Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định 5 hydroxymethylfurfural trong thuốc sắc ký khí khối phổ by Dạy Kèm Quy Nhơn Official

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

H Ư

ẠO

U Y

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TR ẦN

TÀO THỊ PHƯƠNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

10 00

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH 5-HYDROXYMETHYLFURFURAL TRONG THUỐC, NƯỚC NGỌT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ - KHỐI PHỔ

HÀ NỘI 2016

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

U Y

TÀO THỊ PHƯƠNG

10 00

TR ẦN

H Ư

ẠO

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH 5-HYDROXYMETHYLFURFURAL TRONG THUỐC, NƯỚC NGỌT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ - KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

MÃ SỐ : 60720410

ÁN

-L

Í-

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT

2. PGS.TS. Phạm Thị Thanh Hà

IỄ N

ÀN

Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Vũ Công Sáu

HÀ NỘI 2016

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

LỜI CÁM ƠN

tình và có hiệu quả của rất nhiều cá nhân và tập thể, của các thầy cô giáo, các

Hoàn thành bản luận văn này tôi đã nhận được sự giúp đỡ, hỗ trợ nhiệt

bạn đồng nghiệp xa gần.

U Y

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Phạm Thị

Thanh Hà - Giảng viên Bộ môn Hóa phân tích và độc chất - Trường Đại học

Dược Hà Nội và TS. Vũ Công Sáu - Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an là

ẠO

những người thầy đã hướng dẫn, tận tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình nghiên

cứu và hoàn thành luận văn này.

Tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học, các thầy

H Ư

giáo, cô giáo Bộ môn Hóa phân tích và độc chất và các bộ môn khác của trường

trong suốt thời gian học tập.

TR ẦN

Đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức quý báu

Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo và các cán bộ Phòng Hóa lý, cán bộ Trung

10 00

tâm Giám Định Ma Túy - Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an đã giúp đỡ tôi

trong quá trình thực nghiệm. Nhân dịp này, tôi xin gửi lời cám ơn tới TS.

Nguyễn Xuân Trường - Giám đốc Trung tâm Giám Định Ma Túy, Thầy đã tạo

Í-

điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài này.

-L

Tôi luôn ghi nhớ đến sự giúp đỡ, chia sẻ cả về vật chất cũng như tinh thần

ÁN

của mọi thành viên trong gia đình, bạn bè tôi, đó là nguồn động lực mạnh mẽ,

Trân trọng cảm ơn!

IỄ N

ÀN

niềm khích lệ to lớn giúp tôi yên tâm học tập, nghiên cứu.

DS. Tào Thị Phương

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH

Chương 1. TỔNG QUAN ................................................................................

U Y

ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................

ẠO

1.1. Tổng quan về 5-HMF .................................................................................

1.1.1. Cấu trúc và công thức cấu tạo .................................................................

H Ư

1.1.2. Tính chất vật lý .........................................................................................

TR ẦN

1.1.3. Tính chất hoá học ....................................................................................

3 3 3 3 3

1.1.5. Quá trình chuyển hoá và độc tính của 5-HMF ......................................

10 00

1.1.4. Điều chế ....................................................................................................

1.2. Phương pháp sắc ký khí khối phổ ............................................................

1.1.6. Một số phương pháp định lượng 5-HMF ...............................................

Í-

1.2.1. Đại cương về sắc ký khí ...........................................................................

1.2.3. Một số thông số đặc trưng .......................................................................

ÁN

-L

1.2.2. Detector khối phổ......................................................................................

ÀN

1.2.4. Ứng dụng của sắc ký khí khối phổ ..........................................................

IỄ N

1..2.4.1. Phân tích định tính ................................................................................

18 18

1.2.4.2. Phân tích định lượng .............................................................................. 18 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................

2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

2.2. Hoá chất và thiết bị ....................................................................................

2.2.2. Thiết bị, dụng cụ ..................................................................................

2.2.1. Hoá chất, dung môi .................................................................................. 19

2.4. Phương pháp nghiên cứu ..........................................................................

U Y

2.3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................

ẠO

2.3.1. Lấy mẫu và xử lý mẫu .............................................................................. 20

2.3.2. Xây dựng phương pháp phân tích ........................................................... 20

H Ư

2.3.3. Thẩm định phương pháp định lượng 5-HMF trong thuốc, nước ngọt

TR ẦN

bằng GC-MS ...................................... ...................................... ......................... 21 23

2.4. Phương pháp xử lý số liệu .........................................................................

10 00

2.3.4. Bước đầu áp dụng phương pháp khảo sát một số mẫu thực tế .............

Chương 3. KẾT QUẢ........................................................................................

3.1. Xây dựng phương pháp phân tích............................................................. 25

Í-

3.1.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn.......................................................................

ÁN

-L

3.1.2. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký khí khối phổ....................................

3.2. Thẩm định phương pháp định lượng 5-HMF trong thuốc, nước ngọt

ÀN

bằng GC-MS .....................................................................................................

IỄ N

3.2.1. Tính phù hợp của hệ thống .....................................................................

25 25 34 34

3.2.2. Khảo sát tính chọn lọc, đặc hiệu..............................................................

3.2.3. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng ................................................

3.2.4. Khoảng nồng độ tuyến tính .....................................................................

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

3.2.3. Độ đúng và độ chính xác .........................................................................

Chương 4. BÀN LUẬN .....................................................................................

3.3. Bước đầu ứng dụng phương pháp khảo sát một số mẫu ........................ 40

U Y

4.1. Về phương pháp GC-MS ........................................................................... 44

4.2. Về quy trình phân tích ............................................................................... 45

ẠO

4.3. Về thẩm định phương pháp ......................................................................

4.4. Ứng dụng của phương pháp phân tích ....................................................

46 48

H Ư

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..........................................................................

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

10 00

TR ẦN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

IỄ N

ÀN

ÁN

Ơ H N U Y .Q TP

10 00

TR ẦN

H Ư

ẠO

5-Hydroxymethylfurfural Giá trị trung bình Acetonitril Hiệp hội các nhà Hóa phân tích Hệ số bất đối Nồng độ (5-Carboxylic acid-2-furoyl) amino methan Ion hóa hóa học Chương trình nhiệt độ Dung dịch Ion hóa trên cơ sở va đập điện tử Acid furoic Acid 2,5- furandicarboxylic Sắc ký khí Acid 5-hydroxymethyl-2-furanoic N-(5-hydroxymethyl-2-furoyl)glycine Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chất chuẩn nội Sắc ký lỏng Nồng độ ức chế 50% Giới hạn phát hiện Giới hạn định lượng Methanol Khối phổ Nước ngọt Độ lệch chuẩn tương đối Diện tích pic Độ lệch chuẩn Sắc ký 5-Sulfoxymethylfurfural Sulfotransferase Tiêu chuẩn Việt Nam Tài liệu tham khảo Thực phẩm chức năng Thời gian lưu

Í-

ACN AOAC AF C CAFAM CI CTNĐ Dd EI FA FDCA GC HMFA HMFG HPLC IS LC LD50 LOD LOQ MeOH MS NN RSD S SD SK SMF SULT1A1 TCVN TLTK TPCN TR

: : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : :

-L

5-HMF

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Bảng 1.2: Một số nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ ..............

U Y

Bảng 1.1: Một số nghiên cứu bằng phương pháp đo quang ....................................

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.3: Một số nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

ẠO

Bảng 1.4: Một số nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ ..........

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát các mức năng lượng va chạm ......................................

H Ư

Bảng 3.2: Sắc ký đồ theo các chương trình nhiệt độ .................................................

TR ẦN

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát theo các chương trình nhiệt độ ..................................

29 30

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát nhiệt độ ban đầu . ............................................................

Bảng 3.4: Sắc ký đồ của các chương trình có nhiệt độ ban đầu khác nhau ........

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống .......... .......... ......................

10 00

Bảng 3.6: Sắc ký đồ với tốc độ khí khác nhau ............................................................

Í-

Bảng 3.8: Kết quả S/N của các mẫu trắng thêm chuẩn .......... .......... .......... ............ 36 37

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác .......... .......... .......... .......... .....

ÁN

-L

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính .......... .......... .......... ..........

IỄ N

ÀN

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát một số mẫu thực tế .......... .......... .......... ......................

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Hình 1.2: Phản ứng tổng hợp 5-HMF từ đường …………………………………….

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của 5-HMF …………………………………………….

DANH MỤC CÁC HÌNH

U Y

Hình 1.3: Quá trình chuyển hoá của 5-HMF ………………………………………...

Hình 1.4: Sơ đồ thiết bị sắc ký khí ……………………………………………………. 14

ẠO

Hình 1.5: Detector khối phổ ……………………………………………………………

Hình 3.1: Hình ảnh phổ khối của 5-HMF ……………………………………………

H Ư

Hình 3.2: Cường độ tín hiệu của ion 97, 126 với năng lượng va chạm 1 - 4V

TR ẦN

Hình 3.3: Phổ khối với năng lượng va chạm là 2 V ……………….................……

15 25 27 27 33

Hình 3.5: Sắc ký đồ của mẫu thử với tốc độ khí là 1,0 ml/phút ………………….

10 00

Hình 3.4: Kết quả khảo sát tốc độ khí mang ………………………………………...

Hình 3.7: Sắc ký đồ mẫu trắng thêm chuẩn tại nồng độ 2 µg/ml ……………...

Hình 3.6: Kết quả khảo sát tính chọn lọc, đặc hiệu ………………………………

Í-

Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và diện tích pic ………...

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Hình 3.9: Kết quả phân tích 5-HMF trong mẫu thực tế …………………………...

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong tiêu chuẩn chất lượng thuốc, tiêu chí tạp chất liên quan biểu hiện

tính an toàn của thuốc luôn là vấn đề khó, đòi hỏi sự đầu tư nghiên cứu của

ngành kiểm nghiệm. Bên cạnh đó, trong thực phẩm, vấn đề mất an toàn vệ

sinh đang là vấn nạn đòi hỏi ngành kiểm nghiệm tìm phương pháp kiểm tra.

U Y

Trong những năm gần đây, nghiên cứu về 5-HMF ngày càng thu hút được sự

quan tâm chú ý của nhiều nhà khoa học. Đây là một sản phẩm chuyển hóa của đường, có thể có mặt trong rất nhiều loại sản phẩm. Các nghiên cứu đã cho

ẠO

thấy 5-HMF có khả năng gây kích thích đường hô hấp, da và niêm mạc [9],

có khả năng thúc đẩy khả năng hình thành và phát triển của các khối u [7].

H Ư

Hơn thế nữa, những sản phẩm chuyển hoá của 5-HMF như 5cloromethylfurfural, 5-sulfoxymethylfurfural có khả năng gây đột biến và ung

TR ẦN

thư (như ung thư đại tràng, ung thư gan, ung thư da) [31]. Năm 2012, Tổng cục tiêu chuẩn đo lường chất lượng Việt Nam cũng đã

10 00

ban hành tiêu chuẩn TCVN-9042:2012 xác định hàm lượng 5-HMF bằng phương pháp quang phổ có sử dụng thuốc thử p-toluidin [3]. Trong chuyên

luận glucose của dược điển Việt Nam IV [2] cũng mới chỉ đưa ra phương

pháp xác định giới hạn 5-HMF bằng phương pháp đo quang. Tuy nhiên,

-L

Í-

phương pháp này lại không đặc hiệu, có thể bị ảnh hưởng bởi các chất trong

ÁN

nền mẫu, làm ảnh hưởng tới kết quả phân tích. Chính vì vậy cần phải có một

phương pháp có độ nhạy và tính chọn lọc cao để xác định 5-HMF trong chế

ÀN

phẩm. Trong khi đó, máy sắc ký khí kết nối detector khối phổ ra đời đã làm

IỄ N

tăng cao khả năng phân tích các tạp chất. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu

xây dựng phương pháp xác định 5-hydroxymethylfurfural trong thuốc, nước ngọt bằng phương pháp sắc ký khí - khối phổ” với 2 mục tiêu sau:

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Xây

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

dựng

và

thẩm

định

phương

pháp

xác

định

hydroxymethylfurfural trong thuốc, thực phẩm chức năng và nước ngọt bằng

phương pháp sắc ký khí khối phổ.

2. Ứng dụng phương pháp phân tích một số mẫu thuốc, thực phẩm chức

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

10 00

TR ẦN

H Ư

ẠO

U Y

năng và nước ngọt trên thị trường.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về 5-HMF

1.1.1. Cấu trúc và công thức cấu tạo [21]

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của 5-HMF

U Y

Công thức cấu tạo

ẠO

1.1.2. Tính chất vật lý [29]

- Khối lượng phân tử: M = 126,11 g.

- Dạng tinh thể, chất lỏng màu vàng đậm hoặc dạng bột, có mùi hoa cúc.

H Ư

- Nhiệt độ sôi: Ở áp suất 0,002 mmHg sôi ở 110 oC; ở áp suất 1 mmHg

TR ẦN

sôi ở 114-116 oC.

- Nhiệt độ nóng chảy: 31,5 oC.

- Độ tan: Tan trong nước, methanol, ethanol, aceton, ethyl acetat,

10 00

dimethylformamid; tan được trong ether, benzen, cloroform; ít tan trong

CCl4.

- Cực đại hấp thụ: 283 nm

Í-

1.1.3. Tính chất hoá học [21]

-L

Trong phân tử 5-HMF có chứa nhóm hydroxymethyl nên mang đầy đủ

ÁN

tính chất hóa học của một alcol. Bên cạnh đó, 5-HMF cũng dễ tham gia phản

ứng khử do có nhóm formyl.

IỄ N

ÀN

1.1.4. Điều chế Quá trình phản ứng tạo 5-HMF là một quá trình phức tạp, nó trải qua các

phản ứng isomer hoá, phản ứng loại nước, phản ứng tách và phản ứng ngưng tụ. 5-HMF được tổng hợp chủ yếu do quá trình mất nước của các phân tử monosacharid (glucose, fructose), disacharid hoặc polysacharid [21].

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Haworth [15] là người đầu tiên đề cập đến cơ chế dehydrat hoá fructose để tạo 5-HMF. Sau đó, Kuster [19], [21] đã đưa ra hai con đường chuyển hoá

của hexose thành 5-HMF: con đường a là quá trình chuyển đổi qua các hợp

10 00

TR ẦN

H Ư

ẠO

U Y

chất vòng trong khi con đường b lại thông qua các hợp chất mạch hở.

Hình 1.2. Phản ứng tổng hợp 5-HMF từ đường

1.1.5. Quá trình chuyển hoá và độc tính của 5-HMF

Hầu hết các thực phẩm hoặc sản phẩm chứa đường đều có thể chứa 5-

-L

Í-

HMF với hàm lượng khác nhau. Đặc biệt có những sản phẩm có thể chứa 5-

ÁN

HMF với hàm lượng lên đến 1 g/kg. 5-HMF cũng được tìm thấy trong một số

sản phẩm tự nhiên như mật ong, nước ép hoa quả [26].

IỄ N

ÀN

a) Quá trình chuyển hoá của 5-HMF Để theo dõi quá trình chuyển hoá của 5-HMF người ta gắn đồng vị

phóng xạ C14+ vào 5-HMF. Sau khi sử dụng, 5-HMF được hấp thu nhanh chóng, chuyển hóa và đào thải qua đường nước tiểu [5]. 5-HMF được chuyển thành acid 5-hydroxymethyl-2-furanoic (HMFA), sau đó HMFA kết hợp với glycin tạo N-(5-hydroxymethyl-2-furoyl)glycin (HMFG) – đây là sản phẩm chuyển hoá chính của 5-HMF, được đào thải chủ 4

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

yếu qua đường nước tiểu. Ở cả chuột và người, tỷ lệ HMFA/HMFG giảm khi mà 5-HMF tăng và glycin tự do giảm, kết quả dẫn tới sự đào thải acid furoic

(FA) hoặc 2,5-furandicarboxylic acid theo con đường thứ hai. Người ta đã tìm

thấy cả HMFA, HMFG và FDCA trong nước tiểu của chuột. Tuy nhiên khi

cho chuột sử dụng nước quả mận khô thì chỉ tìm thấy HMFG, (5-carboxylic

U Y

acid-2-furoyl) amino methan (CAFAM) mà không thấy có FDCA. Với những

người sử dụng đến 3944 µmol (497 mg) HMF, sau 6h thu được 36,9 % HMFG; 4,2 % CAFG và 1,9% CAFGM so với hàm lượng 5-HMF ban đầu

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

10 00

TR ẦN

H Ư

ẠO

[5].

Hình 1.3. Quá trình chuyển hoá của 5-HMF Trong các quá trình chuyển hoá của 5-HMF thì quá trình quan trọng nhất

là quá trình chuyển thành SMF dưới tác dụng của SULTs, đây là một chất có độc tính cao do tính ái điện tử của carbocation allyl. Sự hình thành 5-SMF đã được nghiên cứu trên chuột FVB/N. Sau khi tiêm tĩnh mạch 793 µmol

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

HMF/kg, thời gian bán thải của pha đầu và pha cuối là 1,7 và 2,8 phút. Nồng độ SMF đạt cực đại sau 2,5 phút. Có khoảng 452 đến 551 ppm 5-HMF được

chuyển thành SMF [5].

b) Độc tính

Trong nghiên cứu của Edoardo Capuano và Vincenzo Fogliano [9] đã

U Y

chỉ ra rằng ở liều cao cho thấy 5-HMF có độc tính, nó có tác dụng kích thích

thị giác, kích thích đường hô hấp, da và niêm mạc. Đối với chuột, khi sử dụng đường uống, LD50= 3,1 g/kg. Trong một nghiên cứu khác, đối với chuột cái

ẠO

LD50= 2,5 g/kg còn đối với chuột đực thì LD50= 2,5-5,0 g/kg.

Khi nghiên cứu về tác dụng gây ung thư của 5-HMF, Archer và cộng sự

H Ư

đã chứng minh được rằng 5-HMF có tác dụng thúc đẩy sự phát triển của khối u và các tổn thương trong chuột. Gần đây, một số báo cáo cho thấy rằng 5-

TR ẦN

HMF là một yếu tố có thể gây ung thư đối với chuộc thí nghiệm. 5-HMF làm tăng tỷ lệ mắc u gan đối với chuột cái B6C3F1 khi sử dụng liều 188 và 375

10 00

mg/kg [7].

Trong quá trình nghiên cứu cho thấy, trong cơ thể, 5-HMF được chuyển

thành SMF dưới tác dụng của SULT1A1 . Đây là một chất có độc tính mạnh

hơn 5-HMF do có nhóm sulfat ở vị trí allylic có thể dễ dàng bị cắt tạo

-L

Í-

electropin, một chất gây ảnh hưởng tới protein và ADN [31].

ÁN

Năm 1984, Ulbricht và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu trên chuột cống

thu được LD50= 3100 mg/kg, trong khi với chuột nhắt thì LD50= 1910 mg/kg.

ÀN

Khi cho chuột sử dụng liều 310 mg/kg/ngày trong 2 tháng dẫn đến sự rối loạn

IỄ N

chức năng gan, thay đổi tỷ lệ protein huyết tương, làm tăng men gan tributyrinase, tăng hoạt tính của một số men trong đường ruột như phosphomonoesterase và enterokinase [34]. Một số nghiên cứu in vitro trên tế bào của một số động vật có vú và một số loài chim cho thấy, với mức liều 1,0

mg/ml đã có thể gây ức chế quá trình tăng trưởng tế bào.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Trong nghiên cứu dài hạn, khi sử dụng liều 0, 40, 80 và 160 mg mỗi ngày, mỗi tuần sử dụng 6 ngày trong vòng 11 tháng. Kết quả cho thấy, chuyển

hoá protein, lipid, nồng độ acid ascorbic và hoạt động của succinat

dehydrogenase không thay đổi. Tuy nhiên với nồng độ 160 mg/kg đã có sự

thay đổi một số thông số lâm sàng như: tăng nồng độ γ-globulin, tăng hoạt

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

10 00

TR ẦN

H Ư

ẠO

U Y

tính của tributyrinase, tăng khối lượng lách [34].

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

U Y

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

1.1.6. Một số phương pháp định lượng HMF

Trên thực tế đã có nhiều nghiên cứu định lượng 5-HMF trong một số sản phẩm khác nhau. Có thể tóm tắt các

ẠO

phương pháp nghiên cứu trong các bảng sau:

Thuốc thử

Mật ong

p-toluidin

Siro và mật ong

p-toluidin

TLTK

550 nm

[25]

550 nm

[20]

10 00

TR ẦN

Bước sóng

Mẫu phân tích

H Ư

STT

Bảng 1.1: Một số nghiên cứu bằng phương pháp đo quang

Bảng 1.2 : Một số nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ Mẫu

Thực phẩm

Cột

Pha động

TLTK

Acid acetic 0,01 mM

[14]

MeOH : H2O (5:95)

[24]

ÁN

Nước tiểu

RP 100 (55x2mm;3µm)

IỄ N

ÀN

-L Í-

STT

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

U Y

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Mẫu phân tích

Cột sắc ký

Pha động

XBridge C18

A: H2O : ACN: acid percloric (97:3:0,01)

RP-18

Mật ong

Mật ong, nước giải

285

[11]

Acid acetic 5% : MeOH (80:20)

285

[23]

H2O : MeOH (9:1)

285

[17]

H2O : MeOH (9:1)

285

[35]

Dd acid acetic 1% : ACN (95:5)

284

[33]

[12]

B: ACN: acid percloric (100:0,1)

10 00

C18 (5µm)

khát

TLTK

280

Dd acid acetic 1% : ACN (90:10)

(125x4mm,5µm) 3

(nm)

H Ư

(250x4,6mm;5µm)

TR ẦN

Mật ong, nước ngọt

Bước sóng

ẠO

STT

Bảng 1.3: Một số nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

RP-18 LiChcrosphere

Đường

-L Í-

(250x4mm; 10µm)

Thực phẩm

ÁN

C18

Thực phẩm

IỄ N

ÀN

(150x3,9mm; 4µm)

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

C18 (250x4,6mm;5µm)

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Thực phẩm

Glucose

Thực phẩm

Star PR-18 (250x4,6mm;5µm)

.Q TP

[36]

H2O:MeOH (92:8)

284

[8]

[37]

284

[38]

[28]

XBP-C18

ODS

MeOH:H2O (5:95)

10 00

(250x4,6mm;5µm)

Acid H2SO4 5Mm

TR ẦN

(300x7,8mm)

HPX-87H

H Ư

B: ACN 100%

263**

ẠO

(75x4,6mm; 4µm)

Mật ong

A: H2O : ACN (70:30)

Synergy Fusion

U Y

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Natri acetat 0,04M : MeOH (70:30)

IỄ N

ÀN

ÁN

Ghi chú: **: sau khi dẫn xuất hóa

-L Í-

(250x4,6mm;5µm)

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

U Y

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Khí

Cột sắc ký

CTNĐ

DB5

Lúc đầu 37oC, giữ 2 phút, sau đó tăng 30 oC/phút đến 100 oC, rồi

H Ư

(50mx0,2mm;0,33µm)

Nhiệt độ tiêm 250oC, 1

TLTK

ẠO

mang

STT

Bảng 1.4 : Một số nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ

[22]

TR ẦN

tăng đến 250 oC với tốc độ 8 oC/phút, giữ 5 phút

ZB-Wax

Nhiệt độ ban đầu 150oC, sau tăng 4oC/phút đế 240oC, giữ 40

60mx0,32mm;0,5 µm)

10 00

Nhiệt độ tiêm 250oC.

[13]

phút.

HP-5MS

(30mx0,25mm;0,25

ÀN

ÁN

(60mx0,32mm;1,0µm)

IỄ N

µm)

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

-L Í-

SPB-5

Nhiệt độ tiêm 290oC. Nhiệt độ ban đầu 40oC giữ trong 5 phút, sau tăng đến 200oC với

[10]

tốc độ 3oC/phút, giữ trong 5 phút. Nhiệt độ tiêm 250oC.

Nhiệt độ ban đầu 50oC, giữ trong 2 phút, sau đó tăng đến 250oC

[18]

với tốc độ 10oC/phút giữ trong 5 phút. 11

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

U Y

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Nhiệt độ ban đầu 50oC giữ trong 1 phút, tăng 25oC/phút đến DB5

150oC, sau đó tăng 20oC/phút đến 170oC, sau đó tăng 80oC/phút

ẠO

đến 250oC rồi giữ trong 3 phút.

[27]

H Ư

HP-5MS

Nhiệt độ ban đầu 70oC giữ trong 2 phút, sau tăng đến 300oC với

[30]**

TR ẦN

Nhiệt độ tiêm 250oC.

tốc độ 12oC/phút rồi giữ trong 2 phút.

10 00

Nhiệt độ tiêm 280oC.

DB-5MS 7

Nhiệt độ ban đầu 70oC giữ trong 1 phút, sau đó tăng 7oC/phút

He (30m x 0,25mm)

[32]**

đến 110oC, sau tăng 20oC/phút đến 300oC rồi giữ 10 phút.

IỄ N

ÀN

ÁN

-L Í-

Ghi chú:** có dẫn xuất trước khi sắc ký khối phổ

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Trên thực tế phương pháp đo quang được ứng dụng đầu tiên trong khi xác định 5-HMF trong các chế phẩm. Tại Việt Nam, trong chuyên luận

glucose cũng như TCVN năm 2012 về an toàn vệ sinh thực phẩm cũng có quy

trình định lượng 5-HMF bằng phương pháp đo quang với thuốc thử p-

toluidin[3]. Tuy nhiên, phương pháp này có thể bị ảnh hưởng nhiều bởi sự có

U Y

mặt của các chất khác trong nền mẫu. Do đó phương pháp này có độ chính

xác và chọn lọc không cao

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao cũng được sử dụng để xác định

ẠO

trực tiếp 5-HMF trong các chế phẩm. Tuy nhiên, trong đề tài này các mẫu

được pha loãng rồi tiến hành sắc ký trực tiếp nên sẽ bị ảnh hưởng nhiều bởi

H Ư

nền mẫu phức tạp.

Từ đó dẫn đến yêu cầu cần phải có một phương pháp có độ nhạy cao,

TR ẦN

giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thấp, phương pháp không bị ảnh hưởng khi có mặt các chất khác trong nền mẫu, đặc biệt là những chất có

10 00

vòng furan. Phương pháp LC/MS và GC/MS đều đáp ứng được yêu cầu đó. Trong 2 phương pháp này thì phương pháp GC/MS có ưu việt hơn, đặc biệt

sử dụng Detector khối phổ hai lần (MS/MS) với độ chọn lọc và đặc hiệu cao.

1.2. Phương pháp sắc ký khí khối phổ

-L

Í-

1.2.1. Đại cương về sắc ký khí

ÁN

Sắc ký khí là kỹ thuật chia tách trong đó các thành phần của mẫu phân

tích phân bố giữa hai pha: pha tĩnh và pha động. Trong đó pha động là một

ÀN

chất khí, thường là khí trơ. Mẫu phân tích được đưa vào đầu cột và quá trình

IỄ N

rửa giải được thực hiện nhờ dòng khí trơ qua cột sắc ký. Trong phương pháp sắc ký khí, pha động không tương tác với chất phân tích mà chỉ làm chức năng vận chuyển chất phân tích qua cột, mẫu được tách do sự phân bố giữa pha tĩnh và pha động nhờ cơ chế hấp phụ, phân bố hoặc kết hợp cả hai cơ chế này. Sơ đồ thiết bị sắc ký khí:

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

ẠO

U Y

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Hình 1.4. Sơ đồ thiết bị sắc ký khí

* Khí mang:

H Ư

Các loại khí mang sử dụng trong GC-MS cần phải đảm bảo trơ, sạch và

argon và nitơ.

* Buồng tiêm mẫu:

TR ẦN

không được tương tác với các chất phân tích. Thường sử dụng khí heli, hydro,

10 00

Trước khi vào cột phân tích, mẫu thường ở dạng lỏng, cho vào buồng

bay hơi rồi được dòng khí mang đưa vào cột. Có 3 cách tiêm mẫu chính: tiêm

mẫu chia dòng, tiêm mẫu không chia dòng và tiêm mẫu trực tiếp.

Í-

* Cột tách:

-L

Cột là bộ phận trung tâm của hệ thống sắc ký. Trong sắc ký khí có hai

ÁN

loại cột: cột nhồi và cột mao quản. Chương trình nhiệt độ của sắc ký khí là

IỄ N

ÀN

thông số quan trọng cần kiểm soát chính xác. * Các loại pha tĩnh trong sắc ký khí Trong sắc ký khí, pha tĩnh đóng vai trò chủ yếu trong việc tách các chất

khỏi nhau. Tùy thuộc vào bản chất của các chất phân tích mà lựa chọn pha tĩnh thích hợp. Các loại pha tĩnh có thể được xếp vào 4 nhóm dựa vào tính phân cực của nó, bao gồm: nhóm không phân cực, nhóm phân cực yếu, nhóm phân cực trung bình và nhóm phân cực cao.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

1.2.2. Detector khối phổ Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử

của các hợp chất hóa học bằng việc phân tích các ion phân tử theo tỷ số giữa

khối lượng và diện tích (m/z) của chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm

hay bớt điện tích của chúng (loại bỏ electron, proton hóa ...) [4].

U Y

Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng

nhờ bộ phân tích khối trước khi đến detector. Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại

ẠO

thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối. Nó cung cấp thông tin để định tính

(khối lượng phân tử, nhận dạng các chất), xác định cấu trúc và định lượng các

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

10 00

TR ẦN

H Ư

chất [1].

Hình 1.5. Detector khối phổ [1]

* Cấu tạo: Gồm 3 phần chính: nguồn ion hóa, bộ phận phân tích khối và bộ phận

phát hiện. - Nguồn ion hóa có vai trò ion hóa các phân tử, nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi [1].Trong GC-MS thường sử dụng kỹ thuật ion hóa trên cơ sở va đập điện tử (EI) và ion hóa hóa học (CI).

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

- Bộ phân tích khối (Mass analyzer): Có vai trò tách các ion có trị số m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt. Có thể chia bộ phận phân tích khối

thành 4 loại [1], [4]:

+ Bộ phân tích từ: Gồm thiết bị khối phổ hội tụ đơn và thiết bị khối phổ

hội tụ kép.

U Y

+ Bộ phân tích tứ cực: gồm bộ phân tích tứ cực đơn, bộ phân tích tứ cực

chập ba và bẫy ion kiểu tứ cực.

Bộ tứ cực: Gồm có 4 cực bằng kim loại đặt song song và sát nhau. Có

ẠO

một khoảng không giữa 4 cực để các ion bay qua. Dòng điện một chiều (và

điện thế xoay chiều cao tần được đặt vào từng cặp đối diện của tứ cực.

H Ư

Bẫy ion tứ cực: Hoạt động theo nguyên lý của bộ phân tích khối tứ cực, chỉ có một điểm khác là các ion được lưu giữ và đưa dần ra khỏi bẫy

TR ẦN

Bộ tứ cực chập ba: Bộ phân tích khối gồm ba bộ tứ cực nối tiếp nhau: Q1, Q2 và Q3. Trong đó, Q1 và Q3 làm nhiệm vụ phân tích. Q1 sẽ tách các ion;

10 00

một số ion chọn lọc từ đây vào Q2. Trong buồng Q2 với áp suất cao, các tiền ion bị phân ly do va chạm với khí trơ có mặt như nito, argon, heli. Nhờ va

chạm này, năng lượng động học của các ion chuyển thành nội năng nên chúng

bị phân mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ hơn, ion con. Các ion con mới hình

-L

Í-

thành được dẫn tới Q3 tách riêng và đến detector. Kỹ thuật này được gọi là

ÁN

khối phổ hai lần.

- Bộ phận phát hiện (Mass detection): Thường có hai loại nhân electron

ÀN

và

IỄ N

nhân quang, với chức năng chuyển các ion đã đến thành tín hiệu và khuếch đại để đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ.

* Một số kỹ thuật ghi phổ Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ bao gồm:

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

- Quét toàn phổ: Khi thao tác với chế độ scan, detector sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt

- Chế độ chọn lọc ion: Khối phổ kế chỉ nhận diện một số ion và ghi sắc

quá trình phân tích.

đồ theo ion lựa chọn. Kỹ thuật này làm giảm bớt nhiễu đường nền và do đó

U Y

tăng độ nhạy.

- SRM và MRM:

+ SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các

ẠO

mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để

phát hiện.

H Ư

+ MRM: Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các

TR ẦN

ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện.

10 00

1.2.3. Một số thông số đặc trưng

- Số đĩa lý thuyết: Hiệu lực cột thể hiện khả năng phân tích của cột và

Í-

được thể hiện bởi đại lượng: số đĩa lý thuyết của cột (N) [1]:

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Trong đó: W: chiều rộng pic đo ở đáy pic. W1/2: chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic. tR: Thời gian lưu

Số đĩa lý thuyết càng lớn hiệu lực cột càng cao (đỉnh nhọn, hẹp). - Hệ số bất đối AF (assymetry factor) AF = b/a Ở đây: b: Nửa chiều rộng phía sau pic a: Nửa chiều rộng phía trước pic

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Chiều rộng pic đo ở 1/10 chiều cao pic. Hệ số bất đối càng gần tới 1, pic càng đối xứng [1].

1.2.4. Ứng dụng của sắc ký khí khối phổ

1.2.4.1. Phân tích định tính

- So sánh thời gian lưu của chất phân tích với thời gian lưu của chất

U Y

chuẩn đối chiếu trong cùng điều kiện sắc ký.

- So sánh sắc ký đồ của mẫu phân tích với sắc ký đồ của mẫu phân tích đã thêm chuẩn đối chiếu

ẠO

- So sánh phổ khối của chất phân tích với chất chuẩn đối chiếu trong

cùng điều kiện sắc ký và so sánh phổ khối của chất phân tích với phổ khối các

H Ư

chất có trong thư viện phổ, phương pháp này cho kết quả khá tin cậy. 1.2.4.2. Phân tích định lượng

TR ẦN

Một số phương pháp định lượng:

- Phương pháp chuẩn hóa diện tích: Hàm lượng phần trăm của một thành

10 00

phần trong mẫu phân tích được xác định bằng tỷ số (tính theo phần trăm) giữa diện tích pic của thành phần đó và tổng diện tích các pic của tất cả các thành

phần có mặt trong mẫu (trừ pic của dung môi, thuốc thử và của các thành

phần có hàm lượng nhỏ hơn giới hạn phát hiện của chúng).

-L

Í-

- Phương pháp thêm chuẩn: Phân tích các mẫu thêm chuẩn vào mẫu

ÁN

cùng điều kiện như phân tích mẫu bình thường. Dựa trên lượng chuẩn thêm

và tín hiệu các mẫu không thêm chuẩn và mẫu thêm chuẩn, từ đó tính được

IỄ N

ÀN

nồng độ chất có trong mẫu. - Phương pháp nội chuẩn: Trong phương pháp này, người ta chọn một

chất chuẩn nội đưa vào trong mẫu phân tích và trong dung dịch chuẩn đối chiếu. Tỷ số diện tích của chất phân tích và chất chuẩn nội là thông số phân tích được dùng để xây dựng đường chuẩn.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu

Mẫu trắng: Dung dịch thuốc kiểm tra không phát hiện có 5-HMF.

Mẫu tự tạo: Pha loãng dung dịch chuẩn gốc với mẫu trắng, lắc đều thu

được dung dịch mẫu tự tạo.

U Y

Mẫu thử: Một số mẫu thuốc, thực phẩm chức năng, nước ngọt lưu hành

ẠO

Chất nghiên cứu: 5-hydroxymethylfurfural (5-HMF)

trên thị trường Hà Nội.

2.2. Hoá chất và thiết bị

2.2.1. Hoá chất, dung môi

H Ư

5-Hydroxymethylfurfural (5-hydroxymethylfurfural 99,6%, chất chuẩn

Nước cất 2 lần. 2.2.2. Thiết bị, dụng cụ

TR ẦN

Sigma Aldrich, CAS number 67-47-0, lot: BCBR3219V).

10 00

Hệ thống sắc kí khí Agilent Technologies 7890A GC System kết nối với detector khối phổ Agilent Technologies 7000 GC/MS Triple Quad.

Tủ lạnh bảo quản mẫu Sanyo MPR 514 (Nhật)

Pipet thuỷ tinh các loại, cốc có mỏ, bình định mức

-L

Í-

Micropipet Eppendorf loại 100 - 1000 µl (Đức)

ÁN

Màng lọc 0,45 μm

Lọ sắc ký 1,5 ml có nắp đậy

ÀN

Các dụng cụ phòng thí nghiệm khác (đũa thuỷ tinh, ống đong thể

IỄ N

tích…). 2.3. Nội dung nghiên cứu - Xây dựng phương pháp phân tích 5-HMF trong một số chế phẩm nước ngọt, thực phẩm chức năng và thuốc bằng phương pháp GC-MS: Khảo sát lựa chọn điều kiện làm việc của GC-MS. - Thẩm định phương pháp phân tích: Thẩm định các chỉ tiêu:

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

+ Tính thích hợp của hệ thống + Tính chọn lọc, đặc hiệu

+ Khoảng tuyến tính

+ Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

+ Độ đúng, độ chính xác

U Y

- Bước đầu ứng dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng

5-HMF trong một số mẫu nước ngọt, thực phẩm chức năng, thuốc trên thị

ẠO

trường.

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Lấy mẫu và xử lý mẫu

H Ư

- Lấy mẫu

địa bàn quận Hoàn Kiếm.

TR ẦN

Các mẫu nước ngọt được mua ở các cửa hàng tạp hoá và các siêu thị trên

10 00

địa bàn quận Hoàn Kiếm.

Các mẫu thực phẩm chức năng, thuốc được mua ở các hiệu thuốc trên

Các mẫu sau khi mua được ghi lại thông tin số lô, hạn dùng rồi tiến hành

- Xử lý mẫu

xử lý mẫu.

-L

Í-

Khuấy trộn đồng nhất mẫu. Sau đó, mẫu sẽ được pha loãng theo tỷ lệ

ÁN

phù hợp. Đối với mẫu thuốc, tiến hành pha loãng bằng dung dịch mẫu trắng

đã lựa chọn. Đối với mẫu TPCN, nước ngọt tiến hành pha loãng bằng nước

ÀN

cất. Mẫu sau khi pha loãng được lọc qua màng lọc 0,45 μm. Dịch lọc này

IỄ N

được phân tích dựa trên phương pháp đã được xây dựng. Các mẫu được bảo quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, sau 1 tháng tiến hành định lượng lại nồng độ 5-HMF với tỷ lệ pha loãng đã chọn. 2.3.2. Xây dựng phương pháp phân tích

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Dựa vào tính chất vật lý, hoá học của chất cần phân tích, tham khảo các tài liệu và dựa vào thực tế điều kiện thiết bị phòng thí nghiệm, từ đó khảo sát

lựa chọn các điều kiện làm việc của hệ GC-MS.

- Pha tĩnh: cột HP-5MS (30,0m x 250µm x 0,25µm), 5% phenyl methyl

polysiloxan.

U Y

- Loại khí mang: Heli

- Điều kiện khối phổ: Tiến hành phân tích trên thiết bị có bộ phân tích khối dạng tứ cực chập ba. Sử dụng nguồn ion hóa EI với năng lượng ion hóa

ẠO

70 eV, tiến hành lựa chọn ion mẹ, ion con và điều kiện phân mảnh. Cụ thể,

cài đặt chế độ quét toàn thang (Full scan) để xác định mảnh mẹ đặc trưng m/z

H Ư

= 126 và mảnh con đặc trưng m/z = 97. Sau đó khảo sát và lựa chọn năng lượng va chạm (collision energy) để tín hiệu mảnh con thu được là tốt nhất,

TR ẦN

bằng chế độ Product ion. Các thông số trên: mảnh ion mẹ, ion con, năng

10 00

phân tích khối phổ 5-HMF.

lượng va chạm được sử dụng để cài đặt chế độ MRM, phương pháp dùng

- Khảo sát chương trình nhiệt độ và tốc độ khí mang: Thay đổi các

thông số nhiệt độ đầu vào, tốc độ gia nhiệt, thời gian duy trì nhiệt độ, tốc độ

khí mang. Phân tích, đánh giá khả năng tách dựa vào số đĩa lý thuyết, hệ số

-L

Í-

bất đối trên sắc ký đồ thu được. Từ đó lựa chọn chương trình nhiệt độ và tốc

ÁN

độ khí mang phù hợp.

2.3.3. Thẩm định phương pháp định lượng 5-HMF trong thuốc, nước ngọt

IỄ N

ÀN

bằng GC-MS Đối với 5-HMF, trong thẩm định đánh giá phương pháp phân tích coi

như thẩm định đánh giá các tạp chất. Tham khảo hướng dẫn của AOAC [6], ICH [16] quy định về các chỉ số cần đánh giá gồm: tính phù hợp của hệ thống, độ đúng, độ chính xác, tính chọn lọc, giới hạn định lượng, khoảng nồng độ tuyến tính. 2.3.3.1. Tính phù hợp của hệ thống

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Đánh giá độ ổn định của hệ thống về thời gian lưu và diện tích píc khi tiêm lặp lại 6 lần các dung dịch chuẩn đã chuẩn bị, ghi lại các giá trị thời gian

lưu, diện tích pic.

Yêu cầu: độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của các đáp ứng phân tích ≤

2,0%.

U Y

2.3.3.2. Tính chọn lọc, đặc hiệu

Tính đặc hiệu cho biết khả năng nhận diện và phân biệt rõ ràng chất phân tích với các thành phần khác có trong mẫu thử.

ẠO

Tiến hành thẩm định tính đặc hiệu bằng cách phân tích theo quy trình:

các mẫu chuẩn; mẫu trắng (dung dịch thuốc không chứa 5-HMF); mẫu trắng

H Ư

có thêm chuẩn, mẫu thử

Yêu cầu: Trên sắc ký đồ mẫu trắng phải không xuất hiện pic có thời gian

TR ẦN

lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn. 2.3.3.3. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

10 00

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể

thí nghiệm cụ thể.

xác định được nhưng không nhất thiết phải định lượng được trong điều kiện

LOD được xác định tại nồng độ có tỷ lệ S/N bằng 3. Trong đó, S là chiều

-L

Í-

cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đường nền được tính về hai phía

ÁN

của đường nền, bề rộng mỗi bên tối thiểu gấp 10 lần chiều rộng của pic tại ½

chiều cao.

ÀN

Giới hạn định lượng LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu

IỄ N

thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chính xác và độ đúng phù hợp. Giá trị LOQ được xác định tại nồng độ có tỷ lệ S/N bằng 10. Cách xác định: chuẩn bị mẫu trắng, thêm các dung dịch chuẩn pha loãng

vào các mẫu trắng sao cho được dung dịch có nồng độ 10 µg/ml, 4 µg/ml, 2 µg/ml. Tiến hành phân tích các mẫu theo phương pháp lựa chọn, xác định trên

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

sắc ký đồ tỷ lệ tín hiệu của chất phân tích chia cho nhiễu nền như công thức trên.

2.3.3.4. Khoảng nồng độ tuyến tính

Khoảng nồng độ tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng

nồng độ, ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ

U Y

chất phân tích. Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn (7 dung dịch), ghi lại

Yêu cầu: Tính hệ số tương quan hồi quy r ≥ 0,995.

ẠO

2.3.3.5. Độ đúng, độ chính xác

sắc ký đồ và xác định đáp ứng của pic.

Tiến hành đánh giá độ đúng và độ chính xác trên các mẫu tự tạo (mẫu

H Ư

trắng có thêm chuẩn) ở 3 mức nồng độ chuẩn được thêm vào khác nhau (mức nồng độ cao, trung bình, thấp trong khoảng nồng độ đã được xác định của quy

TR ẦN

trình phân tích). Ở mỗi mức nồng độ thêm chuẩn, định lượng ít nhất 6 mẫu độc lập.

10 00

Độ đúng được biểu thị dưới dạng phần trăm tìm thấy của chất phân tích so với nồng độ chất chuẩn thực đã biết. Độ chính xác được đánh giá thông

qua RSD giá trị nồng độ định lượng thu được.

Yêu cầu: Đối với mức nồng độ từ 100 – 1000 µg/ml, độ thu hồi nằm

-L

Í-

trong khoảng từ 90 – 107 %, RSD ≤ 5,3 %.

ÁN

2.3.4. Bước đầu áp dụng phương pháp khảo sát một số mẫu thực tế

- Mẫu nước ngọt:

IỄ N

ÀN

+ Một số mẫu nước ngọt bán tại chợ trên địa bàn quận Hoàn Kiếm. + Một số mẫu nước ngọt được bán tại các siêu thị trên địa bàn quận

Hoàn Kiếm. - Mẫu thuốc: Được bán ở nhà thuốc trên địa bàn quận Hoàn Kiếm - Mẫu thực phẩm chức năng: Được bán ở nhà thuốc trên địa bàn quận Hoàn Kiếm.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

2.4. Phương pháp xử lý số liệu - Một số đặc trưng thống kê: Các đặc trưng thống kê được tính dựa vào

các hàm số trong Microsoft Excel.

Giá trị trung bình ( ): Hàm AVERAGE.

U Y

Độ lệch chuẩn (SD): Hàm STDEV.

Độ lệch chuẩn tương đối: RSD=100*SD/

- Tương quan hồi quy tuyến tính:

ẠO

Phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện quan hệ giữa diện tích pic sắc

Hệ số góc a: Hàm SLOPE.

TR ẦN

Hệ số chắn b: Hàm INTERCEPT.

H Ư

Y = aC +b

ký và nồng độ chất phân tích:

Hệ số tương quan r: Hàm CORREL.

- Phương tiện xử lý: Phần mềm Microsoft Excel 2010, phần mềm

10 00

offline Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.06.00 đi kèm hệ thống

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

máy GC–MS

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Chương 3. KẾT QUẢ 3.1. Xây dựng phương pháp phân tích

3.1.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn

- Pha dung dịch chuẩn 5-HMF 2000 µg/ml: Cân chính xác khoảng

3.1.2. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký khí khối phổ

U Y

vạch, lắc đều bảo quản ở nhiệt độ 2-8 oC, sử dụng trong 1 tháng.

0,020g 5-HMF cho vào bình định mức 10,00 ml. Thêm nước cất vừa đủ tới

3.1.1.1. Phổ khối của 5-HMF

ẠO

Tốc độ khí: 1 ml/phút

Nhiệt độ tiêm: 250 oC; Nhiệt độ buồng ion: 280 oC.

H Ư

Chế độ tiêm: Chia dòng 1:2 m/z: 20-300 o

TR ẦN

Chương trình nhiệt: Lúc đầu 50 oC giữ trong 2 phút, sau đó tăng 25 C/phút đến 295 oC, giữ trong 1 phút.

10 00

Cài đặt chế độ MS1 Scan, phân tích trên dung dịch mẫu chuẩn tìm được phổ khối của 5-HMF và phổ 5-HMF trong thư viện chuẩn NIST 08 (National

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

Institute of Standaeds and Technology) minh họa trong hình sau:

Hình 3.1: Hình ảnh phổ khối của 5-HMF Từ phổ khối 5-HMF và tham khảo các tài liệu ta thấy ion 126 là mảnh

mẹ, ion 97 là mảnh con đặc trưng của 5-HMF, nên 2 mảnh ion này sẽ được lựa chọn chạy chế độ Product ion tìm năng lượng va chạm tối ưu. 3.1.1.2. Khảo sát lựa chọn năng lượng va chạm

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Cài đặt chế độ Product ion để khảo sát các mức năng lượng va chạm ta được kết quả sau:

Năng lượng

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát các mức năng lượng va chạm

Phổ khối lần 2

U Y

va chạm (V)

H Ư

ẠO

10 00

TR ẦN

-L

Í-

IỄ N

ÀN

ÁN

Nhận xét:

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Từ bảng 3.1 ta thấy ở mức năng lượng va chạm cao (20V, 15V), tín hiệu ion 126 không còn tuy nhiên cường độ tín hiệu ion 97 thấp hơn so với các ion

khác. Với mức năng lượng va chạm thấp (5V, 1V), cường độ tín hiệu ion 97

cao hơn nhiều so với các ion khác nhưng ion 126 vẫn còn. Để tìm được mức

năng lượng tối ưu, đề tài tiếp tục khảo sát các mức năng lượng va chạm thấp

U Y

với chỉ số phân tích là cường độ tín hiệu ion 126 và ion 97. Kết quả được

TR ẦN

H Ư

ẠO

trình bày trong hình:

10 00

Hình 3.2: Cường độ tín hiệu của ion 97, 126 với năng lượng va chạm 1 - 4 V Nhận xét:

Từ đồ thị ta thấy, lúc đầu khi năng lượng tăng dần, cường độ tín hiệu của

ion 97 tăng lên, đạt giá trị cao nhất ở mức năng lượng 2 V. Nếu tiếp tục tăng,

Í-

cường độ tín hiệu của ion 97 giảm do hiện tượng bẻ gãy ion 97 ở mức năng

-L

lượng cao. Do đó, đề tài chọn mức năng lượng va chạm là 2 V cho cường độ

IỄ N

ÀN

ÁN

tín hiệu của ion 97 cao nhất, ion 126 còn lại ít và các ion khác là thích hợp.

Hình 3.3: Phổ khối với năng lượng va chạm là 2 V

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Với năng lượng va chạm là 2 V, ion mẹ là 126, ion con là 97 được sử dụng để cài đặt chế độ MRM, dùng cho các khảo sát tiếp theo.

3.1.1.3. Khảo sát lựa chọn chương trình nhiệt độ cột

a) Khảo sát tốc độ gia nhiệt

Tốc độ khí: 1 ml/phút. Nhiệt độ tiêm: 250 oC. Chế độ tiêm: Chia dòng

U Y

1:2. Nhiệt độ buồng ion: 280 oC.

Thay đổi tốc độ gia nhiệt trong cột với một số chương trình nhiệt độ và kết quả được minh họa qua sắc ký đồ tương ứng:

ẠO

Bảng 3.2: Sắc ký đồ theo các chương trình nhiệt độ Sắc ký đồ

CTNĐ

H Ư

CTNĐ 1: Nhiệt độ ban đầu 50oC, giữ trong 2 phút. Sau đó với tốc

10oC/phút, giữ trong 1 phút.

độ

TR ẦN

tăng lên 295oC

10 00

CTNĐ 2: Nhiệt độ ban đầu 50oC, giữ trong 2 phút , sau đó

với tốc

độ

tăng lên 295oC

15oC/phút, giữ trong 1 phút.

-L

Í-

CTNĐ 3: Nhiệt độ ban đầu 50oC

ÁN

giữ trong 2 phút, sau đó tăng lên

295oC với tốc độ 20oC/phút, giữ

IỄ N

ÀN

trong 1 phút CTNĐ 4: Nhiệt độ ban đầu

50oC duy trì trong 2phút , sau đó tăng lên 295oC

với tốc

độ

25oC/phút, duy trì ở nhiệt độ này trong 1 phút.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

CTNĐ 5: Nhiệt độ ban đầu 50oC duy trì trong 2 phút tăng lên

295oC với tốc độ 30oC/phút rồi

giữ 1 phút.

CTNĐ 6: Nhiệt độ ban đầu

U Y

50oC duy trì trong 2 sau đó tăng

với tốc độ 10oC/phút tăng lên tăng lên 295oC

với tốc

ẠO

200oC, giữ trong 1 phút, sau đó độ

25oC/phút, duy trì trong 1 phút.

H Ư

Lựa chọn chương trình nhiệt độ dựa trên số đĩa lý thuyết và hệ số bất đối

TR ẦN

được ghi lại trong bảng sau:

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát theo các chương trình nhiệt độ tR

10,887

142007

1,11

CTNĐ 2

8,874

100130

1,55

7,742

86384

3,12

CTNĐ 4

7,000

134054

2,78

6,487

115126

2,69

CTNĐ 6

10,896

110736

1,03

lý thuyết

10 00

H Í-

-L

TO ÀN Đ

Thời gian

CTNĐ 1

CTNĐ 5

IỄ N

Hệ số bất đối

(phút)

CTNĐ 3

Số đĩa

ÁN

CTNĐ

phân tích (phút)

Khi tăng tốc độ gia nhiệt, thời gian lưu của 5-HMF giảm đồng thời số

đĩa lý thuyết cũng thay đổi, với tốc độ gia nhiệt 10 oC/phút ta nhận thấy pic có số đĩa lớn và tương đối cân pic. Tuy nhiên, với tốc độ gia nhiệt 10 oC/phút thì thời gian phân tích khá dài. Do đó, để giảm thời gian phân tích chúng tôi điều chỉnh tăng tốc độ 10 oC/phút đến 200 oC, sau đó tăng nhiệt đến 295 oC với tốc

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

độ 25oC/phút, duy trì trong 1 phút. Với chương trình nhiệt độ này (CTNĐ 6), thời gian phân tích giảm xuống chỉ còn 21 phút, đồng thời pic chất phân tích

và các pic tạp hoàn toàn tách khỏi nhau.

b) Khảo sát nhiệt độ ban đầu

Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn 5-HMF với nhiệt độ ban đầu khác

U Y

nhau ta thu được sắc ký đồ như sau: Tbđ (oC)

Bảng 3.4. Sắc ký đồ của các chương trình có nhiệt độ ban đầu khác nhau

ẠO

Sắc ký đồ

TR ẦN

H Ư

10 00

ÁN

-L

Í-

IỄ N

ÀN

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Tiến hành phân tích số đĩa lý thuyết và hệ số bất đối được kết quả như bảng sau:

Số đĩa lý thuyết

Hệ số bất đối

81920

1,21

110736

1,03

91136

41289

39673

Nhiệt độ ban đầu (oC)

U Y

STT

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát nhiệt độ ban đầu

0,23 0,2

H Ư

ẠO

0,97

TR ẦN

Nhận xét: Khi tăng nhiệt độ đầu vào ta thấy số đĩa lý thuyết giảm. Đồng thời với nhiệt độ ban đầu thấp, pic bị kéo đuôi (AF = 1,21), trong khi đó tăng nhiệt độ ban đầu lên cao, pic lại bị đổ đầu và mất cân xứng (AF < 1). Khi

10 00

nhiệt độ ban đầu là 50oC, pic có số đĩa lý thuyết lớn nhất và cân đối nhất. Do đó, đề tài chọn nhiệt độ ban đầu 50 oC.

c) Khảo sát tốc độ khí mang

Í-

Nhiệt độ tiêm: 250 oC

-L

Chế độ tiêm: Chia dòng 1:2

ÁN

Chương trình nhiệt: Nhiệt độ ban đầu 50 oC giữ trong 2 phút. Tăng

22oC/phút đến 295 oC.

Năng lượng va chạm: 2V Giữ nguyên các thông số trên, thay đổi tốc độ khí mang và tiến hành sắc

ký thu được kết quả sau:

IỄ N

ÀN

Nhiệt độ buồng ion: 280 oC

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Bảng 3.6: Sắc ký đồ với tốc độ khí khác nhau Sắc ký đồ

Tốc độ khí (ml/phút)

U Y

0,8

H Ư

ẠO

1,0

10 00

TR ẦN

1,2

-L

Í-

1,4

ÁN

Phân tích số đĩa lý thuyết và hệ số bất đối thông qua hình 3.4. Từ kết quả

trong hình 3.4 ta thấy, khi thay đổi tốc độ khí mang ta thấy số đĩa lý thuyết và

ÀN

độ cân xứng của pic đều thay đổi. Khi tốc độ càng cao thì pic càng bị đổ đầu

là 1 ml/phút.

IỄ N

mặc dù thời gian phân tích giảm. Chính vì vậy chúng tôi lựa chọn tốc độ khí

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Hình 3.4: Kết quả khảo sát tốc độ khí mang

U Y

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

ẠO

Với tốc độ khí 1 ml/phút, tiến hành phân tích trên mẫu thử. Kết quả cho

thấy pic 5-HMF thu được khá nhỏ, gọn, cân đối và tách hoàn toàn với các pic

10 00

TR ẦN

H Ư

tạp khác.Do đó, tốc độ khí 1,0 ml/phút là phù hợp.

Hình 3.5: Sắc ký đồ của mẫu thử với tốc độ khí 1,0 ml/phút

Í-

Vậy quy trình phân tích

-L

Các mẫu thử sau khi mua được ghi lại đầy đủ thông tin, khuấy trộn đồng

ÁN

nhất. Sau đó, mẫu sẽ được pha loãng theo tỷ lệ phù hợp.

+ Đối với mẫu thuốc, tiến hành pha loãng bằng dung dịch mẫu trắng đã

IỄ N

ÀN

lựa chọn. + Đối với mẫu TPCN, nước ngọt tiến hành pha loãng bằng nước cất. Dung dịch sau khi pha loãng được lọc qua màng lọc 0,45 μm. Dịch lọc

này được phân tích dựa trên phương pháp đã được xây dựng. Điều kiện sắc ký lựa chọn: Nhiệt độ tiêm: 250 oC

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Chế độ tiêm: Chia dòng 1:2 Chương trình nhiệt: Nhiệt độ ban đầu 50 oC giữ trong 2 phút, sau đó tăng lên 200 oC với tốc độ 10 oC/phút, rồi tăng lên 295 oC với tốc độ 25

C/phút, duy trì 1 phút.

Khí mang: Heli, tốc độ 1 ml/phút.

U Y

Nhiệt độ buồng ion: 280 oC, năng lượng va chạm: 2V

3.2. Thẩm định phương pháp định lượng 5-HMF trong thuốc, nước ngọt

ẠO

bằng GC-MS 3.2.1. Tính phù hợp của hệ thống

Tiến hành sắc ký 6 lần dung dịch chuẩn 5-HMF có nồng độ chính xác

H Ư

khoảng 500 µg/ml theo điều kiện đã chọn, ghi lại sắc ký đồ. Kết quả được trình bày ở bảng sau:

TR ẦN

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống Thời gian lưu

Lần

10,922

1148364

10,911

1139988

10,916

1139875

10,920

1133652

10,928

1144471

10,932

1138500

Trung bình

10,921

1140808

RSD

0,07

0,45

10 00

ÁN

-L

Í-

IỄ N

ÀN

Diện tích pic

Kết quả cho thấy độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của thời gian lưu, diện tích pic đều nhỏ đạt yêu cầu cho phép phân tích định lượng theo điều kiện đã xây dựng. 3.2.2. Khảo sát tính chọn lọc, đặc hiệu

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Tiến hành phân tích theo đúng quy trình đã xây dựng các mẫu: mẫu chuẩn chất phân tích; mẫu trắng (dung dịch đã khảo sát không có 5-HMF);

mẫu trắng thêm chuẩn; mẫu thử (có lấy phổ toàn thang để so sánh)

Kết quả ở hình 3.6 cho thấy trên sắc ký đồ mẫu trắng không xuất hiện

pic tương ứng với thời gian lưu của chất cần phân tích. Đối với mẫu trắng

U Y

thêm chuẩn và mẫu thử (e), pic chính trên sắc ký đồ có thời gian lưu tương

ứng với thời gian lưu của chất cần phân tích trên sắc ký đồ mẫu chuẩn. Đồng thời, khi tiến hành lấy phổ toàn thang Full scan của mẫu thử (d), ta thấy pic 5-

ẠO

HMF (tR=10,904) không tách hoàn toàn so với các pic xung quanh. Trong khi

đó, với chương trình đã xây dựng, kết quả trên sắc ký đồ của chính mẫu thử

H Ư

này cho thấy rõ pic 5-HMF tách hoàn toàn so với các pic xung quanh. Như

10 00

TR ẦN

vậy, phương pháp có độ đặc hiệu, chọn lọc cao.

ÁN

-L

Í-

(a) Sắc ký đồ mẫu trắng

(b) Sắc ký đồ dung dịch trắng thêm chuẩn

IỄ N

ÀN

(e) Sắc ký đồ MRM mẫu thử

(d) Sắc ký đồ Scan mẫu thử

Hình 3.6: Kết quả khảo sát tính chọn lọc, đặc hiệu

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

3.2.3. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng Tiến hành xác định LOD

Chuẩn bị mẫu trắng thêm chuẩn có nồng độ 10 µg/ml, 4 µg/ml và 2

µg/ml. Tiến hành tiêm sắc ký các dung dịch trên theo điều kiện đã xác định.

Xác định tỷ lệ tín hiệu của chất phân tích chia cho nhiễu nền (S/N) bằng cách

U Y

xác định chiều cao mỗi pic chia cho độ nhiễu nền xung quanh pic tính về hai

phía. Nhiễu nền xác định trong khoảng 20 lần độ rộng pic ở ½ chiều cao pic.

ẠO

Tính tỷ lệ S/N của các mẫu, kết quả được trình bày trong bảng sau:

Bảng 3.8 : Kết quả S/N của các mẫu trắng thêm chuẩn

Nồng độ

9,6 5,6 3,1

-L

Í-

10 00

2 µg/ml

TR ẦN

4 µg/ml

H Ư

10 µg/ml

S/N

ÁN

Hình 3.7: Sắc ký đồ mẫu trắng thêm chuẩn tại nồng độ 2 µg/ml

IỄ N

ÀN

Nhận xét: Phương pháp có giới hạn phát hiện là 2 µg/ml, còn giới hạn định lượng

có giá trị là 10 µg/ml. Giới hạn khá thấp chứng tỏ phương pháp có độ nhạy phù hợp. 3.2.4. Khoảng nồng độ tuyến tính Chúng tôi tiến hành khảo sát tính tuyến tính giữa diện tích pic sắc ký và nồng độ các chất phân tích:

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

- Dung dịch chuẩn gốc: Tiến hành pha dung dịch chuẩn 5-HMF nồng độ 2000 µg/ml trong nước cất hai lần.

- Dung dịch chuẩn làm việc: từ các dung dịch chuẩn gốc, tiến hành pha

loãng để có các dung dịch chứa chất chuẩn 5-HMF ở trong khoảng nồng độ

200µg/ml – 800 µg/ml.

U Y

Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn, ghi lại sắc ký đồ. Kết quả

thu được như sau:

ẠO

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính Diện tích pic

Phương trình hồi quy- hệ số r

800

2117131

600

1549871

400

835325

350

668597

y = 3375,2 * x – 534541

300

464466

r = 0,9987

10 00

TR ẦN

H Ư

Nồng độ (µg/ml)

250

299903 111099

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

200

Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và diện tích pic

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Trong đó: x là nồng độ của 5-HMF (µg/ml)

y là diện tích pic của 5-HMF

Nhận xét:

Đường tuyến tính của 5-HMF có hệ số tương quan r > 0,995. Như vậy,

U Y

có sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic chất phân tích và nồng độ chất

phân tích trong khoảng nồng độ tử 200 µg/ml đến 800 µg/ml khi phân tích. 3.2.3. Độ đúng và độ chính xác

ẠO

Tiến hành đánh giá độ đúng và độ chính xác trên các mẫu tự tạo (mẫu

trắng thêm chuẩn) ở 3 mức nồng độ chuẩn được thêm vào khác nhau (mức

H Ư

nồng độ cao, mức nồng độ trung bình, mức nồng độ thấp trong khoảng nồng

lượng ít nhất 6 mẫu độc lập.

TR ẦN

độ đã xác định của quy trình phân tích). Ở mỗi nồng độ thêm chuẩn, định

Độ đúng được biểu thị dưới dạng phần trăm tìm thấy của chất phân tích

10 00

so với nồng độ chuẩn thực đã biết. Độ chính xác được đánh giá thông qua RSD giá trị nồng độ định lượng được.

Chọn 3 mức nồng độ là 360 µg/ml; 450 µg/ml; 540 µg/ml (lần lượt

tương ứng với các mức 80%, 100% và 120% so với nông độ giữa của đường

-L

Í-

chuẩn dự kiến).

ÁN

Kết quả thẩm định độ đúng và độ chính xác với mẫu trắng thêm chuẩn

ÀN

như sau:

Lần

Mức

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác C

Diện tích

IỄ N

(µg/ml)

Thấp

Ctìm lại

Độ thu hồi

RSD

(µg/ml)

360

695284

364,37

101,21

360

613409

340,11

94,48

360

674027

358,07

99,46

2,76

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

351,11

97,53

360

657547

353,19

98,11

360

704636

367,14

101,98

355,67

98,80

431,46

95,88

450

912217

428,64

95,25

450

939997

436,87

97,08

450

945868

438,62

450

1054567

470,82

450

944789

438,29

97,40

440,79

97,95

ẠO Đ

536,43

99,34

540

1380636

567,43

105,08

540

1352351

559,05

103,53

Ó 540

Í-

540

10 00

1276002

104,63

540

-L

540

3,46

97,47

Cao

TR ẦN

921735

bình

450

H Ư

Trung

650526

360

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

U Y

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

3,65

1197390

513,13

95,02

1253678

529,81

98,11

1283328

538,60

99,74

540,74

100,14

ÁN

IỄ N

ÀN

Nhận xét: Theo AOAC, yêu cầu độ thu hồi nằm trong khoảng từ 90-107%, RSD <

5,3% đối với nồng độ >0,01%. Trong phương pháp phân tích trên, kết quả độ thu hồi nằm trong khoảng 97,95-100,14%; RSD từ 2,76-3,65% nằm trong khoảng giới hạn cho phép. Như vậy độ đúng và độ chính xác phương pháp phân tích 5-HMF đáp ứng được yêu cầu của AOAC.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Kết quả thẩm định phương pháp cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu cao, khoảng tuyến tính rộng, độ lặp lại và độ đúng của phương pháp đáp ứng

yêu cầu của AOAC. Phương pháp có giới hạn phát hiện thấp 2 µg/ml do vậy

có thể định tính đối với các mẫu có hàm lượng thấp. Kết quả thẩm định đáp

3.3. Bước đầu ứng dụng phương pháp khảo sát một số mẫu

thực.

U Y

ứng các yêu cầu của AOAC do vậy có thể áp dụng đối với phân tích mẫu

Áp dụng phương pháp đã xây dựng để phân tích 5-HMF trong một số

ẠO

mẫu thuốc, thực phẩm chức năng và nước ngọt.

Thuốc, thực phẩm chức năng và nước ngọt sau khi mua được ghi lại

H Ư

thông tin. Khuấy trộn đồng nhất mẫu. Sau đó, mẫu sẽ được pha loãng theo tỷ lệ phù hợp lọc qua màng lọc 0,45 μm. Dịch lọc này được phân tích dựa trên

TR ẦN

phương pháp sắc ký đã xây dựng.

Các mẫu được bảo quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Sau 1 tháng (thời

10 00

gian từ 01/2016 đến 02/2016), tiến hành định lượng với tỷ lệ pha loãng đã chọn.

-L

Trong đó:

Í-

Công thức tính nồng độ 5-HMF trong mẫu ban đầu:

ÁN

Cđo là nồng độ 5-HMF trong dung dịch sau pha loãng, được tính dựa vào

đường chuẩn (µg/ml)

K là hệ số pha loãng Kết quả phân tích mẫu thử được trình bày trong bảng 3.11 và hình 3.9:

IỄ N

ÀN

Cmẫu: Nồng độ 5-HMF có trong mẫu ban đầu (µg/ml)

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát một số mẫu thực tế Cmẫu 0 tháng

Tên

mẫu

S0 tháng

Cmẫu 1 tháng S1 tháng

(µg/ml)

158401

205

228254

226

U Y

NN1

947786

439

957802

NN2

242857

460

811150

NN3

408952

279

NN4

200631

NN5

225946

NN6

242342

NN7

NN8

10 00

NN9

NN10

442

275273

1199

450

249746

464

920

299877

988

182934

850

332807

1027

146347

1008

224383

1124

535465

634

844924

817

Í-

233050

454

459111

588

NN11

275702

960

298172

986

NN12

149252

405

176733

421

NN13

143201

1004

148422

1011

NN14

141351

1001

176912

1053

NN15

140701

800

199944

870

NN16

209982

1102

390214

1369

NN17

145673

1007

148194

1011

TR ẦN

H Ư

1089

ÁN

329

-L

797

ẠO

578385

ÀN Đ

IỄ N

STT

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

145642

1007

149967

1014

TPCN1

688262

1811

858741

2064

TPCN2

334762

1287

347792

1307

TPCN3

374966

1347

391532

1371

TPCN4

245910

1156

387334

1365

TPCN5

542811

1595

736093

TPCN6

544173

319

771326

NN18

U Y

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

386

10 00

TR ẦN

H Ư

ẠO

1882

Í-

Nhận xét:

Hình 3.9. Kết quả phân tích 5-HMF trong mẫu thực tế

-L

Trong các mẫu thuốc khảo sát, chỉ có mẫu thuốc T1 chứa 5-HMF với

ÁN

nồng độ 205 µg/ml, còn lại các mẫu T2-T4 không phát hiện có 5-HMF.

Với các mẫu nước ngọt khảo sát đều có chứa 5-HMF với nồng độ trong

IỄ N

ÀN

khoảng 279 – 1102 µg/ml. Nồng độ 5-HMF trong các mẫu thực phẩm chức năng khá cao, trong

khoảng 319 – 1811 µg/ml. Sau thời gian 1 tháng bảo quản ở nhiệt độ phòng, nồng độ 5-HMF đều tăng. Điều này có thể cho thấy ảnh hưởng của nhiệt độ có thể làm tăng quá

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

trình chuyển hóa từ đường thành 5-HMF. Ngoài ra, pH của dung dịch thấp

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

10 00

TR ẦN

H Ư

ẠO

U Y

(một số mẫu nước ngọt vị chanh) cũng là yếu tố gây tăng nồng độ 5-HMF.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Chương 4. BÀN LUẬN 4.1. Về phương pháp GC-MS

5-HMF là sản phẩm chuyển hóa của đường, đặc biệt là đường glucose và

đường fructose. Chính vì vậy, trong các chế phẩm thuốc, thực phẩm chức

U Y

năng hay thực phẩm đều có thể có chứa chất này. Tuy nhiên, ở Việt Nam mới

chỉ định lượng chất này bằng phương pháp quang phổ. Ưu điểm của phương

pháp quang phổ là cách tiến hành và trang thiết bị đơn giản, có thể tiến hành ở

ẠO

nhiều phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, khi sử dụng phương pháp này, nền mẫu

có thể ảnh hưởng tới tính chọn lọc cũng như khả năng phân tích do vậy

phương pháp so màu sẽ không đảm bảo kết quả chính xác. Mặt khác, phương

H Ư

pháp này cũng chỉ đề cập đến việc định lượng 5-HMF trong thực phẩm và

TR ẦN

trong glucose nguyên liệu, chưa tiến hành trên sản phẩm khác. Do đó, để mở rộng phương pháp có thể phân tích trên các đối tượng khác và có độ nhạy tốt

10 00

hơn thì phương pháp GC-MS đáp ứng được yêu cầu này. Những vài thập kỷ gần đây, kỹ thuật liên hợp giữa sắc ký khí và phổ

khối lượng ra đời. Cả hai phương pháp này cùng có những đặc tính chung:

mẫu ở trạng thái khí, cả hai phương pháp đều có độ nhạy cao, tốc độ phân tích

Í-

tương tự nhau. Từ đó, liên hợp GC-MS có ưu điểm: lượng mẫu phân tích nhỏ,

-L

tiến hành tốt việc tách và nhận biết đồng thời hỗn hợp nhiều cấu tử [4]. 5-

ÁN

HMF là sản phẩm chuyển hóa của đường, tan trong nước chính vì vậy sử dụng kỹ thuật GC-MS để tách và nhận biết 5-HMF có trong các mẫu dung

IỄ N

ÀN

dịch là thích hợp. Hơn nữa, phương pháp xây dựng đã sử dụng kỹ thuật khối phổ hai lần MS/MS làm giảm bớt nhiễu đường nền, do đó phương pháp có độ nhạy cao. Với phương pháp sắc ký khí khối phổ: Trên thế giới cũng có một số nghiên cứu định lượng 5-HMF trong một số thực phẩm sau khi tiến hành dẫn xuất hóa. Khi tiến hành dẫn xuất hóa trước khi phân tích có thể thu được giới

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

hạn định lượng thấp hơn nhưng lại khá tốn kém về chi phí và phức tạp. [30],[32]. Trong khi đó, trên mẫu thực tế lại chứa một lượng khá lớn 5-HMF.

Do đó, chúng tôi quyết định tiến hành định lượng bằng phương pháp sắc ký

U Y

toàn phù hợp với điều kiện thực tế và một số tài liệu tham khảo [18].

khí khối phổ mà không cần dẫn xuất hóa. Với phương pháp đã lựa chọn hoàn

4.2. Về quy trình phân tích

5-HMF là một chất có khả năng tan tốt trong nước, hơn nữa các mẫu thử

ẠO

đều ở dạng dung dịch trong dung môi nước. Vì vậy đề tài đã tiến hành phân

tích trực tiếp 5-HMF mà không cần sử dụng bất kỳ dung môi chiết nào. Điều

này cũng phù hợp với một số nghiên cứu định lượng 5-HMF bằng phương

H Ư

pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao hay phương pháp sắc ký khí khối phổ.

TR ẦN

Để tăng độ nhạy của phương pháp, chúng tôi đã tiến hành khảo sát năng lượng va chạm và lựa chọn được năng lượng va chạm phù hợp sao cho tín

10 00

hiệu của ion 97 tạo ra với cường độ lớn nhất, trong khi các ion khác nhỏ, thích hợp. Với kỹ thuật này ion hóa trên cơ sở va đập điện tử (EI), phổ thu được có

thể so sánh với dữ liệu phổ sẵn có để xác định được các hợp chất.

Đối với phương pháp GC, quá trình tách phụ thuộc vào tính bay hơi của

-L

Í-

chất tan, tức điểm sôi của chúng. Trong các yếu tố tác động đến kết quả thực

ÁN

nghiệm, việc kiểm soát nhiệt độ cột, nhiệt độ đầu vào, cũng như tốc độ khí

mang là cần thiết để tăng hiệu lực tách của cột, loại bỏ ảnh hưởng của nền

ÀN

mẫu, làm giảm thời gian phân tích. Chính vì vậy, sau khi khảo sát, chúng tôi

IỄ N

đã lựa chọn được chương trình nhiệt độ thích hợp đảm bảo tách được các chất. Chương trình nhiệt độ này cũng tương tự so với tài liệu đã công bố của Kumar R. và cộng sự [18]. 4.3. Về thẩm định phương pháp

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Phương pháp phân tích trong nghiên cứu đã được thẩm định các chỉ tiêu: độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ

đúng và độ chính xác.

Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính cho thấy phương pháp có khoảng

U Y

tuyến tính rộng 200-800 µg/ml, có sự tương quan chặt chẽ giữa hàm lượng

chất phân tích với diện tích pic với hệ số tương quang > 0,995. Đồng thời,

khoảng nồng độ này là phù hợp để phát hiện và định lượng 5-HMF trong các

ẠO

mẫu thực tế.

Độ đúng và độ chính xác của phương pháp được đánh giá thông qua độ

thu hồi và RSD giá trị nồng độ định lượng được trên các mẫu trắng thêm

H Ư

chuẩn. Kết quả cho thấy, độ thu hồi đạt 97,95 – 100,14 % nằm trong khoảng

đạt yêu cầu của AOAC [6].

TR ẦN

yêu cầu của AOAC (90 – 107 %); RSD từ 2,76 – 3,65 % đều nhỏ hơn 5,3%

10 00

So với những kết quả phân tích 5-HMF bằng phương pháp GC-MS mà không cần dẫn xuất hóa, các tác giả mới chỉ đưa ra được chương trình nhiệt

độ phân tích 5-HMF mà chưa đưa ra kết quả thẩm định nào.

Về giá trị LOD và LOQ, kết quả phân tích cho giá trị LOD là 2 µg/ml và

-L

Í-

giá trị LOQ là 10 µg/ml. Các kết quả này khá thấp, có thể áp dụng để định

ÁN

lượng 5-HMF trong các mẫu thuốc, thực phẩm chức năng và nước ngọt.

IỄ N

ÀN

4.4. Ứng dụng của phương pháp phân tích Trên thị trường Hà Nội nói riêng và trên cả nước nói chung, các mẫu

nước ngọt, thực phẩm chức năng cũng như những sản phẩm thuốc có chứa đường đang ngày càng nhiều. Trong khi đó tại Việt Nam mới chỉ có quy định

về giới hạn 5-HMF trong glucose nguyên liệu và trong sản phẩm rau quả. Tuy nhiên, đứng trước những mối nguy hại của 5-HMF, khuyến khích định lượng

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

nghiên cứu 5-HMF trong các chế phẩm chứa đường, nghiên cứu này đã góp phần phân tích một cách chính xác, nhanh chóng trong các mẫu.

Phương pháp này được sử dụng để kiểm tra các mẫu nước ngọt, thực

phẩm chức năng và thuốc. Bước đầu cho thấy nồng độ 5-HMF trong các mẫu

U Y

này khá lớn đặc biệt là trong các chế phẩm thực phẩm chức năng và trong

nước ngọt. Do đó, việc sử dụng các chế phẩm này sẽ có nguy cơ ảnh hưởng

tới sức khỏe của người tiêu dùng, đặc biệt trẻ nhỏ.

ẠO

Do số lượng mẫu phân tích chưa nhiều nên kết quả phân tích các mẫu

thử trên chưa đại diện cho toàn bộ các chế phẩm thuốc, thực phẩm chức năng

và nước ngọt trên thị trường. Chính vì vậy chúng tôi đề xuất tiến hành nghiên

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

10 00

TR ẦN

H Ư

cứu trên lượng mẫu lớn hơn trong các nghiên cứu tiếp theo.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN

Qua thời gian nghiên cứu thực nghiệm, chúng tôi đã thu được các kết

quả phù hợp với mục tiêu đề ra:

thực phẩm chức năng, thuốc bằng sắc ký lỏng khối phổ. Cụ thể là:

U Y

1. Đã xây dựng được phương pháp định lượng 5-HMF trong nước ngọt,

ẠO

* Quy trình phân tích:

- Xử lý mẫu: Khuấy trộn đồng nhất mẫu. Sau đó, mẫu sẽ được pha loãng

theo tỷ lệ phù hợp. Đối với mẫu thuốc, tiến hành pha loãng bằng dung dịch

H Ư

mẫu trắng đã lựa chọn. Đối với mẫu TPCN, nước ngọt tiến hành pha loãng

TR ẦN

bằng nước cất. Mẫu sau khi pha loãng được lọc qua màng lọc 0,45 μm. Dịch lọc này được phân tích với điều kiện sắc ký sau:

10 00

- Điều kiện sắc ký:

+ Cột HP-5MS (30,0m x 250µm x 0,25µm)

+ Nhiệt độ tiêm: 250 oC

Í-

+ Chế độ tiêm: Chia dòng 1:2

-L

+ Khí mang: Heli với tốc độ 1 ml/phút

ÁN

+ Chương trình nhiệt: Nhiệt độ ban đầu 50 oC giữ trong 2 phút. Sau đó

IỄ N

ÀN

tăng 10 oC/phút đến 200 oC, rồi tăng 25 oC/phút đến 295 oC, giữ trong 1 phút. + Nhiệt độ buồng ion: 280 oC + Năng lượng va chạm: 2V + Chế độ chạy Full Scan 20-300 m/z để định tính + Chế độ MRM dùng định lượng với mảnh ion 97.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

- Định tính: Định tính 5-HMF dựa vào thời gian lưu, hình dạng pic, phổ khối của pic xuất hiện trên sắc ký đồ mẫu thử so với thời gian lưu, hình dạng

pic, phổ khối của pic trong sắc ký đồ của dung dịch chuẩn.

- Định lượng: Hàm lượng 5-HMF được xác định dựa vào đường chuẩn

U Y

có hệ số r = 0,9987 > 0,995

* Thẩm định phương pháp:

Phương pháp đã thẩm định các tiêu chí: độ đặc hiệu chọn lọc, khoảng

ẠO

tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ đúng và độ chính xác.

Kết quả cho thấy phương pháp có tính chọn lọc đặc hiệu cao; khoảng nồng độ

tuyến tính 200-800 µg/ml với r = 0,9987; độ đúng của phương pháp 97,95-

H Ư

100,14 % nằm trong giới hạn cho phép của AOAC; RSD từ 2,76-3,65 % đáp

TR ẦN

ứng yêu cầu của AOAC. LOD và LOQ của phương pháp đối với 5-HMF tương đối thấp, chứng tỏ phương pháp có độ nhạy cao.

10 00

2. Đã ứng dụng phương pháp xây dựng để xác định 5-HMF trong một số

Í-

KIẾN NGHỊ

có nồng độ khá cao.

mẫu nước ngọt, thuốc và thực phẩm chức năng, trong đó hầu hết các mẫu đều

-L

Chúng tôi kiến nghị tiếp tục nghiên cứu thực hiện các vấn đề sau:

ÁN

- Tiếp tục tiến hành phân tích mẫu thuốc, thực phẩm chức năng và nước

ngọt với số lượng lớn hơn để đánh giá được toàn diện nồng độ của 5-HMF

- Phát triển và ứng dụng phương pháp phân tích trên nhiều đối tượng mẫu khác, nhất là các mẫu sản phẩm dùng cho trẻ em.

IỄ N

ÀN

trong các chế phẩm trên.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt

1. Trần Tử An (2007), Hoá phân tích II, NXB Y học, Hà Nội, tr. 107-

166.

2. Dược điển Việt Nam (2009), Dược điển Việt Nam IV.

U Y

3. TCVN 9041:2012, ISO 7466:1986, Cục An toàn vệ sinh thực phẩm,

Bộ Y tế.

4. Phạm Hùng Việt (2005), Sắc ký khí cơ sở lý thuyết và khả năng ứng

ẠO

dụng, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.

Tiếng Anh

5. Abraham K. et al (2011), “Toxicology and risk assessment of 5-

H Ư

Hydroxymethylfurfural in food”, Mol.Nutr.Food Res., 55, pp.667-678.

TR ẦN

6. AOAC International (2012), AOAC official methods of analysis,

10 00

Appendix K: Guidelines for dietary supplements and botanicals, Part I: AOAC Guidelines for single laboratory validation of chemical methods for dietary supplements and botanicals. 7. Archer C. et al (1992), “Aberrant Crypt Foci and Microadenoma As

Í-

Markers for Colon Cancer”, Environmental Health Perspectives, 98, pp. 195197.

ÁN

-L

8. Ariffin A.A., Ghazali H.M., Kavousi P. (2014), “Validation of a HPLC method for determination of hydroxymethylfurfural in crude palm oil”, Food chemistry, 154, pp. 102-107.

IỄ N

ÀN

9. Capuano E., Fogliano V. (2011), “Acrylamide and 5hydroxymethylfurfural (HMF): A review on metabolism, toxicity, occurrence in food and mitigation strategies”, LWT-Food Science and Technology, 44, pp. 793-810.

10. Faculdade de Farmáasci universidade do porto, Furanic compounds in food products: assessment and mitigation strategies, pp. 42. 11. Fallico B. et al (2004), “Effects of conditioning on HMF content in uniﬂoral honeys”, Food Chemistry, 85, pp. 305-313.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

gas

13. Gaspar M.S.M. and Lopes J.F. (2009), “Simple chromatographic method for furfural analysis”, 1216, pp.2762-2767.

12. Gaspar M.S.M và Lucena F.F. (2009), “Improved HPLC methodology for food control–furfurals and patulin as markers of quality”, Food Chemistry, 114, pp. 1576–1582.

U Y

14. Gokmen Vural et al (2006), “Rapid Determination of Hydroxymethylfurfural in Foods Using Liquid Chromatography - Mass Spectrometry”, Food Industry, pp. 1-6.

ẠO

15. Haworth W.N. and Jones W.G. (1944), “The conversion of sucrose into furan compounds. Part I: 5-hydroxymethylfurfuraldehyde and some derivatives”, Journal of the Chemical Society, pp. 667-670.

H Ư

16. ICH (2005), Validation of analytical procedures: Text and Methodology Q2(R).

10 00

TR ẦN

17. Kowalski S. et al (2013), “Dynamics of 5-Hydroxymethylfurfural Formation in Shortbreads during Thermal Processing”, Czech J. Food Sci., 31 (1), pp. 33-42.

18. Kumar R. et al (2015), “Pulsed electric field and combination processing of mango nectar: effect an volatile compounds and HMF formation”, Croat. J. Food Sci. Technol. , 7 (2).

ÁN

-L

Í-

19. Kuster F.M. and Temmink M.G. (1977), “The influence of pH and weak-acid anions on the dehydration of D-fructose”, Carbohydrate Research, 54 (1977), pp. 185-191.

IỄ N

ÀN

20. Leblanc B.W. et al (2009), “Formation of Hydroxymethylfurfural in Domestic High-fructose Corn Syrup and Its Toxicity to the Honey Bee (Apis mellifera)”, Journal of agricultural and food chemistry, 57, pp. 7369-7376.

21. Lewkowski J. (2001), “Synthesis, chemistry and applications of 5hydroxymethylfurfural and its derivatives”, General Papers ARKIVOC, pp. 17-54. 22. Locas C. P. and Yaylayan V. A. (2008), “Isotope Labeling Studies on the Formation of 5-(Hydroxymethyl)-2-furaldehyde (HMF) from Sucrose

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

by Pyrolysis-GC/MS”, Journal of agricultural and food chemistry, 56, pp. 6717-6723.

23. Makawi S. Z. A. et al (2009), “Identification and quantification of 5-Hydroxymethyl furfural HMF in some sugar-containing food products by HPLC”, Pakistan Journal of Nutrition, 8 (9), pp. 1391-1396.

U Y

24. Murkovic M. and Pichler N. (2006), “Analysis of 5hydroxymethylfurfural in coffee, dried fruits and urine”, Mol. Nutr. Food Res., 50, pp.842-846.

ẠO

25. Nafea A., Moselhy A., Fawzy M. (2011), “Does the HMF value affect the Antibacterial activity of the Bee Honey?”, Egypt. Acad. J. biolog. Sci., 4 (1),pp. 13-19. and

H Ư

26. National toxicology program (2010), “Toxicology carcinogenesis Studies of 5-(hydroxymethyl)-2-furfural”.

10 00

TR ẦN

27. Omari K.W. et al (2012), “Hydrolysis of chitosan to yield levulinic acid and 5-hydroxymethylfurfural in water under microwave irradiation”, The Royal Society of Chemistry, pp.1-7.

28. Petisca C. et al (2014), “Assessment of hydroxymethylfurfural and furfural in commercial bakery products”, Journal of Food Composition and Analysis, 33, pp. 20-25.

ÁN

-L

Í-

29. Prepared for NCI by Technical Resources International, Inc under Contract No NO1-CP-56019 (12/94), 5-(Hydroxymethyl)-2-furfural, CAS NO. 67-47-0.

IỄ N

ÀN

30. Senila L. et al (2012), "Development of a GC-MS Method for 5hydroxymethylfurfural Determination in Wood after Steam- explosion Pretreament", REV. CHIM. , 63 9(6), pp. 557-561. 31. Svendsen C. et al (2009), “5-Hydroxymethylfurfural and 5Sulfooxymethylfurfural Increase Adenoma and Flat ACF Number in the Intestine of Min/+ Mice”, Anticancer research, 29, pp. 1921-1926. 32. Teixido E. et al (2006), "Analysis of 5-hydroxymethylfurfural in foods by gas chromatography - mass spectrometry", Journal of chromatography A, 1135, pp. 85-90

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

33. Toker O.S. et al (2013), “Optimization of the content of 5hydroxymethylfurfural (HMF) formed in some molasses types: HPLCDAD analysis to determine effect of different storage time and temperature levels”, Industrial Crops and Products, 50, pp. 137-144.

U Y

34. Ulbricht J. et al (1984), “A Review of 5-Hydroxymethylfurfural (HMF) in Parenteral Solutions”, Fundamental and applied toxicology, 4, pp. 843-853.

ẠO

35. Vorlova L. et al (2006), “Hydroxymethylfurfural contents in foodstuffs determined by HPLC method”, Journal of Food and Nutrition Research, 45 (1), pp. 34-36.

H Ư

36. Windsor S., Kavazos K., Brooks P. (2013), “The quantitation of hydroxymethylfurfural in Australian Leptospermum honeys”, Journal of Pharmacognosy and Phytotherapy, 5(1), pp. 21-25.

10 00

TR ẦN

37. Zhang J., Cao Y., Li H., Ma X. (2014), “Kinetic studies on chromium-catalyzed conversion of glucose into 5-hydroxymethylfurfural in alkylimidazolium chloride ionic liquid”, Chemical Engineering Journal , 237, pp. 55-61.

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

38. Zhang Yu-Yu et al (2012), “Effects of sugars in batter formula and baking conditions on 5-hydroxymethylfurfural and furfural formation in sponge cake models”, Food Research International, 49, pp. 439-445.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

DANH MỤC PHỤ LỤC

PHỤ LỤC A: Chứng chỉ chất phân tích chuẩn

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

10 00

TR ẦN

H Ư

ẠO

U Y

Chuẩn 5-(hydroxymethyl)furfural

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

PHỤ LỤC B: Tiêu chí đánh giá

ẠO

U Y

Bảng B1: Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC)

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

10 00

TR ẦN

H Ư

Bảng B2: Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau (theo AOAC)

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

U Y

PHỤ LỤC C: Một số sắc ký đồ mẫu chuẩn

Lần 1

ẠO

Lần 2

10 00

TR ẦN

H Ư

Hình C.1: Khảo sát tính phù hợp của hệ thống

Nồng độ 400 µg/ml

Nồng độ 600 µg/ml

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

Hình C.2: Khảo sát khoảng tuyến tính nồng độ 600 µg/ml và 400 µg/ml

Nồng độ 350 µg/ml

Nồng độ 300 µg/ml

Hình C.3: Khảo sát khoảng tuyến tính nồng độ 350 µg/ml và 300 µg/ml

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Nồng độ 200 µg/ml

Nồng độ 250 µg/ml

U Y

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

TR ẦN

H Ư

ẠO

Hình C.4: Khảo sát khoảng tuyến tính nồng độ 250 µg/ml và 200 µg/ml

10 00

Lần 1

Lần 2

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

Hình C.5: Khảo sát độ đúng, độ chính xác nồng độ 360 µg/ml

Lần 1

Lần 2

Hình C.6: Khảo sát độ đúng, độ chính xác nồng độ 450 µg/ml

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Lần 1

U Y

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Lần 2

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

10 00

TR ẦN

H Ư

ẠO

Hình C.7: Khảo sát độ đúng, độ chính xác nồng độ 540 µg/ml

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

(b) Sau 1 tháng

10 00

TR ẦN

H Ư

Hình D.1: Sắc ký đồ mẫu TPCN2

ẠO

(a) 0 tháng

U Y

PHỤ LỤC D: Một số sắc ký đồ mẫu thử

(b) Sau 1 tháng

(a) 0 tháng

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

Hình D.2: Sắc ký đồ mẫu TPCN3

(a) 0 tháng

(b) Sau 1 tháng

Hình D.3: Sắc ký đồ mẫu TPCN4

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

U Y

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

(b) Sau 1 tháng

Hình D.5: Sắc ký đồ mẫu NN3

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

(a) 0 tháng

10 00

TR ẦN

H Ư

Hình D.4: Sắc ký đồ mẫu NN1

ẠO

(b) Sau 1 tháng

(a) 0 tháng

(b) Sau 1 tháng

Hình D.6: Sắc ký đồ mẫu NN4

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

U Y

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

10 00

TR ẦN

H Ư

Hình D.7: Sắc ký đồ mẫu NN5

ẠO

(b) Sau 1 tháng

(a) 0 tháng

(b) Sau 1 tháng

Hình D.8: Sắc ký đồ mẫu NN6

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

(a) 0 tháng

(b) Sau 1 tháng

Hình D.9: Sắc ký đồ mẫu NN7

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

(a) 0 tháng

(b) Sau 1 tháng

U Y

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

TR ẦN

H Ư

ẠO

Hình D.10: Sắc ký đồ mẫu NN8

10 00

(a) 0 tháng

(b) Sau 1 tháng

(a) 0 tháng

(b) Sau 1 tháng

Hình D.12: Sắc ký đồ mẫu NN10

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

Hình D.11: Sắc ký đồ mẫu NN9

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

PHỤ LỤC E: THÔNG TIN CÁC MẪU

26/10/2015

25/10/2018

Dung dịch

15009SN

03/09/2015

03/09/2017

Dung dịch

130415

13/04/2015

08/04/2018

030715

09/07/2015

09/07/2018

Dung dịch

NN1

0517

15/09/2015

15/09/2016

Dung dịch

NN2

0950C2N

02/11/2015

Dung dịch

NN3

12247

09/10/2015

NN4

A1733A

NN5

428NJ5

NN6

A21512

NN7

12:12

NN8

A0035C

NN9

NN10

NN11

U Y

154417741

ẠO

Dung dịch

04/11/2015

04/05/2016

Dung dịch

03/11/2015

03/05/2016

Dung dịch

25/11/2015

25/05/2016

Dung dịch

27/08/2015

27/05/2016

Dung dịch

29/09/2015

29/03/2016

Dung dịch

A0134C

03/11/2015

08/05/2016

Dung dịch

24/05/2015

24/05/2016

Dung dịch

1B44

11/10/2015

11/10/2016

Dung dịch

NN12

C5W03B

21/12/2015

20/06/2016

Dung dịch

NN13

02:09

04/08/2015

04/05/2016

Dung dịch

NN14

A2151B

25/11/2015

25/05/2016

Dung dịch

NN15

A0720A

16/12/2015

16/06/2016

Dung dịch

NN16

05W47B

20/10/2015

19/04/2016

Dung dịch

B 10 00

Í-L

ÁN

ÀN

TR ẦN

Dung dịch

H Ư

02/11/2016 09/10/2016

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

bào chế

Hạn dùng

Đ IỄ N

Ngày sản xuất

Số lô

mẫu

STT

Dạng

Tên

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

NN17

A6:44

14/08/2015

14/05/2016

Dung dịch

NN18

A1428F

29/10/2015

29/04/2016

Dung dịch

TPCN1

25/01/2015

25/01/2017

Dung dịch

TPCN2

01/06/2015

01/06/2017

Dung dịch

TPCN3

0115

05/01/2015

05/01/2018

Dung dịch

TPCN4

15299

07/08/2015

06/08/2017

TPCN5

161115

21/11/2015

21/11/2018

Dung dịch

TPCN6

017/15

07/07/2015

06/07/2018

Dung dịch

U Y

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

10 00

TR ẦN

H Ư

ẠO

Dung dịch

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial