La luz como nueva herramienta en farmacología

La luz como nueva herramienta en farmacología Los azobencenos son moléculas constituídas por dos anillos de benceno unidos a través de un doble enllace N=N. Este doble enlace puede presentar dos geometrías y, como consecuencia, tenemos dos isómeros diferentes: el cis y el trans. Estos isómeros se pueden interconvertir entre ellos mediante luz de una determinada longitud de onda (Figura 1).

Figura 1. Reacción de isomerización del azobenceno entre los estados trans/cis.

Estos compuestos han sido ámpliamente utilizados como tintes debido a la coloración intensa que presentan. De hecho, se ha observado que los dos isómeros pueden presentar coloraciones muy diferenciadas. Además, los espectros de absorbancia que presentan los dos estados de la misma molécula son claramente diferentes (Figura 2).

0.20

0.20

0.15

0.15

Dark

Absorbance (AU)

Absorbance (AU)

380nm

0.10 Trans

0.05 Cis

365nm 500nm

0.10

405nm 580nm

0.05

435nm 525nm

0.00 300

550nm

0.00 400

500

600

300

Wavelength (nm)

455nm

400

500

600

595 nm

Wavelength (nm)

Figura 2. Espectros de absorbancia de un azobenceno en su forma estable (trans) y excitada (cis).

1

Alhora estos compuestos se utilizan en un campo muy innovador y reciente denominado fotofarmacología. La idea es que la fotofarmacología utiliza la luz para activar o desactivar los fotofármacos en células, tejidos u órganos específicos, proporcionando un alto grado de control local y temporal de la actividad de la molécula (Figura 3). Así pues, este hecho la hace útil para aplicaciones terapéuticas y como herramienta de investigación. Aunque no está en fase de desarrollo clínico, tiene el potencial de convertirse en una nueva terapia en medicina, puesto que permitiría fotocontrolar de manera selectiva la liberación de fármacos en el cuerpo humà.

Figura 3. Funcionamiento de los fotofármacos. En un futuro, el paciente ingeriría el fotofármaco inactivo (bolas grises en la figura adjunta) y éste se distribuiría por todo el cuerpo. Entonces, con un dispositivo adecuado se iluminaría el tejido o el órgano en el que de manera específica se quiere actuar. La luz activaría el fotofármaco (bolas tojas en la figura adjunta), de modo que haría efecto en la zona iluminada.

Durante el desarrollo del taller práctico, los asistentes se adentrarán en este innovador mundo de la fotofarmacología. Por un lado, conocerán las características fotoquímicas de los azobencenos y a la vez su uso en varios campos. Y por otro lado, estudiaremos las proteínas y su importancia como diana en varias patologías. Por eso, se llevarà a cabo la caracterización fotoquímica de un derivado de azobenceno y un ensayo colorimétrico para conocer la concentración proteica de las muestras.

SESIONES Las sesiones serán de 3-4 horas aproximadamente y se llevarán a cabo durante los meses de enero a abril. La actividad se realizará a las instalaciones del grupo de investigación Medicinal Chemistry & Synthesis* liderado por el Dr. Amadeu Llebaria (IQAC-CSIC, Barcelona). Finalmente, comentar que el taller práctioc estará dirigido por las estudiantes de doctorado Anna Duran Corbera y Maria Ricart Ortega.

Más información: web del grup: https://www.iqac.csic.es/mcs/ web del IQAC: https://www.iqac.csic.es/

2

Photochemical characterisation

Assay 1 using plates LED (continuous mode) 1) Prepare a 0.001 M solution 1 from 0.01 M stock solution (100%DMSO) of compound X. 2) Prepare a 5 or 50 µM solution from 0.001 M (1 mM or 1000 µM) stock solution 1 of compound X. Prepare the following solutions: -

Add 10 µL 0.001 M stock solution and 190 µL DMSO (condition 100% DMSO) Add 1 µL 0.001 M stock solution and 199 µL DMSO (condition 100% DMSO) Add 10 µL 0.001 M stock solution and 190 µL Binding buffer pH 7.5 (condition 5% DMSO in Binding buffer pH 7.5) Add 1 µL 0.001 M stock solution and 199 µL Binding buffer pH 7.5 (condition 0.5% DMSO in Binding buffer pH 7.5)

Use a transparent 96-well plate to perform the assay.

3) Mix the samples by shaking at 250 rpm. Keep the samples in the dark.

4) Record the DARK absorbance spectra from 300 nm to 800 nm.

5) Apply a constant 380 nm light illumination 3 min at 12 V. 1) Record the 380 nm absorbance spectra from 300 nm to 800 nm.

2) Apply a constant 500 nm light illumination 3 min at 12 V. 3) Record the 500 nm absorbance spectra from 300 nm to 800 nm.

4) Apply a constant 455 nm light illumination 3 min at 12 V. 5) Record the 455 nm absorbance spectra from 300 nm to 800 nm.

6) Apply a constant 550 nm light illumination 3 min at 12 V. 7) Record the 550 nm absorbance spectra from 300 nm to 800 nm.

3

Determinación proteína hmGlu5 mediante BCA Kit

El ácido bicinconínico (BCA), sal sódica, es un compuesto capaz de formar un complejo púrpura intenso con inones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un método analítico capaz de monitorizar el ión cuproso producido en una reacción entre las proteínas con Cu2+ en medio alcalino (reacción de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromóforo proporciona un método para la cuantificación de proteínas que es sencillo, rápido, muy sensible, y que muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros métodos.

Listado del material necesario - Tubos de ensayo o placa 96 - Pipetas de automáticas regulables de 20-100 μl y de 200-1000 μl - Espectofotómetro - Agua destilada o MiliQ - Soluciones estándar de proteína - Reactivo de BCA 4

Método de BCA - Preparar las diferentes diluciones de la recta patrón (BSA) y de las muestras problemas según la siguiente tabla: 1

2

3

4

5

6

A

20 µL H2O MiliQ

20 µL H2O MiliQ

0

0

0

0

0 mg/mL

0 mg/mL

B

20 µL H2O MiliQ + 20 µL C1 - 20 µL dio final

20 µL H2O MiliQ + 20 µL C2- 20 µL dio final

1/64

1/64

1/64

1/64

0.03 mg/mL

0.03 mg/mL

20 µL H2O MiliQ + 20 µL D1

20 µL H2O MiliQ + 20 µL D2

1/32

1/32

1/32

1/32

0.06 mg/mL

0.06 mg/mL

20 µL H2O MiliQ + 20 µL E1

20 µL H2O MiliQ + 20 µL E2

1/16

1/16

1/16

1/16

0.125mg/mL

0.125mg/mL

20 µL H2O MiliQ + 20 µL F1

20 µL H2O MiliQ + 20 µL F2

1/8

1/8

1/8

1/8

1/4

1/4

1/4

1/4

1/2

1/2

1/2

1/2

nontransf

nontransf

transf

transf

C D E

-

0.25 mg/mL

0.25 mg/mL

F

20 µL H2O MiliQ + 20 µL G1

20 µL H2O MiliQ + 20 µL G2

0.5 mg/mL

0.5 mg/mL

G

20 µL H2O MiliQ + 20 µL H1

20 µL H2O MiliQ + 20 µL H2

1 mg/mL

1 mg/mL

H

40 µL BSA

40 µL BSA

2 mg/mL

2 mg/mL

7

8

9

Añadir 100 µL Mix BCA a cada pocillo (para 1 mL = 500 µL A + 480 µL B + 20 µL C).

Incubar 30 min a 37 ºC. Leer Absorbancia a 562 nm frente al blanco.

Representar la curva estándar y mirar valores de las muestras problema.

5

10