Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYTSECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYTFONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYTFACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACIA UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

INFORME FINAL

ESTUDIO QUÍMICO DE LOS ACEITES ESENCIALES Y METABOLITOS SECUNDARIOS DE TRES PLANTAS DEL GÉNERO Lantana (VERBENACEAE).

PROYECTO FODECYT No. 011-2007

JUAN FRANCISCO PÉREZ SABINO Investigador Principal

GUATEMALA, AGOSTO DE 2011.

AGRADECIMIENTOS: La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología -CONCYT-.

Biografía académica de los autores: Dr. Juan Francisco Pérez Sabino.

Químico graduado de la Universidad de San Carlos, MBA por ESEADE, Universidad Francisco Marroquín y M.Sc. en Estudios Ambientales por la Universidad del Valle de Guatemala. Es Doctor en Química de Productos Naturales, por el Núcleo de Pesquisas de Productos Naturales de la Universidad Federal de Río de Janeiro, Brasil. Ha hecho estudios de especialización en Química Analítica Nuclear en la Universidad de Lund, Suecia, y en la Universidad de Viena, Austria, y de microcontaminantes orgánicos en medio ambiente en los Laboratorios del OIEA en Seibersdorff, Austria, y en el Instituto Biológico, Sao Paulo, Brasil. Profesor Titular de la Escuela de Química de la USAC desde 1998, actual Director de la misma, ha impartido cursos de Química Orgánica, Análisis Instrumental y Fisicoquímica desde 1993. Anteriormente se desempeñó como Jefe del Laboratorio de Radiactividad Ambiental de la Dirección General de Energía Nuclear (1990-1997). Ha participado en más de 25 proyectos de investigación relacionados con la Química Ambiental, Radiactividad Ambiental, Química Analítica y Química de Productos Naturales. Es Autor y Co-autor de 12 publicaciones nacionales y más de 30 internacionales.

M.A. Sully Margot Cruz Velásquez Química Farmacéutica, Maestría Multidisciplinaria en la Producción y Uso de Plantas Medicinales (MUPLAM) graduada de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos. Profesora a nivel Licenciatura de los cursos Farmacognosia y Fitoquímica, profesora a nivel de posgrado de los cursos Farmacología y Toxicología, Técnicas Instrumentales de Análisis. Se ha capacitado en técnicas instrumentales, caracterización fitoquímica y evaluación de bioactividad de extractos vegetales, formulación de productos cosméticos y medicinales en INETI Portugal, Universidad Federal de Rio Grande do Sul, Universidad de Niteroi en Brasil y Centro de Investigación de la Flora Panameña de la Universidad de Panamá. Ha participado como Coordinadora e Investigadora en proyectos nacionales e internacionales sobre química de productos naturales, fitocosmética, farmacología, agrotecnología, biotecnología. Autora y coautora en doce publicaciones nacionales e internacionales.

M.Sc. Pedro Guillermo Jayes Reyes Químico graduado de la Escuela de Química de la USAC, habiendo sido acreedor al Premio a la mejor tesis del año por la USAC en 1996. M.Sc. en Formulación y Evaluación de Proyectos, Faculta de Economía, USAC. Ha hecho estudios de especialización en Ciencia y Tecnología Ambiental por la Universidad de Cádiz, y Nanotecnología en la USAC. Es Profesional Analista e Investigador de la Unidad de Análisis Instrumental de la Escuela de Química. Ha impartido cursos de Fisicoquímica, Gerencia y Garantía de la Calidad y Formulación y Evaluación de Proyectos de la Escuela de Química. Ha participado como coordinador e investigador en proyectos de investigación en el área de la Química de Productos Naturales. Cuenta con tres publicaciones nacionales y una internacional.

Lic. Fabiola Prado de Micheo Química Farmacéutica, graduada de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos. Investigadora y Analista Profesional del Departamento de

Toxicología de la USAC desde 1997. Laboró de 1972 a 1996 como Investigadora y analista en el ICAITI. Tiene especialización en Cultivo de Tejidos efectuada en el Centro Agronómico Tropical de investigación y Enseñanza), Turrialba, Costa Rica y en Técnicas Cromatográficas de Análisis en los Laboratorios de la Armada de los EE.UU. en Natick, Massachussets, Estados Unidos. Ha asesorado siete tesis de graduación en la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la USAC y tiene trece publicaciones internacionales en el área de la Química Agrícola.

M.Sc. Bessie Oliva Hernández de Sandoval Química graduada de la Universidad de San Carlos. Obtuvo su M.Sc. en Estudios Ambientales en la Universidad del Valle de Guatemala. Profesora de la Escuela de Química de la USAC desde 1998, ha impartido cursos de Química Orgánica, Análisis Instrumental y Fisicoquímica des 1993. Realizó estudios de especialización en Análisis de Metales Traza en el Centro de Energía Nuclear en la Agricultura (CENA), Piracicaba, Brasil, y en la Universidad Católica del Norte, Antofagasta, Chile, y de Garantía de la Calidad, en la Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia. Anteriormente se desempeñó como Jefe del Laboratorio de Fluorescencia de Rayos X de la Dirección General de Energía Nuclear (1992-1996). Ha participado en más de 25 proyectos de investigación relacionados con la Química Ambiental, Química Analítica y Química de Productos Naturales. Es Co-autora de 10 publicaciones nacionales y más de 20 internacionales.

M.A. Christian Daniel Farfán.

Químico graduado de la Escuela de Química de la USAC. Maestro en Uso y Producción de Plantas Medicinales por la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la USAC. Se ha capacitado en Nanotecnología en la USAC y en Cristalografía Matemática en Universidad de La Habana, Cuba. Cuenta con cinco años de experiencia en proyectos relacionados a la Química de Productos Naturales en la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia. Se ha desempeñado también en la docencia relacionada con Química Orgánica y Análisis Instrumental. Es Autor de 2 publicaciones nacionales y Co-Autor de 5 publicaciones nacionales e internacionales.

También participaron en este proyecto: Lic. Armando Cáceres Lic. Marco Vinicio García Sarán Licda. Odra Babette Lara Max Samuel Mérida Reyes

INDICE ABREVIATURAS _________________________________________________ i RESUMEN iii SUMMARY (ABSTRACT) iv PARTE I I.1 INTRODUCCIÓN

1

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA I.2.1 Antecedentes I.2.1.1 Plantas a estudiar I.2.1.2 Lantana camara I.2.1.3 Lantana hispida HBK I.2.1.4 Lantana trifolia L. I.2.1.5 Estudios de polimorfismo de aceites esenciales de diferentes plantas I.2.1.6 Estudios de actividad antimicrobiana de aceites esenciales de plantas en América Latina I.2.2 Justificación del trabajo de investigación

3 3 3 3 4 4 4

I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS I.3.1 Objetivos I.3.1.1 General I.3.1.2 Específicos I.3.2 Hipótesis

8 8 8 8 9

5 7

I.4 METODOLOGÍA 9 I.4.1 Localización 9 I.4.2 Las variables 10 I.4.2.1 Variables dependientes 10 I.4.2.2 Variables independientes 10 I.4.3 Indicadores 10 I.4.3.1 Aceites esenciales 10 I.4.3.2 Metabolitos secundarios 10 I.4.4 Estrategia Metodológica 11 I.4.4.1 Población y Muestra 11 I.4.5 El Método 11 I.4.5.1 Muestreo 11 I.4.5.2 Preparación de la muestra 11 I.4.5.3 Determinación de humedad 11 I.4.5.4 Determinación de contenido de cenizas 12 I.4.5.5 Extracción de aceites esenciales por hidrodestilación con aparato tipo Clevenger 12 I.4.5.6 Extracción de metabolitos secundarios por maceración con diclorometano y metanol 12 I.4.5.7 Análisis cromatográfico de los aceites esenciales 12 I.4.5.8 Tamizaje fitoquímico 13 I

I.4.5.8.1 Investigación de alcaloides I.4.5.8.2 Investigación de flavonoides y antocianinas I.4.5.8.3 Investigación de antraquinonas I.4.5.8.4 Investigación de cumarinas I.4.5.8.5 Investigación de saponinas I.4.5.8.6 Investigación de principios amargos I.4.5.8.7 Investigación de taninos I.4.5.9 Actividad biocida de metabolitos secundarios aislados y aceites esenciales I.4.5.10 Indice de refracción de aceites esenciales I.4.6 La técnica estadística I.4.7 Los instrumentos utilizados

13 14 15 15 16 17 17 17 17 17 18

PARTE II MARCO TEÓRICO (CONCEPTUAL) II.1 ACEITES ESENCIALES II.1.1 Biosíntesis II.1.1.2 Terpenos II.1.1.3 Fenilpropanoides II.1.1.4 Extracción de los aceites esenciales II.1.2 Polimorfismo químico II.1.3 Actividad antioxidante II.1.4 Actividad antioxidante de aceites esenciales II.1.5 Actividad biológica de aceites esenciales II.1.6. Métodos de análisis de actividad antimicrobiana II.1.6.1 Métodos de difusión en agar II.1.6.2 Métodos bioautográficos II.1.6.3 Métodos de dilución II.1.7 Bioautografía directa II.1.8 Análisis de los aceites esenciales II.1.8.1 Cromatografía de gases (CG) II.1.8.2 Espectrometría de masas (EM) II.1.8.3 Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM)

19 21 21 22 22 23 24 24 25 26 26 26 27 27 27 28 29 29

II.2 FLAVONOIDES

29 31 31 32 33

II.2.1 Funciones de los flavonoides II.2.2 Actividad antioxidante de los Flavonoides II.2.3 Anti-carcinogénesis II.2.4 Evolución de la producción de flavonoides por plantas PARTE III III.1 RESULTADOS III.1.1 Colecta de plantas III.1.2 Determinación del porcentaje de humedad III.1.3 Aceites esenciales III.1.3.1 Rendimiento III.1.3.2 Composición del aceite esencial de Lantana hispida

35 35 37 37 37 38 II

III.1.3.3 Composición del aceite esencial de Lantana camara 39 III.1.3.4 Composición del aceite esencial de Lantana trifolia 40 III.1.3.5 Evaluación de la actividad biológica, antioxidante e índice de refracción de los aceites esenciales de las plantas de estudio 41 III.1.3.6 Actividad biocida y antioxidante de extractos con solvente de las plantas de estudio _________________________________________ 42 III.1.4 Tamizaje fitoquímico 43 III.1.4.1 Alcaloides 43 III.1.4.2 Flavonoides y antocianinas 44 III.1.4.3 Saponinas 44 III.1.4.4 Antraquinonas, cumarinas, principios amargos y taninos 45 III.1.5 Extracción de metabolitos secundarios por maceración con diclorometano y metanol 47 III.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS 48 III.2.1 Rendimiento de extracción de aceites esenciales 48 III.2.2 Composición de los aceites esenciales de las plantas de estudio 48 III.2.3 Tamizaje Fitoquímico y extractos diclorometánicos y metanólicos 49 III.2.4 Actividad biológica, antioxidante e índice de refracción de los aceites esenciales de las plantas de estudio ______51 III.2.5 Actividad biológica y antioxidante de los extractos de las plantas de Estudio obtenidos con solventes _________________________________51 PARTE IV IV.1

CONCLUSIONES

53

IV.2

RECOMENDACIONES

55

IV.3

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

56

IV.4 ANEXOS 63 IV.4.1 ANEXO 1 CROMATOGRAMAS_______________________________ 64 IV.4.2 ANEXO 2. APARIENCIAS DE LOS EXTRACTOS________________ 68 IV.4.3 ANEXO 3. Determinación de actividad antioxidante de los extractos de las plantas de estudio.________________________________71 PARTE V V.1

INFORME FINANCIERO

73

III

Lista de Ilustraciones Figura 1. Ruta del ácido mevalónico en la biosíntesis de terpenos 21 Figura 2. Ruta de la 1-desoxi-Dixilulosa-5-fosfato en la biosíntesis de terpenos 23 Figura 3. Estructura de las principales clases de flavonoides 30 Figura 4. Actividad antioxidante de extractos de plantas del género Lantana____52 Figura 5. Cromatograma del aceite esencia de Lantana camara, muestra 1 64 Figura 6. Cromatograma del aceite esencial de Lantana camara, muestra 2 64 Figura 7. Cromatograma del aceite esencial de Lantana camara, muestra 3 65 Figura 8. Cromatograma del aceite esencial de Lantana hispida, muestra 1 65 Figura 9. Cromatograma del aceite esencial de Lantana hispida, muestra 2 66 Figura 10. Cromatograma del aceite esencial de Lantana trifolia, muestra 1 66 Figura 11. Cromatograma del aceite esencial de Lantana trifolia, muestra 2 67 Figura 12. Apariencia del extracto metanólico de Lantana camara 68 Figura 13. Apariencia del extracto metanólico de Lantana hispida 68 Figura 14. Apariencia del extracto metanólico de Lantana trifolia 69 Figura 15. Apariencia del extracto diclorometánico de Lantana camara 69 Figura 16. Apariencia del extracto diclorometánico de Lantana hispida 70 Figura 17. Apariencia del extracto diclorometánico de Lantana trifolia 70 Figura 18. Fotografía de la determinación de la actividad antioxidante del extracto etanólico del residuo de la extracción con diclorometano de Lantana hispida.______________________________________________71 Figura 19. Fotografía de la determinación de la actividad antioxidante del extracto diclorometánico de Lantana hispida._______________________71 Figura 20. Fotografía de la determinación de la actividad antioxidante de la solución etanólica de BHT______________________________________72 Lista de Tablas Tabla 1. Ubicación geográfica de los sitios de colecta de muestras 9 Tabla 2. Códigos, localización geográfica y datos de rendimiento de aceite esencial de las muestras de las plantas de estudio colectadas 35 Tabla 3. Porcentaje de humedad 37 Tabla 4. Rendimiento de extracción de aceite esencial por especie 38 Tabla 5. Resultados del análisis de muestras de Lantana hispida por cromatografía de gases 38 Tabla 6. Resultados del análisis de muestras de Lantana camara por cromatografía de gases 39 Tabla 7. Resultados del análisis de muestras de Lantana trifolia por cromatografía de gases 40 Tabla 8. Actividad biológica, antioxidante e índice refracción de los aceites esenciales 41 Tabla 9. Actividad biocida de extractos etanólicos de las especies de Lantana a una concentración de 1 mg de extracto/mL ________________42 Tabla 10. Actividad antioxidante de extractos de las especies de Lantana estudiadas y del antioxidante artificial BHT, expresada como IC 50_______42 Tabla 11. Presencia de alcaloides en las plantas Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L. 43 IV

Tabla 12. Detección de alcaloides por CCF Tabla 13. Detección de flavonoides y antocianinas por CCF Tabla 14. Detección de saponinas mediante la prueba de espuma Tabla 15. Detección de saponinas por CCF Tabla 16. Presencia de antraquinonas Tabla 17. Presencia de cumarinas Tabla 18. Cromatografía en capa fina cumarinas Tabla 19. Presencia de principios amargos en cromatografía en capa fina Tabla 20. Presencia de taninos Tabla 21. Extractos metanólicos Tabla 22. Extractos diclorometánicos

43 44 44 44 45 45 45 46 46 47 47

V

ABREVIATURAS % por ciento µL microlitro ATP adenosin trifosfato BHA butil-hidroxianisol BHT butilhidroxitolueno C carbono CCF cromatografía de capa fina CE50 concentración eficiente CG cromatografía de gases CG-EM cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas CG-IRTF cromatografia de gases acoplada a espectroscopía de infrarrojo com transformada de Fourier CI50 concentración inhibitoria CIM concentración inhibitoria mínima d.i. diámetro interno DMAPP γ,γ-dimetilalilpirofosfato DMSO dimetilsulfóxido DPPH difenil picrilhidrazina EM espectrometría de masas ERN especies reactivas del nitrógeno ERO especies reactivas del oxígeno FAB bombardeo con átomos rápidos FPP farnesil difosfato g gramo GGPP geranilgeranilo difosfato GP galato de propilo GPP geranil difosfato h hora IE impacto electrónico IPP isopentenilpirofosfato IQ ionización química m/z masa/carga Mg miligramo mg/mL miligramos por mililitro min minuto mL mililitro mm milímetro msnm metros sobre el nivel del mar N normal nm nanómetro ºC grado celsius p/v peso volumen Rf factor de retención i

RMN Resonancia MagnĂŠtica Nuclear TBHQ terc-butil-hidroxiquinona THBP trihidroxibutilfenona UV ultravioleta VIS visible w/d.w. peso sobre peso seco

ii

RESUMEN: Las plantas estudiadas pertenecen al género Lantana, de la (Verbenaceae). Esta familia se caracteriza por contar con varios géneros que presentan rendimientos interesantes de aceite esencial, como el caso del género Lippia, que ha sido estudiado en Guatemala. Se evaluaron los metabolitos secundarios y el rendimiento y composición de aceite esencial de tres especies del género Lantana, Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L., las cuales se colectaron en siete localidades de Guatemala de forma bimensual entre mayo 2008 y mayo 2009. Las localidades fueron: Escuintla, Retalhuleu, Quetzaltenango, El Progreso, Zacapa, Alta Verapaz e Izabal. Estas plantas son nativas y son utilizadas en la medicina popular. Actualmente existe información obtenida en otros países, sobre la composición química de una de las plantas propuestas (L. camara), sin embargo, dicha información no puede considerarse válida para Guatemala, en vista que las variaciones en el clima generan diferenciación en los metabolitos secundarios producidos.

Los aceites esenciales fueron extraídos a partir de material vegetal seco por medio de hidrodestilación, utilizando un aparato tipo Clevenger, obteniéndose rendimientos entre 0.03 y 0.65% (w/d.w.). La especie que presentó el mayor rendimiento de aceite esencial fue L. hispida (0.38%). Los rendimientos para las otras dos plantas fueron 0.18% para L. camara y 0.17% para L. trifolia. La composición de los aceites fue analizada por cromatografía de gases, encontrándose compuestos comunes a los aceites esenciales de plantas de la Familia Verbenaceae, como  -cariofileno y germacreno D. El aceite esencial de L. trifolia presentó entres los componentes principales metileugenol, lo cual sugiere una mayor factibilidad de aplicación económica. La finalidad de la investigación consistía en evaluar la actividad biocida y antioxidante de los aceites esenciales aislados de los especímenes colectados. Ninguno de los aceites presentó actividad biológica frente a las bacterias Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhi ATCC 14028 y Staphylococcus aureus ATCC 25923, mientras que los aceites de L. camara y L. hispida no presentaron actividad antioxidante significativa por el método del DPPH. Se realizó el tamizaje fitoquímico por medio de pruebas a nivel macro y en cromatografía en capa fina, de siete familias de metabolitos secundarios confirmándose la presencia de flavonoides, saponinas y alcaloides en todas las muestras pero no de cumarinas, principios amargos, antraquinonas y taninos. La recomendación más importante al considerar los resultados de la investigación es la de realizar experimentos de domesticación de L. hispida y L. trifolia., para evaluar rendimientos y composición de los aceites esenciales en condiciones controladas. También se considera de utilidad caracterizar los alcaloides presentes en las tres plantas al igual que hacer pruebas biológicas con Bacillus subtilis, Pseudomona aeruginosa, Sarcina lutea, Candida albicans y los hongos Aspergillus Níger y A. fumigatus.

iii

SUMMARY (ABSTRACT)

The plants that were studied are found in the Lantana genus (Verbenaceae). This family is characteristic for having various genus with interesting yields of essential oils, such as in the case of the Lippia genus, which has been studied in Guatemala. The yield and composition of the essential oils as well as the presence of secondary metabolites were analyzed in three species of the Lantana genus: Lantana camara L, Lantana hispida HBK and Lantana trifolia L. The samples were collected every two months in seven different locations between May 2008 and May 2009. The locations were: Escuintla, Retalhuleu, Quetzaltenango, El Progreso, Zacapa, Alta Verapaz and Izabal. These are native plants and are used in traditional medicine. There is some information regarding the chemical composition of one of these plants (L. camara). Nevertheless, such information cannot be generalized to include those found in Guatemala since different environments cause different productions of secondary metabolites. Hydrodistillation was used to extract the essential oils with a Clevenger type apparatus. The yields obtained ranged between 0.03 and 0.65% (w/d.w.). The species with the highest yields was L. hispida (0.38%). The yields of the other two plants were 0.18% for L. camara and 0.17% for L. trifolia. The composition of the oils was determined using gas chromatography. The compounds found are common to the Verbenaceae family such as ď ˘ -caryophellene and germacrene D. The essential oil of L. trifolia showed a significant presence of methyleugenol, which suggest the plausibility of economical significance. Ultimately, the investigation sought to establish the biological and antioxidant activity of the essential oils isolated from the plants. None of the essential oils showed any biological activity on the microorganisms used for the bioassays: Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhi ATCC 14028 and Staphylococcus aureus ATCC 25923. The essential oils of L. camara and L. hispida did not show any significant antioxidant activity (DPPH method). Phytochemical screening was performed in order to establish the presence or absence of 7 families of secondary metabolites; TLC assays were also used. Flavonoids, saponines and alkaloids were found in all three species, but no presence of coumarins, bitter principles, antraquinones or tannins was detected. The most important recommendation that should be considered according to the results obtained is to perform domestication experiments of L. hispida and L. trifolia. That would allow to measure yields and chemical compositions of the essential oils of plants raised in a controlled environment. It would also be recommendable to characterize the alkaloids detected in the three plants and to perform bioassays with Bacillus subtilis, Pseudomona aeruginosa, Sarcina lutea, Candida albicans and the fungi Aspergillus NĂ­ger and A. fumigatus.

iv

PARTE I I.1

INTRODUCCIÓN

Las especies del género Lantana estudiadas, Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L., son plantas nativas de importancia apícola y ornamental, que se utilizan en medicina popular en afecciones gastrointestinales, dérmicas y reumáticas (Stevens, W. 2001; Márquez, et al., 1999). L. camara se encuentra desde el nivel del mar hasta los 2200 msnm, en los departamentos de Alta Verapaz, Baja Verapaz, Chimaltenango, Escuintla, Guatemala, Huehuetenango, Izabal, Jalapa, Petén, Quetzaltenango, Retalhuleu, Sacatepéquez, San Marcos, Santa Rosa, Sololá y Zacapa.

L. hispida presenta dos formas más diversas, una con hojas oblongas-lanceoladas, escabrosas a hispidulosas, que se encuentra entre 1300 y 2700 msnm y otra que presenta hojas ovales anchas, siempre velutinosas-tomentulosas y que crece entre 600 y 1900 msnm. L. trifolia se encuentra normalmente en matorrales húmedos y en bosques de pino, desde el nivel del mar hasta los 1200 msnm, en Alta Verapaz, Guatemala, Izabal (tipo Los Amates), Petén, El Quiché (Standley, P. Steyermark, 1970).

Previamente se había obtenido información sobre la composición química de una de las plantas estudiadas, L. camara (Ross, 1999), sin embargo, dicha información no puede considerarse válida para Guatemala, en vista que las variaciones climáticas, edáficas, latitudinales y ontológicas generan diferenciación en los metabolitos secundarios producidos. En Guatemala se ha determinado únicamente la actividad biocida de L. camara y L. hispida, a nivel de extractos (Cáceres et al., 1990), en cambio de L. trifolia, no se encontró información en la revisión de literatura efectuada. En cuanto al contenido de aceites esenciales, en estudios previos se ha encontrado que las diferencias climáticas y edáficas, pueden causar polimorfismo químico intraespecífico (Pereira et al, 2000; Pereira et al., 2003), por lo que en este estudio se colectaron individuos de la misma especies en diferentes localidades. Anteriormente no se había realizado ningún estudio a nivel químico de estas tres especies en Guatemala, y es debido a ello que se realizó esta investigación de los aceites esenciales y metabolitos secundarios más importantes presentes en estas plantas con el objetivo de generar información que permita validar el conocimiento popular de la flora nativa. Esta información servirá para el desarrollo de investigaciones futuras con un grado de especificidad mayor acerca de otros componentes de las plantas; y a la vez se espera que contribuya a propiciar el desarrollo económico de diferentes regiones en Guatemala, a partir del aprovechamiento de las plantas de estudio, que podría generar mayores oportunidades de trabajo y a su vez llegar a mejorar la calidad de vida de sus habitantes.

Sin lugar a dudas, L. camara es la especie que se encuentra presente sobre una mayor extensión del territorio nacional. Sin embargo, las poblaciones ubicadas en el occidente del país, sobre todo en el área de Quetzaltenango, cuentan con los especímenes de mayor tamaño y por lo tanto mayor biomasa. Esto las provee de especial interés y utilidad industrial en el caso de determinarse alguna utilidad para esta especie. Por su parte, L. hispida y L. trifolia se encuentran distribuidos sobre una extensión mucho menor de terreno y han presentado menor capacidad de adaptabilidad al estrés de origen antropogénico por lo que varias de las poblaciones reportadas por Standley y Steyermark 1

(1970) ya no existen. La determinación de utilidades específicas para ambas especies puede contribuir a su conservación al existir un valor económico por su supervivencia.

La composición de los aceites esenciales para las tres especies estudiadas indicó presencia de compuestos químicos característicos de la Familia Verbenaceae. Un aspecto importante en cuanto al contenido de aceite esencial de las plantas de estudio, es que se encontró que los rendimientos de extracción a partir de las muestras de L. camara y L. trifolia fueron menores a los de L. hispida. Aún así, es L. trifolia la que presenta mayor potencial para su aprovechamiento, ya que cuenta con una alta concentración de metileugenol.

Otros datos obtenidos de los análisis químicos de las plantas estudiadas indican que las tres contienen alcaloides, flavonoides y saponinas. Los flavonoides son de particular interés debido a su aplicabilidad como antioxidantes en la industria cosmética y de alimentos. Por su parte, las saponinas presentes en las plantas podrían ocasionar dificultades para la extracción del aceite esencial utilizando la técnica de hidrodestilación.

Este problema no se observó en las diferentes extracciones realizadas a las muestras por lo que su concentración podría ser lo suficientemente baja para no ocasionar dicha dificultad, al menos a escala de laboratorio. No se encontró presencia de cumarinas, principios amargos, antraquinonas y taninos en las hojas de las tres especies.

No se encontró actividad biocida a partir de los extractos analizados. Estos resultados deben ser interpretados de acuerdo a las metodologías utilizadas. La ausencia de actividad biocida es específica para Escherichia coli, Salmonella typhi y Staphylococcus aureus (todas ATCC), por lo que cabe la posibilidad que los extractos presenten actividad ante otros microorganismos patógenos. De igual manera, la actividad antioxidante determinada por el método del DPPH, resultó negativa. La misma prueba de actividad pero con otras metodologías podría arrojar resultados diferentes.

2

I.2

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

I.2.1

Antecedentes en Guatemala

I.2.1.1 Plantas a estudiar: Las plantas estudiadas pertenecen al género Lantana, de la Familia Verbenaceae. La Familia Verbenaceae se caracteriza por contar con varios géneros que presentan rendimientos interesantes de aceite esencial, como el caso del género Lippia, que ha sido estudiado en Guatemala. A continuación, se describen las plantas estudiadas en el presente trabajo, de las cuales no se contaba con información fitoquímica básica en Guatemala.

I.2.1.2 Lantana camara Conocida también como cinco negritos. Arbusto de 1 a 3 m de altura, de tallo espinoso, flores amarillas, anaranjadas o rojas en forma de pequeños manojos. Los frutos son bayas de color azul verdoso o negro, de sabor dulce. Sus hojas pueden ser redondeadas o alargadas, ásperas o rugosas por el haz y con pelillos por el envés. La planta es originaria de América tropical, habita en los climas cálidos, semicálido, semiseco, desde el nivel del mar hasta los 1000 m y de los 2300 a los 3000 msnm.

Presenta diferentes usos etnomédicos, siendo usado en El Salvador como antipirético, a partir de la cocción de flores y hojas con agua. Los frutos son tóxicos por contener lantadeno, un sesquiterpenoide. En Colombia, se usa la planta entera en forma de cocción para facilitar el parto y como emenagogo. En Guatemala se le atribuyen propiedades curativas de heridas, úlceras y contusiones e infecciones de la piel. Se reporta también su uso en afecciones respiratorias como catarro y tos ferina, se usan solo las ramas en cocimiento. En Guatemala se encuentra desde nivel del mar hasta los 2,200 metros sobre el nivel del mar. Se reporta en Alta Verapaz, BajaVerapaz, Chimaltenango, Escuintla, Guatemala, Huehuetenango, Izabal, Jalapa, Petén, Quetzaltenango, Retalhuleu, Sacatepéquez, San Marcos, Santa Rosa, Sololá, Zacapa (Standley, P. Steyermark, 1970) En cuanto a su composición química, se ha reportado el triterpenoide lantadeno A como principio tóxico, asimismo se ha reportado la presencia de a-amarina, lantamarona, lantadeno B, C, y D; ácidos lantanílico, lantanólico y lantoico, oleanólico, verbascósido, ácidos botulínicos y butulónico, -sitosterol, furanonaftaquinonas. Presenta aceite esencial, especialmente en las flores.

Se ha encontrado actividad antibiótica por las hojas y el aceite esencial sobre Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomona aeruginosa, Sarcina lutea, Salmonella typhi y los hongos Aspergillus Níger y A. fumigatus. El extracto etanólico de las ramas de la planta presentó efecto antibióticos contra Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, y Streptococcus faecalis, habiendo resistencia en cuanto a Eschericchia coli y Candida albicans.

Es planta tóxica para el ganado. Se ha reportado actividad antimicrobiana de los extractos brutos de sus hojas (Cáceres et al., 1990). Se ha reportado también hojas 3

presentan usos etnobotánicos para enfermedades gastrointestinales, del tracto respiratorio y enfermedades de piel y mucosas (Cáceres et al., 1990 a) I.2.1.3 Lantana hispida HBK Arbustos erectos, de 1-2 m de altura con ramas puberulentas a hispidas, hojas usualmente opuestas, raramente verticiladas, raramente subsésiles ovales u oblongas lanceoladas, de 1-9 cm de longitud (principalmente de 2-5 cm) brácteas lanceovaladas, corola blanca, crema, púrpura, o levemente rosadas. Frutos púrpura-negros, jugosos.

La planta crece en bosques de roble, pino-roble, o de pino, ocasionalmente en colinas secas y rocosas, entre los 300 y los 2700 msnm. Las dos formas más diversas de esta especie compleja son las plantas con hojas, oblongas-lanceoladas, escabrosas a hispidulosas (1300-2700 msnm) y las que presentan hojas ovales anchas, siempre velutinosas-tormentulosas (600-1900msnm). (Standley, P. Steyermark, 1970). Cáceres reporta que los extractos brutos presentan actividad contra levaduras (Cáceres et al., 1990) y que sus hojas presentan usos etnobotánicos para enfermedades gastrointestinales, y enfermedades de piel y mucosas (Cáceres et al., 1990 a) I.2.1.4 Lantana trifolia L. Se le encuentra normalmente en matorrales húmedos, en bosques de pino, raramente en terrenos claros. Crece desde el nivel del mar hasta los 1200 msnm, en Alta Verapaz, Guatemala, Izabal (tipo Los Amates), Petén, El Quiché. Son arbustos erectos de hasta tres metros de altura, trocos pilosos, hojas usualmente con pecíolo corto, lanceoladas u oblongo-lanceoladas, agudas o atenuadas en la base. Las inflorescencias de 5 cm de largo, densamente floreadas, pedunculadas, brácteas verdes, corola usualmente rosa, lila o púrpura, raramente blanca. Es una planta común en muchos lugares de América Central, a menudo en bosques secundarios (Standley, P. Steyermark, 1970). No se encontró información en la literatura sobre estudios realizados acerca de esta planta.

I.2.1.5 Estudios de polimormismo de aceites esenciales de diferentes plantas El polimorfismo químico ha sido estudiado en especies de diferentes regiones geográficas. La composición química de los aceites esenciales de Lippia alba de 15 diferentes regiones de Colombia fue analizada por CG-EM y por Análisis de Componentes Principales (ACP). Se encontraron tres quimiotipos, siendo estos: a) carvona (41 %), b) citral (55 %); c) híbrido (carvona: 25 %; limoneno: 22 % y citral: 21 %). Más del 60 % de la variación fue representada en los dos primeros componentes principales (Durán et al., 2007).

Poli et al. (1997) realizaron un estudio comparativo de los aceites esenciales de Santolina insularis y Santolina corsica. Las dos especies se encuentran en Sardeña, Italia, siendo utilizadas indistintamente por la medicina tradicional en la isla. El análisis de los aceites esenciales por CG-EM mostró diferencias cualitativas y cuantitativas siendo algunos componentes identificados en ambas especies, mientras que otros fueron característicos de una sola especie, como felandreno, -3-careno y -terpineno para S. 4

insularis.

La composición del aceite esencial de 11 poblaciones de Thymus carnosus y su variabilidad fue estudiada por CG, CG-EM y RMN-13C, y análisis multivariado de conglomerados. Tres muestras de Extremadura (España) fueron caracterizadas por su alto contenido de linalol (9.5-25.5 %). Los primeros tres componentes principales explicaron 83.8 % de la variancia total. Se obtuvo tres conglomerados. I: alto contenido de borneol, hidrato de cis-sabineno y terpinen-4-ol (54.2 % de las muestras); II: linalol, borneol e hidrato de trans-sabineno (9.6 %); III: borneol y canfeno (36.2 %) (Salgueiro et al., 1995).

En un estudio del polimorfismo químico en aceites esenciales de Thymus caespetitius de las Islas Corvo, Flores, São Miguel y Terceira (Açores), en Portugal, se analizó la composición de los aceites esenciales de 24 poblaciones analizada por CG y CG-EM. Se encontraron tres conglomerados principales: carvacrol (41-65%), timol (3551 %) y -terpineol (33-37 %). Según los autores, el polimorfismo químico puede deberse a la variabilidad genética o a la influencia de factores edáficos (Santos et al., 2005).

Pereira et al. (2000) investigaron el polimorfismo químico de los aceites esenciales de Thymus caespetitius en la isla San Jorge (Açores). En el estudio, los autores extrajeron el aceite esencial por hidrodestilación utilizando un aparato Clevenger para determinar el rendimiento del aceite y por extracción-destilación con aparato Likens-Nickerson, para determinar la composición del aceite esencial por CG-EM. Así, se analizaron los aceites esenciales de diez poblaciones de Thymus caespetitius habiéndose encontrado que la relación enantiomérica de sabineno y -terpineol varía con la localidad de colecta (Pereira et al., 2000).

En otro estudio se investigó la influencia de los factores ambientales sobre el polimorfismo químico de los aceites esenciales de Lychnophora ericoides en dos poblaciones de la planta en el Cerrado brasileño. Se colectaron hojas de la planta en intervalos de 2 meses durante un año y estas fueron analizadas por CG-EM y ACP. Dos grupos de aceites esenciales fueron distinguidos en relación con el local de colecta y composición, siendo estos: Conglomerado I: correspondientes a la localalidad Vianópolis, con alto porcentaje de -bisabolol (45-76 %) y -cadinol (11-24 %). Conglomerado II: correspondiente a la localidad Cristalina, con alto contenido de (E)-nerolidol (31-47 %) y ar-dihidro-turmerona (5-15 %). La quimiovariación encontrada parece deberse a factores ambientales y a características del suelo (Curado et al., 2006).

I.2.1.6 Estudios de atividad antimicrobiana de aceites esenciales de plantas en América Latina Diferentes estudios de actividad antimicrobiana han sido realizados en aceites esenciales de plantas de América Latina, especialmente del género Lippia, Familia Verbenaceae. En un estudio en Brasil, el aceite de L. origanoides tipo carvacrol presentó mayor actividad que el antibiótico Amphotericina B contra los hongos Candida albicans Serotipo B ATCC 36802, Candida albicans, Candida guilliermondii, Candida parapsilosis, y mayor actividad que el antibiótico Vancomicina contra las bacterias 5

Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus aureus MRSA (BMB9393), Lactobacillus casei ATTC 4646 y Streptococcus mutans ATCC 25175 (Oliveira et al., 2007).

El aceite esencial de L. graveolens de dos poblaciones de Guatemala fue evaluado contra diferentes microorganismos. Los aceites, tipo carvacrol y timol, presentaron actividad contra varios microorganismos, entre ellos Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Streptococcus faecalis, Proteus vulgaris, Candida albicans, Clodosporium cladosporioides, Apergillus niger, encontrándose que el tipo carvacrol presentó la mayor actividad (Salgueiro et al., 2003).

En otro estudio, L. alba f. Intermedia y L. alba presentaron actividad antimicrobiana contra diferentes bacterias y hongos por el método de difusión en agar (Oliveira et al., 2006). El aceite de L. alba f. Intermedia presentó mayor actividad que la anfotericina contra los hongos Candida albicans Serotipo B ATCC 36802, Candida guilliermondii, Trichophytum rubrum T544, y que vancomicina contra las bacterias Staphylococcus aureus MRSA (BMB9393), Lactobacillus casei ATTC 4646 y Streptococcus mutans ATCC 25175. El aceite de L. alba presentó mayor actividad que los antibióticos contra los hongos Candida albicans Serotipo B ATCC 36802, Candida albicans, Candida guilliermondii, Trichophytum rubrum T544, y que vancomicina contra las bacterias Staphylococcus aureus ATCC 25923, Lactobacillus casei ATTC 4646 y Streptococcus mutans ATCC 25175. Otro quimiotipo de L. alba había presentado previamente, actividad contra C. albicans, con una CIM de 0.6 mg/mL, siendo un aceite que presentó un rendimiento de 0.1 % y linalol como componente principal (76.3 %) seguido por cineol (2.34 %) (Duarte et al., 2005).

En un estudio reciente, el aceite esencial de Lippia sidoides presentó timol (56.67 %) y carvacrol (16.73 %) como componentes principales, seguidos por p-cimeno (7.13 %), timol metil éter (5.06 %) y aromadendreno (2.79 %). El método de difusión del disco fue utilizado para evaluar la actividad antimicrobiana, mostrando 10 L de una solución de 217.5 mg/L, inhibición del crecimiento para Streptococus mutans (d.i. 18.7 mm contra 20.0 mm de vancomicina), Streptococcus mitis (d.i. 10.0 mm contra 17.0 mm de vancomicina), Streptococcus salivarius (d.i. 8.5 mm contra 22.7 mm de vancomicina), Streptococcus sanguis (d.i. 12 mm contra 16 mm de vancomicina) y Candida albicans (34 mm contra 27.2 mm de cetoconazol) (Botelho et al., 2007a). La actividad contra estos microorganismos orales fue confirmada por la prevención del gel de L. sidoides (0.5% volumen/masa) contra la absorción del hueso alveolar en periodontitis experimental en ratones (Botelho et al., 2007b). Es interesante mencionar que una muestra del aceite esencial de L. sidoides con timol (59.65 %) y (E)-cariofileno (10.60 %) como componentes principales también presentó actividad antihelmíntica contra el nematoide Haemochus contortus en ensayos con ratones (Camurça-Vasconcelos et al., 2007). El aceite esencial de L. sidoides de Ceará también ha presentado actividad larvicida contra Aedes aegypti (Carvalho et al., 2003).

6

I.2.2

Justificación del trabajo de investigación

Las plantas estudiadas en la presente investigación pertenecen a la familia Verbenaceae, género Lantana, siendo las especies Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L. Estas plantas son nativas de Guatemala y son utilizadas en la medicina popular. Actualmente existe información obtenida en otros países, sobre la composición química de una de las plantas propuestas (L. camara), sin embargo, dicha información no puede considerarse válida para Guatemala, en vista que las variaciones en el clima generan diferenciación en los metabolitos secundarios producidos. En Guatemala se ha determinado únicamente la actividad biocida de dos de las plantas a estudiar (L. camara y L. hispida), a nivel de extractos, por lo cual no se tiene conocimiento sobre que metabolito o grupo de metabolitos son los responsables de esa actividad, lo cual no permite la generación de valor agregado para estas plantas. De la tercera planta, L. trifolia, no se encontró información en la literatura sobre estudios sobre su composición química.

Es debido a ello que se justificó la realización de esta investigación; el contar con información química respecto a los aceites esenciales y los grupos de metabolitos secundarios más importantes presentes en estas plantas, servirá para el desarrollo de investigaciones futuras con un grado de especificidad mayor acerca de otros componentes de las plantas. Así mismo, se espera que contribuya al desarrollo económico de diferentes regiones en Guatemala, a partir del aprovechamiento económico de las plantas de estudio, que podría generar mayores oportunidades de mejoramiento del ingreso económico y a su vez contribuir al mejoramiento de la calidad de vida de sus habitantes. Por otra parte, también se contribuye a los objetivos de la Escuela de Química y del Laboratorio de Investigación de Productos Naturales –LIPRONAT- en la obtención de información útil en relación con L.camara L., L.hispida HBK y L.trifolia L., siendo esta última investigada por primera vez en Guatemala a nivel químico.

7

I.3

OBJETIVOS E HIPOTESIS

I.3.1

Objetivos

I.3.1.1 General Evaluar la actividad biocida y antioxidante de los aceites esenciales y metabolitos secundarios aislados de Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L., de la Familia Verbenaceae, de diferentes regiones de Guatemala.

I.3.1.2 Específicos I.3.1.2.1 Determinar la composición química de los aceites esenciales de Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L. I.3.1.2.2 Determinar las variaciones estacionales en el rendimiento de extracción de aceites esenciales de las plantas nativas estudiadas.

I.3.1.2.3 Determinar las diferencias en el rendimiento y la composición química de los aceites esenciales obtenidos por los métodos de hidrodestilación con aparato tipo Clevenger y por extracción-destilación con aparato Likens-Nickerson.

I.3.1.2.4 Establecer los posibles usos del aceite esencial de las plantas nativas estudiadas, con base en su composición química.

I.3.1.2.5 Determinar la actividad biocida de los aceites esenciales y metabolitos secundarios aislados de Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L., usando la metodología de bioautografía.

I.3.1.2.6 Determinar la actividad antioxidante de los aceites esenciales y metabolitos secundarios aislados de Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L. I.3.1.2.7 Establecer las procedencias de Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L. con mejores rendimientos cualitativos.

I.3.1.2.8 Desarrollar metodología de aislamiento y análisis que permita la determinación rápida y confiable de los componentes de aceites esenciales y metabolitos secundarios.

I.3.1.2.9 Evaluar los métodos de extracción de metabolitos secundarios por maceración en etanol y por extracción por ultrasonido.

1.3.1.2.10 Caracterizar los aceites esenciales de Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L. por su índice de refracción.

8

I.3.2

Hipótesis

Las tres plantas sujetas a estudio, Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L., presentan aceites esenciales y metabolitos secundarios con actividad biocida y antioxidante.

I.4

METODOLOGIA (Descripción detallada de la Metodología)

I.4.1

Localización

El área de colecta de las plantas se localiza en los departamentos de Escuintla, Retalhuleu, Quetzaltenango, El Progreso, Zacapa, Alta Verapaz e Izabal (Tabla 1), en los cuales se realizó una búsqueda de acuerdo con la información provista por la Flora de Guatemala y de acuerdo al cuadro siguiente, en cuanto a la localización de las plantas en el país.

Tabla 1. Ubicación geográfica de los sitios de colecta de muestras.

Nombre Científico Lugar Coordenadas Geográficas Lantana hispida L. San Vicente Pacaya, N 14º 23. 452´ Escuintla WO 90º 35. 897´ Lantana hispida L. San Cristóbal N 14º 55.305´ Acasuaguastlán, El Progreso WO 89º 56.413´ Lantana hispida L. San Cristóbal N 14º 55.341´ Acasuaguastlán, El Progreso WO 89º 56. 480´ Lantana hispida L. San José, Teculután, Zacapa N 14º 59.043´ WO 89º 41.677´ Lantana hispida L. San José, Teculután, Zacapa N 14º 59.002´ WO 89º 41. 704´ Lantana hispida L. El Chico, Usumatlán, Zacapa N 15º 01.141´ WO 89º 50. 528´ Lantana hispida L. Chorjalé, Cabricán, N 15º 05.646´ Quetzaltenango WO 91º 40.838´ Lantana hispida L. Lantana camara L.

La Grandeza, Cabricán, Quetzaltenango Zunil, Quetzaltenango

Lantana camara L.

Zunil, Quetzaltenango

Lantana camara L.

La Calera, Zunil, Quetzaltenango La Calera, Zunil, Quetzaltenango

Lantana camara L.

N 15º 06.184´ WO 91º 41.296´ N 14º 46.748´ WO 91º 29.791´ N 14º 46.393´ WO 91º 30.098´ N 14º 46.472´ WO 91º 30.096´ N 14º 46.480´ WO 91º 30.091´

Altitud (msnm) 2,290 278 296 248 232 999 2,472

2,462 2,085 1,989 2,010 2,010

9

Lantana camara L.

San Felipe, Retalhuleu

Lantana trifolia L.

Santa Inés, Los Amates, Izabal Santa Inés, Los Amates, Izabal Santa Inés, Los Amates, Izabal Santa Inés, Los Amates, Izabal Santa Inés, Los Amates, Izabal

Lantana trifolia L. Lantana trifolia L. Lantana trifolia L. Lantana trifolia L.

Lantana trifolia L. Lantana trifolia L.

Santa Inés, Los Amates, Izabal Lachuá, Alta Verapaz

N 14º 37.373´ WO 91º 35.771´ N 15º 13.788´ WO 89º 07.575´ N 15º 13.759´ WO 89º 07.623´ N 15º 13.018´ WO 89º 09.253´ N 15º 13.144´ WO 89º 08.941´ N 15º 13.323´ WO 89º 08.570´

620

N 15º WO 89º N 15º WO 89º

100

13.144´ 08.941´ 56.038´ 30.601´

103 103 93 100 105

165

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007 I.4.2

Las Variables

I.4.2.1 Variables dependientes Rendimiento de los aceites esenciales (% p/p) y porcentaje de los componentes de los aceites esenciales de las plantas de estudio (% área cromatográfica).

Metabolitos secundarios de las plantas de estudio (cualitativo).

I.4.2.2 Variables independientes Especies de estudio (Lantana camara, Lantana hispida y Lantana trifolia) Localidades de colecta de las plantas de estudio.

I.4.3

Indicadores

Los indicadores fisicoquímicos que permiten evaluar los objetivos de la presente investigación son los siguientes: 1.4.3.1 Aceites esenciales Porcentajes de rendimiento de extracción de aceites esenciales.

Porcentajes de componentes de aceites esenciales analizados por cromatografía de gases.

1.4.3.2 Metabolitos secundarios Presencia de metabolitos secundarios analizados por tamizaje fitioquímico: flavonoides, cumarinas, alcaloides, saponinas, antocianinas, antraquinonas, princípios amargos y taninos.

10

I.4.4

Estrategia Metodológica

I.4.4.1 Población y Muestra La población está constituida por las poblaciones de las plantas L. camara, L. hispida y L. trifolia en los departamentos de Escuintla, Retalhuleu, Quetzaltenango, El Progreso, Zacapa, Alta Verapaz e Izabal. La muestra corresponde a los especimenes colectados en las poblaciones localizadas, de acuerdo con la información que se presenta en la Tabla 1 en la sección de Resultados.

I.4.5

El Método

I.4.5.1 Muestreo Con base en la información de la Flora Guatemalteca, se realizaron viajes de campo para la localización de las especies a estudiar. En la Tabla 1 se presentan los lugares en que se localizó y colectó material vegetal correspondiente a las tres especies de estudio.

Se colectaron dos ejemplares de cada especie para herborizar, depositándose una en el herbario de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia. A cada muestra le fue asignado un código, con ocho letras abreviando el nombre científico de la especies, seguido de punto y cuatro letras abreviando el lugar de colecta, seguido del número asignado a la población de colecta en el lugar seguido de punto y dos cifras correspondientes al ejemplar. Las coordenadas geográficas de los lugares de colecta se registraron utilizando un sistema de posicionamiento geográfico (GPS) para referenciar el lugar.

En vista que en varias localidades el material era muy escaso, el tamaño de la muestra varió entre 100 g y 1000 g de material húmedo. El material vegetal colectado fue transportado a la ciudad de Guatemala para su procesamiento, en el Laboratorio de Investigación de Productos Naturales (LIPRONAT) de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia.

I.4.5.2 Preparación de la muestra Las hojas y los troncos suaves del material vegetal fueron separados, descartándose el material sobrante. El material vegetal fue mezclado y secado a temperatura ambiente, dejando una fracción de 25.0 g para determinaciones de humedad. Dos ejemplares de cada especie fueron herborizados para depositar en herbario. Cada muestra fue dividida en tres submuestras de masa aproximadamente igual masa. A partir de cada submuestra se realizaron las determinaciones que se describen en las siguientes secciones.

I.4.5.3. Determinación de humedad 10.0 g de material vegetal recién cortado (submuestra 1) fueron pesados, colocados en una cápsula de porcelana e introducidos en el horno de convección y a 95ºC por 20 h.

Luego de transcurridas las 20 h, la muestra fue pesada en balanza analítica, determinando el contenido de humedad por diferencia con el peso original.

11

I.4.5.4 Determinación de contenido de cenizas 4.0 g de material vegetal húmedo fueron pesados con exactitud en un crisol de porcelana. Luego, la muestra fue calcinada en una mufla a 550 oC por 14 h, o hasta obtener cenizas blancas. El crisol conteniendo las cenizas fue pesado en balanza analítica luego de la calcinación El contenido de cenizas fue calculado por la diferencia de peso del crisol con material vegetal y con las cenizas.

I.4.5.5. Extracción de aceites esenciales por hidrodestilación con aparato tipo Clevenger Se pesaron entre 10.0 y 25.0 g de material vegetal en un balón de 250 mL, 24/40, agregándose agua hasta sobrepasar levemente el nivel de la mitad del balón.

Luego el balón fue acoplado con el aparato de extracción, y fue encendida la estufa y la circulación del agua a través del refrigerante del aparato de destilación. El aceite esencial fue destilado por 3 horas, contadas a partir de la hora en que se inició la destilación.

Luego de apagar el aparato de destilación, el aceite fue colectado en n-pentano y concentrado en rotavapor. Luego se midió la masa del aceite destilado y se almacenó en vial de 2 mL en refrigeración, para su posterior análisis cromatográfico.

I.4.5.6. Extracción de diclorometano y metanol

metabolitos

secundarios

por

maceración

con

Se colocaron 50.0 g de material seco, en un percolador de 1 L. Se agregó diclorometano al percolador, hasta cubrir completamente la muestra. Luego se dejó reposar la muestra por 48 horas. La muestra fue filtrada y se colectó la solución diclorometánica en un recipiente de vidrio. A continuación se agregó una nueva cantidad de diclorometano al material vegetal restante en el percolador, dejándose reposar la muestra por 24 horas.

La muestra fue nuevamente filtrada y se colectó la solución diclorometánica. En los casos en que la solución aún presentaba coloración, se repitieron los dos pasos anteriores, hasta obtener soluciones sin coloración o con coloración muy débil. El mismo procedimiento se llevó a cabo con metanol utilizando el mismo material, obteniendo así dos extractos de la misma muestra: diclorometánico (con una mayor concentración de compuestos apolares) y metanólico (con una mayor concentración de compuestos polares).

I.4.5.7. Análisis cromatográfico de los aceites esenciales Se realizaron de acuerdo con la metodología de Adams (2002), inyectando 0.1 µL de una solución con aproximadamente 5 µL de aceite esencial en 0.2 mL de cloroformo, en un cromatógrafo de gases equipado con una columna capilar HP5 de 60 m y programa de temperatura con rampa de 60 ºC a 220 ºC, a 3 ºC/min.

12

La identificación de los componentes de los aceites esenciales se realizó por medio de los índices de retención de los componentes presentes, calculados a partir de la inyección de una mezcla de hidrocarburos de cadena lineal de serie homóloga desde el octano al eicosano y por la comparación de tiempos de retención de los picos cromatográficos con los de estándares puros. El análisis cuantitativo se realizó por medio del cálculo del porcentaje de área total de los picos cromatográficos.

I.4.5.8. Tamizaje fitoquímico Se realizaron pruebas de tamizaje fitoquímico para determinar la presencia de los siguientes compuestos en el material vegetal seco que son considerados como principios activos: alcaloides, taninos, flavonoides, principios amargos, antraquinonas, cumarinas y saponinas. Las pruebas se realizaron siguiendo los procedimientos del Laboratorio de Investigación de Productos Naturales y del Departamento de Farmacognosia de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos (Medinilla, 1996), que se describen a continuación: I.4.5.8.1 Investigación de alcaloides Ensayos macro y semimicro: Pesar 1 g de material vegetal. Agregar 2 gotas de solución de hidróxido de amonio al 10 por ciento (p/v), luego añadir 25 mL de metanol a 60C. Filtrar con papel filtro Whatman 1 y acidificar el filtrado con ácido clorhídrico 2 N. La solución resultante dividirla en 4 tubos y evaluar de la siguiente manera: Tubo 1: agregar 5 gotas del reactivo de Mayer’s. (Color blanco a crema).

Tubo 2: agregar 5 gotas del reactivo de Dragendorff. (Color rojo a naranja).

Tubo 3: agregar 5 gotas del reactivo de Wagner. (Color marrón).

Tubo 4: testigo.

Usar como estándar soluciones al 1 por ciento de atropina y papaverina. Observar durante 2 horas la existencia de precipitados, turbidez o precipitación de complejos en los tubos.

Preparación de Reactivos: Mayer’s (yoduro de mercurio y potasio) a. 1.36 g de HgCl2 /60 mL H2O b. 5 g KI / 10 mL H2O c. Mezclar y diluir a 100 mL. Dragendorff (yoduro de bismuto y potasio) a. 8 g Bi(NO3)3 5 H2O / 20 mL HNO3 7. 27.2 g KI / 50 mL H2O 8. Mezclar, reposar, decantar supernadante. Diluir a 100 mL. Wagner (yodo-yoduro de potasio) a. 1.27 g I2 + 2 g KI / 5 mL H2O b. Diluir a 100 mL.

13

Cromatografía en capa fina: Pesar 1 g de material vegetal seco y molido, agregar 1 mL de hidróxido de amonio al 10 por ciento (p/v) y extraer con 5 mL de metanol. Colocar en baño maría a 60 C durante 5 minutos. Filtrar y concentrar. Aplicar en una placa de silica gel 60 F254, utilizando como estándar una solución de atropina y papaverina al 1 por ciento en metanol (10 μL).

Fase móvil: tolueno-acetato de etilo-dietilamina (70:20:10); acetato de etilo-metanol-agua (100:13.5:10), cloroformo- dietilamina (90:10); acetona-agua-amonio concentrado (90:7:3) Detección: Sin tratamiento químico: UV 254nm fluorescencia, UV 365 nm algunos fluorescen azul o amarillo.

Reactivo de Dragendorff: zonas cafés o naranjas en región visible, los colores no son estables.

I.4.5.8.2 Investigación de flavonoides y antocianinas Ensayos macro y semimicro: Extraer 3 g de material vegetal pulverizado con 10 mL de etanol o metanol al 80 por ciento, filtrar y concentrar. Enfriar a temperatura ambiente y triturar el residuo con 15 mL de éter de petróleo hasta que la extracción sea incolora.

Disolver el residuo en 30 mL de metanol al 80 por ciento, filtrar y dividir en 5 tubos: Tubo 1: agregar 0.5 mL de ácido sulfúrico concentrado.

Tubo 2: agregar 3 a 5 gotas de cloruro férrico al 10 por ciento (p/v).

Tubo 3: agregar 0.5 mL de ácido clorhídrico concentrado y calentar en baño de maría por 5 minutos (prueba para leucoantocianinas).

Tubo 4: agregar magnesio metálico y 0.5 mL de ácido clorhídrico concentrado.

Tubo 5: agregar un álcali a un extracto acuoso.

Tubo 6: agregar solución de ácido bórico en anhídrido acético.

Tubo 7: testigo.

Evaluar las reacciones, cambios de color y/o formación de precipitado comparados con el testigo.

Desarrollo inmediato de color flavonas y flavonoles (amarillo a rojo), flavanonoles (rojo a magenta), flavanonas (rojo, magenta, violeta, azul), isoflavonas (amarillo); isoflavononas, chalconas y auronas no dan coloración.

Cromatografía en capa fina: Extraer 1 g de material vegetal seco pulverizado con 10 mL de metanol por 5 minutos en baño de maría a 60C. Filtrar la solución y aplicar sobre las cromatoplacas de silicagel 60 F254. Como estándar emplear solución de flavonoides al 0.05 por ciento en metanol (10 μL). (Quercetina, rutina, ácido clorogénico, hiperósido).

Fase móvil: acetato de etilo-ácido fórmico-ácido acético glacial-agua (100:11:11:27), nbutanol-ácido acético-agua (40:10:50); acetato de etilo-ácido fórmico-ácido acético glacial-etilmetilcetona-agua (50:7:3:30:10) 14

Detección: Sin tratamiento químico: UV 254 nm fluorescencia, zonas azules o amarillas. UV 365 nm, dependiendo la estructura fluorescen de color amarillo, azul o verde.

Reactivo de Productos Naturales (NP/PEG). Fluorescencia intensa en UV-365 nm.

Solución 1: solución metanólica al 1 por ciento de difenilboriloxietilamina (NP).

Solución 2: solución etanólica al 5 por ciento de polietilenglicol 4000 (PEG).

Aplicar a la placa vapores de amoniaco para intensificar el color de las manchas.

I.4.5.8.3 Investigación de antraquinonas Prueba de Bornträger: Extraer 3.0 g de material vegetal pulverizado con 10 mL de etanol al 80 %, filtrar y concentrar en baño de maría (60C). Disolver el residuo con 30 mL de agua destilada y filtrar. Extraer con 10 mL de benceno. A la fase bencénica añadir 5 mL de solución de test de amonio y agitar. Observar cambios de color en la fase alcalina (color rojo, rosado: positivo).

Prueba de Bortränger modificada: Calentar 0.3 g de material vegetal pulverizado con 10 mL de hidróxido de potasio alcohólico 0.5 N y 1 mL de peróxido de hidrógeno al 3 por ciento y calentar 10 min en baño de maría a 60C. Añadir 10 gotas de ácido acético glacial para acidificar. Extraer con 10 mL de benceno. A la capa bencénica adicionar 5 mL de solución de prueba de amonio y agitar. Observar cambios de color en fase alcalina (color rojo, rosado: positivo).

Cromatografía en capa fina: Extraer 0.5 g de material vegetal seco pulverizado con 5 mL de metanol en baño maría (60C) por 5 minutos. Filtrar y aplicar 10 μL en la cromatoplaca de silicagel 60 F254.

Estándar: solución al 0.1 % en metanol de antraquinonas (10 μL). (Aloína, flangulina A/B, glucofrangulina A/B y sus agliconas, reina, aloe-emodina, extracto de sen) Fase móvil: acetato de etilo-metanol-agua (100:17:13), acetato de etilo-metanol-agua (100:13.5:10).

Detección: Sin tratamiento químico: UV 254 nm fluorescencia, UV 365 nm fluorescencia amarilla o rojo-café.

Solución etanólica de hidróxido de potasio al 5 o 10 %.

Antraquinonas: zonas rojas en visible y fluorescencia roja en UV-365 nm.

Antronas y antranolas: zona amarillas en visible y fluorescencia amarilla en UV-365 nm.

I.4.5.8.4 Investigación de cumarinas Ensayos macro y semimicro: Medir 5 mL de extracto vegetal metanólico. Agregar 1 mL de agua destilada hirviendo. Con un capilar aplicar 2 manchas en papel filtro. A una 15

mancha agregar 1 gota de hidróxido de potasio 0.5N. Observar bajo luz ultravioleta de 365 nm (fluorescencia azul o verde: positivo).

Cromatografía en capa fina: A 1.0 g de material vegetal adicionar 10 mL de metanol y calentar 30 minutos en baño de maría. Filtrar y evaporar hasta 1 mL. Aplicar 20 μL en una cromatoplaca de sílica gel 60 F254. Utilizar como estándar canela en metanol al 1 por ciento, umbeliferona, ácido p-cumárico, cumarina.).

Fase móvil: tolueno-acetato de etilo (93:7); tolueno-éter (1:1 saturado con 10 % de ácido acético, 50 mL de tolueno y 50 mL de éter son mezclados durante 5 min con 50 mL de ácido acético al 10 %, se filtra y se descarta la fase de abajo, y la mezcla de tolueno-éter es usada).

Detección: Sin tratamiento químico UV 254nm fluorescencia. UV 365 nm todas las cumarinas muestras una intensa fluorescencia azul o verde- azul.

Solución etanólica de KOH al 5 o 10 por ciento. UV-365 nm fluorescencia azul o verde.

I.4.5.8.5 Investigación de saponinas Prueba de espuma: Tubo 1: 100 mg de material vegetal pulverizado y seco.

Tubo 2: 2 mL de control de saponinas (0.5 %).

Tubo 3: 2 mL de agua.

A cada tubo se le adiciona 10 mL de agua destilada. Calentar en baño de maría (60C) durante 30 minutos. Enfriar, tapar los tubos, agitar vigorosamente 30 a 40 segundos. Dejar reposar los tubos durante 30 minutos, observar la formación de capa de espuma. Si una capa de espuma mayor de 3 cm persiste en la superficie líquida después de 30 minutos se presume la presencia de saponinas.

Cromatografía en capa fina: 2 g de material vegetal seco, se extraen con 10 mL de etanol al 70 por ciento con reflujo por 10 minutos. Evaporar a 5 mL y proceder a aplicar 25-40 μL en una cromatoplaca de silicagel 60 F254. Estándar de saponinas al 0.1 por ciento en metanol (10 μL).

Fase móvil: (50:10:40).

cloroformo-metanol-agua

(64:50:10),

n-butanol-ácido

acético-agua

Detección: Reactivo de sangre, zonas hemolíticas blancas en fondo rojo.

Reactivo de Liebermann-Burchard: UV-365 o VIS zonas azules y verdes de saponinas esteroidales, rojas y violetas de triterpenoides. Reactivo de Komarowsky: zonas azules,

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amarillas y rojas. Vainillina-ácido sulfúrico y anisaldehído-ácido sulfúrico: zonas azules, violetas, amarillentas.

I.4.5.8.6 Investigación de principios amargos Cromatografía en capa fina: Calentar 1 g de material vegetal con 10 mL de metanol en baño de maría a 60C por 10 minutos. Evaporar y filtrar a 2 mL. Aplicar en la cromatoplaca. Estándar: artemisina al 1 por ciento en metanol (20 μL).

Fase móvil: acetato de etilo-metanol-agua (77:15:8) y cloroformo-metanol (95:5).

Detección: vainillina-ácido sulfúrico, anisaldehído-ácido sulfúrico. Zonas rojas-violetas, cafés-rojas, azules-verdes.

(Reactivo de Liebermann-Buchard: UV-365 nm: gris, café; VIS: café oscuro, gris).

I.4.5.8.7 Investigación de taninos Ensayos macro y semimicro: Extraer 10.0 g de material vegetal pulverizado con 30 mL de etanol o metanol al 80 %, filtrar y evaporar a sequedad. Añadir 25 mL de agua caliente al residuo y agitar con varilla y dejar enfriar. Agregar 1 mL de solución de cloruro de sodio al 10 por ciento y filtrar. Adicionar 3 mL del filtrado a 4 tubos de ensayo: Tubo 1: testigo.

Tubo 2: agregar 4 a 5 gotas de solución de gelatina al 1 % (p/v).

Tubo 3: agregar 4 a 5 gotas de gelatina-sal (1 por ciento de gelatina y cloruro de sodio al 10 por ciento).

Tubo 4: agregar 3 a 4 gotas de solución de cloruro férrico al 10 % (p/v).

Observar la formación de precipitado y/o cambio de coloración.

Con cloruro férrico: grisáceo-negro: catecol; negro-azulado: pirogalol) I.4.5.9 Actividad biocida de metabolitos secundarios aislados y aceites esenciales Los aceites esenciales de dos especimenes de cada especie, fueron utilizados para realizar ensayos de actividad biocida por inoculado en caja de Petri y por bioautografía colocando los cromatogramas de capa fina obtenidos cromatoplacas de sílica gel sobre medio inoculado. Los ensayos realizados correspondieron a la bacteria grampositiva, Staphylococcus aureus, y a las bacterias gramnegativas Salmonella typhi y Escherichia coli.

I.4.5.10 Indice de refracción de aceites esenciales El índice de refracción de los aceites esenciales fue obtenido utilizando un Refractómetro tipo Abbe. Este parámetro es de utilidad para la evaluación de de diferencias entre los aceites esenciales.

I.4.6

La técnica estadística Para la interpretación de los resultados se utilizó estadística descriptiva. Se obtuvo la 17

media del rendimiento de la extracción de aceites esenciales de tres o más repeticiones, así como de la integración de las áreas de los picos cromatográficos correspondientes a los componentes de los aceites esenciales analizados en las plantas de estudio.

Para su identificación, las muestras colectadas en cada muestreo fueron codificadas, consignándose en una hoja de registro las características principales del lugar de muestreo, ubicación y de la planta, además de registrarse la información en cuaderno de campo.

Se considera que una planta presenta potencial económico para su extracción de aceite esencial si su contenido de aceite es mayor que 0.5 % y presenta componentes mayoritarios de valor económico (Aragao, 1981).

I.4.7

Los instrumentos utilizados Los principales instrumentos utilizados en esta investigación fueron:

Cromatógrafo de gases con detector de llama Cromatógrafo de gases con detector de masas Espectrofotómetro UV-VIS Aparato de hidrodestilación tipo Clevenger Refractómetro tipo Abbe Rotavapor

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PARTE II MARCO TEÓRICO (CONCEPTUAL)

II.1 Aceites esenciales Los aceites esenciales son productos volátiles de origen vegetal obtenidos por proceso físico y puede presentarse aisladamento en mezclados entre sí, rectificados, desterpenados o concentrados (Yunes y Cechinel, 2009). Los aceites esenciales son usados en muchas industrias para proporcionar aromas y olores especiales a productos como perfumes, cosméticos, jabones, condimentos, dulces, etc. Otros usos consisten en enmascarar olores desagradables en ambientes de trabajo e instalaciones sanitarias, así como su uso como solventes y como insumos en productos de las industrias de plásticos, tintas, caucho, insecticidas y otras.

Algunas especies vegetales que contienen aceites volátiles, como canela, clavo de la India, nuez moscada y jenjibre, fueron extensamente consumidas en Europa a partir de la época de las cruzadas, debido a que poseían aroma y/o sabor acentuados. Especies elaboradas con flores, frutos, semillas, cáscaras y raices de una gran variedad de plantas provenientes de regiones tropicales, alcanzaron un elevado valor comercial. Esto motivó la creación de nuevas rutas comerciales entre occidente y oriente. Las esepcies fueron utilizadas tanto en la culinaria, con con fines de condimentación y conservación de los alimentos, enla preparación de aceites, ungüentos, cosméticos y medicamentos (Yunes y Cechinel, 2009).

La utilización de los aceites esenciales requiere de una cuidadosa caracterización química y evaluación de posibles modificaciones de su composición quíica, deibdas a los diferentes orígenes geográficos y condiciones climáticas y a variaciones genéticas poblacioneas que pueden provocar la formación de diferentes quimiotipos. Además, la comosiciòn química de una misma especie fegetal puede variar de acuerdo con la parte de la planta utilizada.

En la actualidad, muchos aceites esenciales constituyen compuestos de partida para síntesis de otras sustancias útiles en las industrias química y farmacéutica. Otros componentes tienen propiedades farmacológicas y son usados como antibacterianos, analgésicos, sedantes, expectorantes, estimulantes y estomáquicos en la composición de medicamentos.

La introducción de un aceite esencial nuevo en el mercado internacional, presenta diferentes niveles de dificultad, según la industria para la que se destine, así por ejemplo, para su aceptación en la industria de aromas debe cumplir con patrones complejos y rígidos, exigiendo una calidad uniforme. Por esta razón, generalmente existe un gran interés en esta industria por la investigación de nuevas fuentes de aceites esenciales. En el caso de la industria química, en la cual los aceites esenciales son utilizados como solventes, o bien, como insumos, las restricciones son menores.

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Aragão et al. (1981), seleccionaron varias plantas con posibilidades económicas en cuanto a su cultivo, basándose en los siguientes criterios: a) abundancia de la planta en la región b) rendimiento de aceite esencial elevado, igual o mayor que 0.5% c) un componente principal económicamente importante en concentración superior a 30% d) un componente secundario de alto valor económico En dicho estudio, Aragão obtuvo resultados de análisis químico de 82 Aceites esenciales de plantas del Noreste de Brasil, de 14 familias botánicas diferentes. Los resultados más importantes de dicho estudio fueron los cromatogramas correspondientes a cada aceite y la relación de los constituyentes químicos identificados, así como sus fuentes alternativas. Previo a su análisis, los aceites estudiados fueron obtenidos extracción por arrastre con vapor de agua, a partir de materiales colectados en el campo y transportados al laboratorio en vehículo, manteniéndolas a baja temperatura. Existen otras técnicas de extracción antiguas, como la extracción con grasa fría o grasa caliente, que no serán utilizadas en el proyecto, al ser de bajo rendimiento (Guenther, 1948). Como aporte final, el autor presentó once monografías de los aceites esenciales seleccionados por la importancia de sus posibilidades económicas, en las cuales se hicieron sugerencias sobre la necesidad de investigación agronómica para su aprovechamiento agroindustrial en el noreste de Brasil.

En cuanto a las técnicas de extracción, los aceites esenciales son obtenidos por diferentes procesos, dependiendo de su localización en el vegetal, de la cantidad y de las características requeridas para el producto final. Las técnicas más conocidas son el arrastre con vapor de agua, la hidrodestilación y la extracción con solventes. Para propósitos analíticos la hidrodestilación con aparato tipo clevenger es la más utilizada (Pereira, et al., 2000), sin embargo, esta técnica provoca reacciones de oxidación en varios componentes del aceite, debido a la presencia de agua y la alta temperatura, por lo que la composición del aceite se altera antes del análisis. Por esto, se ha utilizado recientemente la destilación extracción por tres horas, utilizando el aparato de Likens-Nickerson, para la extracción del aceite con fines puramente analíticos (Pereira et al., 2003), que es la técnica que se propone en el presente estudio. Además, recientemente se ha utilizado la técnica de Microextracción en Fase Sólida, que permite la extracción del aceite esencial a partir de material fresco y su inyección inmediata en el cromatógrafo de gases, lo cual evita el uso de solventes y permite un análisis más inmediato de la composición del aceite esencial estudiado.

Otras técnicas de extracción utilizadas son la expreción, la enfloración la extracción con solventes orgánicos o grasas, y con fluidos supercríticos. Los solventes de baja polaridad o el dióxido de carbono supercrítico, permiten obtener aceites esenciales en mezcla con compuestos lipofílicos no volátiles. Por otro lado, la ausencia de calentamiento evita la producción de artefactos, como los de la serie de derivados del sabineno (terpinen-4-ol, -terpineno, -terpineno y terpinoleno). En algunos casos el calentamiento es necesario para formarción de compuestos de interés, como el camazuleno en la camomila (Yunes y Cechinel, 2009).

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II.1.1 Biosíntesis Los terpenos y terpenoides son producidos en la naturaleza por dos rutas biosintéticas, siendo estas la del mevalonato a través del ácido mevalónico y la ruta no mevalónica, descubierta más recientemente, a través del intermediario de cinco átomos de carbono 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato (Dubey et al., 2003). Los fenilpropanoides son sintetizados a partir de la fenilalanina producida vía el ácido shiquímico.

II.1.1.2 Terpenos El ácido mevalónico, formado a partir de dos moléculas de acetilcoenzima A, es el precursor de las dos unidades básicas de los terpenos, el isopentenilpirofosfato (IPP) y el ,-dimetilalilpirofosfato (DMAPP). La ruta del ácido mevalónico se presenta en la Figura 1. El ácido mevalónico es pirofosfatado por dos unidades de ATP originando el mevalonil-pirofosfato, el cual se descarboxila con la participación de otra molécula de ATP, originando al isopentenilpirofosfato (IPP). El DMAPP es formado por isomerización del enlace doble del IPP. La condensación de moléculas de IPP y DMAPP origina a los precursores inmediatos de los diferentes terpenoides como el geranil difosfato (GPP), farnesil difosfato (FPP) y geranilgeranilo difosfato (GGPP) (Yang y Orihara, 2002; Dewick, 2001).

Figura 1. Ruta del ácido mevalónico en la biosíntesis de terpenos.

Fuente: Dewick, 2001.

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En la ruta del 1-desoxi-D-xilulose-5-fosfato (Figura 2) la descarboxilación del piruvato mediada por tiamina difosfato produce un acetaldehído enlazado en la forma de una enamina la cual reacciona como nucleófilo en una reación de adición con el gliceraldehido-3-fosfato (Dubey et al., 2003; Rochdich et al., 2001; Fellermeier et al., 2001). La liberación de la tiamina difosfato genera aL 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato que sufre un rearreglo tipo pinacol y una reducción siendo transformado en 2-C-metil-Deritrol-4-fosfato (Duvold et al., 1997; Sagner et al., 1998). La reacción de esta molécula con citidina trifosfato produce un derivado difosforado de citidina el cual es fosforilado vía ATP, resultando en un derivado 2-fosfato que es convertido en un fosfoanhidrido cíclico con pérdida de citidina fosfato. El ciclofosfato es transformado por reacciones todavía no esclarecidas en IPP que relaciona la síntesis de la desoxixilulosa con la del mevalonato. El DMAPP podría ser derivado del IPP o producido independientemente, lo cual no ha sido elucidado (Dewick, 2001).

La gran variedad diversidad estructural de los monoterpenos se deriva de las reacciones de cilización enzimáticamente catalizadas, en especial por las monoterpeno ciclasas y las isomerasas. De forma general, estas enzimas presentan propiedades semejantes y la mayoría es capaz de sintetizar no solo uno, sino una serie de productos, normalmente con la misma configuración espacial (Lu et al., 2002).

II.1.1.3 Fenilpropanoides Los fenilpropanoides no son constituyentes muy comunes de los aceites esenciales, aunque existen especies que producen estas sustancias en cantidades importantes. Los fenilpropanoides son sintetizados a partir de la ruta del ácido shikímico (Dewick, 2001).

Los fenilpropanoides de aceites esenciales son derivados de la fenilalanina y en menor grado de la tirosina (Sangwan et al., 2001). En la ruta biosintética, la fenilalanina es convertida en ácido trans-cinámico; el ácido trans-cinámico es convertido en p-cumarato (Schmid y Amrhein, 1995). Entre los fenilpropanoides comunes en aceites esenciales, se encuentran el eugenol, el metileugenol, la miristicina, el chavicol, el metilchavicol, el estragol y el anetol, entre otros.

II.1.1.4 Extracción de los aceites esenciales En el laboratorio los aceites esenciales son extraídos generalmente por hidrodestilación con aparato tipo Clevenger (Pereira, et al, 2000), siendo esta la técnica más utilizada para la determinación del contenido del aceite esencial y para la extracción del aceite esencial utilizado para el análisis cromatográfico. Esta técnica provoca reacciones de oxidación en varios componentes del aceite esencial por la presencia de agua y la temperatura elevada de operación, por lo cual la composición del aceite puede ser alterada antes del análisis cromatográfico (Richter y Schellenberg, 2007). Por esa razón recientemente se ha utilizado la técnica de extracción-destilación simultáneas con aparato Likens-Nickerson para extraer el aceite con fines puramente analíticos (Pereira et al., 2003). Existen otras técnicas de extracción antiguas, como el arraste con vapor de agua, la extracción con disolventes y la extracción con cera fría o caliente (Guenther, 1948).

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Figura 2. Ruta de la 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato en la biosíntesis de terpenos.

Fuente: Dewick, 2001.

II.1.2 Polimorfismo químico Diferentes estudios de plantas ricas en aceite esencial han demostrado en los últimos años, la existencia de polimorfismo químico entre plantas de la misma especie, es decir, existen plantas de una misma especia que producen aceites esenciales con composiciones diferentes, debido principalmente a la diferencia en condiciones climáticas donde crecen.

Estas plantas pueden agruparse de acuerdo a orígenes comunes de acuerdo a quimiotipos (Pereira et al., 2003), de manera que puede seleccionarse la procedencia que producirá los mejores resultados en cuanto a composición y a rendimiento.

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Algunas poblaciones de plantas poseen principalmente un quimiotipo simple, pero se ha observado que muchas poblaciones presentan dos o tres, o más quimiotipos, como ocurre en el caso de Thymus vulgaris, planta que posee seis quimiotipos (Thompson et al., 2003). Em el caso de polimorfismo en plantas de Guatemala del género Lippia, se ha encontrado que L. graveolens presenta tres quimiotipos (Fischer et al, 1997) y L. alba dos quimiotipos (Fischer et al., 2004).

II.1.3 Actividad antioxidante Las especies reactivas de oxígeno son reconocidas como responsables por un gran número de enfermedades, así como por el proceso de envejecimiento. Los radicales libres constituyen un blanco interesante para el desarrollo de nuevos medicamentos, en este contexto los antioxidantes de origen natural merecen atención especial, pues las plantas sintetizan un gran número de metabolitos capaces de captar los radicales libres (Potterat, 1997). Los mecanismos de acción de estos compuestos son diversos, incluyéndose la captura de oxígeno, la desactivación de radicales por reacción de adición covalente, la reducción de radicales peróxidos y la complejación de metales de transición (Larson, 1995).

La reducción del radical DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo) permite determinar la actividad antioxidante. La prueba es bastante simple: los extractos, fracciones o productos puros a evaluar son depositados en una placa de cromatografía de capa fina (sílica gel) y se realiza la separación adecuada con un sistema de solventes apropiado, que es optimizado por medio de pruebas de separación de los aceites esenciales. Después de secarse, la placa es vaporizada con una solución metabólica de 2 mg/mL de DPPH. Las actividades antiradicalares aparecen en la forma de manchas amarillas sobre fondo violeta. La determinación de actividad antioxidante en solución también es posible (Hostettmann et al., 2003).

II.1.4 Actividad antioxidante de aceites esenciales Algunos aceites esenciales son conocidos por sus propiedades antioxidantes, las cuales presentan amplia paliación den la industria farmacéutica, de cosméticos y pricipalmente en la industria alimenticia (Sacchetti et al., 2005). La actividad antioxidante es de utilidad enla conservación de alimentos y también en cualquier tipo de producto que contenga en su composición un sustrato lipídico (Hirasa y Takemasa, 1998).

Los antioxidantes son sustancias que, presentes en bajas concentraciones, comparadas con el sustrato oxidable, retardan significativamente o inhiben la oxidación del sustrato. Los radicales formados a partir de antioxidantes no son reactivos para propagar la reacción en cadena, siendo neutralizados por la reacción con otro radical, formando productos estables o pueden ser reciclados por otro antioxidante (Sousa et al., 2007). Los principales mecanismos de acción de las sustancias antioxidantes incluyen captadores de radicales y supresores de estados excitados, sistemas catalíticos que neutralizan o eliminan las especies reactivas de oxígeno (ERO) y especies reactivas de nitrógeno (ERN), y el enlace de iones metálicos a proteínas, haciéndolos indisponibles para producir especies oxidantes.

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En la industria alimenticia la oxidación lipídica es inhibida por secuestradores de radicales libres. Las sustancias más utilizadas para esa función son: butil-hidroxianisol (BHA), butilhidroxitolueno (BHT), terc-butil-hidroxiquinona (TBHQ), trihidroxibutilfenona (THBP) y galato de propilo (GP). Estudios recientes han sugerido la posibilidad de que estas sustancias presenten efectos tóxicos (Soares, 2002).

Varios métodos son utilizados para determinar la actividad antioxidante de extractos y sustancias aisladas, encontrándose entre ellos el método de oxidación térmica (AlmeidaDoria y D’Arce, 2000), el del -caroteno y el del DPPH, que permiten la evaluaciòn de las etapas primarias y secundarias de la oxidación en sistemas liposolubles (Sacchetti et al., 2005); uno de los métodos más utilizados es la evaluación de la actividad secuestradora del radical libre 2,2-difenil-picril-hidrazil (DPPH) de color púrpura que absorbe radiación electromagnética a 515 nm (Sousa, 2005). Por acción de un antioxidante (AH) o de una especie radical (R.), el DPPH. es reducido generando difenil-picril-hidrazina, de color amarillo con disminución proporcional de la absorbancia. A partir de las medidas de absorbancia obtenidas puede determinarse la actividad antioxidante o secuestradora de radicales libres como porcentaje de DPPH. remanente en el medio reactivo (SánchezMoreno, 1998). El porcentaje de actividad antioxidante (% AA) corresponde a la cantidad de DPPH consumida por el antioxidante, mientras que la cantidad de antioxidante necesaria para disminuir la concentración inicial de DPPH en 50 % es denominada concentración eficiente (CE50) también llamada como concentración inhibitoria (CI50).

Cuanto mayor el consumo de DPPH por una muestra, menor será la CE50 de la sustancia y mayor su actividad antioxidante.

Sacchetti et al (2005), evaluaron la actividad antioxidante, antiradical y biocida de once aceites esenciales, usando los métodos del  -caroteno, DPPH y luminolquimioluminiscencia para determinar la actividad antioxidante obteniendo resultados consistentes entre los métodos usados. El método del DPPH fue usado también en la evaluación de la actividad antioxidante del aceite esencial Lippia berlandieri (RochaGuzmán et al., 2007) y de Ocotea quixos (Lam.) (Laureaceae) del Ecuador (Bruni et al., 2004). Besco et al. (2007), determinaron la capacidad antioxidante integral (IAC) de productos de baobab por fotoquimioluminiscencia.

II.1.5 Actividad biológica de aceites esenciales La actividad biológica puede ser definida como la capacidad de una sustancia o mezcla de sustancias para alterar una o más funciones químicas o fisiológicas de una célula. Esa capacidad está relacionada con la naturaleza física de la sustancia, la composición química y concentración, y con la duración de la exposición de la célula a la sustancia. Existen varios ensayos para evaluar la actividad biológica dependiendo del objetivo. Los organismos utilizados como blancos para ensayos de actividad biológica, pueden clasificarse en 6 grupos principales (Hosttettman et al., 2003): a) organismos inferiores: microorganismos (bacterias, hongos) b) invertebrados: insectos, crustáceos, moluscos. c) sistemas sub-celulares: enzimas, receptores.

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d) culturas de células de origen vegetal o animal e) órganos aislados: humanos f) animales vivos En el caso de los aceites esenciales, las actividades antibacteriana y antifúngica son estudiadas en la búsqueda de sustancias que puedan ser utilizadas como desinfectantes y en la industria de alimentos. El esquema de trabajo es relativamente simple. El extracto o sustancia es colocado en contacto con el agente patógeno y después de un período de incubación se observa la inhibición del crecimiento o muerte de esporas en el caso de hongos (Hosttettman et al., 2003). En las últimas décadas, se ha estudiado exhaustivamente la actividad antimicrobiana de una gran variedad de aceites esenciales (Oumzil et al., 2002; Burt et al., 2004; Cheng et al., 2006). La mayor parte de estos estudios se realizó con lso aceites esenciales sin fraccionamiento, y en algunos casos, sin la identificación de los componentes químicos. En lagunos casos la actividad fue atribuida a alguno de los componentes del aceite, con base en estudios realizados con las sustancias aisladas.

Es importante que los resultados de actividad antimicrobiana sean confrontados con la sensibilidad variable de las diferentes cepas de microorganismos utilizadas en los experimentos. Los métodos más empleados para la detección de actividad antimicrobiana son ensayos in vitro realizados por difusión, dilución o bioautografía, siendo posible en este último, relacionar los efectos bacteriostáticos o bactericidas y fungistáticos o fungicidas con los componentes de la mezcla. En algunos casos, el aceite de una planta puede presentar un constituyente mayoritario, como el de la canela que contiene más de 85 % de cinamaldehido, lo que evidencia la correlación entre la química y la actividad. Sin embargo, las sustancias presentes en menor cantidad pueden contribuir, por lo menos en parte, a la actividad, posiblemente por sinergismo entre sus componentes (Yunes y Cechinel, 2009). .

II.1.6. Métodos de análisis de actividad antimicrobiana Los métodos para análisis de actividad antimicrobiana son clasificados en tres tipos (Valgas et al., 2007): II.1.6.1 Métodos de difusión en agar En estos métodos el inóculo bacteriano es colocado en agar y el aceite esencial es colocado en el agar en pozos o en discos de papel filtro que son puestos en contacto con el inóculo. Después de la incubación los resultados son obtenidos como diámetros de los halos de inhibición.

II.1.6.2 Métodos bioautográficos Existen dos métodos, el directo y el indirecto, en los cuales el aceite esencial es corrido en una cromatografía en capa fina (CCF) y después la placa es colocada sobre el inóculo. Con esta metodología se determina el halo de inhibición que corresponde a las sustancias separadas en la CCF. 26

II.1.6.3 Métodos de dilución En este método se determina la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM), usando diferentes diluciones del aceite esencial en DMSO que son distribuidas en placas de 96 pozos, siendo cada pozo utilizado, inoculado con la suspensión bacteriana a evaluar.

Después de la inoculación, se determina la menor concentración del aceite que inhibe el crecimiento bacteriano, correspondiendo a la CIM, siendo esta expresada en mg/mL (Valgas et al., 2007).

II.1.7 Bioautografía directa Esquema bastante simple para actividades antifúngica y antibacteriana. En un primer ensayo debe colocarse el extracto o sustancia en contacto con un agente patógeno, y puede observarse con relativa facilidad la inhibición del crecimiento o muerte de esporas, en el caso de los hongos. (Hostettmann et al., 2003).

Actualmente muchas investigaciones son realizadas para desarrollar nuevos agentes antimicóticos, pues un número de casos ligados al SIDA, de micosis sistémicas, están en plena expansión. La bioautografía directa, combina la cromatografía en capa fina y el ensayo biológico in situ, es un excelente método porque puede conseguir la fácil localización de los compuestos activos en una matriz compleja. Algunos métodos de cromatografía directa que utilizan Aspergillum, Penicillium y Cladosporium sp. han sido publicados en la literatura (Van der Sluis et al., 1981) Las placas de capa fina son asperjadas con una suspensión de esporas y en seguida, incubadas por dos o tres días en atmósfera húmeda. Las zonas de inhibición son directamente visibles, pues durante el período de incubación, el hongo produce un pigmento colorido. La técnica también puede ser usada para Candida albicans.

II.1.8 Análisis de los aceites esenciales El desenvolvimiento de técnicas instrumentales de análisis y el acoplamiento con sistemas computadorizados ha facilitado el análisis de los aceites esenciales.

Antiguamente el análisis era un proceso muy largo ya que se necesitaba aislar y purificar cada componente de los aceites esenciales para determinar la estructura por métodos químicos tradicionales (Bandoni, 2003). En la actualidad, las técnicas usadas en el análisis de los aceites esenciales son los siguientes: a) Técnicas cromatográficas de alta resolución, como cromatografia de gases con columna capilar. b) Técnicas espectroscópicas, como espectrometría de masas (EM), espectroscopía infrarroja (IR) y espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (RMN). c) Sistemas cromatográficos acoplados a técnicas espectroscópicas, como cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM) y cromatografia de gases acoplada a espectroscopía de infrarrojo con transformada de Fourier (CG-IRTF).

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Las principales técnicas analíticas utilizadas en el análisis de aceites esenciales se basan en las caracteristicas fisicoquímicas de los aceites y sus componentes.

II.1.8.1 Cromatografía de gases (CG) Por tratarse de una mezcla de constituyentes volátiles, los aceites esenciales brutos pueden analizarse directamente por cromatografía de gases, sin tratamiento previo de la muestra, además de una simple dilución, permitiendo no solamente el análisis cuantitativo de sus constituyentes, sino también cualitativo, ya sea por el uso de tiempos o índices de retención, o por el acoplamiento del cromatógrafo con un espectrómetro de masas. Sin embargo, cuando los aceites se encuentran como componentes en formas farmacéuticas, alimentos u otros tipos de formulaciones, su análisis es posible solamente mediante una o varias etapas de extracción.

La técnica más usada en los laboratorios para el análisis cualitativo y cuantitativo de aceites esenciales es la cromatografía de gases con detector de ionización de llama (Bandoni, 2003). El análisis de aceites esenciales se basa en la identificación de las sustancias presentes en el aceite por el tiempo de retención de estas comparado con los tiempos de retención de sustancias puras o por medio de índices de retención obtenidos a partir de la inyección de hidrocarburos de serie homóloga y su comparación con los índices de estándares de sustancias comunes en los aceites esenciales (Marriot et al., 2001). Existen bases de datos de los índices de retención para un número grande de sustancias encontradas en aceites esenciales (Adams, 2001). El análisis cuantitativo es realizado por medio de la integración de las áreas de los picos pertenecientes al aceite esencial y el cálculo del porcentaje del área de cada pico dentro del área total de los picos correspondientes al aceite (Bandoni, 2003). En la actualidad son utilizadas columnas capilares de 25 a 60 m de largo por 0.25 mm de diámetro, que proporcionan alta resolución cromatográfica. Columnas de polidimetilsiloxano y polietilenglicol son utilizadas normalmente en el análisis de aceites esenciales (Bandoni, 2003).

Desde 1952, cuando fue desarrollada la cromatografía de gases, existe interés en mejorar la velocidad de separación. Recientemente se han desarrollado alternativas para disminuir el tiempo de análisis en casos en que el número de platos teóricos de una columna capilar es demasiado alto para un problema de separación específico presentando solutos muy bien separados (R>>2) pero tiempos de retención muy largos. Estos métodos incluyen el uso de columnas multicanales y cromatografía de gases “Flash” (David et al., 1999). El incremento de la velocidad de separación sin disminuir la resolución obtenida para una mezcla compleja sobre una determinada fase estacionaria, puede realizarse por la reducción del diámetro interno de la columna capilar. Así, una columna de 10m x 0,1 mm D.I., proporciona la misma resolución que una columna de 25 m x 0.25 mm D.I.. Como la columna es 2,5 veces más corta, el tiempo de análisis es reducido drásticamente, pudiendo ser usadas también mayores velocidades de flujo para el gas portador ya que la velocidad óptima del gas es mayor y las gráficas de H versus u (curvas de Van Deemter) son más planas para columnas finas (Cramers y Leclercq, 1999). Con el uso de programas de computadora de conversión de métodos, un procedimiento de operación existente para una columna capilar normal puede ser convertido en un procedimiento de operación para una columna fina, resultando en un análisis más rápido con la misma resolución. Ambos datos 28

cualitativos y cuantitativos permanecen sin alteraciones. La técnica de cromatografía de gases ultra rápida (CG-UR) ha sido probada en el análisis de aceites esenciales de diferente complejidad, mostrando buena reproducibilidad en la separación e identificación de sustancias confiable (Bicchi et al., 2004).

II.1.8.2 Espectrometría de masas (EM) El objetivo de la EM es determinar la masa molecular del analito y generar información sobre su estructura. La masa molecular es determinada por medio de la ionización de la molécula utilizando diferentes técnicas como Impacto Electrónico (IE), Ionización Química (IQ), Bombardeo con Átomos Rápidos (conocida por FAB en inglés), entre otras.

Los iones generados en la cámara de ionización son acelerados eletrostáticamente y separados en el analizador en función de su relación masa/carga (m/z), y son colectados en el detector donde es registrada la señal producida. Las señales son digitalizadas y procesadas en un sistema computarizado donde son comparadas con espectros de bibliotecas de sustancias patrón. Esta técnica se utiliza pocas veces en forma aislada en el análisis de aceites esenciales, para el cual su utilidad principal es en forma acoplada como sistema de detección con CG. II.1.8.3 Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM) La cromatografía de gases con detector de masas (CG-EM) presenta una gran utilidad para el análisis de sustancias volátiles y estables a temperaturas altas. En la literatura existen bases de datos y bibliotecas de espectros (Adams, 2001) que son usadas para identificar los componentes de los aceites esenciales por medio de la comparación de los espectros. La espectrometría de masas no presenta espectros únicos para componentes de aceites esenciales en muchos casos, en vista del gran número de isómeros con la misma fórmula molecular y diferente estructura que presentan espectros muy similares. El acoplamiento con CG permite la separación de las sustancias de los aceites esenciales en la columna cromatográfica y la obtención de los espectros de masas de cada una de las sustancias eluidas. Así, el uso combinado de la información proporcionada por los tiempos de retención en la cromatografía y los espectros de masas es de gran utilidad para la identificación de los componentes de los aceites (Marriot et al., 2001). En la actualidad casi todas las publicaciones sobre identificación de los componentes de aceites esenciales son basadas en estas dos técnicas acopladas.

II.2 Flavonoides

Entre los grupos de metabolitos secundarios que se encontraron en las plantas de estudio que presentan mayor potencial para la investigación de posibles aplicaciones en las industrias de alimentos y farmacéutica, se encuentran los flavonoides. Los flavonoides constituyen una clase de compuestos polifenólicos de amplia distribución en el reino vegetal. Se encuentran principalmente en plantas en la forma de glucósidos, siendo los pigmentos amarillos, naranja, azules y rojos de las flores, responsables también por el color amarillo de las horas en el otoño. Son importantes para el crecimiento normal, desarrollo y defensa de las plantas, Actúan como atractivos visuales favoreciendo la polinización, como mecanismo de defensa contra el ataque de insectos y microorganismos 29

y como protectores contra la radiación ultatvioleta, por sus propiedades antioxidantes (Yunes y Cechinel, 2009).

Los flavonoides son importantes constituyentes de la dieta humana, a pesar de no ser considerados nutrientes. Se encuentran en una gran variedad de vegetales, bebidas como té o vino tinto, y en frutas, especialmente las cítricas. Se ha calculado que la ingestión diaria de flavonoides aportados por la dieta se encuentra entre 50-800 mg/día (Yunes y Cechinel, 2009), existiendo estimaciones de que la ingestión podría ser de hasta 1 g (Kandaswami et al., 2005). Una taza de té verde o de un vaso de vino tinto pueden proporcinar hasta 200 mg de flavonoides totales; una cebolla, 40 mg/100 g; una manzana, 6-10 mg, un durazno, 1-2 mg y una naranja, 10 mg (Yunes y Cechinel, 2005). El hecho de que los flavonoides estén presentes en la dieta y de que se les atribuya una gran variedad de actividades biológicas, hace suponer que estos polifenoles podrían cumplir una función protectoa contra enfermedades cardiovasculares y contra ciertas forams de cáncer.

Las plantas sintetizan centenas de compuestos fenólicos y polifenólicos, que poseen variadas estructuras y funciones (Figura 3). Entre estos compuestos, los más estudiados como antioxidantes son los flavonoides que tienen en común las estructura C 6-C3-C6, consistiendo de dos anillos aromáticos enlazados por un heterociclo oxigenado. Dentro de los aproximadamente 4000 flavonoides descritos, las mayores clases son los flavonoles, catequinas o flavonas, antocianidinas e isoflavonas. En estas clases hay grandes variaciones estructurales, dependiendo del nivel de hidrogenación, hidroxilación, metilación y sulfonación de las moléculas.

Figura 3. Estructuras de las principales clases de flavonoides.

Fuente: Bruneton, 1993.

Los flavonoides constituyen los ingredientes nutracéuticos más activos en las plantas. Corresponden a un grupo de moléculas orgánicas distribuidas en las plantas 30

vasculares. Como compuestos fenólicos típicos, pueden actuar como potente antioxidantes y quelantes metálicos.

II.2.1 Funciones de los flavonoides Los flavonoides cumplen una amplia variedad de funciones ecológicas y fisiológicas en las plantas. Es bien conocido el rol de los pigmentos de antocianina como señales visuales en angiospermas para atraer polinizadores y agentes de dispersión de frutas, pero estas funciones se adquirieron tarde en la diversificación evolutiva de los flavonoides.

Funciones menos conocidas y probablemente más antiguas de los flavonoides incluyen la protección contra los efectos nocivos de la radiación UV, la mediación de las interacciones entre el polen y el estigma, defensa contra bacterias, hongos patógenos y herbívoros, mediación de interacciones entre plantas y hongos micorrízicos mutualistas, y como reguladores de la actividad hormonal (Shirley, 1996).

La ruta biosintética de los flavonoides ha sido útil como sistema modelo para el entendimiento de la regulación de los genes en las plantas. En forma similar, los genes de la ruta de los flavonoides, estructurales y reguladores, han sido útiles como sistema modelo para el entendimiento de una gran variedad de procesos evolutivos, incluyendo el rol de la duplicación de genes en la facilitación de la evolución de caracteres nuevos y la importancia relativa de los genes estructurales y reguladores en la evolución de caracteres ecológicamente importantes.

La ruta de los flavonoides es un ejemplo clásico de las rutas que se han ido extendiendo gradualmente, conforme nuevos productos y nuevas funciones van surgiendo.

A pesar que muchos detalles de su construcción evolutiva aún son desconocidos, es posible reconstruir los principales eventos evolutivos con confianza. La duplicación de genes ha proveído la materia prima para la construcción de la ruta. Hay una simetría satisfactoria en esto, ya que una vez que la ruta de los flavonoides se completó, la duplicación y la divergencia de los genes de la ruta han permitido la aparición de nuevas clases de compuestos. A través de la duplicación de los genes, las rutas no solo nacen, sino también se expanden en rutas sintéticas adicionales (Lin y Weng, 2008).

II.2.2 Actividad antioxidante de los flavonoides Las dietas ricas en flavonoides, frutas y vegetales, son protectoras contra una variedad de enfermedades, particularmente enfermedades cardiovasculares y algunos tipos de cáncer (Ness y Powles, 1997). Los antioxidantes y la fibra dietética son los nutrientes responsables por estos efectos protectores. Las Especies Reactivas de Oxígeno (ERO) son formadas in vivo durante el metabolismo aeróbico normal y pueden causar daño al ADN, proteínas y lípidos, no obstante el sistema de defensa antioxidante natural de todos los organismos (Lin y Weng, 2008). Las ERO contribuyen al envejecimiento celular (Kawanishi et al., 2001) y enfermedades coronarias (Khan y Baseer, 2000), posiblemente a través de la desestabilización de membranas (Takabe et al, 2001), daño del ADN, y oxidación de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) (Meyer et al., 1998).

31

Los efectos protectores de los flavonoides en los sistemas biológicos se deben a su capacidad para transferir electrones de radicales libres, la quelación de catalizadores metálicos (Ferrari et al., 1997), la activación de enzimas antioxidantes, la reducción de radicales de -tocoferol (Hirano et al., 2001) y la inhibición de oxidasas (Cos et al., 1998). Velioglu et al. (1998), analizaron la actividad antioxidante y fenoles totales en frutas, vegetales y granos. Ellos encontraron correlación estadísticamente significativa entre la actividad antioxidante y el contenido de fenoles totales.

Algunos flavonoides como la quercetina, presentan mayor velocidad de reacción con radicales libres in vitro que el -tocoferol. Se ha sugerido que esto es debido a la conjugación más extendida de sus estructuras, que lleva a radicales libres más estabilizados. La presencia de dos o más grupos OH reactivos y menor impedimento estérico en el sitio de abstracción también deben influir.

Los polifenoles son capaces de captar radicales alcoxilo (RO .), alquilperoxilo (ROO.), superóxido (O2.-) radical hidroxilo (HP.), óxido nítrico (NO.), además del oxidante peroxinitrito (ONOO./ONOOH). La eficacia antioxidante de polifenoles in vivo todavía necesita de ser evaluada, pues se conoce poco sobre su biodisponibilidad.

II.2.3 Anti-carcinogénesis: Numerosos estudios in vitro indican que los flavonoides encontrados en plantas pueden participar efectivamente en procesos que pueden tener efectos anticarcinogénicos y anti-anterogénicos. Estos estudios han demostrado que los flavonoides inhiben la carcinogénesis in vitro y evidencia sustancial indica que también lo hacen así in vivo (Caltagirone et al., 2000; Miyagi et al., 2000). Los flavonoides pueden inhibir la carcinogénesis afectando los eventos moleculares en las etapas de iniciación, promoción y progresión. Los estudios en animales usando diferentes modelos celulares sugieren que ciertos flavonoides podrían inhibir la iniciación de tumores así como el crecimiento de los mismos (Makita et al., 1996; Tanaka et al., 1997, 1999).

Entre los procesos que previenen estas enfermedades, el más evidente es la capacidad antioxidante de estos compuestos atribuida al poder reductor del grupo hidroxilo aromático, que reduce radicales libres reactivos, produce el radical libre fenoxilo estabilizado por resonancia. La capacidad antioxidante de los polifenoles es influida por el número y posición de los grupos OH, así como por las posiciones de glicosilación. Al contrario del ácido ascórbico y el -tocoferol, que actúan en medio acuoso y en la cámara fosfolipídica celular, respectivamente, los flavonoides pueden localizare en las dos fases.

En cuanto a la actividad anticancerígena de los flavonoides, Soleas et al. (2006) compararon las actividades antitumorales de un fenol de cada uno de cuatro diferentes clases: flavanoles [(+)-catequina], estilbenos (trans-resveratrol), flavonoles (quercetina) y ácidos hidroxibenzoicos (ácido gálico). Para eso, fue utilizado un modelo de cáncer de piel de ratón CD-1 en dos etapas, con el 9,10-dimetil-1,2-benzantraceno (DMBA) como iniciador. Los ratones fueron tratados con polifenoles específicos en dosis entre 0 y 25 32

moles (disueltos en 200 L de acetona), dos veces por semana hasta dieciocho semanas.

La solución fue aplicada tópicamente en la región dorsal afeitada de cada animal Los autores comparan las potencias relativas de los polifenoles, por la evaluación de la inhibición de la formación de tumores en individuos y por el número de ratones que desarrollaron uno o más tumores con los diferentes programas de dosis. La quercetina fue la más efectiva (ED50< 1 mol) y el ácido gálico el menos efectivo (ED 50 5-10 moles), (+)-catequina y trans-resveratrol fueron intermedios, con ED50 entre 5 y 6 mol, respectivamente. Los autores concluyeron que el trans-resveratrol podría ser el polifenol anticancerígeno más efectivo de los presentes en el vino tinto en la forma como es consumido por humanos saludables, ya que el trans-resveratrol es absorbido mucho más eficientemente que la (+)-catequina y la quercetina en humanos después de la ingestión.

II.2.4 Evolución de la producción de flavonoides por las plantas.

Los flavonoides juegan un papel muy importante para la quimiosistemática, como marcadores de la evolución de las plantas. Es aceptada la teoría de que las plantas terrestres se derivaron de organismos como las algas verdes, sin embargo, no se han encontrado flavonoides en las algas. Además, a pesar que los genomas de algunas algas se han secuenciado, ninguno contiene marcos de lectura abiertos que muestren homología con las secuencias de codificación de las enzimas conocidas en la biosíntesis de los flavonoides. Así, la evolución inicial de la ruta de los flavonoides probablemente se desarrolló después de la colonización del suelo. El grupo parafilético (briofitas), representa las primeras plantas que colonizaron la tierra. Corresponde también a las plantas que produjeron los primeros flavonoides, estando entre los tipos producidos por estas plantas, las charconas, los flavonoles y las flaconas, que son derivadas de las primeras tres enzimas de la ruta de los flavonoides (Lin y Weng, 2008).

Dos hipótesis han sido planteadas en relación a las funciones que pudieron dar origen a la biosíntesis de flavonoides por las primeras plantas que colonizaron la tierra. La primera hipótesis sugiere que los flavonoides se originaron como pantalla efectiva contra la radiación UV cuando las plantas iniciaron la colonización de la tierra (Shirley, 1996).

Entre los hechos que dan soporte a esta hipótesis se encuentran las observaciones de que aún los flavonoides simples, como chalconas, auronas y flavanonas, absorben fuertemente longitudes de radiación UV, y que mutantes que no presentan estos compuestos son extremamente susceptibles a daños por la radiación UV. En contraste, Stafford planteó en 1991 la hipótesis de que la primera función de los flavonoides fue regular las hormonas de las plantas. Según Stafford, esta hipótesis es más probable, en vista que la de la protección contra radiación UV ya que presumiblemente las primeras enzimas de los flavonoides no eran tan eficientes como las enzimas actuales, y de esta forma los flavonoides no podían acumularse en cantidades suficientes para proteger a las plantas.

Además de esto, ha sido demostrado que los flavonoides contribuyen a la regulación del transporte de auxina en las angiospermas (Peer et al., 2004).

La última etapa evolutiva de los flavonoides corresponde a las gimnospermas y angiospermas. En estos dos grupos fue donde hicieron su aparición las antocianinas. La adición clave a la ruta de los flavonoides involucrada en esta etapa fue la enzima 33

antocianidina sintasa (ANS), posiblemente como resultado de la duplicación de genes de la familia de las oxigenasas de pendientes del 2-oxo-glutarato. Esta enzima cataliza la producción de las antocianinas coloreadas a partir de las leucoantocianidinas incoloras.

No esta claro, sin embargo, si fue la producción de color per se la que constituyó la función original de las antocianinas. A pesar de la función señalizadota del color, especialmente para los polinizadores y los agentes dispersores de frutas, es claramente la función primaria de las antocianinas en las angiospermas, dicha señalización es rara sino ausente en las gimnospermas de las cuales se desarrollaron las angiospermas (Lin y Weng, 2008). Se ha estimado que existe más de un millón de polifenoles naturales, en frutas y vegetales, ya que los polifenoles se encuentran generalmente como glucósidos, existiendo una gran variedad de especies de azúcares y las formas de enlace con la aglicona (Herrmann, 1976; Wollenweber et al., 1981).

34

PARTE III III.1

RESULTADOS

III.1.1 Colecta de plantas.

La Tabla 2 presenta los códigos y los sitios de colecta de los especimenes de las plantas de estudio, en los departamentos de Escuintla, El Progreso, Zacapa, Quetzaltenango, Retalhuleu, Izabal y Alta Verapaz.

Tabla 2. Códigos, localización geográfica y datos de rendimiento de aceite esencial de las muestras de las plantas de estudio colectadas.

LH.PACA.01.01 LH.PACA.02.01

Nombre científico L. hispida L. L. hispida L.

LH.KM93.01.01

L. hispida L.

30-jun-08

LH.KM93.01.02A

L. hispida L.

30-jun-08

LH.KM93.01.02B

L. hispida L.

30-jun-08

LH.KM93.01.02C

L. hispida L.

30-jun-08

LH.KM93.01.POOL

L. hispida L.

30-jun-08

LH.SNJO.01.01A

L. hispida L.

30-jun-08

LH.SNJO.01.01B

L. hispida L.

30-jun-08

LH.SNJO.01.01C

L. hispida L.

30-jun-08

LH.SNJO.01.01D

L. hispida L.

30-jun-08

LH.SNJO.01.03

L. hispida L.

30-jun-08

LH.CHOR.02.01A

L. hispida L.

11-ene-09

LH.CHOR.02.01B

L. hispida L.

11-ene-09

LH.CHOR.02.01C

L. hispida L.

11-ene-09

LH.LGRA.02.01

L. hispida L.

11-ene-09

LH.KM93.02.01

L. hispida L.

11-ene-09

LH.SNJO.02.01A

L. hispida L.

11-ene-09

LH.SNJO.02.01B

L. hispida L.

11-ene-09

LH.KM93.03.01

L. hispida L.

10-may-09

LH.SNJO.03.01

L. hispida L.

10-may-09

LH.CHIC.03.01

L. hispida L.

10-may-09

LC.ZUNI.01.01A

L. camara L.

06-jul-08

Código

Fecha

Lugar

01-may-08 08-nov-08

Volcán Pacaya, Escuintla Volcán Pacaya, Escuintla San Cristóbal Acasuaguastlán, El Progreso San Cristóbal Acasuaguastlán, El Progreso San Cristóbal Acasuaguastlán, El Progreso San Cristóbal Acasuaguastlán, El Progreso San Cristóbal Acasuaguastlán, El Progreso Aldea San José, Teculután, Zacapa Aldea San José, Teculután, Zacapa Aldea San José, Teculután, Zacapa Aldea San José, Teculután, Zacapa San Cristóbal Acasuaguastlán, El Progreso Aldea Chorjalé, Cabricán, Quetzaltenango Aldea Chorjalé, Cabricán, Quetzaltenango Aldea Chorjalé, Cabricán, Quetzaltenango Aldea La Grandeza, Cabricán, Quetzaltenango San Cristóbal Acasuaguastlán, El Progreso Aldea San José, Teculután, Zacapa Aldea San José, Teculután, Zacapa San Cristóbal Acasuaguastlán, El Progreso Aldea San José, Teculután, Zacapa Aldea El Chico, Usumatlán, Zacapa Carretera a Zunil,

Altitud (msnm) 2.290 2.290

Masa (g) 9.8

Rend (%) 0.09

296

30

0.60

296

27.3

0.65

296

30

0.46

278

0.57 248

29.2

0.33

249

30.2

0.35

250

31.4

0.24

251

30

0.29 0.33

2.472

0.11

2.472

0.23

2.472

0.17

2.462 278

0.72

248

0.30

249

0.35

278 232 999 2.085

25

0.09

35

LC.ZUNI.01.01B

L. camara L.

06-jul-08

LC.ZUNI.01.02

L. camara L.

06-jul-08

LC.ZUNI.01.03

L. camara L.

06-jul-08

LC.ZUNI.01.04

L. camara L.

06-jul-08

LC.SNFE.01.01

L. camara L.

06-jul-08

LC.ZUNI.02.01

L. camara L.

11-ene-09

LC.ZUNI.02.02A

L. camara L.

11-ene-09

LC.ZUNI.02.02B

L. camara L.

11-ene-09

LC.ZUNI.02.03A

L. camara L.

11-ene-09

LC.ZUNI.02.03B

L. camara L.

11-ene-09

LC.ZUNI.02.03C

L. camara L.

11-ene-09

LC.ZUNI.02.04

L. camara L.

11-ene-09

LC.SNFE.02.01

L. camara L.

11-ene-09

LC.ZUNI.03.01A

L. camara L.

26-abr-09

LC.ZUNI.03.02

L. camara L.

26-abr-09

LC.ZUNI.03.01B

L. camara L.

26-abr-09

LC.ZUNI.03.03A

L. camara L.

26-abr-09

LC.ZUNI.03.03B

L. camara L.

26-abr-09

LC.ZUNI.03.04

L. camara L.

26-abr-09

LT.LAMA.01.01A

L. trifolia L.

31-ago-08

LT.LAMA.01.01B

L. trifolia L.

31-ago-08

LT.LAMA.01.02A

L. trifolia L.

31-ago-08

LT.LAMA.01.02B

L. trifolia L.

31-ago-08

LT.LAMA.01.02C

L. trifolia L.

31-ago-08

LT.LAMA.01.03

L. trifolia L.

31-ago-08

LT.LAMA.02.01A

L. trifolia L.

07-dic-08

LT.LAMA.02.01B

L. trifolia L.

07-dic-08

LT.LAMA.02.01C

L. trifolia L.

07-dic-08

LT.LAMA.02.03A

L. trifolia L.

07-dic-08

LT.LAMA.02.03B

L. trifolia L.

07-dic-08

LT.LAMA.02.03C

L. trifolia L.

07-dic-08

Quetzaltenango Carretera a Zunil, Quetzaltenango Aldea La Calera, Zunil, Quetzaltenango Carretera a Zunil, Quetzaltenango Aldea La Calera, Zunil, Quetzaltenango San Felipe, Retalhuleu Carretera a Zunil, Quetzaltenango Aldea La Calera, Zunil, Quetzaltenango Aldea La Calera, Zunil, Quetzaltenango Carretera a Zunil, Quetzaltenango Carretera a Zunil, Quetzaltenango Carretera a Zunil, Quetzaltenango Aldea La Calera, Zunil, Quetzaltenango San Felipe, Retalhuleu Carretera a Zunil, Quetzaltenango Aldea La Calera, Zunil, Quetzaltenango Carretera a Zunil, Quetzaltenango Carretera a Zunil, Quetzaltenango Carretera a Zunil, Quetzaltenango Aldea La Calera, Zunil, Quetzaltenango Carretera a Aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal Carretera a Aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal

2.086

20

0.09

620

30

0.09

2.085

14.1

0.22

2.010

23.4

0.34

2.010

20

0.11

1.989

25

0.12

1.989

20

0.17

1.989

25

0.46

2.010

20

0.39

2.085

26.3

0.07

2.010

20

0.17

2.085

25

0.13

1.989

19

0.10

1.989

19

0.16

2.010

25

0.13

103

25

0.03

103

25

0.51

103

25

0.09

103

19.5

0.13

103

25

0.01

2.010 1.989 2.010

620

93

0.13

103

25

0.25

103

25

0.32

103

25

0.36

93

28

0.18

93

27

0.27

93

20

0.17

36

LT.LAMA.02.03D

L. trifolia L.

07-dic-08

LT.LAMA.02.03E

L. trifolia L.

07-dic-08

LT.LAMA.02.04

L. trifolia L.

07-dic-08

LT.LAMA.02.05

L. trifolia L.

07-dic-08

LT.LAMA.03.06ª

L. trifolia L.

07-abr-09

LT.LAMA.03.06ª

L. trifolia L.

07-abr-09

LT.LAMA.03.07

L. trifolia L.

02-may-09

Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal Carretera de aldea Santa Inés a aldea Gayuser, Los Amates, Izabal Carretera de aldea Santa Inés a aldea Gayuser Los Amates, Izabal Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal Carretera de terracería de Rubelsanto a Parque Nacional Laguna Lachúa, Alta Verepaz

93

25

0.10

93

30

0.05

100

30

0.03

100

30

0.02

100

105

165

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

III.1.2 Determinación del porcentaje de humedad En la tabla 3 se observan los porcentajes de humedad obtenidos de las muestras en que se determinó humedad, obteniéndose como resultados porcentajes desde 13.08 % hasta 14.80 %.

Tabla 3. Porcentaje de humedad No. muestra Muestra Peso (g) Porcentaje de Humedad LC.ZUNI.01.01 0.5 14.55 1 LC.ZUNI.01.04 0.5 13.80 2 LT.LAMA.01.01 0.5 14.75 3 LH.SNFE.01.01 0.5 14.01 4 LT.LAMA.01.03 0.5 13.08 5 LH.KM93.01.01 0.5 14.80 6 Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007. Balanza de humedad utilizada: HB35 Halogen.

III.1.3 Aceites esenciales La tabla 4 presenta los resultados de rendimiento de extracción de los aceites esenciales de las plantas de estudio, mientras que las tablas 5, 6 y 7 presentan los resultados de los análisis cromatográficos de los aceites.

III.1.3.1 Rendimiento La Tabla 4 presenta los resultados del rendimiento de extracción por hidrodestilación del aceite esencial de las plantas de estudio, utilizando un aparato tipo Clevenger. La planta que presentó el rendimiento más elevado fue L. hispida con 0.38 %, mientras que L. camara y L. trifolia presentaron un rendimiento bajo (0.18 y 0.17 %, respectivamente). No fue posible obtener los rendimientos por la técnica de destilación-extracción, ya que los bajos contenidos de aceite esencial de las especies de estudio no permiten la evaluación de los mismos por esta técnica.

37

Tabla 4. Rendimiento de Extracción de aceite esencial por especie.

Especie n % de rendimiento Lantana hispida 16 0.38 Lantana camara 17 0.18 Lantana trifolia 17 0.17 n = número de especimenes extraídos.

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

III.1.3.2 Composición del aceite esencial de Lantana hispida El aceite esencial de L. hispida presentó como componentes mayoritarios, sabineno (6.59-13.91 %; no se encontró sabineno en especimenes colectados en San José, Zacapa, y Cabricán, Quetzaltenango), limoneno (2.9-24.34 %), -cariofileno (16.44-30.61 %) y germacreno D (9.05-18.5 %) (Tabla 5).

Tabla 5. Resultados del análisis de muestras de Lantana hispida por Cromatografía de gases, expresados en porcentajes de área. En los códigos de muestras se han omitido las siglas LH, correspondientes a las iniciales de la especie.

IK teórico ND 930 939 975 979 ND 991 1003 1017 1025 1029 1031 1037 1060 1097 1177 ND 1189 1290 1375 1388 1391 1404 1419 1455 1460 1485 1498 ND ND 1506 1514 1523

Sustancia NI -thujeno -pineno Sabineno -pineno NI -mirceno -felandreno -terpineno p-cimeno Limoneno 1,8-cineol Ocimeno -terpineno -linalol 1-terpinen-4-ol NI -terpineol Timol -copaeno -bourboneno -elemeno Metileugenol -cariofileno -cariofileno Aloaromadendreno germacreno D -selineno NI NI (E,E)--farneseno -cadineno -cadineno

KM93.01.01 KM93.01.02 KM93.01.04 SNJO.01.01D CHOR.02.01B 0.81 0.74 0.91 16.43 2.4 2.62 4.68 4.42 2.54 13.91 13.17 6.59 1.02 11.51 0.7 1.55 1.51 4.35 4.73 4.16 2.49 3.55 3.05 2.74 1.72 10.97 10.42 2.9 24.34 7.35 6.43 4.97 0.74 1.07 1.48 1.06 1.17 1.06 1.48 0.57 0.62 1.48 1.15 3.77 5.85 1.57 4.71 0.67 0.64 1.07 2.88 0.65 2.51 16.44 21.75 30.61 23 15.62 1.32 1.58 1.76 1.05 9.05 10.62 18.5 17.66 14.33 3.42 3.78 5.15 1.08 0.58 0.68 0.88 0.63 10.92 3.81

38

1561 1578 ND 1583 1640 1654 ND ND ND ND ND 1658 1672 1686 ND

Germacreno B Espatulenol NI óxido de cariofileno Epi--cadinol -Cadinol NI NI NI NI NI -oxido de bisabolol B Epi--Bisabolol -bisabolol NI SUMA

1.28 3.32

1.33 2.61

3.41 0.57

2.25

2.86 0.83 3.53 1.27 5.99 1.54 0.37 1.27 0.66

3.76 5.76

7.96 3.45

3.23 4.87 3.75

3.35

99.42

100.0

100.0

0.34 100.0

99.98

NI = No identificado.

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

III.1.3.3 Composición del aceite esencial de Lantana camara El aceite esencial de L. camara presentó como componentes mayoritarios, cariofileno (4.45-32.97 %) y germacreno D (29.5-50.36 %), presentes en todas las muestras, las cuales presentaron más del 70 % de compuestos correspondientes a sesquiterpenoides (Tabla 6).

Tabla 6. Resultados del análisis de muestras de Lantana camara por Cromatografía de gases, expresados en porcentajes de área. En los códigos de muestras se han omitido las siglas LC, correspondientes a las iniciales de la especie.

IK teórico 930 939 975 979 1025 1029 1031 1037 1060 1097 1238 1267 1290 ND 1338 1351 1369 1375 1388 1391 1419 1432

Sustancia -thujeno -pineno Sabineno -pineno p-cimeno Limoneno 1,8-cineol Ocimeno -terpineno -linalol Neral Geranial Timol NI -elemeno -Cubeneno NI -copaeno -bourboneno -elemeno -cariofileno -copaeno

ZUNI.01.01 ZUNI.02.02 1.59

ZUNI.03.03 ZUNI.02.04 2.55 1.09 2.09

2.61

5.78

16.26 0.87

ZUNI.02.01

LACH.04.01 4.71

0.32

7.67

3.11 2.51

2.99

0.93

7.77

1.32 2.02

7.34

0.59 0.53 0.66 3.62

10.12

0.46

5.83 32.97

3.46 29.83

0.62 2.13 21.74

0.45 0.58 1.72 22.13

0.96

1.95 3.09 4.45

28.73

39

1455 1460 1480 1485 1493 1498 ND ND 1506 1514 1523 1550 1561 1563 1568 1578 1583 ND ND ND 1604 1608 ND 1640 ND 1646 1654 1658 1672 1686 1691

-cariofileno Aloaromadendreno -muuroleno germacreno D -selineno -selineno NI NI (E,E)--farneseno -cadineno -cadineno Elemol Germacreno B E-nerolidol NI Espatulenol óxido de cariofileno NI NI NI NI Epóxido de humuleno II NI Epi--cadinol NI -muurolol -cadinol -oxido de bisabolol B Epi--Bisabolol -bisabolol NI SUMA

1.88 1.37 0.57 29.54 10.85

3.24

1.57 1.17 29.6 15.28

1.37

2.37 1.06 0.58 29.5

1.55 2.00

5.56 1.30

39.26

18.47

9.97 4.56 0.54 1.20 0.57

16.91

5.69

2.12 0.65

0.75

2.15 50.36 2.12 1.92

2.34 12.89

0.99 4.18 0.93 1.02

1.7

1.04 2.52

4.44 1.08 2.68 2.72 1.14 1.30

0.76 0.79

2.71

1.81 1.25

99.99

98.91

100.0

1.06 99.98

100.0

98.17

NI: No identificado. Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

III.1.3.4 Composición del aceite esencial de Lantana trifolia El aceite esencial de L. trifolia presentó como componentes mayoritarios, α-copaeno (3.67-12.48 %, presente en tres de las cuatro muestras analizadas), metileugenol (21.0640.01 %, presente en todas las muestras analizadas), y muuroleno (17.8-22.09 %) por lo que su composición es diferente del aceite de las otras dos plantas estudiadas (tabla 7).

Tabla 7. Resultados del análisis de muestras de Lantana trifolia por Cromatografía de gases, expresados en porcentajes de área. En los códigos de muestras se han omitido las siglas LT, correspondientes a las iniciales de la especie.

IK teórico 975 1025 1029 1031 ND 1097 ND ND 1238

Sustancia Sabineno p-cimeno Limoneno 1,8-cineol NI -linalol NI NI Neral

LAMA.01.01

LAMA.02.03 LAMA.01.03 LACH.04.02 2.16 0.69 3.51 1.26 0.68 2.05 1.57 2.83 0.84 0.88 0.98 4.09

40

1257 1290 1338 1351 1369 1375 1391 1404 1432 1435 1455 1460 1480 1485 ND 1493 1498 ND ND ND 1506 1507 1514 1550 1561 1568 1578 1583 1608 1632 1654 ND ND

Acetato de Linalilo Timol -elemeno -Cubeneno NI -copaeno -elemeno Metileugenol -copaeno trans-bergamoteno -cariofileno Aloaromadendreno -muuroleno germacreno D NI -selineno -selineno NI NI NI (E,E)--farneseno Z--bisaboleno -cadineno Elemol Germacreno B NI Espatulenol óxido de cariofileno Epóxido de humuleno II -eudesmol -Cadinol NI NI SUMA

5.36

0.73 0.99 1.27

10.39 3.55 40.01

12.48 3.48 3.3.32

7.3

3.45 1.82 1.72 17.8 0.73

22.09

2.41

1.4 2.68

3.8

1.1 4.15

1.29 0.91 3.99 1.44 21.63 5.19 4.7 7.48 1.21

2.6

1.38

99.97

98.93

3.67 1.69 21.06 8.35 1.39 18.79

7.31 0.68 3.78 1.89 4.77 0.33 1.91 1.9

2.84 5.06

3.51

0.69 2.2 1.33

6.89 1.72 2.65 98.93

1.56 1.54

2.01 2.79 3.03 9.01 2.58 6.09 1.32 1.55 1.81 1.38

96.64

NI: No identificado Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

III.1.3.5 Evaluación de la actividad biológica, antioxidante e índice de refracción de los aceites esenciales de las plantas de estudio Como puede apreciarse en la Tabla 8, ninguno de los aceites esenciales de las plantas estudiadas presentó actividad antioxidante por el método del DPPH, ni contra los microorganismos S. aureus, S. typhi y E. coli, lo cual puede deberse a que los aceites no presentan compuestos fenólicos o con funciones alcohólicas en porcentajes elevados.

Tabla 8. Actividad biológica, antioxidante e índice de refracción de los aceites esenciales Especie S. aureus S. typhi E. coli Antioxidante IR Lantana camara Negativo Negativo negativo negativo ND Lantana hispida Negativo Negativo negativo negativo 1.4960 Lantana trifolia Negativo Negativo negativo ND ND NM: no determinado. Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

41

III.1.3.6 Actividad biocida y antioxidante de extractos con solvente de las plantas de estudio.

La Tabla 9 presenta los resultados de actividad biocida de los extractos metanólicos de las tres plantas del género Lantana estudiadas. Ningúno de los extractos presentó actividad contra los microrganismos evaluados.

Tabla 9. Actividad biocida de extractos etanólicos de las especies de Lantana a una concentración de 1 mg de extracto/mL Procedencia L. hispida L. cámara L. trifolia

Parte

Escherichia coli Salmonella typhi Staphylococcus aureus ATCC 25922 ATCC 14028 ATCC25923

Hoja Rizoma Hoja

Negativo Negativo Negativo

negativo negativo negativo

negativo negativo negativo

Fuente: FODECYT 011-2007 La Tabla 10 presenta los resultados de actividad antioxidante de los extractos de las tres plantas del género Lantana estudiadas, determinada por el método de la extinción del radical libre DPPH. Para las plantas L. hispida y L. trifolia se evaluaron los extractos etanólicos obtenidos directamente del material vegetal y del material vegetal previamente extraído con diclorometano. En el caso de L. camara, se evaluó la actividad antioxidante del extracto metanólico correspondiente. Los extractos diclorometánicos de las tres plantas de estudio, no presentaron actividad antioxidante.

Tabla 10. Actividad antioxidante de extractos de las especies de Lantana estudiadas y del antioxidante artificial BHT, expresada como IC50 (concentración de extracto que inhibe la concentración del DPPH al 50 %).

No. Muestra IC50 (g/mL) 1 L. hispida CH2Cl2/etanol 95% 50.24 2 L. trifolia CH2Cl2/etanol 95% 28.29 3 L. hispida etanol 95% 74.34 4 L. trifolia etanol 95% 29.15 5 L. hispida CH2Cl2 ND 6 L. trifolia CH2Cl2 ND 7 L. camara CH2Cl2 ND 8 L. camara metanólico 29.32 9 BHT etanol 95% 34.22 ND: No detectado.

Fuente: FODECYT 011-2007

42

III.1.4 Tamizaje fitoquímico En las tablas 11 a 15 se presentan los resultados obtenidos mediante pruebas macro y semimicro y cromatografía en capa fina (CCF) de los metabolitos evaluados, habiéndose detectado la presencia de alcaloides, flavonoides y saponinas en CCF. III.1.4.1 Alcaloides Tabla 11. Presencia de alcaloides en las plantas Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana Trifolia L. No. Muestra Reactivo Reactivo Reactivo Muestra Mayer’s Dragendorff Wagner LC.ZUNI.01.01 + Marrón 1 LC.ZUNI.01.04 2 LT.LAMA.01.01 + Marrón 3 LH.SNFE.01.01 + Marrón 4 LT.LAMA.01.03 + (naranja) + Marrón 5 LH.KM93.01.01 + (naranja) + Marrón 6 Reactivo Mayer’s cambio de color blanco a crema (+) Reactivo Dragendorff cambio de color rojo a naranja (+) Reactivo Wagner cambio de color marrón (+).

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

Tabla 12. Detección de Alcaloides por CCF No. Mx Muestra No. Bandas 2 1 LC.ZUNI.01.01

Rf 0.50 0.68 2 0.38 2 LC.ZUNI.01.04 0.55 2 0.33 3 LT.LAMA.01.01 0.38 3 0.23 4 0.30 LH.SNFE.01.01 0.37 3 0.23 5 0.32 LT.LAMA.01.03 0.42 2 0.28 6 LH.KM93.01.01 0.42 1 0.28 Estándar Papaverina 1 0.08 Atropina 1 0.22 Reserpina Fase móvil: tolueno, acetato de etilo, dietilamina (70:20:10).

Revelador utilizado: Reactivo de Dragendorff.

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

Color de la banda Naranja, naranja Naranja, naranja Naranja, naranja Naranja, naranja

naranja,

Naranja, naranja

naranja,

Naranja, naranja Naranja Naranja Naranja

43

III.1.4.2 Flavonoides y antocianinas Tabla 13. Detección de flavonoides y antocianinas por CCF No. Mx Muestra No. Rf Bandas LC.ZUNI.01.01 2 0.50, 0.68 1 LC.ZUNI.01.04 2 0.38, 0.55 2 LT.LAMA.01.01 2 0.33, 0.38 3 3 0.23, 0.30, 0.37 4 LH.SNFE.01.01 5

LT.LAMA.01.03 LH.KM93.01.01 Estándar de Flavonoides

6

3

0.23, 0.32, 0.42

2 3

0.28, 0.42 0.09, 0.22, 0.28

Color de la banda Naranja, naranja Naranja, naranja Naranja, naranja Naranja, naranja, naranja Naranja, naranja, naranja Naranja, naranja Naranja

Fase móvil: n-butanol-ácido acético-agua (40:10:50) Reactivo Revelador: Productos naturales (NP/PEG).

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

III.1.4.3 Saponinas Tabla 14. Detección de saponinas mediante la prueba de espuma No. Mx Muestra Reactivo Observación (KOH) LC.ZUNI.01.01 + Se observó 1 formación de espuma. Si LC.ZUNI.01.04 + 2 una capa de espuma mayor LT.LAMA.01.01 + 3 de 3 cm persiste en la LH.SNFE.01.01 + 4 superficie líquida pués de 30 LT.LAMA.01.03 + 5 minutos se presume la LH.KM93.01.01 + 6 presencia de saponinas. +++ Estándar de saponinas + poca formación de espuma +++ abundante formación de espuma Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

Tabla 15. Detección de Saponinas por CCF No. Muestra No. Bandas

Rf

LC.ZUNI.01.01 LC.ZUNI.01.04 LT.LAMA.01.01 LH.SNFE.01.01 LT.LAMA.01.03 LH.KM93.01.01 Estándar de Saponinas

0.97 0.94 0.94 0.96 0.96 0.96 0.69

1 2 3 4 5 6

1 1 1 1 1 1 1

Color de la banda Violeta Violeta Violeta Violeta Amarillenta Amarillenta Violeta

Fase móvil: n-butanol-ácido acético-agua (50:10:40) Revelador: vainillina-ácido sulfúrico.

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

44

III.1.4.4 Antraquinonas, cumarinas, principios amargos y taninos: Las tablas 16, 17, 18, 19 y 20 presentan los resultados de tamizaje fotoquímico correspondiente a los metabolitos secundarios antraquinonas, cumarinas, principios amargos y taninos. No fue detectada la presencia de compuestos correspondientes a estas familias en ninguna de las seis muestras de las plantas de estudio.

Tabla 16. Presencia de Antraquinonas No. Muestra Bornträger Bornträger Muestra modificado LC.ZUNI.01.01 1 LC.ZUNI.01.04 2 LT.LAMA.01.01 3 LH.SNFE.01.01 4 LT.LAMA.01.03 5 LH.KM93.01.01 6 Prueba de Bornträger cambios de color en la fase alcalina (color rojo, rosado: +).

Prueba de Bornträger modificado cambios de color en fase alcalina (color rojo, rosado: +).

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

Tabla 17. Presencia de Cumarinas No. Muestra Reactivo Observación Muestra (KOH) LC.ZUNI.01.01 No se observó 1 fluorescencia LC.ZUNI.01.04 2 azul o verde, 3 LT.LAMA.01.01 bajo luz UV de 4 LH.SNFE.01.01 365 nm 5 LT.LAMA.01.03 6 LH.KM93.01.01 Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

Tabla 18. Cromatografía en capa fina Cumarinas Muestra No. De Rf Color de la bandas banda LC.ZUNI.01.01 0 0 1 LC.ZUNI.01.04 0 0 2 LT.LAMA.01.01 0 0 3 LH.SNFE.01.01 0 0 4 LT.LAMA.01.03 0 0 5 LH.KM93.01.01 0 0 6 1 0.07 Verde Ácido p-cumarico 1 0.07 Verde Umbelliferona 1 0.34 Verde Cumarinas Fase móvil: tolueno-acetato de etilo (93:7) Revelador: solución etanólica de hidróxido de potasio al 5%.

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

No. Muestra

45

Tabla 19. Presencia de Principios Amargos en Cromatografía en Capa Fina No. Muestra No. de Rf Color de la Muestra bandas banda LC.ZUNI.01.01 0 0 1 LC.ZUNI.01.04 0 0 2 LT.LAMA.01.01 0 0 3 LH.SNFE.01.01 0 0 4 LT.LAMA.01.03 0 0 5 LH.KM93.01.01 0 0 6 1 0.17 Amarillenta Neuroloena lobata Fase móvil: acetato de etilo-metanol-agua (97:15:8) Revelador: vainillina-ácido sulfúrico. Las seis muestras dieron resultados negativos.

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

Tabla 20. Presencia de Taninos No. Muestra Gelatina Gelatina- Cloruro férrico Muestra al 1% sal al 10% LC.ZUNI.01.01 1 LC.ZUNI.01.04 2 LT.LAMA.01.01 3 LH.SNFE.01.01 4 LT.LAMA.01.03 5 LH.KM93.01.01 6 Observación de formación de precipitados y/o cambio de coloración es positivo (+). Las seis muestras dieron resultados negativos (-).

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

46

III.1.5 Extracción de metabolitos secundarios por maceración con diclorometano y metanol En las tablas 21 y 22 se presentan los resultados de rendimento de los extractos metabólicos y diclorometánicos, respectivamente, observándose mayores rendimientos en los extractos metanólicos que en los extractos diclorometánicos para las tres plantas. Esto puede estar relacionado a un alto contenido de compuestos fenólicos como los flavonoides y bajo contenido de compuestos poco polares como los presentes en los aceites esenciales.

Tabla 21. Extractos metanólicos Material Extracto Rendimiento Muestra Vegetal (g) (g) % Propiedades Organolépticas Consistencia muy dura, color pardo a negro, olor muy débil e LT.LACH.04.01 50.03 21.5566 43.09 indescriptible Consistencia muy dura, color pardo a negro, olor muy débil e LC.GUA.04.01 50.05 6.2761 12.54 indescriptible Consistencia muy dura, color pardo a negro, olor muy débil e LH.CHIC.03.01 51.86 9.9636 19.21 indescriptible Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

Tabla 22. Extractos diclorometánicos Material Extracto Rendimiento Especie Vegetal (g) (g) % Propiedades Organolépticas Consistencia suave, color pardo LT.LACH.04.01 50.03 1.5987 3.20 a negro, olor ligeramente dulce Consistencia dura, color pardo a LC.GUA.04.01 50.05 3.3591 6.71 negro y olor muy dulce Consistencia suave, color pardo a negro, olor muy débil e LH.CHIC.03.01 51.86 3.1305 6.04 indescriptible Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

47

III.2

Discusión de Resultados

III.2.1 Rendimiento de extracción de aceites esenciales El aceite esencial de una planta es una fracción líquida volátil, para la cual existen diversas técnicas de extracción. En la presente investigación se utilizó la técnica de hidrodestilación con aparato tipo Clevenger, la cual es una técnica reproducible y que presenta alto rendimiento de extracción.

En el presente trabajo, fueron utilizados entre 10.0 y 30.0 g de material vegetal seco para realizar la extracción del aceite esencial por hidrodestilación. En los casos en que se usaron menos de 20.0 g para la extracción, se debió a que la planta era escasa en algunos sitios de muestreo. Los sitios de muestreo se presentan en la Tabla 1 en Resultados, donde se presentan los códigos de las muestras, el lugar de colecta, la altitud y el rendimiento de extracción. En la revisión de literatura, no se encontró información sobre el rendimiento de aceite esencial en este género; pero por estudios previos se tiene conocimiento que distintos géneros de la Familia Verbenaceae tienen buenos rendimientos de aceites esenciales (Pérez, 2008).

Casi todas las muestras y submuestras presentaron porcentajes de rendimiento bajos por debajo del 0.5 %, el cual se sugiere como aceptable para la producción de aceites esenciales (Aragão et al., 1981; Pérez, 2008); la excepción fueron las muestras: LH.KM93.01.02 A y B, y LT.LAMA.01.03 C que presentaron porcentajes de rendimientos de aceites esenciales superiores a 0.5%. También se puede observar en la Tabla 4 que el rendimiento promedio de extracción del aceite esencial de L. hispida fue el más alto (0.38 %), mientras que para L. camara y L. trifolia, fue de 0.18 y 0.17 %, respectivamente. Estos últimos dos rendimientos son bajos, pero considerando que las tres especies estudiadas, por lo que en vista de los resutados de composición obtenidos, en que L. hispida presenta alto porcentaje de metileugenol, esta planta presentaría el mayor potencial para la extracción del aceite esencial.

Por otra parte, no se observaron diferencias en las colectas realizadas en meses diferentes, por ejemplo en el caso de L. hispida, que fue colectada en San Cristóbal Acasaguastlán, El Progreso y en San José, Zacapa, en los meses de junio de 2008 y enero de 2009, los rendimientos fueron similares en ambos meses. En el caso de L. hispida, si se observaron diferencias en el rendimiento de extracción entre los dos municipios mencionados, con mayores rendimientos en las muestras colectadas en San Cristóbal Acasaguastlán (0.46-0.72 %) que en las colectadas en San José (0.24-0.35 %), por lo que en el caso de esta especie si influye la situación geográfica. En el caso de L. camara y L. trifolia, no se observaron diferencias marcadas en los rendimientos entre diferentes sitios de colecta ni entre diferentes meses.

III.2.2 Composición de los aceites esenciales de las plantas de estudio: Las tablas 5, 6 y 7 presentan los resultados de los análisis cromatográficos de los aceites esenciales de L. hispida, L. camara y L. trifolia, obtenidos por hidrodestilación con aparato tipo Clevenger. El aceite esencial de L. hispida presentó principalmente sabineno, 48

-cariofileno y germacreno D, todos en porcentajes promedio superiores a 10 % (tabla 5), siendo el primero de ellos un monoterpeno y los segundos, sesquiterpenos, que resultaron ser los compuestos dominantes en la composición del aceite esencial. No se observaron diferencias marcadas en la composición de los aceites esencial de L. hispida de diferentes localidades, con excepción del aceite esencial de San José, Zacapa, que presentó mayor diversidad (29 compuestos), entre ellos 9 compuestos menores no identificados. El cariofileno y el germacreno D son compuestos que pueden ser utilizados como base para la síntesis de otros compuestos que podrían presentar actividad biológica, por lo que la producción de aceite esencial de esta planta podría ser orientada para la obtención de estos compuestos como materia prima. El aceite esencial de L. hispida no presentó actividad biológica contra los microorganismos investigados. Al ser L. hispida la planta que presentó mayor rendimiento de aceite esencial (0.46-0.72 %), se considera que de las plantas estudiadas es la que presentaría mayor potencial económico para producción del aceite esencial.

El aceite esencial de L. camara presentó -cariofileno (4.45-32.97 %) y germacreno D (29.5-50.36 %) como componentes mayoritarios, presentando los aceites de esta planta más del 70 % correspondiente a compuestos sesquiterpenoides (Tabla 6). En vista del bajo rendimiento de extracción (0.18 %), la falta de actividad biológica del aceite y la presencia de los mismos compuestos mayoritarios que el aceite de L. hispida, el aceite esencial de L. camara presenta menor potencial económico que el de L. hispida. No se observaron diferencias marcadas en la composición del aceite esencial correspondiente a diferentes localidades de colecta.

El aceite esencial de L. trifolia presentó -copaeno (3.67-12.48 %), metileugenol (21.06-40.01 %), y muuroleno (17.8-22.09 %), como principales componentes (tabla 7).

Estos compuestos no presentan porcentajes elevados en las otras dos especies estudiadas, por lo que sería un factor de diferenciación para la producción del aceite esencial. El metileugenol puede ser un precursor en la síntesis de compuestos con actividad biológica., por lo que la producción del aceite esencial de L. trifolia, a pesar del bajo rendimiento de extracción (0.17 %) podría orientarse a la obtención de este compuesto. No se observaron diferencias marcadas en la composición del aceite esencial en las dos localidades ni en meses diferentes.

III.2.3 Tamizaje fitoquímico y extractos diclorometánicos y metanólicos El tamizaje fitoquímico se realizó en seis muestras; dos de cada especie de la familia Lantana: L. camara, L. hispida y L. trifolia provenientes de distintos lugares. El tamizaje fitoquímico se realizó con el fin de determinar cualitativamente los siete grupos principales de constituyentes químicos presentes en planta, ya que en Guatemala no se le ha realizado ningún estudio previo; tales como alcaloides, taninos, flavonoides (fenoles), principios amargos, antraquinonas, cumarinas y saponinas. Se realizaron extracciones con metanol a partir de material vegetal seco, tanto con maceración como con ultrasonido, no habiéndose observado diferencias en los grupos de metabolitos secundarios extraidos con los dos métodos, analizados por pruebas colorimétricas (ensayo macro) cualitativas y un análisis por cromatografía en capa fina.

49

Se puede observar en la Tabla 3, que el porcentaje de humedad en todos los casos fue superior al 10 %, Esto no es relevante ya que la finalidad de reducir el porcentaje de humedad del material vegetal al 10 % es de poder almacenarlo sin que pierda su integridad por un período de dos años aproximadamente, y esa no fue la finalidad de este estudio.

Un grupo de metabolitos secundarios de gran importancia es el conformado por los alcaloides. Esto se debe a que presentan actividad contra una gran cantidad de herbívoros provenientes de diferentes familias. Los resultados de las pruebas realizadas a las seis muestras se presentan en la Tabla 11; se puede observar que se realizaron tres pruebas colorimétricas (ensayo macro) para indicar la presencia de alcaloides. Para que se pueda tomar como significativa la presencia de alcaloides, tienen que ser positivas por lo menos dos de las tres pruebas realizadas, de lo contrario no son significativas. Las muestras No. 5 (L. trifolia) y 6 (L. hispida), (LT.LAMA.01.03 y LH.KM93.01.01 respectivamente) dieron positivas en las pruebas con el reactivo de Dragendorff y Wagner (Trease y Evans, 1991). La desventaja de este tipo de pruebas es que en muchas ocasiones se pueden obtener resultados ambiguos, es decir, falsos positivos; es por eso que se realizó la cromatografía en capa fina, solamente para saber de una forma muy general si hay presencia o no de alcaloides. Se puede observar en la Tabla 12, que en la cromatografía de capa fina, las seis muestras presentaron cualquier tipo de alcaloide. Se utilizaron tres estándares de alcaloides específicos (Papaverina, Atropina y Reserpina), estos se utilizaron con el fin de tener una referencia de comparación en el color de las bandas siempre dependiendo del reactivo revelador (bandas naranjas o cafés), y también a su vez se pudo realizar una comparación entre los factores de retención (Rf) teóricos versus los obtenidos experimentalmente de las seis muestras. Con la realización de este experimento se determinó que en la muestra No. 6, de L. hispida, LH.KM93.01.01, hay presencia del alcaloide papaverina ya que el Rf teórico es igual a uno de los obtenidos experimentalmente en esa muestra; lo cual se puede decir de una forma general que hay presencia de alcaloides.

Los flavonoides y antocianinas son de suma importancia ya que poseen la propiedad de actuar como agentes antioxidantes, aunque frecuentemente presentan más actividades (Bruneton, 1993). Se clasifican en isoflavonas, antocianidinas, flavanos, flavonoles, flavonas y flavanonas. Se realizaron las pruebas a nivel macro pero en ninguna de las seis muestras hubo presencia de alguna de ellas; pero en cambio en la cromatografía en capa fina se puede observar en la Tabla 13 que en las seis muestras hay presencia de flavonoides y antocianinas, debido a que se obtuvieron varias bandas de color naranja similar al de los obtenidos en el estándar; específicamente en la muestra No. 6, de L. hispida, LH.KM93.01.01.

Las saponinas son compuestos que presentan propiedades tensoactivas. Estas mismas propiedades tensoactivas no son deseables durante la hidrodestilación de aceites esenciales al hacer uso del aparato tipo Clevenger o cualquier sistema similar debido a que provocan proyecciones del material vegetal. En la Tabla 14, se observa en que las seis muestras hay presencia de saponinas ya que al realizar la prueba macro se observó la formación de una capa de espuma de aproximadamente 3 cm la cual persistió por más de 30 min. Esto se corroboró con la cromatografía en capa fina, ya que según la Tabla 15, se obtuvieron resultados positivos para la presencia de saponinas, ya que al utilizar el 50

revelador de vainillina-ácido sulfúrico se presentaron bandas de color azul, violetas o amarillas. No se detectó presencia de antraquinonas, cumarinas, principios amargos y taninos en ninguna de las seis muestras a las que se realizó el tamizaje fotoquímico (Tablas 16, 17, 18, 19 y 20).

Las Tablas 21 y 22 presentan respectivamente los rendimientos de los extractos metanólicos y diclorometánicos. Se observa un mayor rendimiento en el extracto metanólico que en el diclorometánico para las tres especies estudiadas. En el caso de L. trifolia, el rendimiento del extracto metanólico es superior al 40 %, trece veces mayor que el rendimiento del extracto diclorometánico. La reducida presencia de aceite esencial en las tres especies y presencia de compuestos fenólicos tales como los flavonoides se correlacionan perfectamente con este tipo de resultados.

III.2.4 Actividad biológica, antioxidante e índice de refracción de los aceites esenciales de las plantas de estudio Los ensayos de actividad biológica se realizaron con dos muestras de aceite esencial de Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L. No se encontró que los aceites presenten actividad biológica frente a los microorganismos Escherichia coli, Salmonella typhi y Staphylococcus aureus (Tabla 8). Esto puede deberse a que los aceites esenciales estudiados no presentan grupos funcionales con alta reactividad (grupos hidroxilo o fenólicos), que puedan atacar a los microorganismos utilizados.

Los mismos aceites esenciales, con excepción del aceite esencial de L. trifolia (debido a la escasez con que se obtuvo este aceite, se priorizaron los análisis cromatográficos y de actividad biológica), fueron utilizados para evaluar la actividad antioxidante por el método del DPPH (Tabla 8). Ninguna de las cuatro muestras de aceite esencial evaluadas (dos correspondientes a L. camara y dos a L. hispida), presentaron actividad antioxidante, considerándose, al igual que con los resultados negativos de actividad biológica, que la ausencia de actividad antioxidante, en este caso, secuestro del radical libre DPPH, se debió a que estos aceites no presentaron componentes con grupos reactivos, por ejemplo fenólicos. De igual manera, únicamente fue posible determinar el índice de refracción de L. hispida, que fue de 1.4960.

III.2.5 Actividad biológica y antioxidante de extractos de las plantas de estudio obtenidos con solventes.

En las tablas 9 y 10 se presentan los resultados de la evaluación de la actividad antimicrobiana y actividad antioxidante de extractos de las plantas de estudio, obtenidos por maceración con solvente.

Los ensayos de actividad biológica se realizaron con muestras de extractos etanólicos de hojas Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L. y de rizomas de Lantana camara L. Ninguno de los extractos de las plantas de estudio presentó actividad biológica frente a los microorganismos Escherichia coli, Salmonella typhi y Staphylococcus aureus (Tabla 9). Es posible que el grado de dilución de los extractos etanólicos de la 51

metodología estándar utilizada no sea el adecuado para que la concentración de los metabolitos secundarios encontrados, entre ellos, flavonoides, muestre actividad biológica.

La actividad antioxidante de los extractos de las plantas de estudio fue evaluada utilizando el método del radical libre DPPH (Tabla 10). Extractos etanólicos obtenidos directamente del material vegetal de L. hispida y L. trifolia, y de material de estas plantas previamente extraido por diclorometano fueron utilizados para esta determinación. En el caso de L. camara fueron utilizados extractos metanólicos. Los extractos diclorometánicos de las tres plantas de estudio, no presentaron actividad antioxidante detectable. El extracto etanólico de L. hispida presentó la mayor actividad antioxidante (IC 50 de 74.34 g/mL) superior inclusive a la actividad presentada por BHT (IC 50 de 34.22 g/mL). La menor actividad antioxidante fue observada para el extracto diclorometánico de L. trifolia (IC50 de 28.29 g/mL), mientras que el extracto metanólico de L. camara presentó una actividad antioxidante ligeramente menor a la del BHT (IC 50 de 29.32 g/mL). Las diferencias pueden observarse en la Figura 4, que presenta la gráfia del IC 50 de los extractos analizados. La actividad antioxidante observada en las especies del género Lantana estudiadas, podría ser causada por la presencia de flavonoides encontrada en las mismas, y que podría presentar potencial para su evaluación para la obtención de antioxidantes naturales para su uso en la industria alimenticia.

Figura 4. Actividad antioxidante de extractos de plantas del género Lantana.

Actividad antioxidante de extractos 80 70

[µg/ml]

60 50

IC50

40 30 20 10

5%

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%

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muestra

Fuente: FODECYT 011-2007.

52

PARTE IV. IV.1

CONCLUSIONES

IV.1.1 El aceite esencial de las plantas Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L., presenta una composición química característica de la Familia Verbenaceae, siendo el aceite de L. trifolia el que presenta mayor potencial para su aprovechamiento en procesos agroindustriales al presentar metileugenol entre sus componentes mayoritarios.

IV.1.2 La planta Lantana hispida presentó el mayor rendimiento de extracción (0.38 %) en comparación con Lantana camara (0.18 %) y Lantana trifolia (0.17 %), no habiéndose encontrado que exista relación entre el rendimiento de extracción de los aceites esenciales de las plantas de estudio con la estación del año en que se realiza la colecta.

IV.1.3 No fue posible determinar las diferencias en los rendimientos de extracción de los aceites esenciales por las técnicas de hidrodestilación y extracción-destilación, ya que por el bajo contenido de aceite esencial de las plantas de estudio, la técnica de extraccióndestilación no resultó útil para la extracción de los aceites esenciales para las especies del género Lantana evaluadas.

IV.1.4 Con base en su composición química, los aceites esenciales de las plantas de estudio presenta potencial para su uso como materia prima para la síntesis de moléculas modificadas para la investigación de actividad biológica, por el elevado porcentaje de sesquiterpenos, para la obtención de metileugenol en el caso de L. trifolia, y en la industria cosmética para el caso de las tres plantas de estudio.

IV.1.5 Los aceites esenciales y metabolitos secundarios presentes en los extractos de Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L., no presentaron actividad biológica frente a los microorganismos Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhi ATCC 14028 y Staphylococcus aureus ATCC25923. .

IV.1.6 Los aceites esenciales de Lantana camara L., Lantana hispida HBK no presentaron actividad antioxidante por el método del DPPH. La actividad antioxidante del aceite esencial de Lantana trifolia L. no pudo determinarse por la escasez con que se obtuvo dicho aceite. En el caso de los extractos con solvente de las plantas de estudio, todos presentaron actividad antioxidante similar o mayor a la del antioxidante artificial BHT (IC50 de 34.33 g/mL), destacando la actividad antioxidante (IC50 de 74.34 g/mL) del extracto etanólico de Lantana hispida. Esta actividad antioxidante de lo extractos puede estar relacionada a la presencia de flavonoides encontrada en los mismos extractos.

IV.1.7 El aceite esencial de Lantana hispida proveniente de San Cristóbal Acasaguastlán presenta mejor rendimiento de extracción que el procedente de la Aldea San José, Teculután, Zacapa, por lo que puede considerarse como con mayor potencial para la selección de plantas con el propósito de producción del aceite esencial. Para las otras dos plantas estudiadas, Lantana camara y Lantana trifolia, no se encontraron diferencias en el 53

rendimiento ni en la composición del aceite esencial que le otorguen mayor potencial a las plantas procedentes de las diferentes localidades de colecta.

IV.1.8 Se optimizó el método de extracción y análisis por cromatografía de gases, que permite la determinación rápida y confiable de los componentes de aceites esenciales y metabolitos secundarios de las plantas Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L. IV.1.9 No hubo diferencia en la extracción de los grupos de metabolitos secundarios identificados en las plantas de estudio, al utilizar las técnicas de maceración en etanol y de extracción en etanol por ultrasonido, al obtenerse los mismos metabolitos secundarios.

IV.1.10 No fue posible realizar la clasificación de los aceites esenciales de las plantas de estudio con base en su índice de refracción, debido a que los rendimientos de extracción fueron muy bajos, siendo todos menores a 0.4 %, por lo que no se contó con material suficiente para la determinación de este parámetro.

IV.1.11 Las plantas Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L. presentaron Alcaloides, Flavonoides y Saponinas, que deben investigarse, ya que podrían presentar potencial en las industrias cosmética, de alimentos y como posibles moléculas con actividad biológica.

IV.1.12 Las plantas Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L. no presentaron Cumarinas, Principios Amargos, Antraquinonas y Taninos.

IV.1.13 Los extractos metanólicos de las plantas Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L. presentan un rendimiento de 12.54, 19.21 y 43.09 % respectivamente; los cuales son superiores a los rendimientos de los extractos diclorometánicos para estas mismas plantas; 6.71, 6.04 y 3.20 % respectivamente.

54

IV.2

RECOMENDACIONES

IV.2.1 Realizar experimentos de domesticación de Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L., para evaluar rendimientos y composición de los aceites esenciales en condiciones controladas, para evaluar el potencial de producción.

IV.2.2 Realizar estudios de aislamiento, identificación y cuantificación de alcaloides y flavonoides en las plantas Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L., para determinar las moléculas que puedan ser investigadas por su actividad biológica y antioxidante, para posibles usos en las industrias de alimentos y farmacéutica.

IV.2.3 Realizar ensayos de actividad biocida con los aceites esenciales y extractos de las plantas del género Lantana, frente a los microorganismos: Bacillus subtilis, Pseudomona aeruginosa, Sarcina lutea, Candida albicans y los hongos Aspergillus Níger y A. fumigatus. Así mismo, se recomienda evaluar la actividad biocida frente a Escherichia coli, Salmonella typhi y Staphylococcus aureus modificando el método, para utilizar una mayor concentración de extractos.

55

IV.3

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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IV.4 ANEXOS

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IV.4.1 ANEXO 1 CROMATOGRAMAS Figura 5. Cromatograma del aceite esencial de Lantana camara, muestra 1. Colectada en Zunil, Quetzaltenango el 6 de julio de 2008; obtenido en cromatógrafo de gases con detector de ionización de llama.

-Cariofileno Germacreno-D

-Selineno -Elemeno

Fuente: FODECYT 011-2007.

Figura 6. Cromatograma del aceite esencial de Lantana camara, muestra 2. Colectada en Zunil, Quetzaltenango el 11 de enero de 2009; obtenido en cromatógrafo de gases con detector de ionización de llama.

-Cariofileno

Germacreno-D

-Selineno

-Elemeno

Fuente: FODECYT 011-2007.

64

Figura 7. Cromatograma del aceite esencial de Lantana camara, muestra 3. Colectada en Zunil, Quetzaltenango el 26 de abril de 2009; obtenido en cromatógrafo de gases con detector de ionización de llama.

Germacreno-D

Limoneno -Cariofileno

-Selineno

Fuente: FODECYT 011-2007.

Figura 8. Cromatograma del aceite esencial de Lantana hispida, muestra 1. Colectada en San Cristóbal Acasaguastlán, El Progreso, el 30 de junio de 2008; obtenido en cromatógrafo de gases con detector de ionización de llama.

-Cariofileno Limoneno

1,8-cineol Germacreno-D

Fuente: FODECYT 011-2007.

65

Figura 9. Cromatograma del aceite esencial de Lantana hispida, muestra 2. Colectada en San Cristóbal Acasaguastlán, El Progreso, el 30 de junio de 2008; obtenido en cromatógrafo de gases con detector de ionización de llama.

-Cariofileno

Limoneno

Germacreno-D 1,8-cineol

Fuente: FODECYT 011-2007.

Figura 10. Cromatograma del aceite esencial de Lantana trifolia, muestra 1. Colectada en Los Amates, Izabal, el 31 de agosto de 2008; obtenido en cromatógrafo de gases con detector de ionización de llama.

Metileugenol

-Muuroleno

-Copaeno trans-Bergamoteno Timol

Fuente: FODECYT 011-2007.

66

Figura 11. Cromatograma del aceite esencial de Lantana trifolia, muestra 2. Colectada en Los Amates, Izabal, el 7 de diciembre de 2008; obtenido en cromatógrafo de gases con detector de ionización de llama.

Metileugenol

-Muuroleno -Copaeno

Fuente: FODECYT 011-2007.

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IV.4.2 ANEXO 2. APARIENCIAS DE LOS EXTRACTOS Figura 12. Apariencia del extracto metan贸lico de Lantana camara, colectada en la ciudad de Guatemala, Guatemala el 22/12/09 (extracto seco).

Fuente: FODECYT 011-2007.

Figura 13. Apariencia del extracto metan贸lico de Lantana hispida, colectada en El Chico, Zacapa (extracto seco), el 10/05/09.

Fuente: FODECYT 011-2007.

68

Figura 14. Apariencia del extracto metanรณlico de Lantana trifolia, colectada en Lachuรก, Alta Verapaz (extracto seco), el 29/11/09.

Fuente: FODECYT 011-2007.

Figura 15. Apariencia del extracto diclorometรกnico de Lantana camara, colectada en la ciudad de Guatemala, Guatemala (extracto seco), el 22/12/09.

Fuente: FODECYT 011-2007.

69

Figura 16. Apariencia del extracto diclorometรกnico de Lantana hispida, colectada en El Chico, Zacapa (extracto seco), el 10/05/09.

Fuente: FODECYT 011-2007.

Figura 17. Apariencia del extracto diclorometรกnico de Lantana trifolia, colectada en Lachuรก, Alta Verapaz (extracto seco), el 29/11/09.

Fuente: FODECYT 011-2007.

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IV.4.3 ANEXO 3. Determinación de actividad antioxidante de los extractos de las plantas de estudio.

Figura 18. Fotografía de la determinación de la actividad antioxidante del extracto etanólico del residuo de la extracción con diclorometano de Lantana hispida.

Fuente: FODECYT 011-2007.

Figura 19. Fotografía de la determinación de la actividad antioxidante del extracto diclorometánico de Lantana hispida.

Fuente: FODECYT 011-2007.

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Figura 20. Fotograf铆a de la determinaci贸n de la actividad antioxidante de la soluci贸n etan贸lica de BHT.

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PARTE V V.1 INFORME FINANCIERO

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