NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG DIUMANCAL TRONG VIÊN NÉN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO by Dạy Kèm Quy Nhơn Official

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG DIUMANCAL TRONG VIÊN NÉN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO WORD VERSION | 2022 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL COM ĐỊNH LƯỢNG DIUMANCAL TRONG VIÊN NÉN Ths Nguyễn Thanh Tú eBook Collection Hỗ trợ trực tuyến Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon Mobi/Zalo 0905779594 vectorstock com/24597468 Tài liệu chuẩn tham khảo Phát triển kênh bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật : Nguyen Thanh Tu Group

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y CHU THỊ THẮM NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG DIUMANCAL TRONG VIÊN NÉN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Giáo viên hướng dẫn: 1. TS. Nguyễn Công Bàng 2. ThS. Nguyễn Hồng Hải HÀ NỘI 2022

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc Học viện, Phòng đào tạo, Viện đào tạo Dược, cùng toàn thể các thầy cô giáo và các kỹ thuật viên trường Học viện Quân y đã dạy dỗ và cung cấp cho em những kiến thức về ngành Dược, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt 5 năm học tập tại trường cũng như thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp này. Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn và kính trọng sâu sắc tới TS. Nguyễn Công Bàng và ThS. Nguyễn Hồng Hải, thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và động viên em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô giáo và các kỹ thuật viên của bộ môn Hóa dược Dược lâm sàng đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để em có khoảng thời gian học tập và làm khóa luận được hoàn thiện nhất. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn động viên, quan tâm giúp em hoàn thành khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn. Hà Nội, ngày 19 tháng 06 năm 2022 Học viên Chu Thị Thắm

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT LAI NHÓM COUMARIN 2 1.1.1. Hợp chất lai nhóm courmarin 2 1.1.2. Tác dụng sinh học của hợp chất lai nhóm coumarin 2 1.1.3. Các thuốc nhóm coumarin 3 1.2. TỔNG QUAN VỀ DIUMANCAL 4 1.2.1. Công thức hóa học 4 1.2.2.Tính chất lý hóa........................................................................................5 1.2.3. Dược động học 5 1.2.4. Tác dụng dược lý.....................................................................................6 1.2.5. Chỉ định, liều dùng 6 1.2.6. Tác dụng không mong muốn, chống chỉ định.........................................7 1.2.7. Thận trọng...............................................................................................7 1.2.8. Một số phương pháp định lượng diumancal...........................................7 1.3. TỔNG QUAN VỀ HPLC ..........................................................................8 1.3.1. Khái niệm................................................................................................8 1.3.2. Các thông số đặc trưng............................................................................9 1.3.3. Các phương pháp định lượng bằng HPLC............................................10 1.3.4. Thẩm định quy trình phân tích..............................................................10 1.3.4.1. Độ tương thích hệ thống.....................................................................11

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 1.3.4.2. Độ đặc hiệu 11 1.3.4.3. Khoảng tuyến tính 11 1.3.4.4. Độ chính xác 12 1.3.4.5. Độ đúng 12 1.3.4.6. Giới hạn phát hiện..............................................................................13 1.3.4.7. Giới hạn định lượng 13 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 14 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 14 2.1.2. Hóa chất, dung môi 14 2.1.3. Dụng cụ, thiết bị 14 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng 15 2.2.1.1. Khảo sát bước sóng phân tích............................................................15 2.2.1.2. Khảo sát hiệu lực cột phân tích 15 2.2.1.3. Khảo sát thành phần pha động ..........................................................16 2.2.1.4. Khảo sát tỷ lệ dung môi pha động 16 2.2.1.5. Khảo sát tốc độ dòng..........................................................................17 2.2.2. Thẩm định phương pháp phân tích .......................................................17 2.2.2.1. Tính tương thích hệ thống ..................................................................17 2.2.2.2. Độ đặc hiệu chọn lọc .........................................................................18 2.2.2.3. Khoảng tuyến tính ..............................................................................18 2.2.2.4. Độ chính xác ......................................................................................19 2.2.2.5. Độ đúng ..............................................................................................20 2.2.2.6. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)................20 2.2.3. Định lượng diumancal trong viên nén ..................................................21

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ 21 2.4. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 21 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 22 3.1.1. Kết quả khảo sát bước sóng phân tích 22 3.1.2. Kết quả khảo sát hiệu lực cột 22 3.1.3. Kết quả khảo sát thành phần pha động 23 3.1.4. Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi pha động 25 3.1.5. Kết quả khảo sát tốc độ dòng 27 3.2. KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 29 3.2.1. Tính tương thích hệ thống 29 3.2.2. Độ đặc hiệu 30 3.2.3. Khoảng tuyến tính 31 3.2.4. Độ chính xác .........................................................................................32 3.2.5. Độ đúng 34 3.2.6. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ...........................................35 3.3. KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG DIUMANCAL TRONG VIÊN NÉN 36 KẾT LUẬN.....................................................................................................38 KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Các thuốc nhóm coumarin 3 1.2 Một số phương pháp định lượng diumancal 8 2.1 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 14 2.2 Các thông số cột được khảo sát 16 2.3 Các loại pha động 16 2.4 Các tỷ lệ dung môi pha động được khảo sát 16 3.1 Kết quả khảo sát hiệu lực cột 22 3.2 Kết quả khảo sát hệ dung môi 24 3.3 Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi pha động 25 3.4 Kết quả khảo sát tốc độ dòng 27 3.5 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống sắc ký 29 3.6 Sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ diumancal 31 3.7 Kết quả khảo sát độ lặp lại 32 3.8 Kết quả độ chính xác trung gian 33 3.9 Kết quả hàm lượng diumancal trong 2 ngày 34 3.10 Kết quả khảo sát độ đúng 35 3.11 Kết quả xác định LOD và LOQ 36 3.12 Kết quả định lượng diumancal trong viên nén 36

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Cấu trúc hóa học của hợp chất coumarin 2 1.2 Cấu trúc hóa học của diumancal 5 3.1 Phổ hấp thụ của diumancal có thời gian lưu là 9,5 phút 22 3.2 Sắc ký đồ của dung dịch diumancal chuẩn nồng độ 20 μg/ml khi sử dụng cột Agilent 23 3.3 Sắc ký đồ của dung dịch diumancal chuẩn nồng độ 20 μg/ml khi sử dụng cột Phenomenex 23 3.4 Sắc ký đồ của diumancal khi sử dụng dung môi MeOH: H2O/HCOOH 0,1% (50,50,v/v) 24 3.5 Sắc ký đồ của diumancal khi sử dụng dung môi ACN: H2O/HCOOH 0,1% (50,50,v/v) 24 3.6 Sắc ký đồ của mẫu dung dịch diumancal chuẩn với tỷ lệ dung môi 60/40 25 3.7 Sắc ký đồ của mẫu dung dịch diumancal chuẩn với tỷ lệ dung môi 50/50 25 3.8 Sắc ký đồ của mẫu dung dịch diumancal chuẩn với tỷ lệ dung môi 40/60 26 3.9 Sắc ký đồ dung dịch diumancal chuẩn ở tốc độ dòng 0,6ml/phút 27 3.10 Sắc ký đồ dung dịch diumancal chuẩn ở tốc độ dòng 27 3.11 Sắc ký đồ dung dịch diumancal chuẩn ở tốc độ dòng 1ml/phút 28 3.12 Sắc kí đồ mẫu trắng 30 3.13 Sắc kí đồ mẫu chuẩn 30 3.14 Sắc ký đồ mẫu thử 30 3.15 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của diumancal 32

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt và ký hiệu Giải thích 1 ACN Acetonitril 2 HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao 3 LOD Giới hạn phát hiện 4 LOQ Giới hạn định lượng 5 MeOH Methanol 6 ED50 Liều lượng hiệu quả trung bình 7 LD50 Liều gây chết trung bình 8 PT Thời gian prothrombin

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh tim mạch là bệnh lý phổ biến, chiếm 1/3 nguyên nhân tử vong trên thế giới và để lại nhiều gánh nặng cho xã hội. Mỗi năm có tới 17,5 triệu người tử vong do bệnh lý về tim mạch và các biến chứng của nó [1]. Trong đó, các cơn đau thắt ngực hay bệnh lý tăng huyết áp gây ra nhiều biến chứng và di chứng nguy hiểm. Nếu không được chẩn đoán và điều trị kịp thời sẽ có thể dẫn đến nguy cơ đột quỵ, tai biến mạch máu não, suy thận,... ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người bệnh và trở thành gánh nặng cho gia đình và xã hội. Do vậy, các thuốc điều trị bệnh lý về tim mạch ngày càng được chú trọng phát triển trong nhiệm vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng. Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của khoa học, các dẫn chất coumarin và hợp chất lai của chúng ngày càng cho thấy tiềm năng lớn trong điều trị nhiều loại bệnh lý khác nhau. Các nghiên cứu đã cho thấy rằng dẫn chất coumarin mang lại hiệu quả cao khi điều trị huyết khối tĩnh mạch, phòng ngừa thuyên tắc hệ thống rung nhĩ hoặc van tim nhân tạo, phòng ngừa nguy cơ đột quỵ và nhồi máu cơ tim [2 4]. Diumancal là một trong những loại dược chất quan trọng từ các dẫn xuất của coumarin và có phổ hoạt tính sinh học rộng rãi. Diumancal được biết đến như một chất chống loạn nhịp tim [5 7], an thần [8] và chống đông máu [8]. Diumancal được Cục quản lý dược - Liên Bang Nga cấp phép năm 1996 và sử dụng dưới nhiều tên thương mại khác nhau như Ancardin, Diumancal-forte, Ancardin forte… với chỉ định điều trị bệnh thiếu máu cơ tim ở người lớn [7,9]. Phát triển các nghiên cứu về diumancal là một hướng mới tại Việt Nam, tạo điều kiện cho bệnh nhân có thêm lựa chọn thuốc trong điều trị. Vì vậy, việc kiểm tra chất lượng thuốc nhằm đảm bảo hiệu quả điều trị và an toàn cho người sử dụng là một tiêu chí quan trọng. Từ lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu định lượng diumancal trong viên nén bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” với hai mục tiêu: 1. Khảo sát và điều kiện phân tích định lượng diumancal trong viên nén bằng HPLC.2.Thẩm định phương pháp đã xây dựng được theo quy định của ICH.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT LAI NHÓM COUMARIN 1.1.1. Hợp chất lai nhóm courmarin Coumarin có công thức C9H6O2 hay 2H-1-benzopyran-2-on và các dẫn xuất của nó là một nhóm hợp chất lớn các hợp chất tự nhiên phân bố rộng rãi trong giới thực vật. Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất coumarin Coumarin có nhiều tác dụng sinh học, là một nhóm đầy tiềm năng trong việc điều trị bệnh. Vì vậy, nhóm hợp chất coumarin được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Hiện nay, các hợp chất lai coumarin đóng vai trò ngày càng quan trọng trong việc nghiên cứu dược chất mới để điều trị các bệnh đa nhân tố. Các hợp chất lai coumarin này được phân loại dựa trên tác dụng điều trị bệnh của từng nhóm hợp chất. Sau đó, đưa ra các đặc điểm cấu trúc liên quan đến tác dụng sinh học để tìm ra mối quan hệ giữa cấu trúc và tác dụng. Chính nhờ điều này, các nhà khoa học có thể dễ dàng tổng hợp ra các chất lai mới có hiệu quả điều trị vượt trội [10]. 1.1.2. Tác dụng sinh học của hợp chất lai nhóm coumarin Hợp chất lai nhóm coumarin được các nhà nghiên cứu đặc biệt quan tâm do có nhiều tác dụng sinh học của chúng. Gần đây, sự kết hợp của coumarin với các hợp chất khác nhau tạo ra sự đa dạng về sự cải thiện tác dụng tác dụng dược lý và chỉ ra các tác dụng sinh học mới. Sử dụng cách tiếp cận này, một số nhóm nghiên cứu đã tổng hợp ra các dẫn xuất lai nhóm coumarin bằng cách kết hợp coumarin với các dẫn chất có hoạt tính sinh học khác nhau như chalcon, idol, benzimidazol và nhiều chất khác. Những nghiên cứu này đã tạo ra bước ngoặt mới với hợp chất lai có

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 3 nhiều tác dụng dược lý đa dạng, cụ thể là tác dụng chống đông máu [11], chống ung thư [12], tác dụng kháng khuẩn[13], tác dụng trên hệ thần kinh [14] và tác dụng chống oxy hóa, chống viêm... [15]. 1.1.3. Các thuốc nhóm coumarin Coumarin và các dẫn chất lai của nó có phổ tác dụng sinh học tương đối rộng. Trong thời gian gần đây, rất nhiều nhà khoa học và các công ty dược đã nghiên cứu và bào chế ra các chế phẩm từ nhóm hoạt chất này nhằm mục đích tìm ra những thuốc mới ứng dụng trong phòng và điều trị bệnh. Một số thuốc thuộc nhóm coumarin được trình bày ở bảng 1.1. Bảng 1.1. Các thuốc nhóm coumarin Hoạt chất Biệt dược Dạng bào chế Công ty, quốc gia sản xuất AcenocoumarolThu ốc chống đông máu Synthrom Viên nén 4mg, có vạch chia ¼ Novartis (Pháp, Úc, Đức) Mini synthrom Viên nén 1mg Novartis (Pháp) Coarol Viên nén Andromaco (Chile) Sintrom Mitis Viên nén Novartis (Hà Lan) ThuWarfarin ốc chống đông máu Coumadine Viên nén 2mg có vạch chia Bristol Myers Squibb (Pháp) Viên nén 5mg có vạch chia Bristol Myers Squibb (Pháp) Warfarex Viên nén Grindex (Nga) Panwarfin Viên nén Abbott (Hy Lạp) Orfarin Viên nén Orion DrogsanSingapore,(Malaysia,TháiLan),(Th ổ Nhĩ Kỳ) NycomedWarfarin Viên nén Nycomed Danmark ApS (Đan Mạch)

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 4 Univarfin Viên nén Unichem (Ấn Độ) Marevan Viên nén Sigma Therabel(Úc)(Bỉ) Nycomed (Na Uy) Orion (Fijandia) GSKGoldshield(Singapore)(M ỹ) Zantoven Viên nén Phòng thí nghiệm Upsher Smith, INC (Hoa Kỳ) PhenprocoumonThu ốc chống đông máu MarcumarMarcoumar,vàFalithrom Viên nén 3mg Viên nén bao phim3mg1,5mg, Đức HymecoromonThu ốc lợi mật, bảo vệ gan, chống co thắt Cantabiline Viên nén, viên nang Cộng hòa (Pháp)MerckSécLipha Isohol Dung dịch tiêm truyền Zentiva (Cộng hòa Séc) Odeston Viên nén Pabianice (Nga) BiscumacetateEthylThu ốc chống đông máu PelentanettaePelentan Viên nén Leciva (Cộng hòa Séc) 1.2. TỔNG QUAN VỀ DIUMANCAL 1.2.1. Công thức hóa học

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 5 Công thức cấu tạo: Hình 1.2. Công thức cấu tạo của diumancal Công thức phân tử: C20H14O6. Khối lượng phân tử 350,079 Tên khoa học: 7,7 etylenglycol 2H 1 dibenzopyran 2,2’ dion [16]. 1.2.2.Tính chất lý hóa Bột kết tinh trắng hoặc gần trắng. Nhiệt độ nóng chảy 236 240oC [16]. Độ tan: Diumancal ít tan trong chloroform, dimethlylformamid, khó tan trong ethanol 95%, rất khó tan trong nước. Diumancal phát huỳnh quang ở bước sóng 365 nm màu xanh lam. - Về tính chất hóa học: Diumancal có phản ứng đóng mở vòng lacton khi gặp các tác nhân axit hoặc base. Tính chất này được sử dụng làm phương pháp định lượng hoạt chất trong các chế phẩm. 1.2.3. Dược động học Hấp thu: Đồng thời, người ta thấy rằng nồng độ tối đa (Cmax = 1,32 μg / ml), thời gian đạt được (Tmax = 2 giờ) và nồng độ cân bằng ổn định (1,02 0,83 μg / ml) của thuốc trong huyết tương giữ được 8 giờ. Phân bố: Hầu hết các diumancal được sử dụng (lên đến 55%) liên kết với protein huyết tương, điều này có thể quy nó vào các chất có mức độ liên kết với protein huyết tương trung bình. Phần không có protein của thuốc được phân bố nhanh chóng trong tất cả các cơ quan và mô. Chuyển hóa và thải trừ: Vì diumancal chứa một liên kết ete nên nó dễ dàng chuyển hóa. Trong trường hợp này, 7 hydroxy 2H 1 benzopyran 2 one được hình thành, không có tác dụng về mặt dược lý và được thải ra khỏi cơ

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 6 thể qua thận. Một phần nhỏ (dưới 0,3%) hoạt chất ở dạng không thay đổi cũng được tìm thấy trong nước tiểu. Sau 13 giờ, chất diumancal thực tế không được phát hiện trong cơ thể. Vì vậy, để duy trì nồng độ diumancal trong máu không đổi, bệnh nhân phải uống thuốc viên 3 lần một ngày. Do đó, các dạng bào chế khác của thuốc có tác dụng kéo dài (Ancardin chậm AZT 0,02 g ở dạng viên nén và Ancardin AZT 0,1% trong dung dịch tiêm, 1 ml) đã được nghiên cứu và bào chế. Các dạng bào chế này cho phép không chỉ giảm số lần uống thuốc, duy trì nồng độ cân bằng mong muốn của hoạt chất của thuốc trong cơ thể trong thời gian dài, mà còn làm tăng đáng kể sinh khả dụng của thuốc [5][18]. 1.2.4. Tác dụng dược lý Thuộc nhóm thuốc: chống đau thắt ngực, hạ huyết áp, chống loạn nhịp tim. Thuốc chẹn kênh calci chậm có tính chọn lọc. Do có tác dụng phong bế các thụ thể của các kênh calci tạo ra điện thế trong tế bào cơ trơn mạch máu và cơ tim nên diumancal ức chế sự di chuyển của các ion calci qua màng. Khi cơ tim thiếu máu cục bộ cấp tính, sẽ gây ra tình trạng thiếu oxy cho cơ tim và động mạch vành. Thuốc có tác dụng tăng cung cấp oxy, tăng lưu lượng máu chuyển đến vùng thiếu máu cụ bộ. Từ đó, nó có tác dụng chống loạn nhịp tim và hạ huyết áp hiệu quả. Ngoài ra, thuốc còn giúp khôi phục chức năng chuyển hóa năng lượng và protein, giúp cân bằng điện giải trong cơ thể. Vì vậy, nó có tác dụng hạ huyết áp, chống oxy hóa, an thần và giảm đau [19]. 1.2.5. Chỉ định, liều dùng Chỉ định: - Điều trị cơn đau thắt ngực mãn tính. - Điều trị cơn đau thắt ngực không ổn dịnh. - Điều trị đau thắt ngực biến thể [20].

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 7 Liều dùng: Điều trị trong vòng 14 ngày. Liều thông thường: Mỗi lần uống 10mg diumancal, ngày 3 lần. Nếu cần thiết, có thể tăng liều lên 20 30mg/lần, ngày 3 lần, trong vòng 5 7 ngày, sau đó dùng liều duy trì 10mg/lần [19]. 1.2.6. Tác dụng không mong muốn, chống chỉ định Tác dụng không mong muốn: Chóng mặt, buồn ngủ, tăng hưng phấn thần kinh, hôn mê, buồn nôn, nôn, táo bón, tăng nhẹ enzym transaminase ở gan, ngứa, phát ban da, cảm giác mệt mỏi, đỏ bừng mặt, phù ngoại vi,...[19]. Chống chỉ định: Quá mẫn với diumancal hay bất kỳ thành phần nào của thuốc. Không dùng cho người có nhịp tim quá chậm, block nhĩ thất độ II III mà không dùng máy chạy tim nhân tạo, tâm phế mạn giai đoạn IIB III, suy tim cấp, sử dụng đồng thời với các thuốc chẹn β, rối loạn xoang thất, hội chứng suy nút xoang, hội chứng Wolff Parkinson White (WPW), phụ nữ có thai và cho con bú, trẻ dưới 18 tuổi [19]. 1.2.7. Thận trọng Cần thận trọng khi dùng cho các trường hợp: Block nhĩ thất độ I, suy tim mạn tính độ I và II, hạ huyết áp động mạch (< 100 mmHg), nhịp tim chập, rối loạn chức năng gan [19]. 1.2.8. Một số phương pháp định lượng diumancal 1.2.8.1. Phương pháp chuẩn độ thể tích Có thể định lượng diumancal bằng phương pháp chuẩn độ acid base, phát hiện điểm tương đương bằng phương pháp đo điện thể hoặc bằng chỉ thị xanh thymol. Phương pháp này thường áp dụng trong định lượng diumancal nguyên liệu hoặc trong chất chuẩn. Tiến hành bằng cách hòa tan diumancal trong ethanol 95%, thêm vào 0,1 M dung dịch NaOH trong bình nón có nút mài, đun nóng trên bếp cách thủy có lắp sinh hàn hồi lưu trong 60 phút. Sau đó làm lạnh hỗn hợp thu được, thêm vào dung dịch một lượng ether. Lượng NaOH dư được chuẩn độ bằng

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 8 dung dịch 0,1 M HCl đến khi dung dịch chuyển màu vàng với chỉ thị xanh thymol. 1 ml HCl 0,1 M tương đương với 0,03644 g C20H14O6. 1.2.8.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Diumancal ít phân cực, cần chọn pha động phân cực mạnh để rửa giải, phù hợp với kỹ thuật HPLC pha đảo. Một số công trình công bố về định lượng diumancal bằng phương pháp HPLC được thể hiện ở bảng 1.2 dưới đây. Bảng 1.2. Một số phương pháp định lượng diumancal Mẫucnghiên ứu Cột Pha động Thờ giani lưu Tốc độ dòng Thể tiêmtích Tác giả Diumancalt ổng hợp SymmetryC18,5µm,(4.6x250mm) ACN: nướ (90/10)c 9,88 (ph0,2±út) ml/phút1 20 μl Abyshev, A. I.Zhurkovich,Z.,K.,Agaev(2017)[16] Viên forteDiumancalnén(0,01g) Cột C18, 5 (4.6µm,x250mm) ACN: nướ (50/50)c (9,88phút) ml/phút1 10 μl Abyshev, A. ZhurkovichZ.,(2007)[17] 1.3. TỔNG QUAN VỀ HPLC 1.3.1. Khái niệm Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - High Performance Liquid Chromatography) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng, dưới áp suấtPhacao.tĩnh có thể là chất rắn được phân chia dưới dạng tiểu phân, chất lỏng được lên trên bề mặt một chất rắn, hoặc chất rắn đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ.

Tùy thuộc vào bản chất của các pha, kỹ thuật và phương tiện sắc ký mà người ta chia làm nhiều loại sắc ký khác nhau: Sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ, sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học. Trong đó, phương pháp sắc ký lỏng phân bố được sử dụng phổ biến nhất hiện nay [20,21]. gian lưu để định tính các chất có trong cột. Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố: Bản chất, thành phần, tốc độ rửa giải của pha động. Bản chất sắc ký pha tĩnh, kích thước, cấu trúc hạt,... Cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan và các nhóm thế. Ngoài ra, trong một số trường hợp nồng độ tạo phức, pH pha động nếu các yếu tố này ảnh hưởng đến cân bằng động của quá trình sắc ký. Hệ số phân bố K: là hệ số phân bố ở trạng thái cân bằng, xác định tốc độ trung bình của mỗi vùng chất tan do pha động vận chuyển khi nó đi qua cột. K càng lớn thì sự di chuyển chất tan qua pha tĩnh càng chậm. Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K cách nhau càng xa thì khả năng tách dễ dàng hơn. Hệ

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 9

số đối xứng pic F: F = �� 2�� Trong đó: W: Chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic. a: Khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic. Thông thường, giá trị F nằm trong khoảng 0,8 1,5 là giá trị có thể được chấp nhận.

1.3.2. Các thông số đặc trưng Thời gian lưu tR: Là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất tan được rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại. Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là không đổi. Vì vậy, có thể dùng thời

1.3.4. Thẩm định quy trình phân tích Khi thẩm định phương pháp phân tích nói chung và thẩm định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC nói riêng là quá trình thực hiện các

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 10 Số đĩa lý thuyết (N): Với một cột xác định, hiệu suất phân tách được thể hiện qua số đãi lý thuyết. Với số đĩa lý thuyết càng cao thì hiệu lực cột càng tốt. Số đĩa lý thuyết cần > 2000 [22]. Độ phân giải Rs: Độ phân giải đánh giá khả năng tách 2 chất trên sắc ký đồ cho 2 pic liền kề. Yêu cầu Rs > 1, giá trị tối ưu Rs = 1,5 [20, 21, 23]. 1.3.3. Các phương pháp định lượng bằng HPLC Có 4 phương pháp định lượng bằng HPLC thường dùng: Phương pháp chuẩn ngoại: Là phương pháp định lượng cơ bản trong đó cả hai mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Sau đó so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu chuẩn. Từ đó, sẽ tính được nồng độ chất cần phân tích trong mẫuPhươngthử.pháp chuẩn nội: Thêm vào cả mẫu chuẩn lẫn mẫu thử những lượng bằng nhau của một chất tinh khiết, rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Chất được thêm được gọi là chất chuẩn nội. Từ kết quả phân tích về diện tích (hoặc chiều cao) pic và hàm lương (hoặc nồng độ) của chuẩn, chuẩn nội và mẫu thử, xác định được hàm lượng của chất cần định lượng trong mẫu thử một cách chính xác. Phương pháp thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử những lượng đã xác định của các chất chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử. Sau đó, tiến hành xử lý mẫu và chạy sắc ký trong cùng một điều kiện. Nồng độ cần xác định của mẫu thử được tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ của chất thêm vào và sự gia tăng của diện tích pic hay chiều cao của pic. Phương pháp chuẩn hóa diện tích: Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc ký [20,21].

Có tính thực tế: phương pháp đề phải có tính khả thi và phù hợp với điều kiện thực tế. - Có tính kinh tế: phương pháp đề ra tốn ít kinh phí nhưng vẫn đảm bảo được tính chính xác. - Có tính an toàn cao: an toàn lao động và bảo vệ sức khỏe con người. Các đặc tính thực hành tiêu biểu của một phương pháp phân tích gồm có: 1.3.4.1. Độ tương thích hệ thống Kiểm tra tính tương thích hệ thống là một phần không thể tách rời trong nhiều quy trình phân tích. Đánh giá tính thích hợp của hệ thống là những phép thử nhằm đánh giá tính thích hợp của toàn hệ thống phân tích được cấu thành bởi các yếu tố như máy móc thiết bị, hệ thống điện, cách tiến hành phân tích và mẫu thử. Các thông số của phép thử tính tương thích của hệ thống được thiết lập cho từng quy trình riêng biệt phụ thuộc vào loại quy trình được thẩm định. Thông số này đặc biệt quan trọng trong các phương pháp sắc ký [24]. 1.3.4.2. Độ đặc hiệu Tính đặc hiệu là khả năng đánh giá chắc chắn một chất phân tích khi có mặt các thành phần khác có thể có trong mẫu thử. Thông thường các thành phần này gồm các tạp chất, sản phẩm phân huỷ, chất nền… Nói cách khác, tính đặc hiệu thể hiện khả năng nhận diện chính xác chất cần phân tích và không bị nhầm lẫn bởi các chất khác [24]. 1.3.4.3. Khoảng tuyến tính Tính tuyến tính được đánh giá bằng cách quan sát đồ thị của tín hiệu ứng với nồng độ (hoặc hàm lượng) của chất phân tích. Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều cao của pic) và nồng độ (hoặc hàm

Các yêu cầu đánh giá phương pháp phân tích: Có tính khoa học: tính đúng, tính chính xác, đặc hiệu, nhạy, ổn định.

nghiên cứu trong phòng thí nghiệm để chứng tỏ các đặc tính thực hành của phương pháp đạt yêu cầu đối với loại phân tích đã được định sẵn.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL

thiểu 5 nồng độ khác nhau để xác định đường tuyến tính. Khoảng tuyến tính phải bao gồm toàn bộ nồng độ các mẫu của chất cần phân tích. Trong khoảng nồng độ cần khảo sát, đường chuẩn phải tuyến tính và có hệ số R2 ≥ 0,99 [24]. 1.3.4.4. Độ chính xác Độ lặp lại: Độ lặp lại diễn tả độ chính xác của một quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn. Độ lặp lại còn được gọi là độ chính xác trong cùng điều kiện định lượng. Độ chính xác được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) [24]. Độ chính xác trung gian: Tuỳ thuộc vào từng trường hợp cụ thể. Phân tích nhiều lần, nhiều mẫu với các yếu tố như thời gian, địa điểm, hệ thống máy thay đổi [25 28]. Yêu cầu: Giá trị RSD nhỏ hơn 2%. 1.3.4.5. Độ đúng Độ đúng của một quy trình phân tích là mức độ sát gần của các giá trị tìm thấy so với giá trị thực, khi áp dụng quy trình đề xuất trên cùng với một mẫu thử dã được làm đồng nhất trong cùng một điều kiện xác định [25,26], [29,30]. Độ đúng được thực hiện bằng cách tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử ở tối thiểu ba nồng độ 80% 120%. Đại lượng đặc trưng cho độ đúng là tỷ lệ phục hồi. Yêu cầu: Tỷ lệ phục hồi nằm trong khoảng 98-102% [25,26].

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 12 lượng) của chất cần phân tích. Mối quan hệ tuyến tính này phải được đánh giá bằng phương pháp thống kê. Sử dụng phương pháp phân tích hồi quy (phương pháp bình phương nhỏ nhất).

Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính. Theo hướng dẫn của ICH, phải áp dụng tối

1.3.4.6. Giới hạn phát hiện Giới hạn phát hiện (LOD) của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được và không cần xác định chính xác hàm lượng [24].

1.3.4.7. Giới hạn định lượng Giới hạn định lượng (LOQ) của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể định lượng với độ đúng và độ chính xác phù hợp [24].

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 13

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 14 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Viên nén bào chế chứa diumancal với hàm lượng 10mg. Viên nén từ Phòng nghiên cứu và sản xuất thuốc Viện vaccine và huyết thanh Xanh Petecbua. 2.1.2. Hóa chất, dung môi Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu STT Tên hóa chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn 1 Acetonitril Merck Tiêu chuẩn HPLC 2 Methanol Merck Tiêu chuẩn HPLC 3 Aceton Trung Quốc Tiêu chuẩn HPLC 4 Acid fomic Trung Quốc DĐVN V 5 Nước cất 2 lần Việt Nam Tiêu chẩn HPLC 6 Chất chuẩn diumancal (độ tinh khiết 99,5%) Liên Bang Nga Dược điển Liên Bang Nga Chất chuẩn: Mã số PC 42 0074 01. 2.1.3. Dụng cụ, thiết bị Các dụng cụ, thiết bị cần thiết: - Hệ thống HPLC Water - 265 (cột C-18), bộ phận tiêm mẫu tự động, đầu dò PDA 2998, phần mềm Empower, Mỹ. - Bộ lọc hút chân không. Cân phân tích Mettler Toledo độ chính xác 0,1mg (Thụy Sĩ). - Máy lắc siêu âm.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 15 Một số dụng cụ, thiết bị nghiên cứu khác: bình định mức 100ml, 50ml, 10ml, pipet định mức, cốc có mỏ,... 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng 2.2.1.1. Khảo sát bước sóng phân tích Căn cứ vào điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm và các tài liệu cùng tham khảo, cố định một số điều kiện phân tích gồm có: Thể tích tiêm: 10 μl. Nhiệt độ cột: 25⁰C. Detector: PDA. Pha động: A: ACN; B: HCOOH 0,1%/ H₂O. - Thời gian chạy: 20 phút. Cách tiến hành: Cân chính xác khoảng 10,0 mg diumancal chuẩn, cho vào bình định mức 100,0 ml, hút khoảng 70 ml ACN cho vào bình định mức, lắc siêu âm trong vòng 30 phút, để nguội. Sau đó, thêm vừa đủ dung môi trên cho vừa đủ tới vạch, lắc đều thu được dung dịch chuẩn 100,0 μg/ml. Hút chính xác 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc, cho vào bình định mức 25,0 ml, thêm ACN đến vạch, thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 20,0 μg/ml. Lọc dung dịch chất chuẩn qua màng lọc 0,45 μm trước khi đem mẫu đi phân tích HPLC. Ghi phổ từ 200 đến 800 nm. Sử dụng công cụ quét bước sóng 3D trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao để thực hiện khảo sát bước sóng định lượng. 2.2.1.2. Khảo sát hiệu lực cột phân tích Theo kết quả bước sóng đã phân tích dựa trên kết quả mục 2.2.1.1 và cố định một số điều kiện phân tích gồm có: Thể tích tiêm: 10 μl. - Nhiệt độ cột: 25⁰C. Detector: PDA.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 16 Pha động: A: ACN; B: HCOOH 0,1%/H2O Thời gian chạy: 20 phút. Tiến hành phân tích mẫu trên 2 loại cột với các thông số được thể hiện trong bảng sau: Bảng 2.2. Các thông số cột được khảo sát STT Tên cột Thông số cột 1 Agilent C18 5 μm (4,6 x 250 mm) 2 Phenomenex C18 5 μm (4,6 x 150 mm) Lựa chọn cột có khả năng tách tốt với pic cân đối, gọn và kết quả về hệ số bất đối AF < 1,5; số đĩa lý thuyết đủ lớn. 2.2.1.3. Khảo sát thành phần pha động Dựa vào kết quả mục 2.2.1.1 và 2.2.1.2 và các điều kiện đã cố định, tiến hành khảo sát trên 2 loại pha động theo bảng 2.3. Bảng 2.3. Các loại pha động STT Thành phần pha động 1 MeOH: HCOOH 0,1%/H2O (50/50, v/v) 2 ACN: HCOOH 0,1%/H2O (50/50, v/v) 2.2.1.4. Khảo sát tỷ lệ dung môi pha động Cố định các điều kiện đã được xác định trước, bước sóng đã xác định theo mục 2.2.1.1, cột khảo sát xác định ở mục 2.2.1.2, hệ pha động theo mục 2.2.1.3, tốc độ dòng 0,8ml/phút Tiến hành khảo sát tỷ lệ pha động ở các tỷ lệ ghi ở bảng sau:

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 17 Bảng 2.4. Các tỷ lệ dung môi pha động được khảo sát STT Tỷ lệ dung môi A (%) Tỷ lệ dung môi B (%) 1 60 40 2 50 50 3 40 60 2.2.1.5. Khảo sát tốc độ dòng Cố định các điều kiện đã được xác định trước với bước sóng phân tích theo kết quả mục 2.2.1.1, cột khảo sát xác định ở mục 2.2.1.2, thành phần pha động mục 2.2.1.3 và tỷ lệ dung môi pha động được xác định ở mục 2.2.1.4 Tiến hành khảo sát mẫu phân tích ở các tốc độ 1 ml/phút; 0,8 ml/phút; 0,6 ml/phút. 2.2.2. Thẩm định phương pháp phân tích Thẩm định phương pháp phân tích theo hướng dẫn của ICH, đánh giá các chỉ tiêu: 2.2.2.1. Tính tương thích hệ thống Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn diumancal: Cân chính xác khoảng 10,0 mg diumancal chuẩn, cho vào bình định mức 100,0 ml, hút khoảng 70 ml ACN cho vào bình định mức, lắc siêu âm trong vòng 30 phút, để nguội. Sau đó, thêm dung môi cho vừa đủ tới vạch, lắc đều thu được dung dịch chuẩn gốc 100,0 μg/ml. Hút chính xác 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 25,0 ml, thêm dung môi cho vừa đủ tới vạch, thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 20,0 μg/ml. Lọc chất chuẩn qua màng lọc 0,45 μm thu được dung dịch chuẩn để phân tích.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 18 Thực hiện tiêm 6 lần dung dịch mẫu chuẩn có nồng độ 20,0 μg/ml và thực hiện sắc ký theo chương trình đã lựa chọn. Xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của 6 phép thử về diện tích pic, thời gian lưu, hệ số đối xứng và số đĩa lý thuyết.Yêucầu: RSD phải nhỏ hơn 2%, hệ số đối xứng ≤ 1,5 và số đĩa lý thuyết cần lớn hơn 2000. 2.2.2.2. Độ đặc hiệu chọn lọc Chuẩn bị mẫu trắng: Dung môi ACN đạt tiêu chuẩn HPLC. Chuẩn bị mẫu thử: Cân 20 viên. Xác định khối lượng trung bình. Cân chính xác một lượng bột thuốc tương đương với 10,0 mg diumancal hoạt chất, cho vào bình định mức 100,0 ml, hút khoảng 70 ml ACN cho vào bình định mức, lắc siêu âm trong vòng 30 phút, để nguội. Sau đó, thêm dung môi cho vừa đủ tới vạch, lắc đều thu được dung dịch thử (nồng độ 100,0 μg/ml). Hút 5,0 ml dung dịch thử cho vào bình định mức 25,0 ml, thêm dung môi đến vạch ta được dung dịch thử có nồng độ 20,0 μg/ml. Lọc mẫu thử qua màng lọc 0,45 µm. Chuẩn bị mẫu chuẩn: Sử dụng dung dịch mẫu chuẩn đã pha ở phần 2.2.2.1.Tiến hành sắc ký trong điều kiện đã khảo sát. Yêu cầu: tại thời gian lưu của chất phân tích, dung dịch mẫu trắng không xuất hiện pic tương ứng, dung dịch mẫu thử của chất phân tích được tách hoàn toàn ra khỏi tạp và trùng với pic của mẫu chuẩn trên sắc ký đồ. 2.2.2.3. Khoảng tuyến tính Khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ với diện tích pic của diumancal trong khoảng 50 200% nồng độ làm việc (tương ứng khoảng 10 µg/ml đến 40 µg/ml). Chuẩn bị dung dịch chuẩn diumancal: Cân chính xác khoảng 10,0 mg diumancal chuẩn, cho vào bình định mức 100,0 ml, hút khoảng 70 ml ACN cho vào bình định mức, lắc siêu âm trong vòng 30 phút, để nguội. Sau đó, thêm dung môi cho vừa đủ tới vạch, lắc đều thu được dung dịch chuẩn gốc

Tiêm lần lượt các mẫu chuẩn vào hệ thống sắc ký, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã khảo sát. Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic của từng mẫu.

mô tả mối quan hệ giữa nồng độ diumancal và diện tích pic, hệ số tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn có trong mẫu và diện tích pic thu được trên sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu. Yêu cầu hệ số tương quan tuyến tính R² ≥ 0,99. 2.2.2.4. Độ chính xác Dung dịch thử: Sử dụng dung dịch thử đã pha ở phần 2.2.2.2. Độ lặp lại: Lặp lại quy trình trên 6 lần, tiến hành sắc ký trong điều kiện đã khảo sát. Xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của 6 phép thử về giá trị chất phân tích thu được. Độ chính xác trung gian: Tiến hành phân tích trên 6 mẫu thử trong điều kiện sắc ký đã khảo sát. Thực hiện trong 2 ngày khác nhau. Xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của 6 phép thử về giá trị chất phân tích thu được. Yêu cầu: RSD ≤ 2%. Hàm lượng (%) diumancal trong mẫu thử được tính theo công thức sau: HL (%) = (�� )��100.�� 1000 Trong đó: S: Diện tích pic của mẫu thử (μV*s) a: Hệ số góc của đường chuẩn b: Hệ số chắn của đường chuẩn m: Khối lượng mẫu thử (mg) N: hệ số pha loãng V: Thể tích dung dịch (l)

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 19 (nồng độ 100,0 μg/ml). Từ dung dịch chuẩn gốc pha dãy nồng độ chuẩn 10,0; 15,0; 20,0; 25,0; 30,0; 40,0 μg/ml. Lọc dãy dung dịch qua màng lọc 0,45 μm.

Xác định phương trình hồi quy tuyến tính y = ax+b

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 20 2.2.2.5. Độ đúng Pha mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 50,0 mg diumancal chuẩn, cho vào bình định mức 50,0 ml, hút khoảng 40 ml ACN cho vào bình định mức, hòa tan bằng máy lắc siêu âm đến khi tan, để nguội. Thêm vừa đủ dung môi đến vạch, lắc đều (dung dịch A có nồng độ 1000,0 μg/ml). Pha mẫu thử + chuẩn: Cân chính xác 1 lượng tương đương với 10 mg diumancal chuẩn (3 mẫu), cho vào bình định mức dung tích 100,0 ml, thêm khoảng 50 ml dung môi, lắc siêu âm cho đến khi tan hoàn toàn, để nguội. Thêm lần lượt 8; 10; 12 ml dung dịch A vào các mẫu (tương ứng với 80; 100; 120% hàm lượng so với chất thử), thêm dung môi vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc dung dịch qua giấy lọc (bỏ 20 ml dịch lọc đầu). Hút chính xác 5,0 ml dịch lọc cho vào bình định mức 50,0 ml, pha loãng bằng dung môi, lắc đều thu được dung dịch thử + chuẩn có nồng độ tương ứng 18; 20; 22 μg/ml. Lọc qua màng lọc 0,45 μm thu được dung dịch thử + chuẩn để định lượng. Pha mẫu thử: Sử dụng mẫu thử 10 μg/ml. Mỗi mẫu thử thêm chuẩn và mẫu thử tiêm 3 lần vào hệ thống sắc ký, chạy ở điều kiện đã chọn, tính giá trị diện tích pic trung bình của các mẫu từ đó tính diện tích pic trug bình của các mẫu từ đó được nồng độ diumancal trong các mẫu. Tính độ thu hồi. 2.2.2.6. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Chuẩn bị mẫu trắng: Dung dịch ACN dùng trong phân tích HPLC. Chuẩn bị mẫu chuẩn: Sử dụng mẫu chuẩn nồng độ 20,0 μg/ml. Tiến hành sắc ký mẫu trắng và mẫu chuẩn. Trên sắc ký đồ của mẫu trắng, đo độ nhiễu đường nền trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn, thu được diện tích nhiễu đường nền So (µV*s), từ đó ước lượng diện tích pic của LOD (gấp khoảng 3 lần So) và LOQ (gấp khoảng 10 lần So) ước lượng được, pha loãng mẫu chuẩn có nồng độ ước lượng được và tiến hành chạy sắc ký theo điều kiện đã chọn. Từ kết quả sắc ký, lựa chọn nồng độ thích hợp sao cho diện tích pic gần với diện tích LOD và LOQ ước lượng từ nhiễu đường nền.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 21 2.2.3. Định lượng diumancal trong viên nén Chuẩn bị dung dịch mẫu thử: Tương tự mục 2.2.2.2 Dựa vào đường chuẩn, tính được nồng độ chất trong dung dịch thử, từ đó suy ra hàm lượng diumancal trong viên nén. 2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ Sử dụng phần mềm Microsoft Exel 2010 để xử lý các số liệu thu được. Các kết quả được xử lý và biểu thị: Giá trị trung bình: - Độ lệch chuẩn: SD = - Độ lệch chuẩn tương đối: RSD = × 100 2.4. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Bộ môn Hóa dược Dược lâm sàng, Bộ môn Kiểm nghiệm Độc chất, Viện Đào tạo Dược, Học Viện Quân Y.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 22 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 3.1.1. Kết quả khảo sát bước sóng phân tích Tiến hành chạy sắc ký mẫu chuẩn trên hệ thống máy HPLC và sử dụng tính năng 3D để xác định phổ UV của diumancal. Hình 3.1. Phổ hấp thụ của diumancal có thời gian lưu là 9,5 phút Nhận xét: Kết quả thu được diumancal được hấp thụ bước sóng cực đại 323nm khi tiến hành chạy mẫu sắc ký chuẩn. Kết quả này phù hợp với công bố của Abyshev [17]. Do vậy, lựa chọn bước sóng 323nm để làm bước sóng phát hiện trong nghiên cứu này. 3.1.2. Kết quả khảo sát hiệu lực cột Tiến hành khảo sát trên hai cột khác nhau, kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả khảo sát hiệu lực cột STT Tên cột Chỉ số AF N 1 Agilent (4,6 x 250 mm) 1,34 6432 2 Phenomenex (4,6 x 150 mm) 1,39 3234

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 23 Hình 3.2. Sắc ký đồ của dung dịch diumancal chuẩn nồng độ 20 μg/ml khi sử dụng cột Agilent Hình 3.3. Sắc ký đồ của dung dịch diumancal chuẩn nồng độ 20 μg/ml khi sử dụng cột Phenomenex Nhận xét: Cả 2 cột đều có hệ số Af < 1,5. Cột Phenomenex số đĩa lý thuyết nhỏ hơn nhiều so với cột Agilent, do vậy cột Phenomenex phân tách kém. Với cột Agilent có số đĩa lý thuyết lớn hơn nên phân tách chất tốt hơn. Vì vậy lựa chọn cột Agilent để làm cột nghiên cứu trong những phần định lượng tiếp theo. 3.1.3. Kết quả khảo sát thành phần pha động

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 24 Tiến hành khảo sát trên hai hệ dung môi khác nhau, kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Kết quả khảo sát hệ dung môi STT Hệ dung môi Chỉ số Thời gian lưu (phút) Hệ số bất đối (AF) 1 MeOH: H2O/HCOOH 0,1% (50/50, v/v) 7,807 1,62 2 ACN: H2O/HCOOH 0,1% (50/50, v/v) 9,530 1,34 Hình 3.4. Sắc ký đồ của diumancal khi sử dụng dung môi MeOH: HCOOH 0,1%/ H2O (50/50, v/v) Hình 3.5. Sắc ký đồ của diumancal khi sử dụng dung môi ACN: HCOOH 0,1%/ H2O/ (50/50, v/v)

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 25 Kết quả khảo sát 2 hệ pha động cho thấy hệ pha động ACN: HCOOH 0,1%/ H2O cho kết quả tách tốt hơn, đỉnh pic nhọn hơn và chân pic gọn hơn so với hệ dung môi MeOH: HCOOH 0,1%/ H2O. 3.1.4. Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi pha động Tiến hành khảo sát tỷ lệ của pha động bao gồm dung môi ACN: HCOOH 0,1% ở các tỷ lệ 60/40, 50/50, 40/60 cho kết quả như bảng 3.3: Bảng 3.3. Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi pha động STT Tỷ lệ dung môi (v/v) Thời gian lưu tR (phút) Diện tích pic (µV*s) Hệ số bất đối (AF) Số đĩa lý thuyết (N) 1 60/40 5,907 1746267 1,26 5243 2 50/50 9,540 1610359 1,34 6497 3 40/60 21,517 564156 1,82 7837 Hình 3.6. Sắc ký đồ của mẫu dung dịch diumancal chuẩn với tỷ lệ dung môi 60/40

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 26 Hình 3.7. Sắc ký đồ của mẫu dung dịch diumancal chuẩn với tỷ lệ dung môi 50/50 Hình 3.8. Sắc ký đồ của mẫu dung dịch diumancal chuẩn với tỷ lệ dung môi 40/60 Nhận xét: Mục đích của việc khảo sát dung môi pha động nhằm chọn ra tỷ lệ pha động có khoảng thời gian lưu mong muốn, rút ngắn thời gian định lượng nhưng vẫn đảm bảo độ chính xác của phương pháp. Với tỷ lệ dung môi 40/60, thời gian lưu là 21,517 phút. Với thời gian lưu này, thời gian định lượng sẽ không phù hợp. Thêm nữa, hệ số Af > 1,5 dẫn đến pic bị khéo đôi, không phù hợp.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 27 Với tỷ lệ dung môi 60/40, thời gian lưu là 5,907 phút. Thời gian lưu này tương đối ngắn, có thể bị ảnh hưởng bởi pic dung môi. Với tỷ lệ 50/50, thời gian lưu là 9,540 phút, là thời gian phù hợp, pic gọn, cân đối (Af = 1,34). Do đó, chọn tỷ lệ dung môi 50/50 để tiếp tục khảo sát ở những bước tiếp theo. 3.1.5. Kết quả khảo sát tốc độ dòng Kết quả khảo sát tốc độ dòng của dung dịch diumancal chuẩn được thể hiện ở bảng 3.4. Bảng 3.4. Kết quả khảo sát tốc độ dòng STT Tốc độ dòng (ml/phút) Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (µV*s) Số đĩa lý thuyết (N) 1 0,6 12,763 1876737 6927 2 0,8 9,522 1620327 6486 3 1,0 7,629 1292921 5853 Hình 3.9. Sắc ký đồ dung dịch diumancal chuẩn ở tốc độ dòng 0,6ml/phút

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 28 Hình 3.10. Sắc ký đồ dung dịch diumancal chuẩn ở tốc độ dòng 0,8ml/phút Hình 3.11. Sắc ký đồ dung dịch diumancal chuẩn ở tốc độ dòng 1ml/phút Nhận xét: Dựa vào sắc ký đồ và kết quả thu được của mẫu diumancal chuẩn ở ba tốc độ dòng khác nhau cho thấy: Với tốc độ dòng 0,6ml/phút, đỉnh pic không nhọn và chân pic khá rộng. Vì vậy, tốc độ dòng này không phù hợp để tiến hành định lượng. Với tốc độ 1ml/phút, chân pic hẹp, không cân đối. Với tốc độ dòng 0,8ml/phút, có ưu điểm nổi bật cho đỉnh pic nhọn, chân pic gọn và thời gian lưu phù hợp. Vì vậy chọn bước sóng 0,8ml/phút để tiến hành định lượng.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 29 Kết luận: Từ các kết quả khảo sát trên, xây dựng phương pháp điịnh lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với các điều kiện sau: Hệ thống sắc ký: Hệ thống HPLC Alliance Water 2998. Cột: Agilent. Detector UV, bước sóng phân tích 323nm. Pha động: ACN/HCOOH 0,1% với tỷ lệ 50/50. Thể tích tiêm mẫu: 10 µl. Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút. Thời gian chạy: 20 phút. 3.2. KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 3.2.1. Tính tương thích hệ thống Tiến hành khảo sát mẫu diumacal chuẩn 20 µg/ml với 6 lần tiêm theo điều kiện sắc ký đã xây dựng, kết quả thu được thể hiện dưới bảng 3.5. Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống sắc ký STT Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (µV*s) Hệ số bất đối (AF) Số đĩa lý thuyết (N) 1 9,529 1618279 1,35 6542 2 9,522 1624323 1,32 6456 3 9,540 1617689 1,36 6430 4 9,536 1604364 1,33 6524 5 9,521 1620359 1,32 6379 6 9,527 1613652 1,35 6512 ��±SD 9,529 ± 0,008 1616444 ± 6870 1,34 ± 0,02 6473 ± 63 RSD(%) 0,08 0,43 1,29 0,98

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 30 Nhận xét: Từ kết quả khảo sát cho thấy RSD (%) của các thông số trong 6 phép thử đều nằm trong giới hạn cho phép (< 2%), các giá trị của hệ số bất đối xứng nằm trong khoảng cho phép từ 0,8 1,5. Điều này chứng minh rằng hệ thống sử dụng là phù hợp và đảm bảo tính ổn định cho các phép phân tích định lượng diumancal. 3.2.2. Độ đặc hiệu Kết quả khảo sát độ đặc hiệu được thể hiện bằng hình ảnh sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử như sau: Hình 3.12. Sắc kí đồ mẫu trắng Hình 3.13. Sắc kí đồ mẫu chuẩn

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 31 Hình 3.14. Sắc ký đồ mẫu thử Nhận xét: Sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện pic trong khoảng thời gian tương ứng với thời gian lưu của diumancal (khoảng 9,5 phút). Trên sắc ký đồ của của mẫu chuẩn và mẫu thử có chứa diumancal đều cho 1 pic ở khoảng thời gian 9,5 phút. Điều này chứng tỏ rằng phương pháp đã xây dựng là đặc hiệu cho phân tích định lượng diumancal 3.2.3. Khoảng tuyến tính Diumancal chuẩn có độ trình độ tinh khiết 99,5%. Khối lượng chất chuẩn đã cân m = 10,3 mg. Kết quả khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ với diện tích pic của diumancal với nồng độ từ 10,0 µg/ml 40,0 µg/ml. Bảng 3.6. Sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ diumancal STT Nồng độ (µg/ml) Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (µV*s) Nồng độ theo đường chuẩn (µg/ml) Hệ số ∆i (%) 1 10,25 9,522 794180 10,86 5,9 2 15,38 9,519 1062446 14,10 8,3 3 20,50 9,529 1614990 20,86 1,8 4 25,63 9,522 2039017 26,03 1,6 5 30,75 9,518 2418340 30,65 0,3 6 41,00 9,525 3260594 40,91 0,2

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 32 Hình 3.15. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của diumancal Nhận Trongxét:khoảng nồng độ khảo sát (10,0 40,0 µg/ml) có sự phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ giữ diện tích pic và nồng độ chất cần định lượng. Phương trình hồi quy là y = 82064x - 97234 với hệ số tương quan R2 = 0,9964, nằm trong khoảng từ 0,99 1. Hệ số ∆i không vượt quá ±15%. Như vậy, đường chuẩn đã xây dựng đáp ứng nhu cầu của phép phân tích định lượng bằng HPLC. 3.2.4. Độ chính xác Tiến hành khảo sát trên 6 thí nghiệm khác nhau: Kết quả thể hiện ở bảng 3.7. Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ lặp lại STT Khối lượng bột (mg) Hàm lượng diumancal tính theo trên nhãn (mg) Diện tích pic (µV*s) Hàm lượng so với (%)nhãn 1 107,3 10,20 1605125 100,69 2 107,8 10,24 1608420 101,42 3 108,7 10,33 1604023 100,32 y = 82064x 97234 R² = 0,99643500000300000025000002000000150000010000005000000 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 (µV.s)pictíchDiện Nồng độ (µg/ml)

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 33 4 108,2 10,29 1592021 100,07 5 106,3 10,10 1591207 101,81 6 106,8 10,15 1598012 101,74 ��SD± 106,8 ± 1,1 10,22 ± 0,09 1599801 ± 7184 101,17± 0,77 RSD (%) 0,77 Nhận xét: Kết quả của phép thử độ lặp lại của phương pháp cho thấy, trong các điều kiện sắc ký đã chọn, độ lệch chuẩn tương đối của các kết quả là 0,77% (< 2%). Điều này chứng tỏ rằng phương pháp đã chọn đảm bảo độ lặp của các thử nghiệm được thực hiện song song. Tiến hành khảo sát 6 mẫu thử khác nhau để tìm độ chính xác trung gian. Kêt quả độ chính xác trung gian được thể hiện trong bảng 3.8. Bảng 3.8. Kết quả độ chính xác trung gian STT Khối lượng bột (mg) Hàm lượng diumancal tính theo trên (mg)nhãn Diện tích (µV*s)pic Hàm lượng so với (%)nhãn 1 105,6 10,04 1601024 103,08 2 106,9 10,16 1594486 100,43 3 106,1 10,09 1599763 101,43 4 108,9 10,36 1612494 102,52 5 107,2 10,19 1600732 100,63 6 107,5 10,22 1610743 101,84 ��SD± 107,1 ± 1,2 10,18 ± 0,11 1603207 ± 6955 101,82 ± 0,87 RSD (%) 0,85

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 34 Kết quả hàm lượng diumancal trong 2 ngày khác nhau được thể hiện trong bảng 3.9. Bảng 3.9. Kết quả hàm lượng diumancal trong 2 ngày STT Ngày 1 Ngày 2 1 101,69 103,08 2 101,42 100,43 3 100,32 101,43 4 100,07 102,52 5 101,81 100,63 6 101,74 101,84 �� 101,17 101,82 RSD (%) 0,77 0,85 Hàm lượng trung bình viên nén của 2 ngày là 101,82%. RSD trung bình của 2 ngày là 0,81%. Nhận xét: Kết quả độ lặp lại của phép định lượng có giá trị RSD ngày 1 là 0,77%, ngày 2 là 0,85% và trung bình đạt 0,81%. Như vậy, các giá trị RSD đều nhỏ hơn 2%. Điều này chứng minh rằng phương pháp định lượng đảm bảo được độ chính xác trung gian. 3.2.5. Độ đúng Khối lượng cân chất chuẩn: m= 506,1 mg. Khối lượng cân chất thử: m1= 105,7 mg; m2=103,7 mg; m3= 106,4 mg m4=105,3mg; m5= 107,1mg; m6= 106,2mg; m7= 104,9mg; m8=105,7mg; m9= 102,3mg. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã khảo sát, thu được kết quả ở như sau:

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 35 Bảng 3.10. Kết quả khảo sát độ đúng Mức nồng độ Lượng chuẩ thêmnvào(mg) Diện tích mẫu thử chuthêm ẩn (µV*s) Lượthtìmng ấ (mg)y Tỷ lệ phần trăm thu hồi (%) �� (%) RSD(%) 80% 8,1 1390059 8,12 100,25 100,12 ± 0,33 0,338,0 1380627 7,98 99,75 8,1 1392901 8,13 100,37 100% 10,1 1555480 10,11 100,10 99,67 ± 0,40 0,4010,1 1549291 10,03 99,31 10,1 1551746 10,09 99,60 120% 12,1 1710516 11,97 99,17 99,39 ± 0,46 0,46 12,1 1717695 12,09 99,92 12,0 1701856 11,89 99,08 Nhận xét: Tỷ lệ thu hồi ở các nồng độ khác nhau đạt từ 99,39 100,12% đều nằm trong khoảng 98 102% so với lượng chuẩn thêm vào. RSD thu được từ 0,33 0,46% đều < 2%. Điều này chứng tỏ rằng phương pháp đã xây dựng có độ đúng cao. 3.2.6. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Theo kết quả khảo sát mẫu chuẩn diumancal thì thời gian lưu của mẫu chuẩn là tR = 9,5 phút. Trên sắc kí đồ của mẫu trắng ta đo được tín hiệu nền trong khoảng thời gian từ 9,310 phút đến 9,823 phút thu được So = 1022 µV.s. Kết quả sau khi thực hiện LOD và LOQ được thể hiện ở bảng 3.11.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 36 Bảng 3.11. Kết quả xác định LOD và LOQ Chỉ tiêu Diện tích nhiễu đường nền (µV*s) Nồng độ chất chuẩn (µg/ml) Diện tích pic thực tế đo được (µV*s) LOD (3*So)3066 0,03 2837 0,04 3156 0,05 3589 LOQ (10*So)10220 0,20 8907 0,25 10365 0,30 14732 Nhận xét: Theo kết quả từ bảng trên cho thấy, phương pháp định lượng xây dựng có LOD = 0,04 µg/ml và LOD = 0,25 µg/ml. 3.3. KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG DIUMANCAL TRONG VIÊN NÉN Kết quả định lượng được tính toán dựa trên đường chuẩn, từ đó tính ra hàm lượng của diumancal trong chế phẩm so với hàm lượng ghi trên nhãn. Kết quả định lượng diumancal trong viên nén được thể hiện ở bảng 3.12. Bảng 3.12. Kết quả định lượng diumancal trong viên nén STT Diện tích pic (µV*s) Hàm lượng mẫu thử diumancal (mg) Hàm lượng (%) 1 1605125 10,20 100,69 2 1608420 10,24 101,42 3 1604023 10,33 100,32 TB 100,14

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 37 Nhận xét: Hàm lượng diumancal trong viên nén nghiên cứu trung bình là 100,14% so với hàm lượng ghi trên nhãn. Như vậy, mẫu thử đều đạt yêu cầu về hàm lượng diumancal.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 38 KẾT LUẬN Sau thời gian tiến hành làm thực nghiệm, đề tài đã hoàn thành được hai mục tiêu đề ra và thu được một số kết quả như sau: 1. Xây dựng phương pháp định lượng diumancal trong viên nén bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Qua quá trình tiến hành nghiên cứu, đã xây dựng được điều kiện sắc ký như sau:-Pha động: A: ACN; B: HCOOH 0,1%/ H2O. - Tốc độ dòng 0,8 ml/phút. Thể tích tiêm mẫu: 10 µl. - Nhiệt độ cột: 25◦C. Tỷ lệ dung môi Acetonitril: dung dịch axit formic 0,1% là 50/50. - Sử dụng cột Aligent. Detector: PDA. Bước sóng định lượng: 323 nm. 2. Thẩm định phương pháp định lượng đã xây dựng được theo quy định của ICH.Phương pháp xây dựng được có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích píc và nồng độ chất chuẩn diumancal trong khoảng nồng độ khảo sát. Phương pháp xây dựng được có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích píc và nồng độ chất chuẩn diumancal trong khoảng nồng độ khảo sát (10,0 40,0 µg/ml), phương pháp có độ lặp lại cao với RSD là 0,77% và có độ đúng từ 99,39 100,12% với RSD từ 0,33 đến 0,46% thích hợp cho phương pháp định lượng với thời gian phân tích phù hợp (khoảng 9,52 phút).

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 39 KIẾN NGHỊ Trong phạm vi khóa luận tốt nghiệp, đã tiến hành nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng diumancal trong viên nén bằng HPLC và thu được các kết quả khả quan. Em xin đưa ra một số kiến nghị như sau: Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện phương pháp trên để ứng dụng rộng rãi phương pháp định lượng diumancal trong viên nén. Áp dụng trong điều kiện các cơ sở kiểm tra chất lượng, các phòng kiểm nghiệm khác.

9. Abyshev, A. Z., Zhurkovich, I. K., Agaev, E. M., Abdullazade, A. A., & Huseynov, A. B. (2007). Methods for standardizing the quality of the substance of diumancal and its dosage forms. Chemical Pharmaceutical Journal, 41(1): 50 53.

2. Hirsh, J., Dalen, J. E., Deykin, D., Poller, L., & Bussey, H. (1995). Oral anticoagulants: mechanism of action, clinical effectiveness, and optimal therapeutic range. Chest, 108(4): 231S 246S.

6. Abyshev, A. Z. O., Agaev, E. M. O., & Marishchenko, O. V. (2002). Method for obtaining Diumancal forte tablets 0,01g.

7. Abyshev, A. Z. O., & Diachuk, G. I. (2000). Mean for treatment of coronary heart disease.

4. Nutescu, E. A., Burnett, A., Fanikos, J., Spinler, S., & Wittkowsky, A. (2016). Erratum to: pharmacology of anticoagulants used in the treatment of venous thromboembolism. Journal of thrombosis and thrombolysis, 42(2):296 311.

3. Salem, D. N., Stein, P. D., Al Ahmad, A., Bussey, H. I., Horstkotte, D., Miller, N., & Pauker, S. G. (2004). Antithrombotic therapy in valvular heart disease native and prosthetic: the Seventh ACCP Conference on Antithrombotic and Thrombolytic Therapy. Chest, 126(3):457S-482S.

1. Khuyến cáo của Hội tim mạch học Việt Nam (2010) về dự phòng bệnh lý mạch vành ở phụ nữ.

10. Sandhu, Sonali, et al (2014). Coumarin hybrids as novel therapeutic agents. Bioorganic & medicinal chemistry, 22.15: 3806 3814.

5. Abyshev, A. Z. O., & Agaev, E. M. O. (2003). Ancardin retard medium of prolonged anti Calcium action.

8. Abyshev, A. Z., Agaev, E. M., & Abyshev, R. A. (2014). Natural and synthetic coumarins and flavonoids. St. Petersburg Baku: Prima.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL TÀI LIỆU THAM KHẢO

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL

12. Wu, Y., Xu, J., Liu, Y., Zeng, Y., & Wu, G. (2020). A review on anti tumor mechanisms of coumarins. Frontiers in Oncology, 10: 2720.

13. Qin, H. L., Zhang, Z. W., Ravindar, L., & Rakesh, K. P. (2020). Antibacterial activities with the structure-activity relationship of coumarin derivatives. European journal of medicinal chemistry, 207:112832.

15. Rakici, Ö., Aslamaci, S., & Akar, F. (2014). Short-Term Resveratrol Pretreatment Suppresses Noradrenaline Induced Contractions in Human Saphenous Vein and Internal Mammary Artery Rings. FABAD Journal of Pharmaceutical Sciences, 39(1): 9. 16 Abyshev, A. Z., Jurkovich, I. K., Ivkin, D. Yu., & Nguyen, K. B. (2017). Synthesis, Physico chemical analysis and pharmacological activity of some Wafarin derivatives. Drug Development and Registration, (2): 192 198.

18. Abyshev, A. Z., Agaev, E. M., & Abyshev, R. A. (2014). Natural and synthetic coumarins and flavonoids. St. Petersburg Baku: Prima.

14. Lee, S. Y., Chiu, Y. J., Yang, S. M., Chen, C. M., Huang, C. C., Lee Chen, G. J., ... & Chang, K. H. (2018). Novel synthetic chalcone coumarin hybrid for Aβ aggregation reduction, antioxidation, and neuroprotection. CNS Neuroscience & Therapeutics, 24(12): 1286 1298.

11 Pineo, G., & Hull, R. D. (2003). Coumarin therapy in thrombosis. Hematology/Oncology Clinics, 17(1):201 216.

17. Abyshev, A. Z., Zhurkovich, I. K., Agaev, E. M., Abdullazade, A. A., & Huseynov, A. B. (2007). Methods for standardizing the quality of the substance of diumancal and its dosage forms. Chemical Pharmaceutical Journal, 41(1), 50 53.

19. Sổ tay bào chế thuốc Liên bang Nga. https://medum.ru/, truy cập ngày 22/12/202120 Bộ Y Tế (2007) Hóa Phân Tích II. NXB Y học, 168 186. 21. Bộ Y Tế (2007) Kiểm nghiệm dược phẩm. NXB Y học, 84 111.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 22 Patil, M. P. N. (2017). HPLC Method Development A Review. Journal of Pharmaceutical Research and Education, 1(2): 243 260. 23. Bộ Y Tế, Thái Phan Như Quỳnh (2007) Kiểm nghiệm thuốc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. NXB Y học, 230 250. 24. ICH Harmonised Guideline (2022). Validation of analytical procedures: Q2 (R2). Text and Methodology. 25. Bộ Y tế (2012), Kiểm nghiệm thuốc (dùng cho đào tạo dược sĩ đại học), Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam, 135 184. 26. Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hoá học và vi sinh vật, 10 59. 27. European Medicines Agency (2011), Guideline on bioanalytical method validation, 9 10. 28. The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1), 6 13. 29. Chenghan Mei, Bin Li, et al (2015), "Liquid chromatography tandem mass spectrometry for the quantification of flurbiprofen in human plasma and its application in a study of bioequivalence", Journal of Chromatography B, 993 994, 69 74. 30. The Europaean Pharmacopieal Commission (2010), Pharmacopoeia Europaea 7(2), 2056 2057.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Ký hiệu Tên phụ lục PL1 Độ tương thích hệ thống PL2 Mẫu thử PL3 Đường chuẩn PL4 Độ đúng

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL PL1 CÁC SẮC KÝ ĐỒ BIỂU THỊ ĐỘ TƯƠNG THÍCH HỆ THỐNG

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL PL2 CÁC SẮC KÝ ĐỒ BIỂU THỊ MẪU THỬ

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL PL3 CÁC SẮC KÝ ĐỒ BIỂU THỊ ĐƯỜNG CHUẨN

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL PL4 CÁC SẮC KÝ ĐỒ BIỂU THỊ ĐỘ ĐÚNG