Informationfolder kartofler
14/10/04
8:58
Side 1
Overv책gning Overv책gning ning for ringbakteriose teriose i kartofler
Informationfolder kartofler
14/10/04
8:59
Side 2
Denne folder er udarbejdet af Plantedirektoratet for at informere kartoffelavlere om, hvordan prøver til analyse for ringbakteriose udtages, analyseres og hvordan avlerne får information om analyseresultatet. Ringbakteriose er en karantæneskadegører i kartofler. Bakterien, der forårsager sygdommen, udgør stadig en trussel for kartoffelerhvervet og for den enkelte avler. Det er derfor vigtigt, at der foregår et samarbejde om bekæmpelse af ringbakteriose mellem de enkelte avlere, erhvervet og myndighederne. Overvågningen for ringbakteriose foretages efter samme retningslinier i hele EU ved prøvetagning og laboratorieundersøgelser i henhold til det gældende EU-Direktiv. I Danmark er det Plantedirektoratet, der overvåger for ringbakteriose. Der har igennem de seneste år været et fald i fund af ringbakteriose i kartofler. Dette skyldes især, at der har været en struktureret indsats indenfor følgende områder; · Avlerne har taget mange forholdsregler, der forebygger mod ringbakteriose som f.eks. årlig rengøring og desinfektion af produktionsapparatet · Det officielle certificeringssystem for danske læggekartofler reducerer risikoen for spredning · Som udgangsmateriale for læggekartofler bruger erhvervet meristemkultur · Plantedirektoratet foretager intens overvågning for skadegøreren herunder survey i læggekartofler og udskiftningskontrol i produktionen af spise-, foder- og industrikartofler · Indenfor EU anvender de officielle kontrolmyndigheder testmetoder til diagnostik af bakterien i latent smittede knolde
2
Informationfolder kartofler
14/10/04
9:00
Side 3
Latent smittede kartoffelknolde, det vil sige tilsyneladende sunde knolde udgør den egentlige fare for kartoffelavlen, idet sygdommen kan spredes uden man er klar over problemet. Plantedirektoratet foretager derfor overvågning for ringbakteriose i latent smittede kartoffelknolde med specielt fokus på læggekartoffelavlen.
Symptomer i latent smittede kartoffelknolde Ved fremskredne angreb af ringbakteriose vil man sjældent være i tvivl om årsagen. I de tilfælde vil ledningsvævet være blødråddent og brunfarvet og der kan forekomme synlige revner på overfladen. Imidlertid er det som nævnt latent smittede knolde, der udgør den største risiko for spredning af ringbakteriose. Ved at lave et tværsnit af latent smittede knolde, vil man ved et begyndende angreb se en svag pletvis gulfarvning af ledningsvævet ca. 0,5 cm under skrællen. Trykker man på en sådan gennemskåret knold, vil det gulfarvede væv presses ud som tandpasta af en tube og have konsistens som kartoffelmos. Er der tale om et mere fremskredent angreb, vil ledningsvævet Overskåret kartoffelknold med symptomer blive mere blødråddent og brunfarvet. på ringbakteriose.
Prøvetagning og prøveidentifikation I forbindelse med overvågningen udtager Plantedirektoratets kontrollører knolde hos avlerne der sendes til laboratorieundersøgelser. Da alle knolde i et parti naturligt nok ikke kan udtages til testen, vil der være tale om en stikprøve, der bliver udtaget så repræsentativt som muligt. Den naturlige opblanding, der sker under frilægning, optagning og indlægning i kule eller boks, er her en stor fordel. For yderligere at gøre prøven så repræsentativ for partiet som muligt, udtager kontrolløren de 200 knolde, der skal bruges til en prøve, på mindst 10 forskellige steder i partiet. Ringbakteriose bevæger sig normalt fra moderknolden til døtreknolde via navlestrengen. Det er derfor i døtreknoldenes navleender den største koncentration af eventuelle bakterier kan findes. Navleenderne udskæres fra kartoffelknoldene og analyseres i Plantedirektoratets laboratorium. Til hver prøve følger et sæt stregkodemærkater til laboratorieundersøgelserne.
Overvågning for ringbakteriose i kartofler I 3
Informationfolder kartofler
14/10/04
9:00
Side 4
Laboratorieundersøgelser Hver prøve behandles meget omhyggeligt for at undgå smitte fra den ene prøve til den anden. Stregkodemærkater anvendes til alle dele af analysen og sikrer identifikation af prøven gennem hele forløbet. Endvidere er prøven anonym for medarbejderne i laboratoriet, indtil analysen er afsluttet og analysebeviset er udskrevet. I Plantedirektoratets laboratorium er analysen af kartoffelprøver for Ringbakteriose akkrediteret i henhold til ISO 17025, som sikrer kvaliteten af analysearbejdet.
Udvinding af bakterier fra kartoffelprøven Navleenderne overføres til engangsplastikbøtter, hvor en stregkode påklistres. Der tilsættes ekstraktionsvæske til prøven og plastikbøtterne sættes på et rysteapparat i 4 timer. Hvis der er ringbakteriose-bakterier i prøven, vil bakterierne trænge ud i vandet. Rystevandet fra plastikbøtterne indeholdende eventuelle bakterier opkoncentreres ved centrifugering (kartoffelekstrakt) og benyttes derefter til de forskellige testmetoder.
Testmetoder Der anvendes testmetoder, der er baseret på biologisk forskellige principper for at sikre optimal sikkerhed for resultaterne af laboratorieanalyserne. Det drejer sig generelt om IF-test, PCR-test og ægplantetest. Men der kan også iværksættes andre supplerende undersøgelser (f.eks. selektiv opformering af ringbakteriose-bakterier fra kartoffelprøven). Ved alle undersøgelser indgår brug af positive og negative kontroller for at dokumentere om resultatet af en given test er brugbart.
4
Laboratorieundersøgelse
Princip for analysen
IF-test (serologisk test - antistof)
Genkendelse af bakteriens overfladestrukturer
PCR-test (DNA-baseret test)
Genkendelse af et specifikt stykke genetisk materiale (DNA)
Ægplantetest (patogenitetstest)
Test af om bakterien kan fremkalde symptomer på en værtplante
Informationfolder kartofler
14/10/04
9:01
Side 5
Alle prøver undersøges ved en 1. screeningstest. Ifølge den gældende lovgivning fra 1993 er den første screeningstest altid en IF-test. Ifølge EU-Direktivet, der træder i kraft 2004/2005 kan denne test være enten IF eller PCR. Når prøven er under mistanke efter 1. screeningstest gennemføres straks efter en 2. screeningstest til at af- eller bekræfte svaret fra 1. screeningstest. Hvis mistanken ikke kan bekræftes ved 2. screeningstest (eller ved en anden supplerende undersøgelse), er prøven negativ. Hvis mistanken bekræftes, iværksættes ægplantetesten med det samme. På det tidspunkt vil Plantedirektoratet orientere avleren om mistanken. Det endelig svar på prøven kan først udmeldes til avleren, når resultatet af ægplantetesten foreligger.
Plastikbægre med kartoffelpropper til rystning. Stregkoden følger prøven ved alle laboratorieundersøgelser.
Overvågning for ringbakteriose i kartofler I 5
Informationfolder kartofler
14/10/04
9:01
Side 6
IF-test Undersøgelsesproceduren består i, at man tager en dråbe af kartoffelekstraktet og overfører det til en lille glasplade. Dråben tørres ind på glasset. Derefter tilsættes en dråbe antistof, der udelukkende vil koble sig til ringbakteriose-bakterier. Derefter tilsættes et fluorescerende farvestof, der binder sig til antistoffet og gør, at bakterierne kan ses i mikroskopet. Ser man derefter på glaspladen i et mikroskop og belyser med en bestemt bølgelængde, vil ringbakteriose-bakterier vise sig som små fluorescerende lysende celler. En prøve uden fluorescerende celler vil kaldes negativ. En prøve, hvor der findes fluorescerende celler, der samtidig har en karakteristisk form og størrelse, kaldes IF-positiv.
IF-test. Renkultur af ringbakteriose-bakterier.
Ægplantetesten Til endelig bekræftelse eller afkræftelse af fund af ringbakteriose i kartoffelprøver anvendes ægplantetesten. Ved denne metode sprøjtes kartoffelekstraktet direkte ind i stænglen på ægplanten. I ægplanten vil der ske en opformering af eventuelle ringbakteriose-bakterier og spredning til de yngre blade.
Ægplantetest.
6
I løbet af 2-4 uger reagerer planten på bakterieangrebet, så enkelte blade mister saftspændingen i afgrænsede områder. Fra ægplantestængler og blade kan bakterierne efterfølgende isoleres i renkultur. Det undersøges afslutningsvis om de bakterier, der er isoleret fra planten, er IF- eller PCRpositive. Hvis det er tilfældet, er det endeligt bekræftet, at prøven indeholdt ringbakteriose-bakterier.
Informationfolder kartofler
14/10/04
9:02
Side 7
PCR-test Ved PCR-testen udvindes først ringbakteriose-bakteriens genetiske materiale (DNA) fra kartoffelekstraktet. Ved en speciel teknik (PCR=polymerase chain reaction) laves der mange kopier af et lille stykke af bakteriens DNA. Det DNA, der kopieres er enestående for netop ringbakteriose-bakterien. Dette stykke DNA synliggøres som et bånd som vist på figuren. Som en kontrol for at metoden er gennemført rigtigt opformeres tilsvarende et lille stykke DNA, der er enestående for kartoffelvævet i prøven. Dette giver en sikkerhed for at et falsk negativt resultat opdages. Hvis der ikke er noget bånd, der er karakteristisk for kartoffelvævet, kan resultatet ikke bruges og undersøgelsen vil blive gentaget. Hvis der kun forekommer ét bånd som har en størrelse, der er karakteristisk for kartoffelvævet, er prøven negativ. M
P N 1
2
3
4
5
6
7
8
9
PCR-test. I bane M ses mange DNA-bånd. Disse bruges som en lineal så man kan vurdere størrelsen på de bånd, der fremkommer i kartoffelprøverne. I bane P ses ét DNA-bånd, der er karakteristisk for ringbakteriosebakterier. I bane N ses ét DNA-bånd, der er karakteristisk for kartoffelvævet. I bane 1-9 er vist resultatet af PCR-testen på forskellige kartoffelprøver. Der er i de fleste prøver bånd af begge størrelser, som tegn på at der er ringbakteriose i alle disse prøver. For de prøver, hvor båndet for kartoffelvævet mangler, skal undersøgelsen gentages for at kunne afgøre om prøven er positiv eller negativ.
Vurdering af resultaterne Generelt gælder det; · at et parti kartofler betragtes som fri for ringbakteriose, når den indledende 1. screeningstest giver negativt resultat i alle prøver. · at et parti kartofler betragtes som angrebet af ringbakteriose, hvis ægplantetesten giver positivt resultat i blot en enkelt prøve. Når der ikke er fund af ringbakteriose i en kartoffelprøve, vil avleren kun modtage et analysebevis for de enkelte prøver fra Plantedirektoratet. I de tilfælde hvor der er mistanke om fund, vil Plantedirektoratet orientere avleren om mistanken og båndlægge avlen inden fundet er bekræftet. Hvis fundet bekræftes, modtager avleren analysebeviset og et brev om restriktioner for avlen.
Overvågning for ringbakteriose i kartofler I 7
Informationfolder kartofler
14/10/04
9:02
Side 8
Oversigt over kartoffelprøvens gang i Plantedirektoratet Kontolløren udtager kartoffelprøven hos avler
Plantedirektoratets laboratorium modtager prøven
Udvinding og opkoncentrering af kartoffelekstrakt fra navleender fra kartoffelprøven
1. screeningstest
Negativ
Avler får tilsendt analysebevis fra Plantedirektoratet
Negativ
Avler får tilsendt analysebevis fra Plantedirektoratet
Negativ
Avler får tilsendt analysebevis fra Plantedirektoratet
Positiv
Avler får brev fra Plantedirektoratet vedr. mistanke om fund af Ringbakteriose
Positiv
2. screeningstest (og evt. andre supplerende undersøgelser)
Positiv
Ægplantetest
Positiv
Avler får tilsendt analysebevis og restriktionsbrev fra Plantedirektoraret
8