informativo técnico
PRODUÇÃO DE SEMENTES DA OSTRA NATIVA crassostrea gasar
EM LABORATÓRIIO
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ESTRUTURAS E PROCESSOS PRODUTIVOS
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Introdução plâncton e, como todas as plantas,
O
processo de produção de sementes de ostra inclui a manutenção e desova dos repro-
dutores sob condições controladas, cultivo larval, assentamento e crescimento em berçário até o tamanho que possam ser transferidos para o meio ambiente para engorda, geralmente maiores que 1 mm. O processo requer a produção de alimento vivo, as microalgas, para alimentar todas as etapas de cultivo. Todas as etapas de cultivo requerem alimentação com microalgas com o tamanho e qualidade nutricional adequadas
para
cada
etapa
do
cultivo. As microalgas são cultivas em
ambientes
com
temperatura
controlada e padrões estritos de limpeza. As microalgas são plantas unicelulares que fazem parte do
requerem água, luz, gás carbônico e nutrientes para fazer a fotossíntese e se reproduzir. A alimentação de larvas de moluscos pode ser considerada um fator chave, pois influencia a variabilidade do crescimento de bivalves quando comparado com a temperatura ou a salinidade As larvas de molusco na fase planctônica são sensíveis aos fatores ambientais, que podem afetar o crescimento e a seleção do método de cultivo. Assim como, os fatores temperatura, salinidade, dieta e densidade de cultivo afetam o assentamento e a metamorfose. Em sistemas de produção em laboratório, a densidade é fácil de ser ajustada e tem uma grande influencia na sobrevivência de larvas de moluscos bivalves.
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As larvas de ostras são muito sensíveis à qualidade de água e infecções de bactérias. Assim, a água do mar deve ser filtrada e esterilizada adequadamente antes de ser usada. O dimensionamento da filtração depende da qualidade inicial da água e da etapa de cultivo. Normalmente os reprodutores recebem água com filtração mais grosseira, de até 10 micra. A água para desova, larvicultura, assentamento e berçário deve ser filtrada 1 mícron e esterilizada com lâmpadas ultra violeta (UV). A água para o cultivo de microalgas deve ser filtrada a 0,45 micra.
`` Figura 1: Diagrama de produção de sementes em laboratório
As informações apresentadas a seguir representam uma descrição básica do processo da produção de sementes, mas cada local apresenta situação específica e o corpo técnico deverá ter capacidade de adaptarse. É muito importante compreender que as estratégias de um laboratório são comumente modificadas para se adaptar às condições locais que, geralmente, são difíceis de compreender antes de realizar os primeiros cultivos larvais e de microalgas.
Cultivo de Microalgas Todas as etapas na produção de sementes de moluscos precisam de microalgas (fitoplancton) como alimento. Até o presente momento não existem estudos científicos que determinem as melhores condições de laboratório para produção de C. Gasar, isto inclui a dieta. Deste modo precisam ser avaliadas as melhores combinações para obter o menor tempo de larvicultura com melhores rendimentos. Contudo as espécies de microalgas ye tem fornecido bons resultoados são: Isochrysis sp. (Iso), Rhodomonas salina (Rh), Chaetoceros calcitrans (Cc), Chaetoceros muelleri (Cm), Nannochloropsis oculata (Na), Tetraselmis sp (Ts) e Pavlova Lutheri (Pav).
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O cultivo de microalgas é feito em condições controladas de luz, nutrientes, temperatura e ar em um ambiente livre de bactérias e protozoários. O cultivo geralmente esta dividido em cepario, intermediário e massivo. As cepas, que representam a parte mais sensível do processo, são mantidas em uma sala pequena denominada cepário, climatizada (22-25˚C) em estantes com iluminação fluorescente. Todos os meios de cultura e vidrarias são autoclavados, e os volumes de cultivo variam entre 30 e 400 ml. O sistema intermediário é composto por garrafas de 2 a 10 litros, as quais são mantidas em uma sala maior, climatizada a 22-25˚C dotada de prateleiras com iluminação fluorescente. As garrafas de 5 e 10L também são esterilizados na autoclave. O cultivo leva até 7 dias e o conteúdo das garrafas é transferido para 350 litros de meio de cultura denominado como cultivo massivo. O cultivo em 350 litros é realizado em colunas verticais de plástico transparente lacrado nas extremidades, o que permite manter isolado do ambiente externo. Cada coluna recebe ar filtrado à 0,45μm e gás carbônico (CO2) na proporção de 2% do volume total de ar ou mantendo o pH entre 8 e 8,5. O sistema de colunas em plástico foi concebido para manter a qualidade microbiológica das algas no mesmo nível que nas cepas. Cada coluna pode ser colhida 100 a 200 L a cada 2-3 dias com concentrações variando de 4x106 cel. ml-1 até 30x106 cel. ml-1, dependendo da espécie de microalga.
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`` Figura 2 Cultivo de microalgas. (A) Cultivo de cepas, (B) Cultivo intermediário, (C) Cultivo massivo.
Maturação Os requerimentos para a maturação controlada de reprodutores da ostra nativa Crassostrea gasar ainda não se encontram definidos. Em geral moluscos tropicais não respondem da mesmo forma que outras espécies de clima temperado, de tal modo que as técnicas utilizadas em Santa Catarina para as ostras japonesas Crassotrea gigas não são validas para C. gasar. Nas experiências obtidas com esta espécie nos últimos anos por distintos laboratórios e por pesquisas científicas indicam baixas respostas a regimes de temperaturas para maturação, contudo resultados positivos podem ser obtidos com corretos regimes alimentares e salinidades entre 20 ppt e 30 ppt.
Larvicultura A larvicultura em C. Gasar assim como outras ostras do gênero Crassotrea apresenta diferentes metodologias que diferem principalmente no manejo e na densidade de cultivo, estes são classificados em sistema estático, semicontínuo e contínuo. O método mias conhecido de larvicultura é do tipo estático, em este sistema as larvas são mantidas em densidades baixas (menor que 2 larvas/m nos últimos dias) e o volume total do tanque é trocado diariamente. O sistema semicontínuo se diferencia do sistema estático pelo desenho do tanque, o qual tem um dreno lateral na altura do nível máximo de água no qual é instalado um filtro (filtro “banjo”) que evita a saída de larvas mais permite a saída de água e fezes. Neste sistema as trocas de água podem ser realizadas mais vezes por dia e deste modo ter um maior controle da qualidade da água sem precisar manejar as larvas todos os dias. As densidades de larvicultura não diferem muito do sistema estático, contudo pode apresentar melhore taxas de crescimento.
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`` Figura 4: A. Filtro “banjo” em PVC. B. Tanque de larvicultura cilindro cônico com filtro lateral.
O sistema contínuo consiste em pequenos tanques cilindro cônicos (volumes menores que 1000) com dreno lateral (semelhante ao semicontínuo), neste sistema é mantido um fluxo constante de água e alimento. As densidades de larvicultura variam entre 300 e 100 larvas/ml.
`` Figura 3 Tanque de larvicultura semicontínuo
Assentamento Na natureza as larvas de ostra fazem parte do plâncton (Larvas véliger), até o momento em que a larva desce da coluna da água para se fixar em um substrato sólido, por exemplo uma raiz de mangue uma concha ou uma pedra. Esta etapa é chamada de assentamento e ocorre quando a larva apresenta algumas características morfológicas, entre elas uma “mancha ocular” e, por esta razão, é chamada de “larva olhada” e o aparecimento do “Pé” (larva pediveliger) entre outras. A partir deste momento as larvas começam a apresentar um comportamento de busca do substrato e podem ser transferidas para o assentamento. A metamorfose pode ser natural, colocando as larvas olhadas em um tanque cheio de substratos, tais como conchas de ostras ou garrafas pet, ou pode ser induzida com sustâncias neurotransmissoras como a
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Epinefrina (EPI). A utilização de substrato pode ter uma taxa de assentamento de 5-10% ou seja, de cada 1 milhão de larvas olhadas somente 50000 a 100000 viram spats. As taxas de metamorfose registradas para esta espécie utilizando EPI vão desde 9 a 40% (estudos realizados em diferentes salinidades ) DARIO, 2012
Berçário Assim que as larvas atingiram a metamorfose são transferidas para o sistema de berçário. Os sistema mais comum para este fim são os tanques com cilindros em fluxo ascendente (upweller) e de cilindros em fluxo descendente (downweller). Este sistema é composto por um tanque que contém em seu interior secções cilíndricas com malha no fundo (de abertura de malha suficiente para conter as sementes). Nos cilindros a água pode ser forçada a subir pela malha e sementes (upwelling) ou com um fluxo entrando na parte superior do cilindro e saindo pela malha. Este último é utilizado somente nos primeiros dias de assentamento para evitar a saída de larvas pelo dreno.
`` Figura 5: Tanque “upweller”
`` Figura 6: Tanque “downweller”
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PROTOCOLOS PARA DESOVA, Larvicultura e Assentamento
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Introdução
A
ostra nativa C. gazar não responde bem aos estímulos térmicos como a ostra japonesa Crassostrea gigas cultivada em Santa Catarina, de tal modo a metodologia adotada é a realização de desovas massivas sem controle de fecundação. Primeiramente devem ser avaliados os lotes que serão utilizados para desovar, podendo ser diretamente do ambiente ou da sala de maturação. Este procedimento deve ser realizado sacrificando pelo menos 6 animais. A quantidade de animais necessários para desova depende da quantidade de larvas que serão necessárias. De modo simples, uma fêmea pode liberar 1 milhão de oócitos, este valor
pode ser maior o menor dependendo da época do ano e da procedência do reprodutores. Para avaliar os reprodutores se deve abrir os animais com uma faca e separar uma das valvas cortando o músculo adutor. Observar o tecido gonadal e determinar visualmente a qualidade reprodutiva do animal, para isto deve ser observada a espessura do tecido, rigidez, etc.. Um ostra “gorda” apresentará o corpo todo coberto pelo tecido e ao fazer um corte superficial no tecido, os gametas escorrerão pela lâmina do bisturi. Uma ostra magra apresentará o tecido gonadal translucido e a região do hepatopancreas (aparelho digestivo) será facilmente visível.
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`` Figura 7 Ostra “gorda” com tecido gonadal cheio.
Em geral C. Gasar em baixas latitudes tem desovas parciais, de tal modo que as gônadas dificilmente estão totalmente cheias. Quando as ostras estiverem magras o processo de desova deve ser abandonado e procurar um novo lote que possa estar em melhores condições. Após abrir os animais e conferir que mais do 50% apresentam um tecido gonadal branco (ainda que não todo o corpo) se procede ao passo seguinte que é determinar a relação de machos e fêmeas para esse lote e a qualidade dos oócitos (se estiverem presentes), isto deve ser feito como segue: Deixar preparada uma lâmina de seddwick rafter com 0,5 ml de água de mar. Cortar cuidadosamente o tecido gonadal e com a ponta do bisturi colocar na lamina de sedwick rafter com água do mar. Cobrir a lâmina e colocar no microscópio no aumento de 40x. Observar a presença de espermatozoides e de oócitos Quando observados os oócitos observar forma, tamanho e capacidade de desprendimento do folículo. No caso de espermatozoides observar movimento.
`` Figura 8: Coleta de gametas , preparação de laminas e observação no microscópio
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Quando for observada a presença de oócitos com formato mais arredondado na maioria das fêmeas se procede a preparar os animais para desova. Os animais escolhidos devem passar por uma limpeza mecânica para eliminar todos os organismos incrustantes, lavados com água doce em alta pressão e finalmente colocados em uma solução de 10ppm de Hipoclorito de sódio. Deixar os animais 10 min na solução de Hipoclorito e logo desclorar utilizando Tiosulfato de sódio. Lavar os animais com água doce e deixar os animais em uma sala com temperatura baixa (23-25˚C) durante a noite. No dia seguinte colocar os animais em um tanque com água circulante (50 animais/1000 L de água do mar) com UV. Após 2 horas se os animais não tiverem desovado drenar todo o tanque (limpar e clorar o tanque) enxaguar tudo. Deixar os animais em cestas plásticas no tanque com água do mar esterilizada com UV e aquecedores a 30 °C durante a noite.
`` Figura 10: Ostras preparadas paar desova (A) Antes da desova; (B) após 12 horas no tanque de desova.
De manhã o tanque deve ser drenado (lembrar de desligar os aquecedores primeiro) em peneiras de 22 e 35 e 90 micras para reter larvas e embriões. A malha de 90 micras deve ser utilizada para a retenção de sujeiras. Os embriões coletados devem ser avaliados no microscópio óptico. O número de larvas D deve ser estimado através da contagem em câmara de contagem (Sedgewick-Rafter).
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As vezes na drenagem do tanque é possível que alguns animais ainda estejam desovando, deste modo é importante avaliar o material retido na peneira de 22 micra para verificar a presença de oócitos recém fecundados, caso isto ocorra deve ser drenado e enxaguado o tanque e adicionada água para que os animais continuem desovando. Este detalhe deve ser avaliado de acordo a necessidade do numero de larvas. Após a avaliação da larvas estas devem ser transferidas para o tanque de larvicultura.
Larvicultura A densidade de larvas recomendada para iniciar a larvicultura em sistema estático ou de trocas parciais é de no máximo 15- larvas/ml sendo diminuída pela seleção de larvas a cada troca de água. Devem ser descartadas as larvas com baixo crescimento ou apresentando má formação.
`` Figura 9 (A) Câmara de Sedgewick-Rafter, (B) Imagem no microscópio na contagem de larva D
Quando utilizado o sistema de larvicultura semicontínuo adaptado com filtro lateral é possível realizar a drenagem total a cada 48 horas e trocas diárias na hora de alimentar. O tempo de larvicultura desde a larva trocófora até pediveliger pode durar de 11 a 20 dias dependendo da temperatura e salinidade.
Alimentação na larvicultura Vinte e quatro horas após a fertilização inicia-se a alimentação das larvas. Esta deve ser ministrada diariamente nas concentrações de acordo ao tamanho e desenvolvimento das larvas. A alimentação é um dos processos de maior atenção no processo de larvicultura, em excesso ele irá trazer problemas de contaminação bacteriana e consequentemente um maior mortalidade no tanque. Por outro lado a falta de alimento diminuiria a taxa de crescimento das larvas prolongando o tempo de larvicultura. A dieta requerida para larvicultura consiste principalmente de algas flageladas como Isochrysis sp. (ISO) ou Pavlova lutheri (PV), Nannochoropsis sp. (Na) e uma diatomácea pequena como Chaetoceros calcitrans (CC) quando a larva apresenta as caraterísticas umbonadas começa a ser utilizada Chaetoceros muelleri (CM). Contudo sempre vai ser a disponibilidade de algas a que vai decidir a espécie a ser utilizada.
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Na alimentação das larvas as microalgas são adicionadas continuamente de modo a manter a mesma densidade de algas no tanque de larvicultura compensando a perda para renovação e as consumidas pelas larvas. A tabela abaixo representa a programação de alimentação ao longo da larvicultura com temperatura entre 27 e 30˚C e salinidade de 28:
Estágio
Idade (dias)
Tamanho (µm)
Densidade (Larvas/ml)
Alimento (células/ ml)
Oócito
0
55
-
-
Larva D
1-5
65
10
ISO ou/e PV –Cc (1:2) 2-3x104
7
ISO ou/e PV-Cc-Na (1:1:1) 3x104
Umbonada
Umbonada
5-7
7-9
140
160
2
ISO-Pav- Cm-Na (1,5:1:1:0,5) 3-4x104
Olhada
10-13
160-300
0,5-1
ISO-CM 3:2 6-7x104
Considerando a densidade das microalgas cultivadas nas colunas de cultivo massivo e a quantidade requerida, pode-se calcular quantos litros de cultura de microalgas será ofertado. As principais espécies de microalgas utilizadas normalmente alcançam as seguintes densidades celulares: ``ISO = 8 milhões de células/ml ``Cm = 6 milhões de células/ml ``Pav= 12 milhões de células/ml Então, por exemplo, se a larvicultura está no 5˚dia e a alimentação requerida é de 30.000 células/ml, que 40% é ISO, 30% de Pav e 30% CM e que o volume do tanque é de 1000 L ``Volume total de água por dia = 1000 litros ``Volume de ISO = { (30 mil células/ml x 0,4) x 1000 litros} / 8 milhões células/ml ``Vol. ISO= 1,5 litros de manhã e de tarde ``Volume de Pav = { (30 mil células/ml x 0,3) x 1000 litros} / 12 milhões células/ml ``Vol. Pav= 0,75 litros de manhã e de tarde ``Volume de CM = { (30 mil células/ml x 0,3) x 4800 litros} / 6 milhões células/ml} ``Vol. CM= 1,5 litros de manhã e de tarde
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Assentamento utilizando Epinefrina O aparecimento das primeiras larvas olhadas é o indicador que o assentamento está próximo e se deve prestar atenção para: ``Larvas na malha de 230-240 micras. ``35% das larvas estão em Pediveliger ``Quando 50% das pediveliger tem de 3 a 5 filamentos branquiais. As larvas que não estão ainda na malha de 236 micra devem voltar para o tanque até o próximo dia quando serão novamente manejadas. As larvas retidas na malha 236 devem ser colocadas em um balde e contadas e depois pesadas. As características para assentamento devem ser examinadas ao microscópio e se estiverem prontas podem ser induzidas a metamorfose ou guardadas na geladeira para juntar com o grupo que sair no dia seguinte. A epinefrina deve ser guardada no escuro em geladeira com temperatura < 8°C. Usa-se uma solução com 0,33 g de EPI em 1 litro de água destilada. A diluição final para tratar as larvas é de 1:9. A) A preparação das larvas para assentamento é feita da seguinte forma:
1. Pesar uma tela de 15x15 cm é um elástico de dinheiro 2. Fazer um funil com uma garrafa de 5 l de água mineral e colocar uma tela de 100-150 micras amarrada com elástico formando uma saco. 3. Verter as larvas do balde para o funil, lavar com jato forte as larvas aderidas as laterais do balde. 4. Retirar com cuidado a malha da boca do funil 5. Secar com delicadeza com papel toalha (deixar alguns segundos drenando) o saco de larvas. 6. Pesar e registrar junto com a data e a contagem feita do numero de larvas. 7. Colocar na geladeira embrulhadas no pano de algodão humedecido em água salgada dentro de um Becker de 500 ml. 8. Deixar até o dia seguinte se for juntar com o outro lote ou deixar por 2 horas.
B) A indução a metamorfose é feita da seguinte forma:
1. Colocar as larvas (até 10 milhões) em um balde com 9 litros de água salgada (igual a de larvicultura) e 1 litro de água destilada com 0,33g de Epinefrina 2. Colocar aeração (suficiente para homogeneizar as larvas) 3. Cobrir da luz 4. Deixar por 1 hora e 10 min 5. Lavar as larvas em peneira de 200 micras 6. Repetir os passos do item A e deixar por 2 horas e repetir os passos do item B até o ponto 5 7. Colocar as larvas no balde e avaliar 8. Colocar as larvas no downweller.
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As larvas sĂŁo colocadas por 24 horas em um tanque especial denominado downweller. ApĂłs 24 horas no downweller peneirar em 236 e 275, se as larvas ainda nĂŁo metamorfosearam (larvas menores que 275) todo o processo deve ser repetido.
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agradecimentos SEBRAE ALAGOAS
Diretor de Administração e Finanças
CONSELHO DELIBERATIVO ESTADUAL Presidente
Coordenação do Projeto Estruturante AquiNordeste
Airton Gonçalves Junior
Kennedy Davidson Pinaud Calheiros
Paulo Jorge Mendes Leitão
DIRETORIA EXECUTIVA Diretor Superintendente
Gestor Estadual
Marcos Antonio da Rocha Vieira
Diretor-Técnico
Ronaldo de Moraes e Silva
Diretor de Administração e Finanças
Francisco Carlos de Almeida Paulino
SEBRAE MARANHÃO CONSELHO DELIBERATIVO ESTADUAL Presidente
José Roberval Cabral da Silva Gomes
Edilson Baldez das Neves
Coordenação do Projeto Estruturante AquiNordeste
DIRETORIA EXECUTIVA Diretor Superintendente
Vânia Brandão de Britto
Gestor Estadual
Manoel Affonso Mello Ramalho de Azevedo
SEBRAE BAHIA CONSELHO DELIBERATIVO ESTADUAL Presidente Antonio Ricardo Alvarez Alban
DIRETORIA EXECUTIVA Diretor Superintendente Adhvan Novais Furtado
Diretor-Técnico
João Batista Martins
Diretor Técnico
José de Ribamar da Silva Morais
Diretor Administrativo-Financeiro Rachel Miranda Jordão da Silva
Coordenação do Projeto Estruturante AquiNordeste Walter Pereira Monteiro
SEBRAE PARAÍBA CONSELHO DELIBERATIVO ESTADUAL Presidente
Lauro Alberto Chaves Ramos
Francisco Benevides de Gadelha
Diretor de Atendimento
DIRETORIA EXECUTIVA Diretor Superintendente
Franklin Santana Santos
Coordenação do Projeto Estruturante AquiNordeste Célia Márcia Fernandes
Gestora Estadual
Nancy Nascimento Santos
SEBRAE CEARÁ CONSELHO DELIBERATIVO ESTADUAL Presidente Flávio Viriato de Saboya Neto
DIRETORIA EXECUTIVA Diretor Superintendente Joaquim Cartaxo Filho
Diretor-Técnico
Alci Porto Gurgel Junior
Walter Aguiar
Diretor-Técnico
Luiz Alberto Gonçalves de Amorim
Diretor de Administração e Finanças João Monteiro da Franca Neto
Coordenação do Projeto Estruturante AquiNordeste Franco Fred Cordeiro Tavares
Gestor Estadual
Jucieux de Lucena Palmeira
SEBRAE PERNAMBUCO CONSELHO DELIBERATIVO ESTADUAL Presidente Josias Albuquerque
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DIRETORIA EXECUTIVA Diretor Superintendente
DIRETORIA EXECUTIVA Diretor Superintendente
Diretora Técnica
Diretor Técnico
Diretora Administrativa-Financeira
Diretor Administrativo Financeiro
SEBRAE PIAUÍ
Coordenação do Projeto Estruturante AquiNordeste
CONSELHO DELIBERATIVO ESTADUAL Presidente
Gestora Estadual
José Oswaldo de Barros Lima Ramos Ana Cláudia Dias Rocha Adriana Tavares Côrte Real Kruppa
Carlos Augusto Melo Carneiro da Cunha
DIRETORIA EXECUTIVA Diretor Superintendente
Mário José Lacerda de Melo
Diretor-Técnico
Delano Rodrigues Rocha
Diretor de Administrativo e Financeiro Ulysses Gonçalves Nunes Moraes
Coordenação do Projeto Estruturante AquiNordeste Geórgia Alcântara Costa de Pádua
Gestor Estadual
João Pinheiro Junior
SEBRAE RIO GRANDE DO NORTE CONSELHO DELIBERATIVO ESTADUAL Presidente José Álvares Vieira
DIRETORIA EXECUTIVA Diretor Superintendente
José Ferreira de Melo Neto
Diretor-Técnico
João Hélio Costa da Cunha Cavalcanti Júnior
Diretor de Operações
José Eduardo Ribeiro Viana
Coordenador do Projeto Estruturante AquiNordeste José Ronil Rodrigues Fonseca
Gestores Estaduais
Marcelo de Oliveira Medeiros Renato Augusto Gouveia de Carvalho
SEBRAE SERGIPE CONSELHO DELIBERATIVO ESTADUAL Presidente Gilson Silveira Figueiredo
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Emanoel Silveira Sobral Marcelo Farias Barreto
Eduardo Prado de Oliveira Junior Angela Maria de Souza Maria Lúcia Alves
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