Ippologia 3 e 4 2013 by E.V. Soc. Cons. a r.l.

IPPOLOGIA

Rivista Ufficiale della SIVE • Anno 24, numero 3-4, trimestrale, settembre-dicembre 2013 Ippologia è indicizzata su: SciSearch® - ISI Research Alert® - Focus on - Cab International - Index Veterinarius

ISSN: 1120-5776

3-4 MEDICINA SPORTIVA Effetti dell’amikacina per via inalatoria in cavalli sportivi affetti da sindrome da calo di rendimento e confronto con la somministrazione endovenosa

ZOOGNOSTICA Caratterizzazione morfo-funzionale e fisiologica dell’Asino Amiatino

MALATTIE INFETTIVE Monitoring the immune response of horses vaccinated with inactivated Equine herpes virus-1 vaccine

Prospective studies of equine herpes virus-1 Myeloencephalopathy in Egypt 2012

2013

❚ Editoriale

Previdenza e crisi economica: l’ENPAV è in prima linea

e ganasce della crisi stringono ormai da tempo l’intera economia nazionale e le ricadute recessive, inevitabilmente, vengono avvertite in ogni settore, anche in quello previdenziale, pubblico e privato. In questo contesto, le Casse dei professionisti, come dimostrato dai Bilanci tecnici prospettici a 50 anni, possono garantire agli iscritti una stabilità a lunghissimo termine. Nello specifico, una gestione oculata e accorta, unitamente ad una strategia di investimento prudenziale e diversificata, hanno messo al riparo ENPAV da eccessivi contraccolpi. Le due recenti riforme del sistema pensionistico dell’Ente, inoltre, (quelle entrata in vigore nel 2010 e quella del 2012) hanno permesso di mantenere il metodo retributivo per il calcolo delle pensioni. Ma, di contro, ENPAV non può non considerare le difficoltà che la crisi sta portando a tutti i suoi iscritti. È innegabile che tutte le categorie produttive siano in difficoltà, ma la categoria dei professionisti, oltretutto, continua ad essere vittima di uno strabismo sociale e di luoghi comuni assurdi. In realtà, tutte le professioni avvertono sensibili cali del fatturato; fatturato su cui gravano tutti i costi vivi relativi allo svolgimento dell’attività e ad eventuali interruzioni della stessa per malattia o infortunio. In considerazione dell’eccezionale situazione di emergenza, ENPAV ha fatto leva sulla propria missione assistenziale, potenziando gli strumenti già in uso e disegnandone di ulteriori. Particolare attenzione è stata posta alla situazione dei giovani Medici Veterinari, che rappresentano la linfa propulsiva della professione (anche dal punto di vista previdenziale, in virtù del patto intergenerazionale), ma anche la fascia debole che più di tutte avverte le difficoltà portate dalla crisi. I primi anni post lauream sono di sicuro i più critici, caratterizzati da redditi molto bassi e ingenti spese per l’avvio dell’attività. Secondo i dati più recenti, 9mila giovani professionisti italiani sotto i 40 anni si sono cancellati dagli Albi solo nel 2012, per non essere riusciti a sostenere le spese. Dal 2007 al 2012 il numero totale di giovani nuovi iscritti a tutte Casse privatizzate e sceso da 34.255 a 28mila (circa 4mila uomini e 3mila donne in meno); il reddito medio dei giovani professionisti risulta in media inferiore del 48,4% rispetto al corrispettivo dei seniores: i gio-

Gianni Mancuso Presidente ENPAV

vani veterinari dichiarano, in media, un reddito di 15.000 euro l’anno. L’attenzione ai giovani Medici Veterinari da parte di ENPAV si è estrinsecata nella riforma del 2010, attraverso incisive agevolazioni contributive per i neo-iscritti, i quali, entro il 32esimo anno di età, sono oggi esentati totalmente dal versamento, nel secondo e terzo anno versano il 33% di quanto dovuto e il 50% nel quarto. ENPAV, inoltre, offre ai suoi iscritti la possibilità di accedere al credito agevolato, sia attraverso la concessione di prestiti erogati direttamente dall’Ente, anche per l’avvio o lo sviluppo dell’attività, sia attraverso convenzioni con istituti bancari che permettono di ottenere delle formule di mutuo studiate appositamente per gli iscritti ENPAV, dalle condizioni vantaggiose. (tutte le informazioni possono essere recuperate sulle pagine dedicate del sito www.enpav.it). La crisi ha, poi, portato all’aumento dei ricorsi allo strumento delle dilazioni: la possibilità di distribuire il pagamento dei propri contributi, permette di non farli eccessivamente pesare in questo periodo di così grande difficoltà per molti, consentendo di mantenere i propri impegni senza correre il rischio di incorrere in procedure per morosità. Anche la copertura sanitaria ENPAV (che prevede una polizza di base gratuita a tutti gli iscritti e la possibilità di integrarla a prezzi estremamente vantaggiosi, anche ai propri famigliari), è stata di recente ampliata, prevedendo anche la copertura di malattie tipiche della nostra professione e l’accesso a diagnostiche preventive. Gli strumenti di natura assistenziale offerti da ENPAV, quindi, sono già molti. Ma la situazione attuale ha sottolineato ancor più l’importanza del welfare per i professionisti, a fronte della copertura del sistema pubblico, in forte difficoltà. Per questo, continuiamo a considerare nuove possibilità di intervento, quali l’ampliamento delle indennità di maternità anche alle gravidanze a rischio e interventi specifici per la sostenibilità della genitorialità nei primi anni di vita del bambino. Molto è stato fatto, quindi, ma ancora vi sono notevoli possibilità di ampliare il nostro ventaglio di servizi di sostegno per i professionisti. Il tutto, certo, sperando non vi siano ulteriori invasioni di campo o inopportune richieste di versamenti nelle casse statali da parte dell’apparato pubblico. Ippologia, Anno 24, n. 3-4, Settembre-Dicembre 2013

IPPOLOGIA, N. 3-4, SETTEMBRE-DICEMBRE 2013

SOMMARIO

M E D I C I N A

S P O R T I V A

EFFETTI DELL’AMIKACINA PER VIA INALATORIA IN CAVALLI SPORTIVI AFFETTI DA SINDROME DA CALO DI RENDIMENTO E CONFRONTO CON LA SOMMINISTRAZIONE ENDOVENOSA

Nehal, S. Saleh; Safaa, A.Warda; Eman, M. Ebeid; Nashwa, A. Madkour & Magda, A. Kalad

CARATTERIZZAZIONE MORFO-FUNZIONALE E FISIOLOGICA DELL’ASINO AMIATINO MORPHO-FUNCTIONAL AND PHYSIOLOGICAL CHARACTERIZATION OF AMIATA DONKEY M. Orlandi, M.C. Curadi, A. Giorgetti, R. Benedetti

I N F E T T I V E

MONITORING THE IMMUNE RESPONSE OF HORSES VACCINATED WITH INACTIVATED EQUINE HERPES VIRUS-1 VACCINE

EFFECTS OF INHALED AMIKACIN ON RACEHORSES WITH HISTORY OF POOR PERFORMANCE AND COMPARISON WITH INTRAVENOUS ADMINISTRATION F. Ferrucci, L. Stucchi, M. Salvadori, G. Stancari, B. Conturba, V. Bronzo, E. Ferro, E. Zucca

M A L A T T I E

PROSPECTIVE STUDIES OF EQUINE HERPES VIRUS-1 MYELOENCEPHLOPATHY IN EGYPT 2012 Magda A. Kalad, Maysa Hanafy, Safaa A.Warda, Nehal S. Saleh, Nashwa K. Madkour, Heba Elgharieb, Sohir Ebraheim, Eman M. Ebied

EDITORIALE/EDITORIAL

Ippologia è indicizzata su: Ippologia is indexed in: SciSearch® (Science Citation Index Expanded) - Research Alert® (ISI Alerting Service) Focus on: Veterinary Science & Medicine - Cab Abstracts - Cab International Index Veterinarius - Impact Factor (aggiornato al 2011): 0,176

ISTRUZIONI PER GLI AUTORI sono disponibili sul sito della SIVE - www.sive.it

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❚ Medicina sportiva

Effetti dell’amikacina per via inalatoria in cavalli sportivi affetti da sindrome da calo di rendimento e confronto con la somministrazione endovenosa Francesco Ferrucci1, Dr. Med. Vet., PhD - Luca Stucchi1, Dr. Med. Vet. - Marco Salvadori2, Dr. Med. Vet. Giovanni Stancari1, Dr. Med. Vet., PhD - Bianca Conturba1, Dr. Med. Vet. - Valerio Bronzo1, Dr. Anim. Prod. Sci. Elisabetta Ferro1, Dr. Med. Vet. - Enrica Zucca1, Dr. Med. Vet., PhD 1

Dipartimento di Scienze Veterinarie per la Salute, la Produzione Animale e la Sicurezza Alimentare, Università degli Studi di Milano, Milano, Italia 2 Libero professionista, Milano, Italia

RIASSUNTO Lo scopo del presente lavoro è di valutare gli effetti dell’amikacina somministrata per via inalatoria sulla citologia e batteriologia del fluido di lavaggio tracheale (Tracheal Wash, TW) e sul clinical score in cavalli da corsa con presunta Inflammatory Airway Disease (IAD) e di confrontarli con la somministrazione endovenosa. Sedici (16) purosangue inglese con anamnesi di calo di rendimento atletico sono stati selezionati sulla base della positività dell’esame colturale del TW e della sensibilità all’amikacina. I cavalli sono stati casualmente suddivisi in 2 gruppi: 8 cavalli (gruppo A) sono stati trattati con amikacina per via inalatoria alla dose di 3,3 mg/kg q24h per 10 giorni; 8 cavalli (gruppo B) con amikacina per via endovenosa alla dose di 10 mg/kg q24h per 10 giorni. I valori di clinical score, la conta differenziale dei neutrofili e le unità formanti colonia/ml (UFC/ml) del TW prima e dopo il trattamento (post trattamento, PT) sono stati confrontati con il test T di Student. Le frequenze di isolamento batterico PT tra i due gruppi sono state confrontate con il test del Chi-quadrato. Nel gruppo A è risultata una riduzione significativa del clinical score (p < 0,01), della conta differenziale dei neutrofili nel TW (p < 0,05) e delle UFC/ml (p < 0,01); nel gruppo B una riduzione significativa del clinical score (p < 0,05) e delle UFC/ml (p < 0,01). Il confronto tra le frequenze di isolamento batterico PT non ha mostrato alcuna differenza significativa tra i due gruppi. In conclusione, l’amikacina per via inalatoria alla dose di 3,3 mg/kg q24h per 10 giorni appare efficace nella riduzione del clinical score, della conta differenziale dei neutrofili e delle UFC/ml nel TW. L’assenza di differenze significative nell’isolamento batterico PT tra i due gruppi suggerisce che l’amikacina possa essere efficace per entrambe le vie di somministrazione.

INTRODUZIONE In tutto il mondo, la performance dei giovani cavalli da corsa in allenamento può spesso essere negativamente influenzata dalla presenza di un processo infiammatorio delle basse vie aeree (Burrel et al., 1996; Christley et al., 2001; Wood et al., 2005). La Inflammatory Airway Disease (IAD) è una sindrome caratterizzata da sintomi quali tosse, accumulo di muco in trachea, scolo nasale, e prolungato recupero dopo l’esercizio, anche in assenza di coinvolgimento sistemico o dispnea a riposo (Ferro et al., 1998; Hoffman 2003). I cavalli con IAD presentano un incremento della percentuale dei granulociti neutrofili, dei mastociti o degli eosinofili all’esame citologico dei fluidi di lavaggio a diversi livelli del tratto respiratorio (Hoffman 2003). Sebbene l’eziologia della IAD sia considerata multifattoriale, numerosi studi hanno dimostrato l’associazione della patologia con l’isolamento di batteri nel Tracheal Wash (TW) (Burrel et al., 1996; Christley et al., 2001; Wood et al., 2005). Nel paziente equino, in corso di infezioni delle vie aeree, il successo della terapia antibiotica sistemica può essere influenzato negativamente dalla insufficiente distribuzione del farmaco in situ, dai potenziali effetti collaterali della somministrazione sistemica, dalla durata del trattamento e dall’elevato costo complessivo dello stesso (McKenzie 2009). L’efficacia di un antibiotico nei confronti delle infezioni batteriche dell’apparato respiratorio è direttamente correlata alla concentrazione del farmaco raggiunta a livello delle vie respiratorie rispetto alla concentrazione ottenuta nel plasma (McKenzie e Murray 2000). L’effettiva diffusione dell’antibiotico nei tessuti dell’apparato respiratorio può essere limitata, in quanto la maggior parte dei batteri colonizza le vie respiratorie a partire dalla superficie epiteliale (via aerogena), piuttosto che dal parenchima polmonare (via ematogena) e, di conseguenza, la mucosa respiratoria può rappresentare un’effettiva barriera al passaggio dell’antibiotico, somministrato per via sistemica, dal circolo ematico al sito d’infezione. La somministrazione di antibiotici per via inalatoria permette la deposizione del principio attivo direttamente sulla superficie epiteliale della mucosa respiratoria senza dover oltrepassare la barriera emato-bronchiale (McKenzie 2009). Tra i diversi antibiotici, gli aminoglicosidi, e tra essi l’amikacina, risultano candidati ideali per la somministrazione per via inalatoria, in quan-

“Articolo ricevuto dal Comitato di Redazione il 20/03/2013 ed accettato per la pubblicazione dopo revisione il 30/09/2013”.

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❚ Medicina sportiva to la loro azione battericida è concentrazione-dipendente, ed è quindi tanto più efficace quanto più è elevata la concentrazione raggiunta nel sito di infezione. La somministrazione sistemica degli stessi, a dosaggi terapeutici, raggiunge invece con difficoltà concentrazioni elevate a livello delle secrezioni bronchiali (Brown e Riviere, 1991). In cavalli adulti, la somministrazione per via inalatoria di 1 g di gentamicina solfato ha permesso di raggiungere concentrazioni circa 12 volte più elevate nel fluido di lavaggio broncoalveolare (Broncho-Alveolar Lavage Fluid, BALF) rispetto all’iniezione endovenosa alla dose di 6,6 mg/kg, nelle 8 ore successive alla somministrazione (McKenzie e Murray 2000). Ripetute somministrazioni giornaliere di gentamicina nebulizzata alla dose di 2,2 mg/kg per 7 giorni non hanno indotto fenomeni flogistici a carico dell’apparato respiratorio (McKenzie e Murray 2004). La nebulizzazione di marbofloxacina alla dose totale di 300 mg in un gruppo di cavalli adulti sani non ha provocato alterazioni della funzionalità polmonare, rispetto ad un gruppo cui è stato somministrato un placebo, e, rispetto all’iniezione endovenosa di marbofloxacina alla dose di 2 mg/kg, ha permesso di raggiungere concentrazioni di principio attivo nel BALF circa 5 volte superiori, con valori plasmatici circa 27 volte inferiori (Art et al., 2007). Infine è stato osservato come in cavalli sani una singola somministrazione per via inalatoria di 225 mg di cefquinome non abbia indotto nessuna reazione avversa e abbia raggiunto la minima concentrazione inibente (MIC) nei confronti della maggior parte dei patogeni respiratori del cavallo, ad una dose del 40-50% inferiore rispetto alla somministrazione parenterale, e che il trattamento ripetuto per 5 giorni non abbia provocato broncospasmo, iperreattività o flogosi a carico delle basse vie aeree (Art et al., 2010). In medicina umana, è stata dimostrata l’efficacia clinica dell’amikacina somministrata tramite inalazione in pazienti ventilati meccanicamente affetti da polmonite da Pseudomonas aeruginosa (Lu et al., 2011). In suinetti sani, ventilati meccanicamente, la somministrazione per via inalatoria di amikacina ha permesso di raggiungere concentrazioni polmonari di principio attivo 10 volte più elevate rispetto alla somministrazione endovenosa (Goldstein et al., 2002B). In suinetti affetti da polmonite indotta sperimentalmente con Escherichia coli, la carica batterica nei soggetti trattati con amikacina per via inalatoria si è ridotta del 71%, contro il 16% dei soggetti nei quali è stato effettuato il trattamento per via endovenosa (Goldstein et al., 2002A). Lo scopo del presente lavoro è stato quello di valutare gli effetti della somministrazione di amikacina per via inalatoria in pazienti equini sulla riduzione della conta differenziale dei granulociti neutrofili e delle UFC/ml nel TW, e sul clinical score, non-

ché di confrontare i risultati ottenuti con un gruppo di controllo sottoposto a trattamento con amikacina per via endovenosa.

MATERIALI E METODI Cavalli Per effettuare lo studio, nei mesi di gennaio e febbraio 2012, sono stati selezionati 35 cavalli di razza purosangue inglese provenienti dalla stessa scuderia, stabulati in box con finestre verso l’esterno, alimentati con fieno bagnato e mangime concentrato della stessa qualità e quantità, mantenuti su lettiera in truciolo e sottoposti allo stesso programma di allenamento per le corse al galoppo. Tutti i cavalli erano vaccinati per Influenza equina, Tetano ed Herpesvirus equino di tipo 1 e 4 e nessun trattamento farmacologico era in atto al momento dello studio. L’anamnesi di tutti i cavalli riportava calo di rendimento atletico riferibile a presunta IAD. I criteri di inclusione per i soggetti di questo studio sono stati l’isolamento di batteri patogeni nel TW e la sensibilità del ceppo batterico all’amikacina. In seguito ad esame clinico, esame endoscopico ed esame citologico e microbiologico del TW sono stati quindi ammessi allo studio 16 cavalli, che sono stati suddivisi in maniera casuale nei due gruppi di somministrazione (8 soggetti, gruppo A, somministrazione per via inalatoria; 8 soggetti, gruppo B, somministrazione per via endovenosa). Tre soggetti appartenenti al gruppo B sono stati esclusi dallo studio in quanto il proprietario non ha acconsentito all’esecuzione delle analisi di controllo post trattamento. Pertanto, allo studio hanno partecipato in tutto 13 animali (età 3,2 ± 0,4 anni, 5 maschi, 5 femmine e 3 castroni).

Indagini diagnostiche Per ciascun animale è stato eseguito un accurato esame fisico, con particolare riferimento agli apparati respiratorio e cardio-circolatorio. Per un oggettivo confronto delle condizioni cliniche dei pazienti prima e dopo il trattamento, a ciascuno di essi è stato attribuito un punteggio utilizzando un clinical scoring system (Pirie et al., 2001), modificato per adattarlo alla definizione di IAD, che differisce dalla Respiratory Airway Obstruction (RAO), anche per l’assenza di episodi dispnoici (Tabella 1). Successivamente, ciascun animale è stato sottoposto ad esame endoscopico delle vie aeree a e contestualmente a TW: posizionato l’endoscopio, precedentemente disinfettato con glutaraldeide b, nella porzione distale della trachea, si è proceduto all’inoculazione di 50 ml di soluzione fisiologica

a b

CF-20HL, Olympus, Milano, Italia. Cidex Plus, Johnson & Johnson Medical, Milano, Italia.

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❚ Medicina sportiva TABELLA 1 Clinical Scoring System applicato per effettuare la valutazione clinica del paziente (Pirie et al., 2001, modificato) TOSSE

ASSENTE PRESENTE

0 1

SCOLO NASALE

ASSENTE PRESENTE

0 1

ALTERAZIONI CARATTERI RESPIRO

ASSENTI LIEVI MODERATE GRAVI

0 1 2 3

FREQUENZA RESPIRATORIA

< 20/MIN 20-30/MIN >30/MIN

0 1 2

AUSCULTAZIONE TORACE

NORMALE RINFORZO LIEVI RUMORI GRAVI RUMORI

0 1 2 3

FREQUENZA CARDIACA

< 50 BPM 50-70 BPM >70 BPM

0 1 2

TEMPERATURA RETTALE

NORMALE >39° C

0 1

sterile a 37° C attraverso un catetere sterile in teflonc introdotto nel canale di servizio dell’endoscopio. Tale soluzione di lavaggio del lume tracheale è stata in seguito aspirata attraverso la stessa via mediante una siringa da 60 ml. Il TW così ottenuto è stato raccolto in provette sterili per gli esami citologici e colturali e conservato a temperatura di 4° C sino alla consegna al laboratorio (Ferrucci et al., 2008). Per effettuare l’esame citologico, alcune gocce di TW sono state depositate su 2 vetrini molati, che venivano collocati in una citocentrifugad e centrifugati a 500 giri/minuto per 5 minuti. Al termine della procedura, i vetrini, essiccati all’aria e colorati con May-Grunwald Giemsa, venivano sottoposti ad una valutazione generale a 20x, 40x e 60x e a conta cellulare differenziale a 100x. Per l’esame colturale, 10 µl di TW sono stati seminati in agar-sangue al 5% per strisciamento e incubati a 37º C per 24-48 ore. Veniva effettuato l’isolamento e l’identificazione dei batteri e la conta delle UFC/ml. La valutazione della sensibilità agli antibiotici dei ceppi batterici isolati (antibiogramma) veniva condotta mediante tecnica di diffusione in gel di agar secondo il metodo Kirby-Bauer. Per ogni campione veniva valutata la sensibilità delle colonie batteriche all’amikacina.

FIGURA 1 - Nebulizzatore Jet f.

acquosa al 16,69% di amikacina solfato (pari al 12,5% di amikacina) registrato per la somministrazione parenterale nel cavallo sportivoe. Per la somministrazione per via inalatoria, è stato utilizzato un nebulizzatore jet ad aria compressaf (Figura 1) connesso ad una apposita maschera g per la somministrazione di farmaci per via inalatoria nel cavallo (Figura 2). La soluzione da nebulizzare veniva pree

Amikavet, Merial, Milano, Italia. F3000, Fiac, Bologna, Italia. g Equine AeroMask,Trudell Medical International, Ontario, Canada. f

Trattamento con amikacina Il prodotto utilizzato in entrambi i gruppi sperimentali era un preparato veterinario in soluzione

c d

PW-1V-1, Olympus, Milano, Italia. Rotofix 32, Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, Germania.

FIGURA 2 - Maschera per terapia inalatoriag.

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❚ Medicina sportiva parata mediante diluizione in soluzione fisiologica allo 0,45% del prodotto commerciale contenente amikacina, al fine di ottenere una concentrazione finale di principio attivo pari a 50 mg/ml (McKenzie 2009). Tale soluzione veniva collocata in una camera di nebulizzazione posta tra il compressore e la maschera e nebulizzata alla velocità di flusso di 20 L/min (Votion et al., 1997). La dose somministrata è stata di 3,3 mg/kg ogni 24 ore (q24h) per 10 giorni (McKenzie e Murray 2000; McKenzie e Murray 2004; Art et al., 2007; Art et al., 2010). Per quanto riguarda il trattamento sistemico, i pazienti del gruppo B sono stati sottoposti a somministrazione endovenosa di amikacina alla dose di 10 mg/kg q24h per 10 giorni (Pinto et al., 2011). Prima e dopo ogni somministrazione ciascun soggetto veniva sottoposto ad accurato esame clinico. Per tutta la durata dello studio i cavalli sono stati quotidianamente passeggiati a mano. Nessun altro tipo di trattamento è stato fornito agli animali. Al termine di entrambi i protocolli di trattamento, per tutti i cavalli è stata nuovamente condotta la procedura di valutazione descritta precedentemente (clinical score, TW, esame citologico e colturale).

re statistico commercialeh. I dati relativi alla conta differenziale dei neutrofili nel TW, alle UFC/ml ed al punteggio attribuito secondo il clinical scoring system nel gruppo A e nel gruppo B, prima e dopo i rispettivi trattamenti, sono stati analizzati mediante test T di Student per campioni appaiati. La distribuzione delle frequenze di isolamento batterico PT nel gruppo A e nel gruppo B è stata confrontata mediante il test del Chi-quadrato. Per tutti i test utilizzati, i risultati con valore di p < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.

RISULTATI I risultati relativi al gruppo A prima e dopo il trattamento sono illustrati in Tabella 2, mentre la Tabella 3 illustra i risultati ottenuti prima e dopo il trattamento nei cavalli del gruppo B. I risultati del test T di Student mostrano come per il gruppo A PT si sia osservata una diminuzione altamente significativa (p < 0,01) delle UFC/ml nel TW (Figura 3); una riduzione altamente significativa (p < 0,01) del clinical score (Figura 4) e una diminuzione significativa (p < 0,05) della conta differenziale

Analisi statistica I dati ottenuti prima e dopo il trattamento (PT) in entrambi i gruppi sono stati analizzati con softwa-

SPSS 19.0, IBM, Milano, Italia.

TABELLA 2 Risultati relativi al gruppo A prima e dopo la somministrazione di amikacina per via inalatoria Pre-trattamento

Post-trattamento

Cavallo n.

% Neutrofili TW

UFC TW

Clinical Score

% Neutrofili TW

UFC TW

Clinical Score

100

250

100

300

200

500

300

150

100

300

200

TABELLA 3 Risultati relativi al gruppo B prima e dopo la terapia per via endovenosa Pre-trattamento

Post-trattamento

Cavallo n.

% Neutrofili TW

UFC TW

Clinical Score

% Neutrofili TW

UFC TW

Clinical Score

200

300

200

300

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❚ Medicina sportiva dei granulociti neutrofili nel TW (Figura 5). Per quanto riguarda il gruppo B PT si osservava una diminuzione altamente significativa (p < 0,01) delle UFC/ml (Figura 3) ed una diminuzione significativa (p < 0,05) del clinical score (Figura 4). Non si osservava alcuna differenza statisticamente significativa tra le conte differenziali dei neutrofili nel TW PT (Figura 5). Il test del Chi-quadrato non mostrava alcuna differenza statisticamente significativa tra i due gruppi nelle frequenze di isolamento batterico PT.

DISCUSSIONE Nel cavallo, gli studi pubblicati riguardanti la somministrazione di antibiotici per via inalatoria sono un numero esiguo. In particolare, a differenza dell’uomo e del suino (Goldstein et al., 2002A; Goldstein et al., 2002B; Lu et al., 2011), non risultano studi clinici riguardanti l’efficacia della somministrazione di amikacina per via inalatoria nel paziente equino. In questo primo studio abbiamo voluto esaminare l’efficacia della somministrazione di amikacina per via inalatoria, rispetto alla somministrazione endovenosa, valutandone gli effetti sulle UFC/ml isolate, sulla conta differenziale di granulociti neutrofili nel TW e sul clinical score prima e dopo il trattamento. A questo proposito, la riduzione altamente significativa delle UFC/ml nel TW nel gruppo A PT sembra suggerire un’effettiva azione battericida del trattamento per via inalatoria, analogamente a quanto osservato nel gruppo B. Nonostante gli aminoglicosidi siano antibiotici ad azione “concentrazione-dipendente”, la riduzione della dose ad un terzo di quella utilizzata per la somministrazione endovenosa risulterebbe comunque efficace. Tuttavia ulteriori studi circa la concentrazione plasmatica e locale, a livello delle vie respiratorie, ottenibile dopo somministrazione per via inalatoria di amikacina nel cavallo potrebbero essere utili per valutare correttamente la distribuzione del principio attivo. La riduzione significativa della percentuale dei neutrofili ottenuta nel gruppo A potrebbe essere interpretata come una conseguenza della riduzione delle UFC/ml. Infatti, la colonizzazione da parte dei batteri dell’epitelio respiratorio porta alla liberazione di metaboliti batterici e di molecole prodotte dai tessuti danneggiati. Di conseguenza l’endotelio vasale è indotto a permettere la diapedesi dei neutrofili verso il sito di colonizzazione. La riduzione della carica batterica determinerebbe un calo degli stimoli chemiotattici nei confronti dei neutrofili e, di conseguenza, una diminuzione della loro percentuale nel TW (Lunn e Holohov, 2010). Poiché, oltre ai metaboliti batterici, anche i neutrofili liberano molecole pro-infiammatorie, ne consegue che la diminuzione della

FIGURA 3 - Confronto delle UFC/ml (* indica p < 0,01) prima e dopo il trattamento per via inalatoria (gruppo A) e per via endovenosa (gruppo B).

FIGURA 4 - Confronto del clinical score (* indica p < 0,01; + indica p < 0,05) prima e dopo il trattamento per via inalatoria (gruppo A) e per via endovenosa (gruppo B).

FIGURA 5 - Confronto della conta percentuale (+ indica p < 0,05) dei granulociti neutrofili, prima e dopo il trattamento per via inalatoria (gruppo A) e per via endovenosa (gruppo B).

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❚ Medicina sportiva neutrofilia possa avere determinato la riduzione altamente significativa dei punteggi di clinical score PT. La riduzione significativa del clinical score nel gruppo B appare sovrapponibile a quanto osservato in seguito a somministrazione per via inalatoria. La conta percentuale dei neutrofili nel TW invece, dopo trattamento endovenoso, non ha evidenziato una variazione significativa, sebbene anche in questo gruppo sia possibile osservare una sensibile riduzione della stessa. Secondo la nostra opinione, osservando anche l’andamento degli altri parametri presi in esame, la non significatività statistica potrebbe essere imputata al numero esiguo di soggetti-campione. Per quanto riguarda il confronto tra i due gruppi, l’assenza di differenze significative nell’isolamento batterico PT permette di affermare che le due vie di somministrazione possono essere considerate sovrapponibili per quanto riguarda l’efficacia battericida, nonostante la quantità di antibiotico somministrato per via inalatoria risulti decisamente inferiore. È possibile concludere che l’amikacina somministrata per via inalatoria alla dose di 3,3 mg/kg ogni 24 ore per 10 giorni è risultata efficace nella riduzione della carica batterica e del relativo processo infiammatorio a carico del tratto respiratorio, con un significativo miglioramento del clinical score, e tale efficacia si è dimostrata sovrapponibile al trattamento endovenoso di controllo. A parità di efficacia, la somministrazione per via inalatoria rispetto a quella endovenosa permette di ridurre la dose di principio attivo somministrato, riducendo di conseguenza anche il rischio di eventuali reazioni avverse. Nel caso specifico degli aminoglicosidi i rischi di effetti collaterali sono riferibili soprattutto alla nefrotossicità, correlata anche all’utilizzo di dosi elevate (Brown e Riviere, 1991; Di Fabio et al., 2004). Inoltre, la somministrazione per via inalatoria permette di limitare l’assorbimento sistemico del principio attivo (Goldstein et al., 2002B). In futuro, la valutazione dei parametri di funzionalità renale, in seguito a trattamento con amikacina per via inalatoria, potrebbe essere oggetto di studio nel cavallo. La riduzione della dose garantirebbe anche di contenere i costi del trattamento: la spesa iniziale per la strumentazione infatti potrebbe essere velocemente ammortizzata in caso di acquisto per un gruppo di cavalli (ad esempio maneggio, scuderia di cavalli da corsa), raccomandando ovviamente un’accurata disinfezione in caso di trattamenti a più animali. Questo tipo di trattamento si è dimostrato efficace in cavalli con presunta IAD: tuttavia la terapia inalatoria presenta dei limiti in caso di pazienti con coinvolgimento interstiziale, oppure in corso di gravi infezioni del tratto respiratorio che possono avere diffusione ematogena ed esitare in batteriemia (McKenzie 2009). La presenza di elevate quantità di essudato, inoltre, può influenzare la deposi-

zione dell’antibiotico nelle aree del polmone meno ventilate (Goldstein et al., 2002A). In corso di polmoniti e pleuropolmoniti, con elevate cariche batteriche ed interessamento sistemico, la terapia antibiotica sistemica deve comunque essere considerata la prima scelta.

RINGRAZIAMENTI Gli Autori desiderano ringraziare la Dr.ssa Piera Anna Martino per l’esecuzione degli esami batteriologici.

Parole chiave Cavallo, Amikacina, Terapia inalatoria, IAD.

❚ Effects of inhaled amikacin on racehorses with history of poor performance and comparison with intravenous administration Summary Aim of the present study was to evaluate the effect of inhaled amikacin, compared with systemic administration, on tracheal wash (TW) cytology and bacteriology and on clinical scoring in racehorses with presumptive Inflammatory Airway Disease (IAD). Thoroughbred racehorses (n=16) with history of poor performance and positive results of TW bacteriology and amikacin sensitivity test were selected. The horses were then randomly divided in 2 groups: 8 horses (group A) were treated with 3,3 mg/kg of inhaled amikacin q24h for 10 days, 8 horses (group B) received 10 mg/kg of amikacin intravenously q24h for 10 days. Values of clinical score, TW neutrophils differential count and colony forming units/ml (CFU/ml) before and post-treatment (PT) in both groups were compared by Student-T test. Rate of recurrence of bacterial isolation PT between the groups was compared with Chi-squared test. In group A, a significant decrease in clinical score (p < 0,01), TW neutrophils differential count (p < 0,05) and CFU/ml (p < 0,01) was found. In group B a significant decrease in clinical score (p < 0,05) and CFU/ml (p < 0,01) was observed. No difference in bacterial isolation PT was found between groups. In conclusion, inhaled amikacin at a dosage of 3,3 mg/kg q24h for 10 days appeared to be effective in the reduction of clinical score, TW neutrophils percentage and bacterial CFU/ml. The absence of a significant difference between the two groups in the isolation of bacteria PT suggested the effectiveness of inhaled amikacin.

Key words Horse, Amikacin, Inhalation therapy, IAD.

Effetti dell’amikacina per via inalatoria in cavalli sportivi affetti da sindrome da calo di rendimento e confronto con la somministrazione endovenosa

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❚ Medicina sportiva BIBLIOGRAFIA 1. Art T, De Moffarts B, Bedoret D, van Erck E, Lekeux P (2007) Pulmonary function and drug’s concentration after marbofloxacin inhalation in horses. Vet Record 161, 348-350. 2. Art T, Ramery E, Fraipont A, Lekeux P (2010) Pulmonary function, airway cytology and bronchoalveolar lavage fluid drug concentration after aerosol administration of cefquinome to horses. Equine Vet Educ 22 (9), 473-479. 3. Brown SA, Riviere JE (1991) Comparative pharmacokinetics of aminoglycoside antibiotics. J Vet Pharmac Ther 14, 1-35. 4. Burrel MH, Wood JLN, Whitwell KE, Chanter N, Mackintosh ME, Mumford JA (1996) Respiratory disease in thoroughbred horses in training: the relationship between disease and viruses, bacteria and environment. Vet Record 139, 308-313. 5. Christley RM, Hodgson DR, Rose RJ, Wood JLN, Reid SWJ, Witear KG, Hodgson JL (2001) A case-control study of respiratory disease in Thoroughbred racehorses in Sidney, Australia. Equine Vet J 33 (3), 256-264. 6. Di Fabio V, Ferrucci F, Zucca E, Croci C, Ferro E (2004) Valutazione di alcuni test di funzionalità renale in 149 cavalli atleti in allenamento e comparazione con valori ottenuti in soggetti sottoposti a trattamenti farmacologici potenzialmente nefrotossici. Atti del LVII convegno nazionale della Società Italiana delle Scienze Veterinarie 58, 155. 7. Ferro E, Ferrucci F, Zucca E (1998) IAD: Malattia infiammatoria delle basse vie aeree del giovane cavallo atleta. Il Progresso veterinario 53, 889-893. 8. Ferrucci F, Zucca E, Croci C, Di Fabio V, Martino PA, Ferro E (2008) Bacterial pneumonia and pleuropneumonia in sport horses: 17 cases (2001-2003). Equine Vet Educ 20 (10), 526-531. 9. Goldstein I, Wallet F, Nicolas-Robin A, Ferrari F, Marquette CH, Rouby JJ, Experimental Intensive Care Unit Study Group (2002A) Lung deposition and efficiency of nebulized amikacin during Escherichia coli pneumonia in ventilated piglets. Am Journal Respir Crit Care Med 166, 1375-1381. 10. Goldstein I, Wallet F, Robert J, Bequemin MH, Marquette CH, Rouby JJ, Experimental Intensive Care Unit Stu-

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❚ Zoognostica

Caratterizzazione morfo-funzionale e fisiologica dell’asino amiatino Mario Orlandi1, Maria Claudia Curadi1, Alessandro Giorgetti2, Roberto Benedetti3 1

Dipartimento di Scienze Veterinarie, Università di Pisa DISPAA, Università di Firenze 3 Collaboratore esterno 2

RIASSUNTO Gli asini amiatini da noi esaminati presentano, sotto il profilo morfologico, un consistente dimorfismo sessuale. I maschi risultano più alti, con una impalcatura scheletrica più consistente ed indici di ossatura e di costituzione più marcati. La femmina è più leggera, con testa più lunga e sottile e con una potenziale buona conformazione del bacino, tale da far pronosticare un miglior sviluppo mammario migliorabile con un’adeguata selezione e quindi una buona disponibilità alla carriera riproduttiva e produttiva. Il confronto tra soggetti giovani e adulti ci suggerisce che lo sviluppo somatico dell’asino amiatino non può definirsi del tutto completato a cinque anni, specialmente per quanto concerne alcuni parametri legati ai diametri traversi come la circonferenza toracica e soprattutto la larghezza del bacino. Il profilo metabolico non mette in evidenza differenze significative tra i sessi ad eccezione del livello di aspartato aminotransferasi, del contenuto ematico di potassio e del numero di leucociti. Si nota inoltre nei soggetti più anziani una diminuzione del contenuto emoglobinico e del fosforo ematico mentre tendono ad aumentare la creatinina ed il cloro.

INTRODUZIONE In Italia molte razze autoctone di animali domestici si sono numericamente ridotte in modo drastico tanto che oggi il livello di biodiversità appare estremamente basso e numerose risultano a rischio di estinzione: tale aspetto costituisce motivo di preoccupazione sotto diversi profili, non ultimo il danno culturale per la scomparsa progressiva di un patrimonio rappresentato da tipi genetici con caratteristiche peculiari, risultato di secoli di adattamento e di selezione naturale e guidata dall’uomo. È opportuno peraltro ricordare che molti tipi genetici oggi scomparsi od in via di estinzione, anche se talvolta meno produttivi, hanno o avevano produzioni con caratteristiche qualitativamente pregevoli (Fogliata, 1910), particolarmente ricercate da ampie fasce di consumatori attenti alla ricerca di elevati standard qualitativi sia dal punto di vista sensoriale che dietetico oltreché ottenuti proprio nel rispetto della genuinità del prodotto e dei conseguenti riflessi sulla salute umana (Giorgetti, 2009). Gli asini di razza amiatina costituiscono un nucleo numericamente ridotto tanto da essere considerato in condizioni critiche in base alla consistenza delle razze-popolazioni ammesse al Registro Anagrafico e rientrano a pieno titolo nelle categorie di soggetti ora descritti. Ad oggi questi animali, in Italia, vengono prevalentemente utilizzati per lo sfruttamento delle aree marginali, nei tradizionali palii di cui è ricca la nostra tradizione, come prima cavalcatura per i bambini ed anche nella onoterapia per il recupero dei disabili in considerazione di alcune loro peculiari caratteristiche morfologiche e comportamentali, già studiate sul cavallo (Orlandi et al., 2002), che li rendono sicuramente adatti per tale attività. Ancora non del tutto chiarita la possibilità di utilizzazione della sua produzione di latte, attitudine per la quale certamente l’asino amiatino non ha mai subìto processi di selezione mirati. Molte caratteristiche nutrizionali sembrano giustificare invece il crescente interesse, anche in Italia, come avviene ormai da tempo soprattutto in Cina (Yang et al., 2006) ma anche in Europa, specie in Germania e Francia, nei confronti del latte equino in funzione di una possibile utilizzazione nell’alimentazione umana e non solo a fini dietetici. Studi specifici (Chiofalo et al., 2004; Salimei et al., 2004) hanno evidenziato come le caratteristiche chimico-organolettiche del latte di asina siano molto simili a quelle del latte umano così da costituire un alimento estremamente valido per bambini che presentino difficoltà alimentari nei primi mesi di vita. Relativamente alla componente glucidica gli aspetti più interessanti riguardano l’alto contenuto in lattosio ma anche la componente oligosaccaridica la cui varietà compren-

“Articolo ricevuto dal Comitato di Redazione il 11/07/2013 ed accettato per la pubblicazione dopo revisione il 04/10/2013”.

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❚ Zoognostica derebbe oltre 130 saccaridi (Uemura et al., 2009; Urashima et al., 2007; Kunz et al., 2006) costituiti da combinazioni di glucosio, galattosio, acido sialico, fucosio, N-acetilglucosamina che sembrerebbero giocare un ruolo fondamentale nel metabolismo del neonato, il quale non è in grado di sintetizzare nel fegato l’acido sialico, costituente fondamentale per lo sviluppo del suo sistema nervoso centrale. Sono stati validati inoltre risultati sperimentali che hanno confermato che il rapporto sieroproteine/caseine che caratterizza questo latte sia di particolare ausilio soprattutto nell’alimentazione di bambini con manifesta allergia IgE-mediata al latte vaccino (Lucenti et al., 1999; Businco et al., 2000; Curadi et al., 2001; Curadi et al., 2001a). Le indagini intraprese hanno avuto lo scopo di costituire una banca dati, la più vasta possibile, per quanto riguarda i principali parametri morfologici, i più significativi indici zoometrici ed i più importanti riferimenti utili alla caratterizzazione di un profilo metabolico dell’asino dell’Amiata. I risultati ottenuti, aggiunti e confrontati con nostre precenti indagini (Orlandi et al., 1997; Orlandi et al., 1997a) potranno offrire utili riferimenti ai fini di una approfondita conoscenza della razza in oggetto ed assumeranno significato non solo nella più esatta formulazione degli standard ma anche ai fini dei controlli sanitari o propriamente per una precisa valutazione di eventuali alterazioni metaboliche legate ad una alimentazione carente o inadeguata, ed infine, per quanto già espresso, per poter meglio sottolineare e studiare la predisposizione dei soggetti di razza amiatina per l’utilizzazione delle aree marginali, per la onoterapia e soprattutto ai fini di un possibile miglioramento della produzione di latte, suggerendo eventuali interventi di tipo selettivo mirati.

MATERIALI E METODI La prima parte dell’indagine è costituita dalla raccolta progressiva dei parametri morfologici e dei principali indici zoometrici relativi ad un numero totale di 82 asini amiatini di cui 54 femmine e 28 maschi; l’età dei soggetti oscillava tra i 5 ed i 25 anni; essi provenivano per lo più da allevamenti di tipo familiare, situati nella maggior parte nella provincia di Grosseto ed in minoranza nella provincia di Siena. In dettaglio sono stati esaminati:

Parametri morfologici Lunghezza e larghezza della testa, lunghezza e circonferenza del collo, lunghezza del tronco, profondità, circonferenza e altezza del torace, ampiezza del petto, lunghezza del dorso, lunghezza e larghezze (bisiliaca e bisischiatica) della groppa, distanza ginocchio-punta dell’anca e ginocchio-punta della natica, altezze al garrese, croce, groppa e

Caratterizzazione morfo-funzionale e fisiologica dell’asino amiatino

coda, lunghezza parte libera dell’arto, circonferenza dello stinco.

Indici morfologici di formato – Indice di conformazione laterale del corpo: rapporto tra altezza garrese e lunghezza tronco. – Indice toracico di profilo: rapporto tra altezza torace e lunghezza tronco. – Indice toracico trasversale: rapporto tra profondità e altezza torace. – Indice di compattezza o indice corporale: rapporto tra lunghezza tronco e circonferenza toracica. – Indice di altezza del torace: rapporto tra altezza torace ed altezza garrese.

Indici meccanici o di costruzione – Indice di lunghezza del bacino: rapporto tra lunghezza groppa e lunghezza tronco.

Indici organici o di costituzione – Indice di lunghezza del torace: rapporto tra profondità torace e lunghezza tronco meno lunghezza groppa. – Indice di larghezza del bacino: rapporto tra larghezza bisischiatica e bisiliaca. – Indice di lunghezza della testa: rapporto tra lunghezza testa ed altezza garrese.

Indici di volume – Indice di ossatura: rapporto tra perimetro stinco e circonferenza toracica. L’indagine concernente il profilo metabolico è stata svolta su un totale di 65 asini di cui 47 femmine e 18 maschi tra i 3 ed i 19 anni. Per questa prova è stata selezionata la maggior parte dei soggetti già utilizzati per l’indagine morfologica; inoltre sono stati impiegati anche altri soggetti, alcuni anche di età inferiore. Gli animali hanno utilizzato, durante la fase sperimentale, condotta nel periodo primaverile, esclusivamente essenze foraggere provenienti dal pascolo senza alcuna integrazione. I prelievi di sangue sono stati operati sempre alla stessa ora, la mattina a digiuno, per un totale di 5 a giorni alterni, cercando di ridurre al minimo qualsiasi stress da contenimento. Sul siero sono state effettuate le seguenti analisi: proteine totali, creatinchinasi (CK), latticodeidrogenasi (LDH), aspartatoaminotransferasi (AST), alaninaminotransferasi (ALT), fosfatasi alcalina (ALP), gammaglutamiltransferasi (gammaGT), bilirubina totale, urea, creatinina, calcio, fosforo inorganico, potassio, cloro, ferro. Per la determinazione di CK, LDH, AST, ALT, ALP sono stati utilizzati kit ottimizzati (IFCC) e standard Boehringer; per la bilirubina è stato utilizzato il metodo colorimetrico Jendrassik, per le proteine totali il metodo del biureto. Per la quantificazione dell’azoto ureico è stato impiegato il test enzimatico colorimetrico Boehringer. Il fosforo ed il cloro sono stati determi-

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❚ Zoognostica nati con metodo colorimetrico SEAC; calcio, potassio e ferro sono stati determinati tramite spettrofotometria ad assorbimento atomico; è stato inoltre operato ogni volta un esame emocromocitometrico completo. Sono state calcolate le medie e l’errore standard. La comparazione per sessi e per età è stata operata separatamente con l’analisi della varianza ad una via. Il confronto tra età e sesso per le valutazioni morfologiche è stato condotto con l’analisi della varianza a due vie secondo un modello fattoriale completo. Al fine di ottenere maggiori informazioni circa l’eventuale influenza dell’età sui parametri fisiologici analizzati, si è ritenuto opportuno suddividere le campionature in due gruppi, uno comprendente soggetti di età inferiore od uguale a cinque anni, quindi non ancora adulti, ed un altro quelli di età superiore. Anche in questo caso è stata operata l’analisi della varianza ad una via nel confronto tra i due nuclei.

RISULTATI Nella Tabella 1 vengono riportati i valori relativi ai singoli tratti morfologici nei due gruppi di asini amiatini suddivisi per sesso. Si notano marcate e significative differenze innanzi tutto per quanto concerne le altezze al garrese (cm 136,1 vs. cm 131,0) alla croce (135,9 vs. 131,4) ed alla groppa (133,7 vs. 127,6) con misure sempre prevalenti nei maschi ed anche per quanto riguarda circonferenza del torace (156,5 vs. 151,3) e circonferenza dello stinco (18,7 vs. 17,4). Tali valori sono paragonabili a quelli riscontrati in una nostra precedente indagine (Orlandi et al., 1997) e superiori a quelli verificati da Sargentini et al. (2009). La lunghezza della testa risulta statisticamente superiore nelle femmine (68,1 vs. 65,8) mentre la larghezza non evidenzia differenze. Molte delle altre misure sono superiori nei maschi, come ad esempio la lunghezza del tronco (144,4 vs. 141,2), la profondità del torace (62,3 - 59,5) e la lunghezza della groppa (89,8 - 84,5). Per quanto concerne il posteriore ed in particolar modo la groppa, alcune misure di larghezza sono invece significativamente superiori nelle femmine come la larghezza anteriore della groppa (57,9 vs. 48,6) e la distanza ginocchio - punta dell’anca (38,3 vs. 37,6) a sottolineare un maggior sviluppo del bacino. Possiamo dunque osservare un evidente dimorfismo sessuale con una struttura più massiccia nei maschi, che si presentano più alti e con una superiore consistenza scheletrica, ad evidenziare un maggior sviluppo dei diametri trasversi, specie nel treno posteriore nelle femmine, per le quali un buon sviluppo del bacino potrebbe già indicare validi suggerimenti selettivi per un ulteriore miglioramento accompagnato da un buon sviluppo dell’apparato mammario. L’esame della Tabella 2 ci consente di verificare che gli indici meccanici o di costruzione (29,2 e

TABELLA 1 Parametri morfologici M = n 28

F = n 54

Lunghezza testa

65,8 ± 0,64

68,1 ± 0,68

Larghezza testa

24,4 ± 0,44

24,7 ± 0,48

n.s.

Lunghezza collo

61,0 ± 0,66

63,0 ± 0,41

Circonferenza collo

92,1 ± 0,82

87,4 ± 0,64

Lunghezza tronco

144,1 ± 0,81

141,2 ± 0,71

Profonditò torace

62,3 ± 0,70

59,5 ± 0,62

156,5 ± 0,42

151,3 ± 0,84

Altezza torace

67,0 ± 0,83

61,9 ± 1,02

Larghezza petto

31,5 ± 0,34

31,2 ± 0,48

n.s.

Lunghezza dorso

89,8 ± 0,69

84,5 ± 0,64

Lunghezza groppa

42,6 ± 0,84

37,9 ± 1,01

Larghezza ant. groppa

48,6 ± 0,68

57,9 ± 0,34

Larghezza post. groppa

21,1 ± 0,48

21,9 ± 0,21

n.s.

Dist. ginocchio-anca

37,6 ± 0,49

38,3 ± 0,64

Dist. ginocchio-natica

47,9 ± 0,21

47,8 ± 0,34

n.s.

Altezza garrese

136,1 ± 0,54

131,0 ± 0,98

Altezza croce

135,9 ± 0,82

131,4 ± 0,48

Altezza groppa

133,7 ± 0,78

127,6 ± 1,02

Altezza coda

118,0 ± 0,41

115,0 ± 0,86

Lunghezza p. libera arto

68,1 ± 0,84

67,8 ± 0,56

n.s.

Circonferenza stinco

18,7 ± 0,22

17,4 ± 0,18

Circonferenza torace

M = maschi - F = femmine - n = numero soggetti - S = significatività * = p<0,05 - * * = p<0,01

29,6 nei maschi al di sotto ed al di sopra rispettivamente dei 5 anni, per quanto concerne l’indice di lunghezza del bacino) ci offrono importanti informazioni anche per quanto riguarda il movimento e risultano significativamente superiori ai valori riscontrati nei gruppi femminili. Anche gli indici morfologici organici che offrono indicazioni sulla struttura delle diverse regioni del corpo risultano pressoché totalmente superiori nei maschi: in particolare si osserva che l’indice di lunghezza del torace intesa come rapporto tra profondità toracica e lunghezza del tronco meno lunghezza della groppa risulta pari a 60,2 e 61,8 nei maschi più giovani e sopra i 5 anni rispettivamente, e 55,6 e 57,5 nelle femmine. Si nota inoltre in linea maschile una diminuzione significativa dell’indice di compattezza con il progredire dell’età; si conferma pertanto la tendenza all’aumento della circonferenza toracica negli asini che hanno superato i 5 anni. Si evidenziano differenze significative per i maschi per quanto riguarda i valori dell’indice di conformazione laterale del corpo che aumenta nei più anziani forse perché, a causa della scarsa precocità della razza, che non ha subìto selezioni finalizzate, l’altezza al garrese tende ad aumentare anche dopo i 5 anni. Un’analoga Ippologia, Anno 24, n. 3-4, Settembre-Dicembre 2013

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❚ Zoognostica TABELLA 2 Confronto degli indici relativi ai soggetti suddivisi per età e sesso Indici

Indici di formato

Indici meccanici Indici organici Indici di volume

Indice conformazione laterale corpo (hg/lt)

91,8

94,4

91,9

92,2

n.s.

Indice toracico profilo (htor/lt)

45,8

47,1

n.s.

44,7

44,6

n.s.

Indice toracico trasversale (ltor/htor)

92,8

92,1

n.s.

94,2

95,0

n.s.

Indice compattezza (lt/ctor)

95,1

91,4

95,3

93,6

n.s.

Indice altezza torace (htor/hg)

49,6

49,8

n.s.

48,7

48,4

n.s.

Indice lunghezza bacino (lgr/lt)

29,2

29,6

n.s.

24,6

25,9

n.s.

Indice lunghezza torace (htor/lt-lgr)

60,2

61,8

n.s.

55,6

57,5

n.s.

Indice larghezza bacino (lbisisch/lbisi)

43,1

43,0

n.s.

40,3

40,5

n.s.

Indice lunghezza testa (ltes/hg)

45,9

49,4

52,5

52,3

n.s.

Indice ossatura (psa/ctor)

12,0

12,1

n.s.

11,8

11,6

n.s.

M1 = soggetti di sesso maschile di età ≤ 5 anni - M2 = soggetti di sesso maschile di età ≥ 5 anni F1 = soggetti di sesso femminile di età ≤ 5 anni - F2 = soggetti di sesso femminile di età ≥ 5 anni n = numero dei soggetti - S = significatività * = p<0,01 - ** = p<0,001

TABELLA 3 Valori ematici relativi ai due sessi (Media ± DS) Parametri ematici Eritrociti

U X1012/l

Media ± DS M = n 19

Media ± DS F = n 47

5,77

1,75

5,28

1,44

X10 /l

8,24

4,01

13,02

3,22

g/dl

14,0

0,61

13,6

0,33

n.s.

Neutrofili

50,0

1,28

53,0

1,00

n.s.

Eosinofili

1,8

0,33

2,1

0,26

n.s.

Basofili

Linfociti

46,4

1,38

43,5

1,08

n.s.

Monociti

1,9

0,28

2,0

0,21

n.s.

Proteine tot

g/dl

7,0

0,15

7,3

0,1

n.s.

LDH

UI/l

356,6

27,63

360,5

17,10

n.s.

UI/l

118,3

18,26

133,4

11,30

n.s.

AST

UI/l

199,4

14,83

160,0

9,18

ALT

UI/l

5,8

0,65

5,0

0,40

n.s.

g-GT

UI/l

39,8

3,36

33,5

2,08

n.s.

Leucociti Hb

ALP

n.s.

UI/l

225,8

22,74

225,8

14,07

n.s.

N ureico

mg/dl

39,0

2,53

39,3

1,57

n.s.

Creatinina

mg/dl

1,31

0,05

1,19

0,03

n.s.

Bilirubina tot.

mg/dl

0,13

0,04

0,16

0,03

n.s.

Sodio

mmol/l

137,8

1,04

137,2

0,64

n.s.

Potassio

mmol/l

4,3

0,18

4,9

0,11

Cloro

mmol/l

102,9

0,95

104,4

0,59

n.s.

Calcio

mg/dl

11,3

0,34

11,8

0,21

n.s.

Fosforo

mg/dl

Ca/P Ferro

mg/dl

5,7

0,34

4,8

0,29

n.s.

2,58

0,21

2,62

0,12

n.s.

123,2

6,70

113,1

4,14

n.s.

M = soggetti di sesso maschile - F = soggetti di sesso femminile n = numero dei soggetti - S = significatività * = p<0,05 - ** = p<0,01

Caratterizzazione morfo-funzionale e fisiologica dell’asino amiatino

tendenza si osserva in linea femminile, pur non evidenziandosi differenze significative tra i due gruppi. L’indice di lunghezza della testa, inoltre, mostra un aumento altamente significativo nei maschi più anziani (49,4 vs. 45,9), mentre in linea femminile questi tratti morfologici sembrano già definiti evidenziando una generale maggiore precocità somatica. Nella Tabella 3 vengono riportati i valori medi dei parametri ematici considerati. Dall’esame della stessa si può notare una notevole uniformità nei due sessi; infatti per quanto concerne l’esame emocromocitometrico solo il numero dei leucociti si differenzia, risultando significativamente superiore nelle femmine (13,02 vs. 8,24). Gli eritrociti mostrano valori pari a 5,77 x 1012/l e 5,28 x 1012/l rispettivamente nei maschi e nelle femmine. Anche i neutrofili, di norma più elevati numericamente nei maschi (Schalm et al., 1975) non mostrano differenze significative (50,0 vs. 53,0% nella formula leucocitaria). Da segnalare, tra gli enzimi valutati, che l’aspartatoaminotransferasi (AST) è significativamente superiore nei maschi (199,4 UI/l vs. 160 UI/l). In bibliografia non si trovano di norma differenze per questo parametro nel cavallo, mentre per quanto concerne la specie asinina livelli simili sono rilevati da Vacca et al. (1994) nell’asino sardo. Si notano differenze significative tra i sessi in alcuni parametri come la potassiemia, che risulta più elevata nelle femmine (4,9 mmol/l vs 4,3); ciò non si verifica per la natriemia; la sideremia risulta superiore nei maschi (123,2 mg/dl vs. 113,1 mg/dl), mentre la cloremia raggiunge livelli superiori nelle femmine (104,4 mmol/l vs. 102,9) anche se non si sono evidenziate differenze statisticamente significative. La bilirubina totale mostra livelli superiori nelle femmine (0,16 mg/dl vs. 0,13 mg/dl), mentre la creatinina è apparentemente superiore nei soggetti maschi (1,31 mg/dl e 1,19

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❚ Zoognostica mg/dl) anche se non si evidenziano differenze statisticamente significative. Infine il valore dell’azoto ureico si presenta pressoché uguale in media nei due sessi (39,3 mg/dl nelle femmine vs. 39,0 mg/dl nei maschi). Nella Tabella 4 sono riportate le medie dei singoli parametri suddivisi in due classi di età, al di sopra ed al di sotto dei cinque anni. Anche in questo caso si possono formulare alcune utili osservazioni. La differenza tra i due gruppi risulta significativa per: emoglobina, creatinina, cloro, fosforo e rapporto Ca/P. Per quanto riguarda Hb si nota inoltre che il valore medio scende con l’età (14,5 g/dl vs. 13,6), in contrasto con quanto osservato da altri AA. (Ekman et al., 1976), Codazza et al. (1978), che hanno però rilevato tali parametri in cavalli trottatori. Valori inferiori sono riportati peraltro anche da Carcangiu et al. (2003) in asini bianchi dell’Asinara. Per la creatinina si nota un aumento con l’avanzare dell’età (1,32 mg/dl vs. 1,13 mg/dl) forse attribuibile al maggior sviluppo corporeo dei soggetti più adulti che potrebbe determinarne una utilizzazione più elevata da parte delle fibre muscolari favorendo appunto l’innalzamento dei livelli creatininici nel plasma. Relativamente ai principali enzimi considerati non si segnalano differenze significative in rapporto all’età degli animali, in accordo con gli AA. (Codazza et al., 1978; Ximenes et al., 1984; Greppi et al., 1990; Zinkl et al., 1990.) che hanno affrontato l’argomento nel cavallo ed anche con Vacca et al. (1994), nell’asino Sardo, che sostiene come eventuali differenze riscontrate tra i soggetti non risultino agevolmente interpretabili se non facendole risalire in termini generali, come affermato anche da altri AA (Payne et al., 1987; Spandrio, 1989), a fenomeni di induzione o attivazione enzimatica, su base androgenica surrenalica, più spiccati in soggetti di sesso maschile.

DISCUSSIONE Le indagini sperimentali condotte ci inducono ad affermare che i nuclei di asini amiatini da noi esaminati presentano, sotto il profilo morfologico, un consistente dimorfismo sessuale. I maschi appaiono più alti, con una impalcatura scheletrica più consistente ed indici di ossatura e di costituzione più marcati. La femmina è più leggera, con testa più lunga e sottile, con diametri longitudinali più sviluppati rispetto ai trasversali nell’anteriore, ma con una buona conformazione del posteriore specialmente per quanto riguarda il bacino. Il confronto tra i gruppi dei soggetti giovani ed adulti evidenzia indici di ossatura e di compattezza superiori nei primi, probabilmente per l’aumento progressivo, con l’età, della circonferenza toracica, specie in linea maschile. L’indice di lunghezza del bacino risulta altresì significativamente più elevato nei

TABELLA 4 Valori ematici relativi alle due categorie di età (Media ± DS)

Parametri ematici

Soggetti ≤ 5 anni Media ± DS n 32

Soggetti > 5 anni Media ± DS n 33

g/dl

14,5

0,44

13,6

0,36

Proteine tot

g/dl

7,3

0,11

7,1

0,10

n.s.

LDH

UI/l

378,7

20,45

340,7

20,13

n.s.

UI/l

125,6

13,74

132,8

13,53

n.s.

AST

UI/l

170,8

11,57

171,0

11,39

n.s.

ALT

UI/l

5,2

0,49

5,2

0,48

n.s.

g-GT

UI/l

36,4

2,56

34,2

2,52

n.s.

ALP

UI/l

261,0

17,50

260,8

17,23

n.s.

Urea

mg/dl

40,6

1,88

37,9

1,85

n.s.

Creatinina

mg/dl

1,13

0,04

1,32

0,04

Bilirubina tot.

mg/dl

0,15

0,03

0,14

0,03

n.s.

Sodio

mmol/l

136,6

0,77

138,1

0,76

n.s.

Potassio

mmol/l

4,77

0,14

4,78

0,14

n.s.

Cloro

mmol/l

102,6

0,68

105,3

0,67

Calcio

mg/dl

11,4

0,25

11,9

0,25

n.s.

Fosforo

mg/dl

5,8

0,33

4,3

0,32

2,26

0,15

2,87

0,15

mg/dl

115,8

5,09

116,0

5,01

n.s.

Ca/P Ferro

n = numero dei soggetti - S = significatività * = p <0,05 - * * = p <0,01

soggetti di età inferiore, mentre quello di lunghezza della testa è maggiore nel nucleo dei più anziani. Tali risultati ci inducono a concludere che lo sviluppo somatico dell’asino amiatino non può definirsi del tutto completato a cinque anni, specialmente per quanto concerne alcuni diametri traversi come la circonferenza toracica e soprattutto la larghezza del bacino. Il profilo metabolico ci mostra che non sono evidenziabili differenze consistenti tra i sessi ad eccezione del livello di aspartato aminotransferasi, del contenuto ematico di potassio e del numero di leucociti. Si nota inoltre nei soggetti più anziani una diminuzione del contenuto emoglobinico e del fosforo ematico, aspetti fisiologicamente compatibili, mentre tendono ad aumentare la creatinina ed il cloro. I valori non si discostano sostanzialmente da quanto riportato in Letteratura per la specie equina e costituiscono una banca dati inerente la razza esaminata: essi possono fornire un utile riferimento nell’ambito di controlli sanitari ed in eventuali alterazioni metaboliche connesse ad errori dietetici o a sindromi e manifestazioni patologiche ma soprattutto, se unite alle cognizioni di ordine morfologico, possono costituire un valido strumento per protocolli di selezione finalizzati. Ippologia, Anno 24, n. 3-4, Settembre-Dicembre 2013

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❚ Zoognostica Parole chiave Asino amiatino, parametri morfo-funzionali, parametri fisiologici.

❚ Morpho-functional and physiological characterization of Amiata Donkey Summary The Amiata donkeys we have examined present, in terms of morphology, a significant sexual dimorphism. Males are higher, with larger skeletal framework and stronger indices of bone formation and body composition. The female is lighter, with longer and thin head and with a good pelvis structure, such as to better predict udder system development improvable by an appropriate selec-

tion and then a good availability to reproductive and productive career. The comparison between younger and more mature adults suggests that the Amiata donkey somatic development can not be defined fully completed within five years, especially with regard to some transverse diameter as the chest circumference and the width of the basin. The metabolic profile does not highlight significant differences as to sexes except for aspartate aminotransferase level, potassium blood content and leukocytes number. Between older subjects we noted a decreasing hemoglobin content and blood phosphorus, blood creatinine and chlorine increase.

Key words Amiata donkey, morpho-functional traits, physiological parameters.

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Caratterizzazione morfo-funzionale e fisiologica dell’asino amiatino

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❚ Malattie infettive

Monitoring the immune response of horses vaccinated with inactivated Equine herpes virus-1 vaccine Nehal, S. Saleh; Safaa, A. Warda; Eman, M. Ebeid; Nashwa, K. Madkour & Magda, A. Kalad Veterinary Serum and Vaccine Research Institute, Abbasia, Cairo, Egypt P.O. Box:131- Fax: (202) 23428321 - E-mail: svri@idsc.gov.eg

ABSTRACT Three tissue culture inactivated equine herpesvirus-1(EHV-1) vaccines formulae were successfully prepared using different adjuvants (Montanide ISA - 206, Mineral oil and saponin with two concentrations).Virus was inactivated by binary ethyleneimine and residual virus infectivity was carried out on VERO cells and chorioallantoic membrane of embryonated chicken eggs. The vaccines proved to be safe and potent in both pregnant mice and mares. Challenge was applied only to inoculated mice to detect the role of vaccine in reduction of virus reisolation. Cell mediated immune response in horse by lymphocyte blastogenesis revealed that there was an increase in the cytotoxic T-lymphocytes (CTL) at the 5th day postvaccination and declined at 10th day then begins to increase at 10th day post boostering till 30 days. Also, the result showed that Montanide vaccine is better than mineral oil and horses vaccinated with saponin adjuvanted vaccine with 4 mg/dose induced more CTL than 2 mg/ dose after vaccination but were nearly of the same value after boostering. Assessment of the vaccine immunogenicity in horses by ELISA and complement fixation tests (CFT) revealed that saponin adjuvanted vaccine was the best one and 2 mg & 4 mg/dose saponin produced the same immune potentiation effect.

INTRODUCTION Equine herpesvirus-1 (EHV-1) is an important ubiquitous viral pathogen that induce sporadic or storms of abortion in pregnant mares, early neonatal death, respiratory disease in young foals and myloencephalopathy (Reed and Toribio, 2004- Patel and Heldens, 2005). In Egypt, virus isolation & identification from several outbreaks were recorded in 1998 (Hassanein et. al. 2002), 2007 (Nehal et. al., 2009) and 2009- (Abd El-Hafiez et. al., 2010). Vaccination is the crucial to control the disease using either live attenuated or inactivated vaccines. Inactivated one is more preferable (Mayr et. al., 1978). Adjuvants are modulators when used in combination with specific antigen or hapten enhance the immune response. Saponins are glycosides of steroid and triterpene which induce antinflammatory, immunomodulatory, antitumor, anti-fungal, antiviral, hypoglycemic and hypocholesremic action (Lacaille-Dubois, 2005). EHV-1 ISCOM vaccine produced from purified virion proved to protect hamsters challenged with lethal dose of hamster adapted EHV-1 (Cook et. al., 1990). On the other hand Montanide ISA-206 adjuvant (a mineral oil composed of metabolic sequalene-based oil with Mannide monoleate emulsifier) was reported to induce early and long term protective immune response (Cauchard et. al., 2004). The aim of this work was to evaluate the immune response by monitoring humeral and cellular immunity of horses vaccinated with inactivated EHV-1 vaccine using different adjuvants (Montanide ISA-206, mineral oil & saponin) and assessment their safety & potency to determine the best one.

MATERIALS AND METHODS I. Virus EHV-1 locally isolated strain in 2007 (Nehal et al., 2009) supplied by Equine Viral Disease Research Depart., Veterinary Serum and Vaccine Research Institute (VSVRI), Abbasia, Cairo.

II. Antisera A) Reference freeze dried rabbit anti EHV-1 Serum was kindly supplied by Dr. Jennet Wellington, Research follow, Dept. of biological science, Maquairia, Univ, NSW Australia and used for virus identity.

“Articolo ricevuto dal Comitato di Redazione il 14/02/13 ed accettato per la pubblicazione dopo revisione il 26/11/13”.

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❚ Malattie infettive B) Locally prepared rabbit anti EHV-1 hyper immune serum (Safaa et al., 2005). It was used as a positive serum control in serological tests.

A) Eighteen apparently healthy pregnant and non pregnant mares. B) Groups of mice, 4-6 weeks old were used to evaluate the potency and safety.

concentration 0.008M of BEI (Nehal, 2006). The control virus and the inactivated one were incubated at 37ºC for 24 hours with continuous stirring followed by addition of sodium thiosulphate at final concentration 2% to stop the action of BEI on the virus and neutralize the toxic action of residual inactivator on target host. Samples were taken at different time intervals to determine the actual time of virus inactivation.

IV. African green monkey kidney cells (VERO)

XI - Residual infective virus activity

It was maintained and grown in Eagle’s minimum essential media supplemented with 10% newly born calf serum, antifungal, penicillin sodium 100 IU/ml and streptomycin 100 mg/ml. It used in vaccine preparation.

It was applied by inoculation of inactivated virus fluid on: 1) Chorioallantoic membrane (CAM) of embryonated chicken eggs (ECE) 11-13 days incubated at 37ºC for five days with daily examination (Nehal, 2006). 2) VERO cells, incubated at 37ºC for seven days with daily observation addition blind passage was done.

III. Animals

V. Embryonated chicken eggs (ECE) 11-13 days old specific pathogens free-embryonated chicken eggs (SPF–ECE) were used for detecting the virus infectivity.

VI. Binary ethyleneimine (BEI) 0.1M binary ethyleneimine (Aldrich chemical Co. LTD) were used as virus inactivator according to Bahnemann (1990).

XII - Vaccine preparation Inactivated virus fluid was mixed with three different adjuvants separately (Mineral oil, Montanide ISA -206 and Saponin). Saponin was mixed with inactivated virus in two different concentration (2 and 4 mg/dose). The vaccinal dose (2 ml) contains not less than 107 TCID50 / dose (Mayr, et. al. 1978).

VII. Adjuvants 1- Montanide™ oil ISA- 206 Montanide oil ISA 206 VG is a mineral oil based adjuvant which has been developed for the manufacture of Water-in-Oil-in-Water (W/O/W) emulsions (50% w/w) produced by Seppic company. 2- Mineral oil It composed of paraffin oil (white mineral oil), tween 80 (polyethylene sorbitan) and span 80 (sorbitan monooleate) and sterilized by autoclaving (Nehal, 1998). 3- Saponin Saponin was obtained from Ubichem.PIc. (Anderson et al., 1971- Soliman et al., 2011).

VIII. Preparation of vaccine virus fluid Second passage (P2) of EHV-1 was seed virus was propagated on VERO cells for another passages. Vaccine stock virus (P5) was subjected to titration and calculated according to Reed & Muench, 1938.

IX - Identity test Virus identification was carried out by serum neutralization test using reference anti EHV-1 (Bernhardt, 1993).

X - Virus inactivation The prepared viral fluid was inactivated at a final

XIII - Vaccine quality control I. Sterility test - Samples from the final vaccine preparations were tested for bacterial, fungal & mycoplasma contamination (OIE, 2008) 2. Safety test. It was performed in: a) Susceptible host, according to OIE, 2008, where four groups of pregnant mares at last third of pregnancy (four mares/group), were inoculated I/M with 2 ml of each vaccines. b) Pregnant mice, four groups of pregnant mice. (four mice / group). Inoculated subcutaneously (S/C) with 0.2 ml of each vaccine (Slater et. al, 1993). - All groups of both mares and mice were kept under daily observation in a good hygienic condition for two weeks.

XIV - Immunogenicity of the prepared vaccines 1- In mice Five groups of mice 4-6 weeks old (20 mice/ group) were used for testing the potency of the prepared vaccine. All groups were inoculated subcutaneously (0.2 ml/dose). Group (A) was inoculated with Montanide ISA-206 adjuvanted vaccine. Group (B) was inoculated with mineral oil adjuvanted vaccine. Group (C) was inoculated with saponin (2 mg/dose) adjuvanted vaccine. Group (D) inoculated with saponin (4 mg/dose) adjuvanted vaccine. Group (E) was kept as control. The

Monitoring the immune response of horses vaccinated with inactivated Equine herpes virus-1 vaccine

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❚ Malattie infettive four groups were inoculated with booster dose of the same vaccine after one week. Two weeks later four mice from each group were bled to collect serum samples, to detect specific antibodies by complent fixation test (CFT) and indirect ELISA. All groups were challenged I/N 10 days post inoculation by 45 µ of living EHV-1 (106.5TCID50 /ml). Four mice from each group were sacrified at intervals time (3rd- 5th -7th - 9th days) post challenge .10% of liver and lung suspension of sacrified mice were inoculated on CAM of ECE to detect the role of the vaccine in the reduction of virus circulation and excretion. 2 - In Horses Eighteen healthy susceptible horses with low antibodies titer (≤4 neutralizing antibody) were divided into four groups (4 horses/group) each one was inoculated I/M with 2 ml/dose/horse of the prepared vaccines. Group (A) was inoculated with Montanide ISA-206 vaccine, Group (B) was inoculated with mineral oil inactivated vaccine, Group (C) was inoculated with inactivated vaccine adjuvanted with saponin 2 mg/dose while Group (D) was inoculated with inactivated vaccine adjuvanted with saponin 4 mg/dose and the Group (E) (2 horses) was kept as control. Vaccinated groups were boosted by corresponding vccine four weeks after the first dose. Serum samples were collected from each group at different time intervals up to seven months post vaccination for monitoring humeral immunity. Heparinized blood samples were collected at time intervals 5, 10, 14, 21 & 30 days post vaccination (dpv) and post boostering (dpb) for separation and cultivation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC)for monitoring cellular immune response. Humeral immunity was done by CFT according to Mumford and Bates, 1984-Singh et al., 2006 and ELISA as described by Suguira et al., 1997. Cell mediate immunity (CMI) was assayed by lymphocyte blastogenesis according to Lucy, 1977and Lee, 1984.

RESULT AND DISCUSSION Infectious disease control programs in conjugation with vaccination are important in maximizing the health, productivity and performance in horses. This current study is a trial for preparation and evaluation of inactivated EHV-1 vaccine adjuvanted with Montanide ISA-206, mineral oil and saponin to detect the best safe and immunogenic one through monitoring its immune response in mice (as a laboratory model) and horses (as a natural host). Firstly, the locally isolated EHV-1 seed virus was propagated on VERO cells for further passages.Titer of the vaccine stock virus was 8.5 log10 TCID50/ ml which is recommended for preparation of inactivated vaccine (Mumford and Bates, 1984). Table 1 and

TABLE 1 Inactivation curve of locally isolated EHV-1 Hours of incubation State of virus

Treated virus

8.5*

5.2

3.7

2.7

1.6

1.2

1.0

-ve

Untreated virus

8.5

7.0

6.8

6.6

6.5

6.0

* Virus titer expressed as log10 TCID

/ml.

FIGURE 1 - Inactivation curve of locally isolated EHV-1.

figure 1 revealed that complete virus inactivation was established at a final concentration of 0.008 M of BEI within 24 hours at 37ºC that come in parallel with the finding of Nehal, 2006. The results of residual virus infectivity of inactivated vaccine proved that there was no residual virulent virus which was proved by absence of pock lesion and CPE in both ECE and VERO cells respectively as recommended by OIE, 2008. Concerning the vaccine safety, all inoculated horses showed normal body temperature and no undesirable local reaction following first and booster injections. There was neither abortion in pregnant mice nor mares except one mare inoculated with mineral oil adjuvanted vaccine. Also in mice there wasn’t roughled fur, loss of weight & distress (Kirisawa et. al., 1995OIE, 2008). Table 2 and figure 2, showed the immunogenicity of tissue culture inactivated EHV -1 vaccine with different types of adjuvants in mice revealing that the mean complement fixing antibodies (CF-abs) titers was 32, 18, 32 & 44 while the mean ELISA titer was 712.5, 670, 657.5 &707.5 in group A, B, C & D, respectively, coincided with Kirisawa et. al, (1995) who state that ELISA titer 300-600 in serum samples of inoculated mice resist challenge. Also, the duration of viral reisolation from challenged mice was demonstrated in table 3, there was significantly shorter time in inoculated mice than in control one. At the 5th day post challenge (dpc), 50% of the viral reisolation was in the groups inoculated with the Ippologia, Anno 24, n. 3-4, Settembre-Dicembre 2013

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â?&#x161; Malattie infettive TABLE 2 Immune response of mice inoculated with tissue culture inactivated EHV-1 vaccine with different types of adjuvants Group (E)

EHV-1 antibodies titer in inoculated mice Group Group (D)

Group (C)

Group (B)

Group (A)

Mice NO

ELISA

CFT

ELISA

CFT

ELISA

CFT

ELISA

CFT

650

600

700

*650

700

680

650

700

650

750

700

680

750

707.5

657.5

670

712.5

Mean

(*) Reciprocal of the highest dilution of serum showed positive result. (-) Negative result Group (A) mice inoculated with inactivated EHV-1 Montanide adjuvanted vaccine. Group (B) mice inoculated with inactivated EHV-1 mineral oil adjuvanted vaccine. Group (C) mice inoculated with inactivated EHV-1 adjuvanted vaccine with 2 mg saponin. Group (D) mice inoculated with inactivated EHV-1 adjuvanted vaccine with 4 mg of saponin. Group (E): Control non inoculated mice.

FIGURE 2 - Immune response of mice inoculated with TC inactivated EHV-1 vaccine with different adjuvants.

prepared vaccine adjuvanted with Montanide ISA206 and mineral oil while in saponin adjuvanted vaccine groups was 75% and 100% in the control one. At 9th dpc the viral reisolation in all vaccinated groups was 0%, while in the control one was 25%. This result agreed with kirisawa et al., 1995 who stated that virus recovery from lungs of infected mice occurred within 9 days. The animal immune response is depending on the complex interaction of mucosal, humeral and cellular (Allen et al., 1999 - Goldsby et al., 2000). Thus, assessment of the immunogenicity of prepared vaccine in horses illustrated in table 4 showed that, there was slight increase in the mean (CF-abs) but after boostering a significant increase was detected reaching its peak values at 3 mpv with mean CF- abs titer 37, 32, 48 &48 in group A,

B, C & D, respectively, then decline gradually till 67 mpv. CF-abs persisted for longer period in saponin adjuvanted groups than oil adjuvanted one. These results agree with Singh et al., 2006 who found that CF-abs may be detected for 110 days; also Munford and Bates (1984) revealed that CFabs titer of 1/10 resist the challenge. From table 5 and figure 4, slight increase was observed in the mean ELISA-titer in vaccinated groups with Montanide ISA-206 and mineral oil adjuvanted vaccine but nearly double increase was detected in saponin adjuvanted vaccine groups. After boostering, it continued to increase reaching its peak at 2 mpv with mean titer 760, 730, 1130 & 1220 in group A, B, C & D, respectively then decreased gradually reaching starting titer at 7th mpv. These results coincided with Sugiura et al., 1997, Kydd et al., 2006 who stated that horses are protected from natural reinfection against EHV-1 ranged from 3-6 months and reduced the incidence of abortion. Assessment of cell mediated immunity (CMI) of horses vaccinated with different types of inactivated EHV-1 vaccine measured by lymphocyte blastogenesis estimated by OD values as shown in table 6 revealed that the mean lymphocyte blastogenesis increased at the 5th dpv recording values 0.654, 0.528, 0.456 & 0.6 61 in group A, B, C & D respectively and decline at 10th dpv then begins to increase at 10 th dpb till 30 th dpb. Also, the result showed that Montanide vaccine is better than mineral oil and horses vaccinated with saponin adjuvanted vaccine with 4 mg/dose give more CTL than 2 mg/dose after vaccination but were nearly of the similar values after boostering. These results coincidence with Allen et. al.,

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â?&#x161; Malattie infettive TABLE 3 EHV-1 reisolation from inoculated mice after challenge Animal group

Days post challenge

% of virus reisolation

3 5 7 9

100% 50 % 25 % 0%

3 5 7 9

100% 50% 25% 0%

3 5 7 9

100% 75% 25% 0%

3 5 7 9

100% 75% 25% 0%

3 5 7 9

100% 100% 75% 25%

Group (A): mice inoculated with inactivated adjuvanted vaccine. Group (B): mice inoculated with inactivated adjuvanted vaccine. Group (C): mice inoculated with inactivated vaccine with 2 mg saponin. Group (D): mice inoculated with inactivated vaccine with 4 mg of saponin. Group (E): Control non inoculated mice.

FIGURE 3 - Mean complement fixing antibodies in horses vaccinated with inactivated EHV-1 vaccines using different adjuvants.

Montanide EHV-1 EHV-1 mineral oil EHV-1 adjuvanted EHV-1 adjuvanted

FIGURE 4 - Mean ELISA titer in horses vaccinated with inactivated EHV-1 vaccine using different adjuvants.

TABLE 4 Mean complement fixing antibodies of vaccinated horses with inactivated EHV-1 vaccinesusing different types of adjuvants Mean EHV-1 CF- antibodies titer of vaccinated horses Group (D)

Group (C)

Group (B)

Group (A)

Time of sample

0-Time

4.5

2WPV

4 WPV

Group (E)

Boostering 4

1.5 MPV

2 MPV

3 MPV

4 MPV

5 MPV

6 MPV

7MPV

(*) Reciprocal of the highest dilution of serum showed positive result. Group (A): horses vaccinated with inactivated Montanide EHV-1 adjuvanted vaccine. Group (B): horses vaccinated with inactivated EHV-1 mineral oil adjuvanted vaccine. Group (C): horses vaccinated with inactivated EHV-1 adjuvanted vaccine with 2 mg saponin. Group (D): horses vaccinated with inactivated EHV-1 adjuvanted vaccine with 4 mg of saponin Group (E) control unvaccinated horses. WPV: Weak post vaccination - MPV: Month post vaccination

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â?&#x161; Malattie infettive TABLE 5 Mean EHV-1 ELISA antibodies titer of vaccinated horses with inactivated EHV-1 vaccines using different types of adjuvants Group (E)

Mean ELISA antibodies titer of vaccinated Horses Group (D)

Group (C)

Group (B)

Group (A)

Time of sample

95*

0-Time

730

640

185

200

2WPV

150

140

100

120

4W PV

Boostering 90

940

850

580

630

1.5MPV

1220

1130

730

760

2 MPV

1180

1050

670

800

3 MPV

950

850

530

650

4 MPV

850

680

390

400

5 MPV

600

520

220

310

6 MPV

400

320

180

220

7 MPV

(*) Reciprocal of highest dilution of serum. Group (A) horses vaccinated with inactivated EHV-1 Montanide adjuvanted vaccine. Group (B) horses vaccinated with inactivated EHV-1 mineral oil adjuvanted vaccine. Group (C) horses vaccinated with inactivated EHV-1 adjuvanted vaccine with 2 mg saponin. Group (D) horses vaccinated with inactivated EHV-1 adjuvanted vaccine with 4 mg of saponin Group (E) control unvaccinated horses. WPV: Weak post vaccination - MPV: Month post vaccination.

TABLE 6 Evaluation of cell mediated immunity (CMI) of vaccinated horses with inactivated EHV-1 vaccine using different types of adjuvants by lymphocyte blastogenesis Group (E)

Lymphocytes OD of vaccinated horses

Time of sample

Group (D)

Group (C)

Group (B)

Group (A)

0.140

0.661

0.456

0.528

0.654*

5DPV

0.145

0.189

0.159

0.154

0.175

10DPV

0.140

0.157

0.222

0.229

0.284

5 DPB

0.140

0.560

0.618

0.640

0.685

10 DPB

0.140

0.633

0.623

0.609

0.616

14 DPB

0.140

0.744

0.733

0.640

0.673

21DPB

0.140

0.713

0.712

0.610

0.613

30 DPB

Boostering

* Mean lymphocyte blastogenesis of vaccinated horses estimated by O D. Group (A) horses vaccinated with inactivated EHV-1 Montanide adjuvanted vaccine. Group (B) horses vaccinated with inactivated EHV-1 mineral oil adjuvanted vaccine. Group (C) horses vaccinated with inactivated EHV-1 adjuvanted vaccine with 2mg saponin. Group (D) horses vaccinated with inactivated EHV-1 adjuvanted vaccine with 4mg of saponin. DPV: Days post vaccination - DPB: Days post boostering.

1995 who stated that CTL was detected in horse peripferal blood monocyte for one week post infection and reach maximal level at 2-3 weeks. In conclusion, saponin (4 mg/dose) adjuvanted EHV-1 vaccine has the highest values of humeral immunity in inoculated mice and horses. There was a significantly shorter time in duration of virus reisolation from mice inoculated with Montanide ISA - 206 and mineral oil adjuvanted EHV-1 vaccine after challenge than that inoculated

by saponin adjuvanted EHV-1 vaccine. Finally we conclude that, all the prepared inactivated EHV-1 vaccine were safe and potent in both pregnant mice and mares. Montanide ISA-206 adjuvanted vaccine induced the earliest and the best cell mediated immune response (CMI) whereas saponin adjuvanted vaccine was good in both humeral and cellular immune response with prolonged time to be considered as the best choice.

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❚ Malattie infettive

Prospective studies of equine herpes virus-1 Myeloencephalopathy in Egypt 2012 Magda A. Kalad, Maysa Hanafy, Safaa A.Warda, Nehal S. Saleh Nashwa K. Madkour, Heba Elgharieb, Sohir Ebraheem, Eman M. Ebied Veterinary Serum and Vaccine Research Institute (VSVRI) and Animal Health Research Institute (AHRI), Cairo, Egypt. Box:131- Fax: (202) 23428321 - E-mail: svri@idsc.gov.eg

ABSTRACT Equine herpes virus -1 (EHV-1) is an important viral pathogen that induces major economic diseases: abortion in pregnant mares, early neonatal death in foals, respiratory disease in young and myeloncephalopathy. Recurrent occurrence of nervous manifestations in different horse breeding farms were reported in Egypt causing great economical loss, That may end with death of infected horses. This work was to isolate and identify EHV-1 as a possible cause of this major problem. Nasal swabs and blood samples (buffy coat and paired serum samples) were collected from sick horses (n=21) with respiratory and/or nervous manifestation and contact horses. Organs from dead horses were processed for histopathology and electron microscopy. Paired sera were tested by complement fixation test to detect rising titers (seroconversion). EHV-1 myeloencephalopathy were isolated from 9 horses (7 with respiratory manifestations and 2 from organs of horses died after nervous manifestations). Seroconversion (four fold rise in titer) was detected in paired serum for all horses showed respiratory manifestations. Vasculitis was the major lesion detected in brain tissues, while intra-nuclear inclusion bodies were detected in kidney, liver, lung and brain cells. EHV-1 particles were detected in the nucleus of brain cells with a measured diameter of 160 nm. In conclusion EHV-1 myeloncephalopathy should be considered as causative agent of respiratory and /or nervous manifestations in horses in Egypt.

INTRODUCTION Egypt is considered the most famous country and a center of breeding and exportation of pure Arabian horses all over the world which constitute a remarkable additional support to the national income. Equine herpes virus-1 (EHV-1) is an important, ubiquitous equine viral pathogen that exerts its major impact by inducing abortion storms or sporadic abortions in pregnant mares, early neonatal death in foals, respiratory disease in young horses and myeloencephalopathy in adult horses (Peet et al., 1978; Ostlund, 1993; van Maanen, 2002; Patel and Heldens, 2005). Outbreaks of neurological disease of equine herpesvirus-1 myeloencephalopathy (EHM) among horses may cause mortalities and consequently great economic losses, also lead to extensive movement restriction, disrupting breeding or training schedules and causing management difficulties at training centers, race tracks and horse events (Kohn et. al., 2006, Henninger et al., 2007). Virus isolation is considered the “gold standard” test for a laboratory diagnosis of EHV-1 infection and should be attempted, especially during epidemics of EHM. Isolation and identification of EHV-1 from nasal swabs or buffy coat samples beside internal organs are strongly supportive of EHM diagnosis in horses with compatible clinical signs. Identification of viral isolate EHV-1 was conducted by SNT and confirmed histopathologically (Michel, 2010) and by electron microscope (Richard Mclntosh. 2011).

MATERIAL AND METHODS MATERIAL Clinical history and samples: Samples were collected from 27 horses showing respiratory and /or nervous manifestations during the period from November 2011 to October 2012 in two stud farms in Cairo governorate. Samples were as follows: - Nasal swabs, buffy coat and paired serum samples (two weeks apart) were collected from 16 horses suffering from respiratory manifestations, five of them had fever. Also from two horses with nervous manifestation.

“Articolo ricevuto dal Comitato di Redazione il 12/04/13 ed accettato per la pubblicazione dopo revisione il 26/11/13”.

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â?&#x161; Malattie infettive - Nasal swabs and paired serum samples (two weeks apart) were collected from six contact horses (apparent normal) to the previous cases. - Brains and internal organs (liver, kidney, heart and lung) were collected from three dead horses that previously showed nervous manifestation (ataxia of the hind limbs with dragging of the toes or reluctance to move was common, urine dribbling and diminished tail tone). These specimens have been submitted to Vet., Serum & Vaccine Research Institute (VSVR), Abbassia, Cairo and Animal Health Research Institute, Doki, Giza.

recovered Died

Nervous Manifestation

Respiratory Manifestation

Contact animal

TABLE 1 Isolation of EHV-1 on CAM of SPF-ECE and VERO cells Horse no

Sample

Pock lesion on CAM

CPE on VERO cells

Nasal swab

-ve

Nasal swab

-ve

Nasal swab

+ve

Nasal swab

-ve

Nasal swab

-ve

Nasal swab

-ve

Nasal swab & Buffy coat

+ve

Nasal swab

-ve

Nasal swab

-ve

Nasal swab & Buffy coat

+ve

Nasal swab

-ve

Nasal swab

+ve

Nasal swab

+ve

Nasal swab & Buffy coat

-ve

Nasal swab

-ve

Nasal swab

+ve

Nasal swab

-ve

Nasal swab

-ve

Nasal swab

-ve

Nasal swab

-ve

Nasal swab

+ve

Nasal swab

+ve

Liver & lung

+ ve

Liver & lung

+ ve

Liver & lung

- ve

+ve: Positive -ve: Negative. ND: Not done

Prospective studies of equine herpes virus-1 Myeloencephalopathy in Egypt 2012

Virus isolation A total of 22 nasal swab samples were collected on virus transport medium, also buffy coat were separated from blood samples were processed for virus isolation on specific pathogen free embryonated chicken eggs (SPF-ECE) via chorioallantoic membrane (CAM) and on VERO cells (Hassanein et al., 2002, OIE, 2008). Identification of the isolated viral agent: using virus neutralizing test (VNT) VNT used for identification of the isolated viral agent according to Bernhardt, 1993 were performed using reference antisera against both EHV-1 and EHV-4 kindly supplied by Dr. Jannet Wellington, Research Flow, Department of Biological Science, Macquaire University, Australia. Serological test Complement fixing antibody detection technique (indirect method) was performed on paired sera sample of infected and contact horses as described by Singh et al., 2006. Histopathological examination Tissue samples from (brain, liver, kidney, heart and lung) were received in 10% neutral buffered formalin from died horses. Paraffin sections (5Âľm thickness) were prepared and stained with H & E according to Michel, 2010 and examined microscopically. Brain slides from adult died horses with neurological symptoms were examined for rabies by use of fluorescence microscope according to Bishop et al., 2003. Electron microscopic (E.M) examination Tissue samples from brains were fixed in 3% glutaraldehyde and prepared for examination by transmission electron microscope according to Richard, 2011.

RESULTS Virus isolation Isolation of EHV-1 was carried out on CAM of SPF from the 27 horse samples. Positive pock lesions was detected in 10 samples as followed: 7 out of 16 nasal swab and buffy coat samples of horses showed respiratory manifestation, liver and lung of two died horses suffered from nervous manifestation and nasal swab of one contact healthy horse as shown in table 1. Positive samples were inoculated on VERO cells showed a characteristics cytopathic effect (CPE) of herpes virus-1 (rounding cells, similar to brunches of grapes and syncytial formation).

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â?&#x161; Malattie infettive Virus identification The identity of EHV-1 isolated from the 10 samples was confirmed by VNT using reference antiserum against EHV-1 revealed a positive result.

N.B: all slides were stained with H& E.

Serological test Paired serum samples of the16 horses with respiratory manifestations and the 2 recovered animals after nervous manifestations demonstrated four fold or more increase in complement - fixing antibodies titer in their convalescent samples (seroconversion). No rising in titer was detected in sera from contact animals (table 2).

FIGURE 1 - Small thrombus x 400

TABLE 2 Detection of EHV-1 (EHM) antibodies in horse Sera using CFT Horse No.

Brain showing FIGURE 2 - Brain malacia x 200

Complement fixing antibodies titer* Acute samples

Convalescent samples

-ve

Horse No. 1 to 6 contact horses. Horse No. 7 to 22 with respiratory manifestation. Horse No. 23 - 24 recovered animal with nervous manifestation. *CFT titer > 8 is considered postive.

FIGURE 3 - Perivascular cuffing x100 Brain showing FIGURE 4 - Hyaline degeneration of media and adventitia x200

FIGURES 5, 6 - Perivascular and pericellular oedema x 200,100 Brain showing FIGURE 7 - Satelletosis x 650

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â?&#x161; Malattie infettive Pathological results I- Macroscopic lesions There were petechial and echymotic heamorrhages in the subcutis of the three dead horses and a few scattered dark grey to black foci (of 12 mm diameter) all over their brains. The liver of one of those horses showed white nodules (2-3 cm diameter).

II- Microscopic lesions of the three horses

FIGURES 8, 9 - Neuron with minute vacuoles coalesce beside each others x 650 Brain showing FIGURE 10 - Astrocyte with vacuolar degeneration. in cytoplasm x 650

FIGURE 11 - Demyelination of nervous sheathes x 650 Brain showing FIGURE 12 - Gliosis x 650

Brain: The examined slides showed vasculities of small arteries and veins which led to thrombosis as shown in (fig. 1) and brain malacia in (fig. 2).The vascular lesions were characterized by perivascular cuffing (fig. 3), hyaline degeneration of the media and or adventitia (fig. 4) with endothelial proliferation. Small arteries and arterioles were predominantly affected (fig. 5), perivsacular and pericellular oedema (fig. 6), satelletosis (fig. 7) and neurophagia were detected. Some neurons appeared with minute vacuoles which coalesced beside each other (fig. 8, 9). Astrocytes appeared with vacuolar degeneration which distributed all over their cytoplasm (fig. 10). Some slides showed demyelinations were detected in purkinje cells in two examined slides (Fig. 11, 12) and intranuclear like inclusion in purkinje cells (Fig. 13, 14). Liver: All the examined liver slides showed degeneration and necrosis of hepatic cells with intranuclear eosinophilic inclusion bodies, hepatocytomegaly with vesicular nucleus was common in all examined slides in one of the two horses (fig. 15), but the liver of the another horse exhibited hepatocellular carcinoma (fig.16) and also intranuclear inclusions as the first horse liver. Kidney: All examined slides showed hyalinization of the epithelial lining of renal tubules with extensive hemorrhages in-between and intranuclear inclusions were detected in (fig. 17,18,19). Heart: Histopathological examination of heart tissues showed intranuclear inclusion bodies (fig. 20) and fibrinoid thrombus (fig. 21).

Brain showing

FIGURES 13, 14 - Brain showing intra nuclear like inclusion in purkinje cells x650

Prospective studies of equine herpes virus-1 Myeloencephalopathy in Egypt 2012

Lung: Intranuclear eosinophilic inclusion bodies were recorded in the epithelial lining of broncule and in some of alveolar walls (Fig. 22, 23).

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â?&#x161; Malattie infettive E.M examination (cerebrum of neurologically died horses) Herpes virus detected in the cell nucleus as a non-enveloped viral particles and the chromatin accumulated at the periphery of nucleus membrane (Fig. 24). The nucleocapsid consists of a core and three concentric shells, inner, middle and outer capside (Fig. 25).

DISCUSSION The recent upsurge in the large, high mortality outbreaks of EHV-1 neurological disease posses an emerging threat to equine health & economic prosperity of horse related business (Reed and Toribio, 2004 and van Maanen et al., 2001). EHV-1 neurological disease known as equine herpes myeloencephalopathy (EHM), may be a result of hypoxic damage to the central nervous system (CNS) secondary to vasculitis and thrombosis rather than direct neurologic injury by the virus (Pellegrini-Masini & Livesey, 2006). EHM infection has been detected in several countries as Australia (2003), Holland (2005), USA (2007) and in Brazil (2011) (Mori et. al., 2011) in contrast, sporadic cases were recorded in Egypt. The exact signs reported from examined positive horses with EHM were ataxia, unsteadiness in hind limbs which were significant to that horse presenting these signs had a higher probability of being infected by EHM as detected by Studdert, 2003 and Allen, 2006. Isolation and identification are the gold standard for the diagnosis of EHM as stated by Davis and Tyler, 2005 and Lara et. al., 2008 who reported that a definitive diagnosis of EHM can only be supported by isolation and identification of viral particles. Isolation of EHV-1 was carried out on both CAM of ECE and VERO cells from nasal swab and buffy coat revealed that 10 samples showed highly characteristics positive pock lesions as showed in table 1 and CPE respectively. These results agree with Pusterla et. al., 2008 who recorded that isolation and identification of EHV-1 from nasal or nasopharyngel swabs and buffy coat samples is strongly supportive in diagnosis of EHM in horses with compatible clinical signs. However that EHV-1 could be isolated from the respiratory tract of healthy horses. The identity of the isolated EHV-1 from all samples was confirmed by VNT using reference antiEHV-1 and anti EHV-4 sera (Bernhardlt, 1993). Concerning with serological testing of the paired sera sample, clarifies four fold or more increase in complement-fixing antibodies titer in their convalescent sample provides presumptive evi-

FIGURE 15 - Hepatocytomegaly with intra nuclear eosinophilic inclusions x 650 Liver showing FIGURE 16 - Hepatocellular carcinoma with intra nuclear inclusions x 650

Kidney showing

FIGURES 17, 18, 19 - intra nuclear inclusions with heamorrhages beside necrobiotic changes x 650

FIGURE 20 - Intra nuclear inclusions x 400 Heart FIGURE 21 - Heart, with fibrinoid thrombus x 650

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Lung - FIGURE 22, 23 - Iintra nuclear inclusions in both bronchule and in the alveolar walls .x650

Brain (cerebrum) - FIGURE 24 - E. M. showing nucleus of oligodendeocyte showing a packet of virions x10.000.

Brain (cerebrum) - FIGURE 25 - E. M. showing several virions accentuates their basic nucleocapsid structure and hexagonal shape x 160.000.

Prospective studies of equine herpes virus-1 Myeloencephalopathy in Egypt 2012

dence of EHV-1 infection that is in parallel with Pusterla et. al., 2008. While the contact horses showed low complement fixing antibodies, less than 8 which agree with Singh et. al., 2006 who stated that CF- antibodies more than 8 considered positive result. In this study all histopathological lesions in brain and other organs that were EHM positive had a basic vascular injuries and secondary ischemic degeneration of the nervous tissues as described for cases of EHM which was recorded by Mori et. al., 2007. Thrombosis and secondary ischemic degeneration were observed because of the neurological variants of EHV-1 induced myeloencephalitis which were exhibited through an endotheliotropism instead of specific neurotropism in contrast to several other alpha herpes viruses (van Maanen 2002). The detection of intra nuclear inclusion bodies in all parenchymatous organs in all tissues examined, which indicated that these tissues were directly affected by the virus but does not rule out the possibility of immunological mediated lesions; these results were suggested by Anon, 2007. Electron microscope (EM) detected a characterstic herpes virion in the brain tissues supported the histopathologial results with the clinical symptoms recorded in addition to isolation and identification of EHM. From the point of view that enveloped nucleocapside is considered the infectious particle, but the unenveloped nucleocapcid may also be infectious when passed from cell to cell during fusion and syncytia formation (Richard, 2011). This study highlights the importance of including EHM in the differential diagnosis of other neurological diseases in horses. It is note worth that CNS samples from that died with nervous signs are commonly analyzed only for detection of rabies viruses. In conclusion, the recurrent occurrence of nervous manifestation in different horse breeding farms after the storm abortion in the same farms threw the lights on the suspicious of EHV-1 which confirmed by those results of isolation and identification of the same isolated strains using reference antisera, histopathological examination and electron microscopy. The isolated strains were neuropathogenic causing EHV-1 neurological form (EHM), but molecular biological investigation will be available in the future.

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â?&#x161; Malattie infettive REFERENCE 1. Allen, G.P. (2006): Antemortem detection of horses latentely infected with neuropathogenic strain of EHV-1. Am.J.Vet. Res., 67:1401-1405. 2. Anon (2007): Information sheet.Equine herpes virus myeloencephalopathy. Center of emerging issues (accessed on June 2009). 3. Bernhardt, D.(1993): In vitro diagnosis of EHV (EHV-1 and EHV-4) Tieroriztliche Umschau, 48(2): 67-68, 70-72. 4. Bishop, G.C., Durhiem, D.N.& Kloek, K.P.E.(2003): Rabies guide for the medical veterinary and allied professions.second print. 5. Davis, L.E & Tyler, L. (2005): Molecular diagnosis of CNS viral infections. J.Neurology, Neurosurgery and Psychiatry, Vol., 76(1) p 10. 6. Hassanein, M.M.; Maysa, H.; El-Bagoury, F.; Magda, A.K.; El-Kabbany, M.M.A. and Daoud, M.A. (2002): Trials for isolation and identification of equine herpesvirus abortion in Egypt. Vet. Med. J., Giza, 50 (4): 977-986. 7. Henninger, R.W., Reeed,S.W., Saville, W.J., Allen, G.A, Hass, G.F., Kohn,C.D., Sofaly, C.(2007): Outbreak of neurological disease caused by equine herpes virus-1 at a university equestrian center. J. Vet. Int. Med. 21,157165. 8. Kohn, C.W., Reed, S.M., Sofaly, C.D., Henninger, R.W., Saville, W.J., Allen, G.P., Premanadan, C. (2006): Transmission of EHV-1 in horses with EHV-1 myeloencephalopathy: implication for biosecurity and review. Clinical techniques in Equine Practice 5: 60-66. 9. Lara, M.C.C.S.H., Cunha, E.M.S., Villalobos, E.M.C, Nassar, A.F.C., Asano,K.M., Fernandes, W.R., Richtzenhain, L.J., Brandao, P.E., & Mori, E. (2008): First isolation of Equine herpes virus type 1 from a horse with neurological disease in Brazil. Arq.Inst. Bio., Sao Paulo, V.75, n.2: 221-224. 10. Michel, H. Ross (2010): Histology text.and atlas,6th ed.chrchuil-Living stone. London. 11. Mori Borges, DT.Z., Delfial, J.P. (2011): First detection of EHV-1 neuropathogenic variant in Brazil. Rev. Sscitech.of Int. Epez., 30(3)949-954.

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ISTRUZIONI PER GLI AUTORI ISTRUZIONI GENERALI IPPOLOGIA è la rivista ufficiale della SIVE con periodicità trimestrale e pubblica lavori originali, studi retrospettivi e casi clinici nonché comunicazioni brevi dei congressi presentati in forma estesa. Articoli di carattere editoriale o articoli review verranno accettati solo se richiesti dal Comitato Scientifico. Lettere alla rivista e commenti su articoli pubblicati devono essere inviati alla redazione con relativi riferimenti bibliografici. Qualsiasi protocollo di ricerca dovrà essere approvato dal comitato etico dell’istituzione di riferimento e risultare accettabile da parte del Comitato Editoriale. Qualsiasi studio che abbia comportato trattamenti negativi o condizioni di vita disagevoli per gli animali non sarà preso in considerazione a meno che l’autore non possa dimostrare che i dati così acquisiti siano di tale importanza da giustificare il disagio imposto agli animali. PRESENTAZIONE DEI MANOSCRITTI I manoscritti vanno inviati preferibilmente via email a: francesca.chiari@evsrl.it - info@sive.it. Quando ciò non fosse possibile si prega di inviare il manoscritto in formato elettronico su CD ROM a: IPPOLOGIA - Via Trecchi, 20 - 26100 Cremona. Tutti i testi devono essere composti su foglio elettronico (Microsoft Word® 2000 o versioni successive) con doppia spaziatura, righe numerate, testo giustificato ed impiegando il carattere Times New Roman a dimensione 12. Le pagine devono essere numerate in maniera consecutiva, iniziando da quella con il titolo del lavoro. Gli articoli che non seguono queste indicazioni verranno esclusi dalla valutazione e saranno rispediti all’autore per le necessarie modifiche. Il frontespizio (pagina 1) dell’articolo deve comprendere il titolo in lettere maiuscole (in italiano e in inglese), nome, cognome, indirizzo ed istituzione di appartenenza di ciascun autore e l’indirizzo (comprensivo di numero di telefono e fax e di e-mail) dell’autore a cui deve essere inviata la corrispondenza infine 3-5 parole chiave (in italiano e in inglese). Sulla seconda pagina il titolo e le parole chiave vanno ripetute, ma ogni riferimento agli autori deve essere evitato. La stesura generale del manoscritto deve avere questa sequenza: breve sommario (in italiano e in inglese), Introduzione, Materiali e metodi, Risultati, Discussione, Bibliografia. Se necessario, possono essere aggiunti altri paragrafi (ad es. analisi statistica, reperti di laboratorio, ecc.). Sono tassativamente da evitare, in tutto il manoscritto, i riferimenti a cliniche, istituti o luoghi di lavoro. Struttura dei manoscritti Un lavoro originale deve comporsi di un’Introduzione comprendente una sintesi delle informazioni disponibili sull’argomento, ipotesi e scopi dello studio; Materiali e Metodi in cui vengono descritti tutti i procedimenti eseguiti, inclusi i metodi statistici; Risultati, con tutti i dati utili ad informare il lettore sull’esito dello studio: quando possibile, i risultati vanno sintetizzati in tabelle; la Discussione deve sinteticamente mettere in relazione gli scopi dello studio con i risultati e confrontare lo studio stesso con la letteratura precedente, sottoline-

ando affinità e differenze. I Casi Clinici devono focalizzare gli aspetti clinici dei casi descritti e non devono necessariamente essere suddivisi in paragrafi. Quando possibile, il caso deve essere corredato da immagini e da un numero limitato di riferimenti bibliografici. Note Le note devono essere richiamate nel testo con lettere in ordine alfabetico in posizione di apice. Le note vanno limitate a notizie riguardanti nomi commerciali di farmaci e case produttrici, abstracts minori e comunicazioni personali. Di ogni produttore vanno indicati il nome e la località. Bibliografia I riferimenti bibliografici vanno selezionati in modo tale da limitarne il numero ma permettendo al lettore di avere un quadro esaustivo della letteratura disponibile sull’argomento. I riferimenti vanno elencati secondo l’ordine alfabetico degli autori; in caso di autori identici, va posto prima il riferimento più vecchio. In caso di articoli aventi autori e data identica, una lettera alfabetica in posizione di pedice deve distinguere un titolo dall’altro. Nella bibliografia, da riportare al termine del lavoro, di ogni titolo vanno riportati tutti gli autori. I titoli delle riviste devono essere abbreviati secondo il metodo della National Library of Medicine e l’Index Medicus. Esempio di corretto riferimento bibliografico da riportare nella bibliografia al termine del lavoro: Articolo da rivista Bickers RJ, Lewis RD, Hays T, Noble JK (1998) Acquired inguinal hernia in a gelding. Equine Pract. 20, 28-29. In caso di citazioni da libri, citare nella bibliografia il nome dell’autore, la data ed il titolo del capitolo devono essere seguiti dal nome dell’Editor, dal titolo del libro in corsivo e dal nome e dalla località dell’editore. Esempio di corretto riferimento bibliografico da riportare nella bibliografia al termine del lavoro: Capitolo o paragrafo da libro Kaneps AJ (1992) Hernias. In: Auer AJ, Ed.: Equine Surgery. WB Saunders Co., Philadelphia. P. 420. Nel testo, ogni titolo bibliografico va richiamato almeno una volta; la citazione va riportata al termine della frase, citando tra parentesi il cognome del primo e del secondo autore e l’anno di pubblicazione, nel caso di articolo con uno o due autori. Nel caso di articoli con tre o più autori, il cognome del primo autore deve essere seguito dalla abbreviazione et al. e dall’anno di pubblicazione. Esempio di corretto riferimento bibliografico da riportare nel testo al termine della frase tra parentesi: in caso di articolo con uno o due autori: (Stanga e Flex 1995) in caso di articolo con tre o più autori: (Stanga et al., 1995) Figure Si richiedono figure di buona qualità. Le figure devono essere numerate, con riferimento nel testo e inviate via email in formato EPS, JPG o TIFF con risoluzione minimo 300 dpi. Le didascalie devono essere messe al termine del manoscritto.

Testo italiano e sommario in inglese Ogni articolo verrà pubblicato su IPPOLOGIA in lingua Italiana con il sommario in lingua inglese. Si richiede, pertanto, agli autori di presentare le seguenti parti sia in lingua italiana che in lingua inglese: titolo, sommario, parole chiave. È disponibile un servizio di correzione e traduzione a richiesta dell’autore: informazioni sui costi possono essere richieste alla segreteria SIVE. REVISIONE, RIFIUTO, ACCETTAZIONE E PUBBLICAZIONE I manoscritti ricevuti verranno sottoposti ad una prima verifica da parte del comitato scientifico di IPPOLOGIA. Il manoscritto non deve essere stato pubblicato, o sottoposto per pubblicazione, nemmeno in parte, ad altri giornali. Il primo autore deve dichiararlo al momento della presentazione. Almeno un autore del manoscritto deve essere veterinario e, quando gli autori sono diversi, ciascuno di essi deve avere contribuito alla preparazione del testo e deve concordare con le interpretazioni e le conclusioni. Collaborazioni minori (ad esempio veterinari referenti, esperti consultati oralmente) devono essere menzionate nei ringraziamenti. Il materiale già presentato in congressi, corsi, seminari ecc. deve essere accompagnato dalla corrispondente pubblicazione o abstract (capitolo di manuale, volume degli atti, ecc.) e verrà valutato allo scopo di preservare l’originalità del materiale pubblicato su IPPOLOGIA. L’autore è ritenuto responsabile dei contenuti pubblicati nel manoscritto. Soltanto i manoscritti in possesso dei requisiti formali sopra elencati richiesti per la presentazione su IPPOLOGIA verranno inviati per la revisione. In caso di accettazione, uno o più specialisti verranno incaricati di fare una revisione dell’articolo e di restituirlo entro 45 giorni. Ulteriori esperti verranno consultati se necessario o in seguito ad una richiesta dei referee. I commenti e le correzioni dei referee verranno trasmessi al primo autore con richiesta di restituire l’articolo corretto entro 30 giorni: gli autori dovranno presentare un elenco delle correzioni che sono state apportate in seguito ai suggerimenti del referee - tale elenco verrà inviato alla redazione di IPPOLOGIA unitamente all’articolo corretto; in alternativa gli autori possono contrassegnare le correzioni direttamente sul testo del manoscritto riportandole in colore rosso o evidenziandole oppure rispondere in quoting sul modulo di revisione. Gli autori dovranno attenersi scrupolosamente ai suggerimenti/indicazioni dati dai referee e non metterli nelle condizioni di dover effettuare una nuova revisione su un lavoro diverso dall’originale. Ai referee verranno dati altri 30 giorni per verificare le correzioni e fare una revisione finale. Le bozze del lavoro accettato verranno inviate al primo autore per l’approvazione definitiva prima della stampa e dovranno essere approvate entro una settimana. Nessuna correzione e nessun cambiamento nell’articolo verranno concessi dopo la revisione finale da parte dei referee. Il mancato rispetto delle istruzioni sopra elencate comporterà la restituzione del manoscritto.

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INSTRUCTION FOR AUTHORS GENERAL INSTRUCTION IPPOLOGIA, published every third month, is the official journal of SIVE and it publishes original works, retrospective studies and clinical cases as well as long abstracts of congresses. Editorial or review articles only will be accepted if requested by Scientific Committee. Letters to the journal and comments on published articles must be send to the editorial staff with related bibliographic references. Any research protocol has to be approved by ethics committee of the institution of reference and be acceptable by the Editorial Board. Any study that has caused adverse treatments or uncomfortable conditions of life for the animals will not be taken into account, unless the author cannot prove that the data thus acquired are so important to justify the inconvenience imposed to animals. SUBMISSION OF MANUSCRIPTS The manuscripts must be submitted, preferably by email, to: francesca.chiari@evsrl.it - info@sive.it. When this is not possible, please send the manuscript in electronic format on CD ROM to: IPPOLOGIA Via Trecchi, 20 - 26100 Cremona. All texts must be made in spreadsheet (Microsoft Word® 2000 or later versions) with double spacing, consecutively numbered lines, justified text, and typed in Times New Roman font size 12. The pages must be numbered consecutively, starting from the page with the title of the work. Articles that do not follow these recommendations will be excluded from the assessment and will be returned to author for the necessary changes. The title page (page 1) of the article must include the title in capital letters (in Italian and in English), the name, surname, address and institution of each author and the address (including telephone and fax number and e-mail) of the author to whom the correspondence should be sent and, finally, 3-5 keywords (in Italian and in English). On the second page title and keywords should be repeated, but all references to authors should be avoided. The manuscript must have the following overall structure: a brief summary (in English and Italian), Introduction, Material and Methods, Results, Discussion, Bibliography. If necessary, other sections can be added (e.g. Statistical analysis, Laboratory findings, etc.). In the whole manuscript, any reference to clinics, institutes or workplaces must be strictly avoided. Structure of the article An original work should be constituted by: Introduction, including a synthesis of available information on the subject, hypothesis and scope of the study; Materials and Methods, where all the performed proceedings, including statistical methods, are described; Results, including all useful data to inform the reader on the outcome of the study: when possible, the results should be summarized in tables; Discussion, that must synthetically relate the goals of the study with the results and compare the study itself with the previous literature, highlighting affinities and differences. Clinical Cases must focus the clinical features of the described cases and not necessarily should be divid-

ed in paragraphs. When possible, figures and a limited number of bibliographic references should be added to the case. Notes The notes must be indicated in the text with superscripted letters in alphabetical order. The notes are limited to information on drugs’ trade names and manufacturers, minor abstracts and personal communications. The name and the base of each manufacturer must be indicated. Bibliography The references should be selected so as to limit their number, but allowing the reader to have a comprehensive picture of the available literature on the subject. The references should be listed in alphabetical order according to the authors; in case of identical authors, the older reference must be placed first. In case of works with identical authors and date, a title must be distinguished from the other by a subscripted alphabetical letter. In bibliography, that has to be reported at the end of the work, in every title all the authors must be indicated. The titles of the journals should be abbreviated according to the method of the National Library of Medicine and the Index Medicus. Example of correct bibliographic reference to report in the bibliography at the end of work: Article from journal Bickers RJ, Lewis RD, Hays T, Noble JK (1998) Acquired inguinal hernia in a gelding. Equine Pract. 20, 28-29. In case of quotations from books, indicate in the references the author’s name, the date and the title of the chapter, followed by the name of the Editor, the book title in italics and the name and the base of the Publisher Example of correct bibliographic reference to report in the bibliography at the end of work: Chapter or paragraph in a book: Kaneps AJ (1992) Hernias. In: Auer AJ, Ed.: Equine Surgery. WB Saunders Co., Philadelphia. P. 420. In the text, each bibliographic entry must be reported at least once; quotation must be made at the end of the sentence, citing in parentheses the surname of the first and the second author and the year of publication, if the article is compiled by one or two author(s). In the case of articles with three or more authors, the surname of the first one must be followed by the abbreviation et al. and the year of publication. Example of correct bibliographic reference to report in the text at the end of the sentence in parentheses: In case of article with one or two author(s): (Stanga and Flex, 1995) In case of article with three or more authors: (Stanga et al., 1995) Figures Images must be of good quality. They must be numbered, with references in the text, and sent by e-mail in EPS, JPG or TIFF format with a minimum resolution of 300 DPI. Captions should be placed at the end of the manuscript.

Italian and English summary On IPPOLOGIA every article will be published in Italian language with a summary in English language. Therefore, the authors are asked to present the following parts both in Italian and in English language: title, abstract, keywords. A correction and translation service is available on request of the author: cost information can be obtained from the SIVE secretariat. REVIEW, REFUSAL, ACCEPTANCE AND PUBLICATION The received manuscripts will be submitted to preliminary review by the IPPOLOGIA Scientific Committee. The manuscript shall not have been published nor submitted to another journal for publication, even in part. This must be stated by the first author at the time of the submission. At least one author of the manuscript must be a veterinarian and, when there are several authors, each of them must have been contributing to the preparation of the text and must agree with the interpretations and the conclusions. Minor contributors (e.g. referral veterinarian, orally consulted experts) should be mentioned in the Acknowledgments. The material already presented at congress, courses, workshops etc… must be accompanied by the corresponding publication or abstract (chapter in textbook, volume of proceedings, etc.) and will be assessed in order to preserve the originality of the material published on IPPOLOGIA. The author is held responsible for the contents published in the manuscript. Only manuscripts having the aforementioned formal requirements for presentation on IPPOLOGIA will be sent for review. In case of acceptance, one or more specialist(s) will then be requested to make a review of the article and return it within 45 days. If necessary or following a request of the referees, further experts will be consulted. Comments and corrections of the referees will be transmitted to the first author with the request to return the correct article within 30 days: the authors must submit a list of the corrections made following the suggestions of the referee - that list will be sent to the editorial staff of IPPOLOGIA along with the correct article; alternatively, the authors can mark directly on the text of the manuscript corrections writing in red or by highlighting them or answering in quoting on the revision form. The authors must strictly follow the suggestions / directions given by referees and not put them in the position of having to make a new revision of a work different from the original one. To the referees will be given other 30 days to verify the corrections and make a final review. Proofs of the accepted work will be send to the author for final approval before printing and will must be approved within 1 week. No correction and no change in the article will be allowed after the final review by the referees. Failure to follow the aforementioned instructions will result in returning the manuscript.

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di Maria Grazia Monzeglio

LA RASSEGNA DI VET-JOURNAL Approccio attuale agli ascessi corneali stromali equini Trattamento medico e chirurgico volti alle infezioni fungine e batteriche e alla sostituzione dello stroma patologico Negli ultimi trent’anni la comprensione della patogenesi e del trattamento degli ascessi stromali (SA) corneali equini è molto cambiata. In precedenza, gli ascessi stromali erano considerati un problema oculare correlato a infezioni batteriche corneali, uveite ricorrente equina, microtraumi e corpi estranei corneali. La diagnosi era più frequente nei cavalli delle aree climatiche subtropicali del mondo. Le raccomandazioni terapeutiche per il trattamento degli SA equini erano storicamente quasi sempre caratterizzate da un approccio medico rivolto ai batteri e all’iridociclite grave spesso associata. Oggi, la patogenesi della maggior parte degli SA equini sembra essere più spesso correlata all’inoculazione fungina dello strato corneale anteriore seguita da migrazione posteriore dei funghi negli strati profondi dello stroma corneale. Attualmente, è inoltre aumentata l’incidenza delle diagnosi di SA corneale nei cavalli che vivono in aree climatiche più temperate. Il trattamento medico e chirurgico è oggi rivolto all’eliminazione delle infezioni fungine e batteriche, all’asportazione e sostituzione dello stroma corneale patologico e alla soppressione dell’iridociclite. Se l’ascesso e l’uveite anteriore non rispondono efficacemente alla terapia medica, la cheratectomia lamellare a spessore parziale per rimuovere le ife fungine e lo stroma patologico, seguita dal trapianto di alloinnesti di tessuto corneale sano, ha un elevato tasso di successo nell’accelerare la guarigione e preservare la vista, concludono gli autori. “Equine corneal stromal abscesses: An evolution in the understanding of pathogenesis and treatment during the past 30 years.” M D Henriksen; P H Andersen; C E Plummer; B Mangan; D E Brooks. Equine Vet Educ. June 2013; 25 (6): 315-323. Altre letture: Ascessi corneali equini: efficacia della cheratoplastica lamellare profonda.

Resistenza ai carbapenemi negli animali da produzione alimentare L’ESFA valuta il rischio di trasmissione della resistenza dagli animali all’uomo attraverso la catena alimentare e le misure preventive I carbapenemi sono antibiotici beta-lattamici ad ampio spettro utilizzati per il trattamento di importanti malattie infettive nell’uomo. Ad oggi, solo studi sporadici hanno segnalato la comparsa di batteri carbapenemasi-produttori (CP) negli animali destinati alla produzione di alimenti e nel loro ambiente. I batteri e gli enzimi isolati includono Escherichia coli produttore di VIM-1 e Salmonella infantis da suini e pollame in Germania, Acinetobacter spp. produttore di OXA-23 da bovini e cavalli in Francia e Belgio e Acinetobacter spp. produttore di NDM da suini e pollame in Cina. Negli isolati di S. infantis ed E. coli in Germania, i geni che codificano per VIM-1 sono localizzati nei plasmidi IncHI2. È stata proposta una metodologia che include la coltura selettiva per l’identificazione dei ceppi CP di Enterobacteriaceae e Acinetobacter spp. La scelta dei terreni selettivi per la sorveglianza della resistenza al carbapenem negli animali e nei campioni di cibo deve essere valutata e validata sperimentalmente. Sono disponibili esami biochimici e fenotipici per l’identificazione definitiva dei batteri CP. Per i batteri CP negli animali e nel cibo, il monitoraggio attivo/passivo e/o la sorveglianza mirata dovrebbero coprire gli agenti zoonosici chiave, i patogeni animali e gli organismi indicatori della flora commensale. La priorità dovrebbe essere data a broiler, tacchini all’ingrasso, suini all’ingrasso, vitelli e carni. Poiché non vi sono dati sull’efficacia comparativa delle singole opzioni di controllo, la priorizzazione è complessa. La proibizione continuata dell’utilizzo di carbapenemi negli animali per la produzione alimentare potrebbe essere un’opzione semplice ed efficace. Poiché i geni che codificano per la produzione di carbapenemasi sono principalmente plasmidi-mediati e la co-resistenza può essere un problema importante per la diffusione di tali meccanismi di resi-

stenza, un’altra priorità è la riduzione della frequenza di utilizzo degli antibiotici negli animali da produzione nella UE in accordo alle linee guida per un uso prudente. L’efficacia di qualsiasi misura di controllo dovrebbe essere monitorata mediante indagini mirate, utilizzando metodi selettivi di isolamento e pre-arricchimento dei campioni. Si dovrebbero implementare misure di controllo proattive a livello nazionale e internazionale per prevenire la diffusione dei ceppi CP negli animali da reddito. “Scientific Opinion on Carbapenem resistance in food animal ecosystems”. EFSA Journal 2013; 11 (12):3501 [70 pp.].

Variabili clinicopatologiche e di esito nei cavalli anziani Prevalenti le patologie dell’apparato digerente nei soggetti di età maggiore di 20 anni di uno studio Uno studio retrospettivo caso-controllo ha confrontato le variabili ciniche, clinicopatologiche e di esito post-trattamento tra cavalli in età geriatrica e non geriatrica. Si includevano 690 cavalli (345 ≥ 20 anni, casi; 345 > 1 e < 20 anni, controlli) visitati presso un ospedale di riferimento. L’età media ± SD era di 23,9 ± 4,6 anni per i casi e 9,2 ± 3,6 per i controlli. Nel gruppo geriatrico erano significativamente più rappresentati i cavalli arabi e i pony. Le diagnosi correlate all’apparato digerente, muscoloscheletrico e respiratorio erano le più comuni nella popolazione complessiva dell’ospedale (casi e controlli). La condizione patologica più

comune erano le coliche. Tra i casi, erano significativamente più prevalenti le patologie dell’apparato digerente. La sopravvivenza a breve termine per la maggior parte delle categorie di colica non differiva tra casi e controlli, con l’eccezione delle coliche idiopatiche. Considerando tutte le patologie, i casi avevano una probabilità significativamente maggiore di non sopravvivere rispetto ai controlli. In alcune sottocategorie patologiche si riscontravano differenze minori dei parametri biochimici. I cavalli in età geriatrica con colica non erano soppressi più frequentemente dei cavalli adulti non in età geriatrica. I risultati indicano, concludono gli autori, che nella popolazione di cavalli studiata, l’età era associata alla prevalenza di specifiche condizioni patologiche. Erano presenti poche differenze nei parametri biochimici sierici tra casi e controlli. “Diagnoses, clinical pathology findings, and treatment outcome of geriatric horses: 345 cases (2006–2010)” Adriana G. Silva, Martin O. Furr. Journal of the American Veterinary Medical Association. December 15, 2013, Vol. 243, No. 12, Pages 1762-1768.

Eco-Doppler del dito nei cavalli con SIRS o laminite Un utile strumento complementare per identificare le modificazioni del flusso ematico digitale, secondo uno studio Uno studio ho valutato l’utilità dell’ecografia Doppler per valutare le modificazioni della dinamica ematica vascolare digitale nei cavalli con sindrome della risposta infiammatoria sistemica (SIRS) o laminite. Si includevano 42 cavalli Andalusi adulti. Il gruppo 1 includeva 9 cavalli sani, il gruppo 2 includeva 19 cavalli affetti da SIRS senza (n = 9) o con (10) aumento palpabile dell’intensità del polso digitale e il gruppo 3 includeva 14 cavalli affetti da laminite senza (8) o con (6) evidenza radiografica di rotazione o dislocazione distale della terza falange. Si ottenevano per ciascun cavallo le caratteristiche qualitative dello spettro Doppler e le misurazioni quantitative dell’arteria digitale palmare laterale. Nei cavalli del gruppo 1, 2 e 3 senza modificazioni radiografiche si osservavano 4 spettri caratterizzati da un picco sistolico positivo seguito da numerosi picchi diastolici positivi. Nei cavalli del gruppo 3 con modificazioni radiografiche si identificava un flusso ematico laminare. Il diametro dell’arteria digitale palmare laterale era significativamente maggiore nei cavalli del gruppo 3 rispetto a quelli del gruppo 2; il flusso ematico era significativamente maggiore nei cavalli del gruppo 2 con aumento dell’intensità del polso digitale, rispetto a quelli dello stesso gruppo senza aumento del polso digitale; l’integrale velocità-tempo e il tempo di accelerazione erano significativamente inferiori nei cavalli del gruppo 3, rispetto a quelli del gruppo 2.

Prognosi sportiva delle fratture della pelvi nel cavallo da corsa I risultati suggeriscono che l’ecografia Doppler può costituire un utile strumento complementare per identificare le modificazioni del flusso ematico digitale nei cavalli affetti da SIRS, soprattutto se presentano un aumento palpabile dell’intensità del polso digitale oppure laminite, concludono gli autori. “Usefulness of Doppler ultrasonography to assess digital vascular dynamics in horses with systemic inflammatory response syndrome or laminitis” C.N. Aguirre et al. Journal of the American Veterinary Medical Association. December 15, 2013, Vol. 243, No. 12, Pages 1756-1761.

Ritenzione fecale nella cupola del cieco del cavallo Una possibile causa non comune di coprostasi, con prognosi buona dopo tiflotomia e lavaggio Uno studio retrospettivo ha determinato i segni clinici, il trattamento e la prognosi della ritenzione fecale della parte craniale della base del cieco (cupola del cieco) nel cavallo. Si includevano 7 cavalli con colica attribuita a ritenzione fecale della cupola del cieco (in assenza di altre anomalie ciecali), identificata durante laparotomia esplorativa. Benché i segni clinici variassero, questi soggetti erano tipicamente caratterizzati da segni modici di colica ed esplorazione rettale non diagnostica, ed avevano condizioni sistemiche stabili al momento della valutazione iniziale. Si effettuava la tiflotomia per la risoluzione della coprostasi mediante lavaggio ed evacuazione. Tutti i cavalli sopravvivevano fino alle dimissioni e vivevano per ≥ 2 anni dopo l’intervento. I risultati di questo studio suggeriscono che la ritenzione fecale della cupola del cieco costituisce un nuovo tipo non frequente di coprostasi ciecale. La condizione non coinvolgeva il corpo o l’apice del cieco e non si osservava macroscopicamente un’ipertrofia della parete del cieco. La ritenzione era efficacemente risolta mediante tiflotomia, lavaggio ed evacuazione. La prognosi dopo la chirurgia era buona. “Clinical signs, treatment, and prognosis for horses with impaction of the cranial aspect of the base of the cecum: 7 cases (2000–2010)” Ceri E. Sherlock and Randall B. Eggleston. Journal of the American Veterinary Medical Association. December 1, 2013,Vol. 243, No. 11, Pages 15961601.

Buone le prestazioni dei purosangue con frattura dislocata o meno che sopravvivono al periodo post-traumatico Uno studio retrospettivo ha valutato la prognosi sportiva a lungo termine dei cavalli da corsa purosangue con fratture della pelvi dislocate o non dislocate identificate mediante scintigrafia. Si rivedevano le cartelle cliniche di 31 cavalli da corsa purosangue con fratture della pelvi in cui si determinava la sede di frattura definendola come dislocata o non dislocata sulla base degli aspetti ecografici e/o radiografici. Si analizzavano i registri delle corse di ciascun cavallo con un follow-up minimo di 24 mesi, correlandoli con il tipo di frattura per determinare la prognosi competitiva a lungo termine. Le fratture di una singola sede erano più comuni (n = 22) rispetto a quelle che coinvolgevano 2 sedi (n = 9) ed era più frequentemente affetta l’ala dell’ileo (n = 12). I cavalli da corsa con fratture pelviche dislocate di qualsiasi sede (n = 12) correvano meno volte nei 24 mesi dopo la diagnosi, rispetto ai cavalli con fratture non dislocate (n = 19) (mediana 0,5, range 0-13 vs 7, 0-24; P = 0.037) ma non vi erano differenze chiaramente significative nelle vittorie dei 2 gruppi. Quattro cavalli con fratture dislocate (33%) venivano soppressi per motivi umanitari a causa del grave dolore persistente. Escludendo questi soggetti dall’analisi, non si osservavano differenze nelle variabili di performance tra cavalli con fratture pelviche dislocate e non dislocate. I cavalli da corsa purosangue con una frattura pelvica dislocata o non dislocata che sopravvivono all’iniziale periodo post-traumatico hanno una buona prognosi per la performance sportiva, concludono gli autori. “Effect of displaced versus non-displaced pelvic fractures on long-term racing performance in 31 Thoroughbred racehorses”. S E Hennessy; M A Muurlink; G A Anderson;T N Puksmann; R C Whitton. Aust Vet J. June 2013; 91 (6): 246-50.

Otoscopia nel cavallo in stazione Efficace l'esame endoscopico dopo blocco locale dei nervi auricolari grande e interno in una ventina di soggetti In uno studio, si effettuavano l’ecografia, l’anestesia locale e l’endoscopia di entrambe le orecchie di 23 cavalli. Lo scopo era quello di sviluppare una tecnica affidabile per l’esame

del condotto uditivo esterno del cavallo sedato in stazione e di creare una classificazione del materiale presente e verificare la presenza di anomalie nei cavalli clinicamente sani. Si effettuava un blocco locale dei nervi auricolari grande e interno dopo palpazione caudalmente alla base dell’orecchio e valutazione ecografica del processo stiloideo come punto di riferimento per il posizionamento dell’ago. Si effettuava l’esame otoscopico con 2 videoendoscopi flessibili di 2 e 7 millimetri di diametro. La profondità del processo stiloideo variava ecograficamente da 2,08 a 2,73 cm a sinistra e da 2,04 a 2,76 cm a destra. L’anestesia locale era efficace in tutti i cavalli sedati senza complicazioni a lungo termine. La classificazione dell’aspetto endoscopico della cute, dell’epitelio e dei detriti ceruminosi e cellulari della parte cartilaginea e ossea, inclusa la membrana timpanica del condotto uditivo esterno, variava da I a III. Anomalie come osteoma, granuloma, aree emorragiche o eritematose e restringimento della parte ossea del condotto uditivo esterno dovuto a stenosi (esostosi) si osservavano in 10 cavalli su 23. La membrana timpanica era visualizzabile in 20 soggetti su 23. Il blocco locale dei nervi auricolari grande e interno era un metodo affidabile per l’anestesia dell’orecchio equino, concludono gli autori. “A Technique for Examining the External Ear Canal in Standing Sedated Horses” Sophia Sommerauer, Alice Snyder, Julia Breuer,Gerald F. Schusser. Journal of Equine Veterinary Science.Volume 33, Issue 12, Pages 1124-1130, December 2013.

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IPPOLOGIA Rivista Ufficiale SIVE Anno 24, numero 3-4, settembre-dicembre 2013 IPPOLOGIA è una rivista trimestrale pubblicata dalla SIVE per favorire l’aggiornamento dei medici veterinari che si dedicano alla cura del cavallo.

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