327514792 investigacion y ciencia temas 03 construccion de un ser vivo by Fernando

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rva toooprns

Sumario La construcción de un ser Natalia López Moratalla

vivo

Genesinteligentes....

.....6

Tim Beardsley

Lafecundaciónenlosmamíferos

.....

Paul M. Wassarman

Una herencia distinta

Robin Holliday

Impronta parental de los genes

Carmen Sapienza

Espermatogénesis

Cristóbal Mezquita Pla

Las histonas, proteínas reguladoras de genes

Michael Grunstein

Carbohidratos en el reconocimiento celular

'7)

El gen de la histona Jovita Mezquita Pla

Nathan Sharon y Halina Lis

Glicoesfingolípidos

Sen-itiroh Hakomori

Genes con homeobox y eI plan corporal de los yertebrados . . : .

Eddy M. De Robertis, Guillermo Oliver y Chistopher V. E. Wright

Base molecular del

desarrollo

Walter J. Gehring

92 100

Arquitectosmolecularesdeldiseñocorporal ..... ll2 William McGinnis y Michael Kuziora

Sustitución dirigida de

genes

Mario R. Capecchi

IZ0

Nofos lmpronlo poterno e impronlo

molerno

ElequilibriodelodosisinformotivodelcromosomoX

AnionioGorcío-Bellido lovitqminoAysucohoÉe ¿Niñooniño? Cosecho de homeobox Linoles celulores

. 32

..... 4l ...70 .....90 ....9g llg I2g

La construcción de un ser vivo Natalia López Moratalla

vivos. entre los que filodos los seres nosotros se cuenta, I cada uno de I están formados por células. Hay una enorme variedad de ellas, que tienen formas y tamaños tan distintos entre sí como lo puedan ser las apariencias de un microbio y de un elefante. Y también hay

una enorme variedad de seres vivos, desde los que no consisten más que en una sola célula hasta los formados por millones y millones de ellas. En marcado contraste con el mundo inerte de su entorno (el agua, el aire o el suelo, que podemos explicar con fórmulas químicas relativamente sencillas), las estructuras de los seres vivos son intrincadas asociaciones de moléculas complejas, generalmente organizadas en una jerarquía de niveles diferenciados. Cada componente y cada parte del organismo tiene su función propia, al tiempo que mantiene una fina armonía con el con-

junto, lo que hace que éste, el individuo, viva. En cualquier ser vivo el conjunto individual es más que la mera suma de las partes.

Pero empecemos por hacernos una idea general. Hasta el más modesto de los seres vivos es capaz de tomar de su

entorno los materiales disponibles y emplearlos en la obtención de la enetgía que necesita para alimentarse, moverse,

reproducirse, etc. Son estos mismos materiales los que se transforman en las estructuras con las que construye y modela su propio organismo. Pero la interacción de los seres vivos con el ambiente no se limita a esta captación de materiales y de energía, sino que, por un lado,

también lo transforman y, por otro, se adaptan con frecuencia a 1o que les ofrece, autorregulando sus capacidades. Con todo, el atributo más llamativo y característico de los seres vivos es su capacidad de producir una réplica fiel de sí mismos, es decir, de utilizar una energía y unos materiales disponibles para construir otra entidad de la misma complejidad y características. ¿Cómo es esto siquiera imaginable? Construir evoca de inmediato la idea de edificar, fabricar, hacer de nuevo algo siguiendo un diseño o un proyecto. La construcción de un ser vivo se parece. en cierto sentido, a la tarea de armonizar las notas musicales para que surja el complejo entramado de una sinfonía. Con fre2

cuencia se compara el mensaje genético,

información genética encriptada

el diseño para que se construya un

forma de secuencias especíticas de los cuatro nucleótidos de1 ADN. Un material muy particLllar. que no sólo sirve como receptáculo de información. sino que. merced a 1a compiementariedad de su estructllra. pelmite que el proceso molecular de realización de copias tenga la

ser

vivo contenido en los genes. con una par-

titura musical. La rnúsica escrita sería el equivalente del mensaje genético que nogal. define una especie -bacteria, una Inistna particamello-. Y a:í como tura puede interpretarse miles de veces con sutiles cambios de matiz expresi-

vo. cada especie puede concretarse

en que son

rniies o millones de individuos. iguales y a la vez diversos. N{ientras que una parlilura se e\crihe r :e intelprct.t

mediante notas musicales. e1 ntet'rsaje genético se escribe. se expresa ) se traduce en clave de compuestos quúnicos capaces de combinarse. Pero. más allá de cualquier rnalogír. un :er \ ir o no e. un artefacto. ni una poesía. ni una canción. Tiene una r ida .u¡ n I propia. r'ot'l u¡l inicio. un desarrollo temporal en el que s" completa. crece. se adapta a dir ersas circunstancias del ambiente. se reproduce ¡ alcanza su final. Desde Ia más remota antigüedad los hombres se han presuntado acerca de ese "r'ivir" de 1os seres rivos: ,.cómo surgenlr. ¿por qué hasta el más insignificante de los organismos es capaz de engendrar otro i-eual a é1. mientras que el más mara-

1os diamantes jarnas podrá hacer una réplica suya?. ..cómo consiguen una semilla o un huevo fecr.rndado llegar a ser planta o anirnal'l. ¿por qué todo 1o que tiene vida muere inexorablemente en un período de tiempo sien-rpre relativamente breve? Sólo en la segunda rnitad del siglo xx comenzó la ciencia biológica a com-

villoso de

prender algo de la lógica de los seres vivos. Desde la especulación basada en la observación contemplativa de 1o viviente se fue abriendo pa\o un conjtrnto de

ciencias activas y rigurosas, con bases

firmes en que asentar nuevos descubrimientos, capaces de dar razón de esa lógica de la vida al explicar los procesos vitales en términos de unas moléculas cuya estructuru les permite orgattizarse en otras estructuras superiores: complejos moleculares, células, teiidos. órganos y organismos. Sabemos actualmente que la clave del proceso se encierra en las estructuras tan pecuiiares que son los cromosomas, celosamente custodiados de ordinario en el núcleo de la célula. Contienen éstos la

elasticidad suficiente para que. ai tiempo que se consen a lo fundarnental del rnenqtje pte\ i,\. .c pueLltn "inr entur" nuevos men.l-ie.. E: f,:l COfllo lo\ \ere\ r ir os sufscD pr)r'gerterreion de proee¡i¡9¡s5 ¡ evolucionan,

Los materiales 1' la energía

de construcción

Los materiales de que están construidos los seres viros son en su mavoría compuestos orgánicos tle ca¡bono. en estadc¡ reducido o hidrogenado t- acompañados de nitrógeno. Se combinan de

lorrnas mur r ariadas \ a \-eces extraordina¡iamente cornplejas. Se calcula que rrna bacteria como Escl¡e r'¿ chitt coli. tno de las seres r-ir-os unicelulares más sencillos. tiene unos cinco n.ri1 tipos diferentes de estas mo1éculas. Es. sin embargo, rnul srmple. si se la compara con un organj5nro superior. Se calcula que e1 cuerpo humano trene unas cien mi1 proteínas diferentes. tiente a las tres mil de esta brctel'iri. \ ri teneltlos ert cttetttr que existen alrededor de un n.ril1ón ¡' n.redio de especres. e1 conjunto podría ascender a unos cuantos brllones de moléculas diferentes. 1o que supone un -qran contraste con e1 reducido número de molécu1as constituventes de la materia inanimada. Destle otro punto de r i.tr. sin embargo. la or-eanización n.rolecular básica de una célu1a es relati"amente simple, puesto que 1os grandes bloques constructi\,os. o sil1ares. de 1a gran mayoría de las biomoléculas mencionadas perte-

necen a un reducido número de tipos. Estas moléculas sencillas. v cotnunes a todos los seres vivos. se combinan de fbrmas distintas para lormar orgánu1os, fibras o membranas. Dos de ellas^ los ácidos nucleicos -e1 ADN y el ARN- y 1as proteínas necesariamente presentes en todo organismo dan identidad a cada una de las especies. Cada individuo de una especie posee un conjunto. distintivo de la especie, de ambas bion.roléculas. Las células actíran como fábricas dotaTnvt-rs 3

das de una maquinaria de gran precisión que produce las moléculas requeridas. Su

funcionamiento depende en buena medida de que algunas de sus proteínas sean enzimas, es decir, catalizadores de gran especificidad y eficacia, que aceleran la velocidad de síntesis, con rendimientos de reacción del 100 por cien y que no generan subproductos. Para realizar su trabajo no necesitan elevadas temperaturas ni presiones. El funcionamiento tan especial de estos procesos de fabri-

cación de los componentes celulares

apoya en la estructura de las propias biomoléculas, que son capaces de reconocerse entre sí e interactuar de

de este tipo, que se denomina

conjugación.

El resultado inicial es una única célula. En rigor sólo es reproducción sexuada la que transmite la vida por fusión de las células germinales, o gametos, procedentes de dos individuos de diferente sexo. Cada gameto porta únicamente la mitad de los cromosomas normales, de modo que, al fundirse los gametos en la fecundación, cadaindividuo recibe en esa

primera célula una dotación cromosómica completa, formada por una combinación de los conjuntos de cromosomas, o genomas, paterno y materno. Estamezcla le confiere su individualidad. basada

en una de las numerosísimas combinaciones de genes posibles. Un organismo pluricelular está formado, sin embargo y como hemos dicho, por muy distintos tipos de células. ¿Cómo se llega a ellas desde esa célula única? La respuesta está en su multiplicación repetida, acompañada de una diferenciación sucesiva, determinadas ambas de forma

detallada por el genoma. La diferenciación celular

es un proceso ordenado y preciso por el cual unos genes concretos se activan y permiten su expresión, mientras que otros permanecen

inactivos. La diversa actividad interna resultante hará que la célula

forma extraordinariamente

adquiera un tipo determi-

selectiva y especifica.

nado, tengaun fenotipo concreto: fabricará un tipo u otro

La energía necesaria para síntesis de biomoléculas, para el transporte de materiales por el interior celular, para la locomoción, etc., es 1a

de materiales, tendrá un tamaño y forma determinados, y no otros, y desempeñará un tipo u otro de función. En muchos casos la diferenciación viene a ser como un aconte-

toda energía química, que proviene del ATP (adenosina trifosfato), la moneda energética universal. El ATP hace posible el aporte de energía al hidrolizar o trans-

cimiento final: una célula

ferir un fosfato terminal, convirtiéndose en ADP (adenosina difosfato). Este ADP puede participal de nuevo en reacciones que aporten ener-

Célula

nerviosa

embrionaria recome muchos pasos hasta llegar a ser un hepatocito y construir el hígado, pero una vez que entró en esa vía tiene ya adquirido el compromiso de ser ese tipo celular y no otro.

La diferenciación no

gía química y le permitan recuperar un grupo fosfato. Las células captan energía

una capacidad exclusiva de los organismos superiores, animales o plantas, consti-

del entomo y la aprovechan

tuidos por millones de cé-

para la síntesis de ATP. Esto sucede tanto si obtienen la energía de la luz solar (células fotosintéticas). como si aprovechan la que proviene

lulas de muy diversos tipos. Los microorgan ismos unicelulares también se diferencian, es decir sufren cambios notables de estructuración, modificándose en respuesta a las variaciones del entorno. Por ejemplo, si no hay nutrientes adecuados, un hongo puede desarrollar una espora: una célula inactiva capaz

Leucocito

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de moléculas, como la glu-

cosa, cuyas reacciones de degradación tienen gran potencial energético, que consumen en su metabolismo; esto es lo que hacen las células llamadas heterotróficas. Las células cuentan con dos tipos de orgánulos parafealizar esta función: los cloroplastos, que absorben la luz solar, y las mitocondrias, que

Eritrocitos

po y germinar después cuando reaparezcan las condiciones propicias, generando una

célula vegetativa. Y de igual forma una bacteria expresa una batería de genes que codifican las proteínas ne-

mediante reacciones de oxidación obtienen la energía

contenida en las moléculas "energéticamente ricas".

cesarias para sintetiza¡ un de-

terminado compuesto, un

Un notable modo de

aminoácido porejemplo. si no

construir

lo tiene en el entorno; por el contrario. si lo tiene. reprimi-

Más del 95 por ciento de

las especies vivas tienen

rá la expresión de esos genes. El mecanismo de la expre-

una reproducción sexuada. Incluso las bacterias poseen una forma de reproducción CoNsrnuccróN os uN Srn Vrvo

de sobrevivir en ambientes adversos durante largo tiem-

DIVERSOS TIPOS DE CELUII\S, representativos de sus gran-

des diferencias morfológicas.

sión y de la represión selectiva de un gen, o de un con-

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Fenilalanina

diferencia fundamental estriba en la notlble capacidad que tienen 1as plantas para responder a los cam-

Metionina

Leucina

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la célula que las recibe, que puede estar ya predelerminada para seguir un destino concreto. El diseño de construcción de un vegetal configura un programa bastante más simple que e1 requerido para el desarrollo de un animal. La

de1 entorno erterior con modilicaciones de su creciiliento e incluso de su

bios

lcll.

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construcción, Así. según sea la intensidad o 1a duración de luz que recibe. 1a planta

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responderá acofiando o alargando los entrenudos de su ta1lo. Y también. dependien-

r.r. i ::.-- ..::' Glicina

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Prolina

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A pesar de ser mucho más

complcjo. cl Je.:trrollo rnima1 ha sido mucho más estudiado ) .c j¡no.c tncior

Glutamina

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2. FORMULAS QUIMICAS de los aminoácidos de que disponen los genes para realizar su úarea. Con ellos se construyen las proteínas. Y las proteínas sou los rnateriales básicos utilizados pa' ra la construceión dá todas lás célulasrjunto con otros pocos tipos de moléculas diferentes (azú'

cares, lípidos, etc.).

clda como rneristemo apical

puede continuar formando nuevas hojas I tallos il. Por el contrario. rr-rodiiicar su programa de desarrollo y dar flores.

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Asparagina

Cisteína

Treonina

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do de ciertas cot-idiciones ambientales. la zona cono-

que el ve-eetal. En el caso de los animale-s e1 prograt-na es

mucho más rígido \ no responde a los cambios en e1

ambiente e\terno. del que e:tá inclLr.u I l.lirnlcnte aislado. No ob.tf,ntc. cl principio de funcionamiento es el mismo. Las planta: tienen ve tetale s. que son mensajes o seña1es químicas que rnforn-ran a Ias

hormonas

célu1as de cómo han de construirse 1 adaptarse

a las

condiciones ambientales,

dlri-eiendo la erpresrón o junto de genes, es siempre el mismo: una jero o, si ya existían en esa célula, sutien bien el silenciamtento de gene: concreieñal delento.noset.uduceenotraseñal unamociificaciónysetornanactivas. tos. Las plantas tiener-i mo1éculas que cambian de folma con la luz r sólo intracelularquellevainstruccioneshasta Vqrip¡le¡l de finos Variedad ¿e su ADN para regular la expresión de genes. Láseñal Jriginariapuede

los

tipos

lil,iil"dü.t.r.,.' ,. ."ri"r,rr.-""

"0. sertanto La diferenciación celular se va produ- cuada se unen a1 ADN. La luz transmite él contacto con las célulai circundantes ciendo a 1o largo del proceso de desarro- así instrucciones a 1as plantas: hasta qué (así sucede, por ejemplo, en el embrión) llocomolaejecucióndeunprograma,con altura deben crecer. cuándo deben florecomo la presenciá o ausencia de molécu- etapas sucesivas de expresión de genes. cer. dar fruto. envejecer I morir. las que ia célula reconoce a través de ordenadas en el tiempo y dependientes Las plantas ¡'algunos animales nlenos ..".ito.., específicos. por su parte las del sitioquecadacélr-rlaocupaenelcon- complejos que 1os mamíteros. como la señáles intraielulares son moléculas, juntodelorganismoendesarrollo.Elam- estreila de mar o 1a rana. mantlenen en denominadas segundos mensajeros. que biente en que se encuentra una célula fases muy ar-anzadas de su desarrollo. e sesintetizanodJgradanent"rp.,estarlu vegetal o animal determinará su destino incluso en str esrado adulto. células totiseñal procedenteáel exterior. Í los r"gr- al inducirle cambios de sus característi- potentes. es decir. con capacidad de conladorés de los genes son proteínas que se cas y fijar sus funciones. Ahora bien, las vertirse en cualquier otra. Esta es 1a lazón sintetizan en ese momento como conse- señales enviadas por el entotxo se inter- de que el núcleo de ltna de estas célu1as. cuencia de la señal del segundo mensa- pretan de forma diferente según cuál sea o una parte del organismo, pueda re-9eTr,l,r.ts 3

nerar la estructura completa de otro individuo. En este sentido se habla de que el programa de desar:rollo es reversible. Las células de los mamíferos, en cam-

bio, alcanzan durante el desarrollo

embrionario una etapa en la que quedan irreversiblemente determinadas para seguir por un camino prefijado y llegar a ser parte de un tejido o de un órgano concretos. El programa no es reversible, debido a que en su ADN se van introduciendo modificaciones, que cier:ran defi-

nitivamente otras posibilidades en el camino de la diferenciación. Y estas modificaciones

se instauran en fases muy tempranas de su desarrollo embrionario,

por

que sus células dejan muy pronto

de ser totipotentes.

Los hitos del camino El desarrollo de un embrión a partir de una única célula puede dividirse en varias etapas. La fecundación conlleva la fusión

de un espermatozoide y un oocito. Inmediatamente después comienzan las divisiones celulares y miles de células poco diferenciadas aún se organizan en el estado de blástula. Un acontecimiento importante en el desarrollo de un embrión animal es lagastrulación, unafase en que movimientos organizados de capas celulares generan tres estratos de células que son progenitoras de todos los demás tejidos y órganos, incluidas las células germinales. Cada línea de células va siguiendo una vía que conducirá a su especialización Las divisiones celulares hacen también que el embrión crezca. Después del nacimiento el organismo seguirá creciendo y seguirá manteniendo y regenerando sus células. Lamayoiade las estructuras de un recién nacido simplemente crecen de tamaño, sin que ocurran cambios cualitativos, excepto en lo que se

refiere al establecimiento de las conexiones neuronales en el sistema nervioso de los vertebrados. Con la excepción del cerebro, los distintos órganos y tejidos animales se regeneran a mayor o menor velocidad, evitándose así que las alteraciones de sus componentes comprometa la vida. Ese recambio celular es posible gracias a la existencia de las llamadas células madre. Estas células se dividen en el organismo de una forma perfectamente

regulada; algunas de ellas conocidas como unipotentes se diferencian hacia un solo tipo celular, como es el caso de las células de la piel. Otras son pluripotentes y dan lugar a varios tipos de células diferenciadas, como es el caso de las células de la sangre. La última etapa del programa consiste en poner en marcha las instrucciones que indican el término de la vida del organismo. Los individuos pertenecen a una especie y sólo pueden vivir un tiempo máximo, CoNsrnuccróN os uN SBn Vrvo

algo que está también genéticamente determinado para cada una de ellas.

Patrones de tamaño y forma Todo organismo. animal o vegetal, tiene un patrón estructural: un sitio fijo para la cabeza y otro para los pulmones, o para las alas, las raÍces o las hojas. Las

células que constituyen un riñón no sólo son diferentes de las que forman un dedo, sino que el riñón que originan también está situado en una posición fija. Hay una información genética posicional según la cual se establece en el embrión desde muy pronto una polaridad cabezacola y otra dorsoventral. Las células guardan memoria del sitio que ocuparon en ese momento en tbrma de moléculas de proteína, codificadas por los genes que portan la información morfbló-eica. que Ies dan un etiquetado concreto. Estas proteínas indicarán qué genes deben expresarse y cuáles no en cada célula concreta. Grupos de células situadas en 1a cercanía de la cabeza se dif'e¡enciarán. por ejemplo. para dar los prrlmones. mientra. que orra\ células más alejadas acabarán. gracias a sus instrucciones, convirtiéndose en los riñones. Los mismos mecanismos moleculares sitúan la mano más alejada que el antebrazo en la extremidad o. en la construcción de una flor, disponen ordenadamente los sépalos, pétaIos. estambres o carpelos desde la perit'eria al centro. Esa información de posición permite que tipos similares de células se configuren de modo diferente. La misma batería de proteínas mensajeras inforn-ra simultáneamente a los genes sobre el número de divisiones celulares que deben inducir, con lo que se fija e1 tamaño que debe alcanzar cada órgano. Por ejemplo,

Ia formación correcta de las extremidades requiere un desarrollo diferencial de músculos, nervios, huesos v piel en cantidades y en ordenaciones distintas según que esa extremidad vaya a ser un brazo o una pierna. Para que 1a construcción de la forma sea correcta. el crecimiento de las células está controlado por regiones delirnitadas a su \ el en comparlimentos. Los tamaños de estos comprrtimentos celulares y sus fronteras forman parte del diseño contenido en el mensaje genético y están controlados por genes específicos.

No todo está decidido de antemano La expresión metafórica que se emplea para referirse al proceso de diferenciación y crecimiento hasta el estado adulto como un "programa de desarrollo" induce a equiparar el proceso de construcción de un ser vivo con un rígido programa de ordenador, cuyas instrucciones predeterminasen por completo el resultado final. La realidad biológica es bien diferente.

El proceso está recibiendo continuamente

nuevos datos que le permiten no sólo ramificarse hacia otros tipos alternativos de instrucciones, sino también cambiarlas. Es decir, los organismos tienen "historia", guardan memoria de situaciones por las que han pasado previamente y su proceso vital sólo en parte está determinado por los genes. Para predecir cómo será el fenotipo de un individuo en el futuro no basta saber cuáles son las peculiaridades propias del mensaje genético heredado, ni es suficiente descubrir el entorno que le afectará en el futuro inmediato, sino que han de conocerse ambos factores. La nutrición, la altitud a la que viva, etc., se alían con la dotación genética para determinar, por ejemplo, la talla. Y hay, por último, una tercera variable que contribuye a las

características morfológicas del organismo: los acontecimientos aleatorios que ocurren durante su desarrollo. Es frecuente que haya asimetría en dos estructuras paralelas de un organismo, o pecu-

liaridades en la distribución del pelo, coloración de la piel, etc. Es el llamado "ruido del desarrollo": pequeñas variaciones al azar er la concJntración y localización de mensajeros en el interior de células en crecimiento y diferenciación que aportarán su contribución al fenotipo.

Por ello, aunque los genes sean los determinantes reales de la arquitectura y construcción de un organismo, no debe pensarse en modelos del tipo de fabricación con molde. Al considerar un ser vivo hay que pensar más bien en términos de construcción artesanal donde el artíltce conoce el diseño y, por detallado que éste sea, no le saldrán nunca dos obras exactamente iguales; aunque intentara la máxima uniformidad, a medida que avanza su tarea, los materiales ejercen su propia influencia en el resultado final por su calidad, textura, etc. Por último, si nos referimos a la construcción de los organismos más complejos, hay que tener en cuenta que algunos órganos esenciales, como el cerebro, tienen un proceso de desarrollo que no se completa hasta pasados bastantes años de

vida. Y, si hablamos de un organismo humano, sobrepuesto a la dotación genética, al ambiente y al ruido del desarrollo, la conciencia del yo actúa además como cauce de relaciones personales, de asunción de tareas, etc. Se hace así posible que ciertos rasgos corporales, gestos, o hasta el modo de moverse, reflejen una biografía no escrita en los genes.

l'{.,1.T¿i.L\ {"{}i}FlZ \f {}li¡11 ALI,A es catedrático de bioquímica y biología molecular de Ia Universidad de Navarra.

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Genes inteligentes Tim Beardsley

¿Por qué genes muy parecidos producen células tan distintas?

La respuesta estriba en saber qué genes se activan y en qué momento, en conocer los mensajes químicos que controlan la diftrenciación

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hace medio siglo los bió-

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ciando, unos genes se activan y otros se inactivan, lo que posibilita que un simple óvulo fecundado se transforme en una flor, una mosca de la fruta o un ser humano. Durante el desarrollo de un organismo las células se mueven, migran, siguiendo complejas es-

trategias, cambian su forma y termi-

nan por asociarse para constituir tejidos especializados. Un ser humano, por ejemplo, tiene más de 250 tipos

distintos de células y cada una debe estar y funcionar en el lugar adecuado. (Las céIulas hepáticas no servirían

en el cerebro.) Todas, sin embargo, portan los mismos genes en su ADN. Cómo se consigue armonizar la actividad de los genes de un organismo para que las células se formen y funcionen en el sitio correcto, y en el momento preciso, ha constituido un misterio que ahora empieza a esclarecerse. Cientos de experimentos demuestran que el control de la expresión de la mayoría de los genes de un

organismo se realiza casi siempre mediante la regulación de la transcripción, un proceso cuyo fin es copiar la información genética que contiene el ADN en ARN, que son las moléculas utilizadas para fabricar los millares de proteínas que determinan que

una célula difiera notablemente

otra. La principal enseñanza de la bio-

logía molecular del último cuarto de siglo es la del control de la expresión génica mediante la regulación de la transcripción. La profundización en el conociACTMCIONde

miento de cómo se controla la transcripción en los organismos pluricelulares ha sido obra de muchos investigadores. Eric H. Davidsonha acuñado la expresión "genes inteligentes" para designar los que responden a las combinaciones de señales enviadas de un

gen a otro en las redes de control. Estudia ahora el "cerebro del gen inteligente", es decir, el complejo transcripcional, un complicado agregado de proteínas. Para que se inicie el proceso de la transcripción, las proteínas, que actúan como señales químicas, han de unirse al ADN en un sitio cercano al gen que debe transcribirse. Este tipo de complejo viene a ser una "computadora desgarbada", donde se combinan señales y se toma la decisión de si se activa o no un gen. En el caso de que la combinación de mensajes químicos pueden recibirse desde

fuera de -que la célula- sea la adecuada, se activará la enzima que realice la transcripción y se producirá ARN. Se suele trabajar con mosca de la

fruta, gusanos microscópicos

incluso

conbloques sueltos de proteínas. Pero

hay razones poderosas para pensar que los resultados serán generalizables a todos los organismos, incluido el ser humano. En efecto, en todos los

organismos pluricelulares parecen funcionar los mismos procesos básiEl "gen inteligente" podría constituir una de las características univercos.

sales de las que dependen los procesos de desarrollo embrionario. Aparte de su interés teórico estricto, conocer los mecanismos por los que los genes controlan y son contro-

lados puede ayudarnos a encontrar

parala diferenciación celularmediante laformación de un complejo de proteínas que se unen a sitios específrcos del ADN. El proceso comienza cuando el AI)N se desprende de las histonas (¿), que mantienen arrollado el AI)N mientras no se utiliza. Los factores de transcripción (estructuras pares) se unen entonces al ADN (ó). Forman un complejo transcripcional (c) que activa a las proteí_ 1.

los genes decisivos

nas asociadas con la enzima encargada de CoNsrnuccróN o¡ uN Snn Vtvo

transcribir el gen en una cadena

de ARN (d).

vías para combatir las enfermedades que se originan cuando los procesos no se llevan a cabo adecuadamente. Enfermedades que no se limitan a las pa-

tologÍas hereditarias, sino que incluyen también eI cáncer y los síndromes de autoinmunidad. Cuando se conozcan mejor los sistemas de control que

regulan los genes, se podrá diseñar drogas que activen o inactiven genes específicos: un auténtico salto cuántico que revolucionará la medicina.

Anteproyectos genéticos La idea de que las señales quÍmicas podían condicionar la actividad de los genes se remonta a los primeros días de la embriología. Cuando en el laboratorio se cortaba un trozo de tejido de un embrión de rana y se trasplan-

taba

a otro sitio, el tejido trasplantado originaba a veces una estructura propia de su ubicación de partida: una rana, por ejemplo, con una extremi-

dad fuera de su región. Pero si la manipulación del embrión aconteeía en una fase precoz del desarrollo, entonces el animal se recuperaba de la "extirpación" y llegaba a término con normalidad. Hasta 1960 no se contó con una explicación coherente del fenómeno; se la debemos a los experimentos realizados por Frangois Jacob y Jacques

Monod con la bacteria intestinal

Escherichia coli.

Se sabía que, en presencia del azicar lactosa, E. coli pro-

ducía rápidamente enzimas capaces de metabolizarla. Los investigadores franceses propusieron la existencia de una proteína que, en presencia de lactosa, activaba algunos genes que estaban inactivos.

"El genoma contiene no sólo una serie de anteproyectos", escribieron Jacob y Monod, "sino todo un programa coordinado de sÍntesis de proteínas y medios para controlar su eje-

cución." Su propuesta incluía también

nan por mantener un medio interno

un punto clave: la proteína que controlaba el proceso era capaz de reco-

constante, no parece tarea fácil decidir qué genes han de activarse. Las

nocer y unirse a una secuencia específica de bases, próxima a los genes sometidos a control. De esta forma, aseguraban, la proteína impedía la transcripción. La hipótesis de Jacob y Monod se mostró acertada. Desde entonces se han descubierto sistemas de control

células de un organismo complejo necesitan "saber" dónde están instaladas para decidir qué genes expresar.

Y deberían, además, estar capacitadas para responder ante situaciones de emergencia, como una agresión o la súbita presencia de una hormona.

producen enzimas que metabolizan un nutriente o sintetizan algún otro

Por ser tan distintos los requerimientos de las bacterias en relación con las exigencias de los eucariotas, nadie se imaginaba que recurrieran a idénticos mecanismos fundamentales para controlar sus genes. Pero ocurre

compuesto que se encuentra en bajas concentraciones. En todos los casos, proteínas con capacidad de unirse al

que las proteínas que se unen al ADN son las que se dan en eucariotas. Desde los mismos comienzos de la

ADN se adhieren a sitios específicos del ADN bacteriano para reprimir o promover la transcripción de un gen

investigación sobre el control transcripcionai en eucariotas empezaron a aparecer fenómenos nor,edosos. Así,

que no suele quedar lejos.

en 1982, Steven L. NlcKrright ¡' Robert

La eficacia con que las proteínas enlazadas al ADN promueven o reprimen la transcripción depende de las

Kingsbury levantaron uno de

génico en E. coli, variantes en su mayoría del esquema inicial. En muchos de ellos participan genes que

1os

pri-

meros mapas en 1os que se señalaban las regiones de AD\ que afectaban a

transcripción de un gen en una célula eucariota. L tilizaron un gen de

concentraciones de dichas proteínas, que a su vez puede depender de mul-

titud

un r.irus helpes que se expresaba en

de factores. Aunque algunos mecanismos de control de la trans-

cripción bacteriana son exquisitamente sensibles, su funcionamiento recuerda más el de un conmutador que eI de una computadora. Reto muy distinto es el que plantea el control de los genes de un organismo pluricelu-

lar, de mecanismos más complejos. Las bacterias podrían utilizar la mayoría de sus genes durante su corta vida, activándolos o reprimiéndolos rápidamente, en respuesta a las condiciones cambiantes del medio. Por contra, una célula diferenciada de un

ovocitos de Ia rana Xenoptts laet'is. Pror-ocaron mutacrones en 1as proximidades de1 gen. con 1a intención de ar-eriguar qué regrones elan fundamentales para 1a transcripción normal del gen ]'. por tanto. intocables. Hallaron valias. L-na estabajunto a1

''promotor". sitio mu¡' próximo al Iugar por donde la enzima encargada de la transcripción aborda su tarea. A tenor de 1o conocido en bacterias. era éste un resultado esperado. Los otros

una pequeña proporción de sus genes.

dos sitios de interés quedaban lejos, en términos moleculares. uno a 50 ¡* el otro a 100 pares de bases. Resultaba extraño que a tanta dis-

Si bien los cambios de actividad

tancia una proteína incidiera en

génica deben ser más escasos, porque los organismos pluricelulares se afa-

transcripción. CabÍa, empero, sospe-

organismo pluricelular utiliza

só1o

char que se tratara de sitios

no tardó en confirmarse, cuando Robert T. N. Tjian aisló una proteína que estimulaba experimentalmente Ia transcripción de un gen en una célula eucariota: 1o hacía mediante el enlace

en otra secuencia de las bases del ADN. Tjian encontró que su proteína se unÍa a cinco sitios distintos en las proximidades de un gen vírico. Luego se vería que todos los genes eucariotas son muy parecidos en ese sentido. A diferencia de las proteínas que se unen al ADN de las bacterias. las de eucariotas suelen controlar 1a transcripción desde sitios de engarce muy alejados. Pronto se identificaron factores transcripcionales que se unían a puntos situados hasta a 40.000 pares de bases del gen diana. sin perder por ello la capacidad de estimu-

1ar, o reprimir, la transcripción. También,

factores transcripcionale

crcLo

2. GENES ESPECIFICOS DE TEJIDOS se activan cuando los factores de transcripción se unen a una combinacién adecua8

eucariotas.

¿Cuántos reguladores? Barbara R. Hough-E\-ans ]- otros que trabajan con Davidson se han ocu-

pado del gen que produce 1a proteína actina en Strongylocentrotus purpuratus (erízo de mar). Hasta 20 regiones próximas al gen son reconocidas por proteínas reguladoras. Davidson y' sus colaboradores han demostrado que cinco de e1las, por 1o menos. deben estar con proteínas reguladoras para que el gen de la actina se transcriba.

Han encontrado también otras

dos

regiones a las que deben unit'.e pro-

teínas reguladoras para lmpedir la transcripción de dicho gen. Según Davidson, cinco es el número medio de sitios reguladores en un gen SEÑAL DE UNA CELULA CONTIGUA

TRANSCRIPCION

------------->

CELULAR

diferencia de las proteínas

Pueden estar a cualquier lado del promotor o incluso curso abajo del gen.

ESPECIFICIDAD TISULAR

bacterianas que se unen al ADN, no importa tanto Ia posición exacta de los

FUNCION NEGATIVA

IDENTIFICADOR DE LINAJE O POSICION

REGULADOR TEMPORAL

engarce de proteínas. Sospecha que

GEN ESPECIFICO DE TEJIDO

CONTROLADOR DE AMPLITUD

da de sitios para constituir un complejo rimico. Cada factor transmite una información específica. TEN{AS 3

3. EMBRIONES TEÑIDOS d.e Drosophila revelan cómo se activan selectivamente los genes en ciertas regiones durante el desarrollo. La proteína producida por hunchbacÉ se tiñe de verde; de rojo, la d.e giant (arriba, a la izquierda). Zen es verd,e y dorsal, roja (centro, a la izquierd.a). El color verd.e revela actividad detu:ist (abajo, alaizquierda). La proteína hunch-

de un organismo pluricelular. Parece como si la mayoría de los genes de los

organismos pluricelulares tuviesen que montar una computadora proteica antes de proceder a la transcripción. Tjian sostiene que el promotor eucariota debe poseer muchos sitios de control, en tanto que el con-

mutador genético bacteriano más complejo que se conoce por Mark Ptashne y que-analizad,o controla la proliferación de un virus bacterianopresenta sólo tres de esos sitios, justo donde se inicia la transcripción. Los factores de transcripción euca-

bach es roja y Krüppel, verde (arriba, o la derecha). La proteinaeuen-shipped. esverd,ey hairy,roja (centro, a la derecha\. (El amarillo débese al solapamiento.) Un embrión de más edad muestra la prof,eíta d"e engrailed, (band.as de color manón) y de 559 (puntos púrpura), que preceden al desarrollo del músculo (abajo, a la derecha).

menos específicas. Dicho de otro modo, en los eucariotas los factores de

transcripción podían mancomunar sus esfuerzos para compensar la falta de especificidad de unión. Pero la única manera de que varias proteínas

entrasen en comunicación mutua cuando se hallaban dispersas a lo largo del filamento de ADN era agrupándose en un complejo. La idea no era descabellada, ya que el ADN que actuaba como espaciador, al ser flexible, podía plegarse. Tljian h arealizado

electromicrografías en las que

aprecian esos bucles en preparaciones

riotas son además menos cuidadosos

de complejos transcripcionales. Ha

que los bacterianos a la hora de unirse

visto, además, que para que el sistema

al ADN. Lo que, en un principio, desconcertó a los investigadores: en el núcleo eucariota había más genes dentro de un volumen mayor y, no obs-

tante, las proteínas se mostraban CoxsrnuccróN

DE uN SER

Vrvo

funcione es preciso que concurran siempre cinco proteínas, por lo menos. Sin embargo, estas proteínas obligatorias no son suficientes por sí solas para la regulación normal de la trans-

cripción. Se necesita la compañía del complejo formado por los factores de transcripción, situadojunto al gen. Sóio

cuando coinciden todos los componentes obligatorias, enzima y la -proteÍnas combinación justa de factores transcripcionales específi cos- se realizar á la transcripción controlada del gen inteligente. Se han encontrado ya varios cientos de factores transcripcionales distintos. Unas dos terceras partes de los mismos se pueden clasificar en grupos, según su estructura molecular: hélicevuelta-hélice, dedos de cinc, cremalle-

ras de leucina, hélice-bucle-hélice. El resto corresponde a proteínas solitarias, algunas de las cuales son específicas de un tipo particular de tejido. Ptashne y Keün Struhl diseñaron

ingeniosos experimentos en los que producían factores de transcripción

híbridos. Y aunque las generalizaciones son peligrosas, demostróse con los ensayos que los factores de transcripción tienen al menos dos regiones: la que reconoce secuencias específrcas de ADN y se une a ellas y la que se considera responsable del efecto activador. Abre muchos interrogantes la forma

de funcionar del complejo transcripcional, entendido como "cerebro" del gen inteligente. Se exige, tal parece, cierto "quorum" de factores transcripcionales; pero no hay modo de plasmar

en imágenes la interacción mutua de hasta 20 proteínas.

una concepción errónea de1 funcionamiento de los factores de trans-

Se admite que los factores transcripcionales se presten mutuo auxilio para unirse al ADN. Tjian afirma haber aislado un tipo de proteína (la llamada coactivador) que reúne a los factores transcripcionales específi cos de secuencia con la enzima que realízala transcripción y las proteínas asociadas. No todos se lo acaban de creer. Ptashne, por ejemplo, piensa que la propuesta de Tjian se funda en

cripción.

Mezcla de señales Aunque los detalles estén por acla-

rar, no cabe duda de que el complejo transcripcional determina cuándo hay que transcribir un gen. Y ello podría explicar 1as observaciones de los embriólogos, según las cuales habría señales extracelulares e intra-

Las infinitas enseñanzas de Drosophila

TI H L

vulsar de la fruta ha sido la favorita de los senetistas du"rante más de 60 años. Su contribución áctuat a la biología del desarrollo no desdice de sus aportaciones a la teoría de la herencia. En los últimos años se ha ido componiendo un cuadro bastante completo de las interacciones génicas que acontecen en las primeras fases sa mosca

del desarrollo embrionario de Drosophila. El adulto está dividido en 17 segmentos, algunos con apéndices (alas o patas). Aunque las células que conforman el embrión son muy parecidas, si se trasplantan a un sitio diferente producen las estructuras características del lugar de partida. Dato que atestigua que, desde muy pronto, las células están programadas para crear estructuras de un segmento concreto. Durante las primeras fases del desarrollo se manifiestan una serie de genes a través de bandas de proteínas que se tornan visibles con tinciones especiales. Las bandas dividen al embrión en segmentos. El proceso comienza cuando las células nutricias maternas secretan en el huevo ARN del gen bicoid. El ARN peÍnanece confinado en un extremo del huevo; traducido allí en proteína, ésta se va propagando por el huevo. Al mismo tiempo, ARN de otro gen materno, de nombre nanos, difur,de en la dirección contraria. La proteína b ic o id estimtila, mediante una adecuada combinación de activaciones y represiones, la transcripción de los genes gap. Son éstos los primeros genes propiamente del embrión que desempeñan un papel en la configuración del patrón de desarrollo. Se forman cuatro bandas anchas, dos de proteínas hunchback, separadas por otras de proteínas de los genes Krüppel y knirps. Christiane NüssleinVolhard y Wolfgang Driever han puesto de relieve el papel KNIRPS

BICOID

KRUPPEL

de la proteína bitoid: si se la altera. carnbia 1a erpresión de los genes gap. Los -9enes gap ceden el paso a siete bandas solapantes.

productc'r de 1a expresión de eler¡-.ikipped.

ltairt y rwtt.

Posteriormente siete bandas de proteínaf r.slti tartt-t alfer' nan con siete de even-skip¡ted. Todar-ía ntás tarde ap¿lrecen 1,1 baridas más estrechas de proteína ettgruiletl. Cada banda parece representar una cornbinación de -qenes acti\-os. Se cree que otros -qenes. la mavoría todar'ía desconocidos. responden a estas combinaciones produciendo las estructu¡as especializadas de cada segmento. Mlentras acontece todo ello. una jerarquía distint¿r crea en el ernbrión r.rn eje dolsoventral. proceso tundamental para que se produzcan diftrentes tipos de tejidos. En el procero interr.iene un gradiente de producto del gen dctrsal. capaz de obrar corno bitoid. Luego los genes denominados n, ist ¡ srlr¡i1 se expresan en regiones específicas del eje dorsoventral. Algunos de los genes implicados en el desarrollo pare-

cen contlanestar el efecto de otros. Otlos operan en concierto. N{uchos se autorregulan: una vez activos. ellos n'rismos se siguen aritoactivando, hasta que ocure also que los inactira. Y otlos. como et'e¡¡-skipped, cunplen uristones diferentes en momentos distintos. Los biólo-uos que trabajan con otros organismo-r singularizan el caso de Dro.sopl'tila porque sus paredes celulares se fonnan bastante tarde. dando tiempo a las proteína-s para crear gradientes de concentración. Sin negar'lo. NtissleinVolhard replica que las céluias pueden tarnbrén crerr los eqLri\ alentes a 1os -sradientes, si hay entre ell¿rs difelencias cuantitativas en las señales que reciben. Está conr encida de que 1os animales más complejos poseen tan'rbién -uradientes. HUNCHBACK

EVEN-SKIPPED

FUSHI TARAZU

ENGRAILED

T¡rres

celulares que intervendrían en la aetivación o inactivación de un gen. Si una célula posee la combinación adecuada de factores de transcripción para un gen particular, el complejo se

formará y cornenzar ála transcripción del gen inteligente. Diferentes tipos de señales podrían procesarse así: información sobre linajes, interacciones con otras células, estado del ciclo de división celular, etc. Los genes inteligentes ofrecen también una salida a un difícil problema, que ha traído de cabeza a los teóricos. Si cada gen de un organismo debe tener su propia proteína controladora, ¿cómo regular

la síntesis de tantas

proteínas? Ahora bien, si se admite la interacción mutua entre varias proteÍnas reguladoras, bastarían unas pocas para controlar muchos genes.

Muchos factores transcripcionales están formados por dos subunidades.

Este rasgo dimérico aumenta el número de genes que pueden controIar. Como las dos subunidades no tienen por qué ser idénticas, con un grupo limitado de subunidades

crean muchos dímeros distintos; bastan cuatro subunidades, A, B, C y D,

para formar diez dímeros: AA, AB, AC, AD, BB , BC, BD, CC , CD

DD.

No es posible decir cuántos genes diferentes podrían controlar los diez dímeros, sin saber exactamente cómo

funcionan los complejos transcripcionales, pero podrían ser cientos, sobre todo si el sistema tolera algunos errores. Y hay indicios de que sí puede. Muchas células parecen producir cantidades pequeñas de algunas proteínas sin función conocida. Quizá son el resultado de imprecisiones que no

afectan al sistema de control de la transcripción. Aunque en los estudios primeros sobre factores de transcripción eucariotas se utilizaron genes simples, los complejos transcripcionales desempeñan un papel fundamental en sistemas más complicados, como podemos ver en el trabajo con levaduras de Ira Herskowitz y Alexander D. Johnson. El organismo unicelular posee, sin embargo, estructura cromosómica eucariota y existen distintos tipos

celulares. De esos tipos, uno es asexuado. Se multiplica por gemación, dividiéndose

simplemente en dos, para producir descendientes idénticos. Los dos tipos celulares restantes son formas sexuadas, que se producen en condiciones desfavorables, y que pueden cruzarse

entre sí. Herskowitz y Johnson han desentrañado los controles genéticos que dan tazón de esa disparidad triCoNsrnuccróN oe uN Srn Vrvo

4. ESTRUCTURA,S ANORMALES derivadas de mutaciones sufridas por los genes del desarrollo. Arriba a la izquierda se ofrece un ojo normal de Drosophil¿. A la derecha, otro con mutaciones en el gen seuenless; a los grupos de fotorreceptores Ies falta una de las siete células. El trasplante en Drosophil¿ de un gen con una secuencia homeótica de ratón produce pala (centro derecha) donde una mosca normal presenta antena (izquierd.a), Abajo a la izquierda, una cría normal de ratón; a la derecha, una deforme, con mutaciones en un gen homeótico.

ple. El principallocus de control es un factor de transcripción que regula los genes que se expresan de manera diferente en los tres tipos. El esquema de control es complejo

y elegante, a un tiempo. El factor transcripcional fundamental está constituido por un dímero, cuyas

formen los tipos sexuales. Si el dímero

consta de subunidades idénticas, se activan los genes utilizados en los tipos sexuales. Las levaduras utilizan feromonas para coordinar sus actividades reproductoras; estos mensajeros químicos,

muy parecidos a las hormonas, inter-

subunidades pueden ser idénticas o distintas. Un dímero integrado por dos subunidades distintas hace que la célula sea asexual, porque reprime

vienen en Ia transcripción. Una

todos los genes necesarios para que se

otra céIula del tipo sexual contrario.

pequeña proteína secretada por una célula de un "tipo sexual" se une a receptores especiales presentes en

5. MODELOS que ilustran la unión de los factores de transcrip' ción al ADN. A la izquierda, una proteína homeótica kn amarL

//o) se une al ADN (.azul

La unión desencadena una cascada de reacciones químicas que termina con

que provocan 1a duplicación de un gen; si una copia duplicada no es perjudi-

de otro factor transcripcional especializado. Provoca, pues, Ia convergencia de los genes que intervienen en el cruzamiento. En con-

v adquirir Llna nueva función. Y si e1 nuevo gen vale la pena. podrÍan per-

la activación

junto, al menos 13 genes participan en el control del tipo celular en levaduras, y casi todos ellos son factores transcripcionales.

La secuencia homeótica Al iniciarse los años ochenta nadie dudaba de la importancia de los factores transcripcionales eucariotas. Pero era difícil hallar ejemplos que destacaran su interés en los procesos de desarrollo. Los biólogos no sabían

cial, puede evolucionar con el tiempo petuar'lo las nueva. e-pecie.. No tardaron en descubrilse secuencias homeóticas. o slmilares. por todas

partes. Drosctphila tenía I'arias

co-

pias, todas ellas en genes relacionados con el desalrollo. Pero no acababa ahí el inter'és clel asunto, La oldenación fÍsica de los genes homeóticos a 1o largo del eromosoma se couespondía bastante bien cot-r e1 orden de sus dominios de actilidad a 1o lalgo de1 cuerpo.

N{u¡' pronto también. }lcGinnis yenco.tr.at.oli jecuenqi¿-. par.eci_

oLt,os

qué secuencias genéticas buscar,

das a 1as homeóticas en otros orga-

hasta que, en 1983, el laboratorio de

nismos: escarabajos. gusanos. ranas. gal1inas. I'atones v hasta en e1 hombre. En todos e1los se consen-aba la

Walter J. Gehring X, por separado, Matthew P. Scott, realizaron un des-

ordenación génica en el cromosorna.

cubrimiento crucial. Estudiaban un grupo

! lilo). A Ia derecha.

tipo dedos de cinc (naronja, omarillo

Ia que Io hace es del

lila\.

pruebas de que 1as proteínas homeóticas se unían. en efecto. al ADN. En 1988 O'Farrel dio e1 último paso al demostrar que 1as proteínas pi'oducidas por/zzsál tctrazu t enjaponés. "falto de segmentos"). un gen homeótico de Drosophila, y por otl'o gen homeótico, no só1o se unían al AD\. srno que activaban y reprimían 1a tlanscripción de genes próximos. Las pluebas ulteriores apuntaban en la misma dilección. En definitiva. los genes homeóticos

producían factores cle transcripción que controlan $ene: en o|ganismos pluricelulares. Ll'na cosa es mostrar un fenómeno en el tubo de ensa¡-o I' ot1'a. mu¡- distinta. demostrarlo en la naturaieza. ]{cGinnis ¡, su colega flichael A. Kuziora pusieron sobre el tapete e1 interés de un dominio homeótico. re-

curriendo a un animal vivo. Sustitu).eron 1a secuencra homeótica de un gen de Drosophilu pol una secuencia

homeótica, ligeramente distinta, de

mentos de los adultos, se desarrolla-

así como 1a plopia secuencia homeótica. Y no sólo en inverteblados ¡'r'er'tebrados: se ha descubielto recientemente una variante (algo alterada I en

e1 gen quimérico se expresara en el insecto, Y nació una lalr,a cuyos segmentos de la cabeza

sen estructuras erróneas.

el desarrollo de las plantas.

parecían segmentos torácicos. El

La tenaz conserr-ación de la secuencia homeótica. durante miies de mil1ones de años. abonaba la idea de atribuirle una función principal. Lo que

dominio homeótico introducrdo reconocía una región específica de1 ADN

de genes de Ia mosca de la fruta, Drosophila, cuya mutación provocaba que, en los seg-

gen

Antennapedia, por ejemplo, determinaba la formación de patas allí donde correspondía que hubiese antenas. Scott, en Colorado, y Ernst Hafen, Michael Levine y William J. McGinnis, en Basilea, descubrieron que varios de estos genes, denominados

genes homeóticos, contenían una secuencia característica de bases, que

desde entonces es conocida como Ia secuencia homeótica ("homeobox"). La secuencia homeótica es un punto de referencia fundamental, ya que es algo concreto que los genéticos moleculares pueden buscar. Una vez identificada una secuencia en el seno de un gen, se hallan las secuencias similares en Ios cromosomas, cuya existencia se explica por las mutaciones 12

se ratificó en 1984. cuando Allen Laughon advirtió que 1a región proteínica determinada por 1a secuencia homeótica guardaba cierto parecido con las secuencias de las proteínas bacterianas que se unen a1 ADN y con

las proteínas implicadas en el tipo sexual de las ler.aduras. Las similitudes llevaron a Laughon y Scott a pro-

poner que la secuencia homeótica determinaba un fragmento de proteína, que llamaron dominio homeótico, capaz de unirse al ADN.

No mucho después Patrick H. O'Farrel y Claude Desplan aportaron

oti'o gen. para que

)' se unía a el1a.

Jerarquía de genes El refinamiento de las técnicas pa-

ra identificar productos génicos ha permitido descubril cierta j erarquía, sorprendente. conrpJeja v enmal'añada, de genes implicados en Ia ejecución

plan corporal de Drosophila. NIuchos son genes homeóticos. En las pride1

meras horas del desarrollo. tras la fecundación, el embrión elipsoidal se

subdivide progresivamente en diferentes direcciones. Las proteínas producidas por esos genes forman gradientes de concentraciones que T¡r¡¡s

activan o inactivan a otros genes, según Martin Hülskamp y Diethard Tautz.

Los genes inteligentes hablan

W ffiF

Abd-B Abd-A Ubx

mucho unos con otros durante ei desarrolio. EI proceso se repite a escalas

Antp

Scr

Dfd

Lab

DROSOPHILA

sucesivamente decrecientes. hasta

configurar bandas de expresión proteÍnica. Cada banda posee una combinación peculiar de genes activos y es probable que éstos determinen qué genes deben activarse en cada segmento de Ia mosca adulta.

RATON

Uno de los genes homeóticos de esta

jerarquía se llama euen-skipped,

denominación que alude al hecho de que algunos mutantes carecen de seg-

mentos pares. La proteína eueru-skip¡ted apar:ece primero en siete bandas, muy poco definidas, que subdividen al embrión. Posteriormente las bandas se van haciendo más precisas. Mutaciones en el gen euerz -skipped condicionan la actividad de otro gen, si-

6. GENES HoMEorrcoa.o., en el mismo orden en "".our"i." "¡-il".i"1parecen los cromosomas de especies diversas. La ordenacióoá ro h.go del cromosoma es ra misma que la de las regiones de actividad en el cuerpo. por ejemplo, el Abd-B de Drosophila y el Hox 2.5 de ratón son activos en el extremo posterñr del embrión.

tuado más abajo en la jerarquía, el

engrailed. El geneuen-skipped es afec-

tado, a su vez, por genes situados curso arriba en la misma jerarquía: httnchback, Krüppel, giant y bicoid.

El equipo harvardiano de Tom Ma-

niatis, junto con Levine, han encontrado que el gen euen-skipped posee varias regiones a las que se unen proteínas reguladoras, que controlan la expresión del gen. Una de esas regiones, que controla 1a aparición temprana de cierta banda euen-shipped., tiene sitios que reconocen las proteínas bícoid, hunchback, Krttppel y giant.TJna serie distinta de proteínas, que se unen a otros sitios, controlan 1a expresión tardía de er,e¡¿ -skipped.Y esto es sólo el principio: casi con toda seguridad cada una de las siete bandas posee su propia batería de proteínas reguladoras. El número de genes de vertebrados

con contrapartida equir.alente en Drosophila parece aumentar cada semana. Ei producto del gen dorsal de Drosophila, por ejemplo, es similar a

un factor de transcripción de mamíferos, designado NF-áB, que participa en una "respuesta de emergencia',. Darnell y su grupo han descubierto un factor de transcripción específico

I HAIRY

RUNT

HUNCHBACK

t BtcotD { . GIANT i t

L,.

KRUPPEL

EXPRESION TARDIA

): 'l ll t:

EXPRESION TEMPRANA

tl-l

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ltL

EVEN.SKIPPED

t I

SITIO DE rNrcrAcroN DE LA TRANSCRIPCION

de hígado, muy afín al producto de un

conocido gen homeótico de Drosophilct, fork-head, que se expresa en las células precursoras del aparato diges-

tivo de la mosca. Estas células dan lugar al equivalente al hígado en

Drosophila, el cuerpo graso. En los últimos años se han realizado ingeniosos experimentos para comprobar si la similitud de secuencias reflejaba un paralelismo de funCoNsrnuccró.¡ o¡ r¡N Sen Vn o

7. ACTTVACION del gen eaen-skipped. de Drosophila. Requiere el concurso de varios factores transcripcionales, producidos por otros genls. Las regiones E7 y E2 (aurnentadas abajo), que controlan ras bandas 7 y 2 de etsen-shippeldtrante er desarrollo temprano, contienen muchos sitios donde se unen proieínas hunchback, bicoid., giant y Krüppel. Una actividad posterior (Z) es contro]l ad,a por hairy, runt y la propia eu en- shipp e d.

8. FACTORES transcripcionales (grandes bonones) pegados en los extremos de una cadena de ADN, en la fotomicrografía

ciones. Se han trasplantado genes del

desarrollo (o parte de ellos) de una especie a otra. McGinnis introdujo en Drosophila un gen de ratón equivalente a Antennapedia y promovió deliberadamente la sobreexpresión del mismo. Las moscas nacieron con defectos "casi idénticos" a los producidos por la sobreexpresión de su propio Antennapedia: patas donde debía haber antenas. Introdujo también en Drosophila rn gen homeótico humano similar a otro encontrado en el insecto. Cuando el gen humano se

sobreexpresa deliberadamente en Dro sophila produce deformaciones en

cabeza, del tipo de las provocadas por la sobreexpresión del gen equivalente de la mosca. En 1991 Osamu Chisaka Y Mario R. Capecchi obtuvieron pruebas directas del papel de los genes homeóticos en

mamíferos. ManiPularon un gen homeótico de ratón Y nacieron embriones de ratón que sólo portaban la versión alterada del gen. Los raton-

citos, que sobrevivieron sólo unas horas, aparecieron con terribles malformaciones en el corazón Y la garganta y carecían de algunas glándulas. Las malformaciones recordaban

Ias que caracterízan al síndrome de DiGeorge, una enfermedad humana

rala.

Pero no se crea que será tarea fácil

de la izquierda. Bajo ciertas condiciones, se unen y forman complejo, lo que origina un bucle de ADN (.d.erecha).

deducir lo que todo esto pueda implicar respecto de las enfermedades humanas relacionadas con el desarrollo. Se anda a oscuras en Io concerniente a los genes de mamíferos que gobiernan las primeras fases del desarrollo. Ignorancia que reina también sobre la mayoría de los genes situados en el extremo opuesto de la jerarquía de control: los que gobier-

nan Ia identidad de los tejidos específicos.

Con una excepción reseñable' Me refiero al gen de mamíferos MYoD, investigado por Harold Weintraub y sus colegas. MyoD es un potente fac-

tor de transcripción que Puede, sin

ninguna ayuda, convertir células en músculo. (Maniatis y su grupo hallaron un gen de Drosophila, nautilus, con una secuencia similar a MYoD, que también se expresa en células destinadas a ser músculo.) EI descubrimiento de que muchos de los genes fundamentales Para el desarrollo sean factores de transcripción refleja la misión destacada que

cumple al control transcripcional. Pero hay otros genes, imPortantes desde el punto de üsta del desarrollo, que afectan también a la transcripción indirectamente.

Andrew P. McMahon Y Allan

Bradley se preguntaron si un gen de ratón, design adoWnt- 1 , similar a otro

9. RENACUAJO NORMAL de rana africana, a la izquierda' Si al embrión se le inyecta ARN de activina humana, se forma un eje 14

gen de Drosophila, ulngless. tenía algo que ver en el desarrollo del sis-

tema nervioso de Ios mamíferos. Promovieron

formación de embrio-

nes de ratón con dos genes ltr¡nl--I de[ectuosos: aparecie]'on sin una parte importante del ce1'ebro. Ocutte, sin embargo, que lvnl- 7 no determina

ningún factor de transclipción;

acuerdo con todos los indicios. lo que

hace es especificar una ¡ustancia difusible que afecta a 1a transcl"ipción en células vecinas.

Se conocen bastante bien ciertas señales extracelulares que provocan 1a respuesta de los genes inteligentes.

Las hormonas esteroides ¡' 1a vitamina D, por ejemplo, viajan desde el exterior de la célula hasta su núcleo, donde se unen a los recePtores Para formar factores de transcripción activos. De otras muchas moléculas vitales, que actúan como señales. sabemos muy poco. Me refiero a los "factores de crecimiento" ¡'1as moléculas de adhesión. Estas moléculas señalizadoras prefleren unirse a 1os

receptores de 1a superficie celular, desde donde enviarían su mensaje al nricleo. Gerald M. Rubin investiga la red de interacciones entre determinaciones específicas de linajes celulares.v señales difusibles que rige el destino de las células fotorreceptoras de los ojos de

adicional klerecha). El ARN determina una sobreproducción de activina, que afecta a los genes del desarrollo. Te\,t.A.s 3

Drosophila. Las células forman grupos de ocho miembros, pero en los mutantes afectados en un gen deno-

minado seuenless falta el séptimo miembro del grupo. El gen seuenless determina un receptor de la séptima

célula, cuya función consiste en reci-

bir una señal de las células vecinas, gracias a la cual aquélla adquiere su identidad. Si el gen está alterado, la señal no se recibe.

H. Robert Horvitz defendía que Ias moléculas implicadas en la comunicación celular en los animales sen-

cillos operaban, asimismo, en los

organismos superiores, tesis a la que acabó de dar fundamento demostrando que el gen let-60 es uno de los varios conmutadores que gobiernan el desarrollo de las seis células pre-

cursoras de la vulva en el gusano microscópico Caenorhabditis elegd,ns.

Claves del cáncer Let-60 , que como el g en seuenless de

Drosophila determina un componente de una ruta de señales, se parece a un oncogén humano, esto es, un gen que

puede causar cáncer. La verdad es que no constituye ninguna sorpresa que muchos oncogenes sean formas mutadas de genes que intervienen en el desarrollo y determinen factores de transcripción u otras moléculas impli-

cadas en las señales ligadas al desa-

rrollo que afectan a la expresión génica. El gen Wnt-1 de ratón de McMahon y Bradley, por ejemplo, tiene una forma oncogénica; lo mismo

que dos importantes factores de transcripción de la "respuesta precoz", fos y jun, que se activan cuando las células de mamíferos responden a factores de crecimiento. Las correspondencias entre genes que controlan la transcripción y sus-

tancias ligadas al cáncer afloran con monótona.

una regularidad casi

Douglas A. Melton ha demostrado que el

factor de crecimiento actiüna activa

genes homeóticos durante el desarro-

llo de la rana Xenopus. Durante el desarrollo del animal, las células saben dónde están gracias a la formación de gradientes de activina; eso se infiere de su ensayo: cuando Melton manipuló los niveles de activina en embriones se

alteraron los ejes corporales. El ácido retinoico desempeña en aves y mamíferos un papel semejante al de la activina enXenopus. No hace mucho que se hallaron pruebas de la

producción de cierta forma de leuce-

mia por parte de un receptor del ácido

retinoico mutado. Consrnuccrón oE ut SEn Vrvo

Histonas En el ámbito de Ia regulación génica los factores de transcripción han quitado protagonismo a Ias histonas, proteínas presentes en grandes cantida-

des en el núcleo eucariótico y que concentraron Ia atención a principios de los años ochenta. Mientras no se transcribe, el ADN permanece arro-

llado en torno a las histonas, formando los nucleosomas. EI ADN empaquetado en nucleosomas es la cromatina. A pesar de Ia reticencia de algunos,

las histonas comienzan a encontrar acomodo en el nuevo marco explicativo

general. Ptashne, por ejemplo, reconoce que los nucleosomas imponen una barrera inespecífrca a la transcripción, aunque cree improbable que ello obligue a introducir cambios profundos en 1os modelos sobre control génico basados en los complejos transcripcionales. James T. Kadonaga estudia Ia lucha de histonas ¡,- factores de transcripción por acceder al ADN. El sí prevé un cambio drástico en ios puntos de vista tradicionales sobre activación génica. Robert E. Kingston r. sus colegas han demostrado que aigrrnos factores de transcripción compiten mejor que otros.

Las histonas podrían ser un componente esencial de los genes inteli-

gentes. Tjian plantea un problema que los modelos basados exclusivamente en los complejos de transcripción no suelen explicar: ¿qué ie impide a un factor de transcripción activar todos los genes que están a su alrededor?

Con el resurgir del interés por las histonas comenzamos a ensamblar las piezas del sistema. Mas, aun cuando se desentrañe en 1os próximos años el control de Ia transcripción y se conozca perfectamente el cerebro

ha publicado sobre el tema, entre otros, los s¡guientes artículos:

¿Ver es creer?, de William J. Mitchell,

Abril

1994

Visiones astronómicas de Chesley Bonestell, de Ron Miller Julio I994

Microscopía confocal, de Jeff

W. Lichtman

Octubre

1994

Las metáforas de Escher, de Doris Schattschneider Enero I 995 La Tierra vista desde el cielo, de D. L. Evans, E. R. Stofan, T. D. Jones y L. M. Godwin

Febrero I 995

La computadora del historiador del arte, de Lillian Schwartz

de los genes inteligentes, no debemos

Junio 1995

olvidar que 1a transcripción no es el único modo de regular genes. Procesos que vienen más tarde, como los que introducen nuc'leotidos en secuencias

de Lothar Haselberger

ya transcritas de ARN ("RNA editing"), añaden un nuevo nivel de complejidad, que mantendrá viva nues-

tra atención-

Agosto

1995

Cuadernos de laboratorio de Thomas Edison, de Neil Baldwin Diciembre

il iil l_1{){t E.\Fr1.4 l{}}{pi,L.,HF.},'l A R lA

Nucr-¡osol,res: REcLrLerons oF TRANScRIprIoN. Michael Crunstein en Trends in Genetics. r,o1. 6. n.. diciembre de 1990.

Descifrando un plano romano,

12.

1995

torre inclinada de

Pisa

de Paolo Heiniger

Febrero 1996

pígs. 395-.+00.

Perrunx

FoRNIATToN DURTNG ANrtrlr_ DEVELOII'IENT. Dor-rglas A. Melton en Science, r.o1.2-52, págs.234-2:11, 12 abril

de 1991.

La fecundación en 1os rnamíferos Paul M. Wassarman

Los fenómenos que preceden y siguen a la fusión del espermotozoide con el óvulo tienen que ocurrir en wna secuencia precisct.

En el curso de este proceso interviene,

forma destacada, una moléculct sirtgular

T'Fan transcurrido más de cien I{ añordesdequeHermannFol, I I un perspicaz zoólogo suizo, lo-

estudio de las interacciones espermatozoide-óvulo con bastante detalle. Esas investigaciones han aclarado grara, mediante su microscoPio, ver no sólo los sucesos fundamentales de la fecundación en los mamíferos, sino cómo un espermatozoide Penetraba también Ios mecanismos moleculares fory fecundaba, en un óvulo Io Para yo hemos mar la primera célula de un nuevo em- subyacentes. Mis colegas y 1a moléy caracterizado identificado las brión. De entonces acá, muchas de que, 1a capa externa en específica cula proceso de el que bonstituyen etapas lafecundación-la serie de sucesos que del ovulo de ratona, lunciona como receptora de1 espermatozoide. También tienen lugar, en un orden estrictamente obligado, desde el contacto inicial hemos descubierto que esta molécula papeles del espermatozoide y el óvulo hasta la receptora desempeña otros fecundación la de decurso en el críticos que los como fusión de ambos-, así 1'en los fenómenos que inmediatamenacontecen inmediatamente después le siguen. Los estudios sobre esta te de ella, han sido objeto de atención molécuia l'eceptora. otras moléculas preferente por parte de los biólogos' implicadas en ei proceso de fecundaA1 igual que Fol, que observó la feción del ratón )- molécuias análogas estrella cundación de un óvulo de una de mar, los primeros investigadores en otros mamíferos, pueden facilitar centraron sus estudios en los inver- en el futuro estudios bioquímicos sobre tebrados marinos. La r azón principal 1a reproducción humana. Dichos estudios podrían llevar a nuevos métodos, de esto estribaba en que los óvulos de para evitar 1a concepción (contratanto (en contraste conlos tales organismos como para el tratamiento de cepciónt, fecunson los mamíferos) óvulos de dados fuera de Ia hembra (en eI agua 1a esterilidad en ios seres humanos. Aun cuando nos hayamos concentradel mar) bajo condiciones que pueden (dado que recrearse con facilidad en el laborato- do en el trabajo con ratones en disponibles humanos hay óvuios rio luéase "EI proceso de la fecunda- no para esque se t'equieren cantidades IuvnsrrceclÓN ción" por Daüd EpeI; vCrsNcIA, enero de 19781. Desdefina- tudios moleculares), su modelo de feles de la década de los 50 se han Pre- cundación es completamente similar parado y perfeccionado sistemas de al de la esPecie humana ¡' al de otros cultivo con los que se logra, in uitro,la mamíferos. Ei proceso fundamental fecundación y las primeras fases de comienza cuando muchos espermatozoides quedan, al principio laxamente desarrollo de los óvulos de mamíferos, Y con los que se hace Posible el adheridos y más tarde tenazmente pegados a receptores, sobre la superficie de la gruesa corteza (córtex) o capa externa ovular, llamada zona !'i e s director del departamento de biología celular y P.¿i-' l-.

. lir;1§

-s

Air: l\ i ¿

desarrollo en el Instituto Roche de Biología Molecular en Nutley, N. J. Obtuvo su doctorado en bioquímica por 1a Universidad de Brandeis en 1968 ytrabajó en diversas instituciones antes de incorporarse a 1a facultad de medicina de Harvard. en donde inició sus investigaciones sobre e1 desarrollo de los mamíferos. Wassarman dqió Harvard en 1985 para acceder a su destino actual. de1

Generalmente 1a unión de un esPermatozoide con un óvu1o Presenta la así llamada especificidad específica que, en nuestro contexto' significa que los receptores espel'maticoi que posee

el ór,ulo reconocen só1o a espermatozoides de la misma especre v rechazan a todos

1os

demás. Esa caPacidad

de Ios gametos, o células sexuales, masculinas y femeninas. dentl'o de 1a m'isma especie. pálá :11 t'econociniiento mutuo, es característica del proceso de fecundación de todos 1os olganismos, vegetales y animales. extendida por doquier. Y ha¡- buenas razones para ello. Los estudios erpelimentales han puesto de manifiesto que. con

unas pocas excepciones notables

(tales como los embriones de mulos y burdeganos. que se originan pol cruzamiento de las especies caballoasno), los embriones producidos por fecundación interespecífica no se pueden desarrollar normalmente.

T a unión del esPermatozoide a la L)roru pelucida ta:eguida de lo que se liama reacción aclosómica del espermatozoide adhelido. E1 acrosoma es un orgánulo rico en enzimas digestivas, que está situado en la i'egión anterior de Ia cabeza de1 espermatozoide, exactamente bajo 1a membrana plasmática que envuelr'e esa cabeza. Durante la reacción los dos tercios, más o menos, que están frente a dicha

membrana plasmática. se unen con la capa externa de la membrana del acrosoma. En esta fusión se forman

ona p eLluc ida ). C ada esper-

microvesículas, que constan de Ia membrana plasmática del esPerma-

matozoide, que tiene en su superficie un gran número de Proteínas óvuloadherentes, se pega a muchos recePtores espermáticos sobre el óvu1o. Más exactamente, cada Punto de engarce de cada proteína óvulo-adherente encaja con su punto de engarce complementario sito en el receptor espermático, del mismo modo que cada llave ajusta en su cerradura.

acrosómico-reactivo perfora, entonces, la cubierta externa ovular.

p elúcida

tozoide y de 1a membrana acrosómica externa. Estas vesÍcu1as híbridas terminan siendo expulsadas. con Io que ).a zona pelúcida queda expuesta a Ia capa interna de 1a membrana del acrosoma y a las enzimas de éste. Estimulado por las enzimas, que digieren l.a zona pelúcida, el espermatozoide

TEN,IAS 3

Uno de los espermatozoides, entre

la multitud de los que avanzan, ai-

fusión de más de un espermatozoide con un único óvulo.

canza el espacio perivitelino, estrecha

región entre la zona peiúcida y la membrana plasmática del óvu1o, se fusiona con esa membrana y fecunda al óvulo: ei material genético del parental masculino se mezcla con e1 del parental femenino, para iniciar el desarrolio de1 embrión resultante. La fusión desencadena también una serie de reacciones que, en pocos segundos, alteran Ia membrana plasmática. ¡r, al

cabo de pocos minutos, alteran asimismo la zona pelúcida, en 1o que se IIama zona de reacción. Con ello, tanto la membrana plasmática como la cubierta ovular externa se vuelven relract

rias para otros espermatozoi-

des. Estos cambios son cruciales para

evitar una situación que lleva a Ia muerte, denominada polispermia:

¡-t

uriosamente. la zona pelucida

modo de barrera para los espermatozoides, y, por tanto, como un impedimento para la fecundación; a menudo, en los experimentos con óvulos de mamíferos, éstos han sido despojados de ella. Ahora ha quedado aclarado que tal envuella lunciona como un sistema de seguridad de gran finura, que puede diferenciar los espermatozoides que llegan, para seleccionar únicamente a 1os compatibles con la fecundación y el desarrollo, prepara al espermatozoide para la fusión con el

óvulo y, posteriormente, protege a1 embrión resultante contra Ia polispermia o fecundación mú1tiple.

1. EN LAZONA PELLUCIDA, o cubierta externa del ómlo, pueden adherirse y penetrar muchos espermatozoides, pero sólo uno llegará, en su caso, a unirse con la frna membrana plasmática que rodea al óvulo propiamente dicho (esferainterna),lo fecundará y originará el nuevo emtrrión. Con estudios recien-

CoNSTRUCCTóN oe uN SEn

Vrvo

l.-z ha considerado. a veces. por los investigadores como un estorbo, a

Cuando nosotros empezamos

estudiar la fecundación en los mamÍferos algunas de las más importantes preguntas sin respuesta eran las siguientes: ¿cuál es la naturaleza del supuesto receptor espermático en Ia zona peiúcida? ¿Qué es 1o que inicia la reacción acrosómica, con la que continúa 1a adhesión del espermatozoide al óvuio? ¿Qué cambios bioquímicos ocu-

rren, después de la fecundación, para que ia zona pelúcida se haga refractaria a los espermatozoides restantes? Ha resultado que una glucoproteína única polipéptido, o cadena de

-un que IIeva unidos grupos aminoácidos. de azúcares- constituye parte de Ia respuesta a las tres cuestiones. Pasamos a estudiar la zona pelúcida de manera indirecta. En el curso de una investigación sobre el desarrollo de1 ratón, intentamos Ia identi-

tes en el ratón acometidos en mi la}¡oratorio y en otros, se han empezado a dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes en la serie de sucesos constitutivos de la fecundación en los mamíferos. Ovulo y espermatozoide de ratón se han ampliado unos 1000 diámetros en esta microfotografía del autor del artículo. 11

o efecficación de genes -represores sólo durante el tores- que actuaran crecimiento de los oocitos, las células madre de los óvulos. Entre los genes que gobiernan la producción de las proteínas de la zona pelúcida era de esperar que encontráramos los más

prometedores candidatos al respecto, pero necesitábamos aislar dichas proteínas antes de poder identificar los genes correspondientes. Jeffrey D. Bleil y yo descubrimos que Ia zona pelúcida en el ratón cons-

taba de tres glucoproteínas diferentes. Las denominadas zPl, zPz y zP3. Sabíamos poco de su estructura química, pero sí logramos diferenciarlas mediante electroforesis sobre gelatina, una técnica estándar que separa moléculas en razón de su peso molecular. Dado que las zP7, zP2 y zY3, que, respectivamente, pesan en unidades dalton 200.000, 120.000 y 83.000, son sintetizadas y seg:regadas por los oocitos en crecimiento, se reúnen para for-

mar una cubierta porosa, que crece

hasta un espesor de unas siete micras (milésimas de milímetro). (La cubierta del óvulo humano es casi el doble de gruesa y la de otros óvulos de mamíferos puede alcanzar un espesor cuatro o cinco veces mayor.) En cierto modo quedamos sorprendidos de esa composición tan simple

de la zona pelúcida del óvulo de

ratona. Al fin y al cabo casi todas las células de mamífero quedan envueltas por wa matriz extracelular, que es marcadamente más compleja y

ADHESION

INICIO DE LA REACCTON ACROSOiIICA.

ESPACIO PERIVITELINO

ZONA PELLUCIDA

MEMBRANA PLASMATICA GRANULO CORTICAL

CONNNUACION DE

I.Á REACCION ACROSOMICA

ESPERIIATOZOIDE ACROSOMICGREACTIVO

PIEZA

INTERMEDIA PARTE ESPERMATICA EXCLUIDA DE ZONA

CUELLO DEL ESPERMATOZOIDE

PENETRACION

ACROSOi¡4A

NUCLEO MEMBRANA PLASMATICA OVULAR (MPO)

CONTENIDO DEL ACROSOMA MEMBRANA ACROSOMICA INTERNA MEMBRANA ACROSOMICA EXTERNA

FUSION DE LA MEMBRANA PLASMATICA OVULAR (MPO) Y DE LA MEMBRANA ACROSOMICA EXTERNA (MAE)

2. EL PROCESO DE FECLINDACION comprende varias etapas. Una vez que el espermatozoide o célula espermática se tt:re ala zona pellucid,o tiene lugar la llamada reacción acro' sómica. La membrana externa del acrosoma (en oerd,e oscu' ro), orgánulo rico en enzimas, y situado en la parte anterior de la cabeza del espermaúozoide, se fusiona en muchos puntos con la membrana plasmática que rodea dicha cabeza. Después, ambas membranas adosadas (e¿ aerd,e claro) forman ve-

sículas que, finalmente, son expulsadas y liberan enzimas acrosómicas (en rojo); las enzimas abren una vía de penetra-

ción en la zona pellucida, lo cual permite el avance del es18

FORMACION DE VESICULAS

ESPERMATOZOIDE ACROSOMICO-REACTIVO

permatozoide. Por fin, el espermatozoide se une a la membrana plasmática del óvulo, y se fusiona con ella, para fecundarlo. El proceso culmina con las reacciones producidas entre corfeza- y zona pellucida. Primeramente, gránulos corticales del citoplasma ovular, ricos en enzimas, sueltan su contenido (en amarillo) dentro de la zona pellucida, comenzando por el punto de fusión y progresando a derecha e izquierda. Después, en la zona reaccionante, las enzimas modifican la zona pellucid,a, hasta transformarla en una barrera impenetrable a los espermatozoides, como defensa contra la

polispermia. TEIV{AS 3

OLIGOSACARIDOS

O-LIGADOS DE 3OOO DALTON

wi componente principal de los frlamentos (izquierd.a) que se asocian para formar la zona pellucida. zP3 es una glucoproteína: un polipéptido al que se unen grupos glucídicos. Se combina con otra glucoproteína, zp2, para, formar los sillares de los filamentos, que aquí están dibujados, 3. MOLECULA zpZ,

en el centro, de manera esquemática; una tercera glucoproteina, zel, une los filamentos. La molécula zpS, que se muestra a la derecha, es la receptora que fija los espermatozoides;

lleva muchas proteínas diferentes. Pero nuestros hallazgos resultaron confirmados, posteriormente, por nuevos datos de que las zonas pelúcidas (zonae pellucidae) en todos los

también induce la reacción acrosómica. Los elementos de unión efectivos sorl un conjunto de las cadenas de azúcar, como salientes radiantes del eje esquelético polipeptídico de la zP8; son oligosacáridos con uniones de oxígeno, unidos a los arrinoácidos serina y treonina, con un peso molecular en torno a los 3900 dalton. Parece ser que las mismas cadenas de azúcar son las que colaboran con el polipéptido en la zp\, para inducir la reacción acrosómica.

de zonas pelúcidas v añadimos espermatozoides de ratón en una piaca de prueba, removimos bien el esperma y 1o incubamos con los óvulos no fecundados. bajo condiciones conocidas, que

mamíferos estudiados, incluida la

permitieran, in citro, tanto la fecun-

especie humana, constan también de unas pocas glucoproteínas.

dación como el desarrollo.

La citada simplicidad nos indicó otra dirección de estudio. Verosímilmente una de las tres glucoproteínas de la zona pelúcida, en la

Cf upusimos que si la disolución

zonas pe'l ucidas contenia recepto-

res espermáticos, éstos y Ias proteínas

óvulo-adherentes del espermatozoide

ratona, actuaba como receptor esper-

podrían reaccionar entre sí y unirse

mático y podríamos identificarla. Sin embargo, primero había que demostrar que, en efecto, la zona pelúcida contenía receptores espermáticos. Pasamos a lo que se llama prueba de competitividad. A partir de óvulos sin fecundar, aislamos zonas pelúcidas y disolvimos el material en una

para formar complejos moleculares.

solución ligeramente acidificada, de tal modo que todas las glucoproteínas de cada

cubierta, no sólo las

la capa

externa del óvulo, pudieran reaccionar libremente con los espermatozoides. Luego neutralizamos la disolución CoNs:rnucctóN

DE uN SER

Vrvo

La formación de estos complejos impe-

diría, entonces, ia acción de las proteínas óvulo-adherentes sobre las zonas pelúcidas de los óvulos no fecundados, en la última etapa de la prue-

ba, y, por tanto, los espermatozoides tratados no llegarían a adherirse a 1os

óvulos,

ni a fecundarlos. En

otras

palabras, los receptores libres disueltos podrían competir con éxito con los receptores espermáticos de los óvulos. Por otra parte, si Ia disolución no contenía receptores, los espermatozoides

no quedarían afectados por el tratamiento con la solución de zonas pelúcidas, y podrían unirse y fecundar a Ios óvulos normalmente. Descubrimos que los espermatozoides tratados no podían adherirse a los óvulos, o fecundarlos; se demostró así que la zona pelúcida de los óvulos de ratona contenía receptores espermáticos. Por otra parte, los preparados de zonas pelúcidas solubili-

zadas, obtenidas no de óvulos sin fecundar, sino de embriones todavía unicelulares, no impedían la adherencia de los espermatozoides ni la fecundación, prueba de que la cubierta de esos embriones carecía de receptores espermáticos competentes. Este último hallazgo está en concordancia con el hecho de que los espermatozoides no pueden unirse a un óvulo fecundado (embrión unicelular), ni perforar su cubierta. Lo que también sug"iere, al menos parcialmente, que la razón por la cual la zona pelúcida se hace refractaria a los espermatozoides después de la fecundación es que ésta provoca 19

FECUNDACION IN VITRO RECEPTORES ESPERMATICOS PROTEINAS

OVULO.

venía en la reacción acrosómica. En un estudio para evaluar el papel de la zP3 como molécula receptora, contábamos con ciertos descubrimientos realizados en nuestro propio laboratorio, en Harvard, así como con los de Bayard T. Storey y sus colaboradores en 1a lJniversidad de Pennsylvania: sólo pueden adherirse a la cubierta externa del óvulo los espermatozoides con un acrosoma intacto, y sólo los es-

ESPERMATOZOIDE

OVULO NO FECUNDADO (VIRGEN)

ADHESION OUE CONDUCE A LA FECUNDACION

PRUEBA DE COMPETITIVIDAD

aa a

permatozoides acrosómico-reactivos pueden llevar a cabo el paso siguiente, la perforación de la cubierta. Estos descubrimientos nos permitieron suponer que si 1a zP3 era un receptor espermático sólo reconocerÍa espermatozoides de acrosoma intacto, y no los de acrosoma sujeto a reacción, cuando se mezclara con espermatozoides en una placa de laboratorio.

s.i:..i!' --a ltt .-----= a

Por otra parte,

só1o reconocería

cabeza del espermatozoide cuando

ESPERMATOZOIDE

RECEPTOBES ESPERMATICOS LIBRES

NO SE PBODUCE LA ADHESION

tuviera lugar su adhesión sobre la zona pelúcida; no reconocería ni la pieza intermedia ni la cola. Se evaluó, mediante autorradiografía,la capacidad

para dis-

4. LA PRUEBA DE COMPETITñ'IDAD contribuyó a demostrar que la zrB de la zo' napellucid.a era el receptor espermático en la ratona. Cuando en una placa de la' boratorio se exponen espermatozoides a óvulos no fecundados (orriba), las proteí-

tinguir entre espermatozoides con acrosoma intacto y 1os acrosómico-

proteínas óvulo-adherentes están bloqueadas, los espermatozoides ya no pueden

reactivos. y entre difel'entes regiones espermáticas. Marcamos ze3 purificada con un isótopo radiactivo; después, registramos, sobre peiícula, la

nas óvulo-adherentes del espermatozoide se unen a los receptores espermáticos de los óvulos y sobreviene la fecundación. En la pruetra de competitividad (oó¿io), los espermatozoides son incubados, en primer lugar, con supuestos receptores espermáticos. Si existen receptores, los espermatozoides se unen a ellos; corno ahora las

unirse a los óvulos y fecundarlos. Si no hay receptores, los espermatozoides no quedan afectados y fecundan a los óvulos. En la prueba de competitividad la zt\, aislada a partir de óvulos no fecundados, impide que los espermatozoides interactúen con óvulos de ratona. (Dibujos de Neil O. Hardy.)

una modificación de los receptores cación espermáticos del óvulo -modifi que destruye su capacidad de unión

con las proteínas óvulo-adherentes del espermatozoide. Comprobado que la zona pelúcida

contenía receptores espermáticos, intentamos saber cuál de las tres glucoproteínas servía como receptora y qué cambios en su molécula la incapacitaban para el reconocimiento de espermatozoides. Dimos muy pronto con Ia respuesta a la primera cuestión. Purificamos las glucoproteínas zY1, zPzy zPS,tanto de óvulos sin fecundar como de embriones unicelulares, e hicimos con cada una de ellas la correspondiente prueba de competitividad. Esto puso de manifiesto que la unión de los espermatozoides con los óvulos sólo quedaba inhibida cuando los espermatozoides eran tratados mediante la ze3 purificada, procedente de zonas pelúcidas. No ejercían ningún efecto ni las glucoproteínas zYl y zP2, ya de óvulos, ya de embriones, ni tampoco la ze3 procedente de embriones. Aún más, en la inhibición de la adhe20

rencia resultaron tan eficaces la zp3 ovular purificada como los preparados mismos de zona peiúcida, seña1 de que la zp3 había sido la responsable de la inhibición en Ias pruebas originales de competitir,id ad.LazpS mostraba ser la receptora espermática.

¡-1 uando comparamos. mediante elec-

U troforesis sobt'e gelatina. la ze3

procedente de óvulos no fecundados con la procedente de embriones, obserrevamos que las dos moiéculas -una ceptora activa, 1a otra inactiva- eran indistinguibles. Estaba claro que, para que se produjera la inactivación del receptor, después de la fecundación, debía darse algún cambio químico muy sutil de ese receptor. Teníamos que conocer mejor la composición, para Ilegar a comprender cómo acontecía 1a

inactivación. Esto llevaría algún tiempo. Mientras tanto, continuamos con otras pesquisas. Entre éstas se incluía una prueba adicional de que la zp3 era la receptora espermática. También esperábamos determinar si la zp3 inter-

de Ia zp3

emisión de radiactividad de las moléculas. Las autorradiografías resul-

tantes indicaban que 1a zr3 marcada ofrecía el comportamiento esperado, y se unía sólo a espermatozoides con acrosoma intacto, y únicamente a las cabezas. Estos experimentos nos per-

mitieron también hacer 1a estimación de que cada acrosoma intacto Podía unirse a unas 10.000 a 50.000 mo1éculas de zp3. Dada Ia extraordinaria

movilidad de ios espermatozoides de mamíferos, habrá que suponer que se necesitan decenas de miles de receptores en la zona pelúcida intacta. para unir cada célula espermática a su superficie. Bleil y yo también colaboramos para dilucidar e1 mecanismo mediante el cual se inducía Ia reacción acrosómica. Era muy posible que una glucoproteína de lazona pelúcida que no fuera Lazp3, esto es, las zP1 o zr2, indujera la reacción, después de producida la unión inicial de1 espermatozoide a Ia zP3. Por tanto, combinamos espermatozoides de acrosoma intacto con cada una de las glucoproteínas de Ia zona

pelúcida, obtenidas de óvulos de ratona, y observamos los efectos sobre el espermatozoide. Sóio Ia ze3 puriflrca-

da, procedente de zonas pelúcidas ovulares, era capaz, in uitro, de inducir Tsru¡s

Ia reacción acrosómica, lo que ponía de manifiesto que esa zp\ e:r.a el inductor

natural. lrlo inducían la reacción ni las zp1 y zp2,ya de óvulos o de embriones, ni la ze3 procedente de embriones. Al parecer, la ze3 pierde su capacidad

para inducir la reacción acrosómica después de

la fecundación, precisa-

idénticas, unidas por puentes disulfuro. Esta arquitectura filamentosa sitúa en la superficie de Ia zona pelúcida a decenas de millones de moiéculas znS, más que suficientes para Ia

unión tenacísima de un ejército

La investigación de las interacciones moleculares que permiten a Ia zp3 unirse al espermatozoide, e iniciar la

Todavía no se ha aclarado, en sus pormenores, de qué manera la unión de espermatozoides con la zp3 induce Ia reacción acrosómica. Algunas pruebas avalan Ia posibilidad de que la unión

reacción acrosómica, comenzó con el análisis previo de Ia acción quÍmica de la molécula. Estos estudios fueron llevados a cabo por Greve y otros dos de mis doctorandos, Richard J. Rolier y George S. Salzmann. En este trabajo no podíamos distinguir, de modo inmediato, qué características eran importantes para la función receptora y cuáles no 1o eran, pero nos dio una base firme para posteriores estudio".

tozoide v Ia posibilidad de que dicho cambio facilite la fusión de las mem-

branas plasmática y acrosómica.

pl I¿l

descubrimiento de la doble función de la zpS espermatica e inducción de-union Ia reacción acrosómica- nos sorprendió gratamente. EI caso es completamente distinto en los erizos de mar y otros invertebrados marinos, en los que estas funcio-

oligosacáridos se presentan en muchas variedades, y en cada molécula de zp7 no se dan las mismas secuencias de cadenas de azúcares.

células espermáticas.

mente cuando pierde su capacidad para adherirse a espermatozoides.

haga más permeabie, a los iones calcio, la membrana plasmática del esperma,

dos aminoácidos, serina o treonina. Los

Averiguamos que la cadena polipeptídica de la zp3 constaba de unos 400 aminoácidos. Como ramas salien-

tes de esa cadena polipeptídica hay muchas cadenas de oligosacáridos, ca, denas cortas de azúcares sencillos. Tres

cuatro son oiigosacáridos N-ligados, que significa que están unidos a un átomo de nitrógeno, sobre el aminoácido asparraguina. Un número indetero

nes se reparten entre dos moléculas diferentes. En esos organismos. los óvulos presentan dos cubiertas exte-

riores: una gruesa, gelatinosa. por

minado. aunque bastante alto, eran

fuera, y otra, mucho más fina. por dentro, la envuelta vitelina. Una molécula glucídica en la capa gelatinosa induce la reacción acrosómica. mien-

un átomo de oxígeno sobre uno de los

oligosacáridos O-ligados, enlazados a

f)oco

después de que HarveyM. Flor-

man llegara a mi laboratorio nos pusimos a trabajar para determinar si eran las cadenas de polipéptidos o las de polisacáridos, o ambas, las responsables de la actividad espermático-receptora de la zpS. En muchos ejemplos de interacciones receptoras, la estructurá tridimensional del recep-

tor, que es a menudo qna proteína, resulta decisiva para su capacidad de unión con una proteína complementaria. No conocíamos la conformación de la ze3, pero sabíamos cómo alte-

rarla, y al hacer esto podría determinarse si lo importante, en su capacidad de interacción con la proteína óvulo-adherente sobre el espermatozoide de ratón, era la forma de la zp3. Nos encontramos con que el exponer la zp7 a agentes que desplegaban su esqueleto polipeptídico (estructura plegada-no plegada) no ejercía influencia

sobre la unión esperntátíca, lo que implicaba que la conformación de la zP3 no era un factor importante al respecto. Para confirmar esto, cortamos moléculas de zp\ en pequeños gluco-

tras que una glucoproteína. en la envuelta vitelina, es 1a responsable de la unión con especificidad específica. El saber que la ze3 puede actuar en la unión espermática y en 1a inducción de'la reacción acrosomica no sirve para explicar cómo lo hace. Esto nos llevó a otro estudio más amplio. si bien mis colegas y yo deseábamos ahondar más en Ia distribución de 1a ze3 por 1a zona

pelúcida. Pretendíamos. en particular, determinar si la superficie de Ia cubierta exhibía suficientes moléculas de zp3 como para hacer posible las decenas de mi'l'lares de interacciones que suponíamos eran necesarias para fijar a cada espermatozoide en su lugar. Jeffrey M. Greve y yo establecimos que la zona pelúcida constaba de largos filamentos interconectados, dotado cada uno de un grosor de unos

7 nanómetros (millonésimas de milÍmetro). Posteriormente determina-

mos que el sillar fundamental de los filamentos era una unidad compuesta

y otta Zp3, y que dicha unidad se repetía, a menudo

', ll

de una molécula Zp2

cientos de veces, en cada filamento. Los filamentos de la zona pelúcida se hallan conectados entre sí por ze1, que consta de dos cadenas polipeptídicas CoNsrnuccróx o¡ uN SEn Vtvo

5. ESPERMATOZOTDE estrechamente adherido a una trola de vidrio, cubierta zp8 de ó¡rulo de ratona. Este hallazgo, unido al de que ni la zpl ni la zr2, ni otras

con glu-

coproteínas, provocan esa unión, proporciona la prueba más importante de que la la receptora espermática en los ratones. La microfotografía, con microscopio de barrido, fue tomada por David M. Phillips, con material preparado por Mónica H. Yázquez. zp8 es

El descubrimiento de que, en el reconocimiento del espermatozoide y el óvulo, están implicados azúcares Oligados se suma a una masa creciente de datos que destacan 1a importancia de los azúcares para el reconocimiento entre gametos, así como en otros tipos de reacciones intercelulares, no sólo en los vertebrados sino también en Ios invertebrados y en los vegetales. En ese sentido, los azúcares son imprescindibles para la unión con especificidad-específica de espermatozoides y óvulos de invertebrados marinos, así como para Ia inducción de la reacción acrosómica. También hay pruebas de

que los azúcares intervienen

manera decisiva en Ias interacciones gaméticas del invertebrado marino Ciona intestinalis \tna ascidia) y el resulta espectacularmente claro en esta microfotoglafía en campo oscuro, tomada por el autor. Los espermatozoides se 6. EL EFECTO DE LA REACCION DE ZONA

adosan a óvulos no fecundados (ez masas apelotonadas), pero 1o a un embrión en fase tricelular. Es muy verosímil que la zr,3 esté implicada en la reacción de zona. Las enzimas corticales Iiberadas en la zo na pellucicla alteran las moléculas de zp8 de manera que si antes actuatran como receptoras ahora rechazan a los espelrnatozoides.

péptidos mediante pronasa, enzima totalmente indiferente ante 1a elección de los puntos de cortadura. Después volvimos a nuestras pruebas de competitividad, y mezclamos espermatozoides con toda 1a colección de glucopéptidos, para exponer ese esperma así tratado a óvulos no fecundaclos. Por Io que respecta a impedir 1a unión de espermatozoides y óvulos, Ios glucopéptidos pequeños mostraban la eficacia de la zp3 intacta, cuyo resultado

elimina, virtualmente,

posibilidad

cada de la ZP3 conserva la actividad espelmático-receptora. E1 haliazgo

impiicaba. rnu¡- hrmemente, que los oligosacáridos O-ligados constituían ia parte plincipai de la zp3 de1 ratón

en 1a adhesión espermática sobre

zonas pelúcidas. Cuando. por otra parte. sepalamos los oligosacáridos O-ligados con un álcaii débil, 1a molé-

cula alterada no mostró actividad espermático-receptora. Y aún más, la exposición de espermatozoides ante pequeñas concentraciones de azica-

tico-receptora de la zP3. El hecho de que la conformación de Ia zp3 no revista importancia para Ia adherencia indica que la cadena polipeptídica, probablemente, no propor-

de 1a zp3res O-ligados -separados impedía 1a unión de 1os espermatozoides a los óvulos 1,' la fecundación. En conjunto, estos resultados demostraron que los oligosacáridos O-ligados eran Ios elementos espermático-adhesivos de la molécula zP3.

ciona el sitio de unión. Para confirmar esto, tratamos la zPB con ácido trifluorometansulfónico, reactivo que elimina de las cadenas polipeptídicas

Clin embargo. no todos los oligosaD cáridos ó-tigudo, manifestaban activi dad e sp ermático -receptora.

tanto los oligosacáridos N-ligados

Tanto en estudios en los que se sepa-

como 1os O-ligados; entonces, mediante Ia prueba de competitividad, ensayamos, sobre la cadena desnuda, Ia actividad espermático-receptora.

raban, con respecto a su tamaño, cadenas de azúcares, y se mezclaban con esperma, como en aquellos en los que se mezclaba el esperma con la dotación total de las cadenas de azúcares O-ligados, obtenidas a partir de la ze3, y en los que se suponía que estarían los oligosacáridos espermático-adherentes, se puso de manifiesto, para todos los casos, que no liegaban al 10 por ciento de 1os oligosacáridos O-ligados de la zp3 los que podían trabarse con Ios espermatozoides. Los que 1o hacían eran los de peso molecular de unos 3900 dalton.

de que se requiera una conformación específica para la actividad espermá-

Tal como se esperaba, la exposición de espermatozoides a la proteína sola no tenía efecto sobre 1a unión de los espermatozoides a ios óvulos: los polipéptidos no poseen, de suyo, actividad espermático-receptora detectable. En pruebas similares separamos los oligosacáridos N-ligados de la zp3, rnediante endoglucosidasa F, enzima que deja intactas las cadenas de glú-

cidos O-ligados. Esta forma modifi22

alga parda Fucus setatus. Una vez sabido que 1a unión de Ia zP3 a 7a cabeza de1 espermatozoide inducía Ia reacción acrosómica. pasamos a examinar el papel de Ia cadena polipeptídica de la zp3 )' sus oligosacáridos en ese proceso. Florman y yo comenzamos con 1a degradación enzimática de la zp3 en sus glucopéptidos, entre los rangos de pesos moleculares deunos 1500 a 70.000 dalton. e.in uitro, añadimos al esperma glucopéptidos de varios tamaños. Los glucopéptidos que eran mayores de unos 40.000 daiton inducían la reacción acrosómica: no así los menores r si bien en nueslros plinreros experimentos los glucopéptidos pequeños Iograron adherirse a espermatozoides de ratón). Además, 1os oligosacáridos O-ligados, obtenidos de una zPB ovular purificada, fracasaban también en la descarga de la reacción acrosómica. Estas y otras observaciones permiten suponer que, si bien sólo se necesitan

oligosacáridos O-ligados de la zp3 para la unión óvulo-esper:mática. se requieren porciones relativamente largas de Ia molécula polipeptídica para inducir la reacción acrosómica. No ha sido aclarado. todavía. si es

cadena polipeptídica misma la que interactúa directamente con los espermatozoides adheridos: pudiera ser, por contra, que sirviera de mero soporte esquelético que permiiiera. a un determinado número de oligosacáridos O-ligados, adecuadamente espaciados sobre la molécula zP3, in-

teractuar con el espermatozoide. Tras haber averiguado algo sobre la

unión de las moléculas de zP3 a ios espermatozoides y la producción de la

reacción acrosómica por parte de aquéllas, volvimos a la cuestión de 1a pérdida, por la zeS, de esas capacida-

des una vez fecundados los óvulos. ¿A

T¡urs

qué obedecía? No se conoce la razón de los cambios que tienen lugar en la zona

actúe, específicamente, sobre dichos oligosacáridos y los convierta en irreconocibles para los espermatozoides. En apoyo de esta idea, mis colegas y yo hemos encontrado que la eliminación o modificación de ciertos azúcares del extremo de los oligosacáridos O-ligados de 3900 dalton que

pe1úcida después de la fecundación, pero sí se sabe que son una consecuen-

cia de la llamada reacción cortical; ocurre ésta inmediatamente después de la fusión del óvulo con el espermatozorde y precede, también inmediatamente, a Ia reacción de zona. En la ratona. la reacción cortical comprende la fusión de la membrana plasmática de1 óvulo con la membrana que rodea a cada uno de los, aproximadamente, -1000 orgánulos ricos en enzimas. que se llaman gránulos corticales y se e\tienden bajo 1a membrana plasmátrca. La reacción provoca la expulsión de las enzimas granulares en el espa-

I {

cro

perivitelino, desde el cual

ll,

glucoproteínas componentes de la zona pelúcida? Ciertas pruebas, a parde estudios con gametos del criceto

tir

o hámster, permiten suponer que Ia molécula de mayor interés para nosotros. 1a zp3, es alterada, sin duda. por las enzimas gránulo-corticales. Ryuzo Yanagimachi y sus colaboradores, de la Universidad de Hawai en NIanoa, vieron que 1os espermatozoides de criceto no podían unirse a 1a zona pelúcida de óvulos expuestos a la acción de

las enzimas gránulo-corticales. Es muy verosímil que lo mismo ocurra en el ratón: que la ze3 quede inactivada como receptor espermático por una

enzima gránulo-cortical. Visto el pa-

primario de los oligosacáridos

O-

ligados delazp} en la adhesión con los espermatozoides, existe Ia posibilidad

de que una enzima gránulo-cortical

un cuando en estos últimos tiempos se hayan encontrado respues-

tas a muchas de las cuestiones relativas a las bases moleculares de la fecundación en los mamíferos, otras mantendrán ocupados a los biólogos en el futuro. Tendrán que ponerse a

fiitran

hacia la zona pelúcida. ¿.Acaso dichas enzimas alteran las

pe1

probablemente podrían -algo hacer las

enzimas gránulo-corticales- destruye su actividad receptora.

corticales, que al parecer catalizan la reacción de zona; pretendemos hacer lo propio con la proteína óvulo-adhe-

rente del espermatozoide, que reconoce los oligosacáridos O-ligados de

la ze3, así como determinar la

secuencia glucídica de los oligosacáridos O-ligados de 3900 dalton en la zp3, que son reconocidos por el espermatozoide; esperamos, por último, ampliar nuestros estudios a Ia fecundación humana, para analizarla con mucho mayor detalle molecular, lo mismo que he-

mos analizado la fecundación del ratón. Los estudios moleculares de la fecundación humana podrÍan conducirnos a nuevos métodos de contracepción por interferencia de los receptores de unión espermáticos con las proteínas

punto métodos con los que abordar las cuestiones pendientes de resolución. Así, el gen codificador de la zp3 ha sido clonado por Ross A. Kinloch y por Jurrien Dean y sus colaboradores. La disponibilidad de tales clones incre-

bién, conducirnos a nuevos tratamientos de ciertas formas de esterilidad causadas por anomalías moleculares del espermatozoide o del óvulo.

lares que reg:ulan la producción de los

tüiiE.iiri i.\ l-' { } t l Pl,.irl,{ E \ l A }t 1.4 M¡culxrsrvrs a¡o CoNtror- o¡ Alnrel F¡ntrrrzlrroN. Dirigido por John F.

óvulo-adherentes. Esto podría, tam-

menta la posibilidad de que las secuencias de ADN y los factores celu-

receptores espermáticos durante la ovogénesis puedan ser identificados prontamente. Se ha determinado ya la secuencia entera de aminoácidos de la cadena polipeptídica de la zp3, en mi

laboratorio y en el de Dean. Esta infor-

mación podría facilitar la identificación de las regiones específicas de la ze3 implicadas en la actividad espermático-receptora, en la inducción de la reacción acrosómica y en el ensamblaje de los filamentos de la zona pelúcida.

Con otros investigadores estamos intentando aislar las enzimas gránulo-

lJ i

Hartmann. Academic Press. 1983. O-LI.IKED Or-rcos,rccs¡nrors or Mous¡ Ecc ZP3 AccouNr ¡oB Irs Spsnl,r R¡cEproR Acrtvrrv. Harvey M. Florman y Paul M. Wassarman en Cell, vol.41, número [, págs. 3 l3-324; mayo de 1985. E¡zu-y Evr.rlrs tN M,rtrl,tnlteN FERTTT.TZArtoN. Paul M. Wassarman en A rutual Reyiey o.f CelL Biologr, vol. 3, págs. 1091.12:1987.

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zATtoN. Paul M. Wassa¡man en Science, vol. 23-5. n.. ¿1788, págs. 553-560; 30 de enero de 1987.

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Sp¿in'lntprcso en España

Una herencia distinta Robin Holliday

La metilación del ADIV poclrío cottstituir uno de los principales meccutistttos " epígenéticos".

Sufunción serío

Lct

transtttisiótt cle

lc¡s pcttt'otles de

ctctividad

génica de una generoción celulctr o otro clurcLnte los.fctses tle clesarrollo

'f-1 tr'{ I-il

I nacimiento de un individuo ple'- nurn"r'lte lormado. con tejidos r órgu.,os fu ncionalmente di sr intos, a partir de un espermatozoide ¡' un óvulo es un acontecimiento que no sólo despierta la admiración de 1os padres, sino que abre también uno de los mayores interrogantes de 1a biología. En parte, Ia solución de dicho enigma reside en 1os genes del nuevo embrión, heredados de 1os padres a través de'l ADN cromosomico presente en el óvulo y el espermatozoide. La activación o desactivación de los genes t de

manera permanente o transitoria) según una secuencia predeterminada modifica Ia mezcla proteínica de 1as células recién formadas y, como resultado de ello, la actividad de las mismas. Aunque las primeras células embrionarias tengan ya todo el poten-

cial que les va a permitir formar un organismo complejo, no están todavía especializadas. Es más tarde cuando

las células se determinan (quedan comprometidas a seguir cierto camino

en el desarrollo); posteriotmente, se diferencian y se convierten en 1as unidades especializadas de los organismos adultos. Las células diferenciadas sintetizan las denominadas

proteínas de lujo. las que confielen identidad a 1os distintos tejidos.

La exister-rcia de ul-l ploglama

nas divergen más tarde. Algunos pr:ocesos deben actual' soble el ADN pala ciiligir la ejecucrón de1 pi'ograma: seleccionar'los genes que deben acti\-a1'se o clesactir-ar'-qe en cada cé1u1a ¡' en cada monlento. Si no fuese asÍ. todas 1as células somáticas (no germinalesr del cuerpo, dotadas de los

m'ismos clomosomas. se desarrollarían de idéntica manera. Debe haber

algo que controle también la transmisión de 1os patrones de activacióndesactivación de una generación celula siguiente. Esta transmisión es

1ar a

decisiva para que las células hijas mantengan o continúen desarrollando el programa de especialización. Los procesos que controlan la ejecución del programa de desarrollo se denominan epigenéticos. Se sabe mu1poco acerca de las complejas regias epigenéticas que regulan la alteración y herencia de las actividades génicas en las células del embrión, o en 1as más especializadas célu1as somáticas

del organismo adulto. EIlo contrasta con el amplio conocimiento que poseemos de Ia genética clásica, esto

ROBIN HOLLIDAYtrabaja en eI laboratorio de biología molecular CSIRO con sede en Ia ciudad australiana de Sydney. Tras doctorarse, en 1959, por la Universidad de Cambridge fue contratado por el Instituto John Innes de Hertford, donde desarrolló Ia teoría de recombinación genética que lleva su nombre. En eI Instituto Nacional de Investigaciones Médicas de Londres, su destino siguiente y cuyajefatura de la división de genética alcanzó en 1970, trabajó sobre recombinación, reparación del ADN y envejecimiento celular. Desde el año 1988 se encuentra en CSIRO, concentrado en el estudio del fenómeno de la metilación del ADN.

desarrollo no explica pol sí sola por' qrre las celula. entht'ionat'ta! tempr'.r-

esJ

de la mera transmisión de genes de padres a hijos. No obstante, el joven campo de la epigenética empieza ahora a cosechar algunos progresos. La mayoría de los investigadores interesados en los estudios sobre e1 control de la actividacl génica durante el desarrollo convendrían en que tiene que basarse en interacciones específicas entre ADN y proteínas. (Después de todo, la unión de proteínas específicas a determinados segmentos de ADIttr de las regiones reguladoras de los genes parece controlar, de forma general, Ia expresión génica: 1a transcripción de un gen en ARN mensajero,

medrada por'1a enzima polimerasa de

-\R\. r'posteliol tladucción de1 mensa-jero er-i la colre-.pondiente proteína. flás allá cle esto. las discrepancias

sor-i

notables,

C'tesulr r1n Du'rt., d. ri:ta. que tur t'p' 'l- helencia pro-

LJ defi"nd'

teínica. las caracteri.ticas heredables de una cé1ula r-ienen detelminadas por"la forn.ración de unos complejos de

ADN r ploteinas asociadas. Los defensole-,1e eira h'prt.-i. creen que dichas proteínas rntelvienen en la opción de 1os gene-. que deben activarse e inactir-arse dulante ei desarro11o ¡'. además. clue tales complejos ADN-ploterna: :e I"irlll iPnen en sucesir.as generaciones celulares. esto es, que esas ploteínas especrficas perma-

necen íntimamente unidas a crertas regrones de ADN durante la leplica-

ción de los cromoson.ias ¡' 1a división celular. No se explica. sin en-rbargo, cómo se puede

lograluna

compene-

tración tan duradela. Otra posibilidad mu¡- distinta es que 1as propias secuencras genéticas se alterasen de una folrla específica ¡.- que tales aiteraciones persistieran en virtud del mecanismo normal que asegura 1a fidelidad de 1a replicación del ADN. Se sabe. por ejemplo, que ciertos segmentos de los genes que determinan anticuerpos se reorganizatl et1 el curso de la diferenciación, con Io que se asegura que diferentes células

de1

sistema inmunológico pro-

duzcan distintos anticuerpos. Las reor-

ganizaciones son, no obstante, irreversibles;

ha observado, por contra,

que 1os cambios epigenéticos en el ADN de ciertas células somáticas especializadas pueden revertirse o reprogramarse. Por tanto, es poco probable que las reorganizaciones de ADN constituyan un mecanismo fundamental en 1a dirección del desarrollo. Hace a1gún tiempo que propusimos T¡tur,qs 3

una tercera hipótesis, afín, aunque distinta, de la que propone la herencia proteínica. En nuestra opinión, la modificación química delADN podría constituir un importante proceso epigenético en los organismos superiores. En particular, la adición de un

grupo metilo (CHs) a las citosinas, una de las cuatro bases nitrogenadas que distinguen a los nucleótidos que conforman el ADN, intervendría en la dirección de los cambios genéticos que producen en las células durante su desarrollo. (Las restantes bases son se

guanina, adenina y timina.) La metilación de la citosina parece intervenir en cómo se produce la herencia de los patrones de actividad génica entre las células, como mínimo. Para nosotros, son los grupos metilo unidos al ADN, y no determinadas proteínas, los que

1. CELULAS ESPECIALIZADAS producidas al tratar un cul- las se diferencian en adipocitos, células que almacenan grativo de fibroblastos (células del tejido conectivo) de ratón con sas (abajo, teñidas d.e rojo). Estos hallazgos apoyan la idea seazacitidina, agente que elimina grupos metilo delAI)N. La des- grín la cual las alteraciones del estado de meiilación del ADN metilación va asociada a menudo con la activación de genes influyen en la vía de desarrollo que van a seguir las células.

silenciados. Normalmente, los frbroblastos no cambian su des- Las fotomicrografras fueron suministradas por Shirley M. Taytino, pero en este caso algunos de los fibroblastos se han trans- lor, Lesley A. Michalowsky y Peter A. Jonei, de la facultad de formado en células musculares (arriba), que se unen para medicina de la Universidad del Sur de California, con cuyo constituir largas fibras (band,o,s) que se contraen. Otras célu- permiso las putrlicamos aquí. CoNsrnuccló¡r

DE LrN SER

Vrvo

de que los sitios que suelen metilarse en el ADN eucariota son dobletes de citosina-guanina, esto es, una citosina seguida en la misma cadena por una guanina. Las bases de las cadenas

emparejadas son complementarias, no idénticasl como Ia citosina de una cadena empareja con guanina en Ia cadena complementaria, Ia presencia de un doblete de citosina-guanina en

ENZIMA +

S-ADENOSILMETIONINA

una cadena empareja siempre con una

unidad de guanina-citosina en la otra cadena. Esta configuración aporta un sustrato (la citosina) para 1a metilación casi exactamente en el mismo 5-METILCITOSINA

CITOSINA

CITOSINA, una de las cuatro bases del AI)N (izquierd'a), Se metila por una enzi' ma que sustituye el átomo de hidrógeno del carbono número cinco por un grupo metilo (CHr) de la S-adenosilmetionina, para formar 5'metilcitosina (d.erecha), La modificación de la citosina se produce después de la replicación del ADN.

se transmiten intactos de una generación celular a otra. Es su presencia o ausencia lo que sirve de señal para las proteínas reguladoras, que actúan sobre el ADN de las células hijas exactamente igual que lo hacían con el de

las células progenitoras.

¡{ ntes de contar con prueba alguna la. a favor o en contra, fueron varios

los mecanismos propuestos para explicar eI papel de la metilación en el

control del desarrollo. Presentaremos luego las pruebas que se han obtenido recientemente y que hablan en favor de la hipótesis; empecemos, sin embargo, por relatar la historia que nos

permitirá entender mejor los razonamientos que apoyaban dichas propuestas.

El interés por la metilación de las citosinas del ADN, entendida como mecanismo epigenético de los eucariotas, surgió mientras se investigaban las interacciones entre enzimas y ADN en bacterias, organismos que carecen de or ganización corporal compleja. A principios de Ios años setenta ya se había observado que las enzimas de restricción, o restrictasas, recono-

cían de forma específrca secuencias breves de bases del ADN y

cortaban

por esos sitios. Estas enzimas estaban capacitadas para distinguir entre las secuencias con algún tipo de modificación y las no modifi.cadas, pues sólo cortaban estas últimas. Una de las modificaciones más comunes que parecían influir en la actividad restrictasa era la metilación de la adenina y del que suele denominarse carbono 5 de la citosina, con la formación de la 5-metilcitosina. Las reacciones

de metilación ocurrían inmediatamente después de la replicación del 26

ADN, por enzimas que tenían la misma especificidad de secuencia que

las correspondientes restrictasas. El descubrimiento de que la 5-metilcitosina podía afectar seriamente la interacción entre proteínas y ADN, junto con el hecho conocido de que constituye un componente habitual del ADN de vertebrados, plantas y muchos otros organismos superiores. nos sugirió a mi alumno John E. Pugh y a mí que la presencia de 5-metilcitosina podría condicionar 1a actividad génica de los eucariotas. conclusión a la que también llegó independientemente Arthur D. Riggs. 1o que le permitiría actuar como una señal que facilitase la activación o Ia inhibición de los genes. Como luego se verá con más detalle, contamos ¡,'a con abundantes pruebas que demuestran que la metilación de 1as regiones reguladoras de 1os genes ro regiones cerca-

sitio de ambas cadenas.

I venturamos que una enzima. la la, metilasa de manlenimiento, actuaría só1o en 1os fragmentos de ADN "hemimetilados". entendiendo por tales aquelios en que una sola de las dos cadenas tur.iese metilado el doblete de citosina-guanina. AI dupli-

carse el ADN completamente metiIado, se originaría ADN hemimetiIado, de cuya metilación inmediata se

ocuparía Ia enzima de mantenimiento. Por el contrario. 1a descendencia del ADN sin metilar estaría también sin metilar ¡. así permaneceria, va que la metilasa de manteni-

miento no podría actuar sobre é1. En consecuenciB, SF cons€r'r'aria una seña1 de metilación prelia durante la división celular; ocurriría 1o propio con la ausencia de metilación y no habría regiones permanentemente hemimetiladas. Con estas reglas, se recompondría en las células hijas el patrón de metilación n'no metilación) del ADN de una célula plogenitora y, por tanto, su dotación de actividades génico-específicas.

Este guión esquemático del mante-

nas) suele hallarse, en efecto, asociada con la inactivación génica, por

nimiento de los patrones de metilación del ADN a través de muchas ge-

la probable razón de que 1a formación de la 5-metilcitosina bloquea Ia unión de Ios activadores transcripcionales o

neraciones de células no explica cómo se activan o desactivan los genes durante el desarrollo: es decir, no explica cómo se cambia el patrón de uniones proteínicas para que ciertas células adquieran una especial tzacíón mayor

estimula la unión de inhibidores. Tanto nosotros como Riggs propusimos además que la señal de metilación podían retenerla los cromosomas

eucariotas durante la replicación,

antes de Ia división mitótica de las células. Todas las células somáticas son diploides; poseen un juego de cromosomas materno y otro paterno. Antes de que la célula se divida, los cromosomas se dupiican: las dos cadenas de ADN de cada cromosoma se separan y se sintetizan nuevas cadenas complementarias. Así cada célula hija recibe un juego cromosómico completo. EI mecanismo que postulábamos se basaba, en parte, en el conocimiento

que sus progenitoras. No existe un

modelo que justifique por sí solo todos los cambios de estado de actividad génica. Lo que no ha sido óbice para que Pugh y yo sugiriésemos aigunas r,ías por 1as que la metilación o des-

metilación

de los cromosomas

podrían

participar en ese tipo de cambios. Nuestra primera premisa establecía que sólo una minoría de 1os dobletes de citosina-guanina del ADN participarían en Ios mecanismos de cambios de actividad génica; el ADN contiene demasiados dobletes metilaTEr'res 3

dos como para que todos cumplan una misión reguladora. Suponíamos también que los dobletes importantes para dichos procesos deberían alojarse en secuencias de bases más largas,

reconocibles porproteínas reguladoras específicas para determinados genes; por sí solos, los ubicuos dobletes no conferirían esa especifi cidad. Sentadas estas bases, parecía razonable sugerir que los cambios de actividad génica se producirían cuando una enzima distinta de Ia metilasa de

mantenimiento reconociese una secuencia específica de bases en una de las cadenas de

ADN

de un cromoso-

ma y colocase un g:rupo metilo en un

doblete de citosina-guanina de esa secuencia. Esta acción obligaría a la enzima de mantenimiento a metilar, inmediatamente, la cadena complementaria. De estamanera, las futuras generaciones del mismo cromosoma estarían metiladas en el mismo sitio, a pesar de que los grupos metilo no estuvieran unidos al gen en un principio.

pn t)l

otros casos, una enzima específica de secuencia podría eliminar un grupo metilo de un sitio concreto, antes de que aconteciese la diüsión celular. En ausencia de la señal de metilación, la enzirlaa de mantenimiento no metilaría el sitio opuesto de la cadena complementaria recién sintetízada, con lo que el gen originalmente metilado dejaría de estarlo. Un caso distinto sería el de una proteína específica de secuencia que bloquease

lación, aunque no se trate necesaria-

cultades en metilar la región diana y que, tan pronto como la región se

mente de'los mismos mecanismos que operan en las células madre. Mi grupo y el de Riggs han abordado la participación de la metilación del ADN en los cambios que, en una fase precoz del desarrollo, determinan la inactivación de uno de los dos cromosomas X en todas 1as células somáticas de las hembras. (El proceso es aleatorio: en algunas células se inactiva el cromosoma X materno: en otras, el paterno.) Hay una región de cambio específica, que recibe el nombre de centro de inactivación, en cada cromosoma X. Esta región interviene en ia determinación de 1a activación o inactivación del cromosoma. En el marco de nuestra hipótesis, esta región podría reconocerla una enzima específica que metila las dos cadenas del centro de inactivación en ei cromosoma X que va a permanecer activo. pero no modi-

metile, la propia metilación desencadene una rápida reacción que imposibilite la modificación del otro cromosoma. De ese modo, uno de los cromosomas quedará metilado en el centro de inactivación y el otro no. Este patrón se mantendría fielmente

en futuras divisiones celulares

mediante las reglas de la herencia descritas antes.

T Tna explicación más detallada de LJ ta inactivación de un cromosoma X requiere también un mecanismo

que dé cuenta de la progresiva inactivación de todo un cromosoma en una etapa temprana del desarrollo. Ello puede llevarse a cabo si la región de cambio no metilada del cromosoma destinado a quedarse inactivo permitiese la unión de una segunda metilasa que, desde ese sitio, recorriese todo el ADN metilando secuencias de

fica el cromosoma homólogo. Esta modifrcación diferencial podría ocurrir si se cumplen simuitáneamente

bases específicas.

Aunquehemos hablado de los meca-

dos condiciones: que la enzima posea

nismos de cambio y heredabilidad

una actir.idad baja o encuentre difi-

como si no estuviesen controlados más

BEGION REGULADORA

REGION ESTRUCTURAL DE LA PROTEINA

la metilación de mantenimiento,

PROTEINA

ACTIVADOFA

uniéndose al punto del segmento de ADN recién replicado donde la metilasa de mantenimiento colocaría normalmente un grupo metilo. A1 replicarse ahora el ADN hemimetilado, la cadena que careciese de grupo metilo originaría otra cadena sin metilar, quedando así eliminada la señal de metilación del cromosoma afectado. Este singularmecanismo de cambio podría muy bien estar implicado en la segregación de actividades génicas, proceso por el que una célula se divide originando una célula hija igual a ella y otra que se ve forzada a seguir cierta ruta diferente luéase la figura 51. La

POLIN/ERASA DE AFN

Y ESPECIFICA DE SECUENCIA

PROTEINA

BLOQUEADA

5-I\,4ETILCITOSINA

segregación se puede producir en células progenitoras (o madre, "stem cells")

ya determinadas de organismos en desarrollo o de adultos; sirvan de

ejemplo las células de la médu1a ósea que producen diversos tipos de glóbulos rojos y leucocitos. Estos fenómenos de segregación ocurren también en etapas bastante tempranas del desarrollo y, en nuestra opinión, podrían obedecer también a cambios de metiCoNsrnucclóN oB uN Sen Vlvo

CH¡

COMENZA LA TRA.NSCRIPCION de un gen (o) cuando una proteína (o proteínas) reconoce una seeuencia específica de bases de la región reguladora de dicho gen y se une,al ADN. Esta unión es la señal para que una enzima, la polimerasa de ARN, transcriba la región de ADN que determina la proteína en urra molécula de ARN mensajero. (Posteriormenüe, el ARN mensajero se traduce en la proteína correspondiente.) La metilación del ADN (ó), indicada en rojo, puede inactivar un gen, si impide la unión de la proteína activadora esencial. En opción alternativa, la metilación puede facilitar la unión de una proteína inhibidora. 3.

que por factores internos de cada célula, se sabe que hay agrupaciones celulares de un embrión que sufren cambios coordinados en respuesta a señales extracelulares (inductores y morfógenos) emitidas por otras célu-

de bases de las regiones promotoras,

donde se inicia la transcripción, poseen a menudo un efecto modulador, 1o que parece volver a indicar que Ia señal de metilación es el regulador más específico de la función génica.

las. Las señales se reciben en la mem-

brana celular y se transmiten al núcleo, donde dejan sentir su influencia sobre la transcripción de genes específicos. La metilación podría mediar

TTlales estudios no establecen por si I mismos una relación de causa a efecto entre metilación y actividad génica, pero otros experimentos son

en'este proceso; esto es: la señal recibida en la membrana celular podría alterar el estado de metilación de las

más concluyentes. Por ejemplo, cuando

secuencias reguladoras de genes particulares en un grupo de células diana. IJna vez realizado el cambio de meti-

recombinante, y se introducen en cultivos de células de mamíferos. sólo se expresan 1os genes sin metiiar. [Estos experimentos de transferencia ("trans-

lación, se heredaría por las siguientes generaciones celulares. Como ya se señaló más arriba, la metilación del ADN podría no ser la única forma de inducir en él cambios heredables. Con todo, a medida que

pasa el tiempo, nuestra idea fundamental, es decir, que la metilación es

un componente de la regulación génica, va ganando apoyo experimen-

tal. Son muchos los estudios que han correlacionado la activación génica con Ia ausencia de metilación del ADN en sitios específicos, normalmente en la región reguladora del gen o en su vecindad. Resulta sorprendente que

dicha correlación no constituya un efecto débil o relativo, sino una asoeiación del tipo todo o nada: la presencia de los grupos metilo no parece estar asociada con un simple descenso de la expresióngénica, sino, casi siempre, con la total inactivación. Por contra, las alteraciones en la secuencia

se preparan genes metilados y sin metilar mediante la técnica del ADN

fection") aportan también pruebas sobre Ia heredabilidad de los patrones de metilación del ADN, ya que el ADN foráneo retiene su estado de metilación muchas generaciones después de su introducción en 1as células cultivadas.l Diversos trabajos de transferencia han demostrado posteriormente que, cuando se introduce un gen metilado en una célula que suele expresar dicho

gen, e1 gen insertado se desmetila y activa de inmediato. Esto se observa para e1 gen de la actina de los mioblastos, precursores de células musculares; la actina es necesaria para la contracción muscular. Resulta cierto también en el caso del gen de Ia insulina en células de origen pancreático y en un gen de anticuerpo en los linfocitos, céluias del sistema inmunoló-

versiones metiladas de los genes en células sin especializar, permanecen metiladas e inactivas. Estudios similares han demostrado que Ia expresión, inducida por hormona, del gen de Ia vitelogenina (un componente de la yema del huevo en anfibios y aves) está asociada con la desmetilación específica de la región reguladora del gen y que el gen de la cristalina (una proteína del cristalino) se desmetila en las células del cristalino antes de su activación. En todos esos ejemplos, la desmetilación parece darse fuera de los períodos de replicación de ADN, Io que indica de manera tajante que el proceso no es un mero subproducto de la replicación, sino que está gobernado directamente por proteínas que sólo funcionan en tipos celulares específicos. La presencia de dicho proceso

activo, específico de tejido, sugiere que la desmetilación no es una reacción casual. sino que encierra un propósito definido: Ia activación génica selectiva. Se han obtenido nuevas pruebas de Ia influencia de la metilación sobre Ia actividad génica con un enfoque expe-

rimentai totalmente diferente: 1a eliminación química de grupos metilo ALA CELULA H]JA

gico. Ahora bien. si se introducen 1as

DOBLETE DE CG

1A I\,lETILASA DE IN¡ IENTO

I\4ANTEN

5-METILCITOSINA

4. TRANSMISION del patrón de meüilación deAI)N de una célula a su hija. Del proceso se ocupa una enzima, la metilasa de mantenimiento (círculos).El resultado puede ser la transmisión de un patrón idéntico de unión de proteínas y, por tanto, de actiüdad e inactiüdad génica. Cuando las cadenas de ADN se separan para la replicación, cada una de ellas retiene sus grupos metilo originales; la metilasa rápidamente coloca nuevos grupos metilo en el sitio opuesto de la cadena recién sintetizada (naranja). La enzima actúa sobre dobletes de las bases citosina (C) y guanina (G). Las otras bases son adenina (A) y tirnina (?).

\ LA CELULA HIJA

Tsues

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]\.-l\{\*{L€\*4V ¡

t-: /

/\ ú

REpLrcACtoN

¡.tt.

REPLICACION

METILASA DE MANTENIMIENTO ANADE CH^

ENZI[/A ESPECIFICA

CROMOSOMA IDENTICO

DE SECUENCIA IVETILA SITIO

ri, I

CROI,IOSOMA ALTERADO

CROMOSOMA IDENTICO

5. CAMBIO GENETICO que perrnite a una célula precursora dar origen a dos células hijas, una igual a ella y otra con un patrón disti¡rto de actividad génica. El cambio puede realizarse de varias maneras, Por ejemplo, ula enzima puede eliminar un grupo metilo de una secuencia específica de bases de un gen recién

delADN. Las células seexponenauna droga,la azacitidina, que se incorpora al ADN e inhibe la actividad de la metilasa de mantenimiento. En virtud de lo cual muchos puntos originalmente metilados quedan desmetilados a los pocos ciclos de replicación celular. En muchos sistemas experimentales se ha demostrado que el fármaco reactiva la expresión de genes que se hallaban antes silenciados, lo que indica claramente que la pérdida

del grupo metilo es su causa. Así se metilan genomas retrovíricos inactivo§ que se han incorporado en cro.celulares

mosomas pero pierden sus g:rupos metilo y simultáneamente se reactivan en cuanto los exponemos a

azacitidina.

f)or citar otro ejemplo, muchas líneas I celulares de mamÍferos se mues-

tran incapaces de sintetizar una enzima activa porque presentan una mutación clásica, esto es, una alteración en la secuencia de ADN del gen. Otras líneas celulares que son deficientes en esa enzima tienen intactos los genes para dicha enzirrr,a, pero se encuentran silenciados, por la presumible causa de su metilación. Cuando las células se tratan con azacitidina, se reactivan del 10 al 30 por ciento de los genes inicialmente silenciados, un efecto que viene a suponer multipliCoNstnuccróN

DE uN SER

Vrvo

l'/IETILASA DE N/ANTENIIVIENTO ANADE CH^

replicado; ello determinará que el gen se herede en su forrna no metilada (o). La unión específica de una proteína puede impedir también la metilación de la nueva cadena (no se muestra). Cabe asimismo que una enzima específica añada un grupo metilo a un gen sin metilar (á), que ahora se heredaría de esta forrna.

car por un millón la tasa de reversión espontánea. Estos experimentos demuestran que puede existir un estl'echo control epigenético de

acti-

vidad génica y que dicho control

heredable.

Aunque el proceso de inactivación )'reactivación de genes en céiulas cultivadas de mamíferos ha suministrado pruebas valiosas sobre la existencia de una reiación entre metilación del ADN ¡ expresión génica, no demuestra por sí solo que las alteraciones de los patrones de metilación desempeñen un papel fundamental en los cambios de actividad génica durante el desarrollo. Pero contamos con pruebas sugestivas de que los cromosomas X activos e inactivos de ias células de 1as hembras (que, como señalamos, se diferencian durante el desarrollo) poseen patrones de metilación distintos, tal como postulaba e1 modelo pro-

puesto por nosotros. En concreto, se ha encontrado que ciertas secuencias de ADN de las regiones reguladoras de los genes "cotidianos", o próximas a ellas, se hallan metiladas en el cromosoma X inactivo y sin metilar en su homóiogo activo. Los genes cotidianos, res-

ponsables del mantenimiento "diario" de las células. suelen darse activos en todas éstas. Los genes del cromosoma X inactivo pueden también ser reacti-

vados por la azacitidina.

Más directo aún es el trabajo de Peter A. Jones y Shirley M. Taylor,

de la facultad de medicina de la

Universidad de California en Los Angeles. Observaron la transformación de fibroblastos no totalmente diferenciados, que pueden considerarse células del tejido conectivo, en otros tipos celulares diferenciados, tras el tratamiento con azacitidina. Algunas células se convierten en mioblastos (precursores de las células musculares) y luego en células musculares adultas, que se contraen en las placas de cultivo. Otras células de la población de fibroblastos se diferencian en adipocitos, céIulas que almacenan grasas. Se ha demostrado que la diferenciación de las células musculares iba asociada con la pérdida de metilación en un determinado gen regulador, Io que indicaría que el estado de metilación de los genes influye en las vías de desarrollo de las células. Si las células somáticas se determinan, diferencian y son capaces de originar sólo ciertos tipos celulares durante el desarrollo, ¿qué es lo que permite a las células germinales permanecer totipotentes, de tal manera que, cuando un espermatozoide fecunda un óvulo, el embrión resultante pueda originar cualquier tipo celular en eI nuevo individuo? Las células germinales no parecen 29

tlI

}-lPilák"""o* MEMBRANA CELULAR

NUEVA SENAL PRODUCIDA

O RECIBIDA

't,

RECEPTOR

RECEiPTOR PRODIUCIDO

SEÑAL INTERNA

DIVISION CELULAR

CH¡

CH,

6. CIERTAS SEÑALES EXTERNAS provocan cambios heredables en las actividades de grupos completos de células durante el desarrollo, modificando quizás el patrón de metila' ción del ácido desoxirribonucleico. En la transmisión de la

complejo señal-receptor puede provocar un cambio en el estado de metilación del ácido desoxirribonucleico celular, co' mo la eliminación de los grupos metilo de un gen' y producir así un nuevo receptor o un factor difusible que puede influir

superficie celular (roio) (o bien una se une a un receptor proteína que se une a la superficie de otro tipo de célula). El

tes (derecha).

seial (izquierd.¿) media una proteína difusible (uerde), qte de la

seguir el curso unidireccional de las células somáticas. Cualquier cambio epigenético que ocurra en las células germinales, como la inactivación de un cromosoma X, reüerte o se altera durante o inmediatamente antes de Ia meiosis, proceso de división celular que origina óvulos y espermatozoides.

sobre otras células. El cambio resultaría hereditario y se mantendría, por consiguiente, en las generaciones posterio-

nes, 1os cromosomas que proceden de

espermatozoides ¡' de óvulos están metilados de forma distinta. Con independencia dei modo en que se controle el desarrollo embrionario de Ios organismos superiores, e1 resultado final es un organismo completo,

cuyo cuerpo permanece estable

Además, los cromosomas de óvulos y espermatozoides reciben una impronta distinta, esto es, una marca diferencial, según procedan de Ia madre o del padre. Así, aunque los cromosomas de un espermatozoide procedan, por ejemplo, de la madre del padre, seguirán llevando la impronta masculina. Se ha comprobado que esta marca diferencial es crucial para el desarrollo normal de los ratones (y, por extrapolación, de otros mamíferos), de 1o que se infiere que su función es silenciar y activar series distintas de genes en los cromosomas maternos y paternos, y que tales diferencias se complementan entre sí

vueh,en torpes. Una causa que probablemente contribuya a ello es la graduaJ disluncion de los mecanismos de mantenimiento celular: los encargados de reparar el ADN, de reemplazar las células que se pierden y de regular 1a transcripción de los genes. Si 1a heredabilidad de los patrones de metilación importa para el funcionamiento a largo plazo de los tejidos, entonces Ia pérdida gradual de grupos metilo contribuiría al envejecimiento. Se pueden producir fallos ocasionales

para dirigir el desarrollo normal.

de los gr:upos

tanto, si se quiere que el desa-

f)or I rrollo

se inicie

y lleve a

cabo

correctamente, al ADN normal de óvulos y espermatozoides debe superponerse un "código epigenético". Trabajos recientes indican, lo que quizá no debiera sorprender, que estarepro-

gramación del genoma durante la meiosis podría conllevar cambios en los patrones de metilación: en los rato3t)

durante bastante tiempo. Con todo, el cuerpo acaba envejeciendo; 1os tejidos se

un gen del cromosoma X inactivo

bastante baja, pero cobra una celeridad progresiva con la edad del animal. Por otro lado. un gen necesario para la formación de pigmentos se silencia cuando se inserta en un cromosoma X inactivo; el resultado es un animal albino. EI gen se activa progresivamente a medida que e1 receptor envejece, con e1 consigr.riente incremento de la pigmentación de1 peiaje.

-l)ruebas experimentales con celu-

las humanas apo]'an este cuadro de la pérdida de metilación. Leonard Hayflick descubrió que la vida media

metilo tras la reparación

de las células humanas en cultivo dependía del número de veces que se dividían y no de1 tiempo cronológico' Se observó que el número de sitios metilados del ADN de dichas células disminuía al aumentar el número de divisiones celulares y terminaban por perder su capacidad de proliferar. La posibilidad de que esta incapacidad multiplicativa, acompasada con 1a

del ADN de céIulas que no se estén dividiendo. La pérdida de metilación podría provocar así un estado de acti-

edad, sea, al menos en parte, una consecuencia de la pérdida de metilación nos la sugieren 1os experimentos aco-

en la metilación de mantenimiento durante la mitosis o en el reemplazo

vación no deseable en genes silenciados y, por consiguiente, un desarreglo de la función celular y la muerte de las células.

Este planteamiento ayudaría

explicar dos descubrimientos recientes hechos sobre ratones. En losjóvenes, la frecuencia de reactivación de

metidos con cé1ulas cultivadas y tratadas con azacitidina. Un único tratamiento de células jóvenes, suficiente

para reducir significativamente el nivel global de metilación del ADN, apenas incide, a} principio, en ei funcionamiento o tasa de crecimiento de las céiulas. Pero diríase que las células Tppr¡.s 3

"recuerdan" la exposición al fármaco, pues se extinguen bastante antes que los controles no tratados. Los trabajos sobre el envejecimiento, aunque no aportan pruebas inconcusas, revelan la fragilidad de los controles epigenéticos sobre la expresión génica: no son absolutos y pueden deteriorarse. Cabe pensar, en ese orden,

otros carcinógenos conocidos. Ahora bien, la azacitidina no suele producir mutaciones genéticas. Y dado que el compuesto químico afecta a la metilación delADN, parece razonable sospechar que las alteraciones que produce en los patrones de metilación contribuyan al desarrollo del cáncer.

Tomados, pues, en su conjunto, los datos aducidos convierten la metilación del ADN en un importante factor epigenético del desarrollo de los organismos superiores. Datos que sugieren, asimismo, que los fallos produci-

dos en los procesos normales de

metilación intervienen en el envejeci-

que las epimutaciones (aberraciones en la actividad génica) podrían cau-

sar la "desdiferenciación" celular y contribuir así a la carcinogénesis. Entre las razones que se aducen

OVULO

ESPEFIMATOZO¡DE

CROMOSOMAS

para sugerir la presunta intervención de las epimutaciones en los procesos cancerosos está la comprobación de que, de células no metastásicas, se originan células metastásicas con mayor frecuencia de lo que cabría esperar si

IMPRONTA MATERNA

IMPRONTA PATERNA

dicho cambio no se desencadenara más que por mutaciones genéticas

CELULAS DEL NUEVO

INDIVIDUO

normales. Por otro lado, las tasas de mutación parecen ser similares en el ratón y en el hombre; sin embargo, las

células humanas se muestran más remisas a transformarse en cancerosas, ya sea espontáneamente o tras la exposición a mutágenos. Según este

descubrimiento, las diferencias en las

tasas de transformación podrían deberse a la existencia de controles epigenéticos más potentes en los

CELULAS SOMATICAS

CELULAS GERMINALES EN EL MACHO

EN LA HEMBRA

humanos.

fJasta ahora, no se ha demostrado II la implicación directa de los cambios de metilación del ADN en la

diü $

carcinogénesis. Hay, sin embargo, pruebas indirectas. Así, la azacitidina es un carcinógeno muy vigoroso, que produce un abanico mayor de tumo-

res en animales experimentales que

.iv 7. LA IMPRONTA característica que identifica el origen paterno (azul) o nLaterno (rojo) de los cromosomas de un

inüviduo (o) puede persistir en las

cé-

lulas somáticas duranúe muchas generaciones celulares (á). La impronta, que

parece determinar un patrón diferencial de activación e inactivación en los cromosomas de origen paterno o materno, se altera, sin embargo, en las células germinales durante la meiosis. (Las células germinales se segregan en una etapa temprana del desarrollo y después,

tras la meiosis, producen óvulos y

: ,t,

ELilVilNACtON DE LA IMPRONTA

I : t

N/EIOSIS

I I

d NUEVA II,4PRONTA

t__-*

l\,1,\,

/\ ,'

es-

permatozoides.) Se elilnina la impronta original (c) y se sustituye por la que co-

mesponde al sexo del individuo en cues-

tión (d). Así, a los cromosomas del

ic i

/--**.----i

l',x

es-

perma se les confiere una impronta masculina (incluso a los cromosomas

que provengan de la madre), y a los del

óvulo una impronta femenina. Los experimentos sugieren que la metilación reversible es el mecanismo que insta la marca diferencial de los cromosomas. CoNsrnucctóN o¡ uN S¡n Vrvo

miento celular y en la transformación de las células normales en cancerosas' El interés potencial de la metilación de las citosinas en los procesos celulares viene subrayado por su presencia en organismos muy disPares, aunque quizá no se trate de un fenómeno universal. Ni en el nematodo Caenorhabditis, ni en la mosca de la frutaDrosophila, que pasan por complejos procesos de desarrollo, se ha encontrado 5-metilcitosina en su ADN. Observación en que se apoyan

algunos investigadores para negar

que

gación nos dirán si los controles epigenéticos sobre el desarrollo de diferentes especies se fundan en los mismos mecanismos moleculares o en otros diferentes.

¡('tualesquiera que sean los factores

\-z

decisivos que gobiernen el desarrollo de Caenorhabditis y Drosophila, no se puede negar que la metilación del ADN se nos ofrece como un factor epigenético importante en muchos eucariotas, aunque no explique todos los procesos del desarrollo. Los con-

la metilación de la citosina troles

desempeñe un papel importante en la ejecución del programa de desarrollo de los eucariotas superiores. Este último punto de vista es cohe-

rente. Pero caben otras explicaciones. Qrizá C aenorhab ditis y Dro sophila sí dependan de la 5-metilcitosina para regular Ia expresión de sus genes, aunque la cuantía de la misma en su ADN no sea detectable con las técnicas actuales. El tiempo y la investi-

sobre eI comportamiento

características celulares ejercen sus efectos en varios niveles: interacciones

entre ADN y proteínas, transducción de señales desde Ia membrana celuIar hasta los cromosomas Y comunicación intercelular. Necesitamos una teoría amplia 1'unificadora del desarroilo, si queremos que 1a epigenética dé cuenta de1 comportamiento de los

genes durante estos procesos con 1a claridad con que la genética mende-

liana describe la transmisión de los genes de generación en generación. Se precisa un marco de ese tipo donde se puedan formular predicciones contrastables y donde se pueda desarrollar ese continuo juego de teorías y experimentos que es esencial para eI avance de la ciencia.

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Impronta patern a e impronta materna Esteban Santiago

-t+{ I

os gametos, las células que aportan padre ¡ nladre para la gen"to.ión del cigoto. son siet-npre haploides: quiet'e esto .á,.-,,.-,i decir que estas célu1as sólo son portadoras de una n-ritad de la dotación genética característica de 1as cé1ulas somáticas. que son diploides. Con 1a t'ecundación se completa mediante la apor-

tación de ambos progenitores e1 patrimonio hereditario propio de un individuo de esa especie. La dotación genétrca de los seres humanos está contenida en ,16 cromosomas. '1'1 de ellos denominados autosomas. formando 22 pares con infornración equivalente en cada miembro del par: y el par 23. que corresponde a los cromosomas sexuales. dos cromosomas X determinantes de la versión femenina, o un X y un Y. si de la versión masculina se trata' Los 22 autosomas procedentes del padre, 1'los 22 procedentes de la madre no intervienen en la determinación sexual. Sin embargo, dentro de cada nuevo par que se constituye en el cigoto. e1 cromosoma que viene del padre mantiene sus dif-erencias en relación con el que procede de 1a madre, y esas diferencias determinan también que cada uno contribuya, con sus peculiaridades, a1 desarro11o del embrión. La naturaleza de esa impronta se ha ido conociendo con cierto cletalle en estos últimos años. Sobre el mensaje genético escrito bases púricas adenina ( A) y guaen clave de cuatro letras -las nina (G) y las pirimidínicas citosina (C) y timina (T)- cada cromosoma tiene la posibilidad de modificar algunas de las citosinas mediante un pequeño cambio químico, la introducción de un grupo metilo en su molécula. El patrón de metilación, el número y la 32

posición que ocupan esas cttosinas metiladas (C" ). es característico de cada cromosoma y diferente para cada uno de ellos. según proceda del padre o de la madre. Esas C* introducen carnbios en el flujo de instrucciones al cerrar. generalmente. marcos de lectura del mensaje, impidiendo la expresión de -cenes situados en el cromosoma después de esas zonas marcadas. E1 patrón de metilación de los distintos cromosomas contribuYe a qr're cada cé1ula del organismo adquiera la identidad biológica corno célula de hígado, de ¡iñón, o de pulmón. La distribución estratégica de estls citosinas etiquetadas condicionará que se expliciten o no instrucciones específicas para la síntesis de los componentes propios de cada tipo celular. E1 fenómeno de la impronta parental tiene un claro significado biológico. Define 1a identidad biológica de1 cigoto ori-sinado por 1a f-usión de los dos gametos. como ernbrión unicelular. diferente de cualquier célula híbrida originada por fusión de los ¡úcleos de otras clos células cualesquiera: y netamente diferente tarnbién de 1a cé1ula producida por fusión entre sí de dos ór'ulos. o de dos espermatozoides. Más aún. un cigoto, resultado de una t-ecundación. que contuviera después de manipularlo experimentalmente los dos cromosomas de un par procedentes de un mismo ór'ulo o de un mismo espermatozoide, sería incapaz de desarrollar.e r originar un individuo de esa especie. La impronta masculina y 1a impronta femenina de la dotación genética que consigo llevan 1os 22 autosomas de los gametos, óvulo y espermatozoide. ¡eaflrman la vinculación heterosexual originaria. Existe en los mamíferos una

Tsl,l¡s

barrera biológica infranqueable. que echa por tierra la posibilidad de que nazca un hijo de un padre sin una madre, o de una madre sin un padre. Su naturaleza está dispuesta de tal modo que "uno" o "una" tiene que venir necesariamente de "uno y una". La madre biológica podría no ser 1a maclre uterina (esto sería un ripo particula¡ de adopción). como los padres adoptivos no son el padre o

/*%,.

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la madre biológicos. La identidad natural biológica no admite

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ovuLoMADURo

opciones. Cada ser humano es Llno o es una biológicamente por la presencia del par de cromosomas XY o XX con la añadidura de la impronta paterna y materna reflejada en los 22 autosomas que aportará con su gameto a sus descendientes. De una lbrma natural, inamovible y no elegible, se es uno o Lrna biológicamente, más al1á de cLralquier tendencia u opción personal de orientación sexual. Só1o cuando la biología falla, v se produce alguna de las enfermedades ocasionadas por defectos en el par de cromosomas 23, que hacen que 1a diferenciación sexual iniciada en el embrión no llegue a término, o que muy excepcionalmente e1 ser humano resulte hermafiodita, con gónadas masculinas y 1-emeninas, puede ser necesaria la dura decisión de optar por vivir como uno. o como una.

ovoGENEStS

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GONADAS I NoTtrEBENCTADAS I /)zz '.---_,--,/:-'-- = -.-@-..'..-.---\ ,/ DE

DESAPARICION DE LA METILACION

propia impronta

Las rnarcas parentales que el cigoto tiene en sus cromosomas representan la suma de la peculiar irr-rpronta cromosómica masculina y f'emenina. Las marcas aportadas por la herenci3 paterna son más abundantes, es decir. el número de citosinas metiladas en los cromosomas del espermatozoide es mayor que el de la aportación genética materna. Y, a su vez. ese grado de metilación es más alto que en cualquier otra célula somática del organismo. Este hecho tiene su significado biológico: los gametos son las células de 1a transmisión de la r,ida. No existen para que viva el individuo que los produce, sino para perpetuar la especie. Las instrucciones de explicitación inmediata que 1os gametos contienen en sus genes mientras no se produce la fecundación se dirigen fundamentalmente a asegurar la conservación del único cromosoma de cada par que contienen. para que éste pueda pasar la dotación -eenética a un nuevo ser. Cada -sameto usa las inst¡ucciones adecuadas durante su propia formación ¡r maduración. El espermatozoide se hace cé1ula pequeña. con capacidad de movimiento muy rápido: a medida que madura deja de usar la intbrmación de sus genes. empaqueta los cromosomas y metila las citosinas según eI patrón masculino, quedando así dispuestos a ser mitad de1 patrimonio de un individuo nuevo si alcanzara a t'ecundar a un óvulo. De forma paralela las células que se diferencian hasta convertirse en óvulo usan la infbrmación genética para llegar a ser una célula de gran tamaño, protegerse con una cubierta, la zona pe1úcida, que orienta la penetración de1 espermatozoide. y almacenar alimentos de tbrma que, si llega a ser fecundado. el cigoto no necesite "buscarse la vida" hasta pasados unos días. A medida que avanza su nladuración irá metilando las citosinas según el patrón femenino. cerrando la información genética y n-ranteniéndose paralizada la expresión de los genes. Una de las tareas que tiene por delante ei embrión en su desarrollo es la de ir eliminando 1a impronta cromosómica heredada. Al comienzo, se van eliminando metilos de 1as citosinas de los crolllosornas paternos a mayor velocidad que de las citosinas de los maternos. Las células que se organizarán en tejidos extraembrionarios, como 1a placenta, recibirán las instrucciones desde la copia paterna. Las células que \¡an a dar los esbozos de los dif'erentes órganos y tejidos del organismo usarán con una determinada preferencia los genes relacionados con una u otra herencia. A1 tiempo que progresivamente se borra la impronta parental. se moldea e1 cuadro de instrucciones contenidas en los genes por el mismo mecanismo de metilación y desntetilación de citosinas: surgirán instrucciones nuevas que hasta un momento determinado perma-

E*h '*

\-*i,u¿+'u):o.,*l W ,y -<tto?\ /utuo'ot

Una tarea más del embrión:

fabricar

kw#/ \;5/

ESpER¡rAroGENESts

/\o\.)

ADULTO

-O

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TEJIDOS EXTRAEMBRIONARIOS

AUI"4ENTO DE ÑlETILAC]ON

EMBRION ANIDADO

EL CIGOTO CONTIENE DOS TIPOS DE ADN, uno que

posee

el patrón de metilación de citosinas característico del espermatozoide (azu[), constifuyendo la herencia paterna, y otro propio del

6tulo (rojo),laherencia materna. La impronta parental se va perdiendo parcialmente en el embrión precoz. Después de la implantación del embrión en el útero las céIulas que constituirán los diferentes érganos y tejidos establecen progresivamente patrones de metilación específicos y distintos (amarillo y verde) para Ios cromosomas heredados del padre y para los heredados de la madre. necían ocultas, y determinadas cé1u1as verán dirigido su desarro-

hasta verse integradas en tejidos y órganos con funciones y morfología propias. Todas las líneas celulares seguiriín este proceso, con la sola excepción de las que dar¿án lugar a los gametos. Hacia la semana sexta del desarrollo embrionario aparece eI esbozo gonadal. Las células del tejido germinativo primordial, de origen ectodérmico, de las que se formarán más adelante los gametos, emigran hacia una matriz procedente del tejido mesenquimático. Las gónadas indiferenciadas, indistinguibles sexualmente, están constituidas en esa etapa por células procedentes del saco 11o

vitelino y por las germinales de origen ectodérmico. En

ese

momento ya se han formado también los conductos de Wolf y de Müller, de origen mesonéfrico, asociados a las gónadas en desarrollo. A partir de este conjunto de estructuras, bajo la dirección de los genes del cromosoma Y (embrión masculino) o del X (embrión femenino), se formarán respectivamente testículos y ovarios embrionarios. Para ese momento las células germinales primordiales habrán hecho ya tabla rasa de la impronta paterna y materna en cada uno de los distintos pares de cromosomas. Serán, por tanto, iguales en ambos tipos de embriones. Sólo más tarde, cuando las células germinales sufran gametogénesis, se irá estableciendo el patrón de metilación de citosinas correspondiente a su sexo, masculino durante la espermatogénesis y femenino durante la ovogénesis, sin guardar memoria de la impronta heredada del padre o de la madre. Así, cada uno de los progenitores podrá transmitir a su descendencia la impronta que le corresponda como padre o como madre. 33

Impronta parental de los genes Carmen Sapienza

Aunque el padre y la madre transmitan genes idénticos a los hijos, sus efectos pueden ser quizá distintos.

La impronta diftrencial de los genes enfunción del sexo podría condicionar el desarrollo normal y provocar enfermedqdes

n sus primeros experimentos con guisantes, realizados a mediados del siglo xrx, Gregor

Mendel hizo una observación que, andando el tiempo, se convertiría en axioma para los genetistas. Observó que, al crr:za'r líneas puras de guisantes lisos con líneas puras de guisantes rugosos, todas las plantas de

la descendencia hÍbrida producían guisantes lisos. El resultado era independiente de la planta lisa empleada en el cruzamiento: se tratara del macho o de la hembra. Mendel había des-

cubierto el principio de equivalencia en los cruzamientos recíprocos, esto es, el gen se comportará siempre de la misma manera, sin importar que ven-

ga de la madre o del padre.

El alcance de la observación

Mendel en la historia y práctica de la genética no puede minusvalorarse. Se

comprobado

su validez para

muchos rasgos genéticos, no sóIo del guisante, sino también de la mosca de la fruta, ratones, el hombre y muchos otros organismos. Recientemente, sin embargo, gene-

tistas y embriólogos han descrito

algunos rasgos que no obedecen esas reglas. Antes bien, se trata de características gobernadas por la impronta genómica, proceso éste que marca o graba diferencialmente a los genes de ndanera transitoria y reversible, según se transmitan a través de la hembra o del macho. Los descendientes que reciben los genes marcados de la madre difieren de quienes los reciben

del padre. Dicho en otras palabras,

importa saber de qué progenitor

la enfermedad.

gan la naturaleza molecuiar de la

del sexo de los descendientes. aunque no directamente de1 sexo del progenitor portador de1 carácter'. La segunda clase de cruzamientos recíprocos no equivalentes pone en

implonta genómica. el mecanismo que 1a establece v el número y tipos de genes que reciben dicha huella. Aunque no son aún grandes los logros, sí hemos descubierto algunos aspectos fascinantes. que nos están permitiendo ampliar el conocimiento sobre cieltos cánceres. enfelmedades genéticas ¡- otros maies. Las investigaciones sobre 1a rmpronta genómica pue-

den incluso poner de manifiesto algunas influencias. hasta ahora insospechada-.. sobre la herencia de los caracteres que se explicaban antaño en el malco de 1a genética mendeliana clásica. Excepciones a 1a regla de Ia reciprocidad en Ios cruzamientos se conocen desde hace mucho tiempo. pero generalmente se inclu¡'en en una de las categorías siguientes. Dentro de 1a primera se encuentran los caracteres Iigados a genes de los cromosomas sexuales. X e Y. Las hembras de los mamíferos tienen dos cromosomas X en todos los núcleos de sus células, mientras que los machos tienen un cromosoma X y otro Y. La ceguera a los colores y Ia hemofilia son dos de los muchos caracteres determinados por genes presentes en el cromosoma X. La herencia de estos caracteres ligados al sexo sigue un patrón bien definido que no exige la equivalencia en los híbridos recíprocos.

Cl i un hombre cieso a los colores se l ;Ai1i,'1

!.ll ¡AI'iÍF;2,1 abrió

camino

en la investigación de 1a influencia de Ia impronta genética en eI desarrollo de ciertas enfermedades genéticas ¡, cánceres. Dirige el laboratorio de genética del desarrollo del Instituto Oncológico Ludwig en Montreal.

ceguera a Ios colores, pero no sufrirán

recibe determinado gen. Científicos de r.arios laboratorios repartidos por todo el mundo investi-

con una muJer que no ".pur".¡u porta ese carácter, por ejemplo, ninguno de sus hijos será ciego a los colores. Si la madre es ciega a los colores y el padre no, entonces todos los hijos heredarán la anomalía. En ambos casos, las hiias portarán el gen de la

La herencia y manifestación de los caracteres ligados al sexo dependen

juego caracteres controlados por genes que residen fuera del núcleo celular. Ciertos orgánu1os subcelulares en células animales y

-mitocondrias mitocondrias y cloroplastos en cé1ulas vegetales- portan su propia información genética. Esos orgánuios

transmiten de generación en generación a través del citoplasma de la célula huevo; por tanto. se heredan exclusivamente por vía materna. El color de 1as hojas en algunas plantas muestra esa forma de herencia, igual que la encefalomiopatía mitocondrial, un tipo de enfermedad neuromuscular humana. La impronta genómica. 1a tercera y más reciente de 1as excepciones a Ia

regla de la equivalencia en 1os ctrzamientos recíprocos, difiele notab.lemente de los tipos antes mencionados. Los rasgos a los que afecta no dependen necesariamente de genes presentes en los cromosomas sexuales, ni están asociados con orgánu1os heredados por vía materna. La impronta puede, al menos en teoría. afectar a cua'lquier gen celulal'. Las excepciones iigadas al sexo y a orgánu1os de heren1. GENES MARCADOS

por Ia impronta,

alojados en los cromosomas de óvulos y espermatozoides. Los dos sexos heredan, por consiguiente, unos genes con impronta paterna y otros con impronta materna. Sin embargo, cuando los hijos producen óvulos o espermatozoides, se pierde la impronta precedente, y se induce otra nueva, específica del sexo del individuo en cuestión, en todos los cromosomas de sus gametos. TEN,IAS 3

CoNsrnLicctrii.l or. uN Sยกn Vtrยกo

CRUZAM¡ENTOS RECIPROCOS

ffi

ffi---.-m &

*.....*m

€ffi

? TODA LA

DESCENDENCIA

& J

ES EQUIVALENTE

t @*,

w#w

\-oescrruoeNCrA No

2. CRUZAMIENTOS en los que el gen responsable de un carácter es aportado por la madre en uno de los casos y por el padre, en el otro; este tipo de cruzamientos se denominan reáíp.o"o". Para la mayoría de los caracteres, como el aspecto liso en el guisante, no importa cuál de los dos progenitores

ciamaterna descansan sobre una desigual contribución genética de los progenitores. No ocurre así en los casos de

impronta genómica: los progenitores pueden transmitir a la descendencia genes exactamente iguales, aunque con efectos distintos si la impronta recibida difrere en eada uno. Estas nue-

vas circunstancias han polarizado la atención de muchos biólogos.

¡/-l

ran parte del interés actual por lo. caracteres afectados por la

impronta genómica tiene su origen en

los experimentos realizados por

James McGrath, Davor Solter y por M. Azim H. Surani y sus colaboradores. McGrath y Solter desarrollaron un elegante procedimiento microquirúrgico, denominado transferencia

nuclear, para intercambiar físicamente la información genética entre dos embriones de ratón. Esta técnica aprovecha la circunstancia de que, una vez fecundado el óvulo por un

EouIvALENTE

con las dos series de cromosomas de uno de 1os progenitores. ]IcGrath. Solter y Sulani tenían culiosidad por observar ei desan'oilo de tales embriones. Crearon ginogenotes i embriones con dos series cromosómicas maternas) )- andlogenotes l embriones con dos series de cromosomas paternos): compararon sus desarrollos con los de embriones no]'males.

Conviene resaltal que, debido a1 aito grado de consanguinidad de los rBtonP: utilizado: en esos exPerimentos, machos ¡- hembras portaban series idénticas de cromosomas (salvo, por supuesto, que 1as hembras carecen de cromosoma Y y los machos sólo

zoide permanecen separados durante

genes de uno de los progenitores, o

un breve intervalo de tiempo en el

mismo, ginogenotes, androgenotes y ratones normales deberían experimentar idéntico desarrollo. No es eso 1o que ocurre. Los embrio-

núcleos son visibles al microscopio

óptico y presentan una posición y tamaño característicos. Con una aguja de cristal hueca muy frna, se puede extraer selectivamente, del óvulo feeundado, cualquiera de los

nes con dos series de genes de proceden-

cia materna o paterna no llevan su de-

sarrollo a término, sino que éste

otro procedente de un huevo fecundado distinto. McGrath y Solter en-

detiene cuando las divisiones alcanzan unas pocas docenas de células. Si el desarrollo continúa, cosa que sucede ocasionalmente, Ios ginogenotes y androgenotes presentan unas curiosas di-

contraron que si sustituían un núcleo espermático por otro, o si sustituían un

ferencias en las anomalías que exhiben. En los ginogenotes de estadios

núcleo procedente del óvulo por otro, el embrión que resultaba se desarro-

más avanzados, los embriones presen-

dos núcleos, o ambos a la vez. Se puede

así reemplazar uno de los núcleos por

& \-oEscEruoeNCrA No

EOUTvALENTE

dre (centro), En los caracteres ligados a los cromosomas sexuales, como el color de las alas de Ia polilla Abraxas, el pa' trón de herencia es más compleio (derecho).

embrión comience a dividirse, el núcleo del óvulo y el del espermatocitoplasma de la célula huevo. Los dos

W#.W=WBffi

las hojas en algunas plantas, sólo se heredan a través de la ma-

llaba a término, sin distinguirse de un ratón normal de la misma estil'Pe. La transferencia nuclear permitía también a los investigadoles crear embriones con constituciones genéticas insólitas, por ejemplo. embf iones

que es

a f

porte el gen (izquierd¿). Ciertos caracteres, como eI color de

tienen un cromosoma X). Si el desarro1lo de un embrión de ratón dependiera exclusivamente de su dotación de genes, en teorÍa no debería importar que un ratón recibiese todos los

espermatozoide, pero antes de que el

W'W='WW & 4

tan aberraciones menores mientras

que sus placentas ¡' membranas vitelinas r estructuras esenciales para la

nutrición del animal'

hallan

seve-

I'amente atrofiadas. En 1os androgenotes avanzados se observa e1 fenómeno opuesto: ias memblanas r-itelinas y pla-

centas parecen casi más normales, mientras que los embliones son débiles ¡' escasamente desarrollados.

¡l-tomo las secuencias de -\DN pre-

(J ."n,".

en los cromosomas de los embriones ginogenético s. androgené-

ticos y normales eran las mismas, \fcGrath, Solter 1' Surani concluyeron que

1os

genes habían sufrido algún

tipo de modificación o impronta diferencial, que dependÍa de su origen, materno o paterno. Este proceso de impronta parecía desactir-al selectivamente algunos genes que, en condiciones normales. debían intervenir

durante ei desarrollo embrionario temprano. De Ios genes aportados por

el padre, algunos decisivos para eI desarrollo embrionario parecían estar

inactivos; de los aportados por la madre parecían inactivos aquellos cuya participación era imprescindible para la formación de la placenta y la

membrana vitelina.

Bruce M. Cattanach ofreció otra demostración gráfrca

de1

fenómeno de

impronta. Cattanach llevaba años investigando el fenómeno de Ia no equivalencia en 1os cruzamientos recíprocos. Para el estudio de tales caracteres utilizaba líneas de ratones que portaban una o más parejas de cromosomas fusionados. En tales ratones, algunos cromosomas estaban físicamente conectados y, por tanto, no se podían separar durante Ia meiosis, el proceso de división ceiular que da lugar a óvulos y espermatozoides. En TENIAS 3

consecuencia, durante la división una célula recibirÍa dos copias de un cro-

ción de su herencia, materna o paterna; tales modificaciones son reversi-

mosoma y la otra, ninguna. Si un óvulo con dos réplicas de un cromosoma es fecundado por un espermatozoide sin ninguna, eI embrión

bles. Pero no se sabe todavía si las modifrcaciones constituyen el mecanismo primario del proceso de impronta en el genoma o sólo reflejan otro fenómeno bioquímico subyacente y desconocido. No todos mis colegas coinciden conmigo, pero apostaría a que la metilación delADN es mera consecuencia del

resultante contendrá el número normal de cromosomas, aunque las dos copias de uno de los cromosomas procederían de la madre. De la misma manera, las dos copias las aportaría el padre si el espermatozoide portase ambos

cromosomas y el óvulo ninguno. De aeuerdo con la regla de equivalencia de los híbridos recíprocos, todos los animales resultantes de ese tipo de cruzamientos deberían ser idénticos. Sin embargo, los experimentos de Catta-

mecanismo primario. Afortunadamente para todos los que estudiamos este fenómeno, todavía podemos acometer

muchos experimentos importantes

sin necesidad de conocer las causas últimas de la impronta genómica. Sea cual sea el mecanismo por el que se realiza la impronta, ésta se manifiesta de formas que son a menudo extrañas, y algunas veces trágicas.

METODO DEL TRANSPLANTE NUCLEAR Técnica para estudtar la impronta genómica que permite fabricar embriones con todos los cromosomas de un mismo sexo

nach demostraron inequívocamente que tal regla no se cumplía para varios de los cromosomas del ratón.

Cattanach encontró, por ejemplo,

NUCLEOS DEL ESPE

que los ratones que heredaban las dos copias del cromosoma 11 de uno de los

progenitores diferían en tamaño y peso de los ratones normales. Criados en las mismas condiciones, los ratones con dos cromosomas 11 de origen

materno eran anormalmente pequeños, mientras que aquellos que lo heredaban de su padre eran gigantescos. Experimentos similares realizados con otras parejas de cromoso-

mas fusionados producían otras aberraciones características, como la muerte del embrión y anomalías del

comportamiento.

experimentos de Cattanach de-

I-.1 mostraban también otro punto importante: los efectos de la impronta genómica no persisten en la siguiente generación. La impronta no supone, por tanto, una modifrcación perrnanen-

te del cromosoma. IJn pequeño ratón macho con las dos copias del cromosoma 11 de su madre produciría descendencia de tamaño normal. Los genes

procedentes de la madre pierden su impronta femenina para ser de nuevo etiquetados como genes de macho. Inspirados por los descubrimientos de McGrath, Solter, Surani y Cattanach, investigadores de varios laboratorios (entre ellos el mío) han tratado

de determinar si Ia impronta genómica débese a una modificación directa del ADN. En particular, nosotros hemos estudiado el papel de la metilación del ADN, proceso en virtud del cual pequeños grupos moleculares se engarzan químicamente a una macromolécula de ADN luéase "Una herencia distinta", por Robin Hollidayl. Para nuestra satisfacción, hemos compro-

OVULO FECUNDADO CON DOS NUCLEOS PROCEDENTES DE ESPEBMATOZOIDES

bado una frecuente metilación diferencial de genes particulares en funCoNsrnuccróN

DE uN SER

Vrvo

EL EFECTO DE LA IMPRONTA y su observacióñ en aEl¡nos de los descend¡entes de los ralones con eromosomas fusionados. Cuando un ra-

tón normal prodirce óvulos o'espermatozoide's (gametcsl, to&s los ga' metos resultánies portan sólo una cópla de qada cromosoma lrecaadrol. En ios ralones con crofrpso-

'66luLA§,rPBOAlJCtOñA§

OE GAMETOS CON CROMOSOMAS FUSIONADOS

GAMETOS CON

UNA DISTBIBUC1ON CROMOSOMICA IRREGULAR

r''-

r.rEMdRlO¡,tE§.rr00Ñ:,]

ii'.,. t,.ll.

DO§ §OPIÁ§:ID§',UN' ', ri

CFIOM0EOMA'IDE UNO,, i: D E LO§'P nOGE¡ltf:§H§$.,,,,:

Aa§r,fr¡§bñ 9¡h,,.§kl':§rntlt¡r{¡q,:rñl§iiÍ tñt si'.dB,,]' lo§r':gñfliÉltirir rffi.611¡,¡l €l'i

dos copias de un cromosoma, o nin-

Wria. Las Gombinacion€s de'esos

gamelos origiñan animaies con dos copias de un crórnosór*a de'uno de los progenitores.

I -CELUU{

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.,'.PR0DUOT..0F}ATTDE''

AMBAS COPÍA§

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DEL PADBS MACHO

GAMETO§.,NOfiMALE.S'.

r,$',

CROMOSOMA

A \,

FECUNDACION

HEMBRA

A}'BAS.EOPIA§,]. Dt LA MAORE'r,,

ULas manifestaciones trágicas aparecen en varias enfermedades huma-

nas. La naturaleza provoca a \¡eces situaciones. en el hombre. eue son :imiiares a las estudiadas por Cattanach en el ratón. Robert D. Nicholls 1sus colaboradores han hecho Iecientemente un descubrimiento de este tipo en pacientes con el síndl'ome de

malmente glandes ¡' peclueños que CattanacL ploducra pl <L¡ s e:ipelimentos. ios síndlomes de Prader-\Villi v Angelman no pueden fácilmente

atlibuilse a las dos caras de 1a misma moneda. causados pol un exceso o url defecto del mismo ploducto génico. Los estudios de Nicholis ¡, sus colaboradores ilu-.tlan 1a diflcuitad de pre-

cor.r

decir 1a posible leacción de ciertos

síntomas de retraso mental. obesidad extrema. corl a estat u ra y mano: \' pie: desproporcionadamente pequeños. Tras examinar los genomas de pacientes con síndrome de Prader-Wi11i ¡- 1os de sus parientes, Nicholls 1Iegó a ia conclusión de que muchos pacientes habían heredado las dos copias dei cromosoma 15 de sus madres. Nicholls, Joan H. M. Knoll y Charles A. Williams obtuvieron luego un descubrimiento parecido, aunque contrastante, en pacientes con síndrome

caracteres ante el p1'oceso de impronLa, Selia por tanto util leeramiriar mu-

Prader-Willi, una enfermedad

chos trastolnos cor-rgénitos en el marco de la

hipur.-i:

de 1a implonta.

podrran hallar'.e afectados incluso I los calactele. pala 1os que no existe una necesrdad obvia de recurrir a la influencia de la impronta genómica. Así Io ilustran ciertos cánceres infan-

tiles: el rabdomiosarcoma embrionario lun tumor muscular). el tumor de Wilm (un tipo de cáncer de riñón) y e1

de Angelman. (Antiguamente, a esas

osteosarcoma (cáncer de hueso).

personas se las describía como "marionetas felices", ya que sonríen cons-

impronta genómica puede estar impli-

tantemente, tienen movimientos

es-

pasmódicos

y otros síntomas

retraso mental y motor.) Los pacientes presentaban frecuentemente dele-

ciones parciales del cromosoma 15 heredado de 1a madre; eI único cro-

Para explicar en qué medida

cada en esas enfermedades, quizá sea útil recordar cómo se supone que se producen esos cánceres. N{uchos cánceres obedecen, eso se cree, a la acumulación de sucesivas mutaciones en

impronta diferencial de los mismos

genes específicos de una sola célu1a. El cromosoma 11, por ejemplo, porta un gen,,Bd, que pertenece a una familia de oncogenes recesivos. genes supresores de tumores o antioncogenes [uéase "En busca del antioncogén",

genes en e1 mismo cromosoma. Ahora bien, a diferencia de los ratones anor-

cIóN Y CIpNcIe, noviembre de 19881.

mosoma 15 completo era el del padre. Es sorprendente que dos enfermedades con un cuadro clínico tan dis-

par puedan estar ligadas a una

r-'

por Robert A. Weinberg; INvnsrrca-

En ausencia del producto de Bd, una célula muscular se transforma en célula cancerosa v. finalmente, origina un rabdomiosarcoma. Como cada núcieo celular contiene dos copias de1 cronosoma

para que

una célula se transforme las dos copias de -Rd deben estal inactir,as. La primera copia de Rr1 puede inactivarse de varias maneras: la l-nás simple, una mutación que altele 1a secuencia de ADN del propio gen. Si se da dicha mutación, cualquier acontecimiento genético adicional que inactir-e 1a otra

réplica de Bd hará. probablemente, que 1a célula se conr-ielta en cancerosa. Con frecuencia. 1os episodios genéticos que destr:u¡-en 1a segunda Rd borran ei cromosoma entero. o 1a parte de éste que contiene el gen. Junto con mis colegas Heidi J. Scrable y Webster K. Car-enee hemos pro-

puesto un mecanismo alternativo para explicar algur.ros cánceles pediátricos. A tenor de nuestra hipótesis, e1 episodio que inactir-a la primera copia de un oncogén lecesivo no tiene

necesariamente que ser una r-erdadera mutación. Puede ser 1a impronta genómica. que inactir-a genes diferencialmente en machos v hembras. (EI segundo episodio. que es el que pone en marcha el proceso de transformación. podría ser una deleción u otro accidente.) En nuestra opinión. Ias cé1ulas del rabdomiosarcoma tendrían, por mor de la impronta, una réplica inactiva dei gen Ed en el cromosoma ll intacto. Dicho cromosoma T¡tut,ls

' i,

genes responsables de

la impronta.

(No confundirse con los propios genes

que reciben la impronta.) En otras palabras, la impronta debe ser un proceso que resulte de Ia actividad de diversos genes que operan de una manera diferencial en machos y hembras. Personas del mismo sexo con diferentes genes controladores del proceso de impronta diferirán también en su dotación de genes marcados con dicha impronta. La mayoría de los machos, por ejemplo, no inactivarán al genRd; sólo lo harán aque-

llos, poco frecuentes, que porten una copia aberrante de uno de los genes que controlan la impronta. La idea de que la expresión de un gen o la represión de la misma puede ser controlada por otros genes no es nueva. Describe un antiguo y bien conocido fenómeno en genética: la modificación de la dominancia. Muchos caracteres responden a la actiüdad de otros genes que modifican su expresión. La impronta genómica puede contemplarse como un caso especial de modiflrcación de la domisería aportado por el mismo progenitor en la mayoría de los casos de rabdomiosarcoma embriona rio. Nuestro laboratorio, 1'Ios de Grad¡, F. Saunders, Manfred \Iannens, NIasao Sasaki y otros, han encontrado

bras, cabría suponer que todos los machos establecerían la impronta en sus genomas de una manera, y las hembras de otra. Ante la falta de pruebas en sentido contrario, suponíamos que todos los miembros de un sexo ejecu-

pruebas que apoyan esta teoría. Ei primer episodio inactivador en e1 rabdomiosarcoma embrionario. e1 tumor

manera.

de Wilms y el osteosarcoma. casi siempre ocurre en un oncogen recesivo ple-

sente en L1n cromosoma de origen paterno. Los datos son congruentes con la participación de la impronta genómica en Ia génesis de esos tumores. No obstante, esos mismos datos

plantean también una dificultad teórica importante. EI escollo se presenta cuando la mayoría de los que estudiamos meno de Ia impronta genómica

fenó-

imaginamos como una consecuencia de las grandes diferencias fisiológicas ¡, bioquímicas que existen en ia formación de gametos (esper:matozoides y 1a

ór,ulos) en machos y hembras. A Io 1argo de la mayor parte de su vida adulta,

los machos producen miles de mi11ones de espermatozoides a partir de una población de células en continua división. Por el contrario,las hembras nacen con todos los óvulos que produ-

cirán en sus años fértiles. A medida que esos óvulos maduran, uno o muy pocos de ellos cada vez, se produce la ovulación, de una forma regular. Si 1a impronta diferencial fuese sólo

reflejo de la dicotomía entre la producción de gametos en machos y hemCoxsrnucctót ot

u:'¡ S¡n

Vrvo

tarían su impronta de Ia misma

nancia. El único e insólito rasgo

de esos genes modificadores que se pos-

tulan como implicados en el control de la impronta genómica es su actividad diferencial en machos y hembras.

aenfermedaddeHuntington(EH) J-¡l constituye un interesante ejem-

Ahora bien, Ios datos que relacionaban los cánceres pediátricos con

ficado por una impronta genómica

oncogenes recesivos inactivos de pro-

específica y ligada al sexo. La EH, una

plo de carácter que parece estarmodi-

fatal,

cedencia paterna contradecían nues-

enfermedad neurológica

tra presunción. Si todos los machos

hereda de forma dominante: todo el que reciba el gen EH de alguno de sus

marcasen con su impronta e inactivasen el genBd, por ejemplo, la incidencia de rabdomiosarcoma embrionario sería altísima: con un solo cambio genético en el.Bd heredado de la madre, algunas células de cualquier individuo se volverían cancerosas Como esos tumores son raros (afectan, aproximadamente, a uno de cada 20.000 niños), es improbable que todos portemos un oncogén recesivo inactivo y heredado de nuestro padre. No obstante, en los individuos que sufren esas enfermedades, eso es precisamente lo que parece haber ocurrido. Una explicación provisional de esa discrepancia sería que no todos los machos (o hembras, presumiblemente) marcan e inacüivan los mismos genes. ¿Cuáles sefian las bases de esas diferencias entre los individuos? Si uno es en el fondo un genetista, siempre debe recurrir primero a su disciplina para responder las cuestiones de ese tenor. La explicación genética requiere la existencia de uno o más

padres sufrirá la enfermedad. Generalmente, la enfermedad se manifiesta en los adultos, diagnosticándose como edad media a los 38 años. Aproximadamente el 10 por ciento de los casos, no obstante, se manifiestan en la infancia, y afectan a niños de hasta dos años y medio. Como ya habían observado los investigadores médicos en un principio, el 90 por ciento de los niños afectados procedían de familias en las que el padre era el progenitor interesado. Por supuesto, en esos casos, padre e hijo portan eI mismo car:ácte.r= deleté-

reo, pero la modificación sufrida por el paso a través del padre ha sido la causa evidente de que la enfermedad aparezca en su hijo a una edad más

temprana.

largo de los años se han ido

sucediendo las hipótesis sobre el com-

portamiento genético de la EH. De todos, el modelo de Charles D. Laird es el que más se ajusta a los datos 39

CELULA TUMORAL COPIAS NO

CELULA NORMAL

CELULA NORMAL DOS COPIAS FUNCIONALES

DE Bd

UNA COPIA FUNCIONAL DE Rd

FUNCIONALES

DE Bd SEGUNDO SUCESO

PRIMER

sucEso LA IMPRONTA

MUTACION PUNTUAL

INACTIVA

UN Bd

E = GEN ACTIVO ! : GEN INACTIVO 3. IMPRONTA PARENTAL de los genes supresores tumorales (como el 8d); ese

DELECION CROMOSOMICA

marchamo puede incremeutar la probabilidad de ciertos cánceres. En los indiüduos que reciben dicha impronta basta con que ocurra un suceso infrecuente mutación puntual, una deleción -una cromosómica u otro cambio genéticepara que la célula se torne cancerosa.

Sin la impronta, tales episodios tendrían que ocurrir dos veces.

existentes. Introduce como principal innovación el concepto de efecto de posición, un fenómeno bien estudiado en la mosca de la

fruta, que determina

la expresión variable de ciertos caracteres. A diferencia de los demás carac-

teres mutantes, éstos presentan el aspecto insólito de no expresarse en todas las células en los tejidos afectados. Por contra, los tejidos son mosaicos formados por células mutadas

otras, dirÍase, perfectamente norma-

les. La proporción de células que expresan la mutación está controlada por genes modificadores, que pueden cambiar el balance desde un tejido casi normal hasta casi mutante.

Laird razonó que, si Ia variabilidad en Ia edad de aparición de la EH refle-

jaba un mosaicismo variable en la expresión del gen de la EH, tal mosaicismo estaba probablemente influenciado por genes modificadores. Un gen modifrcador que inclinara la balanza del mosaicismo hacia una mayor cantidad de tejido mutante, determinaría un adelanto en la edad de aparición de la enfermedad. La situación contra-

ria retrasaría la edad de aparición. (Hay casos de pacientes de EH que no

han sufrido la enfermedad hasta los 70 años.) Laird explicó, además, que la mayor incidencia de casos de EHjuvenil por herencia paterna se debía a la localizacióla del gen modificador en el cro-

mosoma X, Como los machos tienen sóIo un cromosoma X, cualquier aberraeión de su gen modificador no podría ser compensada, como sería el caso en

las hembras, que portan dos cromosomas X. Es más probable, por tanto, que los varones tengan descendencia

en la que eI balance del mosaicismo 40

esté inclinado hacia la situación de mayor cantidad de tejido mutante, lo que determina una ma)'or probabilidad de aparición temprana de 1a enfermedad. El diez por ciento de los casos de EH juvenil procede de familias en 1as que 1a madre. ¡- no el padre, es Ia afectada. Pero eso es 1o esperado; tam-

bién cabe presumrr que existan mujeres con genes modificadores aberrantes en sus dos cromosomas X, aunque esos casos son mucho más raros. Este modelo parece explicar razonablemente bien 1a genética de tan

complicada enfermedad. En mi trabajo he retocado ligeramente el modelo de Laird. para reflejar con mayor precisión e1 comportamiento de los genes modificadores. Esta pequeña aportacion pernrite una aproximación

incluso mayor a1 comportamiento genético real de la EH. n mi opinion. se puede decir que el modelo de Laird de la genetica de la EH, basado en el efecto de posición,

-L./

casi cierra ei círculo de los estudios sobre impronta genómica. Hasta donde 11egan mis conocimientos, el pri-

mer estudio en profundidad sobre impronta genómica fue realizado por Janice Spofford sobre un efecto de posición en la mosca de 1a fruta. Su trabajo, publicado en 1959, recibió escasa atención. Desde entonces han

ido apareciendo, esporádicamente, otros estudios sobre caracteres genéticos cuya expresión dependía del progenitor que transmitía eI gen particular. Caracteres en organismos tan dispares como la mosca de Ia fruta, levaduras, rnaí2, ratones y seres humanos, se ven afectados por el fenómeno de la impronta genómica.

A pesar de todo eso, Ia impronta genómica sigue constituyendo, para muchos biólogos, mera curiosidad limitada a unos pocos caracteres. En algunas ocasiones me han preguntado por qué gasto mi tiempo (y, de paso, eI de1 interpelante) en un fenómeno de tan escasa trascendencia. Siempre he respondido que el número de caracteres afectados por la impronta genómica, aunque desconocido, podría ser importante. Mi respuesta suele provocar una mirada de incredulidad, seguida de una disertación de uno o dos minutos sobre los principios de Mendel, que culmina con el tajante pronunciamiento de que la mayoría de 1os caracteres no funcionan "de esa manera". Las críticas tienen su punto de razón. Si la mayoría de 1os caracteres mostrasen una dependencia absoluta del progenitor que transmite el gen en cuestión, los genetistas io habrían advertido. La clave de la discrepancia. sin embargo, puede muy bien estar en la profundidad con la que los investigadores examinan un carácter particular. Cuando Spofford estudió 1a expresión en mosaico de Ios caracteres mutantes en la mosca de Ia fruta. observó los mismos caracteres en toda la descendencia de los cruzamientos recíprocos, igual que Mendel. Sin embargo, había suficientes diferencias en 1a expresión del carácter como para que pudiese discriminar qué progenitor había contribuido a ellas. De la misma manera. nuestro trabajo y el de mi colega Alan C. Peterson han demostrado que varios caracteres del ratón son mosaicos. Si uno se pregunta sólo por la presencia de tales caracteres, 1a respuesta es afir-

mativa; ahora bien. si Ia pregunta inquiere cuán intensa es su expresión, entonces apreciarán los efectos de ia impronta parental. Para algunos

caracteres, e1 grado de expresión quizá no sea muy importante; para otros, podría resultar decisivo. Por ejemplo, puede significar 1a diferencia entre padecer e1 tumor de Wilms o no, o manifestar la EH a los 5 años o a los 70.

IBr-IijílRAi-i A l,lrJ.\iPI

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Drprun¡NrleL Ilrpnrxnrc .\\D

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ExpRES-

sroN oF Mrtrnt¡i- rro Prrenx[ GrNor,tps. D. Solter en Arutuol Rerietrs oJ Genetics. vol. 22. págs. 127-1,t6; 1988. A MoDEL FoR ET,TBRYoNAL RHABDo\rYosARCoN,IA TrrrtoBtcrx¡sts rH-\T INVot--

ves G¡wolr¡ INrpRrNTrNc. H. Scrable

¡,

cols. en Proceedings qf the Natiottctl Acct-

denty of Scierrc¿s. vol. 86. n." 19. págs. 1180-1484: octubre de 1989.

Ter¡.qs 3

El equilibrio de la dosis informAtiva del rromosoma X Natalia López Moratalla

as células de las hembras de los mamíferos contienen dos cromosomas X, mientras que las de los machos tienen un X

y un Y. La existencia de estos dos cromosomas supondría para el organismo f'emenino una doble dosis de la amplia inforr¡ación genética contenida en los cromosomas X, en franco desequilibrio con el organismo masculino. Sin embargo. este problema 1o ha resuelto la naturaleza mediante un proceso que tiene lugar durante el desarrollo embrionario de las hembras por el que las células somáticas mantienen sólo uno de sus cromosomas X en estado activo. es decir con capacidad de expresar la infbrmación que porta, mientras que el segr-rndo cromosoma X permanece inactir,o. Este proceso, que se inicia al comienzo del desarrollo embrionario, tiene 1u-9ar al azar sobre los cromosomas X: en unas células puede ser uno y en otras otro el que se mantenga activo en e1 subsiguiente proceso de dif'erenciación. De este modo las células somáticas que descienden de una misma célula embrionaria, en la que ya se hizo esa selección, mantendrán siempre el mismo croIro\ornr X acliro ¡ el otro inretirtr. En este sentido los tejidos y órganos de las hernbras de mamíferos son mosaicos compuestos por grupos clónicos de células en las que el cromosoma X activo se heredó bien del padre o bien de la madre. Lin defecto en un gen ligado al cromosoma X, heredado de cualquiera de los progenitores. origina una curiosa enfermedad congénrta que se da en las rnujeres. la displasia ectodérmica anhidrótica, que afecta a las glándulas sudoríparas. La piel de estas mujeres es un mosaico en el que zonas carentes de g1ándulas sudoríparas alternan con otras zonas absolutamente normales. Las primeras corresponden al clon de células en las que el cromosoma X que quedó activo es el que contiene el gen det-ectuoso. mientras que las derivadas de las segundas contienen en su cromosoma uctivo el gen sano. La inactivación de uno de los clomosornas X ocurre en dif'erentes momentos del desarrollo embrionario. En 1os primeros días. tras 1a implantación en la mucosa uterina. las cé1ulas que van a dar lugar a los tejidos ertraembrionarios inactivan pref'erentemente el

croffrosoma X que procede del padre. En cambio, el azar interviene claramente en la selección de uno de los dos cromosomas X en las células que fbrmarán los tejidos del ernbrión. Más tarde, las cé1ulas germinales primordiales. a partir de las cuales se tbrma¡án Ios óvu1os, reactivarán el cromosoma inactivado, preci samente antes de que tenga lugar 1a división meiótica que reduce a la mitad la dotación genética. Así se asegura que el óvr"rlo maduro. al que 1e corresponde exclusivamente uno de los dos cromosomas X del par. 1o contendrá en su tbrma tuncional. Este cromosoma, en su forma activa, es necesario, al igual que los dernás, para que. si ese óvulo es fecundado. se desarrolle el ernbririn. Ya se sabe qué gen es el responsabie del proceso de inactivación del cromosoma X. Este descubrimiento permite plantear una hipótesis acerca del mecanismo de este minucioso proceso de silenciación selectiva de una parte del mensaje genético. Este gen. denominado Xist, está localizado en la región central del cromosoma, en una zona conocida como zona de inactivación. Los dos cromosomas X han de estar presentes en fbrma activa para qr-re el gen Xist se exprese. Precisamente por esta razón, ese proceso no ocurre en las células masculinas. que sólo tienen un crornosoma CoNsrnucctón on ux S¡n Vrvo

X formando parte del par 23. Los productos de la expresión

de este gen de uno de los dos cromosomas se fijan precisamente sobre ese mismo cromosoma. inducen un carnbio en su estructura y, pos-

teriormente. se produce una metilación de una buena parte de las citosinas de su ADN. Esto hace que queden inactivos tanto él como los cromosomas qLre se han fbrmado a partir de la replicación de su ADN. El otro cromosoma quedará activo al no expresar e1 gen Xist. debido posiblemente a una proteína "bloqueadora", que se une a la región de inactivación e impide la expresión del gen. Esta proteína se encuentra en cantidades tan pequeñas que sólo alcanza para uno de los cromosomas X. ¿Cómo se vuelr-e de nuevo activo el cromosoma X en las células que van a terminar siendo ór,uIos? El mecanismo parece ser muy simple: la cantidad de 1a proteína "bloqueadora" de la inactivación que sintetlzan las células precursoras de 1os gametos femeninos es mayor que Ia que sintetizan las células somáticas; por ello, la abundancia de esta proteína es 1o que permite el proceso de reactivación del cromosoma X inactivo al poder unirse al cen-

tro de inactivación de ambos cromosomas.

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Xi Xa Embrión nbrión temprano rspués de después la implanlación implar

Embrión antes de

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Metilación del cromosoma X inactivo

E IJ f¡

Ovulo

En todas las células somáticas

INACTMCION y reactivación de uno de los cromosomas X. Están dirigidas por la expresión de un gen, el Xsit, cuyo producto cierra la expresión de los genes localizados en ese cromosoma. Al comienzo del desarrollo de un embrión de sexo femenino, una molécula "bloqueadora" de la inactivación impide que el otro cromosoma X exprese este gen y como consecuencia se inactive. Por el contrario en las células germinales embrionarias, que en el proceso de diferenciación generarán los évulos, la cantidad de esta molécula bloqueadora es mayor y los dos cromosomas X quedan activos. 4t

Espermatogénssis Cristóbal Mezquita Pla

El espermatozoide, una de las célulqs más especializadas del organismo, surge en virtud de una dramática metamorfosis celular. ¿

Qwé mecanisntos moleculare s erplican

este sorprendente proceso cle diferertciación?

T L Ll

os espermatozoides

contienen la

i.rfor-ación genética reque-

rida para Ia tánsmisión hereditaria de los caracteres de la especie y la maquinaria molecular precisa para la preservación, transporte e introducción en el óvulo de dicha información. Las micrografías de la página opuesta muestran la morfología de los

espermatozoides del cobayo

del

gallo, las dos especies que hemos utiIizado fundamentalmente en nuestras investigaciones. Puede observarse en ellas el volumen diminuto de los núcleos de los espermatozoides y

su estilizada forma hidrodinámica. ¿Qué cambios estructurales de la cromatina de las células germinales per-

miten empaquetar el ADN en un

Y ¿cómo se borra ulteriormente el pro-

grama de diferenciación para dar

lugar al mensaje genético de 1os espermatozoides, verdadera tctbula rcLsa que transmite todos 1os caracteres de

especie?

Para contribuir a la resolución de estas y otras cuestiones relatir.as a 1a biología molecular de 1a espermatogénesis, iniciamos nuestl'o trabajo de investigacion en este campo a prin-

cipios de 1os años setenta. Desde entonces nuestl-o objetir-o fundamental ha consistido en rnr-estigar 1a relación existente entre ios cambios

composición. estructura ¡"- actividad funcional de ia c¡omatina a lo largo de la espermatogénesis. La diferenciación de Ias células germinales del testículo constitu¡'e un modelo ideal para este tipo de inr-estigaciones.

volumen nuclear tan reducido? ¿Cómo se preserva la integridad del mensaje genético que portan los espermatozoides? ¿Qué mecanismos controlan

ios métodos citoquímicos o de los

la expresión de la información genética responsable del proceso de dife-

métodos bioquímicos que parten de la

renciación de las células testiculares?

imprescindible recurrir

CRISTOBAL MEZQUITA PLA es catedrático de fisiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Barcelona. Cursó sus estudios de medicina en dicho centro, donde se graduó en 1967 y obtuvo eI doctorado en 1974. Su interés por Ia fisiología de la línea germinal Ie llevó a investigar el tema en el departamento de química macromolecular de Ia Universidad Po1itécnica de Barcelona (entre 1970 y t972) y err el departamento de biologÍa celular del Baylor College of Medicine, en Houston, Texas, donde fue becario posdoctoral y Visiting Research Associate (entue1974yt978). Enlos últimos 15 años, además de su dedicación a la docencia de Ia frsiología, ha seguido utilizando eI modelo de la espermatogénesis para investigar los mecanismos implicados en el control de la expresión genética durante la diferenciación celulary su relación con el problema del cáncer.

Dadas las eviclentes limitaciones de

fierza de sedimentación unidad, para que 1as partículas de distintos volúmenes se distancien entle sÍ varios milímetros al cabo de tres o cuatro horas de sedimentación espontánea. EI método permite separai'los núcleos de las celulas testiculales glacias

drásticos cambios de r-oiumen que aquéllos experimentan durante Ia espermatogénesis.

1os

pn I-l

efecto. el proceso de dilelenciación que da lugal a l¡. e.permatozoides se inicia con las espermatogonias. Estas celulas. tl'ai una serie de divisiones, originan 1os espermatocitos primarios, los cuales 11egan a poseer doble cantidad de ADN que las

espermatogonias 1'' un volumen nuclear mayor. A1 dividirse los espermatocitos primarios i primera dir-isión meiótica) originan los espermatocitos

permitieran 1a sepalación de las distintas células germinales o de sus

secundarios, reduciéndose a 1a mitad el contenido de ADN r.disminuvendo también el r,olumen nuclear'. Los espermatocitos secundarlos se dividen a su vez (segunda división meiótica) para dar lugar a 1as espermáti-

núcleos. Para separar 1os núcleos de las células testiculares utilizamos el

das, con una nueva reducción a la mitad del contenido de -\D\ ]-un vo-

totalidad del testícu1o. resultaba a

técnicas que

método denominado "velocidad de sedimentación unidad". que se basa en las diferencias de volumen de las partícu1as a separar. Cuando estas diferencias son considerables. basta

el campo gravitatorio terrestre,

Iumen nuclear mucho menor', Finalmente, Ias espermátidas ¡'a no se divi-

den pero experimentan un notable proceso de metamorfosis nuclear y

citoplasmática denominado espermiogénesis que origina los espelma-

1. ESPERMATOZOIDES de cobayo (aniba) y de gallo (abajo) teñidos con naranja de acridina y observados con el microscopio de fluorescencia, en la página opuesta. Los núcleos cilíndricos de los espermatozoides del gallo (fluorescencia amorill¿) poseen un volumen de unos dos micrómetros cúbicos y contienen alrededor de 1 picogramo de ADN. En un extraordinario proceso de miniaturización, el núcleo de los espermatozoides encierra, muy protegida, la información necesaria para la transmisión hereditaria de todos los caracteres de la especie. Los espermatozoides disponen, además, de la maquinaria molecular precisa para introducir en eI óvufo dicha información. EI a€rosoma (fluorescencia roj¿¡) contiene las enzimas responsables de la penetración en el óvulo. Los movimientos de la cola propulsan la célula a una velocidad de varios milímetros por minuto. El desplazamiento se realiza

con la máxima economía energética gracias a Ia forma hidrodinámica de los espermatozoides. Aumento x 1500. TENTAS 3

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nucclóx nr uN S¡u Vryo

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Ios núcleos. Estos pueden separarse

del citoplasma por ultracentrifugación a través de una disolución de sacarosa de alta densidad. La figura 4 ofrece un esquema del proceso de

separación de los núcleos por el método de Ia velocidad de sedimentación a fr¡erza de gravedad unidad. En su parte superior hay un dispositivo para la creación de un gradiente de sacarosa que llenará la cámara de sedi-

mentación cilindrocónica. Ei gra-

diente de densidad no es esencial para

la separación, pero estabiliza

el líquido y evita que los núcleos una vez separados se mezclen como consecuencia de ias corrientes de convección. Antes de iniciarse 1a separación, la muestra que contienen Ios núcleos forma una delgada capa en la superficie del líquido que llena la cámara

6/'

q @ t @

de sedimentación. A1 cabo de 3 o 4 ho-

ras, Ios núcleos forman cuatro capas que corresponden a las siguientes velocidades de sedimentación: 2,0; 1,7; 0,8 y 0,5 milímetros por hora.

os distintos tipos de núcleos fueron caracterizados por su morfología y por su contenido en ADN, ARN,

2. CELULAS TESTICULARES DEL GALLO en distintos estadios de la espermatogénesis. Las espermatogonias (7), tras una serie de divisiones, dan lugar a Ios espermatocitos primarios (2), los cuales, al dividirse (primera división meiótica), originan los espermatocitos secundarios (3 ). Los espermatocitos secundarios, a su vez y a través de la segunda división meiótica, dan lugar a las espermátidas primitivas (4). Estas células no se dividen, pero experimentan un proceso de metamorfosis nuclear y citoplasmática denominado espermiogénesis (J-9), que origina Ios espermatozoides (9). La espermatogénesis del gallo es un proceso muy activo que evoluciona más rápidamente que en otras especies animales (12 días en el gallo frente a 32 días en la rata). Además de las células germinales, los túbulos seminíferos del testículo contienen las células de Sertoli (S). Estas células dividen el túbulo seminífero en dos compartimentos, un compartimento basal que contiene las espermatogonias y las primeras fases de diferenciación de los espermatocitos primarios y un compartimento luminal en el que se encuentran eI resto de las céIulas meióticas, las espermátidas y los espermatozoides. El microambiente creado por las células de Sertoli y el íntimo contacto existente entre estas células ¡, las espermátidas es esencial para la espermiogénesis. Datos morfológicos obtenidos por I. Zlotnik.

proteínas básicas (histonas y protaminas) y proteínas no histonas. La fracción que sedimenta a mayor velo-

cidad, 2,0 milímetros por hora, consiste en grandes núcleos esféricos intensamente teñidos. con una red de cromatina que se extiende a todo el espacio nuclear. Estos núcleos pertenecen a )os espermatocitos primarios y su contenido de ADN i4.27 picogramos) es doble del correspondiente a las células somáticas. Hemos designado esta fracción nuclear como esta-

dio I. E1 estadio II corresponde a núcleos con una velocidad de sedimentación de 1.7 mi1ímetros por hora. Se trata de núcleos de menor diáme-

tro con una cantidad de -\DN aproximadamente igual a la de 1as células somáticas 12.5 picogramos ). Tales núcleos han sido identificados como pertenecientes a los espermatocitos

una drástica reducción del volumen nuclear.

volunten fina1 del núcleo de los espermatozoides de tan só1o 2 micrómetros

deltestículo

núc1eos de 1as célu1as testiculares por

primarios pequeños. esper-rnatocitos secundarios y espermatogonias. E1 denominado estadio III corresponde a núcleos con velocidad de sedimentación de 0,8 miiímetros por hora y con-

nesis. El núcleo de los espermatocitos de los núcleos por este método, deben primarios es una esfera de 110 micró- obtenerse en forma pura, sin contametros cúbicos de volumen. Las esper- minantes citoplasmáticos y por una mátidas primitivas tienen núcleos vÍa que no altere el volumen nuclear. esféricos de só1o 25 micrómetros cúbi- La fligura 3 indica esquemáticamente cos y, a medida que progresa la esper- los pasos seguidos para el aisiamiento miogénesis, eI núcleo se transforma y purificación de ios núcleos de las enunaelipsoidecuyoejelongitudinal células testiculares de1 ga1lo. La se alarga progresivamente mientras homogeneización rompe 1as membraque el transversal se reduce, siendo el nas celulares y libera la mayoría de

tiene nücleos esléricos pequeños ¡' núcleos de forma irregular. Su contenido de ADN representa la mitad del

tozoides y que va acompañado de

cúbicos. Estas notables diferencias La figura 2 representa esquemáti- de volumen permiten separar 1os

camente distintas células

dife- sus diferentes velocidades de sedirenciación. Puede observarse la nota- mentación en el campo gravitatorio ble reducción del volumen nuclear a terrestre. medida que progresa la espermatogé- Antes de proceder a la separación del gallo en varios estadios de

propio de ias células somáticas. Estos núcleos pertenecen a las espermátidas redondas primitivas y a las fases iniciales de su diferenciación. E1 estadio IV corresponde a una fracción de

núcleos alargados con velocidad de sedimentación de 0,5 milímetros por Tru¡s

hora pertenecientes a las espermátidas alargadas y a los espermatozoides

tas en estos geles. La ilustración 5 muestra la fo-

tografía de las bandas correspondientes a las cinco histonas (H1, H2B, H2A, H3 y H4) obtenidas de la cromatina de las

testiculares. Hemos designado como estadio V la fracción de núcleos de espermatozoides obtenidos

del conducto deferente.

tintos estadios de diferenciación. La proporción de las diferentes histonas no se modifica a Io largo de la espermatogénesis. La his-

DEFERENTES

metros por hora. En relación con el contenido deADN, la cantidad de proteínas básicas, proteínas no histonas y ARN varía a lo largo de la espermatogénesis del gallo. La

tona H1 muestra varios subcomponentes con las

movilidades electroforéticas características de es-

ta especie. Componentes de menor movilidad que la histona H1 están presentes en Ia fracción co-

HOIVIOGENEIZACION SACAROSA ISOTONICA

relación entre las proteínas básicas y el ADN permanece constante (alrededor de la unidad) en los

estadios iniciales,

células germinales en dis-

\\ \ \

f,r,

Esta fracción sedimenta a la misma velocidad que lo hace la fracción nuclear de espermátidas alargadas y espermatozoides testiculares, es decir, a 0,5 milí-

.=:

rrespondiente a las esper-

mátidas alargadas. Otro cambio aparente en la elec-

es-

troforesis de las histonas en estas células es una banda de menor movilidad electroforética que las dos bandas }I4. La concentración de este componente

v I

permatogonias, esperma-

tocitos y espermátidas primitivas, y desciende aproximadamente a la

ULTRACENTRIFUGACION SACAROSA ALTA DENSIDAD

mitad en los estadios finales, espermátidas alargadas y espermatozoides. El contenido de proteínas no histonas permanece elevado en las espermatogo-

aumenta durante Ia espermiogénesis a expensas de las dos bandas H4 presen-

tes en los estadios ante-

/-\ (.rl\ /1\

nias y espermatocitos, ini-

) ,l¡\ t./ .l\) \ vt,( \/(

cia el descenso en

las espermátidas primitivas,

r,' -/J --\- l,/

disminuyendo drásticamente en las espermátidas alargadas y espermatozoides. La cantidad de ARN

varía paralelamente al contenido de proteínas no histonas luéase la figura 51. Provocando la lisis de los núcleos y lavándolos suce-

sivamente con disolucio-

nes de concentraciones iónicas decrecientes, obtuvimos la cromatina corres-

pondiente a las distintas fases de la diferenciación. El análisis de la composi-

ción de la cromatina mostró cambios similares a los observados en los núcleos. Estos resultados son com-

AISIAMIEI\r'TO y purificación de nucleos de células testiculares del gallo. El testículo del gallo es un órgano intraabdominal y, a diferencia de lo que ocurre en los mamíferos, la espermatogénesis transcurre a la temperatura interna del animal (42 grados Celsius). Cuando alcaraza su máximo desarrollo en pri3.

mavera, el testículo pesa unos 25 gramos y contiene un extraordinario número de espermátidas (245 x 10J espermátidas por gramo). Inmediatamente después de sacrificar al animal se separan los testículos, se diseca la cápsula que los enlrrelve, se corta el tejido en pequeños fragmentos y se homogeneizapara romper las membranas celulares y liberar los núcleos. Los nú-

cleos son separados del resto de los componentes celulares por ultracentrifucación a través de una disolución concentrada de sacarosa. Los conductos deferentes, a la derecha del esquema superior, son sometidos a los dos mismos procesos de homogeneización y ultracentrifugación para purificar los núcleos de los

espermatozoides.

riores. La heterogeneidad electroforética de la histona H4 ha sido atribuida a

diferentes grados de ace-

tilación de la molécula. El patrón electroforético de las proteínas básicas de las espermátidas

alargadas muestra, además de las histonas citadas, una proteína básica con una movilidad electro-

forética mucho mayor. Dicha banda corresponde a la protamina del gallo. En los espermatozoides

obtenidos del vaso deferente, la protamina es la única proteína básica de la cromatina, no existiendo histonas. M. Nakano, T. To-

bita y T. Ando estudiaron la protamina del gallo, con-

siguiendo aislar, entre los años 1970 y 1975, ocho com-

otros largo de la espermatogénesis del ponentesdistintosysecuenciarvarios citoquí- gallo,extrajimosdichasproteínascon de ellos. Cuando aislamos la protamicos en diferentes especies animales ácido sulfúrico y las separamos por mina del gallo en 1974, sospechamos (crustáceos, equinodermos, artrópo- electroforesis en geles de poliacrila- que la heterogeneidad electroforética dos, peces, anfibios y distintos mamí- mida en presencia de urea. Las pro- demostrada por aquellos autores feros). teínas básicas con diferente número podía ser un artefacto atribuible a parables a los obtenidos por autores utilizando métodos

el proteólisis, por lo que tratamos de distin- inhibir la actividad proteolítica y, al

Paraanalizarcualitativamentelas de cargas positivas migran hacia

proteínas básicas de la cromatina a lo polo negativo con velocidades CoxsrnuccróN o¡ uN

Se n

Vlvct

,1.5

1a protamina del gallo intacta. Utilizando el mismo procedimiento independientemente, T. Ando y coiaboradores confirmaron nuestro resultado y obtu-

conseguirlo, logramos aislar

vieron para la citada protamina la secuencia de aminoácidos mostrada en ia figura 7.

para investigal los cambios cualiI tativos que experimentan 1as ploteínas no histonas de la cromatina durante la espermatogénesis, disociamos estas mo1écu1as del complejo cromatínico y Ias analizamos electroforéticamente. Las proteínas de 1a cromatina pueden disociarse disoh.iéndolas con la ayuda de un detergente

tado las proteínas de la cromatina de las céIulas germinales de1 gallo en distintos estadios de diferenciación. Las bandas existentes en los estadios iniciales (espermatogonias y espermatocitos) son muy similares. En estas células existe una considerable heterogeneidad en las bandas de elevado peso molecular (80.000-200.000). En

viamente separados por velocidad de sedimentación unidad. Observamos

ias espermátidas primitivas, cuatro bandas de elevado peso molecular y

desaparición de las bandas de elevado peso molecular ¡r una reducción considerable de 1as bandas comprendidas entre los pesos moleculares 32.000 y

que 1a mayoría de las proteínas no his-

tonas de la cromatina de las células testiculares del cobayo con pesos moleculares superiores a los 75.000 dalton eran características de las espermatogonias y espermatocitos. En las espermátidas se observó la

las bandas de pesos moleculares 72.000,52.000, 40.000 v 28.000 mues-

tran menor densidad. En las

42.000. Los espermatozordes mostraron una ulterior leducción de las proteínas no histonas. L. S. Hnilica y sus colaboradores obtur,iei'on resultados

esper-

mátidas alai:gadas, doce componentes de elevado peso molecular y tres ban-

das de pesos moleculares 80.000,

similares con

74.000 y 40.000 disminuyen drástica-

cé1ula,q de

testÍculos de

de carga negativa. el dodecilsulfato sódico. ljna vez disociadas las distintas cadenas polipeptídicas quedan recubierlas con las calgas negativas

mente, mientras que cuatro cadenas polipeptídicas de pesos moieculares

rata separadas porel método de veiocidad de sedimentaciór-r unidad. Las

86.000, 70.000, 68.000 ¡. 46.000

proteínas de peso molecular superior

del detergente 1- pueden separarse en eI campo eléctrico creado a trar-é.c de un gel de poliaclilamida. Las molécuias migran hacia el polo positivo a través de los poros de1 ge1 con lelocida-

só1o son

des que dependen de sus

pesos

moleculares. En el laboratorio del Depal'tamento de Biología Celular dei Ba¡1ol Co11ege

of Medicine en Houston. Tera-.. en colaboración con Ching Sung Telig. analizamos por el procedimiento ci-

a 8,1.000 eran caracterrstica-c de los espermatocitos ¡r desaparecían junto a 1as bandas de pesos rnoieculares

aumentan. En 1os espermatozoides l,isibles

bandas. ctl)'os pesos

moieculares se hallan comprendidos entre 36.000 ¡,- 70.000. En experimentos llevados a cabo anteriormente. entre 1972 v 1974. en el Labolatorio cle Fisiología de 1a Facultad de fledicina de la Univei'sidad de Barcelona. en colaboración con S. \ridal-Sir-illa. obtur-imos por'

53.000 ;, 31.000 en las espermátidas.

. f\re relacion rsi:te elltl'e los ¿ kÚ cambios obset 'arl.. err las pro-

teínas de Ia cromatina r- la actividad genética de las distintas cé1u1as germinales? Para investigal esta lelación estudiamos Ia síntesis de ácido ribo-

clomatoglafía en hidroxilapatita las ploteínas no histonas de núcleos de cé1uias testiculares de cobavo. pre-

nucleico durante 1a espelmatogénesis del ga1lo. Para detectar dicha síntesis

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VELOCIDAD DE SEDII\4ENTACION 4, SEPAR"A,CION DE NUCIJOS de células testicufares de gallo por el método de la velocidad de sedimentación a fuerza de grave' dad unidad. Consta esencialmente de un formador de gradientes, representado en la parte superior del esquema, y de una cámara de sedimentación cilindrocónica. La suspensión nuclear se introduce en la cámara de sedimentación a través de la jeringa representada a la izquierda del esquema, y es segrrida de inme46

diato por el gradiente de sacarosa. La muestra forma una delgada capa en la superficie del gradiente y los núcleos sedimentan espontáneamente con velocidades tanto mayores cuanto mayor es el volumen nuclear. Después de 3 o 4 horas de sedirnentación, se obtienen cuatro capas (una por velocidad), representadas aquí en distintos colores, que son recogidas y caracterizadas por criterios morfológicos y de composición química. TEN,TAS 3

en las diferentes células germinales, incubamos las células in uitro con un

precursor del ácido ribonucleico, la

1,0

uridina marcada con tritio. Deter-

0,8

minamos luego Ia cantidad de ácido ribonucleico radiactivo presente en Ios diferentes tipos nucleares separados por el método de velocidad de sedi-

mentación unidad. Otro procedimiento utilizado consistió en aislar primero los núcleos y determinar des-

pués su capacidad para sintetizar

0,6

a a I.JJ

ó c

ARN a partir de los correspondientes nucleótidos. También incubamos pe-

a ul

queños fragmentos de tejido testicular

con uridina tritiada, determinando ulteriormente por autorradiografía e1 ácido ribonucleico radiactivo existente en 1os núcleosLos distintos métodos mostraron que la síntesis del ARN ocurre en los núcleos de las espermatogonias, espermatocitos y espermátidas primitivas del gallo y cesa cuando los núcleos de 1as espermátidas inician 1a metamorfosis que dará lugar a los espermatozoides. No hay, pues. síntesis de ARN en los núcleos de las espermátidas alargadas y de los espermatozoides. Observaciones simi-

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ESTADIO DE LA ESPERMATOGENESIS

cial merecen los estudios ller.ados

coMPosICroN QUTMICA DE Los NUCLEOS aislados de células testiculares del gallo en distintos estadios de diferenciación. La cantidad de proteÍna sbásicas (azul intenso), proteínas no histonas (rosa) y de ácido ribonucleico (en color azul púlid.o) desciende a medida que avanza la espermatogénesis.

T. Tres, quienes visualizaron el proceso de síntesis de ARN con el microscopio electrónico. Las espermatogo-

histonas de la cromatina. Cuando esta pérdida tiene lugar, todos los

lares se han realizado en distintas

especies animales. Una mención espea cabo por A. L. Kierszenbaum ¡- Laura

nias, los espermatocitos -v

1as

espermátidas redondas del ratón sintetizan ARN. Las moléculas de ARN

aparecen en múltiples puntos de la cromatina de las células meióticas v premeióticas y sólo en algunos puntos de las espermátidas primitir.as. No se

observó síntesis de ARN desde el momento en que Ias espermátidas inician el proceso de diferenciación a espermatozoides. a presencia de proteinas no histonas en los núc'leos de celulas germinales activas en la transcripción y su ausencia en fases avanzadas de la

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espermiogénesis, donde cesa toda actividad genética, es un hecho cons-

tante en 1a espermatogénesis

diversas especies. En las células gené-

ticamente activas, ias proteínas no histonas podrían desempeñar distintas funciones en el proceso de la síntesis del ácido ribonucleico nuclear heterogéneo y en Ia formación, transporte y estabilización de los ácidos ribonucleicos mensajeros. El cese de la actividad genética en

las espermátidas podría relacionarse con la pérdida de las proteínas no Coxslnucctóx

DE uN SriR

VIVo

ácidos ribonucleicos mensajeros responsables de la diferenciación celu-

lar ya han sido sintetizados. El genoma de las espermátidas despro-

visto de Ia mayoría de las proteínas no histonas características de los estadios precedentes queda convertido en watabula rasa q:ue sólo será objeto de nueva programación específica durante la embriogénesis. Le Stourgeon y sus colaboradores han demostrado que la transición de células genéticamente activas a células genéticamente inertes en distintos modelos experimentales comporta la desaparición de las proteínas no histonas de elevado peso molecular, la disminución de un componente de peso molecular 52. 000, posiblemente

tubulina, y el incremento de una banda de peso molecular 46.000 identificada como actina. Las proteínas que forman parte de las partÍculas que contienen el ARN nuclear heterogéneo desaparecen.

Para investigar Ia relación existente entre las proteínas no histonas y la expresión genética resulta imprescindible car acterizar individualmente dichas proteínas y establecer

su posible relación con los procesos de replicación, transcripción y recom-

binación genética. Una proteína no histona, posiblemente relacionada con eI fenómeno de la recombinación genética en las células meióticas del

lirio, fue aislada y caracterizada por Y. Hotta y H. Stern. Dicha proteína se unía con gran afinidad al ADN de una sola cadena y facilitaba el proceso de apertura y cierre de la doble hélice. En 1971, en el Departamento de Química Macromolecular de la Universidad Politécnica de Barcelona, investigamos, en colaboración con J. A. Subirana, la presencia de una proteína similar en las células germinales de la gónada macho de equinodermos del género Holoturia. La proteína se encontraba en las célu-

las germinales, pero no era detectable en un tejido somático de los mis-

mos animales. Y. Hotta y H. Stern extendieron sus observaciones a distintos mamíferos, incluido el hombre,

y demostraron que la proteína

en cuestión estaba presente únicamente en los espermatocitos, pero no en otras

células testiculares o en células somáticas. En muchas especies animales, además de la pérdida de proteínas no his47

tonas y del cese de la actividad genética, se produce en las espermátidas

una intensa reorganización de la estructura de la cromatina. En efecto,

las histonas responsables del empaquetamiento del ADN en todas las células del organismo son desplazadas

H-)

del núcleo de las espermátidas y su lugar lo ocupa una nueva proteína altamente básica, la protamina. El complejo ADN-protamina (nucleoprotamina) tiene un grado de compacta-

ción mucho mayor que el complejo A.DN-histonas (nucleohistona). ¿Cómo

ocurre la transición de una a otra forma de empaquetamiento? La pérdida de proteínas nucleares

y las modificaciones químicas que éstas experimentan antes de ser desplazadas podrían dar lugar a la exposición de sitios delADNbloqueados en estadios anteriores de la espermato-

génesis. Para investigar esta posibi-

Iidad inyectamos actinomicina D radiactiva en testículos de gallo iru uiuo y determinamos la cantidad de actinomicina que se unía a la cromatina de las diferentes células germi-

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nales. La unión de la actinomicina es proporcional al número de sitios del ADN expuestos en la cromatina. La unión de actinomicina D es máxima

en las esperm;itidas

alargadas,

donde, en relación con los estadios precedentes, la cantidad de proteínas de la cromatina es mínima. la misma conclusión por l.r., método totalmente distinto.

/-\btuvimos

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Preparamos ARN polimerasa bacteriana y calculamos el número de sitios donde la polimerasa puede iniciar la síntesis de ARN en Ia cromatina de diferentes células germinales. El máximo número de sitios de iniciación y, por tanto, la máxima exposición del ADN, correspondía a las espermátidas alargadas. Nótese que no existe relación entre el número de sitios de iniciación para la síntesis de ARN ln uitro por la polimerasa bacteriana y la síntesis de ARN que tiene llugar in uiuo, pues en estas células no hay transcripción nuclear. Estudiamos, además, la afrnidad de las diferentes cromatinas hacia la polimerasa bacteriana, así como la cinética de Ia

unión polimerasa cromatina. Estos estudios y los realizados con la ARN 6. HISTONAS extraídas de la cromatina de núcleos pertenecientes a células testiculares de gallo en distintos estadios de diferenciación (I a IV). Las histonas fueron separadas por elecf,roforesis en geles de poliacrilamida en presencia de urea. El gel de la izquierda (7) muestra el patrón obtenido con las histonas extraídas del embrión de pollo de 11 días y se ha utilizado como referencia. obsérvese asimismo el cambio registrado en la intensidad de las bandas H4 (b, c) en las espermátidas y la aparición de un componente adicional con menor movilidad electroforética (a\, co' mo consecuencia protrable de la acetilación. 48

polimerasa eucariótica de germen de trigo demostraron que una parte del ADN de la cromatina de las espermátidas se comporta como el ADN aislado y desprovisto de proteínas. La exposición del ADN en las espermátidas ha sido también observada por métodos citoquÍmicos. T¡trl,A.s 3

Nuestras investigaciones revelaron que el proceso de transición de nucleohistona a nucleoprotamina no suponía un bloqueo progresivo de sitios del ADN expuestos en estadios previos de

Ia espermatogénesis, como habían propuesto otros autores, sino que el proceso tenía lugar en dos fases. En una fase inicial, que podríamos denominar de desempaquetamiento de la nucleohistona, se producía una mayor exposición del ADN en la cromatina de las espermátidas, mientras que en la fase final del empaquetamiento de

la nucleoprotamina tendría lugar un bloqueo total del ADN en el núcleo de los espermatozoides. Esta hipótesis planteaba dos interrogantes: por una parte, ¿qué mecanismos protegen al ADN expuesto de Ias espermátidas frente a las distintas agresiones del medio que pueden alterar el mensaje genético de estas células? Las radiaciones ionizantes,

diversos agentes quÍmicos con potencial mutagénico y las nucleasas ejercen su acción en regiones de la cro-

matina donde la estructura del complejo nucleoproteico determina una mayor accesibilidad al ácido nucleico. La segunda cuestión era la siguiente: ¿cómo es posible desempaquetar la

nucleohistona manteniendo el ADN en un estado relativamente compacto, dado el reducido volumen nuclear de las espermátidas? Debe tenerse en cuenta que el ADN es una molécula rígida, cuyas cadenas se aproximan difícilmente por Ia repulsión eléctrica de los grupos fosfato cargados negativamente y, en condiciones normales, tiende a la expansión, no a la com-

H,'H

pactación. Un problema similar se plantea en el empaquetamiento del ADN en la cabeza de los bacteriófagos. En algunos de estos virus, el problema se ha resuelto por la presencia de las poliaminas naturales espermina y espermidina. La espermina, con cuatro cargas positivas, y la espermidina con tres, neutralizan los grupos fosfato del ADN, dan flexibilidad a la molécula y contrarrestan su ten-

o",oH

7. SECUENCIA DE AMINOACIDOS de la protamina del gallo. De los 65 aminoácidos que la componen, 38 son argininas y están distribuidas a lo largo de la molécula, dispuestas en gTupos de 2, 3, 4, 5 y hasta 6 residuos. La secuencia se otrtuvo por T. Ando y sus colaboradores. Intercaladas entre las argininas, hay 11 serinas. El equipo de G. H. Dixon demostró que la fosforilación de las serinas y su defosforilación juegan un papel importante en la unión de la protamina al ADN.

dencia a la expansión. Crean, por

üanto, las condiciones propicias para

la compactación del ADN. Además,

poliaminas naturales podían jugar un papel esencial en Ia transición nucleo-

las poliaminas ejercen sobre el ADN bacteriano y en la cromatina de los organismos superiores una potente acción antimutágena.

figura

función protectora de las poliaJI-¡l aminas y

su función estructural

podrían constituir la respuesta a los dos interrogantes planteados anteriormente. En el año 1977 postulamos como hipótesis de trabajo que las CoxsrnuccróN os uN Ssn Vtvo

histona-nucleoprotamin a lu éase la 81. Los análisis revelaron la presencia de poliaminas, especial-

mente espermina, en los núcleos de las espermátidas del gallo. Los sistemas enzimáticos requeridos para su síntesis

encuentran probablemente

en las células de Sertoli, según los resultados de las investigaciones rea-

lizadas en la rata por Roger W. Turkington y sus colaboradores y de nues-

tras propias investigaciones en el gallo. Es conocida la íntima relación entre las células de Sertoli y las espermátidas [uéase la figura 1], por 1o que los autores citados postularon la posible transferencia de poliaminas desde la célula de Sertoli a las espermátidas. La actividad de la primera enzima de la cadena biosintética de las poliaminas, la ornitindescarboxilasa, aumentaría por la acción de la hormona FSH sobre las células de Sertoli. 49

diaron algunos de los procesos implicados en dicho desplazamiento. Uno de estos fenómenos consiste en 1a acede ias histonas. modificación química al parecer necesaria para el desempaquetamiento de la nucleohistona en las espermátidas. La ace-

tilación

tilación supone la neutralización

determinadas cargas positivas de Ias histonas y! en consecuencia, la disminución de la interacción entre estas moléculas y eI ADN. A diferencia de 1o que ocurre en las células germinales genéticamente activas, en las que se detectaron actividades enzimáticas de acetiiación ¡r desacetilación de las histonas, con un recambio rápido de los grupos acetilo, en las espermátidas, si bien está presente la activi-

dad acetilasa, la actividad desace-

tilasa es muy pequeña o no existe, por lo que el recambio de 1os grupos acetilo es prácticamente nulo. Se observó. además. que la espelmina ejerce un notable efecto estimulante sobre la actividad acetilasa de la cromatina, mientras que a elevadas concentraciones inhibe 1a actividad desacetilasa. EI incremento de 1a concentración

NH] NH] l-)' CH, 'r CH. CH, CH^ CH, CH. t_)' NHi NH] NH] ll

de poliaminas en el núcleo de las espermátidas podría explicar Ia intensa acetilación de Ias histonas que

precede a su desplazamiento. Cuando las histonas han sido reem-

9H' 9H' 9H,

CH, CH, l¡

CH"

9H' 9H, cH, cH. lll

cH. cH-

plazadas por Ia protamina, el ADN del espermatozoide del gallo queda totalmente inaccesible a la actinomicina D y a la ARN polimerasa.v muestra un grado de compactación comparable al del ADN de la cabeza de los bacteriófagos.

NHI ruHl ¡lr-¡' 9r, 9H,

9¡,

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8. LA TRANSICION NUCLEOHISTONA-NUCLEOPROTAMINA tiene lugar en las espermátidas alargadas del gallo. El esquema superior muestra cómo la transición de una a otra forma de empaquetamiento supondría la exposición de sitios del ácido desoxirribonucleico (ADN) como consecuencia del desplazamiento, previa acetilación, de las proteínas de la cromatina. Las poliaminas naturales, fundamentalmente la espermina y la espermidina, mantendrían el AI)N en un estado de compactación relativa y lo protegerían mientras tiene lugar el empaquetamiento definitivo en forma de nucleoprotamina. Las fórmulas químicas correspondientes a las poliaminas espermina, espermidina y putrescina con 4, 3 y 2 cargas positivas, respectivamente, se han representado a la izquierda del esquema.

En experimentos realizados i¿ uitro, concentraciones de espermina superiores a 2 milimolar inhibían la síntesis de ARN en una mezcla de ARN polimerasa de germen de trigo y cromatina de células germinales. Las mismas concentraciones inhibían completamente la acción de las nucleasas sobre la cromatina. Las poliaminas podrían, pues, bloquear in uiuo los sitios de iniciación para la síntesis 50

de ARN y proteger al ADN expuesto frente a la acción de las nucleasas y

otros agentes. Aún no conocemos el mecanismo mediante el cual son desplazadas las histonas y proteínas no histonas de la cromatina de las espermátidas. En el Laboratorio de Fisiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Barcelona, y en colaboración con J. Mezquitay S. Vidal-Sivilla, se estu-

ADN de los espelmatozoides, en condiciones. puede afron-

tar la"rar. aventura de saiir al medio externo en busca del óvulo sin riesgos de alteración de1 mensaje genético que transporta. Su volumen diminuto y su forma altamente hidrodinámica le permitirán realizar e1 desplazamiento con Ia máxima economía energética.

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AcTDIC PRoTEINS oF rHE Nrcm-s. Dirigido por I. L. Clamerot.t ¡' J. R. Jeter. Aca-

demic Press.

197"1.

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nt¡c Sp¡nNl,cI-oGENESIS t-x N{rruntrc RoosrER TESTIS A¡'D DF.\lo\STRATED B) THE INITIATToN PATTER\ o¡ RtguxucLErc Actu Svxrn¡sts ¡,r' l'rrHo. Cristóbal Mezquita 1'Ching Strng Teng en l/re Biochetnical Journul. r,olumen 170. páginas 203-210. 1977.

Teu.qs

Las histonns, proteínas reguladoras de genes Michael Grunstein

Reputadas antaño puro material de empaquetamiento del ADN nuclear, estas proteínas estdn capacitadas

para ejercer unq doble misión: bloquear

la octivación de muchos genes o pronlor)er, por contra, su expresión

T as histonas se comblnan en el ! . núcleo de la celula con largas ,I¿f hebras de AD\. que contienen los genes, para formar Ia cromatina, el material que constituve los cromosomas. No hace mucho que todar.ía se suponía que esas proteínas pequeñas no intervenían en 1a regulación de los genes y tenían Ia misión exclusiva de servir de material de empaquetamiento celular. Venían a ser

una suerte de "bobinas" dotadas de carga positiva, a cuyo alrededor se enrollarían las hebras de ADN cargadas negativamente para así poder

encaiar en el interior del diminuto núcleo celular.

Pero la investigación tenaz acaba de demostrar que nos hallamos ante partícipes activos en Ia regulación de los genes. Un tipo por lo menos de histonas colabora en la activación: a1-uda a iniciar la copia, o transcripción, de Ia información almacenada en ADN a

las moléculas del ARN mensajero. (Estos transcritos son los moldes a partir de los cuales se sintetizan las

Ias células de un organismo en desarrollo presente la misma dotación de genes, Ia diferenciación hará que unas se conviertan en neuronas, otras en células sanguíneas y unas terceras en hepáticas, por ejemplo. El estado final varía en gran medida por Ia activación, o desactivación, de distintos genes en e1 instante apropiado, produciendo mezclas peculiares de enzimas o proteínas que confieren a cada céiula sus propiedades características. El ahondar en el proceso de activación y en el de represión de los genes nos faciiitará desentrañar el motivo por el que fallan a veces los controles de dichos procesos, con resultados patológicos. A modo de ejemplo, el cáncer puede originarse por cuipa de una actividad desbordada de los genes cuyos

productos proteicos promueven Ia replicación de 1as células o por culpa de ia inactir.idad anómala de los genes que suspenden

replicación.

Las funciones reguladoras de las

istonas repri men

histonas pasaron inadvertidas hasta hace poco. Influ¡-ó en ese retraso el haberse conseguido la transcripción

también la transcripción. En resumen, si queremos conocer el meca-

tras exponer ADN desnudo (libre de histonas) a extractos celuiares que

proteínas.) Ciertas

nismo de control de los genes hemos de atender al comportamiento de las histonas.

El interés por el mecanismo de activación y desactivación génica obedece, en parte, a que constituye Ia condición para adentrarse en el desarrollo embrionario de los organismos pluricelulares. Aunque 1a mayoría de

contenían proteínas reguladoras

se-

leccionadas. Ante el éxito de los experimentos "sin células enteras". se concluyó que, en los organismos, Ias histonas no participaban en Ia regu-

lación génica. La falsedad de la conclusión no fue óbice para que ese tipo de estudios, y otros, permitieran adentrarse en los mecanismos de activación de los genes. Investigaciones que,junto con Ios

MICHAEL GRUNSTEIN, de origen rumano, enseña, desde 1975, biología molecular en la Universidad de California en Los Angeles. Inició su formación en la Universidad de McGiIl y la culminó con el doctorado en la de Edimburgo, en 1971.

CoNsrnuccróN og uN Spn Vrvo

análisis estructurales de ia cromatina, prepararon el camino que terminó conduciendo al descubrimiento de la importancia de las histonas. Desde muy pronto se estableció que

Ios genes de las células eucariotas (nucleadas) poseían, por los menos,

tres segmentos especializados. Entre éstos se encuentra, naturalmente. Ia región codificadora, que especifica la secuencia aminoacídica de una proteí-

na. Los otros son regiones distintas que influven sobre el segmento de codificación r. determinan si éste ha de copiarse en ARN mensajero y cuántas moléculas de ARN deben sintetizarse.

f)ara que un gel se acrive. ha de I constituirse un grupo especial de proteínas en una región reguladora, que suele recibir el nombre de región promotora proximal. De entrada. una proteína se une a cierta parte de dicho promotor, 1a caja TATA. Después se van unciendo otras proteínas a la primera, dando lugal a una combinación de proteína y, ADN: el complejo de preiniciación. La caja TATA debe su denominación a la secuencia nucleotídica TATA-A-4TA, porque Ia abarca en cierto grado. Los nucleótidos, que son los sillares de1 ADN, se distinguen por su base química: timina (7), adenina (A), guanina (G) o citosina (C). l-Ina vez formado, el comple.jo de preiniciación coloca a uno de sus integrantes enzima ARN polimera-ladel promotor proximal, en sa- dentro el lugar de iniciación de la transcripción. La polimerasa, bien aloiada, ayat\za y retrocede a Io largo de la región codificadora (a modo de vagoneta sobre los raíles), sintetizando ARN mensajero. El reconocimiento del ADN por las proteínas del complejo de preiniciación, si se dan las condiciones adecuadas, genera en el tubo de ensayo una transcripción con un nivel bajo, o basal; de ahí viene que a estas proteínas se les llame factores basaies.

Otras proteínas, las activadoras, se engarzan' en un segundo lugar regu-

Iador: en la secuencia activadora

curso arriba del ADN ("upstream"); el acoplamiento desencadena la producción máxima de mensajero. En muchos organismos eucariotas, las secuencias activadoras curso arriba del ADN responden también al nombre de intensificadores ("enhancers").

a investigación de la química y la

I-¿l estructura

de la cromatina había determinado, desde hacía tiempo, las cinco categorías fundamentales de histonas: H1, HzA, H2B, H3 y H4. Se demostró luego, por cristalografía de rayos X y otras técnicas, que las "bobinas" donde se arrolla el ADN eran

octámeros, constituidos por ocho de la histona H4, moléculas con dos de las histonas combinadas-dos H3, H2A y H2B. Una cinta formada por 146 nucleótidos de ADN da dos vueltas casi enteras alrededor del octámero, o núcleo de la histona; la unidad resultante es el nucleosoma. En Ia mayoría de los eucariotas, el

ADN queda aún más anclado al sitio

de diámetro; los arrollamientos abar-

por una sola molécula de H1. Esta histona, además de agarrarse a la superoctámero, se traba también con ambos

6 nucleosomas porvuelta. Lo cual contrasta con la cromatina de la levadura de panadero que, en su mayor parte, permanece desplegada;

tramos de los flancos, o "conectores"

parecida

ficie externa del ADN que rodea el

("linkers"), del ADN que ligan un nucleosoma a otro. Pero la histona H1 no es imprescindible para la forma-

ción de los nucleosomas. Citemos, como botón de muestra, la levadura de panadero o de cerveza (Saccharo' myces cereuisiae); este eucariota unicelular, que ha prestado tantos servicios aI conocimiento de la regulación génica, produce muy poca histona, si es que la produce; Io que no impide que abunden los nucleosomas en los cromosomas de Ia levadura.

Por otra parte, Ia H1 parece promover la compactación delADN en los organismos pluricelulares. En sus células, buena parte de la cromatina se arrolla en fibras de unos 30 nanómetros (mil millonésimas de metro)

canunos

un cordón (ADN) con nudos

(nucleosomas), mide, en su mayor parte, 10 nanómetros de diámetro: la talla de un nucleosoma. Hacia mediados de los años ochenta, algunos habían comenzado a poner a prueba una idea controvertida, la de la posible intervención, en Ia regulación génica, de otros miembros, amén de las cajas TATA, de los elementos

activadores curso arriba del ADN y las proteínas especializadas que se ligan a ellos (Ios factores basales y las proteínas activadoras). Las histonas podrían tener también algún papel. Veinte años antes, algún que otro trabajo había apuntado la posibilidad de que las histonas bloquearan la transcripción. Pero las pruebas eran muy endebles.

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1. PROTEINAS IIISTONAS HB (azul) y H4 (aerde), capaces de doblar el ADN (anillo pardo dorodo alrededor d.e las histonas) en este corte fino, de delante hacia atrás y a través de un mapa tridimensional de un nucleosoma. Los nucleosomas consti-

€ tuyen un rasgo estructural característico de los cromosomas de todas las células nucleadas. Se ha demostrado que las histonas ejercen funciones reguladoras de las actividades de los genes contenidos en los cromosomas. TEI'{AS 3

permitía estudios más definitivos. Concurría, además, cierto descubri-

tos libres de células, las proteínas moléculas que se activadoras

en el papel desempeñado por las histonas en las células vivas. HabÍa que responder a cuestiones del tenor si-

miento relacionado con la evolución. Los

unen

arriba del ADN- ejercerían verosímilmente una influencia disociadora en los nucleosomas. Ya en 1984, Beverly M. Emerson y Gary Felsenfeld

guiente: ¿se incorporan siempre de

análisis de las secuencias aminoací-

Atenor

En los ochenta, el progreso científrco

dicas de las histonas ponían de manifiesto que las proteínas del núcleo histónico apenas diferían de una especie a otra. De manera palmaria, las histonas del guisante se parecen llamativamente a las de la vaca. Siempre que la estructura de una molécula varía en un mínimo grado de una especie a otra, se entiende que su secuencia de

aminoácidos reviste sumo interés para el funcionamiento de la célula. Si las histonas limitaran su misión a

servir de instrumento para el plegamiento del ADN, cualquier secuencia, o casi, rica en aminoácidos cargados positivamente podría valer para plegar el ADN, dotado de carga negativa; no hubiera sido necesario conservar, con semejante rigor y a lo largo de millones de años, las secuencias de aminoácidos.

TIll sólido resoaldo oue avala la idea lA d" lu irrtervención de las histonas en el control génico procede, en parte,

de los estudios en medios libres de células. En 1986, Joseph A. Knezetic y Donald S. Luse combinaron histonas con moléculas de ADN que contenÍan genes de un adenovirus humano. Cuando introdujeron fracciones de las células humanas que incluÍan los factores basales (entre ellos, ARN polimerasa), Ios nucleosomas recién for-

mados impidieron que los factores incoaran la transcripción.

El grupo de Roger D. Kornberg demostró entonces que la inclusión selectiva de cajas TATA en los nucleosomas evitaba que IaARN polimerasa

iniciara la transcripción. Kornberg

otras pruebas con extrac-

-las activadoras curlas secuencias

habían demostrado que las proteínas que se unían a secuencias reguladoras del ADN obstaculizaban la formación de nucleosomas en esos sitios. Más tarde, Luse, Robert G. Roeder y otros generalizaron, cada grupo por su lado, esa idea. Demostraron que las histonas y los factores basales competían por acceder ala cajaTATA. En estos laboratorios se modificó el orden de exposición del ADN a histonas y factores basales. Pues bien, la transcripción sólo se producía si se concedía a los factores Ia oportunidad de asociarse con los elementos 7i4?i4 antes de añadir las histonas. Las histonas ganaban, por contra, cuando los

competidores se añadían al ADN simultáneamente. En el curso de esa serie de experimentos, Jerry L. Workman, Roeder y su equipo de la Rockefeller se apuntaron un curioso hallazgo. Sus datos sugerían que, si el ADN se exponía simultáneamente a histonas y extrac-

Considerados en conjunto, estos resultados indican que las histonas podrían colaborar en la represión de los genes dentro de células enteras. Sin

suspender del todo la transcripción dentro de la región codificadora, podrían evitar que los factores basales encerrasen el ADN. E inversamente, si los genes habían de activarse, parecía probable que las partículas núcleo de las histonas se desengarzaran de

la caja TATA. CoNsrnuccróN os uN Sen Vrvo

fican las enzimas galactoquinasa

(GALI) y la fosfatasa ácid.a(PHO5). Pusieron también de manifiesto que la activación de esos genes se acompañaba de la liberación, del ADN, de los nucleosomas asociados con las cajas TATA. Los investigadores sabían que se producía cierto grado de disociación en los genes activos, ya que las nucleasas (enzimas que rompen el ADN) cortaban con mayor elemento 7i4.7á, corte que sólo es posible si el ADN se endereza 1o suficiente para quedar expuesto a la acción de las nucleasas. Pero no acababa de quedar clara la relación causal. ¿Debíase a los cambios estructurales del nucleosoma la transcripción? ¿O eran acaso estos cambios una consecuencia del deslizamiento de la ARN polimerasa a lo largo del gen? A finales de los ochenta, mi laboratorio decidió abordar e1 problema de la manipulación de los genes de las histonas de la levadura. La biología y la industria cervecera habían descifrado ya buena parte de la dotación génica de ese organismo; así que opta-

histona

Hl in uitro.

¿Qué sugeúan esos resultados? Una

teínas activadoras podrían colaborar, directa o indirectamente, a debilitar Ia unión entre histonas y ADN en las

venidas de la ARN polimerasa.)

soltura las regiones portadoras del

posibilidad del mayor interés: las pro-

cripción. (La investigación ulterior demostraría, sin embargo, que los nucleosomas podían frenar las idas y

grupos encabezados por Dennis E. Lohr y Wolfram Horz reunieron algunas de las pruebas más sólidas de la formación frecuente de nucleosomas enlas cajas TATA. Muchos genes de la levadura de panadero exponen, de manera regular, nucleosomas en el elemento TATA. Er;:tre dichos genes se hallan los que especi-

J lJ

les y proteínas activadoras, la suerte se inclinaba a favor de los factores basales. Estos se anclaban en las cajas TATA, a pesar de la presencia de histonas, e impedían así que las cajas TATA se itcorporasen en los nucleosomas. El grupo de James T. Kadonaga había demostrado con técnicas parecidas que los activadores bloqueaban la represión de la transcripción por la

D. Brown lograron, además, otro avan-

importante. Al inducir la formación de nucleosomas en el seno de la región codificadora, no se bloqueó la trans-

mados?

tos celulares dotados de factores basa-

y, de manera independiente, Donald ce

manera rutinaria las cajas TATA en los nucleosomas? ¿Reprime la partícula nuclear de histonas la transcripción cuando se ha unido a los elementos TATA? ¿Cómo podrían debilitarse los enlaces entre octámeros de histonas y ADN en los nucleosomas ya for-

células; en concreto, un activador podría alterar algún factor basal en el

complejo de preiniciación, capacitando a la proteína para disociar los nucleosomas y ganar acceso al elemento TATA. Los estudios con extractos celulares son muy útiles, lo que no significa que

los resultados reflejen, necesariamente y con precisión, el funcionamiento de las células en los organismos. Así pues, en paralelo con el trabajo sobre extractos celulares Iibres, y en ocasiones en respuesta a esa técnica, varios laboratorios, incluido eI mío de la Universidad de California en Los Angeles, se centraron

mos por é1. Como también resultó una

suerte el disponer entonces de herramientas que permitían hacer cortes y empalmes y combinar los elementos genéticos de las levaduras con fines experimentales.

Si logr:ábamos impedir la síntesis de las histonas, evitaríamos, pensábamos, que las cajas TATA de muchos genes normalmente reprimidos quedasen atrapados en los nucleosomas. Si en tales circunstancias se produjeran los ARN mensajeros de estos genes, habríamos demostrado que es la separación de las histonas lo que 53

Estructura del nucleosoma e forma un nucleosoma (n) cuando 1as histor-ras se combinan entre sí, haciendo que e1 ADN (e/

hLlto de lt rcpresentttcitin esqtrcnttitica) dé un par .1e vueltas en torno a1 compleio de histonas resultante. Est.r partícula, o núcleo nucleosómico, abarca

en su centro dos copias de la histona H3 (.azul) 1t crtras dos de la H,l (terde). El tetrámero H3-H1 está flar-rqueado por dos pares H2A-H2B, o dímeros lLlttttl' rillo q ptirpurn), uno de 1os cuales no se ve. Cad.r

molécula cle histona se provecta en una cola (cii¡t¿s pñlidts) clesde la partícula nuclear hacia el exterior,

preparada para interaccionar con otras moléculas.

(Se desconoce ia conformación eracta c1e la co1a.) En rnuchos or¡;anismos (quizá no en tcdos), Ia histona H7 (¿structura gris rt ln izquierLla) facilita el anclaje de ADN en 1a partícula nuclear. Nu-

cleosomas y ADN libre c1e histonas clue los mantiene unidos forman la cromatina (h-d). Al promover el em-

paquetamiento

de los

+ + \¡o¡l + + *.,*, ':i. +.';: +'. 'r i t+ NH¿ Ñri, NHz

mrcleosomas, 1a cromatina

(t o a enrollarse en fibras de 30 nanóme- Cf F tros (esquemn y microgrnfía rn b). Los ADN clengenes comprehdidos en el o tro de esas fibras de 30 nanómetros z

la histona H1 ayuda a

NHz PARTICULA NUCLEAR

LLl

DE LA HISTONA

de diámetro perm¿lnecen inactivos. zO E1 desenrollamiento de la cromatina o hasta alcanzar una conform¿rci(rn r1e 10 nanón-retros (c) la hace nrás propicia para 1a activación de los genes. Para clue los geues acaben tc¡rnánclose actir.os, el ADN debe desenrollar-

se parcialmente cle 1os nucleosc¡mas

por las secuenci.rs implicadas en la regulación génica (d).

posibilita la transcripción, no só1o en el tubo de ensayo sino también en las

células vivas. El t,allazgo indicaría también que las histonas pueden reprimir los genes en las células vivas. Min Han y LIng-Jin Kim suspendieron Ia síntesis de ias histonas adaptando una técnica diseñada por Mark Johnston. Introduj eron elementos leguladores del gen de la galactoquinasa en

regiones codificadoras determinan histonas. Sustituyeron entonces estos genes por las versiones normales en las células de levadura. Cuando las células así alteradas se cultivan en un medio enriquecido en g'l ucosa.la secuencia reguladora de 1a galactoquinasa evita Ia 1as

de los genes que

transcripción 5rl

de 1os genes asociados a

ella. Por tanto. para detener Ia síntesis de histonas Han v Kim sólo tenían que exponer a la presencia de glucosa la ler.adura alterada genéticamente.

emergente, que acaba desprendiéndose para convertirse en cé1ula independiente. Suspendida ia síntesis de histonas,

ias células de levadura alteradas

A principio del tratamiento. las la, celulas ati ar esaban distintos estadios del ciclo vital de ia levadura.

genéticamente reprodujeron su ADN una vez sin dificultad. Pero éste por-

A diferencia de

número habitual de nucleosomas. Y Io que enceraba mayor interés: 1os aná-

que ocurre con muchas cé1ulas de mamíferos (por ejemplo, las neuronas ). Ias células de levadura 1o

crecen sin solución de continuidad y se dividen (por gemación). a no ser que las condiciones ambientales amenacen Ia supervivencia de ias nuevas céiulas. Conforme Ios cromosomas de1 organismo se van duplicando durante Ia división celular, los dos conjuntos se segregan. Uno se entrega a la yema

taba aproximadamente ia mitad del Iisis de los productos de ia digestión con nucleasa indicaban que 1a mayoría de los nucleosomas que quedaban no ocupaban las posiciones acostum-

bradas; estaban, por contra, colocados aI azat. Más aún, nuestros haliazgos señalaban que las cajas TATA, habituaimente incluidas en los nucleosomas, se encontraban ahora en liberTr.rvr.ls 3

tad. De este modo, los cromosomas

asemejaban al ADN desnudo, satisfaciendo así nuestros requisitos expe-

rimentales. Han y Kim procedieron a medir la

cantidad de ARN producido por

muchos genes en levaduras deplecionadas de nucleosomas. En 1988 descubrieron que sólo los genes activado§ en respuesta a dicho vaciado nucleosómico pertenecían aI tipo inducible. Genes que permanecen silenciosos a no ser que Ia célula quede expuesta a un cambio en el nivel de un azúcar, un

SECUENCIA ACTIVADORA CURSO ARRIBA DEL ADN

PROMOTOH PROXIMAL

LUGAR INICIADOR

DE LA TRANSCRIPCION

\-----'4

aminoácido determinado u otro estímulo similar. A la inversa, los genes encargados de la intendencia doméstica, cuyos productos se necesitan permanentemente para el cumplimiento de las funciones celulares, no se activaron por encima de lo ordinario. Este último resultado no debe sor-

REGION CODIFICADORA

ARN POLIMERASA ARN MENSAJERO

3 PROTEINAS ACTIVADORAS

prender, si es correcta la afirmación de que los nucleosomas reprimen la transcripción. Es de esperar que los genes de uso continuo carezcan de

nucleosomas en sus cajas TATA, antes incluso de que se acometan los ensayos. Los procedimientos diseña-

dos para eliminar las histonas del ADN no tienen por qué afectarlos.

Ti\ I examen atento de los genes indu11 cibles proporcionó un apoyo más directo a la hipótesis de la represión. Por manipulación genética, Han y Linda K. Durrin descubrieron que, para muchos de esos genes, Ia eliminación de los nucleosomas en torno a las cajas TATA conüteía ala síntesis de

ARN mensajero, síntesis que movió

a pensar que los factores basales se hallaban unidos a }as cajas TATA.La transcripción se produjo faltando incluso secuencias activadoras curso arriba del ADN; ello indica que basta la eliminación de los nucleosomas asociados con las caj as TATA para iniciar

la transcripción en su nivel basal. Para algunos genes, sin embargo, hubo que restablecer la secuencia activadora curso arriba del ADN al

MODELO DE LAACTfVACION GENICAcentrado en elADNdesnudo, libre de histonas. Los genes incluyen una región codificadora (band.a ozul en el extremo d,e lo derecha en 7), qrue especifica la secuencia aminoacídica de una proteína, y dos regiones reguladoras importantes: el promotor proximal (band.o amarilla) y la se' cuencia activadora curso arriba del ADN (band.a aerd,e)l estas dos regiones deter' minan si se sintetiza o no la proteína codificada. El modelo sostiene que, si un gen tiene que activarse (2), las proteínas conocidas por factores basales (roJb) det¡en en' samtrlarse sobre la caja TATA dentro del promotor (segtnento amarillo en el ertre' mo de la izquierd.a\, Este ensamblaje coloca un factor basal -la enzima ARN polimerasa- sobre el punto de iniciación de la transcripción, o sitio I (segrnento otnarillo en el etctremo d,e la d.erecha), q10te capacita a la enzima para copiar, o transcribir, la información de la región codificadora en el AEN mensajero (el molde a partir del cual se sintetiza la correspondiente proteína). El ligamiento de las llamadas proteínas activadoras (aioleta en 3) a la secuencia activadora curso arriba del ADN se traduce en una ulterior estimulación del complejo basal (fleeha seg' mcnto.d.a) y eleva la transcripción a su glado máximo (flecho grueso). 2.

del ADN consiguen directa o indirectamente que el núcleo de histona se disocie de la caja TATA. La liberación de dicha partícula facilita que los factores basales se asocien a la caja TATA y formen un complejo de prei-

transcripción de nivel basal. En la segunda etapa, independiente de las histonas, los activadores esti-

fica una histona; codifica una enzima relaeionada con eI empleo de histi-

niciación, generando con ello una

transcripción en las células vivas. Ba-

ARN. En nuestra opinión, pues, muchos consiguen a veces la activación in uitro en ausencia de histonas porque podrían estar replicando sólo los episodios finales del proceso de acti-

sándonos en los estudiosin uitro,hemos propuesto un modelo mejorado, en dos etapas, para explicar la activación génica. En Ia primera, la etapa de activación dependiente de histonas, las pro-

teínas activadoras colocadas sobre la secuencia activadora corriente aruiba CoNsrnuccróN »s uN Sen VIvo

algunas células mutantes de levadu-

ras, eI segmento "transponible" TY, del ADN, se inserta cerca de Ia caja TATA del gerr HIS4. (HIS4 no especi-

objeto de que la transcripción alcanzara s1t velocidad máxima. Para mi grupo, semejante comportamiento debe entenderse en el sentido de que, al formarse los nucleo-

somas, las histonas reprimen Ia

tonas en la regulación génica. El grupo de Winston desarrolló su técnica a la sombra del descubrimiento del laboratorio de Gerald R. Fink: en

mulan el complejo de preiniciación para alcanzar la máxima síntesis de

vación.

En 1988 Fred Winston y su equipo reunieron otros datos celulares que denunciabanla implicación

de las

his-

dina, un aminoácido.) La inserción hace que la transcripción comience dentro del elemento TY y no por el gen

HIS4. Este error supone la producción de un transcrito sin sentido, incapaz de dirigir la síntesis de la proteí-

na His4. El grupo de Winston demostró que, si alteraba el número de copias de los genes de las histonas HZAy H2B en la levadura, se esquivaba el efecto re55

Experimentos iz vifro decisivos f,n las postrimerías de los años ochenta, el estudio realizado con .U extractos de células humanas evidenció que las histonas y los factores basales compelan por el acceso a las cajas TATA, cor. victoria habitual de las histonas (experímento 1), salvo cuando concurrían circuns-

tancias especiales (experimentos 2 y 3). Y así comenzó a sospecharse que las proteínas activadoras, o las proteínas sobre las que éstas influyen, podrían ser los agentes que liberan las cajas TATA de los nucleosomas en el interior celular para proceder a la transcripción. EXPERIMENTO

OCOC CCCC

Cuando se expone

ADN

simultáneamente a histona: r' factore> ba-

HISTONAS

sales, 1as histonas forman nucleosomas en torno a

las cajas tl 14 r' bloel acce.o de lo:

quean

factores basales. FRACCION CELULAR> FACTORES BASALES

:.,.

.,,rtt-..-,:.-'-

c^l^/

génica, correspondía a 1as histonas un papel que nadie había pensado con-

cederles antes.

Los datos acumulados prestan sólido respaldo a la idea según la cual

no puede explicarse adecuadamente la regulación génica si só1o se atiende a las interacciones entre ADN y proteínas no histonas. La eliminación de Ia represión controiada por las histonas constituye el primer paso, necesario, para la activación de un gen eucariota silencioso. Y si ello es así. lo importante ahora estriba en conocer cómo se relajan los lazos que mantienen unido el núcleo de histona a la ¡/-'l omparto con mis colaboradores

\-/

activadoras,

EXPERIMENTO

COMPLEJO DE PREINICIACION

r--.-------------

'.i

,...

Cuando se erpone e1 ADN ¡ ios tactores hasales, ante' de que re introduzcan 1as histonas lctnpn l\. aquellos se err-

tL--l

+ ..,.,,.t_1.-..

samblan cabe las ca jas TA7A I' cierran e1 paso

a las histonas añadidas posteriormente (etn¡tn 2).

ETAPA 2

T-

EXPEBIMENTO 3

@@@@ @@@(E

ffi +

ffiffiffiffi PROTEINAS ACTIVADORAS

un intermediario suyo,

divide dentro de 1a bobina octamérica en dos dominios fundamentales. El do-

minio central, o nuclear, que incluye

el extremo carboxílico (COOHI de ia proteína, se enrolla en héiices hidrofóbicas muy prietas. Estas hélices se enredan a su vez para configurar el componente mayoritario del octámero de histonas. Por contraste, el dominio de la cola, que incluye el extremo amino (NH2), es hidrofílico. Permanece suelto, como un cabo. La razón de que abordáramos el posible papel regulador de 1as colas de Ias histonas debióse, en parte. a lo demostrado por Harold Weintraub y por James Whitlock y Robert T. Simpson; a saber: que los cabos tenían poco que ver con el ensamblaje ¡,-estabilidad de los nucleosomas. Se extienden a modo de prolongaciones de 1as hélices. Com-

OOCC CCCC

y el segmento de 1a "co1a" de una de las histonas, la H4. Cada histona se

¡'\:

e'l

conrrencimiento de que esa rela-

jación resulta, verosímilmente, de uniones específicas entre proteínas

eL.t

TATA

ETAPA

dejaba claro que, en la regulación

cajaTATA.

QUE CONTIENE LOS

presor de TY y se obtenía la transcripción correcta del gen I11S4. Este levantamiento de Ia represión d,e HI54

SECUENCIA ACTIVADORA ADN ARRIBA

Cuando se expone ei ADN simultáneamente

histonas, factores

sales

y proteínas

b¿-

activa-

doras, estas últimas facilitan el acceso v unión de los factores basales a las cajas 7AIA, 1, bioquean el acceso de las histonas.

parados con los dominios del núcleo, están potencialmente más abrertos a las interacciones con otras moléculas en el entorno local de la cromatina. Otros trabajos, un tanto desconcer-

tantes, avivaron también nuestro interés por ias "colas". En 1977, el grupo de Vincent G. Allfrey había observado que Ia transcripción solía ir acompañada de la adición de grupos acetilo (CHBCO) a las colas de ias

histonas. Cabía esperar que esas adiciones neutralizaran las cargas positivas de las colas,

que a su vez podrÍa

provocar una interrupción potencial de Ia interacción entre colas y ADN dotado de carga negativa. (No sabe56

Tpues

mos todavía si la acetilación precede o sigue a la transcripción.) El hallazgo sugería que las colas podrían liberar de las cajas TATA a los nucleosomas. En 1991 Durrin daba consistencia a semejante posibilidad. Al eliminar los aminoácidos comprendidos entre la posición 4 y la 23 de la cola de la histona H4, quedaron bloqueados en buena medida varios de los genes de

la levadura normalmente inducibles, incluidos los implicados en el meta-

bio puede llevar a la separación temporal de las histonas }I2Ay H2B del nucleosoma. El desplazamiento de 1os dímeros podría, a su vez, desenrollar parte del ADN del nucleosoma y quedar al alcance de los factores basales. Después del paso de la ARN polime-

mente del tetrámero y transferirse de un nucleosoma a otro. Toda esa gavilla de pruebas viene

a indicar que, cuando las proteínas activadoras, o las accesorias de éstas, se unen a un lugar específico de Ia cola, puede inducirse un cambio conformacional en la histona. Este cam-

rasa, los dímeros HZA-}JZB podrían

CRUZAMIENTO DE

FUSION CELULAR

CELULAS DE

bolismo de la galactosa. La inhibición indujo a pensar que todo el segmento

eliminado, o parte de é1, interactuaba normalmente con la maquinaria de la transcripción. El hallazgo de Durrin nos llevó a

amplificar la etapa de activación

dependiente de las histonas en nuestro modelo de regulación de los genes. Y avanzamos la hipótesis según la cual las proteínas activadoras, o las proteínas sobre las que influyen, desplazan a las histonas de la cajaTATA

LOCUS DE CRUZAMIENTO HML-ALFA EN RESERVA

LOCUS DE CRUZAN/IENTO HMRA EN RESERVA

MAI

1, ELII,/INACION DE LOS /

mediante la unión específica con algún segmento de la región com-

prendida entre los aminoácidos de la cola de la histona H4.

LOCUS

GENES ORtctN ALES

DE HMRA

4 y 23

='l

podemos ya imaginarnos hoy un I mecanismo en cuya virtud esa unión facilitaría la transcripción. Nuestras ideas arrancan del modo en que entendemos la formación de los nucleosomas y de lo que ocurl:e en su

liberación. Abraham Worcel tuvo mucho que ver en nuestro enfoque. Sugirió que el primer paso hacia la construcción del nucleosoma era el ensamblaje de dos moléculas de histona H3 y dos moléculas de histona H4, que originaba un tetrámero. El ADN envolvía entonces al tetrámero, entrando en contacto con las cuatro moléculas. (Felsenfeld, Alan P. Wolffe

3, LOS

GENES

COPIADOS SE INSERTAN EN EL LOCUS M/T

--*;¡

§ry

L;;;-:.-.;-.--

L;:iÉ=éJ tJ;-;-;J

L.>=É3IJ;J

I I

1 I

FACTOR

á-

\t/_S

* *'e

^t}§ a *-6-Cs ** EÉ

4. LA

ACTTVACTON

LOS

GENES DE HMBA EN EL

bPP.!¡^H"Bfl98I S.',?o8,o* "SEXUAL' a

LOCUS DE CRUZAMIENTO EN RESERVA SIB

y Kensal E. Van Holde han confirmado la estabilidad del tetrámero, amén de mostrar que en muchos

3\ ,- - .- ), §R,-z COLA \ L DE Ha

- -§*oTlo.

aspectos se comporta como un nucleosoma entero.)

Otros trabajos prueban que esta estructura parcial dirige la adición subsiguiente de dos pares o dímeros de histonas }f2A-HzB aI tetrámero, incorporación que promueve, a su vez, el retorcimiento ulterior del ADN en

torno aI núcleo de la partícula. Bradford B. Baer y Daniela Rhodes

han comprobado también que los nucleosomas desprovistos de sus dímeros H2A-H2B son menos eficaces que los intactos cuando se trata de bloquear la transcripción. A mayor abundamiento, Vaughn Jackson y Roger

Cha1kley señalan que las histonas H2A y H2B pueden disociarse fácilCoNSTRUCCTóN DE uN SER

Vlvo

3. CELULAS DE LEVADIIRA. sorprendidas en el momento del cruzamiento (fotograd.e la izquierda) y después de la fusión (fotografia d.e la derecha).Para que se pro(o ttsexot') de una de las células tiene que ser alfa, y duzea la fusión, el tipo

fia

"sexual" el de la otra a. Tbes loci genéticos MAT y HMRa- en un mismo cromo-HML-alfa, soma (arriba) capacitan a las células de levadura para cambiar de un tipo "sexnal" a otro. El caml¡io acontece cuando se eliminan (1) los genes dellocus MAT y se reemplazan por un duplicado de los genes del HML o del HMRa (2 y 3), los llamados -alfa de estos loci silenciosos no esloci de cruzamiento en reserva. Los genes originales tán nunca activados, pero la inserción de sus duplicados permite que las copias se transcriban (4). Aqui los genes IIMB¿¡ se han copiado en el locus MAT, con lo que la célula pasa a ser del tipo a. El detalle de la parte inferior muestra que un segmento de la cola de la histona H4 eontribuye a mantener en silencio los loci en reserva de cruzamiento, La cola ejerce su efecto al interaccionar (flechas intenumpid,as) conla proteína Sir 3, perteneciente a uno de los varios glupos de proteínas Sir (6'ris) que ayrrdan, a las secuencias silenciadoras de AI)N situadas en ambos extremos de los loci (band,as blancas), a reprimir los genes dentro de esas regiones. 51

1. ETAPA DE ACTIVACION

NHz

PBOTEINAS ACTIVADORAS

\..'

DEPENDIENTE

COLA

DE H4

DE HISTONAS

la activación génica de regiones antes

reprimidas. En nuestro laboratorio, y también en los de M. Mitchell Smith y de Jack Szostak se ha visto que basta la deleción de un aminoácido de las

ffi%

SITIO

posiciones 16 a 19 para que se produzca un efecto semejante. Así pues, la presencia de todo el conjunto de esos ami-

SECUENCIA ACTIVADORA ADN ARRIBA

\_-/

TATA

>e Sffieq

H2A_H2B

..MP.NENTES DE LA pARlculAr$%",k.r?

-ffi <@q3-:

2. ETAPA DE ACTIVACION

REGION CODIFICADORA

ARN POLIN/ERASA

,t)

\--z/ *,/__

INDEPENDIENTE

ARN N/ENSAJERO

DE HISTONAS

,l (-/

EL MODELO EXPANDIDO DE LA ACTryACION DEL GEN defiende la intervencron de las histonas en el proceso de transcripción que se desarrolla en las células. El modelo propone que, para que comience Ia transcripción, las proteínas activadoras Qsioleto en f¿) deben interaccionar directa o indirectarnente (flecha segmcntad,a) con la cola de la histona H4 en la caja TATA kinta d.elgado que etnerge del núcleo de la partículo terde). La interacción conduce a la disgregación parcial de la partícula nuclear por la razón verosímil de que se suelten H2A y H2B (pequeños frogmentos uerdes en lb).La disgregación conduce al ligamiento de la caja TATA a factores basales (complejo rojo) y a un nivel bajo de transcripción. El nivel máximo de transcripción se conseguiría de manera parecida a como lo sugiere el modelo del ADN 4.

desnudo para la activación del gen (2),

reasociarse de nuevo con los tetrámeros H3-H4, con la consiguiente reaparición de los nucleosomas detrás de la polimerasa.

\Tos 1\

sorprendió bastante ver que, al las propiedades de los "*u-irlar segmentos de la cola de la diferentes histona H4, éstos tenían a veces res-

ponsabilidades antagónicas. Así, mientras ciertos aminoácidos entre

permanecer perpetuamente en silencio, ya que las céIulas en las que se encuentran activas se tornan incapacitadas para el cruzamiento, es decir, no pueden fundirse entre sí. Las células se cruzan cuando están en el estado haploide, aportando sujuego de cromosomas. La fusión de dos células

haploides engendra una célula diploide, algo semejante a lo que ocurre con la unión de un espermatozoo y un

los números 4 y 23 se necesitan para

óvulo, que produce un embrión di-

la transcripción de varios genes, una parte de la cola participa en la repre-

ploide, portador de su propia dotación de cromosomas, en la que están representadas tanto la aportación paterna

sión de otros genes. Paul S. Kayne identificó una impor-

tante función inhibidora de la cola de la histona H4: ayuda a reprimir los loci de quzamiento en reserva. Las levaduras de cerveza poseen dos de estas reg"iones genéticas, que deben 58

como la materna.

Kayne demostró que la deleción de los aminoácidos 15 a 19 de la cola de la

histona H4 debilitaba grandemente la capacidad de apareamiento de las levaduras. La causa de ello yacía en

noácidos constituye una condición necesaria para mantener reprimidos los loci de cruzamiento en reserva. Lianna M. Johnson ha demostrado que la mayoría de los aminoácidos entre 1as posiciones 21 y 29 constituyen un requisito adicional para reprimir los mismos genes. Asimismo, ha comprobado que Ia sustitución de uno de dos aminoácidos presentes en la proteína Sir 3 puede contrarrestar e1 déficit de Ia capacidad de cruzamiento inducida por ia mutación en H4. E1 cambio en Ia proteína Sir promovió 1a represión de los loc¿. de cruzamiento en reserva y Ia estimulación dei cruzamiento. EI hecho de que un defecto en la histona H4 quede contrarrestado por un defecto en Ia proteína Sir apoya Ia idea de que la histona H4 y 1a proteína Sir intervienen de maneta

rutinaria

en 1a represión de los loci de

cruzamiento en reser\¡a. Los loci de cruzamiento en reserva residen cerca de los extremos. o telómeros. del cromosoma III de la levadura. Para Daniel E. Gottschling las colas de la histona 4 están implicadas también en 1a represión de otros genes

vecinos de los telómeros de la levadura. El grupo de Gottschling descubrió un fenómeno sorprendente: de las mutaciones de la H4 que levantan 1a represión de los loci de cruzamiento en reserva, algunas vencen la repre-

sión de genes insertados artificialmente en regiones próximas a 1os telómeros. Ocurre io mismo con Ia carencia de proteínas Sir. En resumidas cuentas, Ios genes que residen cerca de los telómeros quedan maniatados como si se tratara de los /oci de cruzamiento en reserva. Además de revelar nuevos detalles sobre el funcionamiento de las histo-

nas. el análisis del cruzamiento nos ha proporcionado una poderosa herramienta para el estudio de las histonas. Un haz de defectos genéticos. que responde al nombre colectivo de mutaciones s¿¿,1 (del ingiés "srvitch", interruptor), bloquean 1a actir.ación del gen de la levadura que codifica cierta enzima esencial para Ia determinación dei tipo "sexual". (La levadura puede corresponder a1 tipo a o al tipo alfa.) Ira Herskorvitz ha observado Ia existencia de otras mutaciones (las sliz) que anulan ese bloqueo; Tpues

hay una mutación de éstas en el gen de la histona H3, seña1 de que la

región alterada de la histona HB puede influir sobre la actividad del gen. El descubrimiento de otras mutaciones sin acabaráindicando posible-

mente la existencia de segmentos reguladores adicionales de los genes histonas. Esas mutaciones contribuirán, sin duda, a identificar las proteínas que controlan genes mediante su influjo en las histonas. En esa misma onda, se ha obserde las

vado en el laboratorio de Winston que

los efectos de las mutaciones snf, generadas por Marian Carlson son muy parecidos a los producidos por las mutaciones s¿ui. Las proteínas determinadas por las versiones normales de los genes mutados podrían facilitar la liberación de los nucleosomas y, con ello, quitar las trabas para la transcripción. El esclarecimiento y análisis de las mutaciones swi, snf y otras que afecten a la estructura de la cromatina se han convertido en objetivos prioritarios de la investigación en regulación génica. Por ser la histona HB semejante a la histona H4 en muchos aspectos (incluido su patrón de acetilación y su papel en la formación y estabilización

de los nucleosomas), es razonable esperar que la cola de la histona HB controle genes a la manera de la cola de la histona H4. Podría, por ejemplo, predecirse que la cola de la histona H3 participe en la supresión de los loci del

genes cuyas secuencias activadoras curso arriba del ADN, o intensificadoras, están incluidas en los nucleosomas. ¿Cómo se las arreglan? Apoyándonos en los descubrimientos de Helen M. Blau podríamos, con

lógica, responder que ciertas proteínas (tal vez distintas de los activadores) logran desplazar de los intensifi-

cadores a los nucleosomas. Cabe también que los genes que la célula humana ha de activar en un momento y silenciar en otro (como ocurre con la mayoría de los genes de la levadura) porten intensificadores que persistan en estado de alerta, prestos a intervenir, exentos de nucleosomas.

Hay que trabajar duro todavía antes de dominar los mecanismos de acción celular de las histonas, trátese de levaduras o de otros organismos. Sabemos ya lo suficiente para abjurar del viejo dogma que atribuía a la

partícula nuclear de histonas un papel de bobina pasiva. Hemos probado, con otros autores, que las tales

partículas están capacitadas para activar y para reprimir genes. Las distintas histonas, así como los dominios específicos dentro de sus moléculas, dan cuenta de sus efectos. Y acariciamos la idea de que ciertas proteínas reguladoras que colaboran con los activadores controlen los genes al unirse específicamente al ADN y a ciertos dominios críticos de las histonas. Nos toca ahora recoger otro guante:

hace. Más aún, Randall K. Mann ha mostrado que se requiere la cola de la

descifrar las funciones que la naturaleza ha asignado a los pequeños segmentos del interior de los dominios histónicos e identificar qué proteínas

de muchos de los genes que, para activarse, necesitan la cola de la histona H4.

interactúan con tales segmentos. Muchos investigadores, cuya inspiración permanecía aletargada al enfrentarse

Para explicar por qué las histonas H3 y H4 desempeñan esas funciones

con las histonas, están hoy volcados de lleno a ese esfuerzo. La exploración de la estructura de la cromatina se ha convertido de repente en una nueva fron-

apareamiento silencioso. Pero no Io

histona H3 para la represión

dispares, es obligado conocer mejor Ia interacción entre dichas moléculas y otras proteínas, así como entre aquéllas y el ADN. No se ha determinado aún la función celular de las histonas H2Ay H2B, aunque sepamos que no se comportan igual que las histonas H3 y H4. Buena parte de cuanto se conoce a propósito de la regulación génica por las histonas procede de los estudios realizados con levaduras. En éstas,

las secuencias activadoras curso arriba del ADN permanecen, tal parece, exentas de nucleosomas. En las

células humanas, una fracción nota-

ble de la cromatina se encuentra en la conformación de 30 nanómetros. Ello significa que, durante el desa-

rrollo

de las células humanas, podría

reclamarse la activación de algunos CoNsrnuccróN oB uN Ssn Vrvo

eFftffiL$ffi€Fhf,ftüÉH&

tera, sugerente y atractiva, del estudio de la regulación génica.

CIENCIA ha publicado sobre el tema, entre otros, los siguientes artículos:

Objetos de metales prec¡osos del Sicán Medio, de lzumi Shimada y Jo Ann Griffin Junio 1994

Ciudades and¡nas de la antigüedad, de Shelia Pozorski y Thomas Pozorski

Agosto 1994 Ciencia en la campaña egipcia de Napoleón, de Charles C. Gillispie

Noviembre 1994 Fósiles de Flaming Cliffs, de M. J. Novacek, M. Norell, M. C. McKenna y J. Clark

Febrero I 995

Degradación del suelo en la Grecia ant¡gua, de Curtis N. Runnels

Mayo 1995

Reparto del poder en una ciudad mesopotám¡ca, de Elizabeth C. Stone y Paul Zimansky

l-l{JfiltAIjl ¡r l-'i}ivlP! .1:-\11:,\TAR;,1 Nuct-posotvlE Loss Acrlv,-rrns Ys.,rsr DowNsrREAr\,{ PRoNToTERS rr Vrvo. Min I:t

¡ll

Han 1, Michael Grunstein en C¿11, vc¡lumen -55. páginas ll37-ll.l.5; 23 cle diciembre de 1988. Ys.rs'r Hrs'roxu H,+ N-TERNITNAr- SsqLraNcE rs Rrqurneo ¡on Pnouror¡n Acrrvrttox tN VIvo. Linda K. Durrin. Randall

K. Mann. Paul S. Kavne y Michael

Grunstein en Cel.l. i,o1. 65. págs. 1023ll)l I : l-l de jrrnio de l9q I Cutotr'trtlx ,ls ,rN EsspNrt,cl- P-\RT oF THE TnrxscnrpL'roNAl MpcH.,\Nlsl,r. Gary Felsenl'eld en NcLture, vol. 35-5, n.o 6357, págs. 219-223: 16 de enero de 1992. .

Junio 1995 Las cuevas paleolíticas de Francia, de Jean Clottes Septiembre 1995

Los yacimientos de Atapuerca de Emiliano Aguirre

Octubre

1995

a Prensa Cient ífica, S.A.

El gen de la histona Hl Jovita Mezquita P1a

Un gen que codifica la proteína responsable de la organización espacial de la cromatina y condiciona el estado de diferenciación de cada tipo celular

I ADN contiene. escrita en un alfabeto de cuatro letras. la información necesaria para que

las células se desarrollen y dividan. La molecula de ADN proporciona. además, la base del proceso evolutivo

que ha generado la ingente variedad de formas vivas que conocemos. El descubrimiento por James Watson ¡.' Francis Crick, en 1953, de 1a estructura en doble hé1ice dei ADN permitió comprender de qué manera esta molécula almacenaba la lnformación genética y cómo podían producilse múltiples copias de tal información. Cada una de las cuatro piezas básicas que constituyen la molécula de ADN.

denominadas nucleótidos, contiene una de las cuatro bases nitrogenadas siguientes: adenina (A). citosina iCr. guanina (G) y timina (7). Los nucleótidos se unen entre sí a través de dos tipos de enlaces: los enlaces covalen-

tes fosfodiéster, que engarzan las posiciones 5' y 3'de dos nucleótidos formando una cadena, por ejemplo, 5' -ATG C AATTAG C G -3', y Ias uniones no covalentes por puentes de hidrógeno entre las bases A- 7 y C- G, que aco-

plan

cadena constituida a otra com-

plementaria; siguiendo con el ejemplo anterior. sería 3' -TACGTTAATCGC

-5'

A través de estos enlaces, los nucleótidos van creando Ia doble cadena de ADN, que adopta una conformación helicoidal. En la cadena de nucieótidos haliamos escrita la información necesaria para programar el crecimiento y la diferenciación de las células. Cuando la doble cadena se abre Ji.:1 i?A -hi]I1:Qiri'.1,! Pl,A es profesora titular del Departamento de Ciencias Fisiológicas de la Facultad de Medicina de la Universidad de Barcelona. donde dirige la sección de ácidos nucleicos del grupo de Genética Molecular. Su principal línea actual de investigación versa sobre la expresión de genes en 1a 1ínea germinal espermatogénica,

ai romperse Ios puentes de hidrógeno,

la información codificada en las

EI carácter regular y la gran preci-

se-

sión con que las histonas organizan el

cuencias de nucleótidos puede copiarse y ller arse a tér'mino. El tamaño de 1a molécula de ADN

ADN en los nucieosomas quedan

de doble hélice. variable. se cuenta por miles de millones de nucieótidos. Para acomodar una molécula de esas dimensrones en un volumen limitado e1 del núcleo celulal resulta imprescindible empaquetaria de una forma sumamente compacta. El empacomo

reflejados en Ia rigidez evolutiva con que se ha conservado la secuencia de esas proteínas. La superestructura de Ia cromatina varía en mayor medida que la subestructura nucleosómica, io que posiblemente tenga que ver con una mayor flexibilidad en ei mantenimiento de la secuencia de 1a histona Hl alo largo de la evolución.

quetamiento deberá ser. al propio tiempo. rer-elsible a fin de que. en cualquier momento. la información contelrida en detelmrnadas secuencias sea accesible a los mecanismos de copia

que conlleva la expresión genética. Ei empaquetamiento de 1a mo1écula de ADN en e1 núcleo celular corre a cargo de 1as histonas. Estas proteínas básicas forman con el ADN un complejo que en ias pleparaciones histológicas teñidas destaca por su aspecto coloreado. por cu]-a razón recibe el nombre de cromatina. que está constituida por ciertas unidades denominadas nucleosomas. Constan éstos de par ocho moiéculas de histonas de cada uno de los cuatro -un tipos siguientes: H4, H3. H2A -t H2B- y tn segmento de ADN que 1as envuelve dando un par de vueltas a su alrededor. Una quinta histona,laHl, de mayor tamaño que las anteriores, se1la el par de vueltas que e1 ADN describe

en torno a las histonas restantes y organiza a los nucleosomas en una estructura de orden superior: en Ia superestructura de Ia cromatina.

f L/

histonas I11 presentan una con-

formación caracterizada por un

dominio globular, Ia "cabeza", y dos ex-

tremos extendidos, 1a "nariz" y ia "cola". La variación evolutiva de 1a histona 111 se refleja principalmente en 1os extremos de Ia molécula, que se

distinguen por su alto contenido en restos de iisina. Este aminoácido confiere a los extremos de 1a moiécula un carácter policatiónico que es el responsable de su conformación desplegada y de su capacidad para interac-

tuar con el ADN. La sustitución

lisinas por arginina, otro aminoácido

similar y asimismo dotado de carga positiva, aunque interactúa más intensamente con el ADN. confiere a las variantes de 111 un mayor de tamaño

poder condensante. Cuando se afirma que 1as histonas f11 se unen al ADN cooperativamente se quiere indicar que Ia unión de una molécula de .F11 resulta mu)' favorecida si antes se ha engarzado en la molécula de ADN otra histona É11. La cooperación posibilita que un deter-

LA HISTONA fIl. Esta proteína está constituida por una cabeza de conformación globular, que apenas ha sufrido cambios a lo largo de la evolución, y por dos extremos: la nariz y la cola. Más variables en su evolución, las dos últimas adoptan una conformación extendida; predominan en éstas los aminoácidos de carga positiva (lisinas). En la cola se encuentran las tres serinas, susceptibles de fosforilarse. En el esquema de la dereeha se detalla la secuencia de aminoácidos de la molécula histónica, simbolizados con una letra: d alanina; E, ácido glutámico: V, valina; P, prolina: K, lisina; G, glicina; S, serina; L, leucina; I, isoleucina; R, arginina; Y, tirosina; D, ácido aspártico; N, asparagina; T, treonina y Q, glutamina. Los aminoácidos con carga positiva se destacan en rojo y las serinas fosforiladas, en azul. 1. CONI'ORMACION DE

T¡M,A.s 3

NARIZ

CABEZA

COLA

Co¡¡srnuccróN os uN Ssn Vryo

minado dominio delADN se repliegue o expanda súbitamente. La expansión de un dominio es necesaria para la activación genética. La condensación del ADN provocada por las histonas Il1 puede intensificarse con la fosforilación de estas moléculas, fenómeno que se ha observado durante el proceso de división celular, cuando un segmento de ADN de cinco centímetros, por ejemplo, viene a recluirse en cinco micrómetros. El aminoácido fosforilado es la serina, resto situado estratégicamente en los dominios ter-

minales de la histona

Hl.

La fosfori-

lación permitiría el entrecruzamiento

mediante interacciones electrostáticas de dichos dominios terminales. a función de las histonas I11 po¡ dría regularse a través de modificaciones químicas de estas moléculas

Hlo

lt,

las que no se dividen, y, por úItimo,

en vez de desoxirribosa. La secuencia del ARN, formada con las bases A, U,

hay variantes mínimas, detectadas en proporciones cambiantes, en diferen-

C y G, surge de la copia de determinados segmentos del ADN de acuerdo

tes tejidos. Conocemos esa extensa variabilidad de las histonas.Ill merced a los análisis electroforéticos y cromatográf,icos, que ponen de manifresto diferencias en el tamaño y en la carga de estas proteínas. Ante Ia dificultad que

con el principio de complementarieA se copia en LI, T en A. C en G y ésta en C. Para ello, Ia doble hélice se abre en sus dos hebras componentes, una de las cuales se copiará en

implica verificar dicha variabilidad mediante la determinación de la

brar la doble hélice, en tanto que eI

cas, como l.a H5,

y \a H

en célu-

secuencia de aminoácidos, nos propusimos caracterizar las variantes de 1a H7 anil.izando la secuencia de sus genes. Ello permitiría, además. el estudio de las secuencias que regulan la expresión genética de esta proteína. Gracias a 1a introducción de las

técnicas de ingeniería genética 1'de recombinación bacteriana se ha avan-

zado extraordinariamente en el conocimiento de las secuencias de ADN

en la fosforilación men-pensemos cionada- y por histonas I11 con diferentes secuencias de aminoácidos. La cromatina de células distintas o diferentes dominios de la cromatina de una misma célula podrían contener variantes específrcas de la histona I11. Esta posibilidad viene avalada por Ios hechos siguientes: laI11 es la histona que ha desarrollado una más amplia variabilidad a lo largo de la evolución; se han observado variantes de esa histona durante la diferenciación celu-

GCCAAGA

copia,

ADN torna a enhe-

ARN permanece en su configuración de cadena única. El ARN podrá dar Iugar a 1a síntesis de una proteína en el proceso de traducción, en el que cada triplete nucieotídico o codon se encarga de ia incorporación de un aminoácido, estableciéndose así una secuencia de aminoácidos o proteína.

[1n el genoma. los genes pueden I-!l encontrarse aislados. .\' se transcribiéndose conjuntamente. Otras

para

veces. los genes se presentan reuni-

copiarse en una secuencia de ARN

dos formando un conjunto. y cada gen

a una proteína: este último proceso recibe el nombre de traducción. Iguai qr-re e1ADN, el ARN es un polí-

mero lineal de nucieótidos: distínguese de aquél. sin embargo, en que posee 1a base uracilo t Li) en el lugar de la base timina ]'en contener ribosa

GGGTTTCTTCCACTT

CCCAAAGAAGGUGAA

tona 111 las llevamos a cabo en el departamento de bioquímica médica de Ia Universidad de Calgary', bajo Ia dirección del profesor Gordon H. Dixon. El modelo utilizado fue la trucha

secuenciamos un segmento del genoma de la trucha que contenía el conjunto de los genes de las histonas.

zfEE

Nos servimos de una genoteca de trucha construida en el vector lambda Charon 44. (Una genoteca es una colección de fragmentos de ADN representativos del genoma entero,

un fago capaz de replicarse en una bacteria y multiplicar así el ADN introducido.) Utilizando enzimas de

T mlttllr

del conjunto se transcribe por separado, aunque puedan hacerlo de una manera coordinada. Los genes de las histonas se disponen en e1 genoma formando un conjunto o "cluster". Las investigaciones que condujeron a la determinación de1 gen de 1a his-

arco iris (.Sctlmo gaírdnerii l. Junto a la determinación de la secuencia del gen de la histona I11 abordamos un

-r-r-r-T-r--r-T CGGTTCT :::::::

segmento de ADN que con-

la información necesat'ia

(transcripción ) que. a su r'ez. dará 1ugar, en muchos casos. a una secuencia de aminoácidos, es decir. a un péptido o

existen variantes extremas específr-

cripción,

criben por separado. o bien encontrarse en un determinado dominio, trans-

t'iene

hormonal y en células transformadas;

ARN. Terminada la fase de trans-

y del significado de las mismas. Llama-

mos gen

lar, en respuesta a la estimulación

dad:

proyecto más amplio, en colaboración con Wayne Connor y Robert J. Winkfein, de1 mismo laboratorio. en el que

insertados en un vector. que suele ser

z = J

a J

z É.

z J o cr fL

z U)

a J

z I

a J

LJ.l

o fr o-

DOBLE HELICE DE ADN con sus nucleótidos eomplementarios unidos por enlaces de hidrógeno. Ciertos seguentos de ADN se transcriben en moléculas de ARN. Algunas de éstas, los ARNn, dan lugar, por traducción, a moléculas proteicas. Ca2.

da tres nucleótidos sucesivos (codon o triplete) determinan un aminoácido. La figura ilustra parte de la secuencia del gen de la histona.ÉI1 de la trucha, su transcripción y su traducción en proteína. En rojo se destaca un pentapéptido que se repite tres veces en la secuencia de la histona. 62

restricción, enzimas que reconocen secuencias de cuatro a seis pares de bases, se puede cortar el ADN genómico y el ADN del fago, para reconstruir luego moléculas híbridas del fago con cada uno de los fragmentos del genoma.

Estas moléculas híbridas de genoma y fago pueden empaquetarse ln uitro y construir así partículas viables T¡r¡¡s

de bacteriófago que, en presencia de células bacterianas en cultivo, se mul-

ENZIMA Eco Rl

tiplicarán produciendo círculos claros, las placas de lisis, que destacan

5',

f:r-Iilll:llr:T:l:f]i:l-

.-Ti:l

li:-::i::i:_:-::i:T::=r-:i

oinl

de entre las zonas de bacterias intactas. De este modo se puede disponer

V G

Por simple contacto de estas placas filtro de nitrocelulosa o con una membrana de nailon se puede transferir suficiente cantidad de ADN para proceder a la selección de clones de

mapa de restricción de cada ADN. Las

que reconocían secuencias de ADN poco frecuentes. Con cada enzima, o mediante la combinación de dos, se digería el ADN (es decir, se fragmentaba) y se determinaba en geles de agarosa el tamaño de los fragmentos producidos. En esos geles, la movilidad depende del tamaño y se expresa en pares de bases (pb) o en miles de pares de bases (kilobases, Ká). Para determinar esos tamaños se separaban paralelamente, en la misma elec-

5',

GGICC

3',

CCGG

5',

V GG CC

5' J

ENZIMA Sst

3',

C.TCGAG

5',

V 5',

GAGCT

3',

nifiesto que había un gran parecido en

la organización de estos clones,

con identidad en el mapa de restricción en una extensión de 10 kilobases. Uno de los clones, el lambda 7f13, difrere algo, y a él nos referiremos más adelante.

corría el riesgo de que se uniera a secuencias poco específicas. Era una situación típica de estringencia baja de la hibridación.

La hibridación de fragmentos del clon lambda TH2 con la sonda

Vayamos al segundo paso en la

Drosophila mostraba un resultado

catacterización. Consistió en determinar Ia localización exacta de cada gen de las histonas dentro del conjunto. Sondas construidas con genes de histonas de Xenopus, erizo de rlaat y Drosophila resultaron adecuadas para la localización de los genes H3, H4 y

que variaba desde la ausencia de bandas en condiciones de relativa estrin-

de un gen I11 de

CoNsrnuccróN os uN Sgn Vrvo

J 5',

ACCION DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCION sobre la molécula del ácido deso-

Drosophilo. Variando

J as bandas de ADN separadas se la temperatura o la concentración, o I-¡l visualizaban con luz ultravioleta, ambas, durante la hibridación y el

los genes de las histonas se utilizaron las enzimas Eco R 1, Bam H7, XhoT y Ssú1. Los resultados pusieron de ma-

TCGAG

xirribonucleico. Esas enzimas reconocen secuencias cortas, de cuatro a seis pares de bases sucesivas (azul).La secuencia reconocida por la enzima se fragmenta de forma simétrica o asimétrica; en el último caso se generan extremos de cadena simple. La figura recoge las secuencias reconocidas y cortadas por las enzimas: EcoRl, Hae III y Sstl. La enzima EcoRl genera un extremo 5'litrre, mientras que la enzima Sstl da lugar a un extremo 3'libre.

tencia a su localización con una sonda

fragmentos generados por las enzimas de restricción, se construyó el mapa por superposición de los mismos. Para determinar el mapa de restricción de los clones que presentaban

GAGCTC

tamaño conocido (marcadores).

teñir el gel con bromuro

3', 5',

H2B.ElgenHl oponía una dura resis-

después de

CC GG

troforesis, fragmentos de ADN de

de etidio. Averiguado el tamaño de los

5',

turalizados, que tengan el suficiente g:rado de complementariedad: son las llamadas sondas. La genoteca de trucha se hibridó inicialmente con una

enzimas de restricción permitían localizar las secuencias por ellas reconocidas. Las enzimas más útiles para construir el mapa de restricción eran las que cortaban pocas veces, esto es, las

3',

ENZIMA Hae lll

interés, en nuestro caso clones porta-

na de ellos para prepararADN y caracterizarlo. Se empezó por construir el

AATTC

CTTAA

con un

sonda del gen H4 de Xenopus; d.ado que esta histona se ha mantenido casi inalterada a lo largo de Ia evolución biológica, cabía esperar que la homología en el ADN fuese estrecha. Con esta sonda se detectaron 35 clones positivos. Se multiplicó una doce-

3',

de un número de placas de lisis que, en conjunto, representa la genoteca. Cada placa de lisis contiene moléculas recombinantes idénticas o clones.

dores de genes de histonas. La selección se realiza por hibridación del A-DN, desnaturalizado previamente (es decir, con sus dos cadenas separadas), con fragmentos de ADN, también desna-

tl.c

CTTAA:G

lavado, lográbase modificar la unión de la sonda con secuencias sólo parcialmente complementarias. Realizando la hibridación a temperaturas bajas de 37 a 40 grados C y a una fuerza iónica elevada (0,9 molar), y lavando posteriormente a temperatura ambiente y sin disminuir la concentración de sal, la hibridación de la sonda resultaba ser mayor, aunque se

gencia hasta la aparición de varias bandas positivas cuando se reducía la estringencia. Para ver si los fragmen-

tos positivos contenían el gen Hl,

secuenciamos los que hibridaban con mayor intensidad; ante nuestra sorpresa, observamos que estábamos

secuenciando el gen H2A,todavíano localizado. La localizacíón del gen I11 se consiguió frnalmente con una sonda

ff1

tritón.

En todos los clones se encontraron

las cinco histonas, en el siguiente orden: H 4-H2B -H L-HZA-H\, orientadas en el mismo sentido. El que la orientación de los genes sea la misma significa que la información que codifican, a diferencia de lo que ocurre en otros conjuntos de genes de histonas, se halla en la misma cadena de ADN. 63

Para la secuenciación de estos

m ffi

BACTERIOFAGO

7000 pares de bases, se siguió el proce-

coRTAR Coru Eco nl ELIMINAR PIEZA CENTRAL

DIGESTION PARCIAL CON Eco Rl

§§M§BN

§§wre BRAZOS DE BACTERIOFAGO

PIEZAS GENOMICAS [/EZCLAR Y LIGAR

v ADN RECOMBINANTE

EMPAQUETAIVIENTO ..IN VITRO,,

-ñ-l

(E-l

INFECCION Y LISIS

.,\\

DESNATURALT,AR

,;----G..

t_/

(* \

maños mucho menores. Seleccionamos, con enzimas de resmentos, que se obtenían como moléculas biológicamente activas a partir de geles de agarosa, se introdujeron en un vector pequeño, de unas cuatro kiIobases: el vector pBR322. Se trata de un plásmido capaz de replicarse en una bacteria con independencia del genoma de esta última. Contiene, además, una secuencia que le confrere resistencia a Ia penicilina, y que nos permitía seleccionar las bacterias que transportaban el plásmido o el híbrido recombinante, ya que en presencia de penicilina no crecen las demás bacterias. De esta forma se multiplicaron

Para la inserción de los fragmentos de

.")

o ,-rJ*ANA y

or*

tor distinto det lambda Charon 44. La secuencia se obtuvo a partir del clon lambda TH2, que contiene el conjunto de genes de las histonas en un fragmento del genoma, de unas diez kilobases, inserto en un vector de unas 30 Kb. Para Ia secuenciación era conveniente simplifrcar Ia complejidad de ese sistema y reconstruir moléculas recombinantes en que tanto el ADN insertado como el vector tuviesen ta-

tor pequeño, consiguiéndose cantidades de ADN del orden del miligramo.

TRANSFERTR

nados fragmentos de ADN en un vec-

las moléculas recombinant€s err üflv@c:

/^\ [: .,

dimiento de Maxam y Gilbert, que explicaremos inmediatamente. A tal fin hubo que volver a clonar determi-

tricción, fragmentos de parte o de la totalidad de cada gen. Tales frag-

//t.

genes, que constituían un total de

' t))

o* ""'

HIBRIDAR

interés en el vector, los extremos de ambos ADN han de disponer de ter4. CONSTRUCCION de una genoteca y aislamiento, a partir de la misma, de clo-

nes que contienen secuencias específicas. La parte central de la molécula de ADN del bacteriófago lambda es sustituible por fragmentos deAI)N genómico, de tamaño eomprendido entre 10 y 20 ki' lobases. La molécula recombinante que resulta puede empaquetarse in aitro; es decir, en presencia de proteínas especí' ficas que forman una cápside, elAI)Ndará lugar a partículas del bacteriófago lambda y podrá infectar una bacteria. IJna vez introducido el AI)N en la bacte'

ria, se multiplicará allí por replicación,

produciéndose mriLltiples copias de ADN y partículas víricas que matar¿ín la bacteria por lisis. Cada bacteria es infectaLAVAR Y HACER AUTORRADIOGRAFIA

da por un solo bacteriófago y, segin la proporción de bacterias infectadas, se formará un número variable de placas de lisis. Las placas de lisis que alojan clo' nes de interés se identifrcan por auto' rradiografía, después de desnaturalizar el ADN, transferirlo a una membrana e hibridarlo con la sonda pertinente. T¡nes

minaciones compatibles, generadas con enzimas de restricción. En la cons-

tro

trucción de subclones 111 no siempre

I,JJ

lográbamos que

E§§§§

o o (/]

la enzirna cortase

el fragmento de interés y el vector. Re-

curríamos entonces a Ios ligadores ("linkers"), moléculas de una decena

=E xlx EE §§ §E

de pares de bases que se acoplaban a los extremos del ADN y que contenían

el sitio de restricción adecuado.

p Ill

I método de secuenciación de Maxam y Gilbert comprende varias etapas. La primera consiste en cortar el ADN con una enzima de restricción que produzca extremos 5' que se pro-

I =

or o(D IJJcl)

(§ (D

rr+

___F

EE S§ §E (/)(/) X)< X tlr

yecten libres, como en el caso de EcoRl. Conviene que el grupo 5'fosfato se proyecte libre para el desarroilo de las reacciones que se suceden a con-

tinuación; en efecto, su rendimiento cae

drásticamente cuando el fosfato 5'

oo rx(,)

eñ

66 :cc xt!

oo xx oo

queda dentro de la doble cadena de ADN; las reacciones en cuestión son dos: una defosforilación a cargo de una fosfatasa que elimina el grupo fosfato y una fosforilación que incorpora fósforo radiactivo P32 a partir de ATP(P321 y una enzima quinasa. Se producen así

E8 oEEu) tux

Eor ooo

(,)UJ

§ §

6E -r

oo§< (,r(/) xx

xtu

EE xlx

dos extremos marcados radiactivamente, uno de los cuales se elimina con una segunda enzima de restricción.

I =

ADN, marcado en un solo extremo. se reparte en cuatro muestras, cada una

(io§oo UJ C0

<¡) (D

§ O

qo (4(/)

xx Etr x r.lJ(/)

de las cuales se procesará con un reac-

tivo químico que destruye. selectivamente, una o dos bases de ADN. Se controla el tiempo de 1a reacción, en general intervalos breves de r..arios minutos. para que'las reacciones sean parciales y se produzca una proporción adecuada de cada tipo de modificación posible. Sólo los fragmentos que conecten con el extremo radiactivo aparecerán en las autorradrografías. con lo que el proceso queda simplificado a lo que ocurra a tales fragmentos

marcados. Los fragmentos complementarios se separan por desnaturalízación. Separando por electroforesis en gel de poliacrilamida Ios productos de las cuatro reacciones químicas, se pueden observar bandas escalonadas,

que difieren una de otra en un solo nucleótido. Para determinar la secuencia, se leen las bandas sucesivas equivalentes al nucleótido modificado en cada carril. La resolución con que se separan los fragmentos disminuye al aumentar su tamaño. Para secuenciar el gen I11 entero por este procedimiento hubo que ampliar su mapa de

restricción a fin de disponer de sitios adecuadamente Iocalizados. ¿Cuáles son las características estructurales del gen 111 secuenciado? La secuencia de aminoácidos deduciCousrnuccróN nE

urN

Spn Vrvo

=i [=

oo LJJO

= §

MAPADE RESTRICCION de los clones con genes de histonas, en este caso genes trucha. Se muestra la localización de las secuencias reconocidas por las enzimasEcoRT,BamHlyXhoT. Obsérvese la identidad en el mapa de restricción de la región EcoRT-EcoRl central que contiene los genes de las cinco histonas. El clon lambda TH3, que se muestra en la parte superior de la figura, presenta ciertas diferencias, como es la ausencia de una de las secueneias de SsfI; viene, a continuación, el clon lambda TH2, a partir del cual se secuenciaron los genes de las histonas; pbr riütimo, se ofrecen otros clones, que se caracterizan por contener, en los extremos, fragmentos EcoRT-EcoRl adicionales. 5.

de histonas de

da del gen consta de 206 restos,

buidos en los tres dominios

distri-

estructu-

otro codon de lisina. Bastaría sustituir el nucleótido central (AAG por AGG o

AAA por AGA) para obtener un tridan las lisinaq y alaninas y escasean plete de arginina: AGG, AGA. El helas argininas. Al parecer, un conte- cho de que, no obstante la fácil sustinido alto en lisinas (63 en esta I11) y tución de un triplete por otro, se bajoenargininas(unpar)resultafun- mantenga eI codon de lisina en esta damental para ciertas HL, mientras .É/1 abona la hipótesis de una fuerte que en otras variantes lo caracterís- selección en favor de la lisina en un tico es lo contrario, una mayor propor- grupo de histonas f/L. Asimismo, sugiere que ambos aminoácidos, lisina ción de argininas y menos lisinas. En este gen, de las 63 lisinas, 57 y arginina, aunque muy similares en están determinadas por el triplete tamaño y carga, deben cumplir una ralestípicosdeestasproteínas;abun-

AAGy sóloseisporeltripleteAAA,el función muy distinta en su interac-

ción con el ADN en la cromatina. En el extremo final de Ia molécula hallamos, triplicada, la secuencia lys-serpro-lys-lys, pentapéptido cuyas seri-

En un gen eucariota, la región codi-

región codificadora se hallan las

metionina, y acaba con un triplete de terminación: TAA, TAG o TGA. En el

secuencias reguladoras. En el gen-811, t27 parcs de bases antes del codon metionina (posición *27) se encuen-

A?G, equivalente al aminoácido

nas se fosforilan durante el proceso de

división celular.

gen I11, el codon de terminación es TAA. Por delante y por detrás de esta

ficadora de una secuencia de nucleótidos se inicia siempre con el triplete

tra Ia secuencia TTTAA, que sería el equiva'lente a una secuencia promoLora (TATAA) de otros genes. Estas

H2B

H2A

secuencias, reconocidas por Ia enzima H3

NLC

á+

BC ffiffil

desconoce la repelcusion exacta que pueda tener en esta secuencia la sustitución de una A por una 7, aunque no se descarta que afecte al de 1a

transcripción. En

posición -31 se ubica la secuencia alternante repetida GTGTGTGTGTTT, cuyo significado se desconoce. La se-

cuencia AAACACA. descrita como elemento específico de los genes 111 por L. S. Coles y J. R. E. We1ls, aparece dos veces en este gen I11, en las posiciones -206 (agaAAACACAag) y -733 (aagaAAACACAca).

'ffi. V

La transcripción del gen I11 comienza con la secuencia AATAG en posición -93. Este sitio de iniciación u origen del ARN se determina preparando piezas genómicas complementarias a }a región 5' del ARNm. Las piezas preparadas eran de dos tamaños: Ias pequeñas, de unos 100 nucleótidos, no sobrepasaban el origen del ARNm (fragmento 1); las más

largas sobrepasaban dicho origen

N@%.

(fragmento 2). Ambos fragmentos se marcaron en su extremo 5'. En el caso de fragmento 1, la pieza se extendió con la enzima transcriptasa inversa

)

hasta alcanzar el origen del ARNm. En el caso del fragmento 2. 1a pieza se cortó con nucleasa S1, enzima que actúa sobre el ADN de cadena única y, por consiguiente, digería el ADN que rebasaba el sitio de iniciación. El segmento final de ADN, obtenido en ambas condiciones, se caracterizó en geles de acrilamida, visualizándolo por autorradiografía. Al igual que ocurre en los otros genes de las histonas, inmediata-

N\/

.ü

SIIBCLONES a partir de fragmentos de ADN del clon lamb-

da TII2. En la parte superior de la frgura se muestra la posición relativa de los cinco genes de histonas: H4, HzB, Hl y H3; debajo de los mismos, uno de los fragmentos seleccionados para la construcción de subclones del gen de la histona.EIl. En uno de esos subclones se insertó el fraguento B-C (BamH7-Cla7)'e¡ los sitios de restrieciónBamHT y ClaT delvector pBRÍ122. Otro de los subclones se construyó a partir de este último, eliminando parte de la molécula, al cortar con N (Ncol) y religar el fragmento que contenía la inserción. 66

Cte

rendimiento

,JC

6. CONSTRUCCION DE

de ARN polimerasa II -responsable Ia transcripción del ADN-, dirigen a dicha enzima, con precisión, hacia el Iugar donde se iniciará la transcripción y garantizan que esto ocurra de forma eficiente.

mente después de Ia región codificada se halla Ia secuencia 5'-GGCTCTTTTAA GAGCCAC-S', formada por dos

mitades complementarias entre sí. Dicha secuencia señala la terminación del ARNm. A una distancia de 15 y 28 nucleótidos encontramos, respectivamente, las secuencias,4AA-

AGC y ATTCCA, esta última dupliT¡u.rs

G+A

DOBLE CADENA ADN

T+C

c ,llrlr,,

coRTAR

ro*al* \,

Los EXTREM.. '' '$.Jt' tiii,i, :=¡::!:ii

r:-i,i

::,

CORTAR Y SEPARAR LAS PIEZAS

_*_-__a I

AISLAR LA CADENA MARCADA

DESECHAR

TRATAR

cebn vuesrn^

-=*rr"

oue AcruA

soBRE LA BASE "t-^lio iñorcnón--""*r,r

sELErcr¡vAMENTE

GATC

OOOO l;l li-l t./ I t.¡ Ifl

lil

l'r

l-71 iY litt. II l\r lr-l l'?l l¡,

uI.,i.r0

CONTROLAR,Ln nEAcCIoI.I PARA QUE SE GENEBEN

liPosrcroNl

T G

Énnov=ruros e pnniln

c DE CADA

SEPARACION DE FRAGMENToS PoR TAMAÑo EN ELECTFIoFoRESIS Y VISUALIZACION I

PoH AUToRRADIoGRAFIA

C :itt,

A G

recGrAGl

ffiffiffiIril

G<o z AE

laccr ---l

EEg-.I o

ffi§-.-S§ñ-ffi

CADENA ANALIZADA I

tu re

ÍtA

ffiH$mffil

I--

ztlj

o llJ

7. SECLIENCIACION por el método de Maxam y Gilbert. Se corta el ADN mediante una enzima de restricción y se marcan los extremos 5'fosfato con fósforo radiactivo (P32). El fragmento así marcado se cor"ta de nuevo con una segunda enzima de restricción y se aísla el AI)N que se va a secuenciar, que se hallará marcado radiactivamente sólo enuno de sus extremos. Este fragmento se somete, por separado, a la acción de cuatro reactivos químicos distintos, que actuarán selectivamente sobre las bases G, A, T y C, rnodificando una proporción variable de las mismas para dar lugar a un conjunto de moléculas de todos los tamaños

-l

A C

§i: R.

'=.*

-=:-

'::i:

posibles, cortadas específicamente en el nivel de las bases se. ñaladas. Los fragmentos resultantes se separan en geles de acrilamida y los que son radiactivos, por conectar con el extremo 5', quedan patentes en la autorradiografia. Las l¡andas en cuestión aparecen escalonadas y difieren una de Ia inmediata siguiente en un nucleótido. La lectura de esta escalera, desde el final del gel, donde se alojan los foagmentos más próximos al extremo marcado 5', y en sentido ascendente, nos da la secuencia en la dirección 5'-3'- A la derecha se muestra Ia autorradiografia de un segmento de la secuencia del gen -8I1.

cada. El ARNm del gen fI1 se transcribiría sobrepasando todas estas

¿Se transcribe el gen Hl in uiuo? Los estudios que realizamos con

ésta destaca en el extracto gonadal, es

secuencias, hasta una longitud desconocida, para ser luego procesado, es decir, cortado, a través de un mecanismo en eI que estas secuencias

ARNm procedentes de extractos hepátieos, renales y testiculares, separa-

mucho menos intensa en el riñón y resulta mínima en el extracto de tejido

dos de acuerdo con su respectivo

hepático. Tales datos señalan que no existe heterogeneidad en Io relativo a tamaños moleculares, o bien que, si

servirían de señales de reconocimiento. CoNsrnuccróN oe uN S¡n Vrvo

tamaño en geles de agarosa y transferidos a una membrana de nailon, mostraron, tras hibridarlos con la

sonda de1 gen H7, una sola banda;

hubieraARNm del

genfIl

distinto 61

REGION NO CODIFICADORA 5'

-532

GAGCTCTCCT

-522

TTAGAACACC

462

452

TCGGCTCACT

CCACAATCAA

CAGGAfuMGC

AGTGCGCACC

-322

GCACGGGCTT

-252

TTGGGCCAAA

ACAGTCGAAC

CATTTAGGAG

-352

-ó+z

-292

-282

-272

-¿¿¿

-¿t¿

-202

-362

-302

412

-422

ACTTTTAGGC

-242 -172

-162

AAGCCGAGCT

GGTGAGGTTT TGAGCGAGTC

GGGTGGCTTG

-132

GTTCTCATGT

AGTCTACATG

-102

-92

-82

-72

-32

-22

-12

-2

-472

GCCAGACATC

AACACGGCTC CGTCGGTGAC TTTTGGCCCG ATATTGGCGA CCAGAAAACA

-62

TGCACGGTGT GGAGCTTCAA TAGCGCAGAG CAGCGTCTAC AGCAAAGTAC

GCTCCACCCG

TGATTCCCTT

CCAAACCATT

+ó¿ AATCGGATGC

-312

-182

-112

-442

TGGTGCTCGC

482

492

-502

TCAGGGGACG

CTGCAGCCCA CATGACTTTA TTCTGAACGG ACACAAGTCT GCTCGCTGGG

AGCATTTGGC CAGCCCGGAG GCCAGCCCCC

-512

AAGGAGCACA

-402

ACAAATAGCA

-óó¿

GCAGCAAAAT

-262

CCGTTCGCTT

-192

CAAGTGAAAG

-122

CGCGTTTAAG

-52

TCCTCCTCAC

,,ii:,i::.,,i,.,,=.=:,,¡..,...::

REGION CODIFICADORA

't4

104

GCA GCA GCC AAG CCC AAG AAA GCG GGA CCC AGC GTA GGC GAG CTC ATC GTC AAG GCG

Ala Ala Ala Lys Pro Lys Lys Ala GIy Pro Ser Val Gly Glu Leu lle 134

TCC GCC TCC AAG GAG AGG AGC GGC GTG

Ser Ala Ser Lys Glu Arg Ser Giy VaT

Val Lys AIa

119

GTG Val

149 TCC Ser

209

224

239

re LEU

ffi @

299 ASN

359

419

rÍffi 449

434

479

539

584

569

554

599

614

REGION NO CODIFICADORA 3'

633

ACCTATTACA

643 AACAGTGTTC

6s3

663

733

673

683

TTTCTACTCG ACACATGTTG TTACCACAAA AGGCTCTTTT

743

753

703

713

723

773

783

793

843

853

863

873

883

893

913

923

933

943

953

963

983

993

1003

1013

1023

1033

1093

1103

CACCTCTTTC CATAMAGCG CATGTCATTC CATTCCACCT

MTGACTTTT ACGCACCACA TTTTCGAGTG

803 GCTAAATGGC

ACCTACCCGT 813 TTTACATTTG

GGTGCAAAAG

823

TCACTCAAGA

CTCACCAGTC AACATTGTTG TGATGTGTTA GAATTGGCAT GTCACATTGA TCCTGATAAT CATACTATAG TGGGTTGGAC AGCAGCCATT GGTATTATGA GCCACTCTCG AATTGATTGA

AGTGATTTGA GTAGTCACTT TGGCGCTCCC GCCAACGTGA AAAAGTCACA AAAGTCGGAG 1 053 TAGCCTAGCC

1123

1063

1073

CTCGTCACTC TGCTGCCTGC 1

133

1143

:1'

'r083 CTGCCTGCGG 1

153

GTGGGTGGGG GCGGGCTTAG 1

163

693 AAGAGCCACC 763 AAATGAAATG 833 GTGCAGCACC 903 AAGAAGCATA

973 TACACGTTTC 1043 GGAAACAGAG 1113 GGCTGACTGC

1173

GGATAGGCCA CACCGGTCCG GTGGCCAATC

GAT

TElr,rs

histonalll

tamaño, éstos no hibridarían con la

secuencia proteica de la

sonda utilizada.

testículo de trucha. Comparando la

Ante los hechos observados cabe preguntarse sobre el posible polimorfismo del gen Hl en la trucha arco iris. Entre las variantes reseñadas de f11, algunas en la H5-pensemos que pueden considedifieren tanto rarse incluso como no pertenecientes a la familia del gen fl1. EI gen ff5 se catactetiza, además, por encontrarse aislado en el genoma, es decir, sin formar parte del conjunto de genes de las histonas. ¿Existen en el genoma de la

trucha variantes del gen

de la

histona

fI1 que no formen parte del conjunto?

para resolver esa cuestión se digiI rióelADNgenómicoconenzimas de restricción. Ello nos aclararía si era posible obtener algún fragmento que, presentando un gen H7, se distinguiera nítidamente de los fragmentos portadores del gen

-É11

en los

clones analizados. Utilizando genomas procedentes de truchas distintas o de tejidos distintos, los resultados indicaron siempre que los fragmentos que hibridaban con la sondafll eran los esperados a tenor del mapa de restricción de los clones conocidos. Además, el número de copias f/1 encontrado en el genoma de la trucha (unas 145) coincidía con el número de copias hallado para los otros genes de histo-

nas. Los resultados daban pie a dos posibles interpretaciones: que los genes fI1 variantes estuvieran en los clones caracterízados sin que las diferencias aparecieran en las cortas secuencias reconocidas por las enzimas de restricción o que las diferencias de

secuencia en las varianíes H7 bastaran para que no hibridaran conla sonda del genfl1 secuenciado. Seyedin y Cole describieron, en 1981, variantes de la proteína H1 en la trucha, sirviéndose de la separación cromatográfrca. En extractos de hígado aparecían seis picos cromatográficos, ocho en el riñón y uno solo en el tejido testicular. En L977, Mcleod y colaboradores, trabajando en el mismo laboratorio de Gordon H. Dixon, habían obtenido la

secuencia encontrada por Mcleod con

la deducida del gen secuenciado,

observan ciertas diferencias en las regiones menos conservadas de la

molécula. En el extremo inicial: serina por alanina, alanina por serina en dos posiciones, alanina por isoleu-

cina y glicina por valina; en la parte globular se registra un solo cambio, ácido glutámico por glutamina; en la cola, las diferencias consisten en reorganizaciones de fragmentos de secuencia idéntica y en la presencia de un péptido adicional de 12 aminoácidos en el gen secuenciado. Existe la posibilidad de que variantes de este

tipo, con modificaciones en unos cuantos aminoácidos, se den y se organicen en el genoma, de forma idéntica a la de los clones caracterizados. ¿Qué sucede con el clon lambda TH3? Este difiere del resto de clones por haber perdido un sitio de restricción en la región codificadora del gen de la histonafll. Nos preguntamos si

se trataba de una variante

ff1 y

secuenciamos por entero la región del

clon correspondiente a esta histona. Descubrimos que se trataba de un gen con una deleción, es decir, carente de parte de la secuencia, justamente la que corresponde a la narizy alaparte

globular. Sólo quedan 177 pares bases que codifican la cola de

lafl1 y

las secuencias reguladoras de los extremos 5' y l'.El hecho de que sea la cola de la proteínaf/1 la responsable de que esta histona entre en el núcleo

y el que secuencias parecidas a esta cola estén implicadas en la introducción de otras proteínas en el núcleo plantean una cuestión del máximo interés: ¿desempeña la cola alguna

función in uiuo? No podemos contestar mientras no se detecte el gen, tal como se encuentra en el clon lambda TH3, en el genoma o en el ARNm. Estas investigaciones y otras posteriores realizadas en el Laboratorio de Genética Molecular de la Facultad de Medicina de laUniversidad de Barcelona se encaminan a completar la caracterización de los genes de la his-

8. GEN DE LA HISTONA Hl.La región codificadora se inicia con el triplete A?G; a éste le siguen los demás tripletes que se traducirán en la secuencia de la proteína .8I1. El frnal de la región codificadora se reconoce por el triplete ?14,{. Delante y detrás de dicha región aparecen las secuencias que pueden desempeñar una función reguladora; en la región 5', la secuencia promotora TTTAA, las seeuencias específicas de los genes HI,AGAAAACACAyIa secuencia alternante GTGTGTGTGT.En la región 3', la secuencia de 16 nucleótidos GGCTCTTTTAAGAGCC, con dos mitades complementarias de siete nucleótidos, marca el final de la molécula de ARNn. Las secuencias que siguen a esta región 3'se cortarán después de la transcripción por un mecanismo en el que se hallan implicadas, probablemente, las secuencias AAAAGCGC y TTCCA. En azul se representan las secuencias que sólo existen en el gen o que son eliminadas del ARNm antes de la traducción. CoNsrnuccróN »s uN SBn Vtvo

tonaIll

con el objeto de poder abordar

su expresión genética diferencial. Siendo, como se ha dicho anteriormente, la histona fI1 la que controla

la superestructura de la cromatina, de Ia mano de esa proteína puede recorrerse un doble camino: el de la expresión genética del gen a la histona, y la vía inversa, de la histona al gen. En

este último caso se trata de descifrar el papel que esta proteína ejerce controlando la accesibilidad de los genes en la cromatina a la maquinaria mole-

cular responsable de su expresión fenotípica.

para estas investigaciones, la líI nea germinal espermatogénica estudiada en nuestro laboratorio

coastituye un modelo ideal. ,4.lo largo de la espermatogénesis ocurren cambios drásticos en la estructura y función del genoma que se acompañan

de cambios cualitativos y cuantitativos en Ias histonas f11. Las implicaciones de los avances en el cono-

cimiento de los mecanismos

expresión genética para descifrar los procesos que conducen a Ia diferenciación de las células normales o a su

transformación cancerosa resultan evidentes. Pero, además, el modelo investigado permitirá, utilizando el genoma de la línea germinal como hilo de Ariadna, llegar hasta los rrlecanismos que programan el desa-

rrollo embriológico y que se encuentran en la base de las futuras características fisiológicas o patológicas del individuo y la especie.

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HIsroNE GpN¡s

Srnucrun¡. OnceNrze-

rtoN & R¡cuI-,A.rroN. Dirigido por G. S. Stein. J. L. Stein y W. F. MarzlufT. John Wiley & Sons. 198'1.

OnceNrz.qrroN or rrc HlsroN¡ G¡NEs rN THE RArNBow TRour f.tA¿Mo ?ATRDNER11). W. Connor. J. Mezquita, R. J. Winkfein. J. C. States y G. H. Dixon en Journal of Moleculur Ero lution,voL 20, págs.

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OncrilrzenoN,rNo NucLrorros SseusNcE oF RArNBow TRour HrsroNE ¡124 rNo H3. W. Connor. J. C. States. J. Mezquita y G. H. Dixon en Journal oJ Molecular EtolLttir¡n, vol. 20. págs. 23ó-2501 198.1.

AN 111 Hrsro¡-¡ G¡NE ¡noM RerNsow TRour ISA¿,r.1o GATRD^"ERrr). J. Mezquita, W. Connor, R. J. Winkfein y G. H. Dixon en JoLtrnctl of Molecular Etolúir»t, yol. 2

l. págs. 209-219; 1985.

HlsroNr 11,1 eND 1l2B GENES rN RArNBow TRour ISA¿Mo c,unouerur). R. J. Winkfein, W. Connor. J. Mezquita y G. H. Dixon en Journal oJ' Molecular Evolution, voI. 22, págs. l-19; 1985.

Antonio Garc ía-Bellido Génesis y desaruollo de una nueva ciencia

o aparece en las negritas de las gacetillas sedicentes culturales. Ni es de cuna aristocrática, aunque lo sugieran sus apellidos realengos, García-Bellido y García de Diego. Tiene. por conira, a sus espaldas, anchas espaldas. una herencia de saber de rara singularidad en la España contemporánea. Hijo de iberista afamado, nieto de lexicógrafo famoso y hasta cuñado de experto filólogo. Buscar la raíz de las cosas llámense fundación de colonias foceas del Mediterráneo occidental o establecimiento de castros astures, derivación de este participio del españo1 de Hita o etimología de aquel aoristo griego- debió ser preocupación familiar que hubo de compartir. como si algo su¡,'o fuera. en Ios años menesterosos de Ia posguerra. Antonio García-Bellido nació en Madrid en 1936. "En la biblioteca de mi padre. enriquecida además con la del paleontólogo Hugo Oberrnaier que nos la legó. había libros de

del locus.f,rrrt¡trecl de Drosophilu rnelunogaster', que defendí en la Universidad Complutense en 1962.Y me casé." No da

por terminada su fase de formación. Con María Paz Capdevila. su rnujer y. andando el tiempo, compañera de investigaclón. se rnarcha al Instituto de Anaton.ría Comparada de la Universidad de Zurich para trabajar con E. Hadorn: ha empezado y'a a publicar en alemán aigunos artículos sobre fisiolo-eía 1' dif-erenciación celular, que remata con el escrito. en colaboración con Hadorn, sobre prolif'eración de cultivos eel tLlrt'e. rle D ro sttl,lt i l,t. "\'olrirnos a España en i965 y, después de unos meses. ernpecé rni se_gundo período posdoctoral en el Instituto de Tecnolo_eía de California." Los dos años que transcurren aquí

divulgación científica.

con A. H. Sturter,ant v E. Lewis no son de mero discente. "Sturt". del nrítico trío (con Bridges y Muller) que apuntala la escuela de \,{organ. es ya un anciano, "muy brioto que no se perdía ninguna lec-

De su lectura surgió mi

ción del seminario donde

vocación por la biolo-eía del desarrollo: el cómo y el porqué se hace un organismo a partir de un

yo exponía

huevo.'' García-Bellido

más capacitado para

entra a 1os diecisiete

maravillarse ante el des-

años en la Universidad

pliegue y transformación celular, fenómenos desconocidos para los acostumbrados a trabajar en

1o que estábamos realizando en bioIogía del desarrollo en

Europa. Era quizás el

de Madrid. de donde sale licenciado en biología a los 22.

cortes histológicos fija-

No existió en la España de la primera mitad

dos".

del siglo una línea in-

García-Bellido esboza 1o que será su teoría

vestigadora sostenida

en el campo de ia gené-

apogenética de1 desarrollo, enfbque alternativo a

tica. por más que figu-

la explicación clásica

ras aisladas (Fernández

Nonídez y, sobre todo. Antonio de Zulueta) rea-

Antonio García-Bellido inició una nueya línea de la genética atraído por el cómo y el porqué se hace un organismo a

lizaran algunos trabajos decorosos. Pero es una genética morganiana, estática. que atiende a la relación de vecindad de los genes en el cromosoma o su estructura interna.

I l1

García-Bellido le interesaba, por contra, de qué rnodo 1ot genes vcn contigurando paso a paso el organismo embrionario, la morfogénesis. Se recibía en sus años estudiantiles. y se recibe, una enseñanza dogmática, de apuntes. Enfiascarse en el laboratorio o consultar otr¿rs fuentes podía acarrear varapalos inmisericordes, como el suspenso en genética que estuvo a punto de anotarse en su brillante erpediente académico por ir más allá cle 1a lección dictada. Aprende por su cuenta ¿rlemán e inglés. Sale al extranjero. "Después de una estancia de siete lneses en el departamento

de zoología de Cambridge con el profesor W.

B. Wigglesworth. empecé Ia tesis doctoral. sobre f'enogenética 70

partir de un huevo

epigenética: de acuerdo con esta irltima. en las cé1u1as

embrionarias ini-

ciales los campos n.rorfogenéticos de regulación detinidos por distribución de morfógenos determinan 1a dit-erenciación de cé1ulas genéticamente iguales o inespecíficas. En la tesis apogenética de García-Bellido, el genoma activo de cada célula determina un comportamiento celular especítico, y corresponde a éste organizar las células en sistemas supracelulares.

Tal visión fisiológica del desarrollo 1a ha ido consolidando en las seis áreas de investigación donde ha demostrado un interés mayor: bases genéticas del reconocimiento celular, mosaicos genéticos y mapas del blastodermo, análisis c1onal de sistemas en desarrollo. genética de las céluIas somáticas, transregulación y sintagmas genéticos e interacciones intercelulares en la morfbgénesis. Se adentró en la primera durante su estancia en Zurich, en la segunda y tercera 1íneas estando va en California. inició las dos Terr¿es 3

siguientes a comienzos del decenio de los setenta, y en los años ochenta la última.

: f\ué pautas se siguen en la formación de los epitelios ó \f de las alas y patas de la mosca del vinagre? En el

laborat-ório de Hadorn aborda las bases genéticas del reconocimiento celular realizando experimentos de disociación de células procedentes de discos imaginales con su reagrupación y metamorfosis posterior, que revelan unas configu-

el alcance de los mismos. "Nos proponemos en este artículo (lo firma con P. A. Lawrence) describir la investigación sobre el desarrollo de los epitelios intactos y, de manera particular, los importantes resultados e ideas del profesor Antonio García-Bellido y su grupo de Madrid, que todavía no son suficientemente conocidos. Es nuestra intención explicar con la mayor nitidez posible la naturaleza de esas ideas y el tipo de experimentos acometidos para respaldarlas." Crick y Lawrence se refieren a 1a tercera línea de inquisición mencionada: el análisis clonal de sistema en desarrollo

raciones complejas y propias del disco de origen. (Los discos que le condujo a1 descubrimiento de los compartimentos imaginales son grupos de células larvarias que intervienen supracelulares. en la formación de las estructuras del adulto. En Drosophila En la investigación del linaje celular se parte de mosaicos hay 19, nueve pares más el disco genital, único.) Creíase, y lo defendía Hadorn, que la configuración en patrones nor- genéticos producidos por recombinación genética inducida por rayos X. Los clones de células mutantes permiten determales de los agregados celulares nacía ex novo a partir de minar distintos parámetros cuantitativos, desde el número de células indiferenciadas. células que hay en el primordio hasta la ubicación de las García-Bellido diseña un nuevo ensayo con células marestructuras que estamos investigando o la emigración local cadas extraídas de discos imaginales distintos o de diferende ciertas células. así como establecer tes regiones del mismo disco in.raginal propiedades cuaiitativas : morfología de y prueba su tesis de la autonomía celulos clones, segregación de los linajes lar, es decir. se da un alto grado de " No quiero que nctdie que originan las estructuras buscadas y determinación celular en 1a diferenciaenvejezca a mi lado. otras. ción de los tipos cuticulares v poseen (Algo menos espectacular, pero no las células implicadas unas propiedaPrefiero inco rporctr gente menos decisivo para los trabajos de des de reconocimiento que tienen que nueva a las nuevas ideas García-Bellido fue el sacar del terreno ver con la posición que ocupaban en de 1a erudición biológica la recombiel disco de origen. Esta línea de inr es.\ a Las nuevas líneas de nación cromosómica que se opera tigación, objeto ahora de ar.rálisis mo-

lecular en diversos laboratorios. 1a irá refinando solo o en colaboración con alguno de sus prirneros doctorandos en el Instituto de Genética del

Consejo Superior de Ini est isae ione: Científicas. Algo tendrá que ver su ¿rfición a 1a

lilosofía (dedicó

su discurso de in-sreso

investigación. Sí, me gusta seguir por mí mismo el proyecto del comienzo al fin. Otra cosa son los seminarios. Ahí es donde cada uno da la medida de sí mismo."

en la Academia de Ciencias a una 1ectura chomskyana de la -uenétical ¡' a la música de cámara con su estilo de trabajo solitario. "No quiero que nadie envejezca a mi lado. Prefiero incorporar gente nueva a l¿is nuevas ideiis ¡, a las nuevas líneas de investigación. Sí, me gusta seguir por mí mismo el proyecto del comienzo al fln. Otra cosa son los seminarios. Ahí es donde cada uno da la medida de sí mismo."

T a autonomía de la celula le permite investigar el análisis l-r genétic., tle lu herene ia eelrrlcr en los discos imaginales. Se ocupa así de alelos letales en mosaicos genéticos para definir el tiempo de acción de los genes. valorar el et'ecto de las mutaciones en la proliferación y en 1a dif'erenciación celu-

lares, y, en general, explorar los procesos de desarrollo durante el períoclo que media entre la formación del cigoto y la constitución del organismo a término. No es poca la virtualidad de ese análisis. extendido hoy al plano molecular. que permite acotar la función de este o aquel -een. así como identificar redes de regulación génica. Pero las ideas y los trabaios de laboratorio de GarcíaBellido no I'rubieran llegado t¿rn pronto a los manuales (el "Alberts", por ejernplo), ni por supuesto sería hoy miembro de la Regia Sociedad Londinense, cle la Academia Nacional estadounidense de Ciencias y cien más, si Francis Crick, el descubridor con Watson de la estructura helicoidal del ADN. no htrbiera reconocido desde la tribuna de Scíence en 1975 Co\s rRt c( ro\ uL I r Scn Vrr u

durante Ia división celular normal. la mitosis. y en aprovechar las posibilidades que le ofrecía la inducción de mutaciones letales.) El fruto más divulgado del análisis

clonal ha sido ia cartografía dei embrión en desarrollo, esos mapas con un lejano parecido con ei de los cuatro colores que dividen los territorios que más tarde habrán de conformar los segmentos de la mosca. \u\ capas germinales y hasta las quetas o los tricomas.

Se expresa con cla¡idad precisa cuando habla. Cordial. No mira el reloj. Duro y seco con el provincianismo regionalista, en todos los sentidos, que ha empapado la médula de la investigacióty docencia españo-

las. Reacio al direccionismo petulante: "He sufrido por la impotencia, por la frustración de ver que la sugerencia que parece razonable, positiva y justa no puede llevarse a cabo por la malicia y la desidia o cobardía de los responsables de la acción." combinación del análisis genético y la clonación celular desembocó también en su idea de los genes selectores. Los selectores, con los realizadores, son jerarquías de genes que convierten señales genéticas específicas de posición en operaciones de desarrollo y, a la postre, en diferenciación celular espacial. Son la clave para comprender, hoy, el tamaño, la forma del ala o el patrón de venación en Drosophila. Pero la existencia de compartimentos y consera

vación de los mismos genes selectores y realizadores en otros organismos hace pensar que mañana, quizás, entenderemos cómo se generan las circunvoluciones del cerebro humano. El camino está abierto. Luis Alonso '7t

Carbohidratos en el reconocimiento celular Nathan Sharon y Halina Lis

Las células colocan en su sttperficie azítcares que hacen de señales de reconocimiento para oÍras células.

Los medicatnentos dirigidos hacia esas moléculas servirán para detener la infección y la inflanmción

1952 Aaron Moscona separó las células de un embrión de pollo al incubarlas en una solu-

ción enzimática

agítarlas suave-

mente. Pero no permanecían aisladas, sino que volvían a reunirse en un nuevo agregado. Moscona observó también

que, cuando las células retinianas y las hepáticas convergían así, las retinianas emigraban hacia el interior de la masa celular. Tres años después, Philip L. Townes yJohannes Holtfre-

ter realizaron un experimento semejante con células de embriones de anfibio, que en este caso se reorganizaban para producir las capas de tejidos de

donde procedían.

Estos experimentos, sumados a incontables observaciones, ponen de manifiesto la capacidad de las células para reconocerse entre sí y responder en conjunción. Los espermatozoides, por ejemplo, distinguen los ovocitos de su propia especie de los gametos femeninos de otras, y se unen sólo con los primeros. Algunas bacterias se asientan, de preferencia, en el intestino o en el tracto urinario, mientras que otras hacen en órganos diferentes.

Está, pues, justificado, el interés

por descifrar el lenguaje de las interacciones celulares. Aunque se desconocen las bases químicas de la mayoría

de los fenómenos de reconocimiento

celular, han ido surgiendo algunas 1' } i,{1, ill,\ i.1li hallan adscritos al departamento de

¡lA'l'iJ¿§ S}IAIt{}¡* se

biofísica del lnstituto Weizmann en Rehovot. Durante lasgos años han trabajado juntos en el estudio de carbohidratos complejos y lectinas, proteínas que se unen selectivamente a los carbohidratos.

explicaciones bastante satisfactorias a 1o largo del último decenio. Las proteínas, que median en la ma¡oría de Ias reacciones químicas en el interior de las células. también aparecen en su superficie, donde. pol supuesto, desempeñan su cometido, Abundan, sin embargo. 1os indicios de que los hidratos de carbono o carbohrdratos (también llamados azúcaresr son los

malcadores plincipales del reconocimiento celular': de los avances en ese terreno se beneficrarán. sin duda, la prevención ¡- e} tratamiento de las

integrada por monosacáridos I azúcares simples como Ia glucosa ¡- Ia fructosa) y por oligosacáridos ¡' polisacáridos, compuestos por monosacáridos

enlazados. Hasta finales de los sesenta creíase que Ios carbohidratos se

limitaban a una función energética (en forma de monosacáridos 1. de molécuias de reserva como el almidón, un polisacárido) o a una función estructural (los polisacáridos ceiulosa en Ias

plantas y la quitina en el exoesqueleto de los insectos). Las otras dos familias fundamentales de compuestos

enfermedades. Los bió1ogos aceptan que ias cé1ulas se reconocen entre sí gracias a la existencia de parejas de estructuras complementarias situadas en su superfi cie : una estructura acomodada en 1a superficie de una cé1ula porta

biológicos ácidos nucleicos, portadores de-1os la información genética, y las proteínas- se erigían, por razones estructurales obvias. en candidatos ideales para desempeñar una gama más amp)ia de lunciones.

información que 1a estructura de otra puede descifrar. idea que generaliza Ia hipótesis de la llave ¡- 1a cerradura, formulada en 1897 por Emil Fischer, para describir Ia especificidad de las interacciones entl'e enzimas y sustratos. Paul Ehrlich la amplió en 1900

compleja. A diferencia de lo que ocurre con los nucleótidos en 1os ácidos nucleicos y con los aminoácidos en Ias proteínas, que sólo se traban de un único modo, Ios monosacáridos. unidades componentes de oligosacáridos

para expiicar 1a elevada especificidad de las reacciones de1 sistema inmunitario. Y en 1914 Frank Rattray Lillie hizo uso de la misma hipótesis para

señalar el reconocimiento mutuo de óvulo y espermatozoide. Hacia los años veinte, la hipótesis de Ia llave y la cerradura se había convertido en uno de los postulados centrales de la biología ce1ular, 1o que

impidió que 1a naturaleza e identidad de las moléculas del reconocimiento celular siguieran envueltas en el misterio. Para Ia mayoría, la idea de que esas moléculas fueran los carbohidratos parecía descabellada. La familia de los carbohidratos está

Además, poseían una estructura

y polisacáridos, presentan distintas posibilidades de unión entre sí. Dos monosacáridos idénticos dan lugar a HORMONA

W¡

11 disacáridos diferentes, mientras que dos aminoácidos idénticos sólo producen un dipéptido. Cuatro nucleó-

tidos diferentes originarán 24 tetranucleótidos distintos, mientras que

virtieron en centro de atención.

TIse cambio se debió a dos hechos. la gl primero lue el descubrimiento

cuatro monosacáridos diferentes

de que todas ias células lievan una

podrían configurar hasta 35.560 te-

cubierta de azúcares, constituida en su mayor parte por glicoproteínas y

trasacáridos.

Tamaña diversidad estructural

glicolípidos, dos tipos de carbohidra-

representa una ruina para el químico de azúcares, al mismo tiempo que un enorme beneficio para 1a célula: hace posible que los polímeros constituidos por monosacáridos sean excelentes portadores de información. Los carbohidratos incorporan mucha más información por unidad de peso que los ácidos nucleicos o las proteínas. En el lenguaje de 1os azúcares. las paiabras se escriben apoyándose no sólo en Ia variedad de monosacáridos. sino también en los diferentes enlaces que los unen y en la presencia o ausencia de ramificaciones. Se tardó en tomar conciencia clara de Ia participación de Ios carbohidra-

tos complejos en los que 1os azúcares están unidos a proteínas y lípidos respectivamente. Se conocen ya val.ios

tos. Hacia los años cincuenta, por ejemplo, se sabía ya que los polisacáridos inyectados estimulaban la producción de anticuerpos en 1os animales. Se conocía también que los grupos sanguíneos AB0 están determinados por azúcares de la superficie de ias células de la sangre y que el virus de la gripe se une a los hematíes a través del ácido siálico, un azúcar. Pero

aparecer en la superficie de las céluIas, situadas estratégicamente para combinarse con los carbohidratos de Ias células vecinas. Poseen una especificidad notabilísima: no sólo distinguen entre monosacáridos, sino también entre diferentes oligosacáridos. A propósito de Ia interacción entre lectinas y carbohidratos en el reconocimiento celular, debemos reseñar el trabajo de G. Gilbert Ashwell y de Anatol Morell, quienes en 1968 sepa-

hasta Ia década siguiente no se con-

millares

de glicoproteínas y glicolípi-

dos, número que crece a un ritmo vertiginoso. Tamaña diversidad tiene su

sentido:

repertorio de las estructu-

ras ubicadas en la superficie de 1a célula según ésta se desarrolle, enferme o entre en fase de diferenciación. EI conjunto de carbohidratos de una célula cancerosa diverge del que porta una céiula normal. Las lectinas propiciaron también el cambio. Estas proteínas se combinan con los azúcares con presteza, gran

selectividad y reversibilidad. Suponíase que las lectinas eran un atributo exclusivo del mundo vegetal, hasta que se descubrió su presencia en toda la escala orgánica. Suelen

BACTERIA

CELULA VIBUS

TOXINA

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1. CARBOHIDRATOS DE LA SUPERFICIE CELULAR, puntos de anclaje para otras células, bacterias infecciosas, virus, toxinas, hormonas y muchas otras moléculas. Los carbohidratos intervienen en la emigtación de las células durante el desarrollo embrionario, los procesos infecciosos y otros fenómenos. Los compuestos constituidos por carbohidratos que están unidos químicamente a proteínas reciben el nombre de glicoproteínas; si los carbohidratos están unidos a lípidos, hablaremos

de glicolípidos. CoNsrnuccróN op uN S¡n

Vlvo

raron enzimáticamente unas cuantas moléculas de ácido siálico de ciertas glicoproteínas del plasma sanguÍneo, y las inyectaron en conejos. Aunque las glicoproteínas persisten durante algún tiempo en la circulación de la sangre, vieron que desaparecían en seguida las moléculas deficientes en ácido siálico.

Ashwell y Morell observaron que las glicoproteínas acababan en el hígado. La eliminación de los ácidos siálicos había dejado desnuda la galactosa de las glicoproteínas, y las galactosas expuestas se habían unido a una lectina de las células hepáticas. Se demostró luego que, si eliminaban los ácidos siálicos y las galactosas al descubierto, volvía a su valor normal lavelocidad de eliminación, fuera de Ia sangre, de las moléculas. A partir de estos resultados, llegaron a la conclusión de que las cadenas laterales de

carbohidratos de las proteínas servían

acuerdo con patrones característicos.

quizá de marcadores para identificar cuáles han de ser eliminadas de 1a cir-

Uno de los carbohidratos es el trisa-

culación para su degradación ulterior.

nario específico del estadio (SSA-1), o también Lewis' (Le'). Aparece en el estadio de 8 a 16 células. cuando el embrión, hasta entonces un agrupamiento celular más o menos suelto, adquiere una estructura esférica, lisa

/\ semejanza de los carboh idratos de -f,L super[icie. las lect inas sufren cambios que coinciden con Ios estados fisiológicos y patológicos de la célu1a. En 198 1 Reuben Lotan y Abraham Raz

demostraron que 1as células tumoraIes procedentes de ratón o de hombre portan una lectina de superficie que no se encuentra en las células normales: más tarde se evidenciaría la implicación de esa lectina en el desa-

rrollo

de metástasis, Trabajando con embriones de ratón.

Sen-itiroh Hakomoi'i ¡'Ten Feizi han demostrado que. cuando un ór'ulo fecundado se divide. las estructul'as de los carbohidratos de las cé1ulas embrionarias resultantes cambian

cárido conocido por antígeno

¡r compacta.

El grupo de Hakomori ha demostrado que un compuesto soluble que lleva unidades múltiples de1 mismo trisacárido inhibe el proceso de compactación e interrumpe 1a embriogénesis. Otros carbohidratos. de estruc-

tura muy parecida. no intervienen para nada. De Io que se infiere que el trisacárido Le' desempeña algún papel en el proceso de compactación.

Los carbohidratos adhesivos son, pues, esenciales en e1 desarrollo embrionario. Con el tiempo iremos domi-

Complejidad estructural de los carbohidratos ácidos nucleicos v proteú1as lleran in- ficado * una entre rnuchas otras

arbohidratos, formación biológica escrita en sus estructlrra-<. Per., son los carbohidratos los que ofrecen una Inavi)r .aLracidad para e1 transporte de i¡ft¡rmaciiin merced a sL1 \ ariedad de conformaciones. Sus rLnidades estructurale-', 1os monosacáridos, pueden unirse entre sí en r-arios ptintos dando lugar a diferentq; formas lineales o ramificada:; en el ejemplo que se muestra abajo, el carbi,hidrato ranl-

nlrclei¡tidt-¡s en 1os ácidos nucleicos, generan só1o cstruclura-s lincalcs, 1o que restringe su diversidad. E1 péptido

(un fragmentc, dc protcína) quc se muestra abajo es 1a irnica ¿stnrctura posible qlle se obtiene a partir de cuatri¡ rrolécu1as de1 aminoácido giicina.

PEPIIDO (TETRAGLICINA)

OLIGOSACARIDO (TETRAGLUCOSA RAIUIFICADA)

MONOSACARIDO (GLUCOSA)

%',. CARBONO

'74

:,.

OXIGENO

estrrrctr-lras que prle-

den fc,¡rlLarse a partir de cuatro n-roléculas idénticas de g1r-Lcosa. Li.s arilni¡ácidos en 1as proteínas, así como los

AMTNOACTDO (GLTCTNA)

É:

l embrio-

É.;".' NITROGENO

HIDROGENO

T¡raes

nando los pormenores de dicha parti-

cipación. Sabemos bastante ya sobre la adhesión bacteriana a las células hospedadoras y la adhesión de los leucocitos a los vasos sanguíneos. Las interacciones mejor entendidas conciernen a la adhesión microbiana, objeto de estudio desde hace una veintena de años y modelo de otras formas

de reconocimiento celular mediada por carbohidratos.

para ejercer su acción dañina, los I ürus,lasbacteriasylosprotozoos deben adherirse a la superficie de un tejido de un organismo sensible. Los agentes infecciosos que carecen de esa

capacidad son barridos de esos sitios potenciales de infección por los mecanismos de limpieza del organismo. Los microorganismos que lleguen a las

vías respiratorias superiores, por ejemplo, podrán ser tragados y luego destruidos por el ácido de1 estómago. Los del tracto urinario podrán ser arrastrados por la orina. Las primeras pistas acerca del mecanismo de la adhesión bacteriana se las debemos aJ. P. Duguid. Enlos años cincuenta Duguid demostró que muchas cepas de Escherichia coli (enterobacteria que puede colonizar otros tejidos) y bacterias emparentadas se adhieren a células del revestimiento epitelial de los tejidos y a los eritrocitos. En presencia de bacterias pegajosas, los hematíes forman cúmulos fenómeno aI que se da el nombre -un de hemaglutinación. Para averiguar cómo se unen las bacterias a las células, Duguid las expuso a una gama amplia de compuestos. Vio que sólo el monosacárido manosa y azúcares afines inhibían la hemaglutinación. Observó, asimismo, que las cepas bacterianas responsables de la hema-

glutinación sensible a la manosa tenían apéndices pilosos submicroscópicos en su superficie. Estas estruc-

turas miden de 5 a 10 nanómetros de ancho por varios centenares de largo. Les dio el nombre de fimbrias, palabra latina que significa flecos. Por aquel entonces, Charles C. Brinton, Jr., describió las mismas estructuras y les dio el nombre de pili, vocablo latino que significa pelos. Ambos términos se siguen usando. Llegamos a los años setenta, cuando aparecieron los primeros trabajos del grupo de Ronald J. Gibbons sobre la adhesión selectiva de bacterias a nichos de la cavidad oral. Gibbons observó q:oe el Actinonxyces naeslundii colonizaba Ia superficie epitelial

de niños (sin dientes o con ellos) y adultos. Por el contrario, la bacteria

CoNsrnuccróN o¡ uN Sen Vryo

2. ADHESION SELECTM de las bacterias a los tejidos. A través de las fimbrias, las bacterias se unen a ciertos carbohidratos de la superficie celular. Estas interacciones determinan qué tejidos son susceptibles de la invasión bacteriana.

A. uiscosus, emparentada con aquéIla, no medraba en la boca hasta que los dientes ya habían salido de las encías; prefiere los dientes a las superficies epiteliales de la boca.

ganismos. Los mutantes de bacterias que habían perdido 1a capacidad de unirse a las céiuias intestinaies se

mostraron también incapaces de inlectar a los animales. Además, algunos cochinillos presen-

f a especi[icidad de la adhesión bacIJ teriana a un tejido determinado, lo sabemos ahora, constituye un fenómeno general: E. coli, agente causal común de las infecciones del tracto urinario, abunda en los teiidos que

rodean los conductos que unen el riñón a la vejiga, pero no frecuenta el tracto respiratorio superior. Por

taban una resistencia genética a las K88: ni siquiera las bacterias potencialmente virulentas podían unirse a las células de su intestino. Con la selección genetica de cerdos inmunes se logró una progenie resistente a las K88. EI organismo causante de 1a gono-

rrea, l/elsseria gonothoene, es otro

individuos de la misma especie a tenor de la edad, constitución genética y estado de salud. A principios de los

ejemplo de especificidad de especie y tejido. Se adhiere a las célu1as humanas de los epitelios genital y oral, pero no a 1as células de otros órganos o de otras especies animales. Ahí reside el motivo de que el hombre sea hospedador exclusivo de Ia N. gonorchoecLe y de que otros animales no contraigan la gonorrea. La propuesta avanzada en 1977 por Itzhak Ofek, David Mirelman y uno

setenta, los equipos de R. Sellwood y Richard A. Gibbons estudiaron la

impulso al estudio

su lado, los estreptococos del grupo A, que colonizan sóIo el tracto respirato-

rio superior y la piel, raramente producen infecciones del tracto urinario. La adhesión bacteriana varía no sólo de un tejido a otro, sino también

entre especies y, en ocasiones, entre

infectividad de la cepa K88 de E. coli. Estas bacterias, pesadilla de granjeros, producen diarrea en el cochinillo. El grupo de Gibbons vio que las bacterias K88 se adherían a las células abdominales de los cochinillos expuestos, pero no a las de los cerdos adultos o del hombre, que son resistentes a la infección de tales microor-

de nosotros (Sharon) dio un gran

de la adhesión bacteriana. Afirmábamos que la adhesión bacteriana estaba mediada por las Iectinas bacterianas de superficie que se unían a 1os azúcares complementarios de la célula hospedadora. La idea se ha asentado. Se ha comprobado que las bacterias producen Iectinas específicas de ciertos carbohidratos y dependen de esas proteÍnas para adherirse

a un tejido del hospedador, primer paso del proceso infectivo.

Las lectinas mejor caracterizadas son las que corresponden a ias fimbrias del tipo 1 de E. coli, q:ue se unen, de preferencia, a Ias glicoproteínas de superficie que contienen manosa. Por los estudios de Catharina SvanborgEdén conocemos el funcionamiento de

Ias fimbrias P, que interaccionan específicamente con la substancia P de los grupos sanguíneos, un glicoiípido muy común en cuya composición

entra el disacárido galabiosa. Los equipos de Karl-Anders Karlsson y Victor Ginsburg han cartografiado las especificidades de lectinas de una amplia gama de cepas bacterianas. esas investigaciones se deduce las bacterias no se unen so'lo a los extremos de los carbohidratos de superficie; se traban también con azú-

f)e t-l

q:ue

cares del interior de 1a estructura. Además, diferentes bacterias pueden

engarzarse en zonas diversas del mismo carbohidrato. Y si en una célula queda expuesta una sola cara de oligosacárido, aquélla se unirá a bacterias de una clase v no a otras. La capacidad de los azúcares de super'ficie para servir de puntos de unión depende de la presencia de 1os g1úcidos. así como de su accesibilidad v modo de presentación. Se está consolidando la idea según Ia cual la unión de las bacterias a 1os

azúcares de superficie de 1a célula hospedadora marca el comienzo de 1a infección. Se aduce, por ejemplo, que

las célu1as epiteliales del tracto urinario

de los

la infección bacteriana que el resto de población. Pero Ias bacterias se unirán a las células epiteliales si éstas se recubren antes con un glicolípido sintético que contenga galabiosa. Las células intestinales de cochinillos resistentes aE. coli K88, el agente causal de 1a diarrea, carecen del macrocarbohidrato al que se engan1a

individuos que carecen

cha la bacteria. Aunque se desconoce

la estructura exacta del carbohidrato. se sabe que está presente en 1os cochinillos sensibles y ausente en e1 cerdo adulto, por cuya razón las bacterias no logran instalarse en el intestino de1 cerdo adulto y colonizarlo, en tanto que infectan al lechal. Otro caso interesante es el de 1a cepa K99 de E. coli. A1 iguai que 1a K88. 1a cepa K99 ploduce dial'rea en allirnales estabulados pero no en el hombre. Menos específica que 1a K88. infecta terneras, corderos 1'lechones. Las bacterias K99 se unen a un g1icolípido que

contiene ácido N-glicocolilneulamÍnico (un tipo de ácido siálico r ligado a1

lactosilcerámido. Este 91ico1ípic1o. presente en cochinillos. ter'neras ]' corderos. está ausente en las cé1u1as del cerdo aduito ¡' de1 horrble. que a su \.ez contrenen ácido -\--acetilneuramínico. un aná1ogo del ácldo siálico

no enlazante. En este caso. una pequeña diferencia entle do-. azúcales simiiares -.ustitución de r-rn glupo acetilo por-1a otro glicoli1o- se detecta rápidamente por'1as bacterias. 1o que explica 1a gan-ra de hospedadores de 1a infección. Las ideas qr-re se acaban de exponer han recibido un nuevo respaldo de 1os experimentos con dos lectinas de las

fimbrias de E. coli que infectan el tracto urinario del hombre y del perro. Ambas lectinas reconocen Ia galabiosa. si bien una se une sólo a 1as células del epitelio humano y 1a otra sólo a las células de1 perro. Los glico1ípidos de la superficie de 1as células que 1levan galabiosa varían de forma sutil; las pautas de unión de las lectinas se ajustan a 1a vinculación de la cepa de E. colí con el hospedador.

I l ser la adhesion bacteriana un .Fl, hecho clave en e1 ploceso de la infección. Ia inr.estigación médica está considerando seriamente el uso de azúcares para su prevención y tratamiento. Los azúcares que selectir-amente inhi-

ben la adhesión podrían actuar como d

i-t ractores mo'lecu'la res. i ntercep-

tando los patógenos antes de qr-re alcanzaran su corespondiente tejido. En colaboración con Ofek. NIoshe

.\ronson y Mirelman. inicianros esa línea en 1979. Inyectamos una cepa de E. coli específica de manosa en 1a r-ejiga urinaria de ratones. En algu-

nos animales, inyectamos también alfa-metiimanósido, un azúcar que en tubo de ensayo inhibía 1a adhesión bacteriana a Ias células epiteliales. La presencia del azúcar redujo la colonie1

zación bacteriana de1 tracto urinario. Svanborg-Edén ha realizado experimentos análogos con -8. coll portadora de fimbrias P que infecta el riñón del ratón. Incubó Ias bacterias en soluciones de globotetraosa. un azúcar que se encuentra en e1 glicolípido de las células renales. Inyectó luego esas

bacterias en los ratones

persistieron

en el riñón durante menos tiempo que

la substancia P de los grupos sanguíneos no se unen a las bacterias E. coli

portadoras de fimbrias P; estos individuos son mucho menos sensibles a

LINFOCITO Elvl cFANDO LINFOCITO CON DIFERENTES

RECEPTOBES DE APOSENIAN/IENTO BECEPTOR DE

/ -

APOSENTAMIENTO

(SELECT|NA

FUERA DE LA VENULA

q\ ffi

CARBOHIDRATOS

k PLACA

CJE PEYER

DEL SISTEMA INMUMTARIO: defienden el organismo frente a la infección saliendo de la circulación y emigrando a los tejidos. El primer paso implica la adhesión selectiva de los leucocitos a las paredes de las vénulas del endotelio alto (fotografia). La adhesión depende de las selectinas, que se unen a los car3. LEUCOCITOS

Teu.rs

Ias bacterias sin tratar. James A. Roberts obtuvo resultados semejantes en experimentos con monos: la incubación de E. coli de fimbrias P con un

azicar semejante a la galabiosa

retrasó el desarrollo de las infecciones del tracto urinario. Los glicopéptidos pueden oponerse también a la unión de las bacterias a los tejidos del hospedador. En 1990, el

grupo de Michelle Mouricout demostró que las inyecciones de glicopéptidos obtenidos del plasma sanguíneo de vacas protegían a las terneras recién nacidas frente a dosis letales de E. coli. Los glicopéptidos con azúcares para los que la bacteria tiene afinidad desanima la adhesión de las bacterias al intestino de los animales tratados. La verdad es que. para bloqr-rear la adhesión bacteriana, no se necesitaría ni siquiera un carbohidrato -valdría cualquier agente que pugnara por enlazarse con 1a lectina bacteriana o el carbohidrato de ia superficie de Ia célula hospedadora. En ese

contexto, Edwin H. Beacher- r. sus colaboradores han utilizado anticuerpos frente a la manosa para er-itar la infección de ratones con determinados E. coli específicos de manosa. Los anticuerpos se unen a Ia manosa de

las células, bloqueando los sitios unión de la bacteria.

Los resultados experimentales ava-

cocitos y 1os dirige a1 lugar donde se re-

1an 1a posibilidad de terapias antiad-

quiere su presencia. El proceso exige un reconocimiento entre leucocitos cir-

hesivas en las enfermedades bacterianas. Nuevos estudios en torno a Ia acción de ios azúcares sobre la célula hospedadora y las lectinas bacterianas habrán de conducir al diseño de mejores inhibidores bacterianos. Un punto relacionado con este enfoque se considera ya como algo seguro: puesto que los agentes infecciosos

-incluidas bacterias diferentes dentro de 1a

misma cepa- pueden tener una amplia gama de especificidades de carbohidratos, parece imprescindible

conjugar diversos inhibidores para prel,enir o tratar estas enfermedades. Las interacciones intercelulares dirigidas por carbohidratos no se limitan a Ios fenómenos patológicos; intervienen en el funcionamiento normal del sistema inmunitario. cuyo5 componentes principales son Ios leucocitos. Este grupo Io integran dir-ersas células monocitos y neu-linfocitos, que actúan de forma contrófilosjunta para eliminar bacterias y otros

intrusos, y para mediar en 1a respuesta inflamatoria de los te.lidos

afectados. Aunque los leucocitos circulan por 1a sangre, es en los espacios extravasculares donde llevan a cabo sus funciones principales. EI endotelio, recubrimiento interno de 1os vasos sanguíneos, atrae a los leu-

culantes y células endoteliales exquisitamente regulado y mediado, quizá,

por una famiiia de lectinas estructuralmente emparentadas. Se las suele Ilamar selectinas porque son molécuIas mediadoras del contacto selectivo entre las células; también se las denomina moléculas LEC-CAM (acrónimo de 1a expresión inglesa "leucocyte-ce11, or lectin, adhesion molecules"). Las selectinas, proteínas complejas mu1, asimétricas, presentan una configuración en mosaico poco habitual. Constan de tres tipos de dominios funcionales: uno que sirve de ancla para fijar la selectina a la membrana celu1ar: otro dominio que forma la mayor parte de la molécula, y un tercero. localizado en el extremo extracelular de 1a molécula y cuya estructura semeja la de las Iectinas animales que actúan sólo en presencia de iones calcio. La

unión

de las molécu1as de

carbohidra-

to a ese dominio es fundamental para el funcionamiento de 1as selectinas en las interacciones entre las células.

f_f I I

ace unos 10 años. Eugene C. But-

cher e lrving L. Weissman esta-

blecieron Ios criterios para entender de qué modo las selectinas (cuya exis-

tencia se desconocía) dirigen el tráfico de los linfocitos. Los linfocitos se caracterizan por un rasgo mu)¡ pecu-

liar: patrullan por el organismo

busca de antígenos bacterianos o r,íricos. Con ese propósito. 1os linfocitos salen del torrente circulatorio )¡ recorren los ganglios linfáticos, Ias amígdalas, Ias adenoides, 1as placas de Peyer y otros órganos linfoides secundarios; la emigración de ios linfocitos es selectiva y cada uno busca ei órgano

correspondiente. Para abandonar 1a circulación, se unen a las r.énulas del endotelio a1to, unos r.asos sanguíneos de menos de 30 micras de 1uz. Con una técnica especial que Hugh B. Stamper, Jr., y Judith J. Woodruff

desarrollaron, Butcher ¡r Weissman

observaron que la especificidad del aposentamiento está dictada por Ia interacción selectiva de los linfocitos con Ias vénulas de endotelio alto en los

órganos diana. Butcher y Weissman consiguieron un anticuerpo monoclona1, el MEL-14, que se une a los linfocitos que emigraron a 1os ganglios lin-

bohidratos de otras células. Las selectinas L, de aposentamiento, situadas en la superficie de los linfocitos, determinan sobre qué células endoteliales se fijarán. Una vez que el linfocito se ha unido al endotelio, tiene ya el camino preparado para salir de la circulación sanguínea. CoNsrnucctóN o¡ uN Spn Vrvo

fáticos periféricos. En los cortes de tejido, los anticuerpos bloquearon Ia adhesión de los linfocitos a las vénulas de endotelio alto de dichos tejidos, pero no de otros órganos linfáticos. Cuando se inyecta en el ratón, el MEL11

FARMACO DE CARBOHIDRATOS

,:l

BACTERIA

E .:,

FARMACO DE LECTINA

recrtrun

l''.2' ./

\rF \)---

111":-;

-}.

.e.

h CARBOH IDBATO DE SUPERFICIE

§4 I

CELULA

ADHESION BACTERIANA para combatir la infección. Como preludio de la infección, las lectinas de la superficie bacteriana se unen a la superficie de los carbohi-

4. BLOQUEO DE LA

dratos de la célula hospedadora susceptible (o). Los fármacos

que porten cartrohidratos parecidos podrán evitar la adhesión al unirse a las lectinas (ó); o también, los fármacos que se parezcarr a las moléculas de lectina podrían tener el mismo efecto al ocupar los sitios de enlace de los carbohidratos (c).

la selectir.ra. L. \\¡eissman,

14 inhibe Ia emigración de los linfocitos a los ganglios linfáticos periféricos.

han unido

Butcher y Weissman demostrarort también que su anticuei'po se une a la membrana del linfocito a tlar-és c1e 1a

Rosen. pol otro. dernostlaron en 1989 que el I'ecepto1. de aposentamiento es el mediadol de la adhesión de los 1infocitos a las células endoteliales.

selectina L, glicoproteína responsable de la unión específica de 1os linfocitos a las vénulas de endotelio alto ¡- cor-rocida también por receptol' de aposer.r-

tamiento.

por un lado. ¡- Laulence A. Lasky y

I dilelencra de 1o que oculle con e'l 1L,'"..pto,' cie apo-enramiento. las otl.as dos seiectinas suelen l'ecalar en

Si las vénulas de endotelio alto pe1'-

las células endoteliales.

aun enton-

tenecientes a ganglios linfáticos se exponen a soluciones de selectina L. Ios linfocitos pierden su adhesir.idad: Ias moléculas de selectina L ocupan todos los sitios potenciales de unión a las células endoteliales. Y. a la inversa. como Steven D. Rosen ha demostrado. ciertos azucal es pequeños

ces só10 cuando atlaen a 1os leucoci-

y polisacáridos de mayor tamaño pue-

Cuando un tejido se rnfecta, segrega en reacciólr delensiva citocinas. gl'upo

den bloquear también 1as interacciones entre lifocitos y vénu1as endoteliales. En esos casos, los azúcares se

5. EFECTOS SELECTIVOS de los

tos. ]Iichael P. Ber-ilacqua descubrió en 1987 una de éstas. la selectina E

(ELAfI-1,, Dos años después, era descubielto el telcel miembro. la selectina P (antes GIIP-140 ¡'PADGEMtpor

Rodger P. l-lcEr-er'¡- Bruce ¡' Barbara Furie. en tlabajos independientes.

ai que pertenecen la interleucina-1 y e1 factor de necrosis tumoral. Las cito-

carbohidratos sotrre las bac-

terias. Las bacterias de E, coli poseen una lectina para el glicolípido P. Las bacterias incubadas en presencia del azúcar 78

cinas estimulan las células endoteliales de las vénulas y proYocan en ellas la expresión de las selectinas E y P que se ubican en su superficie. Los

leucocitos se adhieren a las moléculas que sobresalen de su superficie porque su cubierta de carbohidratos contiene

estructuras complementarias. Una vez que se ha unido a Ia pared de una vénula, e1 leucocito abandona Ia san-

gre escurriéndose entre dos células endoteliales adyacentes. Estas dos selectinas apal'ecen en las

células endoteliales en momentos diferentes y reclutan tipos distintos de

leucocitos de 1a sangre. Las células

endoteliales tienen una reserva interna de selectina P que pueden colocar en su superfice en cuestión de

minutos después del comienzo de una infección. La selectina P puede, por tanto, atraer leucocitos que actúan en las primeras fases de 1a defensa inmu-

manosa conservan su adhesividad al tejido epitelial (izquierconstituyente del glicolipido P se une a la lectina de la bacteria, lo que impide su adhesión (d.erecho).

d.a), Un

Tsues

ffi€ff

ha publicado sobre el tema, entre otros, los siguientes artículos: 6.

LAS CELULAS CANCEROSAS presentan carbohidratos poco corrientes en su su-

perficie, lo que puede explicar sus propiedades invasivas. La oncoterapia habrá de

recurrir

a medicamentos que bloqueen Ia adhesividad de las células anormales.

nitaria. La selectina E. en cambio. sólo se sintetiza en las células endoteliales cuando se requiere. por'1o clue tarda más en aparecel'.

pl I-¡l

mecanismo que a¡uda a lo. lcucocitos a abrilse paso a tlaves de la barrera endotelial, ir-rdispensable para que puedan cumplir sus funciones y combatir 1a infección. tiene su talón de Aquiles: permite ia acumulación leucocitaria en punto-i inadecuados provocando disfunciones. hinchazón y dolor. La inflamacrón de 1a

artritis reumatoide, por ejemplo.

produce cuando los leucocitos penetran en las articulacione-s ¡- liberan enzimas proteolíticas, radicales libres del oxigeno y otros factole. tnricos. Otro ejemplo es el de las alteracrones

hísticas debidas a la interrupción temporal del flujo sanguíneo en el ataque cardíaco. Cuando ei flujo sanguíneo se reanuda, los leucocitos de 1a sangre destruyen los tejidos alterados por la lalta de oxrgeno. En teoría, cualquier fármaco que bloquee Ia adhesión de los leucocitos

y su ulterior salida del vaso sanguíneo gozará de propiedades antiinfla-

matorias. La clave para el desarrollo de tales fármacos está en la estruc-

tura

de las regiones enlazantes de las moléculas de selectina y en la estruc-

tura de los carbohidratos donde se enganchan. Investigación que corre paralela a la de la síntesis de carbohidratos inhibidores de 1as selectinas E y P. Para que una terapia antiadhesiva sea eficaz, los fármacos deben cumplir un doble objetivo: evitar la salida inoportuna de los leucocitos del Coss'Lnr

ccrril

oe L:x Spn Vlr,'ci

torlente ¡. facilitar, por contra, su abandono en el lugar idóneo. No se trata

nada inalcanzable, ya que ias

especificidades de ias moléculas de adhesión varían de un tejido a otro. Aparte de su implicación en Ia inflamación. las moléculas de adhesión celular pueden ejercer otros efectos dañinos, verbigracia, Ia diseminación de las células cancerosas por todo el organismo a partir del tumor principal. El carbohidrato que reconoce Ia selectina E se expresa en células de diversos tumores, incluidos algunos cánceres. Bevilacqua acaba de expone1'que por 1o menos un tipo de células cancerosas se une específicamente a Ia selectina E expresada en el endo-

Nacimiento y muerte de la nova Y 197 4 Cygni, de Sumner Starrfield y Steven N. Shore Marzo

1995

Ley y orden en el universo, de Bárbara Burke Hubbard y John Hubbard

Marzo

1995

Máseres en el firmamento, de Moshe Elitzur,

Abril

1995

Los confines de la heliosfera, de J. R. Jokipii

y Frank B. McDonald Junio 1995 Estrellas binarias de neutrones, de Tsvi Piran

telio activado. Quizá para promover

Julio I995

malignas recluten la adhesión de moléculas de las defensas del organismo; en cuyo caso, Ios medicamentos antiadhesivos podrían tener también propiedades antimetastásicas.

Asteroides y cometas como amenaza para la Tierra,

sus propias metástasis, algunas cé1u-

1as

de Andrea Carusi Septiembre 1995 El encuentro del cometa Shoemaker-Levy 9 con Júpiter,

l;l

{X,

A ir

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l{ -:X I ;r

i- Il ]rí L.tr

¡i]t l.¡.

Lr,crtNs :rs C¡Lr- Rncoc;NItlotr' Mor-ncu t-¡s. N. Sharon y H. Lis en §¿r¿¿,¡r¿¿. volumen 2.16. páginas 221-234 1989.

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de David H. Levy, Eugene M. Shoemaker y Carolyn S. Shoemaker

Octubre

1995

Las compañeras de las estrellas jóvenes, de Alan P. Boss

Diciembre

1995

/-lr (U \_ Prensa Científica,

Glicoesfingolípidos Sen-itiroh Hakomori

La composición de esas ntoléculas de membrana

alte ra espectacularmente durante la diferencictción celular

y con lct aparición de un cáncer. Cabe erplotar esos cambios para mejorar el diagnóstico )' el tratamiento de los neoplasias

n 1951 una mujer de 66 años ingresó en un hospital de Charlottesviile, Virginia, para que

le extirparan un tumor maligno

estómago. Su grupo sanguíneo era del

tipo O, comúnmente conocido

Por donante universal. Las pruebas de 1aboratorio demostraron. sin embargo. que en su suero había también antrcuerpos capaces de reaccional contl'a casi todos los tipos de células sanguíneas excepto las suyas propias. No se encontraron donantes cu)-a sangre fuese compatible con esos anticuet'pos. La operación entrañaba. por tan-

to, un gran riesgo. pues probablemente habría de efectuarse durante su transcurso alguna transfusión sanguínea. Para calibrar 1a magnitud dei riesgo al que se iba a exponer se lereallizó una pequeña transfusión de 25 mililitros de sangre de tipo O. Como se presumía, 1a reacción inmunitaria de la mujer fue dramática: en su suero aumentó la concen-

tración de anticuerpos contra la sangre del donante hasta una parte por 51-2. Las pruebas realizadas recomendaban que, para evitar mayores

-cEN-1?iH(ili i{AKíJ}'IOitI tiene

a su

cargo el programa de oncología bioquí-

mica del Centro Fred Hutchinson de Investigación del Cáncer, de Seattle. También enseña microbiología en la Facultad de Medicina de 1a Universidad de Wash i ngton. Tras li cenci arse en

medicina por 1a Universidad de Tohoku, Japón, en 1952, y doctorarse en 1956 por el Instituto de Bioquímica, disfrutó de una beca de investigación en el Hospital General de Massachusetts y 1a Facultad de Medicina de Harvard, integrándose luego en eI claustro docente de Tohoku. En 1963 voh'ió al Hospital General de Massachusetts ¡,, tres años más tarde, ocupó plaza de pro-

fesor visitante en 1a Universidad de Brandeis. En 1975 chison Center.

integró en el Hut-

riesgos, se 1e extirpase sólo parte de1 estómago. Algo de tejido canceroso debía, por tanto. quedar en el cuerpo de 1a paciente. No obstante, para sor-

presa )'satisfacción de todos,

ese

tejido maligno desapareció después de 1a opelación. La mujel vir-ió hasta los E8 años sin lastros de cáncer. ¿A qr-ré se debió 1a espectacular lecuperación de 1a mujer'? Poco des-

pués de

intervención quirúrgica. los

trabajos de Phiiip Levine. de Fundación Oltho. sugrlieron

1as

pri-

meras respuestas. En el examen ruti-

nano

de Ios

glupos sanguíneos sólo

estudia el sistema ABIJ. clasificándose la sangle r- Ios tejidos en los ya familiares tipos O.A. B ¡ AB. Existen, sin embal.go. muchos otros sistemas de grr-rpos sangr-ríneos. ¡' 1a expresión

o supresión de I'alios antígenos en cada uno de esos sistemas determina

un grupo sanguÍneo distinto e independiente. Para uno de esos sistemas,

denominado P. 1a paciente en cuestión fue e1 primer caso conocido cuyos tejidos normales carecían a 1a vez de dos marcadores inmunológicos específicos, los antígenos P y Pr. La falta de esos marcadores inmunológicos define un tipo raro de sangre dentro del sistema P; a1 grupo sanguÍneo en cuestión se le denomina p. Según se ha comprobado posteriormente, sólo una de cada 100.000 personas Presenta el grupo sanguíneo p. Cuando Levine anaTizó el suero de ia mujer descubrió otra interesante peculiaridad: contenía anticuerpos contra los antígenos P y P1, que sólo se forman en presencia de esos dos antígenos. ¿De dónde procedían? La hipótesis de

Levine era que probablemente ios

expresara el tumor. Treinta años después de 1a operación se analizó en nuestro laboratorio una muestra de tejido del tumor de aquella mujer, guardado congelado en el laboratorio de Levine. Nuestro aná-

lisis demostraba que el tejido contenía, efectivamente, dos tipos de antí-

genos, uno que reaccionaba contra anticuerpos anti-P y otro que 1o hacía contra anticuerpos anti-Pr. Encontramos también que ambos antígenos pertenecían a la clase de moléculas denominadas glicoesfingolípidos, que aparecen embebidas en ias membranas celulares por todo e1 organismo. Como su nombre indica, los glicoesfingolípidos poseen una parte 1ipídica (sustancia soluble en grasa) 1'otra de azicar. El prefijo esfingo indica que la parte lipídica de la moiécula es una esfingosina. Se confirmó así 1a primi-

tiva conclusión de Levine, según la cual los anticuerpos del suero de la mujer los habían inducido antígenos incompatibles localizados en el tumor. a enérgica respuesta rnniunitaria ¿e la mu.ier lrente a )a sangre del donante derivó de 1a presencia de anticuerpos anti-P y anti-Pr en su sis-

T L¡

tema; en circunstancias normales 1os toleraba porque sus tejidos sanos carecÍan de los antígenos P ¡. Pr. Con

la transfusión, no obstante. recibió antígenos P y Pt que estimularon Ia rápida producción de más antrcuerpos anti-Py anti-Pr. La pre'encia masiva de anticuerpos probablemente desencadenó una compleja reacción por parte de las céluIas del sistema inmunitario, que provocó la destrucción selectiva de las células de1 tumor,

portadoras de 1os antigenos incompatibles P y Pr. Se sabe desde hace algún tiemPo que todas las células animales y algunas vegetales poseen glicoesfingolípidos. Pero apenas si 1os investigadores habían prestado atención a esas moléculas, cuya función biológica estaba lejos de conocerse. Son numerosos los estudios que han establecido que Ios antígenos de los grupos sanguíneos y

otros muchos que se modifican

TEN{AS 3

1. MODELOS MOLECULARES correspondientes a las cuatro estructuras nucleares básicas de los glicoesfingolípidos, sustancias que suelen integtarse en la membrana plasnática que

NUCLEO DE TIPO GANGLIO GRUPO N.ACETlL

\\ \\

CEBAMIDA

!-v_./ NUCLEO LACTO DE fIPO 2

NUCLEO LACTO DE TIPO 1 Ñ-ACETIL. GLUCOSAMINA

Coxsrnucclóx o¡

uN Snn

Vn,o

recubre la céIula. Todos los glicoesfingolípidos constan de una cadena de carbohidrato unida en ángulo recto al Iípido ceramida. En su mayoría se ajustan a una de estas estructuras básicas, definidas por la identidad y el tipo de enlace quÍmico de los azúcares más próximos a la ceramida. En todas estas estructuras, la ceramida aparece unida a una glucosa, y ésta a una galactosa. En los glicoesfingolípidos de la serie ganglio (arriba, a la izquierd.¿) la cadena se continúa en el azúcar N-acetilgalactosamina, al cual se enlaza otra molécula de galactosa. Las dos galactosas llevan unido un azúcar, el ácido siálico, no mostrado aquÍ. En la serie globo, la cadena inicial glucosa-galactosa se continúa en otra galactosa y una N-acetilgalactosamina (arriba, a la d,erecha). En la serie lacto, por el contrario, la cadena inicial se prolonga en el azúcar tr/-acetilglucosamina y una galactosa. Según la posición que adopte el último enlace, las moléculas de la serie lacto se sutrclasifican en moléculas de tipo I (abajo, a la izquierd.a) y de tipo 2 (abajo, a la d.erecha). Los glicoesfingolípidos de la serie lac' to pueden alargarse y ramificarse; entre la gran variedad de moléculas a que dan lugar se cuentan los antígenos de los grupos sang'uíneos del importante sistema áIlñI. Los modelos se muestran en su conformación de mínima energía. 81

expresan de manera anómala durante el desarrollo de tumores malignos son glicoesfingolípidos, lo que ha suscitado eI interés por esos compuestos de

los inmunólogos que investigan Ios orígenes del cáncer y, a su vez, ha generado gran cantidad de información sobre la función que desempeñan en la vida de las células, en el cáncer y en otras enfermedades. Por encontrarse dispuestos sobre la

membrana celular, los glicoesfingolípidos participan activamente en la regulación de las interacciones que suelen establecer las células normales con su medio ambiente. Así, por ejemplo, en el anirhal ejercen de mar-

cadores característicos de ciertos órganos y median en los procesos de comunicación y reconocimiento entre células. Además, la expresión de los glicoesfingolÍpidos sobre la superficie celular cambia a medida que la célula se divide y diferencia; resultan, pues,

esenciales para que el organismo

ctezca y se desarrolle acordemente. Según se sabe, la regulación del crecimiento larealizar,, al menos, de dos

maneras. Por una parte, detectan la densidad de células similares en su vecindad y estimulan o inhiben la división celular y, por otra, gracias a su interacción con proteínas receptoras de la superficie celular bloquean la respuesta celular a los factores de crecimiento que se encuentren en el medio que rodea a las células. Dada la omnipresencia e importancia de las funciones reguladoras de los glicoesfingolípidos, no sorprende su implicación en numerosas enfermedades graves. Según parece, constituyen el sitio de infección de varios tipos de virus y bacterias. Su papel en el cáncer lo ilustra el caso de la mujer

portadora del grupo sanguíneop: los tipos de antígenos de grupos sanguíneos expresados sobre la superficie de las células normales y las poblaciones

relativas de cada tipo de antÍgeno cambian durante el desarrollo de los tumores malignos. Hay que tener en cuenta, no obstante, que no es del todo correcto hablar de antígeno de grupo sanguíneo, ya que tales antígenos no sólo se encuentran en la sangre, sino también en muchos tejidos. Además, alcanzan elevadas concentraciones en la superficie de todos los tipos de células epiteliales, que forman el revestimiento mucoso de numerosos órganos. Más del 90 por ciento de todos los cánceres humanos derivan de céIulas

epiteliales.

La reciente comprobación de la natttr aleza glicoesfi ngolipídica de los

CADENAS DE CARBOHIDRATO

SUPERFICIE EXTERNA DE LA MEMBRANA

FOSFOLIPIDO

MEMBRANA

PLASMATICA

,ffirnfulll flnll

lll

ilül]

lll GLICOESFINGOLIPIDOS GLICOPROTEINA

ll,/-llilrffitilM

GLICOPROTEINA REGIONES HIDROFILAS

2. MEMBRANA PLASMATICA, la envoltura externa de la célula. Se representa en el esquema como una bicapa formada trásicamente por moléculas de fosfolípidos. Las de glicoesfingolípidos, presentadas como ristras de bolas de color, correspondientes a diversos azúcares, se sitúan en la capa externa de la membrana. Los azúcares hidrófilos se disponen sobre la superficie de la membrana, en el medio acuoso que rodea la célula. En perpendicular queda la región hidrófoba de Ia molécula, la ceramida, que ancla la estructura entera en la bicapa. La membrana aloja igualmente otras muchas moléculas, así glicoproteínas, otros tipos de glicolípi-

dos y colesterol (no mostradas aquí). La porción periférica de la cadena de cartrohidrato de los glicoesfingolípidos puede presentar la misma estructura que la parte periférica de la cadena de carbohidrato que se encuentra unida a las glicoproteínas. El color señala esas similitudes. El diagrama de la izquierda muestra los efectos de las interacciones que se establecen entre glicoesfingolípidos y otras moléculas de la superficie celular. Los glicoesfingolípidos cuyas cadenas de carbohidratos quedan expuestas en la superficie pueden actuar de receptores de li-

GLICOESFINGOLIPIDOS

gandos que se unen a la célula (¿). También pueden asociarse a otros glicoesfingolípidos (ó) o a proteínas de membrana (c). Terurs

r-:------l

I L_ |

oERAMTDA

@ clucosr I cnucrosn O ncroo srAlrco @ r--rucose O

N-AcETTLGALAcTosAMTNA

N-AoETTLGLUoosAMTNA

LACTOSILCERAMIDA GALACTOCEREBROSIDO

C---.__,

LL-]

3. ESTRUCTURA. MOLECULAR de los

glicoesfingolípidos más importantes, presentada de forma esquemática. Arriba se muestra un diagrama detallado de la ceramida. En el resto de los dibujos esa molécula se presenta como un pequeño rectángulo de color amarillo, unido a las cadenas de azúcares, que aparecen como hexágonos de color de acuerdo con las indicaciones de la clave de la izquierda. Los glicoesfingolípidos de la fila superior no se ajustan a ninguna de las cuatro estructuras básicas comunes a la mayoría. En la segunda fila se muestran las moléculas de la serie ganglio, en la tercera las de la globo y, en las dos inferiores, las de lacto. El glicoesfingolípido Lea es la única molécula que pertenece a la serie lacto de tipo

o_€----.-., lrl

GD.

GM,

GALACTOGLOBOSIDO (SSEA-3)

las demás son del tipo 2.

antígenos de grupos sanguíneos ha permitido establecer un nexo de unión entre la poderosa metodología inmunológica y un conjunto importante y diverso de conocimientos bioquímicos.

IJna consecuencia de ello es la verificación de que los cambios de antígenos de grupos sanguíneos observados cuando se origina un cáncer pueden

generalizarse a otro tipo de moléculas. Los bioquímicos han identiflrcado

Le'DIMERICO (FH4)

otros glicoesfingolípidos no relacionados con los antígenos de gTupos san-

guíneos, cuya composición y metabo-

lismo se alteran espectacularmente cuando una célula normal se transforma en cancerosa por distintos agentes víricos y químicos. Los análisis inmunoquímicos de los glicoesfingolípidos tumorales demuestran que muchos antígenos asociados a procesos cancerosos son formas de antíge-

Thudichum lo denominó cerebrósido. Investigadores posteriores encontraron que el cerebro y los tejidos ner-

te león alado, aterroñzóla ciudad de

nos de grupos sanguíneos modifica-

viosos son ricos en glicoesfingolípidos.

das químicamente.

De hecho, durante muchos años los principales estudios sobre esos compuestos los realizaron neurobiólogos y neuroquímicos. Pese al volumen de trabajos acumulados desde entonces, el romántico prefijo de esfingo, introducido por Thudichum, no ha perdido

La función de muchos glicoesfrngolípidos en las estructuras neuronales

[l I)l

sos importantes descubrimientos

experimentales han avivado el interés por conocer la estructura fundamental de los glicoesfingolípidos y su papel en la vida de la célula. El primero de éstos lo halló, en 1874, Johann LudwigW. Thudichum, en el cerebro. Cor¡srnuccróN op uN Ssn VIvo

Tebas, devorando a todo aquel infeliz que no acertara aresolversus enigmas.

sigue constituyendo un enigma.

Se conoce desde hace tiempo la estructura molecular de los glicoes-

validez. En la mitología griega, la

frngolípidos. La morfología de la molécula recuerda una L: uno de los brazos lo forma una cadena de carbohidrato, esto es, de residuos de azú.car. El otro

monstruosa Esfinge, parte mujer y par-

es un lípido denominado ceramida 83

oa*

luéase la figura 31. Los dos brazos de la L constituyen, pues, dos componentes distintos. La cadena de carbohidrato es hidrófila e interactúa con el medio acuoso que rodea a ia céluia. El

segundo componente, Ia ceramida, es hidrófobo y tiende por tanto a repeler las moléculas de agua de ia vecindad.

GLICOESFINGOLIPIDO PRECURSOR

ffi

TNTERMED|o

GLICOESFINGOLIPIDO

_ ffi ,/\

ANTTGENO iENo

a/\-

Tanto Ia ceramida como la cadena carbohidrato presentan gran variabilidad estructural. Se conocen hasta de

%_,ffiffi ü

ANTIGENO P (GLOBOSIDO)

ANTIGENO H

ANTGEN6

g e,

arurloeuo É

130 variedades de glicoesfi ngolípidos;

de ellas, unas 40 corresponden a 1a estructura denominada ganglio, 10 a la estructura globo y 60 a la lacto, según Ia secuencia de azúcares que compongan la cadena de carbohidrato y la

naturaleza de los enlaces que unan los azúcares luéase la figura 1). El resto de 1os glicoesfingolípidos permanece sin clasificar. Es limitado el

ANTIGEN.

número de combipaciones que se pueden dar entre los componentes de un glicoesfingolípido, pues ciertas estructuras de carbohidratos se unen preferentemente a determinadas cerami-

das, según se encuentren en unas células y tejidos u otros.

menudo. la misma secuencia

.13. azúcares que hay en la estructura lacto (pero no en las ganglio o globo) aparece unida a proteínas. Dado que

ANTIGENO A,

la especificidad antigénica

ANTIGENO

suele

depender de la secuencia del azttcar, y no dei sustrato de ceramida o proteína al que vaya unido, 1os anticuerpos de los antígenos que constituyen los grupos sanguíneos pueden también reconocer ciertas glicoproteínas. El reconocimiento de las cadenas de

azúcares presentes en las glicoproANTIGENO DE FORSSMAN

teínas explica la presencia de antígenos de los grupos sanguíneos en los revestimientos mucosos, asÍ como en

las secreciones. Los gangliósidos, clase importante de glicoesfingolípidos descubierta en 4. ANTIGENOS DE LOS GRUPOS SANGUINEOS, de importancia clínica fundamental en relación con los problemas de compatibilidad de sang?e y tejidos. También son glicoesfingolípidos. El diagrama muestra las interrelaciones químicas y estructurales de dos sistemas de grupos sanguíneos. Los colores utilizados responden también a la clave de la figura 3. El sistema mejor conocido es el AB.EI, aunque la molécula precursora de todos los antígenos que pertenecen a ese sistema es la misma que la del sistema P (arriba). Todas las células pueden clasificarse de acuerdo con cada uno de esos sistemas. En el sistema ABH,las céIulas de tipo O presentan una molécula precursora intermedia y el antÍgeno.EL Además, las células de tipo A y B presentan los antígenos A y B, respectivamente. Las células de tipo AB ofrecen los cuatro antígenos. En algunas personas de tipo A ese antÍgeno presenta una forma más larga, que se conoce como Ar. En otras, las de tipo A, la cadena no se alarga tanto, Las estructuras de los anúígenos A, y A, las determinaron Henrik Clausen y Levery. En el sistema P, las raras células del tipo Pfr sólo expresan el antígeno Ph y su precursor glicoesfingolípido. Las células de tipo P, presentan ambos antígenos, el Pk y el P, o globósido, derivado del primero. Las células del tipo P, presentan el antígeno P, además de los antígenos del sistema P propios de las de tipo Pr. Donald M. Marcus resolvió la estructura del sistema P. Aproximadamente una de cada cinco personas lleva en sus tejidos el antígeno Forssman, que deriva

del globósido. 84

1936 por Ernst Klenk, ilustran ese tipo de distribución de los giicoesfingolípidos en función del tejido. Klenk sólo encontró gangliósidos en el cere-

bro, si bien posteriormente otros investigadores los han hallado también en las membranas celulares de todos los tejidos. Los gangliósidos se carac-

terizan por poseer en sus cadenas de carbohidratos un azúcar acídico, el ácido siálico. Ciertas membranas de las neuronas son particularmente ricas en

gangliósidos que contienen más

de un tipo de ácido siálico en sus cadenas de carbohidratos. Sus patrones de

distribución difieren de unas células a otras y de unas especies a otras, como ya sugiriera Tamio Yamakawa

en 1952. Tplrr¡s

100

La inclusión de las moléculas de gli-

coesfingolípidos en las membranas celulares resulta favorecida desde el punto de vista energético. Y la mayoría lo está. La membrana celular viene a ser (según un modelo simple) una bicapa formada principalmente por fosfolípidos y colesterol. La molécula de fosfolípido, como el glicoesfingolípido, posee una cabeza hidrófila y dos colas hidrófobas compuestas por carbohidratos. En un recipiente lleno de agua, Ias moléculas de fosfolípidos y

Jo <z fr ul

ANTIGENOS SSEA-3 Y

Íe^ o2\

ANTIGENO SSEA-1 (HEPTASACARIDO Le)

>... F

trH ñso

P<6 HÓE

EÉL r,! = -,t úoo

de colesterol forman espontánea-

mente una vesícula esférica cuyo es-

(o ) \_-/

pesor equivale a dos capas de molécu-

las. Los grupos hidrófilos de Ia capa interna se disponen mirando hacia el agua de1 interior de Ia vesÍcula y, los

!e-?

la)

(ñ, (9,ww @\ ñ

CoMPACTACION

de la capa externa, hacia el agua

situada fuera de la vesícula. Las colas hidrófobas de las dos capas de moléculas que forman 1a superficie de Ia vesícula no quedan, por tanto, en contacto con el agua. Las membranas celulares presentan ese mismo tipo de organización general que las moléculas de fosfolípidos. La matriz de fosfolÍpido y coles-

terol puede, no obstante. contener otras muchas sustancias. fundamentalmente moléculas de proteína y g1icoesfingolípidos. En general, la mem-

brana plasmática que reviste

superficie celular es mucho más rica en glicoesfingolípidos que 1as membranas de los orgánulos intracelulares. Además, Ios glicoesfingolípidos de

Ia membrana plasmática parecen localizarse exclusivamente en 1a parte externa de la bicapa. Las dos colas de carbohidratos de la ceramida se anclan en el interior hidrófobo de 1a membrana y le confieren rigidez estructu-

ral. La cadena de carbohidrato

'-e'//

5. PATRON DE APARICION y desaparición de algunos antígenos glicoesfingolípidos, en función del estadio de preimplantación del emtrrión de ratón. El antígeno SS-EA-i aparece en eI estadio de 8 a 32 células; su concentración desciende rápidamente tras agruparse las células en el estadio denominado de compactació¡ (línea d.e color). Según disminuye el nivel de SSEA-I, aumenta el del antÍgeno Ler (curua. gris), de características químicas muy similares a las del SSEA--I, pues posee una fucosa adicional en la galactosa terminal. Los antígenos SS,EA-S y SSEA-4 presentan un alto nivel de expresión hasta la fase temprana de la compactación, desapareciendo casi por completo en el estadio de 32 células (línea negra). Los glicoesfingolípidos mencionados quizás intervengan en la regulación del reconocimiento intercelular y el crecimiento de los tejidos.

tido de azicar,la molécula que dona el azicar, asÍ como un sustrato precursor, al que se transfiere el residuo. Las únicas moléculas que participan en el proceso cuyas estructuras se transcriben directamente a partir del ADN son las enzimas glicosiltransferasas. Saul

Roseman propuso que la síntesis de gangliósidos seguía ese mecanismo.

expone las moléculas a las sustancias extracelulares, a menos que 1as ocul-

ten proteínas u otros glicoesfingolípi-

y su traducción en las correspondien-

dos alojados en las inmediaciones. Una de las consecuencias más importantes que se derivan de Ia natutaleza glicoesfingolipídica de los antígenos de los grupos sanguíneos es que son productos génicos secundarios. En

otras palabras, su estructura no la determina el ADN igual que determina la secuencia de aminoácidos de una proteína. La síntesis de un glicoesfingolípido contempla una serie de reacciones, catalizadas por las enzimas glicosiltransferasas.

Tales enzimas determinan, en la membrana, la secuencia del azúcar. Reconocen secuencialmente un nucleóCoxsrnuccróN

DE uN SER

Vrvo

,-t\ ,/-z^a\ //a "\J

l§

a síntesis de glicoesfingolÍpidos J-¡l está sujeta a dos tipos de control. EI primero es común a la síntesis de muchas otras enzimas: la transcripción de la secuencia de bases del ADN

de carbohidrato. Ta1 disposición

>[,F.Y)) f'ai \19l \\-J/

sitúa en el exterior de 1a superficie ceIular, casi en perpendicular a las colas

NUMERO DE CELULAS

tes enzimas puede acelerarse o reprimirse activando o inhibiendo secuencias especiales de ADN, los pro-

motores, secuencias exaltadoras. O bien, puede alterarse con gran rapidez la actividad de las glicosiltransferasas en las membranas por medio

res no sólo depende de su tasa de síntesis, sino también de su organización y de la que adopten otras moléculas de membrana. Su accesibilidad a los anticuerpos u otras sustancias externas puede verse afectada por la proximidad que guarden con otras molécrtlas luéase la figura 21. La existencia de más de un mecanismo de control de la expresión de los glicoesfingolípidos determina que su concentración sobre la superficie celuIar resulte mucho más sensible a los

cambios del medio ambiente, por pequeños que sean, que, por ejemplo, Ia concentración de una proteína. Los rápidos cambios de la expresión de los

glicoesfrngolípidos podrían derivar de

una regulación coordinada de los genes que determinan las enzimas

de moléculas de enzimas ya existen-

implicadas en su síntesis, de Ia competencia entre varias enzimas por su sustrato o de un cambio de orientación y exposición de los antígenos glicoesfingolipídicos que se hallen ya sobre

tes. Tales modificaciones influyen

la superficie celular. En mi laborato-

tanto en la distribución de las enzimas por las membranas como en las interacciones que establezcan con los sustratos allí presentes. Es más, la expresión de los glicoesfingolípidos en Ia superficie de las membranas celula-

rio, y en otros, se ha comprobado recien-

de pequeñas modifi caciones químicas

temente que durante el desarrollo embrionario ciertos glicoesfrngolípidos se exhiben en algunos tipos celulares durante muy breve tiempo. Sugieren esos hallazgos que los glicoesfingolí85

pidos guardan una estrecha relación con los mecanismos de crecimiento y diferenciación celular. A las células, que han de enfrentarse con los continuos cambios que se dan durante el desarrollo, les debe resultar más eficaz

tituyen a menudo uno de los eslabones fundamentales de la compleja

alterar glicoesfingolípidos que pro-

por Eric Bremer, en colaboración con Daniel F. Bowen-Pope, Elaine W. Raines ¡, Russel Ross, indican claramente que ciertos glicoesfingolípidos pueden romper ese eslabón e inhibir el crecimiento celular.

teínas. Según pare.ce, los glicoesfingolípidos influyen sobre la célula y su crecimiento de dos formas principales. Modulan las funciones de algunas de las proteínas que residen en la membrana plasmáticay actúan, junto con las proteínas, como marcadores de superficie, necesarios para mantener una adecuada comunicación intercelular. Los primeros indicios de que los

secuencia de acontecimientos previos a la mitosis, que así se llama el proceso de división de las células somá-

ticas. Estudios recientes realizados

Tll n circunstancias norma'les. para l1 qr" las células animales sufran mitosis se requiere Ia presencia

ciertas hormonas extracelulares específicas, denominadas factores de cre-

glicoesfingolípidos intervenían en eI

cimiento, que se unen a proteínas

funcionamiento de las proteínas de membrana se obtuvieron tras com-

receptoras específicas en determinados puntos de Ia parte externa de 1a membrana plasmática. Las proteínas receptoras son macromolécu1as aloja-

probarse que ambos tipos moleculares se encontraban estrechamente asociados en las membranas. Tal proximidad quedó demostrada en los estudios de Clifford Lingwood y en los de

y sus colaboradores encontraron que los glicoesfingolípidos del cerebro activaban Tae Hwa Ji. Ranwel Caputto

a continuación, en 1a célula.

Cuando se añaden 1os glicoesfingo1ípidos GM ro GM.ra células cultivadas

en presencia de factores de crecimiento, queda bloqueada la proliferación celular. Es más, 1as proteínas receptoras de las membranas de las cé1ulas cu¡ra proliferación se inhibe ante GM, o GM. no tienen el grupo fosfato. efecto que parece específico de

GMly GM"; ningún otro glicoesflrngolípido provoca esos resultados. Razonamos, en consecuencia, que el funcionamiento del receptor es sensib1e a 1os glicoesfingolípidos que le rodean. Merece señalarse que, cuando

virus tumorígenos, ias correspon-

plasmática es en realidad una enzima. cuya misión consiste en catalizar ia adición de grupos fosfato a drr-ersas

un contenido más bajo de GfuI , en algunos tipos de tumor y de GM, en

proteínas del citoplasma. incluido el

energía necesaria para la transmisión de mensajes por los nervios.

propio receptor. Por 1o que se \-e. cuando el factor de crecimiento se une al receptor, Ia enzima asociada con su

Las proteínas reeeptoras, incrusta-

fosfato en el receptor, acción que parece instarle un cambio conformaciona'l: ese tipo de alteraciones permite la agrupación de los receptores en la superficie de la membrana. Los receptores, y los factores de crecimiento que llevan unidos, penetran,

das en la membrana;parte de 1a molécula queda en el interior de la célula y parte en el exterior'. La polcion cito-

la ATPasa, proteína que libera la

das en Ia membrana plasmática, cons-

induce la incorporación de un grupo

porción citoplasmatica se acti'''a

las células sufren transformación por

dientes células tumorales presentan otros. Las reducciones pueden correIacionarse con una pérdida de1 control sobre el desarrollo celuiar ejercido por los glicoesfingolípidos. No debe concluirse, sin embargo,

]BANA DE LA CELUL

nfl

Rnflnnf,n

BACTERIA

COLI

PROTEINA DE LAS FIMBRIAS GLICOESFINGOLIPIDO DE LA SERIE GLOBO

ESTRUCTURA

COMPLEMENTARIA DE Le'

MEMBRANA DE LA CELULA A

6. RECONOCTMIENTO INTERCELULAR, esquematizado en dos supuestos, segtin parece que se desarrolla entre dos cé-

lulas animales y entre una bacteria y una célula hospedadora. Las proteínas de memt¡rana de las dos células animales (izquierd,a) reconocen la estructura del antígeno S§.EA-I alojado en la superficie de la célula contraria. Tal reconocimiento es típico de los embriones de 8 a 32 células, no im86

MEMBRANA DE LA CELULA HOSPEDADORA

plantados aún. Las proteínas de las frmbrias de una bacteria Escherichia coli patógena (d,erecha,) reconocen los azúcares internos de los glicoesfingolípidos de la serie globo presentes en una célula hospedadora y los utilizan como sitios de infección. Los azúcares de los glicoesfingolípidos se han coloreado de acuerdo con la clave de la figura 3. (Dibujos de Hank [ken.) TE\,IAS 3

que los glicoesfingolípidos estén siempre asociados con la inhibición del cre-

cimiento y la diferenciación celular. Estudios realizados por Yoshitaka Nagai y sus colaboradores indican que la adición de otro glicoesfingolípido, el llamado GQ.tu a neuronas tumorales

embrionarias induce la formación de células nerviosas maduras, además de otros muchos cambios. Luego Masaki Saito, Hisao Nojiri y sus colaboradores observaron que cuando ciertas células de leucemia de ratón se incuban conGMrse diferencian en macrófagos.

¡{

demás del papel que desempeñan en la regulación de proteínas, a los glicoesfrngolípidos les corresponden

la,

ciertas funciones celulares propias. La más importante es la de acuñar diferencias, en el nivel celular, entre las especies, entre los individuos de una misma especie e incluso entre células de un mismo individuo. Los antígenos de grupos sanguíneos constituyen un buen ejemplo de la variación de los

glicoesfingolípidos entre individuos de la población humana. El estudio de los cambios que sufren

los marcadores glicoesfingolípidos durante el desarrollo celular normal y durante el canceroso ha despertado gran interés. Es el caso, por ejemplo,

GALACTOSA

del antígeno SSEA-I (por stage-specific embryonic ontigen), descubierto por Davor Solter y Barbara B. Knowles. Para detectar la presencia de ese antígeno se utilizan anticuerpos específicos contra é1. Se comprueba asÍ que no está en el óvulo fecundado, el huevo, aunque a veces se le detecta entre la tercera y quinta división celular, es decir, en embriones formados por 8 o 32 células. En ese estadio, las células

del embrión sufren el denominado proceso de compactación, durante el cual se adhieren fuertemente unas a otras para maximizar sus contactos intercelulares. Superado el proceso, la concentración de SS.EA-I desciende

rápidamente.

Reiji Kannagi, Steven B. Levery, Edward Nudelman, Ten Feizi y sus colaboradores identifi caron la estructura química del SSEA-1. Se trata de

una cadena de carbohidtato, Le*, situada en un glicoesfingolípido o en una glicoproteína. Bruce Fenderson y

Uri Zehavi, Susan J. Kimber y sus colaboradores descubrieron que cuando se añade Le'o stt estructura

conjugada a embriones, se inhibe la compactación en el estadio de 16 a 32 células. Presumiblemente, la presencia de la estructura tre' en una célula

le permite "percibir" la cercanía CoxsrnuccróN or uN Ssn VIvo

AIIIIGENO FH4, crtya presencia está asociada con un tumor, representado aquí por un modelo generado por ordenador. En el dibujo de la izquierda el área sombreada corresponde a la región hidrófot¡a de la molécula, que quizás interaetúe con los anticuerpos. El antígeno FH4ha resultado ser la forma dimérica del glicoesñngolipido Le\ y presenta un elevado nivel de expresión en cánceres humanos derivados de células gastrointestinales. El modelo (arribo) es obra de Levery, Stenkamp y Watenpaugh. 7.

N,ACETILGLUCOSAN¡ NA

otras células. AI añadir Lex se erttorpece el complejo proceso de adhesión celular, basado probablemente en una afinidad específica entre Zer y sus receptores superficiales. La compactación seguirá la pauta apropiada al descender el nivel de Ze' después del estadio de 32 células. Según parece, muchas toxinas bacterianas, así como organismos víricos y microbianos, explotan esa capacidad de los glicoesfingolípidos de mediar en Ias interacciones entre las células y su medio ambiente. Las primeras pruebas de que los gangliósidos interactuaban con la toxina del tétanos las obtuvo William E. van Heyningen, hace ya muchos años. Estudios posteriores indican que el gangliósido GM, es el

receptor específico de la toxina del tétanos y también de Ia de1 cólera. Esta última no invade la célula, sino que actúa sobre la membrana, restándole impermeabilidad al agua y a los elec-

trólitos hidrosolubles de la célula. Gracias a los trabajos de van Heyningen se avivó el interés por determinar si nuevos glicoesfingolípidos actuarían también de receptores de otras toxinas y factores bioactivos. Algunos investigadores han demostrado que los gangliósidos interactúan

(aunque no necesariamente como receptores) con muchas sustancias de importancia biológica, como la toxina del botulismo, eI interferón, las inter-

leucinas, la serotonina, Ias hormonas y el virus Sendai.

Varios grupos de investigadores han obtenido pruebas de que ciertos glicoesfingolípidos específicos de la superficie de una célula hospedadora interactúan con proteínas de parásitos víricos y bacterianos. Investigadores de Finlandia y Suecia descubrieron que ciertas estirpes de la bacteria Escherichia coli qoe producen pielonefritis, una infección

de las vías

uri87

narias y de los riñones, presentan en su superfrcie unas estructuras fibrilares finas: fimbrias. Las proteínas de

experimentos que las proteínas de superficie de las bacterias son capaces de reconocer breves secuencias

las fimbrias interactúan con el glicoesfingolípido globósido y con sus pre-

internas de azúcares que podrían

cursores químicos. Probablemente constituya esa interacción el primer paso de la infección de la céIula hospedadora.

exhibir una gama amplia de glicoesfingolípidos de la célula hospedadora.

fton las técnicas de Karlson se han (-l fi;uao también los puntos de

Karl-Anders Karlson y sus colaboradores marcaron radiactivamente la bacteria -8. coli catsante de las infecciones urinarias. Investigaron entonces las interacciones que se establecían entre esas bacterias y un grupo

unión de ciertos tipos de bacterias de la "flora intestinal" normal del tubo digestivo. Se trata de bacterias ino-

de glicoesfingolípidos que habían

propionibacterias, comunes en el intestino, poseen una proteína de

separado en una capa fina de gel de

sílice. De los 32 glicoesfingolípidos ensayados, los únicos que se unían a

las bacterias eran los portadores

cierta cadena de tres azicares empalmada a la ceramida de la molécula. Si a esa cadena de tres azúcares se le añadían otras cadenas de azúcares dispuestos de forma arbitraria, las bacterias no se unían. Sugieren esos

*É

fensivas y beneficiosas para el hospedador, pues inhiben el crecimiento de las patógenas. Así, por ejemplo, las

superficie capaz de unirse a un glicoesfingolípido muy común: la lactosilceramida. La estructura de carbohidrato de la lactosilceramida es el precursor químico de la mayoría de los glicoesfingolípidos conocidos. De hecho, los dos azitcares que se enlazan al componente ceramídico de Ia Iactosilceramida son idénticos a los

de los glicoesfingolípidos presentes en las células sanas, el crecimiento canceroso está claramente asociado a gli-

coesfingolípidos alterados. No cabe duda de que ese cambio expresa a1guna anormalidad subyacente. Cualquiera que sea 1a causa, la alteración de 1a población de glicoesfingolípidos podría obstruir una parte esencial de los recursos de que dispone Ia célula para mantener su vida social ordenada. No sorprendería descubrir que

Ia alteración glicoesfingolipídica fuese una de las causas principales de

las caóticas e indisciplinadas interacciones sociales que son caracterís1as células cancerosas. E1 tipo de cambio producido en los

ticas de

glicoesfingoiípidos depende de

célula hospedadora y del agente cancerígeno. Algunas células tumorales

s.t :

.'@

ciertas fases del desarrollo humano y en un tumor gastrointestinal. La tinción castaño oscura de las fotomicrografías corresponde a la unión del anticuerpo monoclonal FH4 con elantígeno, La coloración de la foto superior izquierda indica un elevado nivel de expresión del antígeno en células epiteliales de estómago de un embrión de algo más de cinco semanas (38 días). La de la parte superior derecha muestra las células epiteliales de estó8. EXPR"ESTON DEL ANTIGENO FH4 en

dos primeros azúcares de Ia cadena de

tres reconocida por labacteríaE. coli que provoca as in lecciones urinari as. Mientras que las toxinas y las infecciones viricas o bacterianas se sirven

mago de un feto de 120 días. En este caso sólo se colorea la parte más interna de los pliegues del revestimiento del estómago. El epitelio del estómago de adultos prácticamente no se ti-

ie (abajo, a la izquierd.¿). En la imagen inferior derecha

observa coloración en las células correspondientes a un cáncer de estómago, pero no en las normales. Los antígenos que se expresan tanto en células tumorales como durante el desarrollo fetal se denominan oncofetales. TENTAS 3

acumulan glicoesfingolípidos simples; quizás esté bloqueada la sínte-

sis de los más compiejos, derivados de

aqué1los. Otras, en particular las procedentes de cánceres epiteliaies humanos, sintetizan cadenas de carbohidratos poco usuales y acumulan nuevos glicoesfi ngolÍpidos : ios neogli-

I I

§ I l!

o 2

colípidos.

J(I Tanto los glicoesfingolípidos pre- ur< ocE

cursores como los neoglicolípidos

-F

EPITELIO DE COLON E INTESTINO

identificaron como antígenos asocia- 6E a< Ll¡¡ dos a tumores en estudios ciásicos t^u realizados con anticuerpos de conejo.

1as

ñE U

células tumorales generaban varian-

6<1

Pero esa comprobación de que

LU=

tes glicoesfingolipídicas no pudo o explotarse convenientemente hasta e1 6 z desarrollo de los anticuerpos mono- tU F z clonales, técnica que pusiet'on a pullto en 1976 George Kohler 1' Cesar Milstein. Los anticuerpos monoclonales poseen una gran afinidad

es-

pecífica por un solo antígeno. Se identifica rápidamente 1a presencia de un antigeno pol medio de un arrtrcuet'po monoclonal unido a una molécu1a marcada.

Para elaborar una abundante can-

tidad de anticuerpos monoclonales específicos de antígenos de tumol es preciso inyectar primero el antÍgeno en ratones. Se fusionan luego cé1u1as de bazo del ratón inmunizado con células de tumor de ratón. Las células así obtenidas, denominadas hibridomas, combinan la capacidad de cre-

cimiento ilimitado propia de las

células del tumor con 1a capacidad de 1as células del bazo para generar anticuerpos. Ya se han identificado ¡' caracterizado químicamente. en razón

de su especilicidad pol anticuelpo< monoclonales, más de diez tipos de antígenos glicoesfingolipídicos asociados a tumores.

¡/-lada hibridoma produce un anti\-z .u".po distinto. lo que obliga a

seleccionar los adecuados. La maJ.oría de los inmunólogos que trabajan con tumores se sirven al efecto de 1a estrategia de 1a perdigonada: inyectan

en el ratón antígenos sin caracterizar, procedentes de tejidos tumorales, y a continuación, entre los hibridomas resullantes, buscan los que reacc'ionan contra 1os antígenos específica-

mente asociados al tumor. En nuestro laboratorio utilizamos un método menos convencional. En primer lugar obtenemos y car:actert-zamos químicamente un glicoesfingolípido asociado con un tipo específico de cáncer. A continuación se inyectan en el ratón bacterias recubiertas con el glicoesfingolípido. De esa manera, lo que se CoxsTnlcctirx »r

uN Sun VNcr

01234579 EDAD DEL EMBRION (SEMANAS)

del antígeno FH4 durante el desarrollo fetal humano. En las células epiteliales del estómago la expresión de FH4 alcanza su máxima inüensidad cuando el embrión tiene entre cinco y siete semanas. En el epitelio de colon e intestino la intensidad máxima se observa entre las siete y nueve semanas. En cánceres diferenciados de estómago o de colon el nivel de expresión del antígeno FH4 es cornparable al del epitelio letal (.4, B). En cánceres indiferenciados de estómago o de colon no se expresa el antigeno FH4, Esas células caneerosas se parecen a las células embrionarias de los estadios tempranos (C, D). g. NTyELES DE EXPRESION

busca posteriormente es un hibridoma que reaccione preferentemente con el antígeno que se había preparado con anterioridad. Hemos aplicado ese procedimiento elaboración de anticuerpos monoclonales dirigidos contra una amplia variedad de nuevas estructuras asociadas con tumores. En sus estudios sobre los antígenos Lex y Ld', regulados en función del desarrollo, Nudela 1a

telio gástrico e intestinal, desapareciendo en Ias células del recién nacido

adulto Luéase lo ligurcL 8). Los antígenos de superficie que exhiben ese comportamiento se denominan e1

antígenos oncofetales, pues se encuen-

que lievaban unidas ácido siálico. Yasuo Fukushi y Kazuo Abe han con-

tran en cantidades similares tanto en células cancerosas como en ciertos momentos del desarrollo de algunos tipos de celulas embrionalias. Se conocen yavarios antígenos oncofetales. Vale también de ejemplo un derivado siálico de la forma Ie' dimérica, definido antigénicamente por el anticuerpoFH6. Abunda en los tejidos fetales, pero no en el tejido gastrointestinal adulto, aunque sí va asociado con tumores gastrointestinales. Ese tipo de hallazgos supone un sólido apoyo ex-

seguido anticuerpos monoclonales capaces de distinguir varios tipos dife-

vaciones de que ias célu1as cancerosas

man, Levery y Kannagi encontraron que muchos tejidos tumorales poseÍan

gran cantidad de glicoesfingolípidos muy parecidos a -Le-' y tre-". Entre los nue\¡os antígenos se contaban formas

diméricas y triméricas

Le'y formas

rentes de Le'. Uno de esos anticuerpos, denominado FH 4, reacciona específicamente con el antígeno Le'dimérico, pero no

con su forma simple. Utilizando ese

anticuerpo, convenientemente marcado, Fukushi encontró que las célu-

perimental a las frecuentes obserse

parecen

a 1as célu1as,

relativamen-

te indiferenciadas, de los primeros estadios del desarrollo embrionario. Otro antÍgeno oncofetal importante es el derivado siálico de un glicoesfingolípido llamado antígeno Le n. HiIary Koprowski y sus colaboradores

Ias epiteliales gástricas de embriones

Iograron obtener un anticuerpo

de 35 a 45 días presentaban un alto nivel de expresión de la forma dimérica deLe'. En ios fetos de 100 dÍas el

monoclonal contra el antígeno Leo. El antígeno fue aislado y luego carac-

terizado por Victor Ginsburg, John

antígeno se expresaba sólo en

1as

L. Magnani y sus colaboradores. Dado

áreas más ocultas y profundas del epi-

que los anticuerpos monoclonales lJ9

sólo se unen a Ia cadena de carbohidrato del glicoesfingolÍpido, también reconocen a esas cadenas cuando las

portan glicoproteínas del suero que no están unidas a células. Los anticuerpos contra los derivados siálicos de los glicoesfingolípidos Lea y Lex, por ejemplo, reaccionan con el suero de pacientes que padecen cáncer. Los antígenos circulantes se detectan con

facilidad, por lo que su presencia resulta muy útil en el diagnóstico oncológico. El estudio de ese tipo de antígenos constituye uno de los principales objetivos de las investigaciones clínicas. Los antígenos glicoesfi ngolipídicos unidos a células constituyen la gran esperanza de la lucha contra el cáncer. Le* y sus análogos, las formas Zer

y Let diméricas y triméricas, por ejemplo, están asociados a células tumorales y no se encuentran libres en el suero. En principio, y una vez identifi cados los anticuerpos específi cos de

antígenos asociados

tumores,

podría administrarse a los pacientes

tales anticuerpos, que detectarían preferentemente las células cancerosas que presentan poblaciones alteradas de antígenos asociados a tumo-

res y las destruirían por medio

complejos mecanismos instados por los propios anticuerpos y por ciertos

feld y sus colaboradores. Nuevamente el anticuerpo resultó eficaz en tres de los 12 casos, aunque otros tipos de

anticuerpos antimelanoma no surgieron efecto. Aunque el glicoesfingo-

Iípido GD, se halla en cantidades moderadas en tejidos normales del riñón y en cantidades más elevadas en la retina, ninguno de los pacientes sufrió daños en esos órganos que fuesen imputables al tratamiento con 1os

anticuerpos. Los únicos efectos negativos observados luelon reacciones inflamatorias de 1a piel alrededor del melanoma. observaciones que resultan muy alentadoras y sugieren

que los antígenos glicoesfingolipídicos de las células tumorales son más susceptibles de ataque por parte de los anticuerpos que Ios mismos antígenos presentes en tejidos normales.

tóxicas se mataría, también de forma selectiva, las céIulas tumorales.

No se olvide que los anticuerpos constituyen el medio natural y más eftcaz de que se sirve eI organismo

para aislar y acabar con las células enfermas. Un anticuerpo monoclonal, como cualquier otro anticuerpo, no sólo se une a la célula que posee un determinado antígeno, sino que también la señala para que el sistema inmunológico del organismo la destruya. El afortunado accidente clínico ocurrido hace ya tantos años podrÍa traducirse, gracias a los trabajos de muchos investigadores, en el origen

de un tratamiento fácil y efrcaz contra muchas formas de cáncer.

Qe han propuesto \ af ias est|ategias LJ para e'l iminaro matal las celulas tumorales, basadas en 1a especificidad de los anticuerpos monoclonales. De utilizarse anticuerpos unidos a isótopos radiactivos, éstos se adherirÍan a las células tumorales v las irladiarían o indicarían con precisión su posición en el cuerpo. Todo eilo facilita-

ría o 1a

tratamiento radiactir-o ulterior extirpación quirúrgica del tumor'.

Si los anticuelpos pol'taran drogas

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F., 1

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H.\\DBooK op Lrpro R¡ss.lBcu. Vor-. 3: SpntxcoLrpr» Brocr¡Eursrny. Dirigido por J. N. Kanfer

S. Hakomori. Plenum

Press. 1983. A R¡vI¡rv oF THE I\tMUNoG¡Nrc

¡No ltrt-

rruNo-Moluo¡tony Pnop¡nrIES

CI-r-cospntxcot-tptos. D. M. Marcus en ,\:lolecular InmturLologT, vol. 21. n.. 11. págs. 1083-l 091: noviembre, 198.1. Tuuon-AssocrA.reo C,\R¡oHyDRATE ANrlc¡Ns. Sen-itiroh Hakomori en Atutuol Rey ieyt

c¡J'

I nunttnolo g». v ol. 2. págs. I 03-

126:1984.

tipos de células especializadas. La desaparición gradual del tumor maligno de la mujer de grupo sanguíneop respondió, sin saberse, a ese mecanismo.

Los trabajos inmunológicos han demostrado que muchos anticuerpos

monoclonales dirigidos contra antígenos asociados a tumores son, en rea-

lidad, específicos de glicoesfingolípidos. Los resultados de al menos dos estudios clínicos parecen justificar algunas de las esperanzas más optimistas. En uno de ellos, un grupo de

investigadores dirigidos por Lloyd J. Old y Kenneth O. Lloyd desarrollaron un anticuerpo

con

Lavitamina A y su cohorte Tim Beardsley

gran afinidad

por el glicoesfingolípido GDr. Alan N. Houghton y sus colaboradores administraron el anticuerpo a 12 pacientes con melanoma, una forma virulenta de cáncer que produce tumores oscuros en la piel y que, en última instancia, genera metástasis e invade diversos órganos. En tres de los 12 pacientes se observó una clara regresión del melanoma y otros cuatro mostraron una respuesta variada.

En el segundo de los estudios, Ronald B. Herberman administró

anticuerpos anti-GD, a otros 12 pacientes de melanoma. El anticuerpo lo prepararonycaracterizaronRalphA. Reis90

os antiguos egipcios sabían que en el hígado hay poderosos elementos medicinales. Solían tratar con jugos extraíclos de esta víscera la ceguera nocturna y otras enl'ermedades de los ojos. Al principio activo que mejoraba la visión del egipcio se le cr¡noce ho¡r por retinol o vitamina A. Pero esta sustancia qr.rímica liposoluble sirve para muchas cosas más, amén de excitar el pigmento sensible a la luz que posibilita la visión. La vitarnina A y su tamilia pertenecen a un grupo escogido de sistemas maestros de control que orquestan la formación 1' el funcionarniento de la célLrla y desempeñun un papel clave para protegerla contra el cáncer. Para George Wolf. de la Universiclad de Calitbrnia en Berkeley, "la vitamina A ha pasado a ocupar una posición central en 1a biologÍa". Et-ectivamente. uno de sus productos. el ácido retinoico. interviene en la difelenciación celular de los embriones. Un error genético que af'ecta a su acción desemboca en una fbrma de leucemia. Y otras variantes químicas de la r,itarnina A. 1os retinoides. son poderos;rs-1, peli-erosas drogas: una de ellas protege contra ciertos cánceres, pero también es causa de det-ectos de nacimiento.

El cuerpo

extr¿re

la vitamina A de Ios alimentos, bien

sea directamente o

bien fragTEMAS 3

mentando betacarotenos. pigmentos de color anaranjado que dan ese tono a las zanahorias. En los países industrializados. es casi desconocida la deficiencia de vitamina A. pero. se-eún una estimación. 500.000 niños pierden cada año 1a vista en los países pobres por falta de esta vitamina. Y muchos hasta mueren. La deficiencia de vitarnina A impide el crecimiento y aumenta la sensi-

bilidad a las inf-ecciones.

f a r,itamina A ejerce su poder protector actuando en I-¡ lrt células que tapizan 1a piel, la córnea. los pulmones y el tracto cligestivo. Las anomalias cutáneas. algunas de las cuales semejan alteraciones cancerosas. fueron los primeros entre los muchos efectos de la deficiencia de vitamina A que se observaron en humanos. Ya a comienzos de nuestro siglo los investigadores se percataron de que una carencia grave de esta r itlminu origina en las ratas cáncer de estrimago. Intrigaclos. los investigadores han erperimentado con retinoicles sintéticos. Uno de el1os. el ácido 1r¿zns-retinoico. se emplea para el tratamiento del acné grave.

Otros retinoides y el betacaroteno suprimen las alteraciones malignas en células desarrolladas en cultivo y' en anir-nales de experimentación. Richard C. \'Ioon. del Instituto de Tecnolo-sía de Illinois, ha demostrado que un retinoide sintético llamado -1-HPR suprime los cánceres cle mama en las ratas. Los datos epidemiológicos proporcionan ulteriores pruebas de que hay un nexo entre los retinoides l e1 cíncer. )Iuchos investigadores han conflrmado que quienes contraen Ia enferntedad es probable que tengan bajos nrreles de retinol er-L la sangre y que consuman menos betacarLrteno del prontedio conr eniente. En los países desarrollados Ia gente consume va más vitamina A de la que se necesita. por 1o que los esfuerzos inr estigadores se han enfocado sobre el bet¿rc¿rroteno. El único iltcomodo que causa éste. si se toma en exceso. es e1 de poner amarillenta 1a piel. El ef-ecto antioxidante del betacaroteno lue puesto en claro hace poco en los resultados preliminares de un estudio sobre los ef'ectos de 1a aspirina en ios trastc¡rnos cardíacos. Según Charles H. Hennekens, de la Facultad de Medicjna cle Harr ard. un subgrupo de los partlcipantes que tomaron betaca¡oteno tur ieron menor incidencia de ataques combinados de apople,jía ¡ de corazón. por la posi-

se patentiza con estas dos alas de embrión de pollo. El ala normal (a Ia izquierda) tiene tres dedos. En la otra (derecha), perteneciente a un embrión tratado con ácido retinoico, se ha desarrollado un par de dedos extra. Foto: Gregor Eichele.

EL ACIDO RETINOICO influye en el crecimiento, segrin

Y os resultados de un estudio de cinco años de dr-rración sobre I-r la posible rctir itlud rnticancerosa clel betacaroteno. cl¿rdos a

Estudios Biológicos, hicieron cada uno por su cuenta un descubrimiento que supuso un gran adelanto hacia la explicación de cómo logran los retinoides sus poderosos efectos. Hallaron que enlalos núcleos de las células contenían receptores -proteínas cuando se les zantes- que modificaban la actividad de los genes unía ácido retinoico (y probablemente otros retinoides). Desde entonces, se han encontrado varios receptores de esos, aunque sus funciones exactas siguen siendo oscuras. "Sabemos que los receptores son afectados de distintos modos por varios retinoides", dice Chambon. Algunos regulan su propia velocidad de producción, mientras que otros tienen complejas interacciones con otros sistemas receptores que hay en el núcleo celular. La presencia de estos receptores le sugiere, a Eichele, que los retinoides pueden formar parte de un sistema señalizador que controla la actividad de los genes. Entre los genes cuya actividad se sabe que viene condicionada por el enlazamiento del ácido retinoico está el que da origen a la laminina, proteína de la ma$iz que mantiene fijas las células. Eichele conjetura que e1 ácido retinoico podría afectar a la comunicación intercelular. Hay también receptores para el ácido retinoico fuera del núcleo, cuya función

conocer por un equipo diri-sido por E. Robert Greenberg. de la

se desconoce.

ble razón de que el betac¿rroteno inhibió la orrdación de los depó-

sitos de colesterol.

facultad de medicina de Darmouth. fueron. sin embargo. decepcionantes. No pudieron den.iostrar ningún efecto protector contra el cáncer de piel en sujetos qLre habían padecido anteriormente el mal. El Instituto Nacional del Cáncer estadounidense anunció a comienzos de 1996 que dos estudios clÍnicos patrocinados por él sobre la posible eficacia a largo plazo del betac¿rroteno para prevenir el cáncer y la enl-errnedad coronaria habían proporcionado resultados negativos. Uno de ellos se había suspendido antes de tiempo porque, sorprendentemente. surgieron dudas de que los participantes en 1a prueba no estuviesen incurriendo en ma¡ ores riesgos de contraer cáncer que quienes no tomasen betacaroteno. El segundo estudio no present(r estos signos alarmantes. pero. tras doce años de aplicación. tampoco puso de manifesto ninguna r entaja de tomarlo. Gregor Eichele, del Baylor College de Houston. y Christina Thaller han elucidado la acción de estas substancias. Han demostrado que, a través del brote embrionario clel ala, se va produciendo una gradual concentración de ácido retinoico que influ.ve en el proceso evolutivo cle 1as células. Alterando la concentración del ácido retinoico se hace que las alas desarrollen dedos supernumerarios. Esto indica que el ácido retinoico es un "mortógeno" que dirige el desarrollo normal. "El ácido retinoico impone un programa", explica Eichele: "es una molécula de instrucción". Hace algunos años Pierre Charnbon. de la Universidad Louis Pasteur de Estrasbr.rrgo, y Ronald M. Evans, del Instituto Salk para

Co¡srnuccróN op uN Ssn Vtvcr

A A

ntonio Simeone y sus colegas, del Instituto Internacional de Genética y Bioiísica de Ñápoles, han demostrado que el aumento de concentración del ácido retinoico activa sucesivamente a los miembros de una clase de genes homeobox. Este podría ser un indicio importante para averiguar cómo actúa el ácido retinoico, opina Chambon. Se sabe que los genes de ese tipo desempeñan un papel clave en la especificación de las sendas epigenéticas (desarrollísticas), desde luego en 1os invertebrados y probablemente también en los mamíferos. Cree Eichele que la importancia que el ácido retinoico tiene en el desarrollo puede explicar su capacidad para hacer que las célu1as cancerosas reviertan a su carácter estable. El grupo de Hugues de Thé, del Instituto Pasteur de París, informó recientemente que es probable que en la leucemia promielocítica esté implicado un receptor nuclear del ácido retinoico. Descubrieron que en las células cancerosas el gen para un receptor de ácido retinoico aparece a menudo desplazado y fusionado con un gen antes desconocido, donde es probable que él origine un producto anómalo. Ese prode Thé- tal vez bloquee a los genes ducto anómalo -sugiere que normalmente son regulados por el ácido retinoico y desar-

bole el control. "Dado que el ácido retinoico interviene en

diferenciación y

en el desarrollo de las células, no es demasiado sorprendente que ejerza su efecto sobre los tumores", recalca Chambon. "Si promueve u obstaculiza a otros factores reguladores, no 1o sabemos."

Genes con homeobox y el plan co{poral de los vertebrados Eddy M. De Robertis, Guillermo Oliver y Christopher V. E. Wright

determinarrrr'-:':!i:':':r:'::;;rt:;::r':;:;:r:; a lo largo del eje cctbeza-colo en campos celulares que se transforntarán en mierubros y otras estructLtras

*f\ e un óvulo fecundado. de apa[ ! .iencia homogenea. surge gralJ dualmente, por división ce-

Iular, un embrión formado de piel,

músculos, nervios y otros tejidos. Sin embargo, mucho antes de que Ia

mayoría de las células del cuerpo naciente comiencen a especializarse, se halla ya establecido un esquema que define las principales regiones del cuerpo: la cabeza, e1 tronco, la cola, etcétera. Este esquema permite que

combinaciones aparentemente idén-

ticas de tejidos se dispongan

estructuras anatómicas claramente diferenciadas, como pudieran ser brazos y piernas. Los embriólogos han realizado en

nes relativas al establecimiento del esquema corporal embrionario. La clave reside en una familia de genes. conocidos como genes con homeobox (caia homeótica), que subdividen al embrión temprano en campos celulares dotados de la capacidad de transformarse en tejidos ¡- órganos específlrcos. EI proceso de desarrolio de Xerto¡ttts lcteris, una lana sudafricana. constituye un ejemplo adecuado de cómo toma forma un verteblado. Los embriólogos modernos prefieren trabajar con este anfibio porque en toda época del año puede inducirse a la hembra a poner alrededor de 1500 huevos grandes 1' fácilmente fecundables. Dado que todos los vertebrados se desarrollan de

mica termina por desplazarse hacia el

interior del embrión, durante el proceso de gastrulación. Hacia el frn de este proceso, se hallan delimitadas tres capas con potenciales de desarro-

llo diferentes: el mesodermo, el endodermo y el ectodermo. El mesodermo da origen a la mayor parte del cuerpo, incluyendo la columna vertebral, los músculos, los huesos y la pared del

cuerpo. El endodermo genera la capa epitelial de tejido que reüste el tracto digestivo y otros varios órganos, tales como el pulmón, el hígado y el páncreas. El ectodermo da lugar a la piel y el sistema nervioso.

IlI-¿l

ectodermo se transforma en sis-

épocas recientes grandes avances en el conocimiento de los mecanismos que

forma parecida. 1a ma¡'oría de los

controlan este proceso, otrora miste-

prana de

rana son también aplica-

del mesodermo subyacente. Las seña-

rioso. Las poderosas técnicas de la biología molecular han permitido aislar y canacterizar genes particulares que intervienen en algrrnas de las decisio-

bles a peces. pollos, seres humanos 1otros animales. Uno de Ios rasgos sobresalientes de ias primeras fases del desarrollo es su rapidez. Una célula huevo fecundada de Xenopus se dlvide en dos al cabo de aproximadamente 90 minutos. A continuación, Ias células se dividen sin-

les inducen un engrosamiento de parte del ectodermo, que forma una

EDDY M. DE ROBERTIS, GUI. LLERMO OLIVER y CHRISTOPHER V. E. WRIGHT han trabajado en colaboración en la Universidad de California en Los Angeles (UCLA). De Robertis se doctoró en bioquímica por Ia Universidad de Buenos Aires en 1975. Desde 1985 ocupa la cátedra Norman Sprague de química biológica de 1a facultad de medicina de UCLA. Oliver obtuvo su licenciatura en ciencias biológicas en Ia Universidad de Ia República

Oriental del Uruguay en 1980 y su grado en biología molecular en la Universidad de México en 1984. Es profesor de bioquímica er¡. sr alma mater,Urtguay. Wright, que se doctoró en bioquímica por 1a Universidad de Oxford, en 1984, enseña biología celular en la facultad de medicina de Vanderbilt.

mecanismos de 1a

embriogénesis tem-

cronizadamente cada 30 minutos, hasta alcanzar el número de 4000. En este estadio, e} embrión se denomina blástula media y tiene Ia forma de una esfera hueca. A simple vista, todas las células parecen idénticas; no obstante, algunas de ellas, situadas alre-

tema nervioso en respuesta a señales químicas difundidas a partir

estructura denominada placa neural. (En este estadio, eI embrión se deno-

mina néurula.) A continuación, los bordes de la placa neural se pliegan uno hacia otro, en tanto que el medio se hunde en el cuerpo embrionario. Finalmente, los bordes se fusionan para formar un tubo neural, que se convierte en la base del cerebro y la

médula espinal.

La determinación del eje anteroposterior (cabeza-cola) del embrión constituye la piedra angular del desa-

dedor del ecuador de la blástula

rrollo, porque proporciona la línea

media, ya están destinadas a volverse la capa celular llamada mesodermo. La formación del mesodermo viene

central a 1o largo de la cual se desarrollará el resto de las estructuras. Ross G. Harrison demostró que las

inducida por factores de crecimiento proteicos liberados por las grandes células vitelinas situadas en el polo

células embrionarias están destinadas a transformarse en miembros y otras estructuras anatómicas especí-

inferior del embrión.

ficas muy poco después de completada

La totalidad de

1a capa mesodér-

la gastrulación. Tpl,hs

En 1918 Harrison extrajo pequeños fragmentos de mesodermo de los flancos de néurulas de anfibios y los trasplantó en los flancos de otras. Cuando el tejido trasplantado provenía de una

región determinada del donante, siempre daba origen a un miembro anterior adicional en eI receptor.

retirara todo el mesodermo

Harrison observó que, si bien el meso-

cuando

dermo tenía en esos embriones la apariencia de una capa uniforme, las células de algún modo ya sabían a qué

que normalmente hubiera dado origen a dicho miembro. Interpretó este hallazgo en el sentido de que la zona de mesodermo circundante tenía también el potencial de inducir y controlar el crecimiento dé los miembros. Esta extensa zona, con potencial para

parte del cuerpo pertenecían. Una de las peculiaridades notadas por Harrison fue que el embrión podía

formar un miembro anterior aun

é1

DROSOPHILA

lox-2

2.2

2.6

EMBRION DE RATON

1. LOS GENES CON HOMEOBOX controlan el desarrollo de animales tan dispares comoDrosophilamelanogrosrer (la mosca de la fruta) y el ratón. Estos genes dividen al embrión, a lo largo del eje cabeza-cola, en bandas cou diferentes potenciales de desanollo. La ubicación de un gen con homeobox en un cromosoma corresponde al lugar donde se expresa en el cuerpo: procediendo de izquierda a derecha, los genes controlan regiones

CoNsrnuccróN »e uN SsB Vrvo

del cuerpo más cercanas al extremo anterior del animal. Todos los genes con homeobox parecen tener un origen evolutivo común. En el presente diagrama se han coloreado en forrna similar los genes con homeobox relacionados enDrosophila y en el ratón y las regiones corporales que controlan en cada animal. El mecanisrno que determinalacabezareltronco y la cola pudiera haber surgido una sola vez en el curso de la evolución. 93

expresar una estructura, tomó el nombre de campo morfogenético. Tras Harrison, numerosos investigadores llevaron a cabo experimentos de trasplante en embriones de anfibios. Estos estudios permitieron establecer que el mesodermo constituye la capa celular crucial que especifica qué extremo del embrión es cabeza y cuál cola. El mesodermo de la néurula de anfibios se cartografió, o subdividió, en campos morfogenéticos para varios

Los estudios relativos ai control ejercido por el mesodermo sobre el plan corporal de anfibios hechos con la técnica de trasplantes terminaron en las postrimerías de Ia segunda guerra mundial, siendo reemplazados por estudios genéticos referidos a la manera en que el cuerpo adquiere forma. Edward B. Lewis inició en 1948 un anáIisis genético profundo de mutaciones homeóticas en la mosca de la

órganos: branquias, balancines (es-

frtta Drosophila melctnogaster. La mutación homeótica pro\¡oca Ia susti-

tructuras que aseguran que los rena-

tución de una parte

de1

cuerpo por una

genes rectores que dirigían la actividad de varios genes subordinados.

Una vez que Ia ingeniería genética dio a los científicos medios para aislar genes, se desató la carrera por descubrir y aislar genes homeóticos. David

S. Hogness y Welcome Bender aislaron los genes Ultrabithorax, Abdominal -A y Ab dominal - B enel complejo

bithorax a principios de 1980. Walter J. Gehring, Richard L. Garber, Matthew P. Scott y Thomas C. Kaufman aislaron los genes del complejoAntennapedia, incluyendo los denominados Labial, Proboscapedia, Deformado y Antennapedia.

cuajos permanezcan erguidos), oídos,

estructura cuya ubicación normal

miembros anteriores, miembros posteriores, cola, etcétera. Dentro de cada campo morfogenético, el potencial de

correspondería a otro sitio. Por ejemplo,Ias moscas mutantes bithorctx tíenen dos pares de alas en r.ez de uno;

formación de órganos variaba gradualmente. En consecuencia, se pos-

las mutantes Antennapedlo portan patas adicionales donde deberían

esultó crucial el descubrimiento, heclro por Gehring y su colega William J. McGinnis en 1983, de que

tuló que cada campo morfogenético

poseer antenas.

el gen Antennapedio contenía una

contenía un "campo de gradientes" de información, para determinar cada órgano. Como se explicará más adelante, el comportamiento de estos campos de gradientes se corresponde

Lewis descubrió que 1as transfor-

expresión de determinados grupos de

maciones homeóticas podían deberse a mutaciones en genes individuales, aun cuando se hubieran necesitado cientos de genes actitos para crear las alas ¡r patas con 1a ubicación anormal. Por consiguiente. era razonable supo-

genes.

ner que las mutaciones afectaban

estrechamente con los modelos de

HUEVO FECUNDADO

ESTADIO DOS CELULAS (90 N/INUTOS)

T) ll

secuencia de ADN que se encontraba también en otro gen rector del desarrollo. (A las secuencias similares de ADN en genes diferentes se les llama secuencias conservadas.) Dado que

las secuencias conservadas de ADN pueden hibridarse, o aparearse, unas a otras, era posible marcar radiacti-

BLASTULA I/EDIA oooo CELULAS, T HoRAST

GASTRULA TEMPRANA

(zo.ooo CELULAS, 9 HORAS)

POLO ANIMAL CAVIDAD

DEL:

BLASTOCELO

ECTODERIVO MESODERMO

POLO VEGETATIVO

BLASTOPORO

*=u*rro

TEMPRANA

PLACA NEUBAL

,uurrro

TEMPRANA

PLACA NEUFAL

A través de divisiones celulares

rá-

pidas (a-c), el huevo fecundado se transforma en una esfera de células hueca. Las grandes células vitelinas del polo inferior del embrión liberan factores de crecimiento que inducen la trans94

NEURULA TARDIA (50.000 cELULAS,

20 HoRAS)

neruncun¡o EN EcLostoN (500.000 CELULAS. 3 DIAS)

CIERRE DEL TUBO NEURAL

2. EL PI"AN CORPORAL DE LOS VERTEBRADOS se establece mediante la formación y el moümiento, químicamente inducidos, de capas celulares, como se ve eu el desarrollo deXenopus

lacois,tnarana sudafoicana.

formación de las células suprayacentes en la capa mesodérmica (color azul). El mesodermo constituye la capa crítica, que determina la polaridad anteroposterior del embrión. Otras dos capas celulares ectodermo (color marrón) y el endodermo -el quedan establecidas durante la gastrulación, (color amarillo)proceso mediante el cual el mesoderrno emigra hacia el interior

del embrión (d-e). El mesodermo induce la transformación de TEN,TAS 3

EMBRION DONANTE

TRASPLANTE

EMBRION RECEPTOR

DE IVESODERMO

PLIEGUE NEURAL

ii CAMPO DEL MIEMBRO ANTERIOR

CAMPO DE OIDO

CAMPO DEL MIEIVBRO

CAMPO

DE LOS BALANCINES

CAMPO DE

CAIVPO DE LA COLA

LAS BRANQUIAS

vamente la secuencia conservada de ADN de Antennapedla y emplearla como sonda para localizar otros genes que contuvieran 1a misma región. Así fue como Gehring y \IcGinnis aislaron (Jltrabíthorat. Defornrodo y otros

A "

3. TRASPLANTES en que se

injerta mesodermo de un embrión en estadio de néurula en otro embrión: originarán la formación de miembros u órganos adicionales. Si se trasplanta mesodermo de la reg'ión de los mieml¡ros anteriores, por ejemplo (¿), el emtrrión receptor tendrá un miembro anterior supernumerario (ó). Experimentos de este tipo hechos con anfibios han permitido a los embriólogos identificar los campos morfogenéticos que determinan el desarrollo de diversas estructuras (c),

genes homeóticos. También Scott identificó la región conservada de ADN, de forma independiente. IJna nueva comprobación significativa obtenida por Mccinnis fue que

otros invertebrados, tales como los ciempiés y los gusanos de tierra, de los cuales se supone que han evolucionado Ios insectos, poseen también la misma región conservada de ADN. Resultaba

GASTRULA TARDIA

(tz HoBAS)

PLACA NEURAL

clara la existencia de una relación entre las estructuras moleculares de

TEI'/PRANA

numerosos genes cuyo control sobre el

desarrollo celular embrionario

sé

hallaba comprobado. La región conservada de ADN de cada gen homeó-

BLASTOPOBO

[,4lEMBRO ANTERTOR

VISTA LATERAL

RANA ADULTA (2 MESES)

tico fue apodada "homeobox". El homeobox codifica una secuencia de 60 aminoácidos, muy similar en los productos proteicos de la mayorÍa de los genes homeóticos. En la proteína, esa secuencia se conoce como eI homeodominio. Su función consiste en

uls desde hacía ya cierto tiempo.

seguir los grandes avances realizados en los estudios sobre Drosophila, se nos hizo evidente que, si queríamos llegar a un conocimiento comparable

del desarrollo de los vertebrados, deberíamos identificar en ellos los genes rectores.

Sin embargo, la falta de conocimiento acerca de la genética de las ranas parecía una barrera infranqueable para lograr nuevos avances.

Aun cuando se disponía de estudios razonables sobre la genética de ratones, no existían candidatos verdaderos en lo concerniente a genes rectores de

la embriogénesis.

J\ecidimos intentar lo que en aquel parecía un expárimento loco: aislar un gen similar a

lrf -o-"oto

Antennaped,lo del ADN de rana, con las sondas de homeobox de las moscas de la fruta de McGinnis y Gehring. Habíapocasrazones paracreerque él

reconocer y unirse a secuencias específicas deADNenlos genes regulados por genes homeóticos. ADNderanacontuvieraesegenoque La cadena polipeptídica del homeo- los genes de especies tan poco empa-

dominio consta de cuatro hélices, de las cuales es responsable del

una

reco-

rentadas pudieran ser significativamente similares. No obstante, creímos

nocimiento de una secuencia especí- que el intento valía la pena. Algunos fica de ADN. Debido a que esta hélice de nuestros colegas eran escéptiáos en es casi idéntica en todas las proteínas cuanto a que ese experimento pudiera con homeodominios, todas estas pro- funcionar y dos de nuestros alumnos teínas se unen a secuencias bastante declinaron trabajar en ello. similares de ADN. Al unirse a genes Pronto nos encontramos celebránenunacélula, lasproteínasconhomeo- dolo con una botella de champaña. dominios activan o reprimen la expre- Tuvimos éxito al primer intento, tra-

subordinados. bajando con Andrés E. carrasco. Nuestro trabajo de investigación Analizamos la secuencia de ADN del sobre homeoboxes se inició en 1983, gen de rana que habíamos aislado, llacuando uno de nosotros (De Robertis) mado actualmente xtHbox 7, y confirtenía su laboratorio en e1 mismo piso mamos que contenía ra región del que Gehring. Nos veníamos intere- homeobox.Estedescubrimientodejaba sión de esos genes

parte del ectodermo en placa neural (rojo) en el estadio de néurula ff-g). Como se ve en el corte transversal (á-i), la placa neural se cierra sobre sí misma y se conüerte en tubo neural, predecesor del cerebro y de la médula espinal en el animal adulto (¡). (P. J. Wynne.) CoNsrnuccróN o¡ uN Ssn Vrvo

sando en el desarrollo deXenopus

lae-

claro que, por frn, podía disponerse de 95

Pero, ¿de qué modo orquestan los genes con homeobox Ia diferenciación

celular durante el desarrollo? La observación de las regiones donde las

proteínas producto de los genes con homeobox se Iocalizan en el cuerpo del embrión. en varios estadios del desarro11o, aporta un indicio a Ia respuesta. La proteína de Xenopus XlHbox 1, por ejemplo, se encuentra en una banda HELICES

PROTEINAS CON HOMEODOMIMOS, unidas al AI)N, regulan la expresión génica. Se componen de una región variable, la que determina una actividad proteica específica, una pequeña región de articulación conectiva y un homeodominio, secuencia de sesenta aminoácidos, que es similar en todas las proteínas de este tipo. Esta secuencia es codificada por las regiones de homeobox de los genes. El homeodominio consta de cuatro hélices alfa (7-4), una de las cuales (roJb) reconoce y se une a una secuencia específica de ácido desoxirribonucleico en los genes blanco, o 4.

diana. (E. Bell.)

un gen que controlaba directamente eI desarrollo de los vertebrados. Mal podíamos imaginar, tras este primer experimento, que llevaría seis años más, y el esfuerzo de laboratorios

de todo el mundo, confirmar que los genes con homeobox de vertebrados están directamente involucrados en el

control de1 desarrollo. Aun así. Ios avances iniciales en el estudio de mamíferos fueron rápidos. Trabajando con ratones, Frank H. Ruddle y Peter Gruss aislaron numerosos genes con homeobox: Dado Boncinelli obtuvo éxitos similares con genes humanos. Las proteínas codificadas por todos estos genes con homeobox se diferencian

mucho unas de otras! salvo en la región muy conservada del homeodominio. La lista de proteínas con homeodo-

minios creció en 1988. al logralse 1a primera purificación de factoles de transcripción. Estos factores son proteínas que aumentan 1a expresión de determinados genes diana. A1 secuenciarse los factores de transclipción. se encontró que algunos de el1os contenían homeodominios. 1o que rndicaba que eran productos de genes cort t'egiones de homeobox. Tales investigacio-

nes bioquímicas confirmaron. de forma independiente. que los genes

estrecha de células, situada detrás mismo de la cabeza del embrión de la rana. Esta banda está formada tanto por e1 mesodermo como por 1a médu1a espinal anterior y 1a cresta neural. En estas capas hísticas. el límite anterior y el límite posterior de expresión deXll{óor 7 guardan una clala alineación. Porque e1 mesodermo induce.

según es sabido, Ias características anteroposteriores del tejido ner-rral. parece posible que e1 mesodermo que expresa XlHbox -1 induzca también la expresión del mismo gen en cé1u1as de 1a placa neural suprayacente.

tros genes con homeobox tienen actividad en regiones diferentes. Basándose en los patrones de expresión de los genes con homeobox. podemos concebir el embrión de vertebra-

dos subdividido en campos celulares

anteroposteriores con diferentes

con homeobox legulaban 1a actir-idad de otros genes.

potenciales de desarrollo. Esta subdivisión cle1 cuerpo embrionario precede a la formación de órganos o estructuras específicos.

IAHALCLTERQIKIWFQNRRMKWKKEN

codificados por diferentes genes con homeobox son muy similares entre sí, para identificarlos se puede recurrir

Aun cuando los homeodominios Consenso RKRGRTTYTRYQTLELEKEFHFNRYLTRRRRI

Labial N]'tS -

a diferencias características en sus

-*--

NF -N]K-LT- - - - - - - - - - - - - -A-¡iT-Q-N-l-!-- - - - - - -;- -.a.V -NF TF.-LT - - - - - - - - -K- - S -A- -V* - -AT -G-¡i-J -i:'- - - - - - - - - -.; - -.P.E llox-2.9

PGGL-

Deformado

D__n__a___H_r____----y

secuencias de aminoácidos. Algunos homeodominios se asemejan mucho más estrechamente que otros. Tomando como criterio estas similitudes v diferencias, resulta interesante des-

---T-v-s-----------------D-

p- * s- -A- - -Q-v- - - - - - - -Y- - - - - - - - -v- - - - - - - - s - - - - - - * - - - - - - - - - -DH Hox-2.6

tacar que determinados homeodominios de mamíferos se parezcan mucho a aquellos producidos por determinados genes de la mosca de la fruta. A1 analizar patrones de expresión de varios genes con homeobox de embriones de ratón, Robb Krumlauf y

Denis Duboule realizaron importan-

tes observaciones, cada uno por su 1ado. Con anterioridad se había demostrado que,

mismo en r.erte-

brados que en invertebrados, los genes con homeobox se agrupaban en 5. TODOS LOS HOMEODOMINIOS son esencialmente similares, pero los producidos por genes de determinados insectos y mamíferos guardan un parecido muy estrecho. Aquí se muestran secuencias de aminoácidos de varios homeodominios. Los genes Labia\ Deformado,Antp y Abd-B provienen de la mosca de la fouta, Drosophilo; y los cuatro genes -EIor análogos provienen de ratones. Las letras representan aminoácidos en todas las secuencias. El guión indica que el aminoácido es el mismo que en la fila del consenso, un promedio de todas las secuencias de homeodominios. (E. Bell.) 96

complejos, o grupos, en un cromosoma. En otras palabras, en la molécula lineal de ADN que compone un cromosoma, los genes con homeobox están dispuestos en un orden preciso, de izquierda a derecha.

Krumlauf y Duboule descubrieron TEN,TAS 3

RENACUAJO CONTROL

MEDULA ESPINAL ANTERIOR

RENACUAJO INYECTADO CON ANTICUERPO

6. INHIBICION de una proteína con homeodominio. Dicha inhibición puede alterar el desüino de los tejidos embrionarios. En los renacuajos normales (izquierda), la proteína XlHbor 7 se expresa en una región definida de la médula espinal ante-

inesperadamente que, en ratones, el orden de los genes con homeobox de un complejo se correspondía directamente con el lugar de expresión de los genes. Los genes con homeobox situados cerca del extremo izquierdo de un complejo se expresan en 1as regiones

rior (azul), Si se inyectan anticuerpos contra la proteinaXlHóor 7 en un embrión unicelular, tal región se transformará en el mielencéfalo (rojo) del renacuajo resultante @.ibujo de lo d.erecha).

Mediante el agregado de ácido retinoico a células embrionarias en cul-

tivo,

grupo de investigación

Boncinelli demostró que e1 compuesto activaba numerosos genes con homeobox. Douglas A. ]lelton comprobó que el factor de crecimiento de fibro-

1os genes de de

blastos lque induce Ia formación de1 mesodermo en el embrrón temprano)

la cabeza. Leu.is había observado el

acti\.aba selectivamente los genes posteriores con homeobox en ei embrión de rana. Ken \\. Y. Cho mostró que una ploteína parecida al TGFB r factol de crecimiento transformante

posteriores dei cuerpo v

la derecha se expresan más celca

mismo patrón en Drosophilo. muchos años antes.

Todos los vertebrados poseen cuatro complejos de homeobox. cada uno de ellos localizado en cromosomas distintos. Es probable que estos compiejos hayan surgido a lo lalgo de la evoIución mediante 1a duplicación de un único grupo de genes con homeobox en

invertebrados. Cada sel humano

F' actir-aba sóio genes anteriores.

que se establece el plan corporal. Ai examinar los renacuajos que se desarrollaron, descubrimos que los tejidos que normalmente expresaban XlHb ox

7. y que deberían haberse transformado en una sección de la médula espinal anterior, se habían transformado, por contra, en estructuras del mielencéfalo. En efecto, Ia "pérdida de

función" del XlHbox 7 transformó parte de la médula espinal en una estructura más anterior. En el segundo ensayo, Gruss y Michael Kessel inyectaron ADN que contenía un gen con homeobox de ratón en embriones de ratón. El segmento de

T Tnu \-ez act¡\'ados. uespecifican los ADN se diseñó de manera que el gen L,/ eenes con homeobox las identi- con homeobox se expresara en la totadades ¡'destinos de las céIulas embrionarras, dando por consiguiente forma

posee, pues, cuatro genes que se palecen, por ejemplo, al gen AódontincLl-B

al cuerpo

de Ia mosca de Ia fruta v otlos cuatl'o similares al Deformado. Un principio unificado]' se apl1ca a

efectos? Los resultados de dos experimentos proporcionan argumentos en favor de un papel directo.

todos los complejos de homeobox: los genes que se expresan en zolras posteriores se alojan a la izquierda r-. a la derecha, los que se expresan en zonas anteriores. Así, en el ADN cromosómico, los genes con homeobox se dlsponen en el mismo orden en el que se explesan a Io largo del eje anteroposterior del cuerpo. Tai disposición extraoldinaria puede haberse producido a consecuen-

En el primer ensayo, inyectamos anticuerpos dirigidos contra Ia proteína XlHbox 7 en embriones uniceIulares de Xenopus. Los anticuerpos se frjaron a Ia proteína y la inactivaron durante el período crucial en el

1, dirigiendo la constitución de los órganos? ¿O son indirectos sus

lidad del cuerpo. incluso en regiones donde no 1o hubiera hecho en condiciones normales, tales como la cabeza y el cuello. Los ratones resultantes presentaban frecuentemente defectos graves en 7a cabeza (verbigracia, frsura

palatina). Más interesante aún, poseían una vértebra adicional y un disco

intervertebral en la base del cráneo; algunos tenían un par de costillas supernumerarias en Ia región del cueIlo. Así, la "ganancia de función" de un

gen con homeobox inducía transfor-

cia de que 1os genes con homeobox deban activarse en un orden deterrninado.

Se van acumulando las pruebas sobre cómo se produce este despiiegue secuencial de genes con homeobox. E1

ácido retinoico (compuesto relacionado con la vitamina A, que en ocasiones puede provocar graves defectos en recién nacidos) y 1os factores de crecimiento peptídicos constituyen buenos candidatos para proveer esas pis-

tas posicionales en los embdones de vertebrados. Podrían transmitir esa información mediante la activación selectiva de genes con homeobox en el mesodermo, elemento clave en la determinación del plan corporal. CoNsrruccróN oE uN S¡n Vtvo

7. LOS GENES CON HOMEOBOX se

expresan en bandas discretas a lo largo del eje

anteroposterior del embrión. Por ejemplo, en el renacuajo de Xenopus laetsis, el gea XlHbox 7 se expresa en una región del tronco anúerior del cuerpo. La proteína producida por el gen se encuentra en los núcleos celu.lares de tejidos tanto mesodérmicos (azul) como ectodérmicos (rojo). El miembro anterior crece enteramente a

partir

de células del mesodermo que

expresanlaproteinaXlEbox

8. EN ESTAS TINCIONES de brotes de miembros se pueden observar gradientes de proteínas con homeodominios. En el trrote de ala de pollo (izquierda), la mayor concentración de proteína Hor 5.2 se encuentra en los núcleos celulares cercanos a la región posterior (borde derecho). En el brote de ale-

maciones homeóticas exactamente similares a las observadas en 1as mutaciones de la mosca de Ia fruta. Hay otros trabajos que indican que los genes con homeobox cumplen un papel en la especificación de 1a identidad celular. Como se dijo antes, los genes con homeobox se expresan intensamente en bandas a Io largo del eje anteroposterior, en la fase tem-

prana del desarrollo. Nfás tarde. cuando los órganos de estas regiones se están formando. los mismos genes

con homeobox se expresan de nuevo con intensidad. En estos estadios más tardíos, los genes con homeobox parecen proporcionar etiquetas moleculares que recuerdan a las células el lugar del embrión donde se originaron. EI desarrollo del miembro anterior constituye un caso muy esclarecedor. La totalidad del campo del miembro

anterior se deriva de Ia banda de mesodermo que expresa XlHbox 1. Las células proliferan en Ia banda y forman un brote (una insinuación) de miembro anterior que, en Xenoptts, aparece hacia la tercera semana después de la lecundación. En este estadio, el mesodermo de1 brote de miembro anterior parece un iforme, pero contiene un gradiente de

la proteína de XlHbox 7. O sea, que la proteína abunda más en los núc1eos celulares situados a 1o largo del lado anterior del brote del miembro -ely lado que da origen al dígito mayormenos en los núcleos del lado posterior, que da origen al dígito menor. Mientras el miembro crece y se conforma, la concentración de proteína XlHbox 7 se mantiene en el nivel más

elevado cerca del hombro, en el extremo proximal del brazo. Por contra,),a proteína producto de otro gen, el Hox 5.2 , establece un gradiente cuyo 98

ta pectoral del pez cebra (derecha), la concentración más elevada de proteína XlHbox I está en la región anterior (borde izquierdo), La aleta pectoral es el precursor del miembro anterior de los tetrápodos. Los gradientes son mecanismos eficaces para transmitir la información de posición.

nivel máximo se encuentra a 1o largo del lado posterior y el extremo distal del miembro, un patrón exactamente inverso a1 establecido para XlHbox 1.

tremidades. Es probable que intervengan señales de comunicación intercelulares, parecidas a las involucradas en la formación del eje y tal vez mediadas por factores de creci-

Tll n embriones de rana. pollo r laron 11 ." pueden detecral gladienres

miento o ácido retinoico.

XlHbot 7 ¡- de.É1o.r' 5.2. En e1 desarrollo de los miembros ante-

sobre eI desarrollo embrionario, el estudio de los genes con homeobox ha aportado nuevas perspectivas sobre la evolución. Debido a que el orden de

proteicos

riores también están comprometidos otros genes con homeobox. Duboule identificó otros tres genes con homeobox ad¡-acentes all1o.t 5.2. que se activan secuencialmente a medida que la punta de la extremidad crece. EI orden en que los gene: se activan corresponde a1 orden que presentan en el

AD\.

Gradientes de proteÍnas o de otras

moléculas constituyen indicadores apropiados para especificar 1as posiciones celulares )- para orientar con eficacia sus destrnos. Por ejemplo, las céiulas de una insinuacrón o brote de miembro pueden formar dígitos separados respondiendo, de manera dife-

rente. a cantidades variables de una proteína. SerÍa menos económico el que una proteína diferente especificara cada dÍgito. En conclusión, el análisis de los gradientes de proteínas con homeodominios durante el desarroilo de los miembros revela que Ia misma batería de genes con homeobox que esta-

blece el eje cabeza-cola vuelve a usarse más tarde para determinar 1as posiciones celulares durante el desarrollo de los miembros. Las proteínas con homeodominios se encuentran en Ios núcleos celulares, como se podría esperar de 1as proteínas combinadas

de ADN que activan

y desactivan

genes. Aún se ignora la manera en que

se establecen los gradientes de proteínas nucleicas en los brotes de ex-

Además de cuanto nos ha aclarado

los genes con homeobox es similar en

vertebrados e invertebrados, los primeros compleios con homeobox debie-

ron haber evolucionado, eones atrás, en platelmintos u otros organismos

primitivos, antepasados comunes

los seres humanos y de los insectos. Sería interesante saber si los organismos pluricelulares más primitivos con polaridad anteroposterior, como los rotíferos, poseen también complejos de genes con homeobox. La asombrosa conservación de los complejos a

través de la evolución sugiere que, una vez encontrada una vía eficaz de

determinación del eje anteroposterior, resultó más fácil producir nuevas formas corporales modificando ese sistema que creando métodos totalmente nuevos.

La actividad de los genes con homeobox ofrece también claves para entender la posible evolución de

estructuras anatómicas específicas. Una inquietud científica antigua se refería al origen del brazo,

o del

miem-

bro anterior, de los tetrápodos, por ejemplo. Puesto que los peces primitivos denominados celacantos poseían

aletas pectorales con articulaciones la creencia generalizada era que el brazo había evolucionado de las óseas,

aletas pectorales. El trabajo de Anders Molven y Charles B. Kimmel presta apoyo a esta teoTenrs

úa.EIXlHbor 7 se expresa en primer Iugar en una región circular del mesodermo lateral, correspondiente al campo de la aleta pectoral. En este estadio, Ia expresión del gen se corresponde exactamente con la de un campo morfogenético definido por Harrison en 1918. A medida que las células proliferan,

la proteínaXlHbox

forma un agudo

gradiente en el brote de aleta pectoral, similar al gradiente encontrado en insinuaciones de miembros anteriores de ranas, pollos y ratones. Este patrón hace pensar que XlHbox 7 es un gen antiguo, cuya función en el gradientecampo del miembro antecede a la aparición de estructuras tetrápodas de1 tipo de los dígitos. Probablemente sea mucho Io que se pueda aprender aber-

dando la embriología compalada de Ios vertebrados en el ámbito de 1a expresión génica.

levará mucho tiempo entendel con exactitud como coope) an ent le si los genes para organizar células que, a partir de un huevo aparentemente homogeneo. oliginen un lerracuajo nadador, pero e1 estudio molecular del

J IJ

desarrollo de 1os vertebrados r.a ha progresado mucho. La expresión de 1os genes con homeobox puede proporcionar'

una explicación molecular a 1os gradientes-campos reconocidos por 1os

embriólogos experimentales hace muchos decenios. Los genes que contro-

lan el eje anteropostel'iol' tienen

grado de conservación en el espectro zoológico que sobrepasa 1as expecta-

tivas más delirantes de ios investigadores. Se han identificado moléculas que pudieran intervenir en la transmisión de la información posrcional, como el ácido retinoico 1- los factores de

crecimiento. Ahora

plantea

po-

sibilidad de investigar cómo cambia 1a forma del cuerpo en el transcurso de la evolución. Puede que algún dÍa los que hoy son estudiantes bisoños puedan responder preguntas simples de1 tenor siguiente: ¿en virtud de qué difiere un brazo de una pierna? ¡Qué buen

momento para comenzar!

i:i I i:l i

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i.' j . 1, t.-

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¡¡ ;. :,

A Gn.rorErr orHoN{EoDoNrAtN Pnor¡rx tN DEvEr-oprNc Fo«¡l-rMss oF XL,vop{.,s e¡o Mouse EivttsRyos. Guillermo OIive¡ et al. en C¿ll, vol. 55, n." 6, págs. 10171024:23 de diciembre de 1988.

V,cntarroNs op C¡nvrc¡l- V¡nrsen,{¡ .crren ExpnEssroN oF A É1ox CENE rN

/ Tu¡s-

Mrc¡. Michael Kesset et al.

* niña?

1a especie humana el sexo se determina fundamental y primariamente por el par de cormosomas 23,XX en la mujer y XY en el varón. Como cada gameto tiene só1o 1a mitad de la dotación genética, a un espermatozoide le puede tocar llevarse un cromosoma X y a otro 1e puede comesponder un Y. Si el

azar reparte bien la suerte. habr'á igual número de representantes de uno y otro. Para el ór,ulo. en cambio. esa rueda de la fortuna no existe, y en e1 reparto todos se quedarán siempre con uno de los X. Si un espermatozoide con dotación X f-ecunda a un

óvulo. el cigoto desarollarí caracteres femeninos. En cambio. si el f'ecundante es Y. el cigoto generado desalrollará cal'acteres masculinos. El tipo de crolnosomas del par 23. heredados en el ntomento de la fecunclación. define, por tanto. el sexo -eenético. Los 22 pares de cromosontas restantes (:14 autosomas) son equir.,alentes

en el ci-uoto femenino en el masculino. Una serie de los 22 pares procede del padre \, ticne toda ella 1a irnpronta. Ia estructura propia de la herelcia paterna. Difiere. por tanto. c1e 1a otra seric. que ller a 1a irnpronta propia de la herencia naterna. En al_suna ocasión. aunque con muv escasa ltecuencia. pr.rede darse algr.rna ano-

malía en el proceso de fecundación. Las células germinales de los progenítores. por ejemplo. pueden sufrir algurra alteración, que accidentalrnente conduzca a la pérdida o a la repetición de uno de Ios dos cromosomas del par 23, los denominados cromosomas seruales. Tales ¿rnomalías genéticas originan alteraciones funcionales y malfbrmaciones que se reflejan en las glándulas sexuales. las gónadas, t,en los caracteres sexuales secundarios.

lnstrucciones para el desarrollo Normalmente es la presencia de un cromosoma Y lo que hace que un ernbrión se desarrolle como individuo de sexo masculino. Para que el cromosoma Y pueda realizar su función ha de estar completo y poder así expresar las instrucciones que Ie corresponde port¿rr en su estructura. En los úrltimos años se ha identificado el gen llamado SRY en la re-eión I del brazo corto del cromosoma Y, que tiene intbrmación para la síntesis de un factor determinante del testícr.rlo. el TDF. Este factor hace que en la séptirna semana de gestación se inicie el proceso de rnasculinizacitin del embrión humano actir,ando en cas-

cada los genes que causan Ia transformación de las gtinadas embrionarias indiferenciadas en testículos fetales. Una vez que éstos se han formado. col.nienzan a segregar 1a hormona testosterona. que dirige el desarrollo del tracto urorenital y 1os genitales masculinos al transfblmar las estructuras embrionarias conocidas como conductos de Wolf y las pron'rinencias labioescrotales. Además.1as células de Sertoli de ese testícr.r1o ernbrionario producen la hormona antimulleriana. que clestruye las estrllcturas embrionalias denominadas conc'luctos de M|iller a partir de los cuales se -eenerarían órganos f'en-reninos. tales como el útero, la vagina y las trompas de Falopio. si del cromosor.na Y no emanaran las instrucciones de retroceso. ¿,Quiere esto decir que 1a diferenciación de 1as g1ándulas f'emeninas no está determinada genéticamente? Durante bastante tiempo se pensó que así era; que la diferenciación de1 cigoto hacia el tipo f'emenino era 1a fbrma espontánea. mientras que el desarrollo masculino vendría a ser como una corrección de éste. debida a las instrucciones escritas en los genes del cromosoma Y, sin embargo, datos recientes han perrr-ritido saber que la diférenciacicin femenina no es una diferenciación por det-ecto. sino que existe una r,ía embriogenética para el desarrollo del ovario. paralela a la vía comentada para el desarrolio de los testículos. En 199,1 se ha descrito la existencia cle r.rna región del cronlosoma X ODF. que favorece el desarrollo de1 ovario e inhibe el desarrollo del testículo. Esta zona contendría los genes de la feminidad. designados corno Od o DSS. Una vez formado el ovario en el embrión t'emeninr¡. éste comienza a sintetizar y segregar estrógenos que dirigen la diferenciación del conducto de Müller y de las prominencias labioescrotales hacia los órganos sexuales femeninos. Existen por tanto dos r,ías perf-ectamente diferenciadas en el desanollo sexual norrnal del embrión masculino o femenino. Y de tbnna similar a lo que ocurre si ¿rccidentalmente se altera el número de los cromosomas de este par 23, también se presentarán anomalías con caracte¡ísticas clínicas variadas. si el cigoto hereda los cromosomas X o Y sin los genes qlre controlan este proceso. o con más de r-rna copia de e1los.

Cell, vol.61, n.,, 2. págs. 301--308: 20 de ab¡il de 1990.

CoNsrnuccrón or us Spn Vrvo

¿F{iño

Atm Carmen Martuello y Natalia Lripez Moratollct

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Base molecular del desaffollo Walter J. Gehring

¿Cómo se establece la arquitectura bdsicq de un embrión? El descubrimiento de un corto segmento de ADN,

la llamada cajo homeótica, puede suministrar una parte crucial de la respuesta para un número bastante amplio de especies

no de Ios grandes misterios de la bioiogía es el modo en que la información 1inea1 contenida en e} ADN genera un organismo tridimensional específrco en el curso de su desarrollo a partir del huer.o fecundado. Cada órgano de1 animal

potencial genético utilizado en una célu1a depende de qué genes suyos se expresen y cuáles no. Cada céiu1a se

caracteriza por un patrón determinado de genes, activos

inactivos, que

sufre cambios secuenciales a medida que el desarrollo avanza. Dado que el

una tarea concreta

genoma de un organismo superior (su

y consta de tejidos especializados. A

genética completa) puede contener hasta 50.000 genes, no parece probable que cada gen se regule individualmente. Hay que pensar que los genes se regulan en grupos, con un gen "rector" que controle Ia acción de cada grupo. Aunque hace ya tiempo que este esquema se viene considerando piausible, ha costado encontrar

adulto lleva

a cabo

su vez, los tejidos están constituidos por células también especializadas. Estas muestran:olo una pequeña parte de1 gran potencial genético dei huevo fecundado. La fracción de ese

genes rectores. En los últimos años se fueron identificando algunos de los genes rectores que controlan el desarrollo. Resulta claro que para que éste proceda de forma correcta deben regularse con precisión tanto el momento en que 1os

ocurren los distintos procesos del desarrollo como Ia organización espa-

cial de los tejidos dei embrión. Los genes identifrcados tienen que ver con

ambas funciones. Un grupo de genes hallado en el nematodo transparente

Caenorhabditis elegan s desempeña, por Io que parece, un papel crucial en la regulación temporal de la diferenciación celular del mismo. Sin embargo, los resultados más sorprendentes se refieren a la organización espacial del embrión y provienen de trabajos realizados con la mosca Drosophilct ntelanogcLster. Usando los nuevos

métodos de ia biología molecular, hemos observado en mi laboratorio que muchos de los genes que controian Ia organización espacial de Drosophila comparten cierto segmento de ADN.

i,'i I ii .1. (-] !: i:1i'-i :; {-,: es c ate drátiy director de1 departamento de biología celular del Biocenter de 1a Lrnrversidad de Basilea. Nació en Zurich. en cuya universidad se educó, licenciándose en zoología en 1963 y doctorándose en 1965. Preparaba su tesis i'!r"{

sobre la mosca Drosop,álla cuando se interesó por 1a genética molecular. que desde entonces ha constituido su campo de investigación. Tras cinco años de docencia en Ia Universidad de Yale volvió a Suiza. Gehring se unió al claustro docente de1 Biocenter poco después de su fundación, en 1971.

1. PATRON DE EXPRESION del gen d.entellado (engrailed). Se aprecia aquí en la distribución de 14 zonas brillantes en una sección fina de un embrión de la mosca del winagre, Drosophila melanogaster.Las zonas brillantes denuncian la presencia de transcritos d.entellad.os (moléculas de ARN mensajero que llevan la información del gen), que se acumulan en los lugares del embrión donde el gen se expresa. La ñgura reproduce una sección longitudinal de un embrión a las seis horas de la fe-

cundación. En este estadio el embrión ya se ha dividido en los segmentos caracte-

rísticos del cuerpo de la mosca (claae a la izquierd,a). Existen, por lo menos, tres segmentos cefálicos (Md., Mx, tró), tres segmentos torácicos (Tt-rc) y ocho segmentos abdominales completos (A1-A8). (Los segmentos abdominales, que formarán finalmente la parte posterior del insecto, se han desplazado sobre la superficie dorsal en un complejo movimiento de desarrollo.) Cada segmento se divide en un eompartimiento anterior (A) y otro posterior (P). El gen d.entellad.o (engrailed) se expresa en los 14 compartimientos posteriores y contribuye a proporcionarles su identidad. Los transcritos dentellad.os se detectaron mediante la técnica llamada de hibridación in situ. Se aplicó ADN marcado radiactivamente procedente del gen dentellad,o a una sección del embrión. El ADN hibridó, es decir, se unió selectivamente, con el mensajero ARN de dentellad.o (ARNm). Se cubrió el tejido con una emulsión fotográfica y se reveló. La porción de ADN radiactivo de los híbridos ADNARN impresionó los granos de plata de la emulsión, dando puntos brillantes. CoNsrnuccróN »¡ ux S¡n Vrvo

101

rias y una adulta. Al final de cada

CELULAS FOLICULARES

etapa,

gusano muda y adquiere así

una nueva cutícula (cubierta exterior). Una mutación particular en el

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gen llamado lin- 11hace que el gusano mude dos veces más. Durante las etapas supernumerarias el desarrollo de la cutícula se retrasa: a pesar de que

el animal ha alcanzado Ia madurez sexual. 1a cutícula es todavía larvaria. Del efecto de esas mutaciones pue-

de deducirse que el ctonogén lin-14 normal (tipo siivestret tiene por misión pror-ocar 1a diferenciación de las cé1ulas formadoras de cutícula que

producirán la del adulto en el momento correcto. Se han encontrado también otros cronogenes que interPUENTE

NUCLEO DEL OOCITO

2. OOCITO DE DROSOPHILA MELANOGASTER, o huevo sin fecundar. Se forma dentro de una estructura ovárica llamada folículo; la ilustración superior 1o muestra en un corte transversal. El oocito y 15 células nutricias se forman a partir de la misma célula precursora en cuatro ciclos de división celular. Los puentes citoplas-

máticos permiten que las células nutricias transfieran al huevo ácido ribonucleico, proteínas y orgánulos celulares. Entre las sustancias así transferidas podrÍan hallarse moléculas que establezcan la polaridad inicial del zigoto (huevo fecundado) en las etapas tempranas de la embriogénesis.

Este segmento, llamado caja homeó-

tica, podría permitir a los genes que

parte. a la pauta de desarrollo del pequerlo nematodo. Ei embrión de C. eleguns se desal'r'oIla de tal manera que 1a cronología de C. elegans se debe, en

vienen en la diferenciación de muchos más linajes celulares. E1 control crono1ógico de 1os procesos del desarrollo reviste una importancia destacada en organismos como C. elegans, cuyo es-

quema formativo se basa en iinajes ceiulares invariantes. Pero 1a mayoría de los organismos no se desarrollan así. De hecho, C. elegans está situado en un extremo de1 espectro de esquemas de desarrollo. En el otro extremo del espectro se encuentran el ratón y otros or-

adecuada se activara en un grupo de

Iinaje. Se puede conocer 1a genealogía de cada una de las 959 células del adulto y remontarse a trar'és de sus

ganismos cuyas células embrionarias gozan de una flexibilidad considerable. Una cé1ula de embrión precoz de latón puede terminar en casi cualqurer estructura adulta. Su destino no r-iene determinado por e1 lugar que tenga en un linaje fijo. sino por la posición espacial que ocupe, más o menos por casualidad, en el embrión pl:ecoz. La mayoria de 1os organismos se encuentran entre estos extremos. Así Drosophíla, que ha aportado la parte

células del embrión de Drosophila, esas células se encauzarían por el

predecesoras hasta e1 huer.o fecundado. Las genealogías de estas célu-

principal de cuanto conocemos sobre el control genético del desarrollo.

camino que conduce

la conversión en

las no varían esencialmente de un

Thomas Hunt Morgan, introductor de

parte de un ala; la activación de una batería distinta de genes en un segundo grupo de células podría llevarIas a la formación de una parte de una pata. Más aún, la importancia de la

gusano a otro, a menos que e1 animal haya sufrido una mutación. Para dar lugar a las estructuras especializadas del adulto, los linajes deben ramificar5e en el momento p|eciso.

caja homeótica trasciende el ámbito deDrosophilo. La secuencia común de ADN se ha encontrado en una gama

DrosophilcL en el laboratorio a principios de este siglo, se sirvió de ella para demostrar Ia base cromosómica de Ia herencia y el orden lineal de los genes en los cromosomas. Drosophilct tíene algunas características que Ia con-

Ql dnel Brenner comenzo los estuL) dios de C. elegatts en los años se-

vierten en un organismo excepcional

lo contienen regular la acción de agru-

paciones de otros genes. Cuando el gen que contiene la caja homeótica se traduce en una proteí-

na, la caja homeótica produce una secuencia de aminoácidos que, así se cree, se une a la doble hélice de ADN. Al fijarse al ADN de unos genes concretos, la proteína podría activarlos o

reprimirlos. Si la batería de genes

los acontecimientos tiene especral importancia. Las células del embrión de C. elegans muestran poca flexibilidad..Estos gusanos tielren un nunrelo fijo de células ¡'e1 destino de casi todas

eiias está predeterminado por su

de organismos que va desde los gusanos hasta los seres humanos. Quizá la

senta. Desde entonces varios investigadores han descubierto genes que controlan el momenlo en que se asignan los destinos a los distintos linajes celulares. Dichos genes. llamados

controvertible que en los últimos años la biología del desarrollo ha entrado

observar los efectos causados en e1los por las mutaciones. Las mutaciones específicas en los cronogenes alteran el desarrollo de los linajes celulares, provocando que se separen antes o después de Io que les correspondería en el organismo normal . C. elegarus suele atravesar cuatro etapas larva-

caja homeótica encierre la clave que abra los mecanismos de desarrollo en los organismos superiores. Se cumplan o no esas esperanzas, resulta in-

en la fase en que las explicaciones pue-

den buscarse en el nivel molecular. El hecho de que los genes que con-

trolan la secuencia temporal de acontecimientos que ocurren en la embriogénesis fueran descubiertos en 102

cronogenes, se han descubierto al

para el estudio de ia herencia. Recordemos, entre otros rasgos, sus cromosomas politénicos gigantes, presentes en muchas células, sobre todo en 1as de 1as glándulas salivales. Mientras que los cromosomas de 1a mayorÍa de los seres contienen una copia de cada gen, Ios cromosomas politénicos de Drosophila incluyen hasta 1000 copias de cada gen, alineadas unas con otras a modo de cerillas en su caja. Gracias a

esa abundancia, Ios genes individuales se pueden teñir y observar en el microscopio óptico en forma de bandas oscuras. Además Drosophíla es T¡v,q.s

el espermatozoo se unen; el zigoto resultante contiene cromosomas de ambos padres. Casi inmediatamente, el núcleo del zigoto se divide; los núcleos hijos empiezan una serie de divisiones rápidas, una cada 10 minutos. Siempre que los núcleos se dividen, debe doblarse la cantidad de ADN en la célula. Esta formidable tarea mantiene plenamente ocupados a los núcleos del zigoto, sin que lleguen a expresarse muchos genes zigóticos.

sión, cuando hay 256 núcleos, éstos inician su marcha hacia la superficie

mada folículo, las células nutricias

En el modo habitual de división

alimentan al huevo. Proteínas, moléculas de ARN y orgánulos como las mitocondrias penetran en el oocito a través de canales que lo conectan con Ias célu1as nutricias. La contribución de estas células ayuda a construir el huevo y a prepararlo para la fecunda-

celular, los núcleos quedan separados

células. La monocapa celular resultante recibe el nombre de blastodermo. El embrión se desarrolla rápidamente en las horas siguientes, sufriendo una compleja reorganización espacial. En eI proceso de gastrulación se for-

muy prolífrca, con un tiempo de gene-

ración corto y un genoma relativamente pequeño. El desarrollo de un ejempl ar

Dro-

sophila comienza en el ovario de la hembra, donde una célula germinal primitiva inicia una secuencia muy especializada de división celular. La célula germinal se divide cuatro veces, dando 15 células nutricias y el oocito que más tarde se transformará en el huevo. Dentro de una estructura lla-

ción. Esta acontece cuando el huevo y

por membranas celulares recién formadas. No ocurre así con los núcleos

hijos del zigoto de Drosophila: comparten, mientras se dividen, un citoplasma común. Durante las primeras divisiones, los núcleos están dispersos por el citoplasma. Tras Ia octava divi-

del huevo, hacia la capa llamada córtex; ubicados ya en el citoplasma cortical, se distribuyen por la periferia en una capa cuyo espesor viene a medir el de un núcleo. En este momento del desarrollo se activa por fin un número sustancial de genes zigóticos. Después de 13 ciclos de división, las membranas celulares empiezan a dividir el

citoplasma común y se forman las

man las capas celulares interiores. Quizás eI rasgo más sobresaliente de la transformación espacial sea la divi-

POSTERIOR

MICROPILO

VENTRAL

CORTEX

BLASTODERMO

3. ETAPA§ IMCIALES del desarrollo de un embrión de Drosophila. Conllevan repetidas diwisiones de los núcleos en un

citoplasma común. El espermatocito penetra en elhuevo a través del micropilo, que está en la parte anterior del oocito (7). El núcleo del espermatocito se une al del huevo. Poco después de la fecundación comienzan ciclos sincronizados de división nuclear que doblan el número de núcleos cada lO minutos (2-8). Concluida la octava división, cuando hay 256 núcleos, és-

CoNsrnuccróN os uN Sen Vryo

tos empiezan a desplazarse hacia el córtex, o periferia, del huevo (9). Llegados a los 512 núcleos, se forman las primeras membranas celulares en torno a un grupo de células de la parte posterior del huevo (lO). Estas "células polares" originarán las células germinales de la mosca adulta. Los otros núcleos siguen dividiéndose en el córtex (11-14). Con 6OOO núcleos en la

periferia, las memt¡ranas separan los núcleos en una monocapal el blastodermo (f5).

103

sión del embrión en segmentos correspondientes a los segmentos del insecto adulto. Además de tres segmentos, por lo menos, que se retraen más tarde hasta el interior de la cabeza y a los que llamamos Md, Mx y Lb, existen

otros tres segmentos torácicos (denominados TL,T2 y T3) y ocho segmentos abdominales completos (que van del A1 al A8). A1 día siguiente de la fecundación, el embrión sale del huevo y se trans-

forma en una larva que mantiene el patrón segmentario del embrión. La larva muda dos veces, se convierte en pupa y, tras la metamorfosis, emerge la mosca adulta. La mosca adulta está

organizada también en segmentos. Ahora bien, los tejidos de la epidermis adulta no se derivan directamente de

la cubierta exterior de Ia larva, sino

Md Mx Lb

r,r2 rgAl A2 A3 A¿A5A6

que provienen de los discos imaginales, que son pequeñas bolsas de epitelio que hay en el cuerpo de la larva. Mientras transcurre la metamorfosis,

ATAe

las bolsas se evaginan (se doblan hacia fuera) y se convierten en estruc-

turas adultas. Así, a cada lado del cuerpo un disco produce el ojo y la antena; tres discos dan lugar a las patas, que se encuentran unidas a los

tres segmentos torácicos, y un disco origina eI ala y una parte importante del segmento torácico medio, al cual va unido el ala. Los discos imaginales sirven, pues, de bloques de construc-

ción para eI ensamblamiento del cuerpo adulto.

a facilidad con que se deja maniI-.1 pular el genoma de Dr osophilaha

posibilitado reconstruir la genealogía de las células desde las estructuras adultas hasta sus orígenes embrionarios. También ha permitido averiguar cuándo los g-rupos de células quedan abocados a cumplir sus destinos particulares. Se pueden usar dosis de 4. E¡üTRE LAS

ETAPAS TARDIAS del de-

sarrollo embrionario de Drosophila melanogaster se incluyen la división del euerpo en segmentos y movimientos morfogenéticos complejos. Poco después de la formación delblastodermo algunas de sus regiones quedan determinadas o destinadas a forrnar estructuras corporales específicas. Por medio de varios tipos de experimentos se ha podido remontar la genealogía de las estructuras hasta las partes del blastodermo en donde se originaron. El resultado es un "rnapa de destinost'del blastodermo, en el cual los segmentos corporales apare-

cen como bandas consecutivas (f). El embrión se alarga y los segmentos atrdominales se desplazan por la superficie dorsal en la dirección anterior (2). En esta etapa se expresa el gen d.entellad.o (engrailed.) y se subdividen los segmentos. El embrión se estrecha de nuevo, los segmentos abdominales retroceden hacia la parte posterior y los límites segmentarios se hacen visitrles (3). El embrión sale del huevo convirtiéndose en una larva que muda dos veces, pnpa y se transforma en adulto (4). El adulto está segmentado, pero su cubierta externa no se deriva de la larva. Las estructuras adultas proceden de unas bolsas de células, llamadas discos imaginales, que se encuentran en el cuerpo de la larva.

104

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LA NASOBEMIA es una mutación que hace crecer patas en la cabezade Drosophila errvez de las antenas correspondientes. La

mutación transforma los discos imaginales, que originarían las antenas, en el tipo de disco que crea el par meüo de los tres pares de patas de la mosca. Del efecto producido por la mutación

rayos X controladas con precisión para inducir mutaciones ¡- recombinaciones genéticas (intercambios de ADN entre cromosomas) en 1os embriones de Drosophilo. Los efectos de dichas aberraciones genéticas sir\-en de marcadores de cé1u1as o núcleos concretos.

Las unidades marcadas

pueden seguirse hasta Ia mosca adulta para averiguar en qué momento quedaron determinadas. es decir, comprometi-

se dedujo que el objetivo del gen nornal era asegurar que cada disco imaginal forme la estructura adulta correcta. La Nasobemia fue descubierta por el autor en 1965. Pertenece a un gYupo de mutaciones que transforrna una estructura en otra situada en otro segmento; dichas mutaciones se llaman homeóticas.

ción inicial afecta tanto a los precursores de los segmentos embrionarios

y larvarios cuanto a los de los discos imaginales, que formarán estructuras adultas. Experimentos realizados en mi laboratorio al inicio de los años setenta mostraron que, desde la etapa blastodermo precoz, los precursores de los discos imaginales se ven obli-

gados a formar o estructuras adultas anteriores o estructuras adultas pos-

núcleo puede colonizar cualquier

teriores. Los embriones blastodérmicos precoces pueden desgajarse en células individuales, que luego pueden "cultivarse", transplantándolas al interior de la cavidad abdominal de una mosca adulta o de una larva. Las célu-

parte del citoplasma cortical y 1os des-

las tratadas así alcanzan su desarrollo

cendientes de un núcleo preblasto-

de la constitución del biastodermo, el

completo en cultivo y forman estructuras adultas. Cuando se realizó este experimento, las células procedentes de la parte antedor del blastodermo produjeron únicamente estructuras adultas anteriores, mientras que las células de la parte posterior del blastodermo dieron lugar únicamente a estructuras adultas posteriores.

proceso de determinación empieza a ay anzaÍ rápidamente. La determina-

viduales marcándolas genéticamente

das en la producción de una parte con-

del adulto. Usando estos métodos se ha visto que antes de la formación del blastodermo 1os núcleos poseen una flexibilidad total. Un creta de

larva

dérmico pueden encontrarse después en cualquier zona de Ia mosca adulta.

EI clon, o grupo de células descendientes, tiende a mantenerse unido, pero puede formar parte de cualquier

estructura adulta. Sin embargo, poco tiempo después

Co¡rsrnuccróN »¡ uN SEn Vrvcr

analizó el destino de células indi-

en el blastodermo y siguiendo su desa-

rrollo hasta la fase adulta, cuando la progenie de la célula marcada forma un clon. Se vio que los clones respeta-

ban los límites segmentarios:

ni si-

quiera los clones de gran tamaño mar-

cados cruzaban el límite entre un segmento y el adyacente. Este resultado ponía de manifiesto que las células del blastodermo estaban yaforzadas a transformarse en parte de un segmento concreto. Se obtuvo más información destruyendo grupos pequeños de células de blastodermo con un microhaz proveniente de un láser: un haz de radiación ultraüoleta enfocado con mucha precisión. El destino de las células destruidas se puede inferir observando los defectos que aparecen en el adulto. Al representar sobre una imagen del blastodermo los datos proporcionados por el microhaz, se obtiene un "mapa de destinos" del blastodermo, que comelaciona las regiones de éste con las estructuras del cuerpo.

Los segmentos larvarios y adultos

aparecen en el mapa como un patrón ordenado de bandas. Así pues, la arquitectura segmen105

se obtuvieron algunos indicios sobre el mecanismo de determinación, a partir de las observaciones realizadas sobre tres curiosos tipos de mutaciones que alteraban el proceso de desarrollo de Drosophila: mutaciones de efecto materno, mutaciones de segmentación y mutaciones homeóticas. Algunas mutaciones de efecto materno intervienen en la polaridad espacial del embrión. Por ejemplo, en

molecular

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un folículo normal las células nutricias se encuentran solamente cerca

del polo anterior del huevo. En la mutación dicefálica (dicephalic) las células nutricias se encuentran en ambos polos. Dichos folículos bipolares producen embriones que poseen dos conjuntos de estructuras anteriores unidas por eI centro y carecen por completo de estructuras posteriores. datos genéticos cabe inferir monstruos de dos cabezas débense a defectos en el genoma de sus madres. Las hembras de Drosophila homozigóticas para la mutación dicefálica, que tienen dos copias del gen deficiente, producen folículos aberrantes (y de ahí embriones aberrantes), sea cual fuere la contribución genética del padre. Las madres hete-

f-le t-l

FUSHI TARAZU es un gen de segmentación, es decir, un gen cu)'a acción es necesaria para que el embrión d,e Drosophila melanogaster se divida correctamente en segmentos. Un embrión con el gen silvestre de fushi tarazu tíene co-

entero de tres segmentos-normalcefálicos,

mo mínimo el conjunto tres segmentos torácicos y ocho segmentos abdominales completos (ilustración superíor). Durante el desarrollo, los segmentos de cabeza se retraen dentro del cuerpo )- por tanto no son vi. sibles. El borde anterior de cada segmento está señalado por una banda de diminu-

tas proyecciones llamadas dentículas. Las bandas denticulares aparecen en la ilustración en forma de bandas blancas que cruzan las imágenes. Los embriones que han sufrido una mutación en el gen fushi tarozu carecen de algunas partes de los segmentos corporales alternados y las partes restantes están fusionadas (ilustración inferior). Por ejemplo, la parte posterior de A2 se encuentra ausente junto con la parte anterior de A3; la parte ausente de AB incluye la banda denticular. Las restantes partes d,e A2 y A3 se han fusionado para producir un segmento compuesto A2l3. Se trata de una mutación letal, es decir, el embrión resultante presenta la mitad del número normal de segmentos y muere antes de salir del huevo.

tada de Drosophila se encuentra va la estructura adulta. tal como el seestablecida en la fase blastodérmica gundo segmento de una pata. Los desy los grupos de células del blasto- tinos de estas legiones pequeñas se dermo están asignados a un segmento asignan durante una -serie de pasos del cuerpo de Ia larva y del adulto. Sin que. por 1o que parece. no terminan embargo, la asignación de destinos hasta los últimos días de la larr.a. En celulares no se acaba en la fase blas- el momento de la metamorfosis, cada todérmica. En cuanto quedan esta- grupo pequerlo de células determinablecidos los segmentos se asigna cada das en ei disco imaginal se transfor-

una de sus células a 1a mitad anterior ma, bajo 1a influencia de hormonas, en o a 1a posterior, quedando el segmento 1a estructura adulta correspondiente. dividido en dos compartimientos: uno La conclusión general de los expeanterior y otro posterior. Tras la for- rimentos de marcaje genético fue que mación de 1os compartimientos, se 1as cé1ulas de1 embrión deDrosophila determinan las estructuras adultas. iban quedando determinadas en una Primero se distinguen unos de otros serie de grados cada vez más finos que los discos imaginales. Los discos con- no concluía hasta la metamorfosis. tienen muchas regiones pequeñas, ¿Cómo se ejecuta esta serie de etapas? que se corresponden con una parte de Mucho antes de la era de Ia genética 106

1os

q:ue estos

rozigóticas, con un gen deficiente y otro normal, producen únicamente

huevos normales. Este resultado muestra que la polaridad anteropos-

terior

se establece cuando se forma el huevo en el ovario bajo el control del genoma materno. Otros mutantes de efecto materno alteran la polaridad

dorsoventral. Las observaciones de los mutantes de efecto materno inducen a pensar que el citoplasma del huevo contiene sustancias que definen las coordenadas espaciales del futuro embrión. Después de la fecundación, cuando los núcleos se desplazan hasta el córtex de1 huevo, encuentran estas sustancias y quedan determinados a cumplir unos destinos concretos según su posición en el citoplasma cortical. El interés de los mutantes de efecto materno reside en que ponen de manifiesto que algunos de los primeros pasos en el proceso de la determinación ocurren bajo la influencia del genoma materno y no bajo la del genoma del huevo fecundado. Sin embargo, poco se sabe actualmente sobre las sustancias codificadas por los genes maternos que dotan aI citoplasma del

huevo de su polaridad espacial. Hay algunos indicios de que el ARN mensajero materno (ARNm) almacenado en el huevo contribuye a la especificación de la polaridad dorsoventral, pero la mayoría de las demás sustanT¡u,q.s 3

cias citoplásmicas que intervienen en estos procesos siguen siendo desconocidas. En cambio, durante los últimos años se ha adelantado considerablemente en la comprensión del funcionamiento de los genes de segmentación y de los genes homeóticos. De hecho,

estos dos tipos de genes han constituido la puerta de acceso ai nivel molecular de la biología del desarrollo. La mayoría de las mutaciones de

segmentación y de las mutaciones homeóticas se expresan sólo después de la activación del genoma zigótico durante la formación del blastodermo.

Cada mutación de segmentación

interfiere

la probóscide (tubo de alimentación), patas que se transforman en antenas, etcétera. Me he sentido fascinado por las mutaciones homeóticas desde 1965, cuando, trabajando como estudiante graduado en la Universidad de Ztric},, descubrí un mutante que tenía patas en la cabeza en vez de ante-

nas. Buscando un nombre para la mutación, me vino ala mente una creación de Christian Morgenstern, poeta

alemán que describía una criatura fantástica llamada el Nasobemo, que caminaba sobre su nariz. La coincidencia me divirtió y decidí llamar

Nasobemia a la mutación.

de una forma concreta en 1a

división ordenada

de1

embrión en

subunidades repetitivas. Uno de los mutantes de segmentación más notables es /usái tara z u, expresión j aponesa que significa "segmentos insuficientes". En un embriónfLtshi tcLrazu faltan partes de ciertos segmentos y las partes incompletas están fu.qionadas con 1os segmentos adyacentes. Así, la parte anterior de los segmen-

tos Mx, T1, T3. A2. A.1. A6 ¡'A8 se fusiona con la parte postelior de los segmentos que 1es siguen lt'éctse lct figura 61. El resultado es un embrión que tiene siete segmentos en lugar de 14 y muere antes de

salir del huer.o

transformarse en larva. Fushi tarazu es una mutación más entre el gran número de ellas que afectan al patrón segmentario.

Sin embargo, 1os tlastornos más espectaculares del desalrollo de Drosophila son 1os prodr-rcidos por las mutaciones homeóticas. La mutación homeótica conlleva 1a transformación de una parte del cuelpo en otra situada normalmente en un segmento distinto. Los resultados de dichas transformaciones son grotescos y desconcertantes. Alas que crecen en el lugar de 1os ojos. patas en el lugar de

f a clase de mutaciones a que perI-¡l tenece Nasobemia es amplia y diversa. Se le ha dedicado un considerable número de trabajos. Se ha visto que, enDro

sophila,lanayoría

de los

genes homeóticos se distribuyen en

dos grupos. IJno, que constituye el complejo Antennapedlo, comprende los genes que determinan las estructuras adultas de la cabeza y de los segmentos torácicos anteriores. N¿so-

bemia se presenta en el complejo Antennapedia. El otro complejo se llamabithorar e incluye los genes que controlan la determinación de los segmentos torácicos posteriores y los abdominales. Edward B. Lewis, basándo§e en su análisis exhaustivo del complejo bithorax, propuso que cada

segmento posterior del adulto está determinado por la actividad combinada de un único grupo de genes homeóticos. Según el modelo de Lewis, Ia determinación del segundo segmento torácico (el segmento más anterior de los controlados por el complejo bitho-

rar) requiere un número mínimo de genes homeóticos. Los sucesivos segmentos posteriores precisan Ia activación de uno o más genes homeóticos adicionales para conseguir su carácter.

Resultaba tan profunda la altera-

ción que producen las mutaciones homeóticas y las mutaciones de segmentación que obligó a pensar si los genes correspondientes no servirían pata organizar el proceso normal del desarrollo. Dado que una mutación de segmentación entorpece el establecimiento de los segmentos embrionarios, parece razonable que el gen normal regule la construcción correcta de esos segmentos. Puesto que una mutación homeótica produce patas donde deberían crecer antenas, el gen normal tiene que ser responsable de la formación de patas en el lugar adecuado. Ahora bien, cualquier gen capaz de organizar semejantes procesos fundamentales en el desarrollo normal debe funcionar regulando muchos otros

genes. Mediante experimentos de genética bacteriana se había demostrado ya que grupos amplios de genes podían regularse por la acción de un gen singular, que codifica una proteína que se fija aIADN e inhibe o activa la transcripción de los grupos en cuestión. Parecía, pues, que el modelo bacteriano suministraba un modelo plausible del funcionamiento de los genes

rectores del desarrollo. Sin embargo, hasta 1978 dichas ideas pertenecían al dominio de la especulación, porque no existían métodos adecuados para aislar y experimentar con genes de desarrollo en organismos superiores.

En el intervalo de unos cuantos la situación cambió drástica-

años,

7. SE EXPRESA EL FUSHI TLAAZU en pares de segmentos en el embrión precoz. La ilustración muestra la sección fina de un emtrrión a las dos horas y media de su fecundación. Los círculos pálidos, apreciables con mayor nitidez en el lado derecho de la imagen, sonnúcleos que acaban de Ilegar al córtexy no estrintodawía

separados por membranas celulares. Las bandas oscuras son de CoNsrnuccróN o¡. un SEn Vlvo

ARNn del gen fushi tarazulocalizadas por medio de hibridación in situ, (Los granos de plata pueden aparecer oscuros o brillantes en la imagen fotográfica escogiendo el sistema óptico apropiado.) Cada banda abarca dos segmentos embrionarios, como muestra la clave. Esta sección no contiene los segmentos de la cabeza. Si así fuera, se verían siete trandas oscuras, no seis. 107

MO-10 Ser Lys Arg MM3 Arg Lys Arg

RATON RANA

Gly Gly

ANTENNAPEDIA ATg Lys Afg

GIy

Ser Lys Arg Arg Arg Arg

Thr

FUSHI TARAZU ULTRAAITHORAX

Gly

Arg Arg Arg Arg Arg

Thr Ala Gln Thr Gln Thr Gln fhr Gln Thr

Tyr Thr Arg Pro Gln Leu Val Tyr Thr Arg Tyr Gln Thr Leu Tyr Thr Arg Tyr GIn Thr Leu Tyr fhr Arg Tyr GIn Thr Leu lyr Thr Arg Tyr Gln fhr Leu

Glu Glu Glu Glu Glu

Leu Glu Lys Glu Leu clu Lys Glu Leu Glu Lys Glu Leu clu Lys Glu Leu Glu Lys clu

Phe

Asn Leu Leu His Val Leu His Ala Leu Asn Ala Leu Tyr Ala Leu

Asn

Leu

Cys Cys

Leu

Ser

Leu

Cys

Leu

MO-10 MM3

RATON RANA

Tyr Leu Met Arg Pro Arg Arg Val Glu Met Ala Tyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg lle Glu lle Ala Asn Arg fyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg lle Glu lle Ala Asn Arg Tyr lle Thr Arg Arg Arg Arg lle Asp lle Ala Thr Asn His Tyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg lle Glu Met Ala

Phe H¡s Phe ANTENNAPEDIA His Phe FUSHI TARAZU His Phe His

ULTRABITHORAX HiS

MO-l0 MM3

Thr Glu Thr Gtu ANTENNAPEDTA Thr G,u FUSHT TARAZU Ser otu ULTRABTTHORAY Thr Glu

RATON RANA

Asn Arg Asn Arg

Arg Arg Arg Arg Arg

cln cln cln Gln

cln

lle lle lle lle lle

Lys Lys Lys Lys Lys

lle lle lle lle lle

Trp Trp Trp Trp Trp

Phe Pha Phe Phe Phe

Gln Gln Gln Gln

Asn Asn Asn Asn Asn

Arg Arg A¡g Arg Arg

Arg Arg Arg Arg Arg

Met Met Met Met Met

Lys Tyr Lys Lys Lys Trp Lys Lys Lys Trp Lys Lys Lys Ser Lys Lys Lys Leu Lys Lys

Phe PhB Phe Phe

mento de ADN complementario al ARNm de Antennapedia. El clon

hibridaría las secuencias de ADN cromosómico complementarias con Ia

Leu

Asp Gln Glu Asn Glu Asn Asp

Arg

Glu

lle

8. SE LLAMA DOMINIO HOMEOTICO a la secuencia de aminoácidos correspon. diente a la caja homeótica. La caja homeótica es un trozo corto de ADN que se encuentra en más de una docena de genes homeóticos y de genes de segmentación de Drosophila, así como en genes procedentes de una amplia gama de organismos superiores. La ilustración muestra la secuencia de 60 aminoácidos (designados por su código de tres letras) en los dominios homeóticos que resultan de cinco genes. Son el gen MO-LO de ratón, el gera MMB de rana y tres genes de Drosophilo: Antennapedia, fushi tarazu y Ultrabithorar. El gen de Antennapedi¿ se ha utilizado co. mo patrón de comparación. Las discrepancias entre el dominio homeótico de An tennaped.ia y los de otros genes aparecen en f¡lanco. Los cinco dominios homeóticos son bastante similares. Este parecido sugiere que el dominio homeótico cumple la misma función en las cinco proteínas y que Ia presión selectiva ha impedido que las secuencias de aminoácidos varíen mucho de un caso a otro. No se conoce bien el funcionamiento de las proteínas que contienen el dominio homeótico. En efecto, siendo todos los dominios homeóticos ricos en lisina (/ys) y arginina (arg), clos ami. noácidos básicos, éstos podrían permitir al dominio homeótico fijarse en el .{DN. AI unirse a secuencias específicas de ADN, esas proteínas podrían regrrlar la acción de muchos otros genes y ejercer así un control en el desarrollo. La reg:ión por donde la proteína se une al ADN está constituida por una secuencia de nueve aminoá. cidos, idéntica en los cinco dominios homeóticos (.color íntensot,

mente con la aparición de métodos de no de ellos. El gen de Antennapeclia. clonación de genes que permiten su que dio su nombl'e a1 complejo -{naislamiento sin disponer de ninguna tettnapedict. fue aislado por Richard información bioquímica sobre sus pro- Garber r'-{tsushi Kurorn'a. E1 prrmer ductos. Inmediatamente varios gru- paso consistió en reunil un conjunto pos de investigación se dispusieron a de fragmentos de ADN consecuti\-os. purificar 1os genes homeóticos de que se solapaban palcialmente. )- que Drosophilo. David S. Hogness y sus abarcaban 1a región cromosómica a 1a colegas abrieron camino con sus

expe-

que pel'tenec ía Arttenn aped¿

r¡ . E

sto se

rimentos con el complejo bíthorctx, 1levó a cabo pol el método llamado mientras que mi grupo se centró en "paseo a 1o largo del cromosoma". orilos genes del grupo Antennapedia. ginal de Hogness. EI paseo cromosóCuando se logró purificar los genes mico se basa en la índole complehomeóticos, viose que eran sorpren- mentaria de las dos cadenas de la dentemente grandes y complejos.

Así,

el gen Antennd.pedia abarca 100.000 pares de bases de nucleótidos, un número inusitadamente a1to. Además, losgeneshomeóticostienenuna estructura compleja que comprende

hé1ice de ADN. gracias a 10 cual pueden hibridar, o sea, formar una molécula de doble cadena. Si dos trozos de

ADN procedentes de cadenas opuestas de la doble hélice están ligeramente superpuestos, hibridarán en la

muchos exones separados por intro- región de superposición. Al "pasear" nes. Los intrones son secuencias de se empieza con un fragmento de ADN ADNque setranscribenenARN, para corto que se sabe cercano al deseado. desprenderse inmediatamente de lo Mediante Ia hibridación, se identifica transcrito; únicamente resisten Ios otro pedazo de ADN, solapante con el exones, que se empalman y forman ei fragmento conocido en su extremo y ARN maduro. En el procesamiento de prolongándose hacia el gen deseado. 1o transcrit o, de Antennapedía , se Repitiendo el proceso, se puede cubrir pueden desechar hasta 60.000 pares y aislar e1 segmento cromosómico de bases en un solo intrón. completo que incluye al gen. Para llegar a este conocimiento Tras reunir el conjunto de fragmensobre la estructura de los genes homeó- tos de ADN, era necesario conocer la ticos hubo que esperar a aislar algu- Iocalización precisa del gen Anten108

napedict en el segmento cromosómico. Para encontrarlo, aislamos primeramente un clon de ADNc, un frag-

molécula deARNm. Se empleó este clon

a modo de sonda que descubriera Ia secuencia de ADN que codifica el ARNm de Antennctpedla. Para nuestra sorpresa, dicha sonda no hibridaba sólo con las secuencias codifican-

tes de Antennapedlo, sino también con secuencias de un gen vecino. gen que resultó ser fushi tarazu, Io que puso de manifiesto q:ue fushi taraztt y

Antennapedla compartían un corto

fragmento de ADN. (Mattherv P. Scott

ilegó por su cuenta a ia misma conclusión. ) Quisimos comprobar Ia posibilidad de que Ia secuencia común fuera

característica de los genes homeóticos. Para ello examinamos un gen en el complejo bithorax llamado Ultrabithorax. Mi colega William J. McGinnis encontró ese fragmento de ADN en L

ltrabithorox. E1

sorprendente descubrimiento en

mi laboratorio de este segmento mún

co-

ADN, en 1983, instó una búsqueda inmediata por todo el genoma de

de Drosophila. Con esa corta secuencia común por sonda, no tardamos en identificar más de una docena de genes

que contenían secuencias similares. Dado que muchos de los genes recién

aislados correspondían a mutantes homeóticos conocidos, llamamos caja homeótica a Ia secuencia común. Al parecer, todos los genes que incluyen 1a ca.ja homeótica son homeóticos o están implicados en la determinación de la organizactón espacial del embrión. Casi todos ellos se alojan en el complejoAn/ennapedia o en el complejo bithorax. Se sabía que los genes de estos dos complejos estaban implicados en Ia determinación de la organización espacial y ya se habían identificado muchos de ellos. Sin embargo, algunos otros genes que poseen la caja homeótica están en otras partes del genoma, sin que se les haya conseguido identificar por medio de mutaciones. Es de notar que entre los genes que

contienen Ia caja homeótica se encuentran genes de segmentación, corno fus

hi tdrazu, y

gerres

implicados

en Ia división de los segmentos en compartimientos, como d, gen dente-

llado (engrailed'). A pesar de que los efectos físicos de 1os genes de segmentación y de los genes de compartimentación pueden diferir mucho de los producidos por los genes homeóticos, el descubrimiento de la presencia T¡Mes

de la caja homeótica en los tres grupos muestra que comparten un elemento significativo. El descubrimiento de este elemento común refuerza 1a hipótesis de que las tres clases se encuentran entre los genes rectores que dirigen el desarrollo. No se sabe todavía si todos los genes que contienen la caja homeótica derivan de un antecesor común o su parecido estriba únicamente en el exón que contiene Ia caja homeótica. Los próximos traba-

jos deben encaminarse a resolver pronto esta importante cuestión.

Tll la

stablecida la existencia de Ia caja

homeótica en la mosca. nos aprestamos a descubrirla en nuevos geno-

mas. No nos sorprendió encontrar la secuencia común en otras especies de Drosophila y en insectos en los que se

sabía que se producen mutaciones homeóticas, como ios escarabajos. EI examen de Ios gusanos anélidos, antecesores de los insectos, mostró que también poseen la caja homeótica. Sin

tas cajas homeóticas guardan entre sí mayor semejanza que las secuencias

de nucleótidos de las propias cajas homeóticas. (Esto es posible porque un mismo aminoácido puede ser codificado por más de un triplete, que es un grupo de tres nucleótidos.) Por ejemplo,

las cadenas de aminoácidos correspondientes a las cajas homeóticas del genAntennapedia y del gen MMB de Xenopus comparten 59 de sus 60 ami-

noácidos, una homología sorprendente si se considera que los vertebrados e invertebrados se separaron hace más de 500 millones de años. La simiIitud entre las cadenas de aminoácidos implica que todos los dominios homeóticos funcionan aproximadamente del

mismo modo y que ha habido una intensa presión selectiva para evitar la pérdida de su función. ¿Cuál podría ser esa función común? TaI como indicaba antes, una de las primeras hipótesis fue que los genes

rectores operaban dirigiendo la síntesis de proteínas que se unen a1 ADN.

rebajar el interés de este hallazgo,

La caja homeótica es bioquímica-

muchísimo más sorprendente fue descubrir que Ios vertebrados Ia presentan también. En coiaboración con mi colega Edward De Robertis y su grupo, el nuestro consiguió aislar la primera caja homeótica de vertebrado, de la rana Xenopus loeuis. Todos los demás vertebrados estudiados poste-

mente compatible con tal modelo. Muchas proteínas que se unen al ADN poseen regiones ricas en aminoácidos básicos. El dominio homeótico, que forma parte de proteínas mayores, es rico en lisina y arginina, dos aminoá-

cidos básicos. Una primera indicación

de que el dominio homeótico pudiera estar implicado en las uniones con el ADN surgió de una comparación por ordenador con secuencias conocidas de ADN. En la búsqueda se detectó una pequeña homología, pero aun así significativa, entre Ia caja homeótica y trozos de genes en dos especies de levadura, llamados genes MAT. Cada gen MAT codifica una proteína que regula todos los genes necesarios para controlar la diferenciación de las levaduras en uno u otro de los dos tipos de apareamiento existentes o para la

formación de esporas. La proteína reaLiza su función uniéndose a secuencias específicas deADN que se encuentran al comienzo de los genes a

regular (hacia el extremo 5' del ADN). La homología parcial entre la caja homeótica y las secuencias del gen MAT de la levadura sugiere una función similar para el dominio homeótico. Si el dominio homeótico controla la determinación, la expresión de los genes que poseen la caja homeótica se debe regular con precisión en el tiempo y en el espacio durante la embriogénesis. El patrón espacial de la expresión genética se está estudiando en la actualidad mediante la hibridaciónin situ (con ello se quiere decir que

riormente, seres humanos incluidos, manifestaron poseer secuencias homólogas o similares. De acuerdo con un ensayo provisional de revisión, la caja homeótica está presente en todos los grupos de animales segmentados.

Aunque no se ha detectado en la mayorÍa de 1os grupos de animales que carecen de segmentos, sí parece hailarse en los erizos de mar. Los primeros indlcios sobre el modo de acción de la caja homeótica en el piano molecular (a nivel molecular, si

transigimos con el anglicismo) se ob-

tuvieron al comparar las secuencias de ADN de varias cajas homeóticas. Ya se han establecido más de una docena de estas secuencias. Del cotejo de

las mismas se ha visto que Ia homología entre secuencias de cajas homeó-

ticas se circunscribe a una región de 180 pares de bases. La homología fluctúa entre el 60 y el 80 por ciento, según los genes. Todas las cajas homeó-

ticas estudiadas hasta el momento pueden traducirse en cadenas de aminoácidos, lo que sugiere que Ia caja homeótica codifica un dominio, o segmento funcional, de una proteína. A este dominio se le ha llamado dominio homeótico. Las secuencias de aminoácidos correspondientes a las distinCorsr nt ccru\ Dt

Srn Vtvo

9. SE IIA DADO EL NOMBRE DE DEFORM¡OO (DEFORMED) a un gen homeótico que parece especificar la identidad de los segmentos cefálicos posteriores en el embrión de Drosophila. La fotografía muestra una sección de un embrión poco después de la formación del blastodermo; la región anterior cae en la parte superior izquierda y la posterior en la inferior derecha. La banda brillante señala la posición de los transcritos Deformad,o tal cotno se detectan en la hit¡ridación in situ.En el mapa de destinos, la situación de la banda trrillante corresponde a los segmentos cefálicos posteriores. Además, las moscas portadoras de una mutación en el gen Deformad,o tienen defectos en esos segmentos. Parece que el gen Defornad,o de tipo silvestre hace falta para la correcta formación de la región posterior de la cabeza. Muchos datos recientes sugieren que la identidad de los segmentos del cuerpo de la mosca Drosophila está especificada por genes homeóticos. 109

no se trabaja en el tubo de ensayo, sino en los tejidos del organismo). Esta técnica se basa en la hibridación de un trozo de ADN de cadena sencilla de un gen con el correspondiente transcritoARNm. Dado que elARNm se acumula en las regiones del embrión donde se expresa el gen, Ia hibridación puede mostrar eI patrón espacial de la expresión génica. Las sondas se preparan purificando genes que

contienen la caja homeótica y mar-

cándolos radiactivamente. Una gota de solución que contenga la sonda se deposita sobre una sección fina del embrión deDrosophila. Se deja que la sonda hibride con su transcrito y se

cubre la sección con una emulsión fotográfica. Dejada la preparación sensible un tiempo adecuado, se revela la emulsión y entonces las sondas

radiactivas de ADN ligadas a ARNm homólogo aparecen en forma de granos oscuros o claros, según sea el sis-

tema óptico elegido. Ernst Hafen y Michael Levine refrnaron esta técnica en mi laboratorio para posibilitar la detección de transcritos procedentes de genes homeóticos. Algunos de los resultados más inte-

resantes de la hibridación in situ

han obtenido usando fushi tarazu por sonda. Los transcrit os de fushi tctrczu se empiezan a detectar en los núcleos

alineados en el citoplasma cortical, antes de que se formen las membranas celulares. Amedida que los núcleos se van dividiendo, aumenta la transcripción y muy pronto los granos oscu-

ros forman un espectacular diagrama de siete bandas alrededor del blastodermo. El mapa de destinos muestra que esas zonas corresponden precisamente a las siete secciones ausentes en el mutante fushi tcrrczu. Una vez

constituidos los segmentos embrionarios, desaparecen los transcritos.

De estos resultados se deducen dos puntos importantes sobre el funcionamiento defushi tarazu. Al inicio de la embriogénesis, eI gen normal se

. §".

§-1§

10. LOS TRANSCRITOSANTENNAPEDIA se acumulan diferencialmente en los segmentos del embrión, como vemos en esta sección de un embrión en las últimas etapas de su desarrollo. En esas fases postreras de la embriogénesis la segmentación se otrserva con toda nitidez en el sistemanervioso central, que forma un ganglio por cada segmento corpotal- Antenn aped,ia se expresa muy poco en el primer gan' glio torácico. En cambio, lo hace fuertemente en el segundo ganglio torácico y débilmente en los segmentos siguientes. La expresión diferencial puede ser parte del mecanismo por el cual los genes homeóticos confieren identidades específicas a los segmentos del embrión de Drosophila mc' lanogaster.

110

Tsrrms

t debe expresar en secciones alternas

para que se establezca el plan

seg-

mentario; Iuego ya no es necesario. El hecho de que el gen normal de fushi tarazu se exprese espacialmente con precisión antes de que se formen las membranas celulares, implica que los propios núcleos tienen un "sensor" que les permite identificar su posición en el citoplasma cortical. Mi opinión es que el sensor constituye una región de control adyacente al gen fushi tarazu y a otros genes implicados en la elaboración del patrón segmentario. Se investigó sobre esta posibilidad creando un gen artificial que incluía la región de control del gen fushi tarazu y el gen bacteriano de 1a enzima beta-galactosidasa. La expresión del gen sintético queda controlada por 1a secuencia de fushi tarazu, pero la proteína producida por el gen es 1a bacteriana. Se inserta el gen artificial en un embrión de Drosophila. La expresión del gen de beta-galactosidasa se detecta por reacción química que ercita un colorante. Cuando se realiza el experimento se encuentra ia beta-galacto-

sidasa distribuida según un diaglama de siete franjas que coincide cabaimente con el patrón de 1os transclitos defushi tarazu. Queda claro que después de la entrada del núcieo en e1 citoplasma cortical. una sustancia rnteractúa con la región de control de fushi tarazu y activa o bioquea e1 gen según la posición del núcleo en el córtex. A su vez, e1 producto proteínico de fushí tarazu puede ir a regular un grupo de otros genes de una manera coordinada con precisión. Fushi tarazu es uno más entre los genes cuya expresión se ha investigado por hibridación in situ . Otros experimentos han avudado a esclarecer cómo se completa el plan segmentario. Se sabe que eI gen clentellado tengrailed) es necesario en el compartimiento posterior de cada segmento. La

hibridación in situ indica que, poco después de c4ue fushi tardzu se expre-

se,los transcritos de engrailed se dis-

tribuyen según un patrón de 14 franjas estrechas, correspondientes ai compartimiento posterior de los segmentos. Por lo que se manifiesta, el embrión se divide primeramente en segmentos que iuego se subdividen en

compartimientos. El mejor lugar para seguir Ia acción de los genes homeóticos es el sistema nervioso ventral, que en posteriores fases del desarroIlo embrionario forma un ganglio por cada segmento corporal. Empleando

la caja homeótica como sonda, se ha clonado una serie de genes homeótiCousrnuccróu »¡ u¡ Spn Vrvo

cos cuyos transcritos se acumulan en ganglios ventrales consecutivos. Cada gen se expresa con más fuerza en un segmento concreto y con menos fuerza

COLAITORADORES DE, ESTE NUNIE,RO Traduccirin: Sartiago Tores: (;(tk s intcl¡gt,ilte.\. Ltrut herail tio tlistiiltd. lil¡pro\Íu púrant¿!l tle los gent,sG I it r tli t t g o I í¡t i tl o s,- S t !.tti Í u c i ó n cl i r i g íd t L tl e ,gerres: Rafael Alvarado: Lo lectnlcu:irirt t,rt los t t tu tt (t, ror. Esteban Santiaso: Lo ¡ hi ytttttts, ¡¡roteí¡tu.¡ ru gul rulorus dt,,gt,nt,s. Curbt¡ltitlrtÍcts ail el rcco¡tt¡t:itni¿,t¡to celttlur'..1. l\'1. Carcía de la Mota. l.tt t if tnti¡to .4 \' \u ehort.,: N.,1.' \¡crónica Etcltart: G¿¡c.r ¡.¡r¡t ho¡¡tet¡bo.r r el ¡tltut torporttl rlt' lt¡s tertel¡rLttlt¡¡: Rosa Nlarii.\suilar v Juan \'lorlolell \lainou: Bust utt¡l¿r ulor rlt,l tt c st rntl I tr. F,r¡rcslo SÍnchez-Hcrreio: ,\rtTtif et to s nt ol t,r tt l u r¿' ¡ rl<,1 rl i s e ño t o rpr trul'. Joandonrinec Ros: C¿rser'/l¿ de lnnttol¡¡t¡.

en todos los segmentos posteriores a ése. Eso concuerda con la hipótesis de Lewis, según Ia cua11a actividad de una combinación específica de genes homeóticos determina 1a identidad de los

distintos segmentos.

\ /f IVI

uchos laboratorios siguen inves-

tigando para consoliclary exten-

der los conocimientos obtenidos con la identificación de Ia caja homeótica. Si

el dominio homeótico se fija al ADN,

Página

Fuente

Tomo Narashima Michael Goodman Michael Xevine, Mantued Frasch (a¿djo,

será importante saber dónde x- cómo. Además. aunque 1os genes poseedores de cajas homeóticas regulen la actividad de muchos otros genes. e1los

Charles R. Kissinge¡ y Cel O. Pabo (i.quieftla). Nikola P. Pavletich y Cill O.

mismos deberán ser regulados a su vez. Desentrariar 1a regulación de los reguladores constituirá otro paso importante. que podrá además conducir a identificar 1os factores citoplasmáticos de1 huer.o que proporcionan Ia información posicionai. Todo este trabajo febril marca la frontera entre dos eras. En ia era premolecular se avanzó mucho en el conocimiento del momento en que se asignan 1os destinos a 1as células embrionarias. En 1a era molecular, se averiguará cómo ocurre

ello. Los mecanismos moleculares subyacentes a dicho desarrollo pueden resultar mucho más universales de 1o que se había sospechado.

Michael Goodman Gmeme Mardon (ar¡i¿d). William J. McGilnis (cerlro), Mrio R. Capecchi (abajo)

Pabo (.derecha)

Michael Goodman Robert T. N. -ljian (aü¡ba). Douglas A. Melton (d,b¿jo) Paul M. Wassa¡man Neil O. Hardy Paul M. Wassarman (i¿da.), Neil O. Hardy

t4 17 18

Neil O. Htrdy David M. Phillips Paul M. Wassa¡man Shirley M. Taylor, Lesley A. Michalowsky y Pere, A. lone.. t niver.idatl de Calilornia

22 25 16-.l

35 36 -10 l3 1.1-.+7 .i8 lg --i(l -51

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Psptto¡ Rpcror¡ Hotvlolo-

DnOSopHttt HOl,t¡OrtC Gl.x¡s. Anclrés E. Can¿rsco. William McGinnis. Walter J. Gehring y Eddl'M. De Robertis en C¿11, r'o1. 37. n." 2. pírgs..l09-,ll,t: GOUS TO

junio.

A Hortolocr¡rrs PnorgtN-Co»rNc S¡eLrE\cE tN l)nosopltt-,r HouEolc GENES AND Irs Coxs¡nvrlroN lx Oru¡n METAZo-{NS. William McCinnis. Richarcl L. Garber. Johannes Wirz. Atsushi Kuroiria l, W¿rlter J. Gehring en Cell. vol. 37. n.o 2. pírgs. .103-.108:.j unio. 198,1. FLI ,rxn FRoc Horroso Doprexs Suou' HoMoLoC;rr-s u,ttu Y¡;rs r N,[.rrrxc Type R¡cuL-rronv PRorErNs. John C. W. Shepherd. William N4cginnis. Andrés E. Carrasco. Eddy M. l)e Robertis y Walter J. Gehring en Nuture. vol. 310. r.r." -5972. págs.70-71: -5 dejulio de 1984.

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1984.

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E2-E7

93 95 96 91 9E

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C \lürquirr)J Vi\c¡Ntrñe

Sellés

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SetLés

Tinr,lh\ J Rirhm¡|d. Bibluecr del In\t Feder¡L dc TecnologÍ! dc Suizr. Zurich

lrn \\'orpole: Barb¡rr A. Hrmkalo. Uni\.

lan Worpole Jovita Mezquita y Magda Milia Tomo Narashima Jiled Schneidman/JSD Co¡tesía de Kazuhiko Fujita, Esc. Univ. de Medicina en Juntendo. Tokyo Kathleen Katims/JSD Cortesía de Steven Rosen. Univ. de Califomia. San Francisco Kathleen Kayims/JSD (arriba), coúesía de Kazuhiko Fujita, Esc. Univ. de Medicina en Juntendo, Tokio (dáajo) Photo Resetrchers, Inc. S¡even B. Levery, Cenüo Fred Hutchinson, Ronald E. Stenkamp y Keith D. Wa¡enpaugh, Washington Hank lken, Walken Graphics Steven B. Levery, Centro Fred Hutchinson ptua la investigación del cáncer, Ronald E. Stenkamp y Keith D- Watenpaugh, Washington Yasuo Fukushi, Univ. de Tohoku. Japón HaDk Iken. Walken Graphics Patricia J. Wynne Edward Bell Patricia J. Wynne G. Oliyet (.i.qu¡enla). A. Molven, Univ. de Oreeón (derecha)

I13

Walter J. Gehring Tom Prentiss Walter J. Gehring Tomo Narashima

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William Mccinnis (arriba\. Tomo

15 I l6 1 ll ll8 l2l I l2 I 15 I 16

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C¿lifornia. Iruine Ian Worpole Stephen J. Kron y Gerald R. Fink, Whirehead Institud (ar¡ibd)i lan Womoie

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TomoNxr!\hima Tono Nu¡shiilra .lered Schncidrrrn Design

NIilio R Crpe..hi (drrió¿). Tomo \ilreshimr (¿rr¡l01

il1

Arquitectos moleculares del diseño corporal William McGinnis y Michael Kuziora

La introducción de un gen humano en una mosca nos evoca escenas cinematográficas de un relato fantéstico.

Mds importante: sirve para demostrar que las formas corporales de todo los animales se definen por mecanismos casi ídénticos

los animales se desarrollan tTFlodos t I u partir de un huevo fecundaI doque, tras experimentarmúl-

tiples tandas de división, origina, por lo común, millones de células embrionarias. Mediante un sorprendente proceso de autoorgani zación, em'uelto

todavía en el misterio, estas células se disponen formando un organismo completo en el que hueso, músculo, cerebro y piel se integran en un conjunto armónico. El proceso fundamental es constante, no así los resultados: seres humanos, ratones, moscas y gusanos representan un amplio muestrario de diseños corporales. Ante semejante diversidad, los bió-

logos suponían que los arquitectos moleculares de la morfología corporal genéticos que controlan el -procesos desarrollo embrionario en las diferentes especies- serían también muy variopintos. Pero hay pruebas convincentes de que un grupo de genes relacionados entre sí, los llamados ge-

HOM en invertebrados y genes Hox en vertebrados, dirige aspectos nes

similares del diseño corporal en todos los embriones animales. Al menos en Io concerniente a algunos sistemas moleculares que moldean nuestra forma, los seres humanos nos parecemos, seguramente,

ltil-l.tÁli :llcili§§1S l rüli lii3llL 1i]-:

iJlílí{i\ investigan

el papel ejercido

mucho más de lo que nos gustaría a gusanos e insectos, nuestros parientes lejanos. Tanto, que en los laboratorios se han empleado genes 1{or de ratón y humano para guiar el desarrollo de embriones de la mosca del vinagre. El relato histórico sobre estos ar-

quitectos moleculares universales se remonta a 1os estudios genéticos que iniciara Edward B. Lewis. quien ha pasado gran parte de ios últimos 40 años estudiando el complejo ólráo-

ror, un pequeño grupo de genes homeóticos de Drosophilo, melanogoster. la mosca del vinagre. EI término griego Homeo significa "semejante": por 1o mismo, se denominan homeóticos aquellos genes de la mosca que, tras sufrir mutación, adquieren capacldad de transformar un segmento de su cuerpo en la réplica de otro. Las mutaciones en los genes del complejo ólthorax suelen producir este tipo de defectos en el desarrollo de 1a parte

posterior del plano corporal de Ia mosca. El equipo de Thomas C. Kaufman ha descubierto un segundo grupo de genes homeóticos de 1a mosca, el complejo Antennapedlo (que debe su nombre al gen fundador de1 complejo, Antennapedis). Las mutaciones en estos genes producen defectos homeóticos en la parte anterior dei cuerpo. Ocurre a menudo en biología que ciertos defectos raros observados en

animales extraños encierran 1a clave para resolver problemas importantes.

en el desarrollo por ia superfamilia de genes con secuencia homeótica. McGin-

Pocos fenómenos producen mayor ex-

nis enseña biofísica en Yale. Inves-

seño corporal causadas por las mutaciones homeóticas; a modo de botón de muestra: algunas mutaciones del gen

tigando en la Universidad de Basilea descubrió con Michael Levine Ia secuencia homeótica en genes de Drosophila. Kuziora es profesor en Pittsburgh.

1t2

traieza que las alteraciones del di-

Antennapedio determinan que 1as antenas de 1a cabeza de la mosca del vinagre se transformen en un par

supernumerario de patas torácicas.

Para mayor admiración, algunos individuos que desarrollan las patas supernumerarias sobreviven, se alimentan e incluso se aparean con moscas normales. LosAntennapedia qteTTegan a adultos constituyen una rareza, puesto que casi todas las mutaciones inducidas en genes homeóticos producen defec-

tos embrionarios letales en Droso-

phila. Pero también estos embriones que mueren pueden enseñarnos mucho. A este respecto, Ernesto Sánchez-

Herrero y Ginés Morata descubrieron que la eliminación de los tres genes

del complejo bithorax -Ultrabithorax, obdominal-A y Abdominal-Bresultaba letal. Sin embargo, estos embriones mutantes viven lo bastante para desarrollar estructuras especializadas que ponen de manifiesto 1a

transformación

de los ocho segmentos

abdominales en segmentos torácicos.

T\e sus estudios senéticos iniciales Lrl sobre el compl"ejo bithorax Lewts extrajo dos importantes conclusiones. La primera, que la función normal de estos genes homeóticos estriba en con-

ferir a las células identidades

espa-

ciales (o posicionales) inequívocas en diferentes regiones a 1o largo del eje anteroposterior de la mosca. Esto es, Ios genes les "dicen" a las célu1as si forman parte de la cabeza, el tórax o el abdomen de la mosca. Estas identidades son hasta cierto punto abstractas, por cuanto 1as coordenadas espaciales asignadas por 1os genes homeóticos se interpretan de diversa forma en distintos estadios de

desarrollo. Antennapedl¿¿ confiere identidad torácica 1o mismo durante el período embrionario que durante

TEr,rAS 3

1. EMBRIONES de vertebrados (peces, salamandras, pájaros, corderos y humanos) y su estrecho parecido mutuo en etapas precoces de su desarrollo. La mosca del vinagre Drosophila, y otros invertebrados siguen un desarrollo muy diferente, pero en los primeros estadios comparten con los vertebrados un patrón de expresión común de los genes con secuencia homeótica. Tal descubrimiento revela que, pese a las diferencias en el aspecto frnal de los animales, éstos usan genes estrechamente emparentados para especificar partes del cuerpo a lo largo del eje anteroposterior (o catreza-cola).

---__- proboscipedia ¿_--

AntennaPed¡a

Abdominal_B

í'

I I I I

i .

DROSOPHILA

CoNsrnuccróx

DE uN SER

SALAMANDRA

Vrvo

CORDERO

HO[/BHE

113

ejemplo, si se elimina de las células de la región anterior del abdomen la

función del gen Ultrabithorax, Antennapedia se encargará del desarrode esa región. Por consiguiente, estructuras asociadas sólo con el tórax (región ql;e Antennapedia contrTbaye a especifrcar) aparecen también en posiciones más rezagadas.

llo

Las mutaciones que expresan un gen homeótico en una posición incorrecta provocan también transformaciones homeóticas. Así, se originan las mutaciones A ntennapedia en las moscas adultas cuando se activa el gen

Antennapedia en la cabeza, l.ogar

donde suele hallarse inactivo. En resumen, las pruebas genéticas indican que son necesarios todos los genes del complej o flOM para especifrcar el destino de las células situadas en cierta posición del eje anteroposterior durante el desarrollo: cabezaposterior, tórax, etcétera. Más importante (y más revelador de su función biológica) resulta el hecho de que la actividad de cada gen del complejo -ÉlOM es sufrciente, según parece, para determinar el destino de

algunas células por lo menos, aun cuando éstas no se encuentren bajo la influencia normal de un gen dado. IVOSCA IVIUTANTE Antennapedta

MOSCA NOBMAL

TRANSFOBMACIONES HOMEOTICAS se producen en moscas del vinagre que han sufrido mutaciones en genes homeóticos. A modo de ejemplo, las mutaciones del gen Antennaped,ia pueden hacer que aparezca;n cinturones de dentículos torácicos (espínulas) en las cabezas de las lawas (arriba, a la derecha). Otra consecuencia de la mutación es que, a las moscas mutantes, les salen patas donde debía haber antenas (abajo, a la, d,erecha), A la izquierda se muestran una larva y un adulto normales. 2.

La segunda conclusión importante

la mosca del vinagre. Los genes HOM están en eI ADN de todas las céIulas de la mosca, pero sólo se expresan en algunas. Cuando se activan, estos genes se copian en moléculas de ARN mensajero, que sirven de molde para

a la que llegó Lewis fue que el orden

la síntesis de proteínas HOM. Antes

pupal del ciclo vital de la mosca, aunque las estructuras (órganos sensoriales, patas, alas, etcétera) que se desa-

rrollan en el tórax difieren en larvas y adultos.

lineal que presentan los genes del

de que las

complejo bithorax en el u:omosoma de Ia mosca se comesponde exactamente con el orden de las regiones corpora-

les que dichos genes especifican a lo

tren signo alguno de su destino final, los genes del complejo HOM se activan en bandas celulares sucesivas a 1o largo del eje anteroposterior. Al-

largo del eje anteroposterior del

gunas de estas bandas de activación

embrión. La misma relación se mantiene en el caso de los genes del complejo Antennapedia. Unidos por estas características comunes, los genes de los complejos bithorax y Antennapedia recTben la denotación de complejo HOM. La observación de los lugares del

embrión donde se muestran activos los genes del complejollOMnos puede

llevar a comprender, siquiera

parte, cómo determinan éstos las posiciones axiales en el plan corporal de

tt4

regiones del embrión mues-

se solapan, pero cada gen del

complejo

HOM tiene rtn límite de activación anterior propio en el plan corporal. Si la deleción del gen o algún incidente similar impide la expresión de una proteína HOM, las células embrionarias, que abundan en esa proteína, experimentan a menudo una transformación homeótica, transformación debida a un gen homeótico de reserva ya activo en las mismas céluIas y que puede reemplazarle con su

propia información posicional. Por

os genes del complejo HOM son rrirtualmente los únicos de Drosophila que gozan de esas propieda-

L¿

des. También comparten una intere-

sante semejanza estructural, al ser todos ellos miembros de la familia génica con secuencia homeótica. Esta caja homeótica, como también se la llama, es una secuencia de ADN que contiene las instrucciones para la sín-

tesis de un grupo emparentado de homeodominios, regiones proteicas de un tamaño de 60 aminoácidos. El prefijo homeo- proviene de su descubri-

miento inicial en las proteínas HOM d.eDrosophilo. Desde entonces se han encontrado homeodominios con varios grados de similitud en otras muchas proteínas. Los correspondientes a las proteínas HOM d.e Drosophila revelart una estrecha semejanza mutua, indicio de parentesco. De ahí les viene Ia denominación de homeodominios de la clase Antennapedia. ¿Qué función bioquímica desempeñan estas proteínas HOM? No podemos dar todavía una respuesta satisfactoria. Pertenecen a un grupo de proteínas que se unen al ADN en las zonas reguladoras de los genes. La combinación apropiada de estas proteínas enlazadas en un elemento regulador del ADN señalará la activación o la represión de un gen, es decir, el comienzo o la interrupción de Teues

Ia síntesis de la proteína determinada por ese gen. Se ha demostrado que la región del homeodominio de las proteínas HOM constituye Ia fracción que

interacciona directamente con Ios sitios de union al ADN.

Llama poderosamente la atención el contraste ofrecido entre la semejanza estructural de las proteínas

El primer desafío que se nos planteaba era crear genes que codificaran las proteínas homeóticas quiméricas que deseábamos. Esto fue factible g:racias a las técnicas de ADN recombinante de corte y empalme de pequeños segmentos del ADN génico. Si la ingeniería genética se ej ecuta debidamen-

cimiento a 37 "C durante un breve período. (Drosophila vive a 25oC, pero puede tolerar 37oC durante una o dos

te, Ios dominios pueden trasladarse

sómicas normales y en su entorno prueba riembrionario natural -una gurosa que remeda de cerca las condiciones habituales en las que operan

HOM y sus efectos, diversos y especí-

con suma precisión de una proteína a

ficos. Se trata de una familia de pro-

otra conservando sus características funcionales. Teníamos luego que ase-

teínas que se unen, todas, al ADN y

derivan, presumiblemente, de un mismo polipéptido ancestral de la clase Antennapedl¿¿. Pero cumplen misiones dispares en el desarrollo: una proteína determina que unas células se

conviertan en parte de }a cabeza, otra que lo hagan en parte del tórax, etc. Parece probable que 1as proteínas

HOM designen diversa. posiciones

Io largo del eje anteroposterior regu-

lando Ia expresión de

1o que quizá

sean grandes grupos de genes subor-

dinados (genes diana). La especificidad funcional de las proteÍnas HOM puede residir, por tanto, en las diferencias entre ellas que las permiten regular, de modo selectivo. ciertos genes en ios embriones.

Con el

fin de conocer mejor

esta

especifrcidad, en 1986 decidimos cons-

horas sin sufrir efectos dañinos.) Pudimos ensayar la capacidad de las proteínas quiméricas para actuar sobre los elementos reguladores de los genes diana en sus posiciones cromo-

gurarnos de que los genes quiméricos fueran activos en todos los tejidos embrionarios. Para ello recurrimos a

estas proteínas.

Puesto que las proteínas HOM tienen homeodominios muy similares, se unen a sitios de ADN casi idénticos en los ensayos de laboratorio. Al princi-

un método desarrollado años atrás por Gary Struhl que requería la unión del

gen a secuencias de ADN regulador que pueden activarse por choque térmico moderado. Por último, insertamos nuestras quimeras del gen HOM inducibles por calor en los cromosomas de Drosophila mediante la técnica de transformación por elementos P.

L.l

pio parecía probable que las características que dotaban de especifrcidad funcional a cada proteína se encontralas sen fuera del homeodominio idiosinregiones de la proteína más -en crásicas. Sin embargo esa suposición resultó ser errónea. Observamos que, si sustituíamos el homeodominio nativo de una proteína

rosophila asítransformadas portarÍan en adelante

as moscas de D

Deformed por un homeodominio Ultra-

los genes quiméricos en todas las célu-

bithorax, la proteína quimérica perdía

las de su cuerpo; y ellos producirían

su capacidad para regular la expre-

las proteínas quiméricas en cualquier momento del desarrollo con sólo subir la temperatura de la cámara de cre-

sión del gerl Defornl.ed en el embrión. En cambio, la nueva proteína actuaba sobre Ia expresión del gen Antenna-

truir proteínas HOM quiméricas. formadas por elementos procedentes de distintas fuentes. ' La quimela era un

EMBRION DE DROSOPHILA

monstruo de la mitología griega que

TORAX

CABEZA

ABDOI\,4EN

tenía cabeza de león. r-ientre de cabra y cola de dragón.) Pensamos que, ensayando Ia función de estas proteínas quiméricas, podrÍamos definir qué

subregiones de las proteínas HOM determinan sus propiedades reguladoras seiectivas. Para nuestros plimeros experimentos escogimos Ias proteínas HOM Deformed, Ultrabithorax ¡. Abdominal-B, que tienen homeodominios estructu-

ralmente similares: e} de Ia proteína Deformed es idéntico al de la proteÍna

lab

Ultrabithorax en 44 de sus 66 aminoácidos;no comparten, sin embargo, un parecido generalizado en otras regio-

nes. Cada una de estas proteínas influye también en otros genes de Ia familia HOM. Así,la proteÍna Deformed activa selectivamente la expre-

dominal-B regula su propio gen y los de otras proteínas en el complejo HOM, entre ellosA¿ tennctpedia, Ultrabitho rax y abdominal-4. Cabia, pues, aprovechar esas relaciones de autorregu-

lación y regulación cruzada para comprobar las funciones específicas de las proteínas HOM quiméricas. CoNsrnuccróN oe ux Sen Vrvo

WWWffi

abd-A

Abd-B

GENES HOM ÚE DROSOPHILA

-ffi7r=-1 83

ZWffiA-I----1

WffiWW

GENES HOxB DE RATON

sión de su propio gen; la proteína UI-

trabithorax reprime la expresión del gen Antennapedia; y la proteína Ab-

wÉffi-

GENES

l---1 w Ho.roq

ffi

DE RATON

D3 D4 lHiA ffi

r---]

GENES HOXD DE HOMBRE 3. COMPLEJOS GEMCOS con secuencia homeótica, identificados en invertebrados y vertebrados . Drosophila tiene genes -ÉIOM, cuyo orden en el cromosoma de la mosca es el mismo que las regiones del cuerpo cuyo desarrollo controlan en el eje anteroposterior. Ratones y seres humanos portan genes -É[or, emparentados con los miemtrros del conplejo HOM y muestran idéntica disposición espacial y funcional.

115

COOH

PROTEINA CON SECUENCIA HOMEOTICA

SECUENCIA CONSENSO

RKBGRTTYT Labial

BYOT

LELEKEFHF

FYLTBBFR

IEIA

HALC

LT EFOI KIW FONRF

¡"1KW K K

4. LIAMANSE HOMEODOMINIOS ciertas regiones muy similares de 60 aminoácidos, presentes en las proteínas codificadas por todos los genes con secuencia homeótica. Cada letra de la se-

cuencia consenso representa un aminoácido; se muestran desviaciones de esta secuencia para varias proteínas HOM y ñIor estrechamente emparentadas.

nalidad de estas proteínas más res-

HoxBl

trictivo que el aplicado por nosotros.

Deformed

Pese a 1o cual, sus resultados corroboraron la idea de que buena parte de Ia especificidad funcional de las proteínas HOM (aunque no toda) reside en 1as pequeñas diferencias existentes dentro del homeodominio o en regiones adyacentes.

HoxB4

HoxBT Abdominal-B

flodos estos descubrimientos nos I sugerÍan que habÍa una posibili-

HoxB9

dad reai de que ciertos experimentos que ya estaban en marcha en nuestro Iaboratorio, un tanto osados y para 1os que sólo teníamos ligeras esperanzas

pedia como lo haría -prácticamente una proteÍla Ultrabithorax normal. Al transferir el homeodominio Ultrabithorax a Ia proteína Deformed habíamos transferido también, veíase, sus

capacidades reguladoras selectivas. Otro experimento de intercambio de

homeodominios dio resultados similares. Una proteína Deformed con un homeodominio Abdominal-B en lugar del suyo propio imitaba la especifici-

dad reguladora de una proteína Abdominal-B. Las proteínas quiméricas no se com-

portaban exactamente como las proteínas de las que derivaban sus homeodominios. Lo mismo la proteína

quimérica Deformed/Ultrabithorax que la DeformeüAbdominal-B activa-

ban la expresión de sus genes diana, mientras que las proteínas llltrabithorax y Abdominal-B normales la reprimían. Cabe suponer que regiones de

la proteína Deformed situadas fuera del homeodominio proporcionan una fuerte función activadora que estaba capacitada para actuar con cualquiera de estos homeodominios HON{. En coherencia con esa idea, la proteína Deformed presenta alguna: regione: ricas en am'inoácidos que caracterizan los "dominios de activación" de otras

proteínas reguladoras génicas. Richard Mann, David S. Hogness. Greg Gibson y Walter J. Gehring han llevado a cabo experimentos simllares sobre la especificidad funcronal de las proteínas HOM. Los ensa)¡os se basaron en la evaluación de las transformaciones homeóticas que las proteínas HOM mutantes ¡,'1as quiméricas inducían en el desarrollo de 1as moscas. Abordaron 1os efectos de las proteínas HOM en el desarrollo, y'no só1o sus efectos sobre la expresión génica; por el1o. usaron un criterio de funcio-

5. EXPRESION del gen Defortned en embriones de mosca, re-

velada por la tinción marrón; suele estar restringida a una banda de células que se conwierten en estructuras cef¿ilicas posteriores (o la izquierd.a). Los embriones con genes Defor-

tt6

de éxito, proporcionaran resultados interesantes. Se trataba de ensayos funcionales, en embriones de Drosophila, de proteínas con homeodominios de ratón y humanos. Antes de seguir. conviene conocer qué se sabe acerca de los genesf{or de mamíferos. -\ lo largo de los últimos nueve años se han encontrado genes que contienen secuencias homeóticas de la clase

Antennapedlo en los cromosomas de muchas especies animales, además de

Drosophila. Esos genes se han estudiado en ranas, ratones y seres humanos, donde se denominan genes .F1or ( abreviatura de secuencia homeótica, "homeobox", en inglés). En el ratón y en ei hombre los genes Ilox se agrupan en cuatro grandes complejos locaiizados en diferentes cromosomas. En cuanto a su organización y sus patrones de expresión embrionaria, los genes de los compiejosllor comparten un

m¿d. transferidos mediante ingeniería producirán la proteína Deformed en todas las células del organismo tras una breve exposición al calor (derecha). Las anomalías del desarrollo permiten inferir la función del gen HOM.

T¡lr,tes 3

asombroso parecido con los genes del complejo IIOM de la mosca. Por ejemplo, se pueden identificar genes Ilor

PROTEINA OUIMERICA Deformed/Ultrabithorax

cuya estructura se acerca a la de los genes H O M labial, probo scipedia, D efor -

med, Antennapedia y Abdominal-B. Los geneslloxy HOM equivalentes se

disponen en el mismo orden lineal, dentro de sus complejos respectivos.

Un ulterior paralelismo observaron, por un lado, Denis Duboule y Pascal DolIé y, por otro, el equipo de Robb Krumlauf. Recabaron pruebas concluyentes de que los patrones de expresión de los dos tipos de genes eran similares. Es decir, Ios genes Hox se activan a lo largo del eje cabeza-cola enlas etapas iniciales del desarrollo embrionario del ratón en el mismo orden relativo que se activan los genes HOM en el eje anteroposterior de Drosophila. Las semej anzas estructurales entre

las proteínas de mosca y de ratón se limitan principalmente a las regiones de1 homeodominio. La secuencia de aminoácidos del homeodominio de la

proteinaAntennapedia de la mosca y ratón son casi idénticas (difieren sólo en cuatro posiciones de 61); significa ello que estas dos proteínas se parecen entre sí más de lo qre Antennapedia

se parece a cualquier otra proteína HOM de la mosca. Desde un punto de vista evolutivo, esta información sugiere que HoxB6 y Antennapedia son es, deshomólogos estructurales -esto común cienden de un gen ancestral diferente del que dio lugar, pongamos por caso, aAbdominal-B o Deformed. Siguiendo el mismo razonamiento, la similitud entre el complejo HOM y los complejos -Flor indica que el antepasado común más reciente de Drosophila, el ratón y los seres humanos criatura con aspecto de gusano

-una que üvió,

más o menos, hace unos 700

millones de años- tenía un protocomplejo de genes con secuencia homeó-

tica de laclaseAntennapedia. El tipo y la disposición exactos de los genes en ese complejo siguen siendo un misterio. Sin embargo, guiándonos por los complejos HOM y Hox actuales podemos estar seguros de que ese protocom-

plejo primitivo contenía homólogos estructurales de labial, proboscipedia, Deformed, Antenruapedia y Ab do minal-B . Esta visión general de Ia evo-

GEN Antennapedia

GEN Deformed

I o"r,uo

],=,",,.

I¡OTEINA

Deformed

PROTEINA Ultrabithorax

6. LAS DIANAS GENETICAS de las proteínas con homeodominio están determina-

das en buena medida por las regiones del homeodominio de dichas proteínas. Por ejemplo, una proteína quimérica Deformed que lleva un homeodominio Ultrabithorax actúa sobre los mismos genes que lo hace Ultrabithorax. Sin embargo, el se asemeja más al de Deformed deefecto regulador de la quimera -activaciónsituadas fuera del homeodominio. bido a las regiones de la proteína

que el gusano primitivo Caenorhabditis elegans también tiene un complejo HOM, aunque remota, claramente emparentado con los complejos HOM de Drosophila y Hox de vertebrados.

la secuencia de aminoácidos del homeo-

dominio de la proteína HoxB6 del

o"r,uo

lTlodo este respaldo estructural,

I arnque sugerente, no nos permite aún afirmar de manera tajante que las proteínas HOM y Hox cumplen la misma función durante el desarrollo de los embriones. No se olvide que los

complejos génicos de la mosca y el ratón han estado en diferentes linajes evolutivos durante cientos de millones de años, con tiempo de sobra para desarrollar capacidades nuevas o divergentes. Por tanto, las semejanzas de estructura y expresión podrían ser caprichos históricos y no indicadores fieles del parecido funcional entre las proteínas HOM y Hox actuales. {Jna manera de abordar eI problema es explorar los efectos biológicos de los genesflor en embriones devertebrados y compararlos con lo que se conoce acerca de los efectos de los genes HOM en invertebrados. Por ejemplo, ¿causa

transformaciones homeóticas la activación ectópica o la inhibición específrca de la función de un gen Hox ütrante el desarrollo del ratón? En busca de una respuesta, el equipo de Peter Gruss creó cepas de ratones cuyos embriones producen proteína HoxAT en la cabeza y en la región cervical anterior. La proteína HoxAT (que es simi-

y, en algún caso, presentan transformaciones homeóticas de las vértebras cervicales.

El experimento inverso, muy delicado, consiste en bloquear la función de un gen flo*. Osamu Chisaka y Mario R. Capecchi 1o han acometido para

HoxAS, y Thomas Lufkin y Pierre

Chambon para HoxAl. Han demostrado que algunas estructuras de las regiones anteriores del embrión de ratón dependen de esos genes. La mutación del genHoxAS origina ratones, que mueren al poco de nacer con un complejo conjunto de deformidades en cabeza y cuello (estructuras óseas anómalas en el oído interno y cara y ausencia de timo). Tales deformidades recuerdan el síndrome de DiGeorge, una enfermedad congénita humana, lo que abre la esperanza de que el estudio de los genes HOM y Hox nos lleve a entender defectos hereditarios del hombre. Habrá que avanzar mucho más antes de desentrañar la participación de los genes flor en eI diseño del desarrollo de ratones y humanos. Pero los experimentos mencionados, y otros que se

están incoando, confirman que los genes H ox y HOM desempeñan misiones similares. En nuestro laboratorio nos propu-

simos abordar una comparación

directa, comprobando si las proteínas Hox pueden ocupar el lugar dé las proteínas HOM en el desarrollo embrio-

lar a las proteínas Antennapedia y nario de Drosophila. En teoría, conlución de los genes HOM y Hox está Ultrabithorax del complejo HOM) seguiríamos el intercambio con la sustentada frrmemente por la inves- abunda en las regiones cervical poste- sustitución del gen HOM de wa tigación que Richard W. Beeman y

rior y torácica anterior y está ausente

Rob E. Denell han realizado sobre los

de las regiones más anteriores. Algu-

genes homeóticos del escarabajo; lo corroboran publicaciones recientes de

presa anormalmente desarrollan

muchos laboratorios, que demuestran

deformidades en el oído y el paladar

Coxs'rnuccróN »u

r SBn

Vrvo

nos ratones en los que HoxAT se ex-

mosca por su homólogo.FIo*; éste se expresaría cuando y donde lo hubiera hecho el gen HOM. Pero no podemos acometer todavía un experimento así; la técnica actual no puede abarcar y

lll

¿Qué cabe deducir de estos experimentos sobre intercambio de genes entre especies? En primer lugar, refuerzan nuestras conclusiones de que los propios homeodominios deter-

minan gran parte de la especificidad reguladora de las proteínas: fuera de la región del homeodominio, Ias proteÍnas homólogas de moscas y vertebrados tienen poco en común. Además, los experimentos sugieren que, desde una óptica funcional, las proteÍnas homólogas son, hasta cierto punto, intercambiables y tienen "significados" similares para los embriones durante sus fases iniciales de desarrollo. Ei sistema para determinar la posición en el eje anteroposterior ha cambiado poco en los últimos 700 millones de años. Si asociamos a un rompecabezas la complicada red de interacciones entl'e MOSCA MUTANTE Deformed

IVOSCA NORMAL

1as proteínas encargadas de regular los genes dentro de un organismo, 1as

proteÍnas homólogas de mosca y

varias anomalías en la cabeza,

mamiferos serían piezas que encaja-

entre ellas la ausencia de la mitad inferior de los ojos compuestos. Las mismas deformidades pueden inducirse haciendo que las larvas expresen la proteína HOXD4.

rían en ios mismos sitios. Planteán-

7. LAS MOSCAS MUTANTES DEFORMED exhiben

manipular genes enteros. Pero sí pudimos aproximarnos al ideal: usando secuencias de ADN de Hox unidas a elementos reg"uladores inducibles por calor, logramos que todas las células de una mosca en desarrollo expresaran una proteína Hox. La primera proteína que sometimos a este tipo de prueba, con Nadine McGinnis, fue HOXD4, proteína humana equivalente a la HoxD4 de ratón. (De acuerdo con la nomenclatura genética

normalizada, la abreviatura Hox se escribe con ma¡rúsculas al referirse a los genes humanos.) El gen que codifica esta proteína humana, que tiene un homeodominio semejante al de la proteína Deformed de la mosca, fue aislado y caracterízado en 1986 por Fulvio Mavilio y Edoardo Boncinelli. En Drosophila, caando el gerr Deformed se expresa fuera de sus límites normales en el eje anteroposterior,

provoca anomalías cefálicas, como ausencia de la porción ventral de los

alimentación positivo.) La proteína humana HOXD4 remedaba, pues, los efectos de la expresión inadecuada de Deformed, ya que en par-al menosimpropia te- promoula la expresión de Deformed. Pese a todo, pudimos comprobar que HOXD4 actuaba como una réplica, débil pero específica, de su homólogo de Drosophila. Alentado por este resultado, Jarema Malicki examinó la función de la proteína de ratón HoxBG durante eI desarrollo de la mosca. La proteína HoxB6, que Klaus Schughart y Frank H. Ruddle identificaron y caracteriza-

ron, tiene un homeodominio muy similar al de Ia proteína Antenna-

donos así el sistema HOMlHox, se pone de relieve también todo 1o que

nos queda por aprender todavía: hemos de identificar aún las otras piezas del rompecabezas que permiten a

las proteínas HOM y Hox regular genes ¡,'cumplir una función específica.

pn algún momento del intervalo lJ./ que media entre hace 600 millones ¡'mi1 millones de años, se desarroel sistema HOM lHox. Muchos ani-

11ó

males han dependido desde entonces de é1 para determinar Ia posición axial durante el desarrollo. ¿Es el único sistema genético de desarrollo que se ha conservado? Parece improbable. Se han encontrado indicios de que otros genes reguladores de ratón y de mosca

pedia. Los efectos de la expresión de la proteína HoxB6 en las células de la mosca durante su desarrollo eran espectaculares e inconfundiblemente

presentan una estructura muy simiIar y son activados en el mismo tejido

homeóticos. En las larvas de Drosophilalaproteína HoxB6 hizo que gran

y de su interacción con el sistema HOM lHox promete revelar muchos

parte de la región cefáLica se desarro-

en tejidos homólogos. La exploración funciones de estos nuevos genes

de las

más descubrimientos fascinantes

ojos. Ante nuestro asombro, la expre-

llara como si fuera torácical. en vez de un esqueleto larvario cefálico, Ias

de los primitivos sistemas genéticos,

sión de la proteína humana HOXD4 en las células de la mosca en desarrollo causa las mismas deformida-

moscas transformadas producían cin-

auténticos arquitectos moleculares

turones de dentículos, filas de espínulas habitualmente dispuestas en la

del plan corporal de los animales.

des. Sin embargo, no pudimos atribuir estos cambios enteramente a la proteína humana: nuestros experimentos indicaban que esta proteína también instaba la expresión del gen Deformed de la mosca. (Recordemos que un efecto normal de la proteína Deformed es activar su propio gen, en lo que constituye un ciclo de retro118

parte ventral del tórax de Drosophila. En los adultos de Drosophila, HoxB6 producía Ia transformación homeótica de las antenas en patas torácicas. Ya fueran larvarias o adultas, las transformaciones homeóticas eran muy similares a las producidas por la expresión inadecuada de Ia pro-

teínaAntennapedia en todo el cuerpo.

sobre 1a evolución y el funcionamiento

Eltii,i{,:i-;it.\l--1.-\ !.i].1ilrJ .i,.\:i:}.

l ,\iii i

HoNrHoBox GnsEs ,rs» AxrAL PATTERxrNc. William McGinnis y Robb Krumlau1'en Ce 1/. volumen 68. número 2, páginas 283-302; 2,1 de enero de 1992. TgE M,TTINC; O¡ .T FLY: THE GENETICS OF

ANtlt¡l- DEstcN. Peter A. Lalvrence. Blackwell Scientific Publications.

992.

TErr¡s

Cosecha de hameabox John Rennie

uando un esbozo de tejido de un embrión madura espontáneamente en un brazo completamente formado, lo hace

siguiendo órdenes. Estas órdenes las imparten genes homeobox, una f-arnilia de genes "maestros" que asigna el destino del desarrollo. Los genes homeobox. característica ubicua de hongos y animales pluricelulares, podrían haliarse también en 1as plantas. Un equipo de investigadores del Centro de Expresión Cenética del Departamento de Agricultura de los EE.UU. y de la Universidad de Califbrnia en Belkeley descubrieron genes vegetales homeobox. llegando a afirmar qrte esos genes constituyen un grupo unive¡sal de reguladores que. pu' más de mil millones de años, han venido dictándoles a las célu1as en qué tenían que acabar. A lo largo de los años ochenta. genéticos y ernbriólogos advirtieron que ciertas mutaciones. muy complejas, que se operaban en la mosca del vinagre tenían su raíz en determinados genes. Esas mutaciones homeóticas. así se 1as llamó. eliminaban segmentos corporales enteros c-r provocaban la aparición de extremidades en lugares insólitos. Los mutantes A nteiltnpedio, por ejemplo, tenían patas donde debieran haber tenido antenas. Los genes mutados parecían supen'isar 1a actividad de otros genes y, a través de ellos, la dit-erenciacitin de grupos enteros de célu1as durante el desarrollo. La investi-uación posterior reveló que truchos de los genes responsables de 1as mutaclones honteó¡icas mostlaban un estrecho parecido a lo largo de cierta secuencia. la secuencia homeobox. Con otros estndiosos William J. N{cGinnis. ahora en la Universidad de Yale, demostró posteriolmente que podía haber genes homeobox muy similares en todo e1 reino animal y hasta en 1as levaduras. Pero, curiosatrente. los múltiples intentos por observarlos en plantas dispares tiacasaron sin ren'redio. No los buscaba. sin ernbargo. el equipo de Sarah Hake. de Berkeley, aunque tampoco se sorprendieron cuando un gen homeobox les salió al paso. Estaban trabajando en cierta mLrtación de1 maí2, la llamada Knottetl (nudosa). Las hojas de los mutantes Knotted están desfiguradas pot'nr.rdos. o protuberancias rrrelnolinadas de las vasos laterales. Los nudos "parecen formar un grupo de células que continúan dividiéndose. rodeadas por otras células que han dejado de h¿icerlo''. explica Hake. "Divergen de los tumores. Todas las célu1as se encuentran en una 1áminu sana y bien definida. Imagínese usted un niño que intenta con el dedo hacerse un siete en el jersey."

teínas conocidas. Había. en ef'ecto. suticientes similaridades entre la proteína codlficada y los productos de genes homeobox para que Hake clasificara el gen Knoffed entre 1os que contenían un

homeobox. Recapitulando, señala Hake. resulta claro por qué fiacasaron los intentos previos en busca de esos genes en las plantas. El método habitual implicaba 1a técnica de hibridación cruzada, en la que heblas de ADN complementarias de un homeobo-x servían de sond¿is para otras. Srn embargo, la divergencia entre secuencias de ADN r,egetal y animal es tan grande que las moléculas sonda basadas en genes animales no se podían adherir a los genes vegetales. "Con la existencia ya de un motivo vegetal conocido, lesultará más iáci1 obtener genes homeobox vegetales." Hake y su grupo han identiticado varios homeobox más en el maí2. tomate y arroz. Aunque los genes homeobox vegetales difieren bastante de los que se encuentran en animales y hongos, las semejanzas siguen sr-rgiriendo que todos los homeobox descendieron de un gen en el antepasado común de los organismos, que vivió hace mil millones de años. El papel de un gen de tales características ("homeoboxoide") en este ¿intepasado unicelular es motivo de especulación. Cabe la posibilidad. señala McGinnis. de que el gen regulara 1¿r transtbrmación de aquellos organismos unicelulares en varias forrnas clistint¿rs. Una vez hubo evolucionado 1a p1uricelular. pudo haberse orientado esa función hacía 1a producción de diferentes tipos celulares en distintas regiones del cuerpo.

Tl1 descubrinuento de los genes en 1as plantas continúa defi-E nien,lo el rangu .le actividades por ellos regulaclas añade Matthew P. Scott.-un pionero de la investigación de homeobox en la Universidad de Stanford. "La cuestión central es muy importante. ¿Por qué un determinado tipo de molécu1a reguladora se halla implicado en un determinado proceso?" Y prosigue: "¿Se trata de un mero accidente histórico que establece cuáles de estos tipos de proteínas se hallan implicados?" O, como Shakespeare podría haber expresado: ¿Por qué eres tú, homeo?

f as células de 1as vasos laterales que han deiado de dividirse I-¿ son anormales: poseen características de células de la vaina. o base de la hoja. Asimismo. en los mutantes Kilotted la lígula (una pequeña balda de tejido epidérmico que normalmente se encuentra entre 1a hoja plana y la vaina) crece en Ia misma hoja. Para el grupo de Hake, todos los rasgos del mutante vendrían causados por células que exhiben un comportamiento normal en sitios impropios o en momentos inadecuados. Como tales, ¡ecordaban las mutaciones homeóticas observadas en la mosca del vinagre. "Las lígulas en un sitio impropio no ofrecen Ia espectacularidad de las mutaciorres Antennapedla". comenta, "pero. en cierto sentido. son análogas". Tras varios años de trabajo consiguieron identificar el gen resmutación Knotted. Dedujeron la secuencia de amínoácidos que determinaría y la compararon con las de otras proponsable de

CoNSTRUCCIÓN DE

LTN

SER VIVO

MAIZ MUTANTE KNOTTED (izquierda) y su correspondiente versión normal (.derecha).La anomalía se da en un gen homeobox que regula la diferenciación y provoca que algunas células foliares expresen rasgos indebidos. Fotografía: Bruce Veit.

119

Sustitución dirigída de genes Mario R. Capecchi

La biología de los mamíftros está experimentando una auténtica revolución,

impulsada por una nueva técnica que perrnite crear ratones

portadores de mutaciones controladas de cualquier gen conocido

células de nuestro organismo T asportan en su núcleo un manual I J-¡l áe mstrucciones donde se especifrcan sus distintas funciones. Aunque ese manual es el mismo para todas, cada estirpe celular epi-hepáticas, dérmieas y otras- echa mano de un capítulo diferente para cumplir su propia misión. El manual contiene, asimismo, la información en cuya virtud un embrión unicelular, elóvulo fecundado, se convierte, primero, en feto y, luego, en bebé. Y además sigue

suministrando información mientras

el niño madura física e intelectualmente. Cada uno de nosotros es irrepetible; en efecto, el manual difiere ligeramente de un sujeto a otro, de suerte que en él están especifrcadas casi todas las características físicas y muchas de las claves del comportamiento que nos individualizan. Manual tan extraordinario

llama

genoma. Está escrito en forma de nu-

cleótidos, con un alfabeto de cuatro letras: adenilato (A), citidilato (C), guanilato (G) y timidilato (7). Igual que la secuencia de letras de una palabra determina su significado, así Ia secuencia de nucleótidos delADN encierra la información. En cada división

trucciones de las células de un ratón. Reescribiendo partes del texto y evaluando las consecuencias de esa alteración de las instrucciones sobre el desarrollo del múrido, o sobre su operación posterior, podemos desentrañar las peculiaridades del programa que gobierna dichos procesos.

Las unidades funcionales

del

nes que componen el genoma humano

gen en el desarrollo cerebral, podríamos preparar embriones de ratón en

La secuencia de nucleótidos de un gen determina los aminoácidos que deben ensartarse para formar una proteína dada. (Las proteínas llevan a cabo la mayoría de las actividades celulares.) La propia secuencia de aminoácidos de una proteína suministra, a su vez,

los que el gen normal estuviera "fuera de combate", anulado del todo. Si por

culpa de esa inactivación nacieran ratones con malformaciones cerebeIares, sabríamos que eI gen en cuestión era decisivo para la formación del cerebelo. El proceso mediante el cual se introducen cambios específicos en la secuencia de nucleótidos de un gen se denomina sustitución dirigida de genes ("gene targeting").

f l-l

función de un pequeñísimo porcentaje de genes de cada una de esas especies.

a información que se obtenga con

los experimentos de sustitución

embrionario humano, sino también

permite cambiar una letra, una frase o varios párrafos del manual de ins-

sobre la constitución de nuestro sis-

tema inmunitario y su intervención en la lucha contra las infecciones. Es de presumir que esa técnica de sustitución nos conduzca más lejos, hasta el funcionamiento del cerebro humano y la forma en que ciertos defectos génicos se traducen en enfermedad. A propósito de esto último, se está aplicando la técnica para provocar en

ratones modelos de enfermedades t20

magna empresa a establecer Ia secuencia nucleotídica de todos los ge1'el del ratón (unos 200.000 genes en cada caso). Se ha identificado sólo la

Utah he desarrollado la técnica que

más, ha contribuido al estudio de Ia sín-

El entusiasmo despertado por la técnica de sustitución se alimenta con otra esperanza, ),a de su promesa de ahondar en el conocimiento generado por e1 proyecto genoma. Aspira esta

manual son los genes. Escogemos uno

celular se replica el manual entero: una copia por cada célula resultante. En humanos y ratones, el genoma viene a constar de unos tres mil millones de nucleótidos. Con mi grupo de la Universidad de

tesis de proteínas y ha participado en el descubrimiento de los intensificadores de ADN.

aterosclerosis, por citar algunas.

y cambiamos su secuencia específica de nucleótidos: alteraremos su función. Para mayor claridad: si sospecháramos la participación de cierto

génica en los ratones debiera sernos útil a los humanos, pues el 99 por ciento, y algún pico más, de los genes coinciden en ambas especies y cumplen similares cometidos. Esa línea de investigación en el ratón arroja luz no sólo sobre las etapas del desarrollo

MABI0 B. CAPECCHI enseña genética en la Universidad de Utah. Suyas son las técnicas descritas aquí. Ade-

humanas: fibrosis quística, cáncer y

MUTACION DIRIGIDA de un gen ee-

lular. El procedimiento consiste en introducir copias mutadas del gen (moléculas aerd,es y amarillas d,e la izquierd,a) en las células y dejando que una copia ocupe el lugar del gen original (molécula amarilla d,e la d,erecha) en el cromosoma correspondiente. Estas células al-

teradas permiten producir ratones con

mutaciones genéticas específicas. La aparición de una cola cu¡vada y problemas de equilitrrio y audición en uno de los ratones (arriba) llevó al descubrirniento de que el gen afectado, el int-2, participa en el desarrollo de la cola y el oído interno. TEu,rs

importantes pistas sobre el papel que ésta desempeña en las células: actividad enzimática, componente estructural o molécula transmisora de señales. Pero la secuencia no basta, por sí

misma, para revelar las tareas realizadas por la proteína durante la vida del animal. La sustitución génica dirigida sí puede proporcionar esa información y ampliar nuestro conocimiento sobre las funciones de los genes y sus proteínas. La sustitución génica nos ofrece

una nueva manera de hacer genética de mamíferos: la posibilidad de ver cómo intervienen los genes en los procesos biológicos. Los métodos clásicos de la disciplina, muy fructíferos a la

ADN (un mutágeno). Eligiendo la dosis adecuada del mutágeno, aseguraremos que cada individuo porte una mutación en uno o varios genes. Apartir de esta población de bacterias o

hora de abordar esos procesos en organismos elementales, no acababan de adaptarse al estudio de seres de la complejidad de los mamíferos. Para saber cómo replican su ADN

levaduras que han experimentado

bacterias y levaduras, unicelulares, basta con exponer mil millones o más a un agente químico lesivo para el

mutaciones en cada uno de los genes necesarios para la replicación del ADN. (En la replicación del genoma

mutagénesis, identificaremos individuos incapaces de replicar su ADN. En tamaña población resulta proba-

ble hallar individuos distintos con

COPIAS IVUTADAS DEL GEN ELEGIDO

REGTON N,IUTADA

GEN ESCINDIDO DEL ADN

\ É

EL GEN MUTADO SUSTITUYE

VERSION NORMAL EN EL ADN CELULAR

CELULA

CoNslnuccróN »e ux Sen Vrvo

t2t

Sustitución dirigida de genes en cultivos celulares 't. Se alteran las copias de un gen (barra de la izquierda) en el tubo de 2. Vector y sus dos marcadores se introducen ensayo y se prepara un vector director (barra nlargadn). El gen mostrado se ha inactivado por inserción del gen neor (oerde) en la región que cifra la proteína (azul). El gen. neor servi¡á de marcador para indicar que el ADN vector se ha instalado m un cromosoma. En un extremo del vector se ha introducido un seg'undo marcador: el gen /k de herpes (r7b).

en células (8rls) aisladas de un embrión de

ratón.

CELULAS

GEN CLONADO

EXON 2

EXON

/--,

i!;/.,, I

--------+ \^ vall 1

VECTORES

(REGTON

ALTERAR

--a-\ \...;,

).-

QUE CIFRA

LA PROTEINA)

bacteriano o de levaduras participan un centenar largo de genes.) Uravez

identificados los genes, podemos

tituiría un experimento

de una magde compa-

nitud inabordable. A modo

replicación: qué genes controlan Ia de-

ración, en los ratones se alcanzaría el límite práctico de deteccrón de una mutación dada en torno a los mii ani-

cisión de copiar el ADN y cuáles la

males.

determinar su papel específico en la precisión y tasa de duplicación. Planteamientos similares se han aplicado a los organismos pluricelulares. Los dos favoritos de los genetistas son Caenorhabditis elegans, un gusano,y Drosophila melanoga,sler, la mosca del vinag:re. No obstante, incluso en estas formas sencillas de organismos

pluricelulares, la identificación

todos los genes implicados en un proceso biológico es

dificilísima.

Varios factores explican semejante dificultad. Uno es el tamaño del genoma. El de la bacteria Escherichia coll contiene sólo 3000 genes, mientras que el de D. melanogaster tiene al menos 20.000 y el de ratón, 10 veces esa

cifra. Cuanto mayor

es el número de genes tanto mayor es Ia complejidad,

porque aquéllos forman redes interactivas más intrincadas. Averiguar el efecto de cualquiera de esos genes en una red tan enrevesada constituye una tarea hercúlea. Además, el mayor tamaño de los organismos pluricelulares pone límites prácticos al número de individuos que puede abarcarse en un experimento de mutagénesis. No cuesta demasiado buscar tipos específicos de

mutantes entre más de mil millones de bacterias o levaduras sometidas a mutagénesis. Pero detectarlos aunque sólo sea en 100.000 moscas const22

A I sel en su mA\ona diploides los A organismos plulicelulale-. las dificultades 1ogÍsticas para identificar y estudiar ios genes se ledoblan: ser diploides significa que sus células poseen dos copias de los genes. una heredada de la madre ¡'otra del padre. A electos de supelr ivertcia. impolta mucho tener dos copias de 1a ma¡'oría 'los genes. Normalmente. -i una de copia sufre una mutación per-judicial. la otra Ia compensa, 1' así no se pro-

nitaria. habrá que realizar en éstos los aná1isis. Esa es la razón por Ia que los genetis-

tas interesados en el desarrollo, las funciones neuronales, la respuesta inmunitaria. 1a fisiología y las enfermedades de 1os mamíferos hayan empezado a trabajar con el ratón. Desde un punto de vista genético, este animal es un mamífero ideal. Pequeño y plolífico, constituye, además, un excelente referente para Ia mayoría de los procesos bioiógicos humanos. Con todo, Ias manipulaciones genéticas que pueden llevarse a cabo en los ratones son, comparadas con las operaciones permitidas en los organismos

simples, muy limitadas. Para identificar ratones que han experimentado

ducen graves consecuencias. Esta redundancia significa también que

mutagénesis y son portadores de defectos en los genes que intervienen

una mutación provocará defectos

en determinados procesos, tendrían

flsiológicos o anatómicos en el organismo sólo si las dos copias del gen están dañadas. Se logra este tipo de individuos cruzando parentales que tengan cada uno la mutación en una copia del gen. Aproximadamente una cuarta parte de la descendencia de esos cruzamientos será portadora de las dos copias defectuosas del gen. Pese a las dificultades. Ia identificación de mutaciones seleccionadas en animales vivos sigue siendo el mejor medio para empezar a aclarar y ordenar las etapas de todo proceso

que controlarse de 10.000 a 100.000 individuos, a un costo prohibitivo. Por

genetistas, se dispone hoy de una nutrida coiección de ratones mutantes. Pero ni siquiera ese grupo de ratones mutantes se halla libre de inconvenientes: no representan una muestra aleatoria de las posibles mutaciones de'l genoma del ratón. sino que contiene un número desproporcionado de

biológico. Además, si queremos entender procesos que sólo ocurren en los organismos complejos, como el desencadenamiento de Ia respuesta inmu-

mutaciones que se traducen en anomalías fisiológicas o de comportamiento fácilmente perceptibles. Así, abundan las mutaciones que afectan

estudiosos se han venido ciñendo a los animales mutantes que sur-

el1o. los

gían de modo espontáneo en sus coIonias. Fruto de la tenacidad de los

T¡u,rs

Se produce recombinación homóloga (arriba)i

el vector

alinea con el gen normal (el objetivo), ubicado en un cromosoma; a conünuación, las regiones idénticas alineadas del vector (junto con cualquier ADN que haya intercalado entre ellas) ocupan el lugar del gen original y se Produce la exclusión del mariador situado en el extremo (rojo). En muchas células, sin embargo, se produce inserción aleatoria de todo el vector (también eI marcádor extra) en algún cromosorna (centro) y en otras la integración fracasa (abajo). INSERCION DIRIGIDA DEL ADN VECTOR POR RECOMBINACION HOMOLOGA

4. Para aislar las células portadoras de una mutación diri-

gida, se cultivan todas en un medio que contenga ciertas árogas: un análogo de la neomicina (G418) y el ganciclovir. EI G418 es letal para las células, a menos que lleven un gen neú funcionaL elimina, pues, las célt¡las en las que no se haya integrado el vector ADN (grls). El gancitlovir mata las células que tienen un.gen fk; es decit, é[mina las células portadorás de un vector integrado al azar. Las únicas células que sobreviven y proliferan son las que portan la inserción dirigida (t¡erde).

LA NEOIVIClNA

^.*'::::Er@.-."'". MEDIO CON DROGAS

VECTOR

GEN OBJETIVO DEL CROMOSOMA

SIN INSERCION

CFIOMOSOMA CON LA INSERCION DIRIGIDA

INSERCION ALEATORIA

1________; CELULAS

CELULAS

CON INSERCION

La sustitución géni-

ca dirigida permite

______>

superar tales difi cultades al dejar en

VECTOR

UN GEN

CROIVOSOIVA CON INSERCION ALEATORIA

CUALQUIEBA

nuestlas

manos qué gen queremos alterar. También permite ejercer el control sobre el tipo de modificaciones introducidas en el gen. de suerte

tal que la mutación

puede diseñarse a me-

------>/

é/

,f/ VECTOR

UN GEN CUALQUIERA

CROIVOSON¡A INALTERADO

al color del pelaje, mientras que hay pocas que influyan en las primeras etapas del desarrollo (pues suelen determinar la muerte inesperada del embrión).

Por no hablar de lo costoso que resulta aislar los genes responsables manifiestos en los ratones mutantes; tarea ésta que exige a menudo años de esfuerzo concertado. Podemos deducir muchas de las etapas involucradas en los fenómenos biológicos sin descubrir los genes implicados; pero sin aislarlos no hay de los defectos

progreso molecular: no se puede determinar la naturaleza de las proteínas cifradas por los genes mutados,

ni identificar las células en las dichos genes son activos. CoNsrnuccróN oe uN SEn

Vlvo

que

,''..-/

[D ep.

ALEATORIA

DIRIGIDA

-'+

CELULAS PORTADORAS

DE LA [,4UTACION DIRIGIDA

dida para abordar cuestiones específi cas sobre Ia función del gen. Los criterios para seleccionar e1 gen a mutar pueden basarse en el conocimiento obtenido de la investigación en ratones y

otras especies. Ahora resulta bastante

fácil aislar una serie de genes que son activos durante la formación del corazón del ratón; la sustitución de genes

permitiría, por tanto, determinar el papel de cada uno de esos genes en el desarrollo cardíaco. Por vía alternativa, podemos averiguar si existe en el ratón una serie de genes cuya función en D. melanogasú¿r consiste en guiar el desarrollo neuronal y si cumplen una función similar. De entrada se pretende anular el gen a estudiar, para conocer las consecuencias que arrastra la ausencia del

producto que dicho gen determina. Probablemente serán complejas y afectarán a múltiples vías metabólicas. Puede comprenderse aún mejor

la función del gen introduciendo mutaciones definidas, más sutiles,

que incidan sólo en una de sus múltiples funciones. Muy pronto, podrán ponerse los genes bajo el control de un conmutador, elemento que permitirá conectar y desconectar un gen durante el desarrollo embrionario o posnatal del ratón. Supongamos, por ejemplo, un gen, hipotético, responsable de Ia formación y el funcionamiento de una serie de neuronas. La anulación del gen determinaría la ausencia de esas neuronas durante la formación del cerebro e impediúa valorar la actividad génica en el adulto. Si el gen estuviera bajo el control de un conmutador, éste podría dejarse conectado durante el desarrollo, y las neuronas se formarían normalmente. En el adulto, el conmutador se desconectaría; podríamos evaluar entonces la función del gen sobre las neuronas.

TI n los últimos 15 años la técnica de l! lu sustitución génica dirigida ha avanzado mucho. Cuando yo empecé, a finales de los años setenta, utilizaba agujas de crisüal muy pequeñas para

inyectar ADN directamente en el núcleo de las células de mamífero. Las

agujas se controlaban mediante micromanipuladores hidráulicos y las

dirigíamos hacia el núcleo con Ia ayuda de microscopios de alta resolución. El procedimiento resultó de una gran eficacia. Una de cada tres o cinco

células recibía ADN funcional y comenzaba a dividirse y a transmitirse establemente a las células hijas. Cuando investigué el sino de esas moléculas de ADN en el interior celu123

Sustitución génica dirigida en ratones 1. Se aíslan céIulas madre embrionarias (ME) (oerde, a la izquierdn) de una 2. Los embriones estirpe de ratón de color marrón y se introduce una mutación dirigida en un cromosorna (inserto). Las células ME se colocan a conünuaéión en embriones jóvenes. El color del pelaie de las futuras crías sirve de guía para comprobar si las células ME han sobrevivido en el embrión. En general se introducen las células ME en embriones que, sin ellas, originarían ratones totalmente negros. Estos embriones se obüenen a partir de una estirpe de color CROMOSOMA

NORI/AL

negro (abajo), carentes del gen agoutí, que produce pelo marróry aunque esté presente en

MUTACION DIRIGIDA

que contienen las ME se deian crecer a término en "madres de alquiler".'Se

examina

el pelo de los recién nacidos.

presencia de parches marrones sobre una fondo negro manifiesta que las células ME han

sobrevivido y proliferado en el animal. (Se llaman quimeras porque contienen células procedentes de dos estirpes de ratón.) Un color totalmente negro significaría que las cé-

lulas ME han perecido.

una sola copia.

RATON QUIMERICO MACHO (PORTADOB DE CELULAS

DE DOS ESTIHPES)

HEMBRAS NEGRAS

il,ih"Jb','?./»-Y

w \

EMBRION EN

€¡r DE

---->

\-.

ALQUTLER

._.r

.z -/

....§

los 1000 volúmenes del manual de ins-

ban al azat el uno de los cromosomas de la célula receptora, a veces se intro-

ducía más de una molécula en el mismo sitio y todas tenían la misma orientación. Igual que en los idiomas existe una dirección de lectura (de izquierda a derecha en español), así también en las moléculas de ADN. Según parecía, antes de que las células llevaran a cabo la inserción aleatoria, había algún mecanismo nuclear en virtud del cual las moléculas de ADN introducidas se engarzaban en la misma orientación. Demostramos que las células utilizaban un proceso de recombinación homóloga para conseguir tales engarces. La recombinación homóloga se produce sólo entre moléculas de ADN

la misma secuencia

_-->

EI,IBR|ON

lar, un sorprendente fenómeno llamó mi atención. Aunque las moléculas de ADN recién introducidas se inserta-

nucleótidos: se alinean una aI lado de la otra, ambas sufren cortes y sejuntan por los extremos cortados. Los empalmes se realizan con tal precisión, que no se altera la secuencia nucleotídica del sitio donde se producen dichos engarces. 124

EMBRION ALTERADO

I/ADRE

RATON MABRON

que tienen

ESTADIO

BLASTOCISTO

Esta inesperada observación revelaba que todas las células de ratón, y presumiblemente todas las de mamífero, poseían la maquinaria necesaria

para llevar a cabo la recombinación homóloga. En aquellas fechas no

había razones para sospechar que

tlucciones genéticas parecía mínima. Pese a la denegación, decidí aprovechar los fondos que recibÍa de otro plo.\ecto. Era una empresa arriesgada. Si fracasaba, no dispondría de

datos suficientes para solicitar la renovación de la subvención. La for-

contaran con ella las células somáticas, que no están implicadas en la

tuna vino en mi ayuda. En 1984, cuando volvimos a solicitar fondos

reproducción sexual. Comprobamos la sobresaliente del mecanismo, pues logramos microinyectar más de 100 moléculas de ADN de idéntica secuencia, que las células eragarzatort en la misma orientación. Inmediatamente comprendí que, si aprovechábamos esta maquinaria para provocar la recombinación homóloga entre

para proseguir Ia investigación, teníamos pruebas de la viabilidad de la sus-

efi cacia

una molécula recién introducida de ADN de nuestra elección y la misma secuencia del cromosoma de una célula, podríamos reescribir a voluntad su manual de instrucciones.

[lntusiasmado ante esta perspecti-

I-¡l

va. en 1980 solicité una subven-

ción para investigar la üabilidad de la técnica de sustitución génica dirigida. Pero eI comité de expertos que revisó el proyecto lo rechazó. En su opinión,

la probabilidad siquiera de que la

secuencia de ADN recién introducida encontrase su secuencia homóloga en

titución génica en las células. Los expertos que habían rechazado Ia primera propuesta demostraron ahora su buen sentido del humor. El informe de valoración dei nuevo proyecto empezaba con Ia siguiente frase:

"Nos alegramos de que no siguiese nuestros consejos." ¿Cómo se efectúa la sustitución

génica dirigida en las células? Se empieza por clonar el gen que nos interesa y propagarlo en bacterias, para así lograr una fuente pura de ADN que contiene el gen. A continuación, en un tubo de ensayo, se cambia la secuencia de nucleótidos del gen en función de los fines del experimento. A1 gen alterado se le denomina vector director ("targeting vector"). Se introduce el vector en células r.ivas. Dentro del núcleo celular, forma complejo con las proteínas que TEN,IAS 3

3. Se cruzan ratones quiméricos macho con hembras negras (no agouti. k analiza la descendencia en busca de indicadores de la mutación dirigida (inserto oerde) en el gen deseado. Los ratones negros se apartan; si los animales han nacido a partir de esperma procedente de células ME

con probabilidad de portar la mutación- serían marrones. El

4. Se cruzan machos

-y examen

directo de los genes de los ratones marrones revela cuál de esos animales (recuadro) ha heredado Ia mutación dirigida.

hembras portadores

de Ia mutación para obtener ratones cuyas células presenten la mutación en las dos copias del gen (inserto), careciendo por tanto del gen firncional. La identificación final de esos animales (recuadro)

se realiza por análisis directo de su ADN. Por último, se comprueba si tienen algún defecto físico o de comportamiento.

_.§J

§ ,_:=\

QUIMERA MADUBO

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recombinación homó1oga. Ayudado por esas proteínas. el vector busca su secuencia homóioga ie1 objetivo) por todo e1 genoma. Si 1a encuentra, se ali-

gen de la quinasa de timidina (th) de un virus herpes, se frja a un extremo del vector. Cuando se produce recom-

nea junto a ella ¡- la sustituye. Por desgracia, esta sustitución dirigida ocurre só1o en una pequeña fracción de 1as células tratadas. Lo habitual es que el vector se inserte a), azar

binación homóloga, los segmentos

en lugares no homologos o que ni siquiera se integre. Debemos, pues, ser capaces de identificar 1as células

situado fuera de la zona de secuencias alineadas, no se integra en el cromosoma y es degradado por la célula. Por el contrario, cuando las células insertan aleatoriamente el vector director, lo engarzan todo, incluido el gen th, en el ADN. Si no hay integración, se pierden el vector y sus marcadores.

en las que la sustitución ha resultado

satisfactoria. Aproximadamente una de cada millón de células tratadas tiene la sustitución deseada.

Para simplificar 1a búsqueda de esas células, utilizamos dos "marcadores seleccionables", que se introducen en eI vector director desde el prin-

cipio. La inclusión de un marcador seleccionable "positivo" promueve 1a supervivencia y el crecimiento de las células que han incorporado el vector, ya sea donde se pretendía o en una

iocalización aleatoria dentro del genoma. La inclusión del marcador seleccionable "negativo" ayuda a e1iminar la mayoría de las células que han incorporado el vector en una Ioca-

lízación aleatoria. E1

marcador positivo, normalmente

un gen de resistencio a neomicinct tal forma que quede flanqueado por secuencias de ADN también presentes en el gen diana homólogo que se desea reemplazar. El marcador negativo, por Io general el (neor ), se coloca de

CoNsrnucclóx »¡ uN SEn Vrvo

inalterados del gen clonado,junto con el gen neor intercalado entre ellos, sustituyen a la secuencia diana presente en el cromosoma. Pero el genth,

\fo I\

necesitamos examinar directamente el ADN para identificar

cuál de esas posibilidades ha ocurrido. Nos basta con cultivar las céIulas en un medio que contenga dos drogas: un

análogo de la neomicina llamado G418 y el antiherpético ganciclovir. El G418 mata a las células que care-

cen del genneo'protector en sus cromosomas, esto es, las que no han inte-

grado el ADN vector. Pero permite sobrevivir y crecer a las células portadoras de las inserciones, ya sean aleatorias o dirigidas. A suvez el ganciclovir mata todas las células que tienen eI gen tk herpético, es decir, las que albergan una inserción aleatoria. Al final, las únicas células supervivientes vienen a ser las portadoras de la inserción dirigida (las que poseen

el gen "seleccionable positivo" neo'y carecen del gen "seleccionable negativo" tk). En 1984 habíamos demostrado ya que era posible sustituir genes específicos en células de ratón cultivadas. Estábamos preparados para ampliar Ia técnica al genoma de ratones vivos.

Nos servimos de células especiales desarrolladas en 1981, por Matthews

H. Kaufman y Martin J. Evans. Se trata de las células madre embrionarias (ME), es decir, células pluripotentes obtenidas de las primeras fases de un embrión de ratón, que pueden cultivarse indefi nidamente en placas de Petri y están capacitadas para originar cualquier línea de células. En resumen, mediante el procedimiento antes descrito, produjimos células ME conunamutación dirigida en una de las dos copias del gen elegido. Luego introdujimos las células ME en embriones muy jóvenes de ratón y los dejamos desarrollarse a término. Algunos de los ratones resultantes, cuando maduraron, produjeron esperma derivado de las células ME. Cruzando estos ratones con otros normales, conseguimos descendientes heterocigotos para Ia mutación, esto es, ratones que la portan en todas las células en una de las dos copias del gen. En casi todos los casos, esos heterocigotos estarán sanos, porque la segunda copia del gen, intacta, seguirá funcionando correctamente. Pero el t25

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2.RATONRECIENNACIDO(aniba,izquierda)cortunamu- que todo ese esperma lleva e1 gen

f"',"J,;:i"T,T,x i1L1i"l" li; ;:ü";iri'iiliillil"T;:'"T".ffifilÍJ:fi:d;""J,';:: :íir,;J ::'" -" :'^., "

loizquiercla).Mueslras de tejidos de ratones mutantes tizquierd.a) y normales (derecha) revelan que los mutantes

tambiéncarecendetimoytienenunaglándulatiroideaexa-

q:-T:-l{'1']

dlentes seran-tY-lt]-."1''"t negros'

)' los descen-

Así pues, cuando vemos crías maindicanque elger HoxA-Sesnecesarioparaeldesarrollodelos arorr"a, sabemos que los genes transtejidos y los órganos que se originan a partir de un3.estre- portados por las células ME han ido a geradamente empequeñecida. Estos y otros defectos

i}::tr:;:;:;y:X""i;;;":;e.s

en los embriones

cruzamiento de estos heterocigotos modificadas.llegala

jóvenes

término en

con hermanos o hermanas portadores "madre de alquiler". de la misma mutación produce homocigotos: animales con Ia mutación diri- Q i todo r-a bien. las células

una

l"-"1:,"?::q::':111:il::r{I'1.:d" mos 1n1c1ar los cruzamientos entre hermanos heterocigotos para producir 1'atones con dos copias defectuosas de1 gen objetivo. Antes, sin embargo, debemos saber qué crías marrones son las portadoras de una copia del gen

]IE aiteEstos LJ radas se reploducen repetida- mutado. Esto lo conseguimos busanimales exhibirán anomalías que mente durante este tiempo. transmi- candolamutaciónporexamendirecto revelarán las funciones normales del tiendo copias completas de todos sus de su ADN. Cuando se cruzan hermagen sustituido en todos sus tejidos. genes a sus cé1u1as hijasl éstas se mez- nos heterocigotos, uno de cada cuatro Empezamos inyectando nuestras clan con las del embrión y- contribu- descendientes tendrá las dos copias céIulas ME modificadas en embrio- yen a la formación de 1a mayoría de defectuosas dei gen. Identificamos los nes en estado de blastocisto, que aún lostejidos delratón. Porconsiguiente. homocigotos también por análisis no se han implantado en el útero ma- Ios recién nacidos son qulmeras: rato- directo de su ADN, esta vez buscando terno. Como dependíamos del color nes compuestos por células derir-adas dos copias de Ia mutación. Luego, se del pelaje para saber si el procedi- de las ME extrañas ¡' de 1as células examinan los animales para compromiento marchaba de acuerdo con el del embrión original. Las quimeras barlaexistenciadeanomalíasanatóplan, elegimos blastocistos que en un son fáciles de identificar por los am- micas, fisiológicas o de comportadesarrollo normal se transformarían plios parches de color marrón que pre- miento que puedan dar pistas sobre en crías de color diferente de1 encon- sentan en un pelaje negro. Si 1os ani- 1a función del gen alterado. Todo el trado en las producidas por la estirpe males no portaran células derivadas procedimiento, desde Ia clonación de de ratón de Ia que obtuvimos las célu- de las ME, serían completamente un gen hasta la producción de ratones las ME. negros porque carecerÍan de genes con una mutación dirigida en ese gen, Las células madre se aislaron de un agoutí funcionales. viene a durar alrededor de un año. ratón marrón que portaba dos copias Ahora bien, con sólo mirar ias quiLaboratorios de todo el mundo aplidel gen agoutí. Este gen, aun cuando meras no podemos determinar si las can ahora la técnica de la sustitución esté presente en una sola copia, pro- células ME dieron origen a células génica dirigida en ratones para estuduce colorido marrón debido a Ia pre- germinales, instrumento por e1 que se diar una amplia variedad de problesencia, en cada uno de los pelos, de transmite la mutación a las genera- mas biológicos. Desde 1989 se han una banda de pigmento amarillo sobre ciones futuras. Y esto io averiguamos producido más de 250 estirpes portalapigmentaciónnegranormal(lapro- sólo al pasar a la etapa siguiente: la doras de defectos genéticos selecciogida en las dos copias del gen.

ducción de Ios pigmentos propiamente de producción de ratones heterocigodichos está controlada por otros ge- tos portadores de una copia de 1a nes). Por tanto, seleccionamos blasto- mutación en todas sus células. Para cistos que, de no ser tratados, se con- generar esos animales, cruzamos

nados. Unos pocos ejemplos de

1os

des-

cubrimientos obtenidos permitirán

ilustrar el tipo

de información que es-

tos animales pueden suministrar. En mi propio laboratorio hemos

vertiríanenratonesnegros(losratones ratones quiméricos machos con hemsondecolornegrocuandoelgenagoutí bras negras, defectivas para e} gen estadoexplorandolasfuncionesdelos heredado de ambos padres es defec- ctgoutí. Los descendientes serán geneshomeóticos,ogenesllor.Estos tuoso). Esperamos, por fin, a que el marrones si el esperma que fecundó genes son una suerte de conmutadoembrión, que contenía las células 126

NIE

el óvulo procede de 1as células ME

(ya

res maestros encargados de que las T¡ru,A.s 3

ditaria humana. El análisis cromosó-

partes de Ia cabeza, se formen en Ios lugares adecuados y adopten su morfología correcta. Los estudios sobre los genes homeóticos de Drosophila han

suministrado valiosa información

so-

bre sus actividades. Sin embargo, quedan por resolver muchas cuestiones. Por ejemplo, D. melanogaster tiene sólo ocho genes.Flor, mientras que el ratón y el hombre tienen 38 cada uno. Proba-

blemente, la expansión de la familia 11or desempeñó un papel crucial en la progresión evolutiva de invertebrados a vertebrados, aportando ia maquinaria adicional necesaria para formar un cuerpo más complejo. ¿Qué función precisa cumplen esos 38 genes?

I ntes de que dispusie'emos de la la, tecnica de sustirucion genica dirigida, no había forma

de responder pregunta. l,a que nadie había encontrado ratones o seres humanos con mutaciones en ninguno de los 38 genes -É1or. Mis colegas v vo mismo estamos embarcados ahora en un proyecto cuyo objetivo es establecer ia función de cada uno de esos genes. N'Iás tarde intentaremos identificar cómo establecen una red interactiva para dirigir Ia formación de nuestlo cuerpo. Dentro de ese programa. hemos descubierto que 1a alteración dirigida a esa

del gen HotA-3 origina múltiples defectos. Los ratones que portan dos copias mutadas del gen mueren al nacer por disfunción cardiovascular debida al desarrollo incompleto del corazón y los principales r.asos sanguíneos que arrancan dei mismo. Esos

ratones nacen también con aberraciones en otros muchos tejidos, entre ellos el timo y

paratiroides tque fal-

tan), Ia glándula tiroidea. el hueso y Ios cartílagos de la parte inferior de Ia cabeza, el tejido conectivo. el músculo y el cartílago de la faringe. Esas anomalías, aunque dispares,

comparten un rasgo común: todos los tejidos afectados descienden de células que estaban agrupadas en un principio en una estrecha región de Ia

parte superior del embrión en desarrolio. Los rudimentos del corazón, por ejemplo, se alojan en esa región antes de alcanzan: su ubicación más retrasada en el tórax. Parece, por tanto, que la función dei gen l1orA-3 consiste en controlar la construcción de muchos de los tejidos y órganos que se originan en esa estrecha región.

mico de los pacientes con ese síndrome

muestra que el gen HoxA-S humano no es el culpable; las víctimas presentan daños genéticos en un cromosoma distinto del que alberga dicho gen. Ahora sabemos, sin embargo, que el gen responsable del síndrome actúa dificultando la activación dd, HoxA-S

o los episodios desencadenados por ese gen. Además, contamos ya con un modelo de la enfermedad en el ratón

que acabará proporcionando pistas para su tratamiento. Este imprevisto beneficio resalta el valor de Ia investigación básica: los descubrimientos nacidos de la curiosidad suelen llevar a aplicaciones muy prácticas. Los inmunólogos se hanbeneficiado también de la técnica de sustitución génica. La están aplicando para acotar la responsabilidad de cada uno de los más de 50 genes que influyen en el desarrollo y el funcionamiento de las dos clases principales de células defenso-

ras del organismo: linfocitos B y linfocitos 7. Los oncólogos acuden también a ella. Con frecuencia se confirma que uno o más tipos de tumores comparten mutaciones en un gen concreto, cuyo papel normal, sin embargo, se desconoce. Su descubrimiento mediante el empleo de nuestra técnica de anulación puede ayudar a revelar cómo contribuye la forma mutante del gen al desarrollo de la neoplasia. El gen supresor tumoralp5S ofrece un ejemplo que hace al caso. Se entiende por genes supresores de tumores aquellos cuya inactivación contribuye al desarrollo del cáncer. Es posible que hasta en el 80 por ciento de todos los cánceres humanos el genp53 esté mutado, pero hasta hace muy poco se desconocía sufunción normal. El análisis de ratones homocigotos para una mutación dirigida en p53 indicó que probablemente este gen actúe a modo de cancerbero que impida la división de las células sanas hasta no haber reparado cualquier daño que haya podido sufrir su ADN. Daños infligidos a menudo a las células como consecuencia de las frecuentes agresiones ambientales a las que están sometidas. La pérdida de los genesp5S funcionales elimina esa salvaguarda, lo que facilita la transmisión del gen

Inesperadamente comprobamos

lesionado a las células hijas, donde participa en el desarrollo cancerígeno. No sólo el cáncer. Más de 5000 enfermedades humanas se han atribuido a defectos genéticos. La identi-

que el desorden producido por Ia desactivación del gen HoxA 3 dei ratón semejaba el observado en e1 síndrome

ficación de los genes y las mutaciones responsables de esas enfermedades permitirá conse$rir las mismas muta-

Cr¡Nsrnuccl(rx oE uN Ssn Vrvo

Di George, una enfermedad here-

diferentes partes del organismo, como

las extremidades, los órganos y las

ciones en ratones. Los modelos en ratones harán posible, a su vez, la identificación detallada de los procesos que median entre el funciona-

miento anómalo de un gen y la manifestación de la enfermedad. Con un mejor conocimiento de la patología molecular de la enfermedad diseñaremos terapias más eficaces. Entre los modelos que se están creando ahora destacan los ratones con diferentes tipos de mutaciones en el gen de la fibrosis quística. Cuanto más ahondamos en la gené-

tica de las enfermedades, mayor es nuestro deseo de aplicar la terapia génica para corregir los defectos. De

momento, las técnicas utilizadas en dicha terapia se basan en la inserción aleatoria de genes sanos en los cromosomas para compensar las versiones dañadas. Mas los genes asíinsertados no suelen funcionar con la eficacia de los que ocupan su lugar correcto en el cromosoma. En principio, Ia sustitución génica dirigida puede ofrecer una solución

a ese

problema. Sin embargo,

antes de que la técnica pueda utilizarse para correg"ir un gen defectuoso en el tejido de un paciente, habrán de obtenerse cultivos de células capaces de participar en la formación de esos

tejidos en el adulto. Dichas células, que, como las ME de nuestros estudios, se denominan células madre, están presentes en médula ósea, hígado, pulmones, piel, intestinos y otros tejidos. Pero Ia investigación sobre cómo aislar y cultivar esas células está todavía en mantillas. ntes de ello, la sustitución génica

.13, encontrará un uso común en el estudio de la neurobiología de los mamíferos. Ya se han preparado ratones con mutaciones dirigidas que alteran su capacidad de aprendizaje. La identificación de nuevos genes neuronales acelerará el desarrollo de esta

línea de trabajo.

Ei,lí-Xii{..\l-'i.\

t)1{fr{_i,.i.1i:\ 1'ARIA

Tu¡ N¡w Mouss GEN¡rtcs: Ar-rszuNc rsr Gexorvr¡ sy Ge xn Tenc¡rrxc. M. R. Capecchi en Trends itt Genetics, vol. 5, número 3. páginas 70-76.marzo de 1989.

Gr¡oue ey HoNlolocous Rscol{er{.rrrox. M R. Capecchi en

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junio de 1989.

R¡cto:.llr-ly

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DlstnuprtoN ot rHE MousE Hol,tgoeox GENE HOX-1.5. Chisaka y M. R. Capecchi en Na¡¿rr¿. r,olumen 350, n.n 63 I 8, pá-

ginas 473-2179: 1 1 de abril de 1991.

127

Linajes celulares Ernesto Sánchez-Herrero y Ginés Morata

I desarrollo de los organismos pluricelulares requiere una gran proliferación celular para formar los diferentes órganos y tejidos. Uno de los primeros problemas que se plantea el investigador para entender el desarrollo de un organismo es la determinación de su linaje celular. es decir, la descripción de la historia de cada cé1ula desde e1 oocito l-ecundado hasta la fbrmación de órganos y tejidos adultos. Este tipo de análisis ha permitido determinar ei origen de cada parte del cuerpo y establecer las relaciones entre las diversas partes. Podemos así deducir 1as subdivisiones principales del embrión y cómo se fbrman durante el desarrollo. Los primeros en.rbriólogos describieron el linaje celular de embriones de invertebrados (sanguij ue1as. moluscos, poliquetos), ya que estos animales presentaban ciertas ventajas para semejante tipo de análisis: algunos embriones son transparentes y el linaje se puede seguir directan-rente hasta estadios de desarroiio avanzadosi otros presentan coloraciones o gránulos específicos en ciertas células. o blastómeros con diferentes formas o tamaños, características que pasan a la progenie celular. Los resultados de estos trabajos permitieron definír las relaciones específicas entre patrones de división en el embrión temprano y 1a formación de determinados tejidos y ór'ganos. La invariancia en el linaje observada en muchas especies. junto con Ios ef'ectos producidos en el desarrollo tras 1a ablación de ciertos blastómeros. llevó a1 concepto de desarrollo en mosaico, según e1 cual existen depositados en e1 huevo factores locales que determinan el desarrollo de 1as diversas partes del organismo. Por otra parte, el concepto de desarrollo regulativo, opuesto al anterior. provenía de resultados de ablación y transplante en diferentes organismos, como el erizo de mar. y def'endía que la diversidad mortblógica se establecía de forma gradual a través de interacciones entre 1as diversas partes del embrión. El debate en torno al carácter regulativo o en mosaico del desarrollo de 1as diferentes especies, asentado en buena parte en estudios de linaje celular, inundó la iiteratura embriológica durante la última década dei siglo pasado y las primeras de éste. Dichos trabajos iniciales se basaban en 1a observación dilecta de emb¡iones y por su propia naturaleza estaban limitados o bien a 1os primeros estadios del desarrollo o bien a organismos con muy pocas células. Este enfoque se emplea ahora refbrzado con nuevas técnicas microscópicas y fotográficas. Destaca el análisis del nematodo C. elegans, el único organismo del que se conoce su linaje celular completo.

f)ero se tmta de un método inadecuado cuando ha de habérselas I con embriones que no son transparentes o que contienen gran núrmero de células. Se han ideado varias técnicas para determinar el linaje celular en estos otros casos. Una de las más utilizadas ha sido la inyección de enzimas, tintes o sustancias fluorescentes en la cé1u1a cuyo linaje se pretende seguir. La sustancia inyectada debe ser estable y fácil de detectar. no pasar de una célula a otra ni a1-ectar e1 desarrollo. El linaje de la célula inyectada se puede así seguir durante cierto número de divisiones tras la iluminación del fluorescente o la detección de la reacción enzimática. Este n'rétodo se ha ernpleado para resolver el linaje celular en diversas especies. si bien requiere que las células inyectadas sean relativamente grandes y que e1 desarrollo del embrión se pueda seguir luego sin dificultad. La eficacia del método depende del grado de dilu128

ción de 1a substancia marcadora. razón por la cual só1o se marcan clones pequeños. Aunque menos. para el aná1isis de1 linaje celular se ha recurrido también al transplante de célu1as o a la formación de quimeras con cé1ulas de especies fácilmente diferenciables. La biología molecular ha aportado nuevos medios para e1 estudio de los linajes celulares. En los ratones se ha erperimentado con cierta técnica fundada en Ia inf'ección por retrovirus moditlcados de embriones tempranos. El virus se integra de modo estable en e1 genoma 1' se transmite luego a 1as celulas descendientes. Si quedan incluidas en e1 genoma ví¡ico 1as \e!ue11eia\ necesarias que determinan cierta proteína detectable. como Ia beta-galactosidasa cuva presencia no af'ecta la viabilidad de1 organismo, podemos descubrir. por reacción enzimática. la progenie de la célula infectada. A mayor abundamiento, han servido de indicadores de linajes los anticuerpos específicos que reconocen proteínas que e-\tán va presentes en f'ases precoces del desarrolio. En Drosophilo ntelonogoster, la mosca del vinagre, los métodos habituaies para Ia investigación del linaje celular parten de mosaicos genéticos. sean éstos muy tempranos y producidos por pérdida de un cromosoma en ia primera división de1 zigoto. o sean. 1o más frecuente. producidos por recombinación mitótica inducida por ra¡'os X. EI método requiere 1a utilizacion de mutaciones marcadoras que permitan reconocer el clon obtenido.

"pl I-r

sitteura de reconlbinacion mitótica inducida tiene la ventala de que lo. clones se pueden generar en cualquier momento del desarrollo ).. por tanto, se pueden definir las relaciones de linaje en cualquier estadio. Por ejemplo, mediante la irradiación de embrrones o larvas heterozigóticos para el marcador recesivo epidérmico nttrh. se producen clones homozigóticos para el malcador en 1os que todas las cé1ulas manit-estarán la característica mutante ¡'. por ende, se reconocerán en la epidermis. Esa estrategia técnica no se ha limitado a la epidermis: mediante mutaciones en genes que determinan ciertas enzimas se han realizado experimentos similares para conocer el linaje de estructuras internas. Un marcaje genético, como 1os últimos desc¡itos. tiene la ventaja de ser indeleble y heredable durante todas las divisiones. Los marcadores usados no afectan al desarrollo de la célula 1' son fácilmente reconocibles. Posibilita, además. conjugar técnicas moleculares con marcaje genético; así acontece con los genes cuya actividad se marca con Ia expresión de 1a enzima beta-galactosidasa en conjunción con marcadores genéticos como ¡nli. Recientemente se ha puesto a punto para el estudio del linaje en el embrión de Drosophila una nueva técnica llamada fotoactivación local de fluorescencia, que permite la observación del linaje celular en el momento deseado del desarrollo; el embrión se invecta con un compuesto derivado de fluoresceína que no es fluorescente. salvo que se ilumine con una luz de 350 nanómetros (inocua para el desarloilo). El compuesto químico va unido a dextrano (para impedir su paso entre células) y a un péptido que 1o porta hasta el núcleo, para observar mejor el linaje ce1u1ar. Tras 1a iluminación de una célula e1 compuesto se activa y el linaje de 1a misma puede seguirse por observación de su fluorescencia. Este método. aptcr para ser usado en principio en otros organismos. ofrece la doble ventaja de permitir 1a observación de linajes en vivo y facilitar la activación de1 compuesto en el momento deseado. T¡l,r.rs