การศึกษาโครงสร้าง ของเอนไซม์แมนแนนเนส
คณะนักวิจยั ของสถาบันวิจยั แสงซินโครตรอน ได้รว่ มกับนักวิจยั จากศูนย์พนั ธุ วิศวกรรมและเทคโนโลยีชวี ภาพแห่งชาติ มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีสรุ นารี และ University of Natural Resources and Applied Life Sciences ประเทศออสเตรีย ท�ำการศึกษา เอนไซม์แมนแนนเนส ซึ่งมีประโยชน์ในการย่อยสลายโมเลกุลน�้ำตาลสายยาวใน อุตสาหกรรมการผลิตอาหาร ซึ่งคุณสมบัติในการเร่งปฏิกิริยาการย่อยโมเลกุลน�้ำตาล สายยาวที่พบมากในหัวบุกและกากมะพร้าวสามารถน�ำไปใช้ประโยชน์ในอุตสาหกรรม การผลิตอาหาร ช่วยเพิม่ มูลค่าของวัตถุดบิ ทางการเกษตรได้ โดยใช้เทคนิคการวิเคราะห์ สเปกตรัมรังสีอนิ ฟราเรด และการศึกษาโครงสร้างโมเลกุลขนาดใหญ่ดว้ ยรูปแบบการหักเห รูปที่ 1 สเปกตรัมที่ได้จากเทคนิค รังสีเอกซ์ ซึง่ ทางคณะวิจยั สามารถหาสภาวะทีเ่ หมาะสมกับการท�ำงานของเอนไซม์ได้ และ การทดลอง IR Spectroscopy การรูถ้ งึ โครงสร้างโมเลกุลสามมิตขิ องเอนไซม์จะท�ำให้เราสามารถเข้าใจกลไกการท�ำงาน ของเอนไซม์ได้ดขี นึ้
รูปที่ 2 ผลึกเอนไซม์แมนแนนเนส
รูปที่ 3 แบบแผนการหักเหรังสีเอกซ์ ของผลึกเอนไซม์
เอนไซม์แมนแนนเนสเป็นเอนไซม์ ในกลุ่มไกลโคซิลไฮโดรเลส (GH26) ซึ่งมี คุณสมบัตใิ นการเร่งปฏิกริยาการย่อยโมเลกุล น�้ำตาลสายยาวซึ่งพบมากในหัวบุกและกาก มะพร้าว ให้ได้ผลิตภัณฑ์ทเี่ ป็นน�ำ้ ตาลสายสัน้ ลงสามารถน�ำไปใช้ประโยชน์ในอุตสาหกรรม การผลิ ต อาหารและอาหารเสริ ม ซึ่ ง มี ประโยชน์ในเชิงการเพิ่มมูลค่าของวัตถุดิบ การเกษตร คณะผู้วิจัยประสบความส�ำเร็จใน การผลิตเอนไซม์แมนแนนเนสที่บริสุทธิ์จาก แบคทีเรีย Bacillus licheniformis และทดสอบ คุ ณ สมบั ติ ก ารเร่ ง ปฏิ ก ริ ย าที่ ส ภาวะต่ า งๆ พบว่ า เอนไซม์ ท� ำ งานได้ ดี ที่ ค ่ า ความเป็ น
กรด-ด่าง (pH) ในช่วง 6.0 - 7.0 และอุณหภูมิ 50 - 60 องศาเซลเซียส ซึ่งเป็นสภาวะที่ เหมาะสมในการประยุ ก ต์ ใ ช้ จ ริ ง ในระดั บ อุตสาหกรรม จากการวิเคราะห์ผลผลิตที่ได้ จากการย่ อ ยโมเลกุ ล น�้ ำ ตาลของเอ็ น ไซม์ พบว่ า เอนไซม์ มี ค วามจ� ำ เพาะในการเร่ ง ปฏิกริยาของสารตั้งต้นโมเลกุลน�้ำตาลชนิด ต่างๆ แตกต่างกัน นอกจากนั้นได้ท�ำการ ตรวจสอบคุณสมบัตโิ ครงสร้างหน่วยย่อยและ น�้ำหนักโมเลกุลเอนไซม์ด้วยเทคนิค MALDITOF Mass Spectrometry รวมถึงวิเคราะห์ การเปลีย่ นแปลงโครงสร้างทุตยิ ภูมขิ องเอนไซม์ ทีอ่ ณ ุ หภูมติ า่ ง ๆ ด้วยเทคนิคการวิเคราะห์ สเปกตรัมรังสีอนิ ฟราเรด (Infrared spectro-
งานวิจัยด้านอุตสาหกรรม
เพื่อใช้ในการอธิบายคุณสมบัติการเร่งปฏิกิริยา
scopy) ที่สถานีทดลอง IR Spectroscopy and Imaging ณ สถาบันวิจัย แสงซิ น โครตรอน พบว่ า โครงสร้ า ง ทุ ติ ย ภู มิ ข องเอนไซม์ เริ่ ม มี ก าร เปลี่ยนแปลงที่อุณหภูมิ 40 - 45 องศา เซลเซียส แต่อย่างไรก็ตามไม่พบการ เปลี่ยนแปลงโครงสร้างในระดับที่ท�ำให้ โปรตีนสูญเสียคุณสมบัติ ซึ่งผลที่ได้ผล สอดคล้องกับการศึกษาผลของอุณหภูมิ ต่อคุณสมบัติความเสถียรของเอนไซม์ เพื่อน�ำไปสู่ความเข้าใจกลไก การเร่ ง ปฏิ กิ ริ ย าของเอนไซม์ ใ ห้ ดี ขึ้ น ทางคณะวิจัยจึงได้เตรียมผลึกเอนไซม์
ดังกล่าว ณ ห้องปฏิบัติการสถาบันวิจัย แสงซิ น โครตรอน และเก็ บ ข้ อ มู ล การหักเหรังสีเอกซ์โดยเครื่อง X-ray diffractometer ณ ปลายสถานีทดลอง Macromolecule Crystallography (MX) ของสถาบันวิจัยแสงซินโครตรอน ซึ่งแบบแผนการหักเหรังสีเอกซ์ที่ระดับ ความแยกแยะขนาด 2.3 อังสตรอม ได้ ถู ก น� ำ ไปประมวลผลเพื่ อ หากลุ ่ ม สมมาตรและขนาด Unit cell ของผลึก ซึ่งสามารถหาเฟสเริ่มต้นเพื่อวิเคราะห์ โครงสร้างสามมิติของเอนไซม์ได้
รูปที่ 4 แผนภาพความหนาแน่นอิเล็กตรอนของ เอนไซม์แมนแนนเนส
ดร. ชมภูนุช ส่งสิริฤทธิกุล1, ดร. วราภรณ์ ตัณฑนุช1, นางสาวศศิธร ลาภบุญเรือง1, ดร. สิทธิรักษ์ รอยตระกูล2 นายบัญชา บูรณะบัญญัต3ิ , รศ. ดร. มณฑารพ ยมาภัย3 และ Prof. Dietmar Haltrich4 1 สถาบันวิจัยแสงซินโครตรอน (องค์การมหาชน) 2 สถาบันจีโนม ศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ 3 สาขาวิชาเทคโนโลยีชีวภาพ ส�ำนักวิชาเทคโนโลยีการเกษตร มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีสุรนารี 4 University of Natural Resources and Applied Life Sciences, Vienna, Austria เอกสารอ้างอิง 1. Songsiriritthigul, C, Lapboonrueng, S, Roytrakul, S, Haltrich, D, Yamabhai, M. "Crystallization and Preliminary Crystallographic Analysis of β-Mannanase from Bacillus licheniformis". Acta Cryst. 2011; F67: 217–220. 2. Yamabhai M, Buranabanyat B, Jaruseranee N, Songsiriritthigul C. "Efficient E. coli expression systems for the production of recombinant β -man nanases and other bacterial extracellular enzymes". Bio Bugs. 2011; 2:1, 1-5. 3. Songsiriritthigul, C, Lapboonrueng, S, Roytrakul, S, Haltrich, D, Yamabhai, M. "Crystallization and Preliminary Crystallographic Analysis of β -Mannanase from Bacillus licheniformis". Acta Cryst. 2011; F67: 217–220. 4. Lapboonrueng, S, Songsiriritthigul, C, Tanthanuch, W, Roytrakul, S, Haltrich, D, Yamabhai, M. "Structural analysis of β -mannanase from Bacillus licheniformis". Proceeding of The 3rd BMB International Conference “From Basic to Translational Researches for a Better Life”; The Empress Convention Centre, Chiangmai, Thailand, 6th-8th April, 2011. 5. Songsiriritthigul C, Buranabanyat B, Haltrich D, Yamabhai M. "Efficient recombinant expression and secretion of a thermostable GH26 mannan endo-1,4- β -mannosidase from Bacil us licheniformis in Escherichia coli". Microb Cell Fact. 2010; 9(20). doi:10.1186/1475-2859-9-20. 6. Yamabhai M, Emrat S, Sukasem S, Pesatcha P, Jaruseranee N, Buranabanyat B. "Secretion of recombinant Bacillus hydrolytic enzymes using Escherichia coli expression systems". J. Biotechnol. 2008; 133(1): 50–7.