NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH SỬ DỤNG VẬT LIỆU γ– Al2O3 ĐỂ TẠO CAO VÀ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM CÓ HOẠT TÍNH HẠ ĐƯỜNG by Dạy Kèm Quy Nhơn Official

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Q uy

hơ

………… ………...

CÔNG TRÌNH THAM DỰ

GIẢI THƯỞNG“SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC “

Kè

NĂM 2014

m /+

ạy

Tên công trình: NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH SỬ DỤNG VẬT LIỆU γ– Al2O3 ĐỂ TẠO CAO VÀ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM CÓ HOẠT TÍNH HẠ ĐƯỜNG HUYẾT TỪ LÁ DÂU TẰM

Họ và tên sinh viên: Đỗ Hoàng Giang Lớp, khóa:KTHH 5 – K54 Họ và tên sinh viên:Bùi Văn Dũng Lớp, khóa:KTHH 1– K55 Họ và tên sinh viên:Nguyễn Thị Hồng Nhung Lớp, khóa:CNKTHH 1 – K56 Họ và tên sinh viên:Đặng Khánh Chi Lớp, khóa:KTHH 3 – K56 Họ và tên sinh viên:Ngô Thị Vui Lớp, khóa:KTHH 5 – K56 Viện: Kỹ thuật hoá học Giảng viên hướng dẫn:TS. Trần Thượng Quảng

Nam Tel: +84 975335463 Nam Tel: +84 966783392 Nữ Tel: +841696804365 Nữ Tel: +84 1669828806 Nữ Tel: +84973167826

Hà Nội, tháng 5 năm 2014

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

TÓM TẮT CÔNG TRÌNH MÃ ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH SỬ DỤNG VẬT LIỆU γ– Al2O3 ĐỂ TẠO CAO VÀ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM CÓ HOẠT TÍNH HẠ ĐƯỜNG HUYẾT TỪ LÁ DÂU TẰM

Đỗ Hoàng Giang – Lớp KTHH5 – Khóa 54 Bùi Văn Dũng – Lớp KTHH1 – Khoá 55 Nguyễn Thị Hồng Nhung – Lớp CNKTHH1 –Khoá 56 Đặng Khánh Chi – Lớp KTHH3 – Khoá 56 Ngô Thị Vui – Lớp KTHH5 – Khoá 56 Giáo viên hướng dẫn: TS. Trần Thượng Quảng Khoa/Viện Kỹ thuật hoá học Qua nghiên cứu công nghệ sử dụng vật liệu γ– Al2O3 để phân lập các hợp chất có hoạt tính sinh học từ lá Dâu tằm, chúng tôi nhận thấy rằng, các phân đoạn chất thu được từ quá trình hấp phụ và nhả hấp dịch chiết lá dâu tằm trên vật liệu γ– Al2O3 có hoạt tính hạ đường huyết rất tốt. Vì vậy, trong công trình này, chúng tôi tiếp tục hoàn thiện công nghệ và đưa ra quy trình sử dụng hạt hấp phụ γ– Al2O3 để tạo cao chiết Dâu tằm có hoạt tính hạ đường huyết. Bên cạnh đó, với sự trợ giúp từ các đối tác, nhóm nghiên cứu đã tiến hành tạo chế phẩm viên nén từ cao chiết Dâu tằm. Các thử nghiệm về hoạt tính sinh học cũng như độc tính cấp cho thấy, viên nén có thành phần cao Dâu tằm không chỉ có khả năng hạ đường huyết, ức chế Glucosidase mà còn không gây độc hại cho cơ thể. Với những ưu điểm vượt trội đó, sản phẩm này hứa hẹn sẽ là một giải pháp hiệu quả trong công tác phòng chống và điều trị căn bệnh tiểu đường hiện nay.

ạy

Kè

Q uy

hơ

Sinh viên:

m /+

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, tập 2, NXB Khoa Học và KỹThuật, Hà Nội, 345. 2. Bộy tế– viện dược liệu (1990), Cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản khoa học và kỹthuật Hà Nội, 275–276. 3. ĐỗTất Lợi (1981), Những cây thuốc và vịthuốc Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹthuật Hà Nội. 4. Lê Trần Đức (1997), Cây thuốc Việt Nam – trồng hái chếbiến trịbệnh ban đầu, Nhà xuất bản nông nghiệp, Hà Nội, 889–890.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

I. ĐẶT VẤN ĐỀ 1.

Tính cấp thiết của đề tài Tiểu đường hiện đang là một trong những căn bệnh đe doạ lâu dài tới sức

khoẻ của con người. Với số lượng người mắc bệnh tăng nhanh chóng trong khi các thuốc hạ đường huyết hiện tại chưa tỏ rõ hiệu quả và gây nhiều tổn thương

hơ

nặng nề cho người sử dụng thì việc tạo ra các chế phẩm giúp phòng và điều trị

bệnh tiểu đường có nguồn gốc từ tự nhiên là rất có ý nghĩa. Nắm bắt được thực

Q uy

tế này, dựa trên kết quả nghiên cứu trong nhiều năm qua, chúng tôi đã thử nghiệm và bước đầu tạo ra một chế phẩm có khả năng hạ đường huyết từ lá Dâu

tằm. Với hoạt tính sinh học cao, độc tính thấp, dạng bào chế dễ sử dụng, đây hứa

Mục tiêu nghiên cứu

ạy

Kè

hẹn là một sản phẩm có giá trị cao cả về khoa học, y học lẫn giá trị kinh tế.

Đề tài tập trung vào nghiên cứu quy trình tạo cao có hoạt tính hạ đường

m /+

huyết rồi sử dụng cao này để tạo chế phẩm viên nén có khả năng thương mại hoá dưới dạng thực phẩm chức năng.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu quá trình sử dụng vật liệu γ– Al2O3 để tạo cao có hoạt

tính từ lá Dâu tằm và sử dụng sản phẩm sau hấp phụ để tạo chế phẩm dạng viên

nén có hoạt tính

Phương pháp nghiên cứu

Dựa trên các kết quả nghiên cứu trước đó, nhóm nghiên cứu đưa ra một số thử nghiệm mới về quy trình tạo cao. Kế đến, chúng tôi tiến hành thử hoạt tính chống tiểu đường của chế phẩm này, hợp tác với đơn vị chuyên môn về bào chế để tạo thành chế phẩm viên nén rồi sau đó thử hoạt tính, độc tính của chế phẩm.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

Kết cấu của đề tài Kết cấu của đề tài gồm những phần sau: - Tóm tắt đề tài. - Đặt vấn đề - Kết quả nghiên cứu

hơ

- Kết luận - Tài liệu tham khảo.

Nhóm sinh viên nghiên cứu chúng em xin được gửi lời cảm ơn tới TS.

Q uy

Trần Thượng Quảng đã tạo điều kiện hướng dẫn và giúp đỡ các thành viên trong nhóm thực hiện đề tài này. Trong quá trình thực hiện chắc hẳn sẽ còn

những sai sót. Kính mong hội đồng xét duyệt đóng góp ý kiến để nhóm nghiên

Kè

cứu của chúng em có thể hoàn thiện hơn công trình của mình.

m /+

ạy

Chúng em xin chân thành cảm ơn!

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

II. NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1.

Cơ sở khoa học của nghiên cứu

1.1. Tổng quan về cây dâu tằm 1.1.1 Đặc điểm Cây dâu tằm

Tên khoa học:

Mulberry, White mulberry L

Hình 1 : Lá dâu tằm

m /+

ạy

Kè

Q uy

hơ

Tên Việt Nam:

Cây dâu tằm (Mulberry hay White mulberry) thuộc họ dâu (Moraceae), thuộc bộ Moreae, giống Morus, loài M. Alba trong tự nhiên cây dâu tằm có 16

chi, trong đó chi Morus alba L là một loại chi điển hình có nhiều hoạt tính sinh

học hữu ích. Vì vậy việc nghiên cứu thành phần hóa học của các cây trong chi là điều hết sức cần thiết tạo cơ sở cho các ngành y học và dược học. Trên thế giới, lá cây dâu tằm từ lâu đã được các nhà Hoá học hợp chất thiên nhiên quan tâm nghiên cứu bởi các đặc tính dược lí quý báu như: Chữa

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

bệnh tăng huyết áp, chữa bệnh tăng cholesterol trong máu dẫn đến hiện tượng bệnh đái tháo đường rất có hiệu quả [14,17]. 1.1.2 Thực vật học và thành phần hợp chất trong cây dâu tằm 1.1.2.1 Thực vật học

Cây dâu tằm thuộc cây thân gỗ, sống lâu năm, tuổi thọ khoảng 8–12 năm,

hơ

năm đầu tiên cao khoảng 1–1,5m, năm thứ hai cao khoảng 2,3–3 m, rễ ăn sâu và

rộng 2–3 m, nhưng phân bố nhiều ở tầng đất 10–30 cm và rộng theo tán cây, lá

Q uy

mọc so le, hình bầu dục, chia 3 thùy, có gân nổi rõ, đầu lá nhọn hoặc hơi tù. Phía cuống lá hơi tròn hoặc hơi bằng, mép có răng cưa to. Từ cuống lá tỏa ra 3 gân rõ

rệt. Hoa đực mọc thành bông, có lá đài, 3 đến 4 nhị. Hoa cái cũng mọc thành

Kè

bông hay thành khối hình cầu, có 4 lá đài. Quả mọc trong các lá đài, màu đỏ, sau

ạy

đen sẫm, ăn ngon – ngọt, dùng làm thuốc hoặc ngâm rượu để uống, mùi thơm, vị

chua ngọt.

m /+

Cây dâu tằm trồng ở nhiệt độ thích hợp là 25–32°C, trên 40°C hoặc dưới

12°C bị hạn chế sinh trưởng, là cây ưa ánh sáng. Đất trồng dâu tằm cần tơi xốp, giữ ẩm, giữ nhiệt, tầng canh tác dầy, đất

không quá chua hoặc quá mặn, mực nước ngầm thấp.

Các dinh dưỡng cần thiết như: Đạm–Lân–Kali–Canxi.

1.1.2.2 Thành phần hợp chất trong cây dâu tằm a) Rễ cây dâu tằm Năm 1976 – 1978 Taro Nomura đã phân lập và xác định cấu trúc của 3

dẫn xuất Flavone là morusin, cyclorusin và hợp chất trong dịch chiết benzene từ rễ cây dâu tằm Morus alba L [18,19].

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ OH

HO O

Báo cáo nghiên cứu khoa học OH

O O

Cyclomorusin

Morusin

O HO

Q uy

hơ

Compound A

Kè

Kuwanon A

HO O

ạy

m /+

Kuwanon C

HO HO

Albanol B

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

HO OH O

hơ

Chalcomoracin

Q uy

Năm 1989, Yoshio Hano phân lập được mulberrofuran I, mulberrofuran S, mulberrofuran Ptừ Morus alba L

Kè

OH O

ạy

m /+

Mulberrofuran I

HO O

Mulberrofuran P

Năm 2003, Jiang Du và KM.Park đã phân lập được 8 flavonoids từ rễ Morus alba L

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học OH HO

OH OH O

HO OH O

Kuwanon S

Moralbanon

Q uy

hơ

Mulberrosid C

ạy

Kè

OH O

O OH

OH O

m /+

OOH

Eudraflavone B hydroperoxit

Oxydihyromorusin

OH O

Leachianon G

AcO

a -Acetyl-amyrin

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học OH

OH HO

OH O

hơ

Q uy

Kuwanon G

OH O

Năm 2003, Toshio Fukai đã phân lập artonin E, licoricidin, licochalcon A,

OH O

OCH3 O

Licorisoflavan A

Artonin E O

OCH3

Licoricidin

m /+

ạy

Kè

licorisoflavan A

H3CO

OCH3

Licochalcon A

Năm 2005, Abdel Nasser B.Singab đã phân lập được neocyclomorusin, kuwanon E

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

HO HO

O O OH O

OH O

Kuwanon E

Neocyclomorusin

hơ

Năm 2009, Mi Zhang, Man Chen đã phân lập được mulberrosid A và

Q uy

steppogenin–4’–O–β–D–glucosid từ rễ .

HO HO

O-glc

Kè

OH O

ạy

Steppogenin-4'-O -D-glucosid

Mulberrosid A

m /+

Năm 2009, Mi ZHANG, Rong–Rong WANG, Man CHEN, Han–Qing ZHANG, đã phân lập một Flavanone Glycoside có tác dụng ức chế tế bào ung

thư từ vỏ rễ cây [16].

HO HO HO

HO O

O HO

OH OH OH

OH OH

5,2'-dihydroxyflavanone-7,4'-di-O-b-D-glucoside (steppogenin-7,4'-di-O-b-D-glucosiade)

b) Lá cây dâu tằm

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

OH OH

HO O

H2C O O HO OH

OH O H3C

O OH OH

OHOH

Quercetin

Rutin

hơ

Q uy

OH O

Isoquercetin

O Glc

OH OH

O O

OH HO

co e.

O O

Quercetin 3-(6-malonylglucoside)

O Glc

OH OH

m /+

ạy

Kè

Kaemferol

Moracin OH

G HO O

Acid ascorbic

ClN+ HO

S H2N

N N

Vitamin B

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học O

O OH

2+ O- Ca

O OH O

O Acid succinic

Calcium malat N NH2

OH O

Acid tartaric

HN N

Adenin

Q uy

COOH

hơ

OH O

Kè

m /+

ạy

axit gallic

a -Caroten

OH O

OH OH

Catechin

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

1.1.3 Những tác dụng dược lý của cây dâu tằm Các nghiên cứu gần đây cho thấy một số hợp chất cô lập từ rễ cây dâu tằm có nhiều hoạt tính sinh học thú vị đặc biệt là các hợp chất flavonoid. Năm 1986, Hirakura đã cô lập được hợp chất mulberrosid C từ rễ cây dâu

tằm và đã thử nghiệm thành công hoạt tính kháng virus Herpes simplex–1 (HSV–1:

hơ

một loại virus gây viêm não) (IC50 = 75.4 µg/mL, CC50 = 250 µg/mL) [24]

Năm 1993, Linuma [25] đã cô lập được leachianon G và cũng đã thử

Q uy

nghiệm thành công hoạt tính kháng virus HSV–1 trên tế bào in vitro,hợp chất

này có khả năng kháng khuẩn mạnh hơn mulberrosid C (IC50=1,6 µg/mL)

Kè

Các công trình nghiên cứu của một số tác giả Nhật Bản (1994)[21], Trung Quốc (1996)[26] đã chứng minhpolyphenol chứa trong lá dâu có nhiều tác dụng

ạy

quý và có thể ứng dụng trong sinh y học như: làm hạ glucose máu, chống oxy

m /+

hóa, hạn chế rối loạn lipid máu.

Năm 2003, K.M. Park và các cộng sự đã cô lập được hợp chất kuwanon G

từ rễ cây dâu tằm và phát hiện chúng có thể kháng lại vi khuẩn Streptococcus(vi

khuẩn gây ra nhiễm trùng) và các loại vi khuẩn Cariogenic như: S. mutans( loại

khuẩn nàychuyên bám trên bề mặt răng và tạo cao răng), S. sobrinus, S. sanguis,

Periodontal bacterium(gây viêm nướu), P. gingivalis (vi khuẩn gây bệnh lợi)...

[11]

Vi khuẩn

IC50 (Hg/mL)

Streptococcus mutans

Streptococcus sanguis

Streptococcus sobrinus

Porphyromonas gingivalis

Staphylococcus aureus

125

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

Actinobacillus actinomycetemcomitans

1000

Candida albicans

1000

Lactobacillus acidophilus

>1000

Lactobacillus casei

>1000

Bảng 1: Hoạt tính sinh học của kuwanon G với các loại vi khuẩn

Khi dùng cloroform để chiết suất các hợp chất hữu cơ từ rễ cây dâu, các

hơ

nhà khoa học Hàn Quốc phát hiện dung dịch thu được có tác dụng bổ trợ cho

trực khuẩn Bacillus subtilis phát triển mạnh, trực khuẩn này sinh nhiều loại

Q uy

kháng sinh, vitamin và đặc biệt là các loại men tiêu hóa như: proteaza, amylaza ... có tác dụng ngừa tiêu chảy hữu hiệu. Ngoài ra, nếu dùng acid acetic để chiết

suất thì có thể kháng được vi khuẩn Staphylococcus aureus (một nhóm vi khuẩn

Kè

sống trên da tay chân con người; hầu hết vụ ngộ độc thực phẩm cấp tính đều do

ạy

Staphylococcus aureus gây ra) và Escherichia coli (vi khuẩn này là nguyên nhân

m /+

nhiễm trùng huyết)[27].

gây tiêu chảy, nhiễm trùng đường tiết niệu như viêm thận, viêm bàng quang,

Mặc dù có nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy cây dâu tằm có hoạt tính

kháng virus rất mạnh nhưng cho đến nay vẫn không có nhiều hợp chất được phát

hiện và cô lập được. Chính vì vậy mà các nhà khoa học ngày nay vẫn không

ngừng nghiên cứu về loài cây này để tìm ra các hợp chất mới có khả năng trị

bệnh và ứng dụng được trong y học. 1.2. Tổng quan về vật liệu hấp phụ γ–Al2O3

1.2.1.Giới thiệu về γ–Al2O3 Cấu trúc của oxyt nhôm được xây dựng từ đơn lớp của các quả cầu xếp chặt. Lớp thứ nhất có dạng tâm đối mà ở đó mọi ion O2– được định vị ở vị trí 1. Lớp tiếp theo được phân bố trên lớp thứ nhất, ở đó tất cả những quả cầu thứ hai nằm ở vị trí lõm sâu của lớp thứ nhất ( vị trí 2). Lớp thứ 3 nằm trên các lỗ sâu 15

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Báo cáo nghiên cứu khoa học

Bộ môn Hoá hữu cơ khác của lớp thứ nhất ( vị trí 3) hình 2.

1: vị trí 1 2: vị trí 2

hơ

3: vị trí 3

ạy

Kè

Q uy

Hình 2: Cấu trúc khối của γ –Al2O3

m /+

Hình 3:Hai lớp đầu tiên của tinh thể γ– Al2O3 Các thông số của γ–Al2O3:

Khối lượng riêng của γ–Al2O3: 3,20 – 3,77 g/cm3;

Hệ số khuếch tán của tinh thể γ–Al2O3: no=1,73, Ng=1,69, Np= 1,69;

Thông số ô mạng cơ sở của γ–Al2O3 (A0): a = 7,70 – 7,96, c = 7,82 – 7,92.

γ–Al2O3 có diện tích bề mặt khá lớn, chứa nhiều lỗ xốp có đường kính vào khoảng 30 ÷ 120Å. Thể tích lỗ xốp: 0,5 ÷ 1 cm3/g. Dạng γ–Al2O3 không tìm thấy trong tự nhiên, mà nó được tạo thành khi 16

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

nung Gibbsit, Bayerit, Nordstrandit và Boemit ở nhiệt độ khoảng 450÷6000C, hay trong quá trình phân hủy muối nhôm từ 900÷9500C. Trên bề mặt của γ–Al2O3 tồn tại hai loại tâm axit, đó là tâm axit Lewis và tâm axit Bronsted.

1.2.2.Ứng dụng làm chất hấp phụ của γ–Al2O3

hơ

Ứng dụng của các vật liệu mao quản là rất rộng trong nhiều ngành, nhiều lĩnh

vực. Nhôm oxit hoạt tính có độ phân tán cao và cấu trúc khuyết, ở dạng γ–Al2O3

Q uy

do có thể tích mao quản và diện tích bề mặt lớn, nên được sử dụng làm vật liệu hấp phụ, đặc biệt là trong công nghiệp dược phẩm, đặc tính hấp phụ của γ–

Al2O3 dùng để tách asen, flo trong nước sinh hoạt, tách các hợp chất đa vòng,

Kè

các chất hữu cơ dễ bay hơi và nghiên cứu khả năng tách một số chất độc trong

ạy

khói thuốc lá. Nhôm oxit còn có vai trò quan trọng trong việc làm khô chất lỏng

và khí, hấp phụ chọn lọc trong ngành xăng dầu.

m /+

Lương

Thông số kĩ thuât/

chất mang (mg/g)

Phản ứng (U/g)

Lipolytic Phản ứng

Hiệu

(U/g)

suất

(sau phản ứng)

(%)

vật liệu mang

Protein trên

Lipolytic

giản

1.Chất hấp phụ đơn

9,3

1,5

Polypropylene

8,1

333

41,1

Polyethylene

1,5

n.d.*

–

SiO2

15,7

6,1

Influsorial earth

20,0

0,9

n.d.

–

Silicagel

2.Hấp phụ có hình thành liên kết Polypropylene +

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

Glutaraldehyde Polyethylene +

n.d.

–

Amberlite IRC–50 (H)

14,9

600

40,3

Amberlite IR–4B (OH)

5,3

402

75,9

Dowex 2X8

7,1

280

39,4

Colophony

17,5

255

CaSO4.2H2O

19,5

571

29,3

CaCO3

19,7

529

26,9

Al2O3

19,7

181

9,2

Glutaraldehyde

hơ 14,6

4.Vật liệu hấp phụ

3.Hạt nhựa

m Kè

ạy

5.Zeolite

Q uy

dạng gel

6,1

2,0

Zeolite X

14,3

0,7

16,7

0,2

13,4

4,0

Zeolite UCC 6. Vật liệu bẫy

Sodium alginate

m /+

Zeolite Mox1

Bảng 2: So sánh khả năng hấp phụ của các chất mang ảnh hưởng đến hiệu suất

phản ứng của enzim trong quá trình thủy phân dầu[28]

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

Quy trình thực nghiệm

2.1. Tạo cao từ lá Dâu tằm bằng vật liệu γ–Al2O3 1. Phơi, sấy lá dâu tằm, nghiền để tạo bột lá. 2. Chiết 300g bột lá bằng 3 lít Etanol 30%, chia làm 2 lần bằng nhau, đánh siêu âm bằng máy UltraSonic trong 60 phút ở 40oC, ngâm chiết trong 3 ngày,

hơ

thu được dịch chiết.

3. Hấp phụ dịch chiết lên 300g hạt γ–Al2O3 trong vòng 48h thu được hạt hấp

phụ và dịch không hấp phụ.

Q uy

4. Rửa bằng 2 lít nước cất.

5. Nhả hấp bằng dung dịch EtOH có nồng độ giảm dần từ 90%đến 0%–

pH=9, chia làm hai phân đoạn. Phân đoạn thứ nhất gồm toàn bộ dịch nhả hấp

Kè

bằng EtOH có nồng độ 90–60%, phân đoạn hai từ 50%–0% EtOH.

m /+

ạy

6. Cất loại dung môi trong dịch nhả hấp thu được cao Dâu tằm.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

Bột lá Dâu tằm Chiết với 3 lít Etanol 30%, chia làm 2 lần, đánh siêu âm bằng máy UltraSonic trong 60 phút ở 40oC.

Q uy

Dịch không hấp phụ

Hấp phụ lên cột chứa hạt γAl2O3

hơ

Dịch chiết

Hạt γ-Al2O3 đã hấp phụ chất

Kè

1. Rửa nước cất 2. Nhả hấp bằng Ethanol có nồng độ 90% đến 0% - pH=9

m /+

ạy

Cao DT KHP

Dịch nhả hấp phụ EtOH 90

Cất loại dung môi

Cao DT30

Cao DT90

Dịch nhả hấp phụ EtOH 30

Sơ đồ 1: Quy trình tạo cao Dâu tằm

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

2.2. Thử hoạt tính cao DT 2.2.1. Hoạt tính hạ đường huyết

Vật liệu – Hoá chất • Hoạt chất nghiên cứu Phân đoạn: DT EtOH 30, DT KHP

• Hóa chất: Alloxan monohydrate (Sigma Aldrich).

hơ

• Động vật: chuột thuần chủng dòng BALB/c khoẻ mạnh, không mắc bệnh,

có khối lượng từ 22– 26g, không phân biệt giống, được nuôi tại khu nuôi động

Q uy

vật của Viện Công nghệ sinh học. Chuột được cho ăn thức ăn tiêu chuẩn và nước uống tự do.

• Dụng cụ thí nghiệm: kim cong đầu tù dùng để uống, kim tiêm và các thiết

Kè

bị phụ trợ khác.

ạy

• Thiết bị xác định nồng độ glucose: Nồng độ glucose trong huyết thanh

chuột được định lượng bằng phương pháp so màu, thực hiện trên máy định

m /+

lượng sinh hoá bán tự động AU680 của hãng Beckman Coulter.

Phương pháp

• Phương pháp pha mẫu thử

Động vật cho uống 0,2 ml mẫu /con/ngày. Và chất đối chứng uống nước

cất 0,2 ml/con/ngày.

• Phương pháp gây tăng đường huyết bằng Alloxan monohydrate

o Chuẩn bị chuột thí nghiệm: Lấy máu định lượng glucose trong huyết

thanh (Chuột được nhịn đói hoàn toàn trước đó 12 giờ),loại bỏ những con chuột

có glucose huyết ban đầu quá cao hoặc quá thấp o Quá trình thí nghiệm:

- Gây tăng đường huyết cho chuột bằng cách tiêm dung dịch Alloxan monohydrate ở nồng độ 180 mg/kgP/1 lần duy nhất, tiêm dưới da bụng (Chuột

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

được nhịn đói hoàn toàn trước đó 12 giờ theo phương pháp của Yanarday và Colak, 1998) - Sau 72 giờ tiêm Alloxan monohydrate, lấy máu định lượng glucose trong huyết thanh (chuột được nhịn đói hoàn toàn trước đó 12 giờ), những con chuột có glucose huyết lớn hơn hoặc bằng 8 mmol/L thì được coi là mắc bệnh tiểu

đường (N.A.Rahman et al, 2011).

hơ

• Phương pháp kiểm tra hoạt tính hạ glucose huyết của các chất chiết

Sau khi gây tăng đường huyết cho chuột bằng cách tiêm dung dịch

Q uy

Alloxan monohydrate ở nồng độ 180 mg/kgP/1 lần duy nhất, tiêm dưới da bụng (Chuột được nhịn đói hoàn toàn trước đó 12 giờ) theo phương pháp của

Yanarday và Colak, 1998)

Kè

Ngày 0: Những con chuột có nồng độ glucose trong huyết thanh lớn hơn

ạy

hoặc bằng 8 mmol/L được chọn để nghiên cứu hoạt tính hạ glucose huyết của các mẫu chiết bằng phương pháp uống qua kim uống đặc biệt. 20 con chuột thí

m /+

nghiệm (được lựa chọn trong tổng số 25 con chuột được tiêm Alloxan monohydrate) được chia thành 4lô thí nghiệm sao cho các lô có trị số glucose

huyết trung bình ban đầu tương đương nhau (5 con/lô).

• Lô 1: Chứng bệnh lí, uống dung môi nước hòa tan mẫu (0,2 ml/con/ngày)

• Lô 2: Thuốc thử phân đoạn DT 30 ở nồng độ 500 mg/kgP/ngày

• Lô 3: Thuốc thử phân đoạn DT KHP ở nồng độ 400 mg/kgP/ngày

• Lô 4: Thuốc thử phân đoạn DT90 ở nồng độ 500 mg/kgP/ngày

Ngày 9: Cho chuột uống mẫu thử hoặc nước trong 9 ngày, mỗi ngày cho chuột

uống 1 lần vào buổi sáng. Ngày thứ 9, sau 1 giờ uống thuốc lần cuối cùng, lấy máu chuột để định lượng glucose huyết (chuột đã được nhịn đói 12 giờ trước). • Phương pháp xử lí số liệu

Số liều được xử lí trên Excell. Tính mức độ giảm glucose huyết của từng lô sau khi được thử mẫu với lô đối chứng. So sánh mức độ giảm giữa các lô thử và lô đối chứng theo phương pháp thống kê sinh học qua phần mềm Prism 4.0. 22

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

Kết quả • Khối lượng của chuột trước và sau khi thí nghiệm

Khi bị bệnh tiểu đường thì khối lượng của cơ thể sẽ bị sụt giảm do rốiloạn chuyển hóa cacbohydrat khi hormone insulin của tụy bị thiếu hay giảm tác động trong cơ thể. Do vậy, kiểm tra khối lượng cơ thể trước và sau quá trình thí

nghiệm sẽ phần nào đánh giá được tình trạng bệnh. Kết quả kiểm tra khối lượng

Lô

trước khi thí nghiệm

sau khi thí nghiệm

(g/con)

DT 30

DT KHP

DT 90

28.22 ± 3.15

28.03 ± 2.34

28.67 ± 0.58

27.67 ± 1.75

28.89 ± 3.54

27.85 ± 3.0

ạy

27.95 ± 2.10

28.06 ± 2.13

H2O (ĐC)

m /+

Kè

Chất nghiên cứu

Khối lượng chuột

Q uy

Khối lượng chuột

hơ

động vật thí nghiệm được trình bày ở bảng 1.

Bảng 3. Khối lượng của chuột trước khi và sau khi thí nghiệm

Các kết quả trên chưa cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Do vậy,

kết quả kiểm tra sự sụt giảm khối lượng là không rõ ràng. Kết quả này có thể do thời gian thực hiện thí nghiệm ngắn (9 ngày) nên không cho thấy sự sụt giảm khối lượng ở chuột thí nghiệm. • Nồng độ glucose trong máu chuột thí nghiệm

Để kiểm tra tình trạng mắc bệnh tiểu đường thì việc lấy máu xác định nồng độ glucose trong huyết thanhlà cần thiết và rất quan trọng. Bởi vì, khi kiểm tra mức độ glucose trong huyết thanh sẽ cho biết tình trạng bệnh ở mức độ nào, 23

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

cũng như khả năng phục hồi của người bệnh sau khi được điều trị bằng những hoạt chất có tác dụng hạ đường huyết và có tiềm năng sử dụng để chữa trị đái tháo đường. Đồng thời từ đó đưa ra những giải pháp phù hợp để kiểm soát cũng như phòng ngừa sớm bệnh. Kết quả kiểm tra nồng độ glucose trong huyết thanh

% Glucose

giảm so với

giảm so với đối chứng

Q uy

ngày 0

hơ

Chất nghiên cứu

% Glucose

Lô

được trình bày ở bảng 2.

Nước cất (ĐC)

14.25

DT 30

31.74

17.49

DT KHP

25.78

10.84

DT 90

4.82

ạy

Kè

m /+

Bảng 4. Nồng độ glucose trong máu chuột trước và sau khi được sử dụng các chất chiết

Kết quả bảng 2 cho thấy: Sau khi gây bệnh tiểu đường bằng Alloxan và

sau 9 ngày sử dụng chất chiết DT 30, DT KHP cũng như không sử dụng ĐC

H2O thì nồng độ glucose huyết thanh đều giảm so với lúc chưa sử dụng chất

chiết.DT90 không gây giảm nồng độ Glucose huyết. Nồng độ glucose huyết thanh trong các mẫu thử giảm 31.74%, 25.78%,

một cách tương ứng so với lúc chưa sử dụng chất chiết. Trong khi đó, ĐC nước cũng giảm 14.25% một cách tương ứng. Điều này cho thấy hiệu quả gây đường huyết cao cấp tính của Alloxan monohydrate đã bị suy giảm phần nào. Tuy nhiên, DT EtOH 30, DT KHP so với đối chứng vẫn giảm 17.49%, 10.84% một cách tương ứng.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

2.5.1. Hoạt tính ức chế α–amylase và α–glucosidase

Phương pháp o Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế α–amylase:

– Hoá chất, thiết bị: DMSO (Merck), đệmPhotphat pH 7,0, α–glucosidase Sigma–Aldrich),

Aldrich),

acarbose

p–nitrophenyl–α–D–glucopyranoside phiến

lượng

Mark

hơ

(Sigma–Aldrich).Máyđọc

(Sigma–

(G0660,

Microplate Absorbance Spectrophotometer.

Q uy

–Hoạt tính ức chế α–glucosidase được thực hiện dựa vào phản ứng thủy phân p– nitrophenyl–α–D–glucopyranoside(pNPG) dưới xúc tác α–glucosidase trong sự

có mặt/không có hoạt chất nghiên cứu. Cụ thể, tra 2 µL mẫu (pha trong DMSO ở

Kè

các nồng độ phù hợp) cùng với 40 µL enzym α–glucosidase (0,5 U/mL) vào phiến 96 giếng có chứa sẵn 120 µL đệmPhotphatrồi ủ trong 5 phút. Sau đó bổ

ạy

sung 40 µL pNPG (5 mM pha trong đệm phốt–phát) rồi tiếp tục ủ hỗn hợp trong

30 phút ở 37°C. Hoạt động của enzym được định lượng bằng cách đo độ hấp thụ

m /+

của sản phẩm p–nitrophenol ở bước sóng dài 405 nm. Acarbose được sử dụng làm đối chứng dương.

o Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế α–amylase:

– Hoá chất, thiết bị: DMSO, đệm phốt phát pH 7,0, α–amylase (A3176, Sigma–

Aldrich), p–nitrophenyl–α–D–maltohexaoside (Sigma–Aldrich), Máy đọc phiến

vi lượng xMark Microplate Absorbance Spectrophotometer.

– Hoạt tính ức chế α–amylase được thực hiện dựa vào phản ứng thủy phân p–

nitrophenyl–α–D–maltohexaoside (pNPM) dưới xúc tác α–amylase trong sự có

mặt/không có hoạt chất nghiên cứu. Cụ thể, tra 2 µL mẫu (pha trong DMSO ở các nồng độ phù hợp) cùng với 45 µL enzym α–amylase (10 U/mL) vào phiến 96 giếng có chứa sẵn 110 µL đệm Photphatrồi ủ trong 5 phút. Sau đó bổ sung 45 µL pNPM (5 mM pha trong đệm Photphat) rồi tiếp tục ủ hỗn hợp trong 30 phút ở 37°C. Hoạt động của enzym được định lượng bằng cách đo độ hấp thụ của sản 25

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

phẩm p–nitrophenol ở bước sóng dài 405 nm. Acarbose được sử dụng làm đối chứng dương. Kết quả được tính theo công thức sau: % Ức chế = ((ODc+ – ODc–) – (ODs – ODb))/(ODc+ – ODc–) x 100

Trong đó:

hơ

ODc+: Mật độ quang trung bình của mẫu chứng dương (không có mẫu thử, có enzyme; trường hợp này coi như giá trị ức chế 0%);

ODc–: Mật độ quang trung bình của mẫu trắng (không có mẫu thử và

Q uy

enzyme; trường hợp này coi như giá trị ức chế 100%); ODs: Mật độ quang trung bình của mẫu thử;

Kè

ODb: Mật độ quang trung bình mẫu trắng (có mẫu thử, không có enzyme). Nồng độ ức chế 50%, IC50 được xây dựng dựa trên 5 nồng độ thử nghiệm.

Kết quả

α–amylase

α–glucosidase

DT96

>1000

DT KHP

>1000

DT30

36,6

573,8

Acarbose (đối chứng)

34,5

484,1

Tên mẫu

m /+

mềm Graphpad Prism 5.0.

ạy

Giá trị IC50 được xác định theo phương pháp hồi quy phi tuyến tính trên phần

Bảng 9. Hoạt tính ức chế α–amylase vàα–glucosidase (IC50, µg/mL) của các mẫu thử nghiệm Kết quả thử nghiệm cho thấy mẫu DT30 cho tác dụng ức chếα–amylase mạnh với giá trị IC50 là 36,6 µg/mL tươngđương vớiđối chứng dươngacarbose.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

Mẫu này cũng có tác dụng ức chế với enzyme α–glucosidase (IC50 là 573,8 µg/mL). Mẫu DT90 và DT KHP không thể hiện hoạt tính ức chế hai loại enzym

trên. 2.3. Công thức dập viên nén Với kết quả thử nghiệm như trên, có thể thấy hoạt tính chống tiểu đường

của cao chiết lá Dâu tằm tập trung hầu hết ở phân đoạn DT30. Do đó, chúng tôi

hơ

sử dụng cao chiết phân đoạn này để tiến hành dập viên nén.

Thành phần

Q uy

Dưới đây là công thức dập viên:

Khối lượng

Bột cao khô lá Dâu tằm

50 mg

80 mg

Lactose anhydrous

60 mg

ạy

Kè

Avicel 102 (Microcrystalline Cellulose)

1,9 mg

Magnesi stearate

m /+

Bảng 5: Thành phần viên nén

o Dập viên khối lượng trung bình là 190 mg ± 10 mg.

o Độ cứng trung bình: 70 N – 80 N.

2.4. Thử độc tính cấp của viên nén

2.4.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị

Hoạt chất nghiên cứu: viên nén DT chứa hoạt chất chính ở nồng độ 50

mg/viên Hóa chất: Alloxan monohydrate (Sigma Aldrich), nước cất Động vật: chuột thuần chủng dòng BALB/c khoẻ mạnh, không mắc bệnh, được nuôi tại khu nuôi động vật của Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chuột được cho ăn thức ăn tiêu chuẩn và nước uống tự do. 27

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

Dụng cụ thí nghiệm: kim cong đầu tù dùng để uống, kim tiêm và các thiết bị phụ trợ khác. Thiết bị xác định nồng độ glucose: Nồng độ glucose trong huyết thanh chuột được định lượng bằng phương pháp so màu, thực hiện trên máy định lượng sinh hoá bán tự động AU680 của hãng Beckman Coulter.

2.4.2. Phương pháp

hơ

Phương pháp pha mẫu thử: Viên nén DT với nồng độhoạt chất chính là

•

50 mg/viên tan tốt trong nước do vậy khá dễ khi cho động vật uống. •

Q uy

Phương pháp thử độc cấp tính của viên nén DT

42 chuột BALB/c khoẻ mạnh, khối lượng khoảng 22–26 gram, không

Kè

phân biệt giống, được nuôi tại khu nuôi động vật của Viện Công nghệ Sinh học dưới điều kiện tiêu chuẩn về nhiệt độ, ánh sáng, được chia làm 7 lô (6 chuột/lô),

ạy

và bị bỏ đói hoàn toàn 16 giờ trước khi cho uống viên nén DT. Viên nén DT

được cho uống một lần duy nhất ở các ở nồng độ 4000, 5000 và 6,000 mg/kg thể

m /+

trọng (kgP) cùng với 1 lô đối chứng uống nước (ở thể tích tối đa với dạ dày

chuột trong khoảng 1,5–2,0 ml/con), tương ứng với 11 lô thí nghiệm. Sau khi cho uống 1–2 giờ, chuột được nuôi dưỡng bình thường trở lại (cho ăn, uống tự

do) và theo dõi liên tục trong 72 giờ để xác định số chuột chết trong từng lô và

tính giá trị LD50 theo công thức của Abraham (1978) và Turner (1965).

• Công thức tính giá trị LD50

LD50 = X k −

d d k −1 − .∑ mi 2 n i=2

Trong đó: LD50: liều chết 50% động vật thí nghiệm n: số động vật sử dụng trong từng lô thí nghiệm k: số lô động vật 28

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

mi: số động vật chết đếm theo từng lô trong 72 giờ d: khoảng cách giữa các mức liều Xk: liều thuốc thấp nhất gây chết 100% động vật thí nghiệm •

Phương pháp xử lí số liệu

hơ

Các số liệu được sử lí trên Excel, thuật toán thống kê student t’ test, F’test và phương pháp phân tích phương sai một nhân tố ngẫu nhiên (one way

Q uy

ANOVA) và sử dụng hệ số LSD (least–significant difference) để kiểm tra sự sai khác có ý nghĩa so với đối chứng âm (uống nước), với đối chứng acarbose. Nếu p<0.05 được coi là sai khác có ý nghĩa thống kê, nếu p>0.05 thì sự sai khác

Kè

không có ý nghĩa thống kê.

ạy

2.4.3. Kết quả

Độc tính cấp của viên nén DT được tiến hành theo phương pháp của

m /+

Abrham (1978) như đã mô tả trong phần phương pháp. Sau khi cho uống viên nén DT, chuột được theo dõi liên tục trong vòng 24 giờ đối với các biểu hiện

chức năng, đồng thời đếm số lượng chuột chết ở từng lô trong vòng 72 giờ. Kết

quả thu được về tính độc cấp của viên nén DT được trình bày ở bảng Lô

số chuột chết/số

Biểu hiện chức

(mg/kgP)

chuột sống sau

năng trong vòng

72 giờ

24 giờ

25 –72 giờ

0/6

chuột di chuyển,

Liều

4000

thu nhận thức ăn và thu nhận thức ăn và nước uống bình

nước uống bình

thường, phản xạ

ánh sáng và âm

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

5000

Báo cáo nghiên cứu khoa học

0/6

thanh tốt

chuột di chuyển,

thu nhận thức ăn và thu nhận thức ăn và thường, phản xạ

ánh sáng và âm

thanh tốt

hơ

thường, phản xạ

6000

nước uống bình

0/6

chuột di chuyển,

Q uy

nước uống bình

thu nhận thức ăn và thu nhận thức ăn và

nước uống bình

Kè

thường, phản xạ

0/6

chứng

m /+

Đối

thường, phản xạ

ánh sáng và âm

thanh tốt

chuột di chuyển,

ạy D

nước uống bình

thu nhận thức ăn và thu nhận thức ăn và nước uống bình

nước uống bình

thường, phản xạ

ánh sáng và âm

thanh tốt

Bảng 6. Độc tính cấp của viên nén DT trên chuột BALB/c

Kết quả bảng cho thấy, chuột ở tất cả các lô đều không bị chết dù được uống DT ở nồng độ tối đa 6000 m/kgP/lần duy nhất. Theo dõi sự biểu hiện chức năng của chuột thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy chuột ở tất cả các lô đều khỏe mạnh, di chuyển và ăn uống bình thường, phản xạ ánh sáng và âm thanh tốt.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

Như vậy, viên nén DT ở các nồng độ nghiên cứu không thể hiện độ độc cấp tính. Vì hoạt chất chính chỉ chứa 50 mg/viên, trong khi đó khối lượng của 1 viên nén nằm khoảng 1900 mg, nên chúng tôi đã thử liều tối đa có thể trong thí nghiệm này là 6000 mg hoạt chất chính có trong viên nén DT và kết quả cho thấy viên nén này không gây chết chuột thí nghiệm. Do vậy, chúng tôi cho rằng

viên nén DT không thể hiện độ độc cấp tính nên không xác định được giá trị

hơ

LD50 (liều gây chết 50% động vật thí nghiệm).

2.5. Thử hoạt tính của viên nén

•

Q uy

2.5.1. Phương pháp

Phương pháp gây tăng đường huyết và xác định khả năng hạ glucose

Kè

huyết của các chất chiết

Gây tăng đường huyết cho 32 con chuột (khối lượng từ 27–31g) bằng

ạy

cách tiêm dung dịch Alloxan monohydrate ở nồng độ 180 mg/kgP/1 lần duy

nhất, tiêm dưới da bụng (chuột được nhịn đói hoàn toàn trước đó 12 giờ) theo

m /+

phương pháp của Yanarday và Colak, 1998). Lấy máu định lượng glucose trong huyết thanh (sau 72 giờ tiêm Alloxan

monohydrate, chuột được nhịn đói hoàn toàn trước đó 12 giờ). Sau khi định

lượng glucose chọn những con chuột có glucose huyết lớn hơn hoặc bằng 8

mmol/L thì được coi là mắc bệnh tiểu đường (N.A.Rahman et al, 2011). 18 con

chuột thí nghiệm (được lựa chọn trong tổng số 32 con chuột được tiêm Alloxan

monohydrate) được chia thành 3 lô thí nghiệm (6 chuột/lô) sao cho các lô có trị số glucose huyết trung bình ban đầu tương đương nhau và bắt đầu cho uống các

chất chiết (ngày 0). Cho chuột uống viên nén thử hoạt tính hoặc thuốc thương phẩm hoặc nước cất trong 9 ngày, mỗi ngày cho chuột uống 1 lần vào 9h sáng. o

Ngày thứ 9, sau 1 giờ uống thuốc lần cuối cùng, lấy máu chuột để định

lượng glucose huyết (chuột đã được nhịn đói 12 giờ trước).

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

Đánh giá tác dụng của hoạt chất dựa vào sự giảm nồng độ Glucose trong

huyết thanh trước và sau khi cho uống hoạt chất. o

Bố trí thí nghiệm như sau:

Lô 1: Chứng bệnh lí, uống dung môi nước hòa tan mẫu (0,2

ml/con/ngày) Lô 2: Viên nén DT ở nồng độ 1000 mg/kgP/ngày

Lô 3: uống Acarbose liều 5 mg/kgP/ngày.

hơ

Công thức tính % nồng độ đường huyết tăng hoặc giảm so với trước khi

Q uy

thí nghiệm

% giảm so với trước thí nghiệm = 100 × (G1 – G2)/G1

Kè

% tăng so với trước thí nghiệm = 100 × (G2 – G1)/G2 G1: nồng độ glucose trước thí nghiệm

ạy

Trong đó:

m /+

G2: nồng độ glucose sau thí nghiệm •

Phương pháp xử lí số liệu

Các số liệu được sử lí trên Excel, thuật toán thống kê Student t’ test, F’test

và phương pháp phân tích phương sai một nhân tố ngẫu nhiên (one way

ANOVA) và sử dụng hệ số LSD (least–significant difference) để kiểm tra sự sai

khác có ý nghĩa so với đối chứng âm (uống nước), với đối chứng acarbose. Nếu p<0.05 được coi là sai khác có ý nghĩa thống kê, nếu p>0.05 thì sự sai khác

không có ý nghĩa thống kê. 2.5.2. Kết quả

Khi bị bệnh tiểu đường thì khối lượng của cơ thể sẽ bị sụt giảm do rốiloạn chuyển hóa cacbohydrate khi hoocmon insulin của tụy bị thiếu hay giảm tác động trong cơ thể. Do vậy, kiểm tra khối lượng cơ thể trước và sau quá trình thí

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

nghiệm sẽ phần nào đánh giá được tình trạng bệnh. Kết quả kiểm tra khối lượng

Khối lượng chuột

trước khi thí

sau khi thí nghiệm

Q uy

nghiệm (g/con)

hơ

Khối lượng chuột

Chất nghiên cứu

Lô

động vật thí nghiệm được trình bày ở bảng 7.

(g/con)

H2O (ĐC)

29.03 ± 1.42

DT: 1000 mg/kg

29.18 ± 1.09

28.85 ± 0.98

Acabose

29.27 ± 1.07

29.00 ± 1.11

27.50 ± 1.22

ạy

Kè

m /+

Bảng 7. Khối lượng của chuột trước khi và sau khi thí nghiệm Bảng 7 cho thấy: chuột ở tất cả các lô đều giảm khối lượng cơ thể động vật

thí nghiệm. Điều này cho thấy rõ đã tạo thành công mô hình động vật bị tiểu

đường. Tuy nhiên, ở lô được uống viên nén DT khối lượng cơ thể động vật thí

nghiệm giảm ít hơn so với lô đối chứng sự giảm này là không có sự sai khác

thống kê giữa các lô. Lô uống đối chứng tham khảo Acabose giảm khối lượng ít

nhất. Tuy nhiên, sự giảm khối lượng này ở các lô là không có sự sai khác thống kê so với trước khi uống mẫu. •

Nồng độ glucose trong máu chuột thí nghiệm Để kiểm tra tình trạng mắc bệnh tiểu đường thì việc lấy máu xác định

nồng độ glucose trong huyết thanh là cần thiết và rất quan trọng. Bởi vì, khi kiểm tra mức độ glucose trong huyết thanh sẽ cho biết tình trạng bệnh ở mức độ nào, cũng như khả năng phục hồi của người bệnh sau khi được điều trị bằng những hoạt chất có tác dụng trị đái tháo đường. Đồng thời từ đó đưa ra những 33

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

giải pháp phù hợp để kiểm soát cũng như phòng ngừa sớm bệnh. Kết quả kiểm tra nồng độ glucose trong huyết thanh được trình bày ở bảng 8.

nghiên cứu Nước cất (ĐC)

thời điểm

so đối

ngày 0

chứng

ngày 0

thí nghiệm

9.58 ± 1.02

13.05 ± 0.68

↑26.63

9.48 ± 0.71

8.30 ± 0.41*

↓12.40

39.03

Acabose

10.45 ± 2.13

7.20 ± 0.24*

↓31.10

57.73

Q uy

% giảm

sau 9 ngày

Lô

% so với

thời điểm

hơ

Chất

Kè

Ghi chú: * p<0.05, sự sai khác có ý nghĩa thống kê so với đối chứng

Bảng 8. Nồng độ glucose trong huyết thanh chuột

ạy

Kết quả bảng 8 cho thấy: sau khi gây bệnh tiểu đường bằng Alloxan và

được sử dụng các viên nén DTthì nồng độ glucose huyết thanh đều giảm so với

m /+

lúc chưa sử dụng chất chiết (ngày 0), trong khi đó ở lô đối chứng nồng độ

glucose vẫn tăng. Điều này cho thấy viên nén DT đã làm giảm 39.03% nồng độ glucose huyết thanh một cách tương ứng so với lúc chưa sử dụng chất chiết.

Như vậy, viên nén DT đã thể hiện tác dụng hạ đường huyết trên chuột gây

đái tháo đường bằng Alloxan monohydrate.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

III. KẾT LUẬN 1. Đề tài đã xây dựng thành công quy trình tạo cao có sử dụng vật liệu γ– Al2O3và tạo được sản phẩm cao chiết DT30 dựa trên quy trình này. Quy trình này rất đơn giản, không sử dụng những dung môi đắt tiền, độc hại, yếu tố công nghệ đơn giản.

2. Thử nghiệm về hoạt tính sinh học cho thấy cao DT30 có hoạt tính hạ

hơ

đường huyết khá tốt với chuột bị gây tiểu đường bằng Alloxan Monohydrate. So

sánh với cao lấy từ phân đoạn không hấp phụ

Q uy

3. Viên nén DT cho thấy cả hoạt tính hạ đường huyết lẫn hoạt tính ức chế các enzim α–amylase vàα–glucosidase với liều lượng nhỏ. Bên cạnh đó, viên

nén này không hề thể hiện độc tính cấp ở liều cao, độ an toàn rất cao nên hoàn

Kè

toàn có thể tiến hành tiếp các thử nghiệm trên lâm sàng để tiến tới đưa sản phẩm

ạy

này ra thị trường.Nếu sớm được ứng dụng rộng rãi, đây sẽ là một sản phẩm

không chỉ có ích cho người tiêu dùng mà còn là một sản phẩm có giá trị thương

m /+

mại cao, đem tới lợi nhuận không nhỏ cho nhà sản xuất.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

IV. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1] Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, tập 2, NXB Khoa Học và KỹThuật, Hà Nội, 345.

hơ

[2] Bộy tế– viện dược liệu (1990), Cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản khoa học

và kỹthuật Hà Nội, 275–276.

Q uy

[3] ĐỗTất Lợi (1981), Những cây thuốc và vịthuốc Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹthuật Hà Nội, 900.

[4] Lê Trần Đức (1997), Cây thuốc Việt Nam – trồng hái chếbiến trịbệnh ban

Kè

đầu, Nhà xuất bản nông nghiệp, Hà Nội, 889–890.

ạy

[5] Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà

m /+

Nội, 720–723.

TIẾNG ANH

[6] Taro N., Toshio F., Sachiko Y., Masa K. (1976), Phenolic constituents of the

cultivated Mulberry Tree (Morus alba L.), Chemical Pharmaceutical Buletin,

24(11), 2892–2900.

[7] Taro N., Toshio F., Sachiko Y., Masa K. (1978), Studies on the Constituents of the cultivated Mulberry Tree.I.Three new prenylflavones from the Root Bark of Morus alba L., Chemical Pharmaceutical Buletin, 26(5), 1394–1402. [8] Taro N., Toshio F. (1978), Heterocycles, 9, 635. [9] Mitsuo T., shigemitsu N., Tadashi M., Akira S., Kokichi T. (1980), Chalcomoracin, a nature Diels–Alder adduct from diseased mulberry, Chemistry Letters, 1573–1576. 36

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

[10] Yoshio H., Yoko M., Manmiko Y., Taro N. (1989), Correlation between albanol B and mulberrofuran I and structure of mulberrofuran S, novel 2– arylbenzofuran derivative, Heterocycles, 28 (2), 745–750 [11] Jiang D., Zhen D.H., Ren W.J., Wen C.Y., Hong X.X., Paul P.H. (2003), Antiviral flavonoids from the root bark of Morus alba L., Phytochemistry, 62,

hơ

1235–1238.

[12] Park K.M., You J.S., Lee H.Y., Baek N.I., Hwang J.K. (2003), Kuwanon G:

Q uy

an antibacterial agent from the root bark of Morus alba L. against oral pathogens, Journal of Ethnopharmacology, 84, 181–185.

[13] Toshio F., Kazue S., Taro N., Hiroshi S. (2003), Antinephritis and radical

Kè

scavenging activity of prenylflavonoids, Fitoterapia, 74, 720–724.

ạy

[14] Abdel N.B.S., Hesham A., Beshbishy E., Makiko Y., Taro N., Toshio F.

(2005), Hypoglycemic effect of Egyptian Morus alba L. root bark extract: Effect

m /+

on diabetes and lipid peroxidation of streptozotocin–induced diabetic rats,

Journal of Ethnopharmacology, 100, 333–338. [15] Mi Z., Man C. (2009), In vivo hypoglycemic effects of phenolics from the

root bark of Morus alba L., Fitoterapia, 43, 156–158.

[16]Mi ZHANG, Rong–Rong WANG, Man CHEN, Han–Qing ZHANG, Shi

SUN, Lu–Yong ZHANG (2009), A New Flavanone Glycoside with Anti– proliferation Activity from the Root Bark of Morus alba, Chinese Journal of

Natural Medicines,Volume 7, Issue 2, March 2009, 105–107. [17] James A. Duke (1983), Handbook of energy crops, Unpublished Purdue University center for new crops & plants products. [18] Hano Y. (1989), Two new diels alder type adducts mulberrofuran T and Kwanon E from callus tissue of Morus alba L., Heterocycles, 29, 10–15. 37

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

[19] Leena S., Saowapak K., Surapote W. (2003), Quantitative analysis of aglycone quercetin in mulberry leaves Morus alba L. by capillary zone electrophoresis, Electrophoresis, 24, 1236–1241. [20] Jin–Won Kim, Soo–Un Kim, Heui Sam Lee, Iksoo Kim, Mi Young Ahn, Kang Sun Ryu (2003), Determination of 1–deoxynojirimycin in Morus

alba L. leaves by derivatization with 9–fluorenylmethyl chloroformate followed

hơ

by reversed–phase high–performance liquid chromatography, Journal of

Q uy

Chromatography A,Volume 1002(1–2), 20/5/ 2003, 93–99.

[21] Nguyen Tien Dat, Phung Thi Xuan Binh, Le Thi Phuong Quynh, Chau Van

Minh, Hoang Thanh Huong, Jung Joon Lee (2010), Cytotoxic prenylated

Kè

flavonoids from Morus alba, Fitoterapia, Volume 81 (8), 2010, 1224–1227

ạy

[22]Zhenzhong Yang, Yingchao Wang, Yi Wang, Yufeng Zhang (2012),

Bioassay–guided screening and isolation of α–glucosidase and tyrosinase

m /+

inhibitors from leaves of Morus alba, Food Chemistry,Volume 131 (2), 2012, 617–625

[23] Ine`s Thabtia, Walid Elfalleha, He´dia Hannachia, Ali Ferchichia, Maria Da

Graca Camposb (2012), Identification and quantification of phenolic acids and

flavonol glycosides in Tunisian Morus species by HPLC–DAD and HPLC–MS,

Journal of Functional Food ( 2 0 1 2 ), 367 –374

[24] Hirakura K., Fujimoto Y., Toshio F., Taro N. (1986), Two phenolic glycosides from the root bark of the cultivated mulberry tree (Morus lhou), Journal of Natural Products, 49, 218–224.

[25] Linuma, Taro N., Ohyama M., Tanaka T., Lang F.A. (1993), Three new phenolic–compounds from the roots of Sophora leachiana., Journal of Natural Products, 56, 2212–2215.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

[26] Alan R.L (1994), Cholesterol and triglyceride, Free Radical, Biology of Medicin. [27] Gow C. Y., She C. W. and Pin D. D. (1996), Extraction and identification of antioxidant components from the leaves of mulberry (Morus alba L.), Journal Agre Food Chen, 44, 1687 – 1690

hơ

[28] Vilmaminovska, Eleonorawinkelhausen and Slobodankakuzmanova

(2005), Lipase immobilized by different techniques on various support materials

Q uy

applied in oil hydrolysis, J. Serb. Chem. Soc. 70 (4) 609–624

[29]Jun Wang, Fu An Wu, Hui Zhao, Li Liu and Qiu Sheng Wu (2008), African

m /+

ạy

Kè

Journal of Biotechnology Vol. 7 (13), 4/7/ 2008, 2147–2155.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

MỤC LỤC TÓM TẮT CÔNG TRÌNH ................................................................................. 2 MÃ ĐỀ TÀI: ...................................................................................................... 2 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 2

I. ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................ 3

hơ

1. Tính cấp thiết của đề tài.............................................................................. 3

2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................... 3

Q uy

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu............................................................... 3 4. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 3

5. Kết cấu của đề tài ....................................................................................... 4

Kè

II. NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................. 5

ạy

1. Cơ sở khoa học của nghiên cứu .................................................................. 5 1.1. Tổng quan về cây dâu tằm ...................................................................... 5

m /+

1.2. Tổng quan về vật liệu hấp phụ γ–Al2O3 ................................................ 15 2. Quy trình thực nghiệm.............................................................................. 19

2.1. Tạo cao từ lá Dâu tằm bằng vật liệu γ–Al2O3 ...................................... 19 2.2. Thử hoạt tính cao DT ........................................................................... 21

2.3. Công thức dập viên nén ........................................................................ 27

2.4. Thử độc tính cấp của viên nén .............................................................. 27 2.5. Thử hoạt tính của viên nén ................................................................... 31

III. KẾT LUẬN .............................................................................................. 35 IV. TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................ 36