Tecnologie digitali applicate al controllo di processo nella preparazione di estratti oleosi di Cannabis terapeutica in fase unica

Paolo Bongiorno Pitruzzella

Lda ?iore a ciclo annuale appartenente alla famiglia delle Cannabinaceae.

Canapa e Marijuana sono la stessa pianta, la distinzione fra la prima e la seconda è semplicemente di tipo lessicale, dovuta all’uso comune dei termini, infatti ci riferiamo alla prima per l’uso tessile ed alla seconda per quello medico.

La pianta è nota per contenere più di ottocento composti chimici e tra questi le classi più importanti di noidi.

I cannabinoidi sono una classe di terpenofenoli, prodotti in abbondanza nei tricomi ghiandolari sui ?iori femminili attraverso una rete molto complessa di processi enzimatici.

Tra questi, i due composti più rappresentativi sono l'acido Δ9-tetraidrocannabinolico (THCA) e l'acido cannabidiolico (CBDA) (Figura 1).

Gli acidi cannabinolici sono acidi carbossilici dotati di scarsa attività terapeutica, questi perdono le loro

1 Farmacia Dott. Paolo Bongiorno, Via Vittorio Veneto 17/19, 92026 Favara (AG), Italy; farmacia.pbongiorno@gmail.com (P.B.);

2 Department of Pharmacy – Pharmaceutical Sciences, The University of Bari Aldo Moro, Via Orabona 4, 7012 Bari (BA), Italy; antonio.lopalco@uniba.it (A.L.); antonio.spennacchio@uniba.it (A.S.); angelaassunta.lopedota@uniba.it (A.A.); nunzio.denora@uniba.it (N.D.);

3 Department of Pharmaceutical Sciences, The University of Milano, Via G. Colombo 71-20133 Milan, Italy; antonella.casiraghi@unimi.it (A.C.); paola.minghetti@unimi.it (P.M.)

4 Biomedicine, Neuroscience and Advanced Diagnostics, (BIND) University of Palermo I-90127; alessandro.pitruzzella@unipa.it (A.P.)

# These authors contributed equally to the work.

* Correspondence: nunzio.denora@uniba.it; Tel.: +39-080-544-2767.

Nota: per la bibliogra^ia si faccia riferimento al testo integrale dell’articolo disponibile al link: https://www.mdpi.com/ 1999-4923/15/3/870 caratteristiche acide attraverso un processo chiamato decarbossilazione che consiste nella perdita del gruppo carbossilico.

Strutture molecolari dei principali cannabinoidi: Δ9tetraidrocannabinolo (THC), acido Δ9-tetraidrocannabinolico (THCA), cannabinolo (CBD) e acido cannabinolico (CBDA) e del monoterpene β-myrcene e del sesquiterpene β-cariofillene.

Questa trasformazione che avviene spontaneamente con il tempo, la luce ed il calore, può essere accelerata riscaldando le in?iorescenze a temperature superiori ai 100 °C e porta ai cannabinoidi neutri capaci di importanti attività terapeutiche.

Il THC, principale costituente psicoattivo, è responsabile delle attività antidolori?iche, antinausea, antiemetiche, rilassanti e stimolanti dell’appetito attribuite alla cannabis. Anche il CBD mostra diverse attività farmacologiche come l’attività antiossidante, antin?iammatoria, anticonvulsivante, antimicrobica e neuroprotettiva, inoltre, contribuisce alla riduzione della pressione endoculare, sinergizza e modula l’azione del THC.

I terpeni sono un'ulteriore classe ben rappresentata di composti attivi prodotti nelle in?iorescenze di cannabis. Tra i terpeni, il mircene (Figura 1), il limonene, il trans-ocimene e il terpinolene sono i monoterpeni più rappresentati nella pianta, mentre il cario?illene (Figura 1) e l'umulene sono i sesquiterpeni più abbondanti.

Raphael Mechoulam, rinomato chimico israelita della cannabis, descrisse per la prima volta l’effetto entourage, cioè il risultato della complessa interazione fra i vari costituenti chimici della pianta che ne migliorerebbe l’ef?icacia rispetto a quanto essi stessi possano fare separatamente.

La possibilità che la Cannabis debba realmente le sue proprietà terapeutiche all'effetto entourage rimane uno dei concetti più discussi della scienza. Infatti, il ?itocomplesso dif?icilmente può essere studiato analiticamente con metodiche che ne rompono l'unità e il dinamismo (mutua relazione tra molteplici componenti), e non esistono prove a livello recettoriale della partecipazione di tutte le sostanze attive presenti nella Cannabis

Gli effetti del ?itocomplesso possono però essere ef?icacemente testati attraverso gli effetti clinici che produce nei soggetti che lo utilizzano, infatti, diverse evidenze scienti?iche dimostrano come estratti che preservano il ?itocomplesso siano maggiormente attivi rispetto ad analoghi estratti meno conservativi. Negli anni questa divisione concettuale si è tradotta nello studio di una varietà di tecniche estrattive che pur con qualche eccezione hanno privilegiato in maniera alternativa o un alto contenuto di cannabinoidi o un alto contenuto di terpeni ovvero delle componenti più volatili già a basse temperature.

Fra questi studi, nel 2016, la Società Italiana dei Farmacisti Preparatori (SIFAP) ha sviluppato e proposto un metodo per la preparazione di estratti galenici di olio di Cannabis caratterizzati da rese elevate. Il metodo SIFAP è una procedura in due fasi, descritta per la preparazione di un piccolo lotto di estratto oleoso, in particolare 5 g di in?iorescenze estratte in 50 mL di olio di oliva di qualità farmaceutica, che non consente di controllare l'intero processo di decarbossilazione dei cannabinoidi né consente di mantenere la frazione terpenica. Lo studio, comunque, per la sua importanza rappresenta un riferimento nel campo delle preparazioni galeniche a base di Cannabis terapeutica e pertanto è stato utilizzato come riferimento nel presente studio.

I limiti più evidenti delle metodiche estrattive ?in qui studiate e applicate agli oleoliti di Cannabis riguardavano la mancanza di standardizzazione e riproducibilità del metodo su quantità diverse da quelle studiate, lo stress ossidativo dell’olio per via del riscaldamento e dell’esposizione all’ossigeno, la possibilità di cross inquinamento nel caso dell’uso di bagno maria, la perdita della frazione terpenica, l’impossibilità di controllare in progress il processo di decarbossilazione e l’elevata possibilità di errore umano.

Il metodo Bongiorno

Attraverso questo studio sviluppato in collaborazione con l’Università di Bari, e che per gli approfondimenti può essere consultato al seguente indirizzo: https://www.mdpi.com/1999-4923/15/3/870 , si è voluto sperimentare un metodo ?lessibile per la preparazione dell’olio di Cannabis che rappresenti un punto di convergenza fra le metodiche conservative, senza o con moderato passaggio termico, che mirano a mantenere la frazione terpenica e quelle che invece fanno ampio uso del calore, che sono meno conservative puntano ad ottenere alte rese di cannabinoidi.

Il paradigma di analisi e risoluzione dei limiti appena evidenziati è stato aggiornato alla luce delle nuove tecnologie elettroniche a supporto di misurazioni estremamente accurate (realizzate con una sonda al platino direttamente nell’ambiente di reazione) e di un sistema di riscaldamento controllato da un software appositamente realizzato.

Ej stato possibile in questo modo applicare una potenza di riscaldamento proporzionale alla massa da riscaldare, ottenendo una grande riproducibilità del metodo.

La soluzione ai problemi di mantenimento della frazione terpenica, di cross inquinamento e di ossidazione dell’olio è stata trovata nel riscaldamento in reattore chiuso e sotto vuoto; poiché inoltre da una mole di un cannabinoide acido (es. THCA) per decarbossilazione si ottengono una mole di cannabinoide neutro (es. THC) ed una mole di CO2 , questa scelta permette (attraverso apposita sonda per CO2) di misurare l’anidride carbonica prodotta nell’ambiente di reazione e di calcolare facilmente i mg di THC decarbossilati.

Il monitoraggio in progress della decarbossilazione permette inoltre di controllare il processo e di spingere più o meno il grado di decarbossilazione in funzione di quanto richiesto dal medico.

In sintesi, il processo prevede una preparazione in fase unica, nella quale il processo di estrazione è ottenuto sotto vuoto per macerazione e riscaldamento delle in?iorescenze in olio di oliva F.U. (rapporto 1:10), in reattore chiuso ermeticamente, ad una temperatura di 110 °C per due ore e di una fase di decarbossilazione in continuo, nel medesimo reattore, portando la temperatura a 146 °C per 90 minuti.

Apparato Pharmagear® e strumentazione Per l’applicazione del metodo è stato costruito uno strumento apposito denominato Pharmagear® (Energicamente srl, Favara, Agrigento, Italia; Nebiolo Ht, Assoro, Enna, Italia), (Figura 2). Lo strumento riunisce un evaporatore a pressione ridotta, un estrattore di olio essenziale costituito da un maceratore accoppiato con un agitatore magnetico intelligente e un reattore (Figura 2a-c). I processi di estrazione e decarbossilazione sono controllati da un sistema di controllo elettronico automatizzato, che invia in tempo reale tutti i dati acquisiti ad un software di un PC.

L’attrezzatura è stata completata con la costruzione di un apposito sistema ?iltrante per pompa da vuoto. Lo strumento è stato ideato per eseguire il metodo Bongiorno, ma riunendo in uno, forno statico, evaporatore rotante e maceratore, può essere utilizzato in luogo delle attrezzature convenzionali per eseguire tutte le metodiche allo stato dell’arte conosciute. Per la preparazione si sono rese necessarie queste altre attrezzature:

• Sonicatore Baoshishan Fs-600n Ultrasonic Homogenizer 600 W Lab Sonicator Processor; Turbo emulsore Miccra Homogenizer;

• Pompa VidaXL per vuoto ad un solo stadio 50 L potenza 120 W;

• Sistema ?iltrante per pompa da vuoto appositamente costruito.

Descrizione dei Metodi (TGE - TGE-PE)

Indipendentemente dalle quantità di Cannabis da estrarre, per lotto minimo: sono stati pesati 5 g di Cannabis flos e misurati 50 mL di olio di oliva Ph. Eur. che è stato precedentemente raffreddato ad una temperatura compresa tra 2 e 8 °C.

Il reattore è stato avvolto con gel di ghiaccio, un'aliquota di 10 mL dell'olio è stata accantonata e aggiunta alla ?ine dell'intero processo per il lavaggio del reattore. I restanti 40 ml di olio di oliva Ph. Eur. sono stati introdotti nel reattore insieme alle in?iorescenze, precedentemente micronizzate, e disperse nell'olio mediante omogeneizzatore.

PRE RAFFREDDAMENTO DELL’OLIO - 5/8 °C

CONSERVAZIONE FRAZIONE DI LAVAGGIO (10 ml) - TRITURAZIONE IN OLIO A MEZZO TURRAX

SONICAZIONE – 5 min. Potenza 250 W Frequenza 20 Khz

VUOTO – REATTORE COLLEGATO A POMPA DA VUOTO

ESTRAZIONE – 2 h 110 °C e DECARBOSSILAZIONE – 1,5 h 146 °C – FASE UNICA IN CONTINUO RAFFREDDAMENTO FINO A 40 °C e FILTRAZIONE

LAVAGGIO REATTORE (10 ml) FILTRAZIONE FRAZIONE DI LAVAGGIO E UNIONE AL PRIMO FILTRATO

AGGIUNTA DI TOCOFEROLO ALFA 0,05 %

CONSERVAZIONE IN FLACONI IN VETRO AMBRATO

Eventuali in?iorescenze di Cannabis rimanenti, bloccate nella testa del rotore/statore dell'omogeneizzatore, sono state spostate utilizzando una spatola ed è stato eseguito un secondo ciclo di miscelazione per alcuni minuti.

Quindi la miscela nel reattore avvolto in gel di ghiaccio è stata sonicata con una sonda (Baoshishan FS-600N Sonicator Ultrasonic Homogenizer 600 W Lab Sonicator Processor) a una potenza erogata di circa 200 W per 5 minuti e una frequenza di 20 kHz.

Un'ancora magnetica è stata inserita nel reattore, che a sua volta è stato chiuso con un coperchio ermetico. La pompa del vuoto è stata collegata alla testa del reattore e l'ossigeno eliminato per ridurre lo stress ossidativo dell'olio durante le successive fasi di riscaldamento. Il reattore è stato introdotto nel sistema di controllo (Figura 2c).

Il sistema di controllo e riscaldamento denominato Pharmagear® può essere programmato per eseguire un processo estrattivo diretto in fase unica (TGE Tolotto Gear Extraction - Temp. di estrazione 110 °C per 120 minuti e temperatura di decarbossilazione di 146 °C per 90 minuti) o per eseguire una pre-estrazione (TGE-PE, Tolotto Gear Extraction From Pre Extraction) di 12 ore a temperatura ambiente seguita dall’estrazione diretta (TGE).

Al termine del processo, il reattore è stato rimosso dallo strumento e la sua temperatura è stata ridotta a 40 °C con un impacco di gel di ghiaccio. L'olio di Cannabis estratto è stato ?iltrato utilizzando un sistema di ?iltri a membrana in nylon alimentare (dimensione dei pori 37 mm) collegato alla pompa del vuoto (Vi- daXL50L/minpower 120 W, grado di vuoto 50 Pa) (Figura 2f).

Il reattore e l'ancora magnetica sono stati lavati con la frazione oleosa conservata, che è stata aggiunta alla restante preparazione oleosa. L'olio di Cannabis ottenuto è stato conservato in una bottiglia di vetro ambrato ed è stato aggiunto alfa-tocoferolo allo 0,05% v/v per prevenire l'ossidazione. Per il lotto con 10 e 15 g di materiale vegetale è stato utilizzato rispettivamente un volume di solvente di 90 e 140 mL di olio d'oliva per il processo di estrazione nel reattore. Alla ?ine dell'intero processo per il lavaggio del reattore è stata aggiunta un'aliquota di 10 mL dell'olio precedentemente accantonata. In tutti gli esperimenti il rapporto in volume droga:solvente, dopo diluizione con 10 mL di frazione di olio di lavaggio, si è sempre mantenuto pari a 1:10.

Risultati

Attraverso il metodo proposto la resa estrattiva di prodotti decarbossilati è sempre prossima al 100% del risultato ottenibile, nel complesso i metodi TGE e TGE-PE appaiono quasi equivalenti in termini di cannabinoidi estratti ma il metodo con pre-estrazione, evidenzia un incremento di terpeni estratti pari al 6% circa.

Per testarne la riproducibilità i metodi TGE e TGE-FP sono stati applicati a tre varietà di Cannabis, due di esse ad alta concentrazione di THC (Bedrocan e Pedanios) e una bilanciata (FM2), preparate mantenendo costante il rapporto 1:10 ma a volumi diversi di 5:50, 10:100 e 15:150, i risultati sono riportati nella Tabella 1.

Come accennato, questi risultati sono stati confrontati con quelli ottenuti utilizzando il metodo SIFAP, uno dei più diffusi metodi di estrazione ad alta capacità . Il confronto è stato effettuato sulla base dei dati riportati in letteratura e di un nuovo set di dati sperimentali.

Nel periodo dal 2017 al 2019, centinaia di campioni sono stati preparati dai farmacisti e analizzati dall'Università degli Studi di Milano. Nonostante un contenuto di THC vicino o superiore al 20% p/p, è stata ottenuta un'estrazione media di 12.236 ± 3.31 mg/ mL utilizzando Cannabis ^los varietà Bedrocan e Pedanios (N=800) mentre il THCA residuo era inferiore a 1.8 mg/mL. Nel caso di FM2 (N=350), il valore medio di THC era 5,06 ± 1,01 mg/mL e il CBD era 7,268 ± 1,84 mg/mL

Tabella 2. La tabella mostra i risultati applicando le due metodiche allo stesso lotto di Cannabis flos varietà Bedrocan. NQ = Non Quantificabile.

In Figura 4 un raffronto schematico fra le fasi di preparazione nelle due metodiche.

Terpeni

Il profumo tipico della Cannabis è il risultato della presenza di circa 140 diversi terpeni e terpenoidi. I terpeni sono una miscela di diversi composti costituiti da multipli dell'unità chimica isoprene (C5H8). β-myrcene, limonene, trans-ocimene e α-terpinolene sono i monoterpeni più abbondanti nelle in?iorescenze di cannabis, mentre β-cario?illene e α-umule- vegetale medicinale utilizzando metodi TGE e TGE-PE. Le quantità (valori medi utilizzando misurazioni duplicate) sono state determinate mediante analisi GC-MS di una formulazione di olio con volumi finali di 50 mL ne sono i sesquiterpeni più rappresentati. Questi composti hanno proprietà antiossidanti, antin?iammatorie, ansiolitiche e antibatteriche. Durante il processo di preparazione della maggior parte degli oleoliti prodotti con vari metodi, il riscaldamento applicato al materiale vegetale per convertire i cannabinoidi acidi in composti neutri riduce notevolmente la percentuale di terpeni più leggeri (monoterpeni).

L'utilizzo di alte temperature aumenta la concentrazione dei sesquiterpeni a scapito dei monoterpeni. Per ovviare a questo problema, il metodo TGE è stato progettato per eseguire un'estrazione in un ambiente ermetico tale da consentire la condensazione dei terpeni dopo il raffreddamento e sotto vuoto al ?ine di eliminare lo stress ossidativo dell'olio durante il riscaldamento. In questo studio è stata condotta un'indagine preliminare sulla capacità dei metodi TGE e TGE-PE di estrarre e preservare i terpeni utilizzando l'innovativa tecnologia Pharmagear®. TGEPE si differenzia dal primo perché utilizza una preestrazione di 12 ore ad una temperatura di 30 °C. Le concentrazioni in mg/Kg dei terpeni estratti da Bedrocan ^los sono presentate nella Tabella 3. Le concentrazioni di terpeni sono state trovate in linea con i dati disponibili in letteratura per i preparati oleosi. La quantità di terpeni conservati può essere utilizzata come indicazione di conservazione dei ?itocomplessi.

Conclusioni

Per armonizzare le condizioni di estrazione per le preparazioni oleose di Cannabis terapeutica, SIFAP ha proposto ai farmacisti una procedura idonea. Sono stati proposti e adottati anche diversi metodi, ma tutti si basano su due fasi separate: processi di estrazione e decarbossilazione. I metodi TGE e TGEPE, basati su un'innovativa piattaforma automatica, hanno permesso l'estrazione del ?itocomplesso in un unico passaggio, controllando l'intero processo di decarbossilazione dei cannabinoidi. Le analisi HPLC effettuate sulle formulazioni oleose hanno mostrato che le capacità estrattive dei due metodi proposti utilizzando la piattaforma innovativa erano quasi doppie rispetto a quelle ottenute utilizzando la procedura SIFAP. Il contenuto di THC nelle formulazioni di olio era superiore a 21 mg/mL per la varietà Bedrocan e vicino a 20 mg/mL per la varietà Pedanios applicando TGE, mentre con TGE-PE la concentrazione di THC era superiore a 23 mg/mL per la varietà Bedrocan.

Non sono state osservate differenze signi?icative tra i contenuti di THC nelle formulazioni di olio prodotte utilizzando diverse quantità di Cannabis ^los e olio d'oliva (5:50, 10:100 e 15:150, Tabella 2). I risultati dei test effettuati con tre diverse quantità di materiale vegetale supportano che i metodi sono adatti anche per lotti multipli. Alcune differenze in termini di quantità di THCA e CBDA determinate dall'analisi HPLC utilizzando diverse quantità di Cannabis ^los e olio potrebbero essere attribuite ai contenuti residui di questi cannabinoidi nei diversi lotti di materiali vegetali acquistati da diversi fornitori.

Per la varietà FM2, le quantità di THC nelle formulazioni di olio ottenute utilizzando TGE e TGE-PE erano superiori a 7 mg/mL. Le analisi GC-MS nelle formulazioni oleose ottenute da Bedrocan ^los estratto con TGE-PE hanno mostrato un pro?ilo distintivo altamente ricco di terpeni e privo di prodotti volatili ossidati. Pertanto, l'applicazione dei metodi di estrazione TGE e TGE-PE ha permesso di produrre formulazioni oleose standardizzate con una maggiore composizione in cannabinoidi e concentrazioni totali di mono-di-tri-terpeni e sesquiterpeni.

I risultati ottenuti sono rilevanti e permettono di esplorare un nuovo modo di pensare alle preparazioni nel laboratorio galenico. Il moderno ed accurato sistema di controllo del processo di preparazione sancisce l'ingresso della Tecnologia dell'Industria 4.0 o “Fabbrica Intelligente” nel laboratorio galenico e si presta ad ulteriori sviluppi applicativi. L'automazione e la precisione del sistema non richiedono un controllo continuo dell'operatore durante le fasi di preparazione e consentono accuratezza, ripetibilità ed evitano errori umani. L'attrezzatura messa a punto si è rivelata utile non solo per la preparazione dell'olio ma anche per quella delle capsule decarbossilate a base di Cannabis medica. Sulla base della prima valutazione dei risultati ottenuti attraverso questa nuova tecnologia, ulteriori studi saranno condotti in considerazione del fatto che la letteratura sui pro?ili terpenici presenti negli estratti di Cannabis medica oleosa è molto scarsa.

Le analisi quantitative sui cannabinoidi sono state effettuate presso il laboratorio della Farmacia del dr. Paolo Bongiorno mediante cromatogra?ia liquida ad alta prestazione, mentre le analisi sui terpeni sono state effettuate presso il Dipartimento di Agraria dell’Università Federico II di Napoli, responsabile scienti?ico prof. Raffaele Romano.

Al ?ine di rendere più leggibile la sintesi di questo lavoro, la trattazione della parte analitica è stata appositamente omessa, ma come accennato può essere studiata consultando l’intero lavoro disponibile al seguente link : https://www.mdpi.com/ 1999-4923/15/3/870