Texto traduzido e impresso com a autorizaçao do Blackwell Science LTD. de Journal of Applied Microbiology 1997, 82, 552-556
Indicadores biológicos para esterilização por formaldeído ou vapor a baixa temperatura: o efeito das variações nas condições de recuperação sobre a resposta dos esporos de Bacillus stearothermophilus NCIMB 8224 ao formaldeído e vapor a baixa temperatura A.M. Wright1, E.V. Hoxey2, C.J. Soper* e D.J.G. Davies School of Pharmacy and Pharmacology, University of Bath, Bath, Reino Unido 5830/06/96: recebido em 26 de junho de 1996, revisado em 13 de setembro de 1996 e aceito em 23 de setembro de 1996 A.M. WRIGHT, E. V. HOXEY , C.J. SOPER E D.J.G. DAVIES,
1997. Os esporos de uma cepa de Bacillus stearothermophilus, considerados
bons monitores biológicos para a esterilização por formaldeído e vapor a baixa temperatura (LTSF), foram submetidos a diferentes ambientes de recuperação, após a exposição aos relevantes tratamentos por LTSF e antes da contagem do número de esporos sobreviventes. Os tratamentos de recuperação consistem essencialmente em manter as amostras a uma temperatura de 90 ºC por -1
períodos de tempo diferentes antes da preparação para cultura e após a exposição a 12 µg ml de formaldeído a temperatura entre 63 e 83 ºC. Os dados indicam que os esporos expostos ao LTSF apresentam uma recuperação acentuada, quando mantidos a 90 ºC antes da cultura; o grau de recuperação aumenta com o aumento da temperatura de inativação entre 73 a 83 ºC. Os dados põem em dúvida a atividade esporicida do LTSF.
INTRODUÇÃO Tentamos anteriormente sugerir que o mecanismo pelo qual o formaldeído extermina os esporos bacterianos possa ser complexo e incompleto, durante o período de exposição ao formaldeído (LTSF) e ao vapor a baixa temperatura (Wright et al. 1996). A razão para evidenciar essa idéia era que a sensibilidade do esporo ao LTSF independia da temperatura acima de uma faixa de 63 a 83 ºC, enquanto que supunha-se que um indicador químico normal teria um índice maior devido ao aumento da temperatura. Pouco sabemos sobre o mecanismo da atividade esporicida do formaldeído, embora sugere-se que esse mecanismo envolva uma reação irreversível com os ácidos nucleicos, causando, com isso, a inibição da germinação (Trujillo e David 1972). A possível natureza dessas reações pode ser postulada a partir dos dados de Wilkins e McCloud (1976), Bedford e Fox (1981) e Benyajati et al. (1983), que demonstraram que o formaldeído pode reagir com os nucleotídeos, RNA e DNA desnaturado, resultando em derivados de monometilol; com proteínas e ácidos nucleicos, resultando em reações cruzadas de metileno e com nucleoproteínas para formar reações cruzadas de ácido nucleico e
proteína. Entretanto, o formaldeído não reagirá com o DNA natural, sem que as ligações interfilamentares de hidrogênio sejam primeiramente decompostas (Chattoraj
1970; Kozlov e Debabov 1972), porém sabe-se que tal decomposição entre os filamentos ocorre naturalmente abaixo do ponto de desnaturação do DNA (Lukashin et al. 1976) e a freqüência da ocorrência de tais decomposições aumenta com o aumento da temperatura. Esses estudos indicam que tais mecanismos podem levar à morte nas células, porém o fato de que aumentando a temperatura entre 63 e 83 ºC, o que criaria um número maior de decomposições interfilamentares, não aumenta o efeito letal do formaldeído é uma clara indicação de que há muito ainda para aprender sobre o mecanismo de mortalidade dos esporos. Hurrell (1988) sugeriu que o efeito esporicida do formaldeído possui dois estágios. Primeiro, o formaldeído reage reversivelmente com os componentes do esporo, formando uma ligação fraca. Segundo, essas ligações fracas se fortalecem e o formaldeído fica irreversivelmente ligado. Se isso acontecer, então, a manipulação do
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Correspondência para: Professor D.J.G. Davies, School of Pharmacy and Pharmacology, University of Bath, Cleverton Down, Bath B A2 1 A Y, RU. 1 2 Endereços atuais: Zeneca Pharmaceuticals, Macelesfield. RU; Medical Devices Agency, Department of Health, Londres, RU. * Falecido
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ambiente, no qual os esporos são mantidos, imediatamente após o tratamento com LTSF e antes da germinação, pode alterar a resposta medida. Particularmente, um ambiente que favorece a reversão das ligações fracas pode levar a uma recuperação aprimorada. Spicher e Peters (1976, 1981) relataram tal fenômeno, por meio do qual os esporos de Bacillus subtilis, quando expostos a temperaturas entre 50 e 90 ºC e após a exposição à solução aquosa de formaldeído a 15% por 2 horas a 20 ºC, exibiam uma recuperação aprimorada, aumentando para um máximo após 120 minutos de exposição. Se este é um fenômeno geral, fornecerá, então, uma metodologia experimental útil para testar as hipóteses com relação ao mecanismo mortal. Também é muito importante na determinação da utilidade dos indicadores biológicos na monitoração da esterilização por LTSF. Se, por exemplo, o indicador biológico for exposto ao calor na ausência do formaldeído, como pode acontecer durante a fase de eluição do ciclo da Miniclave 80, uma contagem viável mais alta pode ser obtida e, consequentemente, a eficácia dos ciclo do LTSF, subestimada. De uma significância máxima é que tais estudos podem indicar que o formaldeído somente é letal uma vez que a germinação tenha iniciado, o que poderia ter implicações graves para o uso do LTSF como um sistema de esterilização. Esse trabalho relata os experimentos, nos quais os esporos foram expostos a diferentes condições de recuperação, após a exposição ao LTSF.
MATERIAIS E MÉTODOS Esporulação, colheita e limpeza das células A cepa usada foi o Bacillus stearothermophilus NCIMB 8224, obtida do National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, Reino Unido. Essa cepa foi esporulada em um meio sintético de carbono limitado (Wright 1991). O meio de esporulação foi preparado imediatamente antes do uso, diluindo assepticamente soluções estoque estéreis e de concentração dupla com ágar estéril a 3% (Lab. M). Uma cultura de células foi realizada, sem agitação, em Tryptone Soy Broth por 18 horas a 55 ºC, centrifugada em 1500 g por 15 minutos (MSE Chilspin), lavada por duas vezes e ressuspensa em um meio líquido de esporulação. 8 9 Volumes de 1 ml (células de 10 a 10 ) da suspensão foram inoculados em volumes de 20 ml de meios sólidos de esporulação em placas de Petri de poliestireno de 9 cm
(Sterilin). Esses volumes foram incubados a 55 ºC em umidade elevada. A cultura foi examinada diariamente quanto ao grau de crescimento e esporulação, e os esporos foram colhidos quando a esporulação estava no máximo, geralmente em 5 a 7 dias. Os esporos foram coletados dos meios sólidos e colocados em água destilada estéril e fria (4 ºC), agitando ligeiramente com uma espátula estéril de vidro para separá-los e suspendê-los. Os esporos foram girados por centrifugação em 12000 g por 20 minutos a 4 ºC, a suspensão foi então armazenada a 4 ºC, por 3 dias para permitir a lise de qualquer célula vegetativa, e os esporos foram, então, submetidos à centrifugação repetida em 1000 g por 20 minutos a 4 ºC e ressuspensão, conforme sugerido por Long e Williams (1958). As suspensões dos esporos (108 ml-1 de esporos) foram armazenadas a 4 ºC em ambiente escuro. O índice de crescimento desses esporos foi de ≈ 65%, variando sensivelmente de lote a lote.
Aparelhos para a exposição dos esporos ao LTSF A aparelhagem básica foi a Miniclave 80, fabricada por Thackeray Ltd, Leeds e amplamente modificada (Line 1988). As modificações permitiram que as amostras de esporos secasses em suportes de alumínio e fossem colocadas na extremidade de uma haste para serem empurradas para dentro e para fora da atmosfera da câmara, sem alterar o ambiente da câmara ou interromper o ciclo. A amostra foi inserida por uma entrada na porta, que possuía quatro entradas para que cada amostra da câmara pudesse ser removida após quatro tempos diferentes de exposição. Uma modificação adicional permitiu que uma amostra da atmosfera da câmara pudesse ser removida por uma seringa, através de uma divisão na parede traseira.
Método experimental Alíquotas de 20 µl da suspensão de esporo, contendo 6 esporos de ≈ 1 x 10 foram pipetadas em microcopos de 6 mm, bem no meio de um suporte de alumínio estéril para amostra com o tamanho de ≈ 8 x 8 mm quadrado, sob condições de fluxo laminar, e deixadas para secar por 4 horas nessas condições. Após a exposição ao tratamento experimental com LTSF, a amostra de teste foi colocada em um frasco de paredes finas, contendo 10 ml de glicina a 1% e exposta em um banho de ultra-som a 51 kHz por 10 minutos, para remover os esporos. Esse método demonstrou uma completa recuperação dos esporos viáveis (Chinyanganya
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Rotineiramente quatro amostras de teste foram inseridas, ao mesmo tempo, em uma câmara e removidas após períodos diferentes de exposição. Como referência para uma amostra não-exposta, a fração de esporos que sobreviveram a cada tratamento foi calculada a partir da contagem das placas obtidas e dos dados usados para criar as curvas de sobrevivência. Todos os casos resultaram em curvas de sobrevivência lineares, com o intercepto do eixo y correspondendo a um volume de sobrevivência de cerca de 0,9.
condições ótimas descritas anteriormente para exposição ao formaldeído aquoso (40 minutos a 90 ºC). Após a exposição ao LTSF por diferentes períodos de tempo, cada amostra foi avaliada quanto a viabilidade antes e após o tratamento a 90 ºC por 40 minutos. O experimento foi realizado por três vezes e cada curva de sobrevivência, submetida à análise de regressão linear. Os interceptos e inclinações para as três curvas, para as amostras aquecidas e não-aquecidas, foram comparados usando o teste 't' de Student; cada grupo de três foi comparado em pares das três combinações possíveis. Não houve nenhuma diferença estatística entre os valores de inclinação e intercepto em um nível de probabilidade de 5% para cada grupo. A Figura 1 mostra as médias das curvas de sobrevivência para as amostras aquecidas e não-aquecidas.
% de Sobreviventes
1989). Quando as amostras foram expostas a um tratamento de calor, foi, então, realizada uma diluição de 10 partes dessa suspensão primária em água destilada. Essa suspensão foi, então, exposta a uma temperatura constante, em banho-maria, pelo tempo requerido, removida e colocada em água gelada. Essa diluição ou a suspensão primária não-tratada foi submetida a diluições seriais de dez partes em água destilada e um volume de 0,2 ml de uma diluição adequada, contendo esporos viáveis de 102 e 103, foi cultivado na superfície de cinco placas replicadas de Nutrient Agar. As colônias foram contadas após 5 dias de incubação a 55 ºC.
RESULTADOS E DISCUSSÃO Os experimentos preliminares, que não estão registrados neste documento (Wright 1991), foram realizados com esporos de Bacillus stearothermophilus expostos ao formaldeído aquoso a 0,5% a 70 ºC, seguido do tratamento por calor entre 85 e 97 ºC durante períodos de até 120 minutos. Esses dados demonstraram que a exposição após o tratamento aumentou o volume recuperável de esporos e que uma recuperação ótima foi obtida, após a exposição pós-tratamento a 90 ºC por 40 minutos. Embora usando diferentes condições experimentais, esse tipo de 'reativação a calor' dos esporos foi registrada anteriormente por Spicher e Peters (1976, 1981) para os esporos de B. subtilis. Em ambos os exemplos, não foi observada nenhuma reativação dos esporos não-tratados por formaldeído, demonstrando que a recuperação observada não era devido à reativação por calor dos esporos superlatentes (≈ 35% da nossa cepa). Tais dados, entretanto, são importante somente para a esterilização por LTSF, se o mesmo fenômeno for observado após a exposição ao formaldeído gasoso e vapor. Como base para os estudos com o LTSF, o tratamento utilizado foi o demonstrado anteriormente por Wright (1991) como sendo ótimo para a inativação de nossa -1 cepa de Bacillus stearothermophilus, viz. 12 µg ml a 73 ºC. Para a recuperação pós-tratamento, foram usadas as
Tempo de exposição (minutos) Figura 1:
Curvas de sobrevivência dos esporos de Bacillus stearothermophilus submetidos à esterilização por formaldeído e vapor a baixa temperatura (LTSF) com -1 12 µg ml de formaldeído a 73 ºC, antes e após o tratamento por calor a 90 ºC por 40 minutos. ● Antes do tratamento por calor; ▲ após tratamento por calor. Barra = ± SD (Desvio Padrão).
Esses dados demonstram que o tratamento por calor ótimo de pós-exposição, para a recuperação dos esporos tratados com formaldeído aquoso, também leva à recuperação dos esporos tratados com LTSF e que a -1 ativação média constante (k) muda de 0,408 min para -1 0,0875 min , um fator de 5,8. Hurrell (1988) sugeriu um processo de dois estágios para o efeito esporicida do formaldeído: primeiramente, a formação de ligações fracas e reversíveis entre o formaldeído e os componentes do esporo. Durante um período de tempo, entretanto, as
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ligações fracas podem se fortalecer e o formaldeído ficar irreversivelmente ligado, levando à morte do esporo. As ligações originais e metaestáveis podem ser decompostas, permitindo que o formaldeído se difunda do esporo e cause sua recuperação. O pós-tratamento com calor pode favorecer a decomposição das ligações fracas, levando a uma maior viabilidade do esporo. Se isso acontecer, então, após a exposição ao LTSF, manter os esporos à temperatura ambiente antes do tratamento por calor pós-exposição permite a transição das ligações metaestáveis iniciais para ligações estáveis, resultando na diminuição da viabilidade. A hipótese foi rotineiramente testada, usando esporos expostos ao LTSF em 12 µg ml-1 e a 73 ºC. Após a remoção da câmara, os esporos foram retirados das amostras de teste através de ultra-som em glicina a 1% e armazenados a 25 ºC por 1, 6 e 21 horas. A seguir, amostras de 2 ml foram adicionadas a 18 ml de água destilada estéril a 90 ºC e água destilada estéril a temperatura ambiente como controle. Após descansar por 40 minutos, a viabilidade foi determinada, e as curvas de sobrevivência resultantes encontram-se na Figura 2. Esses dados demonstram, novamente, uma recuperação do tratamento por calor pós-exposição com uma alteração aproximada de 6 partes na inativação constante.
Entretanto, armazenar os esporos à temperatura ambiente após a exposição ao LTSF e antes do tratamento por calor parece não afetar a recuperação subsequente e faz com que a hipótese de uma mudança inicial complexa e metaestável para uma estável seja improvável. O efeito da variação da temperatura do vapor usado para exposição ao LTSF, na recuperação subsequente dos esporos, também foi pesquisada. As temperaturas utilizadas abrangem a faixa normal usada na esterilizaçãopor LTSF em lugares diferentes e inclui 63°, 68º, 73º, 78º e 83 ºC. Após o tratamento com LTSF, as amostras foram cultivadas sem e com um tratamento de recuperação por calor a 90 ºC por 4 minutos. As curvas de sobrevivência lineares foram obtidas e as constantes de inativação, juntamente com a proporção dos valores nãotratados/tratados, encontram-se na Figura 3, traçadas em uma escala logarítmica em comparação com a temperatura. Esses dados demonstram que a variação nos valores k ocorre aleatoriamente e em torno do valor médio de 0,44 min-1, confirmando o registro anterior (Wright et al. 1996) de que a temperatura do LTSF não afeta sua atividade contra os esporos acima de temperaturas que variam de 63 a 83 ºC.
Valores K não- tratados
Proporção
% de Sobreviventes
-1
Valor k (min )
Valores K tratados
Proporção de não-tratados/tratados
Tempo de exposição (minutos) Figura 2: Curvas de sobrevivência dos esporos de Bacillus stearothermophilus submetidos à esterilização por formaldeído e vapor a baixa temperatura (LTSF) com -1 12 µg ml de formaldeído a 73 ºC, antes e após a ressuspensão em glicina a 1% seguida do armazenamento em água a 25 ºC por até 21 horas e, então, tratados por calor a 90 ºC por 40 minutos. ■, ▲, ●, armazenamento de 1, 6 e 21 horas a 25 ºC sem tratamento por calor subsequente. , Ì, {, armazenamento de 1, 6 e 21 horas a 25 ºC com tratamento por calor subsequente.
Figura 3:
Temperatura de inativação (°C) Valores k para as curvas de sobrevivência dos esporos de Bacillus stearothermophilus submetidos à esterilização por formaldeído e vapor a baixa -1 temperatura (LTSF) com formaldeído a 12 µg ml a 63 a 83 ºC, antes e após o tratamento por calor a 90 ºC por 40 minutos, juntamente com as proporções associadas de não-tratado/tratado por calor.
Entretanto, a magnitude de recuperação do tratamento por calor depende notavelmente da temperatura utilizada para
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o processo com LTSF. Para uma primeira aproximação, a recuperação por calor obtida independe da temperatura de inativação de 63º, 68º e 73 ºC. Entretanto, acima dessas temperaturas, os graus de recuperação aumentaram com a elevação da temperatura de inativação. A 83 ºC, a proporção de recuperação é de 100 e a recuperação obtida é de quase 100%, demonstrando que a atividade esporicida do LTSF, em determinadas condições, é quase completamente reversível. Esses dados sugerem que o mecanismo letal é de alguma forma complexo, sendo dependente da temperatura da exposição ao formaldeído e do tratamento subsequente dos esporos. Os dados apresentados aqui demonstraram a recuperação por calor dos esporos tratados com formaldeído em um processo de LTSF. Essa recuperação não estava relacionada com a ativação por calor dos esporos latentes, como reportada por outros pesquisadores, como Gorman et al. (1983), embora seja similar àquela reportada por Spicher e Peters (1981) para os esporos de B. subtilis. Contudo, o mecanismo de ação não está claro e os dados põem em dúvida a atividade esporicida do LTSF, sugerindo que o processo do LTSF não tenha nenhum efeito letal sobre os esporos e somente age se o formaldeído ainda estiver presente nas células no momento da germinação.
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