ khoảng 10 µg/ml từ dung dịch chuẩn gốc (50 µg/ml). Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn vào hệ thống HPLC.
DẠ Y
Yêu cầu: Chênh lệch diện tích pic, thời gian lưu giữa các lần tiêm của cùng một mẫu biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) không lớn hơn 2%. + Độ đặc hiệu Chuẩn bị mẫu trắng: Methanol tiêu chuẩn tinh khiết phân tích HPLC.
25
CI
AL
Chuẩn bị mẫu thử: Cân chính xác khoảng 2,0 g bột dược liệu Bụp giấm cho vào bình nón 100 ml, thêm 10 ml methanol và tiến hành chiết siêu âm trong 1 giờ. Gạn dịch chiết methanol và lặp lại quá trình chiết thêm 1 lần nữa với 10 ml methanol. Gộp dịch chiết vào bình định mức 25ml và thêm MeOH đến vạch. Lọc dịch chiết trong bình định mức qua màng 0,45 µm và phân tích HPLC.
OF FI
Chuẩn bị mẫu chuẩn: Sử dụng mẫu chuẩn nồng độ 10,0 µg/ml ở phần tính tương thích hệ thống.
+ Khoảng tuyến tính
NH ƠN
Tiến hành chạy sắc ký theo điều kiện đã khảo sát và ghi sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử. Yêu cầu tại thời điểm thời gian lưu của chất phân tích, trên sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện pic tương ứng, trên sắc ký đồ mẫu thử pic của chất phân tích tách hoàn toàn ra khỏi tạp và trùng với pic chất chuẩn trên sắc ký đồ mẫu chuẩn.
QU
Y
Chuẩn bị 5 mẫu dung dịch chuẩn acid protocatechuic có nồng độ tăng dần: 1; 2,5; 5; 10; 20 µg/ml. Tiến hành sắc kí theo điều kiện đã chọn ở mục 2.2.1.2 (a) và xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ dung dịch chất chuẩn. Xác định hệ số tương quan R2 và độ chệch nồng độ tại đừng điểm chuẩn ∆i: ∆ i=
𝐶𝑡 −𝐶𝑐 𝐶𝑐
x100
Trong đó:
∆i: Độ chệch của điểm chuẩn i dùng xây dựng đường chuẩn.
KÈ M
Ct: Nồng độ tính ngược theo đường chuẩn của các điểm chuẩn. Cc: Nồng độ của các điểm chuẩn theo lý thuyết. Yêu cầu: 0,99 ≤ R2 ≤ 1 và ∆i không được vượt quá ± 15%. + Độ lặp lại
DẠ Y
Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá dựa trên việc tiến hành lặp lại 6 thử nghiệm riêng biệt từ bước cân dược liệu, chiết xuất đến phân tích mẫu thử bằng hệ thống HPLC. Khối lượng cân mỗi mẫu thử chính xác khoảng 2,0g.
26
AL
+ Độ đúng
CI
Độ đúng của phương pháp được đánh giá dựa vào phương pháp thêm chuẩn và xác định tỷ lệ % tìm lại. Một lượng chính xác chất chuẩn đã biết được thêm vào một lượng chính xác dược liệu sau đó xác định lượng APC đã thêm vào dựa vào phân tích HPLC. Tiến hành làm lặp lại 6 thử nghiệm riêng biệt.
% tìm lại =
mchuẩn tìm lại × 100 mchuẩn thêm vào
=
OF FI
Tỷ lệ phần trăm tìm lại chuẩn được xác định theo công thức: Cchuẩn tìm lại ×100 Cchuẩn thêm vào
+ Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
NH ƠN
Tiến hành pha loãng dần dung dịch chuẩn acid protocatechuic bằng MeOH và tiến hành phân tích trên hệ thống HPLC. LOD và LOQ của phương pháp được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu pic/nhiễu đường nền (S/N). Trong đó, S là diện tích tín hiệu APC, N là diện tích đường nền. Giá trị LOD là nồng độ APC mà tại đó S/N = 3. Giá trị LOQ là nồng độ APC mà tại đó S/N = 10. 2.2.1.3. Phương pháp chiết xuất cao lỏng Bụp giấm
Y
a. Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất cao lỏng Bụp giấm
QU
Nguyên liệu Bụp giấm sau khi thu được rửa sạch, sấy khô đến khi hàm ẩm nhỏ hơn 10%, nghiền thành bột. Đóng gói nguyên liệu trong bao bì kín cho đến khi sử dụng.
DẠ Y
KÈ M
Cân chính xác 2,0 g bột dược liệu, cho vào thiết bị chiết, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố: phương pháp chiết, dung môi, thời gian, tỉ lệ dung môi/dược liệu, số lần chiết. Gạn, lọc và gộp tất cả dịch chiết vào bình định mức 100ml, định mức bằng dung môi chiết xuất. Lọc dung dịch đã chuẩn bị ở trên qua màng lọc cỡ 0,45 µm và tiến hành định lượng trên hệ thống HPLC để kết luận phương pháp chiết xuất tối ưu. - Nhiệt độ chiết xuất: Tương đương nhiệt độ sôi của dung môi chiết xuất.
27
AL
b. Khảo sát các thông số của quy trình chiết xuất * Khảo sát ảnh hưởng phương pháp chiết xuất cao lỏng Bụp giấm.
CI
Tiến hành khảo sát hai phương pháp là phương pháp chiết nóng và phương pháp chiết siêu âm. Chuẩn bị mẫu: Cân 2g dược liệu, sử dụng dung môi EtOH 70o, nhiệt độ
OF FI
chiết ≈ 80oC. Tỷ lệ dung môi/dược liệu là 10/1, số lần chiết 2 lần, mỗi lần chiết với thời gian 60 phút.
Định lượng hàm lượng APC trong dịch chiết Bụp giấm theo qui trình ở mục 2.2.1.2 (a).
NH ƠN
Yêu cầu: Lựa chọn phương pháp chiết có hiệu suất chiết APC cao hơn. * Khảo sát ảnh hưởng dung môi chiết xuất cao lỏng Bụp giấm Sau khi đã lựa chọn được phương pháp chiết xuất thì tiến hành khảo sát dung môi: Nước, EtOH 50%, EtOH 70%, EtOH 90% theo bảng dưới đây:
Dung môi
Thời gian chiết
Số lần chiết
Tỷ lệ DM/DL
EtOH 50 o
60 phút/lần
2
10/1
EtOH 70o
Y
Bảng 2.4. Bảng khảo sát lựa chọn dung môi chiết xuất cao lỏng Bụp giấm
2
10/1
60 phút/lần
2
10/1
60 phút/lần
2
10/1
Nước
QU
EtOH 90o
60 phút/lần
KÈ M
* Khảo sát ảnh hưởng số lần chiết Với phương pháp chiết, dung môi chiết, tỷ lệ DM/DL đã lựa chọn, tiến hành khảo sát số lần chiết: 1 lần, 2 lần. *Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi/dược liệu
DẠ Y
Khảo sát tỷ lệ DM/DL gồm: 5/1, 10/1, 20/1 trên cơ sở đã lựa chọn phương pháp chiết, dung môi chiết qua bảng 2.5:
28
Thời gian chiết
2 2 2
CI
5/1 60 phút/lần 10/1 60 phút/lần 20/1 60 phút/lần * Khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết
Số lần chiết
OF FI
Tỷ lệ DM/DL
AL
Bảng 2.5. Bảng khảo sát tỷ lệ DM/DL chiết xuất cao lỏng Bụp giấm
Khảo sát thời gian chiết với phương pháp chiết, dung môi chiết, tỷ lệ DM/DL, số lần chiết đã lựa chọn với thông số là: 30 phút, 60 phút, 90 phút/lần. *Các thông số khảo sát của quy trình chiết xuất được tổng hợp như sau: Bảng 2.6. Các thông số khảo sát phương pháp chiết xuất Bụp giấm Thông số chiết
NH ƠN
Tên thông số Phương pháp chiết xuất
Chiết nhiệt, siêu âm
Dung môi chiết xuất
Nước, Ethanol (50, 70, 90)%
Số lần chiết
1, 2 lần
Tỷ lệ dung môi/dược liệu
5/1, 10/1, 20/1
Thời gian chiết xuất
30, 60, 90 phút/lần
Y
c. Tiêu chuẩn lựa chọn quy trình chiết xuất cao lỏng Bụp giấm
QU
+ Nồng độ acid protocatechuic chiết được từ dược liệu: Dựa vào đường chuẩn biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic, phương trình S = a × C + b.
KÈ M
+ Hàm lượng APC trong dược liệu được xác định dựa trên công thức: HL (%) =
(S−b) × V × n × 100 × 100 a x m ×(100−h) × 1000000
Trong đó: HL: Hàm lượng acid protocatechuic trong dược liệu (%) C: Nồng độ acid protocatechuic trong dung dịch thử.
DẠ Y
V: Thể tích dung dịch hòa tan mẫu thử (ml). n: Hệ số pha loãng; h: Hàm ẩm của dược liệu (%). m: Khối lượng dược liệu cân để chiết xuất (g). S: Diện tích pic acid protocatechuic (µV*s). 29
+ Hiệu suất chiết acid protocatechuic từ dược liệu: H (%) =
HLtt ×100 HLlt
Trong đó:
CI
b: Hệ số chắn của đường chuẩn.
AL
a: Hệ số góc của đường chuẩn
OF FI
HLtt : Hàm lượng APC có trong dược liệu thực tế chiết được (%). HLlt : Hàm lượng APC có trong dược liệu tính theo lý thuyết (%) 2.2.1.4. Điều chế cao lỏng Bụp giấm 1:1 từ dịch chiết
NH ƠN
Tiến hành chiết xuất theo phương pháp đã lựa chọn với mỗi mẻ 1 kg dược liệu Bụp giấm và thu dịch chiết. Dịch chiết được cô bằng thiết bị cất quay chân không, thu hồi dung môi. Cô dịch chiết đến khi thu được cao lỏng 1:1. Phần cao lỏng 1:1 này sẽ tiếp tục được sử dụng cho các nghiên cứu sau này.
QU
Y
2.2.2. Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng của cao lỏng Bụp giấm 2.2.2.1. Hình thức, cảm quan Phương pháp thử: Bằng cảm quan để đánh giá thể chất, màu sắc, mùi vị, độ đồng nhất theo phụ lục 1.1, DĐVN V [37]. 2.2.2.2. Độ tan Độ tan: Phương pháp thử theo DĐVN V, quy định chung, mục 29, trang xlviii. Thử với khoảng 1g cao, cao lỏng Bụp giấm điều chế được phải tan trong dung môi chiết xuất [37]. 2.2.2.3. Tỷ trọng
KÈ M
Phương pháp thử: Tiến hành đo tỷ trọng cao lỏng Bụp giấm bằng tỷ trọng kế theo phụ lục 6.5, dược điển Việt Nam V. Thực hiện phép đo này 3 lần [37]. 2.2.2.4. Định tính flavonoid trong cao lỏng Bụp giấm a. Định tính bằng phương pháp hóa học
DẠ Y
Lấy khoảng 0,5g cao lỏng, thêm 10 ml dung môi chiết xuất và đun nóng cho tan hết, lọc nóng qua giấy lọc. Dịch lọc thu được dùng để tiến hành các phản ứng định tính (dung dịch B) [38]:
30
AL
- Phản ứng Cyanidin
CI
Lấy 1 ml dung dịch B cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm khoảng 10mg bột magnesi kim loại. Nhỏ từ từ từng giọt HCl đậm đặc vào ống nghiệm trên (khoảng 3-5 giọt). Để yên trong vài phút.
- Phản ứng với với FeCl3 :
OF FI
Yêu cầu: Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ. Lấy 1 ml dung dịch B cho vào ống nghiệm, thêm 2 – 3 giọt dung dịch FeCl3 5%, lắc đều và để yên vài phút. Yêu cầu: Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa màu xanh đen.
NH ƠN
b. Định tính APC bằng phương pháp HPLC
Tiến hành lọc dung dịch B qua màng lọc 0,45 µm sau đó thực hiện định tính bằng phương pháp HPLC với điều kiện phân tích và dung dịch chuẩn như ở mục 2.1.2.2 (a) [38]. 2.2.2.5. Định lượng
Y
Tiến hành định lượng bằng phương pháp HPLC với điều kiện phân tích và dung dịch chuẩn như ở mục 2.2.1.2 (a).
QU
Chuẩn bị dung dịch thử: Lấy khoảng 2g cao lỏng vào bình định mức 50 ml, thêm 30 ml MeOH và lắc siêu âm 30 phút, thêm MeOH dến vạch, lắc đều thu được dung dịch A. Lọc dung dịch A qua màng lọc cỡ 0,45 µm và tiến hành định lượng bằng hệ thống HPLC.
DẠ Y
KÈ M
- Tính kết quả: Hàm lượng acid protocatechuic (%) trong cao lỏng Bụp giấm được tính theo công thức: HL (%) =
(S−b)× V × n × 100 × 100 a × m ×(100−h) × 1000000
Trong đó: a: Hệ số góc của đường chuẩn; b: Hệ số chắn của đường chuẩn. V: Thể tích dung dịch hòa tan mẫu thử (ml); n: Hệ số pha loãng. m: Khối lượng cao lỏng cân để định lượng (g). 31
AL
h: Hàm ẩm của cao lỏng Bụp giấm (%). HL: Hàm lượng acid protocetechuic trong cao lỏng Bụp giấm (%). S: Diện tích pic của mẫu thử (µV*s).
DẠ Y
KÈ M
QU
Y
NH ƠN
OF FI
CI
2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU Các số liệu được xử lý bằng thuật toán thống kê và phần mềm Microsoft Excel 2019.
32
AL
CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU CHẾ CAO LỎNG BỤP GIẤM
CI
3.1.1. Kết quả đánh giá chỉ tiêu chất lượng đầu vào dược liệu Bụp giấm
OF FI
3.1.1.1. Hàm ẩm
Kết quả xác định hàm ẩm của dược liệu Bụp giấm được thể hiện qua bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả hàm ẩm của dược liệu Bụp giấm Mẫu
Khối lượng cân (g)
1
1,0050
2
1,0141
3,26
3
1,0091
3,21
3,18
NH ƠN
X ± SD
Hàm ẩm (%)
RSD (%)
3,22 ± 0,04 1,26
Kết quả cho thấy, hàm ẩm của dược liệu Bụp giấm khoảng 3,22%.
Y
3.1.1.2. Kết quả sắc ký lớp mỏng
DẠ Y
KÈ M
QU
Sắc ký đồ khi định tính APC bằng sắc ký lớp mỏng các mẫu: dịch chiết dược liệu Bụp giấm và chất chuẩn acid protocatechuic trong hệ dung môi Ethyl acetate : Methanol : Nước với tỷ lệ 8:1:0,1 được minh họa qua hình 3.1.
A B Hình 3.1. Sắc ký đồ Sắc ký lớp mỏng tại bước sóng 254 nm (A), sau khi hơ hơi iod (B). 33
CI
3.1.1.3. Định tính flavonoid bằng phương pháp hóa học
AL
Nhận xét: Sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử tại bước sóng 254 nm (A) và dưới ánh sáng thường sau khi hơ hơi iod (B) đều cho thấy vết sắc ký có Rf và màu sắc tương tự như vết sắc ký của dung dịch chuẩn APC.
OF FI
Kết quả định tính thành phần flavonoid trong dược liệu Bụp giấm bằng phương pháp hóa học được thể hiện qua bảng sau: Bảng 3.2. Kết quả định tính flavonoid trong dược liệu Bụp giấm Phản ứng
Hiện tượng
1
Phản ứng với dung dịch FeCl3
Xuất hiện màu xanh đen
2
Kết quả Kết luận
+++
Có
Phản ứng Cyanidin
Dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ
+++
Có
Phản ứng với dung dịch NaOH
Xuất hiện tủa vàng, thêm nước cất thì tủa tan và màu vàng tăng thêm
+++
Có
Y
3
NH ƠN
STT
QU
3.1.2. Kết quả xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid protocatechuic trong dịch chiết Bụp giấm 3.1.2.1. Kết quả khảo sát điều kiện phân tích
KÈ M
Qua các tài liệu tham khảo và quá trình khảo sát thực tế, đã xác định được điều kiện sắc ký gồm: - Bước sóng cực đại: 260 nm.
DẠ Y
Vì vậy, bước sóng 260 nm được chọn để định lượng acid protocatechuic (APC) trong mẫu thử. - Khảo sát chương trình pha động: Khảo sát 2 chương trình pha động thu được sắc ký đồ của hệ dung môi 1 ở hình 3.2 và sắc ký đồ của hệ dung môi 2 ở hình 3.3.
34
AL CI OF FI
NH ƠN
Hình 3.2. Sắc ký đồ khảo sát hệ dung môi 1
Hình 3.3. Sắc ký đồ khảo sát hệ dung môi 2
Y
Nhận xét:
KÈ M
QU
Ở điều kiện khảo sát của chương trình pha động 1, khi chạy mẫu chuẩn acid protocatechuic, sắc ký đồ cho thấy pic APC không cân đối và có hiện tượng bị kéo đuôi. Ở điều kiện khảo sát của chương trình pha động 2, pic APC xuất hiện ở khoảng phút 8,3-8,4, pic nhọn, cân đối hơn, do đó lựa chọn chương trình pha động 2 với tốc độ dòng 1,0 ml/phút cho những khảo sát tiếp theo.
DẠ Y
Tiến hành chạy mẫu thử dịch chiết Bụp giấm, sắc ký đồ của chương trình pha động 2 với tốc độ dòng 1,0 ml/phút ở khoảng phút 8,3-8,4 cho thấy pic APC không tách rời ra khỏi pic tạp.
35
AL CI OF FI
NH ƠN
Hình 3.4. Sắc ký đồ dịch chiết Bụp giấm của chương trình pha động 2, tốc độ dòng 1,0 ml/phút
QU
Y
Tiến hành giảm tốc độ dòng xuống 0,6 ml/phút thì pic tách hoàn toàn so với các pic khác, thời gian lưu khoảng 9,1 phút, đồng thời sẽ giảm được chi phí dung môi.
KÈ M
Hình 3.5. Sắc ký đồ dịch chiết Bụp giấm của chương trình pha động 2, tốc độ dòng 0,6 ml/phút
Do đó, lựa chọn chương trình pha động 2 cùng với tốc độ dòng là 0,6 ml/phút cho những khảo sát tiếp theo.
DẠ Y
Các điều kiện sắc ký của phương pháp định lượng APC bằng HPLC được lựa chọn như sau: - Cột sắc ký: Phenomenex Gemini C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 μm) - Detector: PDA.
36
AL
- Nhiệt độ cột: 30oC - Thể tích tiêm: 10 µl.
CI
- Bước sóng định lượng: 260 nm. - Hệ dung môi: A - Acid trifluoroacetic (0,1%), B – ACN
OF FI
- Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút - Điều kiện gradient của pha động theo bảng 2.3
3.1.2.2. Kết quả thẩm định phương pháp định lượng a. Tính tương thích hệ thống
Kết quả xác định tính tương thích hệ thống được thể hiện ở bảng 3.3.
Nồng Mẫu độ (µg/ml)
NH ƠN
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống Diện tích pic (µV*s)
Thời gian lưu (phút)
Số đĩa lý thuyết
Hệ số bất đối xứng
10,2
489250
9,128
6254
1,09
2
10,2
481365
9,135
6130
1,11
3
10,2
476050
9,212
6224
1,12
4
10,2
483612
9,324
5998
1,08
5
10,2
487714
9,236
6180
1,09
6
10,2
489935
9,268
6248
1,10
QU
Y
1
484654±5372,3
RSD (%)
1,11
KÈ M
X ± SD
9,217±0,076 6172±97,27 1,10±0,01 0,83
1,58
1,34
DẠ Y
Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của thời gian lưu và diện tích pic APC lần lượt là 0,83 và 1,11 nằm ở khoảng cho phép (<2%), giá trị của hệ số bất đối xứng là 1,10 chứng tỏ pic cân xứng với số đĩa lý thuyết là 6172 ± 97,27. Do đó, hệ thống được sử dụng là phù hợp để phân tích định lượng APC.
37
AL
b. Độ đặc hiệu
OF FI
CI
Lần lượt tiêm mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử vào hệ thống sắc ký. Kết quả thu được thể hiện qua các hình dưới đây:
NH ƠN
Hình 3.6. Sắc ký đồ mẫu trắng
KÈ M
QU
Y
Hình 3.7. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn APC nồng độ 10 µg/ml
Hình 3.8. Sắc ký đồ dịch chiết mẫu thử Bụp giấm
Nhận xét:
DẠ Y
Kết quả cho thấy, trên sắc ký đồ của mẫu trắng là MeOH, không thấy xuất hiện pic nào có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của APC trên sắc ký đồ mẫu chuẩn (khoảng 9,128 phút).
38
AL
Trên sắc ký đồ của mẫu thử cho một pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của APC trên sắc ký đồ mẫu chuẩn (khoảng 9,190 phút).
CI
Như vậy, phương pháp đã xây dựng là đặc hiệu cho phân tích định lượng APC trong dược liệu Bụp giấm. c. Khoảng tuyến tính
OF FI
Chuẩn APC có độ tinh khiết 98%, trong quá trình cân, khối lượng mẫu chuẩn đã cân là 0,0052g, do đó kết quả xác định khoảng tuyến tính được thể hiện ở bảng 3.4. Bảng 3.4. Sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ acid protocatechuic
1,02
2
2,55
3
5,10
4
10,20
5
20,40
Hệ số ∆i (%)
75487
0,87
-14,71
170733
2,83
11,05
267099
5,08
-0,3
499520
10,51
3,12
914891
20,23
-8,34
Y
1
NH ƠN
Nồng độ chuẩn Diện tích pic Nồng độ tính theo APC (µg/ml) (µV*s) đường chuẩn (µg/ml)
STT
1000000
800000
y = 42772x + 49616 R² = 0,9984
KÈ M
Diện tích pic (µV*s)
900000
QU
Kết quả bảng trên được minh họa rõ hơn dưới dạng đồ thị ở hình 3.9:
700000 600000 500000 400000 300000 200000
DẠ Y
100000 0 0
5
10
15
20
25
Nồng độ (µg/ml)
Hình 3.9. Đồ thị tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ APC 39
CI
AL
Trong khoảng nồng độ khảo sát (1,02-20,40 µg/ml) có sự phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích. Phương trình hồi quy là y = 42772x + 49616 với hệ số tương quan R2 = 0,9984 và hệ số ∆i không vượt quá 15% đạt yêu cầu. Như vậy, đường chuẩn đã xây dựng đáp ứng các yêu cầu của phương pháp phân tích định lượng bằng HPLC.
OF FI
d. Độ lặp lại Kết quả đánh giá độ lặp lại được thể hiện ở bảng 3.5. Bảng 3.5. Kết quả đánh giá độ lặp lại Diện tích pic (µV*s)
Hàm lượng acid protocatechuic trong dược liệu (%)
Hàm lượng acid protocatechuic trong dược liệu (µg/g)
NH ƠN
Khối lượng STT dược liệu (g) 2,0122
274460
0,0135
135,00
2
2,0109
272352
0,0134
134,00
3
2,0117
274752
0,0135
135,00
4
2,0118
274176
0,0135
135,00
5
2,0126
276896
0,0136
136,00
6
2,0149
278656
0,0137
137,00
275215
0,0135 ± 0,0001
135,33 ± 1,0328
0,7631
0,7631
QU
X ± SD
Y
1
KÈ M
RSD (%)
DẠ Y
Qua kết quả bảng 3.5 cho thấy phương pháp định lượng có độ lặp lại cao với RSD = 0,7631%. Hàm lượng của APC trong mẫu dược liệu Bụp giấm là 0,0135%, tương đương với 135,33 µg/g.
40
AL
e. Độ đúng Kết quả đánh giá độ đúng được thể hiện ở bảng 3.6.
CI
Bảng 3.6. Kết quả đánh giá độ đúng Diện tích pic (chuẩn +thử) (µV*s)
Diện tích pic chuẩn tìm lại (µV*s)
Lượng tìm lại (µg)
Tỷ lệ % thu hồi
1
51
495198
219983
50,54
99,10
2
51
494261
219046
50,26
98,56
3
51
498328
223113
51,47
100,92
4
51
499790
224575
51,90
101,77
5
51
495224
220009
50,55
99,12
6
51
495583
220368
50,66
99,32
NH ƠN
OF FI
STT
Lượng chuẩn thêm vào (µg)
99,80 ± 1,25
RSD (%)
1,26
Y
X ± SD
QU
Nhận xét: Kết quả bảng 3.6 cho thấy phương pháp có độ đúng cao với tỷ lệ phần trăm tìm lại từ 98,56 % đến 101,77% (trung bình 99,80 %) so với lượng chuẩn thêm vào và RSD = 1,26 %.
KÈ M
So với yêu cầu của AOAC, chất có hàm lượng <0,1%, độ thu hồi nằm trong khoảng 90-108% cho thấy phương pháp xây dựng có độ đúng cao [41]. *Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
DẠ Y
Theo kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống sắc ký với mẫu chuẩn APC nồng độ 10,2 µg/ml ta có thời gian lưu trung bình của các mẫu là tR = 9,219 phút. Trên sắc ký đồ mẫu trắng, đo tín hiệu nhiễu đường nền trong khoảng từ 8,50 đến 9,90 phút thu được giá trị So = 754 (µV*s).
41
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát LOD, LOQ Nồng độ chất chuẩn (µg/ml)
LOD
OF FI
Diện tích nhiễu đường nền (µV*s)
0,04
2473
0,03
2267
0,02
2041
0,09
7510
0,10
7548
0,11
7598
2262
LOQ
Diện tích
NH ƠN
Chỉ tiêu
CI
AL
Tiến hành pha loãng mẫu chuẩn APC có nồng độ 1.01 µg/ml sao cho đáp ứng thu được gấp khoảng 3 lần So và 10 lần So. Đã khảo sát và xác định được giá trị LOD mà tại đó tỷ lệ tín hiệu pic/nhiễu đường nền là 3/1 và giá trị LOQ mà tại đó tỷ lệ trên là khoảng 10/1 thông qua bảng sau:
7540
Theo kết quả của bảng trên, phương pháp định lượng có giới hạn phát hiện tìm được là 0,03 µg/ml và giới hạn định lượng là 0,10 µg/ml.
Y
3.1.3. Kết quả khảo sát quy trình chiết xuất cao lỏng Bụp giấm
QU
3.1.3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng phương pháp chiết xuất Tiến hành khảo sát hai phương pháp là phương pháp chiết nóng và phương pháp chiết siêu âm. Kết quả được trình bày ở bảng 3.8.
KÈ M
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát lựa chọn phương pháp chiết xuất
Mẫu
DẠ Y
1 2 3
X ± SD RSD (%)
Hiệu suất chiết acid protocatechuic từ dược liệu (%) Phương pháp siêu âm Phương pháp hồi lưu Spic (µV*s) H (%) Spic (µV*s) H (%) 155964 56,83 121197 44,16 153132 55,79 119092 43,39 156841 57,14 122512 44,64 -
56,59 ± 0,71
-
44,06 ± 0,63
-
1,25
-
1,43
42
OF FI
CI
AL
Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.8 cho thấy, khi sử dụng 2 phương pháp chiết là chiết siêu âm và chiết nóng thì hiệu suất chiết thu được là khác nhau. Trong đó, chiết siêu âm là phương pháp cho hiệu suất chiết cao hơn với giá trị 56,59%. Ngoài ra, chiết siêu âm là phương pháp ngày nay được sử dụng nhiều trong nghiên cứu và chiết xuất dược liệu do có nhiều ưu điểm vượt trội. Do đó, lựa chọn chiết siêu âm là phương pháp để tiến hành những khảo sát tiếp theo. 3.1.3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng dung môi chiết xuất
NH ƠN
Tiến hành khảo sát các loại dung môi gồm: Nước, EtOH 50%, 70% và 90% cùng với các thông số lựa chọn như sau: phương pháp chiết siêu âm, tỷ lệ dung môi/dược liệu 10/1, chiết 2 lần với thời gian chiết là 60 phút/lần. Kết quả khảo sát được trình bày ở bảng 3.9. Bảng 3.9. Kết quả khảo sát dung môi chiết xuất Hiệu suất chiết acid protocatechuic từ dược liệu (%) Mẫu
Nước
EtOH 70%
H (%)
1
93099 33,92
119709
43,62 155964
56,83 147505 53,74
2
95140 34,66
116523
42,46 153132
55,79 142651 51,98
3
96213 35,06
113630
41,40 156841
57,14 145332 52,95
-
42,49 ± 1,11
-
56,59 ± 0,71
-
52,89 ± 0,88
-
2,61
-
1,25
-
1,67
RSD (%)
-
34,55 ± 0,58
KÈ M
-
Y
Spic (µV*s)
X± SD
1,67
Spic (µV*s)
H (%)
EtOH 90%
H (%)
QU
Spic (µV*s)
EtOH 50%
Spic (µV*s)
H (%)
DẠ Y
Từ kết quả của bảng 3.9 cho thấy: Khi sử dụng nước là dung môi chiết xuất thì hiệu suất chiết đạt được là khá thấp (34,55%). Tiến hành thay đổi dung môi từ nước thành EtOH thì hiệu suất chiết tăng đáng kể. Hiệu suất chiết là khác nhau ở mỗi nồng độ ethanol khác nhau, hiệu suất đạt cao nhất khi chiết bằng EtOH 70% với giá trị là 56,59 %. EtOH 70% cũng là dung môi có nhiều ưu điểm. Vì vậy, EtOH 70% được lựa chọn là dung môi chiết xuất cho các khảo sát tiếp theo. 43
AL
3.1.3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng số lần chiết
CI
Từ kết quả của các phần khảo sát trên, số lần chiết tiến hành khảo sát là: 1 lần, 2 lần. Kết quả khảo sát được trình bày ở bảng 3.12. Bảng 3.10. Kết quả khảo sát số lần chiết Hiệu suất chiết acid protocatechuic từ dược liệu (%) 1 lần
2 lần
OF FI
Mẫu
H (%)
Spic (µV*s)
H (%)
1
198896
48,32
245942
56,83
2
197154
47,02
239619
55,79
3
201961
49,98
240984
57,14
X ± SD
-
48,44 ± 1,48
-
56,59 ± 0,71
RSD (%)
-
-
1,25
NH ƠN
Spic (µV*s)
0,03
QU
Y
Kết quả từ bảng trên cho thấy, khi thay đổi số lần chiết từ 1 lần lên 2 lần thì lượng hoạt chất chiết được tương ứng cũng tăng lên. Ở 1 lần thì hiệu suất chiết là 48,44% và lần 2 hiệu suất chiết là 56,59%. Do đó, khi chiết với số lần là 2 lần thì cho hiệu suất chiết APC cao hơn và đồng thời tiết kiệm chi phí về dung môi cũng như thời gian chiết xuất hơn. Vì vậy, quy trình chiết xuất với số lần là 2 lần được lựa chọn cho quá trình chiết xuất dược liệu Bụp giấm và khảo sát những thông số tiếp theo. 3.1.3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi/dược liệu
DẠ Y
KÈ M
Sau khi có kết quả phương pháp chiết là chiết siêu âm và dung môi chiết là EtOH 70%, tiến hành khảo sát các tỷ lệ dung môi/dược liệu (ml/g): 5/1, 10/1, 20/1. Ấn định thông số: phương pháp chiết siêu âm, dung môi chiết EtOH 70%, chiết 2 lần với thời gian chiết là 60 phút/lần. Kết quả khảo sát được trình bày ở bảng 3.10.
44
Hiệu suất chiết acid protocatechuic từ dược liệu (%) 5/1 10/1 20/1
245942 239619 240984
X ± SD
-
RSD (%)
-
Spic (µV*s)
89,61 87,31 87,80 88,24 ± 1,21
247882 251158 246841
1,37
-
-
H (%)
Spic (µV*s)
90,17 92,81 91,98 91,65± 1,35
251174 250930 254119
0,12
-
-
H (%)
91,95 91,05 93,01 92,04 ± 0,93 1,10
NH ƠN
1 2 3
H (%)
CI
Spic (µV*s)
OF FI
Mẫu
AL
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi/dược liệu
Kết quả bảng 3.10 cho thấy: tỷ lệ dung môi/dược liệu (ml/g) tăng thì hiệu suất chiết xuất tăng. Khi tỷ lệ dung môi/dược liệu là 5/1 thì hiệu suất chiết khá cao, đạt 88,24%, đồng thời sự chênh lệch về hiệu suất chiết của các tỷ lệ 10/1 (91,65%) và 20/1 (92,04%) là không đáng kể. Để tiết kiệm dung môi, rút ngắn thời gian cô đặc dịch chiết, lựa chọn tỷ lệ 5/1 làm căn cứ cho những chỉ tiêu khảo sát tiếp theo.
Y
3.1.3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết xuất
QU
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết xuất mỗi lần được trình bày ở bảng 3.11. Bảng 3.12. Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết
KÈ M
Hiệu suất chiết acid protocatechuic từ dược liệu (%) 30 phút/lần 60 phút/lần 90 phút/lần Spic Spic Spic H (%) H (%) H (%) (µV*s) (µV*s) (µV*s) 193767 70,60 245942 89,61 228748 83,34 196874 71,73 239619 87,31 230742 84,07 198812 72,44 240984 87,80 228101 83,11 71,59 ± 88,24 ± 83,51 ± 0,93 1,21 0,50
Mẫu
DẠ Y
1 2 3
X ± SD
45
-
1,30
-
1,37
-
0,60
AL
RSD (%)
OF FI
CI
Kết quả bảng 3.11 cho thấy thời gian chiết 30 phút thì lượng hoạt chất chiết được từ dược liệu là thấp nhất với hiệu suất chiết là 71,59%. Nếu tăng thời gian chiết lên 60 phút thì hiệu suất chiết đạt được khá cao (88,24%). Nếu tiếp tục tăng thời gian chiết lên 90 phút thì hiệu suất lại có xu hướng giảm nhẹ (83,51%). Vì vậy, điều kiện chiết 60 phút/lần là lựa chọn phù hợp, vừa cho hiệu suất chiết cao nhất, vừa giúp rút ngắn thời gian quá trình sản xuất cũng như giảm chi phí về nguyên liệu. Các thông số của quy trình chiết xuất được tổng hợp như sau:
Tên thông số
NH ƠN
Bảng 3.13. Thông số của quy trình chiết xuất
Thông số chiết Siêu âm
Dung môi chiết xuất
EtOH 70%
Tỷ lệ dung môi/dược liệu
5/1
Thời gian chiết xuất
60 phút/lần
Số lần chiết
2 lần
QU
Y
Phương pháp chiết xuất
3.1.3. Kết quả xây dựng phương pháp điều chế cao lỏng Bụp giấm
DẠ Y
KÈ M
Tiến hành điều chế cao lỏng Bụp giấm theo các điều kiện đã khảo sát. Quy trình chiết xuất cao lỏng Bụp giấm được thể hiện qua hình 3.10.
46
AL CI OF FI NH ƠN Y
QU
Hình 3.10. Sơ đồ các giai đoạn điều chế cao lỏng Bụp giấm 1:1 Nội dung phương pháp điều chế cao lỏng: - Chuẩn bị nguyên liệu và thiết bị
KÈ M
+ Chuẩn bị nguyên liệu: Phần đài hoa Bụp giấm được sấy ở 70℃ đến khi
có hàm ẩm < 10%. Nghiền nguyên liệu bằng thiết bị nghiền dược liệu. Sấy tiếp bột dược liệu ở 70℃ trong 1h. Bột nguyên liệu sau khi sấy được đo hàm ẩm
DẠ Y
bằng máy đo hàm ẩm và được đóng trong túi PE kín, 2 lớp. Bảo quản nguyên liệu ở nhiệt độ phòng đến khi sử dụng. Pha EtOH 70% từ EtOH 96% với thể tích đủ cho mẻ chiết. + Kiểm tra hệ thống chiết xuất và cô cao: máy lắc siêu âm Elmasonic (Mỹ) và bộ cất quay Buchi (Thụy Sĩ) phải được kiểm tra và đánh giá tình trạng hoạt động trước khi tiến hành, phải đảm bảo sạch và không còn dư phẩm. 47
AL
- Điều chế dịch chiết + Cân chính xác khoảng 100 g bột dược liệu Bụp giấm, cho vào bình nón dung tích 1 lít.
OF FI
+ Cho phần Ethanol 70% còn lại vào bột dược liệu.
CI
+ Đong 500 ml ethanol 70% vào ống đong, làm ẩm bột dược liệu bằng một lượng ethanol 70% vừa đủ.
+ Tiến hành chiết siêu âm trong thời gian 60 phút, số lần chiết 2 lần. + Lọc dịch chiết: Gộp dịch chiết từ 2 lần chiết xuất, lọc qua phễu lọc hút chân không để thu phần dịch trong.
NH ƠN
- Tiến hành cô thành cao như mục 2.2.1.4: cao 1:1 thu được với thể tích cao là 100 ml và được loại tạp nếu cần. 3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CAO LỎNG BỤP GIẤM 3.2.1. Hình thức, cảm quan
Y
- Thể chất, màu sắc, mùi vị: Là chất lỏng sánh, màu đen tím, mùi thơm nhẹ, vị hơi chát.
DẠ Y
KÈ M
QU
- Độ đồng nhất: Cao lỏng đồng nhất, không có váng thuốc, không có cặn bã dược liệu và tạp cơ học lạ.
Hình 3.11. Thành phẩm cao lỏng Bụp giấm 1:1 48
- Độ tan: Cao tan hoàn toàn trong dung môi chiết xuất.
CI
3.2.3. Tỷ trọng
AL
3.2.2. Độ tan
Kết quả được thể hiện qua bảng sau:
OF FI
Bảng 3.14. Kết quả đánh giá tỷ trọng cao lỏng Bụp giấm Mẫu
Tỷ trọng
1
1,030
2
1,029
3
1,025
X ± SD
NH ƠN
1,028 ± 0,002
Nhận xét: Ở 25℃, tỷ trọng của cao lỏng Bụp giấm là 1,028 ± 0,002. Dựa trên kết quả thu được, tỷ trọng cao lỏng Bụp giấm đạt yêu cầu. 3.2.4. Hàm ẩm
Kết quả hàm ẩm cao lỏng Bụp giấm được thể hiện qua bảng sau: Bảng 3.15. Kết quả hàm ẩm cao lỏng Bụp giấm Khối lượng cân
Hàm ẩm (%)
1
1,0112
71,00
1,0048
71,09
1,0125
70,77
X ± SD
70,95 ± 0,17
RSD
0,23
KÈ M
3
QU
2
Y
Mẫu
Hàm ẩm của cao lỏng Bụp giấm đạt khoảng 70,95 %.
3.2.4. Định tính flavonoid trong cao lỏng Bụp giấm 3.2.4.1. Định tính bằng phương pháp hóa học
DẠ Y
Kết quả định tính cao lỏng Bụp giấm bằng các phản ứng hóa học được thể hiện qua bảng 3.16.
49
Hiện tượng
Kết quả
1
Phản ứng với dung dịch FeCl3
Xuất hiện màu xanh đen
+++
Phản ứng Cyanidin
Xuất hiện màu đỏ
2
Kết luận
CI
Phản ứng
OF FI
STT
AL
Bảng 3.16. Định tính flavonoid trong cao lỏng Bụp giấm
+++
Có
Có
Kết quả bảng 3.16 chứng tỏ mẫu cao lỏng Bụp giấm có chứa thành phần flavonoid. Kết quả định tính bằng phương pháp hóa học được thể hiện rõ hơn
Y
NH ƠN
qua hình 3.12.
QU
Phản ứng Cyanidin
Phản ứng với FeCl3
Hình 3.12. Phản ứng định tính APC trong cao lỏng Bụp giấm 3.2.4.2. Định tính bằng phương pháp HPLC
DẠ Y
KÈ M
Sắc ký đồ khi tiến hành định tính bằng HPLC của các mẫu: mẫu trắng, dung dịch chuẩn và mẫu thử cao lỏng Bụp giấm được minh họa qua các hình 3.13, 3.14, 3.15.
50
AL CI OF FI
QU
Y
NH ƠN
Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu trắng
DẠ Y
KÈ M
Hình 3.14. Sắc ký đồ mẫu chuẩn APC nồng độ 10 µg/ml
Hình 3.15. Sắc ký đồ mẫu thử cao lỏng Bụp giấm 51
CI
AL
Kết quả 3 hình trên cho thấy: Tại thời điểm khoảng 9,1 phút không thấy pic xuất hiện trên sắc ký đồ mẫu trắng, ngược lại, xuất hiện pic của acid protocatechuic trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử. Như vậy, trong cao lỏng Bụp giấm có chứa hoạt chất APC. 3.2.5. Định lượng
OF FI
Kết quả xác định hàm lượng APC của cao lỏng Bụp giấm được thể hiện ở bảng 3.17: Bảng 3.17. Kết quả định lượng APC trong cao lỏng Bụp giấm Khối lượng cân (g)
Diện tích pic (µV*s)
Hàm lượng (µg/g)
1
2,0130
359549
309,78
2
2,0158
358695
308,50
3
2,0173
358862
308,44
NH ƠN
Mẫu
X ± SD
308,91 ± 0,76
RSD (%)
0,25
DẠ Y
KÈ M
QU
Y
Kết quả bảng 3.17 cho thấy, hàm lượng acid protocatechuic trong cao lỏng Bụp giấm là 308,91 ± 0,76 µg/g.
52
AL
KẾT LUẬN Sau khi tiến hành các khảo sát và thu được kết quả, đề tài đã hoàn thành được hai mục tiêu đặt ra ban đầu:
CI
1. Đã xây dựng được quy trình điều chế cao lỏng 1:1 từ dược liệu Bụp giấm.
OF FI
- Đánh giá được một số chỉ tiêu chất lượng đầu vào của nguyên liệu hoa Bụp giấm: Hàm ẩm là 3,22%, hàm lượng acid protocatechuic là 135,33 µg/g.
NH ƠN
- Đã xây dựng được quy trình chiết xuất acid protocatechuic trong đài hoa Bụp giấm với các thông số là: phương pháp chiết là siêu âm, dung môi chiết EtOH 70%, số lần chiết 2 lần, tỷ lệ dung môi/dược liệu là 5/1, thời gian chiết 60 phút/lần. Hiệu suất chiết đạt 88,24%. Sau khi cô về cao 1:1đã thu được cao lỏng Bụp giấm. 2. Đã tiến hành đánh giá được một số tiêu chất lượng của cao lỏng Bụp giấm điều chế được.
DẠ Y
KÈ M
QU
Y
Một số chỉ tiêu chất lượng của cao lỏng Bụp giấm đã được tiến hành đánh giá gồm: hình thức cảm quan, tỷ trọng đạt 1,028, cao lỏng tan hoàn toàn trong dung môi chiết xuất, hàm ẩm cao lỏng đạt 70,95%, định tính flavonoid bằng phương pháp hóa học và định tính APC bằng HPLC, kết quả định lượng acid protocatechuic trong cao lỏng Bụp giấm là 308,91 ± 0,76 µg/g.
53
AL
KIẾN NGHỊ Dựa vào các kết quả và kết luận của quá trình nghiên cứu, có các kiến nghị như sau:
CI
- Tiếp tục khảo sát các ảnh hưởng của những yếu tố khác trong quá trình chiết xuất để hoàn thiện quy trình chiết xuất dược liệu Bụp giấm.
DẠ Y
KÈ M
QU
Y
NH ƠN
OF FI
- Tiếp tục hoàn thiện và nâng cao lên quy mô pilot, quy mô công nghiệp.
54
FI CI A
1. Bộ Y Tế (2007) Thực vật dược. Nhà xuất bản Giáo dục.
L
TÀI LIỆU THAM KHẢO
2. Võ Văn Chi (2012) Từ điển cây thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y học.
3. Da-Costa-Rocha, Inês, Sievers et al (2014) Hibiscus sabdariffa L.–A phytochemical and pharmacological review. Food Chemistry. 165: 424-443.
OF
4. Viện Dược Liệu (2002) Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam. Tập I: 271-273.
ƠN
5. Nguyễn Thị Hạnh (2017) Xác định hàm lượng canxi, sắt, kẽm trong đài hoa Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L.) bằng phương quang phổ hấp thụ và phát xạ nguyên tử. Luận văn Thạc sĩ Hóa học, Trường Đại học Khoa Học - Đại học Thái Nguyên.
NH
6. Riaz, G., Chopra, R. (2018) A review on phytochemistry and therapeutic uses of Hibiscus sabdariffa L. Biomedicine & Pharmacotherapy. 102: 575-586. 7. Mckay, Chen, Saltzman et al. (2009) Can Hibiscus tea lower blood pressure. AfroFood Industry Hi-Tech. 20(6): 40-42.
QU Y
8. Yang, Peng, Huang et al (2010) The hypolipidemic effect of Hibiscus sabdariffa polyphenols via inhibiting lipogenesis and promoting hepatic lipid clearance. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58(2): 850–859.
KÈ
M
9. Lin, Sheu, J. Y., Chan, K.C. et al (2012) Hibiscus sabdariffa L. leaf induces apoptosis of human prostate cancer cells in vitro and in vivo. Food Chemistry. 132(2): 880–891. 10. Clifford, M. et al (2003) Hierarchical scheme for LC-MS n identification of chlorogenic acids. Journal of agricultural and food chemistry. 51(10): 2900-2911.
DẠ
Y
11. Alarcon-Alonso, J., Zamilpa, A., Aguilar et al (2012) Pharmacological characterization of the diuretic effect of Hibiscus sabdariffa Linn (Malvaceae) extract. Journal of Ethnopharmacology. 139(3): 751–756.
FI CI A
L
12. Abou-Arab, A. A., Abu-Salem et al (2011) Physico-chemical properties of natural pigments (anthocyanin) extracted from Roselle calyces (Hibiscus subdariffa). Journal of American Science. 7(7): 445-456.
13. Jabeur, I., Pereira, E., Barros et al (2017) Hibiscus sabdariffa L. as a source of nutrients, bioactive compounds and colouring agents. Food Research International. 100: 717-723.
OF
14. Wong, P. K., Yusof et al (2002) Physico‐chemical characteristics of roselle (Hibiscus sabdariffa L.). Nutrition & Food Science. 32(2): 68-73
ƠN
15. Tsai, McIntosh, Pearce, P., Camden et al (2002) Anthocyanin and antioxidant capacity in Roselle (Hibiscus sabdariffa L.) extract. Food research international. 35(4): 351-356.
NH
16. Luvonga, W., Njoroge, M. S. et al. (2012) Chemical characterisation of Hibiscus sabdariffa (Roselle) calyces and evaluation of its functional potential in the food industry. Scientific Conference Proceedings. 31: 631-638.
QU Y
17. Lin, W. L., Hsieh, Y. J., Chou, F. P et al (2003) Hibiscus protocatechuic acid inhibits lipopolysaccharide-induced rat hepatic damage. Archives of Toxicology. 77: 42-47. 18. Afolabi, O. C., F. T. et al (2008) Susceptibility of cariogenic Streptococcus mutans to extracts of Garcinia kola, Hibiscus sabdariffa L., and Solanum americanum. The West African Journal of Medicine. 27(4): 230-233.
KÈ
M
19. Chao, C. Y., & Yin, M. C. (2009) Antibacterial effects of roselle calyx extracts and protocatechuic acid in ground beef and apple juice. Foodborne Pathogens and Disease. 6(2): 200-209.
Y
20. Tanaka, T., M. et al (2011) Potential cancer chemopreventive activity of protocatechuic acid. Journal of Experimental & Clinical Medicine. 3(1): 27-33.
DẠ
21. Woottisin, S., Hossain et al (2011) Effects of Orthosiphon grandiflorus, Hibiscus sabdariffa and Phyllanthus amarus extracts on risk factors for urinary calcium oxalate stones in rats. The Journal of urology. 185(1): 323-328.
FI CI A
L
22. Gosain, S., Ircchiaya et al (2010) Hypolipidemic effect of ethanolic extract from the leaves of Hibiscus sabdariffa L. in hyperlipidemic rats. Acta Pol Pharm. 67(2): 179-184. 23. Inuwa, I., Ali et al (2012) Long-term ingestion of Hibiscus sabdariffa calyx extract enhances myocardial capillarization in the spontaneously hypertensive rat. Experimental Biology and Medicine. 237(5): 563-569.
ƠN
OF
24. Peng. C. H., Chyau, C. Chan et al (2011) Hibiscus sabdariffa polyphenolic extract inhibits hyperglycemia, hyperlipidemia, and glycation-oxidative stress while improving insulin resistance. Journal of agricultural and Food Chemistry. 59(18): 9901-9909. 25. Kakkar, S., & Bais, S. (2014) A review on protocatechuic acid and its pharmacological potential. International Scholarly Research Notice. 23: 1-9.
NH
26. Li X, C., D. et al (2011) Antioxidant activity and mechanism of protocatechuic acid in vitro. Functional Foods in Health and Disease. 7: 232–244.
QU Y
27. Scazzocchio B, Varì R, Filesi C, et al. (2011) Cyanidin-3-O-β-glucoside and protocatechuic acid exert insulin-like effects by upregulating PPARγ activity in human omental adipocytes. Diabetes. 60(9): 2234-2244. 28. Lende AB, Kshirsagar AD, Deshpande AD et al. (2011) Anti-inflammatory and analgesic activity of protocatechuic acid in rats and mice. Inflammopharmacology. 19(5): 255-263.
KÈ
M
29. Borate, A. R., Suralkar et al (2011) Antihyperlipidemic effect of protocatechuic acid in fructose induced hyperlipidemia in rats. International Journal of Pharma and Bio Sciences. 2(4): 456-460.
DẠ
Y
30. Ciftci O, Disli OM, Timurkaan N. (2013) Protective effects of protocatechuic acid on TCDD-induced oxidative and histopathological damage in the heart tissue of rats. Toxicology and Industrial Health. 29 (9): 806–811.
FI CI A
L
31. Liu C-L, Wang J-M, Chu C-Y et al (2002) In vivo protective effect of protocatechuic acid on tert-butyl hydroperoxide-induced rat hepatotoxicity. Food and Chemical Toxicology. 40 (5): 635-641.
32. Guan, S., Bao et al (2006) Protective effect of protocatechuic acid from Alpinia oxyphylla on hydrogen peroxide-induced oxidative PC12 cell death. European journal of pharmacology. 538(1-3): 73-79.
OF
33. Bộ Y tế (2007). Kỹ thuật sản xuất dược phẩm. Nhà xuất bản Y học.
ƠN
34. Vũ Bình Dương, Nguyễn Hoàng Ngân và cs (2017) Xây dựng phương pháp định lượng polyphenol toàn phần trong đài Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L.) bằng quang phổ UV-Vis. Tạp chí Y – Dược học Quân sự. 8: 7-13.
NH
35. Lê Thị Lan Phương, Phạm Huy Kiến Tài, Nguyễn Phương Dung (2014) Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L.) trên chuột nhắt tổn thương tế bào gan cấp tính bằng ethanol. Trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh, Thành phố Hồ Chí Minh.
QU Y
36. Hội Hóa học Việt Nam (2018), Nghiên cứu quy trình chiết xuất phân đoạn giàu hợp chất polyphenol từ loài Hibiscus sabdariffa L. (Malvaceae) ứng dụng chế tạo thực phẩm chức năng. Nhiệm vụ khoa học cấp Bộ, Bộ Công Thương. 37. Bộ Y tế (2017) Dược điển Việt Nam V. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 38. Bộ môn Dược liệu (1998) Bài giảng dược liệu, tập I, Trường Đại học Dược Hà Nội.
KÈ
M
39. Fernández-Arroyo, S., Rodríguez-Medina et al (2011) Quantification of the polyphenolic fraction and in vitro antioxidant and in vivo anti-hyperlipemic activities of Hibiscus sabdariffa aqueous extract. Food research international. 44(5): 1490-1495.
DẠ
Y
40. ICH guidelines (2005) Q2 (R1) validation of analytical procedures: text and methodology. 41.AOAC International (2012), Appendix K: Guidelines for Dietary Supplements and Botanicals, USA.
DẠ
Y
KÈ
M
QU Y
NH
ƠN
OF
FI CI A
PHỤ LỤC 1. PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC
L
PHỤ LỤC