INSEMINACIÓN
ARTIFICIAL EN PORCINO: LA BASE DE LA PORCINOCULTURA INTENSIVA
Joan Enric Rodríguez Gil Dept. Medicina y Cirugía Animal Universidad Autónoma de Barcelona
❶. Resumen histórico
L
a u lización de la inseminación ar ficial (IA) en las explotaciones procinas es un fenómeno rela vamente reciente, especialmente cuando se compara con la u lización de la IA en especies como la bovina. A pesar de ello, los primeros ensayos de IA en el cerdo ya se dieron a principios del siglo XX (Ivanow 1907, 1922), aunque sin una aplicación prác ca subisiguiente. Durante los siguientes decenios aparecieron otros ensayos en los USA; Japón y el Reino Unido (McKenzie 1931; Milovanow 1938; Anderson 1945; Ito et al. 1948; Polge 1956; Niwa 1958; Maule 1962; Nishikawa 1964). En todos estos ensayos, las muestras u lizadas fueron eyaculados conservados a temperaturas que variaban entre los 7ºC y los 20ºC. Los eyaculados se diluían en diluyentes experimentales que consis an básicamente en soluciones de glucosa a las que se le añadían compuestos como el tartrato potásico, el sulfato sódico o la peptona, lo que permi a mantener unos niveles bajos de electrolitos en el diluyente (Milovanov 1938; Anderson 1945; Polge
1956; Maule 1962). A pesar de todo, ninguno de estos ensayos obtuvo resultados de fer lidad y prolificidad “in vivo” suficientemente buenos como para permir el desarrollo de una técnica de IA aplicable comercialmente en granja. Viendo los resultados, algunos grupos intentaron la inseminación ar ficial con semen congelado, de manera similar a lo ya desarrollado para la especie bovina (Polge et al. 1949), pero con modificaciones de poca importancia (Nishikawa 1964; Graham 1978). Los resultados, sin embargo, fueron aún peores que los obtenidos con el semen refrigerado, lo que llevó al pensamiento erróneo, aún incrustado en las creencias de la profesión, que el semen de verraco no era congelable (veremos en otra comunicación que esta aseveración es fundamentalmente falsa, los malos resultados sólo son achacables a la aplicación de técnicas de congelación no adaptadas al semen porcino). Teniendo en cuenta todos estos fracasos, la aplicación comercial de la IA en la producción porcina sólo comenzó en la década de
1980. Existen dos factores principales que explican la introducción de la IA. El primero de ellos es el desarrollo de diluyentes comerciales eficientes para el semen porcino. El primer diluyente realmente efec vo, que se encuentra en la base de todos los demás diluyentes desarrollados hasta ahora, es el “Beltsville Thawing Solu on” (BTS; ver Pursel y Johnson, 1975). Inicialmente, el BTS se diseñó como un diluyente para la descongelación, si bien inves gaciones posteriores mostraron su u lidad como diluyente de conservación a 1517ºC (Johnson et al., 1988). De esta manera, tanto los veterinarios como los granjeros empezaron a poder mantener el semen porcino viable durante períodos de empo que permi an la aplicación correcta de la IA. A par r de esta base, se empezaron a desarrollar una gran variedad de diluyentes comerciales de conservación a 15-17ºC, destacando entre los primeros con viabilidad comercial el medio Zorlesco (Go ardi et al., 1980) y, especialmente, el diluyente MRA (Mar n-Rillo, 1984) que, de semen y embriones
hecho, puede considerarse como el primer diluyente comercial plenamente u lizado, debido a su gran eficiencia, combinada con un costo económico muy bajo. Par endo de estas bases se ha llegado al momento actual, en el que existen en el mercado una amplia variedad de diluyentes que presentan una capacidad de conservación a 15-17ºC de hasta 14-15 días sin una caída significava del poder fecundante. Sin embargo, el desarrollo de diluyentes comerciales sólo es uno de los factores que explican el éxito de la IA en la producción porcina. El otro gran factor es la estandarización de las técnicas de IA u lizadas en granja. Así, el desarrollo de la técnica de inseminación intracervical (IIC), juntamente con la aparición de los catéteres de inseminación apropiados a provisto a los ganaderos con unas herramientas de aplicación de la IA rápidas, de muy bajo coste económico y que no requieren una habilidad o una experiencia previa especialmente intensa (Reed, 1985; Crabo,1990; Johnson et al., 2000). Así pues, la IA se ha conver do en una prác ca extraordinariamente rentable, que ha sus tuido está sus tuyendo muy rápidamente a la monta natural en todo el mundo. Además, muy recientemente la aparición de la técnica de inseminación post-cervical (IPC) ha llevado a reducir aún más el número de espermatozoides u lizados en cada inseminación sin una pérdida de rendimiento ni un incremento en los costes, lo que ha hecho aumentar aún más la importancia de la IA en la industria porcina dentro de un contexto globalizado mundialmente.
semen y embriones
❷. El papel actual de la IA en la producción porcina La implementación de la IA ha crecido de manera exponencial desde la década de los 80, al mismo ritmo que la cría intensiva del cerdo. Este hecho se debe a que ambas prác cas son, de hecho, interdependientes. En estos momentos, se calcula que más de un 90% de las explotaciones intensivas en Europa, USA y Canadá u lizan la IA como técnica ru naria (Lowe and Gereffi, 2008; Reportlinker, 2001). La explicación a esta u lización masiva es fácil de entender si asumimos las múl ples ventajas que supone la u lización de la IA. En resumen, la IA permite una disminución enorme en la relac i ó n n ú m e r o d e v e r r acos/número de cerdas por granja, lo que disminuye de manera paralela el empo consumido por cada monta respecto al u lizado por cada inseminación. Además, la u lización de dosis seminales comerciales permite a los productores aumentar de manera exponencial la posibilidad de elección de líneas gené cas diferentes a introducir en sus granjas, mul plicando así las probabilidades de producir un producto final que responda de manera fiel a las demandas del consumidor. Por úl mo, la u lización de dosis seminales comerciales sanitariamente controladas mejora el control de las montas, disminuyendo así los problemas sanitarios asociados a un control deficiente e la monta natural (verracos portadores de enfermedades que pasan inadver dos, etc.). Por todo ello, no resulta nada sorprendente observar que el aumento exponencial observado en los úl mos
años en el número de cerdas reproductoras existentes en una granja sea un fenómeno paralelo a la implementación de la IA. Un ejemplo de ello es lo sucedido en la Comunidad Autónoma de Catalunya (España). En esta zona, en 1975 el número total de cerdos es mados era de unos dos millones (Observatori, 2009). En ese mismo año, el porcentaje de granjas que u lizaba de manera ru naria la IA era de prác camente cero. Diez años más tarde, el número total de cerdos había aumentado hasta unos tres millones. En el año 2005, prác camente todas las granjas catalanas utlizaban la IA de manera ru naria, y el número de cerdos totales había aumentado hasta más de seis millones (Observatori, 2009). Esta tendencia se observa también en todas aquellas áreas en las que se ha implementado la IA como técnica ru naria, enfa zando así su importancia dentro de la porcinocultura moderna. Sin embargo, hay que indicar que la implantación masiva de la IA en la porcinocultura no hubiera sido posible sin la aparición de granjas especializadas únicamente en la producción de semen a par r de verracos seleccionados con este fin. Estas granjas han permi do la expansión de la IA por varios mo vos. En primer lugar, han liberado a los ganaderos de un trabajo tedioso y para el cual no suelen estar formados, como es el de obtención, preparación y almacenamiento correcto de las dosis seminales a u lizar en IA. Al centrar la producción de dosis seminales en centros preparados técnicamente, tanto desde el punto de vista de la infraestructura como del personal, se han evitado todos
los fallos asociados con la manipulación seminal en malas condiciones y por personal poco preparado, como ocurre en muchas granjas. En segundo lugar, la existencia de granjas especializadas de verracos permite aumentar de manera enorme la variedad genéca disponible para el ganadero, con la finalidad de que éste pueda introducir en su granja las caracterís cas gené cas que más le convengan para la obtención de un producto final buscado por el consumidor. Con todo ello, la existencia de granjas especializadas en verracos es, pues, un elemento clave para la u lización ru naria de la IA en un territorio.
❸. El futuro de la IA: ¿Cuáles son los siguientes pasos? Hacer una predicción de futuro es siempre una tarea imposible. Sin embargo, el estado actual de la u lización de la IA en la industria porcina nos permite entrever algunas posibilidades para un futuro próximo, al menos en los países con un desarrollo elevado en la industria porcina. De hecho, a pesar de los constantes cambios y mejoras que se han ido introduciendo desde hace treinta años, las nociones básicas de la IA se man enen prác camente idén cas desde sus inicios. Hoy en día, la gran eficiencia, combinada con los costos económicos bajos, de la IA hacen di cil pensar que las técnicas actuales puedan sus tuirse por otras de muy diferentes a corto plazo. Esto implicaría que, por ejemplo, la u lización de semen congelado en la industria porcina con nuará centrándose en aspectos puntuales de la producción, como pueden ser las granjas de selec-
ción, ya que la eficiencia del semen congelado con núa siendo menor que la del refrigerado a un coste más elevado, a pesar de los avances con nuos realizados en este campo. En el fondo, el caso de la IA porcina con semen diluido es un claro ejemplo de inhibición tecnológica, en el que el éxito indiscu ble de una técnica determinada impide el avance del sector afectado al no inves garse alterna vas que, en el principio, serán menos eficientes. Ante estas condiciones, es prác camente imposible poder discernir cambios a medio o largo plazo, a menos que no aparezca alguna técnica revolucionaria que cambie el panorama de la IA en la producción porcina de manera radical.
❹. Técnicas de inseminación artificial porcina ④.①. Inseminación artificial con semen refrigerado
Como ya se ha dicho anteriormente, la IA con semen refrigerado es, hoy en día, la técnica más importante u lizada en la industria porcina. En estos momentos, están coexis endo dos sistemas de aplicación seminal. Uno de ellos, la IIC, como ya se ha dicho anteriormente, se puede considerar la técnica clásica, más usada en estos momentos. Sin embargo, en los úl mos años, la aparición de la IPC parece estar llevando a un cambio de sistema de inseminación, con una evolución muy rápida hacia el aumento del uso de la IPC en detrimento de la IIC. Teniendo en cuenta, sin embargo, la coexistencia de ambas técnicas, lo más prác co es llevar a cabo una descripción sucinta de ambas.
④.②. La inseminación intra-cervical (IIC)
La IIC consiste en la introducción y deposición de la dosis seminal en el interior del cérvix de la cerda mediante la u lización de un catéter especialmente diseñado para este uso. Esta técnica, como siempre, requiere la cuidadosa aplicación de una serie de pasos para garan zar su éxito. La técnica se inicia con la limpieza de la vulva de la cerda y la zona adyacente usando para ello un papel o un trapo higienizados para evitar así la contaminación del catéter con residuos fecales o de otro po. Tras la limpieza, se procede a la lubrificación del extremo anterior del catéter u lizando para ello algún lubricante no espermicida como la vaselina o incluso una pequeña can dad del mismo diluyente comercial de semen u lizada para diluir las dosis. En cualquier caso, hay que evitar cuidadosamente que el lubricante entre dentro del orificio anterior del catéter, pues podría taponarlo y dificultar la inseminación. Hay muchos pos diferentes de catéteres, dependiendo de la casa comercial y del po y tamaño de las cerdas a inseminar. Por ejemplo, existen catéteres de tamaño y forma del extremo apical diferentes para cerdas nulíparas y para mul paras (ver Figura 1), eligiendo en cada caso el catéter que se adapte de la manera más óp ma a nuestros propósitos. Una vez lubrificado el catéter, éste se introduce de manera suave en la vagina de la cerda hasta contactar con la entrada del cérvix. Hay que evitar que la punta del catéter toque o se arrastre por el suelo de la vagina, puesto que un es mulo de este po puede semen y embriones
provocar la expulsión de orina, que puede introducirse dentro del catéter, lo que provocará la muerte de los espermatozoides cuando se mezclen con la orina contaminante. Una vez contacta la punta del catéter con la entrada del cérvix, éste es introducido a través del canal cervical mediante movimientos rotatorios dirigidos en sen do contrario al de las agujas del reloj, mirando desde el punto de vista del inseminador. Si se detecta alguna resistencia grande en este punto, lo mejor es hacer retroceder un poco el catéter y volver a intentarlo. Los catéteres cuyo extremo de introducción está formado por un material esponjoso suave no siempre pueden insertarse en el cérvix en una posición profunda y, por lo tanto, tendrán que dejarse en la parte más craneal del canal cervical, en ocasionas sólo hasta el primer anillo cervical. Nos aseguramos que el catéter esté bien introducido y fijado en el cérvix mediante rones flojos. Un catéter bien fijado mostrará una resistencia notable, tanto a los rones como a los intentos de hacerlo rotar dentro del cérvix. Una vez asegurada la posición del catéter dentro del cérvix, se inserta la dosis seminal en el extremo posterior del catéter, que emerge al exterior desde la vulva. Antes de esta inserción, se procederá a la agitación suave de la dosis, mezclando bien los espermatozoides con su diluyente. Una vez insertado, se procederá a la introducción del semen a través del catéter hacia el cérvix. Es absolutamente impera vo que esta introducción se haga de manera lenta. La entrada gradual provocará un es mulo mecánico/hormonal en la cerda, es mulo importante para provo-
semen y embriones
car una sincronización natural entre la entrada de los espermatozoides dentro de la cerda y la ovulación, op mizando así el momento de la fecundación. Se calcula que el empo mínimo que se requiere para una correcta introducción del semen en la cerda es de tres minutos. De hecho, la introducción del semen no se produce mediante compresión del recipiente de la dosis, si no que son los propios movimientos contrác les de la matriz de la cerda en celo los que introducen el semen en el útero, al crearse una presión nega va hacia su interior. Para facilitar este proceso, los recipientes seminales, de unos 90 mL de capacidad en la IIC, nunca deben ser rígidos, sino semirrígidos o totalmente flexibles (Figura 2). Además, el hecho de que sea la propia cerda la que introduzca los espermatozoides en su matriz debido a las contracciones uterinas permite al ganadero poder dedicarse a inseminar de manera simultánea todo un lote de cerdas, no inseminándose así los animales uno a uno de forma secuencial. Si, a pesar de todas las precauciones, aparece un reflujo seminal durante el momento de la inseminación, el catéter ene que reposicionarse en el cérvix rotándolo (por lo general, con un cuarto de vuelta es suficiente) y comprobando a con nuación que el flujo de semen hacia el útero se reinicia. Si el fallo persiste, el catéter ene que extraerse y volverse a colocar de forma correcta. Finalmente, en ocasiones el flujo seminal también puede interrumpirse por la formación accidental de vacío dentro del catéter. En este caso, se procederá a realizar un pequeño agujero en el recipiente
del semen, lo que romperá el vacío. En cualquier caso, es fundamental un control exhaus vo del comportamiento de la cerda y de todo el ambiente que la rodea durante el proceso de la inseminación. Hay que recordar que cualquier factor ambiental o individual que afecte el comportamiento de celo de la hembra puede provocar una caída importante de la fer lidad. Así, en el caso de la IIC, es importante que el inseminador imite el comportamiento del verraco con la cerda en todo lo posible. Esto provocará una es mulación correcta del eje hormonal de la cerda, lo que llevará a la sincronización entre el momento de la inseminación y el de la ovulación. Este comportamiento imitador consis rá en acciones como presentarle por delante a la cerda un verraco adulto y en buen estado de salud, comprimir la zona escapular de la cerda y/o realizarle masajes en sus flancos. Todo ello provocará un incremento en la ac vidad contrác l del útero, facilitando así la llegada de los espermatozoides a los oviductos. Si la cerda no responde bien a estos es mulos, es conveniente separarla del verraco marcador durante como mínimo una hora y volver a empezar el protocolo a con nuación. Esto es importante, puesto que hay que recordar que el reflejo de inmovilidad que producen todos estos es mulos sobre la cerda es esencial para provocar las contracciones uterinas que transportarán el semen a los oviductos. Finalmente, es absolutamente imprescindible mantener a la cerda sin mover in en un ambiente tranquilo durante 230-30 minutos tras la IA. Esto evitará cualquier posible problema sobre el
transporte espermá co provocado por un estrés ambiental. Una vez nos hemos asegurado que todo el semen ha penetrado en el útero, se re ra el catéter sin ningún movimiento brusco aplicando a la vez una rotación lenta en el sen do de las agujas del reloj sobre el catéter. También se puede dejar insertado el catéter en el cérvix durante unos minutos tras acabar la entrada del semen en la matriz. El proceso de inseminación se repe rá durante un celo dos veces. Existen diversas pautas al respecto, aunque quizás la más u lizada sea la de dejar un intervalo de 24 horas entre las dos inseminaciones. Este protocolo permite cubrir la mayor parte del período estral de la cerda. Hay que insis r que el número de inseminaciones no tendría de ser superior a dos por celo. Un número superior de inseminaciones no sólo no provoca un incremento de la fer lidad, si no que, por el contrario, incrementa de manera significa va el porcentaje de problemas reproduc vos del po de metri s o piómetra, dos de los mo vos más importantes de sacrificio de una cerda reproductora. Por supuesto, las inseminaciones se llevan a cabo con catéteres de un solo uso, desechándolos después de cada servicio. Este procedimiento evitará transmisiones de patologías entre los animales. Si se toman todas estas precauciones, el porcentaje de fer lidad que se ob ene es superior al 90%, lo que es un claro exponente de la bondad de la técnica ④.③. La inseminación post-cervical (IPC)
La IPC se lleva a cabo mediante un procedimiento en el que
muchos de sus pasos son comunes a los descritos para la IIC. Ahora bien, en la IPC, el catéter de inseminación presenta dos componentes (ver Fig. 3). El primer componente consiste en un catéter igual al u lizado en IIC. Este catéter, sin embargo, sólo se u liza como guía para el segundo componente, que es el que lleva a cabo la inseminación en sí. Este segundo componente es una sonda semirrígida que se introduce a través del primer componente. Así pues, el primer componente ene la misión de guiar a la sonda semirrígida, que, tras atravesar el cérvix a través del catéter, se introducirá de manera más profunda en el interior del útero. Por lo tanto, la IPC se iniciará siguiendo los mismos pasos que la IIC hasta el momento de la inserción del catéter o primer componente en el cérvix. Una vez asegurada la fijación del catéter al cérvix, se procederá a la introducción de la sonda semiflexible a través del conducto interior del catéter de IIC de manera lenta y progresiva hasta llegar un momento en el que la sonda no pueda introducirse más. Esta detención implicará que la sonda ha alcanzado la zona más distal alcanzable del útero. Una vez aquí, se procederá a extraer menos de un cen metro la sonda (con ello, evitaremos posibles erosiones), ajustaremos la dosis de inseminación a su extremo posterior abierto y aplicaremos el semen siguiendo las guías explicadas para la IIC. Una vez hecha la inseminación, se procede a realizar unos movimientos rotatorios vigorosos con las dos sondas, de tal manera que el sistema de inseminación se mueva dentro del cérvix, pero sin extraerlo. Este movimiento pro-
voca la es mulación de las contracciones uterinas, sus tuyendo el es mulo provocado por el verraco que es esencial en la IIC. Existen diversas razones que explican por qué la IPC ende a sus tuir gradualmente a la IIC. La principal de ellas es que la aplicación de la IPC es, de hecho, más sencilla que la de la IIC en cuanto se adquiere un mínimo de prác ca. Así, la introducción de los dos componentes no es más di cil que en el caso de la IIC y el hecho de no necesitar la presencia del verraco facilita el manejo de la IA. La IPC se lleva cabo también de manera más rápida que la IIC, puesto que la resistencia del líquido introducido en la matriz es más pequeña, al introducir un volumen de líquido inferior (4050 mL en contra de los 90 mL de la IIC, ver Roca et al., 2006). Además, el semen se deposita mucho más cerca del oviducto que en la IIC, aumentando la probabilidad espermá ca de alcanzar la zona importante y, por lo tanto, ayudando a reducir el número de espermatozoides necesarios para cada inseminación. Este hecho provoca otro efecto favorable basado en el hecho de que con la IPC podemos producir más dosis seminales de un eyaculado, al necesitar menos espermatozoides por cada dosis. En consecuencia, el aumento de facilidad y el aumento de rentabilidad de los verracos hacen de la IPC una técnica ventajosa en términos económicos al compararla con la IIC. Teniendo en cuenta estos hechos, es razonable suponer que la IPC acabará sus tuyendo a corto o medio plazo a la IIC, a menos que no aparezca una nueva técnica de IA aún mejor. De todas formas, hay que recordar que, sea cual sea la técnica
semen y embriones
u lizada, la IA en porcino debe su éxito a tres factores: la sincronización entre le momento de la ovulación y el de la inseminación, la deposición óp ma del semen dentro del útero de la cerda y la calidad seminal. El óp mo control de estos tres factores conducirá al éxito seguro de la IA porcina, sea c ual sea la técnica precisa de inseminación u lizada.
Figura 2. Dosis seminales comerciales para la IIC porcina. El volumen seminal de cada dosis es de 90 mL.
Figura 1. Diferentes modelos de catéteres utilizados en la inseminación intracervical clásica (IIC) en la cerda. La fotografía compara catéteres comerciales utilizados de forma rutinaria en cerdas primíparas (A) y multíparas (B).
Figura 3. Descripción del sistema utilizado para la inseminación postcervical (IPC) porcina. La fotografía muestra el catéter externo, igual al utilizado en IIC (A), y la sonda interna (B) que forman ambas el conjunto completo de inseminación que se comercializa. Por último, se muestra el sistema combinado de catéter y sonda tal y como se presenta tras la inserción final (C).
Bibliografía Crabo BG. (1990). Preservation of boar semen: a worldwide perspective. Reprod Dom Anim Suppl 1:3–9. Gottardi L, Brunel L, Zanelli L. (1980). New dilution media for artificial insemination in the pig. 9th ICAR. Madrid 5:49–53. Graham EF. (1978). Fundamentals of the preservation of spermatozoa. In: Proceedings of the Conference of the National Academy of Sciences, Washington, pp. 4-44. Ito T, Niwa T, kudo A. (1948). Studies on artificial insemination in swine. Zootech Exp Sta Res Bill 55:1-74. Ivanow EI. (1907). De la fecóndation artificielle chez les mammifères. Arch Sci Biol 12:377-511. Ivanow EI. (1922). On the use of artificial insemination for zootechnical purposes in Russia. J Agric Sci 12:244-256. Johnson LA, Aalbers JG, Groote HJG. (1988). Artificial insemination of swine: fecundity of boar semen stored in beltsville thawing solution (BTS), modified modena (MM), or MR-A and inseminated on one, three and four days after collection. Zuchthyg 23:49–55. Johnson LA, Weitze KF, Fiser P, Maxwell WMC. (2000). Storage of boar semen. Anim Reprod Sci 62:143–172. Lowe M, Gereffi G. (2008). A value chain analysis of the U.S. pork industry report prepared for environmental defence fund. Center on globalization, governance and competitiveness, Duke University Press, Durham Martín Rillo S. (1984). How AI is progressing in Spain. Pig Intern (May) 24–28. Maule JP. (1962). The semen of animals and artificial insemination. Commonwealth Agricultural Bureaux, Farnham Royal, Reino Unido. McKenzie EE. (1931). A method for collection of boar semen. J Am Vet Assoc 78 (News series 31):244-246. Milovanow VK. (1938). Artificial insemination in domestic animals (pulicado en Ruso). Seljhozgiz, Moscú. Nishikawa Y. (1964). History and delopment of artificial insemination in the world. En: Proceedings of the 5th International Congress on Animal Reproduction and Artificial Insemination, Trento, Italia, 7:163-259. Niwa T. (1958). Artificial insemination whit swine in Japan. Natl Inst Agric Sci, Chiba-shi, Japón. Observatori DP. (2009). Informe estructural. Anàlisi estructural: evolució en l'espai i el temps. Dept. D'agricultura, Alimentació i acció rural; Generalitat de catalunya, Spain, http://www20.gencat.cat/docs/DAR/DE_Departament/DE02_Estadistiques_observatoris/08_Observatoris_sectorials/04_Observatori_ porci/Informes_periodics/D1/Fitxers_estatics/D1_Informe_anual_2009_20100507.pdf Polge C, Smith AU, Parkes AS. (1949). Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperatures. Nature 164:666. Polge C. (1956). Artificial insemination of pigs. Vet Rec 68:62-76. Pursel VG, Johnson LA. (1975). Freezing of boar spermatozoa: fertilizing capacity with concentrated semen and a new thawing procedure. J Anim Sci 40:99–102. Reed HCB. (1985). Current use of frozen boar semen. Future need of frozen boar semen. En: Deep freezing of boar semen. Johnson LA, Larsson K (eds) Swedish Univ Agric Sci, Sweden, pp 225–237. Reportlinker. (2001). Industry reports, company profiles and market statistics. http://www.reportlinker.com.25 Oct 2011. Roca J, Vázquez JM, Gil MA, Cuello C, Parrilla I, Martínez EA. (2006). Challenges in pig artificial insemination. Reprod Domest Anim 41:43–53.
semen y embriones
REPRODUCCIÓN
CANINA Autor: Dr. Luis González Correo: lgonzalezvet@hotmail.com Teléfono:2348678 Hospital Veterinario Lucky
RESUMEN
E
l aparato reproductor de la hembra canina se divide en órganos internos: ovarios, oviductos, útero, cérvix, vagina, ves bulo; y órganos externos: clítoris y vulva.
El ciclo estral se divide en proestro, estro, diestro y anestro, siendo el estro el más importante para la fecundación de la hembra y el cual se puede verificar por medio de citología vaginal o medición sérica de progesterona. El aparato reproductor del macho está conformado por: tes culos, pene prepucio, escroto, próstata, uretra y conductos deferentes. Tanto la madurez sexual de la hembra como la del macho dependen de la raza y tamaño del perro/a. Los métodos ideales para la fecundación una vez confirmado el estro son la monta natural y la inseminación ar ficial la cual puede ser intravaginal, intrauterina y quirúrgica.
ANATOMÍA APARATO REPRODUCTOR HEMBRA CANINA Órganos internos: Ovarios: son órganos pares, aplanados de forma oval, aproximadamente de 2cm de longitud y situados a 2cm del polo caudal del riñón, a nivel de la 3ª y 4ª vértebras lumbares, el ovario izquierdo es más caudal Ÿ Oviductos: Es una estructura tubular que comunica al ovario con el útero, mide de 5 a 8 cm de longitud y está formado por el infundíbulo, ampolla e ismo. Son los conductos en donde los óvulos madurarán hasta llegar al útero. Ÿ
Útero: Es un órgano formado por 2 cuernos estrechos, un cuerpo y un cuello, los cuernos miden de 12-15 cm según la raza y el cuerpo mide de 2 a 3 cm de longitud. Este es el lugar en donde se desarrollara la implantación, y el desarrollo fetal. Ÿ Cérvix: el conducto cervical en la perra se caracteriza por ser ver cal, con la abertura uterina dorsal y la abertura vaginal en posición ventral. Durante la preñez el cérvix cierra el Ÿ
canal de parto, lo que crea una barrera ante microorganismos. Ÿ Vagina: si ada entre cérvix y ves bulo. Formada por una capa serosa , una muscular de fibras gruesas y una mucosa con pliegues longitudinales que terminan en el orificio uretral, donde se une la vagina con el ves bulo. Las células de la vagina pasan por una serie de cambios durante ciclo estral. Ÿ Ves bulo: se ex ende desde
semen y embriones
la vagina hasta la vulva, iden ficándose la unión entre la vagina y ves bulo por la presencia del orificio uretral, el cual se proyecta desde el piso de la porción craneal del ves bulo.
Órganos externos: Clítoris: pequeño, ancho y plano, localizado en el piso del ves bulo cerca de la vulva, mide aproximadamente 3-4 cm y ene un cuerpo formado de tejido graso y un glande de tejido eréc l situado en la fosa del clítoris. Ÿ Vulva: Con dos labios que forman una comisura dorsal y una ventral. Su mucosa es lisa de color rojo con algunos nódulos linfá cos. Ÿ
CICLO ESTRAL DE LA HEMBRA La hembra canina se considera sexualmente madura cuando ha demostrado su primer periodo, generalmente entre los 6 a 16 meses de edad, dependiendo de la raza y tamaño. La mayoría de las hembras cursan el celo dos veces al año. La excepción a esta regla son las lobas y la raza basenjis, las cuales picamente lo cursan una vez al año. El estro o celo de una hembra entera (no esterilizada) y que no presente preñez está dividido en 4 fases: Ÿ Proestro: El indicador clave de esta fase es la descarga sanguinolenta vaginal. Dicha descarga es debido a una extravasación de glóbulos rojos a trasemen y embriones
vés de los vasos sanguíneos del útero. Otros indicadores son la inflamación de la vulva y el lamido frecuente de la zona externa genital. Ÿ Durante el proestro la hembra atraerá al macho, pero no le permi rá la monta. El proestro dura entre 6-11 días, durante esta fase la FSH (hormona folículo es mulante) y LH (hormona luteinizante) ambas secretadas por la glándula pituitaria, es mulan el crecimiento y desarrollo de folículos en los ovarios. Posteriormente, los niveles de estrógenos que son principalmente producidos por los folículos, se incrementan gradualmente a nivel sanguíneo causando un cambio en el
comportamiento de la hembra.· Ÿ Estro: Tiene una duración entre 7 a 9 días. El pico de estrógenos se alcanza 1 a 2 días antes del inicio del estro, ocurriendo la ovulación 24 a 48 horas después de haberse iniciado el estro. La perra muestra signos de celo mientras haya niveles circulantes de estrógenos, la hembra se torna recep va, contrae la región perineal al contacto con el macho. La vulva se torna flácida, con nua la secreción vaginal y puede ser rosada o con nuar siendo hemorrágica. GRÁFICO III: Citología vaginal en estro
GRÁFICO I : Citología vaginal inicio del proestro
Citología vaginal – Inicio del proestro se observan células intermedias con núcleo chico glóbulos rojos y neutrófilos. Fuente: SORRIBAS, 2005
GRÁFICO II: Citología vaginal final del proestro.
Citología vaginal – Sobre el final del proestro se observan células grandes que se queratinizan y van perdiendo su núcleo; pueden distinguirse glóbulos rojos y neutrófilos. Fuente: SORRIBAS, 2005
Citología vaginal – En el estro los neutrófilos por lo general están ausentes, los eritrocitos pueden estar presentes en número variado, pero su presencia carece de significación clínica y las células epiteliales están al máximo de su queratinización con núcleos pequeños picnóticos o ausentes. Fuente: SORRIBAS, 2005
Ÿ
Diestro: su duración va de los 56 -58 días si hubo gestación, 60 -75 días si no la hubo. Empieza el primer día que la hembra no acepta al macho. Dentro de los signos clínicos de esta etapa figuran: a) la hembra rechaza la monta, b) ya no atrae a los machos, c) la vulva regresa a su tamaño normal desapareciendo la
flacidez y secreción. GRÁFICO IV: Citología vaginal en diestro.
Citología vaginal – Se observa la escaza cantidad de células parabasales, neutrófilos aislados y los eritrocitos están ausentes. Fuente: SORRIBAS, 2005
Ÿ
Anestro: con un promedio de 150 días, es el empo que va entre el final de la fase lútea (diestro en perras vacías o gestación en perras gestantes) y el principio de la fase folicular (proestro). No hay diferencia clínica entre la perra diestrica y la anéstrica. GRÁFICO V: Citología vaginal anestro.
Citología vaginal – Células pararabasales de núcleo grande. Fuente: SORRIBAS, 2005
MÉTODOS PARA DETECTAR LA OVULACIÓN 1.- Cambios fisiológicos: Se mencionaron en la sección anterior, se puede elaborar una citología vaginal en donde se verificaran ciertas variaciones celulares como lo indican las fotos anteriores.
2.- Incremento de progesterona: La liberación de progesterona por el ovario y su subsecuente incremento a un promedio de 23 ng es señal de liberación de LH por parte de la glándula pituitaria y denota el principio del proceso ovulatorio. El incremento de progesterona a 5-8 ng indican que la ovulación ha empezado. La hembra debe ser evaluada cada 48-72 horas para an cipar el momento oportuno de la monta. La progesterona se eleva y con nua elevada por aproximadamente 2 meses en las perras, a pesar de no exis r preñez.
ANATOMIA DEL APARATO REPRODUCTOR MASCULINO Órganos externos:
Tes culos: el tamaño varía de acuerdo a la talla del perro, en promedio miden de 1 a 3 cm de diámetro. Tienen como función el transporte, maduración y almacenamiento de los espermatozoides. Ÿ Pene: conformado por el Os penis, hueso peneano que ayuda al macho al momento de la copula y el bulo del pene, el cual le permite ensancharse al pene una vez que está dentro de la vagina de la hembra para impedirle su salida posterior a la eyaculación. Ÿ Prepucio: es una doble invaginación de piel que con ene y cubre al pene, formando por Ÿ
una capa interna lisa y otra externa pilosa. Ÿ Escroto: bolsa de pelo fino que con ene a los tes culos. Órganos internos:
Próstata: Glándula accesoria responsable del fluido que conformara al semen. Ÿ Vías deferentes: Conductos eyaculatorios para la esperma. Ÿ Uretra: Conducto que sale del cuello de la vejiga al pene, el cual transporta la orina, durante la monta será el camino de eyaculación para el semen. Ÿ
CICLO REPRODUCTIVO DEL MACHO Los machos, como las hembras, alcanzan su madurez sexual a diferentes edades dependiendo del tamaño y raza del perro. La mayoría de los machos son sexualmente maduros y capaces de producir esperma a los 10 meses de edad. Las hormonas FSH y LH, secretadas por la glándula pituitaria es mulan la producción de espermas y testosterona por los tes culos. La testosterona es necesaria para el desarrollo y mantenimiento de las caracterís cas sicas y etológicas masculinas así como de la espermatogénesis, la cual ocurre todo el año y dura 62 días.
MÉTODOS PARA LA FECUNDACIÓN en donde como su nombre lo indica, la hembra se
Monta natural:
semen y embriones
pondrá recep va al macho y la copula podrá efectuarse. Inseminación artificial: Se debe realizar por un médico veterinario, el estro en la hembra debe ser confirmado por una citología o progesterona en sangre, se realizará la colección estéril del semen, valoración macro y microscópica del mismo, una vez aprobado la calidad del semen se procederá a la inseminación la cual puede ser intravaginal, intrauterina y quirúrgica.
semen y embriones
BIBLIOGRAFÍA CORREA, J. (noviembre de 2001). Alabama and auburn universi es. Recuperado el 20 de enero de 2014, de h p://www.aces.edu/pubs/docs/U/UNP-0052/UNP0052.pdfHUTCHINSON, R. (10 de Febrero de 2001). IAMS Company. Recuperado el 20 de Enero de 2014, de h p://www.dpca.org/BreedEd/PDF/Euk_Repro.pdfMENDOZA, I. C. (1996). Medicina interna IV: Urinario y Genital. México.SORRIBAS, C. (2005). Atlas de reproducción canina. Buenos Aires: Intermédica.
Impactos de factores ambientales, sociales, y de desarrollo humano en la función reproductiva de los animales que habitan en sistemas ecológicos vírgenes Universidad San Francisco de Quito Sr.Andrés Núñez Quito- Ecuador
Introducción
L
a pérdida de vegetación n a va e n l a s s e l va s y boques tropicales por ac vidades humanas como la agricultura alteran a los animales herbívoros que u lizan dichas plantas como fuentes alimen cias o para alguna fase de su ciclo vital reproduc vo (Bravo, 2007). La caza humana es la principal presión que sufren los mamíferos y las aves. Se reconocen diferentes pos de caza: caza de subsistencia (la principal), caza depor va, caza de entretenimiento y caza de ocasión. La caza ejerce altos niveles de estrés sobre los mamíferos ya sea para que sirvan como alimento o como mascotas de venta y comercialización (Herrán et al., 2010). La fauna local silvestre es afectada por la cacería y pesca que es prac cada por pobladores locales o trabajadores petroleros para la su propia alimentación especialmente
durante los estudios sísmicos (Bravo, 2007). Las rutas o caminos hechos por humanos que atraviesan selvas o bosques de cualquier po enen varios efectos nega vos para el ecosistema en general. Puesto que el paso de personas y vehículos crea una contaminación atmosférica por emisión de gases de escape, una contaminación acús ca, y una contaminación de aguas superficiales y suelo por derrames de substanciasnocivas como combus bles, petróleo, lubricantes y otros. Igualmente, las rutas también generan compactación del suelo, con pérdida de permeabilidad, muertes de animales atropellados, incendios originados por derrames de combus bles, y remociones de masa orgánica y de suelo para trazar el camino en zonas con altas pendientes (Herrán et al., 2010).
La cría de ganado es entre las principales causas de destrucción de los bosques de América La na, ya que la conversión de los bosques en pasturas ene un efecto drás co sobre las comunidades animales y vegetales. Además, la presión del pastoreo y el pisoteo del ganado dentro de los bosques también es un factor de deterioro aunque menos evidente y estudiado. Las principales consecuencias que causan el ganado sobre los ecosistemas naturales son: modificación del proceso de sucesión natural, eliminación de especies na vas, disminución de la regeneración arbórea, facilitación de establecimiento de plantas invasoras, aumento de la erosión, eliminación de la capa de vegetación protectora del suelo, compactación y salinización del suelo, competencia con fauna na va, y aumento del escurrimiento superficial (Herrán et al., 2010). semen y embriones
Desarrollo Primeramente, hay que establecer que existe una gran explotación petrolera en las estribaciones Andinas y en las sierras que forman la cuenca del Orinoco, uno de los hot spots de biodiversidad del planeta (Bravo, 2007). En ciertos lugares amazónicos ecuatorianos intervenidos por construcciones humanas se ha visto una reducción en la can dad de primates grandes y un aumento de la densidad de especies pequeñas debido a que estas especies pequeñas no enen que compe r con los animalesgrandes por los recursos alimen cios y además porque sus áreas de alimentación y reproducción son menores. Las poblaciones de aves también son afectadas. Las construcciones de infraestructura petrolera interrumpe importantes corredores biológicos como son zonas de anidación, zonas de caza, salderos y reproducción de especies grandes (Bravo, 2007). Además, se produce una contaminación de ruido provocada por las detonaciones de dinamita que se hacen cada 6 metros en la fase de prospección sísmica. Igualmente, lo hace los ruidos de los camiones y helicópteros de transporte que hacen que los animales escapen o cambien su comportamiento animal (Bravo, 2007). Similarmente, cuando se realizan estudios sísmicos en el mar se producen disparos aéreos. Estos disparos son dirigidos hacia abajo, teniendo un efecto horizontal significa vo. El sonido bajo el agua ene un impacto de hasta 10 km a la redonda. Los impactos nega vos de estas prác cas son notorios en áreas reproduc vas de peces y larvas de peces de
semen y embriones
importancia comercial. La can dad de peces reduce tanto en la zona pelágica como en el fondo de la columna de agua. También existe una disminución en las fuentes alimen cias de aves, mamíferos marinos y cetáceos, especialmente esto les afecta más en las temporadas de lactancia o crianza. Además las detonaciones afectan las rutas de especies migratorias, especialmente las ballenas. Los lodos de perforación en base a petróleo inhiben el crecimiento y desarrollo reproduc vo de especies marinas. Se encuentran cambios en las respuestas inmunológicas en peces y otras especies. También hay un aumento en la sensibilidad de algunos crustáceos marinos como langostas y camarones, especialmente en las fases tempranas del desarrollo embrionario (Bravo, 2007). La contaminación por petróleo produce efectos su les en la vida marina, ya que los componentes aromá cos disueltos en el agua alteran los mecanismos de quimiorecepcion de algunos organismos marinos. La quimiorecepcion es necesaria para la búsqueda de alimentos y para procesos reproduc vos. La interrupción de estos procesos puede terminar con las poblaciones del área contaminada, aunque el nivel de contaminación sea más pequeña que el nivel letal definido en la forma convencional (Bravo, 2007). Muchas especies de aves enen si os especiales de copulación y requerimientos alimen cios especiales durante el periodo reproduc vo, y las detonacionespueden significar la pérdida de toda una estación reproduc va, afectando la composición de las poblaciones naturales. Las deto-
naciones pueden producir alteraciones en el comportamiento reproduc vo o alimen cio de aves, mamíferos y peces. Los impactos son peores en lugares de desove, apareamiento o crianza. El petróleo genera efectos reproductores nega vos como debilidad general de los animales, incapacidad de poner huevos, alteraciones en comportamientos reproduc vos, disminución en el número de huevos puestos y adelgazamiento de la cascara del huevo. Los huevos de las aves son muy vulnerables al petróleo y este úl mo se puede acumular en los tejidos grasos de los mismos (Bravo, 2007). Cuando suceden casos de contaminación del agua por petróleo u otro po de contaminante, los anfibios son extremadamente afectados dado que estos respiran a través de la piel que es muy sensible y además u lizan el agua y la erra en todos sus ciclos vitales de reproducción. Esto puede llevar a la ex nción de especies endémicas que requierenmicro hábitats de agua. Los ciclos anules de los ríos amazónicos ecuatorianos son de vital importancia para los estadios reproduc vos de los peces. La mayoría de peces amazónicos dependen de las inundaciones del bosque para obtener acceso a ciertos alimentos como semillas y frutos caídos, y esto se podría ser interrumpido si se altera los ciclos de inundaciones (Bravo, 2007). Al realizarse estudios sobre los impactos ambientales a largo plazo de un derrame ocurrido en la Bahía Las Minas en Panamá, donde se encontró que la reducción en el éxito reproduc vo se debe a un mal desarrollo del tejido reproduc vo y se atrofian las
células reproductoras. Este efecto puede durar algunos años después del contacto con el crudo, disminuyendo la reproducción y la densidad poblacional. También se ha visto que en áreas de anidación de tortugas, una contaminación petrolera ene un gran impacto en su reproducción. Puesto que los embriones de tortugas expuestos a petróleo en estadios más tardíos son muy sensi vos a los efectos tóxicos del petróleo. El petróleo retarda la eclosión de los nuevos tortugas bebes y produce anormalidades en el carapacho de las tortugas, especialmente cuando la exposición ocurre en los estadios tempranos, etapa en la cual se forman estos (Bravo, 2007). El uso de estas tecnologías ha sido limitado en especies silvestres y se debe a la dificultad para manejar estas especies y la falta de conocimiento de su biología. Se ha demostrado que existe una gran diferencia entre los patrones masculinos y femeninos también entre una especie a otra. Por ejemplo, dentro de las caracteríscas del semen puede variar el número de espermatozoides producidos y eyaculados, así como en la composición lipídica de la membrana de los espermatozoides, la sensibilidad a la congelación, la variabilidad de preparación de los espermatozoides para la fecundación. En las hembras existen variaciones en los ciclos hormonales, la inducción de la ovulación, o fisiología de la gestación en los mamíferos (se conoce solo 20-30 especies) (Roldán et al., 2005). Por estas razones resulta di cil extrapolar de una especie a otra en los casos de congelación del semen, o de inseminación ar ficial. Sin embargo, se ha realizado
estudios con animales domés cos como congelación de semen de bovinos para ungulados silvestres, o de gatos felinos en peligro de ex nción, pero se hace necesario un proceso de experimentación preliminar para poder transferir una tecnología reproduc va de una especie a otra (Roldán et al., 2005). Entre las tecnologías más desarrolladas tenemos la inseminación ar ficial, la transferencia y congelación de embriones, la fecundación in vitro, la obtención y congelación del semen. Para poder realizar la obtención y congelación del semen se ha tenido que recurrir al empleo de una vagina ar ficial, u lizando técnicas de electroeyaculacion bajo anestesia quirúrgica. En cuanto a los ungulados no se ha tenido ningún inconveniente, que nos permite realizar recolecciones repe das de cada macho, obteniendo un gran número de muestras(Roldán et al., 2005). En zoológicos y centros de inves-
gación existen programas de inves gación de criopreservacion de gametos; sin embargo, hay pocos programas de preservación y conservación de estos recursos gené cos de especies silvestres .Actualmente en Australia se realiza un programa de conservación de marsupiales, en Namibia se hace un programa de conservación de guepardos, en Italia se realiza un programa de reproducción asis da y conservación de recursos gené cos, y en España existen bancos gené cos de especies silvestres mamíferos. En países como España los museos nacionales enen un banco gené co de 3 especies de gacelas y se han desarrollado estudios de congelación de semen y su calidad, de igual manera se está haciendo para otros animales como el lince y el ciervo ibérico (Roldán et al., 2005).
semen y embriones
La inseminación ar ficial consiste en la u lización de técnicas no invasivas para depositar el semen en la vagina o útero, aunque esta técnica es baja en especies silvestres cuando se u liza semen congelado. Resulta di cil el manejo del estrés que este método produce en los animales silvestres, ya que no han sido entrenados o domes cados por el hombre. Por lo que se emplea la laparoscopia bajo anestesia y se deposita el semen en los cuernos uterinos de la hembra(Roldán et al., 2005).
Para lograr una mejor inseminación se recurre a la sincronización de los ciclos hormonales de las hembras, empleándose disposi vos vaginales de liberación de hormonas (progesterona) que inducen la ovulación. Claro que existen factores que influyen en la inseminación ar ficial como la duración del tratamiento, o las dosis hormonales. Se ha tenido éxito con este método en 30 especies de mamíferos diferentes y de estas 16 son silvestres(Roldán et al., 2005).
En España, la inseminación ar ficial unida a la congelación de semen se ha logrado aplicar en pumas, gres y leopardos, el ciervo de eld, y otros animales. Aunque la inseminación vaginal ha sido muy poca sa sfactoria en estas especies, siendo necesaria la inmovilización farmacológica del animal para aplicar la reproducción ar ficial (Roldán et al., 2005).
La superovulación y transferencia de embriones son herramientas biotecnológicas u lizadas para aumentar la eficiencia reproduc va de animales exó cos o razas en peligro de ex nción. Estas técnicas consisten en es mular el desarrollo de una alta can dad de folículos ováricos des nados a la atresia (degeneración programada propia de
las células) en los animales, obteniéndose un número de embriones transferibles que varía entre 3 y 7. La respuesta superovulatoria es una de las variables de mayor relevancia para el éxito de los programas de transferencia de embriones. Existen varios factores que afectan la respuesta hormonal. Por ejemplo, la determinación de la presencia del lla-
mado folículo dominante, inhibe el desarrollo del resto de folículos y reduce la respuesta superovulatoria. Se recomienda un análisis exhaus vo de la fisiología y comportamiento del animal en estudio.Las altas tasas de ovocitos no fecundadoses un problema asociado con los tratamientos superovulatorios. Esto se debe a las alteraciones de la
semen y embriones
maduración como consecuencia del desorden químico, metabólico y motriz presentes en el oviducto y el útero. Estos factores afectan de gran manera la respuesta superovulatoria que a la final establece el éxito y el costo de la técnica en sí. Dado que la eficiencia de esta técnicaestá limitada también por el número de embriones producidos por cada hembra tratada, se recomienda u lizarla en anfibios y rep les (Palma et al., 2009). La conservación de los embriones es otra técnica biotecnológica u lizada en la cual los embriones en fases de mórulas y blastocitos obtenidos por medio de transferencia de embriones pueden ser congelados, descongelados y transferidos sin mayor perdida en la tasa de gestación (Palma et al., 2009). La criopreservación embrionaria contempla cuatro etapas (Belascoain et al., 2010): Ÿ suspensión de los embriones en soluciones con crioprotectores. Ÿ enfriamiento en nitrógeno líquido (-196ºC), sin formación de cristales intracelulares. Ÿ enturbiamiento de los embriones a temperaturas fisiológicas para reasumir sus funciones biológicas. Ÿ remoción de los crioprotectores. Los crioprotectores permeables más frecuentemente u lizados son: glicerol y e lenglicol. Durante la fase inicial de preenfriamiento, los embriones se exponen a la presencia del crioprotector. El embrión ante la presencia de un crioprotector permeable disminuye de volumen por pérdida del agua intracelular, hasta que se alcanza el equilibrio. Esto ocurre por la hiperosmolaridad
inicial de la solución extracelular y al hecho que los embriones son mucho más permeables al agua que a los crioprotectores. La duración de este periodo depende del crioprotector, pero el empo óp mo del e lenglicol es de 5-10 minutos, mientras que para el glicerol es de 10-20 minutos. La inducción de la formación de cristales se da entre temperaturas de -5 y -7°C. Luego se produce un descenso controlado y lento de la temperatura (0,3 a 1,0ºC/min) hasta llegar a los 35°C. Después se produce la colocación de los embriones en nitrógeno líquido para estar almacenados. La descongelación controlada posterior es de 250ºC/min, y la remoción del crioprotector es hecho a temperatura ambiente (Belascoain et al., 2010). La conservación temporal de los embriones recolectados de una madre animal donante antes de ser transferidos o congelados, se realiza en un medio de Solución Buffer Fosfato (PBS), ayudado con 10% de suero fetal que sirve como una fuente de proteínas que reduce la tensión superficial. Esto evita que los embriones se adhieran a algún elemento u lizado para su manipulación, incrementa la can dad de sustancias promotoras del crecimiento, e inhibe metales pesados tóxicos en el medio. La viabilidad embrionaria disminuye después de 12 horas (Belascoain et al., 2010). Los embriones mamíferos se congelan por la técnica lenta tradicional u lizando crioprotectores permeables, pero su descongelación es rela vamente rápida a 20-37°C durante 20-30 segundos. Además, presenta unos 4560% de preñez al momento de u lizar embriones de excelente
calidad, pero ene el inconveniente de que inmediatamente de realizarse la descongelación, el crioprotector debe ser re rado del embrión para evitar el shock osmó co. Esto hace que se requiera un empo mayor que al u lizar otros métodos más directos de criopreservacion (Belascoain et al., 2010). Conclusiones Las biotecnologías reproduc vas pueden u lizarse para la conservación de especies en peligro de ex nción. La conservación de germoplasma, principalmente de espermatozoides a atreves de la congelación da la oportunidad de realizarse bancos de preservación gené ca actual. Mientras que la congelación de óvulos es una opción atrac va que en un futuro pude dar la capacidad de maximizar la conservación de los recursosgené cos, incluyendo a los gametos femeninos. Se espera que el desarrollo de otras técnicas avanzadas como la preselección de sexo mediante separación de espermatozoides X e Y, la transferencia de espermatogonias, la maduración in vitro de ovocitos o el trasplante de injertos tes culares en animales silvestres puedan ser una salvación para su conservación. Para que se dé un desarrollo en las tecnologías reproduc vas se necesita profundizar en el conocimiento de la fisiología reproduc va de especies silvestres y mejorar las leyes de protección ecológica en sus hábitats normales. Se necesita obtener másconocimiento sobre los procesos de reproducción a través de mejores programas de cría en cau verio. Es imposible pensar que las biotecnologías reproduc vas pueden evitar que especies silvestres
semen y embriones
que viven en constante cau verio o son cazadas todo el empo no se van a ex nguir, ya que si los números de individuos se reducen a tal punto que se va a perder toda variabilidad gené ca dentro de las poblaciones y va a exis r un alto índice de consanguinidad que va a impedir la reproducción natural de las especies amenazadas (Roldán, 2005).
Bibliogra a Belascoain, M.G., Teresa, D.E., Soledad, H. (2010). Técnicas Para La Criopreservación De Embriones Bovinos. Universidad Nacional De Córdoba. Facultad De Ciencias Agropecuarias. Escuela Para Graduados. Ins tuto De Reproducción Animal Córdoba (IRAC). Bravo, E. (2007). Los Impactos De La Explotación Petrolera En Ecosistemas Tropicales Y La Biodiversidad. Acción Ecológica. Tomado de: h p://www.inredh.org/archivos/documentos_ambiental/impactos_ explotacion_petrolera_esp.pdf Herrán, M. et al. (2010). Las Yungas - Problemas de Conservación y propuestas de solución. Red Yaguareté, Fundación sin fines de lucro. Tomado de: h p://www.jaguares.com.ar/yungas/problemas.html Palma, G.A., Brem, G. (2009). Biotecnología de la reproducción. Reprobiotec. Tomado de: h p://www.reprobiotec.com/libro_verde/cap_01.pdf Roldán, E., Garde, J. (2005). Biotecnología de la reproducción y conservación de especies en peligro de ex nción. Los retos medioambientales del siglo XXI. Museo Nacional de Ciencias Naturales (CSIC), Madrid e Ins tuto de Inves gación en Recursos Cinegé cos (CSIC-UCLMJCCM) Albacete.
semen y embriones
Clonación por Transferencia de Núcleos y su Importancia en Especies Amenazadas Universidad San Francisco de Quito. Srta. Diana Calderón
Abstract: La clonación por transferencia de núcleos es una técnica biotecnológica que fue ampliamente conocida con el nacimiento de la oveja DOLLY , el primer mamífero en ser clonado. Este experimento no solo demostró que las células somá cas poseían toda la información genéca necesaria para generar un nuevo ser. Esta es una técnicas u lizadas en biotecnología reproduc va ; que se ha u lizado a lo largo del empo para realizar clones de un individuo y ser una alterna va para la conservación de especies y, para muchos , la esperanza |a esperanza de regresar a la vida a ciertas especies que no habitan naturalmente la erra. Mucha polémica ha abarcado en tema, donde los grupos, tanto a favor como en contra , reclaman el sen do común y la é ca de los inves gadores inmiscuidos en este po de clonación . Keywords: B i o te c n o l o g í a reproduc va,, ex nción, conservación, transferencia nuclear, bioé ca.
Introducción
¨ El progresivo deterioro de los ecosistemas naturales y desaparición de especies es uno de los mayores problemas ambientales a escala global¨ (Toledano, SF). ¨ Ex nción significa en Biología la desaparición de una especie o de un grupo taxonómico superior tal como una familia, un orden etc. Con ello queda truncada una línea filogené ca es decir, un proceso evolu vo ¨ ( Baena, 2008). La proliferación de la especie humana y las rapidísimas transformaciones que causa en el planeta, están provocando un periodo de ex nciones sin precedentes en la historia, superado incluso las cinco grandes ex nciones prehistóricas; algunos cien ficos es man que se están ex nguiendo 17.500 especies al año, lo que se supondría que en periodo 19990-2020 desaparecerán del 10% al 38% de las especies existentes (Toledano , SF) . Se puede nombrar varias causas principales causantes de la ex nción de especies; la primera constuye la desnutrición de hábitats, seguida por la introducción de especies exó cas, la caza de
especies cons tuye también un factor preocupante, sin dejar de lado la sobrepoblación de especies; todos estos factores alteran directamente al grado de reproducción de las especies, de modo que no pueden recuperarse del todo. (Eldredge,2001). Se especula que esta será la primera ex nción masiva causada por un factor bió co y no por algo sico como en las anteriores cinco ocasiones. La biotecnología en cuanto a la preservación de las especies se ha enfocado en la reproducción, donde ¨el ser humano interviene a fin de garan zar la conservac i ó n d e l a B i o d i v e r s idad¨(Ugalde, SF) . “ La reproducción es un fenómeno esencial para la supervivencia de especies y, por lo tanto, la Biología y Tecnología de la reproducción ene un papel esencial en la conservación de la biodiversidad” (Rldan,SF). Sin embargo, la reproducción es una ac vidad que se puede ser afectada por diversos factores , tales como aspectos del medio ambiente , de salud, de majo, nutricionales, gené cos, etc. A semen y embriones
los que se somete a los animales en cau verio (Rangel, SF). “ La Biotecnología, entonces contribuye al empleo sostenible de la diversidad biológica y su preservación, mediante el incremento de la eficiencia reproduc va de los animales” (Ugalde,SF). Existe una amplia gama de biotecnologías reproduc vas aplicables a la conservación de especies como: congelación de semen, inseminación ar ficial, conservación y transferencia de embriones, fecundación in vitro, preselección de sexo, micro inyección de espermatozoides, congelación de oocitos, trasplante de espermatogonias, clonación de transferencia de núcleo, etc (Roldán, SF). Dando un pequeño vistazo al pasado, esta es la historia cronológica de la clonación por transferencia de núcleos en animales: Ø 1952: Robert Briggs y Thomas King describieron la clonación en ranas (Rana pipiens) mediante el remplazo del núcleo en los huevos con células de renacuajo y con el epitelio intes nal en ranas adultas. Ø 1997: Anunciamiento de la Oveja Dolly , el primer mamífero enn el ser clonado mediante una célula adulta. Ø 1998: Inves gadores de nueva Zelanda anuncian en nacimiento de Elsie, un clon del úl mo ejemplar sobreviviente bovino en la raza (Bos garaus) . Ø 2003: Nacimiento de prometea un clon de la raza ( Equus caballus) a par r de una célula epidérmica. Ø 2005: Nacimiento de Snuupy , el primer perro clonado. Esta breve revisión se enfoca básicamente en las aplicaciones de la cuarta generación biotecnología que comprende la clonación con células somá cas desarrollada
semen y embriones
en la década de los 90´ s (Ugalde, SF) .” La clonación es un proceso como resultado del cual se originan individuos – céluls , embriones, organismos gené camente idén cos, denominados clónicos” ( Museo Cien fico Coruñeses,SF). La clonación por transferencia de núcleos también es conocida como conservación ex situ( Lascuráin,2009) . la clonación puede resultar decisiva para evitar la ex nción total de especies que no pueden vivir en cau verio , aunque es importante destacar que de poco serviría clonar a estos animales si no se modifican al mismo empo las causas que los han llevado al borde de la ex nción, ya sea la caza masiva de ejemplares o la destrucción del hábitat donde viven (Clonar animales en peligro de ex nción , SF)
Métodos Existen ciertas condiciones previas que deben ser tomadas en cuenta como punto de control antes de realizar la clonación mediante la transferencia de núcleos ; entre ellas se encuentran: Ø Análisis de los ovocitos: El laboratorio o el productor deberá establecer un historial detallado de los ovarios: su origen , salud del animal, detalles de cualquier lesión sistemá ca del animal y datos adecuados del rebaño. Los fluidos foliculares pueden contener varios agentes infecciosos y pueden contaminar la mezcla de fluido folicular procedente de diferentes animales sanos. Propósito: evitar la contaminación cruzada del tejido ovárico. Ø Análisis de las donantes: las células deberán recuperarse correctamente del animal y cul varse en condiciones sanitarias adecuadas ,
mediante el uso de buenas prác cas de laboratorio posteriormente , deben ser almacenados en condiciones adecuadas Propósito: minimizar los riesgos. Ø Análisis de los procedimientos: se debe regir un protocolo establecido y estandarizado ; los embriones deberán cul varse y recolectarse durante un empo y hasta una etapa apropiada , antes de transferirlos o crioconservarlos para un uso ulterior, ; adicionalmente se debe realizar una selección previa. Pronós co: obtener embriones de excelente calidad. Ø Análisis de la madre de alquiler: Realizar todos los análisis para comprobar que la madre de alquiler : Realiza todos los análisis para comprobar que la madre de alquiler y el embrión sean compa bles, aunque las malformaciones de los embriones pueden deberse a una mala reprogramación celular . La hembra receptora de ser joven , virgen y sincronizada. Proósito: evitar abortos espontáneos o reabsorción del embrión . Ø Análisis de los clones animales: Prevenir y controlar los problemas de salud ru nariamente, donde se deben determinar si las anomalías son de origen gené co o epigené co . Propósito : Asegurara el bienestar de las crías clonadas. (Transferencia nuclear de células somá cas en el ganado y los caballos de cría 2010) El proceso comprende de 6 etapas claras: 1. Enucleación: Se extrae un
óvulo de una animal , ser extra el núcleo que con ene DNA . El oocito eas considerado como un receptor univer-
2.
3.
4.
5.
6.
sal ya que no solo provee un medio apropiado para el núcleo de la célula donante en cualquier estado del ciclo , además ene la capacidad de actuar sobre la estructura y la función de la croma na del núcleo somá co, lo que lleva de nuevo a un estado de to potencialidad (Narbón,2008) Transferencia Nuclear: El núcleo es trasferido a un óvulo enucleado. Fusión: Obtenida por 2 pulsaciones eléctricas de 2025 kv/cm segundos. Ac vación Química y reprogramación celular: Se coloca a una célula somá ca adulta al estado similar al de la célula embrionaria prediferenciada. Depende de la habilidad del citoplasma del ovocito de poder remodelar la estructura de la croma na y apropiadamente reprogramar patrones de expresión gené ca de las células donantes. Cul vo in vitro de los embriones: Son colocados en incubadoras, donde se les permite crecer alrededor de unos 6 días , para luego ser implantado en la madrea de alquiler. Transferencia embrionaria en animales receptores. Gráfico N° 1 Proceso de modelo simplificado
Punto clave del proceso: Programación Celular “la reprogramación celular es el proceso mediante el cual las células madre pluripotentes inducidas son generadas; consistente en la conversión de Una célula somá ca adulta , u lizando un set definido de factores i8nductres de pluripotencia y adecuado medio de cul vo, para así obtener una célula muy parecida a la del estado embrionario” (Pico,011) En la clonación por transferencia de núcleos debe exis r una coordinación del ciclo celular de la célula receptora y el de donante de núcleos (Narbón , 2008). Previo a la trasferencia nuclear, las células donadoras del núcleo son incluidas a salir del ciclo de crecimiento y entrar en un estado de arresto celular (G0/G1 en el ciclo celular) , el cual potenciará el desarrollo embrionario , permiendo a los factores en el ooplasma reprogramar el núcleo donante y se permita que la expresión gené ca de la célula somá ca sea la apropiada para un desarrollo embrionario normal (Narbón,2008). El núcleo de la célula somá ca donante no debe haber iniciado o completado la replicación del ADN, para el cigoto pueda tener una ploidía o complemento9 cromosómico normal, es por esta razón que se necesita contar con donantes somá cos en fase G0 que se encuentran presentes en el cúmulus, células de Sertoli y neuronas. Si9 se ac va el oocito, y se le permite entrar a su primer ciclo celular, no ocurrirá la ruptura de la membrana nuclear después de la transferencia del núcleo de la célula donante. Es importante mencionar que es
núcleo quien determina si habrá o no replicación del ADN, de modo que puede esperarse una ploidía normal en nueva célula clonada (Narbón,2008). Otra técnica de reprogramación se conoce como la infección celulares con vectores len virales o retrovirales que consiste en la definición de un set de solo 4 factores inductores: Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4 (Combinación OSKM), demostrando que funcionaban en el mantenimiento de la pluripotencia en varios pos de células somá cas(Cruz,2010). Esta técnica fue u lizada por primera vez con éxito por los cien ficos Japoneses Takahashi y Yamanaka (2006) en la reprogramación de fibroblastos de ratón ( Cruz, 2010) Resultados En cuanto a la conservación de especies en peligro de ex nción, varios han sido los candidatos con posibles esperanzas fr volver a la vida como en el caso de: Bucardo Capra pirenaica. Tigre de Taasmania Thylacinus cynocephalus Ø Tigre dientes de sable Smilodon fatalis Ø Rinoceronte lanudo Coelodonta an quita s Ø El hombre neandertal Homo neanderthalensis Ø Mamut lanudo Mammuthus primigenius( Rigali , SF) Entre la grandes expect5a vas de volver a la vida animales ex ntos o asegurar la conservación de las especies que se encuentran en riesgo crí co, se debe entender que la técnica posee ciertas limitaciones y ciertas ventajas que son importantes y deben tener presentes: Ventajas Ø Transmisión y preservación del potencial gené co del individuo a clonar . Ø Ø
semen y embriones
Ø Ø
Ø
Ø
Reproducción y rápida programación de ejemplares. Asegura y mul plica disponibilidad de semen y embriones de animales de alto valor gené co. Reinserción al sistema produc vo de animales que por diversas razones quedaron fuera de este. Conservación de genes primivos (Rigali,SF)
Desventajas Ø Ø Ø Ø
Ø
Envejecimiento prematuro. Desarrollo de malformaciones congénitas. Padecimiento de dis ntas patologías. Baja eficiencia de la técnica ; en primates, la eficiencia de clonación bordea el 0.7 %. Para la clonación de Dolly se realizaron 270 intentos de clonación. (Aznar,2010)
Discusión “ La mejor estrategia de conservación en la biodiversidad es la preservación del medio Natural” ( Roldán, SF). Las especies en peligro de ex nción se encuentran b ajo niveles amplios de estrés especialmente debido a la ac vidad del ser humano , al contaminar, destruir los bosques, aumentar el efecto invernadero, caza ilegal, etc.(Roldán, SF). En busca de evitar la pérdida de los animales en peligro crí co, actualmente como el oso panda (Aznar,20010). Se ha u lizad las técnicas biotecnológicas ya protocolizadas en el campo ganadero (aplicación en vacas, changos,. Etc) para la conservación de las especies que en el mejor de los casos , se encuentran en cau verio . Pasando por la inseminación ar ficial hasta llegar al peligro de ex nción por transferencia de núcleo.” El uso de estas tecnologías en especies silvestres ha sido limitado, y de más reciente introducción; en parte esto se debe a
semen y embriones
la dificultad de acceder y manejar estas especies , pero también al desconocimiento de aspectos básicos de su biología” (Roldán,SF). La comprensión de la etología de las especies de interés es de una suma importancia para poder considerar la posibilidad de una posible transferencia de núcleos. Si bien la técnica analizada en este paper es de sumo interés, no se exime de los peligros de la clonación de especies animales. Posiblemente, después de varios años , las técnicas biotecnológicas mejoren tanto su protocolo como su eficiencia y no sean tan polémicas como para poder aplicarla masivamente. Conclusiones De toda la recopilación de la información obtenida acerca de la técnica de la clonación por transferencia de núcleos, se puede destacar que la clonación: Ø Ausencia de variabilidad gené ca: Se cuenta con muy poco material gené co, en el caso de las especies amenazadas y de mala calidad el caso de las especies ex ntas. Ø No sería la misma especie : Debido al punto anterior, se ha trabajo en variaciones mínimas en el DNA obtenido con el fin de crear variabilidad y hacer sostenible la conservación de la especie. Ø Polémica é ca: Gran oposición por parte de las personas que no apoyan proyectos gené cos , jugar a ser Dios no es la mejor forma de conservar una especie. Ø Dilemas polí cos: La falta de información y su mala interpretación han hecho que la conservación de las especies sea solo un juego polí co para conseguir el aplauso de las masas. Ø Riegos para todos: No solo se trata del riesgo real del peli-
gro frente al ser humano, sino también la calidad de problemas que pudiesen exis r al revivir especies ex ntas; el nicho ecológico que ocuparon hace miles de años pudo haber sido ocupado por otras especies ; ¿ Los ecosistemas tan frágiles podrían sostener a estos animales? Ø Hacia lo descocido : “ El resultado de las técnicas que desarrollemos para conseguirlo , la información que obtengamos con su estudio, quedarán ahí a, disposición de otros Inves gadores . El conocimiento ene un valor intrínseco”(¿Es posible que la ciencia pueda revivir a las especias ex ntas?2013)
Recomendaciones Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Trabajar bajo los marcos é cos y legales para la clonación de especies. Planificación de las consecuencias de la clonación para conservación de especies. Considerar si sería buena idea revivir animales ex ntos, ¿es realmente viable? Considerar si sería buena idea revivir animales ex ntos, ¿es realmente viable? Perfeccionar la técnica y el proceso de clonación mediante la transferencia de núcleos. Concien zar a la población de la importancia de la conservación de la flora y fauna en peligro de ex nción.
Literatura Citada Ø ¿Clonara animales en peligro
de ex nción? (S F) . www.wduca vo.utalca.cl. Extraído el 31 de ,octubre del 2013. Ø Desde:www.educa vo.utalc a.cl/medios/educa vo/estud
Ø
Ø
Ø Ø Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
iates/media/recursos/clona. pdf ¿Es posible que la ciencia pueda revivir a la especies ex ntas? (2013). El comercio.pe. Extraído el 15 de noviembre de 2013. Desde el c o m e r c i o .pe/actuaqlidad/1559253/no cias-posible-reviviresxpecies-ex ntas Azanar, J (2012). Clonación, células madre y reprogramación celular. www.observatoriobioe ca.c om.Extraido el 31 de octubre del 2013 B aena,M, Halffer,G,Lira, A,Soberón, J, Galindo, C, Franco , M y Montellano, ,(2008).Ex nción de especies. www.biodiversidad.com/presentaciones/reprogr amacion_celulara.pdf Cruz , L.(2010). Reprogramación Nuclear y celular.webcache.googleusercontent.com. Extraído el 21 de octubre del 20103. Desde www.biodivers i d a d .gob.mx/pais/pdf/CapNatMe x/Vol%200I/I10_Ex nciones. pd. Eldredge, N (2001). La sexta Ex nción.www.ac onbioscience.org. Extraído el 31 de octubre del 2013. Desde w w w. a c o n b i o s c i e n c e.org/esp/nuevasfronteras/el dredge.html Imbiomed. (SF). Fundamentos Teóricos www.imbiomed. o rg . E x t ra í d o e l 1 5 d e noviembre. Desde www.imb i o m e d.org/Index..php/plataformas _ t e c n o l o g icas/reprogramacioncelular _ Lascuráin, M. etal.(2009). Conservación de especies exsitu.www.biodiversidad.-
gog.mx. Extraído el 310 de octubre del 2013. Desde w w w . b i o d i v e r s i d a d .gob.mx/pais/pdf/CapNatMe x/Vol%20I1/I I 12 _ C o n s e r v acion%20de% especies%20 ex%situ.pdf Ÿ Museos Cien ficos Coruñes e s . ( S F ) .MCCORUNA.ORG.Extraído el 31 de octubre del 2013. D e s d e . h p://mc2coruna.org/doc/m c2-clonacion-human.pdf.
semen y embriones