4.2. Xác định c ác nhóm hợp chất

4.1.2. Chiết dịch chiết cồn

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL Bã dược liệu được chiết tiếp bằng cồn cao độ (hoặc methanol) trong bình nón với sinh hàn hồi lưu 20-30 phút trên bếp cách thùy, thực hiện 2-3 lần. Gộp các dịch chiết, lọc và cô lại đến khi còn khoảng 50 ml dịch chiết cồn. Phần lớn dịch chiết cồn được dung để định tính trực tiếp các nhóm hợp chất. Một phần dịch chiết được thủy phân để định tính các aglycon sau khi thủy phân. Lấy 15 ml dịch chiết cồn cho vào bình nón 100 ml, thêm 10 ml acid hydroclorid 10% và đun hồi lưu trên bếp cách thủy 30 phút. Để nguội, cho hỗn hợp vào bình lắng gạn và chiết bằng ether ethylic (15 ml x 3 lần). Dịch ether được dùng để định tính các aglycon. 4.1.3. Chiết dịch chiết nước Bã dược liệu sau khi chiết bằng cồn được đem chiết nóng với nước trong bình nón trên bếp cách thủy sôi. Gộp các dịch chiết, để nguội, lọc (và cô lại nếu cần) để thu được khoảng 50 ml dịch chiết nước. Phần lớn dịch chiết được dùng để định tính trực tiếp các nhóm hợp chất. Một phần dịch chiết được thủy phân để định tính các aglycon sau khi thủy phân. Lấy 15 ml dịch chiết nước cho vào bình nón 100 ml, thêm 10 ml acid hydrochloric 10% và đun hồi lưu trên bếp cách thủy 30 phút. Để nguội, cho hỗn hợp vào bình lắng gạn và chiết bằng ether ethylic (15 ml x 3 lần). Dịch ether được dùng để định tính các aglycon. [12]. 4.2. Xác định các nhóm hợp chất 4.2.1. Xác định các chất tan trong dịch ether Dịch chiết được dùng để xác định các nhóm hợp chất sau: 1. Chất béo. 4. Triterpenoid tự do. 7. Anthraquino n. 2. Tinh dầu. 5. Alkaloid. 8. Flavonoid. 3. Carotenoid. 6. Coumarin. a) Xác định tinh dầu Lấy khoảng 5 ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cạn. Nếu cắn có mùi thơm nhẹ, thêm vào cắn một ít cồn cao độ (TT) rồi lại bốc hơi cho đến cắn. Cắn có mùi thơm nhẹ đặc trưng: có tinh dầu. b) Xác định chất béo Lấy vài giọt dịch chiết ether nhỏ lên cùng một chỗ trên một miếng giấy mỏng, hơ hoặc sấy nhẹ cho bay hết dung môi (và hết mùi thơm nếu dịch chiết có tinh dầu). Nếu tại nơi nhỏ dịch chiết có vết trong mờ: có chất béo.

c) Định tính carotenoid

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL Lấy khoảng 5 ml dịch ether cho vào chén sử, bốc hơi nhẹ tới cắn (và gần như không còn mùi thơm nếu dịch chiết có tinh dầu). Thêm vào cắn vài giọt dung dịch SbCl3 (khan) bão hoà trong chloroform (Thuốc thừ Carr-Price). Dung dịch có màu xanh sau đó chuyển thành màu đỏ: có carotenoid. Lấy khoảng 5ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi nhẹ tới cắn (và gần như không còn mùi thơm nếu dịch chiết có tinh dầu). Thêm vào cắn vài giọt H2SO4 đđ. Dung dịch có màu xanh dương đậm hay màu xanh lục ngả sang màu xanh dương: có carotenoid. Nếu phản ứng bị ảnh hưởng bởi chlorophyll, có thể loại chlorophyll ra khỏi dịch chiết ether bằng cách đun nóng với một lượng nhỏ than hoạt và lọc lấy dịch chiết để thực hiện phản ứng. d) Định tính triterpenoid Triterpenoid là những hợp chất được sinh tổng hợp từ 6 đơn vị isopren. Các triterpen có bộ khung chính là 30 carbon rất thường gặp trong thực vật. Các chất steroid có trong thực vật (thường được gọi với tên gọi chung là các phytosterol) xét theo nghĩa rộng cũng thuộc các triterpenoid. Các triterpenoid tồn tại dưới dạng tự do (không có phần đường) trong cây được định tính bằng phản ứng LiebermannBurchard. Kết quả định tính dương tính thường được xem như là có mặt của các triterpenoid tự do (hay đôi khi được gọi là các triterper và steroid tự do) trong dược liệu. Các steroid đặc biệt (aglycon của glycosid tim), các glycosid (glycoside tim, saponin) được định tính trong phần dịch chiết cồn và nhận định bằng các phản ứng khác. Lấy khoảng 5ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hoà tan cắn với 0,5 ml anhydrid acetic rồi thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform. Chuyển dung dịch vào một ống nghiệm nhỏ, khô. Dùng pipet Pasteur thêm cẩn thận 1-2 ml H2SO4 đđ lên thành ống nghiệm để nghiêng cho acid chạy xuống đáy ống nghiệm. Nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp dung dịch phía trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím: có triterpenoid (phytosterol hoặc các triterpen) tự do. Trong trường hợp phản ứng bị ảnh hưởng nhiều bởi chlorophyll, có thể loại chiorophyll ra khỏi dịch chiết ether bằng cách đun nóng với một lượng nhỏ than hoạt tính và lọc lấy dịch chiết để thực hiện phản ứng, hoặc dùng dung dịch chứng (không có H2SO4 đđ) để so sánh. e) Định tính alkaloid Lấy khoảng 10 ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hoà cắn trong 2-4 ml dung dịch acid hydrocloric 1%. Chia dung dịch acid vào 4 ống nghiệm nhỏ.

Định tính alkaloid bằng các thuốc thử Mayer, Bertrand và Bouchardat (có thể sử DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL dụng thêm một vài thuốc thử tạo của khác như thuốc thử Dragendorf, thuốc thử Hager,...). * Thuốc thử Bouchardat : tủa đỏ nâu. * Thuốc thử Bertrand : tủa trắng. * Thuốc thử Mayer : tủa trắng – vàng nhạt. * Thuốc thử Dragendorf : tủa đỏ cam. * Thuốc thử Hager : tủa vàng cam. So sánh kết quả với ống chứng không có thuốc thừ. Nếu dung dịch đục hơn so với ống chứng hoặc có tủa: có alkaloid. f) Định tính coumarin Nhỏ vài giọt dịch chiết ether lên một miếng giấy lọc. Để ether bay hơi cho tới khô, nhỏ lên vết dịch chiết 1-2 giọt dung dịch KOH 10% trong cồn và sấy nhẹ cho khô. Che một nữa vết dịch chiết bằng một miếng kim loại và soi dưới đèn tử ngoại 365 nm. Sau phản phút, lấy miếng kim loại che nửa vết dịch chiết ra. Nếu phần bị che có cường độ phát quang yếu hơn nửa không bị che nhưng sau đó sáng dần lên cho tới khi có cường độ tương đương: Có coumarin. Lấy khoảng 5ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hoà cắn trong 2 ml cồn 70%. Chia đều dịch chiết vào 2 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào ống thứ nhất 0,5 ml KOH 10%, và ống thứ 2 một lượng nước cất tương đương. Đun cách thủy cả 2 ống nghiệm trong 2 phút, nguội và soi dưới đèn tử ngoại 365 nm. Dung dịch trong ống 1 có huỳnh quang mạnh hơn dung dịch trong ống thứ 2: Có coumarin. g) Định tính anthraquinon Các hợp chất anthraquinon (dạng tự do, oxy hoá) có trong dịch chiết ether được định tính bằng phản ứng Bornträger. Lấy khoảng 5 ml dịch ether cho vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào 1 ml dung dịch NaOH 10% và lắc kỹ. Nếu lớp kiềm có màu từ hồng tới đỏ: Có anthraquinon dạng tự do. h) Định tính flavonoid Các hợp chất flavonoid (flavanon, flavanonol, flavon, flavonol) trong dược liệu được định tính bằng phản ứng cyanidin. Lấy khoảng 10 ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi đến cắn khô. Hoà cắn với 2 ml cồn và gạn dịch cồn vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào dung dịch một ít bột magnesi kim loại và thêm từ từ 0,5 ml HCl đđ. Nếu sau phản ứng, dung dịch có màu từ hồng tới đỏ: Có flavonoid. [12].

4.2.2. Xác định các nhóm hợp chất tan trong dịch chiết cồn [12]. DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL Dịch chiết cồn được dùng để xác định các nhóm hợp chất sau: 1. Alkaloid. 4. Glycosid tim. 7. Saponin. 2. Coumarin. 5. Flavonoid. 8. Các chất khử. 3. Anthraquinon. 6. Tanin. 9. Acid hữu cơ. Thông thường, người ta định tính các nhóm hợp chất trực tiếp từ dịch chiết cồn. Các kết quả thường đã tin cậy để xác nhận sự có mặt của nhóm hợp chất trong dịch chiết. Riêng với các anthraglycosid, người ta thường chỉ định tính chúng sau khi đã thủy phân thành dạng tự do. Với một số nhóm hợp chất như coumarin, flavonosid, glycosid tim, saponosid phản ứng định tính của có thể bị che lấp bởi các tạp chất làm cho việc kết luận gặp khó khăn. Trong trường hợp này, người ta có thể thực hiện thêm việc thủy phân các nhóm chất, chiết lấy dạng aglycon và định tính dạng aglycon của chúng. Kết quả định tính dương tính sẽ làm tăng khả năng kết luận sự có mặt của các nhóm hợp chất này trong dịch chiết. *** Xác định trực tiếp từ dịch chiết cồn Dịch chiết cần được dùng để định tính các nhóm hợp chất: 1. Alkaloid. 4. Saponin. 7. Các chất khử. 2. Coumarin. 5. Flavonoid. 8. Acid hữu cơ. 3. Glycosid tim. 6. Tannin. a) Định tính alkaloid Lấy khoảng 5 ml dịch cồn cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hoà cắn trong 24 ml dung dịch acid hydrocloric 5%. Chia dung dịch acid vào 4 ống nghiệm nhỏ. Định tính alkaloid bằng các thuốc thử: Mayer, Bertrand và Bouchardat. So sánh kết quả với ống chứng không thuốc thừ. Nếu dung dịch đục hoặc có tủa: Có alkaloid. b) Định tính coumarin Thực hiện 1 trong 2 cách sau: - Nhỏ vài giọt dịch chiết cồn lên một miếng giấy lọc. Bay hơi cồn cho tới khô, nhỏ lên vết dịch chiết 1-2 giọt dung dịch KOH 10% trong cồn và sấy nhẹ cho khô. Che một nửa vết dịch chiết bằng một miếng kim loại và soi dưới đèn tử ngoại 365 nm. Sau vài phút, lấy miếng kim loại che vết dịch chiết ra. Nếu phần bị che có cường độ phát quang yếu hơn nhưng sau đó sáng dần lên cho tới khi có cường độ tương đương: Có coumarin.

- Lấy khoảng 5 ml dịch cồn cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hoà cắn trong 2 DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ml cồn 70%. Chia đều dịch chiết vào 2 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào ống thứ nhất 0,5 ml KOH 10%, và ống thứ 2 một lượng nước cất tương đương. Đun cách thủy cả 2 ống nghiệm trong 2 phút, để nguội và soi dưới đèn từ ngoại 365 nm. Sự xuất hiện của huỳnh quang mạnh của ống thứ nhất chứng tỏ sự có mặt của coumarin. Thêm vào cả 2 ống nghiệm, mỗi ống 2,5 ml nước cất. Nếu dung dịch trong ống 1 trong hơn dung dịch trong ống 2: Có coumarin. c) Định tính glycosid tim Các glycosid tim nhóm cardenolid thông thường có thể được xác định từ dịch chiết cồn bằng cách các phản ứng sau: - Định tính vòng lacton 5 cạnh: Lấy 5 ml dịch cồn cho vào chén sứ bốc hơi cho tới cắn. Hòa lại cắn với 2 ml cồn, gạn dịch cồn vào 1 ống nghiệm nhỏ. Cho vào 2-3 giọt dung dịch m-dinitrobenzen 1% trong cồn 96 (rồi thêm vào 3 giọt KOH 5% (Phản ứng Raymond-Marthoud). Nếu xuất hiện màu tím: Có các cardenolid. - Định tính đường 2-desoxy: Lấy 5ml dịch cồn cho vào chén sứ bốc hơi cho tới cắn. Hòa lại cắn với 5 ml thuốc thử xanthydrol khuấy cho tan hết cắn, đậy ống nghiệm bằng nút bông gòn, cách thủy trong 5 phút. Nếu có màu hồng đến đỏ mận: Có đường 2-desoxy. d) Định tính flavonoid Định tính các dẫn chất có cấu trúc y-pyron và y-dihydropyron: Các flavonoid có nhân y-pyron và y-dihydropyron (flavanon, flavanonol, flavon, flavonol) trong dược liệu được phát hiện bằng phản ứng cyanidin. Lấy khoảng 5 ml dịch cồn cho vào chén sứ, bốc hơi còn khoảng 2 ml và gạn dịch cồn vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào dung dịch một ít bột magnesi kim loại và 0,5 ml HCl đđ. Nếu dung dịch có màu từ hồng tới đỏ: Có flavonoid. e) Định tính anthocyanosid Lấy 1 ml dịch chiết cho vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm 2-3 giọt dung dịch acid hydrochloric 10%. Nếu dung dịch có màu hồng đỏ tới đỏ và chuyển sang màu xanh khi kiềm hoá bằng dung dịch natri hydroxid 10%: Có anthocyanosid. f) Định tính proanthocyanidin Lấy 5 ml dịch chiết cho vào 1 ống nghiệm. Thêm 2 ml dung dịch acid hydrocloric 10% và đun trong bếp cách thủy 10 phút. Nếu dung dịch có màu hồng tới đỏ: Có proanthocyanidin. g) Định tính tannin Lấy 2 ml dịch chiết cho vào một chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hoà tan cắn với 4 ml nước trên bếp cách thủy. Lọc, chia dịch chiết vào hai ống nghiệm.

- Ống nghiệm thứ nhất: pha loãng 0,5 ml dịch chiết với 1 ml nước cất. Thêm 2-3 DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL giọt thuốc thử FeCl3 5%, lắc đều. Nếu dung dịch có màu xanh đen hay xanh rêu: Có polyphenol. - Ống nghiệm thứ hai: Thêm vào dịch lọc 5 giọt dung dịch gelatin muối, lắc đều, so sánh với ông chứng chứa dịch chiết ban đầu. Nếu có tủa bông trắng: Có tannin. Ghi chú: Dưới tên gọi polyphenol là tất cả các chất có nhiều nhóm hydroxyphenol trong phân tử, cho màu xanh đen hay xanh rêu với FeCl3 trong đó có tannin. Việc kết luận dịch chiết có tannin sẽ chắc chắn hơn khi làm thêm phản ứng chung của polyphenol và phản ứng này bắt buộc phải dương tính. h) Định tính saponin Lấy 5 ml dịch chiết cồn cho vào chén sứ, cô trên bếp cách thuỷ tới cắn. Hoà cắn trong 5 ml cồn 25% trên bếp cách thủy, lọc vào ống nghiệm. Thêm 5 ml nước và lắc mạnh theo chiều dọc ống. Nếu có bọt bền: Có saponin. Phản ứng định tính khung triterpenoid của saponin được thực hiện trong phần (*** Xác định các nhóm hợp chất từ dịch cồn thủy phân). i) Định tính các chất khử Lấy 5 ml dịch chiết cho vào 1 chén sứ, bốc hơi dịch cồn đến cắn. Hòa cắn với 3 ml nước cất trên bếp cách thủy, để nguội và lọc qua giấy lọc. Thêm vào dịch lọc 0,5 ml dung dịch Fehling A và 0,5 ml dung dịch Fehling B. Đun cách thủy 5 phút. Nếu có kết tủa đỏ gạch dưới đáy ống nghiệm: Có các hợp chất khử (chủ yếu là đường khử). j) Định tính các acid hữu cơ Lấy 2 ml dịch chiết cho vào một ống nghiệm Pha loãng với 1 ml nước và thêm vào dung dịch một ít tinh thể natri carbonat. Nếu có các bọt khí nhỏ sủi lên từ các tinh thể Na2CO3: Có acid hữu cơ. [12]. *** Xác định các nhóm hợp chất từ dịch cồn thủy phân Dịch ether thu được sau khi chiến dịch cồn thuỷ phân bằng acid được dùng để định tính các nhóm hợp chất: 1. Triterpenoid thủy phân. 3. Anthraquino n. 5. Flavonoid. 2. Coumarin. 4. Glycosid tim. a) Định tính khung triterpenoid sau khi thủy phân: Phản ứng dương tính của khung triterpen hay steroid trong dịch chiết cồn sau khi đã thủy phân củng cố cho kết luận về sự hiện diện của các triterpenoid glycosid (sponin, glycosia tim) trong mẫu thử.

Lấy khoảng 5 ml dịch ether sau khi thuỷ phân cho vào chén sứ, bốc hơi tới DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL cắn. Hoà tan cắn 0,5 ml anhydrid acetic rồi thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform. Chuyển dung dịch vào một ống nghiệm nhỏ khô. Dùng pipet Pasteur thêm cẩn thận 1-2 ml H2SO4 đđ theo thành ống nghiệm cho chảy xuống đáy ống nghiệm. Nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp dung dịch phía trên lớp ngăn cách dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím: Có triterpenoid. b) Định tính coumarin Nhỏ vài giọt dịch chiết ether sau khi thuỷ phân lên một miếng giấy lọc Bay hơi ether cho tới khô, nhỏ lên vết dịch chiết 1-2 giọt dung dịch KOH 10% trong cồn và sấy nhẹ cho khô. Che một nửa vết dịch chiết bằng một miếng kim loại và soi dưới đèn từ ngoại 365 nm. Sau vài phút, lấy miếng kim loại che vết dịch chiết ra. Nếu phần bị che có cường độ phát quang yếu hơn nhưng sau đó sáng dần lên cho tới khi có cường độ tương đương: Có coumarin. Lấy khoảng 5 ml dịch ether sau khi thuỷ phân cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hoà cắn trong 2 ml cồn 70%. Chia đều dịch chiết vào 2 ống nghiệp nhỏ. Thêm vào ống thứ nhất 0,5ml KOH 10%, và ống thứ 2 một lượng nước cất tương đương. Đun cách thủy cả 2 ống nghiệm trong 2 phút, để nguội và soi dưới đèn tử ngoại 365 nm. Sự xuất hiện của huỳnh quang mạnh của ống thứ nhất chứng tỏ sự có mặt của coumarin. Thêm vào cả 2 ống nghiệm, mỗi ống 2,5 ml nước cất. Nếu dung dịch trong ống 1 trong hơn dung dịch trong ống 2: Có coumarin. c) Định tính anthraguinon Lấy khoảng 5 ml dịch ether sau khi thuỷ phân cô trên bếp cách thủy còn 2 ml rồi cho vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào ống nghiệm 1 ml dung dịch NaOH 10% và lắc kỹ. Nếu lớp kiềm có màu từ hồng tới đỏ: Có anthraquinon. d) Định tính glycosid tim Định tính vòng lacton 5 cạnh: Lấy 5 ml dịch ether sau khi thuỷ phân cho vào chén sứ bốc hơi cho tới cắn. Hòa lại cắn với 2 ml cồn, gạn dịch cồn vào 1 ống nghiệm nhỏ. Cho vào 2-3 giọt dung dịch 1% của m-dinitrobenzen trong cồn 96% rồi thêm vào 3 giọt KOH 5% (phản ứng Raymond-Marthoud). Nếu xuất hiện màu tím: Có các cardenolid. Phần khung steroid của glycosid tim được định tính trong mục (*** Xác định các nhóm hợp chất từ dịch cồn thủy phân). e) Định tính flavonoid Lấy khoảng 5 ml dịch ether sau khi thuỷ phân cho vào chén sứ, bốc hơi đến cắn, hoà cắn vào 2 ml cồn và cho vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào dung dịch một ít bột magnesi kim loại và 0,5 ml HCl đđ. Nếu dung dịch có màu từ hồng tới đỏ: Có flavonoid (nhân y-pyron).

Ghi chú: sử dụng dịch chiết ethylacetat thay cho dịch chiết ether để định tính DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL flavonoid có thể sẽ cho kết quả tốt hơn. 4.2.3. Xác định các chất tan trong dịch chiết nước [12]. Dịch chiết nước được dùng để xác định các nhóm hợp chất sau: 1. Alkaloid. 4. Flavonoid. 7. Các chất khử. 2. Glycosid tim. 5. Tannin. 8. Acid hữu cơ. 3. Anthraglycosid. 6. Saponosid. 9. Polyuronid. Sự hiện diện của các nhóm hợp chất alkaloid, glycosid tim, coumarin trong dịch chiết nước phần nhiều là do chúng có hàm lượng cao nên chưa được chiết hết ở dịch chiết cồn. Saponin, anthraglycosid, flavonosid, tannin, acid hữu cơ hay các đường khử, v.v... nếu phân tử phân cực mạnh (cấu trúc phân tử có mạch đường dài hay nhiều mạch đường hay có nhiều nhóm phân cực) sẽ tan mạnh hơn trong nước và tồn tại nhiều hơn trong dịch chiết nước. Việc xác định các nhóm hợp chất này trong dịch chiết nước được tiến hành phần nhiều mang ý nghĩa xác nhận lại các kết quả của dịch chiết cồn. Riêng nhóm carbohydrat loại heteropolysaccharid (gôm, pectin, chất nhầy, thường được gọi với tên chung là các polyuronic hay các chất polyuronic) chỉ xuất hiện trong dịch chiết nước. Một số nhóm hợp chất khác cũng có thể có mặt trong dịch chiết nước nhưng do có ít ý nghĩa nên ít khi được phân tích. Thông thường, người ta xác định các nhóm hợp chất tan trong nước một cách trực tiếp. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, một số nhóm hợp chất như glycosid tim, saponin, flavonoid có thể cho phản ứng không rõ ràng do bị cản trở bởi các tạp chất. Khi ấy, người ta tiến hành thủy phân và định tính dạng aglycon của chúng. Kết quả nhằm củng cố kết luận của phản ứng định tính trực tiếp. Riêng với các anthraglycosid, người ta thường chỉ định tính chúng sau khi đã thủy phân thành dạng tự do. *** Xác định trực tiếp từ dịch chiết nước Dịch chiết nước được dùng để định tính các nhóm hợp chất: 1. Alkaloid. 4. Tannin. 7. Acid hữu cơ. 2. Flavonoid. 5. Saponin. 8. Polyuronid. 3. Glycosid tim. 6. Các hợp chất khử. a) Định tính alkaloid Lấy khoảng 10 ml dịch nước cho vào một bình lắng gạn 50 ml, kiềm hóa dịch chiết tới pH 10 bằng dung dịch NH4OH 10% và chiết bằng ether ethylic hoặc chloroform (10 ml x 3 lần). Gộp chung và rửa lớp dung môi hữu cơ với 10 ml bằng

nước cất. Lắc lớp ether với dung dịch acid hydrocloric 5% (2 ml x 3 lần). Chia dung DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL dịch acid vào 4 ống nghiệm nhỏ. Định tính alkaloid bằng các thuốc thử: Mayer, Bertrand và Bouchardat. * Thuốc thử Valse-Mayer : tủa trắng - vàng nhạt. * Thuốc thử Bertrand : tủa trắng. * Thuốc thử Bouchardạt : tủa đỏ cam. So sánh với ống chứng không có thuốc thử. Nếu dung dịch đục hoặc có tủa: Có alkaloid. b) Định tính glycosid tim Định tính vòng lacton 5 cạnh: Lấy 5 ml dịch nước cho vào chén sử bốc hơi cho tới cắn. Hòa lại cắn với 2 ml cồn 25%, gạn dịch cồn vào 1 ống nghiệm nhỏ. Cho vào 2-3 giọt dung dịch 1% của m-dinitrobenzen trong cồn 96% rồi thêm vào 3 giọt KOH 5% (phản ứng Raymond-Marthoud). Nếu xuất hiện màu tím: Có các cardenolid. Định tính đường 2-desoxy: Lấy 5 ml dịch chiết nước bốc hơi cho tới cắn. Hòa lại cắn với 5 ml thuốc thử xanthydrol khuấy cho tan hết cắn, đậy ống nghiệm bằng nút bông gòn, cách thủy trong 5 phút. Nếu có màu hồng đến đỏ mận: Có đường 2-desoxy. c) Định tính flavonoid Định tính các dẫn chất có nhân y-pyron và y-dihydropyron: Lấy khoảng 5 ml dịch nước cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hoà tan cắn trong khoảng 2 ml cồn 25%, lọc vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào dung dịch một ít bột magnesi kim loại và 0,5 ml HCl đđ (phản ứng cyanidin). Nếu dung dịch có màu từ hồng tới đỏ: Có flavonoid (flavanon, flavanonol, flavon, flavonol). d) Định tính anthocyanosid Lấy 1 ml dịch chiết nước cho vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm 2-3 giọt dung dịch acid hydrocloric 10%. Nếu dung dịch có màu hồng đỏ tới đỏ và chuyển sang màu xanh khi kiểm hoá bằng dung dịch natri hydroxid 10%: Có anthocyanosid. e) Định tính proanthocyanidin Lấy 5 ml dịch chiết nước vào ống nghiệm. Thêm 2 ml dung dịch acid hydrocloric 10% và đun trong bếp cách thủy 10 phút. Nếu dung dịch có màu hồng đỏ tới đỏ: Có proanthocyanidin. f) Định tính tannin Lấy 0,5 ml dịch chiết cho vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm 2-3 giọt thuốc thử FeCl3 5%, lắc đều. Nếu dung dịch có màu xanh đen hay xanh rêu: Có polyphenol.

Lấy 2 ml dịch chiết, thêm vào 5 giọt dung dịch gelatin-muối, lắc đều, so sánh DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL với dung dịch ban đầu. Nếu có tùa bông trắng: Có tannin. Ghi chú: Dưới tên gọi polyphenol là tất cả các chất có nhiều nhóm hydroxyphenol trong phân từ, cho màu màu xanh đen hay xanh rêu với FeCl3 trong đó có tannin. Việc kết luận dịch chiết có tannin sẽ chắc chắn hơn khi làm thêm phản ứng chung của polyphenol và phản ứng này bắt buộc phải dương tính, bên cạnh phản ứng chính với dung dịch gelatin-muối. g) Định tính saponin Lấy khoảng 5 ml dịch nước cho vào một chén sứ, đun cách thủy tới cắn khô. Hoà cắn với 5 ml cồn 25%, lọc vào ống nghiệm. Pha loãng với 5 ml nước, lắc mạnh theo chiều dọc của ống trong 15 giây. Nếu có cột bọt bền trong 15 phút: Có saponin. Phản ứng định tính khung triterpenoid của saponin được thực hiện ở phần (*** Xác định các nhóm hợp chất từ dịch nước thủy phân) h) Định tính hợp chất khử Lấy 5 ml dịch chiết cô cách thủy tới khô, hoà tan cắn trong cồn 25%, lọc. Cho dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml dung dịch Fehling A và 0,5 ml dung dịch Fehling B. Đun cách thủy 5 phút. Nếu có kết tủa đỏ gạch nặng lắng dưới đáy ống nghiệm: Có các chất khử (chủ yếu là đường khử). i) Định tính các acid hữu cơ Lấy 2 ml dịch chiết cho vào một ống nghiệm. Thêm vào dung dịch một ít tinh thể natri carbonat. Nếu có các bọt khí nhỏ sủi lên từ các tinh thể Na2CO3: Có acid hữu cơ. j) Định tính hợp chất polyuronid Nhỏ từng giọt 2 ml dịch chiết nước vào một ống nghiệm có chứa 10 ml cồn 95% (hoặc aceton). Nếu có nhiều tủa bông được tạo thành: Có các polyuronid (gôm, pectin, chất nhầy...). Để kết luận chính xác hơn, tủa được ly tâm hay lọc và rửa với cồn hay aceton sau đó được nhộm với một số thuốc nhuộm đặc hiệu như hematoxylin, xanh toluidin, xanh methylene, v.v... Chất nhầy sẽ nhuộm màu xanh hay tím. *** Xác định các nhóm hợp chất từ dịch nước thủy phân Dịch ether thu được sau khi chiết dịch nước thuỷ phân bằng acid được dùng để định tính các nhóm hợp chất: 1. Triterpenoid thủy phân. 3. Anthraquino n. 2. Glycosid tim. 4. Flavonoid.

a) Định tính khung triterpenoid

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL Phản ứng dương tính của khung triterpen hay steroid trong dịch chiết nước sau khi đã thủy phân củng cố cho kết luận về sự hiện diện của các triterpenoid glycosid (saponin, glycoside tim) trong mẫu thử. Lấy khoảng 5 ml dịch ether sau thuỷ phân cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hoà tan cắn 0,5 ml anhydrid acetic rồi thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform. Chuyển dung dịch vào một ống nghiệm nhỏ khô. Dùng pipet Pasteur thêm cẩn thận 1-2 ml H2SO4 độ dọc theo thành ống để acid chìm xuống đáy ống nghiệm. Nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp dung dịch phía trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím: Có triterpenoid (Các triterpenoid thuỷ phân). b) Định tính glycosid tim Định tính vòng lacton 5 cạnh: Lấy 5 ml dịch ether cho vào chén sứ bốc hơi cho tới cắn. Hòa lại cắn với 2 ml cồn 95%, gạn dịch cồn vào 1 ống nghiệm nhỏ. Cho vào 2-3 giọt dung dịch 1% của m-dinitrobenzen trong cồn 95% rồi thêm vào 3 giọt KOH 5% (phản ứng Raymond-Marthoud). Nếu xuất hiện màu tím: Có các cardenolid. Phản ứng định tính khung steroid của glycosid tim được thực hiện ở mục (*** Xác định trực tiếp từ dịch chiết nước). c) Định tính anthraquinon Lấy khoảng 5 ml dịch ether cô trên bếp cách thủy còn 2 ml rồi cho vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào ống nghiệm 1 ml dung dịch NaOH 10% và lắc kỹ. Nếu lớp kiềm có màu từ hồng tới đỏ: Có anthraquinon. d) Định tính flavonoid Lấy khoảng 5 ml dịch ether cho vào chén sứ. bốc hơi đến cắn, hoà cắn vào 2 ml cồn 95% và cho vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào dung dịch một ít bột magnesi kim loại và 0,5 ml HCl đậm đặc. Nếu dung dịch có màu từ hồng tới đỏ: Có flavonoid (Các dẫn chất y-pyron). Ghi chú: sử dụng ethylacetat thay cho dịch chiết ether có thể sẽ cho kết quả tốt hơn. [12].