I-03 - Gardner&Peel_Port

Texto traduzido e impresso com a autorizaçao do John Scott & Co. de Gardner, J. & Peel, M. (1998) Sterilization, Desinfection and Infection Control, tercera edición, Churchill Livingstone. 179192

AVALIAÇÃO DOS DESINFETANTES O perfil completo de um desinfetante químico inclui as informações sobre os tipos e espécies de microorganismos suscetíveis, a influência do material orgânico e de outros materiais ou condições de uso sobre seu desempenho e os conselhos relativos aos efeitos adversos nos materiais ou pessoas. Esses aspectos já foram discutidos, e os tipos de testes microbiológicos, usados para investigar o índice da ação biocida e determinar as concentrações eficazes para o uso de um desinfetante, estão definidos nesta seção. Os desinfetantes químicos não podem ser avaliados com base na quantidade do agente ativo, pois isso não permite alterações na atividade biocida, que possam ser resultantes das interações com outros componentes da formulação ou da influência da diluição, do pH, do material orgânico e de outros materiais.

Os testes microbiológicos requerem habilidades técnicas, combinadas com a prática regular, e devem ser executados somente nos laboratórios de controle de qualidade do fabricante, em laboratórios independentes autorizados ou em um laboratório de uma autoridade regulatória. Os testes de desinfetante, em hospitais, devem ser limitados ao desempenho do teste em uso, descrito anteriormente neste capítulo.

Todos os desinfetantes indicados para o uso em objetos inanimados, pele intacta ou membranas mucosas devem ser testados quanto à ação biocida. A inibição reversível do crescimento (biostase) não é relevante para a avaliação dos desinfetantes.

álcool, em uma mistura de água e álcool, também pode ser expressa como uma porcentagem p/p. A concentração normalmente recomendada é de álcool etílico a 70%, originalmente referida como p/p; 70% p/p é equivalente a 77% v/v, e 80% v/v é recomendado para a maioria dos usos.

Porcentagem peso/volume (p/v) A concentração de aldeídos, clorexidina e QACs é expressa como uma porcentagem p/v (gramas de agente ativo por 100 ml de solução). Esse método deve ser usado para soluções estoque concentradas, como também para diluições de uso. Se a solução estoque de clorexidina a 20% p/v for diluída por um fator de 1 em 200 v/v, a concentração na solução diluída é de 0,1% p/v.

Porcentagem volume/volume (v/v) As formulações fenólicas e outros desinfetantes, que contêm vários ingredientes ativos, são diluídas por volume.

O fator de diluição pode ser expresso como uma porcentagem v/v, 1 em X ou 1:X. A porcentagem v/v se refere ao ml da solução concentrada por 100 ml de solução diluída. Um em X significa que 1 ml da solução concentrada forma um volume total de X ml. Um:X significa que 1 ml da solução concentrada é adicionado a X ml de diluente, compondo um volume total de X + 1 ml. O rótulo de uma solução diluída deve identificar a solução original e indicar qual método foi empregado para expressar a diluição.

Expressão das concentrações de desinfetantes Como todos os testes são executados em uma ou mais concentrações especificadas do desinfetante, e as recomendações para esse uso estão declaradas em termos de concentração e tempo, é importante que os diferentes modos, nos quais as concentrações (ou diluições) podem ser expressas, sejam compreendidos.

Porcentagem peso/peso (p/p) O teor de cloro disponível de um desinfetante de cloro em pó, puro ou misturado com substâncias inativas, é expresso como grama por 100 g de pó. A concentração de

Os cálculos envolvidos na preparação das soluções de diluição podem ser cansativos e demandar tempo.

A seguinte fórmula pode ser útil: se a solução concentrada contiver X% (p/v ou v/v) de substância ativa e for necessária uma solução mais diluída, contendo Y%, o y ml da solução concentrada deve ser medido e completado para um volume final de X ml. Por exemplo, se X for 10% p/v e se deseja somente 1%, 1 ml de X poderia ser composto para um volume total de 10 ml.

Testes bactericidas

I – 3.1

Um teste bactericida deve incluir a seguinte seqüência de etapas: 1. O organismo de teste é exposto a uma concentração adequada de desinfetante.

2. As amostras são obtidas em tempos especificados e imediatamente adicionadas a um diluente ou meio de cultura, que contenha o inativante de desinfetante apropriado.

3. A cultura das amostras é feita para verificação dos organismos sobreviventes.

Os desinfetantes de uso geral são submetidos a testes contra espécies selecionadas gram-positivas e gramnegativas através de métodos oficialmente reconhecidos ou recomendados pela autoridade regulatória. A seguinte descrição dos reagentes e das técnicas possui aplicação geral. Uma descrição mais detalhada de alguns testespadrão será apresentada nesse documento.

Organismos de teste As cepas especificadas de S. aureus, P. aeruginosa, Proteus vulgaris e E. coli são geralmente recomendadas.

Uma espécie simples ou uma espécie gram-positiva e gram-negativa pode ser selecionada, se um teste preliminar de triagem bactericida ou bacteriostático for realizado para determinar qual é a amostra mais resistente ao desinfetante a ser testado. Outras espécies ou cepas de bactérias, que são a causa de contaminação ou infecção em hospitais, podem ser incluídas.

Preparação do inóculo Os organismos de teste são conservados, como culturas liofilizadas, em ampolas de vidro seladas.

Essas ampolas são abertas, conforme necessário, para inocular as inclinações de ágar nutriente, que são incubadas por 24 horas. As inclinações podem ser mantidas no refrigerador por um mês, como as culturas estoque de trabalho. Um caldo sintético (Wright & Mundy, 1960) é recomendado para a preparação de uma série de subculturas diárias, que serão usadas no teste. As culturas recém-preparadas, da quinta à décima quinta em uma série, podem ser usadas em um teste.

A cultura de caldo de 24 horas pode ser usada sem tratamento adicional; entretanto, ela é normalmente filtrada, se necessário, para remover o visgo, e centrifugada para eliminar os elementos remanescentes no meio de cultura. As bactérias lavadas são ressuspensas

em água dura (dureza de 342 p.p.m.), à qual a levedura ou soro autoclavado(a) pode ser adicionado(a) para simular as condições de uso em sujeira. Finalmente, a suspensão é agitada com pérolas de vidro ou em um misturador por vórtex, e uma contagem viável é imediatamente estabelecida antes da realização do teste.

Testes de suspensão e de superfície A suspensão das bactérias pode ser adicionada diretamente ao desinfetante ou seca em pequenos transportadores de vidro, aço inoxidável ou porcelana, conforme apropriado para os artigos ou superfícies nas quais o desinfetante será usado. Embora os testes de suspensão possam favorecer o desinfetante, pois as bactérias são expostas de maneira uniforme, eles fornecem os resultados mais reprodutíveis. O nível de desafio pode ser ajustado para representar as condições de uso, variando o tamanho do inóculo e o tipo e quantidade de matéria orgânica incluída. Em um teste de capacidade (Cantor & Shelanski, 1951), o desinfetante é repetidamente desafiado por adições sucessivas de suspensão bacteriana, até sua capacidade de exterminação ser esgotada.

Os testes de desinfecção de superfície são mais realísticos que os de suspensão, na simulação das condições de uso, porém os reagentes e as condições são mais difíceis de padronizar, e os resultados são menos reprodutíveis. Os testes de desinfecção de superfície possuem uma séria desvantagem, pois não fazem a distinção entre a ação bactericida e a remoção das bactérias dos transportadores durante a imersão no desinfetante, diluente ou inativante.

O controle do número de bactérias expostas ao desinfetante também é difícil de ser feito.

Inativantes de desinfetantes A validade dos testes de desinfetantes depende da interrupção imediata da ação bactericida nas amostras, que foram obtidas para a detecção e enumeração das bactérias sobreviventes. Também é necessário evitar a ação bacteriostática no meio de recuperação, ocasionada pela pequena quantidade de desinfetante transportada pela amostra. Se os sobreviventes forem analisados pela contagem de placas, o inativante apropriado é adicionado ao diluente usado para preparar as diluições das amostras para contagem. O meio de recuperação conterá o inativante, se as amostras forem adicionadas a ele diretamente.

I – 3.2

Um detergente aniônico, tal como o polisorbato 80 (Tween 80), pode ser usado sozinho em uma concentração alta ou em combinação com a lecitina em uma concentração mais baixa, para inativar os compostos de amônio quaternário, a clorexidina e os compostos fenólicos substitutos (sintéticos). A lecitina de ovo ou de soja, com 90% de pureza, deve ser usada; é insolúvel em água, porém pode ser dispersa, misturando-a com detergente aquecido, e adicionada antes de a solução ser composta para o volume. A lecitina produz a turvação do meio, que pode interferir na detecção do crescimento devido à turbidez.

O tiosulfato de sódio inativa o cloro e os desinfetantes de iodo, porém inibe o estafilococo; a concentração no meio de recuperação não deve exceder a 0,1% p/v (Kayser & van der Ploeg, 1965; Gross et al, 1973). Green & Litsky (1974) adicionou sulfito de sódio a 0,1% a um meio de ágar e concluiu que é menos tóxico para as bactérias que o tiosulfato. Entretanto, as concentrações baixas de cloro e iodo são inativadas pelas proteínas nos caldos nutrientes, sem a necessidade da adição de um inativante específico (MacKinnon, 1974).

Os desinfetantes, que contêm formaldeído ou glutaraldeído, são difíceis de inativar devido ao excesso de bissulfito de sódio, necessário para inibir o crescimento das bactérias e a germinação dos esporos. A glicina (1% p/v) foi superior aos outros inativantes de glutaraldeído testados por Gorman & Scott (1976). Entretanto, Cheung & Brown (1982) concluíram que a glicina a 1% não inativou o glutaraldeído alcalino a 0,5% p/v e recomendaram que a concentração de glicina de, no mínimo, 2% p/v fosse usada para inativar eficazmente o glutaraldeído a 2 %.

Cada teste deve incluir controles para demonstrar que o desinfetante foi inativado e que o inativante não exterminou ou inibiu o organismo de teste.

Preparação do desinfetante As concentrações ou diluições do desinfetante a ser testado podem ser baseadas nas recomendações de uso do fabricante, porém um teste preliminar é normalmente necessário, a fim de determinar uma faixa adequada para os testes. As soluções devem ser preparadas no dia do teste, a menos que o efeito do envelhecimento seja pesquisado. A água destilada ou a água dura padrão OMS (342 p.p.m.) é usada para a preparação das soluções; a água de torneira não é adequada, pois contém produtos químicos que podem precipitar alguns desinfetantes (por exemplo, a clorexidina).

Recuperação de bactérias sobreviventes O meio utilizado para a cultura das bactérias sobreviventes à exposição ao desinfetante, mas que talvez tenham sido danificadas, deve ser especialmente favorável para o crescimento e não apresentar traços de substâncias inibidoras. Um caldo de carne ou ágar nutriente de boa qualidade é normalmente usado. Um inativante atóxico (por exemplo, um detergente aniônico) pode ser incluído em um meio líquido de recuperação. Uma temperatura baixa de incubação (32 ºC) pode aumentar o número de sobreviventes recuperados. As culturas devem ser incubadas por 48 horas.

A exterminação de todos os microorganismos adicionados ao desinfetante não pode ser comprovada. Os testes bactericidas podem ser projetados para seguir o processo de exterminação por contagem de placas, até que as diluições produzam contagens que não são mais exatas.

Uma redução de 99,9999% (seis logaritmos) para o inóculo pode ser determinada, contanto que a contagem 9 bactericida inicial seja, no mínimo, de 10 por ml de desinfetante. Se esse nível for atingido em 30 minutos, o desempenho é geralmente considerado satisfatório. Uma curva do índice de morte pode ser preparada, traçando uma série da contagem de sobreviventes em comparação com os tempos nos quais as amostras foram obtidas.

Um sistema alternativo utiliza o método de Número Mais Provável (NMP) da estimativa do número das bactérias viáveis. Um volume igual de amostra (por exemplo, 0,02 ml) é adicionado a cada tubo em um conjunto de repetições, contendo o meio líquido de recuperação.

Quando algumas culturas positivas e negativas são observadas em um conjunto, é provável que o volume de amostra adicionado em cada tubo positivo contenha em média um sobrevivente. A porcentagem de exterminação pode ser calculada a partir do número de bactérias adicionadas ao desinfetante. O método NMP é mais sensível que os métodos de contagem de placas para a detecção do ponto final, porém não mede o progresso da ação bactericida. Uma curva do índice de morte não pode ser preparada por esse método, porém a redução geral pode ser calculada.

Testes de suspensão quantitativa do British Standard O primeiro teste de suspensão quantitativa do British Standard foi projetado para a avaliação dos QACs e publicado em 1960 (BS 3286). O desempenho desse teste encontra-se ilustrado na Figura 11.3. Ele foi projetado quando percebeu-se a necessidade de usar um inativante

I – 3.3

de desinfetante, a fim de distinguir a ação bactericida do alto nível da atividade bacteriostática, que é característica da diluição dos QACs. O teste é aplicável para outros bactericidas, tais como a clorexidina e os fenólicos sintéticos, e também para testar a ação esporicida, se os tempos de contato forem prolongados. O inativante para esses desinfetantes contém lecitina a 2% e detergente aniônico a 3% (por exemplo, polisorbato 80). Um protocolo para que os controles possam demonstrar que a inativação foi obtida e que o inativante não é bacteriostático encontrase incluso. O teste pode ser realizado com ou sem a inclusão de um desafio de matéria orgânica e em suspensões de bactérias gram-positivas e gram-negativas selecionadas, conforme apropriadas para o uso indicado do produto a ser testado. Se uma série de amostras for obtida de uma diluição do desinfetante, contendo bactérias 8 9 de 5 x 10 a 5 x 10 por ml no início do teste, a curva do índice de morte pode ser preparada a partir da contagem da colônia do meio de recuperação, que contém o ágar, e 6 os fatores de redução de até 10 (99,9999% de exterminação) podem ser verificados.

O teste para os desinfetantes de amônio quaternário foram revisados em 1984 (BS 6471). O objetivo é determinar o valor antimicrobiano das formulações, contendo QAC como

a maior diluição (concentração mais baixa) do produto que, segundo as condições de teste descritas, reduzirá a população microbiana para uma contagem de colônia que não será maior que 0,01% daquela no controle. O princípio do teste é o mesmo do padrão original, porém um único organismo de teste (E. coli ATCC 11229, NCIB 9517) e um tempo único de contato de 600 ± 5 segundos são especificados. O meio de desafio é uma cultura de caldo diluída do organismo de teste, na qual foi adicionado um volume igual de soro de cavalo. Um ml é adicionado a 9 ml de cada diluição do desinfetante e também aos dois tubos de controle, que contêm somente os 9 ml de diluente. Ao final do período de exposição, é adicionado 1 ml de cada mistura a 9 ml do inativante, e as bactérias sobreviventes são contadas como unidades formadoras de colônia nas placas de ágar. Se a potência dos produtos que serão testados não for conhecida, uma série de diluições é testada para determinar a diluição que atingirá o objetivo de redução da contagem da colônia para 0,01% do controle. Foi feita uma emenda ao BS 6471, com relação aos padrões de repetibilidade e reprodutibilidade do teste.

O desempenho do produto é comparado com as diluiçõespadrão de brometo de dodecildimetil-2-fenoxietil-amônio (75 mg/l e 125 mg/l), o QAC de referência.

Diluição de 10 partes

Suspensão bacteriana

Desinfetante (concentração dupla) 5 ml

Tubos de diluição 4,5 ml

Inativante 9 ml

54 colônias

5 colônias

Sem crescimento

Ágar Nutriente - contagem das colônias Figura 11.3 Diagrama do procedimento de teste da British Standards Institution (BS 3286, 1960) para avaliação dos desinfetantes, usando um teste de suspensão quantitativa.

Teste de Kelsey-Sykes (Kelsey & Maurer, 1974) O teste de Kelsey-Sykes é um teste triplo da capacidade de desafio, elaborado para determinar as concentrações de um desinfetante, que serão eficazes em condições de limpeza e sujeira. O desinfetante é desafiado por três

adições sucessivas de uma suspensão bacteriana; durante a realização do teste, que leva apenas 30 minutos para ser realizado, a concentração do desinfetante é reduzida pela metade, e o material orgânico (células de levedura autoclavadas) se forma em uma concentração final de 0,5% (peso seco). Com isso, é feita a simulação das

I – 3.4

condições que são relevantes aos vários usos em hospitais e laboratórios. Um único organismo de teste pode ser selecionado de S. aureus NCTC 4163, P. aeruginosa NCTC 6749, P. vulgaris NCTC 4635 e E. coli NCTC 8196, comparando a concentração mínima inibidora do desinfetante para cada organismo. P. aeruginosa NCTC 6749 é normalmente mais resistente à clorexidina e QACs, porém S. aureus NCTC 4163 pode ser mais resistente aos fenólicos. O BS 6905 (1987, 1993) fornece os detalhes do teste, e a Figura 11.4 ilustra o procedimento.

Os três conjuntos das cinco repetições de culturas, que correspondem a cada desafio, são incubados a 32 ºC por 48 horas e o crescimento é avaliado através da turbidez.

Os conjuntos, que contêm duas ou mais culturas negativas, são registrados como resultado negativo. O desinfetante passa no teste por causa da diluição testada, se os resultados negativos forem obtidos após o primeiro e

Desinfetante 3 ml

Suspensão bacteriana 10 ml 8 min 0,02 ml/tubo

segundo desafios. O terceiro desafio não está incluso no critério de passa/falha, porém as culturas positivas servem de controle embutido, demonstrando que o meio de recuperação é capaz de propiciar o crescimento de um pequeno número de bactérias, que foram realmente expostas ao desinfetante. Se não houver nenhuma cultura positiva após o terceiro desafio, uma concentração mais baixa de desinfetante deve ser testada.

Nos testes de desenvolvimento de produto, três concentrações de desinfetante devem ser operadas simultaneamente, e testes em separados são necessários para cada organismo nas condições de limpeza e sujeira.

Todos os testes devem ser repetidos separadamente durante três dias, com suspensões bacterianas recémpreparadas e desinfetante recém-diluído - todos os testes devem obter êxito. Os resultados das amostras encontramse na Tabela 11.4.

18 min 0,02 ml/tubo

28 min 0,02 ml/tubo

Figura 11.4 Diagrama do procedimento de teste de capacidade de Kelsey-Sykes para desinfetantes em geral (Kelsey & Maurer, 1974).

Tabela 11.4 Resultado da amostra de um teste de Kelsey-Sykes em fenólico solúvel transparente com P. aeruginosa como organismo de teste, na presença de levedura (condições de sujeira).

Concentração (% v/v)

Inóculo (contagem por ml)

1,0

2 x 10

1,5 2,0

o

Desafio N

Resultado

1

2

3

9

+++++

+++++

+++++

Falha

9

- - - -+

- - +++

+++++

Passa

9

-----

-----

----+

Passa

2 x 10 2 x 10

Teste de Estabilidade e Eficácia a Longo Prazo (Maurer, 1969) As concentrações recomendadas, com base no teste de Kelsey-Sykes, se aplicam somente às soluções recentemente preparadas, porém se houver a probabilidade de as soluções serem mantidas por mais de

24 horas, a eficácia dessas concentrações deve ser confirmada, por um teste complementar, para verificação da estabilidade da solução não-utilizada e da capacidade das soluções recentemente preparadas e envelhecidas em

I – 3.5

evitar a multiplicação de um pequeno número de bactérias, que possam ter sobrevivido à exposição a curto prazo. P.

concentração mais alta de desinfetante deve ser testada da mesma forma. O teste de estabilidade e eficácia a longo prazo encontra-se ilustrado na Figura 11.5.

aeruginosa NCTC 6749 é usada como organismo de teste.

Testes AOAC para desinfetantes É preparada uma solução de desinfetante suficiente para os dois testes. Uma parte é inoculada imediatamente e testada quanto ao crescimento, após ser mantida por 7 dias à temperatura ambiente. A outra parte é mantida à temperatura ambiente por 7 dias e, então, inoculada com uma suspensão do organismo de teste recentemente preparada. Também é testada quanto ao crescimento 7 dias após a inoculação. Se for detectado crescimento, uma

1 ml

Suspensão bacteriana Estágio 1

Os métodos aprovados pela Association of Official Analytical Chemists (AOAC) são reconhecidos oficialmente para os testes de desinfetantes nos Estados Unidos.

Alguns dos testes de suspensão e de desinfecção de superfícies encontram-se listados na Tabela 11.5, juntamente com os organismos de teste e níveis de resistência especificados.

Amostras 7 dias após inoculação 1 gota (0,02 ml)/tubo

Desinfetante 9 ml

1 ml

Meio de cultura neutralizante

Amostras 7 dias após inoculação 1 gota (0,02 ml)/tubo

Suspensão Desinfetante bacteriana 9 ml

Desinfetante recém-diluído

Estágio 2

Meio de cultura neutralizante

Diluição de desinfetante armazenada por 7 dias antes da inoculação

Figura 11.5 Diagrama do procedimento de teste de Maurer para verificação da estabilidade e eficácia a longo prazo dos desinfetantes químicos (Maurer, 1969).

Tabela 11.5 Testes aprovados pela Association of Official Analytical Chemists (Beloian 1995) Nome do teste

Tipo do teste

Organismos de teste

Padrão de resistência

Métodos de coeficiente de fenol

Suspensão

S. Typhi ATCC 6539 S. aureus ATCC 6538 P. aeruginosa ATCC 15442

Fenol, 1:90, 1:100 Fenol, 1:60, 1:70 Fenol, 1:80, 1:90

Métodos de teste de transportador de superfície dura

Superfície (transportadores de vidro descartáveis)

S. Choleraesuis ATCC 10708 S. aureus ATCC 6538 P. aeruginosa ATCC 15442

Idem acima

Concentração equivalente de clorogermicida (disponível)

Suspensão (teste de capacidade)

S. Typhi ATCC 6539 e/ou S. aureus ATCC 6538

Hipocloreto de sódio 200, 100 & cloro disponível de 50 p.p.m.

Atividade esporicida

Superfície (cilindros de porcelana, alças de sutura de seda)

B. subtilis ATCC 19659 C. sporogenes ATCC 3584

Ácido clorídrico, 2,5N

Atividade tuberculocida

Superfície (cilindros de porcelana)

M. smegmatis PRD No. 1 (teste presumível) M. bovis (BCG) (teste confirmatório)

Fenol, 1:50, 1:75

Atividade fungicida

Suspensão (conídios)

T. mentagrophytes (ex. ATCC 9533)

Fenol, 1:60, 1;70

I – 3.6

Métodos de coeficiente de fenol O principio do teste de coeficiente de fenol é originário do teste de Rideal-Walker que, quando introduzido em 1908, tinha a distinção de ser o mais recente teste quantitativo para a avaliação dos desinfetantes fenólicos de alcatrão em uso no momento. Entretanto, com um único organismo de teste, sem proporcionar a neutralização dos efeitos bacteriostáticos e sem o desafio de material orgânico, o teste de Rideal-Walker era inadequado para a avaliação dos QACs e de outros desinfetantes, que manifestam atividade bacteriostática em alta diluição. O teste AOAC leva em consideração essas deficiências ao adicionar dois organismos de teste, que são melhores representantes que o Salmonella Typhi original entre os agentes causadores de infecções atualmente, e ao incluir os inativantes de desinfetante no meio de recuperação. O material orgânico é limitado às proteínas e peptonas no caldo nutriente. O "Letheen broth" que contém inativantes - lecitina (0,7 g/l) e polisorbato 80 (5 g/l) - é o meio de recuperação mais comum, porém o caldo nutriente ou o caldo de tioglicolato (também com inativantes) pode ser usado. Em testes em separado, as culturas bacterianas são adicionadas a diluições-padrão de fenol puro e várias diluições do desinfetante testado. Após os tempos de contato de 5, 10 e 15 minutos, as amostras são transferidas para o meio de recuperação através de uma alça de arame padrão.

Quando as culturas positivas e negativas forem registradas, o resultado do teste será expresso como um coeficiente de fenol, calculado pela divisão do denominador, que expressa a maior diluição (menor concentração) do desinfetante para exterminar o inóculo de teste em 10 minutos, mas não em 5 minutos, pela diluição de fenol que dá o mesmo resultado. Por exemplo, se uma diluição de 1:350 do produto se iguala ao desempenho de uma diluição de 1:90 de fenol, o coeficiente de fenol seria 350/90 = 3,89, registrado como 3,9.

superfície de papel filtro e secos a 37 ºC, por 40 minutos, antes do início do teste. Então são adicionados, um por vez, aos tubos contendo a diluição de desinfetante. Após um tempo de contato de 10 minutos, cada cilindro é transferido para o meio de recuperação apropriado e incubado pelo período prescrito. Um resultado, que não mostre nenhum crescimento em todos os 10 tubos, confirma o resultado do teste de coeficiente de fenol. Se um transportador produzir crescimento, o teste deve ser repetido, usando uma diluição menor (concentração mais alta) do desinfetante de teste.

Concentração equivalente de clorogermicida (disponível) O teste para a concentração equivalente de clorogermicida (disponível) se aplica especificamente ao uso dos desinfetantes à base de cloro em superfícies não-porosas e previamente limpas. Único entre o repertório da AOAC, é um teste de capacidade, no qual um volume de desinfetante é desafiado por adições sucessivas de culturas de teste, S. Typhi ou S. aureus. O teste é realizado com dez adições sucessivas de cultura de teste a cada uma das três soluções-padrão de hipocloreto de sódio, a concentrações de 200, 100 e 50 p.p.m. de cloro disponível. Um minuto após cada adição, uma amostra é transferida para o meio de subcultura e é feita a próxima adição, 1,5 minuto após a primeira. O desinfetante, na concentração recomendada, é então testado da mesma forma. Na atividade de desinfecção, o produto deve produzir culturas negativas no mesmo número de tubos consecutivos nas séries de subculturas, como acontece com o padrão de 200 p.p.m, para obter a equivalência ao cloro disponível de 200 p.p.m. O mesmo se aplica aos padrões de 100 e 50 p.p.m. A validade dos testes depende da resistência da cultura de teste, de maneira que o padrão de 50 p.p.m. produza, no mínimo, uma cultura negativa e o padrão de 200 p.p.m., uma cultura positiva.

Métodos de teste de transportador de superfície dura Atividade esporicida Para confirmar, na prática, a eficiência de uma diluição de desinfetante originado do teste de coeficiente de fenol, deve ser realizado um teste de desinfecção de superfície com diluição de uso. Três organismos de teste são usados, S. Choleraesuis substituindo S. Typhi. Os transportadores de vidro descartáveis (uso único) de borosilicato são preparados para o uso, primeiro enxaguando em água e álcool etílico. Então eles são imersos em água e esterilizados por autoclave. Os transportadores são resfriados antes da imersão em uma das culturas bacterianas. Os cilindros inoculados são drenados em uma

O teste esporicida utiliza duas amostras de bactérias formadoras de esporos, uma aeróbica e a outra anaeróbica (veja Tabela 11.5). Cada amostra é seca em 30 alças de sutura de seda e em 30 cilindros de porcelana, totalizando 120 transportadores. Os esporos devem sobreviver de 2 a 20 minutos no ácido clorídrico padrão (2,5 N). Os transportadores inoculados são adicionados, em seis grupos de cinco, a tubos separados do desinfetante sob teste e transferidos individualmente após um tempo de contato de 2 minutos com o meio de subcultura apropriado.

I – 3.7

Eles são incubados a 37 ºC por 21 dias. Se não ocorrer nenhum crescimento após esse período, os tubos são aquecidos a 80 ºC por 20 minutos e incubados novamente por mais três dias. Uma alegação da atividade esporicida é confirmada se não houver mais de duas culturas positivas entre 120; a esterilização pode ser alegada somente se todas as culturas dos dois esporos de teste, em ambos os tipos de transportador, forem negativos. Se o teste for realizado em um desinfetante gasoso, os transportadores secos e inoculados devem ser hidratados novamente através da imersão em água, por um curto período de tempo, antes do teste.

Atividade tuberculocida O teste tuberculocida é realizado em duas partes: um teste presumível contra Mycobacterium smegmatis e então um teste confirmatório, no qual o Mycobacterium bovis (BCG) é o organismo de teste. No primeiro teste, 30 ou mais cilindros de porcelana inoculados são imersos separadamente, por 10 minutos, em cada uma das três diluições de desinfetante amplamente espaçadas; a porcentagem de culturas negativas obtidas de cada diluição é traçada em um gráfico, e a linha de melhor correspondência é extrapolada para 99% de exterminação.

A diluição correspondente é usada no teste confirmatório.

Nesse último, grupos de dez transportadores inoculados são testados em comparação com as diluições-padrão de fenol e o produto que está sendo testado, por um tempo de contato de 10 minutos. Todos os transportadores de fenol a 1:50 devem produzir culturas negativas, e os de fenol a 1:75 devem produzir culturas positivas. A diluição máxima (concentração mais baixa) de desinfetante, que extermina o M. bovis (BCG) em dez transportadores, é considerada segura para a desinfecção tuberculocida.

Atividade fungicida Os microconídos produzidos pelo Trichophyton 6 mentagrophytes, de concentrações de 5 x 10 por ml, são usados no teste fungicida. Eles devem sobreviver a 10 minutos de exposição a uma diluição de 1:70 de fenol e serem exterminados pela diluição de 1:60. Os esporos são adicionados às diluições do fungicida por 5, 10 e 15 minutos e espera-se que a diluição mais alta, que os extermina em 10 minutos, desinfete as superfícies inanimadas contaminadas por fungos patogênicos.

As descrições anteriores de alguns testes AOAC não contêm os detalhes da preparação das culturas de teste, meios de culturas, aparelhos e procedimento que devem

ser estritamente observados no desempenho desses testes (Beloian, 1995).

Testes viricidas Os requisitos para os testes viricidas em laboratório são discutidos por Chen (1991). Essa discussão inclui o controle cuidadoso das variáveis, tais como tempo e temperatura, e a implementação da diluição ou outros procedimentos para superar os problemas de toxicidade residual do desinfetante, em amostras testadas quanto à inativação. É claro que a inativação completa dos vírus não pode ser testada, pois quantidades diferentes (e desconhecidas) de vírus dão início às infecções em hospedeiros diferentes. Por razões práticas, os vírus dos protótipos, como os que representam os grupos lipofílicos ou hidrofílicos, são geralmente selecionados para os testes. Acima de tudo, os resultados devem ser interpretados em termos de aplicações práticas do viricida.

Os testes de suspensão são geralmente favorecidos, pois muitos vírus são inativados pela secagem, porém o interesse pelos testes de desinfecção de superfície tem sido estimulado pela preocupação com relação às infecções virais, que podem ser propagadas pelas mãos ou fomitos. Um teste de superfície foi projetado por Tyler & Ayliffe (1987) e usado para comparar a ação de vários desinfetantes contra o vírus da herpes simples 1 e o poliovírus (Tyler et al, 1990). Nesse teste, o vírus cresce em uma monocamada das células dos rins de um filhote de hamster, incubada no meio de Eagle e complementada com caldo de fosfato triptose e soro de bezerro. Após a separação do vírus das células, através de um banho de ultra-som e centrifugação, quantidades de 10 µl de suspensão, que contém unidades formadores de placas de 9 3 x 10 , são secas sobre capas. Uma contagem inicial é estabelecida, e as capas inoculadas são colocadas em 5 ml de desinfetante por 1, 5 ou 10 minutos. Após a remoção, as capas são rapidamente enxaguadas, recebem o banho de ultra-som para dispersar os vírus de maneira uniforme, e o ensaio é realizado. Em um estudo preliminar, os resultados do teste demonstraram que o glutaraldeído alcalino a 2% p/v e o etanol ou isopropanol a 70% v/v foram eficazes contra os vírus da herpes, em um minuto. O hipocloreto (cloro disponível de 2500 p.p.m.) e o povidonaiodo (iodo a 1% disponível) foram mais lentos, requerendo 5 minutos, e os desinfetantes que continham fenóis, QACs ou clorexidina foram ineficazes em 10 minutos. Os álcoois acima de 95% também foram ineficazes.

Esse teste de superfície também tem sido utilizado para investigar a ação do álcool e do glutaraldeído sobre o HIV

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sem células e de células associadas, na presença ou ausência de soro seco (Hanson et al, 1989). O vírus de células livres foi inativado por glutaraldeído a 1 e 2% (p/v) em um minuto; o glutaraldeído a 2% inativou esse vírus no soro em 2 minutos, porém a 1% foi ineficaz. Nem o espírito metilado industrial a 70% v/v nem o álcool etílico foi eficaz e não puderam ser recomendados para a desinfecção de superfície do HIV. Embora o glutaraldeído a 2% tenha sido eficaz, não deve-se permitir que sua concentração seja diminúida ou que se torne envelhecido.

Springthorpe et al (1986) e Lloyd-Evans et al (1986) realizaram um estudo colaborativo, usando testes de suspensão e de superfície para verificar a ação de vários desinfetantes comuns sobre o rotavírus. Os desinfetantes foram desafiados pela inclusão de peptona ou fezes infantis diluídas em suspensão de vírus. Após a exposição ao desinfetante, por um minuto, a ação foi interrompida pela diluição, e os vírus sobreviventes foram estimados pelo ensaio de placas. Discos de vidro, aço inoxidável e de plástico liso e áspero foram inoculados com a suspensão de vírus para o teste de desinfecção de superfície. O tempo de contato foi de 1 minuto e, após a adição de um diluente de caldo para interromper a ação, o vírus foi decantado através do banho de ultra-som e então testado.

Em uma comparação dos resultados dos dois testes, o glutaraldeído a 2%, o álcool etílico a 70% e o álcool isopropílico a 70% foram eficazes contra o rotavírus, porém os outros desinfetantes testados não foram confiáveis ou foram ineficazes no teste de suspensão. O glutaraldeído também foi eficaz no teste de desinfecção de superfície, porém os álcoois não foram.

2. A desinfecção por água quente ou vapor puder ser realizada.

3. O uso de um agente antimicrobiano for desnecessário.

Todos os instrumentos, que penetram nos tecidos ou vasos sangüíneos ou que entram em contato com as delicadas membranas mucosas ou feridas, devem ser esterilizados. Alguns tipos de artigos podem ser desinfetados através da pasteurização; esse método também deve ser usado para a desinfecção de equipamentos de limpeza manual ou mecânica (por exemplo, esfregões, baldes e tanques de máquinas de esfregação úmida) e de frascos de armazenagem, quando forem cheios novamente com desinfetantes diluídos. As situações, nas quais o uso de um desinfetante químico é necessário, encontram-se exemplificadas pela limpeza geral do ambiente do hospital. Ayliffe et al (1967) e outros pesquisadores demonstraram que os benefícios de incluir um agente antibacteriano na solução de limpeza é restrito ao curto período de contato úmido. O desinfetante residual, que pode permanecer no piso, é inativo no estado seco e não retarda o índice ou diminui o nível de uma nova contaminação nas áreas, nas quais ocorrem movimentação descontrolada de pessoas e equipamentos.

Muito dos equipamentos usados nas alas do hospital, incluindo as incubadoras infantis, também podem se tornar seguros através de uma limpeza eficiente, a menos que tenham sido usados por um paciente infectado.

A próxima etapa em direção ao desenvolvimento de uma política é especificar os objetivos para os quais um desinfetante químico é necessário. Esses objetivos podem ser dividido em três categorias:

POLÍTICAS PARA A DESINFECÇÃO EM HOSPITAIS O conceito de formular uma política, para a seleção e aplicação dos desinfetantes químicos em hospitais, foi introduzido por Kelsey & Maurer (1967). Suas recomendações foram freqüentemente repetidas e reenfatizadas (Maurer, 1985; Ayliffe et al, 1993) e agora são amplamente praticadas para obter os benefícios de uma maior eficiência e reduzir os custos (Rutala, 1996).

O desenvolvimento de uma política adequada a um determinado hospital é iniciada através de uma abrangente pesquisa de todos os departamentos e preparo de uma lista de produtos atualmente adquiridos, bem como da finalidade para a qual serão usados. As concentrações em uso também devem ser observadas. A lista fornece uma base para eliminar o uso de desinfetantes quando: 1. A esterilização for necessária.

1. Desinfecção dos equipamentos hospitalares.

2. Desinfecção do ambiente hospitalar.

3. Desinfecção da pele e membranas mucosas.

A escolha de um tipo de desinfetante apropriado para cada objetivo e da concentração, na qual deve ser usado, pode ser feita agora. Nenhum tipo é adequado para todos os propósitos, porém o objetivo é reduzir o número de produtos e diferentes concentrações para o mínimo possível.

Desinfecção dos equipamentos hospitalares Um desinfetante fenólico é apropriado para a descontaminação dos instrumentos usados (com a exceção daqueles que são contaminados com sangue ou exsudato e que podem conter vírus da hepatite ou HIV) e para o uso em frascos descartáveis de boca larga nos

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laboratórios bacteriológicos. Quando a presença dos vírus citados acima for considerada um risco, um desinfetante de cloro usado a uma concentração de cloro disponível a 0,5 a 1% (5000 a 10000 p.p.m.) é recomendada (como para desinfecção de artigos manchados de sangue e que suportam altas concentrações). O glutaraldeído alcalino deve ser substituído no caso de instrumentos de metal.

A clorexidina alcoólica, o PVP-I alcoólico ou o PVP-I aquoso são usados para reduzir a baixos níveis as bactérias residentes na pele das mãos dos cirurgiões e nos sítios de operação dos pacientes. A povidona-iodo, que possui um espectro de ação antimicrobiana mais amplo que a clorexidina, pode ser mais eficaz para o uso nos sítios de venipuntura.

A desinfecção com glutaraldeído também é recomendada para os instrumentos endoscópicos, tais como os broncoscópios e os gastroscópios, no curto período de tempo disponível entre o uso do mesmo instrumento em sucessivos pacientes. Esses instrumentos podem ser esterilizados no sistema Steris por ácido peracético, em cerca de 20 minutos. Quando há tempo disponível, os endoscópios podem ser esterilizados por óxido de etileno ou plasma de gás. A imersão dos endoscópios em glutaraldeído a 2 % por 3 horas é um meio aceitável de esterilização, se nenhuma outra alternativa estiver disponível (Ayliffe et al, 1993). Um desinfetante fraco à base de cloro (125 p.p.m.) é usado para as incubadoras infantis, após o uso por um bebê infectado.

Os limpadores de pele de hexaclorofeno foram amplamente usados para o cuidado antiestafilocócico da pele neonatal, porém seu uso diminuiu drasticamente desde que sua toxicidade sistêmica foi descoberta. A clorexidina e o triclosan são usados como substitutos.

As soluções aquosas fracas de gluconato de clorexidina podem ser usadas para a irrigação da bexiga; os álcoois são muito tóxicos para serem usados nas membranas mucosas. A desinfecção da pele e membrana mucosa encontra-se discutida no Capítulo 12.

Desinfecção do ambiente hospitalar Um desinfetante fenólico ou um componente de cloro é adequado para a desinfecção de pisos, paredes, móveis e conexões em áreas, nas quais o imunodeficiente ou outros pacientes suscetíveis são assistidos por enfermeiras(os) e para as áreas contaminadas em outros locais, dependendo dos tipos de microorganismos provavelmente presentes.

Os fenólicos são normalmente recomendados, porém um preparado forte de cloro (5000 a 10000 p.p.m.) deve ser usado para a limpeza de respingos de sangue. As concentrações mais baixas de cloro disponível (por exemplo, 500 p.p.m.) são adequadas para a desinfecção de camas, banheiros ou torneiras, e as de 200 p.p.m. são suficientes para a sanitização de bancadas limpas da cozinha do hospital. O álcool etílico, na concentração usual a 80% v/v, pode ser usado nas superfícies superiores dos carrinhos e superfícies similares, que foram limpas fisicamente.

Desinfecção da pele e membranas mucosas Os limpadores bactericidas para pele e que contêm clorexidina, povidona-iodo (PVP-I) ou triclosan podem ser usados para a lavagem higiênica das mãos; a finalidade é exterminar e remover os contaminantes temporários. A clorexidina alcoólica pode ser usada como enxágüe ou "esfregação" entre os pacientes, se a mãos não estiverem contaminadas ou visivelmente sujas.

Administração de uma política de desinfecção A implementação bem-sucedida de uma política de desinfecção depende da disponibilidade de informações para a equipe hospitalar, especialmente para as pessoas responsáveis por colocá-la em prática ou supervisionar as pessoas que o farão. A responsabilidade por preparar as diluições deve ser centralizada e estar sob a supervisão de um farmacêutico. As soluções, que são distribuídas para as alas e departamentos, devem estar prontas para o uso e claramente rotuladas para identificar o tipo de desinfetante. A concentração deve estar indicada como peso/volume (p/v) sempre que possível; se isso não puder ser feito, a identidade da solução concentrada deve estar indicada juntamente com o grau de diluição por volume (v/v). Todas as precauções discutidas nesse capítulo devem ser tomadas durante a preparação e uso das soluções, para evitar o acesso aos contaminantes bacterianos e evitar a sua multiplicação. As soluções novas devem ser preparadas diariamente, sempre que possível, ou usar soluções esterilizadas previamente.

Seleção dos tipos e marcas de desinfetantes A política de desinfecção deve incluir instruções claras com relação aos tipos e marcas dos produtos selecionados para o uso. Um produto alternativo pode ser designado na política, porém alterações não podem ser feitas, a menos que sejam autorizadas pelo Infection Control Committee. A equipe do hospital, em vários níveis e em vários departamentos, está sujeita à pressão dos representantes dos fabricantes para experimentarem um novo produto, porém as alegações devem ser validadas por um

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especialista antes de um desinfetante, que está desempenhando satisfatoriamente conforme indicado pelo teste normal em uso, seja substituído. Mesmo que os testes em uso revelem que uma solução promoveu o crescimento de bactérias, a causa pode estar nos métodos de preparação ou uso e não relacionada à deficiência do produto. Às vezes é difícil para a equipe do hospital interpretar as informações fornecidas pelo fabricante, ao validar um novo produto, e o conselho de um microbiologista, que entende o método de avaliação que deve ser seguido. O problema pode ser esclarecido facilmente, se existir um requisito padrão para o desempenho dos desinfetantes de grau hospitalar. Qualquer desinfetante que tenha passado no teste de capacidade de Kelsey-Sykes, realizado em um laboratório de teste autorizado, resultará em um desempenho satisfatório da ação bactericida nas concentrações recomendadas para o uso em condições de limpeza e sujeira. A seleção de um tipo ou marca pode, então, ser feita com base em outras propriedades, tais como compatibilidade com os materiais com os quais pode entrar em contato durante o uso, ou o risco ao usuário ou aos artigos tratados. O custo-benefício sempre é um fator decisivo quando dois produtos são similares em outros aspectos. Não é prudente que os bacterioligistas tentem fazer avaliações ocasionais em laboratórios hospitalares porque são necessárias habilidades especiais e prática regular para tal.

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