ĐỊNH LƯỢNG NOTOGINSENOSID R1 VÀ MỘT SỐ GINSENOSID TRONG THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE BẰNG HPLC

ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

vectorstock.com/2358396

Ths Nguyễn Thanh Tú eBook Collection

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG NOTOGINSENOSID R1 VÀ MỘT SỐ GINSENOSID TRONG THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE BẰNG HPLC WORD VERSION | 2022 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL.COM

Tài liệu chuẩn tham khảo Phát triển kênh bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật : Nguyen Thanh Tu Group Hỗ trợ trực tuyến Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon Mobi/Zalo 0905779594

AL

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ƠN

OF

FI

CI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NH

ĐÀM THỊ THU

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

DẠ Y

KÈ

M

QU

Y

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG NOTOGINSENOSID R1 VÀ MỘT SỐ GINSENOSID TRONG THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

HÀ NỘI 2021

AL

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

OF

ĐÀM THỊ THU

FI

CI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Y

NH

ƠN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG NOTOGINSENOSID R1 VÀ MỘT SỐ GINSENOSID TRONG THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

QU

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

KÈ

M

CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ CHUYÊN NGÀNH 8720210

DẠ Y

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh

HÀ NỘI 2021

AL

LỜI CẢM ƠN

CI

Tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. TS Nguyễn Thị Kiều Anh, người thầy đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều thời

FI

gian và tâm huyết giúp tôi hoàn thành luận văn này.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban Giám hiệu, phòng Quản lý đào tạo

OF

sau đại học, đặc biệt là các thầy cô giáo giảng dạy tại bộ môn Hóa phân tích và Độc chất - Trường Đại học Dược Hà Nội, đã tạo điều kiện cho tôi được trau dồi những kiến thức và kinh nghiệm quí báu trong suốt quá trình học tập

ƠN

tại trường cũng như quá trình thực hiện luận văn này.

Tôi chân thành cảm ơn Ban Giám đốc và toàn thể cán bộ trong khoa Kiểm nghiệm Đông dược - Dược liệu của Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc, mỹ

NH

phẩm, thực phẩm Hà Nội đã hết sức giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để cho tôi có thể hoàn thành khóa học và thực hiện luận văn này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình, cùng toàn

Y

thể bạn bè đã luôn giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên

Hà Nội, Ngày 12 tháng 3 năm 2021 Học Viên

DẠ Y

KÈ

M

QU

cứu.

Đàm Thị Thu

AL

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

CI

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG

FI

DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ

1 3

1.1.

Tổng quan về Notoginsenosid R1 và các ginsenosid ……………..

3

1.1.1. Nguồn gốc ………………………………………………………...

3

1.1.2. Đặc điểm tính chất và tác dụng …………………………………...

6

1.1.2.1. Notoginsenosid R1 ……………………………………….........

6

1.1.2.2. Ginsenosid Rg1 ………………………………………………..

7

1.1.2.3. Ginsenosid Re ………………………………………………...

9

NH

ƠN

OF

Chương 1. TỔNG QUAN ……………………………………………….

1.1.2.4. Ginsenosid Rb1 ……………………………………………….. 10 1.2.

Các nghiên cứu định lượng notoginsenosid R1 và các ginsenosid

Y

1.2.1. Định lượng notoginsenosid R1 và các ginsenosid trong một số

12

QU

chuyên luận Dược điển …………………………………………………..

12

1.2.2. Các nghiên cứu khác ……………………………………………... 18 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………. 22 2.1.

Đối tượng và phương tiện nghiên cứu …………………………. ... 22

M

2.1.1. Phương tiện nghiên cứu …………………………………………..

22

KÈ

2.1.1.1. Chất chuẩn …………………………………………………….. 22 2.1.1.2. Dung môi, hóa chất ……………………………………………

22

2.1.1.3. Thiết bị, dụng cụ ………………………………………………. 22

DẠ Y

2.1.2. Đối tượng nghiên cứu …………………………………………….

23

2.1.2.1. Trong thẩm định phương pháp phân tích ……………………... 23 2.1.2.2. Trong nghiên cứu trên mẫu thực ……………………………… 24

24

2.2.

Phương pháp nghiên cứu …………………………………………

24

2.2.1. Xây dựng quy trình phân tích …………………………………….

24

CI

AL

2.1.2.3. Dung dịch chuẩn……………………………………………….

24

2.2.1.2. Khảo sát quy trình xử lý mẫu ………………………………..

25

FI

2.2.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký ……………………………………

2.2.2. Thẩm định quy trình phân tích …………………………………… 25

OF

2.2.2.1. Xác định độ đặc hiệu ………………………………………….. 25 2.2.2.2. Độ thích hợp của hệ thống …………………………………….

26

2.2.2.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn …………………………… 26

ƠN

2.2.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) ……. 27 2.2.2.5. Độ đúng ………………………………………………………..

27

2.2.2.6. Độ chính xác của phương pháp ……………………………….. 28

NH

2.2.3. Ứng dụng phương pháp phân tích một số mẫu thực phẩm bảo vệ

28

2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu ………………………………………..

29

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ………………………………….

30

Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Notoginsenosid

QU

3.1.

Y

sức khỏe chứa notoginsenosid R1 và các ginsenosid ……………………

R1, ginsenosid Rg1, Rb1, Re trong TPBVSK bằng HPLC ……………..

3.1.1.

30

Xây dựng quy trình phân tích …………………………………. 30 30

3.1.1.2. Khảo sát quy trình xử lý mẫu ………………………………..

34

3.1.2.

39

M

3.1.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký ……………………………………

KÈ

Thẩm định quy trình phân tích ………………………………...

3.1.2.1. Độ đặc hiệu ……………………………………………………. 39 3.1.2.2. Độ thích hợp của hệ thống …………………………………….

42

DẠ Y

3.1.2.3. Khoảng tuyến tính ……………………………………………... 43 3.1.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)…….. 45 3.1.2.5. Độ đúng ………………………………………………………..

46

3.2.

AL

3.1.2.6. Độ chính xác …………………………………………………... 49 Ứng dụng phương pháp phân tích một số mẫu thực phẩm bảo vệ

CI

sức khỏe chứa chất phân tích ……………………………………………

Chương 4. BÀN LUẬN ………………………………………………....

52 57

FI

4.1. Về đối tượng và phương pháp nghiên cứu ………………………... 57 4.2. Về kết quả thẩm định phương pháp ………………………………. 58 60

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

62

OF

4.3. Về ứng dụng phân tích mẫu thực tế ……………………………….

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DẠ Y

KÈ

M

QU

Y

NH

ƠN

PHỤ LỤC

Ký hiệu

Tiếng Anh

Tiếng Việt

Thực phẩm bảo vệ sức khỏe Association

AOAC

CI

TPBVSK of

Official Hiệp hội các nhà hoá phân tích chính thống

FI

Analytical Community High performance liquid chromatography High performance thin layer

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

OF

HPLC

AL

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng

chromatography

cao

UHPLC-

Ultra-high performance liquid Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

MS/MS

chromatography tandem mass ghép khối phổ hai lần

ƠN

HPTLC

spectrometry

Liquid chromatography tandem

Sắc ký lỏng ghép khối phổ

MS/MS

mass spectrometry

hai lần

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantification

Giới hạn định lượng

MS

Mass spectrometry

Khối phổ

PDA

Photo diode Array

Mảng diod quang

DAD

Diode array Detector

Detector chuỗi diod

UV-VIS

Ultraviolet-Visible

Tử ngoại và khả kiến

C18

DẠ Y

ELSD

Y

QU

M

KÈ

CAD

NH

LC-

Charged Aerosol Detectors

Detector phun sương tích điện

Octadecyl Evaporative

light

scattering Detector tán xạ ánh sáng

detector

ALP

Alkaline phosphatase

MAPK

mitogen-activated protein kinase

bay hơi

Toll-like receptor 4

TNF-α

Tumor necrosis factors epithelium-derived

CI

Pigment

PEDF

AL

TLR4

factor Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

SD

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

RSD

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

OF

FI

RSD

Repeatability relative standard Độ lệch chuẩn tương đối

RSDr

deviation

lặp lại

ƠN

Reproducibility relative standard Độ lệch chuẩn tương đối tái

RSDR µl

Microlit

ACN

Acetonitril

TB

lặp

NH

deviation

Trung bình

Solid phase extraction

ISO

International Organization for Tổ chức tiêu chuẩn hoá

Y

SPE

DẠ Y

KÈ

M

QU

Standardization

Chiết pha rắn quốc tế

Bảng

AL

DANH MỤC CÁC BẢNG Tên Bảng

Trang

Saponin dẫn chất của 20(S) protopanaxadiol

Bảng 1.2

Saponin dẫn chất của 20(S) protopanaxatriol

Bảng 1.3

Định lượng notoginsenosid R1 và các ginsenosid trong

FI

một số chuyên luận Dược điển

3 4

12

Độ thu hồi chấp nhận, độ lệch chuẩn tương đối lặp lại

OF

Bảng 2.1

CI

Bảng 1.1

(RSDr), độ lệch chuẩn tương đối tái lặp (RSDR) ở các nồng độ khác nhau

28

Chương trình dung môi

Bảng 3.2

Kết quả khảo sát độ đặc hiệu

41

Bảng 3.3

Kết quả kiểm tra độ thích hợp của hệ thống

42

Bảng 3.4

Kết quả thẩm định khoảng tuyến tính của phương pháp

44

Bảng 3.5

Kết quả thẩm định LOD, LOQ của phương pháp

46

Bảng 3.6

Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp

48

Bảng 3.7

Kết quả khảo sát độ lặp lại

50

Bảng 3.8

Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian

51

Bảng 3.9

Kết quả phân tích mẫu thực tế

52

NH

Y

QU

M KÈ DẠ Y

ƠN

Bảng 3.1

30

Hình

Trang

Công thức cấu tạo của 2 genin của saponin triterpenoid tetracyclic

CI

Hình 1.1

AL

DANH MỤC CÁC HÌNH Tên Hình

Công thức cấu tạo của Notoginsenosid R1

Hình 1.3

Công thức cấu tạo của Ginsenosid Rg1

Hình 1.4

Công thức cấu tạo của Ginsenosid Re

Hình 1.5

Công thức cấu tạo của Ginsenosid Rb1

Hình 3.1

Sắc ký đồ dung dịch chuẩn (phía trên), dung dịch thử

OF

FI

Hình 1.2

dạng dầu (phía dưới) theo chương trình pha động 1 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn (phía trên), dung dịch thử

ƠN

Hình 3.2

dạng dầu (phía dưới) theo chương trình pha động 2 Hình 3.3

Sắc ký đồ dung dịch chuẩn (phía trên), dung dịch thử

NH

dạng dầu (phía dưới) theo chương trình pha động 3

3 6 8 9

10 31 32 32

Biểu đồ khảo sát quy trình xử lý mẫu

36

Hình 3.5

Biểu đồ khảo sát nhiệt độ chiết mẫu

37

Hình 3.6

Sơ đồ quy trình chiết mẫu

38

Hình 3.7

Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp

Hình 3.8

Sắc ký đồ mẫu nền (trên) và mẫu tự tạo (dưới) dạng rắn

40

Hình 3.9

Sắc ký đồ mẫu nền (trên) và mẫu tự tạo (dưới) dạng dầu

40

QU

Y

Hình 3.4

Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu nền (trên) và mẫu tự tạo (dưới) dạng lỏng

M

Hình 3.11 Đồ thị khảo sát sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất phân tích

39

41 45 54

Hình 3.13 Sắc ký đồ mẫu cao lỏng (M2)

54

Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu viên nang mềm (M3)

55

Hình 3.15 Sắc ký đồ mẫu viên nang mềm (M5)

55

Hình 3.16 Sắc ký đồ mẫu Viên nang mềm (M15)

55

DẠ Y

KÈ

Hình 3.12 Sắc ký đồ mẫu viên nang cứng (M1)

AL

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay trên thế giới, với xu hướng “Trở về thiên nhiên” nhu cầu sử

CI

dụng các loại thuốc và thực phẩm bảo vệ sức khỏe có nguồn gốc từ thiên

nhiên ngày càng gia tăng. Việc sử dụng các sản phẩm từ thiên nhiên để bảo vệ

FI

sức khỏe, phòng bệnh và trị bệnh đã được khám phá từ hàng ngàn năm trước ở Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam và các nước phương Tây. Với nền khoa học

OF

công nghệ ngày càng phát triển như hiện nay, quy mô nghiên cứu và sản xuất các loại thuốc, thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) có nguồn gốc từ dược liệu để cải thiện sức khỏe, nâng cao tuổi thọ, phòng ngừa các bệnh mạn tính,

ƠN

chống ung thư đang trở nên mở rộng. Các loại thảo dược quý hiếm như Nhân sâm, Tam thất với nhiều công dụng phòng và trị bệnh đã trở thành nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất các sản phẩm trên. Các sản phẩm TPBVSK

NH

chứa Nhân sâm, Tam thất đang được phân phối ở nhiều quốc gia trên thế giới và ngày càng mở rộng với nhiều dạng bào chế khác nhau như: Củ tươi, củ khô, bột, viên nén, viên nang, cao, nước giải khát, kẹo [3,10,23].

Y

Việt Nam là một trong những thị trường tiêu thụ lớn các chế phẩm đông

QU

dược, TPBVSK. Tuy nhiên, hiện nay các sản phẩm này đang được bày bán nhiều trong các nhà thuốc, cửa hàng kinh doanh dược liệu, siêu thị, thậm chí là bán hàng online và nhiều sản phẩm không rõ nguồn gốc xuất xứ. Rất nhiều sản phẩm không được kiểm soát chất lượng khiến cho người tiêu dùng khó có

M

thể chọn lựa cho mình những sản phẩm thực sự có hiệu quả. Mặt khác, Nhân

KÈ

sâm, Tam thất là những dược liệu có nhiều loài và hay bị giả mạo trên thị trường, đây chính là nguyên nhân của vấn đề thuốc giả chủ đề mang tính thời sự trong những năm gần đây [3,4].

DẠ Y

Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh rằng notoginsenosid R1 và các

ginsenosid (Rg1, Re, Rb1, Rf, Rd…) là những hoạt chất đặc trưng, điển hình cho tác dụng sinh học của các loài sâm thuộc chi Panax, họ Nhân sâm như Nhân

sâm,

Tam

thất,

Sâm 1

Việt

Nam,

Sâm

AL

Mỹ…[3,23,24,25,26,27,28,30,36,37]. Trong đó hàm lượng notoginsenosid R1

và các ginsenosid Rg1, Re, Rb1 chính là cơ sở để xác định chất lượng của

CI

dược liệu Nhân sâm và Tam thất theo các tiêu chuẩn Dược điển hiện hành:

Việt Nam, Trung Quốc, Anh, Mỹ… Các sản phẩm TPBVSK chứa Nhân sâm

FI

và Tam thất được công bố cũng sử dụng hàm lượng của các hoạt chất trên làm chỉ tiêu kiểm soát chất lượng [1,17,31,35,41]. Tuy nhiên hiện nay, các Dược

OF

điển chỉ có chuyên luận riêng cho các dược liệu Nhân sâm, Tam thất hoặc cao Nhân sâm còn sản phẩm TPBVSK trong thành phần có Sâm, Tam thất phối hợp cùng nhiều dược liệu khác hoặc vitamin và khoáng chất ở các dạng bào

ƠN

chế viên, bột, lỏng… chưa có phương pháp được công bố. Vì vậy việc xây dựng một phương pháp đáp ứng yêu cầu của các quy định hiện hành để xác định hàm lượng notoginsenosid R1 và các ginsenosid trong mẫu TPBVSK là

NH

cần thiết. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector DAD có độ đặc hiệu, độ chính xác cao, đơn giản, dễ thực hiện và phổ biến, có thể ứng dụng tại nhiều phòng thí nghiệm đã được nhóm nghiên cứu lựa chọn để

Y

thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng notoginsenosid R1 và

QU

một số ginsenosid trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao” với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng notoginsenosid R1 và một số ginsenosid (Rg1, Re, Rb1) trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe

M

dạng rắn, dạng dầu, dạng lỏng bằng HPLC.

KÈ

2. Ứng dụng phương pháp phân tích một số mẫu thực phẩm bảo vệ sức

DẠ Y

khỏe trong thành phần có Nhân sâm, Tam thất.

2

AL

Chương 1. TỔNG QUAN

CI

1.1. Tổng quan về Notoginsenosid R1 và các ginsenosid 1.1.1. Nguồn gốc

FI

Notoginsenosid R1 và các ginsenosid là saponin damaran được xem là thành phần hóa học chính trong các loài sâm thuộc chi Panax, họ Nhân sâm.

OF

Cho đến nay các nhà khoa học đã chiết tách và xác định được cấu trúc hơn 100 saponin từ các loài sâm trong đó có hơn 20 loại saponin có cấu trúc thuộc nhóm damaran, đây là nhóm Saponin triterpenoid tetracyclic: phần aglycon Khi

tác

dụng

bởi

acid

ƠN

gồm 4 vòng và 1 mạch nhánh (khung cyclopentanoperhydrophenantren). thì mạch nhánh đóng vòng tạo thành vòng

tetrahydrofuran. Bằng các phương pháp đặc biệt để cắt phần đường, người ta

NH

đã thu được các genin thật. Hai genin chính là 20(S) protopanaxadiol và

M

QU

Y

20(S) protopanaxatriol [3,7,8,32,33,42,44,45,49].

KÈ

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của 2 genin của saponin triterpenoid tetracyclic

Bảng 1.1. Saponin dẫn chất của 20(S) protopanaxadiol [3] R1

R2

Loài

Ginsenosid Rb1

Glc - Glc

Glc - Glc

Panax ginseng C.A.Mey; Panax notoginseng (Burk)

DẠ Y

Tên

3

Glc - Glc

Glc - Arap

Panax ginseng C.A.Mey; Panax notoginseng (Burk) F.H.Chen

Ginsenosid Rb3

Glc - Glc

Glc - Xyl

Panax ginseng C.A.Mey; Panax notoginseng (Burk) F.H.Chen

Ginsenosid Rc

Glc - Glc

Glc - Araf

Ginsenosid Rd

Glc - Glc

Quinquenosid R1

Glc - Glc Ac

Glc - Glc

Panax quiquefolium L.

Notoginsenosid R4

Glc - Glc

Glc - Glc Xyl

Panax notoginseng (Burk) F.H.Chen

Notoginsenosid Fa

Glc - Glc Xyl

Glc - Glc

Panax notoginseng (Burk) F.H.Chen

Glc - Glc Xyl

Glc - Xyl

Panax notoginseng (Burk) F.H.Chen

FI

OF

Glc

NH

Y

QU

M

KÈ

Notoginsenosid Fc

CI

Ginsenosid Rb2

ƠN

AL

F.H.Chen; Panax vietnamensis Ha et Grushv.

Panax ginseng C.A.Mey; Panax notoginseng (Burk) F.H.Chen Panax ginseng C.A.Mey; Panax notoginseng (Burk) F.H.Chen; Panax vietnamensis Ha et Grushv.

Chú thích: Glc: β-Dglucopyranosyl; Arap: α-L-arabinopyranosyl; Araf: α-L-

DẠ Y

arabinofuranosyl; Xyl: β-D-xylopyranosyl Bảng 1.2. Saponin dẫn chất của 20(S) protopanaxatriol [3] Tên

R1

R2

Loài

Ginsenosid Rg1

Glc

Glc

Panax ginseng C.A.Mey;

4

AL

Panax notoginseng (Burk) F.H.Chen; Panax vietnamensis Ha et Grushv.

Glc - Rha

Glc

Panax ginseng C.A.Mey; Panax notoginseng (Burk) F.H.Chen

Ginsenosid nc

Glc - Rha

Glc

Panax ginseng C.A.Mey

Ginsenosid nf

Glc - Rha

Glc

Panax ginseng C.A.Mey

Ginsenosid Rh1

Glc - Rha

Glc

PseudoginsenosidRT3

Xyl

Glc

Notoginsenosid R1

Glc - Xyl

Notoginsenosid R2

Glc - Xyl

Notoginsenosid R3

Glc

ƠN

OF

FI

CI

Ginsenosid Re

Panax ginseng C.A.Mey Panax pseudo ginseng Wall.

Panax notoginseng (Burk) F.H.Chen

Glc

Panax notoginseng (Burk) F.H.Chen

NH

Glc

Glc - Glc

Panax notoginseng (Burk) F.H.Chen

Y

Chú thích: Glc: β-Dglucopyranosyl; Arap: α-L-arabinopyranosyl; Araf: α-L-

QU

arabinofuranosyl; Xyl: β-D-xylopyranosyl; Rha: α-L-rhamnopyranosyl.

Notoginsenosid R1 được tìm thấy trong Tam thất, Sâm Việt Nam, còn các Ginsenosid (Rg1, Re, Rb1) là hoạt chất điển hình của Tam thất và một số

M

loài sâm (Sâm Trung Quốc, Sâm Hàn Quốc, Sâm Nhật Bản, Sâm Hoa kỳ, Sâm Việt Nam,…). Theo các tài liệu [1,35] Tam thất chứa không ít hơn 0,4%

KÈ

notoginsenosid R1 và không ít hơn 5,0% tổng hàm lượng ginsenosid Rg1, ginsenosid Rb1 và notoginsenosid R1; Nhân sâm chứa không dưới 0,3% tổng hàm lượng của ginsenosid Rg1 và ginsenosid Re và không dưới 0,2% hàm

DẠ Y

lượng ginsenosid Rb1; Sâm Việt Nam chứa không ít hơn 0,5% ginsenosid Rb1, 0,5% ginsensosid Rd, 1,5% ginsenosid-Rg1 [1].

5

AL

1.1.2. Đặc điểm tính chất và tác dụng

NH

ƠN

OF

FI

CI

1.1.2.1. Notoginsenosid R1:

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Notoginsenosid R1 [17] - Công thức phân tử: C47H80O18

QU

- Tên khoa học:

Y

- Khối lượng phân tử: 933,1273 g/mol (2S,3R,4S,5S,6R)-2-[(2S)-2 [(3S,5R,6S,8R,9R,10R,12R,13R,14R,17S)-6[(2R,3R,4S,5S,6R)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-[(2S,3R,4S,5R)-

M

3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,12-dihydroxy-4,4,8,10,14pentamethyl-2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17-dodecahydro-1H-

KÈ

cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-6-methylhept-5-en-2-yl]oxy-6 (hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol.

- Tính chất: [28, 49, 50]

DẠ Y

+ Bột kết tinh màu trắng hoặc trắng ngà. + Tan tốt trong nước và các dung môi phân cực như butanol, ethanol và methanol, tan trong dimethyl sulfoxide.

6

AL

+ Độ tan trong nước là 1 mg/ml. + Hấp thụ UV ở bước sóng thấp 208 nm. + [α]D25 = +15,0o (Dung dịch 1,0 mg/ml trong methanol).

CI

+ Nhiệt độ nóng chảy khoảng 215-217 oC.

FI

- Notoginsenosid R1 có nhiều tác dụng dược lý quý được xác định như:

+ Thúc đẩy sự gia tăng hoạt động của alkaline phosphatase (ALP) tiền

OF

nguyên bào xương, tăng biểu hiện của osteocalcin và chất khoáng, giúp ích cho quá trình tái tạo và khoáng hóa xương [51].

+ Tác động lên các thụ thể estrogen, kích thích hoạt động sao chép của yếu

ƠN

tố đáp ứng estrogen phosphorylated-luciferase và gây ra sự phosphoryl hóa trong hBMSC, tác động lên quá trình phân hoá và khoáng hóa osteoblast [46].

NH

+ Ức chế oxy hóa lipoprotein mật độ thấp sản xuất ra các cytokine gây viêmtrong tế bào nội mô người EAhy926, ức chế sản xuất TNF-α (tumor khối u [20,21,34].

Y

necrosis factors) và interleukin (IL) làm giảm đáng kể sự xuất hiện của

QU

+ Giảm sự phá hủy của amyloid-β gây ra trong tế bào thần kinh bằng cách ức chế các dạng oxy phản ứng và điều chỉnh mitogen-activated protein kinase (MAPK) kích hoạt. Có tác dụng rõ rệt trong điều trị bệnh lý Alzheimer

và

các

bệnh

thuộc

hệ

thần

kinh

[15].

M

+ Ảnh hưởng đến sự tổng hợp các thành phần của hệ thống tiêu sợi huyết

KÈ

trong nuôi cấy tế bào động mạch phổi và tế bào vi mạch nội mô da người, tăng tổng hợp loại plasminogen kích thích (t-PA) và giảm loại plasminogen ức chế (PAI-1) trong tĩnh mạch rốn nội mô người [51,28].

DẠ Y

1.1.2.2. Ginsenosid Rg1: - Công thức phân tử: C42H72O14 - Khối lượng phân tử: 801,024 g/mol - Tên khoa học: 7

AL

(2R,3R,4S,5S,6R)-2 [[(3S,5R,6S,8R,9R,10R,12R,13R,14R,17S)-3,12dihydroxy-4,4,8,10,14-pentamethyl-17-[(2S)-6-methyl-2-

CI

[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyhept5-en-2-yl]-2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17-dodecahydro-1H-

Y

NH

ƠN

OF

FI

cyclopenta[a]phenanthren-6-yl]oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol

QU

Hình 1.3. Công thức cấu tạo của Ginsenosid Rg1 [17] - Tính chất [31,54,55]:

+ Bột kết tinh màu trắng.

+ Tan trong nước, trong etanol khan và trong metanol.

M

+ Độ tan trong nước là 1 mg/ml.

KÈ

+ Hấp thụ UV ở bước sóng thấp 203 nm. + Nhiệt độ nóng chảy khoảng 188-191 oC. + [α]D20= +31,2 (Dung dịch 10 g/L trong methanol).

DẠ Y

- Tác dụng dược lý: + Ginsenosid Rg1 có tác dụng chống oxy hóa và chống lão hóa, thúc đẩy quá trình chữa lành vết thương và tác dụng bảo vệ thần kinh [3,7,27,29].

8

AL

+ Ginsenosid Rg1 có tác dụng chống sự tạo thành huyết khối, chống sự ngưng tập tiểu cầu do ức chế sự hình thành thromboxan trong tiểu cầu, ức

CI

chế sự hình thành sợi huyết do kích thích enzym làm phân hủy sợi huyết.

Làm giãn mạch [3,16,27].

FI

+ Bảo vệ tế bào gan, chống ung thư, điều hòa miễn dịch [3,19,24,25,26,27].

QU

Y

NH

ƠN

OF

1.1.2.3. Ginsenosid Re:

Hình 1.4. Công thức cấu tạo của Ginsenosid Re [17]

M

- Công thức phân tử: C48H82O18 - Khối lượng phân tử: 947,2 g/mol

KÈ

- Tên khoa học:

(2 S , 3 R , 4 R , 5 R , 6 S ) -2 - [(2 R , 3 R , 4 S , 5 S , 6 R ) -2 - [[(3 S , 5 R , 6 S , 8 R , 9 R , 10 R , 12 R , 13 R , 14 R , 17 S ) -3,12-dihydroxy-

DẠ Y

4,4,8,10,14-pentametyl-17 - [(2 S ) -6 -metyl-2 - [(2 S , 3 R , 4 S , 5 S , 6 R) -3,4,5-trihydroxy-6- (hydroxymetyl) oxan-2-yl] oxyhept-5-en-2-yl] 2,3,5,6,7,9,11,12,13, 15,16,17-dodecahydro-1 H -cyclopenta [a]

9

AL

phenanthren-6-yl] oxy] -4,5-dihydroxy-6- (hydroxymetyl) oxan-3-yl] oxy6-metyloxane-3,4 , 5-triol + Bột kết tinh màu trắng

FI

+ Tan trong nước, trong etanol 96% và trong metanol + Hấp thụ UV ở bước sóng thấp 203 nm.

OF

- Tác dụng dược lý:

CI

- Tính chất:

+ Ginsenosid Re có tác dụng làm giãn mạch, ngăn ngừa co thắt động mạch, chống thiếu máu cục bộ, chống loạn nhịp [3,16,23].

ƠN

+ Ginsenosid Re cải thiện tình trạng viêm bằng cách ức chế sự liên kết của lipopolysaccharide với TLR4 (Toll-like receptor 4) trên đại thực bào [30].

[3,23,24,25,27].

DẠ Y

KÈ

M

QU

Y

1.1.2.4. Ginsenosid Rb1:

NH

+ Chống oxy hóa, giảm β-amyloid hiệu quả trong điều trị Alzeimer

Hình 1.5. Công thức cấu tạo của Ginsenosid Rb1 [17]

- Công thức phân tử: C54H92O23 10

AL

- Khối lượng phân tử: 1109,29 g/mol - Tên khoa học:

CI

(2 R , 3 R , 4 S , 5 S , 6 R ) -2 - [[(2 R , 3 S , 4 S , 5 R , 6 S ) -6 - [(2 S ) -2 [( 3 S , 5 R , 8 R , 9 R , 10 R , 12 R , 13 R , 14 R , 17 S ) -3 - [(2 R , 3 R , 4

FI

S , 5 S , 6 R ) -4, 5-dihydroxy-6- (hydroxymetyl) -3 - [(2 S , 3 R, 4 S , 5 S , 6 R ) -3,4,5-trihydroxy-6- (hydroxymetyl) oxan-2-yl] oxyoxan-2-yl] oxy-

OF

12-hydroxy-4,4,8,10, 14-pentametyl-2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17dodecahydro-1 H -cyclopenta [a] phenanthren-17-yl] -6-metylhept-5- vi-2yl] oxy-3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl] metoxy] -6- (hydroxymetyl) oxan-3,4,5-

ƠN

triol - Tính chất [31,54,55]: + Bột kết tinh màu trắng

NH

+ Tan trong nước, trong etanol khan và trong metanol + Hấp thụ UV ở bước sóng thấp 203 nm. + Nhiệt độ nóng chảy khoảng 199 oC.

QU

- Tác dụng dược lý:

Y

+ [α]D20= +11,3 (Dung dịch 10 g/L trong methanol). + Ginsenosid Rb1 có tác dụng ức chế thần kinh trung ương làm giảm lo âu và chống trầm cảm [2,3,16,25]. + Bảo vệ tế bào gan, ức chế sự phosphoryl hóa protein gây bởi CCL4 theo

M

cơ chế điều hòa protein kinase phụ thuộc Ca 2+/calmodulin [3].

KÈ

+ Giảm dung nạp glucose [3]. + Chống ung thư do ức chế sự hình thành mao mạch; ức chế PEDF (Pigment epithelium-derived factor) thông qua thụ thể estrogen-β; ức chế

DẠ Y

giải phóng TNF-α; bảo vệ chống lại stress oxy hóa [3,16,19,22,29,31].

Một số chế phẩm chứa notoginsenosid R1 và các ginsenosid lưu hành trên thị trường:

11

AL

- TPBVSK chứa Tam thất: Bột Tam thất, cao lỏng Tam thất, các dạng bào

chế viên nang cứng, viên nang mềm, bột chứa Tam thất và nhiều dược liệu

CI

khác trong thành phần như Đan sâm, Nghệ, Long não, Hoa hòe, Cao lá Bạch quả, Xạ đen, Trinh nữ hoàng cung…

FI

- TPBVSK chứa Nhân sâm: Nước uống, cao lỏng, chè, các dạng bào chế viên nang cứng, nang mềm, viên sủi chứa Nhân sâm và nhiều dược liệu

OF

khác hoặc multivitamin và khoáng chất.

- TPBVSK chứa Sâm Việt Nam: Nước uống, cao, các dạng bào chế viên nang cứng, nang mềm chứa Sâm Ngọc linh cùng các loại thảo dược khác.

ƠN

- TPBVSK chứa Sâm và Tam thất: Viên ngậm Nhân sâm Tam thất, Viên Tam thất Hồng sâm.

1.2. Các nghiên cứu định lượng notoginsenosid R1 và các ginsenosid

NH

1.2.1. Định lượng notoginsenosid R1 và các ginsenosid trong một số chuyên luận Dược điển

Y

Bảng 1.3. Định lượng notoginsenosid R1 và các ginsenosid trong một số chuyên luận Dược điển Đối tượng

Dược điển Việt Nam V [1]

Dược liệu Nhân sâm (Ginsenosid Rg1, Re, Rb1)

M KÈ DẠ Y

Điều kiện sắc ký

Yêu cầu

QU

Tài liệu

Cột: C18, 5µm (25 cm × 4,6 mm) Tổng Rg1 và Re ≥ Detector quang phổ tử ngoại đặt ở 0,3%; Rb1 ≥ 0,2%. bước sóng 203 nm.

Tốc độ dòng: 1 ml/min.

Thể tích tiêm: 20 µl.

Pha động: Aetonitril (ACN) - Nước (H2O) theo chương trình: Thời gian (Phút)

ACN (% tt/tt)

H2O (% tt/tt)

0 - 35

19

81

35 - 55

19 → 29

81 → 71

55 - 70

29

71

70 -100

29 → 40

71 → 60

Nồng độ định lượng: Ginsenosid Rg1,

12

Cột: C18, 5µm (25 cm × 4,6 mm) R1 ≥ 0,4%; Tổng Detector quang phổ tử ngoại đặt ở R1, Rg1 và Rb1 ≥ bước sóng 203 nm.

5,0%.

Tốc độ dòng: 1,6 ml/min.

Thể tích tiêm: 10 µl.

Pha động: ACN - H2O theo chương

CI

Dược liệu Tam thất (Notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1 và Rb1)

FI

Dược điển Việt Nam V [1]

AL

Re, và Rb1 nồng độ mỗi chất 0,2 mg/ml.

Thời gian (Phút)

ACN (% tt/tt)

0 - 12

19

OF

trình:

12 - 60

19 → 36

81 → 64

36 → 19

64 → 81

19

81

61 - 66

81

ƠN

60 - 61

H2O (% tt/tt)

Cột: C18, 5µm (15 cm × 4,6 mm) Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 196 nm.

Tốc độ dòng: 1 ml/min.

Thể tích tiêm: 20 µl.

Pha động: ACN - H2O theo chương trình:

Y

Dược liệu Sâm Việt Nam (Ginsenosid Rb1, Rd, Rg1 và mạjonosid R2)

DẠ Y

KÈ

M

QU

Dược điển Việt Nam V [1]

NH

Nồng độ định lượng: Ginsenosid Rg1, và Rb1 nồng độ mỗi chất 0,4 mg/ml, Notoinsenosid R1 nồng độ 0,1 mg/ml.

Thời gian (Phút)

ACN (% tt/tt)

H2O (% tt/tt)

0 - 11

21

79

11 - 25

21 → 32

79 → 68

25 - 35

32 → 40

68 → 60

35 - 40

40 - 95

60 - 5

40 - 60

95

5

60 - 61

95 → 21

5 → 79

61 - 71

21

79

Nồng độ định lượng: ginsenosid Rb1, ginsenosid Rd, ginsenosid Rg1 và

13

Rg1 ≥ 1,5%; Rb1 ≥ 0,5%; Rd ≥ 0,5%; majonosid R2 ≥ 0,4%

CI

Pha động: ACN - H2O theo chương trình: Thời gian (Phút)

ACN (% tt/tt)

OF

[35]

Cột: C18, không nêu thông số cột Tổng Rg1 và Re ≥ Detector quang phổ tử ngoại đặt ở 0,3%; Rb1 ≥ 0,2%. bước sóng 203 nm.

Tốc độ dòng: Không nêu Thể tích tiêm: 10 µl.

FI

Dược liệu Nhân sâm (Ginsenosid Rg1, Re, Rb1)

0 - 35

19

81

19 → 29

81 → 71

29

71

29 → 40

71 → 60

35 - 55 55 - 70 70 - 100

H2O (% tt/tt)

ƠN

Dược điển Trung Quốc 2015

AL

mạjonosid R2 nồng độ mỗi chất lần lượt 0,1 mg/ml; 0,1 mg/ml; 0,3 mg/ml; 0,5 mg/ml.

QU

KÈ DẠ Y

Cột: C18, không nêu thông số cột Tổng Rg1 và Re ≥ Detector quang phổ tử ngoại đặt ở 0,25%; bước sóng 203 nm.

Rb1 ≥ 0,20%.

Tốc độ dòng: Không nêu Thể tích tiêm: 10 µl.

Pha động: ACN - H2O theo chương trình:

Y

Dược liệu Hồng sâm (Ginsenosid Rg1, Re, Rb1)

M

Dược điển Trung Quốc 2015 [35]

NH

Nồng độ định lượng: Ginsenosid Rg1, Re và Rb1 nồng độ mỗi chất 0,2 mg/ml.

Thời gian (Phút)

ACN (% tt/tt)

H2O (% tt/tt)

0 - 35

19

81

35 - 55

19 → 29

81 → 71

55 - 70

29

71

70 - 100

29 → 40

71 → 60

Nồng độ định lượng: Nồng độ định lượng: Ginsenosid Rg1, Rb1 nồng độ 0,5 mg/ml và Ginsenosid Re 0,3 mg/ml.

14

CI

AL

Cột: C18, không nêu thông số cột Tổng R1, Rg1 và Detector quang phổ tử ngoại đặt ở Rb1 ≥ 5,0%. bước sóng 203 nm.

Tốc độ dòng: Không nêu Thể tích tiêm: 10 µl.

Pha động: ACN - H2O theo chương trình:

FI

Dược liệu Tam thất (Notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1 và Rb1)

Thời gian

ACN (%

H2O (%

(Phút)

tt/tt)

tt/tt)

0 - 12

19

12 - 60

19 → 36

OF

Dược điển Trung Quốc 2015 [35]

81

81 → 64

ƠN

Nồng độ định lượng: Ginsenosid Rg1, và Rb1 nồng độ mỗi chất 0,4 mg/ml, Notoinsenosid R1 nồng độ 0,1 mg/ml.

Cột: C18, 5µm (15 cm × 4,6 mm) Tổng Rg1 và Re ≥ Detector quang phổ tử ngoại đặt ở 0,19%; Rb1 ≥ bước sóng 203 nm.

0,20%.

Tốc độ dòng: 1,6 ml/phút Thể tích tiêm: 10 µl.

Pha động: ACN - H2O theo chương trình:

NH

Dược liệu Nhân sâm (Ginsenosid Rg1, Re, Rb1)

Y

Dược điển Hồng Kông [17]

ACN (% tt/tt)

H2O (% tt/tt)

0 - 20

19

81

20 - 30

19 → 31

81 → 69

30 - 40

31

69

40 - 60

31 → 40

69 → 60

KÈ

M

QU

Thời gian (Phút)

Nồng độ định lượng: Dãy chuẩn chứa mỗi chất Ginsenosid Rg1, Re và Rb1 chứa mỗi chất ở các mức nồng độ 25, 50, 100, 200, 400 µg/ml.

Dược liệu Hồng sâm (Ginsenosid Rg1, Re, Rb1,

Cột: C18, 5µm (15 cm × 4,6 mm) Tổng Rg1 và Re ≥ Detector quang phổ tử ngoại đặt ở 0,25%; Rb1 ≥ bước sóng 203 nm.

0,20%.

Tốc độ dòng: 1,6 ml/phút

[17]

Rf)

Thể tích tiêm: 10 µl.

Pha động: ACN - H2O theo chương

DẠ Y

Dược điển Hồng Kông

15

H2O (% tt/tt)

0 - 35

19

81

35 - 55

19 → 29

81 → 71

55 - 70

29

71

70 - 100

29 → 40

71 → 60

CI

ACN (% tt/tt)

FI

Thời gian (Phút)

AL

trình:

Nồng độ định lượng: Dãy chuẩn chứa

Cột: C18, 5µm (15 cm × 4,6 mm) R1 ≥ 0,49%; Rg1 ≥ Detector quang phổ tử ngoại đặt ở 2,0% và Rb1 ≥ bước sóng 203 nm.

1,7%.

Tốc độ dòng: 1,6 ml/phút Thể tích tiêm: 10 µl.

Pha động: ACN - H2O theo chương trình:

ƠN

Dược liệu Tam thất (Notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1 và Rb1)

NH

Dược điển Hồng Kông [17]

OF

mỗi chất Ginsenosid Rg1, Re và Rb1 ở các mức nồng độ 25, 50, 100, 200, 400 µg/ml.

ACN (% tt/tt)

H2O (% tt/tt)

0 - 20

20

80

20 → 42

80 → 58

Y

Thời gian (Phút) 20 - 60

M

QU

Nồng độ định lượng: Dãy chuẩn chứa mỗi chất Ginsenosid Rg1, Rb1 ở các mức nồng độ 20, 50, 100, 200, 500 µg/ml và R1 ở các mức nồng độ 10, 25, 50, 100, 250 µg/ml.

DẠ Y

KÈ

Dược Dược liệu Nhân Cột: C18, 5µm (12,5 cm × 4,6 mm) Tổng Rg1 và Rb1 điển Anh sâm (Ginsenosid Detector quang phổ tử ngoại đặt ở ≥ 0,40% 2020 [31] Rg1, Rb1) bước sóng 203 nm.

Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút Thể tích tiêm: 20 µl.

Pha động: ACN và H2O (nước được điều chỉnh đến pH 2,0 bằng acid phosphoric): Thời gian (Phút)

ACN (% tt/tt)

16

H2O (% tt/tt)

80

8 - 40

20 → 40

80 → 60

40 - 45

40 → 60

60 → 40

45 - 47

40 → 0

60→ 100

47 - 52

0

100

FI

Nồng độ định lượng: Nồng độ định lượng: Ginsenosid Rg1, và Rb1 nồng độ mỗi chất 0,3 mg/ml.

AL

20

CI

0-8

ACN (% tt/tt)

H2O (% tt/tt)

0 - 14

90

10

14 - 18

90 → 80

10 → 20

18 - 55

80

20

NH

Thời gian (Phút)

ƠN

OF

Dược Dược liệu Tam Cột: Aminopropylsilyl silica gel, Tổng Rg1 và Rb1 điển Anh thất (Ginsenosid 3µm (10 cm × 4,6 mm) ≥ 3,8% 2020 [31] Rg1, Rb1) Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 203 nm.

Tốc độ dòng: 2,0 ml/phút Thể tích tiêm: 20 µl.

Pha động: ACN - H2O:

QU

Y

Nồng độ định lượng: Nồng độ định lượng: Ginsenosid Rg1, và Rb1 nồng độ mỗi chất 0,3 mg/ml.

Dược Dược liệu Nhân Cột: C18, 3µm (15 cm × 4,6 mm) Rg1 ≥ 0,2%; Rb1 ≥ điển Mỹ sâm, bột dược Detector quang phổ tử ngoại đặt ở 0,1%.

43 liệu Nhân sâm bước sóng 203 nm.

M

(Ginsenosid Rg1, Rb1)

DẠ Y

KÈ

[41]

Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút Thể tích tiêm: 10 µl.

Pha động: Thời gian (Phút)

H2O (% tt/tt)

ACN H2O (4:1) (% tt/tt)

0

76

24

12

76

24

28

65

35

51,5

56,5

43,5

17

100

64,5

76

24

77

76

24

Nồng độ định lượng: Nồng độ định lượng: Ginsenosid Rg1, và Rb1 nồng độ mỗi chất 0,2 mg/ml.

AL

0

CI

52,5

(Ginsenosid bước sóng 203 nm.

Rg1, Rb1, Re, Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút Rc, Rd, Rb2) Thể tích tiêm: 20 µl.

Pha động:

OF

43 [41]

FI

Dược Bột cao dược Cột: C18, 3µm (15 cm × 4,6 mm) Rg1+Rb1+Re+Rc+ điển Mỹ liệu Nhân sâm Detector quang phổ tử ngoại đặt ở Rd+ Rb2 ≥ 3,0%

H2O (% tt/tt)

ACN H2O (4:1) (% tt/tt)

76

24

76

24

28

65

35

51,5

56,5

43,5

52,5

0

100

64,5

76

24

77

76

24

0

Y

NH

12

ƠN

Thời gian (Phút)

QU

Nồng độ định lượng: Nồng độ định lượng: 24 mg/ml cao chuẩn Nhân sâm.

M

1.2.2. Các nghiên cứu khác Đào Văn Đôn và cộng sự (2014) đã nghiên cứu định lượng đồng thời

KÈ

ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd trong viên nang cứng Ukata (Thành phần chứa cao khô bèo hoa dâu 60 mg; cao khô nghệ 100 mg; cao khô tam thất 80 mg) bằng phương pháp HPLC-UV. Phương pháp sử dụng pha động gồm acetonitril -

DẠ Y

nước, cột phân tích Gemini C18 (250 x 4,6 nm, 5 mm), detector UV tại 203 nm và tốc độ dòng 1,5 ml/phút. Các ginsenosid được tách hoàn toàn trong thời gian

18

AL

50 phút. Giới hạn định lượng của ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd nằm trong khoảng 6,0 - 8,0 µg/ml [5].

CI

Nguyễn Thị Hạnh (2016) đã xây dựng được phương pháp định lượng

ginsenosid Rg1, ginsenosid Rb1 trong các mẫu TPBVSK dạng viên nang

FI

cứng, viên nang mềm, cao lỏng chứa Nhân sâm bằng HPLC-DAD và HPTLC. Phương pháp sử dụng ether để loại dầu, chiết mẫu bằng methanol 70%. LOQ

OF

của phương pháp HPLC là 3ppm, tương ứng LOQ trong nền mẫu rắn là 30 µg/g và nền mẫu dạng lỏng là 7,5 µg/100mL. Độ thu hồi đạt từ 95,73% đến 101,4% [7].

ƠN

Nguyễn Quang Tuyển (2017) đã định lượng notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Rb1 trong dược liệu Tam thất bằng phương pháp HPLC-UV. Phương pháp sử dụng cột Phenomenex C18 (5 m, 250 mm x 4,6

NH

mm), rửa giải bằng gradient nước - acetonitril trong 70 phút, bước sóng phát hiện 203 nm, tốc độ dòng 1,5 ml/phút, cho kết quả 1,14% notoginsenosid R1, 4,47% ginsenosid Rg1 và 4,23% ginsenosid Rb1, 10,12% tổng hàm lượng

Y

saponin [10].

QU

Nguyễn Minh Đức và cộng sự (2018) đã tiến hành xác định đồng thời ginsenosid Rb1, Rd, Rg1 và majonosid-R2 trong thân rễ và rễ cây Sâm Việt Nam bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò phun sương tích điện (Charged Aerosol Detectors). Phương pháp sắc ký được thực hiện với cột pha

M

đảo C18 (150 mm x 4,6 mm; 5 mm), hệ dung môi ACN - H2O rửa giải theo

KÈ

chương trình gradient. Khoảng tuyến tính của ginsenosid Rb1 là 0,008 - 0,264 mg/ml, ginsenosid Rd là 0,008 - 0,251 mg/ml, ginsenosid Rg1 là 0,016 0,501 mg/ml và majonosid R2 là 0,020 - 0,637 mg/ml với các hệ số tương

DẠ Y

quan đều trên 0,998. Phương pháp có độ lặp lại (RSD) ≤ 2,85% và độ đúng trong khoảng 95-105% [6].

Quách Thanh Tâm và cộng sự (2019) đã xây dựng quy trình định lượng

các ginsenoside Rb1, Rg1, Rf, Re trong thực phẩm bổ sung chứa Nhân sâm bằng 19

AL

phương pháp LC-MS/MS với giới hạn phát hiện là 0,5 µg/mL, giới hạn định

lượng là 2,0 µg/mL, độ chụm RSD < 20%, hiệu suất thu hồi trong khoảng 80 -

CI

110% [8].

Weichen và cộng sự (2010) đã tiến hành nghiên cứu định lượng xác định

FI

đồng thời 3 chất notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Rb1 của Tam thất trong huyết tương bằng phương pháp LC-MS/MS kết hợp chiết pha rắn.

OF

Phương pháp cho giới hạn định lượng lần lượt là 0,5 ng/mL; 0,82 ng/ mL; và 1,10 ng/mL đối với notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1 và ginsenosid Rb1 [44].

ƠN

Zenzhong Yang và cộng sự (2014) đã tiến hành nghiêc cứu xác định dấu vân tay sắc ký 5 chất (ginsenosid Rg1, ginsenosid Re, notoginsenosid R1, ginsenosid Rb1, ginsenosid Rd) trong dược liệu Tam thất bằng phương pháp

NH

HPLC với detector DAD sử dụng cột Agilent Zorbax C18 (4,6 mm × 50 mm, 1,8 m); tốc độ dòng dung môi là 0,8 mL/phút ở 35°C; Nước và acetonitril được sử dụng để phân tách tương ứng là các pha A và B với chương trình

Y

dung môi: 0-22 phút (17-19% B); 22-30 phút (19-27% B); 30-35 phút (27%

QU

B); 35-47 phút (27-46% B); 47-70 phút (46-90% B). Bước sóng phát hiện là 203nm và thể tích tiêm là 3μL. Khoảng tuyến tính mỗi chất từ 0,05-4,0 mg/ml có hệ số tương quan tuyến tính đạt 0,999; độ thu hồi đạt từ 95,75-104,85%; độ chính xác có RSD từ 1,49-1,72% [52].

M

Zhijiang Wu và cộng sự (2017) đã xác định đồng thời ginsenosid Rg1,

KÈ

Re, Rb1 và notoginsenosid R1 trong các loại mỹ phẩm gồm dầu gội đầu, dầu dưỡng tóc và kem dưỡng da bằng UHPLC-MS/MS kết hợp chiết pha rắn. Bốn chất phân tích được tách trên cột Waters HPLC ACQUITY UPLC HSS T3

DẠ Y

C18 (2.1 mm × 100 mm, 1.8 µm) bằng chương trình rửa giải gradient acetonitril - nước. Các đường chuẩn tuyến tính trong khoảng 0,05-5 mg/L đối với notoginsenosid R1 và 0,1-10 mg/L đối với các ginsenosid Rg1, Re và Rb1, với các hệ số tương quan đều lớn hơn 0,996. Phương pháp cho giới hạn 20

AL

phát hiện và giới hạn định lượng tương ứng nằm trong khoảng 0,3-1,0 mg/kg và 1,0-3,5 mg/kg. Độ thu hồi của bốn chất phân tích nằm trong khoảng 80,9%

CI

- 93,0% với độ lệch chuẩn tương đối (RSDs, n = 6) là 1,9% - 8,2% [53].

Như vậy trong các Dược điển chỉ có chuyên luận riêng cho các dược liệu mà

FI

chưa có quy định đối với các loại sản phẩm TPBVSK. Các nghiên cứu trong và ngoài nước chủ yếu tập trung vào dược liệu, với đối tượng TPBVSK mới chỉ

OF

thực hiện trên sản phẩm chứa Nhân sâm, các nghiên cứu sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để xác định hàm lượng các ginsenosid như HPLC-UV hoặc HPLCDAD, HPLC-CAD, HPLC-ELSD, LC-MS/MS, UPLC-MS/MS… trong đó

ƠN

HPLC-UV là phổ biến. Do các phòng phân tích đều được trang bị thiết bị HPLC-UV nên tính khả thi cao, hơn nữa phương pháp này cho phép tách, định tính, định lượng đồng thời các thành phần với độ chọn lọc, độ chính xác

NH

đảm bảo. Tam thất và Nhân sâm, bên cạnh sử dụng riêng dạng dược liệu thì hiện nay các dược liệu này được bào chế dạng TPBVSK kết hợp với nhiều thành phần khác. Nhưng chưa có nghiên cứu nào thực hiện phân tích đồng

Y

thời cả 4 chất notoginsengosid R1, Gingsenosid Rg1, Rb1, Re trên nền mẫu

QU

TPBVSK được công bố. Do đó, xây dựng phương pháp khả thi, chọn lọc, chính xác để phục vụ công tác tiêu chuẩn hóa các sản phẩm TPBVSK chứa Tam thất,

DẠ Y

KÈ

M

Nhân sâm lưu hành trên thị trường là rất cần thiết.

21

AL

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CI

2.1. Đối tượng và phương tiện nghiên cứu 2.1.1. Phương tiện nghiên cứu

FI

2.1.1.1. Chất chuẩn: - Notoginsenosid R1: Tauto Biotech Co., Ltd. - Trung Quốc.

- Ginsenosid Rg1:

OF

SKS: 19120521; Hàm lượng: 97,9% (Nguyên trạng); Nguồn gốc: Shanghai

Kiểm nghiệm thuốc Trung ương.

- Ginsenosid Rb1:

ƠN

SKS: 0117C002.01; Hàm lượng: 94,05% (Nguyên trạng); Nguồn gốc: Viện

NH

SKS: 0117C001.01; Hàm lượng: 88,59% (Nguyên trạng); Nguồn gốc: Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương.

- Ginsenosid Re:

Y

SKS: 19010322; Hàm lượng: 98,8% (Nguyên trạng); Nguồn gốc: Shanghai

QU

Tauto Biotech Co., Ltd. - Trung Quốc.

2.1.1.2. Dung môi, hóa chất: - Acetonitril dùng cho HPLC; Nguồn gốc: Merck KgaA - Đức.

- Acid phosphoric dùng cho HPLC; Nguồn gốc: Merck KgaA - Đức.

M

- Methanol dùng cho HPLC; Nguồn gốc: Merck KgaA - Đức

KÈ

- Nước khử ion dùng cho HPLC. - Methanol đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho phân tích; Nguồn gốc: Công ty hóa chất Đức Giang.

DẠ Y

2.1.1.3. Thiết bị, dụng cụ: Tất cả các thiết bị phân tích đều được chuẩn hóa theo qui định của

ISO/IEC 17025-2017 và GLP, bao gồm:

22

với detector PDA.

CI

- Bộ chiết pha rắn SPE Vacuum SPE Manifolds (Supelco - Mỹ).

AL

- Thiết bị: Hệ thống sắc ký lỏng Shimadzu - LC - 2030C 3D Plus (Nhật Bản)

- Cột sắc ký: Cột InertSustain C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) (GL Sciences -

FI

Nhật Bản).

- Cột chiết pha rắn: C18 (SilactSPETM - Affinisep - Pháp) (6 ml - 500 mg).

OF

- Cân phân tích A&D Company Limited - GH-202, độ chính xác d = 0,01 mg (Nhật Bản)

- Máy lắc siêu âm Hwashin Techonology Co - Power Sonic 505 (Hàn Quốc).

ƠN

- Micropipet Eppendorf loại 10-100µl, 100-1000µl, 500-5000µl (Đức).

- Bình định mức, pipet thủy tinh class A, Prolabo - Pháp.

2.1.2. Đối tượng nghiên cứu

NH

2.1.2.1. Trong thẩm định phương pháp phân tích: - Mẫu thử:

+ Mẫu dạng rắn: TPBVSK viên nang cứng thành phần chứa: Tam thất 100

Y

mg, cao lá Bạch quả, cao Việt quất, Magnesi, citicolin, vitamin B1, vitamin

QU

B6, magnesi stearat, methyl paraben, propyl paraben, polyvinylpyrrolidone (PVP), talc vừa đủ 1 viên.

+ Mẫu dạng lỏng: TPBVSK Cao lỏng thành phần chứa: Tam thất 2 g/90 ml,

M

Táo đỏ Hàn Quốc, Nước tinh khiết. + Mẫu dạng dầu: TPBVSK Viên nang mềm thành phần chứa: Tam thất 125

KÈ

mg, Ginkgo biloba, rutin, gelatin, sáp ong trắng, sorbitol, dầu đậu nành, dầu cọ, lecithin, glycerin vừa đủ 1 viên.

- Mẫu nền: 03 mẫu tự tạo được chế tạo theo công thức mẫu thử nghiên cứu

DẠ Y

(dạng rắn, dạng lỏng, dạng dầu) nhưng không chứa chất phân tích, dược liệu chứa chất phân tích.

23

AL

- Mẫu tự tạo: Thêm chuẩn vào các mẫu nền ở nồng độ phù hợp theo yêu cầu nghiên cứu.

CI

2.1.2.2. Trong nghiên cứu trên mẫu thực:

Các mẫu TPBVSK chứa Nhân sâm, Tam thất được thu thập trên thị trường

FI

bao gồm:

- 10 Mẫu TPBVSK chứa Tam thất: Được ký hiệu từ M1 đến M10.

OF

- 10 Mẫu TPBVSK chứa Nhân sâm: Được ký hiệu từ M11 đến M20.

2.1.2.3. Dung dịch chuẩn:

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp gốc 1000 µg/ml: Cân chính xác khoảng 20 mg

ƠN

mỗi chất chuẩn notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re, ginseosid Rb1 vào bình định mức 20 ml, thêm methanol, lắc siêu âm cho tan hết, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều. Bảo quản trong điều kiện

NH

2 - 8 oC.

- Các dung dịch chuẩn có nồng độ nhỏ hơn được pha từ dung dịch chuẩn hỗn hợp gốc 1000 µg/ml, được sử dụng trong ngày.

Y

2.2. Phương pháp nghiên cứu

QU

2.2.1. Xây dựng quy trình phân tích 2.2.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký: Tham khảo tài liệu [1,17,31,35] và điều kiện thực tế tại phòng thí

M

nghiệm, khảo sát sơ bộ với các điều kiện sắc ký trong quy trình như sau: - Cột sắc ký: Tiến hành với cột sắc ký pha đảo của các hãng khác nhau, từ đó

KÈ

lựa chọn cột cho kết quả các chất phân tích tách nhau rõ ràng, cân xứng, độ phân giải của pic Rg1 và Re phải lớn hơn 1,5.

- Pha động: Tiến hành khảo sát chương trình rửa giải gradient với pha động

DẠ Y

gồm acetonitril phối hợp với H2O theo các tỉ lệ khác nhau, tiến hành phân tích và đánh giá các thông số pic sắc ký từ đó lựa chọn pha động phù hợp

24

AL

dựa trên khả năng tách các chất phân tích với các chất cản trở trong nền mẫu.

CI

- Tốc độ dòng: Khảo sát với 3 mức độ tốc độ khác nhau, lựa chọn tốc độ

dòng cho tách các chất phân tích, áp suất không quá cao, thời gian phân

FI

tích ngắn.

- Thể tích tiêm: Tiến hành sắc ký các thể tích tiêm khác nhau trong khoảng độ phân giải Rg1 và Re đạt yêu cầu.

OF

10 - 50 µl. Lựa chọn thể tích tiêm cho các pic có đáp ứng không quá nhỏ, - Detector DAD: Quét phổ các chất phân tích ở bước sóng từ 190-300 nm,

ƠN

lựa chọn bước sóng phát hiện cho đáp ứng cao.

2.2.1.2. Khảo sát quy trình xử lý mẫu:

Các sản phẩm TPBVSK chứa Nhân sâm, Tam thất trên thị trường có

NH

thành phần công thức thường phối hợp nhiều dược liệu khác hoặc các vitamin và khoáng chất ở nhiều dạng bào chế khác nhau. Vì vậy đối tượng nghiên cứu là nền mẫu phức tạp, mặt khác bước sóng phát hiện chất phân tích lại thấp

Y

(203 nm) do đó sẽ ảnh hưởng nhiều tới quá trình định lượng chất phân tích.

QU

Để lựa chọn được phương pháp xử lý mẫu tối ưu nhất, chúng tôi đã tham khảo một số tài liệu trong nước và trên thế giới [6,7,17,31,43,44,45], khảo sát điều kiện chiết mẫu theo hai phương pháp: Chiết mẫu bằng methanol 70% và chiết mẫu bằng metahnol 90% kết hợp làm sạch bằng SPE. Lựa chọn điều

M

kiện chiết mẫu tối ưu dựa trên hiệu suất cao, loại được nhiều cản trở của nền

KÈ

mẫu. Sau khi lựa chọn được phương pháp phù hợp tiến hành khảo sát tối ưu các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình: Nhiệt độ chiết, bước làm sạch, rửa giải.

2.2.2. Thẩm định quy trình phân tích:

DẠ Y

Thực hiện theo hướng dẫn của AOAC (Appendix K (2013): Guidelines

for Dietary Supplements and Botanicals), thực hiện tối thiểu trên 3 nền mẫu: viên nang cứng, viên nang mềm và dạng lỏng với các chỉ tiêu sau [13]: 2.2.2.1. Độ đặc hiệu: 25

AL

- Tiến hành sắc ký và so sánh sắc ký đồ của 03 mẫu: Mẫu chuẩn hỗn hợp chứa 100 µg/ml mỗi chất notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, Ginsenosid

CI

Re, ginsenosid Rb1; mẫu nền và mẫu tự tạo dạng rắn, lỏng, dầu được chuẩn bị theo quy trình phân tích.

FI

- Yêu cầu:

+ Sắc ký đồ mẫu nền không có các pic tại thời gian lưu tương ứng với thời

OF

gian lưu của các pic notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, Ginsenosid Re, ginsenosid Rb1 trên sắc ký đồ mẫu chuẩn. Nếu có đáp ứng pic phải ≤ 1,0% so với đáp ứng pic của mẫu chuẩn ở nồng độ giữa đường chuẩn.

ƠN

+ Sắc ký đồ của dung dịch mẫu tự tạo cho pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic chính thu được trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn notoginsenosid R1, Ginsenosid Rg1, Ginsenosid Re, Ginsenosid Rb1. Các

NH

pic notoginsenosid R1, Ginsenosid Rg1, Ginsenosid Re, Ginsenosid Rb1 trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải tách hoàn toàn với các pic tạp.

2.2.2.2. Độ thích hợp của hệ thống:

Y

- Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp Notoginsenosid R1, Ginsenosid

QU

Rg1, Re, Rb1 mỗi chất có nồng độ khoảng 100 µg/ml.

- Ghi lại các sắc ký đồ và xác định thời gian lưu, diện tích pic của Notoginsenosid R1, Ginsenosid Rg1, Ginsenosid Re, Ginsenosid Rb1.

M

- Yêu cầu: Độ phân giải của pic Ginsenosid Rg1 và pic Ginsenosid Re phải lớn hơn 1,5. Độ lệch chuẩn tương đối RSDdiện tích píc ≤ 2,0%, RSDthời gian lưu ≤

KÈ

2,0% đối với mỗi chất phân tích.

2.2.2.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn: - Khoảng tuyến tính được khảo sát bắt đầu từ giới hạn định lượng (điểm

DẠ Y

nồng độ thấp nhất) và cao nhất là nồng độ vẫn đảm bảo tuyến tính. Tiến hành với 07 mức nồng độ của dung dịch chuẩn mỗi chất, xác định đường biểu diễn tương quan giữa nồng độ và diện tích pic.

26

AL

- Đường chuẩn được xây dựng từ khoảng tuyến tính để đảm bảo khoảng nồng độ bao trùm vùng nồng độ trong mẫu thực tế.

CI

- Yêu cầu: + Hệ số tương quan tuyến tính (r): r ≥ 0,995 hay R2 ≥ 0,99.

FI

+ Độ chệch của các điểm cho tất cả các nồng độ không quá ± 15%, không được quá ± 20% ở nồng độ LOQ [12].

OF

2.2.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ): - Dựa vào độ lệch chuẩn trên nền mẫu thử: Ước lượng LOD của phương pháp. Thêm chuẩn vào mẫu nền của từng dạng bào chế ở tạo mẫu thử có

ƠN

nồng độ mỗi chất khoảng 5-7 lần LOD ước lượng. Phân tích mẫu thử 6 lần lặp lại, tính giá trị trung bình x và độ lệch chuẩn SD. LOD = 3SD

NH

LOQ = 10SD

- Tính R = x /LOD:

SD =

 (x

i

− x)2

n −1

Y

Với

QU

+ Nếu 4 ≤ R ≤ 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính được là đáng tin cậy.

+ Nếu R < 4 thì phải tiến hành lại với dung dịch thử đặc hơn. + Nếu R > 10 thì phải dùng dung dịch thử loãng hơn hoặc pha loãng dung

M

dịch thử đã dùng và tiến hành làm lại thử nghiệm [12].

KÈ

2.2.2.5. Độ đúng: - Tiến hành với 09 mẫu tự tạo thêm chuẩn trong khoảng tuyến tính đã xây dựng, tương ứng với 03 mức nồng độ thấp, trung bình và cao của khoảng

DẠ Y

tuyến tính (mỗi mức nồng độ 03 mẫu) (n = 9), xác định độ thu hồi của các chất phân tích, độ thu hồi phải đạt yêu cầu theo quy định của AOAC (Bảng 2.1).

27

AL

Bảng 2.1. Độ thu hồi chấp nhận, độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (RSDr), độ RSDr

(%)

chất

hồi (%)

(%)

(%)

1

100

1

100%

98-101

1

2

2

≥ 10

10-1

10%

95-102

1,5

3

3

≥1

10-2

1%

92-105

2

4

4

≥ 0,1

10-3

0,1%

90-108

3

6

5

0,01

10-4

100 ppm

85-110

4

8

6

0,001

10-5

10 ppm

80-115

6

12

7

0,0001

10-6

1 ppm

75-120

8

16

8

0,000001

10-8

10 ppb

70-125

15

32

Đơn vị

OF

Tỷ lệ

RSDR

NH

ƠN

Hàm lượng

TT

CI

Độ thu

FI

lệch chuẩn tương đối tái lặp (RSDR) ở các nồng độ khác nhau

2.2.2.6. Độ chính xác của phương pháp:

- Độ lặp lại: Với cùng một mẫu thử đã được làm đồng nhất tiến hành phân

Y

tích lặp lại 06 lần theo quy trình phân tích đã xây dựng, xác định RSD. Yêu cầu: Giá trị RSD tính được phải đạt yêu cầu theo bảng 2.1.

QU

- Độ chính xác trung gian: Tiến hành phân tích 06 lần lặp lại của cùng mẫu thử như phần độ lặp lại, ở thời điểm khác nhau và thiết bị HPLC khác, xác định RSD của kết quả phân tích (n = 12).

M

Yêu cầu: Giá trị RSD tính được phải đạt yêu cầu theo bảng 2.1.

KÈ

2.2.3. Ứng dụng phương pháp phân tích một số mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe chứa notoginsenosid R1 và các ginsenosid - Ứng dụng phương pháp nghiên cứu định lượng notoginsenosid R1,

DẠ Y

ginsenosid Rg1, Re, Rb1 trong một số chế phẩm chứa Tam thất, Nhân sâm thu thập trên thị trường: 20 mẫu.

- Mỗi mẫu thực hiện 03 lần lặp lại, tính giá trị trung bình.

28

AL

2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2017 để xử lý số liệu và trình bày

DẠ Y

KÈ

M

QU

Y

NH

ƠN

OF

FI

CI

kết quả.

29

AL

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

R1, ginsenosid Rg1, Rb1, Re trong TPBVSK bằng HPLC

FI

3.1.1. Xây dựng quy trình phân tích

CI

3.1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Notoginsenosid

3.1.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký:

OF

- Cột sắc ký: Sử dụng điều kiện sắc ký của dược điển Hồng Kông chuyên luận Tam thất để khảo sát cột sắc ký [17]. Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp Notoginsenosid R1 (R1), Ginsenosid Rg1 (Rg1),

ƠN

Ginsenosid Re (Re) và Ginsenosid Rb1 (Rb1) có nồng độ mỗi chất khoảng 100 µg/ml. Kết quả thực nghiệm cho thấy: Khi tiến hành phân tích dung dịch chuẩn hỗn hợp trên cột C18 Shimadzu, cột C18 InertSustain và C18

NH

Eclipse Plus (250 cm x 4,6 mm; 5µm) các pic R1, Rg1, Re, Rb1 có tách ra khỏi nhau. Trong đó cột C18 InertSustain các pic R1, Rg1, Re, Rb1 tách nhau rõ ràng nhất, độ phân giải của pic Rg1 và Re là 1,6 đạt yêu cầu lớn

Y

hơn 1. Vì vậy lựa chọn cột này để phân tích đồng thời các chất phân tích.

QU

- Pha động: Khảo sát khả năng tách các chất phân tích với các chất cản trở trong nền mẫu của dung dịch chuẩn hỗn hợp và dung dịch mẫu trắng thêm chuẩn dạng rắn, lỏng, dầu nồng độ mỗi chất 50 µg/ml trên hệ pha động

M

ACN - H2O theo các chương trình sau:

KÈ

Chương trình

DẠ Y

Chương trình 1 Chương

Bảng 3.1. Chương trình dung môi Thời gian (phút)

Acetonitril (% tt/tt)

H2O (% tt/tt)

0 - 20

20

80

20 - 40

20 → 45

80 → 55

40 - 60

45 → 55

55 → 45

60 - 65

20

80

0 - 20

20

80

30

80 → 55

40 - 75

45 → 55

55 → 45

75 - 80

20

80

0 - 35

19

35 - 55

19 → 29

55 - 70

29

CI

70 - 100

29 → 40

AL

20 → 45

81

81 → 71 71

71 → 60

OF

Chương trình 3

20 - 40

FI

trình 2

M

QU

Y

NH

ƠN

Kết quả được thể hiện ở hình 3.1, 3.2, 3.3.

DẠ Y

KÈ

Hình 3.1. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn (phía trên), dung dịch thử dạng dầu (phía dưới) theo chương trình pha động 1

31

AL CI FI OF ƠN

DẠ Y

KÈ

M

QU

Y

NH

Hình 3.2. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn (phía trên), dung dịch thử dạng dầu (phía dưới) theo chương trình pha động 2

Hình 3.3. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn (phía trên), dung dịch thử dạng dầu (phía dưới) theo chương trình pha động 3

32

AL

Kết quả khảo sát cho thấy, cả ba chương trình pha động các chất R1, Rg1,

Re, Rb1 trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn đều tách rõ ràng. Tuy nhiên với nền

CI

mẫu dầu ở chương trình 1 pic Rb1 không tách được với pic tạp nên đáp ứng phân tích lớn hơn khoảng gấp rưỡi dung dịch chuẩn, ở chương trình pha động

FI

3 pic Rb1 cũng không tách hoàn toàn được với pic tạp, chỉ có chương trình pha động 2 pic Rb1 tách hoàn toàn với tạp chất và độ thu hồi đạt 99,3%. Vì

OF

vậy để tiết kiệm thời gian phân tích mà vẫn đảm bảo được các chất phân tích được tách rõ ràng ra khỏi nền mẫu, hệ dung môi ACN - Nước theo chương trình pha động 2 được lựa chọn làm pha động để tiến hành phân tích các chất

ƠN

trong đề tài.

- Tốc độ dòng: Kết quả khảo sát 5 mức tốc độ là 1,0 ml/phút, 1,2 ml/phút, 1,6 ml/phút, 1,8 ml/phút và 2,0 ml/phút cho thấy: Tốc độ 1,6 ml/phút các phân giải giữa Rg1, Re.

NH

pic R1, Rg1, Re, Rb1 tách tốt nhất, đạt yêu cầu về hệ số kéo đuôi và độ - Thể tích tiêm: Tiến hành sắc ký các thể tích tiêm 10 µl, 20 µl và 50 µl,

Y

SKĐ khi tiêm 20 µl cho các pic tách nhau rõ ràng, diện tích pic phù hợp

QU

(lớn hơn 300000), độ phân giải Rg1 và Re đạt yêu cầu.

- Detector: Để lựa chọn bước sóng phát hiện sử dụng detector DAD, quét phổ các chất phân tích trong khoảng 190 - 300 nm. Kết quả cho thấy tại bước sóng 203 nm các chất R1, Rg1, Re và Rb1 cho tín hiệu cao nhất. Do

M

đó 203 nm được lựa chọn để phát hiện các chất phân tích.

KÈ

- Như vậy, từ kết quả thực nghiệm đã xác định được điều kiện sắc ký để phân tích định tính, định lượng R1, Re, Rg1, Rb1 trên hệ thống HPLC như sau:

DẠ Y

➢ Pha động: ACN - Nước gradient theo chương trình: Thời gian (phút) Acetonitril (% tt/tt) H2O (% tt/tt) 0 - 20

20

80

33

20 → 45

80 → 55

40 - 75

45 → 55

55 → 45

75 - 80

20

80

CI

AL

20 - 40

➢ Cột sắc ký: InertSustain C18 (kích thước 250 x 4,6 mm; 5µm)

FI

➢ Tốc độ dòng: 1,6 ml/phút ➢ Detector: DAD ở bước sóng 203 nm.

3.1.1.2. Khảo sát quy trình xử lý mẫu: a. Chuẩn bị mẫu:

ƠN

Mẫu thử:

OF

➢ Thể tích tiêm: 20 µL

- Mẫu dạng rắn: Đồng nhất mẫu thử của 20 đơn vị, nghiền thành bột mịn, trộn đều.

NH

- Mẫu dạng lỏng: Trộn đều dung dịch trong 05 đơn vị.

- Mẫu dạng dầu: Đồng nhất dịch chứa trong nang của 20 viên, trộn đều.

Mẫu nền:

Y

- Mẫu được trộn theo công thức mẫu thực của từng dạng bào chế nhưng

QU

không chứa Tam thất, Nhân sâm.

- Công thức chế tạo mẫu nền như sau: + Mẫu nền dạng rắn: 300 mg cao lá Bạch quả, 50 mg cao Việt quất, 50 mg magnesi, 30 mg citicolin, 1 mg vitamin B1, 1 mg vitamin B6, 2,5 mg magnesi

M

stearat, 1 mg methyl paraben, 0,2 mg propyl paraben, 15 mg

KÈ

polyvinylpyrrolidone (PVP), 5 mg talc vừa đủ 1 viên. + Mẫu nền dạng lỏng: Dịch chiết 5 g Táo đỏ Hàn Quốc, nước tinh khiết vừa đủ 90 ml.

DẠ Y

+ Mẫu nền dạng dầu: 250 mg Ginkgo biloba, 25 mg rutin (20 % rutin), 150 mg gelatin, 10 mg sáp ong trắng, 65 mg sorbitol, 150 mg dầu đậu nành, 135 mg dầu cọ, 40 mg lecithin, 75 mg glycerin cho 1 viên. b. Khảo sát quy trình xử lý mẫu: 34

AL

❖ Khảo sát điều kiện chiết mẫu:

Tiến hành khảo sát lựa chọn quy trình xử lý mẫu. Hai quy trình khảo sát

CI

trong nghiên cứu gồm: - Quy trình 1:

FI

+ Đối với mẫu dạng rắn, dạng dầu: Cân chính xác khoảng 2,0 g mẫu thử vào ống ly tâm dung tích 50 ml. Thêm khoảng 30 ml methanol 90%, lắc xoáy cho

OF

đến khi mẫu phân tán đồng nhất, rung siêu âm ở 50 oC - 60 oC trong 30 phút.

Ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút, gạn dịch trong vào cốc mỏ 100 ml, phần cặn thêm khoảng 15 ml methanol 90%, tiếp tục chiết lần 2. Tập o

ƠN

trung dịch chiết vào cốc mỏ 100 ml. Cô dịch chiết trên cách thủy ở 60 oC - 70 C đến cạn. Hòa cắn trong 5 ml nước. Tiến hành chiết qua cột SPE. Hoạt hóa

cột SPE bằng 3 ml methanol và cân bằng cột bằng 3 ml nước. Chuyển dịch

NH

chiết lên cột SPE. Rửa tạp bằng 5 ml nước, sau đó rửa bằng 5 ml hỗn hợp methanol - nước (3 : 7) (cùng tốc độ rửa 2 ml/phút). Tiến hành rửa giải bằng 8 ml methanol (tốc độ 1 ml/phút), hứng dịch rửa giải vào bình định mức 10 ml.

Y

Thêm methanol vừa đủ đến vạch lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.

QU

+ Đối với mẫu dạng lỏng: Hút chính xác 5,0 ml dịch chế phẩm. Tiến hành chiết qua cột SPE tương tự như trên.

- Quy trình 2:

+ Đối với mẫu dạng rắn, dạng dầu: Cân chính xác khoảng 2,0 g mẫu thử vào

M

ống ly tâm dung tích 50 ml. Thêm khoảng 30 ml methanol 70%, lắc xoáy cho

KÈ

đến khi mẫu phân tán đồng nhất, rung siêu âm ở 50oC - 60oC trong 30 phút.

Ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút, gạn dịch trong vào bình định mức dung tích 50 ml, phần cặn thêm khoảng 15 ml methanol 70%, tiếp tục

DẠ Y

rung siêu âm ở 50oC - 60oC trong 30 phút. Ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút, gạn dịch trong vào bình định mức chứa dịch chiết lần 1. Bổ sung methanol 70% vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.

35

AL

+ Đối với mẫu dạng lỏng: Hút chính xác 5,0 ml dịch chế phẩm cho vào bình

định mức 50 ml, thêm methanol rung siêu âm 30 phút, để nguội, thêm

CI

methanol đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Tiến hành phân tích mẫu trắng của từng dạng bào chế thêm chuẩn ở

FI

nồng độ 50 µg/ml. Kết quả khảo sát hai phương pháp chiết tới độ thu hồi chất

NH

ƠN

OF

phân tích được thể hiện ở hình 3.4:

Y

Hình 3.4. Biểu đồ khảo sát quy trình xử lý mẫu

QU

Kết quả cho thấy hiệu suất thu hồi ở quy trình 2 cho hiệu suất cao hơn quy trình 1, nhưng mắc sai số thừa đối với mẫu dạng rắn và dạng lỏng. Do nền mẫu TPBVSK phức tạp, ngoài chất phân tích còn chứa nhiều thành phần

M

khác dẫn tới ảnh hưởng lớn kết quả phân tích, hàm lượng chất phân tích trong chế phẩm lại nhỏ. SPE với ưu điểm làm sạch và làm giàu mẫu khắc phục

KÈ

được nhược điểm của quy trình 2 là không xử lý được nền mẫu dẫn tới bẩn hệ thống và cần lượng dung môi lớn. Mặt khác, kết quả cho thấy độ thu hồi ở quy trình 1 đạt yêu cầu theo AOAC ở mức nồng độ tương ứng. Do đó quy

DẠ Y

trình 1 được lựa chọn là quy trình chiết mẫu. ❖ Khảo sát nhiệt độ chiết:

36

AL

Nhiệt độ là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết mẫu, ở đây nhiệt độ được sử dụng với mục đích làm tăng khả năng hòa tan các chất

CI

phân tích và làm bay hơi dung môi. Tiến hành khảo sát nhiệt độ chiết mẫu theo quy trình dự kiến ở nhiệt độ bể siêu âm tại 30oC, 40oC, 50oC, 60oC, 70oC

FI

và bay hơi dung môi tại 50oC, 60oC, 70oC, 80oC, 90oC đối với nền mẫu thực dạng rắn. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng chiết được thể hiện ở

NH

ƠN

OF

hình 3.5.

Hình 3.5. Biểu đồ khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ chiết mẫu tới khả năng chiết

Y

Từ kết quả thu được cho thấy khi siêu âm ở 50 oC, 60oC cho tín hiệu các

QU

chất phân tích là lớn nhất. Nhiệt độ bốc hơi ở 50oC, 60oC, 70oC tín hiệu tương tự như nhau, tại 80oC và 90oC tín hiệu giảm có thể do bị phân hủy bởi nhiệt.

Vì vậy, để tăng khả năng chiết mẫu và giảm thời gian bay hơi nên chọn nhiệt

M

độ siêu âm là 50oC - 60oC, nhiệt độ bốc hơi là 60oC - 70oC. ❖ Khảo sát bước làm sạch và dung môi rửa giải:

KÈ

Bước làm sạch là giai đoạn quan trọng trong quá trình chiết mẫu bằng

SPE. Tiến hành khảo sát quá trình rửa tạp với dung môi methanol - nước theo tỷ lệ (5 : 5), (6 : 4), (3 : 7) và (2 : 8) trên nền mẫu dầu thêm chuẩn ở nồng độ

DẠ Y

50 µg/ml. Kết quả cho thấy khi rửa bằng methanol - nước tỷ lệ (5 : 5) hay (6 : 4) hàm lượng chất phân tích bị mất đi trong quá trình rửa tạp, ở tỷ lệ (2 : 8) gây hiệu ứng nền cao, ở tỷ lệ (3 : 7) ảnh hưởng của nền mẫu thấp và độ thu hồi chất phân tích đạt yêu cầu.

37

AL

Một trong những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết SPE chính là

dung môi rửa giải. Khảo sát dung môi rửa giải là methanol, methanol 90% và

CI

methanol 80%, kết quả cho thấy methanol cho hiệu suất rửa giải cao nhất.

Từ kết quả khảo sát, quy trình xử lý mẫu lựa chọn như sau:

Hút 5,00 ml (mẫu lỏng)

OF

FI

Cân cxác  2 g (mẫu rắn, mẫu dầu) + 30 ml methanol 90% Mẫu chiết

NH

Dịch chiết (Lớp trên)

ƠN

- Lắc votex, rung siêu âm 30 phút - Ly tâm 6000 vòng/phút x 5 phút

Bốc hơi cách thủy ở 60 - 70oC

QU

Y

Cắn

+ 5 ml nước

DẠ Y

KÈ

M

Cột SPE đã hoạt hóa - Rửa tạp 5ml nước → 5 ml methanol 30% (tốc độ 2ml/phút) - Rửa giải bằng 8 ml methanol (tốc độ 1 ml/phút)

Dịch rửa giải - + Methanol vừa đủ 10,00 ml - Lọc bằng màng lọc đường kính lỗ lọc 0,45 µm Dung dịch sắc ký

Hình 3.6. Sơ đồ quy trình chiết mẫu 38

AL

3.1.2. Thẩm định quy trình phân tích 3.1.2.1. Độ đặc hiệu:

CI

- Dung dịch chuẩn: Pha dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa R1, Rg1, Re, Rb1

trong methanol để được dung dịch chứa mỗi chất có nồng độ khoảng 1000

FI

µg/ml. Hút chính xác 1,0 ml dung dịch thu được vào bình định mức 10 ml, thêm methanol vừa đủ đến vạch lắc đều (dung dịch chuẩn hỗn hợp R1,

OF

Rg1, Re, Rb1 chứa mỗi chất có nồng độ khoảng 100 µg/ml).

- Dung dịch mẫu nền: Chuẩn bị theo quy trình xử lý mẫu đã xây dựng 03 dạng bào chế rắn, dầu, lỏng.

ƠN

- Dung dịch mẫu tự tạo: Thêm chuẩn R1, Rg1, Re, Rb1 vào mẫu nền của từng dạng bào chế và chuẩn bị theo quy trình xử lý mẫu đã xây dựng để được dung dịch có nồng độ mỗi chất khoảng 100 µg/ml.

NH

- Tiến hành phân tích các mẫu nền và mẫu chuẩn, mẫu tự tạo theo phương pháp đã xây dựng và ghi lại sắc đồ. Kết quả phân tích được thể hiện ở Hình

Hình 3.7. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp

DẠ Y

KÈ

M

QU

Y

3.7, 3.8, 3.9, 3.10 và Bảng 3.2.

39

AL CI FI OF ƠN

DẠ Y

KÈ

M

QU

Y

NH

Hình 3.8. Sắc ký đồ mẫu nền (trên) và mẫu thử (dưới) dạng rắn

Hình 3.9. Sắc ký đồ mẫu nền (trên) và mẫu thử (dưới) dạng dầu

40

AL CI FI OF ƠN NH

Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu nền (trên) và mẫu tự tạo (dưới) dạng lỏng Bảng 3.2. Kết quả khảo sát độ đặc hiệu

Thời gian lưu (Phút)

Rg1

Re

Rb1

19,698

26,656

27,814

49,759

Dạng rắn

19,586

26,589

27,751

49,721

Dạng dầu

19,163

26,230

27,438

49,948

Dạng lỏng

20,016

26,872

28,029

49,774

Dạng rắn

-

-

-

-

Dạng dầu

-

-

-

-

Dạng lỏng

-

-

-

-

368715

418734

410482

246638

Dạng rắn

373729

412744

417097

248420

Dạng dầu

363118

414530

409589

247241

Dạng lỏng

370727

413816

411995

245418

Dạng rắn

-

-

-

-

Dạng dầu

-

-

-

-

Dạng lỏng

-

-

-

-

QU

Chuẩn

R1

Y

Hoạt chất

Thử

M

Mẫu nền

KÈ

Chuẩn

DẠ Y

Diện tích pic (mAU.s)

Thử

Mẫu nền

41

AL

Nhận xét:

- Trên SKĐ của các dung dịch mẫu tự tạo cho pic có thời gian lưu tương ứng

CI

với các pic notoginsenosid R1 (19,7 phút), ginsenosid Rg1 (26,6 phút), ginsenosid Re (27,8 phút) và ginsenosid Rb1 (49,7 phút) trên SKĐ của dung

FI

dịch chuẩn. Các chất phân tích trên SKĐ của dung dịch mẫu tự tạo tách hoàn toàn với các pic tạp.

OF

- Trên sắc ký đồ của các mẫu nền không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với các pic Notoginsenosid R1, Ginsenosid Rg1, Ginsenosid Re và Ginsenosid Rb1 trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn.

ƠN

Do vậy, phương pháp phân tích có độ đặc hiệu chọn lọc với Notoginsenosid R1, Ginsenosid Rg1, Ginsenosid Re và Ginsenosid Rb1 để định tính, định lượng các chất này trong TPBVSK.

NH

3.1.2.2. Độ thích hợp của hệ thống:

- Dung dịch chuẩn: Dung dịch chuẩn hỗn hợp R1, Rg1, Re, Rb1 chứa mỗi chất có nồng độ khoảng 100 µg/ml phần độ đặc hiệu.

Y

- Tiến hành phân tích dung dịch chuẩn hỗn hợp trên theo quy trình đã xây dựng, Kết quả:

QU

ghi sắc ký đồ, xác định thông số của pic các chất phân tích.

Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra độ thích hợp của hệ thống R1

Rg1

Re

Rb1

1

19,686

26,652

27,813

49,739

2

19,667

26,637

27,801

49,738

3

19,651

26,632

27.797

49,734

4

19,676

26,650

27,811

49,742

5

19,636

26,610

27,778

49,738

6

19,629

26,604

27,774

49,733

TB

19,657

26,631

27,795

49,737

RSD

0,11

0,08

0.06

0,01

1

359548

420507

414658

242212

2

360456

420082

414466

242305

KÈ

M

Hoạt chất

DẠ Y

Thời gian lưu (phút)

Diện tích pic

42

(mAU.s)

360145

418137

413383

4

358720

416831

410369

5

357249

414558

407664

6

356079

412568

406274

TB

358700

417114

411136

RSD

0,48

0,74

0,88

1

1,092

1,077

1,083

1,084

2

1,100

1,080

1,082

1,086

3

1,101

1,075

4

1,104

1,073

5

1,095

1,078

6

1,098

1,069

1 2 3 4

NH

Độ phân giải

5 6

240607 238940 238882

CI

FI

OF

ƠN

Hệ số kéo đuôi

241012

AL

3

240660 0,62

1,083

1,079

1,086

1,081

1,081

1,082

1,079

1,079

1,601 1,605 1,597 1,594 1,601 1,602

Y

Từ kết quả thực nghiệm cho thấy các chất phân tích có RSD thời gian lưu

QU

nhỏ hơn 0,11%, RSD diện tích pic nhỏ hơn 0,88%; Độ phân giải giữa hai pic Rg1 và Re là 1,6; Hệ số kéo đuôi nằm trong khoảng 0,8 - 1,2 cho thấy hệ thống ổn định và cột sắc ký có hiệu lực tốt.

3.1.2.3. Khoảng tuyến tính:

M

Phân tích các mẫu chuẩn hỗn hợp chứa R1, Rg1, Re và Rb1 có nồng độ từ

KÈ

4 µg/ml - 400 µg/ml mỗi chất theo quy trình đã xây dựng. Xác định sự tương quan giữa nồng độ chất phân tích có trong mẫu (µg/ml) và diện tích pic (mAU.s) tương ứng thu được trên SKĐ bằng phương pháp hồi qui tuyến tính.

DẠ Y

Kết quả xác định mối tương quan này được trình bày ở Bảng 3.4 và Hình

3.11.

43

C3

C4

C5

Nồng độ (µg/ml)

3,99

9,99

24,96

49,93

99,86

Diện tích pic (mAU.s)

15325

35950

92089

183201

375638

Độ chệch (%)

6,71

7,62

3,09

2,90

C6

199,72

FI

C2

C7

399,43

773330

1489137

3,05

0,70

OF

R1

C1

CI

Hoạt chất

AL

Bảng 3.4. Kết quả thẩm định khoảng tuyến tính của phương pháp

0,07

Phương trình hồi quy: y = 3751 x + 1347; R2 = 0,9996 10,16

25,39

Diện tích pic (mAU.s)

16863

43676

109060

Độ chệch (%)

17,76

5,28

50,79

101,57

203,15

406,30

223421

437984

939118

1832450

0,95

3,92

2,40

0,34

ƠN

4,06

NH

Rg1

Nồng độ (µg/ml)

1,14

Phương trình hồi quy: y = 4538 x - 4847; R2 = 0,9997

Độ chệch (%)

10,28

QU

Re

Diện tích pic (mAU.s)

4,11

Y

Nồng độ (µg/ml)

25,69

51,38

102,75

205,50

411,01

14750

39851

102121

207705

429500

885605

1694239

17,15

8,08

4,91

3,01

0,43

3,61

0,86

M

Phương trình hồi quy: y = 4156 x + 597; R2 = 0,9994 3,97

9,92

24,81

49,61

99,22

198,44

396,88

Diện tích pic (mAU.s)

10007

25381

64425

129915

254616

546778

1032584

Độ chệch (%)

16,98

7,74

3,11

1,25

2,73

4,75

0,98

KÈ

Nồng độ (µg/ml)

DẠ Y

Rb1

Phương trình hồi quy: y = 2624 x + 1361; R2 = 0,9991

44

AL CI FI OF ƠN

NH

Hình 3.11. Đồ thị khảo sát sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất phân tích Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ từ 4 µg/ml đến 400 µg/ml có sự

Y

tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất phân tích với

QU

hệ số R2 từ 0,9991 đến 0,9997. Các giá trị độ chệch so với điểm chuẩn ban đầu đều nằm trong khoảng giới hạn ± 15% và nhỏ hơn 20% tại mức nồng độ ở giới hạn định lượng theo yêu cầu của nhiều tổ chức tại Mỹ, Canada, Châu Âu [12]. Như vậy, đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng

KÈ

AOAC.

M

độ và diện tích pic của các chất phân tích đạt yêu cầu và được chấp nhận theo 3.1.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ): Đánh giá LOD, LOQ của phương pháp dựa vào độ lệch chuẩn trên nền

DẠ Y

mẫu thử. Chuẩn bị mẫu tự tạo thêm chuẩn vào nền mẫu để sau khi xử lý mẫu dung dịch phân tích có nồng độ 10 µg/ml đối với mỗi chất phân tích. Phân tích mẫu thử 06 lần lặp lại theo quy trình đã xây dựng, tính giá trị trung bình x và độ lệch chuẩn SD. Từ đó tính LOD = 3SD, LOQ = 10SD. Tính R =

45

AL

x /LOD, nếu 4 ≤ R ≤ 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính

được là đáng tin cậy [12,13]. Kết quả LOD, LOQ của phương pháp đối với

CI

nền mẫu rắn và tóm tắt đối với nền mẫu lỏng và dầu được thể hiện ở Bảng 3.5. Kết quả đầy đủ được trình bày trong phụ lục 2.

FI

Bảng 3.5. Kết quả thẩm định LOD, LOQ của phương pháp Nền mẫu dạng rắn TB (µg/g chế phẩm)

SD

LOD (µg/ml)

LOD (µg/g chế phẩm)

LOQ (µg/ml)

LOQ (µg/g chế phẩm)

R

R1

46,76

2,16

1,3

6,47

4,3

21,57

7,23

Rg1

52,28

2,15

1,3

6,44

4,3

21,48

8,11

Re

43,65

1,78

1,1

5,34

3,6

17,79

8,18

Rb1

48,43

1,64

1,0

3,3

16,44

9,82

LOD (µg/g chế phẩm)

LOQ (µg/ml)

LOQ (µg/g chế phẩm)

R

1,0

5,01

3,3

16,69

9,34

1,4

6,89

4,6

22,98

7,90

1,1

5,34

3,6

17,79

8,18

1,2

5,76

3,8

19,20

7,67

ƠN

OF

Hoạt chất

4,93

Nền mẫu dạng dầu SD

R1

46,78

1,67

Rg1

54,46

2,30

Re

43,65

1,78

Rb1

44,19

1,92

LOD (µg/ml)

NH

TB (µg/g chế phẩm)

Y

Hoạt chất

LOD (µg/ml chế phẩm)

LOQ (µg/ml)

LOQ (µg/ml chế phẩm)

R

17,58

0,71

1,1

2,13

3,6

7,11

8,25

Rg1

22,43

0,82

1,2

2,45

4,1

8,16

9,16

Re

19,50

0,92

1,4

2,77

4,6

9,22

7,05

16,36

0,81

1,2

2,42

4,0

8,05

6,77

QU SD

LOD (µg/ml)

M

Nền mẫu dạng lỏng

Hoạt chất

TB (µg/ml chế phẩm)

R1

KÈ

Rb1

Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy LOD, LOQ của phương pháp là đáng tin

cậy.

DẠ Y

3.1.2.5. Độ đúng: Độ đúng của phương pháp được đánh giá bằng phương pháp xác định độ

thu hồi của mẫu tự tạo. Thêm chuẩn hỗn hợp vào nền mẫu để sau khi xử lý mẫu dung dịch phân tích có nồng độ mỗi chất phân tích khoảng 4 µg/ml, 50 46

AL

µg/ml và 400 µg/ml của 03 dạng bào chế rắn, lỏng, dầu, tiến hành theo quy trình phân tích thử, mỗi mức thực hiện 03 lần.

CI

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Dung dịch chuẩn gốc có nồng độ mỗi chất khoảng 1000 µg/ml.

FI

- Dung dịch 1 (mẫu có nồng độ 4 µg/ml): Từ dung dịch chuẩn gốc 1000 µg/ml pha dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ 100 µg/ml. Hút chính xác

OF

400 µl dung dịch chuẩn hỗn hợp 100 µg/ml vào cốc mỏ có sẵn 2 g mẫu nền (dạng rắn, dạng dầu) hoặc 5 ml mẫu nền dạng lỏng, thêm methanol 90%, tiến hành chiết như quy trình thử đã xây dựng. Lọc qua màng lọc 0,45 µm

ƠN

(chuẩn bị 3 mẫu).

- Dung dịch 2 (mẫu có nồng độ 50 µg/ml): Hút chính xác 500 µl dung dịch chuẩn hỗn hợp 1000 µg/ml vào cốc có mỏ có sẵn 2 g mẫu nền (dạng rắn,

NH

dạng dầu) hoặc 5 ml mẫu nền dạng lỏng, thêm methanol 90%, tiến hành chiết như quy trình thử đã xây dựng. Lọc qua màng lọc 0,45 µm (chuẩn bị 3 mẫu).

Y

- Dung dịch 3 (mẫu có nồng độ 400 µg/ml): Hút chính xác 4,0 ml dung dịch

QU

chuẩn hỗn hợp 1000 µg/ml vào cốc có mỏ có sẵn 2 g mẫu nền (dạng rắn, dạng dầu) hoặc 5 ml mẫu nền dạng lỏng, thêm methanol 90%, tiến hành chiết như quy trình thử đã xây dựng. Lọc qua màng lọc 0,45 µm (chuẩn bị 3 mẫu).

M

- Tiến hành sắc ký lần lượt các dung dịch, ghi sắc ký đồ, đo diện tích pic của

KÈ

chất phân tích. Xác định hàm lượng chất phân tích có trong các mẫu bằng đường chuẩn phân tích trong cùng điều kiện. Tính độ thu hồi của chất phân

DẠ Y

tích.

Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp được trình bày ở bảng

3.6. Kết quả đầy đủ được trình bày trong phụ lục 3.

47

Nền mẫu dạng rắn

Re

Rb1

CI

RSD (%)

TB

Max

4,03

86,19

87,55

89,20

50,42

97,89

98,74

100,0

1,09

403,35

99,63

100,37

102,39

1,76

3,99

86,68

88,86

49,85

100,82

103,53

398,77

98,02

99,16

4,03

89,58

51,38

96,96

403,10

95,29

4,08

90,40

50,05

96,26

407,5

96,77

FI

Min

OF

Rg1

Độ thu hồi (%)

1,74

90,91

2,38

105,16

2,28

99,83

0,99

90,07

90,91

0,81

97,75

98,41

0,75

96,05

97,05

0,94

94,30

96,68

3,61

98,12

99,59

1,73

97,75

99,62

1,66

ƠN

R1

Nồng độ phân tích (µg/ml)

NH

Hoạt chất

AL

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp

Nền mẫu dạng dầu

DẠ Y

Re

Rb1

Y Min

TB

Max

RSD (%)

4,03

87,63

88,55

89,62

1,14

50,42

97,59

98,29

99,29

0,91

403,35

95,75

97,33

98,13

1,40

3,99

93,16

93,50

94,17

0,62

49,85

96,43

98,33

99,60

1,70

398,77

96,07

97,69

98,61

1,44

4,03

86,97

87,23

87,54

0,33

51,38

94,22

96,05

97,40

1,71

403,10

96,05

97,32

99,52

1,97

4,08

90,83

91,82

92,56

0,97

50,05

95,47

96,79

96,28

1,68

407,5

98,26

99,40

100,92

1,38

KÈ

Rg1

Độ thu hồi (%)

QU

R1

Nồng độ phân tích (µg/ml)

M

Hoạt chất

48

Nồng độ phân tích (µg/ml)

Re

Rb1

Max

4,03

89,60

90,39

91,25

50,42

100,64

101,39

102,64

403,35

96,02

97,23

97,99

1,08

3,99

89,62

90,70

92,10

1,40

49,85

99,98

101,09

102,16

1,08

398,77

97,79

99,26

100,10

1,28

4,03

90,62

91,0

91,48

0,48

51,38

98,53

100,8

102,03

1,95

403,10

96,87

97,3

97,99

0,62

4,08

89,99

90,7

91,39

0,77

50,05

95,83

97,4

98,96

1,61

407,5

97,59

98,0

98,52

0,48

FI

CI

TB

OF

Rg1

RSD (%)

Min

ƠN

R1

Độ thu hồi (%)

NH

Hoạt chất

AL

Nền mẫu dạng lỏng

0,92 1,07

Theo AOAC ở mức nồng độ 4 µg/ml độ thu hồi phải đạt 85-110%, RSD ≤ 4%; ở mức 50 µg/ml là 90-108%, RSD ≤ 3%; ở mức 400 µg/ml là 92-

Y

105%, RSD ≤ 2% [11]. Kết quả thẩm định cho thấy ở các mức nồng độ thực

QU

hiện thu hồi trên 3 nền mẫu rắn, lỏng và dầu, độ thu hồi các chất đều đạt yêu cầu. Ở mức nồng độ LOQ (4 µg/ml) trên các nền mẫu rắn, lỏng, dầu phương pháp có độ thu hồi tương đối tốt: Từ 86,19 - 91,25% (RSD < 1,14%) đối với

M

Notoginsenosid R1; từ 86,68 - 94,17% (RSD < 2,38%) đối với Ginsenosid Rg1; từ 86,97 - 91,48% (RSD < 0,81%) đối với Ginsenosid Re và từ 89,99 -

KÈ

96,68% (RSD < 3,61%) đối với Ginsenosid Rb1. Do đó phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng theo quy định.

3.1.2.6. Độ chính xác:

DẠ Y

a. Độ lặp: Tiến hành phân tích mẫu thực tế của từng dạng nền mẫu theo quy trình

đã xây dựng. Mỗi dạng mẫu làm lặp lại 06 lần. Tính giá trị RSD của từng mẫu.

49

AL

Kết quả độ lặp lại được thể hiện trong bảng 3.7. Kết quả đầy đủ được trình bày trong phụ lục 4.

CI

Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ lặp lại Mẫu dạng rắn Lượng chất trong chế phẩm (mg/g)

RSD theo AOAC (%)

1,80

≤ 3,0%

2,10

≤ 3,0%

1,96

≤ 4,0%

2,16

≤ 3,0%

RSD (%)

RSD theo AOAC (%)

0,16

1,58

≤ 3,0%

0,56

1,83

≤ 3,0%

TB

Max

R1

0,22

0,23

0,23

Rg1

0,74

0,76

0,78

Re

0,095

0,097

0,100

Rb1

0,90

0,92

0,95

OF

Min

FI

RSD (%)

Hoạt chất

ƠN

Mẫu dạng dầu Lượng chất trong chế phẩm (mg/g)

Hoạt chất

Min

TB

R1

0,15

0,16

Rg1

0,54

0,55

Re

0,066

0,067

0,069

1,94

≤ 4,0%

Rb1

0,66

0,67

0,69

1,56

≤ 3,0%

RSD (%)

RSD theo AOAC (%)

NH

Max

Lượng chất trong chế phẩm (mg/ml) Min

TB

Max

QU

Hoạt chất

Y

Mẫu dạng lỏng

0,060

0,061

0,063

1,41

≤ 4,0%

Rg1

0,24

0,25

0,25

2,12

≤ 3,0%

Re

0,025

0,026

0,027

2,91

≤ 4,0%

Rb1

0,62

0,64

0,65

1,94

≤ 3,0%

M

R1

KÈ

Từ kết quả thu được và so sánh theo quy định của AOAC, các chất phân

tích trong từng nền mẫu đều có độ lặp lại trong giới hạn cho phép. Như vậy phương pháp có độ lặp lại đạt yêu cầu của AOAC.

DẠ Y

b. Độ chính xác trung gian Tiến hành phân tích mẫu thực tế của từng dạng nền mẫu theo quy trình đã

xây dựng tương tự độ lặp lại, thực hiện bởi ngày khác và máy HPLC khác.

Tính giá trị RSD của các kết quả phân tích (n=6 và n=12).

50

được trình bày trong phụ lục 5.

Mẫu dạng rắn Lượng chất trong chế phẩm (mg/g)

(%)

RSDR (%)

(n=12)

(n=6)

(n=12)

TB

RSDr

TB (n=6)

Max

R1

0,217

0,22

0,224

0,22

1,39

1,98

Rg1

0,72

0,74

0,76

0,75

1,63

2,39

Re

0,090

0,092

0,095

Rb1

0,90

0,92

0,94

ƠN

OF

Min

0,095

1,88

3,23

0,92

1,68

1,87

RSDr

NH

RSD theo AOAC (%)

FI

Hoạt chất

CI

Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian

AL

Kết quả chính xác trung gian được thể hiện trong bảng 3.8. Kết quả đầy đủ

≤ 3,0% (n = 6) ≤ 6,0% (n = 12) ≤ 3,0% (n = 6) ≤ 6,0% (n = 12) ≤ 4,0% (n = 6) ≤ 8,0% (n = 12) ≤ 3,0% (n = 6) ≤ 6,0% (n = 12)

Mẫu dạng dầu

Hoạt chất

Lượng chất trong chế phẩm (mg/g) TB

(%)

RSDR (%)

(n=12)

(n=6)

(n=12)

0,164

0,16

1,74

2,23

0,54

0,54

055

1,96

1,96

0,062

0,065

0,067

0,066

2,63

2,58

0,65

0,68

0,69

0,68

2,10

2,01

RSDr

TB (n=6)

Max

R1

0,156

0,16

Rg1

0,52

Re

DẠ Y

Hoạt chất

R1

QU

M

KÈ

Rb1

Y

Min

RSD theo AOAC (%) ≤ 3,0% (n = 6) ≤ 6,0% (n = 12) ≤ 3,0% (n = 6) ≤ 6,0% (n = 12) ≤ 4,0% (n = 6) ≤ 8,0% (n = 12) ≤ 3,0% (n = 6) ≤ 6,0% (n = 12)

Mẫu dạng lỏng

Lượng chất trong chế phẩm (mg/ml) Min

TB (n=6)

Max

0,065

0,065

0,067

TB

(%)

RSDR (%)

(n=12)

(n=6)

(n=12)

0,063

0,91

3,47

51

RSD theo AOAC (%) ≤ 4,0% (n = 6) ≤ 8,0% (n = 12)

0,263

0,25

0,72

4,04

Re

0,028

0,028

0,029

0,027

2,02

4,85

Rb1

0,64

0,66

0,68

0,65

1,78

2,71

≤ 3,0% (n = 6)

AL

0,26

≤ 6,0% (n = 12) ≤ 4,0% (n = 6)

≤ 8,0% (n = 12)

CI

0,259

≤ 3,0% (n = 6)

≤ 6,0% (n = 12)

FI

Rg1

trên từng nền mẫu đạt yêu cầu theo AOAC.

OF

Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian thu được của các chất phân tích

Từ các thực nghiệm độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác cho thấy phương pháp đã xây dựng có đủ độ chọn lọc và độ tin

ƠN

cậy để có thể áp dụng cho phân tích định lượng notoginsenosid R1, ginsnosid Rg1, ginsenosid Re và ginsenosid Rb1 trong mẫu TPBVSK.

khỏe chứa chất phân tích

NH

3.2. Ứng dụng phương pháp phân tích một số mẫu thực phẩm bảo vệ sức Tiến hành nghiên cứu 20 sản phẩm TPBVSK chứa notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re và ginsenosid Rb1 trên thị trường ở các dạng

Y

bào chế khác nhau. Trong đó có 10 mẫu chứa Tam thất hoặc cả Nhân sâm và

QU

Tam thất (từ M1 đến M10), 10 mẫu chứa Nhân sâm (Từ M11 đến M20), các mẫu có thành phần công thức kết hợp cùng nhiều dược liệu khác và các vitamin. Kết quả được trình bày ở bảng 3.9 và minh họa ở hình 3.12, 3.13,

KÈ

M

3.14.

DẠ Y

Mẫu

M1

Dạng bào chế Viên nang

Bảng 3.9. Kết quả phân tích mẫu thực tế R1

Hàm lượng (mg/g)

RSD (%)

0,23

1,80

Rg1 Hàm RSD lượng (%) (mg/g) 0,76

2,10

cứng

52

Re Hàm lượng (mg/g)

RSD (%)

0,097

1,96

Rb1 Hàm RSD lượng (%) (mg/g) 0,92

2,16

Cao lỏng

0,066

1,41

0,26

2,12

0,028

2,91

M3

Viên nang mềm

0,16

1,58

0,55

1,83

0,067

1,94

0,67

1,56

M4

Bột

0,78

0,78

2,75

0,82

0,27

0,55

2,79

0,81

M5

Viên nang mềm

-

M6

Viên nang mềm

1,28

0,98

4,92

1,01

M7

Viên nang cứng

0,13

1,72

0,84

0,31

1,05

M9

Trà túi lọc

M10

Viên hoàn cứng

M11

Viên nang mềm

DẠ Y

M13

M14

CI

FI

OF 0,18

1,71

1,18

1,01

0,77

0,11

1,30

1,11

0,86

1,10

+

+

+

1,57

0,53

0,55

1,69

10,29

0,75

0,043

1,89

0,077

1,02

0,083

1,42

Viên nang mềm

0,046

1,37

0,069

1,10

0,047

2,02

Dung dịch uống

0,037

2,02

0,042

1,93

0,19

1,89

Viên nang mềm

0,56

1,18

0,29

1,02

1,63

0,74

M

5,86

KÈ

M12

+

0,92

Y

nang cứng

QU

M8

+

8,73

0,58

0,57

1,94

0,73

NH

Viên

-

0,68

ƠN

-

AL

M2

1,68

53

2,12

0,18

1,62

M16

Viên nang mềm

0,039

1,87

0,015

1,45

M17

Trà hòa tan

+

M18

Bột

3,20

M19

Cốm

-

M20

Viên nang cứng

+

6,83

1,05

1,12

0,99

1,68

+

+

NH

Y QU

M KÈ Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu viên nang mềm (M3)

1,07

0,048

-

Hình 3.12. Sắc ký đồ mẫu viên nang cứng (M1)

DẠ Y

0,024

-

Ghi chú: “-” :Dưới LOD. “+”: Phát hiện được nhưng dưới LOQ

54

0,23

FI 0,46

ƠN

0,29

OF

+

AL

0,049

CI

M15

Viên nang mềm

AL CI FI

ƠN

OF

Hình 3.14. Sắc ký đồ mẫu cao lỏng (M2)

QU

Y

NH

Hình 3.15. Sắc ký đồ mẫu viên nang mềm (M5)

Hình 3.16. Sắc ký đồ mẫu Viên nang mềm (M15) Qua kết quả phân tích 20 mẫu thực tế cho thấy phương pháp đã xây dựng

M

có độ lặp tốt, giá trị RSD đạt yêu cầu theo AOAC, trên sắc ký đồ của dung dịch thử các chất phân tích tách hoàn toàn khỏi các pic tạp. Kết cho thấy hàm

KÈ

lượng 4 chất nghiên cứu trong các mẫu TPBVSK rất khác nhau: R1 từ 0,066 mg đến 1,57 mg trong 1 g chế phẩm, Rg1 từ 0,037 mg đến 5,86 mg trong 1 g chế phẩm, Re từ 0,015 mg đến 6,92 mg trong 1 g chế phẩm, Rb1 từ 0,024 mg

DẠ Y

đến 10,29 mg trong 1 g chế phẩm. Thậm chí, 01 mẫu còn không phát hiện thấy R1 (< LOD), 02 mẫu còn không phát hiện thấy Rg1 và Re (< LOD); một số mẫu (M17, M20, M9) hàm lượng hoạt chất rất thấp (< LOQ). Trong đó,

55

AL

các mẫu M5, M9, M19 không đạt yêu cầu chất lượng theo công bố sản phẩm trên nhãn. Từ đó cho thấy cần tăng cường kiểm soát chất lượng các sản phẩm

DẠ Y

KÈ

M

QU

Y

NH

ƠN

OF

FI

CI

công bố có Tam thất và Nhân sâm là cần thiết.

56

AL

Chương 4. BÀN LUẬN

Vận dụng những kiến thức về cấu trúc hóa học, tính chất vật lý của

CI

notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re, ginsenosid Rb1, những lý

thuyết cơ bản, đồng thời tham khảo các nghiên cứu đã công bố, chúng tôi đã

FI

xây dựng được phương pháp phân tích định lượng notoginsenosid R1 và các ginsenosid trong TPBVSK bằng HPLC sử dụng detector DAD. Phương pháp

OF

được thẩm định đầy đủ và đạt các yêu cầu của một phương pháp phân tích theo hướng dẫn hiện hành của AOAC. Kết quả áp dụng phương pháp trong nghiên cứu mẫu thực cho thấy phương pháp đã xây dựng là phù hợp và có

ƠN

tính khả thi. Từ quá trình thực nghiệm chúng tôi có một số bàn luận sau: 4.1. Về đối tượng và phương pháp nghiên cứu:

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1,

NH

ginsenosid Re, ginsenosid Rb1 thành phần chủ yếu của Tam thất và Nhân sâm là nguyên liệu quý để sản xuất các sản phẩm TPBVSK hiện đang được sử dụng rộng rãi trên thị trường, được nhiều đối tượng sử dụng khác nhau. Vì

Y

vậy, việc xác định hàm lượng các chất này đóng vai trò quan trọng trong việc

QU

đánh giá chất lượng sản phẩm của các cơ sở sản xuất và của các cơ quan quản lý. Tuy nhiên hiện nay các dược điển chỉ có chuyên luận riêng cho các dược liệu Nhân sâm, Tam thất hoặc cao Nhân sâm, những nghiên cứu đã công bố chủ yếu tập trung vào dược liệu, với đối tượng TPBVSK chỉ thấy thực hiện

M

trên sản phẩm chứa Nhân sâm. Trong nghiên cứu này tiến hành nghiên cứu

KÈ

phương pháp định lượng các hoạt chất điển hình của Nhân sâm và Tam thất hay được công bố để có thể ứng dụng phân tích chất lượng đồng thời các mẫu TPBVSK chứa Nhân sâm, TPBVSK chứa Tam thất hoặc chứa cả hai dược

DẠ Y

liệu trên thị trường Việt Nam. Tiến hành theo ISO IEC 17025 hướng dẫn thi hành ở Việt Nam (ARL 05) khi xây dựng phương pháp cho các sản phẩm TPBVSK phải thực hiện ít nhất 3 nền mẫu đại diện cho bản chất đối tượng thử dạng bào chế rắn, lỏng, dầu. Vì vậy, kết quả nghiên cứu có thể cung cấp 57

AL

cho các phòng thí nghiệm qui trình tham khảo để tiết kiệm chi phí trong thẩm định khi xây dựng phương pháp định lượng đồng thời các hoạt chất trong chế

CI

phẩm TPBVSK chứa Nhân sâm và Tam thất.

Lựa chọn phương pháp phân tích là HPLC với detector DAD là phương

FI

pháp hiện đại, có độ nhạy và độ chính xác cao, được sử dụng rộng rãi hiện nay, đồng thời phương pháp này cũng phù hợp với điều kiện trang thiết bị

OF

của nhiều phòng thí nghiệm ở Việt Nam hiện nay. Pha động sử dụng hệ dung môi acetonitril - nước rửa giải theo chương trình gradient trong 80 phút tiết kiệm thời gian hơn so với chương trình dung môi của các dược điển Việt

ƠN

Nam, Hồng Kông, Trung Quốc chuyên luận Nhân sâm (100 phút) [1,17,35].

Các sản phẩm TPBVSK có nền mẫu phức tạp, hàm lượng hoạt chất thường nhỏ, kết hợp với bước sóng phát hiện của các chất phân tích thấp. Vì

NH

vậy việc xây dựng quy trình xử lý mẫu cho tỷ lệ thu hồi cao và ổn định đóng một vai trò rất quan trọng trong phân tích các chất. Sau quá trình khảo sát, đã lựa chọn được quy trình chiết mẫu bằng cách siêu âm với methanol 90%, làm

Y

sạch và làm giàu mẫu bằng cách chiết qua cột chiết pha rắn. Phương pháp

QU

chiết này cho thấy mẫu sau khi chiết độ thu hồi cao, ổn định và có độ tinh sạch mẫu (đường nền ít nhiễu) đáp ứng tốt khi sử dụng phương pháp phân tích HPLC. So với các nghiên cứu định lượng ginsenosid trong TPBVSK chứa Nhân sâm của Nguyễn Thị Hạnh và cộng sự (2016) [7], Nguyễn Minh

M

Đức và cộng sự (2019) [6], Wenkui Li & John F. Fitzloff (2002) [45] sử dụng

KÈ

dung môi hữu cơ như ether, n-hexan để loại dầu, n-butanol để chiết mẫu thì phương pháp chiết qua cột chiết pha rắn nhanh và ít độc hơn. Tuy nhiên phương pháp này cũng có nhược điểm là chi phí cao hơn.

DẠ Y

4.2. Về kết quả thẩm định phương pháp: Nghiên cứu được tiến hành trên mẫu thực của ba dạng bào chế viên nang

cứng, cao lỏng, viên nang mềm. Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp đã

58

AL

xây dựng đạt yêu cầu về độ đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác phù hợp với các yêu cầu của AOAC.

CI

Giá trị LOQ của các chất phân tích từ 3,3 - 4,6 µg/ml tương ứng với 7,11 - 22,98 µg/g chế phẩm, thấp hơn so với nghiên cứu của Đào Văn Đôn và cộng

FI

sự (2014) (có LOQ là 6 - 8 µg/ml) [5], của Nguyễn Thị Hạnh và cộng sự (2016) (có LOQ dạng rắn là 30 µg/g chế phẩm) [7]. Đồng thời, khoảng tuyến

OF

tính của phương pháp (từ 4 - 400 µg/ml) rộng hơn so với các dược điển và các nghiên cứu [5,6,7,8,44,45] khi sử dụng cùng kỹ thuật HPLC-UV, phù hợp để định lượng R1, Rg1, Re và Rb1 nếu có trong mẫu thử.

ƠN

Độ thu hồi của phương pháp được đánh giá tại mức nồng độ LOQ, điểm giữa và điểm cao nhất của đường chuẩn bằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu trắng của 3 nền mẫu rắn, lỏng, dầu, kết quả thu được cho thấy phương

NH

pháp có độ thu hồi tương đối tốt. Tại mức nồng độ LOQ độ thu hồi các chất phân tích đạt từ 86,2 - 96,7%, tương tự như nghiên cứu của Zhijiang Wu và cộng sự (2017) khi thực hiện thu hồi tại mức nồng độ tương tự nồng độ LOQ

Y

của chúng tôi, độ thu hồi các chất chất phân tích trong mỹ phẩm đạt từ 80,9 -

QU

93,0% bằng UPLC-MS/MS [53]. Tại các mức nồng độ khác độ thu hồi các chất đạt từ 95,3 - 105,3%, RSD nằm trong khoảng từ 0,48 - 2,28%. Kết quả thu được tương đương với nghiên cứu của Wan JB và cộng sự (2006) khi định các ginsenosid trong mẫu dược liệu Tam thất bằng HPLC - ELSD (93,1 -

M

105,1% đối với R1, Rg1, Re, Rb1) [43] và nghiên cứu của Zhenzhong Yang

KÈ

và cộng sự (2017) định lượng 05 saponin trong mẫu dược liệu Tam thất bằng HPLC - UV (95,77 - 104,85%) [52]. So với nghiên cứu của Wenkui Li và John F. Fitzloff (2002) (RSD từ 0,52 - 3,31%) định lượng ginsenosid trong

DẠ Y

TPBVSK chứa Nhân sâm bằng HPLC - UV [45] phương pháp đã nghiên cứu có độ thu hồi ổn định hơn. Độ chính xác của phương pháp có RSDr đạt từ 1,41 - 2,91% (yêu cầu <

4%) và RSDR đạt từ 1,29 - 3,23% (yêu cầu < 8%). Kết quả cho thấy phương 59

AL

pháp có độ lặp tốt và ổn định hơn nghiên cứu định lượng ginseosid Rg1, Rb1

trong TPBVSK chứa Nhân sâm của Nguyễn Thị Hạnh (2016) (RSD từ 1,03 -

CI

5,17%) [7].

4.3. Về ứng dụng phân tích mẫu thực tế:

FI

Ứng dụng phương pháp xây dựng được định lượng các chất nghiên cứu trong 20 mẫu TPBVSK: 01 mẫu chứa đồng thời cả Nhân sâm, Tam thất và 05

OF

dược liệu khác; 09 mẫu chứa Tam thất và có thêm ít nhất 02 dược liệu khác; 10 mẫu chứa nhân sâm có thêm một số vitamin và các dược liệu khác, ở các dạng bào chế bột, hoàn cứng, cốm hòa tan, trà túi lọc, viên nang cứng, cao

ƠN

lỏng, dung dịch uống, viên nang mềm, các kết quả đạt được như sau: Hàm lượng ginsenosid R1 trong các mẫu dao động từ hàm lượng thấp nhất định lượng được đến 1,57 mg/g chế phẩm, RSD < 1,8%. Hàm lượng

NH

ginsenosid Rg1 trong các mẫu dao động từ hàm lượng thâp nhất định lượng đến 5,86 mg/g chế phẩm, RSD < 2,12%. Hàm lượng ginsenosid Re trong các mẫu dao động từ hàm lượng thâp nhất định lượng đến 6,83 mg/g chế phẩm,

Y

RSD < 2,91%. Hàm lượng ginsenosid Rb1 trong các mẫu dao động từ hàm

QU

lượng thấp nhất định lượng đến 10,29 mg/g chế phẩm, RSD < 2,16%. Kết quả thu được đã minh chứng cho phương pháp có đủ độ chọn lọc và độ tin cậy để định lượng các chất nghiên cứu trong TPBVSK. Trong 20 mẫu đã phân tích có 02 mẫu không đạt yêu cầu về hàm lượng

M

R1, 04 mẫu không đạt yêu cầu về hàm lượng Rg1, Re, 03 mẫu không đạt yêu

KÈ

cầu hàm lượng Rb1. Từ đó cho thấy cần phải quản lý, kiểm tra chặt chẽ chất lượng các chế phẩm chứa Nhân sâm, Tam thất lưu hành trên thị trường để đảm bảo quyền lợi người tiêu dùng.

DẠ Y

Hiện nay Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm Hà Nội

đã ứng dụng kết quả nghiên cứu ban hành thường quy kỹ thuật “Xác định hàm lượng notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re, ginsenosid Rb1 trong TPBVSK bằng HPLC” (TQKT/HL/036) để kiểm tra chất lượng các 60

AL

mẫu TPBVSK chứa Nhân sâm, Tam thất được các cơ sở gửi đến trung tâm, góp phần vào công tác đảm bảo chất lượng sản phẩm.

CI

Trong khuôn khổ đề tài này, do số lượng mẫu phân tích chưa nhiều, do đó chưa thể đưa ra nhận xét một cách khách quan tình hình chất lượng

FI

TPBVSK chứa Nhân sâm và Tam thất trên thị trường. Chúng tôi sẽ tiến hành thử nghiệm với số lượng mẫu lớn hơn trong các nghiên cứu tiếp theo để có

OF

thể đánh giá được chất lượng các sản phẩm chứa Nhân sâm và Tam thất một

DẠ Y

KÈ

M

QU

Y

NH

ƠN

cách tổng quát và khách quan hơn.

61

AL

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Từ kết quả thu được, chúng tôi có những kết luận sau:

CI

Kết luận

FI

1. Đã xây dựng được phương pháp định lượng notoginsenosid R1 và các ginsenoside Rg1, Re, Rb1 trong TPBVSK (mẫu rắn, mẫu dạng dầu và dạng

OF

lỏng) bằng HPLC - DAD. Mẫu thử được chiết bằng dung môi methanol 90% làm sạch bằng SPE cột SilactSPETM C18, hiệu suất chiết với cả 4 chất đạt đều lớn hơn 95%. Các chất phân tích được tách bằng cột InertSustain C18 (250 x

ƠN

4,6 cm; 5 µm), pha động sử dụng hệ dung môi acetonitril - nước rửa giải theo chương trình gradient trong 80 phút, phát hiện ở bước sóng 203 nm. Các chất được tách rõ ràng, pic cân xứng, pha động dễ chuẩn bị, phù hợp với nhiều

NH

phòng thí nghiệm.

2. Phương pháp đã được thẩm định đầy đủ các chỉ tiêu theo qui định của AOAC trên cả 3 nền mẫu. Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp đảm bảo

Y

độ chọn lọc; độ nhạy cao (LOQ các chất trong khoảng 3,3 - 4,6 µg/ml); khoảng tuyến tính rộng (4,0 - 400,0 µg/ml) đối với cả 4 chất nghiên cứu với

QU

R2 > 0,999 cho phép phân tích các mẫu với hàm lượng khác nhau từ 20 g/g 2000 µg/g chế phẩm ; độ thu hồi tốt ở cả 3 mức nồng độ khảo sát (từ 87,55% đến 103,53%) đạt yêu cầu theo AOAC; độ chính xác trong ngày và khác ngày

M

đáp ứng yêu cầu đối với cả 4 chất nghiên cứu (RSD từ 1,80 - 2,91%).

KÈ

3. Đã ứng dụng phương pháp phân tích được 20 mẫu TPBVSK lưu hành trên thị trường gồm các dạng bào chế bột, hoàn cứng, cốm hòa tan, trà túi lọc, viên nang cứng, cao lỏng, dung dịch uống, viên nang mềm. Kết quả thu được

DẠ Y

đã minh chứng cho phương pháp có đủ độ chọn lọc và độ tin cậy để định lượng các chất nghiên cứu trong TPBVSK, góp phần vào công tác đảm bảo chất lượng các sản phẩm chứa Nhân sâm và Tam thất lưu hành trên thị trường Việt Nam. 62

AL

Kiến nghị

- Tiếp tục ứng dụng phương pháp đã xây dựng định lượng R1, Rg1, Re, Rb1

CI

trong các sản phẩm chứa Nhân sâm và Tam thất trong quá trình sản xuất và các chế phẩm lưu hành trên thị trường.

FI

- Nghiên cứu phát triển phương pháp mở rộng đối tượng với các hoạt chất ginsenosid Rf, R3, Rd và majonosid R2 để xây dựng được quy trình định

OF

lượng đồng thời Nhân sâm, Hồng sâm, Tam thất, Sâm Ngọc linh…ở các

DẠ Y

KÈ

M

QU

Y

NH

ƠN

dạng bào chế, chế biến khác nhau trong TPBVSK.

63

4.

5.

CI

FI

KÈ

M

7.

QU

Y

6.

OF

3.

ƠN

2.

Tiếng Việt Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam lần xuất bản thứ năm, NXB Y học, Hà Nội, tập 2, tr. 1279-1280, tr 1313-1314, tr.1321-1322. Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr.289-290.

Nguyễn Thượng Dong, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hương (2007), Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ Nhân sâm, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. tr.15-41.

Trung tâm Thông tin Khoa học và Công nghệ (2013), Báo cáo chuyên đề Điều chế và thiết lập chất chuẩn từ thiên nhiên để phục vụ công tác nghiên cứu kiểm nghiệm và tiêu chuẩn hóa dược liệu, đông dược, TP Hồ Chí Minh. Đào Văn Đôn, Nguyễn Chu Huy, Trịnh Nam Trung, Vũ Bình Dương, Nguyễn Văn Bạch (2014), “Nghiên cứu định lượng đồng thời ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd trong viên nang cứng Ukata bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”, Tạp chí Y dược học quân sự, Tập 1, tr.42-48.

Nguyễn Minh Đức, Nguyễn Thị Tú Nhi, Nguyễn Trường Huy, Huỳnh Trần Quốc Dũng, Vũ Huỳnh Kim Long, Nguyễn Minh Cang, Vũ Duy Dũng (2018), “Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời các saponin chính trong sâm Việt Nam bằng HPLC-CAD”, Tạp chí Dược liệu, Tập 23 (số 6), tr.345-350.

Nguyễn Thị Hạnh (2016), Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định một số ginsenosid trong thực phẩm chức năng chứa Nhân sâm (panax ginseng), Luận văn thạc sỹ khoa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Quách Thanh Tâm, Nguyễn Đoàn Diễm Ngọc, Lê Thị Ngọc Hạnh (2019), “Xây dựng quy trình xác định các ginsenosid trong sản phẩm bổ sung sâm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần (LC-MS/MS), Tạp chí Y Học TP. Hồ Chí Minh, Phụ Bản Tập 23 (số 5), tr.572-578.

Nguyễn Việt Thúy (2017), Nghiên cứu phân lập và tinh chế notoginsenosid r1 từ nguyên liệu saponin toàn phần của tam thất làm

NH

1.

DẠ Y

8.

9.

AL

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Y

KÈ

15.

QU

14.

Tiếng Anh AOAC - Appendix K (2013): Guidelines for Dietary Supplements and Botanicals - Part I: AOAC Guidelines for Single-Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals.

B.S. Zhao, Y. Liu, X.Y. Gao, H.Q. Zhai, J.Y. Guo, X.Y. Wang (2014), “Effects of ginsenosid Rg1 on the expression of toll-like receptor 3, 4 and their signaling transduction factors in the NG108-15 murine neuroglial cell lineˮ, Molecules, 19 (10), pp. 16925-16936 Bo Ma, Xiangbao Meng, Jing Wang, Jing Sun, Xiaoyu Ren, Meng Qin, Jie Sun, Guibo Sun, Xiaobo Sun (2014), “Notoginsenoside R1 attenuates amyloid-β-induced damage in neurons”, International Immunopharmacology, 22, pp.151- 159.

C.H. Lee, J.H. Kim (2014), “A review on the medicinal potentials of ginseng and ginsenosid on cardiovascular diseasesˮ, Journal of Ginseng Research, 38, pp. 161-166.

M

13.

NH

ƠN

OF

FI

CI

AL

chất chuẩn phục vụ công tác kiểm nghiệm, Luận văn thạc sỹ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội.

10. Nguyễn Quang Tuyển (2017), Nghiên cứu chiết tách một số hoạt chất trong củ Tam thất trồng ở Sapa, Việt Nam và khả năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, Luận án tiến sĩ chuyên ngành Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội.

11. Trần Bảo Trâm, Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Thị Thanh Mai, Trương Thị Chiên, Phạm Thế Hải, Phạm Hương Sơn (2017), “Đánh giá sinh trưởng và thành phần hoạt chất của Sâm việt nam (Panax vietnamensis) trồng ở Quảng Nam”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 33 (số 2S), tr. 227-232.

12. Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật, NXB Khoa học và kỹ thuật, tr.31.

DẠ Y

16.

DẠ Y

KÈ

M

QU

Y

NH

ƠN

OF

FI

CI

AL

17. Department of Health Government of the Hong Kong Special Administrative Region (2005), Hong Kong Chinese Materia Medica Standards, Vol 1, pp.68-77, pp. 80 -89, Vol 9, pp.138-150.

18. E.J. Koh, K.J. Kim, J. Choi, H.J. Jeon, M.J. Seo, B.Y. Lee (2017), “Ginsenosid Rg1 suppresses early stage of adipocyte development via activation of C/EBP homologous protein-10 in 3T3-L1 and attenuates fat accumulation in high fat diet-induced obese zebrafishˮ, Journal of Ginseng Research, 41, pp. 23-30.

19. F.Y. Xu, W.Q. Shang, J.J. Yu, Q. Sun, M.Q. Li, J.S. Sun (2016), “The antitumor activity study of ginsenosid and metabolites in lung cancer cellˮ, Am J Transl Res, 8, pp. 1708-1718.

20. Hong-Sheng Zhang, Sheng-Qi Wang (2006), “Notoginsenoside R1 from Panax notoginseng inhibits TNF-a-induced PAI-1 production in human aortic smooth muscle cells”, Vascular Pharmacology, 44, pp. 224-230.

21. Hong-Sheng Zhang, Sheng-Qi Wang (2006), “Notoginsenoside R1 inhibits TNF-α-induced fibronectin production in smooth muscle cells via the ROS/ERK pathway”, Free Radical Biology & Medicine, 40 pp.1664-1674.

22. Il-Woung Kim, Hee-Do Hong, Sang Yoon Choi, Da-Hye Hwang, Youl Her, and Si-Kwan Kim (2011 November), “Characterizing a Full Spectrum of Physico-Chemical Properties of Ginsenosid Rb1 and Rg1 to Be Proposed as Standard Reference Materials”, Journal of ginseng research, 35(4), pp.487-496.

23. In-Ho Baeg and Seung-Ho So (2013), “The world ginseng market and the ginseng (Korea)ˮ, J Ginseng Res, 37(1), pp.1-7.

24. J.S. Choi, K.S. Chun, J. Kundu, J.K. Kundu (2013), “Biochemical basis of cancer chemoprevenion and or chemotherapy with ginsenosidˮ, International Journal of Molecular Medicine, 32(6), pp.1227-1238.

25. Ji Hye Kim, Young-Su Yi, Mi-Yeon Kim , Jae Youl Cho, (2017), “Role of ginsenosides, the main active components of Panax ginseng, in inflammatory responses and diseases”, Journal of Ginseng Research, 41 (4), pp. 435-443.

DẠ Y

KÈ

M

QU

Y

NH

ƠN

OF

FI

CI

AL

26. Kwok HH, Chan LS, Poon PY, Yue PY, Wong RN. (2015 Sep), “Ginsenosid-Rg1 induces angiogenesis by the inverse regulation of MET tyrosine kinase receptor expression through miR-23a”, Toxicol Appl Pharmacol, 15;287(3), pp.276-83.

27. Liu J.J., Wang Y.T., Qiu L., Yu Y.Y., Wang C.M. (2014), “Saponins of Panax notoginseng: chemistry, cellular targets and therapeutic opportunities in cardiovascular diseases”, Expert Opin Investig Drugs, 23, pp.523-539.

28. Liu, Hai & Yang, Jianqiong & Yang, Wanqing & Hu, Shaonan & Wu, Yali & Zhao, Bo & Hu, Haiyan & Du, Shouying (2020), “Focus on Notoginsenosid R1 in Metabolism and Prevention Against Humanˮ, Diseases, Drug Design, Development and Therapy, 14, pp. 551-565.

29. Lu H, Zhou X, Kwok HH, Dong M, Liu Z, Poon PY, Luan X, NgokShun Wong R. (2017 Nov ), “Ginsenosid-Rb1-Mediated Antiangiogenesis via Regulating PEDF and miR-33a through the Activation of PPAR-γ Pathway”, Front Pharmacol, 13, pp.8-783.

30. Lu Peng, Shi Sun, Lai-Hua Xie, Sheila M Wicks, Jing-Tian Xie (2012), “Ginsenosid Re: Pharmacological Effects on Cardiovascular System”, Cardiovasc Ther, 30(4), pp.183-8.

31. Medicines and Healthcare products Regulatory Agency (2019), British Pharmacopoeia 2020, The Stationery Office, London. pp.248-251, pp.361-362.

32. PadmanabanMohanan, Sathiyamoorth Subramaniyam, RamyaMathiyalagan, Deok-ChunYang (2018), “Molecular signaling of ginsenosid Rb1, Rg1, and Rg3 and their mode of actions”, Journal of Ginseng Research, 42 (2), pp.123-132.

33. Peng M., Zhang T., Ding Y., Yi Y.X., Yang Y.J., Le J. (2016), “Structure-based prediction of CAD response factors of dammarane-type tetracyclic triterpenoid saponins and its application to the analysis of saponin contents in raw and processed Panax notoginseng”, RSC Adv, 6, pp.36987-37005.

DẠ Y

KÈ

M

QU

Y

NH

ƠN

OF

FI

CI

AL

34. Ping Su, ShijingDu, HangLi, ZhiLi, WenfengXin, WenshengZhang (2016), “Notoginsenoside R1 inhibits oxidized low-density lipoprotein induced inflammatory cytokines production in human endo the lialEA.hy926 cells”, European Journal of Pharmacology, 770, pp.9-15.

35. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China, (2015).

Pharmacopoeia Commission of PRC, Vol. Ia, pp. 217-220, pp. 313-314.

36. S.A. Nag, J.J. Qin, W. Wang, M.H. Wang, H. Wang, R. Zhang (2012), “Ginsenosid as anticancer agents: in vitro and in vivo activities, structure–activity relationships, and molecular mechanisms of actionˮ, Front Pharmacol, 3 , pp.1-18.

37. S.F. Nabavi, A. Sureda, S. Habtemariam, S.M. Nabavi (2015), “Ginsenosid Rd and ischemic stroke; a short review of literaturesˮ, J Ginseng Res, 39, pp. 299-303.

38. Sun S., Wang C., Tong R., Li X., Fishbein A., Wang Q., He T., Du W., Yuan C.S. (2010) “Effects of steaming the root of Panax notoginseng on chemical composition and anticancer activities”, Food Chem,118, pp.307-314.

39. T. Ahmed, S.H. Raza, A. Maryam, W.N. Setzer, N. Braidy, S.F. Nabavi, M.R. de Oliveira, S.M. Nabavi (2016), “Ginsenosid Rb1 as a neuroprotective agent: a reviewˮ, Brain Res Bull, 125, pp. 30-43 40. T.H. Lan, Z.W. Xu, Z. Wang, Y.L. Wu, W.K. Wu, H.M. Tan (2011), “Ginsenosid Rb1 prevents homocysteine-induced endothelial dysfunction via PI3K/Akt activation and PKC inhibitionˮ, Biochem Pharmacol, 82, pp. 148-155.

41. U.S. Pharmacopeia National Formulary USP 43 NF 38 (2020). pp.47744775.

42. Wan J.B., Yang F.Q., Li S.P., Wang Y.T., Cui X.M. (2006), “Chemical characteristics for different parts of Panax notoginseng using pressurized liquid extraction and HPLC-ELSD”, J Pharmaceut Biomed, 41, pp.15961601.

43. Wan JB, Li P, Li S, Wang Y, Dong TT, Tsim KW. (2006), “Simultaneous determination of 11 saponins in Panax notoginseng using

47.

AL

OF

KÈ

50.

M

49.

QU

Y

48.

ƠN

46.

NH

45.

FI

CI

44.

HPLC-ELSD and pressurized liquid extraction”, J Sep Sci, 29 (14), pp.

2190-2196.

Wei Chen, Dang Yunjie, Chuanyan Zhu (2010), "Simultaneous determination of three major bioactive saponins of Panax notoginseng using liquid chromatography-tandem mass spectrometry and a pharmacokinetic study", Chinese Medicine, 5 (12), pp.1-6.

Wenkui Li & John F. Fitzloff (2002), “HPLC determination of ginsenosides content in ginseng dietary supplements using ultraviolet detection”, Journal of liquid chromatography & technologies, 25 (16), pp. 2485-2500.

Wilson WB, Sander LC (2018), “Method development for the certification of a ginsenosid calibration solution via liquid chromatography with absorbance and mass spectrometric detection”, Journal of Chromatography A, 1574, pp. 114-121.

X. Jin, D.B. Che, Z.H. Zhang, H.M. Yan, Z.Y. Jia, X.B. Jia (2015), “Ginseng consumption and risk of cancer: a meta-analysisˮ, J Ginseng Res, 40, pp. 269-277.

X.D. Yang, Y.Y. Yang, D.S. Ouyang, G.P. Yang (2015), “A review of biotransformation and pharmacology of ginsenosid compound Kˮ, Fitoterapia, 100, pp. 208-220.

X.J. Chen, X.J. Zhang, Y.M. Shui, J.B. Wan, J.L. Gao (2016), “Anticancer activities of protopanaxadiol- and protopanaxatriol-type ginsenosid and their metabolitesˮ, Evid Based Complement Alternat Med, 2016, pp 1-19.

Y.J. Kim, D. Zhang, D.C. Yang (2015), “Biosynthesis and biotechnological production of ginsenosidˮ, Biotechnol Adv, 33, pp.717735.

Yi Liu, Zhen Lin, Jing Guo, Jianzhi Chen, Gang Wu (2016), “Effect of notoginsenoside r1 on osteoblastogenesis in vitro”, Journal of Orthopaedic Translation, 7, pp.76-81.

Zhenzhong Yang, Jieqiang Zhu, Han Zhang, and Xiaohui Fan (2018 Jul) “Investigating chemical features of Panax notoginseng based on

DẠ Y

51.

52.

DẠ Y

KÈ

M

QU

Y

NH

ƠN

OF

FI

CI

AL

integrating HPLC fingerprinting and determination of multiconstituents by single reference standard” J Ginseng Res, 42(3), pp.334 -342.

53. Zhijiang Wu, Ying Peng, Yingpeng Huo, Yanwu Chen, Fenghui Lu, Qi Peng and Yingying Liang (2017), “Simultaneous determination of ginsenosid Rg1, Re, Rb1 and notoginsenosid R1 by solid phase extraction followed by UHPLC-MS/MS and monitoring their concentrations in various kinds of cosmeticsˮ, Analytical methods, 9(37), pp. 5441-5448.

54. http://www.drugbank.ca/drugs/14/8/2020 55. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/14/8/2020

AL

PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1 - THÔNG TIN MẪU THỰC Mã hóa

Tên mẫu

Nguồn gốc

Thành phần

Công bố sản phẩm

CI

STT

M1

Viên nang CT CP sản cứng Brain xuất dược Ginci liệu trung ương 28

Tam thất 100 mg, cao lá Tam thất: Bạch quả, cao Việt quất, Dương tính magnesi, citicolin, vitamin B1, vitamin B6, magnesi stearat, methyl paraben, propyl paraben, polyvinylpyrrolidone (PVP), talc vừa đủ 1 viên.

2.

M2

Cao lỏng CTCP Tam thất thương mại VNP

Tam thất 2 g/90 ml, Táo đỏ Hàn Quốc, Nước tinh khiết

3.

M3

Viên nang CT TNHH mềm Medistar Vietlife Việt Nam Bình An Nano

4.

M4

Bột Tam Công ty Tam thất 100 g/lọ thất Hoa TNHH DP Pharm Amepro

5.

M5

6.

M6

ƠN

OF

FI

1.

QU

Viên nang CT CPDP mềm Nano High Tech curcumin USA Gold

Nano Curcumin 250 mg, Piperin 2 mg, Xạ đen 5 mg, Tam thất 5 mg, Coenzym Q10 1 mg, phụ liệu vừa đủ 1 viên

Viên nang CT Rostec mềm Nano pharma curcumin USA tex

Nano Curcumin 200 mg, Piperin 2 mg, cao khô Trinh nữ hoàng cung 20

M

KÈ DẠ Y

Y

NH

Tam thất 125 mg, Ginkgo Tam thất: biloba, rutin, gelatin, sáp Dương tính ong trắng, sorbitol, dầu đậu nành, dầu cọ, lecithin, glycerin vừa đủ 1 viên.

mg, cao Bạch hoa xà diệt thảo 14 mg, cao Xạ đen 7 mg, bột Tam thất 20 mg coenzym Q10 1 mg, phụ liệu vừa đủ 1 viên

PL1

Tổng R1+Rg1+Rb1 ≥ 50 mg/g

Viên nang Công ty Cao Trinh nữ hoàng cung cứng Trinh TNHH TM 2000 mg, cao Lá đu đủ nữ Tam thất & ĐT Hoa 1000 mg, Nghệ vàng: 150 Sen mg, Tam thất: 150 mg, phụ liệu vừa đủ 1 viên (850 mg/viên)

8.

M8

Viên cứng

Tổng R1+Rg1+Rb1 ≥ 6 mg/viên

AL

M7

CI

7.

phẩm Trường Thọ

đen 200 mg, phụ liệu vừa đủ 1 viên.

OF

thất Xạ đen

FI

nang Công ty Tam thất bột 300 mg, cao Tam CP Dược Đan sâm 200 mg, cao Xạ

M9

Trà Tam Học viện Gói 2 g chứa: Tam thất 1,0 Tổng Thất Xạ đen Quân y g, Xạ đen 0,5 g, Hoa hòe R1+Rg1+Rb1 0,45 g, Tiêu hồi 0,05 g. ≥ 40 mg/gói

10.

M10

Viên Thất Sâm

12.

M12

13.

M13

NH

M11

Tam CTCP TM Tam thất 100 g, Hồng sâm Hồng dịch vụ 40 g, Nấm linh chi 20 g, Mật Good life Nghệ đen 10 g, dược liệu

Ong Rừng

Việt nam

khác vừa đủ 10 g

Viên nang mềm HHPGold red ginseng

Công ty CP Dược phẩm Hoapharm USA

Nhân sâm 14 mg, Linh chi Ginsenoside ≥ 12 mg, Nhung hươu 12 190 µg/viên mg, Sữa ong chúa 8 mg, phụ liệu vừa đủ 1 viên

CT TNHH DP Amepro Việt Nam

Cao Nhân sâm 25 mg, Nhung hươu 12,17 mg, cao Linh chi 22 mg, Sữa ong chúa 8,2 mg, phụ liệu vừa đủ 1 viên

Korea Ginseng Biosience Co., Ltd

Chiết xuất hồng sâm (Sapoin hơn 50mg/g , hơn 60% chất rắn)

QU

Y

11.

ƠN

9.

Dung dịch uống Korean red Ginseng extract everyone

DẠ Y

KÈ

M

Viên nang mềm Koreking gold

PL2

M14

Viên nang CTTNHH mềm thảo dược Masuryto Thanh Hằng

Cao Nhân sâm 100mg, Ginsenosid ≥ CaHPO4 200 mg, MgO 20 120 µg/viên mg, ZnO 20 mg, Đông trùng hạ thảo 20 mg, Vitamin B5, PP, E, B1, B2, B6, A, D, B12, phụ liệu vừa đủ 1 viên (1250 mg/viên)

15.

M15

Viên nang CT TNHH mềm DP Goldbiligin Amepro Việt Nam

Hồng sâm 43,50 mg, Ginsenosid ≥ Nhung hươu 30,45 mg, 88 µg/viên phụ liệu vừa đủ 1 viên (1250 mg/viên)

16.

M16

Viên nang CT TNHH mềm DP Sapugin Amepro Việt Nam

Nhân sâm 12,06 mg, Nhân sâm: Nhung hươu 12,17 mg, Dương tính Linh chi 10,09 mg, Sữa ong chúa 8,2 mg, phụ liệu vừa đủ 1 viên

17.

M17

Trà sâm AK

18.

M18

Bột H20.28

19.

M19

QU

M20

CI

FI

OF

ƠN

NH

CTCP sản Tinh chất Nhân xuất dược đường vừa đủ 2 g liệu trung ương 28

sâm,

Y

Cốm sâm Quốc

M KÈ DẠ Y

20.

AL

14.

Rg1: 100 - 1000 mg/100g.

Rb1: 20 - 200 mg/100g.

Trà Korea Hàn Ginseng natural food

Tinh chất Nhân đường vừa đủ 2 g

Viên nang cứng Đen tóc Hán Phương

VKN ATTP Quốc gia

CT TNHH DP Amepro Việt Nam

Rg1: 352,0 mg/100g Rb1: 95,2 mg/100g

sâm, Ginsenosid ≥ 20 µg/gói

Nhân sâm 10 mg, Hà Thủ Nhân sâm: ô đỏ 100 mg, Xuyên Dương tính khung 50 mg, Thục địa 50 mg, Mã đề 30 mg, Bạch thược 30 mg, Vitamin B5, B6, H

PL3

AL

PHỤ LỤC 2 - KẾT QUẢ CHI TIẾT LOD, LOQ CỦA PHƯƠNG PHÁP Đường chuẩn:

CI

R1: y = 3751 x + 1347 Rg1: y = 4538 x - 4847

FI

Re: y = 4156 x + 597 Rb1: y = 2624 x + 1361 Thử 2

Thử 3

2,0112

2,0137

2,1003

37106

35545

47,40

45,28

ƠN

R1

Lượng cân (g) Diện tích pic Lượng chất trong mẫu (µg/g)

Thử 1

Thử 4

Thử 5

Thử 6

2,0015

2,0323

2,0111

35378

38190

37424

37757

43,20

49,08

47,33

48,27

NH

Hoạt chất

OF

PL2.1. Kết quả thẩm định LOD, LOQ của phương pháp nền mẫu rắn

DẠ Y

Re

41019

QU

KÈ

M

Rg1

Diện tích pic Lượng chất trong mẫu (µg/g)

Y

Trung bình: 46,76 µg/g chế phẩm; SD = 2,16 LOD: 1,3 µg/ml tương ứng với 6,47 µg/g chế phẩm LOQ: 4,3 µg/ml tương ứng với 21,57 µg/g chế phẩm R = 7,23

50,26

42775

42153

44990

44261

44305

52,12

49,32

54,87

53,25

53,86

Trung bình: 52,28 µg/g chế phẩm; SD = 2,15 LOD: 1,3 µg/ml tương ứng với 6,44 µg/g chế phẩm LOQ: 4,3 µg/ml tương ứng với 21,48 µg/g chế phẩm R = 8,11

Diện tích pic

36568

38283

36072

38491

37067

37748

Lượng chất trong mẫu (µg/g)

43,03

45,03

40,64

45,55

43,18

44,45

PL4

26606

27099

28162

49,66

47,78

46,70

51,03

AL

27131

FI

27570

48,32

26209

47,09

OF

Rb1

Diện tích pic Lượng chất trong mẫu (µg/g)

CI

Trung bình: 43,65 µg/g chế phẩm; SD = 1,78 LOD: 1,1 µg/ml tương ứng với 5,34 µg/g chế phẩm LOQ: 3,6 µg/ml tương ứng với 17,79 µg/g chế phẩm R = 8,18

ƠN

Trung bình: 48,43 µg/g chế phẩm; SD = 1,64 LOD: 1,0 µg/ml tương ứng với 4,93 µg/g chế phẩm LOQ: 3,3 µg/ml tương ứng với 16,44 µg/g chế phẩm R = 9,82

PL 2.2. Kết quả thẩm định LOD, LOQ của phương pháp mẫu dạng dầu

R1

Diện tích pic Lượng chất trong mẫu (µg/g)

Thử 2

2,0055

2,0157

38614 49,54

Thử 3

Thử 4

Thử 5

Thử 6

2,0583

2,0313

2,0401

2,0375

37497

37011

36753

36481

35561

47,81

46,19

46,47

45,91

44,77

NH

Lượng cân (g)

Thử 1

Y

Hoạt chất

QU

Trung bình: 46,78 µg/g chế phẩm; SD = 1,67 LOD: 1,0 µg/ml tương ứng với 5,01 µg/g chế phẩm LOQ: 3,3 µg/ml tương ứng với 16,69 µg/g chế phẩm R = 9,34

KÈ

M

Diện tích pic Lượng chất trong mẫu (µg/g)

DẠ Y

Rg1

Re

Diện tích pic

48739

45452

45351

44036

44457

44025

58,89

54,99

53,75

53,03

53,26

52,86

Trung bình: 54,46 µg/g chế phẩm; SD = 2,30 LOD: 1,4 µg/ml tương ứng với 6,89 µg/g chế phẩm LOQ: 4,6 µg/ml tương ứng với 22,98 µg/g chế phẩm R = 7,90 40450

38136

37889

PL5

36624

37292

37005

47,81

44,81

43,59

42,67

43,28

42,99

27570

26606

27099

49,66

47,78

46,70

28162

27131

OF

Rb1

Diện tích pic Lượng chất trong mẫu (µg/g)

FI

CI

Trung bình: 43,65 µg/g chế phẩm; SD = 1,78 LOD: 1,1 µg/ml tương ứng với 5,34 µg/g chế phẩm LOQ: 3,6 µg/ml tương ứng với 17,79 µg/g chế phẩm R = 8,18

AL

Lượng chất trong mẫu (µg/g)

51,03

48,32

26209 47,09

ƠN

Trung bình: 44,19 µg/g chế phẩm; SD = 1,92 LOD: 1,2 µg/ml tương ứng với 5,76 µg/g chế phẩm LOQ: 3,8 µg/ml tương ứng với 19,20 µg/g chế phẩm R = 7,67

Diện tích pic Lượng chất trong mẫu (µg/ml)

34157

Thử 3

Thử 4

Thử 5

Thử 6

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0

33305

33475

33937

34129

36952

17,49

17,13

17,38

17,48

18,98

17,04

Trung bình: 17,58 µg/ml chế phẩm; SD = 0,71 LOD: 1,1 µg/ml tương ứng với 2,13 µg/ml chế phẩm LOQ: 3,6 µg/ml tương ứng với 7,11 µg/ml chế phẩm R = 8,25

Diện tích pic

42543

45442

47177

46879

47523

46637

Lượng chất trong mẫu (µg/ml)

20,89

22,17

22,93

22,80

23,08

22,69

KÈ

DẠ Y

Rg1

5,0

Thử 2

Y

Thể tích (ml)

M

R1

Thử 1

QU

Hoạt chất

NH

PL 3.3. Kết quả thẩm định LOD, LOQ của phương pháp nền mẫu lỏng

PL6

40521

40746

40863

18,24

19,21

19,32

19,38

AL

41666

FI

38497

19,76

44376 21,07

OF

Re

Diện tích pic Lượng chất trong mẫu (µg/ml)

CI

Trung bình: 22,43 µg/ml chế phẩm; SD = 0,82 LOD: 1,2 µg/ml tương ứng với 2,45 µg/ml chế phẩm LOQ: 4,1 µg/ml tương ứng với 8,16 µg/ml chế phẩm R = 9,16

2183

23626

15,61

16,97

22317

24592

22195

22399

15,97

17,71

15,88

16,03

NH

Rb1

Diện tích pic Lượng chất trong mẫu (µg/ml)

ƠN

Trung bình: 19,50 µg/ml chế phẩm; SD = 0,92 LOD: 1,4 µg/ml tương ứng với 2,77 µg/ml chế phẩm LOQ: 4,6 µg/ml tương ứng với 9,22 µg/ml chế phẩm R = 7,05

DẠ Y

KÈ

M

QU

Y

Trung bình: 16,36 µg/ml chế phẩm; SD = 0,81 LOD: 1,2 µg/ml tương ứng với 2,42 µg/ml chế phẩm LOQ: 4,0 µg/ml tương ứng với 8,05 µg/ml chế phẩm R = 6,77

PL7

AL

PHỤ LỤC 3 – KẾT QUẢ CHI TIẾT ĐỘ ĐÚNG CỦA PHƯƠNG PHÁP Đường chuẩn:

CI

R1: y = 3751 x + 1347 Rg1: y = 4538 x - 4847

FI

Re: y = 4156 x + 597 Rb1: y = 2624 x + 1361

µg/ml

R1

µg/ml

M

µg/ml 50

KÈ

µg/ml 400

µg/ml

DẠ Y

(mg)

0,040

14842

0,040

14388

0,040

14551

4 µg/ml

Độ thu hồi

0,036

89,20

0,035

86,19

0,035

87,27

190319

0,504

100,0

187472

0,496

98,42

186478

0,494

97,89

1500572

3,997

99,09

1508756

4,019

99,63

4,033

1550518

4,130

102,39

0,040

11254

0,035

88,98

0,040

11603

0,036

90,91

0,040

10838

0,035

86,68

0,498

231742

0,521

104,60

0,498

223186

0,503

100,82

0,498

233012

0,524

105,16

3,988

1801461

3,981

99,83

3,988

1797774

3,973

99,62

3,988

1768875

3,909

98,02

0,040

15627

0,036

89,71

0,040

15828

0,037

90,91

0,040

15605

0,036

89,58

0,504 0,504 4,033

QU

µg/ml

Re

(mAU.s)

4,033

400

Rg1

Lượng tìm lại

0,504

50

4

Diện tích pic

ƠN

4

Lượng thêm vào (mg)

NH

Nồng độ phân tích

Y

Hoạt chất

OF

PL3.1. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp trên nền mẫu rắn

PL8

(%)

TB = 87,55% RSD = 1,74% TB = 98,74% RSD = 1,09% TB = 100,37% RSD = 1,76% TB = 88,86% RSD = 2,38% TB = 103,53% RSD = 2,28% TB = 99,16% RSD = 0,99% TB = 90,07% RSD = 0,81%

4 µg/ml

Rb1

50 µg/ml 400 µg/ml

0,514

209574

0,503

97,87

0,514

207639

0,498

96,96

4,031

1597123

3,841

95,29

4,031

1626671

3,912

97,05

4,031

1605973

3,863

95,82

0,041

11028

0,037

90,40

0,041

11606

0,039

95,81

0,041

11700

0,039

0,501

132159

0,498

0,501

127788

0,482

0,501

130742

0,493

98,51

4,075

1037116

3,947

96,86

4,075

1036130

3,943

96,77

4,075

1066613

4,060

99,62

AL

98,41

TB = 97,75%

CI

RSD = 0,75% TB = 96,1%

RSD = 0,94%

FI

µg/ml

0,506

OF

400

210744

ƠN

µg/ml

0,514

NH

50

96,68 99,59 96,26

TB = 94,30%

RSD = 3,61% TB = 98,12%

RSD = 1,73% TB = 97,75% RSD = 1,66%

PL3.2. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp trên nền mẫu dầu

4

M

µg/ml 50

µg/ml

KÈ

R1

400

DẠ Y

µg/ml

Rg1

Lượng thêm vào (mg)

4 µg/ml

Độ thu hồi

Diện tích pic

Lượng tìm lại

(mAU.s)

(mg)

0,040

14907

0,036

89,62

0,040

14724

0,036

88,41

0,040

14605

0,035

87,63

0,504

1486026

3,958

99,29

0,504

1450069

3,862

97,98

0,504

1485477

3,957

97,59

4,033

189132

0,501

98,13

4,033

186655

0,494

95,75

4,033

185904

0,492

98,09

0,040

12009

0,037

93,16

0,040

12192

0,038

94,17

0,040

12012

0,037

93,17

Y

Nồng độ phân tích

QU

Hoạt chất

PL9

(%)

TB = 88,55% RSD = 1,14% TB = 98,29% RSD = 0,91% TB = 97,33% RSD = 1,40% TB = 93,50% RSD = 0,62%

4 µg/ml

µg/ml 400 µg/ml

µg/ml 50

96,43

0,498

218957

0,493

98,95

3,988

1733459

3,831

96,07

3,988

1775429

3,923

98,39

3,988

1779458

3,932

98,61

0,040

15167

0,035

86,97

0,040

15205

0,035

87,19

0,040

15264

0,035

0,514

206723

0,496

0,514

201791

0,484

0,514

208581

0,500

97,40

4,031

1668010

4,012

99,52

4,031

1609921

3,872

96,05

4,031

1615283

3,885

96,37

11074

0,037

90,83

11259

0,038

92,56

11208

0,038

92,08

0,501

127820

0,482

96,28

0,501

130876

0,494

98,61

0,501

126756

0,478

95,47

4,075

1060102

4,035

99,01

4,075

1080556

4,113

100,92

4,075

1052086

4,004

98,26

0,041 0,041

M

µg/ml

AL

0,481

QU

µg/ml 400

213268

0,041

4

Rb1

0,498

Y

Re

50

99,60

TB = 98,33%

CI

RSD = 1,70% TB = 97,69%

RSD = 1,44%

FI

µg/ml

0,496

OF

400

220438

ƠN

µg/ml

0,498

NH

50

87,54 96,53 94,22

TB = 87,23%

RSD = 0,33% TB = 96,05% RSD = 1,71% TB = 97,32% RSD = 1,97% TB = 91,82%

RSD = 0,97% TB = 96,79% RSD = 1,68% TB = 99,40% RSD = 1,38%

PL3.3. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp trên nền mẫu lỏng Nồng độ phân tích

DẠ Y

KÈ

Hoạt chất

R1

4 µg/ml 50

Lượng thêm vào (mg)

Diện tích pic (mAU.s)

Lượng tìm lại (mg)

0,040

14903

0,036

89,60

0,040

15153

0,037

91,25

0,040

15014

0,036

90,33

0,504

195452

0,517

102,64

PL10

Độ thu hồi (%)

TB = 90,39% RSD = 0,92% TB = 101,39%

400 µg/ml 4 µg/ml

Re

50 µg/ml

4

M

µg/ml 50 µg/ml

KÈ DẠ Y

Rb1

100,64

4,033

1478959

3,939

97,66

4,033

1483907

3,952

97,99

4,033

1454127

3,873

96,02

0,040

11817

0,037

92,10

0,040

11370

0,036

89,62

0,040

11507

0,036

90,38

0,498

223869

0,504

101,12

0,498

221297

0,498

0,498

226224

0,509

3,988

1806386

3,992

3,988

1764697

3,900

97,79

3,988

1802622

3,983

99,89

0,040

15779

0,037

90,62

0,040

15924

0,037

91,48

15838

0,037

90,97

210982

0,506

98,53

217993

0,523

101,81

0,514

218465

0,524

102,03

4,031

1623626

3,905

96,87

4,031

1642317

3,950

97,99

4,031

1626592

3,912

97,05

0,041

11064

0,037

90,74

0,041

11134

0,037

91,39

0,041

10984

0,037

89,99

0,501

129277

0,487

97,39

0,501

131335

0,495

98,96

0,501

127218

0,480

95,83

4,075

1050144

3,997

98,08

4,075

1044888

3,977

97,59

4,075

1054856

4,015

98,52

0,040 0,514 0,514

400 µg/ml

PL11

AL

0,507

TB = 97,23% RSD = 1,08%

CI

191682

RSD = 1,07%

TB = 90,70% RSD = 1,40%

FI

0,504

QU

400 µg/ml

100,90

OF

Rg1

50 µg/ml

0,509

ƠN

4 µg/ml

192160

NH

400 µg/ml

0,504

Y

µg/ml

99,98

102,16 100,10

TB = 101,09% RSD = 1,08% TB = 99,26% RSD = 1,28% TB = 91,02% RSD = 0,48% TB = 100,79% RSD = 1,95% TB = 97,30% RSD = 0,62% TB = 90,71%

RSD = 0,77% TB = 97,39% RSD = 1,61% TB = 98,06% RSD = 0,48%

AL

PHỤ LỤC 4 – KẾT QUẢ CHI TIẾT ĐỘ LẶP CỦA PHƯƠNG PHÁP Đường chuẩn:

CI

R1: y = 3751 x + 1347 Rg1: y = 4538 x - 4847

FI

Re: y = 4156 x + 597 Rb1: y = 2624 x + 1361

DẠ Y

KÈ

Re

Rb1

Lượng chất trong chế phẩm (mg/g) 0,23 0,22 0,23 0,22 0,23 0,22 0,78 0,77 0,77 0,75 0,78 0,74 0,098 0,098 0,098 0,095 0,100 0,095 0,93 0,93 0,94 0,90 0,95 0,90

ƠN

174075 169807 174303 168887 173882 169247 703464 690022 699509 676350 703248 677532 82746 81703 81978 79742 83347 80467 491673 487596 494997 473999 497674 479628

NH

2,0106 2,0001 2,0063 2,0003 2,0005 2,0334 2,0106 2,0001 2,0063 2,0003 2,0005 2,0334 2,0106 2,0001 2,0063 2,0003 2,0005 2,0334 2,0106 2,0001 2,0063 2,0003 2,0005 2,0334

Y

Rg1

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

QU

R1

Dung Khối lượng dịch thử cân thử (g)

M

Hoạt chất

Diện tích pic (mAU.s)

OF

PL4.1. Kết quả khảo sát độ lặp lại mẫu dạng rắn

PL12

Trung bình (mg/g) RSD (%)

TB = 0,23 RSD = 1,80

TB = 0,76 RSD = 2,10

TB = 0,097 RSD = 1,96

TB = 0,92 RSD = 2,16

1

2,0834

125901

0,16

2

2,0102

116562

0,15

3

2,0091

118036

0,15

4

2,0062

119652

0,16

5

2,0016

119515

6

2,0012

116989

1

2,0834

506481

2

2,0102

510025

0,56

3

2,0091

496587

0,55

4

2,0062

493970

0,55

5

2,0016

505690

0,56

6

2,0012

486851

1

2,0834

57838

0,066

2

2,0102

58043

0,069

3

2,0091

NH

0,54

55625

0,066

4

2,0062

55646

0,066

5

2,0016

QU

57567

0,068

2,0012

55959

0,067

2,0834

365160

0,67

2,0102

363029

0,69

2,0091

350865

0,66

4

M

2,0062

353746

0,67

5

2,0016

356283

0,68

6

2,0012

345696

0,66

Re

6 1 2 3

DẠ Y

Rb1

PL13

OF

TB = 0,16

RSD = 1,58

0,16 0,15 0,54

ƠN

Rg1

Y

R1

Trung bình (mg/g) RSD (%)

CI

Khối lượng cân thử (g)

Hoạt chất

FI

Dung dịch thử

KÈ

Lượng chất trong chế phẩm (mg/g)

Diện tích pic (mAU.s)

AL

PL4.2. Kết quả khảo sát độ lặp lại mẫu dạng dầu

TB = 0,55 RSD = 1,83

TB = 0,067 RSD = 1,94

TB = 0,67 RSD = 1,56

1

5,0

115546

0,061

2

5,0

118746

0,063

3

5,0

116365

0,061

4

5,0

114656

0,060

5

5,0

118391

6

5,0

115989

1

5,0

531717

2

5,0

552895

0,25

3

5,0

550082

0,24

4

5,0

534391

0,24

5

5,0

557884

0,25

6

5,0

558579

1

5,0

55169

0,026

2

5,0

55404

0,026

3

5,0

NH

0,25

52320

0,025

4

5,0

54891

0,026

5,0

54778

0,026

5,0

57247

0,027

5,0

832892

0,63

5,0

839617

0,64

5,0

835336

0,64

4

M

5,0

809188

0,62

5

5,0

859836

0,65

6

5,0

836866

0,64

Re

5 6 1 2 3

PL14

OF

TB = 0,061 RSD = 1,41

0,062 0,061 0,24

ƠN

DẠ Y

Rb1

Y

Rg1

QU

R1

Trung bình (mg/ml) RSD (%)

CI

Thể tích thử (ml)

Hoạt chất

FI

Dung dịch thử

KÈ

Lượng chất trong chế phẩm (mg/ml)

Diện tích pic (mAU.s)

AL

PL4.3. Kết quả khảo sát độ lặp lại mẫu dạng lỏng

TB = 0,24 RSD = 2,12

TB = 0,026 RSD = 2,91

TB = 0,64 RSD = 1,94

AL

PHỤ LỤC 5 – KẾT QUẢ CHI TIẾT ĐỘ CHÍNH XÁC TRUNG GIAN Đường chuẩn:

CI

y = 3708,1 x + 332,5 y = 4491,6 x - 2194,7

FI

y = 4142 x + 1423 y = 2556,7 x + 212,9

173084 166441 169493 164438 173515 161592 697490 669792 693574 664896 697808 657694 81576 79133 81377 77912 82125 76320 494301 473159 490851 469363 493568 464030

DẠ Y

Rb1

Lượng chất trong chế phẩm (mg/g) 0,222 0,224 0,224 0,221 0,217 0,217 0,74 0,75 0,76 0,74 0,72 0,73 0,092 0,094 0,095 0,092 0,091 0,090 0,92 0,92 0,94 0,92 0,90 0,91

NH

ƠN

2,1002 2,0006 2,0383 2,0021 2,1505 2,0036 2,1002 2,0006 2,0383 2,0021 2,1505 2,0036 2,1002 2,0006 2,0383 2,0021 2,1505 2,0036 2,1002 2,0006 2,0383 2,0021 2,1505 2,0036

KÈ

Re

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

Y

Rg1

Khối lượng cân thử (g)

QU

R1

Dung dịch thử

M

Hoạt chất

Diện tích pic (mAU.s)

OF

PL5.1. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian mẫu dạng rắn

PL15

Trung bình (mg/g) RSD (%) n = 6: TB = 0,22 RSD = 1,39 n = 12: TB = 0,22 RSD = 1,98 n = 6: TB = 0,74 RSD = 1,63 n = 12: TB = 0,75 RSD = 2,39 n = 6: TB = 0,092 RSD = 1,88 n = 12: TB = 0,095 RSD = 3,23 n = 6: TB = 0,92 RSD = 1,68 n = 12: TB = 0,92 RSD = 1,87

Re

CI

(mg/g)

(mg/g)

RSD (%)

1

2,1737

126359

0,156

2

2,0513

124749

0,164

TB = 0,16

3

2,0006

121160

0,163

RSD = 1,74

4

2,1025

123829

5

2,0008

120078

6

2,0522

123549

1

2,1737

OF

FI

n = 6:

n = 12:

0,161

TB = 0,16

0,162

RSD = 2,23

525750

0,54

n = 6:

2

2,0513

509527

0,56

TB = 0,54

3

2,0006

491154

0,55

RSD = 1,96

4

2,1025

492517

0,52

n = 12:

5

2,0008

487307

0,54

TB = 0,55

6

2,0522

498673

0,54

RSD = 1,96

1

2,1737

60388

0,065

n = 6:

2

2,0513

58235

0,067

TB = 0,065

3

2,0006

56263

0,066

RSD = 2,63

2,1025

55418

0,062

n = 12:

2,0008

55255

0,065

TB = 0,066

ƠN

0,158

6

2,0522

57553

0,066

RSD = 2,58

1

2,1737

381621

0,69

n = 6:

2

2,0513

364288

0,69

TB = 0,68

3

2,0006

350057

0,68

RSD = 2,10

4

2,1025

352280

0,65

n = 12:

5

2,0008

354349

0,69

TB = 0,68

6

2,0522

355717

0,68

RSD = 2,01

4

KÈ

M

5

DẠ Y

Rb1

(mAU.s)

Trung bình

NH

Rg1

Khối lượng cân thử (g)

Y

R1

Dung dịch thử

Lượng chất trong chế phẩm

QU

Hoạt chất

Diện tích pic

AL

PL5.2. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian mẫu dạng dầu

PL16

Re

(mg/ml)

CI

(mg/ml)

Trung bình RSD (%)

1

5,0

123768

0,067

2

5,0

121599

0,065

TB = 0,065

3

5,0

120850

0,065

RSD = 0,91

4

5,0

121687

5

5,0

120685

6

5,0

121579

1

5,0

OF

FI

n = 6:

n = 12:

0,065

TB = 0,063

0,065

RSD = 3,47

585890

0,262

n = 6:

2

5,0

581704

0,260

TB = 0,26

3

5,0

578704

0,259

RSD = 0,72

4

5,0

587654

0,263

n = 12:

5

5,0

588664

0,263

TB = 0,25

6

5,0

589159

0,263

RSD = 4,04

1

5,0

62425

0,029

n = 6:

2

5,0

60522

0,029

TB = 0,028

5,0

59166

0,028

RSD = 2,02

5,0

59449

0,028

n = 12:

5,0

59692

0,028

TB = 0,027

5,0

59920

0,028

RSD = 4,85

1

5,0

867987

0,68

n = 6:

2

5,0

855589

0,67

TB = 0,66

3

5,0

823381

0,64

RSD = 1,78

4

5,0

841779

0,66

n = 12:

5

5,0

843064

0,66

TB = 0,65

6

5,0

842253

0,66

RSD = 2,71

3 4

KÈ

M

6

ƠN

0,065

5

DẠ Y

Rb1

(mAU.s)

Lượng chất trong chế phẩm

NH

Rg1

Thể tích thử (ml)

Y

R1

Dung dịch thử

QU

Hoạt chất

Diện tích pic

AL

PL5.3. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian mẫu dạng lỏng

PL17

AL

PHỤ LỤC 6 - SẮC KÝ ĐỒ - Chuẩn đơn

CI

- Khoảng tuyến tính - LOQ

DẠ Y

KÈ

M

QU

Y

NH

ƠN

OF

FI

- Mẫu thực

PL18

Y

DẠ

KÈ M Y

QU ƠN

NH

FI

OF

CI

AL

Y

DẠ

KÈ M Y

QU ƠN

NH

FI

OF

CI

AL

Y

DẠ

KÈ M Y

QU ƠN

NH

FI

OF

CI

AL

Y

DẠ

KÈ M Y

QU ƠN

NH

FI

OF

CI

AL

Y

DẠ

KÈ M Y

QU ƠN

NH

FI

OF

CI

AL

Y

DẠ

KÈ M Y

QU ƠN

NH

FI

OF

CI

AL

Y

DẠ

KÈ M Y

QU ƠN

NH

FI

OF

CI

AL

Y

DẠ

KÈ M Y

QU ƠN

NH

FI

OF

CI

AL

Y

DẠ

KÈ M Y

QU ƠN

NH

FI

OF

CI

AL

Y

DẠ

KÈ M Y

QU ƠN

NH

FI

OF

CI

AL

Y

DẠ

KÈ M Y

QU ƠN

NH

FI

OF

CI

AL

Y

DẠ

KÈ M Y

QU ƠN

NH

FI

OF

CI

AL

Y

DẠ

KÈ M Y

QU ƠN

NH

FI

OF

CI

AL

Y

DẠ

KÈ M Y

QU ƠN

NH

FI

OF

CI

AL

Y

DẠ

KÈ M Y

QU ƠN

NH

FI

OF

CI

AL

Y

DẠ

KÈ M Y

QU ƠN

NH

FI

OF

CI

AL